ES2655643T3 - Medios y métodos para inducir apomixis en plantas - Google Patents

Abstract

Un método para inducir apomixis en una planta transgénica, en el que una secuencia nucleotídica exógena que codifica una proteína capaz de inducir apomixis en una planta se introduce en la planta y se expresa en el óvulo de dicha planta, y en el que dicha secuencia nucleotídica comprende un polinucleótido, que codifica una proteína con actividad de exonucleasa DEDD 3' a 5', polinucleótido que se selecciona del grupo que consiste en a) el polinucleótido definido en una cualquiera de SEQ ID Nº 22 a 25, 27 a 30, 32 a 35, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 46, 47, 49, 50, 52 o 53 o una hebra totalmente complementaria del mismo, b) un polinucleótido que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos definida en una cualquiera de SEQ ID Nº 4 a 9, 13 a 15, 19 a 21 o una hebra totalmente complementaria del mismo, y c) una variante polinucleotídica que tiene un grado de identidad de secuencia de más de 70% con la secuencia de ácido nucleico definida en a) o b), o una hebra totalmente complementaria de la misma.

Description

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DESCRIPCION

Medios y métodos para inducir apomixis en plantas

La presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico para el uso en la inducción de apomixis en una planta, a células transgénicas, en particular células de plantas transgénicas, que comprenden dicha molécula de ácido nucleico, a plantas transgénicas, en particular semillas de plantas, que comprenden dicha molécula de ácido nucleico, a métodos para inducir apomixis en una planta, a métodos para la producción de plantas apomícticas y a usos de las mismas.

La reproducción asexual vegetativa presente en la naturaleza en plantas a través de semillas, también llamada apomixis, es un mecanismo reproductor genéticamente controlado de plantas encontrado principalmente en algunas especies poliploides no cultivadas. Se pueden distinguir diversos tipos de apomixis, entre otros gametofítica y esporofítica. En la apomixis esporofítica, también llamada embrionía adventicia, un embrión somático se desarrolla no a partir del gametofito sino directamente desde las células de la nucela, la pared del ovario o los integumentos. Embriones somáticos procedentes de células circundantes invaden el ovario sexual, uno de los embriones somáticos vence a los otros embriones somáticos y al embrión sexual, y utiliza el endospermo producido.

La apomixis gemetofítica es un tipo presente en la naturaleza de formación asexual de semillas por la que la progenie, es que es clónica con el genotipo materno, se produce a partir de sacos embrionarios meióticamente no reducidos, es decir, el gametofito femenino. La mayoría de las especies gametofíticas apomícticas se encuentran en las Asteraceae, Rosaceae y Poaceae, donde han surgido independientemente y recurrentemente. La poliploidía, la apomixis facultativa (la producción tanto sexual como por semillas apomícticas dentro de un individuo) y un desarrollo más rápido del óvulo apomeiótico con relación al sexual son rasgos que son compartidos entre la mayoría de estos taxones.

Las apomixis se deriva del sexo, y se deben adquirir tres etapas de desarrollo independientes para que una planta sexual produzca semillas apomícticamente: la formación de una megaespora no reducida, que significa la formación de un saco embrionario que tiene la misma ploidía que las células somáticas de la planta madre procedente de una megaespora meióticamente no reducida (diplosporia, apomeiosis) o de una célula nucelar (aposporia), el desarrollo posterior de un embrión a partir de un huevo no reducido en ausencia de fertilización (partenogénesis) y fertilización en la célula central binucleada para formar un endospermo funcional (pseudogamia). El término "apomeiosis" cubre tanto la aposporia como la diplosporia. El embrión derivado apomeióticamente recibe así todo su genoma a través de la línea femenina. Como estos componentes están bajo control genético separado, ha sido difícil prever cómo los tres podrían evolucionar al unísono en un ancestro sexual considerando mutaciones aleatorias, puesto que la expresión de cualquier etapa individual implicaría la aptitud de su portador sexual. Está ampliamente aceptado que el desarrollo de semillas apomícticas da como resultado la desregulación de la ruta de desarrollo sexual, que se manifestaría en múltiples locus simultáneamente. En taxones apomícticos silvestres, se establece como hipótesis que esta desregulación coordinada está influenciada por cambios reguladores globales que resultan de la hibridación y/o la poliploidía (Grossniklaus, 2001, From sexuality to apomixis: Molecular and genetic approaches, In: The flowering of apomixis: From Mechanisms to Genetic Engineering, 168-211).

Informes recientes analizan la expresión génica de la apomeiosis, que significa una formación de gametos no reducidos, en óvulos microdiseccionados de Boechera, y eran capaces de identificar un número bastante grande de alelos expresados diferencialmente entre óvulos sexuales y apomeióticos en una fase particular del desarrollo, a saber la fase de megaesporocito (MMC). Estudios adicionales se enfocaron a la heterocronía de los patrones de expresión génica a lo largo de una serie de fases de desarrollo en óvulos sexuales y apomeióticos (Sharbel y cols., 2009, The Plant Journal, 58, 870-882, Sharbel y cols., 2010, The Plant Cell, 22, 655-671). Sin embargo, aunque el estado de la técnica muestra esperadamente que los óvulos sexuales apomícticos se caracterizan por firmas moleculares específicas, no proporciona ninguna pista de cómo inducir la apomixis en una planta deseada de un modo fiable y predecible, en particular por medio de técnicas de transferencia génica convencionales.

De hecho, una de las principales dificultades para identificar los mecanismos genéticos moleculares que controlan la apomixis es que los genomas de virtualmente todos los apomictos son de naturaleza tanto poliploide como híbrida. Aunque se han realizado esfuerzos considerables, incluyendo análisis moleculares funcionales en profundidad, para analizar el entramado molecular que subyace a fenómenos apomícticos, hasta ahora todavía sigue siendo un reto controlar separadamente las influencias de cualquier efecto, ambos de los cuales pueden tener diversas consecuencias reguladoras.

