ES2651922T3 - Polipéptidos de afinidad elevada para MAST2 y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Polipéptido de como máximo 350 aminoácidos, que comprende, de extremo N-terminal a extremo C-terminal, (1) opcionalmente, un péptido de señal, (2) un dominio para el anclaje de dicho polipéptido a la membrana del retículo y/o a la membrana del Golgi (es decir, el dominio de anclaje) y (3) un dominio expuesto citoplasmáticamente (es decir, el dominio citoplasmático) en el que el polipéptido se ancla en la membrana, en el que dicho dominio citoplasmático termina con un dominio de unión a MAST-2, en el que el tamaño de dicho dominio de unión a MAST-2 es de entre 11 y 13 residuos aminoácidos, los primeros dos residuos de dicho dominio de unión a MAST-2 son S y W, y los últimos cuatro residuos de dicho dominio de unión a MAST-2 son Q, T, R y L, seleccionando dicho dominio de unión a MAST-2 de entre el grupo que consiste en: (A) una secuencia, el tamaño de la cual es de 11 residuos, que consiste en SWX1X2X3X4X5QTRL, en el que cada uno de X1, X2, X3, X4 y X5 es cualquier residuo aminoácido (SEC ID nº 19), en el que X1 es cualquier aminoácido, preferentemente E o A (SEC ID nº 20 y nº 21), más preferentemente E y/o X2 es S, E o V, más preferentemente V (SEC ID nº 22 a nº 24), (B) una secuencia, el tamaño de la cual es de 11 residuos, seleccionada de entre el grupo que consiste en: SWX1KSGGQTRL (SEC ID nº 76), SWX1SSGGQTRL (SEC ID nº 77), SWX1SHGGQTRL (SEC ID nº 78), SWX1SHKGQTRL (SEC ID nº 79), SWX1SHKSQTRL (SEC ID nº 80), SWX1HSGGQTRL (SEC ID nº 86), SWX1HKGGQTRL (SEC ID nº 87), SWX1HKSGQTRL (SEC ID nº 88), SWX1SKGGQTRL (SEC ID nº 89), SWX1SKSGQTRL (SEC ID nº 90), SWX1SHSGQTRL (SEC ID nº 91), SWX1SHKGQTRL (SEC ID nº 92) y SWX1SKGGQTRL (SEC ID nº 93), en la que X1 es cualquier aminoácido, preferentemente E o A, más preferentemente E (SEC ID nº 81 a nº 85 y nº 94 a nº 101), (C) una secuencia, el tamaño de la cual es de 12 residuos, consistente en SWX1X2X3X4X5X6QTRL, en el que cada uno de X1, X2, X3, X4, X5 y X6 es cualquier residuo aminoácido (SEC ID nº 112), en el que X1 es preferentemente E o A, más preferentemente E y/o X2 es S, E o V, más preferentemente V, y (D) una secuencia, el tamaño de la cual es de 12 residuos, seleccionada de entre el grupo que consiste en: SWX1HKSGGQTRL (SEC ID nº 102), SWX1SKSGGQTRL (SEC ID nº 103), SWX1SHSGGQTRL (SEC ID nº 104), SWX1SHKGGQTRL (SEC ID nº 105) y SWX1SHKSGQTRL (SEC ID nº 106), en el que X1 es cualquier aminoácido, preferentemente E o A, más preferentemente E (SEC ID nº 107 a nº 111), (E) una secuencia, el tamaño de la cual es de 13 residuos, consistente en SWX1X2X3X4X5X6X7QTRL, en la que cada uno de X1, X2, X3, X4, X5, X6 y X7, es cualquier residuo aminoácido (SEC ID nº 192), en el que dicha secuencia no consiste en SWESHKSGGQTRL (SEC ID nº 1), en la que dicho polipéptido presenta una afinidad de unión para el dominio PDZ de la proteína MAST2 humana que es superior a la afinidad de unión de la proteína G del virus de la rabia que comprende la secuencia SWESHKSGGQTRL para el dominio PDZ de la proteína MAST2.

Description

Polipéptidos de afinidad elevada para MAST2 y usos de los mismos
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere a polipéptidos que contienen un dominio citoplasmático terminado en un dominio de unión a MAST-2, los primeros dos residuos del cual son S y W, y los últimos cuatro residuos del cual son Q, T, R y L, presentando dichos polipéptidos una afinidad elevada para el dominio PDZ de la proteína MAST2 humana. La invención se refiere además a polinucleótidos, vectores, partículas lentivíricas y células, así como a composiciones que comprenden los mismos. La solicitud da a conocer además la utilización de dichos polipéptidos, polinucleótidos, vectores, partículas lentivíricas, células y composiciones en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad, trastorno o condición, que altera el sistema nervioso central (SNC) y/o el sistema nervioso periférico (SNP), que forma parte de la invención en la medida en que se encuentran comprendidos en las reivindicaciones. Los inventores describen además firmas moleculares de genes celulares con el fin de determinar la neurosupervivencia y/o actividad de neuroprotección de una molécula
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Durante el desarrollo del sistema nervioso, las neuronas extienden los axones a distancias considerables con el fin de inervar sus dianas de una manera apropiada. Ello implica la estimulación en las células de rutas de señalización específicas que pueden estimular la actividad del cono de crecimiento.
Aunque el sistema nervioso en desarrollo, más particularmente el sistema nervioso central en desarrollo, es altamente plástico, el sistema nervioso adulto, más particularmente el cerebro adulto, presenta un potencial de reparación más limitado. Por lo tanto, el crecimiento de la neurita-axón y la protección frente a la degeneración son factores importantes que deben considerarse para mejorar el resultado de un trastorno, condición o enfermedad neurodegenerativa, tal como una lesión aguda del sistema nervioso o un trastorno neurodegenerativo crónico. Los productos que fuesen capaces de inducir el crecimiento de las neuritas de dichas células neuronales constituirían una solución terapéutica y/o preventiva y/o paliativa muy útil a dichas enfermedades, trastornos o condiciones.
En la otra cara del proceso de desarrollo neuronal, la proliferación de los progenitores neuronales, que no se diferencian en estructuras neuronales maduras, conduce a un neoplasma del sistema nervioso. Los productos que fuesen capaces de inducir el crecimiento de las neuritas de dichas células progenitoras constituirían una solución terapéutica y/o preventiva y/o paliativa para dichos neoplasmas.
Se ha descrito que la patogenicidad de una cepa del virus de la rabia se encuentra inversamente correlacionada con su capacidad de inducir apoptosis (documento nº WO 03/048198; Ugolini, 1995; Sarmento et al., 2005; Ugolini, 2008; Jackson et al. 2008). Por lo tanto, cuanto más virulenta sea una cepa de virus de la rabia, menos apoptótica será. El resultado de que las cepas virulentas de virus de la rabia, tales como las cepas CVS, no inducen la apoptosis de las neuronas explica por qué las cepas virulentas del virus de la rabia pueden propagarse tan extensamente en el SNC antes de que aparezcan signos y síntomas de la enfermedad.
Más recientemente, Préhaud et al. (2010) han informado de que la región C-terminal del dominio citoplasmático de la proteína G de los virus de la rabia participa en la unión de la proteína G al dominio PDZ de la proteína serina treonina quinasa 2, MAST2, humana asociada a los microtúbulos. Dicha región C-terminal porta un motivo de cuatro aminoácidos denominado PDZ-BS (‘Binding Site’ en inglés, sitio de unión de PDZ) que presenta la secuencia QTRL en las cepas virulentas de virus de la rabia y la secuencia ETRL en cepas atenuadas. De esta manera, se ha demostrado que la proteína G de la cepa virulenta del virus de la rabia se une con una afinidad elevada a MAST-1 y MAST-2 pero no se une a PTPN4, DLG2 y MPDZ. En contraste, la proteína G de las cepas atenuadas de virus de la rabia se ha demostrado que se une a MAST-1, MAST-2, PTPN4, DLG2 y MPDZ. Esta diferencia respecto a las parejas de unión de la proteína G de las cepas virulentas y atenuadas de virus de la rabia aparentemente se encuentra correlacionada con la diferencia de virulencia de las cepas (figura 2).
De esta manera, tal como se muestra en la solicitud nº WO2010/116258, la naturaleza de los residuos aminoácidos en las posiciones 491(H/L) y 521(Q/E) de la proteína G de los virus de la rabia resulta importante para los efectos sobre la supervivencia neuronal y sobre el crecimiento de las neuritas. La proteína G de la cepa virulenta del virus de la rabia que presenta un residuo H en la posición 491 y un residuo Q en la posición 521 es no apoptótica y favorece el crecimiento de las neuritas. En contraste, la proteína G de una cepa atenuada de virus de la rabia que presenta un residuo L en la posición 491 y un residuo E en la posición 521 es apoptótico y no estimula el crecimiento de las neuritas.
Basándose en estos resultados, existe una necesidad en la técnica de identificar y diseñar medios con propiedades mejoradas en la estimulación del crecimiento de las neuritas y de la neurosupervivencia. La invención proporciona medios para la regeneración y protección de las neuronas, que derivan de la proteína G de las cepas del virus de la
rabia y que muestran propiedades inesperadas. La invención se refiere además a medios para el cribado de moléculas adecuadas para la regeneración y protección de las neuronas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Figura 1. Procesamiento de la proteína G del virus de la rabia (RABV) en el interior de las células: en la traducción, la proteína G, que es una glucoproteína transmembranal de tipo I, es sintetizada en el retículo endoplasmático (RE), procesada seguidamente a través de la ruta secretoria hasta alcanzar el aparato de Golgi, en donde es glucosilada en su dominio extracelular. A continuación, la proteína es enviada a la membrana citoplasmática, en donde se ancla mediante su dominio transmembranal. El dominio citoplasmático de la proteína G se encuentra en contacto en todo momento con el citoplasma.
Figura 2. (A) Representación esquemática del modelo de acción de los polipéptidos de la invención (polipéptidos Neurovita) mediante la interacción con su pareja celular, la proteína MAST2 humana (serina-treonina quinasa 2 asociada a los microtúbulos)..(B) Representación esquemática de la participación de la ruta de señalización PI3K/Akt en la fisiología neuronal.
Figura 3. Identificación de las quinasas estimuladas durante la neuroprotección mediada por el RABV. Perfilado del quinoma en las neuronas post-mitóticas humanas NT2-N. (A) Micromatrices de péptidos que cubren el quinoma humano completo. (B) Representación esquemática del perfilado del quinoma obtenido para las células NT2-N infectadas por rRABV recombinante, RABV-CVSHQ. La ilustración de puntos representa las quinasas que resultan activadas con la infección de neurosupervivencia por rRABV de células NT2-N.
Figura 4. (A) Representación esquemática del polipéptido Neurovita 1; PS: Péptido de señal, EC: dominio extracelular, TM: dominio transmembranal, Cito: dominio citoplasmático, PDZ-BS: Sitio de unión de VEGF. El número de residuos aminoácidos (aa) de cada dominio también es indicado por: (B) la expresión de Neurovita 1 y Neurovita 1 delta PDS-BS por vectores lentivíricos en células NS o en células de neuroblastoma humanas (SHSY-5Y) mediante transferencia western 48 h post-infección (p.i.). (1. Neurovita1; 2. Neurovita1 delta PDZ-BS; 3. Control negativo) (C) Expresión de Neurovita 1 y Neurovita 1 delta PDZ-BS por vectores lentivíricos en células NS mediante inmunofluorescencia 48 h p.i. En (B) y (C) la detección se llevó a cabo con anticuerpos específicos para Cito-G de RABV.
Figura 5. (A) Ensayo de crecimiento de neuritas en células de neuroblastoma humano SH-SY-5Y tras la infección con vectores lentivíricos (30 h p.i.). Las células se trataron con db AMPc (10 µM). (B) Ensayo de crecimiento de neuritas en células NS tras la infección con vectores lentivíricos (72 h p.i.). Las células fueron tratadas con NGF (200 ng/ml) (*: p<0,05, prueba t de Student).
Figura 6. (A) Identificación de la firma molecular genética de la neuroprotección mediada por Neurovita 1; se midió la expresión en células NT2-N, 24 h p.i., con vectores lentivíricos expresantes de Neurovita 1, en una PCR de neurogénesis humana y células madre neurales y de ruta de señalización PI3K-Akt. (B) Representación esquemática de la firma molecular genética de Neurovita 1 obtenida mediante el perfilado de expresión génica (qRT-PCR) centrado en la ruta. El complejo de genes representa los genes regulados tras la infección con Neurovita 1 pero no regulados en cultivo no infectado o en cultivo infectado con Neurovita 1 delta PDZ-BS (los puntos negros son genes específicos de Neurovita).
Figura 7. (A) Firma molecular genética tras la infección de células NT2-N por un vector lentivírico expresante de Neurovita 1 (24 h p.i.) mediante PCR de neurogénesis humana y células madre neurales y matrices de ruta de señalización PI3K-Akt. (B) Firma molecular genética (24 h p.i.) tras la infección por vector lentivírico expresante de Neurovita 1 de células NT2-N en las que la expresión de MAST2 había sido inactivada mediante infección con lentivirus recombinantes específicos de ARN SH MAST2, 48 h antes de la infección con Neurovita 1 en vector lentivírico mediante PCR de neurogénesis humana y células madre neurales y matrices de ruta de señalización PI3K-Akt.
Figura 8. (A) Representación del ensayo de cicatrización. (B) Evaluación de la regeneración 6 días después de la lesión. (C) Regeneración axonal tras la infección con vector lentivírico Neurovita 1.
Figura 9. Firmas moleculares de la regeneración de axones mediada por Neurovita 1; el perfilado de la expresión génica centrada en una ruta se estableció en un cultivo de células NT2-N dos días después de la lesión. (A) Genes participantes en la ruta de señalización PI3K/Akt (matriz de PCR de señalización PI3K-AKT humana). (B) Genes participantes en la proliferación, adhesión y diferenciación celulares, factores de crecimiento y funciones sinápticas (matriz de PCR de neurogénesis humana y de células madre humanas). (C) Representación esquemática del complejo génico participante en la regeneración axonal mediada por Neurovita 1 (los puntos negros son genes específicos de Neurovita).
Figura 10. (A) Secuencia y organización tridimensional de la secuencia de Neurovita. (B) Relación entre la afinidad de los polipéptidos de la invención (polipéptidos Neurovita) para MAST2-PDZ y sus propiedades de neurosupervivencia.
Figura 11. (A) Representación esquemática de los polipéptidos de la invención: PS: péptido de señal, EC: dominio extracelular, TM: dominio transmembranal, Cito: dominio citoplasmático. También se indica el número de residuos aminoácidos (aa) de cada dominio. (B) Secuencia proteica de un polipéptido particular de la invención (Neurovita 2) y comparación entre las secuencias de los polipéptidos Neurovita 1 y Neurovita 1 delta PDZ-BS.
(C) Expresión de Neurovita 1, Neurovita 1 delta PdZ-BS y Neurovita 2 por vectores lentivíricos ("lentivectores") en células NS, medida mediante transferencia western 48 h p.i. con anticuerpos específicos para Cyto-G del RABV (1: Neurovita 2; 2: Neurovita1 delta PDZ-BS; 3: Neurovita1 y 4: control negativo).
Figura 12. Ensayo de crecimiento de neuritas en células NS tras la infección por lentivectores (72 h p.i.). Las células se trataron con NGF (200 ng/ml) (N.I.: células no infectadas).
Figura 13. (A) Dibujo esquemático de la arborización de células NS representativas, infectadas con Neurovita 2 (fotografía superior) o Neurovita 1 (fototografía inferior). (B) Complejidad del árbol de neuritas medido mediante análisis de Sholl en cultivo de NS infectado durante 72 h con lentivectores de Neurovita 1 (cuadrados negros) y Neurovita 2 (círculos negros).
Figura 14. (A) Identificación de la firma molecular genética de la neuroprotección mediada por Neurovita 2. Se midió la expresión en células NT2-N, 24 h p.i., por lentivectores. (B) Representación esquemática de la firma molecular genética de Neurovita 2 obtenida mediante perfilado de la expresión génica centrado en una ruta (qRT-PCR). El complejo de genes representa los genes regulados tras la infección con Neurovita 2 pero no regulados en cultivo no infectado o en cultivo infectado con Neurovita 1 delta PDZ-BS (los puntos negros son genes específicos de Neurovita).
Figura 15. Transcripción de (A) el rRABV 24 h p.i. y (B) de los lentivectores 48 h p.i. en células NT2-N tras la infección con vectores lentivíricos Neurovita. La transcripción se midió mediante RT-qPCR.
Figura 16. (A) Transcripción de un juego representativo de genes de inmunidad (en células NT2-N), (A) después de la infección con rRABV CVS HQ y rRABV CVS, HΔ4 (N.I.: no infectado) o (B) después de la infección con los lentivectores Neurovita 1, Neurovita 1 delta PDZ-BS y Neurovita 2 (neg.: control negativo).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
En la presente solicitud, los inventores han demostrado inesperadamente que los polipéptidos, la secuencia de los cuales comprenden los residuos SW y los residuos QTRL, que presentan una afinidad elevada para el dominio PDZ de la proteína MAST2 humana, presentan un efecto interesante particular sobre la estimulación del crecimiento de las neuritas y sobre las propiedades de supervivencia neuronal. De esta manera, a menor constante de disociación (KD) del complejo formado por los polipéptidos de la invención con el dominio PDZ de la proteína MAST2 humana, mayores las propiedades de neurosupervivencia del polipéptido de la invención.
La invención se refiere a un polipéptido tal como se define en la presente memoria que presenta una afinidad elevada para el dominio PDZ de la proteína MAST2 humana (SEC ID nº 6 para la proteína MAST2 humana de longitud completa y SEC ID nº 7 para su dominio PDZ).
En otras palabras, el polipéptido de la invención tal como se define en la presente memoria ha sido diseñado de manera que la constante de disociación (KD) del complejo que forma con el dominio PDZ de la proteína MAST2 humana es muy baja y como consecuencia que su afinidad para el dominio PDZ de la proteína MAST2 humana es muy elevada (siendo la afinidad la inversa de KD).
De acuerdo con lo anteriormente expuesto, en una primera realización, el polipéptido de la invención presenta una afinidad de unión para el dominio PDZ de la proteína MAST2 humana que es superior a la afinidad de unión para el dominio PDZ de la proteína MAST2 de la proteína G del virus de la rabia que comprende la secuencia SWESHKSGGQTRL (SEC ID nº 1).
En una realización particular, la ganancia de afinidad de los polipéptidos de la invención en comparación con un polipéptido con un dominio de unión a MAST-2 que consiste en SWESHKSGGQTRL (por ejemplo la proporción de KD) se encuentra comprendida entre 2,5 y 20, y en particular en los intervalos de 5 a 20, de 5 a 15 o de 5 a 10.
En una realización particular, la constante de disociación (KD) del complejo formado por el polipéptido de la invención con el dominio PDZ de la proteína MAST2 humana es inferior a 1 µM, inferior a 0,8 µM, inferior a 0,5 µM, inferior a 0,5 µM o inferior a 0,3 µM. En una realización preferente, la constante de disociación del complejo formado por el
polipéptido de la invención con el dominio PDZ de la proteína MAST2 humana es inferior a 0,2 µM, preferentemente inferior a 0,15 µM, más preferentemente inferior a 0,1 µM.
En una realización particular, la constante de disociación (KD) del complejo formado por el polipéptido de la invención con el dominio PDZ de la proteína MAST2 humana (MAST2-PDZ) se mide mediante calorimetría de titulación isotérmica (CTI).
A modo de realización particular de la CTI, la constante de disociación del complejo formado por el polipéptido de la invención con el dominio PDZ de la proteína MAST2 humana (MAST2-PDZ) se determina para una concentración del polipéptido comprendida entre 250 µM y 350 µM (preferentemente en tampón que contiene Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) y una concentración inicial del dominio MAST2-PDZ de 30 µM.
A modo de realización particular de la CTI, la constante de disociación del complejo formado por el polipéptido de la invención con el dominio PDZ de la proteína MAST2 humana se mide de la manera siguiente: se prepara el polipéptido de la invención en un tampón que contiene Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5, a concentraciones iniciales de entre 250 µM y 350 µM. Se realizan mediciones de CTI (calorimetría de titulación isotérmica) utilizando el calorímetro de titulación isotérmica Microcal VP ITC200 de Microcal (Northampton, MA), mediante la titulación de MAST2-PDZ (a una concentración inicial de 30 µM), a 298ºC, mediante la inyección del polipéptido de la invención tal como se ha preparado anteriormente (cada titulación de un polipéptido particular implica 25 a 45 inyecciones consecutivas de inyecciones de alícuotas de 5 a 7 µl a intervalos de 6 min). Los datos en bruto se normalizan y se corrigen para los calores de dilución de los polipéptidos. Se determinan las constantes de disociación de equilibrio llevando a cabo un ajuste de curva no lineal de los datos corregidos a un modelo con un juego de sitios utilizando el software Origin7.0 (OriginLab).
La afinidad de los polipéptidos de la invención para el dominio PDZ de la proteína PTPN4 humana es bajo, es decir, la constante de disociación (KD) del complejo formado por el polipéptido de la invención con el dominio PDZ de la proteína PTPN4 humana es elevado, en particular es superior a 500 µM (por ejemplo según medición mediante CTI, en particular bajo las mismas condiciones y a las mismas concentraciones que para MAST2-PDZ, anteriormente). Este elevado valor de KD (para el dominio PDZ de la proteína PTPN4 humana) se ha demostrado que se alcanza con los polipéptidos de la invención en los que los últimos cuatro residuos son Q, T, R y L.
De esta manera, los polipéptidos con una afinidad elevada para el dominio PDZ de la proteína MAST2 humana y/o diseñados de manera que la constante de disociación (KD) del complejo que forma con el dominio PDZ de la proteína MAST2 humana se encuentra dentro de los intervalos anteriormente indicados, se describen en la presente memoria mediante los elementos estructurales siguientes.
De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la invención se refiere a un polipéptido, de como máximo 350 residuos aminoácidos, que comprende: (1) un péptido de señal, (2) un dominio para anclar dicho polipéptido en el retículo endoplasmático y/o membrana de Golgi (también denominado dominio de anclaje), y (3) un dominio que se encuentra expuesto en el citoplasma al anclar el polipéptido en la membrana (también denominado dominio citoplasmático). Estos dominios se organizan estructuralmente de manera que el péptido de señal es N-terminal respecto al dominio de anclaje, el cual es N-terminal respecto al dominio citoplasmático. De esta manera, el polipéptido de la invención comprende, de extremo N-terminal a C-terminal, (1) un péptido de señal, (2) un dominio de anclaje, y (3) un dominio citoplasmático.
El dominio citoplasmático del polipéptido de la invención termina en un dominio de unión a MAST-2, el tamaño del cual es de 11 a 13 residuos aminoácidos. La expresión "termina en" se refiere a que los 11 a 13 residuos sucesivos del dominio de unión a MAST-2 son los últimos residuos C-terminales del dominio citoplasmático y, en una realización particular, los últimos residuos C-terminales de los polipéptidos de la invención.
El dominio de unión a MAST-2 del polipéptido de la invención consiste en una secuencia, el tamaño de la cual es de 11 a 13 residuos, los primeros dos residuos de la cual son S y W, y los cuatro últimos residuos de la cual son Q, T, R y L (estos 4 últimos residuos aminoácidos representan el denominado PDZ-BS). El dominio de unión a MAST-2 se define según uno de los grupos siguientes, conociendo que, sea cual sea el grupo, los dos primeros residuos aminoácidos del dominio de unión a MAST-2 son S y W y los últimos cuatro residuos aminoácidos del dominio de unión a MAST-2 son Q, T, R y L.
(A) En un primer grupo, el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia el tamaño de la cual es 11 residuos, los primeros dos residuos de la cual son S y W, y los últimos cuatro residuos de la cual son Q, T, R y L, consistente en SWX1X2X3X4X5QTRL, en la que cada uno de X1, X2, X3, X4 y X5 es cualquier residuo aminoácido (SEC ID nº 19).
En una realización particular, X1 es E o A, más preferentemente E, de manera que el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia el tamaño de la cual es 11 residuos, los primeros dos residuos de la cual son S, W y E, y
los últimos cuatro residuos de la cual son Q, T, R y L, que consiste en SWEX2X3X4X5QTRL (SEC ID nº 20) o SWAX2X3X4X5QTRL (SEC ID nº 21), en el que cada uno de X2, X3, X4 y X5 es cualquier residuo aminoácido.
En otra realización, X2 es S, E o V, más preferentemente V, de manera que el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, el tamaño de la cual es de 11 residuos, los primeros dos residuos de la cual son S y W y los últimos cuatro residuos de la cual son Q, T, R y L, que consiste en SWX1VX3X4X5QTRL (SEC ID nº 22), SWX1EX3X4X5QTRL (SEC ID nº 23) o SWX1SX3X4X5QTRL (SEC ID nº 24), en el que cada uno de X1, X3, X4 y X5 es cualquier residuo aminoácido.
En una realización particular, X3 es H, A o Y, de manera que el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, el tamaño de la cual es de 11 residuos, los primeros dos residuos de la cual son S y W y los últimos cuatro residuos de la cual son Q, T, R y L, que consiste en SWX1X2HX4X5QTRL (SEC ID nº 25), SWX1X2AX4X5QTRL (SEC ID nº 26) o SWX1X2YX4X5QTRL (SEC ID nº27), en el que cada uno de X1, X2, X4 y X5 es cualquier residuo aminoácido.
En una realización particular, X4 es G o T, de manera que el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia el tamaño de la cual es 11 residuos, los primeros dos residuos de la cual son S y W, y los últimos cuatro residuos de la cual son Q, T, R y L, que consiste en SWEX1X2X3GX5QTRL (SEC ID nº 28) o SWX1X2X3X3TX5QTRL (SEC ID nº 29), en el que cada uno de X1, X2, X3 y X5 es cualquier residuo aminoácido.
En una realización particular, X5 es G o T, de manera que el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia el tamaño de la cual es 11 residuos, los primeros dos residuos de la cual son S y W, y los últimos cuatro residuos de la cual son Q, T, R y L, que consiste en SWX1X2X3X4GQTRL (SEC ID nº 30) o SWX1X2X3X3X4QQTRL (SEC ID nº 31), en el que cada uno de X1, X2, X3 y X4 es cualquier residuo aminoácido.
En una realización particular, X1 es E y X2 es S, E o V, más preferentemente V, de manera que el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, el tamaño de la cual es de 11 residuos, los primeros tres residuos de la cual son S, W y E, y los últimos cuatro residuos de la cual son Q, T, R y L, que consiste en SWEVX3X4X5QTRL (SEC ID nº 32), SWESX3X4X5QTRL (SEC ID nº 33) o SWEEX3X4X5QTRL (SEC ID nº 34), en el que cada uno de X3, X4 y X5es cualquier residuo aminoácido.
En una realización particular, X1 es E y X3 es H, A o Y, de manera que el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, el tamaño de la cual es de 11 residuos, los primeros tres residuos de la cual son S, W y E, y los últimos cuatro residuos de la cual son Q, T, R y L, que consiste en SWEVX2HX4X5QTRL (SEC ID nº 35), SWESX2AX4X5QTRL (SEC ID nº 36) o SWEX2YX4X5QTRL (SEC ID nº 37), en el que cada uno de X2, X4 y X5es cualquier residuo aminoácido.
