ES2654561T3 - Procedimientos y ácidos nucleicos para determinar el pronóstico de un sujeto con cáncer - Google Patents

Procedimientos y ácidos nucleicos para determinar el pronóstico de un sujeto con cáncer Download PDF

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Abstract

Procedimiento para (i) determinar el pronóstico de un sujeto con cáncer de colon o colorrectal después de cirugía o resección que remueve el tumor primario y antes de un tratamiento después de la cirugía o resección del tumor primario, (ii) determinar la necesidad de tratamiento médico adicional para un sujeto con cáncer de colon o colorrectal después del tratamiento que remueve el tumor primario y antes de un tratamiento luego de cirugía o resección de tumor y antes de un tratamiento luego de cirugía o resección, (iii) seleccionar un sujeto con cáncer de colon o colorrectal para tratamiento de cáncer adicional después del tratamiento que remueve el tumor primario y antes de un tratamiento luego de cirugía o resección, o (iv) determinar, después del tratamiento que remueve el tumor primario y antes de un tratamiento luego de cirugía o resección, si el cáncer de colon o colorrectal de un sujeto con cáncer es metastásico, que comprende las etapas de: a. medir el nivel de ADN genómico metilado de SEPTIN9 (SEQ ID NO: 1) que se metila en cáncer de colon o colorrectal, pero no metilado en tejido no canceroso, o un fragmento del mismo, en la sangre obtenida del sujeto antes de que se remueva el tumor primario mediante cirugía o resección (muestra de pretratamiento); b. medir el nivel de ADN genómico metilado de SEPTIN9 (SEQ ID NO: 1) o un fragmento del mismo, en la sangre obtenida del sujeto después de que se ha retirado el tumor primario mediante cirugía o resección y antes de un tratamiento luego de cirugía o resección del tumor primario (muestra posterior a tratamiento), por lo cual una cantidad en aumento o equivalente del ADN genómico metilado o fragmento en la muestra posterior a tratamiento después de retiro del tumor primario en comparación con la muestra de pretratamiento indica (i) un mal pronóstico, (ii) la necesidad de tratamiento de cáncer adicional para el sujeto, (iii) seleccionar el sujeto con cáncer para tratamiento de cáncer adicional, o (iv) que el cáncer es metastásico.

Description

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En ciertas realizaciones, el gen adicional o biomarcador que está metilado en cáncer, pero no metilado en tejido no canceroso es RASSF2A.
El gen humano de Septin 9 (también conocido como proteína de fusión tipo MLL-septin, MLL-proteína de fusión tipo septin MSF-A, Slpa, Eseptin, Msf, proteína tipo septin del OvarioMama proteína similar a Septin (septin Ov/Br) y Septin D1) se encuentra en el cromosoma 17q25 dentro de contig AC068594.15.1.168501 y es un miembro de la familia de genes Septin. La Figura 13 proporciona la anotación de Ensembl del gen de Septin 9, y muestra 4 variantes de transcripción, las variantes de Septin 9 y las variantes de Q9HC74 (que son versiones truncadas de las transcripciones de Septin 9). La SEQ ID NO: 1 proporciona la secuencia de dicho gen, que comprende regiones tanto de los transcritos de Septin 9 y Q9HC74 como de las regiones promotoras. SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 son subregiones de las mismas que proporcionan la secuencia de regiones promotoras ricas en CpG de transcritos de Septin 9 y Q9HC74, respectivamente. SEQ ID NOs: 4 y 5, son secuencias para la cadena sensible al ADN de Septin 9 tratada químicamente (con bisulfito) y la cadena anticodificantes, respectivamente, que corresponden a la secuencia de la SEQ ID NO: 1 (es decir, donde los dinucleótidos CpG son metilados), como se muestra en la Tabla 1. SEQ ID NOs: 10 y 11, son secuencias para la cadena codificantes de ADN de Septin 9 tratada químicamente (bisulfito) y la cadena anticodificantes, respectivamente, que corresponden a la secuencia de SEQ ID NO: 1 (es decir, donde los dinucleótidos CpG son no metilados), como se muestra en la Tabla 1. SEQ ID NOs: 6 y 7 son secuencias para