ES2648882T3

ES2648882T3 - Péptidos basados en el dominio de transmembrana de un receptor tipo toll (TLR) para el tratamiento de enfermedades mediadas por TLR

Info

Publication number: ES2648882T3
Application number: ES11749552.3T
Authority: ES
Inventors: Yechiel Shai; Avner Fink; Eliran-Moshe Reuven; Liraz Shmuel-Galia
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 2010-07-19
Filing date: 2011-07-19
Publication date: 2018-01-08
Anticipated expiration: 2031-07-19
Also published as: EP2596009A1; US9890202B2; US20170362296A1; EP2596009B1; IL224259B; JP2013538558A; AU2011281192A1; CA2805989A1; US20130225478A1; WO2012011100A1

Abstract

Un péptido sintético de como máximo 30 restos de aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 75-90, 92-94, 96-120 y 121, en donde el péptido sintético inhibe la activación celular mediada por un receptor Tipo Toll (TLR), para uso en el tratamiento de una enfermedad mediada por TLR seleccionada del grupo que consiste en una inflamación, enfermedad inflamatoria intestinal, infección, enfermedad autoinmune, enfermedad pulmonar, insuficiencia cardíaca, enfermedad degenerativa, enfermedad neurodegenerativa, enfermedad reumatoidea, lesión por reperfusión isquémica, enfermedad fibrótica, caquexia, rechazo de injertos, daño por irradiación, asma y cáncer.

Description

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(Figs. 7A-7B).

Además, el péptido mTLR2 TM C'-CtoA (SEQ ID NO: 86) también se demostró que inhibía la activación de TLR2 in vivo. Utilizando un modelo murino para el choque séptico agudo causado por LTA, se demostró que la administración de este péptido era capaz de rescatar a más del 60% de los ratones en comparación con la supervivencia de ratones no tratados (Fig. 8). Debido al hecho de que la muerte estaba causada por la activación excesiva y desequilibrada de TLR2, el péptido mTLR2 TM C'-CtoA está muy probablemente implicado directamente en la inhibición de la activación de TLR2 en estos animales. El descubrimiento de que las tasas de mortalidad se mantenían estables desde las 48 horas después de la inyección de LTA y de ahí en adelante, sugiere que los animales supervivientes se curaron de forma completa e irreversible sin efectos adversos notables.

De acuerdo con la presente descripción, se proporcionan además pruebas que demuestran que los péptidos que comprenden la secuencia de los dominios transmembrana (TM) de TLR4/6 son capaces de formar heterodímeros y péptidos exógenos correspondientes al extremo N o al extremo C de la región TLR6 TM o los péptidos correspondientes al extremo C de la región TLR4 TM pudieron inhibir la secreción de TNFα por los macrófagos RAW264.7 en respuesta a la estimulación β-amiloide fibrilar (Fig. 16).

Al examinar los niveles de ARNm de expresión de diversos TLR en varios tipos de líneas celulares de cáncer de próstata, se encontró que tanto PC3 como DU145 (altamente metastásico) expresan casi todos los TLR probados, mientras que en LNCaP y 22RV1 (bajo metastásico), solo se detectaron los transcritos de ARNm TLR1, 2 y 6 (Fig. 9, datos mostrados solo para células PC3 y LNCaP).

Un ensayo de expresión de luciferasa (Luc) en células PC3 mostró que la activación con LPS (un activador de TLR4)

o LTA (activador de TLR2) dio como resultado un aumento significativo en la expresión de Luc. La adición del péptido TLR2 TM C’ humano (SEQ ID NO: 83) provocó una disminución en la expresión de Luc para la activación de LTA pero no para la activación de LPS (Fig. 10). Además, la incubación de las células con el péptido hTLR2 TM C’ (SEQ ID NO: 83), causó la inhibición en la proliferación de células PC3 (Fig. 11).

Se examinó el nivel de ARNm de expresión de las citoquinas TGFβ y VEGF en células PC3 (altamente metastásicas) y células LNCaP (poco metastásicas) tras la activación con LPS y LTA. Curiosamente, solo las células PC3 mostraron un marcado aumento en la expresión de ARNm de las citocinas tras la estimulación (Fig. 12). Además, se observó una caída en los niveles de expresión en presencia del péptido hTLR2 TM C’ (SEQ ID NO: 83) (Fig. 13).

Tomados en conjunto, los resultados de los inventores demuestran la capacidad de los péptidos basados en los dominios TM de TLR2, 1 y 6 para inhibir la activación de TLR2 tanto in vitro como in vivo, para formar heterodímeros e interactuar con los receptores nativos. Por lo tanto, constituyen candidatos fuertes para la terapia en una variedad de patologías donde se necesita la inhibición de TLR2. Los resultados de los inventores demuestran aún más la capacidad de los péptidos basados en los dominios TM de TLR4 y 6 para inhibir la activación de TLR4/6, formar heterodímeros e interactuar con los receptores naturales. Estos péptidos constituyen candidatos fuertes para la terapia de neurodegeneración causada por β -amiloide fibrilar en la enfermedad de Alzheimer.

Además, los resultados de los inventores muestran una correlación entre el nivel de expresión de matrices TLR específicos en líneas celulares de cáncer de próstata, su capacidad para secretar citocinas antiinflamatorias y su capacidad para generar metástasis. Por lo tanto, el nivel de expresión de matrices específicas de TLR en ciertas células tumorales puede usarse en el diagnóstico como marcadores de la agresividad del cáncer (es decir, la capacidad de generar metástasis).