Manipular la apomixis hasta un rasgo controlable más reproducible proporcionaría mucha ventajas en la mejora de las plantas y el desarrollo de variedades de cultivo. La apomixis proporcionaría híbridos propagados por semillas puros. Así, el aprovechamiento de la apomixis facilitaría y aceleraría mucho la capacidad de los fitomejoradores para fijar y propagar fiablemente la heterocigosidad genética y el de los híbridos asociados en plantas de cultivo. Por otra parte, la apomixis podría acortar y simplificar procedimientos de mejora genética convencionales, de modo que se podrían eliminar la autopolinización y la prueba de la progenie para producir o estabilizar una combinación génica deseable.

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Por lo tanto, el uso controlado de la apomixis simplificaría ciertamente la producción comercial de semillas híbridas. En particular, se eliminaría la necesidad de aislamiento físico de los campos de producción de híbridos comerciales, la tierra disponible se podría usar para desarrollar semillas híbridas en lugar de dividir el espacio entre los polinizadores y líneas estériles macho y finalmente se eliminaría la necesidad de mantener cepas de semillas de la línea parental.

La apomixis proporcionaría el uso como variedades de cultivo de genotipos con combinaciones génicas únicas puesto que los genotipos apomícticos son puros independientemente de la heterocigosidad. Los genes o los grupos de genes podrían fijarse así en supergenotipos. Cada genotipo apomíctico superior procedente de un cruce sexual- apomíctico tendría el potencial de ser una variedad de cultivo. Por lo tanto, la apomixis permitiría a los fitomejoradores desarrollar variedades de cultivo con rasgos estables específicos para caracteres tales como la altura, la calidad de las semillas y el forraje y la madurez.

Así, la aplicación de la apomixis en la agricultura se considera una posible tecnología importante que facilitaría mucho la fijación y la propagación fiable de heterocigosidad genética y el vigor de los híbridos asociados en plantas de cultivo (Spillane, 2004, Nat Biotech 22(6), 687-691).

Sin embargo, todos estos beneficios potenciales que se basan en la producción de semillas a través de apomixis no se han conseguido actualmente hasta un alto grado debido al problema de manipular la capacidad apomíctica en plantas de interés.

El documento US 2002/0069433 A1 divulga métodos para incrementar la probabilidad de la reproducción vegetativa de una nueva generación de plantas en la que se expresa transgénicamente un gen que codifica una proteína que actúa en la cascada de transducción de señales desencadenada por la cinasa receptora de embriogénesis somática. El documento US 2008/0155712 A1 divulga procedimientos para identificar en una planta, en particular maíz, secuencias responsables del desarrollo apomíctico, en particular mediante cartografía genómica. El documento WO 99/35258 A1 divulga marcadores de ácido nucleico para una región genómica específica de aposporia procedente del género Pennisetum. El documento US 7.541.514 B2 divulga métodos para producir plantas apomícticas a partir de plantas sexuales al seleccionar, recoger y mejorar genéticamente líneas de plantas específicas.

Ninguna de dichas divulgaciones proporciona medios, en particular polinucleótidos particulares, que se puedan usar fácilmente en métodos de transferencia génica para obtener de un modo controlable y económico la apomixis en plantas.

Por lo tanto, el problema técnico que subyace a la presente invención es proporcionar medios y métodos para vencer los problemas identificados anteriormente, en particular proporcionar medios y métodos para inducir apomixis en una planta, por ejemplo por medio de tecnología génica recombinante, en particular por medio de tecnología de transferencia de ADN recombinante, en particular proporcionar medios y métodos para inducir apomixis en plantas, en particular de un modo controlable, predecible, fiable, fácil y económico.

La presente invención resuelve su problema subyacente mediante el suministro de la enseñanza de las reivindicaciones independientes, en particular mediante el suministro de moléculas de ácido nucleico, en particular moléculas de ácido nucleico aisladas, útiles para inducir apomixis en plantas, células de planta y partes de planta que contienen dicha secuencia así como métodos para inducir apomixis en plantas, métodos para producir plantas apomícticas y usos de las mismas. En particular, la presente invención resuelve su problema técnico subyacente mediante el suministro de lo siguiente:

- Un método para inducir apomixis en una planta transgénica, en el que una secuencia nucleotídica exógena que codifica una proteína capaza de inducir apomixis en una planta se introduce en la planta y se expresa en el óvulo de dicha planta, y en donde dicha secuencia nucleotídica comprende un polinucleótido, que codifica una proteína con actividad de exonucleasa DEDD 3' a 5', polinucleótido que se selecciona del grupo que consiste en

a) el polinucleótido definido en una cualquiera de SEQ ID N° 22 a 25, 27 a 30, 32 a 35, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 46, 47, 49, 50, 52 o 53 o una hebra totalmente complementaria del mismo,

b) un polinucleótido que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos definida en una cualquiera de SEQ ID N° 4 a 9, 13 a 15, 19 a 21 o una hebra totalmente complementaria del mismo, y

c) una variante polinucleotídica que tiene un grado de identidad de secuencia de más de 70% con la secuencia de ácido nucleico definida en a) o b), o una hebra totalmente complementaria de la misma;

- Un método para la producción de una planta apomíctica, en el que una célula de planta se transforma con una molécula de ácido nucleico capaz de inducir la expresión de una secuencia nucleotídica que codifica una proteína

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capaz de inducir apomixis en una planta y regenerar la célula de planta transformada en una planta transformada que contiene la molécula de ácido nucleico transformada a fin de expresar una proteína con actividad de exonucleasa DEDD 3' a 5' en un óvulo de planta y para inducir apomixis en la planta, en donde la secuencia nucleotídica que codifica la proteína capaz de inducir apomixis en la planta es un polinucleótido, que codifica una proteína con actividad de exonucleasa DEDD 3' a 5', polinucleótido que se selecciona del grupo que consiste en

a) el polinucleótido definido en una cualquiera de SEQ ID N° 22 a 25, 27 a 30, 32 a 35, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 46, 47, 49, 50, 52 o 53 o una hebra totalmente complementaria del mismo,

b) un polinucleótido que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos definida en una cualquiera de SEQ ID N° 4 a 9, 13 a 15 o 19 a 21 o una hebra totalmente complementaria del mismo, y

c) una variante polinucleotídica que tiene un grado de identidad de secuencia de más de 70% con la secuencia de ácido nucleico definida en a) o b), o una hebra totalmente complementaria de la misma.