la cadena sensible al ADN de Septin 9 tratada químicamente (con bisulfito) y la cadena anticodificantes, respectivamente, que corresponden a la SEQ ID NO: 2 (es decir, donde los dinucleótidos CpG están metilados), como se muestra en la Tabla 1. SEQ ID NOs: 12 y 13 son secuencias para la cadena codificantes de ADN de Septin 9 tratada químicamente (bisulfito) y cadena anticodificantes, respectivamente, que corresponden a la SEQ ID NO: 2 (es decir, donde los dinucleótidos CpG no están metilados) como se muestra en la Tabla 1. SEQ ID NOs: 8 y 9, son secuencias para la cadena codificantes de ADN Q9HC74 tratada químicamente (bisulfito) y la cadena anticodificantes, respectivamente, que corresponden a la secuencia de SEQ ID NO: 3 (es decir, donde los dinucleótidos CpG están metilados), como se muestra en la Tabla 1. SEQ ID NOs: 14 y 15, son secuencias para la cadena codificantes de ADN de Septin 9 tratada químicamente (bisulfito) y la cadena anticodificantes, respectivamente, que corresponden a la secuencia de SEQ ID NO: 3 (es decir, donde los dinucleótidos CpG son no metilados), como se muestra en la Tabla 1. Septin9 y estas variantes también se han descrito en la Solicitud de Patente de EE. UU. Publicada No: US-2009-0075260, publicada como Patente de Estados Unidos Nº: 7,951,563; solicitud de patente estadounidense publicada No.: 2006-0286576, publicada como patente de los Estados Unidos No.: 7,749,702; y en la Solicitud de Patente de Estados Unidos publicada No.: US-2011-0039719, como descripción del gen SEPTIN9 y la información de secuencia. Secuencias adicionales relacionadas con el gen Septin9 se describen en los ejemplos y la descripción de este documento.
En ciertas realizaciones, el gen o biomarcador que está metilado en cáncer, pero no metilado en tejido no canceroso es RASSF2A (SEQ ID NO: 16). El gen RASSF2 se encuentra en la ubicación cromosómica 20p13 y codifica múltiples isoformas de transcripción de ARNm. Los miembros de la familia de la proteína Ras están asociados con el cáncer, RASSF2 se une a K-Ras y la expresión de RASSF2 se asocia con un crecimiento celular controlado. La pérdida de expresión da como resultado la proliferación celular no inhibida y, por consiguiente, RASSF2 es un gen supresor de tumores (Vos et al. J. Biol. Chem., Vol. 278, Número 30, 28045-28051, jul. 25, 2003). El gen RASSF2 comprende una región densa CpG en el promotor del gen, que abarca los primeros 2 exones no codificantes. Esta región se ha caracterizado por ser cometilada, y, además, la metilación de la misma se ha asociado con el desarrollo de carcinomas gástricos y de colon. Hesson et al. (Oncogene 2005 jun. 2; 24(24): 3987-94) caracterizaron la isla CpG como cometilada, por medio de análisis COBRA y secuenciación de bisulfito de líneas celulares de cáncer de colon. Además, confirmaron mediante análisis MSP que 21/30 (70%) de las líneas celulares de cáncer de colon analizadas se metilaron dentro de la región promotora RASSF2A. La investigación adicional ha indicado que la metilación de RASSF2 puede estar asociada con el cáncer gástrico (Endoh et al., Br J. Cancer. 2005 12 de diciembre; 93(12): 1395-9) y cáncer nasofaríngeo (Zhang et alInt. J. Cancer. 2007 1 de enero; 120(l): 32-8). SEQ ID NO: 16 proporciona la secuencia de RASSF2A. SEQ ID NOs: 17 y 18, son secuencias para la cadena codificantes de ADN RASSF2A tratada químicamente (bisulfito) y la cadena anticodificantes, respectivamente, que corresponden a SEQ ID NO: 16 (es decir, donde los dinucleótidos CpG están metilados) como se muestra en la Tabla 1. SEQ ID NOs: 19 y 20 son secuencias para la cadena codificantes de ADN de RASSF2A tratada químicamente (bisulfito) y cadena anticodificantes, respectivamente, que corresponden a la secuencia de SEQ ID NO: 16 (es decir, donde los dinucleótidos CpG no están metilados) como se muestra en la Tabla 1. La secuencia del gen genómico completo se muestra en SEQ ID NO: 16, que se ha descrito en la Solicitud de Patente de EE. UU. Publicada: US-2010-0092953, como referencia para la descripción del gen RASSF2A y la información de secuencia.
