ES2652367T3 - Método de detección de los microorganismos resistentes a un agente terapéutico - Google Patents
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Abstract
Un método para detectar microorganismos resistentes a un agente terapéutico en una muestra biológica, en el que dicha muestra biológica es una muestra no cultivada, que comprende las siguientes etapas: a. inocular dicha muestra, en un primer tubo con, y en un segundo tubo sin, al menos un agente terapéutico e incubarla, preferiblemente incluyendo un agente de lisis y/o un tampón; b. añadir a ambos tubos un marcador fluorescente; c. realizar un análisis de fluorescencia para obtener uno o más parámetros de fluorescencia para cada uno de los dos tubos; en el que el fenotipo resistente de los microorganismos de la muestra biológica a dicho agente terapéutico se obtiene comparando el uno o más parámetros de fluorescencia entre los dos tubos.
Description
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DESCRIPCION
Metodo de deteccion de los microorganismos resistentes a un agente terapeutico Campo tecnico de la invencion
La presente invencion se refiere a un metodo de deteccion de los microorganismos resistentes a un agente terapeutico y a la determinacion de los mecanismos de resistencia subyacentes.
Antecedentes de la invencion
Actualmente, hay una necesidad principal de abreviar y de mejorar los procedimientos actuales de laboratorio para la deteccion y sobre todo para la evaluacion de la susceptibilidad de los microorganismos. Una tecnologfa ideal de diagnostico dana un perfil de susceptibilidad de forma cronologica para permitir el establecimiento del tratamiento apropiado basandose en ello.
En el caso de las infecciones mas graves asociadas concretamente a septicemia, la velocidad es esencial. Se ha demostrado que el riesgo de mortalidad aumentana sustancialmente por hora si se retarda el tratamiento antimicrobiano apropiado.
Los criterios de referencia de los metodos de diagnostico actuales se basan en el cultivo que es lento, muy laborioso, que proporciona identificacion fenotfpica y ensayo de susceptibilidad antimicrobiano, que requiere 48-72 h despues de recoger las muestras. Tiene que iniciarse tratamiento empmco a menudo con un antibiotico de amplio espectro, lo que da lugar al aumento de resistencia antimicrobiana.
Usando los ensayos clasicos, los productos biologicos como orina tiene que cultivarse en medios solidos y solamente entonces podna tener lugar la identificacion y la evaluacion de la susceptibilidad. La sangre habitualmente se inocula en medios de caldo (cultivos sangumeos) y se analiza automaticamente; cuando se vuelven positivos se siembran en medio solido y solamente despues de 24 h como mmimo se forman colonias para la evaluacion de la susceptibilidad. Por otro lado, se necesitan otras 24 h para la determinacion del perfil de susceptibilidad ya que se basan en la capacidad de crecer en presencia de un panel de farmacos.
La resistencia clmica podna estar relacionada con la ausencia de susceptibilidad antimicrobiana de la cepa, pero tambien a bajos niveles de farmaco antimicrobiano activo sobre la infeccion local. Hay protocolos bioqmmicos disponibles para solamente unos pocos farmacos, por ejemplo, vancomicina, gentamicina y amicacina, y podnan ser inactivos.
El documento C Pina-Vaz: Journal of Medical Microbiology, vol. 54, n.°1, 1 de enero de 2005, paginas 77-81, XP55038987, ISSN: 0022-2615, describe un metodo seguro, fiable y rapido para estudiar la susceptibilidad a estreptomicina, isoniacida, rifampicina y etambutol. Los aislados de micobacterias, cultivados durante 72 h en ausencia o en presencia de farmacos antimicobacterianos en el tubo indicador de crecimiento de micobacterias (MGIT), se inactivaron por calor, se tineron con SYTO 16 (un tinte fluorescente de acido nucleico que solamente penetra en las celulas con lesion grave de la membrana) y despues se analizan por citometna de flujo.
El documento Pina-Vaz C et al., Clinical microbiology and infection, vol 7, n.° 11, paginas 609-618, XP001128799, ISSN: 1198-743X, divulga una determinacion rapida y fiable de la susceptibilidad de cepas de Candida a anfotericina B (Am B), fluconazol (Flu) y 5-fluorocitosina (5-FC), usando metodos citometricos.
El documento de patente EP0118274 se refiere a procesos de ensayo microbiologico y aparatos para identificar productores de penicilinasa, en que a un recipiente para incubacion de ensayo de una suspension de cultivo de microorganismo con una densidad celular de aproximadamente 108 por ml se proporciona penicilina, tamponamiento pobre y un indicador fluorescente, por ejemplo, una cumarina tal como 4-metil-umbeliferona, en cantidad suficiente para discriminar los productores de penicilinasa y los no productores despues de tiempos de incubacion durante aproximadamente una hora (hasta 18 horas).
El documento de patente WO 2009/095258 divulga un metodo para la deteccion de resistencia a un antibiotico en un microorganismo, que comprende las etapas de exponer el microorganismo sospechoso a un antibiotico marcado (fluorescente) y observar las diferencias entre este y un microorganismo no resistente del mismo tipo.
El documento Pina-Vaz C et al., Journal of Clinical Microbiology, American Society for Microbiology, vol 42, n.°2, paginas 906-908, XP002547425, ISSN: 0095-1137 se refiere al uso de un citometro laser de barrido para la deteccion de micobacterias directamente en muestras clmicas (frotis tenidos con yoduro de propidio-auramida).