En algunas realizaciones, el TLR es un TLR de mamífero 1, 2, 4 ó 6. En otras realizaciones, el TLR de mamífero es TLR1, TLR2, TLR4 o TLR6 humano (hTLR) o de ratón (Musculus, mTLR).

En ciertas realizaciones, el péptido sintético de la descripción comprende una secuencia que consiste en, o se encuentra dentro de la secuencia del dominio transmembrana (TM) de un TLR seleccionado de TLR 1, 2, 4 y 6, opcionalmente flanqueado por una región intracelular o extracelular, o ambas, del TLR correspondiente, donde:

(i): dicho TLR1 humano tiene un dominio transmembrana predicho de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1 o una secuencia que comprende dicho dominio transmembrana predicho y sus regiones flanqueantes citoplásmicas y extracelulares expuestas en SEQ ID NO: 2;

(ii): dicho TLR2 humano tiene un dominio transmembrana predicho de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 3 o una secuencia que comprende dicho dominio transmembrana predicho y sus regiones flanqueantes citoplásmicas y extracelulares expuestas en SEQ ID NO: 4;

(iv): dicho TLR6 humano tiene un dominio transmembrana predicho de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 5 o una secuencia que comprende dicho dominio transmembrana previsto y sus regiones flanqueantes citoplásmicas y extracelulares expuestas en SEQ ID NO: 6;

(v): dicho TLR1 de ratón tiene un dominio transmembrana predicho de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 7 o una

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secuencia que comprende dicho dominio transmembrana predicho y sus regiones flanqueantes citoplásmicas y extracelulares expuestas en SEQ ID NO: 8;

(vi) dicho TLR2 de ratón tiene un dominio transmembrana predicho de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 9 o una secuencia que comprende dicho dominio transmembrana predicho y sus regiones flanqueantes citoplásmicas y extracelulares expuestas en SEQ ID NO: 10;

(viii) dicho TLR6 de ratón tiene un dominio transmembrana predicho de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 11 o una secuencia que comprende dicho dominio transmembrana previsto y sus regiones flanqueantes citoplásmicas y extracelulares expuestas en SEQ ID NO: 12;

(ix): dicho TLR 4 de ratón tiene un dominio transmembrana predicho de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 13 o una secuencia que comprende dicho dominio transmembrana predicho y sus regiones flanqueantes citoplásmicas y extracelulares expuestas en SEQ ID NO: 14; y

(x): dicho TLR 4 humano tiene un dominio transmembrana predicho de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 15 o una secuencia que comprende dicho dominio transmembrana pronosticado y sus regiones flanqueantes citoplásmicas y extracelulares expuestas en SEQ ID NO: 16.

Los dominios de TM predichos se obtuvieron de la base de datos UniProt/swissport, pero otros dominios de TM predichos (idénticos o similares) podrían haberse calculado utilizando cualquier otro algoritmo conocido fácilmente disponible para cualquier persona experta en la técnica, tal como la red neuronal de Pasquier y Hamodrakas, 1999 (An hierarchical artificial neural network system for the classification of transmembrane proteins. Protein Eng 1999 Aug; 12 (8): 631 -4). Por lo tanto, las secuencias de dominio de TM predichas descritas son ejemplos posibles, y no deben interpretarse como limitantes de los péptidos de la presente descripción a las secuencias descritas. Por ejemplo, el dominio TM predicho usando un algoritmo diferente podría ser desplazado por unos pocos aminoácidos a lo largo de la secuencia de aminoácidos del polipéptido TLR y podría ser de una longitud diferente.

En ciertas realizaciones, el péptido sintético consiste en de 16 a 23 restos de aminoácidos encontrados dentro del dominio transmembrana predicho de 21-30 restos de aminoácidos de dicho TLR humano o de ratón. En otras realizaciones, el péptido sintético se selecciona de los péptidos de las secuencias indicadas en la SEQ ID NO: 17 a SEQ ID NO: 23.

En algunas realizaciones, el péptido sintético consiste en de 14 a 19 restos de aminoácidos, 4 a 17 de los cuales se encuentran dentro del dominio transmembrana predicho de dicho TLR humano o de ratón y de 1 a 14, preferiblemente de 3 a 9, se encuentran dentro de la región citoplásmica adyacente a dicho dominio transmembrana. En otras realizaciones, el péptido sintético se selecciona de los péptidos de las secuencias expuestas en la SEQ ID NO: 24 a SEQ ID NO: 43.

Como se usa en este documento, el término "análogo" se refiere a la deleción, adición o sustitución de uno o más restos de aminoácidos. Cuando se preparan análogos obtenidos por sustitución de restos de aminoácidos, es importante que las sustituciones se seleccionen de aquellas que cumulativamente no cambien sustancialmente el volumen, el patrón hidrófobo-hidrófilo y la carga de la porción correspondiente del péptido parental no sustituido. Por lo tanto, un resto hidrófobo puede estar sustituido con un resto hidrófilo, o viceversa, siempre que el efecto total no modifique sustancialmente el volumen, el patrón hidrofóbico-hidrófilo y la carga del correspondiente péptido parental no sustituido, es decir, mientras el motivo de unión a TLR se mantenga.

