ES2651745T3 - Conjugados de amatoxina - Google Patents

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ES2651745T3 ES11763857.7T ES11763857T ES2651745T3 ES 2651745 T3 ES2651745 T3 ES 2651745T3 ES 11763857 T ES11763857 T ES 11763857T ES 2651745 T3 ES2651745 T3 ES 2651745T3
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Abstract

Un conjugado que comprende un resto de unión a diana unido por medio de un conector L a una amatoxina, en el que el conector L está conectado a la amatoxina por medio de (i) el átomo Υ C del aminoácido 1 de la amatoxina, en particular por medio de un enlace amida; (ii) un átomo de oxígeno unido al átomo δ C del aminoácido 3 de la amatoxina, en particular por medio de un enlace éster, un enlace éter o un enlace uretano; o (iii) el átomo 6' C del aminoácido 4 de la amatoxina, en particular por medio de un átomo de oxígeno unido al átomo 6' C del aminoácido 4 de la amatoxina; en cada caso en el que el conector L está conectado al resto de unión a diana por medio de un resto de urea.

Description

DESCRIPCION
Conjugados de amatoxina Campo de la invencion
La invencion se refiere a terapia tumoral. En un aspecto, la presente invencion se refiere a conjugados de una 5 amatoxina y un resto de union a diana, por ejemplo un anticuerpo, conectados a traves de un conector que comprende un resto de urea, que son utiles en el tratamiento del cancer. En un aspecto mas la invencion se refiere a composiciones farmaceuticas que comprenden los conjugados de este tipo.
Antecedentes de la invencion
Las amatoxinas son peptidos clclicos formados por 8 aminoacidos. Se pueden aislar a partir de hongos Amanita 10 phalloides o se pueden preparar de forma sintetica. Las amatoxinas inhiben de forma especlfica la ARN polimerasa II dependiente de ADN de celulas de mamlfero, y por lo tanto tambien la transcripcion y bioslntesis de protelnas de las celulas afectadas. La inhibicion de la transcripcion en una celula produce la parada del crecimiento y la proliferacion. Aunque no esta unido de forma covalente, el complejo entre amanitina y ARN polimerasa II es muy fuerte (Kd = 3 nM). La disociacion de la amanitina de la enzima es un proceso muy lento, haciendo improbable la 15 recuperacion de una celula afectada. Cuando la inhibicion de la transcripcion dura demasiado tiempo, la celula sufrira muerte celular programada (apoptosis).
El uso de amatoxinas tales como restos citotoxicos para terapia tumoral ya se habla explorado en 1981 mediante el acoplamiento de un anticuerpo anti-Thy 1.2 a a-amanitina usando un conector unido al anillo de indol del Trp (aminoacido 4; vease la Figura 1) por medio de diazotacion (Davis y Preston, Science 1981, 213, 1385-1388).
20 La solicitud de patente EP 1 859 811 A1 (publicada el 28 de noviembre de 2007) describio conjugados, en los que el atomo y C del aminoacido 1 de la amatoxina de la p-amanitina se acoplaba directamente, es decir, sin una estructura conectora, a albumina o a los anticuerpos monoclonales HEA125, OKT3, o PA-1. Ademas, se mostro el efecto inhibidor de estos conjugados en la proliferacion de celulas de cancer de mama (MCF-7), celulas de linfoma de Burkitt (Raji), y celulas de linfoma T (Jurkat). Se sugirio el uso de conectores, incluyendo conectores que 25 comprenden elementos tales como restos de amida, ester, eter, tioeter, disulfuro, urea, tiourea, hidrocarburo y similares, pero las construcciones de ese tipo realmente no se mostraban, y no se proporcionaban mas detalles, tales como sitios de union a las Amatoxinas. El documento de patente WO 2007/121326 A2 desvela un conjugado que comprende un oligonucleotido que forma estructuras triplex (TFO) esta unido mediante enlace covalente al atomo gamma-C de la beta-amanitina por medio de un enlace que contiene amida.
30 Se sabe que las amatoxinas son relativamente no toxicas cuando se acoplan a vehlculos de biomoleculas grandes, tales como moleculas de anticuerpo, y que ejercen su actividad cito toxica solamente despues de que el vehlculo de la biomolecula se haya escindido. En vista de la toxicidad de las amatoxinas, en particular para las celulas hepaticas, es de maxima importancia que los conjugados de amatoxina para terapia tumoral dirigida permanezcan altamente estables despues de su administracion en plasma, y que la liberacion de la amatoxina se produzca despues de la 35 internalizacion en las celulas diana. En este contexto, las mejoras menores de la estabilidad del conjugado pueden tener consecuencias drasticas para la ventana terapeutica y la seguridad de los conjugados de amatoxina para enfoques terapeuticos.
Objeto de la invencion
Por lo tanto, en la tecnica anterior habla una gran necesidad de conjugados de resto de union a diana y amatoxina 40 que fueran estables en plasma, de modo que se minimicen los efectos secundarios nocivos para las celulas diana.
Sumario de la invencion
En un primer aspecto la presente invencion se refiere a un conjugado que comprende un resto de union a diana unido por medio de un conector L a una amatoxina, en el que el conector L esta conectado a la amatoxina por medio de
45 (i) el atomo y C del aminoacido 1 de la amatoxina, en particular por medio de un enlace amida;
(ii) un atomo de oxlgeno unido al atomo 5 C del aminoacido 3 de la amatoxina, en particular por medio de un enlace ester, un enlace eter o un enlace uretano; o
(iii) el atomo 6' C del aminoacido 4 de la amatoxina, en particular por medio de un atomo de oxlgeno unido al atomo 6' C del aminoacido 4 de la amatoxina;
50 en cada caso en el que el conector L esta conectado al resto de union a diana por medio de un resto de urea.
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En un segundo aspecto la presente invention se refiere a una composition farmaceutica que comprende el conjugado de acuerdo con la presente invencion.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a una molecula de conjugation a amatoxina que comprende un conector L conectado a una amatoxina por medio de
(i) el atomo y C del aminoacido 1 de la amatoxina, en particular por medio de un enlace amida;
(ii) un atomo de oxlgeno unido al atomo 5 C del aminoacido 3 de la amatoxina, en particular por medio de un enlace ester, un enlace eter o un enlace uretano; o
(iii) el atomo 6' C del aminoacido 4 de la amatoxina, en particular por medio de un atomo de oxlgeno unido al atomo 6' C del aminoacido 4 de la amatoxina;
en cada caso en el que el conector L comprende un derivado del acido carbamico -NH-C(O)-X, en el que X es un grupo saliente que se puede sustituir con una amina primaria de un resto de union a diana.
En otro aspecto mas, la presente invencion se refiere a un metodo para sintetizar un conjugado de la presente invencion, que comprende la etapa de hacer reaccionar una molecula de conjugacion a amatoxina de la presente invencion con un resto de union a diana que comprende un grupo amino primario.
Breve descripcion de las figuras
La Fig. 1 muestra las formulas estructurales de diferentes amatoxinas. Los numeros en tipo negrita (1 a 8) designan la numeration convencional de los ocho aminoacidos que forman la amatoxina. Tambien se muestran las denominaciones convencionales de los atomos en los aminoacidos 1, 3 y 4 (letras griegas a a y, letras griegas a a 5, y numeros de 1' a 7', respectivamente).
La Fig. 2 muestra la actividad citotoxica de diferentes conjugados de amanitina y herceptin usando diferentes restos de conector en celulas SKOV-3 en un ensayo de BrdU despues de incubation durante 72 h.
La Fig. 3 muestra la actividad citotoxica de diferentes conjugados de amanitina y herceptin usando diferentes restos de conector en celulas SK-BR-3 en un ensayo de BrdU despues de incubacion durante 72 h.
La Fig. 4 muestra la actividad citotoxica de diferentes conjugados de amanitina y herceptin usando diferentes restos de conector en celulas NCI-N87 en un ensayo de BrdU despues de incubacion durante 72 h.
La Fig. 5 muestra la actividad citotoxica de diferentes conjugados de amanitina y herceptin usando diferentes restos de conector en celulas MDA-MB231 en un ensayo de BrdU despues de incubacion durante 72 h.
La Fig. 6 y la Fig. 7 muestran la cantidad de amanitina liberada a partir de diferentes conjugados de amanitina y herceptin usando diferentes restos de conector despues de incubacion en plasma hasta 14 dlas.
La Fig. 8 muestra una comparacion de la actividad citotoxica de diferentes conjugados de amanitina y herceptin usando diferentes restos de conector en celulas SKOV-3 en un ensayo de BrdU antes y despues de incubacion en plasma.
La Fig. 9 muestra una comparacion de la actividad de dos conjugados diferentes de amanitina y herceptin usando diferentes restos de conector in vivo en un modelo de xenoinjerto de SKOV-3.
Descripcion detallada de la invencion
A menos que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientlficos usados en el presente documento tienen los mismos significados tal como normalmente lo entiende alguien con una experiencia habitual en la materia.
Preferentemente, los terminos usados en el presente documento se definen como se describe en "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. y Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basilea, Suiza).
A traves de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen a continuation, a menos que el contexto lo requiera de otro modo, se entendera que el termino "comprender", y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", implica la inclusion de un numero entero o etapa o grupo de numeros enteros o etapas indicados pero no la exclusion de ningun numero entero o etapa o grupo de numeros enteros o etapas.
A traves del texto de la presente memoria descriptiva se mencionan varios documentos.
La presente invencion se describira a continuacion con mas detalle. En los parrafos que siguen a continuacion se definen diferentes aspectos de la invencion con mas detalle. Cada aspecto definido de ese modo se puede combinar con otro aspecto o aspectos a menos que se indique claramente de otro modo. En particular, cualquier caracterlstica indicada como preferente o ventajosa se puede combinar con cualquier otra caracterlstica o caracterlsticas indicadas como preferentes o ventajosas.
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En un primer aspecto la presente invencion se refiere a un conjugado que comprende un resto de union a diana unido por medio de un conector L a una amatoxina, en el que el conector L esta conectado a la amatoxina por medio de
(iv) el atomo y C del aminoacido 1 de la amatoxina, en particular por medio de un enlace amida;
(v) un atomo de oxlgeno unido al atomo 5 C del aminoacido 3 de la amatoxina, en particular por medio de un
enlace ester, un enlace eter o un enlace uretano; o
(vi) el atomo 6' C del aminoacido 4 de la amatoxina, en particular por medio de un atomo de oxlgeno unido al
atomo 6' C del aminoacido 4 de la amatoxina;
en cada caso en el que el conector L esta conectado al resto de union a diana por medio de un resto de urea.
En el contexto la presente invencion, el termino "conjugado" se refiere a una molecula que comprende al menos dos moleculas diferentes unidas mediante un enlace covalente.
La expresion "resto de union a diana", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molecula o parte de una molecula que se pueda unir de forma especlfica a una molecula diana o epltopo diana. Los restos de union a diana preferentes en el contexto de la presente solicitud son (i) anticuerpos o fragmentos de union a antlgeno de los mismos; (ii) protelnas similares a anticuerpo; y (iii) aptameros de acido nucleico. Los "restos de union a diana" adecuados para su uso en la presente invencion por lo general tienen una masa molecular de 40 000 Da (40 kDa) o superior.
Como se usa en el presente documento, se considera que un primer compuesto (por ejemplo, un anticuerpo) se "une de forma especlfica" a un segundo compuesto (por ejemplo, un antlgeno, como una protelna diana), si este tiene una constante de disociacion Kd con respecto a dicho compuesto de 100 pM o inferior, preferentemente 50 pM o inferior, preferentemente 30 pM o inferior, preferentemente 20 pM o inferior, preferentemente 10 pM o inferior, preferentemente 5 pM o inferior, mas preferentemente 1 pM o inferior, mas preferentemente 900 nM o inferior, mas preferentemente 800 nM o inferior, mas preferentemente 700 nM o inferior, mas preferentemente 600 nM o inferior, mas preferentemente 500 nM o inferior, mas preferentemente 400 nM o inferior, mas preferentemente 300 nM o inferior, mas preferentemente 200 nM o inferior, incluso mas preferentemente 100 nM o inferior, incluso mas preferentemente 90 nM o inferior, incluso mas preferentemente 80 nM o inferior, incluso mas preferentemente 70 nM o inferior, incluso mas preferentemente 60 nM o inferior, incluso mas preferentemente 50 nM o inferior, incluso mas preferentemente 40 nM o inferior, incluso mas preferentemente 30 nM o inferior, incluso mas preferentemente 20 nM o inferior, e incluso mas preferentemente 10 nM o inferior.