Sumario de la invencion
Esta invencion se refiere a un ensayo de susceptibilidad antimicrobiana realizado sobre cultivos microbianos puros -
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un cultivo de laboratorio que contiene una unica especie de organismo - o directamente de muestras biologicas - no cultivadas - por citometna de flujo. Algunas realizaciones preferidas a adoptar no requieren el uso de un cultivo puro obtenido de un producto biologico - que dura al menos 24 horas para que los microorganismos crezcan - de modo que se realiza un ensayo de susceptibilidad antimicrobiana directamente de muestras biologicas - no cultivadas como orina, cultivos de sangre o de agua por analisis de fluorescencia como una citometna de flujo.
La materia objeto divulgada se refiere a un metodo para detectar microorganismos resistentes a un agente terapeutico en una muestra biologica, que comprende las siguientes etapas:
a. inocular dicha muestra, en un primer tubo con, y en un segundo tubo sin, al menos un agente terapeutico e incubarla, preferiblemente incluyendo un agente de lisis y/o un tampon;
b. anadir a ambos tubos un marcador fluorescente;
c. realizar un analisis de fluorescencia para obtener uno o mas parametros de fluorescencia o de crecimiento para cada uno de los dos tubos;
donde el fenotipo resistente de los microorganismos de la muestra biologica a dicho agente terapeutico se obtiene comparando el uno o mas parametros de fluorescencia entre los dos tubos.
La materia objeto divulgada tambien se refiere a un metodo para detectar microorganismos resistentes (una bacteria, un hongo o un protista) a un agente terapeutico en una muestra biologica. Concretamente, directamente de las muestras biologicas - no cultivadas - como una muestra de orina, cultivo de sangre, agua o una suspension de microorganismos obtenidos de cultivos puros, que comprende las siguientes etapas:
a. inocular dicha muestra, no cultivada, en un primer tubo con, o en un segundo tubo sin, al menos un agente terapeutico; preferentemente incluyendo ademas al menos un agente de lisis y/o un tampon, y/o un medio de cultivo adecuado, o poner la muestra en un tubo de suero de separacion; e incubarla;
b. anadir a ambos tubos un marcador fluorescente;
c. realizar un analisis citometrico de flujo para obtener uno o mas parametros citometricos de flujo para cada uno de los dos tubos;
donde el fenotipo resistente de los microorganismos de la muestra biologica a dicho agente terapeutico se obtiene comparando el uno o mas parametros citometricos de flujo entre los dos tubos.
En otra realizacion, el uno o mas parametros citometricos de flujo comprenden parametros de dispersion frontal y/o dispersion lateral y/o fluorescencia. Los parametros de la senal de dispersion de fluorescencia podnan ser intensidad, perfil espectral y/o recuento de celulas.
En otra realizacion de la presente invencion, el metodo divulgado comprende ademas una o mas de las etapas preparatorias:
• identificar el tipo de microorganismo presente en la muestra biologica y, por consiguiente, seleccionar el agente o agentes terapeuticos, concretamente si el tipo es gram positivo o gram negativo;
• concentrar la muestra biologica y eliminar, si hubiera, cualquier residuo, por ejemplo, residuos de muestras sangumeas, orina u otro producto biologico; preferentemente por centrifugacion, filtracion o uso de un tubo de suero de separacion y centrifugar.
En otra realizacion de la presente invencion, el tiempo de incubacion de la muestra puede variar entre 30 minutos - 2 h, preferiblemente entre 30-60 minutos.
En otra realizacion de la presente invencion, la temperatura de incubacion de la muestra es entre 30-40 °C, preferiblemente entre 25-35 °C.
En otra realizacion de la presente invencion, el tiempo de reaccion de la etapa b) con el marcador fluorescente puede estar entre 5-60 minutos.
En otra realizacion de la presente invencion, para la determinacion de los mecanismos de resistencia de los microorganismos, la muestra biologica de la etapa c) puede comprender ademas un inhibidor enzimatico, por ejemplo, en el caso de deteccion de la presencia de beta-lactamasas de espectro amplio (ESBL). El inhibidor enzimatico preferido podna ser acido clavulanico o tazobactam, o sus mezclas, entre otros.
En otro aspecto preferido de la presente invencion, el metodo comprende ademas la siguiente etapa para detectar los mecanismos de resistencia de los microorganismos, como por ejemplo debido a la presencia de carbapenemasas - enzimas que degradan los carbapenems, un mecanismo importante de resistencia (se recomienda el ensayo de Hodge, que dura otras 24 horas, que es engorroso y diffcil de interpretar):
i. inocular dicha muestra con un carbapenem e incubarla;
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ii. retirar el microorganismo de la muestra biologica, preferiblemente por filtracion;
iii. anadir una cepa con comportamiento conocido - es dedr, una cepa de control con una curva de efecto a la dosis conocida, como por ejemplo incubando una concentracion en serie de un carbapenem con un microorganismo como Escherichia coli, cepa ATCC 25922 por citometna de flujo;
iv. anadir a ambas muestras un marcador fluorescente;
v. realizar un analisis citometrico de flujo para obtener uno o mas parametros citometricos de flujo para cada uno de los dos tubos;
vi. comparar el perfil generado con la cepa de control.
En presencia de carbapenemasas, la cepa ensayada degradara el carbapenem de modo que se reducira el farmaco activo; el efecto de los carbapenems sobre el tipo de cepa se reduce. Si el efecto de una cierta concentracion de carbapenem es inferior a la esperada, el microorganismo es un producto de carbapenemasa.
En una realizacion mas preferida de la presente invencion, el metodo comprende ademas la siguiente etapa para detectar los mecanismos de resistencia de los microorganismos, como por ejemplo debido a la presencia de carbapenemasas:
• obtener una curva de efecto a la dosis citometrica de flujo, incubando una concentracion en serie de un carbapenem con un microorganismo como Escherichia coli, cepa ATCC 25922 por citometna de flujo;
• enfrentar una cepa resistente a carbapenems, retirar el microorganismo por filtracion del tubo de ensayo que contiene la cepa despues de incubacion con una cierta concentracion del carbapenem;
• este filtrado ahora se incuba con el tipo de cepa (ATCC) y se analiza su efecto por citometna de flujo; su efecto se compara con el resultado esperado respecto a la curva de efecto a la dosis.