Usando los procedimientos de la invención, la presencia, determinada cuantitativamente, cuantitativamente en parte, cualitativa, cualitativamente en parte, o cuantitativamente en parte y cualitativamente en parte del gen o biomarcador en la muestra posterior al tratamiento en un sujeto en estadio I o II, indica un mal pronóstico o necesidad de un tratamiento de cáncer más agresivo.
Usando los procedimientos de la invención, un nivel equivalente o superior del gen o biomarcador en la muestra posterior al tratamiento en un sujeto en estadio III indica la necesidad de una monitorización continua usando los procedimientos descritos en este documento para ver si hay una tendencia del nivel de la gen o biomarcador para aumentar.
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Los procedimientos de la invención proporcionan no solo para detectar un cambio en el nivel del gen o biomarcador en la muestra posterior al tratamiento, sino también para el control o la vigilancia continua de la respuesta al tratamiento
o la eficacia del no tratamiento del sujeto y puede ser utilizado para determinar si el cáncer o tumor está en remisión
o recurrencia.
La modificación del ADN con bisulfito es una herramienta reconocida en el arte que se utiliza para evaluar el estado de metilación de CpG. El procedimiento más frecuentemente utilizado para analizar el ADN para la presencia de 5metilcitosina se basa en la reacción de bisulfito con citosina por lo que, tras la hidrólisis alcalina subsiguiente, la citosina se convierte en uracilo que corresponde a la timina en su comportamiento de emparejamiento de bases. Significativamente, sin embargo, la 5-metilcitosina permanece sin modificar bajo estas condiciones. En consecuencia, el ADN original se convierte de tal manera que la metilcitosina, que originalmente no podía distinguirse de la citosina por su comportamiento de hibridación, ahora se puede detectar como la única citosina restante usando técnicas biológicas moleculares estándar reconocidas en la técnica, por ejemplo, mediante amplificación e hibridación, o mediante secuenciación. Todas estas técnicas se basan en propiedades de emparejamiento de bases diferenciales, que ahora se pueden explotar completamente.
Una descripción de los procedimientos reconocidos en la técnica para detectar 5-metilcitosina es proporcionada por Rein, T., et al., Nucleic Acids Res., 26: 2255, 1998.
La técnica de bisulfito, con algunas excepciones (por ejemplo, Zeschnigk M, et al, Eur J Hum Genet. 5: 94-98, 1997), actualmente solo se usa en investigación. En general, se amplifican fragmentos específicos cortos de un gen conocido después de un tratamiento con bisulfito, y se secuencian completamente (Olek y Walter, Nat Genet. 1997 17: 275-6, 1997), se someten a una o más reacciones de extensión de cebador (Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res., 25: 252931, 1997; documento WO 95/00669; patente de los Estados Unidos No. 6,251,594) para analizar posiciones de citosina individuales, o tratadas mediante digestión enzimática (Xiong & Laird, Nucleic Acids Res., 25: 2532-4, 1997). La detección por hibridación también se ha descrito en la técnica (Olek et al., Documento WO 99/28498). Además, se ha descrito el uso de la técnica de bisulfito para la detección de la metilación con respecto a genes individuales (Grigg & Clark, Bioessays, 16: 431-6, 1994; Zeschnigk M, et al., Hum Mol Genet., 6: 387-95, 1997; Feil R., et al Nucleic Acids Res., 22: 695 -, 1994; Martin V., et al., Gene, 157: 261-4, 1995, WO 9746705 y WO 9515373).