Por lo tanto, en ciertas realizaciones, el análogo peptídico sintético se obtiene a partir del péptido sintético por deleción, adición o sustitución de uno o más restos de aminoácidos, preferiblemente por sustitución de uno a cuatro restos de aminoácidos por alanina. En otras realizaciones, el análogo peptídico sintético consiste en de 14 a 35, preferiblemente 16, restos de aminoácidos, de 6 a 21, preferiblemente 8, de los cuales se encuentran dentro del dominio transmembrana predicho de un TLR humano o de ratón, y de 1 a 14, preferiblemente 8, se encuentran dentro de la región citoplásmica o extracelular de dicho dominio transmembrana, y de uno a cuatro restos de aminoácidos de la región citoplásmica están sustituidos con alanina, arginina, lisina, histidina o serina; o el análogo peptídico consiste en restos de aminoácidos, preferiblemente 18, dentro de dicho dominio transmembrana predicho, en el cual uno o dos restos de aminoácidos están sustituidos con alanina. Por lo tanto, de acuerdo con ciertas realizaciones, el péptido sintético tiene una secuencia seleccionada de las secuencias de SEQ ID NO: 44 a SEQ ID NO: 74. En todos estos péptidos sintéticos, los restos de cisteína se mutaron en alaninas para facilitar la síntesis. Este enfoque se usa comúnmente y se basa en el hecho de que los restos de cisteína dentro de los dominios TM usualmente no afectan la actividad de una proteína de membrana (Frillingos et al., 1998; He et al, 1996).

También se incluyen en el alcance de la presente descripción análogos de D, L-aminoácido. Estos análogos pueden poseer propiedades farmacológicas avanzadas tales como mejor solubilidad en agua y degradación controlada por enzimas proteolíticas.

Se debe entender que otras modificaciones de los péptidos y análogos de los mismos también se contemplan en la presente descripción. Por tanto, el péptido o análogo de la presente descripción pretende incluir un "derivado químico" del mismo que retiene al menos una porción de la función del péptido que permite su utilidad en la

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modulación de la actividad de una proteína TLR en respuesta a la activación del ligando.

Un "derivado químico" de un péptido o análogo de la presente descripción contiene restos químicos adicionales que normalmente no forman parte del péptido. Las modificaciones covalentes del péptido están incluidas dentro del alcance de esta invención. Tales modificaciones se pueden introducir en la molécula haciendo reaccionar restos de aminoácidos diana del péptido con un agente de derivación orgánico que sea capaz de reaccionar con cadenas laterales o restos terminales seleccionados. Muchos de tales derivados químicos y métodos para prepararlos son bien conocidos en la técnica.

En ciertas realizaciones, el derivado químico es un éster, amida o derivado de N-acilo del péptido sintético. El derivado N-acilo es opcionalmente un grupo acilo de un ácido carboxílico C6-C18, preferiblemente un grupo acilo de un ácido graso C6-C18 saturado o insaturado. Ejemplos de ácidos grasos incluyen, pero no están limitados a, ácido hexanoico, ácido heptanoico, ácido octanoico, ácido decanoico, ácido undecanoico, ácido dodecanoico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido transhexadecanoico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico y ácido elaidico. En ciertas realizaciones, el péptido se une covalentemente a un polímero no proteico, tal como polietilenglicol (PEG) para aumentar la estabilidad del péptido y cambiar la velocidad a la que se elimina de un sujeto después de la administración al mismo. El PEG es un polímero sustituido o no sustituido que tiene un peso molecular de aproximadamente 1000 a aproximadamente 5000 Da o más. Otros ejemplos no limitantes de dichos polímeros son poli(propilenglicol) o poli(oxialquileno).

También se incluyen en el alcance de la descripción las sales de los péptidos y análogos de la descripción. Como se usa en este documento, el término "sales" se refiere tanto a sales de grupos carboxilo como a sales de adición de ácidos de grupos amino de la molécula peptídica. Las sales de un grupo carboxilo se pueden formar por medios conocidos en la técnica e incluyen sales inorgánicas, por ejemplo, sales de sodio, calcio, amonio, hierro o cinc, y similares, y sales con bases orgánicas tales como las formadas, por ejemplo, con aminas, tales como trietanolamina, arginina o lisina, piperidina, procaína y similares. Las sales de adición de ácido incluyen, por ejemplo, sales con ácidos minerales tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o ácido sulfúrico, y sales con ácidos orgánicos, tales como, por ejemplo, ácido acético o ácido oxálico. Tales derivados químicos y sales se usan preferiblemente para modificar las propiedades farmacéuticas del péptido en lo que se refiere a la estabilidad, solubilidad, etc.

En ciertas realizaciones, los restos de aminoácidos cargados positivamente añadidos en cada uno de los extremos N y C, se seleccionan de lisina, arginina, histidina u ornitina. En otras realizaciones, se añaden uno o dos, preferiblemente dos, restos de lisina en uno o ambos extremos del péptido, preferiblemente en ambos extremos. La adición de restos de lisina en los extremos del péptido sirve para mejorar su solubilidad en fluidos fisiológicos. Por lo tanto, en las realizaciones preferidas, el péptido sintético tiene una secuencia seleccionada de: SEQ ID NO: 75 a SEQ ID NO: 122.

Los péptidos cíclicos se pueden sintetizar mediante un método de fase sólida, con o sin restos de cisteína en los extremos N y C de los péptidos. La ciclación sin cisteína se lleva a cabo protegiendo el N-terminal, activando el Cterminal, luego desprotegiendo el N-terminal y haciendo reaccionar los grupos C-y N-terminal mientras todavía están unidos a la resina. Cuando el péptido contiene restos de cisteína en los extremos N y C, después de la escisión con HF y la purificación con RP-HPLC, los péptidos se solubilizan a baja concentración en PBS (pH 7,3) y la ciclación se completa después de 12 h. Los péptidos cíclicos se purifican adicionalmente en RP-HPLC y se someten a análisis de aminoácidos para confirmar su composición, y SDS-PAGE para confirmar su estado monomérico.

En ciertas realizaciones, el péptido sintético de la presente descripción es capaz de inhibir la actividad de una proteína TLR en respuesta a la activación del ligando.