En otra realizacion preferida, la cantidad terapeutica de cualquier farmaco en un lfquido biologico podna evaluarse ademas basandose en la misma metodologfa.
En una realizacion mas preferible del metodo para detectar microorganismos resistentes a un agente terapeutico en una muestra biologica, dicho microorganismo es un Staphylococcus spp. Streptococcus spp. Enterococcus spp; una enterobacteriacea como Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Proteus spp; una bacteria no fermentativa como Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baummanii o Burkloderia cepaciae; Neisseria spp, Haemophilus spp; Mycobacterium spp y Nocardia spp; Legionella spp y bacterias anaerobicas; un hongo como Candida spp., Cryptococcus neoformans, Pneumocystis jirovecii y moho como Aspergillus spp; un parasito como Giardia spp u otro microorganismo similar.
En otra realizacion preferida del metodo para detectar microorganismos resistentes a un agente terapeutico en una muestra biologica, el agente terapeutico podna ser un farmaco antibacteriano como penicilinas, cefalosporinas, otras beta-lactamas (carbepenems, aztreonam) macrolidos, quinolonas, aminoglucosidos, glucopeptidos, un lipopeptido, tetraciclinas y otros (por ejemplo, colistina, cloranfenicol, clindamicina, fosfomicina, linezolid, nitrofurantoma, sulfonamida, rifampina, trimetoprim, trimetoprim-sulfametoxazol o tigeciclina); un antifungico como polienos, 5- fluorocitosina, azoles o equinocandinas u otro agente terapeutico similar.
En otra realizacion preferible del metodo para detectar microorganismos resistentes a un agente terapeutico en una muestra biologica, el marcador fluorescente puede ser un tinte de acido nucleico, un tinte metabolico, un tinte potencial de membrana, una sonda para organulos, un indicador fluorescente de la morfologfa celular y flujo de ifquidos, una sonda para la viabilidad celular, proliferacion y funcion o sonda para especies de oxigeno reactivo. Mas preferiblemente, el marcador fluorescente es colorante de acridina, colorante de cianina, colorante de fluorona, colorante de oxacina, colorante de fenantridina o un colorante de rodamina.
En una realizacion diferente, la susceptibilidad antifungica a mohos puede realizarse adicionalmente inoculando esporas en viales Bactec Mycosis IC/F o tubos MGIT con y sin antifungicos como: anfotericina B, voriconazol y fluconazol; el tiempo hasta ser positivos - emision de fluorescencia - se registrara por un equipo Bactec. En viales con cepas susceptibles con antifungico se tardara al menos dos veces el tiempo en llegar a ser positivos en comparacion con el vial de control - sin antifungico.
La fluorescencia podna ser un citometro de flujo o un BACTEC MGIT - tubo indicador del crecimiento de micobacterias.
La materia objeto divulgada permite la evaluacion de la susceptibilidad de un microorganismos - concretamente agentes infecciosos - a los agentes antimicrobianos principales de colonias o de las muestras biologicas; los mohos tienen un protocolo diferente. La materia objeto divulgada permite ademas la deteccion de los mecanismos de resistencia e incluso ensayo microbiologico de cuantificacion del farmaco en diferentes muestras biologicas.
Descripcion general de la invencion
Los metodos de laboratorio para el perfil de susceptibilidad usados en laboratorios clmicos rutinarios requieren un
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tiempo mmimo de 48 horas. Este retardo se debe al hecho de que los metodos conocidos se basan en el crecimiento de microorganismos. En su lugar, la evaluacion de susceptibilidad antimicrobiana por analisis de fluorescencia, concretamente citometna de flujo basada en la evaluacion del estado fisiologico de la celula despues de exposicion al farmaco dura un corto periodo de tiempo. La determinacion de las lesiones morfologicas o la actividad fisiologica no es posible por la metodologfa clasica.
Han surgido muchos avances en el campo de la microbiologica, particularmente, respecto a la identificacion de microorganismos usando tecnicas de biologica molecular. Sin embargo, esta tecnologfa presenta una limitacion ya puede aplicarse unicamente a organismo cuyo genoma es conocido. Otro inconveniente se refiere a su alto coste. Ademas, la biologfa molecular proporciona unicamente de forma muy ocasional informacion sobre la susceptibilidad del microorganismo ya que, unicamente de forma ocasional, la presencia de un gen espedfico se sabe que confiere resistencia a un farmaco particular. Esta relacion directa se establece en el caso espedfico de rifampicina respecto a la resistencia de Mycobacterium tuberculosis y resistencia a meticilina en Staphylococcus aureus.
Las caractensticas que permiten que se realice el ensayo directamente del producto son:
• El hecho de que estos productos tengan una densidad celular suficiente (que excede preferiblemente 105) para exploracion por citometna de flujo
- el cultivo sangumeo se somete a una incubacion previa que proporciona, despues de ser positiva, el microorganismo que esta a la densidad celular requerida para realizar los ensayos de susceptibilidad;
- las muestras de orina, cuyos criterios de infeccion corresponden a una densidad celular que excede 105 celulas por mililitro.
• En ambos productos, los microorganismos se encuentran en fase exponencial, esto se requiere porque la evaluacion de susceptibilidad de algunos tipos de farmacos antimicrobianos debe tener microorganismos en la fase exponencial debido a su modo de accion.
