ES2648991T3 - Dispositivo para monitorizar la coagulación espacial de la sangre y de componentes de la misma - Google Patents
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Abstract
Dispositivo para la monitorización óptica de la coagulación espacial de la sangre y sus componentes en una muestra de un medio de prueba, comprendiendo el dispositivo: una cámara controlada termostáticamente (1) fabricada con la capacidad de regulación de temperatura, un fluido que llena la cámara (1), una cubeta (2) para contener la muestra del medio de prueba que está ubicado dentro del fluido que llena la cámara (1), al menos un medio de iluminación (8) para iluminar la muestra del medio de prueba en la cubeta, unos medios para el registro de imágenes (9) de la muestra iluminada del medio de prueba contenido en la cubeta (2), caracterizado porque el dispositivo comprende además una trampa luminosa (11) formada por la geometría de las superficies interiores de la cámara controlada termostáticamente (1), y unos medios de regulación de presión (5) conectados de manera fluida con la cámara controlada termostáticamente (1) o la cubeta (2), mediante lo cual al menos una de la cámara controlada termostáticamente (1) o la cubeta (2) se sella de manera fluida excepto por la conexión a los medios de regulación de presión (5).
Description
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DESCRIPCION
Dispositivo para monitorizar la coagulacion espacial de la sangre y de componentes de la misma Campo tecnico
La presente decision tecnica se refiere a la medicina y la biologfa y puede usarse, en particular, con fines de diagnostico e investigacion para determinar caractensticas de coagulacion de la sangre y sus componentes, asf como en biotecnolog^a y en investigacion biologica fundamental.
Antecedentes de la tecnica
Los estudios de coagulacion de la sangre y sus componentes son de gran interes practico porque no solo permiten que se diagnostiquen determinadas enfermedades sino que tambien hacen posible que se evalue la actividad de preparaciones que afectan a parametros de la coagulacion sangumea. Se conocen diversos dispositivos para determinar la velocidad de coagulacion en sangre completa y en plasma a partir de los antecedentes de la tecnica. Sin embargo, hasta ahora, estos estudios se han disenado en un sistema homogeneo con mezclado permanente. Como el volumen completo de plasma se mezcla permanentemente desde el comienzo de la prueba y hasta el final de la misma, todos los factores de coagulacion formados durante el proceso de formacion de un coagulo de plasma se distribuyen de manera homogenea en el medio de prueba, y la formacion de coagulos continua simultaneamente en el volumen completo de la muestra de prueba. Desde el punto de vista fisiologico, este proceso es diferente de manera fundamental de las condiciones de formacion de coagulos in vivo.
A partir de los antecedentes de la tecnica, se conoce un aparato para monitorizar la formacion espacial de coagulos de fibrina dada a conocer en la solicitud internacional PCT/CH2007/000543 (publicacion internacional WO 2009/055940, cl. G01N 33/49, publicada el 07/05/2009). El aparato contiene un conjunto de cubeta que consiste en una cubeta y una pieza de insercion con activador de la coagulacion inmovilizado sobre el extremo inferior de la pieza de insercion. El conjunto de cubeta se coloca en un soporte que comprende un termostato para la estabilizacion termica de la cubeta y dispositivos para fijar la cubeta en el interior del termostato. El termostato se llena con un fluido al menos parcialmente transparente. Dicho aparato permite el registro del proceso de formacion de un coagulo de fibrina que es el producto final del trabajo del sistema de coagulacion sistema sin proporcionar la posibilidad de registrar el proceso de formacion y la distribucion espacial de otros factores de coagulacion que regulan el proceso de crecimiento espacial de un coagulo de fibrina. El analogo mas proximo a la solucion dada a conocer es el dispositivo para la investigacion de caractensticas de coagulacion de la sangre y sus componentes (patente RU 2395812, cl. G01N33/49, publicada el 27/07/2010) que comprende una camara controlada termostaticamente llena de fluido y que alberga una cubeta con una muestra de prueba y una pieza de insercion con el activador de la coagulacion inmovilizado, unos medios de iluminacion para iluminar el contenido de la cubeta y el coagulo formado cerca del extremo inferior de la pieza de insercion, y una camara digital; el dispositivo se conecta con un ordenador para procesar los datos obtenidos.