En otro aspecto, la presente descripción se refiere a una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica los péptidos sintéticos de la invención.

En otro aspecto más, la presente descripción se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un péptido sintético de acuerdo con la descripción y un vehículo farmacéuticamente aceptable. De acuerdo con ciertas realizaciones, la composición farmacéutica es para el tratamiento de una enfermedad mediada por TLR.

En otro aspecto, la presente descripción se refiere al uso del péptido sintético de la descripción, para el tratamiento de una enfermedad mediada por TLR.

En otro aspecto más, la presente descripción se refiere a un método para el tratamiento de una enfermedad mediada por TLR, que comprende administrar a un paciente que padece dicha enfermedad mediada por TLR una cantidad eficaz del péptido sintético de la invención, opcionalmente con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En algunas realizaciones, la enfermedad mediada por TLR es una inflamación aguda tal como un choque séptico o cáncer, tal como un cáncer de próstata. En otras realizaciones, la enfermedad mediada por TLR se selecciona de: síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS); inflamación aguda (por ejemplo, choque séptico, sepsis, choque endotóxico, choque hemodinámico, neuritis óptica y síndrome de sepsis); lesión por reperfusión isquémica posterior, enfermedades inflamatorias del intestino (p. ej., la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa); agudización de infecciones latentes o activas (por ejemplo, infección con VIH, citomegalovirus, herpes simple, virus de la gripe,

malaria, hepatitis crónica, candidiasis, infección por micobacterias y meningitis); insuficiencia cardíaca congestiva; enfermedades autoinmunes (por ejemplo, esclerosis múltiple, psoriasis, lupus eritematoso sistémico); enfermedad pulmonar obstructiva crónica; predisposición a infección bacteriana pulmonar; insuficiencia cardíaca congestiva con edema pulmonar; enfermedades reumatoides (por ejemplo, artritis reumatoide, espondilitis reumatoide, osteoartritis y otras afecciones artríticas); enfermedades degenerativas (por ejemplo, aterosclerosis), enfermedades neurodegenerativas (p. ej, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson); enfermedad fibrótica; caquexia; rechazo del injerto; daño por radiación; asma y cáncer tales como carcinoma gástrico, cáncer de colon, carcinoma hepatocelular, cáncer de ovario epitelial, carcinomas de células escamosas cervicales, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, melanoma y neuroblastoma.

Cualquier ruta de administración adecuada está abarcada por la invención, que incluye las vías oral, intravenosa, subcutánea, intraarticular, intramuscular, por inhalación, intranasal, intratecal, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica u otras rutas conocidas, que incluyen la ruta enteral. En realizaciones preferidas, los péptidos o análogos de la invención se administran por vía oral, intranasal o subcutánea.

Los intervalos de dosis para la administración de las composiciones de la presente invención deben ser lo suficientemente grandes para producir el efecto deseado, por lo que, por ejemplo, se regula la sobreexpresión o la sobre-activación de un TLR, y además, cuando la enfermedad se trata significativamente. Las dosis no deberían ser tan grandes como para causar efectos secundarios adversos, tales como reacciones cruzadas no deseadas, inmunosupresión generalizada, reacciones anafilácticas y similares.

La presente descripción se describirá ahora con más detalle en los siguientes ejemplos no limitantes y las figuras adjuntas.

Ejemplos

En los ejemplos a continuación, los péptidos de la descripción se presentarán por sus SEQ ID NOs. Los dominios de TM predichos se obtuvieron de la base de datos UniProt/swissport.

Lista de péptidos:

SEQ ID NO: 1 -LLIVTIVATMLVLAVTVTSLC (TLR1 humano TM predicho);

SEQ ID NO: 2 – DFHMSELSCNITLLrVTIVATMLVLAVTVTSLCIYLDLPW (regiones flanqueantes + TM-predichas -TLR1 humano);

SEQ ID NO: 3 -ALVSGMCCALFLLILLTGVLCH (TLR2 humano TM-predicho);

SEQ ID NO: 4 – DVRLSVSECHRTALVSGMCCALFLLILLTGVLCHRFHGLW (regiones flanqueantes + TM-predichas -TLR2 humano);

SEQ ID NO: 5 -LLIVTIGATMLVLAVTVTSLC (TLR6 humano TM-predicho);

SEQ ID NO: 6 – DFHMSELSCNITLLrVTIGATMLVLAVTVTSLCIYLDLPW (regiones flanqueantes + TM-predichas -TLR6 humano);

SEQ ID NO: 7 -VLLTVTIGATMLVLAVTGAFL (TLR1 de ratón TM-predicho);

SEQ ID NO: 8 – DFHMSPLSCDTVLLTVTIGATMLVLAVTGAFLCLYFDLPWYVR (regiones flanqueantes + TMpredichas -TLR1 de ratón);

SEQ ID NO: 9 -AALVSGVCCALLLLILLVGAL (TLR2 de ratón TM-predicho);

SEQ ID NO: 10 -RLQDARPSVLECHQAALVSGVCCALLLLILLVGALCHHFHGLWYLR (regiones flanqueantes + TMpredichas -TLR2 de ratón);

SEQ ID NO: 11 -VLLTITIGATMLVLAVTGAFL (TLR6 de ratón TM-predicho);

SEQ ID NO: 12 -DFHMSPLSCDTVLLTITIGATMLVLAVTGAFLCLYFDLPWYVR (regiones flanqueantes + TMpredichas -TLR6 de ratón).