La aplicacion innovadora de citometna de flujo es la posibilidad de realizar una evaluacion de multiples parametros de una poblacion celular de microorganismos de forma dinamica, a lo largo del tiempo, y correlacionar esto con el estudio de su capacidad de replicacion. Para demostrar una actividad letal rapidamente de un farmaco por el metodo convencional tenemos que demostrar que la celula es incapaz de replicase. Por citometna de flujo, podnamos ser capaces de demostrar despues de un tiempo de incubacion de unos pocos minutos con un farmaco espedfico, una lesion grave de la membrana celular, que significa muerte. Ademas, los mecanismos de accion e incluso de forma mas importante los mecanismos de resistencia podnan investigarse por citometna de flujo. Ademas, esta nueva estrategia permite el estudio de combinaciones de farmacos que a menudo se usan en pacientes cnticos sin evidencias in vitro previas de efecto sinergico.
Descripcion de las figuras
Las siguientes figuras proporcionan realizaciones preferidas para ilustrar la descripcion y no deben verse como limitantes del alcance de la invencion.
Figura 1: Esquema de la metodologfa para una rapida evaluacion de susceptibilidad antimicrobiana directamente de cultivos sangumeos positivos o muestras de orina antes de la adquisicion de citometna de flujo.
Figura 2: Esquema de dos realizaciones distintas de la presente invencion - el metodo de deteccion de la susceptibilidad de un microorganismo a un agente terapeutico usando cultivos sangumeos positivos o muestras de orina implementadas y los resultados obtenidos con cepas tfpicas susceptible y resistentes.
Figura 3: Histogramas de citometna de flujo de un ejemplo tfpico de una Staphylococcus aureus susceptible (MSSA) y resistente a oxacilina (MRSA) despues de un tiempo de incubacion de 2 horas y tincion con FDA.
Figura 4: Histogramas de citometna de flujo de un ejemplo tfpico de una Enterococcus faecalis susceptible y resistente a vancomicina despues de un tiempo de incubacion de 1 hora y tincion con FDA.
Figura 5: Histogramas de citometna de flujo de un ejemplo tfpico de una Escherichia coli susceptible y resistente a quinolonas, concretamente ciprofloxacina despues de un tiempo de incubacion de 1 hora y tincion con SYBR Green.
Figura 6: Histogramas de citometna de flujo de un ejemplo tfpico de Escherichia coli susceptible y resistente a cefotaxima (CTX) despues de incubacion durante 1 hora con el farmaco y tenida con DiBAC^3); en el caso de resistente a CTX se incuba con CTX con y sin acido clavulanico (CLA) y se tine con DiBAC4(3). La cepa positiva a ESBL se comporta como susceptible cuando se incuba con CLA.
Figura 7: Histogramas de citometna de flujo de un ejemplo tfpico de cepa de Candida albicans despues de incubacion durante 1 hora con anidulafungina, fluconazol o las asociaciones de ambos y tenida con DiBAC4(3). A. Celulas de control (sin antifungicos) y C despues de incubacion con los farmacos (C1-anidulagungina, C2-fluconazol y C3-anidulafungina y fluconazol).
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Descripcion detallada de la invencion
Los metodos clasicos de susceptibilidad se basan en cultivos puros en medios solidos. Se preparan suspensiones de microorganismos y conforme a ello se adecuan las placas/paneles de susceptibilidad (ejemplo: bacilos gram-negativos; cocos gram-positivos; hongos, etc.) respecto a metodos automaticos (sistema VITEK 1 o VITEK 2 - BioMerieux; BD Phoenix System - Becton-Dickinson Biosciences; MicroScan WalkAway System - Dade Behring).
Otros ensayos manuales estan disponibles, como los ensayos de macrodilucion y microdilucion en caldo, ensayo E (AB BIODlSK), ensayo de difusion en disco y paneles en forma seca (TREK Diagnostics).
Todos ellos se basan en el estudio de la capacidad de los microorganismos de replicarse en presencia de diferentes antimicrobianos.
En primer lugar, la mayor desventaja es que se realizan en colonias en medios solidos que necesitan al menos 24 h para crecer. A pesar de que hay metodos semiautomatizados disponibles, se basan en la deteccion del crecimiento, que tarda tiempo en dar resultados (mm. 18-24 h), necesitan personal muy cualificado y son caros.
Metodos biomoleculares (no implementados en todos los laboratorios rutinarios).
Los metodos moleculares representaron una revolucion para el ensayo en laboratorio de diagnostico de microbiologfa principalmente relacionado con la identificacion de microorganismos y unicamente en raras ocasiones puede ayudar a la evaluacion de la susceptibilidad (PCR combinada, micromatrices, etc.).
De hecho, hay varios genes implicados en los mecanismos de resistencia, lo que da lugar, muchas veces, a etapas de secuenciacion. Normalmente, hay una ausencia de correlacion entre el genotipo y el fenotipo. A pesar de ser muy sensibles y espedficos, no proporcionan ninguna informacion respecto a la viabilidad y son caros.
1. Preparacion de una suspension microbiana
1.1 Cultivos sangumeos o muestra de orina
A partir de un cultivo sangumeo positivo o una muestra de orina:
• Se realiza una tincion gram (maximo: 10 minutos) o analisis de espectrometna de masas (Maldi-TOF) para guiar el posterior analisis. Esta etapa previa nos proporcionara informacion esencial a cerca del microrganismo, concretamente en terminos de:
- Bacterias: cocos o bacilos; gram positivas o gram negativas - que da lugar a la eleccion de los antibioticos a ensayar;
- Hongos
• Se filtra (para recoger celulas hematicas y desechos grandes) y se transfiere el cultivo sangumeo o la orina a un vial que contiene una solucion de lisis de sangre (solucion acuosa de NH4Cl, KHCO3 y EDTA) o
• Se transfiere a un tubo de suero de separacion (por ejemplo, tubo de gel Vacutainer) y se centrifuga. Las celulas sangumeas permaneceran en el fondo del gel, los microorganismos en la parte superior del gel
• Se prepara una suspension microbiologica en medio de cultivo filtrado esteril.