- Un método para aislar una molécula de ácido nucleico inductora de apomixis de una planta, en el que una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que codifica una proteína con actividad de exonucleasa DEDD 3' a 5', polinucleótido que se selecciona del grupo que consiste en

a) el polinucleótido definido en una cualquiera de SEQ ID N° 22 a 54 o una hebra totalmente complementaria del mismo,

b) un polinucleótido que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos definida en una cualquiera de SEQ ID N° 1 a 21 o una hebra totalmente complementaria del mismo, y

c) una variante polinucleotídica que tiene un grado de identidad de secuencia de más de 70% con la secuencia de ácido nucleico definida en a) o b), o una hebra totalmente complementaria del mismo, o la molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 3, o el vector según la reivindicación 5, se usa para cribar y aislar secuencias de ácido nucleico de la planta;

- Una planta, célula de planta o material de planta transgénico que comprende una célula según la reivindicación 6, que se produce según un método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10, o progenie de los mismos que contiene el vector según la reivindicación 5 o que contiene el polinucleótido que codifica una proteína con actividad de exonucleasa DEDD 3' a 5' según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 10, en donde el polinucleótido está dispuesto en un orden u orientación, o en una posición genómica, que normalmente no se encuentra en la planta, la célula de planta o el material de planta al que se transfiere y en donde la proteína con actividad de exonucleasa DEDD 3' a 5' se expresa en un óvulo de planta;

- El uso de una molécula de ácido nucleico aislada en la inducción de apomixis en una planta transgénica, en donde la secuencia nucleotídica exógena que codifica una proteína capaz de inducir apomixis en una plante se introduce en la planta y se expresa en el óvulo de dicha planta, y en donde dicha secuencia nucleotídica comprende un polinucleótido que codifica una proteína con actividad de exonucleasa DEDD 3' a 5' que se selecciona del grupo que consiste en a) el polinucleótido definido en una cualquiera de SEQ ID N° 22, 23, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 46, 47, 49, 50, 52, 53, o una hebra totalmente complementaria del mismo, b) un polinucleótido que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos definida en una cualquiera de SEQ ID N° 4, 5, 6, 7, 8, 9, 13, 14, 15, 19, 20, 21, o una hebra totalmente complementaria del mismo, y c) una variante polinucleotídica que tiene un grado de identidad de secuencia de más de 90% con la secuencia de ácido nucleico definida en a) o b), o una hebra totalmente complementaria del mismo, en donde la proteína con actividad de exonucleasa DEDD 3' a 5' se expresa en un óvulo de planta. La identidad de secuencia de basa preferiblemente en toda la secuencia. Preferiblemente, la identidad de secuencia se determina mediante análisis por BLAST, preferiblemente en la base de datos del NCBI, en particular mediante análisis por GAP usando un peso del hueco de 50 y un peso de la longitud de 3.

Se divulga en la presente una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que codifica una proteína capaz de inducir apomixis en una planta, preferiblemente en un óvulo de planta, preferiblemente que exhibe una actividad de exonucleasa en un óvulo de planta, que se selecciona del grupo que consiste en a1) el polinucleótido definido en una cualquiera de SEQ ID N° 22 a 62, en particular 23, 25, 27, 28, 29, 30, 33, 35, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 47, 50 o 53, o una hebra totalmente complementaria del mismo, b1) un polinucleótido que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos definida en una cualquiera de SEQ ID N° 1 a 21, preferiblemente SEQ ID N° 4 a 9, SEQ ID N° 13 a 15 o SEQ ID N° 19 a 21, o una hebra totalmente complementaria del mismo, y c1) una variante polinucleotídica que tiene un grado de identidad de secuencia de más de 30%, 40%, 50% o preferiblemente 70% con la secuencia de ácido nucleico definida en a1) o b1), o una hebra totalmente complementaria de la misma,

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preferiblemente en donde la identidad de secuencia se basa en toda la secuencia. Preferiblemente, la identidad de secuencia se determina mediante análisis por BLAST, preferiblemente en la base de datos del NCBI, en particular mediante análisis por GAP usando un peso de hueco de 50 y un peso de la longitud de 3 o cualquier otro análisis adecuado.

Las moléculas de ácido nucleico divulgadas representan el llamado gen apolo, que significa "locus relacionado con la apomixis", o son partes esenciales y específicas del mismo. Dicho gen, en particular su secuencia codificante, codifica la proteína apolo que durante la expresión en el óvulo de la planta conduce a la producción de semillas apomícticas.

El polinucleótido que codifica proteína identificado anteriormente divulgado en la presente se caracteriza en particular por la presencia de al menos una secuencia marcadora duplicada específica en un exón, a saber el quinto exón, de dicha secuencia y que representa una duplicación de un tramo nucleotídico. Preferiblemente, dicha secuencia nucleotídica marcadora duplicada se da en SEQ ID N° 64 y su correspondiente secuencia de aminoácidos en SEQ ID N° 63.