SEQ ID NO: 13 TIISVSVVSVIVVSTVAFLIYHFYFHLILI (mTLR4 TM-predicho)

SEQ ID NO: 14 TIISVSVVSVIVVSTVAFLIYHFYFHLILIAGCKKYSRGESIY (regiones flanqueantes + TM-predichas -TLR4 de ratón)

SEQ ID NO: 15 TIIGVSVLSVLVVSWAVLVY (hTLR4 + TM-predicho)

SEQ ID NO: 16 SLNITCQMNKTIIGVSVLSVLVVSVYAVLVYKFYFHLMLL (regiones flanqueantes + TM-predichas -TLR4 humano)

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SEQ ID NO: 53 -XFYFXLILIAGCKKY (mTLR4 de C-term-TM predicho con X indica R, K, H o A + cito); SEQ ID NO: 54 -SADTVLLTVTACDTVLLTVT IGATMLV (mTLR6 de N-term-TM predicho donde S se sustituye por A

+ extra); SEQ ID NO: 55 -SXDTVLLTVT IGATMLV (mTLR6 de N-term-TM predicho con X indica A o S + extra); SEQ ID NO: 56 -SCDAVLLAVAIGAAMLV (mTLR6 de N-term-TM predicho con sustitución T a A + extra); SEQ ID NO: 57 -APLACDTVLLTVTIGAT (mTLR6 de N-term-TM predicho con sustitución de S a A + extra); SEQ ID NO: 58 -TVLLTVTIGATILVLAV (mTLR6 de N-term-TM predicho con sustitución de M a I + extra); SEQ ID NO: 59 -LVLAVTGAFLXLYFDLP (mTLR6 de C-term-TM predicho con X indica S o A + cito); SEQ ID NO: 60 -LVLAVTGAFLCLYFXLP (mTLR6 de C-term-TM predicho con X indica E o A + cito); SEQ ID NO: 61 -GAFLXLYFDLPWYVRML (mTLR6 de C-term-TM predicho con X indica S o A + cito); SEQ ID NO: 62 -GAFLCLYFDLPWYVRIL (mTLR6 de C-term-TM predicho con sustitución M a I + cito); SEQ ID NO: 63 -TIGATILVLAVTGAFLC (mTLR6 de C-term-TM predicho con sustitución M a I + cito); SEQ ID NO: 64 -MLVLAVTGAFLXLYFDL (mTLR6 de C-term-TM predicho con X indica S o A + cito); SEQ ID NO: 65 -MLVLAVTGAFLALYFXL (mTLR6 de C-term-TM predicho con X indica E o A + cito); SEQ ID NO: 66 -ILVLAVTGAFLALYFDL (mTLR6 de C-term-TM predicho con sustitución M a I + cito); SEQ ID NO: 67 -LVLAVTGAFLCLYFXLP (mTLR6 de C-term-TM predicho con X indica E o A + cito); SEQ ID NO: 68 -LVLAVTGAFLXLYFDLP (mTLR6 de C-term-TM predicho con X indica S o A + cito); SEQ ID NO: 69 -GAFLXLYFDLPWYVRML (mTLR6 de C-term-TM predicho con X indica S o A + cito); SEQ ID NO: 70 -GAFLCLYFXLPWYVRML (mTLR6 de C-term-TM predicho con X indica E o A + cito); SEQ ID NO: 71 -GAFLCLYFDLPWYVXML (mTLR6 de C-term-TM predicho con X indica K o A + cito); SEQ ID NO: 72 -GAFLCLYFDLPWYVRIL (mTLR6 de C-term-TM predicho con sustitución de M a I + cito); SEQ ID NO: 73 -VVSVVAVLVYKXYXHLML (hTLR4 de C-term-TM predicho y flanqueante citoplasmático donde X

representa F o A); SEQ ID NO: 74 -TIGATMLVLAVTVTALCI (hTLR6 de C-term-TM predicho con S sustituido por A); SEQ ID NO: 75-KKLLIVIVATATMLVLAVTVKK kk (N-term-TM predicho hTLRl) kk; SEQ ID NO: 76 -KKALVSGMCCALFLLILLTGKK kk (N-term-TM predicho hTLR2) kk; SEQ ID NO: 77 -KKLLTITIGATMLVLAVTGAKK kk (N-term-TM predicho mTLRl) kk; SEQ ID NO: 78 -KKALVSGVCCALLLLILLVGKK kk (N-term-TM predicho mTLR2) kk; SEQ ID NO: 79 -KKLAVTVTSLCIYLDLPWYLRKK kk (C-term-TM predicho + Cito hTLRl) kk; SEQ ID NO: 80 -KKLILLTGVLCHRFHGLWKK kk (C-term-TM predicho + Cito hTLR2) kk; SEQ ID NO: 81 -KKLAVTGAFLCLYFDLPWKK kk (C-term-TM predicho + Cito TLR1 de ratón) kk; SEQ ID NO: 82 -KKLILLVGALCHHFHGLWKK kk (C-term-TM predicho + Cito mTLR2) kk; SEQ ID NO: 83 -KKLAVTGAFLALYFDLPWKK kk (C-term-TM predicho + Cito mTLRl con sustitución de C a A) kk; SEQ ID NO: 84 -KKLAVTGAFLALYFALPWKK kk (C-term-TM predicho + Cito mTLRl con sustituciones de C a A y D

a A) kk;

SEQ ID NO: 85 -KKLAVTGAFLASYFDLPWKK kk (C-term-TM predicho + Cito mTLRl con sustituciones de C a A y L605S kk SEQ ID NO: 86 -KKLILLVGALAHHFHGLWKK kk (C-term-TM predicho + Cito mTLR2 con sustitución de C a A) kk;

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Ambos péptidos marcados mTLR1 TM C'-CtoA y mTLR1 TM N' (SEQ ID NO: 83 y SEQ ID NO: 77, respectivamente)

M-1 M-1

muestran una alta afinidad hacia liposomas de PC:colesterol con valores de Ka de 7,8x104 y 1,5x104 , respectivamente (Figs. 4A y 4B). Estos valores de Ka relativamente altos indican que los péptidos se unieron completamente a los liposomas en los experimentos de FRET.