Las desventajas de dicho dispositivo incluyen la formacion de burbujas de gas en las muestras de prueba y en el fluido, dentro del area de registro, durante el calentamiento de las muestras de prueba en una camara controlada termostaticamente: estas burbujas distorsionan la senal de dispersion de luz procedente del coagulo de fibrina. Ademas, el dispositivo contiene unos medios de iluminacion solo con una longitud de onda, por ejemplo, luz roja, que impide el estudio de la distribucion espaciotemporal de enzimas proteolfticas, por ejemplo, con metodos de fluorescencia, de manera simultanea al estudio de la formacion de coagulos de fibrina.
Sumario de la invencion
El resultado tecnico que puede obtenerse a traves de la realizacion de la solucion reivindicada es la potenciacion de la precision y fiabilidad del metodo en cuanto a la definicion de parametros de la coagulacion espacial de la sangre y sus componentes necesarios para diagnosticar varios trastornos sangumeos, asf como la posibilidad de determinar varios parametros adicionales que no se han estudiado previamente.
El objeto resuelto por la solucion reivindicada es excluir la influencia de las burbujas de gas dentro de la muestra de prueba y el fluido controlado termostaticamente sobre el propio procedimiento de prueba (por ejemplo, coagulacion sangumea) y sobre el procesamiento de datos registrados al tiempo que influye en la integridad de prueba y la precision de los resultados obtenidos, asf como recibir nueva informacion sobre el proceso de coagulacion y sus parametros espedficos.
El objeto se logra mediante el dispositivo definido segun la reivindicacion independiente 1 adjunta.
Realizaciones del dispositivo comprenden al menos otro medio de iluminacion.
Realizaciones del dispositivo comprenden elementos opticos, que dirigen, enfocan y proporcionan una correccion espectral de la iluminacion.
Realizaciones del dispositivo comprenden una unidad de control para sincronizar el rendimiento del al menos un
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medio de iluminacion, unos medios para el registro de imagenes y unos medios de regulacion de presion. Realizaciones del dispositivo comprenden la conexion a unos medios de procesamiento de los resultados de prueba. La figura 1 muestra una representacion esquematica del dispositivo reivindicado.
El dispositivo reivindicado contiene una camara controlada termostaticamente 1 fabricada con la capacidad de regulacion de temperatura y llena de fluido. Existe la posibilidad de proporcionar diferentes tipos de control termostatico incluyendo control termostatico con agua y aire asf como control termostatico que implica el uso de gel; por supuesto, ha de tenerse en cuenta que el medio de prueba debe seguir siendo transparente a la radiacion. Es preferible el control termostatico con agua. Durante el control termostatico, se mantiene una temperatura permanente. La cubeta 2 se coloca en el interior de dicha camara 1. La cubeta 2 puede fabricarse con al menos un canal 3. Se coloca una muestra de medio de prueba en el canal 3. Una muestra de medio de prueba puede estar representada por fluido biologico de un mairnfero (ser humano o animal), tal como plasma sangumeo, sangre completa, plasma pobre en plaquetas o plasma rico en plaquetas. Ademas, la muestra puede contener mezclas de protemas naturales, sinteticas o recombinantes purificadas y/u otras preparaciones/reactivos con actividad hemostatica. La pieza de insercion 4 con un agente aplicado en su extremo inferior y que facilita que se inicie el proceso estudiado, por ejemplo, de coagulacion, puede colocarse en dicha cubeta 2. Pueden usarse los siguientes agentes para facilitar que se inicie el proceso de coagulacion: una protema, el denominado factor tisular (tromboplastina) inmovilizado mediante diferentes medios sobre la superficie frontal de la pieza de insercion 4 o directamente sobre la superficie interior de la cubeta 2 en un lugar predefinido; asf como otros agentes orgamsmicos tales como preparaciones de celulas y tejidos. Tambien pueden usarse otros agentes trombogenicos, tales como vidrio, caolm, etc., como activador.