Según esto, el método para inducir apomixis en una planta transgénica según la presente invención también se refiere al uso de una molécula de ácido nucleico aislada, que comprende un polinucleótido que codifica una proteína capaz de inducir apomixis en una planta, preferiblemente en un óvulo de planta, exhibiendo preferiblemente una actividad de exonucleasa en un óvulo de planta, en donde el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en a2) el polinucleótido definido en una cualquiera de SEQ ID N° 22, 23, 27, 28, 32 o 33, preferiblemente 23, 28 o 33, o una hebra totalmente complementaria del mismo, b2) un polinucleótido que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos definida en una cualquiera de SEQ ID N° 4, 5 o 6 o una hebra totalmente complementaria del mismo, y c2) una variante polinucleotídica que tiene un grado de identidad de secuencia de más de 70% con la secuencia de ácido nucleico definida en a2) o b2), o una hebra totalmente complementaria de la misma. La identidad de secuencia se puede basar en toda la secuencia. Preferiblemente, la identidad de secuencia se determina mediante análisis por BLAST, preferiblemente en la base de datos del NCBI, en particular mediante análisis por GAP usando un peso de hueco de 5o y un peso de la longitud de 3 o cualquier otro análisis adecuado.

Se divulgan en la presente polinucleótidos, en particular polinucleótidos que codifican una proteína capaz de inducir apomixis en una planta, a saber la proteína apolo, y polinucleótidos capaces de funcionar como elementos reguladores para dicha secuencia codificante, en forma aislada y purificada. Por otra parte, se divulga la enseñanza de que las plantas, en particular su genoma, comprenden secuencias endógenamente nucleotídicas, en lo sucesivo también llamadas "polinucleótido" o "secuencia polinucleotídica", codifican dicha proteína apolo capaz de inducir apomixis y sus elementos reguladores, en lo sucesivo también llamado "polinucleótido presente endógenamente que codifica una proteína capaz de inducir apomixis en una planta". Así, las secuencias tanto codificantes como reguladores que se especifican por ejemplo en SEQ ID N° 37, 40, 43, 46, 49 o 52 habitualmente están endógenamente presentes en diversos estados alélicos en su ambiente genómico natural y original en una planta, particularmente en Brassicaceae, preferiblemente Boechera, y son responsables del desarrollo de un fenotipo sexual o apomíctico en la planta. Según los hallazgos de la presente invención la planta que se propaga sexualmente presente en la naturaleza, dichas secuencias nucleotídica en su estado alélico sexual, tales como en SEQ ID N° 46, 49 o 52, sin embargo, están en el óvulo de dicha planta reprimidas, lo que significa no expresadas, evitando de ese modo la apomixis. En contraste, dicho polinucleótido en su estado alélico apomíctico, tal como en SEQ ID N° 37, 40 o 43, está inducido, lo que significa que se expresa en óvulo de una planta que se propaga asexualmente, lo que significa una planta apomíctica.

En particular, en un óvulo de planta de una planta que se propaga sexualmente, el gen presente endógenamente que codifica la proteína apolo con una capacidad inductora de apomixis se suprime o inactiva en dicho tejido y por lo tanto necesita sea activado a fin de producir una planta apomíctica. En plantas tanto sexuales como apomícticas, las regiones codificantes del gen apolo en su forma apomíctica y alélica sexual son funcionalmente equivalentes. Las diferencias en su expresión se deben a sus diferentes elementos reguladores preferiblemente según se especifica en SEQ ID N° 57 a 62 y 65. En particular, los elementos reguladores apomícticos, preferiblemente los que se identifican en SEQ ID N° 55, 57, 58 y 59, se caracterizan en particular por la presencia de una inserción promotora de 20 pares de bases, en particular la de SEQ ID N° 65, lo que conduce a una expresión ovular, es decir expresión en el óvulo, de un elemento codificante conectado a dicho elemento regulador. Un elemento regulador sexual divulgado en la presente se caracteriza en particular por la ausencia de tal inserción promotora de SEQ ID N° 65 y se representa en particular por un elemento regulador que se da en SEQ ID N° 56, 60, 61 o 62 y proporciona una expresión génica somática, pero no una expresión en el óvulo, posiblemente debido a que se suprime en dicho tejido.

En particular, por lo tanto, la invención proporciona la enseñanza de modificar, en particular activar o inducir, lo que significa obtener dichas secuencias expresadas a fin de alcanzar una planta de un fenotipo deseado, en particular un fenotipo apomíctico. Esto se consigue bien al transformar una planta con secuencias codificantes expresable para la proteína apolo según se define en las reivindicaciones para su expresión en el óvulo de la planta, a fin de proporcionar el fenotipo apomíctico a dicha planta y su progenie. Este objetivo de proporcionar una planta

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apomíctica se consigue al transformar una planta con cualquier secuencia nucleotídica, en particular cualquier molécula de ADN, que interfiere estructuralmente con el elemento regulador reprimido de un gen apolo endógenamente presente. Según la invención, se consigue al transformar una planta con una secuencia polinucleotídica, capaz de expresar una proteína capaz de inducir apomixis en la planta según se define en las reivindicaciones, desreprimiendo de ese modo dicho gen apolo y permitiendo su expresión en un óvulo de planta a fin de producir una planta apomíctica.

Así, la presente invención prevé introducir una secuencia codificante de polinucleótido exógeno, en particular transgénico, para la proteína apolo en una planta según se define en las reivindicaciones, a fin de expresar dicha secuencia codificante en el óvulo de la planta.

En el contexto de la presente invención, el término "inducir la expresión de un gen - o polinucleótido - que codifica una proteína capaz de inducir apomixis" se refiere por lo tanto a la activación, en lo sucesivo también denominada desrepresión, de un elemento regulador que gobierna la expresión de dicha secuencia codificante, eso significa que se refiere a la activación de la expresión que permite la producción de una proteína apolo funcional en el óvulo de planta.

Así, la presente invención proporciona medios y métodos ventajosos como los reivindicados para inducir apomixis en una planta. Los polinucleótidos usados según la presente invención, que codifican una proteína capaz de inducir apomixis, se pueden transformar en una célula de planta a fin de producir una planta que comprende dicho polinucleótido inducido exógenamente, expresa dicho polinucleótido en un óvulo de planta y de ese modo produce un fenotipo apomíctico y una planta apomíctica. Esto se consigue al usar los polinucleótidos de la presente invención, definido en una cualquiera de SeQ ID N° 22, 23, 25, 27, 28, 29, 30, 33, 35, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 47, 50 o 53, en particular 23, 25, 28, 30, 33, 35, 38, 41, 44, 47, 50 o 53, que codifica una proteína capaz de inducir apomixis en un óvulo de planta. Dicha proteína se divulga en una cualquiera de SEQ ID N° 4 a 21, y según la invención, es SEQ ID N° 4 a 9, SEQ ID N° 13 a 15 o SEQ ID N° l9 a 21, bajo el control de un promotor expresado constitutivamente a un promotor que proporciona una expresión específica del óvulo en el óvulo.