En una realización particular, X1 es E y X4 es G o T, de manera que el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia el tamaño de la cual es 11 residuos, los primeros tres residuos de la cual son S, W y E, y los últimos cuatro residuos de la cual son Q, T, R y L, que consiste en SWEX2X3GX5QTRL (SEC ID nº 38) o SWEX2X3TX5QTRL (SEC ID nº 39), en el que cada uno de X2, X3 y X5 es cualquier residuo aminoácido.
En una realización particular, X1 es E y X5 es G o Q, de manera que el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia el tamaño de la cual es 11 residuos, los primeros tres residuos de la cual son S, W y E, y los últimos cuatro residuos de la cual son Q, T, R y L, que consiste en SWEX2X3X4GQTRL (SEC ID nº 40) y SWEX2X3X4QQTRL (SEC ID nº 41), en el que cada uno de X2, X3 y X4 es cualquier residuo aminoácido.
En una realización particular, X1 es E, X2 es V y X3 es H, A o Y, de manera que el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, el tamaño de la cual es de 11 residuos, los primeros cuatro residuos de la cual son S, W, E y W, y los últimos cuatro residuos de la cual son Q, T, R y L, que consiste en SWEVHX4X5QTRL (SEC ID nº 42), SWEVAX4X5QTRL (SEC ID nº 43) o SWEVYX4X5QTRL (SEC ID nº 44), en el que cada uno de X4 y X5 es cualquier residuo aminoácido.
En una realización particular, X1 es E, X2 es V y X4 es G o T, de manera que el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, el tamaño de la cual es de 11 residuos, los primeros cuatro residuos de la cual son S, W, E y W, y los últimos cuatro residuos de la cual son Q, T, R y L, que consiste en SWEVX3GX5QTRL (SEC ID nº 45) o SWEVX3TX5QTRL (SEC ID nº 46), en el que cada uno de X3 y X5 es cualquier residuo aminoácido.
En una realización particular, X1 es E, X2 es V y X5 es G o Q, de manera que el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, el tamaño de la cual es de 11 residuos, los primeros cuatro residuos de la cual son S, W, E y V, y los últimos cuatro residuos de la cual son Q, T, R y L, que consiste en SWEVX3X4QTRL (SEC ID nº 47) o SWEVX3X4QQTRL (SEC ID nº 48), en el que cada uno de X3 y X4 es cualquier residuo aminoácido.
En una realización particular, X1 es E, X2 es V, X3 es H, A o Y y X4 es G o T, de manera que el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, el tamaño de la cual es de 11 residuos, los primeros cuatro residuos de la cual
son S, W, E y V y los últimos cuatro residuos de la cual son Q, T, R y L, que consiste en SWEVHGX5QTRL (SEC ID nº 49), SWEVHTX5QTRL (SEC ID nº 50), SWEVAGX5QTRL (SEC ID nº 51), SWEVATX5QTRL (SEC ID nº 52), SWEVYGX5QTRL (SEC ID nº 53) o SWEVYTX5QTRL (SEC ID nº 54), en el que X5 es cualquier residuo aminoácido.
En una realización particular, X1 es E, X2 es V, X3 es H, A o Y y X5 es G o Q, de manera que el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, el tamaño de la cual es de 11 residuos, los primeros cuatro residuos de la cual son S, W, E y V y los últimos cuatro residuos de la cual son Q, T, R y L, que consiste en SWEVHX4GQTRL (SEC ID nº 55), SWEVHX4QQTRL (SEC ID nº 56), SWEVAX4GQTRL (SEC ID nº 57), SWEVAX4QQTRL (SEC ID nº 58), SWEVYX4GQTRL (SEC ID nº 59) o SWEVYX4QQTRL (SEC ID nº 60), en el que X4 es cualquier residuo aminoácido.
En una realización particular, el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, el tamaño de la cual es de 11 residuos, los primeros dos residuos de la cual son S y W y los últimos cuatro residuos de la cual son Q, T, R y L, que consiste en SWX1X2X3X4X5QTRL, en el que X1 es E o A, X2 es S, E o V, X3 es H, A o Y, X4 es G o T y X5 es G o Q (SEC ID nº 61). En dicha realización, el dominio de unión a MAST-2 consiste en S-W-E/A-S/E/V-H/A/Y-G/T-G/Q-Q-T-R-L.
En una realización particular, el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, el tamaño de la cual es de 11 residuos, los primeros dos residuos de la cual son S y W y los últimos cuatro residuos de la cual son Q, T, R y L, que consiste en SWX1X2X3X4X5QTRL, en el que X1 es E, X2 es S, E o V, X3 es H, A o Y, X4 es G o T y X5 es G o Q (SEC ID nº 62). En dicha realización, el dominio de unión a MAST-2 consiste en S-W-E-S/E/V-H/A/Y-G/T-G/Q-Q-T-R-L.
En una realización particular, el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, el tamaño de la cual es de 11 residuos, los primeros dos residuos de la cual son S y W y los últimos cuatro residuos de la cual son Q, T, R y L, que consiste en SWX1X2X3X4X5QTRL, en el que X1 es E, X2 es V, X3 es H, A o Y, X4 es G o T y X5 es G o Q (SEC ID nº 63). En dicha realización, el dominio de unión a MAST-2 consiste en S-W-E-V-H/A/Y-G/T-G/Q-Q-T-R-L. En una realización más particular, el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, el tamaño de la cual es de 11 residuos, los primeros cuatro residuos de la cual son S, W, E y V y los últimos cuatro residuos de la cual son Q, T, R y L, que consiste en SWEVHGGQTRL (SEC ID nº 64), SWEVHGQQTRL (SEC ID nº 65), SWEVHTGQTRL (SEC ID nº 66), SWEVHTQQTRL (SEC ID nº 67), SWEVAGGQTRL (SEC ID nº 68), SWEVAGQQTRL (SEC ID nº 69), SWEVATGQTRL (SEC ID nº 70), SWEVATQQTRL (SEC ID nº 71), SWEVYGGQTRL (SEC ID nº 72), SWEVYGQQTRL (SEC ID nº 73), SWEVYTGQTRL (SEC ID nº 74) o SWEVYTQQTRL (SEC ID nº 75).
Los polipéptidos que satisfacen una de las definiciones indicadas en dicho grupo resultan preferentes, en particular en el caso de que la constante de disociación del complejo formado por el polipéptido de dicho grupo con el dominio PDZ de la proteína MAST2 humana sea inferior a 0,3 µM, preferentemente inferior a 0,25 µM, preferentemente inferior a 0,2 µM, preferentemente inferior a 0,15 µM, más preferentemente inferior a 0,1 µM, medido según el método definido anteriormente. En una realización más preferente, los polipéptidos que satisfacen una de las definiciones indicadas en dicho grupo presentan una constante de disociación del complejo formado por el polipéptido de la invención con el dominio PDZ de la proteína MAST2 humana que es inferior a 0,09 µM, inferior a 0,08 µM, inferior a 0,07 µM, inferior a 0,06 µM o inferior a 0,05 µM, medido según el método definido anteriormente.
(B) En un segundo grupo, el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia el tamaño de la cual es de 11 residuos, los primeros dos residuos de la cual son S y W y los últimos cuatro residuos de la cual son Q, T, R y L, seleccionando dicho dominio de entre el grupo que consiste en: SWX1KSGGQTRL (SEC ID nº 76), SWX1SSGGQTRL (SEC ID nº 77), SWX1SHGGQTRL (SEC ID nº 78), SWX1SHKGQTRL (SEC ID nº 79), SWX1SHKSQTRL (SEC ID nº 80), SWX1HSGGQTRL (SEC ID nº 86), SWX1HKGGQTRL (SEC ID nº 87), SWX1HKSGQTRL (SEC ID nº 88), SWX1SKGGQTRL (SEC ID nº 89), SWX1SKSGQTRL (SEC ID nº 90), SWX1SHSGQTRL (SEC ID nº 91), SWX1SHKGQTRL (SEC ID nº 92) y SWX1SKGGQTRL (SEC ID nº 93), en el que X1 es cualquier aminoácido, preferentemente E o A, más preferentemente E. De esta manera, en una realización particular, el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, el tamaño de la cual es de 11 residuos, los primeros tres residuos de la cual son S, W y E, y los últimos cuatro residuos de la cual son Q, T, R y L, seleccionando dicho dominio de entre el grupo que consiste en: SWEKSGGQTRL (SEC ID nº 81), SWESSGGQTRL (SEC ID nº 82), SWESHGGQTRL (SEC ID nº 83), SWESHKGQTRL (SEC ID nº 84), SWESHKSQTRL (SEC ID nº 85), SWEHSGGQTRL (SEC ID nº 94), SWEHKGGQTRL (SEC ID nº 95), SWEHKSGQTRL (SEC ID nº 96), SWESKGGQTRL (SEC ID nº 97), SWESKSGQTRL (SEC ID nº 98), SWESHSGQTRL (SEC ID nº 99), SWESHKGQTRL (SEC ID nº 100) y SWESKGGQTRL (SEC ID nº 101). En una realización particular, el dominio de unión a MAST-2 del dominio citoplasmático es SWESHGGQTRL (SEC ID nº 83).
El dominio de unión a MAST-2 de dicho segundo grupo puede obtenerse mediante deleción de dos residuos aminoácidos, consecutivos o no, de la secuencia SWESHKSGGQTRL (SEC ID nº 1).
(C) En un tercer grupo, el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, el tamaño de la cual es de 12 residuos, los primeros dos residuos de la cual son S y W, y los últimos cuatro residuos de la cual son Q, T, R y L, que consiste en X2X3X4X5X6QTRL, en la que X1, X2, X3, X4, X5 y X6 es cualquier residuo aminoácido (SEC Id nº 112).
En una realización particular, X1 es E, A, V o S, de manera que el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, el tamaño de la cual es de 12 residuos, los primeros dos residuos de la cual son S y W y los últimos cuatro residuos de la cual son Q, T, R y L, que consiste en SWEX2X3X4X5X6QTRL (SEC ID nº 113), SWAX2X3X4X5X6QTRL (SEC ID nº 114), SWVX2X3X4X5X6QTRL (SEC ID nº 115) o SWSX2X3X4X5X6QTRL (SEC ID nº 116), en el que cada uno de X2, X3, X4, X5 y X6 es cualquier residuo aminoácido.
En una realización particular, X2 es S, V, H, A o Y, de manera que el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, el tamaño de la cual es de 12 residuos, los primeros dos residuos de la cual son S y W y los últimos cuatro residuos de la cual son Q, T, R y L, que consiste en SWX1SX3X4X5X6QTRL (SEC ID nº 117), SWX1VX3X4X5X6QTRL (SEC ID NO:118), SWX1HX3X4X5X6QTRL (SEC ID nº 119), SWX1AX3X4X5X6QTRL (SEC ID nº 120) o SWX1YX3X4X5X6QTRL (SEC ID nº 121), en el que cada uno de X1, X3, X4, X5 y X6 es cualquier aminoácido.
En una realización particular, X3 es H, A, Y, K o Q, de manera que el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, el tamaño de la cual es de 12 residuos, los primeros dos residuos de la cual son S y W y los últimos cuatro residuos de la cual son Q, T, R y L, que consiste en SWX1X2HX4X5X6QTRL (SEC ID nº 122), SWX1X2AX4X5X6QTRL (SEC ID NO:123), SWX1X2YX4X5X6QTRL (SEC ID nº 124), SWX1X2KX4X5X6QTRL (SEC ID nº 125) o SWX1X2QX4X5X6QTRL (SEC ID nº 126), en el que cada uno de X1, X2, X4, X5 y X6 es cualquier aminoácido.
En una realización particular, X4 es K, A, Q, S o H, de manera que el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, el tamaño de la cual es de 12 residuos, los primeros dos residuos de la cual son S y W y los últimos cuatro residuos de la cual son Q, T, R y L, que consiste en SWX1X2X3KX5X6QTRL (SEC ID nº 127), SWX1X2X3AX5X6QTRL (SEC ID NO:128), SWX1X2X3QX5X6QTRL (SEC ID nº 129), SWX1X2X3SX5X6QTRL (SEC ID nº 130) o SWX1X2X3HX5X6QTRL (SEC ID nº 131), en el que cada uno de X1, X2, X3, X5 y X6 es cualquier aminoácido.
En una realización particular, X5 es S, H, G o T, de manera que el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, el tamaño de la cual es de 12 residuos, los primeros dos residuos de la cual son S y W y los últimos cuatro residuos de la cual son Q, T, R y L, que consiste en SWX1X2X3X4SX6QTRL (SEC ID nº 132), SWX1X2X3X4HX6QTRL (SEC ID nº 133), SWX1X2X3X4GX6QTRL (SEC ID nº 134) o SWX1X2X3X4TX6QTRL (SEC ID nº 135), en el que cada uno de X1, X2, X3, X4 y X6 es cualquier residuo aminoácido.
En una realización particular, X6 es G, T o Q, de manera que el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, el tamaño de la cual es de 12 residuos, los primeros dos residuos de la cual son S y W y los últimos cuatro residuos de la cual son Q, T, R y L, que consiste en SWX1X2X3X4X5QTRL (SEC ID nº 136), SWX1X2X3X4X5TQTRL (SEC ID nº 137) o SWX1X2X3X4X5QQTRL (SEC ID nº 138), en el que cada uno de X1, X2, X3, X4 y X5 es cualquier residuo aminoácido.
En una realización particular, en referencia a los polipéptidos de SEC ID nº 112 y SEC ID nº 122 a SEC ID nº 138 tal como se han definido anteriormente, X1 es E y/o X2 es V, tal como se da a conocer en la Tabla 1, a continuación:
Tabla 1
en el que X1 es E
en el que X2 es V en el que X1 es E y X2 es V
SEC ID nº 112
SWEX2X3X4X5X6QTRL (SEC ID nº X113) SWX1VX3X4X5X6QTRL (SEC ID nº 118) SWEVX3X4X5X6QTRL (SEC ID nº 190)
SEC ID nº 122
SWEX2HX4X5X6QTRL (SEC ID nº 139) SWX1VHX4X5X6QTRL (SEC ID nº 140) SWEVHX4X5X6QTRL (SEC ID nº 141)
SEC ID nº 123
SWEX2AX4X5X6QTRL (SEC ID nº 142) SWX1VAX4X5X6QTRL (SEC ID nº 143) SWEVAX4X5X6QTRL (SEC ID nº 144)
SEC ID nº 124
SWEX2YX4X5X6QTRL (SEC ID nº 145) SWX1VYX4X5X6QTRL (SEC ID nº 146) SWEVYX4X5X6QTRL (SEC ID nº 147)
SEC ID nº 125
SWEX2KX4X5X6QTRL (SEC ID nº 148) SWX1VKX4X5X6QTRL (SEC ID nº 149) SWEVKX4X5X6QTRL (SEC ID nº 150)
SEC ID nº 126
SWEX2QX4X5X6QTRL (SEC ID nº 151) SWX1VQX4X5X6QTRL (SEC ID nº 152) SWEVQX4X5X6QTRL (SEC ID nº 153)
SEC ID nº 127
SWEX2X3KX5X6QTRL (SEC ID nº 154) SWX1VX3KX5X6QTRL (SEC ID nº 155) SWEVX3KX5X6QTRL (SEC ID nº 156)
SEC ID nº 128
SWEX2X3AX5X6QTRL SWX1VX3AX5X6QTRL (SEC SWEVX3AX5X6QTRL (SEC
(SEC ID nº 157)
ID nº 158) ID nº 159)
SEC ID nº 129
SWEX2X3QX5X6QTRL (SEC ID nº 160) SWX1VX3QX5X6QTRL (SEC ID nº 161) SWEVX3QX5X6QTRL (SEC ID nº 162)
SEC ID nº 130
SWEX2X3SX5X6QTRL (SEC ID nº 163) SWX1VX3SX5X6QTRL (SEC ID nº 164) SWEVX3SX5X6QTRL (SEC ID nº 165)
SEC ID nº 131
SWEX2X3HX5X6QTRL (SEC ID nº 166) SWX1VX3HX5X6QTRL (SEC ID nº 167) SWEVX3HX5X6QTRL (SEC ID nº 168)
SEC ID nº 132
SWEX2X3X4SX6QTRL (SEC ID nº 169) SWX1VX3X4SX6QTRL (SEC ID nº 170) SWEVX3X4SX6QTRL (SEC ID nº 171)
SEC ID nº 133
SWEX2X3X4HX6QTRL (SEC ID nº 172) SWX1VX3X4HX6QTRL (SEC ID nº 173) SWEVX3X4HX6QTRL (SEC ID nº 174)
SEC ID nº 134
SWEX2X3X4GX6QTRL (SEC ID nº 175) SWX1VX3X4GX6QTRL (SEC ID nº 176) SWEVX3X4GX6QTRL (SEC ID nº 177)
SEC ID nº 135
SWEX2X3X4TX6QTRL (SEC ID nº 178) SWX1VX3X4TX6QTRL (SEC ID nº 179) SWEVX3X4TX6QTRL (SEC ID nº 180)
SEC ID nº 136
SWEX2X3X4X5GQTRL (SEC ID nº 181) SWX1VX3X4X5GQTRL (SEC ID nº 182) SWEVX3X4X5GQTRL (SEC ID nº 183X)
SEC ID nº 137
SWEX2X3X4X5TQTRL (SEC ID nº 184) SWX1VX3X4X5TQTRL (SEC ID nº 185) SWEVX3X4X5TQTRL (SEC ID nº 186)
SEC ID nº 138
SWEX2X3X4X5QQTRL (SEC ID nº 187) SWX1VX3X4X5QQTRL (SEC ID nº 188) SWEVX3X4X5QQTRL (SEC ID nº 189)
en los que cada uno de X1, X2, X3, X4, X5 y X6, en caso aplicable, es cualquier residuo aminoácido.
En una realización particular, el dominio de unión a MAST-2 consta de 12 residuos, sus primeros dos residuos son S y W y sus últimos cuatro residuos son Q, T, R y L, que consisten en la secuencia SWX1X2X3X4X5X6QTRL, en la que X1 es E, A, V o S, X2 es S, V, H, A o Y, X3 es H, A, Y, K o Q, X4 es K, A, Q, S o H, X5 es S, H, G o T y X6es G, T o Q
5 (SEC ID nº 191). En dicha realización, el dominio de unión a MAST-2 consta de la secuencia S-W-E/A/V/S-S/V/H/A/Y-H/A/Y/K/Q-K/A/Q/S/H-S/H/G/T-G/T/Q-QTRL.
(D) En un cuarto grupo, el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, el tamaño de la cual es de 12 residuos, los primeros dos residuos de la cual son S y W, y los últimos cuatro residuos de la cual son Q, T, R y L, 10 seleccionando dicho dominio de entre el grupo que consiste en: SWX1HKSGGQTRL (SEC ID nº 102), SWX1SKSGGQTRL (SEC ID nº 103), SWX1SHSGGQTRL (SEC ID nº 104), SWX1SHKGGQTRL (SEC ID nº 105) y SWX1SHKSGQTRL (SEC ID nº 106), en el que X1 es cualquier aminoácido, preferentemente E o A, más preferentemente E. De esta manera, en una realización particular, el dominio de unión a MAST-2 consiste en la secuencia, el tamaño de la cual es de 12 residuos, los primeros tres residuos de la cual son S, W y E y los
15 últimos cuatro residuos de la cual son Q, T, R y L, seleccionando dicho dominio de entre el grupo que consiste en: SWEHKSGGQTRL (SEC ID nº 107), SWESKSGGQTRL (SEC ID nº 108), SWESHSGGQTRL (SEC ID nº 109), SWESHKGGQTRL (SEC ID nº 110) y SWESHKSGQTRL (SEC ID nº 111).
El dominio de unión a MAST-2 de dicho cuarto grupo puede obtenerse mediante deleción de un residuo 20 aminoácido de la secuencia SWESHKSGGQTRL (SEC ID nº 1).
(E) En un quinto grupo, el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, el tamaño de la cual es de 13 residuos, los primeros dos residuos de la cual son S y W, y los últimos cuatro residuos de la cual son Q, T, R y L, que consiste en SWX1X2X3X4X5X6X7QTRL, en la que cada uno de X1, X2, X3, X4, X5, X6 y X7, es cualquier residuo
25 aminoácido (SEC ID nº 192), en la que dicho dominio de unión a MAST-2 no consiste en SWESHKSGGQTRL. En una realización particular, el dominio de unión a MAST-2, el tamaño del cual es de 13 residuos no es SWESHKSGGQTRL (SEC ID nº 1) ni SWESYKSGGQTRL (SEC ID nº 16).
En una realización particular, el dominio de unión a MAST-2 de 13 residuos difiere de SWESHKSGGQTRL (SEC ID
30 nº 1) en como mínimo 1 sustitución de residuo aminoácido, en como mínimo 2 sustituciones o en como mínimo 3 sustituciones, con la condición de que los primeros dos residuos sean S y W y los cuatro últimos residuos son Q, T, R y L; en una realización más particular, el dominio de unión a MAST-2 de 13 residuos que difiere de SWESHKSGGQTRL en como mínimo 1 sustitución no es SWESYKSGGQTRL (SEC ID nº 16).
En una realización particular, el dominio de unión a MAST-2 consiste en 13 residuos y difiere de SWESHKSGGQTRL en 1 sustitución en un residuo situado entre SW y QTRL; en una realización particular, no es la sustitución del residuo de histidina (H) por un residuo de tirosina (Y).
En una realización particular de SWX1X2X3X4X5X6X7QTRL, X1 es E o A, y cada uno de X2, X3, X4, X5, X6 y X7 es cualquier residuo aminoácido (SEC ID nº 193).
En una realización particular de SWX1X2X3X4X5X6X7QTRL, X2 se selecciona de entre residuos neutros polares, residuos cargados negativamente o residuos hidrofóbicos (SEC ID nº 194) y preferentemente es S, V o E (SEC ID nº 195), en el que X1, X3, X4, X5, X6 y X7 es cualquier residuo aminoácido.
En una realización particular de SWX1X2X3X4X5X6X7QTRL, X3 se selecciona de entre residuos cargados positivamente, residuos no polares de volumen pequeño y residuos aromáticos polares (SEC ID nº 196) y preferentemente es H, A o Y (SEC ID nº 197), en el que X1, X2, X4, X5, X6 y X7 es cualquier residuo aminoácido.
En una realización particular de SWX1X2X3X4X5X6X7QTRL, X4 se selecciona de entre residuos no polares de volumen pequeño y residuos cargados positivamente (SEC ID nº 198) y preferentemente es K, A o Q (SEC ID nº 199), en el que X1, X2, X3, X5, X6 y X7 es cualquier residuo aminoácido.
En una realización particular de SWX1X2X3X4X5X6X7QTRL, X5 se selecciona de entre residuos neutros polares y residuos cargados positivamente (SEC ID nº 200) y preferentemente es S o H (SEC ID nº 201), en el que X1, X2, X3, X4, X6 y X7 es cualquier residuo aminoácido.
En una realización particular de SWX1X2X3X4X5X6X7QTRL, X6 se selecciona de entre residuos no polares de volumen pequeño, preferentemente residuos neutros preferentemente flexibles y polares (SEC ID nº 202) y preferentemente es G o T (SEC ID nº 203), en el que X1, X2, X3, X4, X5 y X7 es cualquier residuo aminoácido.
En una realización particular de SWX1X2X3X4X5X6X7QTRL, X7 se selecciona de entre residuos no polares de volumen pequeño, preferentemente residuos neutros polares y flexibles (SEC ID nº 204) y preferentemente es G o Q (SEC ID nº 205), en el que X1, X2, X3, X4, X5 y X6 es cualquier residuo aminoácido.
Los residuos aminoácidos correspondientes a los residuos neutros polares, residuos cargados positivamente, residuos cargados negativamente, residuos hidrofóbicos, residuos no polares de volumen pequeño y residuos aromáticos polares son los indicados en la literatura convencional y que se confirman en las listas, posteriormente.
En una realización más particular, dicho dominio de unión a MAST2 consiste en la secuencia SWX1X2X3X4X5X6X7QTRL, en la que X1 es E o A y/o X2 es S, V o E y/o X3 es H, A o Y y/o X4 es K, A o Q y/o X5 es S
o H y/o X6 es G o T y/o X7 es G o Q, en el que X1,X2,X3,X4, X5, X6 y X7 no son, conjuntamente, E, S, H, K, S, G y G. En una realización particular, X1, X2, X3, X4, X5, X6 y X7 no son conjuntamente E, S, H, K, S, G y G, respectivamente, ni son conjuntamente, E, S, Y, K, S, G y G, respectivamente.
De esta manera, en una realización preferente, la secuencia del dominio de unión a MAST-2 es S-W-E/A-S/V/E-H/A/Y-K/A/Q-S/H-G/T-G/Q-QTRL tal como se define en la SEC ID nº 206, con la condición de que el dominio de unión a MAST-2 no sea SWESHKSGGQTRL (SEC ID nº 1); en una realización más particular, el dominio de unión a MAST-2 de la secuencia S-W-E/A-S/V/E-H/A/Y-K/A/Q-S/H-G/T-G/Q-QTRL no es SWESHKSGGQTRL (SEC ID nº 1) ni SWESYKSGGQTRL (SEC ID nº 16). En otra realización preferente, la secuencia del dominio de unión a MAST-2 es S-W-E/A-V/E-H/A-A/Q-S/H-G/T-G/Q-QTRL tal como se define en la SEC ID nº 207. Los dominios de unión a MAST-2 preferentes constan de la secuencia SWAEAQHTQQTRL (SEC ID nº 208) o SWEVHASGGQTRL (SEC ID nº 209).
En una realización particular, el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, el tamaño de la cual es de 11 o 12 residuos, los primeros dos residuos de la cual son S y W y los cuatro últimos residuos de la cual son Q, T, R y L, seleccionados de entre los grupos (A), (B), (C) y (D), tal como se ha detallado anteriormente.
En otra realización, el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, el tamaño de la cual es de 11 residuos, los primeros dos residuos de la cual son S y W y los cuatro últimos residuos de la cual son Q, T, R y L, seleccionados de entre los grupos (A) y (B), tal como se ha detallado anteriormente.
En otra realización, el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, el tamaño de la cual es de 12 residuos, los primeros dos residuos de la cual son S y W y los cuatro últimos residuos de la cual son Q, T, R y L, seleccionados de entre los grupos (C) y (D), tal como se ha detallado anteriormente.
En otra realización, el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, el tamaño de la cual es de 13 residuos, los primeros dos residuos de la cual son S y W y los cuatro últimos residuos de la cual son Q, T, R y L, seleccionados de entre el grupo (E), tal como se ha detallado anteriormente.