Una desventaja importante de los dispositivos conocidos a partir de los antecedentes de la tecnica es la distorsion de los parametros de monitorizacion provocada por la formacion de burbujas de gas en la muestra asf como en el fluido en el interior de la camara controlada termostaticamente 1 durante el calentamiento. Con el fin de eliminar la desventaja, los autores propusieron dotar el dispositivo reivindicado de unos medios 5 de regulacion y mantenimiento de presion estable durante la prueba. Con este fin, los medios 5 de regulacion de presion se conectan con la camara controlada termostaticamente 1. Los medios 5 de regulacion de presion, en un caso particular de fabricacion, pueden estar representados por una bomba de aire conectada a traves de una valvula de retorno a la parte interior (sellada a presion) de la camara controlada termostaticamente 1 y un sensor de presion que mide la presion en dicha camara 1. Basandose en las lecturas del sensor de presion, la unidad de control (no mostrada en la figura1) proporciona el control de la bomba de aire (la enciende/apaga). La bomba se conecta a la camara controlada termostaticamente 1 a traves de la lmea de presion, por ejemplo formada por tubenas en las que se integra, impidiendo la valvula de retorno la liberacion eventual de presion desde la camara controlada termostaticamente 1 a traves de la bomba de aire. La valvula puede ser pasiva mecanica o electromecanica, regulada por la unidad de control. Tras el sellado a presion de la camara controlada termostaticamente 1 y bajo el mando de la unidad de control, la bomba se enciende para comenzar la presurizacion en la camara 1; despues de alcanzar la presion seleccionada como objetivo medida por el sensor de presion, la bomba se apaga. Durante la prueba, se mantiene la presion seleccionada como objetivo encendiendo/apagando la bomba cuando la presion disminuye por debajo del nivel seleccionado como objetivo.
Mientras se mantiene la presion seleccionada como objetivo, se proporciona el sellado a presion de la camara controlada termostaticamente 1. El sellado a presion puede proporcionarse, por ejemplo, usando los medios de sellado 6 de la parte interior de la camara controlada termostaticamente 1. Los medios de sellado 6 pueden estar representados por una cubierta, una copa, un obturador, o cualquier otro medio comun. Al mismo tiempo, los medios de sellado 6 pueden ser mecanicos, cerrarse por el operario o de mando electromecanico por la unidad de control.
Ademas, la presion puede producirse directamente en la cubeta 2. Entonces, los medios 5 de regulacion de presion proporcionan un suministro de presion a la cubeta 2, y la lmea (tubenas) de presion se conectan con dicha cubeta.
Se establecio que es posible la eliminacion de burbujas cuando se mantiene una presion en exceso con respecto a la atmosferica, preferiblemente de desde 0,2 hasta 0,5 atm, durante toda la prueba.