Ejemplo 4. Los péptidos TLR2 TM pueden interactuar físicamente con la proteína TLR1 en lugar de con TLR2 o TLR4.

Para respaldar la presente hipótesis, se han realizado experimentos de coinmunoprecipitación (co-IP) para detectar interacciones de proteínas TLR con péptidos TLR TM. Este enfoque experimental utiliza una sonda fluorescente (rodamina) conjugada con el péptido TLR TM y anticuerpos específicos contra las proteínas TLR. Los lisados celulares con el péptido se incubaron con anticuerpos TLR específicos unidos a perlas de proteína G. Estos complejos fueron luego sometidos a SDS-PAGE. La presencia del péptido fluorescente se verificó mediante un escáner fluorescente y la presencia de TLR precipitados se verificó usando análisis de transferencia Western.

En 10 μΜ, tanto los péptidos mTLR2 TM N'-CtoA como mTLR2 TM C'-CtoA (SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 86, respectivamente) precipitan significativamente más con anticuerpos de TLR1 en comparación con los anticuerpos TLR2 y TLR4 (Figs. 5A-5B). Estos resultados están de acuerdo con los resultados de FRET y respaldan el modelo de los inventores que sugiere que la proteína TLR1 se asocia preferentemente con los péptidos TLR2 TM. El análisis de transferencia de Western reveló que TLR2/1 y 4 coprecipitan juntos, independientemente de la adición de los péptidos (Fig. 5B). Estos resultados refuerzan aún más la idea de que estas proteínas forman grandes complejos en la membrana plasmática y que son capaces, al menos in vitro, de interactuar entre sí.

Ejemplo 5. Los péptidos TLR2/1 TM son α-helicoidales y difieren en su capacidad para formar complejos en el entorno de tampón y lípidos.

Con el fin de obtener una mejor comprensión de la relación estructura-función de los péptidos TLR TM, se han determinado sus estructuras en una interfaz de lípidos, así como su capacidad para autoensamblarse. Usando espectroscopia de dicroísmo circular (CD) se determinaron sus estructuras en micelas de lisofosfatidilcolina (LPC). Como se puede ver en las Figs. 6A-6B, mTLR1 TM N' (SEQ ID NO: 77) así como mTLR2 TM N'-CtoA y mTLR2 TM C'-CtoA (SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 86, respectivamente) adoptan un estructura α helicoidal en micelas LPC. La señal obtenida para estos péptidos fue relativamente fuerte (Θ = ~15-20x10-3 Grados x cm2/Decimol a 208 y 222 nm) a una concentración de péptido de 10 μΜ.

mTLR1 TM C'-CtoA (SEQ ID NO: 83) no mostró señal a 10 μΜ y dio solo una débil señal α helicoidal a 50 μΜ (Fig. 6A). Esto sugiere que este péptido tiene un contenido de α hélice inferior que los otros péptidos examinados. Sin embargo, no se puede descartar la posibilidad de que la señal baja se deba a estructuras adicionales de lámina β o bajas tasas de inserción.

Además, se ha examinado la capacidad de estos péptidos para autoensamblarse en homooligómeros, ya que se ha demostrado que esta propiedad de los péptidos activos de membrana afecta a su actividad (Rosenfeld et al., 2006b, Rosenfeld et al., 2006c). Se ha probado esta característica, tanto en solución como en una interfaz de membrana. Se ha medido la emisión inicial de péptidos marcados con rodamina a 580 nm solo en solución, o en una solución que contenía LUV de PC:colesterol, y luego se siguió el aumento de la emisión a lo largo del tiempo después de la adición de proteasa K al medio. Un aumento alto y rápido en la fluorescencia a lo largo del tiempo indicó que el péptido conjugado con fluoróforo estaba en un estado oligomérico inactivado. El conocido péptido antimicrobiano oligomérico LL37 (Rosenfeld et al., 2006a) se usó como control positivo.

En la solución HEPES mTLR1 TM N' y mTLR1 TM C'-CtoA (SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 83 respectivamente), así como mTLR2 TM C'-CtoA (SEQ ID NO: 86) dieron un aumento muy lento en fluorescencia a lo largo del tiempo, sugiriendo que estos péptidos forman oligómeros en solución hasta cierto punto (Fig. 7A). Estos auto-oligómeros pueden ser disociados por tratamiento con proteasa como puede verse por su aumento relativamente lento de emisión. En contraste, mTLR2 TM N'-CtoA (SEQ ID NO: 88) reveló una muy fuerte propensión a formar agregaciones en solución, como puede revelarse por la baja tasa de emisión inicial para este péptido. Estas agregaciones no se disociaron con la adición de proteasa K a la solución (Fig. 7B, línea negra), pero se demostró que se disolvían parcialmente al agregar LUV al sistema (Fig. 7B, línea gris), sugiriendo que en un entorno lipídico, los péptidos mTLR2 TM N'-CtoA favorecen una forma monomérica.