1.2 A partir de cultivos puros
Se hace una suspension microbiana a partir de una colonia en medio de cultivo de caldo esteril y filtrado (por ejemplo: Mueller-Hinton) y se incuba hasta la fase de crecimiento exponencial.
1. Se incuba la suspension bacteriana a 37 °C y 150 golpes por minuto, hasta que las bacterias alcanzan la primera fase de crecimiento exponencial (preferiblemente cuando la densidad optica es de 0,2 a 600 nm de longitud de onda) en caldo Mueller-Hinton (Difco™) esteril y filtrado (0,22 pm).
2. Se diluye el cultivo de caldo hasta una D.O. = 0,06 (aproximadamente 106 celulas por ml, que es la densidad celular optima para su lectura en un citometro de flujo) o como alternativa se ajusta a 0,5 MacFarland y despues de ello se diluye preferiblemente 1:100 en cultivo de caldo.
2. Tratamiento antimicrobiano in vitro
- Se obtiene la densidad celular para el ensayo de susceptibilidad por citometna de flujo, que podna ser, por ejemplo, 106 celulas/ml.
- Se transfiere la suspension microbiana a un conjunto de viales con diferentes farmacos antimicrobianos (a concentraciones de valor cntico) incluyendo un vial de control (sin farmaco antimicrobiano);
- Se incuban los viales de acuerdo con el farmaco antimicrobiano (0,5-2 horas);
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- Se anade el fluorocromo apropiado (dependiendo del farmaco antimicrobiano) de acuerdo con el protocolo optimizado previo.
3. Analisis citometrico de flujo
Los ajustes de adquisicion se definen usando mezclas de microesferas ajustando el voltaje al tercer decenio logantmico (log) de todos los canales de fluorescencia. Se usa el umbral FSC.
Las muestras se analizan en el canal de fluorescencia FL1, FL2 y FL3 dependiendo de la sonda fluorescente, usando dos transferencias puntuales: SSC frente a FSC y SCC frente a fluorescencia. Los resultados numericos se expresan usando la intensidad de la fluorescencia y/o el porcentaje de celulas tenidas.
El equipo es un citometro de flujo (por ejemplo, un FACSCalibur BD Biosciences, Sidney, Australia) con tres PMT equipados con filtros convencionales (FL1: BP 530/30 nm; FL2: BP 585/42 nm; FL3: LP 670 nm), un laser de argon de 488 nm de 15 mW y que funciona con el software de celulas Quest Pro (version 4.0.2, BDBiosciences, Sidney). El formato del archivo de datos de citometna de flujo fue FCS 2.0a
Ejemplos
Los siguientes ejemplos proporcionan realizaciones preferidas y no deben observarse como limitantes del alcance de la invencion.
Ejemplo n.° 1
Evaluacion de susceptibilidad de Escherichia coli a quinolonas
• Agente microbiano: Escherichia coli
• Farmaco ensayado: quinolona - ciprofloxacina [2 concentraciones de valor cntico: 1 y 4 pg/ml]
• Fluorocromo usado: SYBR Green, un colorante que penetra en la membrana que se une a la estructura de ADN bicatenario.
1. Se distribuye la suspension de bacterias con la concentracion de 106 celulas por ml a una serie de viales que contienen:
■ Ciprofloxacina a 1 pg/ml;
■ Ciprofloxacina a 4 pg/ml;
■ Control viable (sin ciprofloxacina).
2. Despues de treinta minutos de incubacion a 35 °C y 150 golpes por minuto, se centrifuga el conjunto de viales a 10 000 rpm durante cinco minutos.
3. Se anade SYBR Green (preparado en TE, pH = 7,5) a una dilucion final de 1:100 000 durante 30 minutos en la oscuridad.
4. Se realiza la adquisicion citometrica de flujo a 530/30 nm - FL1; se compara la intensidad de la fluorescencia de las celulas tratadas con celulas no tratadas.
Criterios de interpretacion de resultados:
La ciprofloxacina actua inhibiendo la ADN girasa y bloquea la replicacion del ADN, que da lugar a menos ADN bicatenario que es la diana para el fluorocromo SYBR Green. Por lo tanto, se espera que las cepas susceptibles (valores de MlC <1 pg/ml) a citrofloxacina muestren una reduccion del ADN bicatenario - correspondiente a menos intensidad de fluorescencia.
Se calcula un mdice de tincion (SI) basandose en la relacion entre la intensidad de la fluorescencia verde (530/30 nm; FL-1) de las celulas tratadas y de las celulas no tratadas (control viable)
• Bacterias susceptibles si SI < 1 con 1 pg/ml de ciprofloxacina;
• Bacterias resistentes si SI > 1 con 4 pg/ml de ciprofloxacina.
Ejemplo n.° 2
Evaluacion de susceptibilidad para bacterias gram negativas a carbapenems
• Agente microbiano: Pseudomonas aeruginosa
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• Farmaco ensayado: carbapenems - meropenem
[3 concentraciones de valor cntico: preferiblemente 1, 2 o 4 |jg/ml]
• Fluorocromo usado: trimetina oxonol de bis-(acido 1,3-dibutilbarbiturico) (DiBAC4(3)) - un anion lipofilo sensible a voltaje para la medicion de potenciales de membrana; las celulas despolarizadas muestran mayor intensidad de fluorescencia mientras que las celulas polarizadas muestran un valor inferior.