En una realización particular, la secuencia del dominio citoplasmático situado antes del dominio de unión a MAST-2 del polipéptido de la invención es:
-
un polipéptido que contiene 20 a 40 residuos aminoácidos, de manera que el tamaño del dominio citoplasmático entero (secuencia del dominio citoplasmático situada antes del dominio de unión a MAST-2 y el dominio de unión a MAST-2) es de 31 a 53 residuos, preferentemente de 31 a 52 o de 31 a 51 residuos. En una realización particular, la secuencia del dominio citoplasmático situada antes del dominio de unión a MAST-2 consta de 25 a 45 residuos. En otra realización, la secuencia del dominio citoplasmático situada antes del dominio de unión a MAST-2 presenta 31 residuos, de manera que el dominio citoplasmático entero es de 42 a 44 residuos, preferentemente 42 residuos, 43 residuos o 44 residuos. Puede seleccionarse cualquier dominio citoplasmático con la condición de que éste permita la unión del dominio de unión a MAST-2 al dominio PDZ de la proteína MAST-2 humana. Pueden encontrarse ejemplos particulares de dominios citoplasmáticos de la proteína G en Schnell M.J. et al., 1998 y Owens R.J. et al., 1993. La unión del dominio de unión a MAST-2 al dominio PDZ de la proteína MAST-2 humana y, de esta manera, la afinidad del polipéptido de la invención para el dominio PDZ de la proteína MAST2 humana, puede someterse a ensayo mediante el método detallado anteriormente para el cálculo de KD, o
-
la secuencia del dominio citoplasmático situada antes del dominio de unión a MAST-2 es un fragmento del dominio citoplasmático de una proteína G del virus de la rabia, en particular un fragmento del dominio citoplasmático de una proteína G de una cepa atenuada del virus de la rabia o un fragmento del dominio citoplasmático de una proteína G de una cepa virulenta del virus de la rabia; en una realización particular, la secuencia del dominio citoplasmático situada antes del dominio de unión a MAST-2 consiste en la secuencia siguiente: RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIIS (SEC ID nº 2) o una variante que presenta por lo menos 80%, por lo menos 85% o por lo menos 90% de identidad respecto a la SEC ID nº 2, conservando dicha variante la capacidad de unir el dominio de unión a MAST-2 del polipéptido de la invención al dominio PDZ de la proteína PDZ humana. El porcentaje de identidad se calcula en la secuencia más corta de las dos, es decir, en la más corta de entre la SEC ID nº 2 y la de dicha variante. Una variante con por lo menos 80%, por lo menos 85% o por lo menos 90% de identidad respecto a la SEC ID nº 2, se define como una variante por una o más adiciones y/o una o más deleciones y/o una o más sustituciones. Un ejemplo de una variante de la SEC ID nº 2 es un polipéptido que consiste en la secuencia RRVNRSEPTQLNLRGTGREVSVTPQSGKIIS (SEC ID nº 5). En una realización particular, la variante presenta una identidad de por lo menos 90% respecto a la SEC ID nº 2 y se obtiene mediante 1, 2 o 3 sustituciones en la SEC ID nº 2, preferentemente mediante una o más sustituciones conservadoras tal como se definen en la literatura, o según la lista siguiente:
-
el grupo de los residuos aminoácidos no polares (es decir, hidrofóbicos): un primer subgrupo que incluye la alanina (A), la glicina (G) y la prolina (P) y un segundo subgrupo que incluye la leucina (L), la isoleucina (I) y la valina (V); -el grupo de los residuos aminoácidos polares neutros (sin carga): un primer subgrupo que incluye la serina (S), la treonina (T), la cisteína (C) y la metionina (M) y un segundo subgrupo que incluye la asparagina (N) y la glutamina (Q); -el grupo de residuos de carga positiva (es decir, básicos), incluyendo la arginina (R), la lisina (K) y la histidina (H); -el grupo de los residuos de carga negativa (es decir, ácidos), incluyendo el ácido aspártico (D) y el ácido glutámico (E), y -el grupo de los residuos aromáticos, incluyendo la fenilalanina (F), el triptófano (W) y la tirosina (Y).
En una realización particular, y con independencia de la secuencia del dominio citoplasmático situada antes del dominio de unión a MAST-2 y la secuencia del dominio de unión a MAST-2, el dominio de anclaje del polipéptido de la invención es:
-
un péptido de tamaño 18 a 26 aminoácidos, que ancla (o que se ha demostrado que ancla) un polipéptido en la membrana del retículo endoplasmático y/o la membrana del aparato de Golgi en las células (en particular células neuronales, más particularmente células neuronales humanas) (figura 1). Pueden encontrarse ejemplos particulares de dominios de anclaje en Schroth-Diez B. et al., 2000. En una realización particular, el tamaño del dominio de anclaje es de 20 a 24 residuos aminoácidos. En una realización particular, el tamaño del dominio de anclaje es de 22 residuos aminoácidos. Puede seleccionarse cualquier dominio de anclaje con la condición de que ancle el polipéptido de la invención en la membrana del retículo endoplasmático y/o en la membrana del aparato de Golgi en las células (en particular en las células neuronales, más particularmente en células neuronales humanas). En una realización particular, el dominio de anclaje es un dominio transmembranal, es decir, cualquier dominio capaz de interactuar con la bicapa lipidica, y en particular capaz de anclar el polipéptido que lo comprende, en la bicapa lipidica, especialmente en la membrana celular. Un dominio transmembranal es un dominio rico en residuos hidrofóbicos (A, G, P, L, I y/o V) y estable en una membrana, y se organiza en una o más hélices alfa hidrofóbicas. En una realización particular, el dominio transmembranal utilizado en el polipéptido que se describe en la presente memoria es el dominio transmembranal (en forma de fragmento) de una proteína transmembranal conocida. Pueden encontrarse ejemplos particulares de dominios transmembranales en
Schroth-Diez B. et al., 2000. El anclaje correcto del polipéptido de la invención puede determinarse comprobando la afinidad del polipéptido de la invención para el dominio PDZ de la proteína MAST2 humana, mediante la implementación del método detallado anteriormente para el cálculo de la KD, o
-
el dominio transmembranal de la proteína G del virus de la rabia, en particular el dominio transmembranal de la proteína G de una cepa atenuada de virus de la rabia o el dominio transmembranal del dominio citoplasmático de la proteína G de una cepa virulenta de virus de la rabia; en una realización preferente, el dominio transmembranal comprende o consiste en la secuencia YVLLSAGALTALMLIIFLMTCC (SEC ID nº 4) o una variante que presenta por lo menos 81%, por lo menos 86%, por lo menos 90% o por lo menos 95% de identidad respecto a dicha SEC Id Nº 4, conservando dicha variante la capacidad de anclar el polipéptido en la membrana del retículo endoplasmático y/o la membrana del aparato de Golgi en las células; el porcentaje de identidad se calcula a lo largo de la más corta de las dos secuencias, es decir, la más corta de entre la SEC ID nº 4 y dicha variante de dominio transmembranal. Una variante con por lo menos 81%, por lo menos 86%, por lo menos 90%
o por lo menos 95% de identidad respecto a la SEC ID nº 4, se define como una variante por una o más adiciones y/o una o más deleciones y/o una o más sustituciones. En una realización particular, una variante que presenta una identidad de por lo menos 90% o por lo menos 95% respecto a la SEC ID nº 4 se obtiene mediante 1 o 2 sustituciones en la SEC ID nº 4, preferentemente mediante una o más sustituciones conservadoras tal como se definen en la literatura, o según la lista anterior.
Con independencia de la secuencia del dominio de anclaje (preferentemente el dominio transmembranal) tal como se define en la presente memoria:
-
el extremo N-terminal de dicho dominio de anclaje se une, directa o indirectamente, al extremo C-terminal del péptido de señal tal como se define en la presente memoria, y -el extremo C-terminal de dicho dominio de anclaje se une, directa o indirectamente, preferentemente de manera directa, al primer residuo aminoácido N-terminal del dominio citoplasmático tal como se define en la presente memoria.
En una realización particular, y con independencia de la secuencia del dominio citoplasmático anterior al dominio de unión a MAST-2, la secuencia del dominio de unión a MAST-2 y la secuencia del dominio de anclaje, el péptido de señal (que puede ser opcional) del polipéptido de la invención es:
-
un péptido, de tamaño entre 3 y 60 residuos, con diana (o que se ha demostrado que presenta como diana) un polipéptido en el retículo endoplasmático y opcionalmente a través de la ruta secretoria (figura 1); en una realización particular, el tamaño del péptido de señal es de 10 a 40, preferentemente de 15 a 30, más preferentemente de 15 a 25 residuos aminoácidos. En una realización particular, el tamaño del péptido de señal es de 19 residuos aminoácidos. Puede seleccionarse cualquier péptido de señal con la condición de que presente como diana el polipéptido de la invención en el retículo endoplasmático y opcionalmente a través de la ruta secretoria. En una realización particular, el péptido de señal utilizado en el polipéptido indicado en la presente memoria es el péptido de señal de una proteína conocida, tal como las proteínas CD4 y CD8, la hemaglutinina (HA) o un receptor de citoquina (por ejemplo, IL1R1, EGFR1, HER2, HER3 o HER4). La diana correcta del polipéptido de la invención puede determinarse comprobando la afinidad del polipéptido de la invención para el dominio PDZ de la proteína MAST2 humana, mediante la implementación del método detallado anteriormente para el cálculo de la KD, o
-
el péptido de señal de una proteína G del virus de la rabia, en particular el péptido de señal de la proteína G de una cepa atenuada de virus de la rabia o el péptido de señal del dominio citoplasmático de una proteína G de una cepa virulenta de virus de la rabia; en una realización preferente, el péptido de señal de una proteína G de virus de la rabia corresponde a los 19 primeros residuos aminoácidos de la proteína G. En una realización particular, dicho péptido de señal comprende o consiste en la secuencia MVPQALLFVPLLVFPLCFG (SEC ID nº 3) o una variante que presenta por lo menos 68%, por lo menos 73%, por lo menos 89% o por lo menos 94% de identidad respecto a dicha SEC ID nº 3, conservando dicha variante la capacidad de reconocer como diana el polipéptido en el retículo endoplasmático y opcionalmente a través de la ruta secretoria; el porcentaje de identidad se calcula a lo largo de la más corta de las dos secuencias, es decir, a lo largo de la más corta de entre la SEC ID nº 3 y dicha variante de péptido de señal. Una variante con por lo menos 68%, por lo menos 73%, por lo menos 89% o por lo menos 94% de identidad respecto a la SEC ID nº 3, se define como una variante por una
o más adiciones y/o una o más deleciones y/o una o más sustituciones. En una realización particular, una variante que presenta una identidad de por lo menos 89% o por lo menos 94% respecto a la SEC ID nº 3 se obtiene mediante 1 o 2 sustituciones en la SEC ID nº 3, preferentemente mediante una o más sustituciones conservadoras tal como se definen en la literatura, o según la lista anterior.
Con independencia de la secuencia del péptido de señal tal como se define en la presente memoria, dicho péptido de señal, en caso de hallarse presente, es el elemento más N-terminal del polipéptido de la invención.
La expresión "enlace directo" se refiere a que el último residuo C-terminal de un dominio se une mediante un enlace peptídico al primer residuo N-terminal del dominio siguiente.
En contraste, la expresión "enlace indirecto" se refiere a que el último residuo C-terminal de un dominio se une
5 mediante un enlace peptídico al primer residuo N-terminal de un conector peptídico, el último residuo C-terminal del cual se une al primer residuo N-terminal del dominio siguiente. En una realización particular, y con independencia de la secuencia del dominio citoplasmático situado antes del dominio de unión a MAST-2, la secuencia del dominio de unión a MAST-2, la secuencia del péptido de señal y la secuencia del dominio de anclaje, el polipéptido de la invención comprende opcionalmente, entre el péptido de señal y el dominio de anclaje, ambos definidos en la
10 presente memoria, un conector peptídico que consiste en uno a cuatro aminoácidos, preferentemente uno a cuatro aminoácidos del extremo C-terminal del ectodominio de la proteína G del virus de la rabia, preferentemente los dos últimos residuos C-terminal del ectodominio de la proteína G del virus de la rabia, por ejemplo los residuos aminoácidos GK.
15 De esta manera, un polipéptido particular de la invención comprende o consiste en, de extremo N-terminal a extremo C-terminal:
(1) un péptido de señal tal como se define en la SEC ID nº 3 o una variante que presenta una identidad de por lo
menos 68% respecto a dicha SEC ID nº 3, conservando dicha variante la capacidad de reconocer como diana el 20 polipéptido en el retículo endoplasmático y opcionalmente a través de la ruta secretoria,
(2)
opcionalmente, los dos últimos residuos C-terminales del ectodominio de la proteína G del virus de la rabia, preferentemente los residuos aminoácidos GK,
(3)
un dominio de anclaje tal como se define en la SEC ID nº 4 o una variante que presenta una identidad de por
lo menos 81% respecto a dicha SEC ID nº 4, conservando dicha variante la capacidad de anclar el polipéptido en 25 la membrana del retículo endoplasmático y/o la membrana del aparato de Golgi en las células, y
(4) un dominio citoplasmático que comprende o que consiste en (a) un péptido tal como se define en la SEC ID nº 2 o una variante que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a la SEC ID nº 2 y (b) un dominio de unión a MAST-2 tal como se define en la SEC ID nº 19 a SEC ID nº 209, preferentemente seleccionado de entre el grupo que consiste en la SEC ID nº 19 a SEC ID nº 101, SEC ID nº 102 a SEC ID nº 191 y SEC ID nº
30 192 a SEC ID nº 209, más preferentemente tal como se define en las SEC ID nº 64 a nº 68, nº 71, nº 74 y nº 208 a nº 209. En una realización particular, el péptido tal como se define en la SEC ID nº 2 o la variante que presenta una identidad de por lo menos 90% respecto a la SEC ID nº 2 se encuentra situada antes (es decir, Nterminalmente respecto a), preferentemente unida directamente, del dominio de unión a MAST-2.
35 El tamaño del polipéptido de la invención es como máximo de 350, como máximo de 250, como máximo de 200 o como máximo de 150 residuos aminoácidos. En una realización preferente, el tamaño del polipéptido de la invención es de como máximo 100 residuos aminoácidos y preferentemente es de 85 a 87 residuos aminoácidos y más preferentemente es de 85, 86 o 87 residuos aminoácidos.
40 En una realización particular de la invención, el polipéptido de la invención está privado del ectodominio de la proteína G del virus de la rabia, preferentemente con la excepción de los últimos dos aminoácidos del extremo Cterminal del ectodominio. Más particularmente, el polipéptido de la invención no es una proteína G de longitud completa de tipo salvaje de una cepa de virus de la rabia, ni de una cepa no apoptótica (cepa neurovirulenta, tal como la cepa CVS-NIV) ni de una cepa apoptótica (cepa atenuada). En otra realización particular, el polipéptido de
45 la invención presenta una identidad inferior a 75%, inferior a 60% o inferior a 50% respecto a la proteína G de longitud completa de tipo salvaje de una cepa del virus de la rabia, a lo largo de la más corta de las dos secuencias (es decir, a lo largo del más corto de entre el polipéptido e la invención y la proteína G de longitud completa de tipo salvaje de una cepa de virus de la rabia).
50 En una realización particular, el polipéptido de la invención consta de la secuencia MVPQALLFVPLLVFPLCF-GGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIIS (SEC ID nº 17), directamente unida al dominio de unión a MAST-2 tal como se define en la SEC ID nº 19 a SEC ID nº 209, preferentemente seleccionado de entre el grupo que consiste en SEC ID nº 19 a SEC ID nº 101, SEC ID nº 102 a SEC ID nº 191 y SEC ID nº 192 a SEC ID nº 209, más preferentemente tal como se define en las SEC ID nº 64 a nº 68, nº 71, nº 74 y
55 nº 208 a nº 209. En otra realización, el polipéptido de la invención consiste en la secuencia MVPQALLFVPLLVFPLCFGGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSEPTQLNLRGTGREVSVTPQSGKIIS (SEC ID nº 18), unida directamente a un dominio de unión a MAST-2 tal como se define en la SEC Id Nº 19 a SEC ID nº 209, preferentemente seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID nº 19 a SEC ID nº 101, SEC ID nº 102 a SEC ID nº 191 y SEC ID nº 192 a SEC ID nº 209, más preferentemente tal como se define en las SEC ID nº 64 a nº
60 68, nº 71, nº 74 y nº 208 a nº 209.
El polipéptido de la invención no comprende o no consiste en la secuencia tal como se define en la SEC ID nº 9 (Neurovita 1).
Además, el número de acceso NCBI CAI43218 se refiere a la glucoproteína G que consiste en la secuencia siguiente:
MVPQALLFVPLLGFSLCFGKFPIYTIPDELGPWSPIDIHHLSCPNNLVVEDEGCTNLSEFSYMELKVGYISAIKVNGF TCTGVVTEAETYTNFVGYVTTTFKRKHFRPTPDACRAAYNWKMAGDPRYEESLHNPYPDYHWLRTVRTTKESLIII SPSVTDLDPYDKSLHSRVFPGGKCSGITVSSTYCSTNHDYTIWMPENPRPRTPCDIFTNSRGKRASKGNKTCGFV DERGLYKSLKGACRLKLCGVLGLRLMDGTWVAMQTSDETKWCPDQLVNLHDFRSDEIEHLVVEELVKKREECLD ALESIMTTKSVSFRRLSHLRKLVPGGKAYTIFNKTLMEADAHYKSVRTWNEIIPSKGCLKVGGRCHPHVNGVFFNG IILGPDGHVLIPEMQSSLLQQHMELLKSSVIPLMHPLADPSTVFKEGDEAEDFVEVHLPDVYKQISGVDLGLPNWG KYVLMTAGAMIGLVLIFSLMTWCRRANRPESKQRSFGGTGRNVSVTSQSGKVIPSWESYKSGGQTRL (SEC ID nº 14).
De esta manera, en una realización particular, el polipéptido de la invención no comprende o consiste en MVPQALLFVPLLGFSLCFGGKYVLMTAGAMIGLVLIFSLM TWCRRANRPESKQRSFGGTGRNVSVTSQSGKVIPSWESYKSGGQTRL (SEC ID nº 15).
En otra realización particular, el dominio de unión a MAST-2 de un polipéptido de la invención no es SWESYKSGGQTRL (SEC ID nº 16).
Se seleccionan ejemplos particulares de polipéptidos de la invención de entre el grupo que consiste en (el dominio de unión a MAST-2 se muestra en negrita):
(1)
MVPQALLFVPLLVFPLCFGGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSE PTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHGGQTRL (Neurovita 2) (SEC ID nº 210),
(2)
MVPQALLFVPLLVFPLCFGGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSE PTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHGQQTRL (Neurovita 3) (SEC ID nº 211),
(3)
MVPQALLFVPLLVFPLCFGGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSE PTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVATQQTRL (SEC ID nº 212),
(4)
MVPQALLFVPLLVFPLCFGGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSE PTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVYTGQTRL(SEC ID nº 213),
(5)
MVPQALLFVPLLVFPLCFGGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSE PTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHTGQTRL (SEC ID nº 214),
(6)
MVPQALLFVPLLVFPLCFGGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSE PTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHTQQTRL (SEC ID nº 215),
(7)
MVPQALLFVPLLVFPLCFGGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSE PTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVAGGQTRL (SEC ID nº 216),;
(8)
MVPQALLFVPLLVFPLCFGGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSE PTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWAEAQHTQQTRL (SEC ID nº 217) y
(9)
MVPQALLFVPLLVFPLCFGGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSE PTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHASGGQTRL (SEC ID nº 218).
El término "polipéptido" tal como se define en la presente memoria comprende polipéptidos que han sido modificados mediante modificación post-transcripcional y/o mediante química sintética, por ejemplo mediante la adición de un grupo químico no proteico y/o mediante la modificación de la estructura terciaria del polipéptido, por ejemplo mediante acetilación, acilación, hidroxilación, ciclización, racemización, fosforilación, etc., con la condición de que el polipéptido modificado resultante mantenga una elevada afinidad, tal como se ha definido anteriormente, para el dominio PDZ de la proteína MAST2 humana.
La invención se refiere además a los dominios de unión a MAST-2 como tales, que consisten en 11 a 13 residuos aminoácidos tal como se definen en los grupos A a E, anteriormente.
La invención se refiere además a un polipéptido que comprende o que consiste en, de extremo N-terminal a extremo C-terminal:
(1)
opcionalmente, un péptido de señal, preferentemente un péptido de señal tal como se define en la SEC ID nº 3 o una variante que presenta una identidad de por lo menos 68% respecto a dicha SEC ID nº 3, conservando dicha variante la capacidad de reconocer como diana el polipéptido en el retículo endoplasmático y opcionalmente a través de la ruta secretoria,
(2)
opcionalmente, los últimos dos residuos C-terminales del ectodominio de la proteína G de virus de la rabia,
(3)
un dominio de anclaje, preferentemente un dominio de anclaje tal como se define en la SEC ID nº 4 o una variante que presenta una identidad de por lo menos 81% respecto a dicha SEC ID nº 4 que conserva la capacidad de anclar el polipéptido a la membrana del retículo endoplasmático y/o a la membrana del aparato de Golgi en las células, y
(4)
un dominio citoplasmático que comprende o que consiste en (a) una parte citoplasmática antes del dominio de unión a MAST-1, preferentemente un péptido tal como se define en la SEC ID nº 2 o una variante que
presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a la SEC ID nº 2 y (b) un dominio de unión a MAST-2 tal como se ha definido anteriormente en los grupos A a E. En una realización particular, dicho dominio de unión a MAST-2 es tal como se define en la SEC ID nº 19 a SEC ID nº 209, preferentemente seleccionado de entre el grupo que consiste en la SEC ID nº 19 a SEC ID nº 101, SEC ID nº 102 a SEC ID nº 191 y SEC ID nº 192 a 5 SEC ID nº 209, más preferentemente tal como se define en las SEC ID nº 64 a nº 68, nº 71, nº 74 y nº 208 a nº
209.
De esta manera, como realización particular, la invención se refiere a un polipéptido de como máximo 350 aminoácidos que comprende, de extremo N-terminal a extremo C-terminal, un dominio para el anclaje de dicho 10 polipéptido a la membrana del retículo y/o a la membrana del Golgi (es decir, el dominio de anclaje) y un dominio expuesto citoplasmáticamente (es decir, el dominio citoplasmático) al encontrarse el polipéptido anclaje a la membrana, en el que dicho dominio citoplasmático termina con un dominio de unión a MAST-2 tal como se define en los grupos A a E, anteriormente, el tamaño del cual es de 11 a 13 residuos aminoácidos. Dicho polipéptido corresponde al polipéptido tal como se ha definido anteriormente aunque privado de su péptido de señal, tras el
15 corte de dicho péptido de señal después de que el polipéptido tal como se ha definido anteriormente se haya anclado a la membrana. De esta manera, la invención se refiere además a un polipéptido que comprende o que consiste en, de extremo N-terminal a extremo C-terminal:
(1) opcionalmente, los últimos dos residuos C-terminales del ectodominio de la proteína G de virus de la rabia,
20 (2) un dominio de anclaje, preferentemente un dominio de anclaje tal como se define en la SEC ID nº 4 o una variante que presenta una identidad de por lo menos 81% respecto a dicha SEC ID nº 4 que conserva la capacidad de anclar el polipéptido a la membrana del retículo endoplasmático y/o a la membrana del aparato de Golgi en las células, y
(3) un dominio citoplasmático que comprende o que consiste en (a) una parte citoplasmática antes del dominio
25 de unión a MAST-1, preferentemente un péptido tal como se define en la SEC ID nº 2 o una variante que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a la SEC ID nº 2 y (b) un dominio de unión a MAST-2 tal como se ha definido anteriormente en los grupos A a E. En una realización particular, dicho dominio de unión a MAST-2 es tal como se define en la SEC ID nº 19 a SEC ID nº 209, preferentemente seleccionado de entre el grupo que consiste en la SEC ID nº 19 a SEC ID nº 101, SEC ID nº 102 a SEC ID nº 191 y SEC ID nº 192 a
30 SEC ID nº 209, más preferentemente tal como se define en las SEC ID nº 64 a nº 68, nº 71, nº 74 y nº 208 a nº
209.
Como realización particular, dicho polipéptido consiste en la secuencia siguiente:
35 -residuos 20 a 74 de SEC ID nº 17 o nº 18, unido directamente a un dominio de unión a MAST-2 tal como se ha definido anteriormente en los grupos A a E, tal como los definidos en la SEC ID nº 19 a SEC ID nº 209, preferentemente seleccionado de entre el grupo que consiste en SEC ID nº 19 a SEC ID nº 101, SEC ID nº 102 a SEC ID nº 191 y SEC ID nº 192 a SEC ID nº 209, más preferentemente tal como se define en las SEC ID nº 64 a nº 68, nº 71, nº 74 y nº 208 a nº 209, o
40 -residuos 20 a 85 de una de las secuencias SEC ID nº 210 a nº 216 o residuos 20 a 87 de la SEC ID nº 217 o nº
218.
La invención se refiere además a cualquier polinucleótido (o ácido nucleico) codificante de un polipéptido de la invención tal como se define en la presente memoria, de acuerdo con el código genético universal, considerando su 45 degeneración. En una realización particular, el polinucleótido de la invención es ADN, ARN, como cadena positiva o cadena negativa (en el caso de que se encuentre, por ejemplo, en una partícula vírica) o como ADNc (en el caso de que se encuentre, por ejemplo, en una célula transfectada por una partícula vírica). El tamaño del polinucleótido de la invención es como máximo de 1050, como máximo de 750, como máximo de 600 o como máximo de 450 pares de bases (pb). En una realización preferente, el tamaño del polinucleótido de la invención es de como máximo 300
50 pb y preferentemente es de entre 255 y 261 pb, y más preferentemente es de 255, 258 o 261 pb.
Estos son ejemplos de polinucleótidos codificantes de los diferentes dominios de los polipéptidos de la invención indicados en la presente memoria:
55 -el péptido de señal está codificado, por ejemplo, por un polinucleótido situado entre los nucleótidos 1 y 57 de la SEC ID nº 219, posteriormente, -los 2 últimos residuos aminoácidos del ectodominio están codificados, por ejemplo, por un polinucleótido situado entre los nucleótidos 58 y 63 de la SEC ID nº 219, posteriormente, -el dominio transmembranal está codificado, por ejemplo, por un polinucleótido situado entre los nucleótidos 64 60 y 129 de la SEC ID nº 219, posteriormente, y -la parte citoplasmática antes del dominio de unión a MAST-2 está codificada, por ejemplo, por un polinucleótido situado entre los nucleótidos 130 y 222 de la SEC ID nº 219, posteriormente.
Según el tamaño del dominio de unión a MAST-2, el polinucleótido codificante del dominio de unión a MAST-2 se encuentra situado entre los nucleótidos 223 y 255 de una SEC ID seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID nº 219 a nº 225 o entre los nucleótidos 223 y 261 de la SEC ID nº 226 o nº 227.
En una realización particular, los polinucleótidos de la invención comprenden, en su parte N-terminal, un polinucleótido codificante de un péptido de señal.