Se vio una imagen diferente en una solución que contenía LUV. Mientras que los péptidos TLR2 TM no mostraron ningún cambio antes y después del tratamiento con proteasa, se demostró que los péptidos TLR1 TM se disocian hasta cierto punto, lo que sugiere que estos péptidos forman homooligómeros en las membranas, hasta cierto punto (Fig. 7C). Estos resultados están claramente en línea con los resultados de los inventores FRET, lo que sugiere que tanto mTLR1 TM N' como mTLR1 TM C'-CtoA pueden autoensamblarse para formar homodímeros. Como se esperaba, el control positivo de LL37 mostró una recuperación de la fluorescencia muy alta y rápida en un entorno lipídico (Fig. 7D), característico de péptidos altamente oligoméricos.

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Ejemplo 6. Los péptidos basados en el dominio TLR2 TM pueden inhibir la hiperactivación de TLR2 in vivo.

Con el fin de probar la actividad de los péptidos de los inventores in vivo, se ha utilizado un modelo murino para el choque séptico agudo causado por la hiperactivación de TLR2. Los ratones fueron inyectados i.p. con 100 μg de LTA y luego se trataron con el péptido mTLR2 TM C'-CtoA (SEQ ID NO: 86) en diferentes regímenes (véase la sección de materiales y métodos (xi)) o solo con solución salina. Como puede verse en la Fig. 8, la supervivencia de los ratones tratados con solución salina solo disminuyó al 0% dentro de las 48 horas posteriores a la inyección de LTA. En contraste, los ratones tratados con 1 ó 5 mg/kg de péptido mostraron tasas de supervivencia de 50% y 62,5%, respectivamente, hasta 14 días después de la inyección de LTA. Durante todo el experimento, los ratones tratados con el péptido no mostraron efectos adversos notables.

Ejemplo 7. Expresión específica de TLR en líneas celulares de cáncer de próstata metastásico y no metastásico.

Se determinaron los niveles de ARNm de expresión de TLR en varios tipos de líneas celulares de cáncer de próstata: PC3 y DU145 que se conocen como altamente metastásicos y 22RV1 y LNCaP que se conocen como metastásicos bajos (los datos se presentan solo para PC3 y LNCaP). De manera interesante, las células PC3 expresan todos los TLR probados (1, 2 y 6), mientras que en LNCaP, solo se detectaron las transcripciones de ARNm de TLR1, 2 y 6 (Fig. 9). Luego se probaron si estas transcripciones eran realmente funcionales en estas células. Para este fin, se utilizó un ensayo de expresión de luciferasa (Luc) que se basaba en la presencia de NFkB en el núcleo, informando así sobre el producto final de la cascada de señalización de la activación de TLR. La incubación de células PC3 en presencia de LPS (activador de TLR4) o LTA (activador de TLR2) dio como resultado un aumento significativo en la expresión de Luc (Fig. 10).

Ejemplo 8. Un péptido sintético derivado de TMD de TLR2 influye en la activación de las líneas celulares de cáncer de próstata.

Se sintetizaron los péptidos correspondientes a los dominios N-terminal o C-terminal de los dominios TM de los TLR1 humanos, 2 y 5. Cada dominio TM se dividió en dos secuencias superpuestas (Tabla 2). Se realizaron experimentos de actividad y toxicidad en un péptido correspondiente al dominio C-terminal del dominio TM del TLR2 humano, que incluye los 5 aminoácidos adyacentes del dominio intracelular putativo (SEQ ID NO: 83, hTLR2-C en la Tabla 2 a continuación, extendido con dos restos de lisina en cada uno de sus extremos para aumentar la solubilidad). El péptido no era tóxico para las líneas celulares PC3 o LNCaP a una concentración de hasta 100 μΜ (la concentración máxima probada, datos no mostrados).

Tabla 2: Denominaciones y secuencias de péptidos

SEQ ID NO: Denominación del péptido Secuencia de péptido1

24: hTLR1-C LAVTVTSLCIYLDLPWYLR

17: hTLR1-N LLIVTrVATMLVLAVTV

25: hTLR2-C LILLTGVLCHRFHGLW

18: hTLR2-N ALVSGMCCALFLLILLTG

Secuencia en negrita -dominio intracelular

El péptido hTLR2 TM C’ (SEQ ID NO: 83) se ensayó luego para determinar su capacidad para inhibir la cascada de señalización de los TLR después de su activación con LTA y LPS. Cuando se activó con LTA en presencia del péptido (20 μΜ), la expresión de Luc se inhibió en un 40% en las células PC3 (Fig. 10). De manera importante, cuando las células se activaron con LPS, el péptido no pudo inhibir la activación, señalando la especificidad de la inhibición (Fig. 10). Una posible explicación del hecho de que hay una reducción de la línea de base puede deberse a la activación de los TLR a través de la secreción de DAMP por las células de cultivo en condiciones de crecimiento normales.

Una pregunta importante es si la reducción en la activación celular inducida por el péptido mostrado en la Fig. 10 dará como resultado también una tasa reducida de crecimiento celular. De hecho, la incubación de las células con 20 μM de péptido durante 72 horas (se añadió un péptido recién disuelto cada 24 horas), provocó una inhibición del 20% en la proliferación (Fig. 11).

Ejemplo 9. Inhibición de la expresión de citoquinas ARNm por el péptido.

Una de las principales características de las células metastásicas es su capacidad para influir en su entorno debido a la secreción de diversas citocinas. Dos de las citocinas más influyentes son VEGF que induce la formación de vasos sanguíneos, y TGFβ que, p. ej., induce la tolerancia de las células inmunitarias e inhibe la apoptosis. Por lo tanto, se determinó la expresión del ARNm de estas citocinas en las células tras su activación con LPS y LTA y el

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efecto del péptido sobre la activación. Curiosamente, solo las células PC3 mostraron un marcado aumento en la expresión del ARNm de la citocina tras la estimulación (Fig. 12). Además, se observó una caída en los niveles de expresión en presencia del péptido hTLR2 TM C’ (SEQ ID NO: 83) (Fig. 13). Estos hallazgos nos llevan a la hipótesis de que la presencia de los TLR en las células PC3 contribuye a la gravedad (agresividad) del cáncer y su capacidad para formar metástasis. Por lo tanto, los péptidos TLR TM de la descripción se pueden usar como nuevos biomarcadores de diagnóstico, que pueden indicar la velocidad de crecimiento y la capacidad de las células para formar metástasis.