Se divulga el uso de la técnica de bisulfito, en combinación con uno o más ensayos de metilación, para la determinación del estado de metilación de secuencias de dinucleótidos CpG dentro de las secuencias genómicas. Los dinucleótidos CpG genómicos pueden estar metilados o no metilados (alternativamente conocidos como metilados ascendente y descendente respectivamente). Sin embargo, los procedimientos de la presente invención son adecuados para el análisis de muestras de sangre de naturaleza heterogénea, por ejemplo. una baja concentración de células tumorales dentro de un fondo de sangre o eyaculación. Por consiguiente, cuando se analiza el estado de metilación de una posición CpG dentro de tal muestra, la persona experta en la técnica puede usar un ensayo cuantitativo para determinar el nivel (por ejemplo, porcentaje, fracción, proporción, proporción o grado) de metilación en una posición CpG particular opuesta a un estado de metilación. En consecuencia, el término estado de metilación o estado de metilación también debe tomarse para indicar un valor que refleja el grado de metilación en una posición CpG.
A menos que se indique específicamente, los términos “hipermetilado” o “metilado hacia arriba” se tomarán para significar un nivel de metilación superior al de un punto de corte específico, donde dicho punto de corte puede ser un valor que representa el nivel medio o medio de metilación para una población determinada, o es preferiblemente un nivel de corte optimizado. El “corte” también se denomina aquí “umbral”. En el contexto de la presente invención, los términos “metilado”, “hipermetilado” o “metilado hacia arriba” se tomarán para incluir un nivel de metilación por encima del punto de corte cero (0)% (o equivalentes del mismo) de metilación para todas las posiciones CpG dentro y asociado con (por ejemplo, en regiones promotoras o reguladoras) al menos un gen o secuencia genómica que está metilada en cáncer, pero no metilada en tejido no canceroso.
De acuerdo con la presente invención, la determinación del estado de metilación de las secuencias de dinucleótidos CpG dentro de las secuencias genómicas tiene utilidad en la determinación del pronóstico de un sujeto que tiene cáncer.
Procedimientos de ensayo de metilación. Se conocen en la técnica diversos procedimientos de ensayo de metilación, y se pueden usar junto con la presente invención. Estos ensayos permiten la determinación del estado de metilación de uno o una pluralidad de dinucleótidos CpG (por ejemplo, islas CpG) dentro de una secuencia de ADN. Dichos ensayos implican, entre otras técnicas, secuenciación de ADN de ADN tratado con bisulfito, PCR (para amplificación específica de la secuencia), análisis de transferencia Southern y uso de enzimas de restricción sensibles a la metilación.
Por ejemplo, la secuenciación genómica se ha simplificado para el análisis de los patrones de metilación del ADN y la distribución de 5-metilcitosina mediante el uso de tratamiento con bisulfito (Frommer et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89: 1827-1831, 1992). Adicionalmente, se usa la digestión con enzimas de restricción de productos de PCR amplificados a partir de ADN convertido con bisulfito, por ejemplo, el procedimiento descrito por Sadri & Hornsby (Nucl.
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en una reacción “sesgada” (con cebadores de PCR que se superponen a los conocidos dinucleótidos CpG). La discriminación de secuencia puede ocurrir tanto a nivel del proceso de amplificación como a nivel del proceso de detección de fluorescencia.