Algunos polinucleótidos particulares consisten en las secuencias siguientes:
(1)
polinucleótido codificante de Neurovita 2 (tal como se define en la SEC ID nº 210):
ATGGTTCCTCAGGCTCTCCTGTTTGTACCCCTTCTGGTTTTTCCATTGTGT TTTGGGGGGAAGTATGTATTACTGAGTGCAGGGGCCCTGACTGCCTTGATGTTGATAATTTTCCTGATGACAT GTTGTAGAAGAGTCAATCGATCAGAACCTACGCAACACAATCTCAGAGGGACAGGGAGGGAGGTGTCAGTC ACTCCCCAAAGCGGGAAGATCATATCTTCATGGGAAGTACACGGGGGTCAGACCAGACTGTGA (SEC ID nº 219);
(2)
polinucleótido codificante de Neurovita 3 (tal como se define en la SEC ID nº 211):
ATGGTTCCTCAGGCTCTCCTGTTTGTACCCCTTCTGGTTTTTCCATTGTGT TTTGGGGGGAAGTATGTATTACTGAGTGCAGGGGCCCTGACTGCCTTGATGTTGATAATTTTCCTGATGACAT GTTGTAGAAGAGTCAATCGATCAGAACCTACGCAACACAATCTCAGAGGGACAGGGAGGGAGGTGTCAGTC ACTCCCCAAAGCGGGAAGATCATATCTTCATGGGAAGTACACGGGCAGCAGACCAGACTGTGA (Neurovita3) (SEC ID nº 220);
(3)
polinucleótido codificante del polipéptido tal como se define en la SEC ID nº 212:
ATGGTTCCTCAGGCTCTCCTGTTTGTACCCCTTCTGGTTTTTCCATTGTGT TTTGGGGGGAAGTATGTATTACTGAGTGCAGGGGCCCTGACTGCCTTGATGTTGATAATTTTCCTGATGACAT GTTGTAGAAGAGTCAATCGATCAGAACCTACGCAACACAATCTCAGAGGGACAGGGAGGGAGGTGTCAGTC ACTCCCCAAAGCGGGAAGATCATATCTTCATGGGAAGTAGCCACGCAGCAGACCAGACTGTGA (SEC ID nº 221);
(4)
polinucleótido codificante del polipéptido tal como se define en la SEC ID nº 213:
ATGGTTCCTCAGGCTCTCCTGTTTGTACCCCTTCTGGTTTTTCCATTGTGT TTTGGGGGGAAGTATGTATTACTGAGTGCAGGGGCCCTGACTGCCTTGATGTTGATAATTTTCCTGATGACAT GTTGTAGAAGAGTCAATCGATCAGAACCTACGCAACACAATCTCAGAGGGACAGGGAGGGAGGTGTCAGTC ACTCCCCAAAGCGGGAAGATCATATCTTCATGGGAAGTATACACGGGGCAGACCAGACTGTGA (SEC ID nº 222),
(5)
polinucleótido codificante del polipéptido tal como se define en la SEC ID nº 214:
ATGGTTCCTCAGGCTCTCCTGTTTGTACCCCTTCTGGTTTTTCCATTGTGT TTTGGGGGGAAGTATGTATTACTGAGTGCAGGGGCCCTGACTGCCTTGATGTTGATAATTTTCCTGATGACAT GTTGTAGAAGAGTCAATCGATCAGAACCTACGCAACACAATCTCAGAGGGACAGGGAGGGAGGTGTCAGTC ACTCCCCAAAGCGGGAAGATCATATCTTCATGGGAAGTACACACGGGGCAGACCAGACTGTGA (SEC ID nº 223);
(6)
polinucleótido codificante del polipéptido tal como se define en la SEC ID nº 215:
ATGGTTCCTCAGGCTCTCCTGTTTGTACCCCTTCTGGTTTTTCCATTGTGT TTTGGGGGGAAGTATGTATTACTGAGTGCAGGGGCCCTGACTGCCTTGATGTTGATAATTTTCCTGATGACAT GTTGTAGAAGAGTCAATCGATCAGAACCTACGCAACACAATCTCAGAGGGACAGGGAGGGAGGTGTCAGTC ACTCCCCAAAGCGGGAAGATCATATCTTCATGGGAAGTACACACGCAGCAGACCAGACTGTGA (SEC ID nº 224),
(7)
polinucleótido codificante del polipéptido tal como se define en la SEC ID nº 216:
ATGGTTCCTCAGGCTCTCCTGTTTGTACCCCTTCTGGTTTTTCCATTGTGT TTTGGGGGGAAGTATGTATTACTGAGTGCAGGGGCCCTGACTGCCTTGATGTTGATAATTTTCCTGATGACAT GTTGTAGAAGAGTCAATCGATCAGAACCTACGCAACACAATCTCAGAGGGACAGGGAGGGAGGTGTCAGTC ACTCCCCAAAGCGGGAAGATCATATCTTCATGGGAAGTAGCCGGGGGGCAGACCAGACTGTGA (SEC ID nº 225),
(8)
polinucleótido codificante del polipéptido tal como se define en la SEC ID nº 217:
ATGGTTCCTCAGGCTCTCCTGTTTGTACCCCTTCTGGTTTTTCCATTGTGT TTTGGGGGGAAGTATGTATTACTGAGTGCAGGGGCCCTGACTGCCTTGATGTTGATAATTTTCCTGATGACAT GTTGTAGAAGAGTCAATCGATCAGAACCTACGCAACACAATCTCAGAGGGACAGGGAGGGAGGTGTCAGTC ACTCCCCAAAGCGGGAAGATCATATCTTCATGGGCCGAAGCCCAGCACACGCAGCAGACCAGACTGTGA (SEC ID nº 226);
(9)
polinucleótido codificante del polipéptido tal como se define en la SEC ID nº 218:
ATGGTTCCTCAGGCTCTCCTGTTTGTACCCCTTCTGGTTTTTCCATTGTGT TTTGGGGGGAAGTATGTATTACTGAGTGCAGGGGCCCTGACTGCCTTGATGTTGATAATTTTCCTGATGACAT GTTGTAGAAGAGTCAATCGATCAGAACCTACGCAACACAATCTCAGAGGGACAGGGAGGGAGGTGTCAGTC ACTCCCCAAAGCGGGAAGATCATATCTTCATGGGAAGTACACGCCTCTGGGGGGCAGACCAGACTGTGA (SEC ID nº 227).
El polinucleótido codificante de un polipéptido de la invención no comprende o consiste en la secuencia tal como se define en la SEC ID nº 8 (Neurovita 1).
La invención se refiere además a un vector ácido nucleico (tal como un plásmido) que comprende un polinucleótido tal como se define en la presente memoria, es decir, un polinucleótido codificante de un polipéptido de la invención. En una realización particular, el vector es un vector de expresión, es decir, un vector que comprende, aparte de los elementos mencionados explícitamente, todos los elementos necesarios para controlar la expresión del polinucleótido de la invención (elementos reguladores de la expresión) y en particular elementos reguladores de la transcripción. La expresión "elemento regulador de la transcripción" define cualesquiera regiones de ADN que participan en la regulación de la transcripción del polinucleótido y comprende un promotor, tal como CMV o EF1, intensificador o elemento regulador de acción en cis. Dichos elementos, y en particular el promotor, se seleccionan según la naturaleza de las células que deben transfectarse con el vector ácido nucleico. La determinación del promotor adecuado, según el nivel de expresión buscado o la célula transfectada, constituye parte de los conocimientos que posee el experto en la materia. Cabe indicar que, en el caso de que el vector nucleico contenga varios polinucleótidos (uno de los cuales es un polinucleótido de la invención), el elemento o elementos reguladores de la transcripción pueden ser únicos para todos los polinucleótidos o compartidos por algunos de ellos o, en contraste, cada polinucleótido puede estar asociado a uno o más elementos reguladores de la transcripción particulares. En el último caso, los elementos reguladores de la transcripción pueden ser similares o diferentes.
Dentro de la presente invención, los elementos reguladores de la expresión insertados en el vector ácido nucleico de la invención preferentemente se adaptan para la expresión del polinucleótido de la invención en células neuronales, en particular en células neuronales humanas, tal como la línea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y. Entre estos promotores se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los promotores siguientes: enolasa específica de neuronas (NSE), sinapsina-1 (SYN), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), tirosina hidroxilasa (TH) y dopamina β-hidroxilasa (DBH) (Boulaire et al., 2009).
La invención se refiere además a un vector de expresión derivado de lentivirus, en particular un plásmido, que comprende, además del polinucleótido de la invención (es decir, un polinucleótido codificante de un polipéptido de la invención), señales reguladoras para la transcripción y expresión de dicho polinucleótido (elementos reguladores de la expresión), un región de inicio central de acción en cis (cPPT) y una región de terminación de acción en cis (CTS), ambos de origen lentivírico y señales reguladoras de origen retrovírico para la transcripción inversa, expresión y empaquetamiento. Dicho vector es el vector de transferencia utilizado en un sistema de transcomplementación (sistema de vector/empaquetamiento) (ver posteriormente).
En una realización particular, el vector de expresión derivado de lentivirus puede prepararse a partir del genoma de un lentivirus o retrovirus, y sólo contiene, aparte del polinucleótido o constructo de ácidos nucleicos de la invención, las secuencias del genoma lentivírico o retrovírico que son regiones no codificantes de dicho genoma, necesarios para proporcionar señales de reconocimiento para la síntesis y procesamiento del ADN o ARN. Por lo tanto, un vector de expresión derivado de lentivirus puede ser un vector de sustitución en el que todas las secuencias codificantes víricas entre las 2 repeticiones terminales largas (RTL) de un genoma de lentivirus o retrovirus, han sido sustituidas por el polinucleótido de la invención, señales reguladores para la transcripción y expresión de dicho polinucleótido (elementos reguladores de la expresión), una región de inicio central de acción en cis (cPPT) y una región de terminación de acción en cis (CTS) ambas de origen lentivírico y señales reguladores de origen retrovírico para la transcripción inversa, expresión y empaquetamiento. En una realización particular, el vector de expresión derivado de lentivirus se obtiene a partir de un genoma de VIH, en particular de un genoma de VIH-1, en el que todas las secuencias codificantes víricas entre las dos repeticiones terminales largas (RTL) han sido sustituidas por el polinucleótido de la invención, señales reguladoras para la transcripción y expresión de dicho polinucleótido (elementos reguladores de la expresión), una región de inicio central de acción en cis (cPPT) y una región de terminación de acción en cis (CTS), ambas de origen lentivírico, y señales reguladoras de origen retrovírico para la
transcripción inversa, expresión y empaquetamiento, proporcionando un vector derivado de VIH de expresión, en particular un vector derivado de VIH-1 de expresión.
La invención se refiere además al genoma del vector lentivírico, es decir, el material genético contenido en la partícula de vector lentivírico, tras la formación de las partículas en el sistema de trans-complementación, así como cualesquiera intermediarios de ácido nucleico entre el vector de expresión derivado de lentivirus y el material genético contenido en la partícula de vector lentivírico, dicho genoma lentivírico o intermediarios ácidos nucleicos que comprenden el polinucleótido de la invención, señales reguladoras de la transcripción y expresión de dicho polinucleótido (elementos reguladores de la expresión), una región de inicio central de acción en cis (cPPT) y una región determinación de acción en cis (CTS) ambas de origen lentivírico y señales reguladoras de origen retrovírico para la transcripción inversa, la expresión y el empaquetamiento.
De esta manera, la invención comprende además cualquier ácido nucleico apropiado, es decir, ADN o ARN, de doble cadena o de cadena sencilla, incluyendo en la forma que contiene la solapa de ADN en forma de una secuencia tríplex, dependiendo del estadio o ciclo de las partículas, incluyendo el derivado del lentivirus de expresión, utilizado para la cotransfección de las células huésped con el plásmido de encapsidación y el plásmido de cubierta, para la expresión de las partículas, o el genoma de ARN de las partículas una vez formadas, o incluyendo las diversas formas del ácido nucleico de dicho genoma en las células transducidas del huésped en el que se administran las partículas, incluyendo el complejo de preintegración del vector.
De esta manera, el vector derivado de lentivirus de expresión, el genoma del vector lentivírico o cualesquiera intermediarios ácidos nucleicos de la invención, comprenden señales reguladoras de la transcripción y expresión de origen no lentivírico, tal como un promotor y/o un intensificador, preferentemente un promotor adaptado para la expresión del polinucleótido de la invención en células neuronales, en particular en células neuronales humanas, tal como se ha indicado anteriormente. Son ejemplos de promotores, CMV, también denominado CMVie (CMV inmediato temprano), promotor EF1α, PGK, etc. En una realización particular, el polinucleótido de la invención se encuentra bajo el control de señales reguladoras de la transcripción y la expresión.
El vector derivado de lentivirus de expresión, el genoma del vector lentivírico o cualesquiera intermediarios ácidos nucleicos de la invención también comprenden una región de inicio central de acción en cis (cPPT) y una región de terminación de acción en cis (CTS), ambas de origen lentivírico. Estas dos regiones se conocen como solapa de ADN o ADN tríplex. La solapa de ADN adecuada para la invención puede obtenerse a partir de un lentivirus o de un organismo de tipo retrovírico, tal como un retrotrasposón, o puede prepararse sintéticamente (síntesis química) o mediante amplificación de la solapa de ADN a partir de cualquier genoma de lentivirus, tal como mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La solapa de ADN puede obtenerse a partir de un lentivirus y en particular un retrovirus VIH, o del virus VAEC (virus de la artritis-encefalitis caprina), el virus VAIE (virus de la anemia infecciosa equina), el virus VISNA, el virus VIS (virus de la inmunodeficiencia del simio) o el virus VIF (virus de la inmunodeficiencia felina). En una realización más preferente, la solapa de ADN se obtiene a partir de un retrovirus VIH, por ejemplo de virus VIH-1 o VIH-2, incluyendo cualquier aislado de estos dos tipos. La solapa de ADN preferente comprende o consiste en las secuencias definidas en SEC ID nº 228 a nº 234. Cabe indicar que la solapa de ADN se utiliza como fragmento de ADN aislado a partir de su contexto de nucleótidos natural (genoma lentivírico), es decir, fuera del contexto del gen pol en el que se encuentra contenido naturalmente en el genoma del lentivirus. Por lo tanto, la solapa de ADN se utiliza, en la presente invención, delecionada de las partes 5’ y 3’ innecesarias del gen pol y se recombina con secuencias de diferente origen.
Según una realización particular, una solapa de ADN presenta una secuencia de nucleótidos de entre aproximadamente 90 y aproximadamente 140 nucleótidos. En el VIH-1, la solapa de ADN es una solapa de cadena positiva estable de 99 nucleótidos de longitud. Al utilizarla en el vector genómico del vector lentivírico de la invención puede insertarse en forma de una secuencia más larga, especialmente en el caso de que se prepare en forma de fragmento de PCR. Un polinucleótido apropiado particular que comprende la estructura que proporciona la solapa de ADN es un fragmento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de 178 pares de bases que comprende las regiones cPPT y CTS del ADN del VIH-1.
En una realización particular, se insertan las regiones cPTT y CTS en una orientación funcional en el vector o genoma lentivírico con el fin de adoptar una conformación tríplex durante la transcripción inversa.
En una realización particular, la solapa de ADN se inserta inmediatamente antes del polinucleótido de la invención o inmediatamente antes del promotor que controla la expresión del polinucleótido de la invención, ventajosamente para que presente una posición central o prácticamente central en el genoma del vector. El vector derivado de lentivirus de expresión, el genoma del vector lentivírico o cualesquiera intermediarios ácidos nucleicos de la invención también comprenden señales reguladoras de origen retrovírico para la transcripción inversa, expresión y empaquetamiento. Son ejemplos de dichos elementos por lo menos uno (preferentemente dos) repeticiones terminales largas (RTL), tales como RTL5’ y RTL3’ y una secuencia psi que participa en la encapsidación del genoma lentivírico. En una realización particular de la invención, la RTL, preferentemente RTL3’, se deleciona para el promotor y el intensificador de la región U3; se ha demostrado que esta modificación
incrementa sustancialmente la transcripción del transgén insertado en el genoma lentivírico (documento nº WO01/27304).
El vector derivado de lentivirus de expresión, el genoma del vector lentivírico o cualesquiera intermediarios ácidos nucleicos de la invención también pueden comprender opcionalmente por lo menos uno de los elementos siguientes:
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elementos seleccionados de entre un sitio donante de empalme (DE), un sitio aceptor de empalme (AE) y/o un elemento sensible a Rev (ESR), y/o -varios sitios de restricción únicos para la clonación del polinucleótido de la invención y/o -una secuencia de ADN a la que se inicia la replicación, origen de replicación (ori), la secuencia de la cual es dependiente de la naturaleza de las células en las que debe expresarse el genoma lentivírico. Dicho ori puede ser de origen mamífero, más preferentemente es de origen humano, preferentemente adaptado para la replicación en células neuronales humanas. Es una realización ventajosa de la invención disponer de un ori insertado en el genoma lentivírico o en el vector derivado de lentivirus de expresión de la invención en el caso de que el genoma lentivírico no se integre en el genoma de la célula huésped; de esta manera, la presencia de un ori garantiza que por lo menos un genoma lentivírico se encuentra presente en cada célula, incluso después de la división celular y/o -por lo menos una región de unión de andamiaje (RUA) y/o una región de unión a matriz (RUM). En efecto, estas secuencias ricas en AT permiten anclar el genoma lentivírico a la matriz del cromosoma celular, regulando de esta manera la transcripción del polinucleótido de la invención.
En realizaciones particulares de la invención, independientemente o en combinación con las realizaciones comentadas en toda la memoria, el vector derivado de lentivirus de expresión o el genoma del vector lentivírico no presenta genes lentivíricos gag, pol y/o env funcionales. El término "funcional" se refiere a un gen que es transcrito correctamente y/o expresado correctamente. De esta manera, la expresión del vector derivado de lentivirus de expresión o el genoma del vector lentivírico de la invención en la presente realización contiene por lo menos uno, preferentemente la totalidad, de los genes gag, pol y env que no es transcrito o es transcrito incompletamente; la expresión "transcrito incompletamente" se refiere a la alteración en los transcritos gag, gag-pro o gag-pro-pol, en el que uno o varios de ellos no son transcritos. En una realización particular, el vector derivado de lentivirus de expresión o el genoma del vector lentivírico no presenta los genes lentivíricos gag, pol y/o env. En una realización particular, el vector derivado de lentivirus de expresión o el genoma del vector lentivírico también está libre de las secuencias codificantes para los genes accesorios Vif, Vpr, Vpu y Nef (para los vectores lentivíricos de VIH-1) o de sus genes completos o funcionales.
El vector lentivírico de la invención no es replicante, es decir, el vector derivado de lentivirus de expresión o el genoma del vector lentivírico no es capaz de formar nuevas partículas que geman a partir de la célula huésped infectada. Lo anterior puede conseguirse mediante la ausencia en el vector derivado de lentivirus de expresión o en el genoma del vector lentivírico de los genes gag, pol o env, tal como se indica en el párrafo anterior; lo anterior puede conseguirse mediante la deleción de otra u otras secuencias codificantes víricas y/o elementos genéticos de acción en cis necesarios para la formación de las partículas. La ausencia de formación de partículas debería distinguirse de la replicación del vector derivado de lentivirus de expresión o del genoma del vector lentivírico. En efecto, tal como se ha indicado anteriormente, el vector derivado de lentivirus de expresión o el genoma del vector lentivírico puede contener un origen de replicación que garantice la replicación del vector derivado de lentivirus de expresión o el genoma del vector lentivírico sin garantizar la formación de partículas.
La invención se refiere además a una partícula pseudotipada de vector lentivírico que comprende proteínas estructurales GAG y un núcleo vírico constituido de: (a) proteínas POL y (b) un genoma del vector lentivírico que comprende el polinucleótido de la invención, elementos reguladores de la expresión de dicho polinucleótido, una región de inicio central de acción en cis (cPPT) y una región de terminación de acción en cis (CTS), ambos de origen lentivírico, y señales reguladoras de origen retrovírico para la transcripción inversa, la expresión y el empaquetamiento, en el que dicha partícula se pseudotipa con la proteína G de un virus VSV o la proteína G de virus de la rabia.
La expresión "partícula de vector lentivírico pseudotipada" comprende una partícula lentivírica que comprende tanto proteínas como material genético preferentemente encapsidado en dichas proteínas. Las partículas están constituidas de proteínas de cubierta vírica (codificadas por un gen env), así como proteínas estructurales (codificadas por un gen gag). Dentro de las partículas, un núcleo vírico (o cápside) formado de tres enzimas (codificados por un gen pol), es decir, la transcriptasa inversa, la integrasa y la proteasa, y material genético (el genoma lentivírico). Las características de los elementos reguladores de la expresión de dicho polinucleótido, una región de inicio central de acción en cis (cPPT) y una región de terminación de acción en cis (CTS), ambas de origen lentivírico, y señales reguladoras de origen retrovírico para la transcripción inversa, la expresión y el empaquetamiento contenidas en el genoma lentivírico son tal como se ha definido anteriormente para la expresión del vector derivado de lentivirus. En efecto, el genoma lentivírico contenido en la partícula lentivírica es un transcrito del ácido nucleico contenido en el vector derivado de lentivirus de expresión.
La proteína de cubierta del vector lentivírico de la invención puede pseudotiparse con la proteína de cubierta del lentivirus utilizada para preparar el vector lentivírico, o alternativamente con una proteína de cubierta heterogénea que se selecciona con respeto a las células que deben reconocerse como dianas en el huésped.
En una realización particular, dicha partícula lentivírica se pseudotipa con una proteína VSV-G. La proteína VSV-G se origina a partir del serotipo Indiana, New Jersey, Piry, Chandipura, Isfahan, Cocal o la combinación de por lo menos dos de dichos serotipos. En una realización particular, la proteína VSV-G originada a partir de un VSV se modifica con respecto a su forma nativa, especialmente para mejorar el pseudotipado.
En otra realización, dicha partícula lentivírica se pseudotipa con la proteína G de un virus de la rabia. En una realización particular, la proteína G se origina a partir de una cepa atenuada, tal como la cepa ERA-NIV (ERA). En una realización particular, la proteína G se origina a partir de una cepa virulenta, tal como la cepa CVS-NIV (CVS), la cepa CVS-Gif-sur-Yvette (Préhaud et al., 1988), la cepa CVS-11, la cepa N2C o la cepa CVS-24. Una partícula lentivírica, que comprende en su genoma lentivírico un polinucleótido codificante de un polipéptido de la invención pseudotipado con la proteína G de virus de la rabia, es un producto preferente de la invención.
Las cepas ERA y CVS originales de virus de la rabia (RABV) se encuentran disponibles de la ATCC bajo el número de depósito vr332 y vr959, respectivamente (Préhaud C. et al., 2003, y documento nº WO2010/116258).
La secuencia de la proteína G de la cepa CVS-NIV se encuentra disponible bajo el número de acceso AF406694 y se define como SEC ID nº 12. La proteína G de la cepa CVS-NIV se encuentra disponible de la cepa de E. coli recombinante depositada bajo el número I-2758 el 30 de noviembre de 2001 en el CNCM (Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 PARIS, Cedex 15, Francia) bajo los términos establecidos en el Tratado de Budapest. Dicho E. coli recombinante comprende un plásmido (plásmido pRev-TRE-G-CVS, documento nº WO 03/048198), que expresa induciblemente la proteína G de la cepa CVS-NIV.
La secuencia de la proteína G de la cepa ERA-NIV se encuentra disponible bajo el número de acceso AF406693 y se define como SEC ID nº 13. La proteína G de la cepa ERA se encuentra disponible a partir de la cepa de E. coli recombinante depositada con el número I-2760 el 30 de noviembre de 2001 en el CNCM bajo los términos establecidos en el Tratado de Budapest. Dicho E. coli recombinante comprende un plásmido (plásmido pRev-TRE-G-ERA, documento nº WO 03/048198), que expresa induciblemente la proteína G de la cepa ERA.
Las condiciones apropiadas para el cultivo de la cepa de E. coli recombinante que contiene el plásmido CNCM I2758 o el plásmido CNCM I-2760 comprenden la incubación de dicha cepa de E. coli recombinante a 37ºC en un medio de cultivo LB-TYM estándar (en presencia de ampicilina).
En una realización particular, la proteína integrasa contenida en la partícula pseudotipada de vector lentivírico es defectuosa. La proteína integrasa es una de las proteínas codificadas por el gen pol. El término "defectuosa" se refiere a que la integrasa, de origen lentivírico, no presenta la capacidad de integrar el genoma lentivírico en el genoma de las células huésped, es decir, es una proteína integrasa mutada para alterar específicamente su actividad de integrasa. De acuerdo con lo anterior, la capacidad de integrasa de la proteína ha sido alterada, mientras que la expresión correcta de las proteínas GAG, PRO y POL y/o la formación de la cápside y, por lo tanto, de las partículas víricas, así como otras etapas del ciclo vírico, anteriores o posteriores a la etapa de integración, tal como la transcripción inversa, la importación del núcleo, se mantienen intactas. Se dice que una integrasa es defectuosa en el caso de que la integración que debería permitir resulta alterada de manera que tiene lugar una etapa de integración menos de 1 vez de cada 1.000, preferentemente menos de 1 de cada 10.000, en comparación con un vector lentivírico que contiene una integrasa de tipo salvaje correspondiente.
En una realización particular de la invención, la propiedad de que la integrasa sea defectuosa resulta de una mutación de clase 1, preferentemente de sustituciones de aminoácidos (sustitución de un aminoácido) o deleciones cortas que dan lugar a una proteína que satisface los requisitos del párrafo anterior. La mutación se lleva a cabo dentro del gen pol. Son ejemplos de mutaciones que alteran VIH-1 y permiten obtener una integrasa no funcional para la integración (integrasa incompetente para la integración) los siguientes: H12N, H12C, H16C, H16V, S81 R, D41A, K42A, H51A, Q53C, D55V, D64E, D64V, E69A, K71A, E85A, E87A, D116N, D116I, D116A, N120G, N120I, N120E, E152G, E152A, D35E, K156E, K156A, E157A, K159E, K159A, K160A, R166A, D167A, E170A, H171A, K173A, K186Q, K186T, K188T, E198A, R199C, R199T, R199A, D202A, K211A, Q214L, Q216L, Q221 L, W235F, W235E, K236S, K236A, K246A, G247W, D253A, R262A, R263A y K264H. Otra sustitución propuesta es la sustitución de los residuos aminoácidos RRK (posiciones 262 a 264) por los residuos aminoácidos AAH. En una realización particular, resultan preferentes las sustituciones siguientes: H12N, H12C, H16C, H16V, S81 R, D41A, K42A, H51A, Q53C, D55V, D64E, D64V, E69A, K71A, E85A, E87A, D116I, D116A, N120G, N120I, N120E, E152G, E152A, D35E, K156E, K156A, E157A, K159E, K159A, K160A, R166A, D167A, E170A, H171A, K173A, K186Q, K186T, K188T, E198A, R199C, R199T, R199A, D202A, K211A, Q214L, Q216L, Q221 L, W235F, W235E, K236S, K236A, K246A, G247W, D253A, R262A, R263A y K264H. Se dan a conocer otras mutaciones en Wanisch y Yáñez-Muñoz, 2009. Una mutación particularmente apropiada es la mutación D64V.