Ejemplo 10. Correlación entre el nivel de expresión de TLR en células de cáncer de próstata, su funcionalidad y su capacidad para generar metástasis.

El repertorio de TLR expresados en líneas celulares tanto metastásicas como no metastásicas, a nivel de proteínas, se examina por Western blot.

La funcionalidad de los diversos TLR, es decir, su capacidad para secretar citoquinas antiinflamatorias, se prueba mediante su activación mediante los ligandos correspondientes (LTA para TLR1/2/6) y se determina mediante ensayos ELISA.

Ejemplo 11. La activación de los TLR requiere su ensamblaje o heteroensamblaje (TLR1,2 y TLR6/2).

La contribución de los dominios transmembrana (TMD) de los TLRs 1, 2 y 6 al proceso de ensamblaje se examina mediante la búsqueda del ensamblaje de homodímero TMD-TMD y heterodímero en las células vivas. El sistema ToxR-TM-MalE se usa para detectar la homodimerización en bacterias vivas (Langosch et al., 1996; Gerber et al., 2001) y el sistema LexA-TM-MalE para detectar la formación de heterodímeros (Lindner et al., 2006; detalles experimentales en Korazim et al., 2006, Gerber et al., 2004 y Papo et al., 2002).

Los péptidos sintéticos (como se describe en el Ejemplo 8, Tabla 2 anterior) se injertan en los sistemas ToxR-TM-MalE y LexA-TM-MalE para identificar los motivos mínimos de dimerización, así como para identificar secuencias que compiten con el ensamblaje natural. De esta forma, se obtienen los péptidos activos más cortos.

Varios péptidos TLR TMD y sus análogos (mutantes, versión truncada y ácidos grasos conjugados) se sintetizan en base a los resultados de los sistemas ToxR y LexA. El homo y el heteroensamblaje se determinan mediante el uso de diversos métodos biofísicos (los detalles experimentales se dan en Korazim et al., 2006, Gerber et al., 2004 y Papo et al., 2002). Los péptidos se analizan en cuanto a su capacidad para interferir con la dimerización del TMD natural que se inserta dentro de los sistemas ToxR y LexA.

Ejemplo 12. La capacidad de los péptidos sintéticos para inhibir la activación de TLR inducida por sus ligandos naturales (LPS, LTA).

Se usan los péptidos que mostraron efectos significativos sobre el ensamblaje de los TMD de tipo natural en las construcciones ToxR-TM-MalE y LexA-TM-MalE (Ejemplo 11, anterior). La capacidad de los péptidos sintéticos para inhibir la activación de TLR inducida por sus ligandos naturales (LPS, LTA) se examina mediante: (i) la medición de cambios en el estado de activación de NF-κΒ (sistema de notificación inducible NF-KB); (ii) la medición de los cambios en la expresión de moléculas relacionadas pro/antiinflamatorias mediante PCR en tiempo real (RT-PCR) o análisis de microarrays (solo en unos pocos casos específicos); y (iii) después de la secreción de citocinas proinflamatorias TGF-β, IL-10, IL-8 y VEGF mediante ELISA. Los resultados se normalizan con la actividad del ligando natural de TLR (LPS, LTA) o con células no estimuladas.

Las células de cáncer de próstata examinadas incluyen líneas celulares humanas dependientes de andrógenos (AD) e independientes (AI): (i) células PC humanas CL1 (un subclón AI de LNCaP, que se generó cultivando AD LNCaP);

(ii) células de PC humano 22RV1 (subclones AI de AD CWR22): PSA+, metastásico, cepa ATCC; (iii) PC-3: AI, PSA+, metastásico, cepa ATCC; (iv) DU-145: AI, PSA-, metastásico, cepa ATCC, (v) CWR22: AD, PSA-, células primarias de cáncer de próstata; (vi) WISH-2: AI, PSA-, carcinoma de células pequeñas de la próstata.

La próstata humana normal y otras células no cancerosas incluyen: (i) CRL-1609: células epiteliales de células prostáticas humanas adultas histológicamente normales: AD, PSA+; metastásico, cepa ATCC; (ii) fibroblastos normales 3T3; (iii) fibroblastos de prepucio OL; (iv) linfocitos humanos; (v) RBC humanos.

Ejemplo 13. La actividad anticancerígena de los péptidos sintéticos in vivo.

Se generan xenoinjertos de próstata con ratones desnudos con el fin de probar la actividad anticancerígena de los péptidos sintéticos (Tabla 2) aplicándolos intratumor, IP o IV. El efecto sobre el microambiente se prueba detectando las principales citocinas y quimiocinas secretadas en esta área, así como caracterizando la población de células que entran en las proximidades del tumor, p. ej., T-regs, MDSC, etc.

Ejemplo 14. Los péptidos transmembrana derivados de TLR4 y TLR6 son capaces de hetero-dimerización.

Dado que en el caso de la enfermedad de Alzheimer, la hipótesis de trabajo es que TLR4 y TLR6 se heterodimerizan, se investigó el papel de los TTM en su activación. Los péptidos derivados de los TMD de estos

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