Así, las moléculas de ácido nucleico aisladas divulgadas comprenden polinucleótidos, en particular polinucleótidos como los divulgados específicamente en la presente o variantes polinucleotídicas, para el uso en la inducción de apomixis, que codifican una proteína capaz de inducir apomixis en una planta, en particular en un óvulo de planta, en particular codifican una proteína con una actividad de exonucleasa específica capaz de inducir apomixis, en particular apomeiosis, en un óvulo de planta, y en donde dichos polinucleótidos específicos o variantes de los mismos se pueden usar ventajosamente para ser transferidos a una planta, en particular una célula de planta, ser integrados establemente en su genoma y se pueden expresar preferiblemente, en particular y lo más preferiblemente de un modo constitutivo, en el óvulo de la planta transformada obtenida a fin de producir una planta apomíctica transgénica, en particular una planta transgénica, que produce semillas apomícticas. Se divulga la transferencia de un polinucleótido que codifica una proteína capaz de inducir apomixis en una planta y que se especifica en una cualquiera de las SEQ ID N° 1 a 9 de consenso. Según la invención, se proporciona la transferencia de un polinucleótido que codifica una proteína capaz de inducir apomixis en una planta y que se especifica en una cualquiera de SEQ ID N° 4 a 9, SEQ ID N° 13 a 15 o 19 a 21, en una planta a fin de permitir la expresión de dicho polinucleótido, preferiblemente que está bajo el control de un promotor constitutivamente o específico del óvulo, produciendo de ese modo la proteína apolo deseada en el óvulo.

También se divulgan polinucleótidos que son capaces de funcionar como elemento regulador y que se pueden usar para transformar células de planta y de ese modo dichos polinucleótidos capaces de funcionar como elementos reguladores modifican estructuralmente los elementos reguladores de los genes endógenamente presentes que codifican las proteínas capaces de inducir apomixis a fin de desreprimir, esto es activar, los elementos reguladores endógenamente presentes de dichos genes permitiendo de ese modo la expresión de la proteína capaz de inducir apomixis y producir planta con un fenotipo apomíctico. Este enfoque particular se basa en los hallazgos de la presente invención de que el gen que codifica la proteína capaz de inducir apomixis también está presente en plantas silvestres, pero, sin embargo, no está activado, esto es no está inducido, y por lo tanto no se expresa en el óvulo de una planta que se propaga sexualmente. Sin limitarse por una teoría, en plantas silvestres que se propagan sexualmente, la expresión del gen endógenamente presente que codifica una proteína capaz de inducir apomixis está suprimida o inactivada, lo más probablemente debido a elementos reguladores suprimidos de las regiones codificantes de proteína. Así, se divulga que la introducción de elementos reguladores que interfieren estructuralmente con los elementos reguladores endógenamente presentes y suprimidos de una región de la secuencia nucleotídica que codifica una proteína capaz de inducir apomixis en un óvulo de planta permite la inversión de la supresión de los elementos reguladores e induce la expresión de la secuencia codificante.

Según esto, se divulga un polinucleótido, en particular un polinucleótido o una variante polinucleotídica divulgados específicamente, en particular un elemento regulados que se especifica en una cualquiera de SEQ ID N° 55 a 62 o 65, que se transforma en una planta a fin de modificar el elemento regulador endógenamente presente que tiene una secuencia como la dada en el promotor sexual dado en una cualquiera de SEQ ID N° 56, 60, 61 o 62 de un gen endógenamente presente que codifica la proteína apolo capaz de inducir apomixis en una planta a fin de permitir la

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expresión del polinucleótido endógenamente presente que codifica el polipéptido capaz de inducir apomixis en la planta, en particular el óvulo.

Según esto, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas, que comprenden polinucleótidos, esto es los polinucleótidos divulgados específicamente o las variantes polinucleotídicas, para el uso en la inducción de apomixis, en donde los polinucleótidos o las variantes polinucleotídicas específicos son elementos reguladores y son útiles para inducir apomixis en una planta en la medida que permitan una expresión regulable de secuencias codificantes conectadas operativamente a los mismo en el óvulo de planta, en particular durante el desarrollo del óvulo en una planta. Así, estos elementos reguladores proporcionan una falta de capacidad de supresión en el óvulo a una secuencia codificante y proporcionan la ventaja de ser capaces de una expresión directa de secuencias codificantes en el óvulo de plantas.

Así, se divulga una mutación inducida, por ejemplo una recombinación, duplicación, eliminación, inserción o inversión, de la totalidad o parte del elemento regulador endógenamente presente para la secuencia codificante del polipéptido capaz de inducir apomixis en un óvulo de planta, lo que permite la expresión de dicho polinucleótido conduciendo por consiguiente a apomixis en la planta.

Se divulga en la presente la inducción de apomixis en una planta al modificar, en particular inducir, en lo sucesivo también llamado activar, la expresión de los elementos reguladores endógenamente presentes de la secuencia nucleotídica endógenamente presente que codifica una proteína capaz de inducir apomixis en una planta al modificar estructuralmente dichos elementos reguladores endógenamente presentes, por ejemplo mediante mutación, en particular mediante inserción, eliminación, duplicación o inversión de dicho elemento regulador. Dicha modificación estructural se puede conseguir preferiblemente por cualquier medio para la mutación, por ejemplo radiación, uso de agentes químicos o de secuencias nucleotídicas, en particular una molécula de ADN, introducidas en una célula de planta, esto es, en particular, la secuencia es capaz de interferir estructuralmente con dicho elemento regulador y secuencia que puede ser un transposón o cualquier otra secuencia que sea capaz de interferir, por ejemplo recombinar o insertar en dicho elemento regulador en el óvulo de una planta que se propaga sexualmente.