En el contexto de la presente solicitud las expresiones "molecula diana" y "epltopo diana", respectivamente, se refieren a un antlgeno y a un epltopo de un antlgeno, respectivamente, que se unen de forma especlfica mediante un resto de union a diana. Preferentemente la molecula diana es un antlgeno asociado a tumor, en particular un antlgeno o un epltopo que esta presente en la superficie de uno o mas tipos de celulas tumorales en una concentracion creciente y/o en una configuracion esterica diferente en comparacion con la superficie de celulas no tumorales. Preferentemente, dicho antlgeno o epltopo esta presente en la superficie de uno o mas tipos de celulas tumorales, pero no en la superficie de celulas no tumorales. En realizaciones en particular, el resto de union a diana se une de forma especlfica a un epltopo de HER-2/neu o molecula de adhesion de celulas epiteliales (EpCAM). En otras realizaciones, dicho antlgeno o epltopo se expresa preferentemente en celulas implicadas en enfermedades autoinmunes. En las realizaciones de este tipo en particular, el resto de union a diana se une de forma especlfica a un epltopo del receptor IL-6 (IL-6R).
La expresion "anticuerpo o fragmento de union a antlgeno del mismo", como se usa en el presente documento, se refiere a moleculas de inmunoglobulina y partes inmunologicamente activas de moleculas de inmunoglobulina, es decir, moleculas que contienen sitios de union a antlgeno que se unen de forma inmunoespeclfica a un antlgeno. Tambien estan comprendidas protelnas similares a la inmunoglobulina que seleccionan a traves de cllnicas que incluye, por ejemplo, presentacion de fagos para unirse de forma especlfica a una molecula diana, por ejemplo, a la protelna diana Her-2/neu o EpCAM. Las moleculas de inmunoglobulina de la invencion pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molecula de inmunoglobulina. Los "anticuerpos y fragmentos de union a antlgeno de los mismos adecuados para su uso en la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales, monoclonales, monovalentes, biespeclficos, heteroconjugados, multiespeclficos, humanos, humanizados (en particular injertado son CDR), des- inmunizados, o quimericos, anticuerpos de una sola cadena (por ejemplo, scFv), fragmentos de Fab, fragmentos de F(ab')2, fragmentos producidos con una biblioteca de expresion de Fab, diacuerpos o tetracuerpos (Holliger P. et al., 1993), nanocuerpos, anticuerpos anti-idiotlpicos (anti-Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-Id para anticuerpos de la invencion), y anticuerpos de union a epltopo de cualquiera de los mencionados anteriormente.
En algunas realizaciones los fragmentos de union a antlgeno son fragmentos de anticuerpo de union antlgeno humanos de la presente invencion e incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, los Fv de una sola
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cadena (scFv), anticuerpos de una sola cadena, Fv unidos por enlaces disulfuro (dsFv) y fragmentos que comprende en cualquiera de un dominio VL o VH. Los fragmentos de anticuerpo de union a antlgeno, incluyendo anticuerpos de una sola cadena, pueden comprender el dominio o dominios variables solos o en combinacion con la totalidad o una parte de los siguientes: region bisagra, dominios CL, CH1, CH2, y CH3. En la invencion tal vez estan incluidos los fragmentos de union a antlgeno que tambien comprenden cualquier combinacion de dominio o dominios variables con una region bisagra, dominios CL, CH1, CH2, y CH3.
Los anticuerpos que se pueden usar en la invencion pueden ser de cualquier origen animal incluyendo aves y mamlferos. Preferentemente, los anticuerpos son de origen humano, roedor (por ejemplo, raton, rata, cobaya, o conejo), pollo, cerdo, oveja, cabra, camello, vaca, caballo, burro, gato o perro. En particular es preferente que los anticuerpos sean de origen humano o murino. Como se usa en el presente documento, los "anticuerpos humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoacidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulina humana o de animales transgenicos para una o mas inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endogenas, como se describe por ejemplo en el documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.939.598 de Kucherlapati di Jakobovits.
La expresion "protelna similar a anticuerpo" se refiere a una protelna que se ha modificado mediante ingenierla (por ejemplo, mediante mutagenesis de bucles) para unirse de forma especlfica a una molecula diana. Por lo general, una protelna similar a anticuerpo de este tipo comprende al menos un bucle de Peptido variable unido a ambos extremos de un armazon de protelna. Esta doble limitacion estructural aumenta en gran medida la afinidad de union de la protelna similar a anticuerpo hasta niveles comparables con los de un anticuerpo. La longitud del bucle de peptido variable por lo general consta de 10 a 20 aminoacidos. La protelna de armazon puede ser cualquier protelna que tenga buenas propiedades de solubilidad. Preferentemente, la protelna de armazon es una protelna globular pequena. Las protelnas similares anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, aficuerpos, anticalinas, y protelnas de repeticion de anquirina disenadas (para una revision vease: Binz et al. 2005). Las protelnas similares a anticuerpos se pueden obtener a partir de bibliotecas de mutantes grandes, por ejemplo se pueden seleccionar a partir de bibliotecas de presentacion de fagos grandes y se pueden aislar por analogla a la anticuerpos regulares. Ademas, las protelnas de union similares a anticuerpos se pueden obtener mediante mutagenesis combinatoria de restos con la superficie expuesta en protelnas globulares.
La expresion "aptamero de acido nucleico" se refiere a una molecula de acido nucleico que se ha modificado mediante ingenierla a traves de rondas repetidas de seleccion in vitro o SELEX (evolucion sistematica de ligandos mediante enriquecimiento exponencial) para unirse a una molecula diana (para una revision vease: Brody y Gold, 2000). El aptamero de acido nucleico puede ser una molecula de ADN o ARN. Los aptameros pueden contener modificaciones, por ejemplo nucleotidos modificados tales como pirimidinas sustituidas con 2'-fluor.
Como se usa en el presente documento, un "derivado qulmico" (o abreviado: un "derivado") de un compuesto se refiere a una especie que tiene una estructura qulmica que es similar al compuesto, que ademas contiene al menos un grupo qulmico no presente en el compuesto y/o tiene deficiencia de al menos un o que esta presente en el compuesto. El compuesto con el que se compara el derivado se conoce como compuesto "precursor". Por lo general, un "derivado" se puede producir a partir del compuesto precursor en una o mas etapas de reaccion qulmica.
Como se usa en el presente documento, un "analogo" de un compuesto esta relacionado estructuralmente, pero no es identico al compuesto y presenta al menos una actividad del compuesto. El compuesto con el que se compara el analogo se conoce como compuesto "precursor". Las actividades mencionadas anteriormente incluyen, pero no se limitan a: actividad de union a otro compuesto; actividad inhibitoria, por ejemplo actividad de inhibicion enzimatica; efectos toxicos; actividad de activacion, por ejemplo actividad de activacion enzimatica. No es necesario que el analogo presente una actividad de este tipo en la misma medida que el compuesto precursor. Un compuesto Se contempla como un analogo dentro del contexto de la presente solicitud, se presenta la actividad pertinente hasta un grado de al menos un 1 % (mas preferentemente al menos un 5 %, mas preferentemente al menos un 10 %, mas preferentemente al menos un 20 %, mas preferentemente al menos un 30 %, mas preferentemente al menos un 40 %, and mas preferentemente al menos un 50 %) de la actividad del compuesto precursor. Por lo tanto, un "analogo de una amatoxina", como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto que esta relacionado estructuralmente con uno cualquiera de a-amanitina, p-amanitina, Y-amanitina, £-amanitina, amanina, amaninamida, amanulina, y acido amanullnico como se muestra en la Fig. 1 y que presenta al menos un 1 % (mas preferentemente al menos un 5 %, mas preferentemente al menos un 10 %, mas preferentemente al menos un 20 %, mas preferentemente al menos un 30 %, mas preferentemente al menos un 40 %, and mas preferentemente al menos un 50 %) de la actividad inhibitoria frente a la ARN polimerasa II de mamlfero en comparacion con al menos uno de a-amanitina, p-amanitina, Y-amanitina, £-amanitina, amanina, amaninamida, amanulina, y acido amanullnico. Un "analogo de una amatoxina" adecuado para su uso en la presente invencion puede presentar incluso una actividad inhibitoria mayor frente a la ARN polimerasa II de mamlfero que uno cualquiera de a-amanitina, p-amanitina, Y-amanitina, £-amanitina, amanina, amaninamida, amanulina, o acido amanullnico. La actividad inhibitoria se podrla medir mediante la determinacion de la concentracion a la que se produce un 50 % de inhibicion (valor de CI50). La actividad inhibitoria frente a la ARN polimerasa II de mamlfero se puede determinar indirectamente midiendo la actividad inhibitoria sobre la proliferacion celular. Un ensayo adecuado para medir la
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inhibicion de la proliferation celular se describe en los ejemplos.
Un "analogo semisintetico" se refiere a un analogo que se ha obtenido mediante slntesis qulmica usando compuestos de fuentes naturales (por ejemplo, materiales vegetales, cultivos bacterianos, o cultivos celulares) como material de partida. Por lo general, un "analogo semisintetico" de la presente invention se sintetizo partiendo de un compuesto aislado a partir de un hongo de la familia Amanita. Por el contrario, un "analogo sintetico" se refiere a Un analogo sintetizado mediante la denominada slntesis total a partir de componentes basicos pequenos (por lo general petroqulmicos). Normalmente, esta slntesis total se realiza sin la ayuda de procesos biologicos.
Como se usa en el presente documento, un "conjugado de aptamero" se refiere a un conjugado de resto de union a diana y toxina en el que el resto de union a diana es un aptamero de acido nucleico de acuerdo con la alternativa (iii) mencionada anteriormente.
Un "conector" en el contexto de la presente invencion se refiere a una molecula que se conecta a dos componentes, cada uno estando unido a un extremo del conector, y que aumenta la distancia entre dos componentes y alivia la interferencia esterica entre estos componentes, de modo que en el presente caso entre el resto de union a diana y la amatoxina. En ausencia de un conector, una union directa de la amatoxina al resto de union a diana puede disminuir la capacidad de la amatoxina para interactuar con la ARN polimerasa II. En realizaciones en particular, un conector obtiene una cadena continua con entre 1 y 30 atomos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 atomos) en su estructura principal, es decir la longitud del conector se define como la conexion mas corta tal como se mide mediante el numero de atomos o enlaces entre el resto de amatoxina y el resto de union a diana, en el que un lado de la estructura principal del conector ha reaccionado con la amatoxina y, el otro lado con un resto de union a diana. En el contexto de la presente invencion, un conector es preferentemente un grupo alquileno C1-20, heteroalquileno C1-20, alquenileno C2-20, heteroalquenileno C2-20, alquinileno C2-20, heteroalquinileno C2-20, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno, aralquileno, o un grupo heteroaralquileno, opcionalmente sustituido. El conector puede contener uno o mas elementos estructurales tales como restos de carboxamida, ester, eter, tioeter, disulfuro, urea, tiourea, hidrocarburo. El conector tambien puede contener combinaciones de dos o mas de estos elementos estructurales. Cada uno de estos elementos estructurales puede estar presente en el conector mas de una vez, por ejemplo dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, o seis veces. En algunas realizaciones el conector puede comprender un enlace disulfuro. Se entiende que el conector se tiene que unir ya sea en una sola etapa o en dos o mas etapas posteriores a la amatoxina y al resto de union a diana. Con este fin el conector portara dos grupos, preferentemente en un extremo proximal y distal, que puede (i) formar un enlace covalente con un grupo presente en uno de los componentes a unir, preferentemente un grupo activado en una amatoxina o el peptido de union a diana o (ii) que esta activado o se puede activar para formar un enlace covalente con un grupo en una amatoxina. Por consiguiente, es preferente que los grupos qulmicos esten en el extremo distal y proximal del conector, que son el resultado de una reaction de acoplamiento de este tipo, por ejemplo un ester, un eter, un uretano, un enlace peptldico, etc.
En el contexto de la presente invencion, el termino "amatoxina" incluye todos los peptidos clclicos formados por 8 aminoacidos tal como se alslan del genero Amanita y se describen en Wieland, T. y Faulstich H. (Wieland T, Faulstich H., CRC Crit Rev Biochem. Diciembre de 1978; 5 (3): 185-260), y ademas incluye todos los derivados qulmicos de los mismos; ademas todos los analogos semisinteticos de los mismos; ademas todos los analogos sinteticos de los mismos formados a partir de componentes basicos de acuerdo con la estructura principal de los compuestos naturales (clclicos, 8 aminoacidos), ademas todos los analogos sinteticos o semisinteticos que contienen aminoacidos no hidroxilados en lugar de los aminoacidos hidroxilados, ademas todos los analogos sinteticos o semisinteticos, en los que el resto de sulfoxido de tioeter esta sustituido por un sulfuro, sulfona, o por atomos distintos al azufre, por ejemplo un atomo de carbono al igual que en un carba-analogo de amanitina, en cada caso en el que cualquier derivado o analogo de este tipo es funcionalmente activo mediante la inhibicion de la ARN polimerasa II de mamlfero.