Con independencia de los elementos contenidos en el genoma del vector lentivírico, la naturaleza de la proteína de cubierta de la partícula y la característica defectuosa o no de la proteína integrasa, la partícula pseudotipada de vector lentivírico preferentemente se obtiene mediante un sistema de transcomplementación (vector/sistema de empaquetamiento). De esta manera, una célula permisiva (tal como células 293T) son transfectadas in vitro con un vector de transferencia que es un vector derivado de lentivirus de expresión tal como se define en la presente memoria y con por lo menos otro plásmido que proporciona, en trans, secuencias de gag, pol y env codificantes de los polipéptidos GAG, POL y la proteína o proteínas de cubierta o para una parte de dichos polipéptidos suficiente para permitir la formación de partículas lentivíricas. El vector de transferencia genera, como transcrito, el genoma lentivírico, mientras que gag, pol y env proporcionan, respectivamente, las proteínas estructurales GAG, la proteína POL para el núcleo vírico (preferentemente con una integrasa defectuosa) y las proteínas ENV pseudotipadas (preferentemente una proteína G de VSV o una proteína G de virus de la rabia).
A título de ejemplo, las células permisivas son transfectadas con un primer plásmido que es el vector derivado de lentivirus de expresión de la invención (vector de transferencia), un segundo plásmido (plásmido de expresión de cubierta o plásmido con env pseudotipado) que comprende un gen codificante de una o más proteínas de cubierta (tales como VSV-G o la proteína G de virus de la rabia) y un tercer plásmido (plásmido de encapsidación o constructo de empaquetamiento) que expresa las proteínas GAG y POL.
La invención se refiere además a una célula (preferentemente aislada) o a un cultivo celular transfectado con un vector de la invención o transducido por una partícula lentivírica de la invención. De esta manera, la célula o cultivo celular de la invención comprende o expresa por lo menos un polipéptido de la invención y/o comprende por lo menos un polinucleótido de la invención y/o por lo menos un vector de la invención.
Dicha célula puede ser una célula eucariótica [o un cultivo celular preparado a partir de células eucarióticas], preferentemente una célula de mamífero, por ejemplo una célula humana o una célula no humana, más preferentemente una célula humana. Preferentemente, dicha célula no es una célula embrionaria humana o una célula germinal humana.
En una realización particular, dicha célula es una célula neuronal, preferentemente una célula neuronal humana. En una realización particular, dichas células son neuronas premitóticas humanas, neuronas humanas inmaduras, tales como células de neuroblastoma Ntera 2D1 (ATCC CRL-1973), SK-N-SH (ATCC HTB11), SH-SY-5Y (ATCC CRL2266), U373MG (línea celular de astrocitoma humano; Babault N et al, 2011) (Prehaud C. et al., 2010, 2005 y 2003; Lafon M. et al., 2008 y 2006; Megret F. et al., 2007).
A continuación se proporcionan células o cultivos celulares particulares que pueden transfectarse o transducirse según la presente memoria:
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el cultivo celular SH-SY5Y, una línea celular de neuroblastoma humano, que se encuentra disponible de la American Type Culture Collection (ATCC; 10801 University Blvd.; Manassas, Virginia 20110-2209; U.S.A.) bajo el número de depósito CRL-2266. Dichas células, que son un subclón de la línea celular de neuroblastoma humano SK-N-SH (ATCC nº HTB11), pueden diferenciarse al tratarse con db-AMPc permeable de las células. Estas células diferenciadas han mostrado una elevada plasticidad, crecimiento y retracción (Loh SHY et al., 2010),
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neuronas humanas post-mitóticas puras (NT2-N) que se obtienen a partir de la línea celular de carcinoma embrionario NTera 2cl.-D1 (ATCC CRL-1973), tal como está descrito en la técnica, por ejemplo en Préhaud et al., 2005. Las células Tera N2D1 pueden diferenciarse en cultivos puros de neuronas postmitóticas humanas (NT2-N) tras la inducción de la diferenciación con ácido todo-trans-retinoico (ATRA), seguido del tratamiento con inhibidores de la mitosis y la purificación producida mediante tripsinización (Andrews PW, 1998). Las células NT2-N presentan todos los marcadores específicos de neuronas humanas diferenciadas (Guillemain I., 2000). Pueden establecer contactos sinápticos in vitro entre ellas y los contactos funcionales con los astrocitos en cocultivo, así como sinapsis funcionales.
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células de feocromocitoma de rata (células NS, Cellomics, USA), que son un subclón de las células PC12, diferenciadas con NGF. Dichas células diferenciadas presentan una red de neuritas fuerte y organizada y han sido validadas para el cribado de alto rendimiento. Las células NS extienden las neuritas, se tornan eléctricamente excitables, se vuelven más sensibles a acetilcolina aplicada exógenamente, presentan un número incrementado de canales del calcio e incrementan la síntesis de varios neurotransmisores. Las células NS crecen en presencia de NGF, son similares a las neuronas simpáticas y son un modelo de las neuronas noradrenérgicas.
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la línea celular de neuroblastoma humano SK-N-SH (ATCC nº HTB11) (Prehaud C. et al., 2003), que es un prototipo de neurona inmadura adrenérgica (Von Reitzentstein, 2001). Estas células pueden diferenciarse adicionalmente mediante el tratamiento con ATRA (Gaitonde et al., 2001; Wainwright et al., 2001).
Alternativamente, dicha célula puede ser una célula procariótica [o un cultivo celular preparado a partir de células procarióticas], preferentemente una bacteria, por ejemplo E. coli.
En una realización particular, la célula contiene, integrado en su genoma, el polinucleótido de la invención (que expresa el polipéptido de la invención), especialmente en el caso de que la célula o cultivo celular haya sido previamente transducido con una partícula lentivírica de la invención. Alternativamente, el polinucleótido de la invención no se integra en el genoma de las células, aunque haya sido previamente transducido con una partícula lentivírica de la invención, como resultado de una integrasa defectuosa. En este último caso, el polinucleótido de la invención comprende ventajosamente un origen de replicación.
La invención se refiere además a una composición que comprende un polipéptido de la invención, un polinucleótido de la invención, un vector de la invención, un vector derivado de lentivirus de expresión de la invención, una partícula pseudotipada de vector lentivírico de la invención o una célula de la invención, y opcionalmente un vehículo, excipiente o portador farmacéuticamente aceptable. La composición comprende el polipéptido, el polinucleótido, el vector, el vector derivado de lentivirus de expresión, la partícula pseudotipada de vector lentivírico
o la célula de la invención, a modo de principio activo, resultando dicha composición adecuada para la administración en un huésped, preferentemente un huésped humano.
Una composición preferente comprende una partícula de vector lentivírico pseudotipado con una proteína G de virus de la rabia de la invención. En efecto, la partícula de vector lentivírico pseudotipada con una proteína G de virus de la rabia de la invención combina por lo menos las dos características ventajosas siguientes:
(1)
el polipéptido de la invención, mediante las características del dominio de unión a MAST-2 del dominio citoplasmático tal como se ha definido anteriormente, presenta una elevada afinidad para el dominio PDZ de la proteína MAST2 humana. De esta manera, la utilización del polipéptido de la invención mejora los efectos observados sobre la inducción y/o la estimulación del crecimiento de las neuritas y/o sobre la neurosupervivencia, en comparación con los polipéptidos de la técnica anterior, y
(2)
el pseudotipado de la partícula con la proteína G de virus de la rabia permite reconocer específicamente como diana las células neuronales, mediante transporte retrógrado a partir del músculo (sitio de inyección de la composición) y, de esta manera, evitar la transducción innecesaria de otros tipos celulares.
Un "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un relleno, diluyente, material de encapsulado o adyuvante de formulación no tóxico sólido, semisólido o líquido de cualquier tipo convencional. Un "portador farmacéuticamente aceptable" resulta no tóxico para los receptores a las dosis y concentraciones utilizadas y resulta compatible con otros ingredientes de la formulación; entre los portadores adecuados se incluyen, aunque sin limitación, soluciones salinadas tamponadas con fosfato, agua destilada, emulsiones tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, soluciones y similares, dextrosa, glicerol, solución salina, etanol y combinaciones de los mismos. Dichos portadores permiten formular las composiciones farmacéuticas en forma de tabletas, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones y similares. Entre los portadores para la administración parenteral se incluyen soluciones acuosas de dextrosa, manitol, manosa, sorbitol, solución salina, agua pura, etanol, glicerol, propilenglicol, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, polímeros en bloque de polioxietileno-polioxipropileno y similares.
Un "excipiente farmacéuticamente aceptable” se refiere a una sustancia que es utilizada como portador o para la preparación de la forma administrable de uno o más polipéptidos de la invención. Entre los excipientes adecuados se incluyen rellenos, tales como sacáridos, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa, tales como, por ejemplo, almidón de maíz, trigo, arroz o patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carbometilcelulosa sódica y/o polímeros fisiológicamente aceptables, tales como polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, pueden añadirse agentes desintegrantes, tales como polivinilpirrolidona entrecruzada, agar o ácido algínico o una sal del mismo, tal como alginato sódico. De esta manera, para la utilización oral del polipéptido o polipéptidos de la invención, puede utilizarse un excipiente sólido, triturando opcionalmente la mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulo tras la adición de adyuvantes adecuados si se desea, con el fin de obtener tabletas o núcleos de gragea. Son ejemplos de excipientes para el recubrimiento de grageas o tabletas, soluciones concentradas de sacáridos que opcionalmente pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilenglicol, dióxido de titanio, soluciones de laca y solventes orgánicos adecuados o mezclas de solventes. Pueden añadirse tintes o pigmentos a las tabletas o recubrimientos de gragea para la identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuesto activo. La invención se refiere además a un polipéptido de la invención, a un polinucleótido de la invención, a un vector de la invención, a un vector derivado de lentivirus de expresión de la invención, a una partícula pseudotipada de vector lentivírico de la invención, a una célula de la invención o a una composición de la invención (dada a conocer posteriormente en la presente memoria como productos de la invención), para la utilización como medicamento o fármaco.
Con respecto a la utilización como medicamento, así como los usos y tratamiento detallados posteriormente, resulta preferente una partícula de vector lentivírico pseudotipada con proteína G de virus de la rabia de la invención o una
composición que comprende una o más partículas de vector lentivírico pseudotipadas con proteínas G de virus de la rabia de la invención.
De esta manera, se utilizan productos de la invención para inducir y/o estimular el crecimiento de las neuritas, más particularmente en el tratamiento y/o paliación y/o prevención de una enfermedad, trastorno o condición que implica una neuritogénesis insuficiente o alterada, más particularmente un crecimiento de las neuritas insuficiente o alterada.
Según la invención, los productos de la invención, destinados a ser efectores del crecimiento de las neuritas (y/o de desarrollo de axones y/o dendritas), por ejemplo para la diferenciación de las neuronas a partir de progenitores de las neuronas o neuronas neoplásicas, y/o para la regeneración neuronal de neuronas dañadas (obteniendo ambos efectos mediante la estimulación del crecimiento de las neuritas). En una realización particular, los productos de la invención están destinados a la utilización en la inducción y/o estimulación de la neuritogénesis, más particularmente el crecimiento de las neuritas, todavía más particularmente el crecimiento de las neuritas humanas. En otra realización particular, los productos de la invención están destinados a la utilización en la inducción y/o estimulación de la neuritogénesis, más particularmente el crecimiento de las neuritas a partir de neuronas premitóticas, neuronas neoplásicas, progenitores neuronales, así como a partir de neuronas dañadas.
Los productos de la invención están destinados a la utilización como agente neuroregenerativo (generación de nuevas neuronas, glía, axones, mielina y/o sinapsis funcionales) y/o neuroprotector (protección de neuronas frente a la apoptosis o degeneración).
Los productos de la invención están destinados a la utilización en la estimulación y/o inducción de la formación de neuritas y/o el crecimiento axonal y/o la expansión de los árboles dendríticos.
Los productos de la invención son utilizados para estimular y/o para inducir la sinaptogénesis y/o la neurotransmisión. En efecto, el polipéptido de la invención estimula la actividad del cono de crecimiento. Además, evita que el cono de crecimiento se colapse al entrar en contacto con un agente colapsante del crecimiento, tal como LPA, o por el estrés oxidativo.
Los productos de la invención están destinados a la utilización en la estimulación del desarrollo neuronal y/o la regeneración neuronal y/o el crecimiento axonal y/o el desarrollo de las dendritas y/o la extensión del árbol dendrítico y/o la plasticidad neuronal y/o la sinaptogénesis y/o la neurotransmisión.
Los productos de la invención están destinados a la utilización en la prevención y/o inhibición y/o bloqueo de cualquier tipo de neurotoxicidad que pueda conducir a la retracción de las neuritas y/o al colapso del cono de crecimiento.
Los productos de la invención están destinados a la utilización en la estimulación y/o inducción del crecimiento de las neuritas y/o la actividad del cono de crecimiento tras la entrada en contacto de dichas neuritas y/o cono con un agente neurotóxico.
Los productos de la invención están destinados a la utilización en la prevención y/o inhibición y/o bloqueo del colapso del cono de crecimiento y/o la retracción de las neuritas y/o daño o lesión axodendrítica y/o disrupción de la integridad sináptica y/o pérdida de la conectividad neuronal y/o daño a las terminaciones nerviosas y/o deterioro de la neurotransmisión.
Los productos de la invención están destinados a la utilización en la inducción y/o estimulación del crecimiento de las neuritas, que resulta notablemente útil
-
en la inducción de la diferenciación de las neuronas, por ejemplo en el tratamiento y/o paliación y/o prevención de un neoplasma del sistema nervioso, así como -en la regeneración de las neuronas dañadas, más particularmente neuritas dañadas, por ejemplo -en el tratamiento y/o paliación y/o prevención de una enfermedad, trastorno o condición neurodegenerativa, en el tratamiento y/o paliación y/o prevención de infecciones microbianas de las neuronas, o en la protección de las neuronas frente a agentes neurotóxicos o el estrés oxidativo.
Por lo tanto, la invención se refiere a productos de la invención para la utilización en el tratamiento y/o paliación y/o prevención de cualquier enfermedad, trastorno o condición que implique una neuritogénesis insuficiente o deteriorada, más particularmente un crecimiento de las neuritas insuficiente o deteriorado o una arborización insuficiente de las dendritas.
Dicha enfermedad, trastorno o condición se define alternativa o complementariamente como cualquier enfermedad, trastorno o condición que implique un ciclo de las células neuronales no equilibrado, en el que dicho ciclo de las células neuronales no se encuentra equilibrado:
-
mediante la presencia excesiva o no deseada de neuronas premitóticas (más particularmente, por una diferenciación neuronal insuficiente y/o por una reentrada excesiva o no deseada de neuronas postmitóticas en el ciclo de las células neuronales, tal como es el caso al desarrollarse un neoplasma en el sistema nervioso), o
-
mediante la degeneración excesiva o no deseada de las neuronas, más particularmente una degeneración de las neuritas excesiva o no deseada (tal como es el caso de una enfermedad, trastorno o condición neurodegenerativa y para determinadas infecciones microbianas de las neuronas).
La solicitud da a conocer productos para la utilización en el tratamiento y/o paliación y/o prevención de una enfermedad, trastorno o condición, que altera el sistema nervioso central (SNC) y/o el sistema nervioso periférico (SNP), por ejemplo como terapia neurorestauradora y/o prevención y/o paliación. Los productos para dichos usos forman parte de la invención en la medida en que se encuentran comprendidos en las reivindicaciones. La expresión "sistema nervioso central" o "SNC" en la presente memoria pretende referirse al cerebro y (en el caso de un animal vertebrado) a la médula espinal. El sistema nervioso periférico (SNP) es la vasta red de nervios espinales y craneales que enlazan el cuerpo con el cerebro y la médula espinal. El SNP se subdivide en sistema nervioso autónomo (SN simpático y SN parasimpático) y el sistema nervioso somático. El SNP consiste en neuronas sensoriales que van desde los receptores de estímulos hasta el SNC y en neuronas motoras que van desde el SNC hasta el músculo y las glándulas.
Según una realización de la invención, dicha enfermedad, trastorno o condición es o implica una infección microbiana del sistema nervioso, tal como una infección bacteriana y/o vírica, más particularmente una infección vírica. Preferentemente, dicha infección microbiana es una infección microbiana que induce la apoptosis neuronal, tal como la poliomielitis (Blondel et al., 2005). A título de ejemplo de infección vírica, se proporciona la infección por poliovirus o la infección por virus del Nilo Occidental.
Según otra realización de la invención, dicha enfermedad, trastorno o condición es o implica una enfermedad, trastorno o infección no vírico, más preferentemente una enfermedad, trastorno o condición no bacteriano o no vírico, todavía más preferentemente una enfermedad, trastorno o condición no microbiano.
Según una realización de la invención, dicha enfermedad o trastorno es o implica una enfermedad o trastorno neurodegenerativo (por ejemplo una enfermedad o trastorno neurodegenerativo crónico), tal como encefalopatía no vírica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, ELA, enfermedad de Huntington, esclerosis múltiple (EM) o enfermedad genética rara. Preferentemente, dicha enfermedad o trastorno neurodegenerativo es una enfermedad o trastorno no vírico, más preferentemente una enfermedad o trastorno no bacteriano y no vírico, todavía más preferentemente un trastorno no microbiano.
Según una realización de la invención, dicha condición es o implica una condición neurodegenerativa, tal como el envejecimiento. Preferentemente, dicha condición neurodegenerativa es una condición no vírica, más preferentemente una condición no bacteriana y no vírica, todavía más preferentemente una condición no microbiana.
Según una realización de la invención, dicha enfermedad, trastorno o condición es o implica una lesión física o isquémica del sistema nervioso, tal como convulsión, ictus, traumatismo y epilepsia. Preferentemente, dicha lesión física o isquémica es una enfermedad, trastorno o condición no vírico, más preferentemente una enfermedad, trastorno o condición no bacteriano y no vírico, todavía más preferentemente una enfermedad, trastorno o condición no microbiano.
Según una realización de la invención, dicha enfermedad, trastorno o condición implica la presencia de un agente neurotóxico químico y/o de un estrés oxidativo. Preferentemente, dicha enfermedad, trastorno o condición es una enfermedad, trastorno o condición no vírico, más preferentemente, una enfermedad, trastorno o condición no bacteriano y no vírico, todavía más preferentemente una enfermedad, trastorno o condición no microbiano.
Según una realización de la invención, dicha enfermedad es un neoplasma, más particularmente un neoplasma que comprende neuronas neoplásicas. El término "neoplasma" en la presente memoria se refiere más particularmente a un neoplasma maligno, más particularmente un cáncer, todavía más particularmente un tumor o una leucemia, todavía más particularmente un tumor.
Cualquier modo de administración que el experto en la materia encuentre apropiado se encontrará comprendido dentro de la presente invención. Según cómo se formule el producto de la invención, puede administrarse por vía parenteral o entérica (por ejemplo, oral), preferentemente por vía parenteral, más preferentemente mediante inyección parenteral.
La invención se refiere además a la utilización de un polinucleótido de la invención, un vector de la invención, un vector derivado de lentivirus de expresión de la invención, una partícula pseudotipada de vector lentivírico de la invención, una célula o una composición de la invención, para la preparación de un medicamento o un fármaco para
el tratamiento y/o paliación y/o prevención de cualquier enfermedad, trastorno o condición según se define en las reivindicaciones.
La invención se refiere además a un método de tratamiento de un sujeto, más particularmente de un ser humano, que lo necesita, que comprende administrarse en dicho sujeto o ser humano por lo menos un polinucleótido de la invención, un vector de la invención, un vector derivado de lentivirus de expresión de la invención, una partícula pseudotipada de vector lentivírico de la invención, una célula de la invención o una composición de la invención. Dicho método de tratamiento está destinado al tratamiento y/o paliación y/o prevención de cualquier enfermedad, trastorno o condición según se define en las reivindicaciones.
Los productos de la invención no son agentes inmunogénicos o adyuvantes o como mínimo no se utilizan como agentes inmunogénicos o adyuvantes y no se utilizan bajo condiciones que permitirían que el polipéptido de la invención actuase como agente inmunogénico o adyuvante. Los productos de la invención no generan una respuesta inmunológica humoral detectable tras la administración.
La presente solicitud describe además un método para determinar la neurosupervivencia y/o actividad de neuroprotección de una molécula dada en una célula, que comprende:
(a)
añadir una molécula que debe someterse a ensayo en contacto con una célula o cultivo celular, cultivo de células,
(b)
medir la expresión de un juego de genes que consiste o comprende los cinco genes celulares ROBO1, POU4F1, PTN, PARD6B y PAFAH1B1, en una célula o cultivo celular de la etapa a), y
(c)
normalizar la expresión de cada uno de los genes medidos en la etapa b) respecto a la expresión de los mismos genes medidos en una célula del mismo tipo celulares que no ha estado en contacto con dicha molécula, en el que una modulación estadísticamente significativa de la expresión de los genes de dicho juego revela que dicha molécula puede presentar una actividad de neurosupervivencia y/o de neuroprotección.
En una realización particular, la etapa b) comprende además la medición de la expresión de por lo menos un gen adicional seleccionado de entre el grupo que consiste en los doce genes celulares siguientes: PIK3CG, BMP2, DRD1, PAX5, S100A6, DRD2, HDAC7, HEY2, INHBA, SHH, BTK y FOS. En este caso, cada gen adicional se normaliza en la etapa c) respecto a la expresión del mismo gen adicional medido en una célula del mismo tipo celular que no ha estado en contacto con dicha molécula.
De esta manera, en una realización particular, el método para determinar la actividad de neurosupervivencia y/o neuroprotección de una molécula en una célula, comprende:
(a)
añadir una molécula que debe someterse a ensayo en contacto con una célula o cultivo celular, cultivo de células,
(b)
medir la expresión de un juego de genes que consiste o que comprende los cinco genes celulares siguientes: ROBO1, POU4F1, PTN, PARD6B y PAFAH1B1, y opcionalmente por lo menos un gen adicional seleccionado de entre el grupo que consiste en los doce genes celulares siguientes: PIK3CG, BMP2, DRD1, PAX5, S100A6, DRD2, HDAC7, HEY2, INHBA, SHH, BTK y FOS, en una célula o cultivo celular de la etapa a),y
(c)
normalizar la expresión de cada uno de los genes medidos en la etapa b) respecto a la expresión de los mismos genes medidos en una célula del mismo tipo celulares que no ha estado en contacto con dicha molécula,
en el que una modulación estadísticamente significativa de la expresión de los genes de dicho juego revela que dicha molécula puede presentar una actividad de neurosupervivencia y/o de neuroprotección.
Las secuencias de nucleótidos de los genes ROBO1, POU4F1, PTN, PARD6B, PAFAH1B1, PIK3CG, BMP2, DRD1, PAX5, S100A6, DRD2, HDAC7, HEY2, INHBA, SHH, BTK y FOS son los definidos en la SEC ID nº 236 a nº 252, respectivamente.
Dicho método (o procedimiento) comprende, en una primera etapa, añadir una molécula que debe someterse a ensayo en contacto con una célula o cultivo celular.
La expresión "añadir una molécula que debe someterse a ensayo en contacto con una célula o cultivo celular" pretende referirse a que la molécula debe ser capaz de interactuar con el dominio PDZ de la proteína MAST2 humana y, por lo tanto, debe expresarse en el citoplasma de dicha célula o cultivo celular, en particular en una célula
o cultivo celular que expresa la proteína MAST-2 humana. De esta manera, la primera etapa consiste en expresar la molécula que debe someterse a ensayo en el citoplasma de la célula.
De esta manera, puede utilizarse cualquier método conocido por el experto en la materia para transfectar o transformar células o provocar que la célula sea permeable a la molécula, en particular según la naturaleza de la molécula.
A título de ilustración de dicha expresión en el citoplasma, con independencia de la naturaleza de la molécula que debe someterse a ensayo, la molécula puede transportarse al interior del citoplasma de una célula, utilizando liposomas, mediante el contacto de dicha célula con un liposoma que contiene la molécula que debe someterse a ensayo, o mediante electroporación o mediante administración de nanopartículas.
A modo de realización particular, y en el caso de que la molécula sea una proteína o un polipéptido, la expresión puede resultar de la transfección de dicha célula con un ácido nucleico, un plásmido o un vector que contiene la secuencia de ácidos nucleicos codificante de dicha proteína o polipéptido. En dicha realización, la primera etapa del método consiste en transfectar dicha célula con un ácido nucleico, cualquier plásmido o un vector que contiene la secuencia de ácidos nucleicos codificante de dicha proteína o polipéptido. En una realización particular, la molécula es un polipéptido de la invención según se define en la presente memoria. En dicha realización, la primera etapa del método consiste en transfectar dicha célula con un polinucléotido o un vector según se define en la memoria. Los métodos conocidos comprenden la transfección basada en sustancias químicas, tal como el fosfato de calcio, los liposomas catiónicos (DOTMA y DOPE, lipofectamina y UptiFectin), los polímeros catiónicos (DEAE-dextrano, polietilenimina, Fugene, LT-1, GeneJuice y JetPEI) y métodos no químicos, tales como la electroporación, sonoporación, transfección óptica, electrotransferencia génica o impalefección.
Alternativamente, una célula o cultivo celular también puede transducirse con una partícula vírica, que comprende en su genoma vírico, la secuencia de ácidos nucleicos codificante de la proteína o polipéptido que debe someterse a ensayo. A modo de realización particular, las partículas definidas en la presente memoria pueden utilizarse para transducir células o un cultivo celular.
Con el fin de determinar la actividad de neurosupervivencia y/o neuroprotección de una molécula, el método se implementa en una célula neuronal, en particular que expresa la proteína MAST-2, preferentemente una célula neuronal humana. En una realización particular, dichas células son neuronas premitóticas humanas, neuronas humanas inmaduras, tales como células de neuroblastoma. El método preferentemente se implementa en células SH-SY5Y, las células NT2-N, las células NS o las células NS-SK-N-SH, tal como se ha definido anteriormente.
La segunda etapa comprende medir, en una célula o cultivo celular, que ha estado en contacto con la molécula que debe someterse a ensayo, la expresión de un juego de genes que consisten o comprende los cinco genes celulares siguientes: ROBO1, POU4F1, PTN, PARD6B y PAFAH1B1. Dicha etapa puede comprender además la medición de la expresión de por lo menos un gen adicional, en particular, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 genes, seleccionados de entre el grupo que consiste en los doce genes celulares siguientes: PIK3CG, BMP2, DRD1, PAX5, S100A6, DRD2, HDAC7, HEY2, INHBA, SHH, BTK y FOS.
El término "medir" se refiere a someter a ensayo, en particular detectar el producto o varios productos que resultan de la expresión de un gen celular, encontrándose dicho producto en forma de un ácido nucleico, especialmente ARN, ARNm, ADNc, polipéptido, proteína o cualesquiera otros formatos. En una realización particular, la medición de la expresión génica comprende detectar un juego de dianas nucleótidos, correspondiendo cada diana nucleótido al producto de expresión de un gen comprendido en el juego.