La camara controlada termostaticamente 1 esta equipada con una ventana transparente 7 a traves de la que al menos un medio de iluminacion 8 ilumina la muestra de prueba y el coagulo formado en la misma. Pueden usarse LED o cualquier otra fuente de radiacion del rango espectral requerido (por ejemplo, lamparas con filtros opticos) como medios de iluminacion. Se capta la imagen del coagulo en crecimiento (dispersion de luz desde el coagulo) mediante los medios para el registro de imagenes 9, por ejemplo, una camara digital equipada con una lente 10. Con el fin de mejorar la calidad de la imagen registrada (correlacion senal/fondo) asf como para monitorizar parametros de coagulacion adicionales en la camara controlada termostaticamente 1, se proporciona la trampa luminosa 11. Dicha trampa luminosa 11 se usa para reducir la radiacion de fondo. La radiacion de fondo es toda la radiacion excepto la dispersada en direccion a los medios para el registro de imagenes por el coagulo o cualquier otra estructura estudiada que pueda dispersar la luz. La trampa luminosa 11 puede fabricarse de diferentes maneras, entre otros formada por una geometna espedfica de las superficies interiores de la camara controlada termostaticamente, en particular representada por un cono aplanado. Tambien puede formarse confiriendo
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caractensticas de absorcion de luz a las superficies interiores de la camara, por ejemplo, oscureciendolas y haciendo que sean algo rugosas. La geometna y las caractensticas opticas de la trampa luminosa 11 se determinaron de modo que proporcionasen una nueva reflexion y absorcion repetidas de la radiacion de fondo.
A su vez, los medios para el registro de imagenes 9 se conectan electricamente y de manera informativa con los medios 13 de procesamiento de los resultados de prueba, por ejemplo, un ordenador. Los medios de iluminacion y los medios para el registro de imagenes se fabrican con la posibilidad de regulacion por la unidad de control (no mostrada en la figura 1).
La aparicion de sustratos cromogenicos, y mas tarde fluorogenicos, permitio la obtencion de nueva informacion sobre los principios de funcionamiento del sistema de coagulacion. Cuando se anade dicho sustrato a la muestra de prueba que contiene una enzima proteolftica, esta ultima escinde una marca de senal del sustrato. La marca puede o bien cambiar la densidad optica de la muestra de prueba (sustrato colorante) o bien fluorescer cuando se ilumina (sustrato fluorogenico). Es posible determinar la distribucion espacial de la enzima proteolftica correspondiente basandose en la distribucion espacial de la marca de senal usando las ecuaciones de tipo reaccion-difusion- conveccion.
Cuando se usan sustratos fluorogenicos, el dispositivo reivindicado esta dotado de al menos un medio de iluminacion 12 adicional que ilumina la muestra del medio de prueba en determinados instantes de tiempo con la radiacion de excitacion con el fin de excitar la fluorescencia de la marca. Los medios de iluminacion 12 proporcionan un suministro de radiacion, preferiblemente en perpendicular a la pared de la cubeta 2 a traves de elementos opticos que dirigen, enfocan y proporcionan una correccion espectral de la iluminacion, por ejemplo, usando el espejo asf como los filtros de emision 15 y de excitacion 16, a traves de la ventana 7 en la camara controlada termostaticamente 1. Se usan fuentes de radiacion UV, como LED de espectro UV, como medios de iluminacion 12. El filtro de excitacion proporciona la separacion del espectro de fluorescencia de la marca del espectro de los medios de iluminacion 12.
El dispositivo funciona de la siguiente manera. Se establece la temperatura en la camara controlada termostaticamente 1 y se mantiene a un nivel fijo, y la cubeta 2 colocada en el interior de la misma se calienta de manera uniforme. Antes de la prueba, se coloca una muestra, por ejemplo plasma, en la cubeta 2. Cuando se ha llegado a la misma temperatura dentro del volumen completo de la muestra, y se han detenido las corrientes de conveccion en la misma, se coloca la pieza de insercion 4 en el interior de la cubeta de modo que se ponga el agente trombogenico aplicado en el extremo de dicha pieza de insercion 4 en contacto con la muestra y se inicie el proceso de coagulacion estudiado. La camara controlada termostaticamente 1 se cierra con los medios de presurizacion 6, y se crea una presion en exceso en la camara usando los medios 5 de regulacion de presion. Durante el estudio, la trampa luminosa 11 proporciona una absorcion eficiente de la radiacion que pasa detras del plano de la cubeta 2 debido a la geometna y el comportamiento de superficie de la misma que proporcionan una nueva reflexion y absorcion repetidas de la radiacion de fondo de modo que la radiacion reflejada no retrocede al area de registro de la cubeta 2 ni a la abertura de entrada de la lente 10. Se suministran las imagenes del coagulo que crece en el interior de la cubeta 2 a traves de la ventana transparente 7 y la lente 10 a los medios para el registro de imagenes 9. Despues de eso, se suministran imagenes digitalizadas a la memoria de los medios 13 para el procesamiento digital adicional de los resultados.