Funcionalmente, las amatoxinas se definen como peptidos o depsipeptidos que inhiben la ARN polimerasa II de mamlfero. Las amatoxinas preferentes son las que tienen un grupo funcional (por ejemplo, un grupo carboxllico, un grupo amino, un grupo hidroxi, un grupo tiol o un grupo de captura de tiol) que se puede hacer reaccionar con moleculas conectoras por restos de union a diana como se ha definido anteriormente. Las amatoxinas que son en particular adecuadas para los conjugados de la presente invencion son a-amanitina, p-amanitina, Y-amanitina, £- amanitina, amanina, amaninamida, amanulina, y acido amanullnico como se muestra en la Fig. 1 as! como sales, derivados qulmicos, analogos semisinteticos, y analogos sinteticos de los mismos. Las amatoxinas particularmente preferentes para su uso en la presente invencion son a-amanitina, p-amanitina, y amaninamida.
En el contexto de la presente invencion la expresion "conectado al resto de union a diana por medio de un resto de urea" se refiere a una conexion entre el conector y el resto de union a diana, en la que el resto de union a diana esta directamente unido al conector por medio de un grupo -NH-C(O)-NH-.
En realizaciones de la presente invencion en particular, el conjugado tiene una estructura seleccionada entre una de las siguientes estructuras:
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amatoxina-YC(O)-NH-L-NH-C(O)-NH-resto de union a diana; amatoxina-5C-O-C(O)-L-NH-C(O)-NH-resto de union a diana; amatoxina-5C-O-L-NH-C(O)-NH-resto de union a diana; amatoxina-5C-O-C(O)-NH-L-NH-C(O)-NH-resto de union a diana; y amatoxina-6'C-O-L-NH-C(O)-NH-resto de union a diana.
En realizaciones de la presente invencion en particular, el resto de union a diana esta conectado al conector L por medio de un grupo amino presente en el resto de union a diana, en el que dicho grupo amino forma parte de dicho resto de urea.
En realizaciones de la presente invencion en particular, la amatoxina se selecciona entre a-amanitina, p-amanitina, Y-amanitina, £-amanitina, amanina, amaninamida, amanulina, o acido amanullnico, o entre sales o analogos de los mismos.
En realizaciones de la presente invencion en particular, el conector L comprende uno o mas grupos, en particular uno, dos o tres grupos, seleccionados entre el listado de: grupo alquileno, alquenileno, alquinileno, cicloalquileno, heteroalquileno, heteroalquenileno, heteroalquinileno, heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno, aralquileno, y un grupo heteroaralquileno, en el que cada grupo opcionalmente puede estar independientemente sustituido.
El termino "alquileno" se refiere a grupos hidrocarburos saturados de cadena lineal divalentes que tienen de 1 a 20 atomos de carbono, incluyendo grupos que tienen de 1 a 10 atomos de carbono. En ciertas realizaciones, los grupos alquileno pueden ser grupos alquileno inferior. La expresion "alquileno inferior" se refiere a grupos alquileno que tienen de 1 a 6 atomos de carbono, y en ciertas realizaciones de 1 a 5 o de 1 a 4 atomos de carbono. Los ejemplos de grupos alquileno incluyen, pero no se limitan a, metileno (-CH2-), etileno (-CH2-CH2-), n-propileno, n-butileno, n- pentileno, y n-hexileno.
El termino "alquenileno" se refiere a grupos de cadena lineal divalentes que tienen de 2 a 20 atomos de carbono, en el que al menos uno de los enlaces carbono-carbono es un doble enlace, mientras que otros enlaces pueden ser enlaces sencillos o dobles enlaces adicionales. En el presente documento el termino "alquinileno" se refiere a grupos que tienen de 2 a 20 atomos de carbono, en el que al menos uno de los enlaces carbono-carbono es un triple enlace, mientras que otros enlaces pueden ser enlaces sencillos, dobles o triples enlaces adicionales. Los ejemplos de grupos alquenileno incluyen etenileno (-CH=CH-), 1-propenileno, 2-propenileno, 1-butenileno, 2-butenileno, 3- butenileno. Los ejemplos de grupos alquinileno incluyen etinileno, 1-propinileno, 2-propinileno, etc.
Como se usa en el presente documento, "cicloalquileno" pretende hacer referencia a un anillo divalente que forma parte de cualquier sistema monoclclico o policlclico estable, en el que un anillo de este tipo tiene entre 3 y 12 atomos de carbono, pero no tiene heteroatomo, y en el que un anillo de este tipo esta totalmente saturado, y el termino "cicloalquenileno" pretende hacer referencia a un anillo divalente que forma parte de cualquier sistema monoclclico o policlclico estable, en el que un anillo de este tipo tiene entre 3 y 12 atomos de carbono, pero no tiene heteroatomo, y en el que un anillo de este tipo esta al menos parcialmente insaturado (pero excluyendo cualquier anillo de arileno). Los ejemplos de cicloalquilenos incluyen, ciclopropileno, ciclobutileno, ciclopentileno, ciclohexileno, y cicloheptileno. Los ejemplos de cicloalquenilenos incluyen, pero no se limitan a, ciclopentenileno y ciclohexenileno.
Como se usa en el presente documento, los terminos "heterocicloalquileno" y "heterocicloalquenileno" pretende hacer referencia a un anillo divalente que forma parte de cualquier sistema monoclclico o policlclico estable, en el que un anillo de este tipo tiene entre 3 y aproximadamente 12 atomos, y en el que un anillo de este tipo consta de atomos de carbono y al menos un heteroatomo, en particular al menos un heteroatomo seleccionado independientemente entre el grupo que consiste en N, O y S, con heterocicloalquileno haciendo referencia a un anillo de este tipo que esta totalmente saturado, y heterocicloalquenileno haciendo referencia a un anillo que esta al menos parcialmente insaturado (pero excluyendo cualquier anillo de arileno o heteroarileno).
El termino "arileno" pretende indicar un anillo o sistema de anillos divalente que forma parte de cualquier sistema monoclclico o policlclico, en el que un anillo o sistema de anillos de este tipo tiene entre 3 y 20 atomos de carbono, pero no tiene heteroatomo, anillo o sistema de anillos que consta de un resto aromatico como se define mediante la regla de "4n+2" n electrones, incluyendo fenileno.
Como se usa en el presente documento, el termino "heteroarileno" se refiere a un anillo o sistema de anillos divalente que forma parte de cualquier sistema monoclclico o policlclico, en el que un anillo o sistema de anillos de este tipo tiene entre 3 y 20 atomos, anillo o sistema de anillos que consta de un resto aromatico como se define mediante la regla de "4n+2" n electrones y contiene atomos de carbono y uno o mas heteroatomos de nitrogeno, azufre, y/o oxlgeno.
En el contexto de la presente invencion, el termino "sustituido" pretende indicar que uno o mas hidrogenos presentes en la estructura principal de un conector esta sustituido con una seleccion del grupo o grupos indicados, con la
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condicion de que la Valencia normal indicada del atomo, o que el atomo apropiado del grupo que esta sustituido, no se supere, y que la sustitucion de como resultado un compuesto estable. La expresion "opcionalmente sustituido" pretende indicar que el conector esta sin sustituir o sustituido, como se define en el presente documento, con uno o mas sustituyentes, como se define en el presente documento. Cuando un sustituyente es un grupo ceto (u oxo, es decir =O), un grupo tio o imino y a continuacion dos hidrogenos en el atomo de la estructura principal del conector estan sustituidos. Los sustituyentes a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, aralquilo, heteroaralquilo, acilo, arollo, heteroarollo, carboxilo, alcoxi, ariloxi, aciloxi, aroiloxi, heteroaroiloxi, alcoxicarbonilo, halogeno, (tio)ester, ciano, fosforilo, amino, imino, (tio)amido, sulfhidrilo, alquiltio, aciltio, sulfonilo, un sulfato, un sulfonato, un sulfamollo, un sulfonamido, nitro, azido, haloalquilo, incluyendo perfluoroalquilo (tal como trifluorometilo), haloalcoxi, alquilsulfanilo, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, alquilsulfonilamino, arilsulfonoamino, fosforilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, alquilcarboxi, alquilcarboxiamida, oxo, hidroxi, mercapto, amino (opcionalmente mono- o di-sustituido, por ejemplo con alquilo, arilo, o heteroarilo), imino, carboxamida, carbamollo (opcionalmente mono- o di-sustituido, por ejemplo con alquilo, arilo, o heteroarilo), amidino, aminosulfonilo, acilamino, aroilamino, (tio)ureldo, (ariltio)ureldo, alquil(tio)ureldo, cicloalquil(tio)ureldo, ariloxi, aralcoxi, o -O(CH2)n-OH, -O(CH2)n-NH2, -O(CH2)nCOOH, -(CH2)nCOOH, -C(O)O(CH2)nR, -(CH2)nN(H)C(O)OR, o - N(R)S(O)2R en los que n es 1-4 y R se selecciona independientemente entre hidrogeno, -alquilo, -alquenilo,- alquinilo, -cicloalquilo, -cicloalquenilo, -(heterocicloalquilo unido a C-), -(heterocicloalquenilo unido a C-), -arilo, y - heteroarilo, siendo permitidos multiples grados de sustitucion. Las personas con experiencia en la materia entenderan que los sustituyentes, tales como heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquilo, etc., o grupos funcionales tales como -OH, -NHR etc., pueden estar sustituidos por si mismos, si fuera apropiado. Las personas con experiencia en la materia tambien entenderan que los restos excluidos por si mismos tambien se pueden sustituir cuando sea apropiado.
En realizaciones de la presente invention en particular, el conector L, en particular el conector L como se muestra en la section [0042] o en la section [0081], comprende m grupos seleccionados entre el listado de: grupo alquileno, alquenileno, alquinileno, cicloalquileno, heteroalquileno, heteroalquenileno, heteroalquinileno, heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno, aralquileno, y un grupo heteroaralquileno, en el que cada grupo opcionalmente puede estar independientemente sustituido, el conector comprende adicionalmente n restos seleccionados independientemente entre uno de los siguientes restos: un disulfuro (-S-S-), un eter (-O-), un tioeter (-S-), una amina (-NH-), un ester (-O- C(=O)- o -C(=O)-O-), una carboxamida (-NH-C(=O)- o -C(=O)-NH-), un uretano (-NH-C(=O)-O- o -O-C(=O)-NH-), y un resto de urea (-NH-C(=O)-NH-), en los que m = n+1. En realizaciones en particular, m es 2 y n es 1, o m es 3 y n es 2. En realizaciones en particular, el conector comprende 2 o 3 grupos alquileno sin sustituir, y 1 o 2, respectivamente, restos disulfuro, eter, tioeter, amina, ester, carboxamida, uretano o urea que se unen a los grupos alquileno sin sustituir.
En realizaciones en particular, el conector L, en particular el conector L como se muestra en la seccion [0042], es una cadena lineal de entre 2 y 20 atomos seleccionados independientemente entre C, O, N y S, en particular entre 2 y 16 atomos, mas en particular entre 5 y 14 atomos, e incluso mas en particular entre 6 y 12 atomos. En realizaciones en particular, al menos un 60 % de los atomos en la cadena lineal son atomos de C. En realizaciones en particular, los atomos en la cadena lineal estan unidos mediante enlaces sencillos e.
En realizaciones en particular, los atomos de C en la cadena lineal son independientemente parte de grupos metileno opcionalmente sustituido (-CH2-). En las realizaciones de este tipo en particular, los sustituyentes opcionales se seleccionan independientemente entre halogeno y alquilo C1-6, en particular metilo.
En realizaciones en particular, el conector L, en particular el conector L como se muestra en la seccion [0042] o en la seccion [0081], se selecciona entre el siguiente grupo de conectores:
lado de amatoxina: -(CH2)2- lado de resto de union a diana
lado de amatoxina: -(CH2)3- lado de resto de union a diana
lado de amatoxina: -(CH2)4- lado de resto de union a diana
lado de amatoxina: -(CH2)5- lado de resto de union a diana
lado de amatoxina: -(CH2)6- lado de resto de union a diana
lado de amatoxina: -(CH2)7- lado de resto de union a diana
lado de amatoxina: -(CH2)8- lado de resto de union a diana
lado de amatoxina: -(CH2)9- lado de resto de union a diana
lado de amatoxina: -(CH2)10- lado de resto de union a diana
lado de amatoxina: -(CH2)n- lado de resto de union a diana
lado de amatoxina: -(CH2)12- lado de resto de union a diana
lado de amatoxina: -(CH2)16- lado de resto de union a diana
lado de amatoxina: -(CH2)2-S-S-(CH2)2- lado de resto de union a diana
lado de amatoxina: -(CH2)3-S-S-(CH2)2- lado de resto de union a diana
lado de amatoxina: -(CH2)2-S-S-(CH2)3- lado de resto de union a diana
lado de amatoxina: -(CH2)3-S-S-(CH2)3- lado de resto de union a diana
lado de amatoxina: -(CH2)4-S-S-(CH2)4- lado de resto de union a diana
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lado de amatoxina: -(CH2)2-CMe2-S-S-(CH2)2- lado de resto de union a diana
lado de amatoxina: -(CH2)2-S-S-CMe2-(CH2)2- lado de resto de union a diana
lado de amatoxina: -(CH2)2-O-(CH2)2- lado de resto de union a diana
lado de amatoxina: -(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2- lado de resto de union a diana
lado de amatoxina: -(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2- lado de resto de union a diana
lado de amatoxina: -(cH2)2-O-(cH2)2-O-(cH2^-O-(cH2)2-O-(CH2)2- lado de resto de union a diana
En realizaciones de la presente invention en particular el resto de union a diana se une de forma especlfica a un epltopo que esta presente en una celula tumoral.