1. Se distribuye la suspension de bacterias con la concentracion de 106 celulas por ml a una serie de viales que contienen:
• Meropenem a 1 jg/ml;
• Meropenem a 4 jg/ml;
• Control viable (sin meropenem)
2. Despues de treinta minutos de incubacion a 35 °C y a 150 golpes por minuto, se anade DiBAC4(3) a una concentracion final de 1 jg/ml durante 30 minutos en la oscuridad.
3. Se realiza la adquisicion citometrica de flujo a 530/30 nm - FL1; se compara la intensidad de fluorescencia de las celulas tratadas con celulas no tratadas.
Criterios de interpretacion de resultados:
El meropenem es un bactericida que actua inhibiendo la smtesis de la capa de peptidoglucano de las paredes de las celulas bacterianas. La despolarizacion de la membrana puede detectarse rapidamente por DiBAC4(3) en cepas susceptibles. Las celulas despolarizadas muestran mayor intensidad de fluorescencia mientras que las celulas polarizadas muestran un valor inferior.
Se calcula un mdice de tincion (SI) basandose en la relacion entre la intensidad de fluorescencia verde (530/30 nm; FL-1) de las celulas despolarizadas despues del tratamiento con el antimicrobiano y las celulas de control (no tratadas).
• Bacterias susceptibles SI < 1 con 1 jg/ml de meropenem;
• Bacterias resistentes SI > 1 con 4 jg/ml de meropenem;
Ejemplo n.° 3
Evaluacion de susceptibilidad de Staphylococcus aureus a oxacilina
• Agente microbiano: Staphylococcus aureus
• Farmaco ensayado: oxacilina [2 concentraciones: 2, 4 jg/ml]
• Fluorocromo usado: fDa (diacetato de fluorescema), un indiciador fluorescente de viabilidad celular; en celulas viables tras hidrolisis por esterasas, FDA forma fluorescema.
1. Se distribuye la suspension de bacterias con la concentracion de 106 celulas por ml a una serie de viales que contienen:
■ oxacilina a 2 jg/ml
■ oxacilina a 4 jg/ml;
■ control viable (sin oxacilina).
2. Despues de 120 minutos de incubacion a 35 °C, se anade FDA a 1 jg/ml y se incuba durante 60 minutos en las mismas condiciones.
3. Se realiza la adquisicion citometrica de flujo a 530/30 nm - FL1; se compara la intensidad de la fluorescencia de las celulas tratadas con celulas no tratadas.
Criterios de interpretacion de resultados:
La oxacilina es un bactericida que actua inhibiendo la smtesis de la capa de peptidoglucano de las paredes de celulas bacterianas. Por lo tanto, se espera que las cepas susceptibles (valores de MIC < 2 jg/ml) a oxacilina muestren una reduccion de la actividad metabolica - correspondiente a menos intensidad de fluorescencia de fluorescema.
Se calcula un mdice de tincion (SI) basandose en la relacion entre la intensidad de fluorescencia verde (530/30 nm; FL-1) de las celulas tratadas y celulas no tratadas (control viable)
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• Bacterias susceptibles SI < 1 con 2 |jg/ml de oxacilina;
• Bacterias resistentes SI > 1 con 4 jg/ml de oxacilina.
Ejemplo n.° 4
Evaluacion de susceptibilidad de bacterias gram positivas a vancomicina
• Agente microbiano: Enterococcus faecalis
• Farmaco ensayado: Glucopeptido - vancomicina [2 concentraciones de valor cntico: 4-16 jg/ml]
• Fluorocromo usado: FDA (diacetato de fluorescema), un indiciador fluorescente de viabilidad celular; en celulas viables tras hidrolisis por esterasas, FDA forma emision de fluorescencia creciente de fluorescema.
1. Se distribuye la suspension de bacterias con la concentracion de 106 celulas por ml a una serie de viales que contienen:
■ vancomicina a 4 jg/ml
■ vancomicina a 16 jg/ml;
■ control viable (sin oxacilina).
2. Despues de 60 minutos de incubacion a 35 °C y 150 golpes por minuto, se anade FDA a 1 jg/ml y se incuba durante 30 minutos en las mismas condiciones.
3. Se realiza la adquisicion citometrica de flujo a 530/30 nm - FL1; se compara la intensidad de la fluorescencia de las celulas tratadas con celulas no tratadas.
Criterios de interpretacion de resultados:
La vancomicina es un bactericida que actua inhibiendo la smtesis de la capa de peptidoglucano de las paredes de celulas bacterianas. Por lo tanto, se espera que las cepas susceptibles (valores de MIC < 2 jg/ml) a vancomicina muestren una reduccion de la actividad metabolica - correspondiente a menos intensidad de fluorescencia de fluorescema.
Se calcula un mdice de tincion (SI) basandose en la relacion entre la intensidad de fluorescencia verde (530/30 nm; FL-1) de las celulas tratadas y celulas no tratadas (control viable)
• Bacterias susceptibles SI < 1 con 4 jg/ml de vancomicina;
• Bacterias resistentes SI > 1 con 16 jg/ml de vancomicina.
Ejemplo n.° 5 - Estudio de mecanismos de resistencia
Resistencia por B-lactamasas de amplio espectro (ESBL)
• Agente microbiano: Klebsiella pneumoniae
• Farmaco ensayado: cefotaxima (CTX) y ceftazidima (CAZ) 2 concentraciones de valor cntico:
-1 y 4 jg/ml para CTX - 4 y 16 jg/ml para CAZ
• Inhibidor de farmaco ensayado: acido clavulanico (CLA) - 4 jg/ml
• Fluorocromo usado: trimetina oxonol de bis-(acido 1,3-dibutilbarbiturico) (DiBAC4(3)) - un anion lipofilo sensible a voltaje para la medicion de potenciales de membrana.