La expresión "diana nucleótido" se refiere a una molécula de ácidos nucleicos la expresión de la cual debe medirse, preferentemente medirse cuantitativamente. La expresión "medición de la expresión" se refiere a que se mide el producto o productos de expresión, en particular el producto o productos de transcripción de un gen. El término "cuantitativo" se refiere a que el método se utiliza para determinar la cantidad o el número de copias de los productos de expresión, en particular los productos de transcripción o las dianas nucleótido. Lo anterior se opone a la medición cualitativa, el objetivo de la cual es determinar únicamente la presencia o ausencia de dicho producto o productos de expresión.
Una diana nucleótido es en particular un ARN, y más particularmente un ARN total. En una realización preferente, la diana nucleótido es ARNm o transcritos. Según los métodos utilizados para medir el nivel de expresión génica, puede utilizarse el ARNm para obtener ADNc o ARNc, que seguidamente se detecta y posiblemente se mide.
Los productos de expresión o las dianas nucleótido preferentemente se preparan a partir de un cultivo celular, en particular tras el aislamiento o incluso la purificación. En el caso de que las dianas nucleótido sean de ARNm, también puede llevarse a cabo una etapa adicional que comprende o consiste en la retrotranscripción de dicho ARNm en ADNc (ADN complementario) antes de la etapa de detección de la expresión. Opcionalmente, el ADNc también puede transcribirse in vitro para proporcionar ARNc.
Durante la etapa de preparación y antes de someter a ensayo la expresión, el producto o productos de expresión o la diana o dianas nucleótidos pueden marcarse, con marcadores o etiquetas isotópicas (tal como radioactivas) o no isotópicas (tal como fluorescentes, coloreadas, luminiscentes, de afinidad, enzimáticas, magnéticas, térmicas o eléctricas).
Cabe indicar que las etapas llevadas a cabo para someter a ensayo la expresión génica no debe alterar la expresión cualitativa o cuantitativa (número de copias) del producto o productos de expresión o la diana o dianas nucleótidos o no debe interferir con la etapa siguiente que comprende someter a ensayo la expresión cualitativa o cuantitativa de dicho producto o productos de expresión o diana o dianas nucleótidos.
La etapa de perfilado de la expresión génica comprende determinar la expresión de un juego de genes. Dicho juego se define como un grupo de genes que debe someterse a ensayo para un ensayo, y especialmente realizarse simultáneamente, en el mismo cultivo celular.
Un juego de genes consiste o comprende los cinco genes celulares siguientes: ROBO1, POU4F1, PTN, PARD6B y PAFAH1B1. El juego de genes puede comprender además por lo menos un gen adicional seleccionado de entre el grupo que consiste en los doce genes celulares siguientes: PIK3CG, BMP2, DRD1, PAX5, S100A6, DRD2, HDAC7, HEY2, INHBA, SHH, BTK y FOS.
Además, además de dichos genes, la etapa b) puede comprender la medición de la expresión de otros genes celulares y en particular la medición de la expresión de por lo menos un gen o genes celulares seleccionados de entre el grupo que consiste en los genes que participan en la ruta de señalización PI3K/Akt o los genes que participan en la proliferación celular, la adhesión celular, la diferenciación celular, los factores de crecimiento y las funciones sinápticas.
En una realización particular, el juego de genes utilizado en la etapa b) incluye entre 5 y 17 genes, en particular (1) exactamente los cinco genes celulares siguientes: ROBO1, POU4F1, PTN, PARD6B y PAFAH1B1, o (2) por lo menos los cinco genes celulares siguientes: ROBO1, POU4F1, PTN, PARD6B y PAFAH1B1, y entre 1 y 12 genes, en particular entre 1 y 10 o entre 1 y 5 genes, seleccionados de entre el grupo que consiste en los doce genes celulares siguientes: PIK3CG, BMP2, DRD1, PAX5, S100A6, DRD2, HDAC7, HEY2, INHBA, SHH, BTK y FOS. De esta manera, en una realización particular, el juego de genes consiste en 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 genes.
En la etapa c) del método, la expresión de cada gen del juego, según se ha medido en la etapa b), se normaliza, es decir, que para cada gen, la expresión medida en la etapa b9 se compara con la expresión del mismo gen tal como se mide en una célula del mismo tipo celular, en particular del mismo cultivo celular o línea celular, que no ha sido puesto en contacto con la molécula que debe someterse a ensayo. De esta manera, se calculó la proporción siguiente:
expresión de un gen, medida en una célula en contacto con la molécula que debe someterse a ensayo.
expresión del mismo gen medida en una célula no en contacto con dicha molécula
Dicha proporción permite determinar la expresión relativa de cada gen, es decir, si la expresión de cada gen está incrementada o reducida como resultado del contacto con la molécula que debe someterse a ensayo. El término "incrementar" o "reducir" se refiere a que la expresión de un gen es estadísticamente superior o estadísticamente inferior en una célula que se pone en contacto con la molécula que debe someterse a ensayo en comparación con una célula del mismo tipo celulares no puesta en contacto con dicha molécula. Una expresión se considera estadísticamente diferente en el caso de que el valor de p (p) tal como se calcula mediante la prueba t de Student sea < 0,05.
Llevando a cabo el método tal como se describe en la presente memoria, una molécula, y en particular un polipéptido de la invención, se considera que presenta un fenotipo de neurosupervivencia (es decir, neuroprotección y/o neurogénesis y/o neuroregeneración y/o arborización y/o neurorestauración) en el caso de que la expresión de los genes contenidos en el juego tal como se define en la presente memoria se encuentre modificado de una manera estadísticamente significativa.
A título de ejemplo, una molécula, y en particular un polipéptido de la invención, se considera que presenta un fenotipo de neurosupervivencia (es decir, neuroprotección y/o neurogénesis y/o neuroregeneración y/o arborización y/o neurorestauración) en el caso de que los genes ROBO1, POU4F1, PTN, PARD6B y PAFAH1B1 se infraexpresen en grado estadísticamente significativo, en particular en un factor de por lo menos 1,5, en comparación con la expresión de los mismos genes en una célula (cultivo) que no ha estado en contacto con dicha molécula (control negativo); puede calcularse la infraexpresión mediante la implementación del experimento descrito posteriormente, en la sección A.5 (resultados en la sección B.10), en la que el control negativo es un cultivo celular simuladamente infectado.
La solicitud describe además un kit adecuado para llevar a cabo el método tal como se define en la presente memoria, que comprende:
a. una pluralidad de parejas de cebadores específicos para un juego de genes tal como se define en la presente memoria, en particular un juego de genes que consiste o que comprende los cinco genes celulares
siguientes: ROBO1, POU4F1, PTN, PARD6B y PAFAH1B1, y opcionalmente por lo menos un gen adicional seleccionado de entre el grupo que consiste en los doce genes celulares siguientes: PIK3CG, BMP2, DRD1, PAX5, S100A6, DRD2, HDAC7, HEY2, INHBA, SHH, BTK y FOS, y
b. opcionalmente reactivos necesarios para la amplificación de las dianas nucleótido de dichos genes
5 celulares por dichos cebadores, y opcionalmente reactivos para la detección de los productos de amplificación.
Tal como se define en la presente memoria, una pareja de cebadores consiste en un polinucleótido directo y un polinucleótido inverso, presentando cada cebador la capacidad de hibridarse con su diana nucleótida y de amplificar,
10 bajo las condiciones y con los reactivos apropiados, una secuencia de nucleótidos enmarcada por su secuencia complementaria, en la secuencia de su diana nucleótida.
Las parejas de cebadores presentes en los kits de la invención son específicos para un gen, es decir, cada pareja de cebadores amplifica las dianas nucleótidas de un y sólo un gen de entre el juego. Por lo tanto, se excluye que una 15 pareja de cebadores específica para un gen amplifique, de manera exponencial o incluso lineal, las dianas nucleótidas de otro gen y/o otros ácidos nucleicos contenidos en la muestra. De esta manera, la secuencia de un cebador (la pareja de la cual es específica para un gen) se selecciona para que no se encuentre en una secuencia presente en otro gen, no es complementaria a una secuencia presente en dicho otro gen y/o no es capaz de hibridarse bajo condiciones de amplificación tal como se definen en la presente solicitud con la secuencia de las
20 dianas nucleótidas de dicho otro gen.
En una realización particular, el cebador o cebadores directo y/o inverso pueden marcarse, mediante métodos isotópicos (tal como radioactivos) o no isotópicos (tal como fluorescentes, biotina y fluorocromo). El marcaje del cebador o cebadores conduce a marcar el amplicón (producto de amplificación), ya que los cebadores se incorporan
25 en el producto final.
El diseño de una pareja de cebadores es bien conocido de la técnica y en particular puede llevarse a cabo haciendo referencia a Sambrook et al. (Molecular Cloning, A laboratory Manual, tercera edición; capítulo 8 y en particular las páginas 8.13 a 8.16). Se encuentran disponibles diversos programas de software para diseñar parejas de
30 cebadores, tales como Oligo™ o Primer3.
Por lo tanto, cada cebador de la pareja (directo e inverso) presenta, independientemente uno de otro, las características siguientes:
35 -su tamaño es de entre 10 y 50 pb, preferentemente de entre 15 y 30 pb, y -presenta la capacidad de hibridarse con la secuencia de las dianas nucleótidas de un gen.
En una realización particular, en el caso de que se utilicen las parejas de cebadores en una reacción de amplificación simultánea realizada en la muestra, los diversos cebadores presentan la capacidad de hibridarse con
40 sus dianas nucleótidas respectivas a la misma temperatura y bajo las mismas condiciones.
Las condiciones convencionales para la amplificación por PCR son bien conocidas de la técnica y en particular en Sambrook et al. Un ejemplo de condiciones comunes de amplificación mediante PCR: dNTP (200 mM), MgCl2 (0,5 a 3 mM) y cebadores (100 a 200 nM).
45 En una realización particular, la secuencia del cebador es 100% idéntica a una de las cadenas de la secuencia de la diana nucleótida con la que debe hibridarse, es decir, es 100% complementaria a la secuencia de la diana nucleótida con la que debe hibridarse. En otra realización, la identidad o complementariedad no es 100%, pero la similitud es por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90% o por lo menos 95% respecto a su secuencia
50 complementaria en la diana nucleótida. En una realización particular, el cebador difiere de su contrapartida en la secuencia de la diana nucleótida en 1, 2, 3, 4 o 5 mutaciones (deleción, inserción y/o sustitución), preferentemente en 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de nucleótidos. En una realización particular, las mutaciones no se encuentran localizadas en los últimos 5 nucleótidos del extremo 3’ del cebador.
55 En una realización particular, el cebador, que no es 100% idéntico o complementario, mantiene la capacidad de hibridarse con la secuencia de la diana nucleótida, de manera similar al cebador, que es 100% idéntico o 100% complementario a la secuencia de la diana nucleótida (bajo las condiciones de hibridación definidas en la presente memoria). En aras de la especificidad, por lo menos uno de los cebadores (que presenta una similitud de por lo menos 80% tal como se ha definido anteriormente) de la pareja específica para un gen no puede hibridarse con la
60 secuencia que se encuentra en las dianas nucleótidas de otro gen del juego y de otro gen de la muestra.
En la Tabla 2 se dan a conocer ejemplos de cebadores que pueden utilizarse para medir la expresión de los genes celulares listados en la presente memoria.
Tabla 2
Gen
Cebador directo (SEC ID) Cebador inverso (SEC ID)
ROBO1
GTGTGGTGTGTGGCTTCA (253) GTATACAGTCTCATGCC (254)
POU4F1
CCCTCCCTGAGCACAAG (255) GTGGGCAGGCAGGCCC (256)
PTN
GGCAAGAAACAGGAGAAGA (257) GTTTGCTGATGTCCTTT (258)
PARD6B
CATATAGTCATTAGTATG (259) CTGGGAGAATATCCACG (260)
PAFAH1B1
CGGCAAGCTTCTGGCTTC (261) GCATTCAAAGCCCTG (262)
PIK3CG
CGAGATCTACGACAAGTACC (263) CCGGTGCGTGGCCTTCCAGT (264)
BMP2
CCACCATGAAGAATCTTTG (265) ATTAAAGAAGAATCTCCGG (266)
DRD1
GTGTCAGAGCCCCTGATGTG (267) GTCCCGTCCATGGCAGAG (268)
PAX5
CGTCAGTTCCATCAACAGG (269) GGAAGCTGGGACTGGTTG (270)
S100A6
CACCGACCGCTATAAGG (271) GCCAAATGCGACGCGAGCG (272)
DRD2
CATTGTCACCCTGCTGGTC (273) GGTGTTGACTCGCTTGC (274)
HDAC7
GTAGTAGCAGCACGCCCG (275) AGGATGGGATTGGGGC (276)
HEY2
GCAGCCCTGCTCCAGCCCA (277) CTGAAGTTGTGGAGAGG (278)
INHBA
GGGGGAGAGGAGTGAACTG (279) GAAGACATGCCAGGTGC (280)
SHH
GCTGGCCCGCCTGGCGGTGG (281) GCAGTGGATATGTGCCTTGG (282)
BTK
GAATATTTTATCTTGGAGGA (283) AGCCTTCCTGCCCATTTTT (284)
FOS
GAGGAGGCCTTCACCCTGCC (285) TGCTCTTGACAGGTTCCACT (286)
En la solicitud, el término "comprendiendo", que es sinónimo de "incluyendo" o "conteniendo", es abierto y no excluye uno o más elementos, ingredientes o etapas de método adicionales no citados, mientras que la expresión 5 "que consiste en" es una expresión cerrada, que excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente adicional que no se cita explícitamente.
La expresión "que consiste esencialmente en" es una expresión parcialmente abierta, que no excluye uno o más elementos, etapas o ingredientes adicionales no citados, con la condición de que dichos elementos, etapas o 10 ingredientes adicionales no afecten materialmente a las propiedades básicas y nuevas de la invención.
El término "comprendiendo" (o "comprende") por lo tanto incluye el término "consistiendo" ("consiste en"), así como la expresión "consistiendo esencialmente en" ("consiste esencialmente en"). De acuerdo con lo anteriormente expuesto, el término "comprendiendo" (o "comprende") se refiere, en la presente solicitud, a que comprende más
15 particularmente el término "consistiendo" ("consiste en") y la expresión "consistiendo esencialmente en" ("consiste esencialmente en").
Los ejemplos siguientes se proporcionan a título ilustrativo y no a título limitativo.
20 EJEMPLOS
A. Materiales y métodos
A.1. Cálculo de calorimetría de titulación isotérmica (CTI)
25 Se realizaron mediciones de CTI utilizando los calorímetros VP-ITC y VP-ITC200 (MicroCal). Se tituló MAST2-PDZ a 298ºK mediante inyecciones de los polipéptidos (25 a 45 alícuotas consecutivas de 5 a 7 µl a intervalos de 6 min). Los datos en bruto se normalizaron y se corrigieron para los calores de dilución de los polipéptidos. Se determinaron las constantes de disociación de equilibrio (KD) llevando a cabo un ajuste de curva no lineal de los datos corregidos a
30 un modelo con un juego de sitios utilizando el software Origin7.0 (OriginLab). Todas las muestras se prepararon en un tampón que contenía Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5. Los datos se registraron con MAST2-PDZ a una concentración inicial de 30 µM y con péptido a concentraciones iniciales comprendidas entre 250 µM y 350 µM.
A.2. Cultivo celular
35 Las células de neuroblastoma humano, SH-SY-5Y, y el cultivo de células NT2-N humanas, se describen, respectivamente, en Prehaud C. et al., 2010, y en Prehaud C. et al., 2005, y se detallan en la memoria anteriormente proporcionada. Las células se cultivaron en medio RPMI tal como se indica en las instrucciones del fabricante (http://www.cellomics.com/content/menu/Neuroscreen-1_Cells/).
A.3. Producción de lentivirus
Las secuencias de nucleótidos de Neurovita 1 y Neurovita 1 delta PDZ-BS se clonaron a partir del plásmido G-[SP(2aa)-TM-Cyto] descrito en la solicitud nº WO2010/116258. Las secuencias de nucleótidos de Neurovita1 y de Neurovita1 delta PDZ-BS (dadas a conocer en el documento nº WO2010/116258) y de Neurovita2 se obtuvieron mediante PCR y se clonaron en pLenti6.3/V5-TOPO® mediante la utilización del kit de clonación TA (K5315-20, Invitrogen, Francia). Los lentivirus se obtuvieron en células 293T, transfectadas con vectores codificantes de los polipéptidos Neurovita 1, Neurovita 1 delta PDZ-BS o Neurovita 2, mediante los procedimientos estándares, tal como se describen en Vitry S. et al., 2009. Se sometió a ensayo la cantidad de partículas de VIH mediante la utilización del kit ELISA de VIH p24 (Perkin Elmer, NEK050). La infectividad de los lentivectores recombinantes en células NS, SHSY-5Y y NT2-N se monitorizó sistemáticamente mediante qRT-PCR.
A.4. Perfilado del quinoma
El perfilado del quinoma se llevó a cabo mediante Pepscan presto (Países Bajos) en matrices de quinasas PepChip siguiendo las instrucciones del fabricante (http://www.pepscan.com/presto/products-services/pepchip/#kinaseprofiling). Brevemente, las células NT2-N se infectaron simuladamente (control) o se infectaron con rRABV CVS HQ de neurosupervivencia (Prehaud C. et al., 2010) durante 45 h antes de la recolección. El rRABV CVS HQ (cepa CVS-NIV) ha sido depositado en el CNCM el 1 de abril de 2009 bajo el número de depósito I-4140. Se trataron
10.000 mm2 de células NT2-N por duplicado para cada condición. Los lisados celulares se prepararon en tampón MPER que contenía anti-proteasas (Pierce, Thermofisher, Francia) y los sobrenadantes de ultracongelaron en nitrógeno líquido antes de la utilización. Las matrices de quinasas PepChip cubrían el quinoma humano completo (Manning G. et al., 2002). Los datos se sometieron a análisis estadístico de Kolmogorov-Smirnov con un valor de corte de p=0,001 antes de la validación. Se seleccionó una proporción de medias umbral >1,96SE (elevada astringencia). Los puntos representan el complejo de quinasas organizado tal como es definido por Gene Network Central pro (Qiagen, Alemania).
A.5. Perfilado centrado en rutas
Se realizó un seguimiento de la expresión génica mediante la utilización de matrices de PCR de perfilado centrado en rutas de QIAGEN (Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante (http://www.sabiosciences.com/RTPCR.php): la matriz de PCR de señalización PI3K-AKT humana (ref.: PAHS-058) y la matriz de PCR de neurogénesis humana y de células madre neurales (ref.: PAHS-404). Brevemente, se infectaron 15,7 mm2 de células NT2-N con 900 ng de lentivectores p24. Se aisló el ARN total mediante la utilización del kit de purificación RNeasy (QIAGEN, incluyendo el tratamiento con ADNasa 1) y se sometió a síntesis de ADNc (SABioscience, USA) y qPCR (aparato de PCR en tiempo real ABI Fast 7500). Se realizaron experimentos por duplicado y se sometió a ensayo el control de calidad para cada placa de PCR. Los datos se analizaron con la interfaz del web de QIAGEN (http://www.sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php).
Se calcularon los factores de regulación de acuerdo con el método comparativo. En el método comparativo o ΔΔCt de análisis de datos de qPCR, los valores de Ct obtenidos de dos muestras experimentales de ARN diferentes se normalizaron directamente respecto a un gen de mantenimiento y después se compararon. Dicho método supone que las eficiencias de amplificación del gen de interés y de los genes de mantenimiento son próximas al 100% (referidas a una pendiente de la curva estándar o de calibración de -3,32). En primer lugar, la diferencia entre los valores de Ct (ΔCt) del gen de interés y el gen de mantenimiento se calculó para cada muestra experimental. A continuación, se calculó la diferencia de los valores de ΔCt (ΔΔCt) entre muestras experimentales y de control (células simuladamente infectadas). A continuación, el factor de cambio de expresión del gen de interés entre las dos muestras es igual a 2^(-ΔΔCt). El factor de diferencia (factor de cambio) se calculó mediante la ecuación 2(ΔΔC(t). Para el factor de regulación, cualquier factor de regulación (o factor de cambio) inferior a 1 (que significa que el gen está regulado negativamente) se invirtió negativamente, modificando el número fraccionaron por un número entero [por ejemplo, para un gen con un valor del factor de cambio de 0,31, el factor de regulación dado es de -3,2 veces, lo que signifcia que este gen particular está regulado negativamente en 3,2 veces].
La agrupación de los genes en complejos se realizó mediante la utilización del programa Gene Network Central pro (Qiagen, Alemania).
A.6. Crecimiento de las neuritas
Los ensayos de crecimiento de neuritas han sido extensamente descritos en Prehaud C. et al., 2010. Se sembraron células de neuroblastoma humano SH-SY5Y en placas de 24 pocillos (material de plástico Cell Bind, Corning, USA) a una densidad de 40.000 células por pocillo en medio no diferenciador [DMEMF12 (Invitrogen, Reino Unido) con suero de feto bovino al 20% más Pen:Strep al 1% y glutamina al 1%) y se cultivó durante la noche a 37ºC; 24 h después de la siembre se sustituyó el medio de no diferenciación por medio de diferenciación [medio Neurobasal (Invitrogen, Reino Unido) complementado con complemento B27 (Invitrogen, Reino Unido), P/S al 1%, glutamina al 1% y db-AMPc 1 mM (dibutiril-AMPc permeable a través de membrana, Sigma)] y las células se incubaron durante 6
h. A continuación, las células se infectaron con 30 ng de lentivector p24 en medio de diferenciación. Tras 1 h de incubación, las células se lavaron una vez con medio de diferenciación y tras añadir medio de diferenciación, se incubaron durante 24 h a 37ºC. Treinta horas después de la diferenciación, las células se fijaron con paraformaldehído al 3% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 20 min a temperatura ambiente (TA), seguido del tratamiento durante 5 min con Triton-X-100 al 0,1% y suero de cabra normal al 50% (NGS) en PbS durante 1 h a TA. Se utilizó anticuerpo anti-tubulina βIII específico neuronal (Promega, Francia) y anticuerpo antinucleocápside RABV para teñir los procesos de las neuritas y para revelar la infección por RABV, respectivamente. Alternativamente, las células también se tiñeron con cristal violeta, que conserva los procesos de las neuritas.
Se realizó un seguimiento de las células NS durante 72 h y se trataron con 200 ng/ml de NGF en el tiempo=0 (sólo un resultado). Se midió el crecimiento de las neuritas (CN) tal como se ha indicado anteriormente para SH-SY5Y con la excepción de que el CN se siguió 72 h post-infección y las células NS se cultivaron en todo momento en su medio de alimentación (Cellomics, USA).
En ambos casos, se obtuvieron imágenes de células de neuroblastoma humano SH-SY5Y y células NS utilizando un microscopio de UV Leica DM 5000B dotado de una cámara DC 300FX (objetivos de x40 o x20) y se analizaron utilizando software ImageJ 1.38X (Wayne Rasband, NIH, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/) y su software complementario NeuronJ (Meijering et al., 2004; http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/). La longitud media de la neurita por neurona se determinó a partir de experimentos por triplicado.
A.7. Ensayo de rascado (regeneración axonal)
Para los ensayos inducidos por rascado, se sembraron 200 mm2 de células NT2-N (n=8) infectadas con 30 ng de lentivectores p24, sobre placas de 12 pocillos recubiertos con poli-D-lisina-laminina (Sarstedt, Alemania) y se cultivaron durante dos días con el fin de que se recuperasen completamente tras la tripsinización. Se cambió el medio 2 h antes del rascado. Se realizaron lesiones individuales con una aguja para inyección (26GX1/2’’, 12-4,5). Se realizaron por lo menos 10 rascados para cada pocillo individual. Las células se fijaron con PFA (al 4%) 6 días después de las lesiones y se tiñeron con solución de cristal violeta. Se obtuvieron imágenes de las células utilizando un microscopio Leica DM 5000B dotado de una cámara DC 300FX (objetivo x20) y se analizaron utilizando el software ImageJ 1.38X (Wayne Rasband, NIH, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/) y software complementario NeuronJ. Se determinó el porcentaje medio de neuronas en regeneración a partir de 8 experimentos.
A.8. Arborización
Se llevó a cabo un análisis de Sholl, que es un medio para medir la arborización dentrítica, según Sahay A. et al. Y Lioy D.T. et al., Nature, 2011. Se analizó la complejidad de las neuritas a partir de imágenes de 8 bits mediante la utilización del software complementario ImageJ Sholl Analysis (http://www-biology.ucsd.edu/labs/ghosh/software/). Las imágenes se obtuvieron 72 h post-infección (p.i.) con lentivectores.
A.9. Silenciamiento de MAST2
Se silenció la expresión génica de MST2 con el juego específico de lentivirus basados en shARN desarrollado por el RNAI Consortium (TRC, MIT y Harvard, comercializado por Thermoscientific-ABgene, RHS4533-NM_015112). Se produjeron lentivirus recombinantes tal como se ha indicado anteriormente. Se infectaron 15,7 mm2 de células NT2-N con 900 ng de p24 de cada lentivector. Se evaluó la eficiencia del silenciamiento mediante qRT-PCR 2 días postinfección con el juego de cebadores específico QT00042574 (Qiagen, Alemania). A continuación, se utilizaron las células inmediatamente después para los experimentos.
B. Resultados
B.1. Perfilado del quinoma en células NT2-N durante la neuroprotección mediada por el RABV
La incubación con la matriz PepChip Kinomics (que cubre el quinoma humano completo, es decir, más de 518 quinasas) con lisados celulares derivados de células NT2-N infectadas con rRABV CVS HQ de neurosupervivencia reveló que sólo resultaban estimuladas 17 quinasas, bajo condiciones de elevada astringencia (Tabla 3). La totalidad de dichas quinasas están relacionadas, tal como se muestra en la figura 3B.