En la presente, se divulgan polinucleótidos y variantes polinucleotídicas específicos que son capaces de actuar como elementos reguladores, en particular promotores, que actúan muy específicamente de un modo regulador en el óvulo. En particular, este elemento regulador, en lo sucesivo también llamado promotor sexual, es capaz de ser expresado en todo el tejido somático de una planta transgénica transformada, pero específicamente no en el óvulo de dicha planta. En otro aspecto de la divulgación, este elemento regulador, en lo sucesivo también llamado promotor apo, dicho elemento regulador se expresa en el tejido somático de una planta transgénica transformada y también se expresa en el óvulo de dicha planta. Así, se proporcionan polinucleótidos que permiten una expresión génica somática que excluye el tejido ovular, o permiten una expresión génica ovular. A saber, la realización de expresión ovular, que se especifica en una cualquiera de SEQ ID N° 55, 57, 58 o 59, se caracteriza principalmente por una secuencia nucleotídica que comprende una inserción reguladora de veinte nucleótidos con SEQ ID N° 65 en comparación con la realización mencionada en primer lugar, a saber la realización de expresión no ovular, que carece de dicha inserción y que se especifica en SEQ ID N° 56, 60, 61 o 62. Así, el elemento regulador que permite la expresión en tejido somático, pero no en el óvulo, esto es el promotor sexual, se caracteriza por una cualquiera de SEQ ID N° 56, 60, 61 o 62. Por otra parte, el elemento regulador capaz de ser expresado en el óvulo, en particular al no ser suprimible o no estar suprimido, esto es el promotor apo, se caracteriza por SEQ ID N° 55, 57, 58 o 59.

Así, se divulga en la presente una molécula de ácido nucleico aislada, que comprende un polinucleótido, polinucleótido que es capaz de actuar como un elemento regulador y se selecciona del grupo que consiste en a3) el polinucleótido definido en una cualquiera de SEQ ID N° 55 a 62 o 65, o una hebra totalmente complementaria del mismo y b3) una variante polinucleotídica que tiene un grado de identidad de secuencia de más de 30%, 40%, 50%, 60%, preferiblemente 70% con la secuencia de ácido nucleico definida en a3), o una hebra totalmente complementaria del mismo, preferiblemente en donde la identidad de secuencia se basa en toda la secuencia. Preferiblemente, la identidad de secuencia se determina mediante análisis por BLAST, preferiblemente en la base de datos del NCBI, en particular mediante análisis por GAP usando un peso del hueco de 50 y un peso de la longitud de 3 o cualquier otro análisis adecuado.

Así, se divulga la producción vegetativa de semillas idénticas al progenitor. En particular, las presentes moléculas ácidas nucleotídicas se pueden transformar en una planta deseada, por ejemplo híbridos de alto rendimiento, a fin de cambiar su modo reproductivo a la producción apomíctica de semillas. Así, los híbridos de alto rendimiento, según la presente invención, se pueden usar en la producción de semillas para multiplicar copias idénticas de dichas semillas híbridas de alto rendimiento, lo que reduce mucho el coste para la producción de semillas y a su vez incrementa el número de genotipos que se podrían ofrecer comercialmente. Además, los genes se pueden evaluar directamente en híbridos comerciales, puesto que la progenie no se segregaría ahorrando engorrosos procedimientos de retrocruzamiento. La apomixis se puede usar para estabilizar fenotipos deseables incluso con rasgos complejos tales como el vigor de los híbridos. Estos rasgos se pueden mantener muy fácilmente y multiplicarse a través de apomixis indefinidamente. Además, se divulga la posibilidad de combinarlo con

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androesterilidad, evitando ventajosamente que rasgos estabilizados manipulados genéticamente se hibriden con parientes no deseados.

La presente invención proporciona una solución como la definida en las reivindicaciones para el problema técnico identificado anteriormente al proporcionar moléculas de ácido nucleico aisladas específicas que se pueden usar para inducir apomixis en una planta, en particular en un óvulo de planta, preferiblemente para inducir apomeiosis y/o partenogénesis en una planta, preferiblemente en un óvulo de planta.

Estas moléculas de ácido nucleico usadas en la presente invención comprenden en una realización preferida polinucleótidos específicos caracterizados por su capacidad para inducir apomixis en una planta y por la presencia de patrones de secuencia nucleotídica de consenso específicos según una cualquiera de SEQ ID N° 27, 28, 29, 30, en particular 27, 28, 29, 30, preferiblemente 27 o 29, que representan patrones nucleotídicos presentes en todos los alelos inductores de apomixis divulgados específicamente para el uso en la presente invención.

En una realización preferida adicional, los polinucleótidos específicos son los diversos alelos inductores de la apomixis, que se identifican, aíslan y caracterizan específicamente según la presente invención y se caracterizan en una cualquiera de SEQ ID N° 37, 38, 40, 41, 43, 44.

Se divulgan en la presente polinucleótidos y polipéptidos en formas específicas y de consenso. Las formas de consenso son motivos, esto es patrones, de secuencia generalizados, que se encuentran en una realización en todos los genes apolo polimórficos identificados y aislados según la presente invención, en particular son comunes a la secuencia codificante de todas las formas polimórficas diferentes que incluyen las formas apomícticas y sexuales. Las secuencias de consenso también se dan como motivos de secuencia generalizados solamente encontrados en los alelos polimórficos apomícticos o solamente se encuentran en las formas alélicas polimórficas sexuales aisladas según la presente invención. Los alelos apomícticos y sexuales se pueden clasificar mediante diferentes secuencias de consenso para sus elementos reguladores y comparten la misma secuencia de consenso para sus regiones codificantes. En la secuencia de consenso, "Xaa" indica cualquier aminoácido presente en la naturaleza y "n" uno cualquiera de los nucleótidos a, t, g o c.