1. Distribuir la suspension de bacterias con la concentracion de 106 celulas por ml en una serie de viales que contienen:
■ CTX a 1 jg/ml;
■ CTX a 4 jg/ml;
■ CTX a 1 jg/ml + 4 jg/ml CLA;
■ CTX a 4 jg/ml + 4 jg/ml CLA;
■ CAZ a 4 jg/ml;
■ CAZ a 16 jg/ml;
■ CAZ a 4 jg/ml + 4 jg/ml CLA;
■ CAZ a 16 jg/ml + 4 jg/ml CLA;
■ Control viable (sin cefalosporinas)
2. Despues de 30 minutos de incubacion a 35 °C y 150 golpes por minuto, se anade DiBAC4(3) a una concentracion final de 1 jg/ml durante 30 minutos en la oscuridad.
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3. Se realiza el analisis de citometna de flujo con el protocolo apropiado y se lee a 530/30 nm - FL1.
Criterios de interpretacion de resultados:
Se detectan ESBL basandose en su capacidad de hidrolizar cefalosporinas (CTX y CAZ) pero se inhiben por acido clavulanico (CLA), es decir, se espera que detecte una bacteria que es resistente a cefalosporinas a traves de la produccion de ESBL cuando se vuelven susceptibles por la exposicion a cefalosporinas asociadas con CLA.
Se calcula un mdice de tincion basandose en la relacion entre la intensidad de fluorescencia verde (530/30 nm; FL1) de celulas despolarizadas (celulas muertas; celulas con alta intensidad de fluorescencia) despues del tratamiento con las maximas concentraciones de ambas cefalosporinas (4 pg/ml de cefotaxima (CTX) y 16 pg/ml de ceftazidima (CAZ)) con y sin la presencia de CLA - en este caso espedfico, denominado mdice CLA.
Indice CLA > 1,5 (para al menos una cefalosporina) bacteria productora de ESBL Indice CLA < 1,5 bacteria productora negativa de ESBL
Ejemplo n.° 6
Evaluacion de susceptibilidad de una combinacion de farmacos de un cultivo sangumeo positivo para levaduras
Se filtra y usa el agente de lisis o se usa un tubo separador y se centrifuga
• Se realiza un analisis Gram - levaduras o MaldiTof - Candida albicans
• Farmaco ensayado: anidulafungina y fluconazol aislados y en asociacion
• Fluorocromo usado: FUN-1, un marcador fluorescente usado para estudiar la viabilidad de levaduras NOTA: las celulas no viables muestran mayor intensidad de fluorescencia que las viables (celulas no tratadas)
• Despues de 60 minutos de incubacion con el antifungico aislado y en asociacion a 37 °C, se anade FUN-1 a una concentracion final de 0,5 pg/ml durante 30 minutos en la oscuridad.
Se realiza la adquisicion citometrica de flujo a 575 nm - FL2; se calcula un mdice de fluorescencia como la suma de relaciones entre la fluorescencia de celulas tratadas con la asociacion de antifungico y la fluorescencia de celulas tratadas con cada antifungico individual. La asociacion se clasifica como sinergica, indiferente o antagonista.
Criterios de interpretacion de resultados:
La evaluacion de la interaccion de farmacos in vitro se determina de acuerdo con el mdice de tincion (SI). El SI se calcula como la suma de la intensidad media de la fluorescencia presentada por celulas tratadas con combinacion de farmacos (0,5xMIC de cada farmaco) dividida por la fluorescencia del farmaco en solitario. Por tanto, SI =(MIF AND +FLU/MIF AND) + (MIF AND + FLU/MIF FLU) (MIF - relacion entre la intensidad media de fluorescencia de celulas tratadas y celulas viables). Una asociacion se define como "antagonismo" para SI < 1, "indiferente" para SI entre 1-4 y "sinergia" para un SI > 4.
Ejemplo n.° 7
Susceptibilidad antifungica de Aspergillus fumigatus
• Se prepara una suspension densa de Aspergillus fumigatus;
• se inoculan 107 esporas/ml en una serie de viales Bactec de Micosis IC/F o en tubos MGIT de equipos Bactec automatizados (Becton Dickinson);
• cada serie incluye un vial o tubo sin antifungico (control), uno con anfotericina B, uno con posaconazol y uno con voriconazol;
• los viales o tubos se introducen en el equipo Bactec respectivo y se registra el tiempo hasta llegar a ser positivos
Criterios de interpretacion de resultados:
Las cepas susceptibles incubadas con antifungicos tardanan mas del doble del tiempo en llegar a ser positivas en comparacion con el control. Los tubos MGIT dieron resultados mas rapidos que los viales Bactec (por ejemplo, las muestras de control tardan 7 ± 1 horas en viales Bactec frente a 11 ± 1 horas en tubos MGIT)
Ejemplo n.° 8
Cuantificacion antimicrobiana microbiologica de un liquido biologico
• Se usa una cepa de control con una curva de efecto a la dosis citometrica de flujo conocida cuando se incuba con el antimicrobiano que se desea cuantificar;
• se incuba la muestra biologica con la cepa de control;
• se marcan las dos muestras previas con un marcador fluorescente adecuado para evaluar el efecto antimicrobiano;
• se obtiene la fluorescencia citometrica de flujo y las senales de dispersion para generar un perfil de dicho
microorganismo.
Criterios de interpretacion de resultados:
5 Se compara el perfil citometrico de flujo generado con la curva de la muestra de control y se deduce la concentracion presente en la muestra.
La invencion, por supuesto, no debe restringirse de ninguna manera a las realizaciones descrita y un experto en la materia prevera muchas posibilidades a modificaciones de la misma sin alejarse de la idea basica de la invencion 10 que se define en las reivindicaciones adjuntas.