El ensayo MethyLight™ puede usarse como una prueba cuantitativa para los patrones de metilación en la muestra de ADN genómico, en el que la discriminación de la secuencia ocurre al nivel de la hibridación de la sonda. En esta versión cuantitativa, la reacción de PCR proporciona una amplificación específica de metilación en presencia de una sonda fluorescente que se solapa con un sitio de metilación putativo particular. Se proporciona un control imparcial para la cantidad de ADN de entrada mediante una reacción en la que ni los cebadores, ni la sonda se superponen a ningún dinucleótido CpG. Alternativamente, una prueba cualitativa para la metilación genómica se logra al sondear el grupo de PCR sesgado con oligonucleótidos de control que no “cubren” sitios de metilación conocidos (una versión basada en fluorescencia de las técnicas HeavyMethyl™ y MSP), o con oligonucleótidos que cubren sitios de metilación potencial.
El proceso MethyLight™ puede usarse con cualquier sonda adecuada, por ejemplo “TaqMan®”, Lightcycler®, etc. Por ejemplo, el ADN genómico bicatenario se trata con bisulfito sódico y se somete a uno de dos conjuntos de reacciones de PCR usando sondas TaqMan®; por ejemplo, con cebadores de MSP y/o oligonucleótidos bloqueadores de HeavyMethyl y sonda TaqMan®. La sonda TaqMan® tiene una etiqueta dual con moléculas fluorescentes “informadoras” y “silenciadoras”, y está diseñada para ser específica para una región de contenido de GC relativamente alta, de modo que se derrita a una temperatura superior a 10°C en el ciclo de PCR que los cebadores hacia adelante o inversos. Esto permite que la sonda TaqMan® permanezca completamente hibridada durante la etapa de hibridación/extensión de PCR. Como la polimerasa Taq sintetiza enzimáticamente una nueva cadena durante el PCR, eventualmente alcanzará la sonda TaqMan® hibridada. La actividad de la polimerasa Taq 5' a 3' endonucleasa desplazará la sonda TaqMan® digiriéndola para liberar la molécula informadora fluorescente para la detección cuantitativa de su señal ahora no apagada utilizando un sistema de detección fluorescente en tiempo real.
Los reactivos típicos (por ejemplo, como podría encontrarse en un kit típico basado en MethyLight™) para el análisis de MethyLight™ pueden incluir, pero no están limitados a: cebadores de PCR para gen específico (o secuencia de ADN tratada con bisulfito o isla CpG); Sondas TaqMan® o Lightcycler®; tampones de PCR optimizados y desoxinucleótidos; y polimerasa Taq.
El ensayo QM™ (metilación cuantitativa) es una prueba cuantitativa alternativa para patrones de metilación en muestras de ADN genómico, en el que la discriminación de la secuencia ocurre a nivel de la hibridación de la sonda. En esta versión cuantitativa, la reacción de PCR proporciona una amplificación no sesgada en presencia de una sonda fluorescente que se solapa con un sitio de metilación putativo particular. Se proporciona un control imparcial para la cantidad de ADN de entrada mediante una reacción en la que ni los cebadores, ni la sonda se superponen a ningún dinucleótido CpG. Alternativamente, una prueba cualitativa para la metilación genómica se logra probando el grupo de PCR sesgado con oligonucleótidos de control que no “cubren” sitios de metilación conocidos (una versión basada en fluorescencia de las técnicas HeavyMethyl™ y MSP), o con oligonucleótidos que cubren sitios de metilación potencial.
El proceso QM™ puede usarse con cualquier sonda adecuada, por ejemplo “TaqMan®”, Lightcycler® etc. en el proceso de amplificación. Por ejemplo, el ADN genómico bicatenario se trata con bisulfito sódico y se somete a cebadores no sesgados y a la sonda TaqMan®. La sonda TaqMan® tiene una etiqueta dual con moléculas fluorescentes “informadoras” y “silenciadoras”, y está diseñada para ser específica para una región de contenido de GC relativamente alta, de modo que se derrita a una temperatura superior a 10°C en el ciclo de PCR que los cebadores directos o inversos. Esto permite que la sonda TaqMan® permanezca completamente hibridada durante el paso de hibridación/extensión de PCR. Como la polimerasa Taq sintetiza enzimáticamente una nueva cadena durante la PCR, eventualmente alcanzará la sonda TaqMan® hibridada. La actividad de la polimerasa Taq 5' a 3' endonucleasa desplazará la sonda TaqMan® digiriéndola para liberar la molécula informadora fluorescente para la detección cuantitativa de su señal ahora no apagada utilizando un sistema de detección fluorescente en tiempo real.