Tabla 3
Quinasa
Nombre Factor de regulación de la activación Grupo de quinasas
AKT1*
Proteína quinasa B 6,69693 AGC
PIK3CG*
Fosfoinositida-3-quinasa, catalítica, polipéptido gamma 3,81055 Otro
CSNK2A1*
Caseína quinasa 2, alfa 1 3,30198 Otro
SRC
Protooncogén tirosina proteína quinasa 2,52567 TKL
PDLIM5
PDZ y LIM domnio 5 2,47084 TKL
MAP4K1= MEKKK1
Proteína quinasa activada por mitógeno quinasa quinasa quinasa 1 2,26839 STE
ROCK1
Proteína quinasa 1 que contiene superenrollamiento asociada a Rho 2,14479 AGC
GRK6
Receptor quinasa 6 acoplado a proteína G 2,10186 AGC
GRK5
Receptor quinasa 5 acoplado a proteína G 2,05385 AGC
PDK1*
piruvato deshidrogenasa quinasa, isoenzima 1 1,82555 AGC
CDK1
Quinasa 1 dependiente de ciclina 1,82134 GMC
ACVR1B
Receptor de activina A, tipo IB 1,65481 TKL
RPS6KA2
Proteína quinasa S6 ribosómica, 90 kDa 1,65099 AGC
MAPK14* = p38 alfa
Proteína quinasa 14 activada por mitógeno 1,61328 CMGC
ATM*
Mutación ataxia-telangiectasia 0,61628 atípico
PRKCA*
Proteína quinasa C, alfa 0,35932 PKC
MAPK8* JNK, JNK1, JNK1A2, JNK21B1/2, PRKM8, SAPK1
Proteína quinasa 8 activada por mitógeno 0,06722 CMGC
análisis estadístico de Kolmogorov-Smirnov, p de corte=0,001 Proporciones umbral de medias >1,96 SE *: participa en la ruta de señalización Pi3K-AKT
B.2. Crecimiento de las neuritas en células SH-SY5Y y en células NS transducidas con lentivectores expresantes de Neurovita 1
5 Se diseñaron los constructos siguientes: Polipéptido Neurovita 1 y polipéptido Neurovita 1 delta PDZ-BS (figura 4A). Las secuencias de nucleótidos y proteicas eran las siguientes:
Neurovita 1 10 -polinucleótido:
ATGGTTCCTCAGGCTCTCCTGTTTGTACCCCTTCTGGTTTTTCCATTGTGTTTTGGGGGGAAGTATGTATTACTGA GTGCAGGGGCCCTGACTGCCTTGATGTTGATAATTTTCCTGATGACATGTTGTAGAAGAGTCAATCGATCAGAAC 15 CTACGCAACACAATCTCAGAGGGACAGGGAGGGAGGTGTCAGTCACTCCCCAAAGCGGGAAGATCATATCTTCA TGGGAATCACACAAGAGTGGGGGTCAGACCAGACTGTGA (SEC ID nº 8).
-
polipéptido:
20 MVPQALLFVPLLVFPLCFGGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWESH KSGGQTRL (SEC ID nº 9).
Neurovita1 delta PDZ-BS (sin el dominio PDZ-BS)
25 -polinucleótido:
ATGGTTCCTCAGGCTCTCCTGTTTGTACCCCTTCTGGTTTTTCCATTGTGTTTTGGGGGGAAGTATGTATTACTGA GTGCAGGGGCCCTGACTGCCTTGATGTTGATAATTTTCCTGATGACATGTTGTAGAAGAGTCAATCGATCAGAAC CTACGCAACACAATCTCAGAGGGACAGGGAGGGAGGTGTCAGTCACTCCCCAAAGCGGGAAGATCATATCTTCA
30 TGGGAATCACACAAGAGTGGGGGTTGA (SEC ID nº 10).
-
polipéptido:
MVPQALLFVPLLVFPLCFGGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWESH KSGG (SEC ID nº 11).
Los experimentos de transferencia western mostraron que Neurovita 1 y Neurovita 1 delta PDZ-BS se expresaban en ambas líneas celulares (figura 4B). Además, la figura 4C confirmó que Neurovita 1 y Neurovita 1 delta PDZ-BS mostraba un patrón típico de inmunofluorescencia esperado para la glucoproteína de rabdovirus.
El ensayo de crecimiento de neuritas en células SH-SY5Y mostraba que el polipéptido Neurovita 1 mostraba un fenotipo de fuerte crecimiento de las neuritas que estaba mediado por PDZ-BS (comparar el polipéptido con y sin el dominio PDZ-BS en la figura 5A). De manera similar, el ensayo de crecimiento de las neuritas en células NS mostró que el polipéptido Neurovita 1 no sólo mostraba un fenotipo de fuerte crecimiento de las neuritas que estaba mediado por PDZ-BS sino también incrementos de la red de las neuritas en el cultivo infectado (figura 5B).
B.3. Firma molecular de protección mediada por Neurovita 1
El perfilado de la expresión génica centrado en rutas (matriz de neurogénesis humana y células madre neurales y ruta de señalización PI3K/Akt) de las células NT2-N transfectadas con lentivector expresante de Neurovita 1 reveló una firma molecular genética tal como se representa en las figuras 6A y 6B. Dicha firma se caracteriza por los factores de regulación siguientes: Gen SHH (-1,82), gen ROBO1 (-1,69), gen PTN (-1,83), gen POU4F1 (-1,50), gen PARD6B (-1,62), gen PAFAH1B1 (-1,57), gen INHBA (-1,92), gen HEY2 (-3,49), HDAC7 (-1,60), gen DRD2 (-1,64), gen S100A6 (+3,38), gen PAX5 (+1,97), gen DRD1 (+1,59), gen BMP2 (+1,52) y gen PIK3CG (+1,79).
Se comparó dicho perfilado de la expresión génica con el obtenido en células NT2-N en las que se había desactivado la proteína MST2 humana (76% de silenciamiento de MAST-2) y también se transfectaron con el lentivector expresante de Neurovita 1. De esta manera, el complejo de genes identificado en la figura 7B representa los genes regulados en la infección con Neurovita 1 pero regulados diferentemente en células NT2-N, en las que la expresión de MAST2 se había desactivado. La firma molecular genética se caracteriza por los factores de regulación siguientes: Gen SHH (-2,52), gen ROBO1 (+1,00), gen PTN (+1,01), gen POU4F1 (+1,21), gen PARD6B (+1,46), gen PAFAH1B1 (+1,03), gen INHBA (-1,31), gen HEY2 (-2,27), gen HDAC7 (-1,17), gen DRD2 (-1,15), gen S100A6 (-1,44), gen PAX5 (-1,01), gen DRD1 (+2,31), gen BMP2 (+1,23) y gen PIK3CG (-2,24). Cabe mencionar la regulación inversa de los genes ROBO1, PTN, POU4F1, PARD6B, PAFAH1B1, S100A6, PAX5 y PIK3CG en el que la expresión de MAST2 ha sido silenciada, llevando a la conclusión de que MAST-2 controla el patrón de supervivencia génica mediada por Neurovita.
B.4. Regeneración de axones
Se llevó a cabo un ensayo de rascado con células NT2-N que mostraba que sólo las células NT2-N infectadas con Neurovita 1 pueden regenerar sus axones después del rascado. Ni las células no infectadas ni las infectadas con Neurovita 1 delta PDZ-BS puede hacerlo (p<0,0001) (figura 8).
B.5. Firma molecular de regeneración axonal mediada por Neurovita 1
La figura 9 representa el perfilado de expresión génica centrada en la ruta (en matrices de PCR de neurogénesis humana y de células madre neurales y de señalización PI3K-AKT humana) sobre células NT2-N infectadas con Neurovita 1 tras el rascado (sección B.4, anteriormente) en comparación con células no infectadas tras el rascado. La firma molecular genética se caracteriza por los factores de regulación siguientes:
Figura 9A: Matriz de PCR de señalización PI3K-AKT humana
EIF2AK2 (+1,57), FASLG (+2,13), FOXO3 (+1,5), GSK3B (+1,53), HRAS (+1,54), IRAK1 (+1,51), MAPK8 (+1,53), MTCP1 (+1,76), PDK1 (+2,71), PIK3CG (+3,78), RHEB (+1,84), RPS6KA1 (+1,99), TCL1A (+2,10), APC (-1,82), BTK (-1,61), GRB10 (-1,78), RPS6KB1 (-1,68) y TLR4 (-1,63) y Figura 9B: Matriz de neurogénesis humana y células madre neurales ALK (+2,9), GDNF (+1,5), NPTX1 (+1,56), NRG1 (+1,52), PAX5 (+1,65), S100A6 (+1,99), ASCL1 (1,56), BDNF (-1,78), BMP15 (-2,27), BMP4 (-1,58), EGF (-2,10), INHBA (-1,89), NDP (-1,68), NEUROD1 (-3,92), NOTCH2 (-1,57), POU3F3 (-1,55) y ROBO1 (-1,98).
Dichas firmas moleculares muestran una fuerte regulación de los genes que participan en la ruta de señalización PI3K/Akt (figura 9A) y de los genes que participan en la proliferación, adhesión y diferenciación celulares, factores de crecimiento y funciones sinápticas (figura 9B) y demuestran que estos genes se encuentran altamente conectados (figura 9C).
B.6. Diseño de polipéptidos con secuencias optimizadas (constante de disociación y parámetros termodinámicos)
A partir de las estructuras de RMN de alta resolución de los presentes inventores de MAST2-PDZ en complejo con ligandos endógenos y víricos (Protein Data Bank códigos 2KQF y 2KYL), se caracterizó una superficie 5 inesperadamente grande interacción entre el dominio y los polipéptidos. Se demostró que los polipéptidos interactuaban de manera similar con la diana PDZ no sólo a través de los últimos cuatro aminoácidos de las regiones C-terminales canónicas, sino también con otra región de anclaje en la región N-terminal de los péptidos sometidos a ensayo. Aunque los residuos C-terminales de los péptidos contribuyan principalmente a la intensidad de unión a MAST2-PDZ, la presencia de una interacción N-terminal adicional que implica una posición específica del
10 péptido y una característica original del dominio PDZ refuerza claramente la especificidad y afinidad de la interacción. Esta superficie grande y original de interacción constituye una oportunidad para optimizar la afinidad y especificidad de los péptidos para MAST2-PDZ.
Las descripciones termodinámicas y estructurales (a nivel atómico) detalladas de los presentes inventores de los
15 complejos de MAST2-PDZ/péptido (figura 10) se utilizaron para diseñar secuencias optimizadas. Los presentes inventores han propuesto un modelo de relación entre la afinidad de los polipéptidos para MAST2-PDZ (Neurovita) y sus propiedades de neurosupervivencia, en el que a mayor afinidad de los polipéptidos para el dominio MAST2-PDAZ (es decir, a menor KD), más elevadas son las propiedades de neurosupervivencia de estos polipéptidos (figura 10B).
20 Con el fin de conservar la elevada especificidad controlada por los sitios de unión N-terminales y C-terminales del péptido y seleccionados por los ligandos endógenos y víricos para la interacción con MAST2-PDAZ, se dejaron sin modificación las secuencias terminales. La región central del péptido se modificó con el fin de incrementar la afinidad de las secuencias para MAST2-PDZ mediante el diseño de polipéptidos el dominio de unión a MAST2 de los cuales
25 presentaba entre 11 y 13 residuos aminoácidos. La estructura general de dichos polipéptidos se representa en la figura 11A.
Se diseñaron los polipéptidos indicados en la lista, posteriormente, y se llevó a cabo una descripción termodinámica completa para cada complejo MAST2-PDAZ/polipéptido (en el que se estimaron los parámetros entálpicos y 30 entrópicos considerando la flexibilidad y las contribuciones de los contactos polares a la intensidad de la función)
(Tabla 4):
-
un polipéptido terminado en el dominio de unión a MAST-2 tal como se define en la SEC ID nº 235, 35 -un polipéptido tal como se define en la SEC ID nº 9 que termina con el dominio de unión a MAST-2 tal como se define en la SEC ID nº 1, -un polipéptido tal como se define en la SEC ID nº 215 que termina con el dominio de unión a MAST-2 tal como se define en la SEC ID nº 67, -un polipéptido tal como se define en la SEC ID nº 210 que termina con el dominio de unión a MAST-2 tal como 40 se define en la SEC ID nº 64, -un polipéptido tal como se define en la SEC ID nº 218 que termina con el dominio de unión a MAST-2 tal como se define en la SEC ID nº 209, -un polipéptido tal como se define en la SEC ID nº 217 que termina con el dominio de unión a MAST-2 tal como se define en la SEC ID nº 208, 45 -un polipéptido tal como se define en la SEC ID nº 213 que termina con el dominio de unión a MAST-2 tal como se define en la SEC ID nº 74, -un polipéptido tal como se define en la SEC ID nº 211 que termina con el dominio de unión a MAST-2 tal como se define en la SEC ID nº 65, -un polipéptido tal como se define en la SEC ID nº 214 que termina con el dominio de unión a MAST-2 tal como 50 se define en la SEC ID nº 66, -un polipéptido tal como se define en la SEC ID nº 216 que termina con el dominio de unión a MAST-2 tal como se define en la SEC ID nº 68, y -un polipéptido tal como se define en la SEC ID nº 212 que termina con el dominio de unión a MAST-2 tal como se define en la SEC ID nº 71. 55
Tabla 4
Polipéptido
Secuencia del dominio de unión a MAST-2 SE C ID MAST2-PDZ PTPN4 -PDZ
Kd (µM) (constante de disociación )
error ΔH (entalpía ) TΔS (entropía ) n (estequiometría ) Kd (µM)
ATT13
SWESHKSGGETR L 235 0,57 +/0,05 2 - - - 160
VIR13 (Neurovita1 )
SWESHKSGGQTR L 1 1,26 +/0,11 -9929 -1878,39 09996 560
439
SWEVHTQQTRL 67 0,21 +/0,00 2 -8454 646,66 1,022
441 (Neurovita2 )
SWEVHGGQTRL 64 0,12 +/0,00 1 -10230 -808,176 1,069 544
442
SWEVHASGGQTR L 209 0,49 +/0,00 1 -10340 -1737,34 1,037 -
443
SWAEAQHTQQTR L 208 0,4 +/0,00 3 -9088 -360,878 1,007 -
453
SWEVYTGQTRL 74 0,238 - -6511 2521,08 0,846 -
454 (Neurovita 3)
SWEVHGQQTRL 65 0,0629 - -8715 1108,56 1,01 -
455
SWEVHTGQTRL 66 0,13 - -9434 -42,316 0,906 -
460
SWEVAGGQTRL 68 0188 - -7484 1686,68 0,916 -
461
SWEVATQQTRL 71 0,126 - -7688 1722,44 0,806 -
La medición de la constante de disociación (KD) y parámetros termodinámicos (H y TS) mediante ITC de MAST2-PDZ mostró una ganancia significativa de afinidad de los polipéptidos optimizados de la invención para el dominio 5 MAST2-PDZ (Tabla 4). De esta manera, todos los polipéptidos sometidos a ensayo presentaban una KD inferior a 0,5 µM, es decir, una ganancia de afinidad de por lo menos 2,5 en comparación con Neurovita 1. La KD de los polipéptidos sometidos a ensayo varía entre 0,0629 y 0,49 µM, es decir, una ganancia de la afinidad en comparación con Neurovita 1 comprendida entre 2,5 y 20. Un polipéptido particularmente interesante es el polipéptido 454 (Neurovita 3), el dominio de unión a MAST2 del cual consiste en SWEVHGQQTRL, que presenta una KD de 0,0629
10 µM.
En consecuencia, mediante la modificación de la secuencia del conector flexible central de la secuencia de Neurovita, considerando la compensación de entropia/entalpía de los complejos, se incrementó drásticamente la afinidad de los polipéptidos de la invención para MAST2-PDZ.
15 A título de ejemplo, el polipéptido Neurovita 2 (el dominio de unión a MAST2 del cual consiste en SWEVHGGQTRL) muestra una ganancia de 10 veces de la afinidad para el dominio MAST2-PDZ en comparación con Neurovita 1 (0,12 µM frente a 1,26 µM). La comparación de la secuencia del dominio citoplasmático de Neurovita 2 con la de Neurovita 1 y Neurovita 1 delta PDZ-BS se describe en la figura 11B.
20 La expresión del polipéptido Neurovita 2 en las células NS infectadas con un lentivector (en el que se había clonado la secuencia de Neurovita 2) era similar a la obtenida con la infección con vectores lentivíricos que expresaban los polipéptidos Neurovita 1 y Neurovita 1 delta PDZ-BS (figura 11C).
25 B.7. Crecimiento de las neuritas en células NS infectadas con lentivectores expresantes de Neurovita 2
Ensayo de crecimiento de las neuritas en células NS infectadas con lentivectores expresantes de Neurovita 2 que muestra que Neurovita 2, al igual que Neurovita 1, muestra un fenotipo de fuerte crecimiento de las neuritas que está mediado por PDZ-BS (p<0,0001) (figura 12).
B.8. Arborización en células NS transducidas con lentivectores expresantes de Neurovita 2
La arborización en células NS transducidas con lentivectores expresantes de Neurovita 2 demuestra que el crecimiento de las neuritas mediado por Neurovita en células NS se caracteriza por una complejidad más fuerte del
5 árbol de las neuritas que es específico de las neuronas simpáticas completamente funcionales, en comparación con Neurovita 1. De esta manera, Neurovita 2 incrementa la intensidad y complejidad del árbol de neuritas, que es un rasgo de funcionalidad y supervivencia (figura 13).
B.9. Firma molecular de la neuroprotección mediada por Neurovita 2
10 La expresión de cuatro genes celulares, identificados previamente, se sometió a ensayo en células NT2-N 24 h p.i. La figura 14 mostraba los factores de regulación siguientes: BTK (-1,64), FOS (-1,82), DRD2 (-2,35) y POU4F1 (1,53).
15 B.10. Firmas moleculares genéticas de las moléculas Neurovita 1 y Neurovita 2
La Tabla 5 presenta un resumen de los factores de regulación obtenidos con la infección con Neurovita 1 o con Neurovita 2 de las células NT2-N.
20 Un cuadrado negro indica un gen que está regulado en el ensayo de rascado; un cuadrado blanco indica un gen para el que la regulación se encuentra invertida al silenciar MAST2; un cuadrado sombreado indica un gen regulado en la infección con Neurovita 2 (umbral x<-1,5 o x>+1,5).
El núcleo de la firma génica de neurosupervivencia es en este caso ROBO1, POU4F1, PTN, PARD6B y PAFAH1B1,
25 que son genes regulados de la misma manera en las infecciones tanto de Neurovita 1 como de Neurovita 2, la regulación de la cual se encuentra invertida al silenciar MAST2. Cabe indicar que ROBO1 también se encuentra regulado negativamente en el ensayo de rascado.
Los otros genes se utilizaron para caracterizar más específicamente Neurovita 1 (es decir, PIK3CG, BMP2, DRD1, 30 PAX5, S100A6, HDAC7, HEY2, INHBA, SHH) o Neurovita 2 (es decir, DRD2, BTK, FOS).
Dichos genes y su función se listan en la Tabla 7, posteriormente.
La Tabla 6 es una representación de mapa de colores de la firma molecular genética de Neurovita 1 (a) y de la firma molecular genética de Neurovita 2 (b).
a) 5
INHBA
PTN PAFAH1B1
ROBO1 PARD6B
SHH
POU4F1
BTK FOS
Tabla 6 15 b)
PIK3CG S100A6 INHBA PTN BMP2
DRD2 PAFAH1B1 ROBO1
DRD1 HDAC7 PARD6B SHH PAX5 HEY2
POU4F1
BTK FOS
Tabla 7
Genes
Funciones conocidas
Neurovita 1
PIK3CG
Miembro de la familia de la ruta de señalización PI3/Akt (regulada por PTEN)
PAX5
Regulador de la diferenciación celular
S100A6
Regulador del ciclo y proliferación celulares
PAFAH1B1
Regulador de la motilidad y migración celulares
PARD6B
Regulador del ciclo y proliferación celulares
POU4F1
Factor de transcripción, represión de genes neurogénicos tempranos, control de diferenciación terminal
PTN
Citoquina, regulador del ciclo celular
ROBO1
Regulador de la adhesión celular
INHBA
Regulador negativo del ciclo celular
Neurovita 2
BTK
Regulador del crecimiento de las neuritas
FOS
Regulador positivo de apoptosis
DRD2
Inhibidor de la ruta de señalización Wnt (Wnt es una ruta mayor de señalización Que participa en el crecimiento, supervivencia y ramificación neuronales)
POU4F1
Factor de transcripción, represión de genes neurogénicos tempranos, control de diferenciación terminal
B.11. Transcripción de rRABV y lentivectores en células NT2-N
30 Se infectaron células NT2-N con virus de la rabia recombinantes (rABV CVS HQ o rRABV CVS HΔ4) o los lentivectores indicados anteriormente. El virus rABV CVS HQ expresa una proteína G de longitud completa que termina con un dominio de unión a MAST-2 tal como se define en la SEC ID nº 1; el virus rRABV CVS HΔ4 expresa una proteína G de longitud completa que termina con un dominio de unión a MAST-2 que consiste en la SEC ID nº 1
35 en la que los residuos Q, T, R y L han sido delecionados.
Se extrajo el ARN total 24 h p.i. para las infecciones de rRABV durante 48 h para las infecciones con lentivectores. La transcripción específica de los virus recombinantes (rRABV, lentivirus) se sometió a ensayo mediante RT-QPCR. El gráfico mostró que las células NT-2N resultaban infectadas eficientemente con ambos tipos de virus.
B.12. Transcripción de un juego representativo de genes de inmunidad en células NT2-N
Se sometió a ensayo la transcripción mediante RT-qPCR en los cultivos recolectados anteriormente (figura 15)
Se sometió a ensayo el factor relativo de inducción de un juego de genes de inmunidad en células NT2-N infectados con la cepa CVS-HQ o con la cepa CVS HΔ4. La comparación entre la figura 16A y la figura 16B muestra que la inducción del complejo de genes de inmunidad y el fenotipo de neurosupervivencia están disociados.
Además, el factor relativo de inducción de un juego de genes de inmunidad se sometió a ensayo en células NT2-N con vectores lentivíricos que expresaban Neurovita 1, Neurovita 1 delta PDZ-BS o Neurovita 2. La figura 16B muestra que ninguno de los polipéptidos Neurovita solos son capaces de inducir una respuesta de genes de inmunidad en neuronas post-mitóticas humanas.