En realizaciones de la presente invencion en particular el resto de union a diana se une de forma especlfica a un epltopo de Her-2/neu o molecula de adhesion de celula epitelial (EpCAM).
En realizaciones de la presente invencion en particular el resto de union a diana se selecciona entre el grupo que consiste en: anticuerpo o fragmento de union a antlgeno del mismo, protelna similar a anticuerpo, y aptamero de acido nucleico.
En realizaciones de la presente invencion en particular el anticuerpo o el fragmento de union a antlgeno del mismo se seleccionan entre un diacuerpo, un tetracuerpo, un nanocuerpo, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo deshumanizado, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.
En realizaciones de la presente invencion en particular el fragmento de union a antlgeno se selecciona entre el grupo que consiste en Fab, F(ab')2, Fd, Fv, Fv de una sola cadena, y Fv unidos por enlaces disulfuro (dsFv).
En realizaciones en particular, el anticuerpo es herceptin o HEA125, o un fragmento de anticuerpo que comprende el fragmento de union a antlgeno de herceptin o HEA125.
En realizaciones en particular, mas de una molecula de amatoxina se acopla a un resto de union a diana. Un aumento del numero de amatoxinas por conjugado tambien aumentara la citotoxicidad. Por consiguiente, en una realization en particular, la proportion de resto de union a diana con respecto a amatoxina esta entre 1 resto de union a diana y entre 2 y 15 moleculas de amatoxina, en particular 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15. Para fines de calculo de la proporcion en caso de dlmeros de anticuerpos tales como las IgG, el dlmero se considera un resto de union a diana.
En realizaciones de la presente invencion en particular, el conjugado es para uso como un medicamento.
En realizaciones de la presente invencion en particular, el conjugado es para el tratamiento de cancer en un paciente, en el que el cancer se selecciona entre el grupo que consiste en cancer pancreatico, colangiocarcinoma, cancer de mama, cancer colorrectal, cancer de pulmon, cancer de prostata, cancer de ovario, cancer de estomago, cancer de rinon, melanoma maligno, leucemia, linfoma maligno.
Como se usa en el presente documento, un "paciente" se refiere a cualquier mamlfero o ave que se pueda beneficiar de un tratamiento con el conjugado de resto de union a diana y toxinas descritos en el presente documento. Preferentemente, un "paciente" se selecciona entre el grupo que consiste en animales de laboratorio (por ejemplo, raton o rata), animales domesticos (incluyendo por ejemplo cobaya, conejo, pollo, cerdo, oveja, cabra, camello, vaca, caballo, burro, gato, o perro), o primates incluyendo seres humanos. Es particularmente preferente que el "paciente" sea un ser humano.
Como se usa en el presente documento, "tratar", "que trata" o "tratamiento" de una enfermedad o trastorno se refiere a conseguir uno o mas de los siguientes: (a) reducir la gravedad del trastorno; (b) limitar o prevenir el desarrollo de slntomas caracterlsticos del trastorno o trastornos que se estan tratando; (c) inhibir el empeoramiento de slntomas caracterlsticos del trastorno o trastornos que se estan tratando; (d) limitar o prevenir la reaparicion del trastorno o trastornos en pacientes que previamente han tenido el trastorno o trastornos; y (e) limitar o prevenir la reaparicion de slntomas en pacientes que previamente eran sintomaticos para el trastorno o trastornos.
Como se usa en el presente documento, el tratamiento puede comprender la administration de un conjugado o una composition farmaceutica de acuerdo con la presente invencion a un paciente, en el que la "administracion" incluye administracion in vivo, as! como administracion directamente a tejido ex vivo, tal como injertos de venas.
En realizaciones en particular, se usa una cantidad terapeuticamente eficaz del conjugado de la presente invencion.
Una "cantidad terapeuticamente eficaz" es una cantidad de un agente terapeutico suficiente para conseguir la finalidad pretendida. La cantidad eficaz de un agente terapeutico dado variara con factores tales como la naturaleza del agente, la via de administracion, el tamano y especie del animal que recibe el agente terapeutico, y la finalidad
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de la administracion. La cantidad eficaz en cada caso individual la puede determinar de forma emplrica un experto en la materia de acuerdo con metodos establecidos en la tecnica.
En un segundo aspecto la presente invention se refiere a una composition farmaceutica que comprende el conjugado de acuerdo con la presente invencion, que comprende adicionalmente uno o mas diluyentes, vehlculos, excipientes, cargas, aglutinantes, lubricantes, sustancias de deslizamiento, adsorbentes; y/o conservantes farmaceuticamente aceptables.
"Farmaceuticamente aceptable" se refiere a aprobado por una agencia reguladora del gobierno Federal o un estado gubernamental o enumerado en la farmacopea de Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, y mas en particular en seres humanos.
En realizaciones en particular, la composicion farmaceutica se usa en forma de un medicamento administrado por via sistemica. Esto incluye agentes parenterales, que comprenden, entre otros, agentes inyectables e infusiones. Los agentes inyectables se formulan en forma de ampollas o como los denominados agentes inyectables listos para usar, por ejemplo jeringas listas para usar o jeringas de un solo uso y aparte de esto en frascos perforables para multiples extracciones. La administracion de agentes inyectables se puede realizar en forma de aplicacion subcutanea (s.c.), intramuscular (i.m.), intravenosa (i.v.) o intracutanea (i.c.). En particular, es posible producir las formulaciones de inyeccion respectivamente adecuadas en forma de una suspension de cristales, soluciones, nanopartlculas o sistemas dispersos coloidales tales como, por ejemplo hidrosoles.
Las formulaciones inyectables se pueden producir adicionalmente en forma de concentrados, que se pueden disolver o dispersar con diluyentes isotonicos acuosos. La infusion tambien se puede preparar en forma de soluciones isotonicas, emulsiones grasas, formulaciones liposomicas y microemulsiones. Al igual que los agentes inyectables, tambien se pueden preparar formulaciones de infusion en forma de concentrados para su dilution. Las formulaciones inyectables tambien se pueden aplicar en forma de inclusiones permanentes tanto en terapia en el paciente como en terapia ambulatoria, por ejemplo por medio de mini-bombas.
Es posible anadir a formulaciones de farmaco parenteral, por ejemplo, albumina, plasma, agente de expansion, sustancias de superficie activa, diluyentes organicos, sustancias que influyen en el pH, sustancias formadoras de complejos o sustancias polimericas, en particular como sustancias para influir en la adsorcion del conjugado de resto de union a diana y toxinas de la invencion a protelnas copollmeros o tambien se pueden anadir con el objeto de reducir la adsorcion del conjugado de resto de union a diana y toxinas de la invencion a materiales tales como instrumentos de inyeccion o materiales de envasado, por ejemplo, plastico o vidrio.
Los conjugados de resto de union a diana y toxina de la invencion se pueden unir a microvehlculos o nanopartlculas en compuestos precursores tales como, por ejemplo, a partlculas finamente dispersas basadas en poli(met)acrilatos, polilactatos, poliglicolatos, poliaminoacidos o polieter uretanos. Las formulaciones parenterales Tambien se puede modificar como preparaciones de deposito, por ejemplo basandose en el "principio de multiples unidades", si los conjugados de resto de union a diana y toxina de la invencion se introducen en forma finamente dispersa, dispersa y suspendida, respectivamente, o como una suspension de cristales en el medicamento o basandose en el "principio de una sola unidad" si el conjugado de resto de union a diana y toxina de la invencion esta introducido en una formulation, por ejemplo en un comprimido o una varilla que se implanta posteriormente. Estos implantes o medicamentos de deposito en formulaciones de una sola unidad o de multiples unidades a menudo consisten en los denominados pollmeros biodegradables tales como por ejemplo poliesteres de acido lactico y acido glicolico, polieter uretanos, poliaminoacidos, poli(met)acrilatos o polisacaridos.
Los adyuvantes y vehlculos anadidos durante la production de las composiciones farmaceuticas de la presente invencion formuladas como agentes parenterales son preferentemente aqua sterilisata (agua esterilizada), sustancias que influyen en el valor del pH tales como, por ejemplo acidos organicos o inorganicos o bases as! como sales de los mismos, sustancias de taponamiento para ajustar los valores del pH, sustancias para isotonizacion tales como por ejemplo cloruro sodico, hidrogenocarbonato sodico, glucosa y fructosa, agentes tensioactivos y de superficie activa, respectivamente, y emulsionantes tales como, por ejemplo esteres parciales de acidos grasos de polioxietileno y sorbitan (por ejemplo, Tween®) o, por ejemplo esteres de acido graso de polioxietilenos (por ejemplo, Cremophor®), aceites grasos tales como, por ejemplo aceite de cacahuete, aceite de soja o aceite de ricino, esteres sinteticos de acidos grasos tales como, por ejemplo oleato de etilo, miristato de isopropilo y aceite neutro (por ejemplo, Miglyol®) as! como adyuvantes polimericos tales como, por ejemplo gelatina, dextrano, polivinilpirrolidona, aditivos que aumentan la solubilidad de disolventes organicos tales como, por ejemplo propilenglicol, etanol, N,N- dimetilacetamida, propilenglicol o sustancias formadoras de complejos tales como, por ejemplo citrato y urea, conservantes tales como, por ejemplo ester de hidroxipropil y ester de metilo del acido benzoico, alcohol bencllico, antioxidantes tales como por ejemplo sulfito sodico y estabilizantes tales como por ejemplo EDTA.
Cuando las composiciones farmaceuticas de la presente invencion se formulan como suspensiones en una realization preferente se anaden agentes espesantes para evitar la sedimentation de los conjugados de resto de
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union a diana y toxina de la invencion o, agentes tensioactivos y polielectrolitos para asegurar la nueva capacidad de suspension de sedimentos y/o agentes formadores de complejos tales como, por ejemplo, EDTA. Tambien es posible conseguir complejos del principio activo con diversos pollmeros. Los ejemplos de los pollmeros de este tipo son polietilenglicol, poliestireno, carboximetil celulosa, Pluronics® o ester de acido graso de polietilenglicol y sorbitan. Los conjugados de resto de union a diana y toxina de la invencion tambien se pueden incorporar en formulaciones llquidas en forma de compuestos de inclusion por ejemplo con ciclodextrinas. En realizaciones en particular los agentes de dispersion se pueden anadir como adyuvantes adicionales. Para la produccion de liofilizados se pueden anadir agentes formadores de armazon tales como manita, dextrano, sacarosa, albumina humana, lactosa, PVP o Variedades de gelatina.
En un aspecto mas la presente invencion se refiere a un metodo para tratar cancer pancreatico, colangiocarcinoma, cancer de mama, cancer colorrectal, cancer de pulmon, cancer de prostata, cancer de ovario, cancer de estomago, cancer de rinon, melanoma maligno, leucemia, o linfoma maligno en un paciente con necesidad del mismo, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un conjugado o composicion farmaceutica de la presente invencion.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a una molecula de conjugacion a amatoxina como un compuesto intermedio para la slntesis de los conjugados de la presente invencion, en el que la molecula de conjugacion a amatoxina comprende un conector L conectado a una amatoxina por medio de
(i) el atomo y C del aminoacido 1 de la amatoxina, en particular por medio de un enlace amida;
(ii) un atomo de oxlgeno unido al atomo 5 C del aminoacido 3 de la amatoxina, en particular por medio de un enlace ester, un enlace eter o un enlace uretano; o
(iii) el atomo 6' C del aminoacido 4 de la amatoxina, en particular por medio de un atomo de oxlgeno unido al atomo 6' C del aminoacido 4 de la amatoxina;
en cada caso en el que el conector L comprende un derivado del acido carbamico -NH-C(O)-X, en el que X es un grupo saliente que se puede sustituir con una amina primaria de un resto de union a diana.