Los reactivos típicos (por ejemplo, como podría encontrarse en un kit basado en QM™ típico) para análisis QM™ pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para gen específico (o secuencia de ADN tratada con bisulfito
o isla CpG); Sondas TaqMan® o Lightcycler®; tampones de PCR optimizados y desoxinucleótidos; y polimerasa Taq.
Ms-SNuPE. La técnica Ms-SNuPE™ es un procedimiento cuantitativo para evaluar las diferencias de metilación en sitios CpG específicos basados en el tratamiento con bisulfito de ADN, seguido de la extensión de cebadores de un solo nucleótido (Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25: 2529-2531, 1997). Brevemente, el ADN genómico se hace reaccionar con bisulfito sódico para convertir la citosina no metilada en uracilo mientras deja inalterada la 5metilcitosina. La amplificación de la secuencia objetivo deseada se realiza luego usando cebadores de PCR específicos para ADN convertido con bisulfito, y el producto resultante se aísla y se usa como molde para el análisis de metilación en el (los) sitio(s) CpG de interés. Se pueden analizar pequeñas cantidades de ADN (por ejemplo, Secciones de patología microdisectadas) y se evita la utilización de enzimas de restricción para determinar el estado de metilación en los sitios CpG.
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aminoalilo 1 durante la síntesis de ADNc y luego conjugando un colorante de éster N-hidroxisuccinimida (NHS) con el ADNc modificado con aminoalilo después de que se complete la reacción de transcripción inversa. Alternativamente, la sonda puede estar sin marcar, pero se puede detectar mediante unión específica con un ligando que está marcado, directa o indirectamente. Los marcadores y procedimientos adecuados para marcar ligandos (y sondas) son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, marcadores radioactivos que pueden incorporarse por procedimientos conocidos (por ejemplo, traslación de cortes o quinasing). Otros marcadores adecuados incluyen, pero sin limitación, biotina, grupos fluorescentes, grupos quimioluminiscentes (por ejemplo, dioxetanos, dioxetanos particularmente activados), enzimas, anticuerpos y similares.
Para realizar el análisis diferencial de la expresión génica, los ADNc generados a partir de diferentes muestras de ARN se marcan con Cy®3. El ADNc marcado resultante se purifica para eliminar los nucleótidos no incorporados, el colorante libre y el ARN residual. Después de la purificación, las muestras de cDNA marcadas se hibridan con la micromatriz. La rigurosidad de la hibridación está determinada por una serie de factores durante la hibridación y durante el procedimiento de lavado, que incluyen la temperatura, la fuerza iónica, el período de tiempo y la concentración de formamida. Estos factores se describen en, por ejemplo, Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., 1989). La micromatriz se escanea después de la hibridación utilizando un escáner de micromatrices fluorescente. La intensidad fluorescente de cada punto indica el nivel de expresión del gen analizado; los puntos brillantes corresponden a genes fuertemente expresados, mientras que los puntos oscuros indican una expresión débil.
Una vez que se obtienen las imágenes, los datos sin procesar se deben analizar. En primer lugar, la fluorescencia de fondo se debe restar de la fluorescencia de cada punto. Los datos luego se normalizan a una secuencia de control, como ácidos nucleicos añadidos exógenamente (preferiblemente ARN o ADN) o un panel genético constitutivo para dar cuenta de cualquier hibridación no específica, imperfecciones de matriz o variabilidad en la disposición de la matriz, etiquetado de ADNc, hibridación o lavado. La normalización de datos permite comparar los resultados de múltiples matrices.