BIBLIOGRAFÍA
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LISTADO DE SECUENCIAS
<110> INSTITUT PASTEUR CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (C.N.R.S.) UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE -PARIS 6
<120> POLIPÉPTIDOS DE AFINIDAD ELEVADA PARA MAST2 Y USOS DE LOS MISMOS
<130> B09627 -AD/LV/KN
<140> EP XXXXXX
<141> 2011-11-08
<160> 286
<170> PatentIn versión 3.5
<210> 1
<211> 13 38
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Neurovital
5 <400> 1
<210> 2
<211> 31
<212> PRT 10 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio citoplasmático
<400> 2
15 <210> 3
<211> 19
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> Péptido de señal
<400> 3
<210> 4
<211> 22 25 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio transmembranal
<400> 4
<210> 5
<211> 31
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Variante de dominio citoplasmático
<400> 5
<210> 6
<211> 1798
<212> PRT
<213> Homo sapiens -serina/treonina proteína quinasa asociada a los microtúbulos 2 (MAST2)
<210> 7
<211> 93
<212> PRT
<213> Homo sapiens -Dominio PDZ de la proteína MAST2 humana
<400> 7
<210> 8
<211> 264 5 <212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Neurovita 1
<220> 10 <221> CDS
<222> (1)..(264)
<400> 8
<210> 9 15 <211> 87
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 9
<210> 10
<211> 252 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 de Neurovita 1 delta
<220> 10 <221> CDS
<222> (1)..(252)
<400> 10
<210> 11 15 <211> 83
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 11
<210> 12
<211> 524
<212> PRT
<213> Virus de la rabia -Proteína G de CVS -NIV
<400> 12
<210> 13
<211> 524
<212> PRT
<213> Virus de la rabia -Proteína G de ERA -NIV
<400> 13
<210> 14
<211> 522
<212> PRT
<213> Virus de la rabia -proteína G NCBI CAI43218
<400> 14
<210> 15
<211> 87
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Polipéptido
<400> 15
<210> 16
<211> 13
<212> PRT
<213> Virus de la rabia -dominio de unión a MAST-2
<400> 16
<210> 17 10 <211> 74
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Parte de polipéptido
15 <400> 17
<210> 18 20 <211> 74
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Parte de polipéptido
<400> 18
5 <210> 19
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
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<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(7)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
15 <400> 19
<210> 20
<211> 11
<212> PRT 20 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
<221> misc_feature 25 <222> (4)..(7)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 20
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(7)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 21
<210> 22 10 <211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
15 <220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<220> 20 <221> misc_feature
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 22
25 <210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 30 <223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
35 <220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 23
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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5 <220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(6)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
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<221> misc_feature
<222> (5)..(7)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
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<221> misc_feature
<222> (5)..(7)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<213> Secuencia artificial
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<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<210> 36
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
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<221> misc_feature
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<212> PRT
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<222> (7)..(7)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
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<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 42
<210> 43
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 43
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 44
<210> 45
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 45
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 46
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<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 47
<210> 48
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 48 <210> 49
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
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<400> 49
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<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
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<400> 50
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<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 51
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 52
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
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<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
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<222> (7)..(7)
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<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
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<220>
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<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
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<221> misc_feature
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
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<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<210> 59
<211> 11
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<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
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<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<211> 11
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<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa es H, Ao Y
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<210> 62
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
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<221> misc_feature
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<223> Xaa es S, Eo V
<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa es G o T
<220>
<221> misc_feature
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa es H, Ao Y
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa es G o T
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa es G o Q
<400> 63
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 de Neurovita 2
<400> 64
<210> 65
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 de Neurovita3 (454)
<400> 65
<210> 66
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 455
<400> 66
<210> 67
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 439
<400> 67
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 460
<400> 68
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<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<400> 69
<210> 70
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<400> 70
<210> 71
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 461
<400> 71
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<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<400> 72
<210> 73
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<400> 73
<210> 74
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> 453 Dominio de unión a MAST-2
<400> 74
<210> 75
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
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<210> 76
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa es cualquier aminoácido, preferentemente E o A
<400> 76
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<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa es cualquier aminoácido, preferentemente E o A
<400> 77 <210> 78
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa es cualquier aminoácido, preferentemente E o A
<400> 78
<210> 79
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa es cualquier aminoácido, preferentemente E o A
<400> 79
<210> 80
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa es cualquier aminoácido, preferentemente E o A
<400> 80
<210> 81
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<400> 81
<210> 82
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<400> 82
<210> 83
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<400> 83
<210> 84
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<400> 84
<210> 85
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<400> 85
<210> 86
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa es cualquier aminoácido, preferentemente E o A
<400> 86
<210> 87
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa es cualquier aminoácido, preferentemente E o A
<400> 87
<210> 88
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa es cualquier aminoácido, preferentemente E o A
<400> 88
<210> 89
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa es cualquier aminoácido, preferentemente E o A
<400> 89 <210> 90
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa es cualquier aminoácido, preferentemente E o A
<400> 90
<210> 91
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa es cualquier aminoácido, preferentemente E o A
<400> 91
<210> 92
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa es cualquier aminoácido, preferentemente E o A
<400> 92
<210> 93
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<220>
<221> misc_feature <222> (3)..(3)
<223> Xaa es cualquier aminoácido, preferentemente E o A
<400> 93
<210> 94
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<400> 94
<210> 95
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<400> 95
<210> 96
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<400> 96
<210> 97
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<400> 97
<210> 98
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<400> 98
<210> 99
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<400> 99
<210> 100
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<400> 100
<210> 101
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 11 residuos
<400> 101
<210> 102
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 de 12 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa es cualquier aminoácido, preferentemente E o A
<400> 102 <210> 103
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 de 12 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa es cualquier aminoácido, preferentemente E o A
<400> 103
<210> 104
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 de 12 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa es cualquier aminoácido, preferentemente E o A
<400> 104
<210> 105
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 de 12 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa es cualquier aminoácido, preferentemente E o A
<400> 105
<210> 106
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 de 12 residuos
<220>
<221> misc_feature <222> (3)..(3)
<223> Xaa es cualquier aminoácido, preferentemente E o A
<400> 106
<210> 107
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 de 12 residuos
<400> 107
<210> 108
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 de 12 residuos
<400> 108
<210> 109
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 de 12 residuos
<400> 109
<210> 110
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 de 12 residuos
<400> 110
<210> 111
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 de 12 residuos
<400> 111
<210> 112
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 de 12 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(8)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 112
<210> 113
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 12 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(8)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 113
<210> 114
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 12 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(8)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 114
<210> 115
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 12 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(8)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 115
<210> 116
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<220>
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(8)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<210> 171
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<223> dominio de unión a MAST-2 de 12 residuos
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<223> dominio de unión a MAST-2 de 12 residuos
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<210> 177
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<212> PRT
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<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 12 residuos
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<221> misc_feature
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<212> PRT
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<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 12 residuos
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<222> (4)..(6)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 12 residuos
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<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<223> dominio de unión a MAST-2 de 12 residuos
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<223> dominio de unión a MAST-2 de 12 residuos
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<221> misc_feature
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<212> PRT
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<223> dominio de unión a MAST-2 de 12 residuos
<220>
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 183
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 12 residuos
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<221> misc_feature
<222> (4)..(7)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 12 residuos
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(7)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 185
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 12 residuos
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<221> misc_feature
<222> (5)..(7)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 12 residuos
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<221> misc_feature
<222> (4)..(7)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
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<223> dominio de unión a MAST-2 de 12 residuos
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<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(7)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 188
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 12 residuos
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<221> misc_feature
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 12 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(8)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 190
<210> 191
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio de unión a MAST-2 de 12 residuos
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa es G, To Q
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<210> 192
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<212> PRT
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(9)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 192
<210> 193
<211> 13
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 de 13 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa es Eo A
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(9)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 193
<210> 194
<211> 13
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 de 13 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa se selecciona de entre residuos neutros polares, residuos cargados negativamente o residuos hidrofóbicos
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(9)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 194
<210> 195
<211> 13
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 de 13 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa es S, Vo E <220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(9)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 195
<210> 196
<211> 13
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 de 13 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa se selecciona de entre residuos cargados positivamente, residuos no polares de volumen pequeño y residuos aromáticos polares
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(9)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 196
<210> 197
<211> 13
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 de 13 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa es H, Ao Y
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(9)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 197
<210> 198
<211> 13
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 de 13 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(5)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa se selecciona de entre residuos no polares de volumen pequeño, residuos neutros polares y residuos cargados positivamente
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(9)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 198
<210> 199
<211> 13
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 de 13 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(5)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa es K, Ao Q
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(9)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 199
<210> 200
<211> 13
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 de 13 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(6)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa se selecciona de entre residuos neutros polares y residuos cargados positivamente
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 200
<210> 201
<211> 13
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 de 13 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(6)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa es So H
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 201
<210> 202
<211> 13
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 de 13 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(7)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa se selecciona de entre residuos no polares de volumen pequeño, preferentemente residuos flexibles y neutros polares
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 202
<210> 203
<211> 13
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 de 13 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(7)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa es G o T
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 203
<210> 204
<211> 13
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 de 13 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(8)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa se selecciona de entre residuos no polares de volumen pequeño, preferentemente residuos flexibles y neutros polares
<400> 204
<210> 205
<211> 13
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 de 13 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(8)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa es G o Q
<400> 205
<210> 206
<211> 13
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 de 13 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa es Eo A
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa es S, Vo E
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa es H, Ao Y
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa es K, Ao Q <220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa es So H
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa es G o T
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa es G o Q
<400> 206
<210> 207
<211> 13
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 de 13 residuos
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa es Eo A
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa es Vo E
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa es H, Ao Y
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa es K, Ao Q
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa es So H
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa es G o T
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa es G o Q
<400> 207
<210> 208
<211> 13
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> 443 Dominio de unión a MAST-2
<210> 209
<211> 13
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
15 <220>
<223> Dominio de unión a MAST-2 442
<400> 209
<210> 210 20 <211> 85
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Polipéptido Neurovita2 (441)
25 <400> 210
<210> 211 30 <211> 85
<212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Polipéptido Neurovita3 (454)
<400> 211
5 <210> 212
<211> 85
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 10 <223> Polipéptido 461
<400> 212
15 <210> 213
<211> 85
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> Polipéptido 453
<400> 213
<210> 214
<211> 85
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Polipéptido 455
<400> 214
<210> 215
<211>
85 15 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Polipéptido 439
<400> 215
<210> 216
<211> 85
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Polipéptido 460
<400> 216
<210> 217
<211>
87 15 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Polipéptido 443
<400> 217
<210> 218
<211> 87
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Polipéptido 442
<210> 219
<211> 258
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
15 <220>
<223> Polinucleótido de Neurovita2 (441)
<400> 219
<210> 220
<211> 258
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Polinucleótido de Neurovita3 (454)
<210> 221
<211> 258
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
15 <220>
<223> Polinucleótido codificante del polipéptido de SEC ID nº 212
<400> 221
<210> 222 20 <211> 258
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Polinucleótido codificante del polipéptido de SEC ID nº 213
<400> 222
<210> 223
<211> 258
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Polinucleótido codificante del polipéptido de SEC ID nº 214
<210> 224
<211> 258
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
15 <220>
<223> Polinucleótido codificante del polipéptido de SEC ID nº 215
<400> 224
<210> 225 20 <211> 258
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Artificial/ Polinucleótido codificante del polipéptido de SEC ID nº 216
<400> 225
<210> 226
<211> 264
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Polinucleótido codificante del polipéptido de SEC ID nº 217
<210> 227
<211> 264
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
15 <220>
<223> Polinucleótido codificante del polipéptido de SEC ID nº 218
<400> 227
<210> 228
<211> 200
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
25 <220>
<223> CAEV FLAP <400> 228
<210> 229
<211> 200
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> EIAV FLAP
<210> 230
<211> 200
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
15 <220>
<223> VESNA FLAP
<400> 230
<210> 231 20 <211> 200
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SIV AGM FLAP
25 <400> 231
<210> 232
<211> 200
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> VIH-2 RID FLAP
<400> 232
<210> 233
<211> 200
<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> VIH-1 LAI FLAP
<400> 233
15 <210> 234
<211> 119
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> VIH-1 FLAP
<400> 234
<210> 235
<211> 13 25 <212> PRT
<213> Virus de la rabia -dominio de unión a MAST-2 de la proteína G de una cepa atenuada
<400> 235
<210>
236 30 <211> 7385
<212> ADN
<213> Homo sapiens -receptor roundabout de guía axonal, homólogo 1 (ROBO1)
<400> 236
<210>
237 5 <211> 3817
133 <212> ADN
<213> Homo sapiens -homeobox 1 de clase 4 POU (POU4F1)
<400> 237
<210> 238
<211> 1558
<212> ADN
<213> Homo sapiens -pleiotrofina (PTN)
<400> 238 <210> 239
<211> 4625
<212> ADN
<213> Homo sapiens -distribución defectuosa par-6 homólogo beta (PARD6B)
<400> 239
<210> 240
<211> 5614
<212> ADN
<213> Homo sapiens -factor activador de plaquetas acetilhidrolasa 1b, subunidad reguladora 1 (PAFAH1B1)
<400> 240
<210> 241
<211> 5379
<212> ADN
<213> Homo sapiens -fosfoinositida-3-quinasa, catalítica, polipéptido gamma (PIK3CG)
<400> 241
<210> 242
<211> 3150
<212> ADN
<213> Homo sapiens -proteína morfogenética ósea 2 (BMP2)
<400> 242
<210> 243
<211> 3373
<212> ADN
<213> Homo sapiens -receptor de dopamina d1 (drd1)
<400> 243
<210> 244
<211> 3650
<212> ADN
<213> Homo sapiens -paired box 5 (PAX5)
<400> 244
<210>
245 5 <211> 683
<212> ADN
<213> Homo sapiens -proteína S100 de unión al calcio A6 (S100A6)
<400> 245
<210> 246
<211> 2713
<212> ADN
<213> Homo sapiens -receptor de dopamina D2 (DRD2)
<210>
247 5 <211> 4190
<212> ADN
<213> Homo sapiens -histona desacetilasa 7 (HDAC7) 152
<400> 247
<210> 248
<211> 2672
<212> ADN
<213> Homo sapiens -hairy/intensificador de split relacionado con el motivo 2 de YRPW (HEY2)
<400> 248
<210> 249
<211> 2175
<212> ADN
<213> Homo sapiens -inhibina, beta A (INHBA)
<400> 249
<210> 250
<211> 1576
<212> ADN
<213> Homo sapiens -sonic hedgehog (SHH)
<400> 250
<210>
251 10 <211> 2611
<212> ADN
<213> Homo sapiens -tirosina quinasa de la agammaglobulinemia de Bruton (BTK)
<400> 251
<210> 252
<211> 2158
<212> ADN
<213> Homo sapiens -homólogo del oncogén vírico del osteosarcoma murino FBJ (FOS)
<400> 252
<210> 253
<211> 18 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo de ROBO1
<400> 253 10 gtgtggtgtg tggcttca 18
<210> 254
<211> 17
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
15 <220>
<223> Cebador inverso de ROBO1 <400> 254 gtatacagtc tcatgcc 17
<210> 255
<211> 17
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo POU4F1
<400> 255 ccctccctga gcacaag 17
<210> 256
<211> 16
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso POU4F1
<400> 256 gtgggcaggc aggccc 16
<210> 257
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo PTN
<400> 257 ggcaagaaac aggagaaga 19
<210> 258
<211> 17
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso PTN
<400> 258 gtttgctgat gtccttt 17
<210> 259
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo PARD6B
<400> 259 catatagtca ttagtatg 18
<210> 260
<211> 17
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso PARD6B
<400> 260 ctgggagaat atccacg 17
<210> 261
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo PAFAH1B1
<400> 261 cggcaagctt ctggcttc 18
<210> 262
<211> 15
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso PAFAH1B1
<400> 262 gcattcaaag ccctg 15
<210> 263
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo PIK3CG
<400> 263 cgagatctac gacaagtacc 20
<210> 264
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso PIK3CG
<400> 264 ccggtgcgtg gccttccagt 20
<210> 265
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo BMP2 <400> 265 ccaccatgaa gaatctttg 19
<210> 266
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso BMP2
<400> 266 attaaagaag aatctccgg 19
<210> 267
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo DRD1
<400> 267 gtgtcagagc ccctgatgtg 20
<210> 268
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso DRD1
<400> 268 gtcccgtcca tggcagag 18
<210> 269
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo PAX5
<400> 269 cgtcagttcc atcaacagg 19
<210> 270
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso PAX5
<400> 270 ggaagctggg actggttg 18
<210> 271
<211> 17
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo S100A6
<400> 271 caccgaccgc tataagg 17
<210> 272
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso S100A6
<400> 272 gccaaatgcg acgcgagcg 19
<210> 273
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo DRD2
<400> 273 cattgtcacc ctgctggtc 19
<210> 274
<211> 17
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso DRD2
<400> 274 ggtgttgact cgcttgc 17
<210> 275
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo HDHC7
<400> 275 gtagtagcag cacgcccg 18
<210> 276
<211> 16
<212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador inverso HDAC7
<400> 276 aggatgggat tggggc 16
<210> 277
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo HEY2
<400> 277 gcagccctgc tccagccca 19
<210> 278
<211> 17
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso HEY2
<400> 278 ctgaagttgt ggagagg 17
<210> 279
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo INHBA
<400> 279 gggggagagg agtgaactg 19
<210> 280
<211> 17
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso INHBA
<400> 280 gaagacatgc caggtgc 17
<210> 281
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo SHH
<400> 281 gctggcccgc ctggcggtgg 20
<210> 282
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso SHH
<400> 282 gcagtggata tgtgccttgg 20
<210> 283
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo BTK
<400> 283 gaatatttta tcttggagga 20
<210> 284
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso BTK
<400> 284 agccttcctg cccattttt 19
<210> 285
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo FOS
<400> 285 gaggaggcct tcaccctgcc 20
<210> 286
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso FOS
<400> 286 tgctcttgac aggttccact 20

Claims (28)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Polipéptido de como máximo 350 aminoácidos, que comprende, de extremo N-terminal a extremo C-terminal,
    (1) opcionalmente, un péptido de señal, (2) un dominio para el anclaje de dicho polipéptido a la membrana del retículo y/o a la membrana del Golgi (es decir, el dominio de anclaje) y (3) un dominio expuesto citoplasmáticamente (es decir, el dominio citoplasmático) en el que el polipéptido se ancla en la membrana, en el que dicho dominio citoplasmático termina con un dominio de unión a MAST-2, en el que el tamaño de dicho dominio de unión a MAST-2 es de entre 11 y 13 residuos aminoácidos, los primeros dos residuos de dicho dominio de unión a MAST-2 son S y W, y los últimos cuatro residuos de dicho dominio de unión a MAST-2 son Q, T, R y L, seleccionando dicho dominio de unión a MAST-2 de entre el grupo que consiste en:
    (A)
    una secuencia, el tamaño de la cual es de 11 residuos, que consiste en SWX1X2X3X4X5QTRL, en el que cada uno de X1, X2, X3, X4 y X5 es cualquier residuo aminoácido (SEC ID nº 19), en el que X1 es cualquier aminoácido, preferentemente E o A (SEC ID nº 20 y nº 21), más preferentemente E y/o X2 es S, E o V, más preferentemente V (SEC ID nº 22 a nº 24),
    (B)
    una secuencia, el tamaño de la cual es de 11 residuos, seleccionada de entre el grupo que consiste en: SWX1KSGGQTRL (SEC ID nº 76), SWX1SSGGQTRL (SEC ID nº 77), SWX1SHGGQTRL (SEC ID nº 78), SWX1SHKGQTRL (SEC ID nº 79), SWX1SHKSQTRL (SEC ID nº 80), SWX1HSGGQTRL (SEC ID nº 86), SWX1HKGGQTRL (SEC ID nº 87), SWX1HKSGQTRL (SEC ID nº 88), SWX1SKGGQTRL (SEC ID nº 89), SWX1SKSGQTRL (SEC ID nº 90), SWX1SHSGQTRL (SEC ID nº 91), SWX1SHKGQTRL (SEC ID nº 92) y SWX1SKGGQTRL (SEC ID nº 93), en la que X1 es cualquier aminoácido, preferentemente E o A, más preferentemente E (SEC ID nº 81 a nº 85 y nº 94 a nº 101),
    (C)
    una secuencia, el tamaño de la cual es de 12 residuos, consistente en SWX1X2X3X4X5X6QTRL, en el que cada uno de X1, X2, X3, X4, X5 y X6 es cualquier residuo aminoácido (SEC ID nº 112), en el que X1 es preferentemente E o A, más preferentemente E y/o X2 es S, E o V, más preferentemente V, y
    (D)
    una secuencia, el tamaño de la cual es de 12 residuos, seleccionada de entre el grupo que consiste en: SWX1HKSGGQTRL (SEC ID nº 102), SWX1SKSGGQTRL (SEC ID nº 103), SWX1SHSGGQTRL (SEC ID nº 104), SWX1SHKGGQTRL (SEC ID nº 105) y SWX1SHKSGQTRL (SEC ID nº 106), en el que X1 es cualquier aminoácido, preferentemente E o A, más preferentemente E (SEC ID nº 107 a nº 111),
    (E)
    una secuencia, el tamaño de la cual es de 13 residuos, consistente en SWX1X2X3X4X5X6X7QTRL, en la que cada uno de X1, X2, X3, X4, X5, X6 y X7, es cualquier residuo aminoácido (SEC ID nº 192), en el que dicha secuencia no consiste en SWESHKSGGQTRL (SEC ID nº 1), en la que dicho polipéptido presenta una afinidad de unión para el dominio PDZ de la proteína MAST2 humana que es superior a la afinidad de unión de la proteína G del virus de la rabia que comprende la secuencia SWESHKSGGQTRL para el dominio PDZ de la proteína MAST2.
  2. 2.
    Polipéptido según la reivindicación 1, en el que dicho dominio de unión a MAST-2 que consiste en la secuencia de 11 residuos SWX1X2X3X4X5QTRL, en la que X1 es E o A y/o X2 es S, E o V y/o X3 es H, A o Y y/o X4 es G o T y/o X5 es G o Q, y preferentemente presenta la secuencia S-W-E/A-S/E/V-H/A/Y-G/T-G/Q-Q-T-R-L tal como se define en la SEC ID nº 61.
  3. 3.
    Polipéptido según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho dominio de unión a MAST-2 consiste en la secuencia de 11 residuos S-W-E-V-H/A/Y-G/T-G/Q-Q-T-R-L tal como se define en la SEC ID nº 63 y preferentemente se selecciona de entre el grupo que consiste en SWEVHGGQTRL (SEC ID nº 64), SWEVHGQQTRL (SEC ID nº 65), SWEVHTGQTRL (SEC ID nº 66), SWEVHTQQTRL (SEC ID nº 67), SWEVAGGQTRL (SEC ID nº 68), SWEVAGQQTRL (SEQ ID NO:69), SWEVATGQTRL (SEC ID nº 70), SWEVATQQTRL (SEC ID nº 71) SWEVYGGQTRL (SEC ID nº 72), SWEVYGQQTRL (SEC ID nº 73), SWEVYTGQTRL (SEC ID nº 74) o SWEVYTQQTRL (SEC ID nº 75).
  4. 4.
    Polipéptido según la reivindicación 1, en el que dicho dominio de unión a MAST-2 consiste en la secuencia de 12 residuos SWX1X2X3X4X5X6QTRL, en la que X1 es E, A, V o S, X2 es S, V, H, A o Y, X3 es H, A, Y, K o Q, X4 es K, A, Q, S o H, X5es S, H, G o T y X6es G, T o Q, tal como se define en la SEC Id nº 191.
  5. 5.
    Polipéptido según la reivindicación 1, en el que dicho dominio de unión a MAST-2 consiste en la secuencia de 13 residuos SWX1X2X3X4X5X6X7QTRL, en la que X1 es E o A y/o X2 es S, V o E y/o X3 es H, A o Y y/o X4 es K, A o Q y/o X5 es S o H y/o X6 es G o T y/o X7 es G o Q, preferentemente presenta la secuencia S-W-E/A-S/V/E-H/A/Y-K/A/Q-S/H-G/T-G/Q-QTRL tal como se define en la SEC ID nº 206 y más preferentemente consiste en SWAEAQHTQQTRL (SEC ID nº 208) o SWEVHASGGQTRL (SEC ID nº 209)
  6. 6.
    Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la secuencia del dominio citoplasmático antes del dominio de unión a MAST-2 es:
    -un polipéptido que contiene 20 a 40 residuos aminoácidos, preferentemente que contiene 31 residuos, o -un fragmento del dominio citoplasmático de la proteína G de virus de la rabia que consiste en la secuencia tal como se define en la SEC ID nº 2 o una variante que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a la SEC ID nº 2, tal como RRVNRSEPTQLNLRGTGREVSVTPQSGKIES (SEC ID nº 5).
  7. 7.
    Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el dominio de anclaje es:
    -un péptido, el tamaño del cual es de 18 a 26 residuos, que ancla el polipéptido a la membrana del retículo endoplasmático y/o a la membrana del aparato de Golgi en las células, preferentemente un dominio transmembranal, o -el dominio transmembranal de la proteína G de virus de la rabia que consiste en la secuencia tal como se define en la SEC ID nº 4 o una variante que presenta una identidad de por lo menos 81% respecto a dicha SEC ID nº 4 que conserva la capacidad de anclar el polipéptido a la membrana del retículo endoplasmático y/o a la membrana del aparato de Golgi en las células.
  8. 8.
    Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende un péptido de señal que es:
    -un péptido, el tamaño del cual es de entre 3 y 60 residuos, que dirige el polipéptido al retículo endoplasmático y opcionalmente por la ruta secretoria, o -un péptido de señal de la proteína G del virus de la rabia que consiste en la secuencia tal como se define en la SEC ID nº 3 o una variante que presenta una identidad de por lo menos 68% respecto a dicha SEC ID nº 3 que conserva la capacidad de dirigir el polipéptido al retículo endoplasmático y opcionalmente por la ruta secretoria.
  9. 9.
    Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende, entre el péptido de señal y el dominio de anclaje, un conector que consiste en 1 a 4 residuos aminoácidos, preferentemente 1 a 4 residuos aminoácidos del extremo C-terminal del ectodominio de la proteína G del virus de la rabia, preferentemente los dos últimos residuos C-terminales del ectodominio de la proteína G del virus de la rabia.
  10. 10.
    Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende o que consiste en, de extremo Nterminal a extremo C-terminal:
    (1)
    un péptido de señal tal como se define en la SEC ID nº 3 o una variante que presenta una identidad de por lo menos 68% respecto a dicha SEC ID nº 3 que conserva la capacidad de dirigir el polipéptido al retículo endoplasmático y opcionalmente por la ruta secretoria,
    (2)
    opcionalmente, los últimos dos residuos C-terminales del ectodominio de la proteína G de virus de la rabia,
    (3)
    un dominio de anclaje tal como se define en la SEC ID nº 4 o una variante que presenta una identidad de por lo menos 81% respecto a dicha SEC ID nº 4, que conserva la capacidad de anclar el polipéptido a la membrana del retículo endoplasmático y/o a la membrana del aparato de Golgi en las células, y
    (4)
    un dominio citoplasmático que comprende o que consiste en (a) un péptido tal como se define en la SEC ID nº 2 o una variante que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a la SEC ID nº 2 y
    (b)
    un dominio de unión a MAST-2 tal como se define en la SEC ID nº 19 a SEC ID nº 209, preferentemente seleccionado de entre el grupo que consiste en la SEC ID nº 19 a SEC ID nº 101, SEC ID nº 102 a SEC ID nº 191 y SEC ID nº 192 a SEC ID nº 209, más preferentemente tal como se define en las SEC ID nº 64 a nº 68, nº 71, nº 74 y nº 208 a nº 209.
  11. 11.
    Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para el que la constante de disociación (KD) del complejo formado entre dicho polipéptido y el dominio PDZ de la proteína MAST2 humana es inferior a 0,5 µM, preferentemente inferior a 0,2 µM, más preferentemente inferior a 0,1 µM, medido mediante calorimetría de titulación exotérmica (CTI).
  12. 12.
    Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, la secuencia del cual se selecciona de entre el grupo que consiste en SEC ID nº 210 a SEC ID nº 218.
  13. 13.
    Polinucleótido codificante del polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, la secuencia del cual presenta como máximo 1.050 nucleótidos.
  14. 14.
    Polinucleótido según la reivindicación 13, seleccionado de entre el grupo que consiste en SEC ID nº 219 a SEC ID nº 227.
  15. 15.
    Vector que comprende un polinucleótido según la reivindicación 13 o 14.
  16. 16.
    Vector según la reivindicación 15, que es un vector de expresión en el que dicho polinucleótido se encuentra bajo el control de uno o más elementos reguladores de la transcripción, tal como un promotor, por ejemplo el promotor del CMV.
  17. 17.
    Vector derivado de lentivirus de expresión, en particular un plásmido, que comprende el polinucleótido según la reivindicación 13 o 14, elementos reguladores de la expresión de dicho polinucleótido, una región de inicio central de acción en ces (cPPT) y una región de terminación de acción en ces (CTS), ambas de origen lentivírico, y señales reguladoras de origen retrovírico para la transcripción inversa, la expresión y el empaquetamiento.
  18. 18.
    Partícula pseudotipada de vector lentivírico que comprende proteínas estructurales GAG y un núcleo vírico constituido de: (a) proteínas POL y (b) un genoma del vector lentivírico que comprende el polinucleótido según la reivindicación 13 o 14, elementos reguladores de la expresión de dicho polinucleótido, una región de inicio central de acción en ces (cPPT) y una región de terminación de acción en ces (CTS), ambas de origen lentivírico, y señales reguladoras de origen retrovírico para la transcripción inversa, la expresión y el empaquetamiento, en el que dicha partícula se pseudotipa con la proteína G de un virus VSV o la proteína G del virus de la rabia.
  19. 19.
    Partícula lentivírica según la reivindicación 18, en la que la proteína integrasa de la proteína POL es defectuosa.
  20. 20.
    Célula o cultivo celular transfectado con un vector según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17 o transducida con una partícula lentivírica según la reivindicación 18 o 19.
  21. 21.
    Composición que comprende un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, un polinucleótido según la reivindicación 13 o 14, un vector según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, una partícula lentivírica según la reivindicación 18 o 19 o una célula según la reivindicación 20, y opcionalmente un vehículo, excipiente o portador farmacéuticamente aceptable.
  22. 22.
    Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, un polinucleótido según la reivindicación 13 o 14, un vector según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, una partícula lentivírica según la reivindicación 18
    o 19, una célula o un cultivo celular según la reivindicación 20 o una composición según la reivindicación 21, para la utilización a modo de medicamento.
  23. 23. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, un polinucleótido según la reivindicación 13 o 14, un vector según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, una partícula lentivírica según la reivindicación 18
    o 19, una célula o un cultivo celular según la reivindicación 20 o una composición según la reivindicación 21, para la utilización en el tratamiento y/o la paliación y/o la prevención de un neoplasma del sistema nervioso, en particular un tumor de cáncer.
  24. 24. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, un polinucleótido según la reivindicación 13 o 14, un vector según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, una partícula lentivírica según la reivindicación 18
    o 19, una célula o un cultivo celular según la reivindicación 20 o una composición según la reivindicación 21, para la utilización en el tratamiento y/o la paliación y/o la prevención de infecciones microbianas de las neuronas, en particular infecciones microbianas que inducen apoptosis de las neuronas.
  25. 25. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, un polinucleótido según la reivindicación 13 o 14, un vector según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, una partícula lentivírica según la reivindicación 18
    o 19, una célula o un cultivo celular según la reivindicación 20 o una composición según la reivindicación 21, para la utilización en la protección de las neuronas frente a agentes neurotóxicos y el estrés oxidativo.
  26. 26. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, un polinucleótido según la reivindicación 13 o 14, un vector según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, una partícula lentivírica según la reivindicación 18
    o 19, una célula o cultivo celular según la reivindicación 20 o una composición según la reivindicación 21, para la utilización en el tratamiento y/o la paliación y/o la prevención de una enfermedad, trastorno o condición neurodegenerativa, en particular la encefalopatía no vírica, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, ELA, la enfermedad de Huntington, la escleroses múltiple (EM) o una enfermedad genética rara.
  27. 27. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, un polinucleótido según la reivindicación 13 o 14, un vector según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, una partícula lentivírica según la reivindicación 18
    o 19, una célula o un cultivo celular según la reivindicación 20 o una composición según la reivindicación 21, para la utilización en el tratamiento y/o la paliación y/o la prevención de una lesión física o isquémica del sistema nervioso, o de una enfermedad, trastorno o condición que implica dicha lesión, en particular una convulsión, ictus, traumatismo o epilepsia.
  28. 28. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, un polinucleótido según la reivindicación 13 o 14, un vector según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, una partícula lentivírica según la reivindicación 18
    o 19, una célula o un cultivo celular según la reivindicación 20 o una composición según la reivindicación 21, para la utilización en el tratamiento y/o la paliación y/o la prevención de una leucemia.
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