En una realizacion, la molecula de conjugacion a amatoxina tiene una estructura seleccionada entre una de las siguientes estructuras:
(i) amatoxina-YC(O)-NH-L-NH-C(O)-X;
(ii) amatoxina-5C-O-C(O)-L-NH-C(O)-X;
(iii) amatoxina-5C-O-L-NH-C(O)-X;
(iv) amatoxina-5C-O-C(O)-NH-L-NH-C(O)-X; y
(v) amatoxina-6'C-O-L-NH-C(O)-X.
En ciertas realizaciones, la amatoxina se selecciona entre a-amanitina, p-amanitina, Y-amanitina, £-amanitina, amanina, amaninamida, amanulina, o acido amanullnico, o entre sales o analogos de los mismos.
En ciertas realizaciones, el conector L es un grupo alquileno, heteroalquileno, alquenileno, heteroalquenileno, alquinileno, heteroalquinileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno, aralquileno, o un grupo heteroaralquileno, opcionalmente sustituido.
En ciertas realizaciones, el conector L comprende un resto seleccionado entre uno de los siguientes restos: un resto disulfuro, un eter, una amina, un ester, una carboxamida, un uretano, y una urea.
En ciertas realizaciones, el grupo funcional X se selecciona entre: -tbutiloxi, -succinimidiloxi, -1-O-succinimidiloxi-3- sulfonato (-Sulfo-NHS), -O-(4-nitrofeniloxi), -O-(3-nitrofeniloxi), -O-(2,4-dinitrofeniloxi), -O-(2,4-dicloro-6-nitrofeniloxi), -pentafluorofeniloxi, -pentaclorofeniloxi, -O-(2,4,5-triclorofeniloxi), -O-(3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-1,2,3-benzotriazin- 3-ilo), -O-(endo-1-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboximid-1-ilo), -1-ftalimidoiloxi, -1-benzotriazoliloxi, -1-(7-aza- benzotriazolil)oxi,), y -N-imidazolilo.
En otro aspecto mas, la presente invencion se refiere a un metodo para sintetizar un conjugado de amatoxina de la presente invencion, que comprende la etapa de hacer reaccionar una molecula de conjugacion a amatoxina de la presente invencion con un resto de union a diana que comprende un grupo amino primario.
Ejemplos
En lo sucesivo, la invencion se explica con mas detalle con los siguientes ejemplos:
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Ejemplo 1
Sintesis de Conjugado de Anticuerpo de a-Amanitina y Herceptin Her-DSC-30.0134
1.1 Sintesis de 6'-NH-boc-(6-aminohexil)-a-amanitina HDP 30.0132
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En una atmosfera de argon y a temperatura ambiente 30,00 mg (32,6 gmoles) de a-amanitina secada al vaclo se disolvieron en 900 gl de dimetilsulfoxido seco (DMSO). Se anadieron 3,66 mg (32,6 gmoles) de terc-butilato de potasio y 73,18 mg (261,2 gmoles, 8 equiv.) de bromuro de NH-Boc-aminohexilo (Fluka 89171). Despues de 6 h a temperatura ambiente la mezcla de reaccion se acidifico a pH = 5 con 50 gl de una solucion de acido acetico 0,33 M en DMSO. Los compuestos volatiles se evaporaron en vaclo y el residuo se disolvio en 1000 gl de metanol y se diluyo con 20 ml de eter dietllico. El precipitado se recogio y se absorbio en 1000 gl de metanol. Esta solucion se diluyo con 1000 gl de agua y se uso para la purification en una LaPrep-HPLC:
(columna: Kromasil 100-C18, 250 mm x 20 mm, 10 gm, con metanol/agua (TFA al 0,05 %), flujo: 26 ml/min, detection en A = 295 nm).
Disolvente A: agua al 95 %: metanol al 5 % : acido trifluoroacetico al 0,05 %
Disolvente B: 10 % agua: metanol al 90 %: acido trifluoroacetico al 0,05 % gradiente: 0-5 min para A al 100 %; 5-20 min para A al 0 %; 20-40 min para A al 0 %
La fraction con el tiempo de retention de 19,8 min se recogio y los disolventes se evaporaron. 15,9 mg (rendimiento de un 43 %) de un polvo. MS: 1119 (M+H+); 1141 (M+Na+)
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1.2 Sfntesis de 6'-(-6-aminohexil)-a-amanitina HDP 30.0134
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9,90 mg (8,85 |jmoles) de 6’-NH-boc-6-aminohexil-a-amanitina HDP 30,0132 se disolvieron en 250 |jl de acido trifluoroacetico. La mezcla de reaccion se agito en atmosfera de argon a temperatura ambiente. Despues de 2 min El acido se retiro en vaclo a 20 °C y el residuo se seco. El eter de amanitina en bruto se purifico en una LaPrep-HPLC:
(columna: Kromasil 100-C18, d = 10 mm, 10 jm, con metanol/agua (TFA al 0,05 %), flujo: 6 ml/min, deteccion en A = 295 nm).
Disolvente A: agua al 95 %: metanol al 5 %: acido trifluoroacetico al 0,05 %
Disolvente B: 10 % agua: metanol al 90 % : acido trifluoroacetico al 0,05 %
Gradiente: 0-5 min para A al 100 %; 5-25 min para A al 50 %; 25-30 min para A al 0 %; 30-35 min para A al 0 % ; 35-40 min para A al 100 %, 40-45 min para A al 100 %
Las fracciones con el mismo tiempo de retencion (14,5 min) se recogieron y los disolventes se evaporaron.
9,10 mg (rendimiento de un 99 %) de un polvo de color blanco. MS: 1019 (M+H+); 1041 (M+Na+)
1.3 Sfntesis del derivado Her-DSC-30.0134 del anticuerpo HDP 30.0134
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En el Esquema 1 (y otros esquemas mostrados en los ejemplos), herceptin se representa mediante una formula esquematica que muestra una cadena lateral de lisina con R3 y R4 representando la parte restante de la protelna de anticuerpo de herceptin.
1.3.1 Sfntesis del conjugado Her-DSC-30.0134 de 6'-(-6-aminohexil-6-hidroxisuccinimidil)-a-amanitina- Herceptin con diferentes cargas utiles de toxina (Tabla 2)
5.00 mg de 6'-(-6-aminohexil)-a-amanitina HDP 30.0134 se disolvieron en 538 pl de dimetilformamida seca (DMF). En una atmosfera de argon y agitando a temperatura ambiente se anadieron 18,6 pl de una solucion de dihidroxisuccinimido carbonato (DSC) en DMF (2,56 mg en 100 pl de DMF) y 10,0 pl de trietilamina de una vez. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente. Despues de 12 h, se anadieron 60 ml de eter dietllico frlo. El precipitado de carbonato de a-amanitina-6'-(-6-aminohexil-6-hidroxisuccinimidilo) se recogio y se lavo varias veces con eter dietllico y se seco en vaclo. El solido restante se recogio en 750 pl de DMF = solucion A.
114.0 mg de Herceptin se disolvieron en 19,0 ml de solucion salina tamponada con fosfato (PBS, pH = 7,4) = solucion B.
Tabla 2
3 muestras de la solucion de Herceptin se tratan con diferentes cantidades de las soluciones de carbonato de a- amanitin-6'-(-6-aminohexil-6-hidroxisuccinimidilo):
Solucion A
Solucion B Carga de Herceptin: conector de amanitina Nombre de la muestra
152 ml
11,0 ml 1 : 1,3 Her-DSC-30.0134 [1.3]
242 ml
5,0 ml 1 : 4,3 Her-DSC-30.0134 [4.3]
290 ml
3,0 ml 1 : 7,5 Her-DSC-30.0134 [7.5]
Las tres soluciones de Herceptin y conector de amanitina se agitaron a 4 °C durante 14 h y cada una se separo mediante cromatografla de filtracion en gel en columna Sephadex G-25 (columna XK-16; 2 ml/min). La columna G- 25 se lavo previamente con 500 ml de soluciones de PBS, pH = 7,4. La fraccion del conjugado de Her-DSC-30.0134 se detecto mediante absorcion de UV. La concentration de protelna se determino mediante el Ensayo RotiQuant (Carl Roth; Alemania). La carga de amanitina de Herceptin se determino mediante la determination de la absorcion de UV a A = 280 nm y A = 310 nm.
Ejemplo 2
Sfntesis del Conjugado Her-DSC-30.0256 de a-Amanitina y Herceptin
2.1 Preparacion de 1-Isocianato-6-BocNH-aminohexano HDP 30.0247
imagen4
2,50 g (11,56 mmoles) de NH-Boc-1,6-hexametilendiamina (Aldrich 79229) se disolvieron en 35 ml de diclorometano. Se anadieron 35 ml de una solucion saturada de NaHCO3 en agua. Despues de la adicion de 1,143 g (3,85 mmoles) de carbonato de bis-(triclorometilo (trifosgeno) la mezcla de reaccion se agito vigorosamente a 0 °C durante 30 min. La fase organica se separo y la fase acuosa se extrajo tres veces con 15 ml de diclorometano. Las fases organicas combinadas se secaron sobre MgSO4 y se evaporaron. El residuo oleoso se fracciono a 150 °C y 59 Pa en un horno Kugelrohr. 2,23 g (80 %) de un aceite transparente MS: 242 (M+).
2.2 Sfntesis de 5-O-(NH-boc-6-aminohexilcarbamoil)-a-amanitina HDP 30.0253
imagen5
En una atmosfera de argon se disolvieron 13,43 mg (14,6 gmoles) de a-amanitina secada al vaclo en 1000 gl de 5 dimetil formamida seca (DMF). Se anadieron 7,08 mg (29,2 gmoles) de NH-Boc-6-isocianato aminohexano y 18,46 mg (29,2 gmoles) de dilaurilestannato de di-butilo y la mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente. Despues de 23 h se anadieron 13,43 mg (14,6 gmoles) de NH-Boc-6-isocianato aminohexano adicionales. Despues de 52 h la mezcla de reaccion se hidrolizo con 200 gl de metanol y se evaporo a sequedad. El residuo se disolvio en 1200 gl de DMSO y se purifico en una columna de LaPrep-HPLC: Kromasil 100-C18, 10 gm, 250 mm x 20 mm, con 10 metanol/agua (TFA al 0,05 %), flujo: 26 ml/min, detection a A = 295 nm. Disolvente A: agua al 95 %: metanol al 5 %. Disolvente B: agua al 5 %: metanol al 95 %. Gradiente: 0-5 min para A al 100 %; 5-20 min para A al 0 %; 20-25 min para A al 0 %; 25-27 min para A al 100 %; 27-35 min para A al 100 %. Las fracciones con el mismo tiempo de retention se recogieron y los disolventes se evaporaron.
9,06 mg (rendimiento de un 53 %) de un solido de color blanco. MS: 1161 (M+H+); 1183 (M+Na+).
15 2.3 Sfntesis de 8-O-(6-aminohexilcarbamoil)-a-amanitina HDP 30.0256
imagen6
9,06 mg (7,8 gmoles) de HDP 30.0253 se disolvieron en 250 gl de acido trifluoroacetico y se agito durante 2 min a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se evaporo a sequedad y el residuo se co-evaporo 2 veces con 1,5 ml de acetonitrilo. El solido se purifico en una LaPrep-HPLC:
20 columna: Kromasil 100-C18, 10 gm, 250 mm x 20 mm, con acetonitrilo/agua, flujo: 26 ml/min, deteccion a
A = 295 nm. Disolvente A: agua al 95 %: 5 % acetonitrilo. Disolvente B: agua al 5 %: 95 % acetonitrilo. Gradiente: 0-5 min para A al 100 %; 5-20 min para A al 0 %; 20-25 min para A al 0 %; 25-27 min para A al 100 %; 27-35 min
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para A al 100 %.
Las fracciones con es tiempo de retencion entre 12-17 min se recogieron y se evaporaron hasta un solido de color blanco.
8,75 mg (rendimiento de un 95 %). MS: (1061 M+H+); 1083 (M+Na+).