Se divulga in kit para usar en determinar el pronóstico de un sujeto que tiene cáncer de acuerdo con los procedimientos de la presente invención, dicho kit comprende: un medio para medir el nivel de transcripción de por lo menos un gen
o secuencia genómica que está metilado en el cáncer, pero no metilado en el tejido no canceroso. En una realización preferida, los medios para medir el nivel de transcripción comprenden oligonucleótidos o polinucleótidos capaces de hibridar en condiciones rigurosas o moderadamente rigurosas con los productos de transcripción de por lo menos un gen o secuencia genómica que está metilada en cáncer, pero no metilada en tejido no canceroso. En una realización más preferida, el nivel de transcripción se determina por técnicas seleccionadas del grupo de análisis de transferencia Northern, PCR de transcriptasa inversa, PCR en tiempo real, protección de RNAsa y micromatriz. En otra realización de la invención, el kit comprende además medios para obtener y/o almacenar una muestra biológica del sujeto. Se prefiere un kit, que comprende además un recipiente que es más preferiblemente adecuado para contener los medios para medir el nivel de transcripción y la muestra biológica del sujeto, y más preferiblemente comprende instrucciones de uso e interpretación de los resultados del kit.
En una realización preferida, el kit comprende (a) una pluralidad de oligonucleótidos o polinucleótidos capaces de hibridar en condiciones restrictivas o moderadamente rigurosas con los productos de transcripción de por lo menos un gen o secuencia genómica que está metilada en cáncer, pero no metilada en tejido no canceroso (b) un recipiente, preferiblemente adecuado para contener los oligonucleótidos o polinucleótidos y una muestra de sangre del sujeto que comprende los productos de transcripción en los que los oligonucleótidos o polinucleótidos pueden hibridar en condiciones restrictivas o moderadamente rigurosas con los productos de transcripción, (c) medios para detectar la hibridación de (b); y opcionalmente, (d) instrucciones para el uso e interpretación de los resultados del kit.
El kit también puede contener otros componentes tales como tampón de hibridación (donde los oligonucleótidos se usarán como sonda) empaquetados en un recipiente separado. Alternativamente, cuando los oligonucleótidos se van a usar para amplificar una región diana, el kit puede contener, envasarse en contenedores separados, una polimerasa y un tampón de reacción optimizado para la extensión del cebador mediado por la polimerasa, tal como PCR. Preferiblemente, dicha polimerasa es una transcriptasa inversa. Se prefiere además que dicho kit contenga adicionalmente un reactivo de Rnasa.
Se divulgan procedimientos para la detección de la presencia del polipéptido codificado por dichas secuencias génicas en una muestra obtenida de dicho sujeto.
Los niveles aberrantes de expresión de polipéptidos de los polipéptidos codificados por lo menos en un gen o secuencia genómica que está metilada en cáncer, pero no metilados en tejido no canceroso están asociados con el pronóstico de un sujeto que tiene cáncer.
Según la presente invención, la subexpresión de dichos polipéptidos está asociada con un pronóstico negativo de un sujeto que tiene cáncer.
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Tabla 1 Secuencias genómicas y variantes tratadas de las mismas de acuerdo con la invención
SEQ ID NO:
Ubicación de Base de datos de Ensembl* Base dedatos deEnsemb*ubicacióngenómca Transcripcionesde gen asociadas* Secuenciaconvertida de bisulfito metilado (sentido) Secuenciaconvertida debisulfito metilado (anticodificantes) Secuenciaconvertida de bisulfito nometilado (sentido) Secuenciaconvertida debisulfito no metilado (anticodificantes )
1
AC068594.15.1. 168501 150580 a 151086 (+) a AC111170.11.1. 158988 137268 a 138151 (+) 1772789082 a 73008258 (+) Septin 9 &Q9HC74 4 5 10 11]
2
AC068594.15.1. 168501 150580 a 151255 (+) 1772789082 a Septin 9 6 7 12 13
72789757 (+)
3
AC111182.20.1. 171898 127830 a 129168 (+) 1772881422 a 72882760 (+) Q9HC74 8 9 14 15
16
RASSF2 A 17 18 19 20
31
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