Los polinucleótidos y polipéptidos específicos usados en la presente invención se aíslan y analizan específicamente y exponen el patrón de la secuencia de consenso en forma ejemplificada.

En una realización particularmente preferida, la presente invención se refiere por lo tanto al uso de los polinucleótidos y polipéptidos de consenso y específicos caracterizados en las siguientes tablas I y II.

Tabla I

Secuencias de aminoácidos de apolo (polipéptidos)

SEQ ID N°

tipo subtipo caracterización codificado por SEQ ID N°

4

consenso Global proteína con duplicación 22, 23

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consenso Apo proteína con duplicación 27, 28

6

consenso Sex proteína con duplicación 32, 33

7

consenso Global proteína sin duplicación 24, 25

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consenso Apo proteína sin duplicación 29, 30

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consenso Sex proteína sin duplicación 34, 35

13

especifico Apo Proteína A011a 37, 38

14

especifico Apo Proteína A043a 40, 41

15

especifico Apo Proteína A081a 43, 44

19

especifico Sex Proteína S011a 46, 47

20

especifico Sex Proteína S355a 49, 50

21

especifico Sex Proteína S390a 52, 53

leyenda:

A011a, A043a, A081a: alelos de Boechera holboellii apomícticos; S011a, S355a, S390a: alelos de Boechera holboellii sexuales

"consenso" significa secuencia de consenso, esto es un motivo de secuencia general presente en más de un alelo específico del gen apolo con posiciones específicamente identificadas para derivaciones de secuencia observadas, a saber polimorfismos de nucleótidos/aminoácidos. En las secuencias de aminoácidos, "Xaa" puede ser cualquier aminoácido presente en la naturaleza. En las secuencias nucleotídicas "n" puede ser cualquiera de a, g, t o c, en los 5 intrones "n" puede indicar adicionalmente un nucleótido perdido.

"específico" significa un alelo polimórfico específicamente aislado con secuencia nucleotídica y de aminoácidos secuenciada o deducida.

10 "Global" significa una secuencia de consenso para gen o proteína apolo tanto apomícticos como sexuales.

"Apo" significa gen o proteína apolo apomícticos.

"Sex" significa en o proteína apolo sexuales.

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"proteína" significa proteína apolo.

"Dominio de exonucleasa" significa el fragmento de la proteína apolo en la que está situada la actividad de exonucleasa DEDDh 3'-5' biológicamente activa específica.

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"duplicación" significa una secuencia marcadora duplicada opcionalmente presente en la región codificante del aleo apomíctico y sexual del gen apolo y especificada en SEQ ID N° 63 (aminoácido) y 64 (nucleótido).

Tabla II

Polinucleótidos que codifican proteína apolo

SEQ ID N°

tipo subtipo caracterización

22

consenso Global genómico con duplicación

23

consenso Global codificante con duplicación

24

consenso Global genómico sin duplicación

25

consenso Global codificante sin duplicación

27

consenso Apo genómico con duplicación

28

consenso Apo codificante con duplicación

29

consenso Apo genómico sin duplicación

30

consenso Apo codificante sin duplicación

32

consenso Sex genómico con duplicación

33

consenso Sex codificante con duplicación

34

consenso Sex genómico sin duplicación

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consenso Sex codificante sin duplicación

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especifico Apo A011a genómico

38

específico Apo A011a codificante

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específico Apo A043a genómico

41

específico Apo A043a codificante

43

específico Apo A081a genómico

44

específico Apo A081a codificante

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específico Sex S011a genómico

47

específico Sex S011a codificante

49

específico Sex S355a genómico

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específico Sex S355a codificante

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específico Sex S390a genómico

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específico Sex S390a codificante

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leyenda: véase la tabla I; "genómico" significa secuencia de ADN genómico, preferiblemente que incluye elementos reguladores, exones e intrones.

"codificante" significa solamente la secuencia de ADN codificante que codifica la proteína apolo de longitud completa.

leyenda: véase la tabla I; "inserción promotora": inserción reguladora de 20 pb encontrada en promotores apo

La presente invención proporciona en una realización el uso en los métodos y medios reivindicados de secuencias genómicas de consenso globales, en particular las de SEQ ID N° 22 y 24 que representan patrones de secuencia nucleotídica encontrados en los alelos apomícticos y sexuales de la presente invención en la medida que las secuencias nucleotídicas dadas se han de encontrar en ambos tipos de alelos.

Así, se proporcionan los polinucleótidos de la presente invención que codifican para la proteína apolo que se caracterizan por una cualquiera de las secuencias polinucleotídicas dadas en SEQ ID N° 22, 23, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 46, 47, 49, 50, 52, 53 que son secuencias de consenso y específicas encontradas en alelos apomícticos y sexuales y que codifican la proteína apolo de consenso o específica de una cualquiera de SEQ ID N° 4 a 9, 13 a 15 o 19 a 21. Se identifican en la Tabla I los polinucleótidos que codifican las proteínas apolo de consenso o partes esenciales de las mismas, a saber una cualquiera de SEQ ID N° 4, 5, 6, 7, 8, 9, 13, 14, 15, 19, 20 o 21. Otros polinucleótidos divulgados comprenden una cualquiera de SEQ ID N° 23 o 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 47, 48, 50, 51, 53 o 54, comprendiendo todos ellos secuencias codificantes para la proteína apolo, pero no elementos reguladores específicos sexuales que son suprimibles en un óvulo de planta. Así, estas secuencias no comprenden los promotores sexuales con SEQ ID N° 56 o una cualquiera de 60, 61 y 62, que en particular carecen de la inserción promotora de SEQ ID N° 65.