2.4 Sfntesis del derivado Her-DSC-30.0256 del anticuerpo HDP 30.0256
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1,00 mg de HDP 30,0256 se disolvio en 108 pl de dimetilformamida seca (DMF). En una atmosfera de argon y agitando a temperatura ambiente se anadieron 10,0 pl de una solucion de dihidroxisuccinimido carbonato (DSC) en DMF (2,56 mg en 100 pl de DMF) y 2,0 pl de trietilamina se anadieron de una vez. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente. Despues de un perlodo de incubacion durante una noche, se anadieron 30 ml de eter dietllico frlo. El precipitado se recogio y se lavo varias veces con eter dietllico y se seco en vaclo. El solido restante se recogio en 143 pl de DMF = solucion A. 12,0 mg de Herceptin se disolvieron en 6,0 ml de solucion salina tamponada con fosfato (PBS, pH = 7,4) = solucion B. La solucion A y la solucion B se combinaron. La solucion de Herceptin y conector de amanitina se agito a 4 °C durante 14 h y se separo mediante cromatografla de filtracion en gel en columna Sephadex G-25 (columna XK-16; 2 ml/min). La columna G-25 se lavo previamente 500 ml de solucion de PBS, pH = 7,4. La fraccion del conjugado de Her-DSC-30.0256 se detecto mediante absorcion de UV. La concentracion de protelna se determino mediante el Ensayo RotiQuant (Carl Roth; Alemania). La carga de amanitina de Herceptin se determino mediante determinacion de la absorcion UV a A = 280 nm y A = 310 nm. Se calculo una carga de toxina de 3,3 moleculas de amanitina para cada molecula de Herceptin.
Ejemplo 3
Sintesis del Conjugado de Anticuerpo de n-Amanitin y Herceptin Her-DSC-30.0304
3.1 Amida de BocNH-hexametilendiamino-p-amanitina HDP 30.0299
imagen8
5 En una atmosfera de argon 4,65 mg (5,05 gmoles) de p-amanitina secada al vaclo se disolvieron en 1000 gl de dimetilformamida seca (DMF). 100 gl de una solucion 0,15 M de BocNH-hexametilendiamina en DMF y 100 gl de una solucion 0,15 M de diisopropiletilamina (DIPEA) en DMF se anadieron a temperatura ambiente. Despues de la adicion final de 100 gl de una solucion 0,30 M de hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxitripirrolidinofosfonio (PyBOP) en DMF, la mezcla de reaccion se agito durante 20 h y se hidrolizo con 100 gl de agua. La mezcla de 10 reaccion se evaporo a sequedad en vaclo y el residuo se disolvio en 1000 gl de dimetilsulfoxido (DMSO). La purificacion se realizo en una LaPrep-HPLC:
columna: Kromasil 100-C18, 10 gm, 250 mm x 20 mm, con metanol/agua (TFA al 0,05 %), flujo: 26 ml/min, deteccion en A = 295 nm. Disolvente A: agua al 95 % : metanol al 5 %. Disolvente B: agua al 5 % : metanol al 95 %. Gradiente: 0-5 min para A al 100 %; 5-20 min para A al 0 %; 20-25 min para A al 0 %; 25-27 min para A al 15 100 %; 27-35 min para A al 100 %.
Las fracciones con el mismo tiempo de retencion se recogieron y los disolventes se evaporaron.
4,45 mg (rendimiento de un 80 %) de un solido de color blanco. MS: 1119 M+H+; 1141 M+Na+.
3.2 Amida de 6'-hexametilendiamino-p-amanitina HDP 30.0304
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4,14 mg (3,70 gmoles) de amida de BocNH-hexametilendiamino-p-amanitina HDP 30.0299 se disolvieron en 500 gl de acido trifluoroacetico (TFA) y se agito durante 2 min. El exceso de TFA se evaporo al vaclo y el residuo se co- evaporo con 2 porciones de 1000 gl de acetonitrilo. El solido restante se purifico en una LaPrep-HpLC:
columna: Kromasil 100-C18, 10 gm, 250 mm x 20 mm, con metanol/agua (TFA al 0,05 %), flujo: 26 ml/min, 5 deteccion a A = 295 nm. Disolvente A: agua al 95 %: metanol al 5 %. Disolvente B: agua al 5 %: metanol al 95 %.
Gradiente: 0-5 min para A al 100 %; 5-20 min para A al 0 %; 20-25 min para A al 0 %; 25-27 min para A al 100 %; 27-35 min para A al 100 %.
Las fracciones con el mismo tiempo de retencion entre 13,43-14,02 min se recogieron y los disolventes se evaporaron. El residuo se recogio en 2000 gl de agua y la solucion se congelo con nitrogeno llquido y se liofilizo 10 durante una noche.
4,00 mg (rendimiento de un 95 %) de una espuma de color blanco. MS: 1018 (M+H+); 1041 (M+Na+).
3.3 Sfntesis del derivado Her-DSC-30.0304 del anticuerpo HDP 30.0304
imagen10
3.3.1 Sfntesis del conjugado del anticuerpo HDP-30.0304 Herceptin Her-DSC-30.0304 [4.7]
15 1,33 mg de HDP 30.0304 se disolvieron en 144 gl de dimetilformamida seca (DMF). En una atmosfera de argon y
agitando a temperatura ambiente se anadieron 13,4 gl de una solucion de dihidroxisuccinimido carbonato (DSC) en DMF (2,56 mg en 100 gl de DMF) y 2,6 gl trietilamina de una vez. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente. Despues de 12 h, se anadieron 30 ml de eter dietllico frlo. El precipitado se recogio y se lavo varias veces con eter dietllico y se seco en vaclo. El solido restante se recogio en 200 gl de DMF = solucion A. 12,0 mg de
20 Herceptin se disolvieron en 4,0 ml de solucion salina tamponada con fosfato (PBS, pH = 7,4) = solucion B. La solucion A y la solucion B se combinaron. La solucion de Herceptin y conector de amanitina se agito a 4 °C durante 14 h y se separo mediante cromatografla de filtracion en gel en columna Sephadex G-25 (XK-16 columna; 2 ml/min).
La columna G-25 se lavo previamente con 500 ml de soluciones de PBS, pH = 7,4. La fraccion del conjugado de Her-DSC-30.0304 se detecto mediante absorcion de UV. La concentracion de protema se determino mediante el Ensayo RotiQuant (Carl Roth; Alemania). La carga de amanitina de Herceptin se determino mediante la determinacion de la absorcion de UV a A = 280 nm y A = 310 nm. Se calculo una carga de toxina de 4,7 moleculas 5 de amanitina por cada molecula de Herceptin.
Ejemplo Comparativo 4
Otras estructuras de conjugados de Amanitina-Herceptin
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ester
lauado
HN---CH-
HDP inAb-DCC'30-0252
1
HC-HC I CH,
CO
GQWHa
amida Nn—
HDP mA.b-DCC-30.G127
hK-hK
COWHf
HDP mAb= Estei -30.0001
rnAi
•COL fC
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Ejemplo 5
Citotoxicidad de conjugados de Herceptin-Amanitina en diferentes lineas de celulas tumorales positivas para HER2 y negativas para HER2 in vitro
5 La actividad citotoxica de Her-DSC-30.0134, Her-DSC-30.0256, Her-Ester-30.0001, Her-DCC-30.0252 y Her-DCC- 30.0127 se evaluo con las lineas de celulas tumorales positivas para HER2, SKOV-3 (ovario), SK-BR-3 (mama), NCI-N87 (estomago) y la linea de celulas tumorales negativas para HER2, MDA-MB231 (mama) y un ensayo de incorporacion de BrdU quimioluminiscente (Roche Diagnostics) in vitro. La viabilidad celular se determino despues de 72 h a 96 h de incubacion con diferentes concentraciones de conjugados de Herceptin-Amanitina a 37 °C y CO2 10 al 5 % por medicion de celulas fijadas y permeabilizadas con un anticuerpo anti-BrdU-HRP en un lector de microplacas Optima de BMG Labtech. Los valores de la CE50 de curvas de dosis-respuesta se calcularon mediante el software Graphpad Prism 4.0 (veanse las Figuras 2 - 5).
Estabilidad de conjugados de Herceptin-Amanitina en plasma in vitro
5.1 Liberacion de amanitina despues de incubacion en plasma
15 Los conjugados de Herceptin-Amanitina 35 pM se incubaron hasta 14 dias en plasma de raton en un bano de agua a 37 °C. Las muestras se recogieron en diferentes momentos y se analizaron para compuestos liberados de amanitina de molecula pequena mediante un metodo de ELISA. Por lo tanto, la amanitina liberada y metabolitos de amanitina se extrajeron en diferentes momentos con EtOH al 80 %. Las soluciones se aclararon mediante centrifugacion a 10.000 g durante 5 min y los sobrenadantes se almacenaron a -70 °C. Una placa de micropocillos Lumitrac (Greiner) 20 de color blanco se revistio con antisuero anti-amanitina de conejo durante una noche a 4 °C. La placa se bloqueo con BSA al 3 % en PBS durante 1 h a 37 °C y se lavo tres veces con Tween al 0,05 %/PBS. Las muestras de amanitina y soluciones de amanitina con concentraciones definidas se mezclaron con biotinil-amanitina 1 nM en BSA al 1 %/PBS y se incubaron en pocillos revestidos durante 1 h a 37 °C. Los pocillos se lavaron tres veces con Tween al 0,05 %/pBs. La solucion de reserva de estreptavidina-HRP (Sigma-Aldrich) (1 mg/ml en PBS) se diluyo a 1 : 1000 25 en BSA al 3 %/PBS y se anadieron 50 pl a cada pocillo. Despues de incubacion durante 1 h a 37 °C, los pocillos se
lavaron tres veces con Tween al 0,05 %/PBS. Se anadieron 50 pl de una solucion de luminol (Applichem) a cada pocillo y la senal de luminiscencia se midio con un lector Optima de BMG Labtech. Las cantidades de compuestos de amanitina liberados se calcularon mediante regresion lineal (veanse las Figuras 6 - 7).
5.2 Actividad citotoxica despues de incubacion en plasma
30 Los conjugados de Herceptin-Amanitina se incubaron hasta 11 dias en plasma humano en un bano de agua a 37 °C. Las muestras se recogieron en diferentes momentos y se analizaron para la potencia citotoxica restante en celulas SKOV-3 positivas para HER2 mediante un ensayo de incorporacion de BrdU quimioluminiscente (Roche Diagnostics) in vitro. La viabilidad celular se determino despues de un periodo de incubacion de 72 h con diferentes concentraciones de conjugados de Herceptin-Amanitina a 37 °C y CO2 al 5 % por medicion de celulas fijadas y 35 permeabilizadas con un anticuerpo anti-BrdU-HRP en un lector de microplacas Optima de BMG Labtech. Los valores
de la CE50 de curvas de dosis-respuesta se calcularon mediante el software Graphpad Prism 4.0 (vease la Figura 8).
Actividad antitumoral conjugados de Herceptin-Amanitina en modelos de xenoinjerto de raton con celulas cancerosas positivas para HER2
Se adquirieron ratones atlmicos BALB/c nu/nu hembra intactos de seis semanas de edad (Janvier) y se dividieron de forma aleatoria en tres grupos de ocho ratones cada uno. Se inyectaron 2,5 x 106 celulas SKOV-3 por via s.c. en el 5 costado de cada raton. Los conjugados de Herceptin-Amanitina se inyectaron una vez por via i.v. a una dosis de 50 |jg/kg al dla, 19 dlas despues de la inoculacion de tumor, mientras que al grupo de control negativo se le inyecto el vehlculo (tampon de NaCl). Se registraron parametros tales como supervivencia, peso y tamano del tumor (Vease la 9).
Ejemplo 6
10 Preparacion de compuestos de conector de a-amanitina adicionales, HDP 30.0353, HDP 30.0354, HDP 30.0355, HDP 30.0409, HDP 30.0410, HDP 30.0411 y HDP 30.0412
6.1 Conector de amanitina HDP 30.0353
6.1.1 Sfntesis de 6'O-(NH-boc-6-amino-3,4-ditia-hexil)-a-amanitina HDP 30.0341
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15 6,78 mg (7,38 jmoles) de a-amanitina secada al vaclo se disolvieron en 500 jl de dimetilsulfoxido (DMSO). Se
anadieron 18,67 mg (59,02 jmoles, 8 equiv.) de bromuro de NH-boc-amino-3,4-ditia-hexilo y 73,8 jl (7,38 jmoles, 1 equiv.) de LiOH (0,1 M) en agua / DMSO (1:1) en atmosfera de argon. Despues de 1 h, 3,5 h, 4,5 h, 6,5 h y 8 h se anadieron equivalentes adicionales de la solucion de LiOH 0,1 M. La mezcla de reaccion en bruto se purifico en una LaPrep-HPLC:
20 columna: Kromasil 100-C18, 10 jm, 250 mm x 10 mm, con metanol / agua (TFA al 0,05 %), flujo: 6,5 ml/min,
deteccion en A = 295 nm. Disolvente A: agua al 95 %: metanol al 5 %, acido trifluoroacetico al 0,05 %. Disolvente B: 10 % agua: metanol al 90 %, acido trifluoroacetico al 0,05 %. Gradiente: 0-5 min para A al 100 %; 5-20 min para A al 0 %; 20-25 min para A al 0 %; 25-27 min para A al 100 %; 27-35 min para A al 100 %.