Las siguientes reivindicaciones exponen realizaciones particulares de la invencion.
Claims (12)
- 5101520253035404550556065REIVINDICACIONES1. Un metodo para detectar microorganismos resistentes a un agente terapeutico en una muestra biologica, en el que dicha muestra biologica es una muestra no cultivada, que comprende las siguientes etapas:a. inocular dicha muestra, en un primer tubo con, y en un segundo tubo sin, al menos un agente terapeutico e incubarla, preferiblemente incluyendo un agente de lisis y/o un tampon;b. anadir a ambos tubos un marcador fluorescente;c. realizar un analisis de fluorescencia para obtener uno o mas parametros de fluorescencia para cada uno de los dos tubos;en el que el fenotipo resistente de los microorganismos de la muestra biologica a dicho agente terapeutico se obtiene comparando el uno o mas parametros de fluorescencia entre los dos tubos.
- 2. Un metodo para detectar microorganismos resistentes a un agente terapeutico en una muestra biologica, en el que dicha muestra biologica es una muestra no cultivada, que comprende las siguientes etapas:a. inocular dicha muestra, en un primer tubo con, y en un segundo tubo sin, al menos un agente terapeutico e incubarla, preferiblemente incluyendo un agente de lisis y/o un tampon;b. anadir a ambos tubos un marcador fluorescente;c. realizar un analisis citometrico de flujo para obtener uno o mas parametros citometricos de flujo para cada uno de los dos tubos;en el que el fenotipo resistente de los microorganismos de la muestra biologica a dicho agente terapeutico se obtiene comparando el uno o mas parametros citometricos de flujo entre los dos tubos.
- 3. El metodo de acuerdo con las reivindicaciones previas, en el que el uno o mas parametros citometricos de flujo comprenden dispersion frontal y/o dispersion lateral y/o parametros de fluorescencia; preferiblemente en el que dicha senal de dispersion de fluorescencia comprende la intensidad, perfil espectral y/o recuento celular.
- 4. El metodo de acuerdo con las reivindicaciones previas que comprende ademas una o mas de las etapas de preparacion:i. identificar el tipo de microorganismo presente en la muestra biologica y, por consiguiente, seleccionar el agente o agentes terapeuticos, concretamente si el tipo es bacterias gram-positivas o gram-negativas u hongos;ii. concentrar la muestra biologica y eliminar, si hubiera, cualquier residuo, en particular con una centrifugacion o una filtracion.
- 5. El metodo de acuerdo con las reivindicaciones previas, en el que en la etapa a) la muestra se inocula en un medio de cultivo adecuado.
- 6. El metodo e acuerdo con la reivindicacion previa, en el que el tiempo de reaccion de la etapa b) con el marcador fluorescente es de 5-60 minutos.
- 7. El metodo de acuerdo con las reivindicaciones previas, en el que la muestra biologica en la etapa c) comprende ademas un inhibidor enzimatico en el caso de deteccion de presencia de p-lactamasas de amplio espectro (ESBL).
- 8. El metodo de acuerdo con la reivindicacion previa, en el que el inhibidor enzimatico es un acido clavulanico o tazobactama.
- 9. El metodo de acuerdo con las reivindicaciones previas, que comprende ademas la siguiente etapa:i. inocular dicha muestra con un carbapenem e incubarla;ii. retirar el microorganismo de la muestra biologica, preferiblemente por filtracion;iii. anadir una cepa con comportamiento conocido;iv. anadir a ambas muestras un marcador fluorescente;v. realizar un analisis citometrico de flujo para obtener uno o mas parametros citometricos de flujo para cada uno de los dos tubos;vi. comparar el perfil generado con la cepa de control.
- 10. El metodo de acuerdo con las reivindicaciones previas, en el que dicho microorganismo es una bacteria, un hongo o un protista, en particular dicha bacteria es una bacteria gram-positiva o negativa; gram-variable o con incapacidad de tincion Gram como Mollicutes; o una bacteria acido-alcohol resistente.
- 11. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 10, en el que dicho microorganismo es una Staphylococcus spp. Streptococcus spp. Enterococcus spp; Enterobacteriacea, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Proteus spp;Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baummanii, Burkloderia cepaciae; Neisseria spp, Haemophilus spp; Mycobacteria spp, Nocardia spp; Legionella spp, bacterias anaerobicas; Candida spp. Cryptococcus neoformans, Pneumocystis jirovecii o mohos como Aspergillus spp; Giardia spp.5 12. El metodo de acuerdo con las reivindicaciones previas, en el que el agente terapeutico es un farmacoantibacteriano como penicilinas, cefalosporinas, carbapenems, aztreonam, macrolidos, quinolonas, aminoglucosidos, glucopeptidos, un lipopeptido, tetraciclinas colistina, cloranfenicol, clindamicina, fosfomicina, linezolid, nitrofurantoma, sulfonamida, rifampina, trimetoprim, trimetoprim-sulfametoxazol o tigeciclina, polienos, 5-fluorocitosina, azoles o equinocandinas.10
- 13. El metodo de acuerdo con las reivindicaciones previas, en el que el marcador fluorescente es un tinte de acido nucleico, un tinte metabolico, un tinte potencial de membrana, una sonda para organulos, un indicador fluorescente de morfologfa celular y flujo de lfquidos, una sonda para la viabilidad celular, proliferacion y funcion o sonda para especies de oxfgeno reactivo, preferiblemente dicho marcador fluorescente es un colorante de acridina, un colorante 15 de cianina, un colorante de fluorona, un colorante de oxacina, un colorante de fenantridina o un colorante de rodamina.
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