Si, por ejemplo, se anaden sustratos fluorogenicos a la muestra de prueba, esta ultima se ilumina en determinados instantes por los medios de iluminacion 12 para excitar la fluorescencia de la marca, y se registra la distribucion espacial de fluorescencia de la marca en la muestra por los medios para el registro de imagenes 9. Software desarrollado especialmente permite que la unidad de control de los medios de iluminacion y los medios para el registro de imagenes enciendan los medios de iluminacion 8 y/o 12 solo durante un tiempo corto cuando se realiza el registro. Tal regimen de funcionamiento de los medios de iluminacion reduce el efecto de fotodecoloracion de la marca del sustrato. De manera simultanea a la iluminacion de la marca del sustrato, la muestra de medio de prueba se ilumina por los medios de iluminacion 8 para registrar parametros opticos de la muestra de prueba seleccionados del grupo que consiste en: la distribucion espacial de la dispersion de luz, la distribucion espacial de la transmision de luz dentro de la muestra, o una combinacion de las mismas. De ese modo, se registra la distribucion espacial de los parametros de coagulacion sangumea, en particular, la distribucion espacial de fibrina. Ha de observarse que la longitud de onda de iluminacion se selecciona segun el espectro de excitacion de la marca en el que caso en que se estudia la fluorescencia, o segun el espectro de dispersion de luz y la sensibilidad de los medios para el registro de imagenes en el que caso en que se estudia la dispersion de luz.
Por tanto, el dispositivo reivindicado permite un estudio mas preciso y detallado de todas las fases del proceso de coagulacion en el tiempo y el espacio, aumentando la precision y fiabilidad de las evaluaciones clrnicas de las muestras de prueba en condiciones normales y patologicas diferentes.
Claims (5)
- REIVINDICACIONES1. Dispositivo para la monitorizacion optica de la coagulacion espacial de la sangre y sus componentes en una muestra de un medio de prueba, comprendiendo el dispositivo:una camara controlada termostaticamente (1) fabricada con la capacidad de regulacion de temperatura,5 un fluido que llena la camara (1),una cubeta (2) para contener la muestra del medio de prueba que esta ubicado dentro del fluido que llena la camara (1),al menos un medio de iluminacion (8) para iluminar la muestra del medio de prueba en la cubeta,unos medios para el registro de imagenes (9) de la muestra iluminada del medio de prueba contenido en la 10 cubeta (2),caracterizado porque el dispositivo comprende ademasuna trampa luminosa (11) formada por la geometna de las superficies interiores de la camara controlada termostaticamente (1),y unos medios de regulacion de presion (5) conectados de manera fluida con la camara controlada 15 termostaticamente (1) o la cubeta (2),mediante lo cual al menos una de la camara controlada termostaticamente (1) o la cubeta (2) se sella de manera fluida excepto por la conexion a los medios de regulacion de presion (5).
- 2. Dispositivo segun la reivindicacion 1, que comprende al menos otro medio de iluminacion (12).
- 3. Dispositivo segun la reivindicacion 1, que comprende ademas elementos opticos (14, 15, 16), que dirigen,20 enfocan y proporcionan una correccion espectral de la iluminacion.
- 4. Dispositivo segun la reivindicacion 1, que comprende ademas una unidad de control para sincronizar el rendimiento del al menos un medio de iluminacion (8), los medios para el registro de imagenes (9) y los medios de regulacion de presion (5).
- 5. Dispositivo segun la reivindicacion 1, conectado ademas a unos medios (13) de procesamiento de los25 resultados de prueba.
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