La fraccion con un tiempo de retencion de 20,8-21,4 min se recogio y los disolventes se evaporaron en vaclo.
25 1,29 mg (rendimiento de un 15 %) de un solido de color blanco. MS: 1154 M+H+
6.1.2 Sfntesis de 6'-O-(-6-amino-3,4-ditia-hexil)-a-amanitina HDP 30.0353
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1,29 mg (1,12 gmoles) de 6'-O-(-6-amino-3,4-ditia-hexil)-a-amanitina HDP 30.0341 se disolvieron en 200 gl de acido trifluoroacetico (TFA). La mezcla de reaccion se agito en atmosfera de argon a temperatura ambiente. Despues de 1 5 min el acido trifluoroacetico se diluyo con 1000 gl de tolueno y se evaporo a sequedad. La temperatura no deberla superar 20 °C. Este proceso se repitio con 1000 gl de tolueno y 1000 gl de acetonitrilo (2 x). El eter de a-amanitina en bruto se purifico en una LaPrep-HPLC:
columna: Kromasil 100-C18, 10 gm, 250 mm x 10 mm, con metanol / agua (TFA al 0,05 %), flujo: 6,5 ml/min, deteccion en A = 295 nm. Disolvente A: agua al 95 %: metanol al 5 %, acido trifluoroacetico al 0,05 %. Disolvente 10 B: 10 % agua: metanol al 90 %, acido trifluoroacetico al 0,05 %. Gradiente: 0-5 min para A al 100 %; 5-25 min
para A al 50 %; 25-30 min para A al 0 %; 30-35 min para A al 0 %; 35-40 min para A al 100 %, 40-45 min para A al 100 %.
La fraccion con un tiempo de retencion de 16,1-17,0 min se recogio y los disolventes se evaporaron. El residuo se liofilizo en agua.
15 0,39 mg (rendimiento de un 30 %, sal de TFA) de un solido de color amarillo. MS: 1054 M+H+
6.2 Conector de amanitina HDP 30.0354
6.2.1 Sfntesis de 6'O-(NH-boc-7-amino-4,5-ditia-heptil)-a-amanitina HDP 30.0349
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5,67 mg (6,17 gmoles) de a-amanitina secada al vaclo se disolvieron en 250 gl de dimetilsulfoxido seco (DMSO). Se 20 anadieron 19,00 mg (58,00 gmoles, 9,3 equiv.) de bromuro de NH-boc-7-amino-4,5-ditia-heptilo HDP 30.0345 a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. 61,7 gl (6,10 gmoles, 1 equiv.) de LiOH 0,1 M en agua / DMSO (1:1) se anadieron a once. La mezcla de reaccion se agito durante 3,5 h y se anadieron 10 gl (13,00 mg; 39,7 gmoles; 6,3 equiv.) de bromuro de NH-boc-7-amino-4,5-ditia-heptilo HDP 30.0345 y 61,7 gl de LiOH 0,1 M en agua / DMSO (1:1) adicionales. Despues de 8 h la mezcla de reaccion en bruto se purifico en una LaPrep-HPLC:
columna: Kromasil 100-C18, 10 |jm, 250 mm x 20 mm, con metanol / agua (TFA al 0,05 %), flujo: 26 ml/min, deteccion en A = 295 nm. Disolvente A: agua al 95 %: metanol al 5 %, acido trifluoroacetico al 0,05 %. Disolvente B: 10 % agua: metanol al 90 %, acido trifluoroacetico al 0,05 %. Gradiente: 0-5 min para A al 100 %; 5-20 min para A al 0 %; 20-30 min para A al 0 %; 30-35 min para A al 100 %; 35-40 min para A al 100 %.
5 La fraccion con un tiempo de retencion de 19,4-21,0 min se recogio y se evaporo a sequedad a temperatura ambiente.
4,83 mg (rendimiento de un 67 %) de un polvo de color blanco. MS: 1168 M+H+
6.2.2 Sfntesis de 6'O-(7-amino-4,5-ditia-heptil)-a-amanitina HDP 30.0354
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10 4,83 mg (4,13 jmoles) de 6'O-(NH-boc-7-amino-4,5-ditia-heptil)-a-amanitina HDP 30.0349 se disolvieron en 200 jl
de acido trifluoroacetico (TFA). La mezcla de reaccion se agito durante 1 min en atmosfera de argon y se evaporo a sequedad a temperatura ambiente. El residuo se co-evaporo con 1000 jl de tolueno y 1000 jl de acetonitrilo. El solido restante se purifico en una LaPrep-HPLC:
columna: Kromasil 100-C18, 10 jm, 250 mm x 10 mm, con metanol / agua (TFA al 0,05 %), flujo: 6,5 ml/min, 15 deteccion en A = 295 nm. Disolvente A: agua al 95 %: metanol al 5 %, acido trifluoroacetico al 0,05 %. Disolvente
B: 10 % agua: metanol al 90 %, acido trifluoroacetico al 0,05 %. Gradiente: 0-5 min para A al 100 %; 5-20 min para A al 0 %; 20-25 min para A al 0 %; 25-27 min para A al 100 %; 27-35 min para A al 100 %.
La fraccion con un tiempo de retencion de 17,1-17,5 min se recogio y se evaporo. El residuo se liofilizo in agua.
0,36 mg (rendimiento de un 7,0 %, sal de TFA) de un solido de color amarillo. MS: 1068 M+H+
20 6.3 Conector de amanitina HDP 30.0355
6.3.1 Sfntesis de 6'O-(NH-boc-7-amino-3,3-dimetil-4,5-ditia-heptil)-a-amanitina HDP 30.0350
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5,67 mg (6,17 gmoles) de a-amanitina secada al vaclo se disolvieron en 250 gl de dimetilsulfoxido seco (DMSO). En una atmosfera de argon se anadieron 18,00 mg (51,62 gmoles, 9,8 equiv.) de bromuro de NH-boc-7-amino-3,3- dimetil-4,5-ditia-heptilo HDP 30.0348 y 61,7 gl (6,10 gmoles, 1 equiv.) de LiOH 0,1 M en agua / DMSO (1:1). 5 Despues de 2 h la mezcla de reaccion se trato repetidamente con 10 gl (12,00 mg; 34,4 gmoles; 5,6 equiv.) de bromuro de NH-boc-7-amino-3,3-dimetil-4,5-ditia-heptilo HDP 30.0345 y 61,7 gl de LiOH 0,1 M. Despues de 8 h la mezcla se diluyo con DMSO y se purifico en una LaPrep-HPLC:
columna: Kromasil 100-C18, 10 gm, 250 mm x 20 mm, con metanol / agua (TFA al 0,05 %), flujo: 26 ml/min, deteccion en A = 295 nm. Disolvente A: agua al 95 %: metanol al 5 %, acido trifluoroacetico al 0,05 %. Disolvente 10 B: 10 % agua: metanol al 90 %, acido trifluoroacetico al 0,05 %. Gradiente: 0-5 min para A al 100 %; 5-20 min
para A al 0 %; 20-30 min para A al 0 %; 30-35 min para A al 100 %; 35-40 min para A al 100 %.
La fraccion con un tiempo de retencion de 20,5-21,0 min se recogio y los disolventes se evaporaron.
0,51 mg (rendimiento de un 7 %; rendimiento de un 48 % basandose en la a-amanitina convertida). MS: 1196 M+H+
6.3.2 Sfntesis de 6'O-(7-amino-3,3-dimetil-4,5-ditia-heptil)-a-amanitina HDP 30.0355
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0,51 mg (0,43 gmoles) de HDP 30.0350 se disolvieron en 200 gl de acido trifluoroacetico (TFA) y se agito durante 1 min a temperatura ambiente. El acido trifluoroacetico se diluyo con 1000 gl de tolueno y se evaporo a 20 °C a sequedad. Este proceso se repitio con 1000 gl de tolueno y 1000 gl de acetonitrilo (2 x). La mezcla de reaccion se purifico en una LaPrep-HPLC:
20
columna: Kromasil 100-C18, 10 |jm, 250 mm x 10 mm, con metanol / agua (TFA al 0,05 %), flujo: 6,5 ml/min, deteccion en A = 295 nm. Disolvente A: agua al 95 %: metanol al 5 %, acido trifluoroacetico al 0,05 %. Disolvente B: 10 % agua: metanol al 90 %, acido trifluoroacetico al 0,05 %. Gradiente: 0-5 min para A al 100 %; 5-20 min para A al 0 %; 20-25 min para A al 0 %; 25-27 min para A al 100 %; 27-35 min para A al 100 %.
5 La fraccion con un tiempo de retencion de 18,2-18,6 min se recogio y los disolventes se evaporaron. El residuo se liofilizo en agua.
0,15 mg (rendimiento de un 27 %, sal de TFA) de un solido de color amarillo. MS: 1096 M+H+
6.4 Conector de amanitina HDP 30.0409
6.4.1 Sfntesis de 6'O-(NH-boc-12-amino-dodecil)-a-amanitina HDP 30.0404
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6,67 mg (7,26 jmoles) de a-amanitina secada al vacio se disolvieron en 250 jl de dimetilsulfoxido seco (DMSO). Se anadieron 21,00 mg (58,10 jmoles, 8 equiv.) NH-boc-12-amino-dodecilbromuro HDP 30.0383 and 72,6 ml (7,26 jmoles, 1 equiv.) de LiOH 0,1 M en agua / DMSO (1:1). Despues de 6 h se anadieron 36,5 jl de LiOH 0,1 M y la mezcla se interrumpio con 72,6 jl de una solucion de acido acetico 0,1 M en DMSO dos h mas tarde. El producto 15 de reaccion en bruto se purifico en una LaPrep-HPLC:
columna: Kromasil 100-C18, 10 jm, 250 mm x 20 mm, con metanol / agua (TFA al 0,05 %), flujo: 26 ml/min, deteccion en A = 295 nm. Disolvente A: agua al 95 %: metanol al 5 %. Disolvente B: agua al 5 % : metanol al 95 %. Gradiente: 0-5 min para A al 100 %; 5-20 min para A al 0 %; 20-25 min para A al 0 %; 25-27 min para A al 100 %; 27-35 min para A al 100 %.
20 La fraccion con un tiempo de retencion de 22,0-22,7 min se recogio y los disolventes se evaporaron.
5,96 mg (rendimiento de un 68 %) de un solido de color blanco. MS: 1202 M+H+
6.4.2 Sfntesis de 6'-O-(12-aminododecil)-a-amanitina HDP 30.0409
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5,96 mg (4,96 gmoles) de HDP 30.0404 se disolvieron en 200 gl de acido trifluoroacetico (TFA) y se agito 1 min a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se co-evaporo con 1000 gl de tolueno y acetonitrilo y el solido restante se purifico en una LaPrep-HPLC:
columna: Kromasil 100-C18, 10 gm, 250 mm x 20 mm, con acetonitrilo / agua, flujo: 26 ml/min, deteccion en A = 295 nm. Disolvente A: agua al 95 %: 5 % acetonitrilo. Disolvente B: agua al 5 %: 95 % acetonitrilo. Gradiente: 0-5 min para A al 100 %; 5-20 min para A al 0 %; 20-25 min para A al 0 %; 25-27 min para A al 100 %; 27-35 min para A al 100 %.
La fraccion con un tiempo de retencion entre 18,6-19,2 min se recogio y se evaporo hasta un solido de color blanco. 6,03 mg (rendimiento de un 99 %, sal de TFA). MS: 1102 M+H+
6.5 Conector de amanitina HDP 30.0410
6.5.1 Smtesis de 6'O-(NH-boc-11-amino-3,6,9-trioxa-undecil)-a-amanitina HDP 30.0405
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6,67 mg (7,26 gmoles) de a-amanitina secada al vaclo se disolvieron en 250 gl de dimetilsulfoxido seco (DMSO). Se anadieron 20,51 mg (58,10 gmoles, 8 equiv.) de bromuro de NH-boc-11-amino-3,6,9-trioxa-undecilo HDP 30.0391 y 72,6 gl (7,26 gmoles, 1 equiv.) de LiOH 0,1 M en agua / DMSO (1:1). La reaccion se realizo a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. Despues de un periodo adicional de 6 h, se anadio base de LiOH (0,5 equiv.). La mezcla se inactivo despues de 8 h con 72,6 gl de una solucion de acido acetico 0,1 M en DMSO y se purifico en una LaPrep-HPLC:
columna: Kromasil 100-C18, 10 gm, 250 mm x 20 mm, con metanol / agua (TFA al 0,05 %), flujo: 26 ml/min, deteccion en A = 295 nm. Disolvente A: agua al 95 %: metanol al 5 %. Disolvente B: agua al 5 % : metanol al
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95 %. Gradiente: 0-5 min para A al 100 %; 5-20 min para A al 0 %; 20-25 min para A al 0 %; 25-27 min para A al 100 %; 27-35 min para A al 100 %.
