ES2651352T3 - Método y dispositivo para separación y eliminación de ciertas proteínas y partículas utilizando electroforesis - Google Patents
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Abstract
Un método para separar un analito que va a ser separado de una composición de analitos por enfoque isoeléctrico de flujo libre que comprende: formar con una cámara de electroforesis de flujo libre (FFE) un perfil de función de pH entre un ánodo y un cátodo, que comprende una meseta de separación por pH cuyo pH promedio corresponde esencialmente al punto isoeléctrico (pI) de un analito que va a ser separado y que tiene un rango de pH delimitado por un límite de pH superior y un límite de pH inferior; una función de pH entre el ánodo y la meseta de separación por pH que tiene un promedio inferior al pH de la meseta de separación por pH o una conductividad eléctrica mayor que la meseta de separación por pH, o tanto un pH promedio inferior como una conductividad eléctrica superior que la meseta de separación por pH; y una función de pH entre el cátodo y la meseta de separación por pH que tiene un pH promedio mayor que el pH de la meseta de separación por pH o una conductividad eléctrica superior a la de la meseta de separación por pH, o tanto un pH promedio superior y una mayor conductividad eléctrica superior que la meseta de separación por pH; en el que la meseta de separación por pH y los perfiles de función de pH entre el cátodo y el ánodo son formados por sistemas reguladores respectivos; introducir una muestra que comprende un analito que tiene un pI definido para ser separado de una muestra de analitos en la cámara de FFE en el que la muestra puede ser introducida en la meseta de separación por pH, en una zona en el lado anódico o en una zona en el lado catódico de dicha meseta de separación por pH; y eluir los analitos de la cámara de FFE, y opcionalmente recuperar todos o una porción de los analitos en una o una pluralidad de fracciones; opcionalmente en el que el método comprende adicionalmente identificar el pI de un analito que va a ser separado de una composición de analitos antes de la separación electroforética en el caso de que el pI de dicho analito no sea conocido.
Description
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condiciones de desnaturalización. La invención puede ser utilizada, por ejemplo, para mejorar el descubrimiento de biomarcadores, especialmente para proteínas o analitos que son ya difíciles de detectar en vista de su baja abundancia y concentración, y cuya detección es obstaculizada adicionalmente por la existencia de proteínas no marcadoras abundantes tales como albúmina. Por ejemplo, la presencia de albúmina en muchos extractos celulares frecuentemente hace que la detección de las proteínas que están presentes en baja concentración y abundancia sea difícil o casi imposible.
En tales aplicaciones, la invención presente puede ser utilizada para separar/aislar selectivamente proteínas de alta abundancia, permitiendo por lo tanto el análisis de las proteínas no eliminadas en su estado natural que históricamente han sido enmascaradas por proteínas de alta abundancia cuando se analizan, por ejemplo, por geles de gradiente de pH inmovilizados (IPG), SDS-PAGE1D o 2D.
Los métodos, dispositivos y composiciones/kits de acuerdo con los aspectos de la presente invención incluyen al menos una o más de las siguientes ventajas principales sobre otros métodos conocidos en la técnica:
- (i)
- recuperación más alta de la muestra de compuestos de interés directamente en solución;
- (ii)
- un nivel más alto de resolución de las separaciones;
(iii) un rango dinámico incrementado de proteínas detectadas;
- (iv)
- rata de separación de alta resolución más rápida debido a que las moléculas cargadas migran en solución en vez de hacerlo a través de materiales más densos tales como geles;
- (v)
- un enriquecimiento incrementado de proteínas de baja abundancia;
- (vi)
- ninguna o limitada pérdida de muestra;
(vii) uso repetido del dispositivo de separación;
(viii) una reducción de enlace no específico de analitos a proteínas de alta abundancia;
- (ix)
- una mayor flexibilidad y aplicabilidad a una variedad de diferentes analitos; y
- (x)
- compatibilidad directa con técnicas analíticas corriente abajo, incluyendo pero no limitándose a electroforesis en gel (tales como PAGE 1 D o 2D), espectroscopía de masas (MS) (tales como ESI, MALDI o SELDI), LC-MS(/MS), MALDI-ToF-MS(/MS), quimioluminiscencia, HPLC, secuenciación de Edman, espectroscopía de RMN, difracción de rayos x, secuenciación de ácidos nucleicos, electroprecipitación, secuenciación de aminoácidos, citometría de flujo, dicroísmo circular y combinaciones de los mismos.
La presente invención provee métodos, dispositivos (aparatos), y composiciones para eliminar toda o una porción de cierta proteína con el fin de permitir un mejor acceso a proteínas o analitos de baja abundancia en una muestra de espécimen. En ciertas realizaciones de la invención, la albúmina es la proteína seleccionada para ser eliminada o excluida del análisis con el fin de medir o identificar mejor proteínas de abundancia más baja.
Cuando se retiran o eliminan proteínas de alta abundancia, la concentración relativa de las otras proteínas se incrementa. Esto puede ser evidente como se presenta en las imágenes similares a gel, y como electroferogramas para cada muestra en un formato tabular.
Los analitos típicos que pueden ser separados bien sea como analitos que van a ser eliminados o analitos no eliminados, por un método y un dispositivo de FFE de acuerdo con realizaciones de la presente invención incluyen moléculas inorgánicas y orgánicas, y preferiblemente biopartículas, biopolímeros, biomoléculas, incluyendo biomarcadores tales como proteínas, agregados de proteínas, péptidos, complejos ADN-proteína, ADN, membranas, fragmentos de membrana, lípidos, sacáridos, polisacáridos, hormonas, liposomas, células, organelos celulares, virus, partículas de virus, anticuerpos, cromatina, y similares. Moléculas inorgánicas u orgánicas que pueden ser separadas de acuerdo con ciertas realizaciones de la invención son polímeros y partículas modificadas en su carga de superficie tales como resinas de melamina, partículas de pintura de látex, poliestirenos, polimetilmetacrilatos, dextranos, derivados de celulosa, poliácidos, fármacos ilícitos, explosivos, toxinas, agentes farmacéuticos, cancerígenos, venenos, alérgenos, agentes infecciosos y similares.
Tal como se utiliza aquí, "biomarcador" se refiere a compuestos de origen natural o sintéticos, los cuales son un marcador de un estado de enfermedad o de un proceso normal o patológico que ocurre en un organismo (por ejemplo, metabolismo de un fármaco).
El término "proteína", tal como se utiliza aquí, significa cualquier proteína, que incluye, pero no se limita a péptidos, enzimas, glicoproteínas, hormonas, receptores, antígenos, anticuerpos, factores de crecimiento, etc., sin limitación,
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