La fraccion con un tiempo de retencion de 18,1-18,6 min se recogio y los disolventes se evaporaron.
4,68 mg (rendimiento de un 54 %) de solido. MS: 1194 M+H+
6.5.2 Sfntesis de 6'O-(11-amino-3,6,9-trioxa-undecil)-a-amanitina HDP 30.0410
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4,68 mg (3,92 pmoles) de HDP 30.0405 se disolvieron en 200 pl de acido trifluoroacetico (TFA) y se agito durante 1 min a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se co-evaporo con tolueno y acetonitrilo y el solido en bruto se purifico en una LaPrep-HPLC:
columna: Kromasil 100-C18, 10 pm, 250 mm x 20 mm, con metanol / agua (TFA al 0,05 %), flujo: 26 ml/ min, deteccion en A = 295 nm. Disolvente A: agua al 95 %: metanol al 5 %. Disolvente B: agua al 5 %: metanol al 95 %. Gradiente: 0-5 min para A al 100 %; 5-20 min para A al 0 %; 20-25 min para A al 0 %; 25-27 min para A al 100 %; 27-35 min para A al 100 %.
La fraccion con un tiempo de retencion entre 18,6-19,2 min se recogio y se evaporo. El solido restante se liofilizo en agua.
2,44 mg (rendimiento de un 52 %, sal de TFA). Polvo de color blanco MS: 1102 M+H+
6.6 Conector de amanitina HDP 30.0411
6.6.1 Sfntesis de 6'O-(NH-boc-16-amino-hexadecil)-a-amanitina HDP 30.0406
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anadieron 24,00 mg (58,10 gmoles, 8 equiv.)de bromuro de NH-boc-16-amino-hexadecilo HDP 30.0398 a temperatura ambiente en atmosfera de argon. Se anadieron 72,6 gl (7,26 gmoles, 1 equiv.) de LiOH 0,1 M en agua / DMSO (1:1) y la mezcla de reaccion se calento a 50 °C. Despues de un periodo adicional de 6 h, se anadio base de LiOH (36,5 gl) y la mezcla de reaccion se interrumpio despues de 8 h con 72,6 gl de una solucion de acido 5 acetico 0,1 M en DMSO. La mezcla de reaccion solidificada se diluyo con DMSO y se purifico en una LaPrep-HPLC:
columna: Kromasil 100-C18, 10 gm, 250 mm x 20 mm, con metanol / agua (TFA al 0,05 %), flujo: 26 ml/ min, deteccion en A = 295 nm. Disolvente A: agua al 95 %: metanol al 5 %. Disolvente B: agua al 5 % : metanol al 95 %. Gradiente: 0-5 min para A al 100 %; 5-20 min para A al 0 %; 20-25 min para A al 0 %; 25-27 min para A al 100 %; 27-35 min para A al 100 %.
10 La fraccion con un tiempo de retencion de 23,4-24,1 min se recogio y los disolventes se evaporaron.
4,41 mg (rendimiento de un 48 %) de un solido de color blanco. MS: 1258 M+H+
6.6.2 Sfntesis de 6'O-(16-amino-hexadecil)-a-amanitina HDP 30.0411
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4,41 mg (3,50 gmoles) de HDP 30.0406 se disolvieron en 200 gl de acido trifluoroacetico (TFA) y se agito durante 2 15 mins a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se co-evaporo dos veces con 1000 gl de tolueno y 1000 gl de acetonitrilo y el residuo solido se purifico en una LaPrep-HPLC:
columna: Kromasil 100-C18, 10 gm, 250 mm x 20 mm, con metanol / agua (TFA al 0,05 %), flujo: 26 ml/min, deteccion en A = 295 nm. Disolvente A: agua al 95 %: metanol al 5 %. Disolvente B: agua al 5 % : metanol al 95 %. Gradiente: 0-5 min para A al 100 %; 5-20 min para A al 0 %; 20-25 min para A al 0 %; 25-27 min para A al 20 100 %; 27-35 min para A al 100 %.
La fraccion con un tiempo de retencion entre 20,5-21,2 min se recogio y se evaporo. El residuo se liofilizo en agua. 2,44 mg (rendimiento de un 52 %, sal de TFA). MS: 1102 M+H+
6.7 Conector de amanitina HDP 30.0412
6.7.1 Sfntesis de 6'O-(NH-boc-2-amino-etil)-a-amanitina HDP 30.0317
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20,00 mg (21,8 |jmoles) de a-amanitina secada al vaclo se disolvieron en 900 |jl de dimetilsulfoxido seco (DMSO). Se anadieron 100,0 jl (21,8 jmoles, 1 equiv.) de una solucion 0,218 M de t-butilato de potasio en DMSO Y 39,00 mg (174,1 jmoles 8 equiv.) de bromuro de NH-boc-2-aminoetilo (obtenido en Fluka) a temperatura ambiente. Despues de 4 y 6 h, se anadieron 1 y 2 equivalentes adicionales de t-butilato de potasio y bromuro de NH-boc-2-aminoetilo. La mezcla se inactivo despues de 23 h con 72,6 jl de una solucion de acido acetico 0,1 M en DMSO y se purifico en una LaPrep-HPLC:
columna: Kromasil 100-C18, 10 jm, 250 mm x 20 mm, con metanol / agua (TFA al 0,05 %), flujo: 26 ml/min, deteccion en A = 295 nm. Disolvente A: agua al 95 %: metanol al 5 %. Disolvente B: agua al 5 % : metanol al 95 %. Gradiente: 0-5 min para A al 100 %; 5-20 min para A al 0 %; 20-25 min para A al 0 %; 25-27 min para A al 100 %; 27-35 min para A al 100 %.
La fraccion con un tiempo de retencion entre 13,2-14,5 min se recogio y los disolventes se evaporaron.
3,86 mg (rendimiento de un 16 %) de un solido de color blanco. MS: 1062 M+H+
6.7.2 Sfntesis de 6'O-(2-amino-etil)-a-amanitina HDP 30.0412
imagen26
3,86 mg (3,36 jmoles) de HDP 30.0317 se disolvieron en 200 jl de acido trifluoroacetico (TFA) y se agito durante 2 mins a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se co-evaporo con 1000 jl de tolueno y 1000 jl de acetonitrilo y el solido se purifico en una LaPrep-HPLC:
columna: Kromasil 100-C18, 10 jm, 250 mm x 20 mm, con metanol / agua (TFA al 0,05 %), flujo: 26 ml/min, deteccion en A = 295 nm. Disolvente A: agua al 95 %: metanol al 5 %. Disolvente B: agua al 5 %: metanol al 95 %. Gradiente: 0-5 min para A al 100 %; 5-20 min para A al 0 %; 20-25 min para A al 0 %; 25-27 min para A al 100 %; 27-35 min para A al 100 %.
La fraccion con un tiempo de retencion entre 20,5-21,2 min se recogio y se evaporo. El residuo se liofilizo en agua. 1,54 mg (rendimiento de un 44 %, sal de TFA) de un solido de color blanco. MS: 962 M+H+.

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    REIVINDICACIONES
    1. Un conjugado que comprende un resto de union a diana unido por medio de un conector L a una amatoxina, en el que el conector L esta conectado a la amatoxina por medio de
    (i) el atomo y C del aminoacido 1 de la amatoxina, en particular por medio de un enlace amida;
    (ii) un atomo de oxlgeno unido al atomo 5 C del aminoacido 3 de la amatoxina, en particular por medio de un enlace ester, un enlace eter o un enlace uretano; o
    (iii) el atomo 6' C del aminoacido 4 de la amatoxina, en particular por medio de un atomo de oxlgeno unido al atomo 6' C del aminoacido 4 de la amatoxina;
    en cada caso en el que el conector L esta conectado al resto de union a diana por medio de un resto de urea.
  2. 2. El conjugado de la reivindicacion 1, en la que el conjugado tiene una estructura seleccionada entre una de las siguientes estructuras:
    (i) amatoxina-YC(O)-NH-L-NH-C(O)-NH-resto de union a diana;
    (ii) amatoxina-5C-O-C(O)-L-NH-C(O)-NH-resto de union a diana;
    (iii) amatoxina-5C-O-L-NH-C(O)-NH-resto de union a diana;
    (iv) amatoxina-5C-O-C(O)-NH-L-NH-C(O)-NH-resto de union a diana; y
    (v) amatoxina-6'C-O-L-NH-C(O)-NH-resto de union a diana.
  3. 3. El conjugado de la reivindicacion 1 o 2, en el que el resto de union a diana esta conectado al conector L por medio de un grupo amino presente en el resto de union a diana, en el que dicho grupo amino forma parte de dicho resto de urea.
  4. 4. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la amatoxina se selecciona entre a- amanitina, p-amanitina, Y-amanitina, £-amanitina, amanina, amaninamida, amanulina, o acido amanullnico, o entre sales o analogos de los mismos.
  5. 5. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el conector L es un grupo alquileno, heteroalquileno, alquenileno, heteroalquenileno, alquinileno, heteroalquinileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno, aralquileno, o heteroaralquileno, opcionalmente sustituido.
  6. 6. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el conector L comprende un resto seleccionado entre uno de los siguientes restos: un resto disulfuro, un eter, una amina, un ester, una carboxamida, un uretano, y una urea.
  7. 7. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el que el resto de union a diana se une de forma especlfica a un epltopo que esta presente en una celula tumoral, en particular en el que el resto de union a diana se une de forma especlfica a un epltopo de molecula de adhesion de celula epitelial (EpCAM).
  8. 8. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el resto de union a diana se selecciona entre el grupo que consiste en:
    (i) anticuerpo o fragmento de union a antlgeno del mismo;
    (ii) protelna similar a anticuerpo; y
    (iii) aptamero de acido nucleico.
  9. 9. El conjugado de la reivindicacion 8, en el que el anticuerpo o el fragmento de union a antlgeno del mismo se selecciona entre un diacuerpo, un tetracuerpo, un nanocuerpo, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo deshumanizado, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.
  10. 10. El conjugado de resto de union a diana y toxina de la reivindicacion 8 o 9, en el que el fragmento de union a antlgeno se selecciona entre el grupo que consiste en Fab, F(ab')2, Fd, Fv, Fv de una sola cadena, y Fv unidos por enlaces disulfuro (dsFv).
  11. 11. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para uso como un medicamento, en particular para uso en el tratamiento de cancer en un paciente, en el que el cancer se selecciona entre el grupo que consiste en cancer pancreatico, colangiocarcinoma, cancer de mama, cancer colorrectal, cancer de pulmon, cancer de prostata, cancer de ovario, cancer de estomago, cancer de rinon, melanoma maligno, leucemia, linfoma maligno.
  12. 12. Composicion farmaceutica que comprende el conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y que ademas comprende uno o mas diluyentes, vehlculos, excipientes, cargas, aglutinantes, lubricantes, sustancias de deslizamiento, adsorbentes; y/o conservantes farmaceuticamente aceptables.
  13. 13. Una molecula de conjugacion a amatoxina que comprende un conector L conectado a una amatoxina por medio
    5 de
    (i) el atomo y C del aminoacido 1 de la amatoxina, en particular por medio de un enlace amida;
    (ii) un atomo de oxlgeno unido al atomo 5 C del aminoacido 3 de la amatoxina, en particular por medio de un enlace ester, un enlace eter o un enlace uretano; o
    (iii) el atomo 6' C del aminoacido 4 de la amatoxina, en particular por medio de un atomo de oxlgeno unido al
    10 atomo 6' C del aminoacido 4 de la amatoxina;
    en cada caso en el que el conector L comprende un derivado del acido carbamico -NH-C(O)-X, en el que X es un grupo saliente que se puede sustituir con una amina primaria de un resto de union a diana.
  14. 14. La molecula de conjugacion a amatoxina de la reivindicacion 13, en la que X se selecciona entre: -tbutiloxi, - succinimidiloxi, -1-O-succinimidiloxi-3-sulfonato (-Sulfo-NHS), -O-(4-nitrofeniloxi), -O-(3-nitrofeniloxi), -O-(2,4-
    15 dinitrofeniloxi), -O-(2,4-dicloro-6-nitrofeniloxi), -pentafluorofeniloxi, -pentaclorofeniloxi, -O-(2,4,5-triclorofeniloxi), -O-
    (3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-1,2,3-benzotriazin-3-ilo), -O-(endo-1-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboximid-1-ilo), -1- ftalimidoiloxi, -1-benzotriazoliloxi, -1-(7-aza-benzotriazolil)oxi,), y -N-imidazolilo.
  15. 15. Un metodo para sintetizar un conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende la etapa de hacer reaccionar una molecula de conjugacion a amatoxina de la reivindicacion 13 o 14 con un resto de
    20 union a diana que comprende un grupo amino primario.
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