Se divulgan en la presente secuencias polinucleotídicas que comprenden elementos reguladores sexuales tales como los polinucleótidos de SEQ ID N° 32, 34, 46, 49, 52, 56, 60, 61 o 62 que comprenden elementos reguladores útiles para proporcionar capacidad de supresión en la expresión en óvulo de planta o para mutar genes apolo endógenamente presentes a fin de inducir apomixis. Estos polinucleótidos se pueden modificar, en particular para contener la inserción de promotor apomíctico de SEQ ID N° 65, dando como resultado de ese modo un elemento regulador que se expresa en el óvulo, no suprimiéndose ya de ese modo en el óvulo de una planta.

Se divulgan polinucleótidos funcionalmente equivalentes para el uso en la inducción de apomixis en una planta, en particular en un óvulo de planta, preferiblemente para inducir apomeiosis y/o partenogénesis en una planta, preferiblemente en un óvulo de planta, que no muestran exactamente la secuencia nucleotídica específica de dichos patrones de secuencia nucleotídica específicos o alelos inductores de apomixis y en particular dada en los protocolos de identidad de secuencia dados en la presente, sino que exhiben ligeras desviaciones de los mismos y que se denominan "variantes polinucleotídicas". Estas variantes polinucleotídicas son variantes alélicas, polimórficas, mutadas, truncadas o prolongadas de los polinucleótidos definidos en los presentes protocolos de identidad de secuencia y que por lo tanto muestran eliminaciones, inserciones, inversiones o adiciones de nucleótidos en comparación con los polinucleótidos definidos en el presente protocolo de identidad de secuencia. Así, las variantes polinucleotídicas o polipeptídicas, en lo sucesivo también denominadas "equivalentes funcionales" de un polinucleótido o polipéptido, tienen una estructura y suficiente longitud para proporcionar la misma actividad biológica, esto es la misma capacidad para inducir apomixis en la planta que los polinucleótidos o polipéptidos divulgados específicamente.

Un polipéptido codificado por una variante polinucleotídica es - en el caso de que su secuencia de aminoácidos esté alterada en comparación con la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por el polinucleótido de la presente invención - denominado una variante polipeptídica. Sin embargo, debido a la degeneración del código genético, una variante polinucleotídica no codifica necesariamente en todos los casos una variante polipeptídica sino que también puede codificar un polipéptido según se usa en la presente invención.

El término "variante" se refiere a una secuencia sustancialmente similar de los polinucleótidos o polipéptidos divulgados específicamente para el uso en la presente invención. Las variantes polinucleotídicas para el uso en la invención tendrán al menos 70%, 90%, en particular las que representan los presentes alelos inductores de apomixis, en particular su secuencia codificante, en donde el % de identidad de secuencia se basa en toda la secuencia. Preferiblemente, la identidad de secuencia se determina mediante análisis por BLAST, preferiblemente en la base de datos del NCBI, en particular mediante análisis por GAP usando un peso del hueco de 50 y un peso de la longitud de 3 o cualquier otro análisis adecuado.

Las variantes de secuencias polipeptídicas divulgadas tendrán al menos aproximadamente 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% u 80%, preferiblemente al menos aproximadamente 85% o 90%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 91%, preferiblemente al menos 92%, preferiblemente al menos 93%, preferiblemente al menos 94%, preferiblemente al menos 95%, preferiblemente al menos 96%, preferiblemente al menos 97% y lo más preferiblemente al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con la presente proteína capaz de inducir apomixis, en donde el % de identidad de secuencia se basa en toda la secuencia. Preferiblemente, la identidad de

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secuencia se determina mediante análisis por BLAST, preferiblemente en la base de datos del NCBI, en particular mediante análisis por GAP usando un peso del hueco de 12 y un peso de la longitud de 4 o cualquier otro análisis adecuado.

Un número de aminoácidos de los presentes polipéptidos se puede reemplazar, insertar o eliminar sin alterar una función de la proteína. La relación entre proteínas se refleja por el grado de identidad de secuencia entre secuencias de aminoácidos alineadas de proteínas individuales o secuencias integrantes alineadas de las mismas.

Para los alineamientos de secuencias y la determinación de identidades de secuencia en el contexto de la presente invención, se pueden usar diversos programas y algoritmos, tales como los algoritmos de Wilbur-Lipman (Wilbur WJ, Lipman DJ, (1983), Rapid similarity searches of nucleic acid and protein data banks. Proc Natl Acad Sci USA 80:726- 730), de Lipman-Pearson (Lipman DJ, Pearson WR (1985), Rapid and sensitive protein similarity searches. Science 227:1435-1441), de Martínez-NW (Needleman-Wunsch) (Martínez H (1983), An efficient method for finding repeats in molecular sequences. Nucleic Acids Res 11:4629-4634; Needleman SB y Wunsch CD (1970), A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins. J Mol Biol 48:444-453) o una combinación de los mismos. El método de Wilbur-Lipman se usa preferiblemente con los de defecto proporcionados por el programa (ktupla = 3; Penalización por hueco = 3; ventana = 20). Según describen las instrucciones del programa MegAlign, el método de Wilbur-Lipman construye tablas de K-tuplas para encontrar regiones de similitud entre dos pares de secuencias de ADN usando el método de Wilbur y Lipman (1983). Este método lee las secuencias, construye estructuras del caso de las K-tuplas, encuentra las diagonales y compara, y crea el alineamiento acabado. El método de Martínez-NW usa dos métodos de alineamiento en sucesión. Un enfoque descrito por Martínez (Martínez H (1983), An efficient method for finding repeats in molecular sequences. Nucleic Acids Res 11:4629-4634) identifica regiones de coincidencia perfecta. A continuación, el método de Needleman- Wunsch (Needleman SB and Wunsch CD (1970), A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins. J Mol Biol 48:444-453) optimiza el ajuste entre coincidencias perfectas. Las condiciones del alineamiento eran aquellas por defecto proporcionadas por el programa (Coincidencia mínima = 9; Penalización por hueco = 1,10; Penalización por la longitud del hueco = 0,33). El programa usado preferiblemente para calcular los algoritmos puede ser MegAlign (DNASTAR La-sergene version 9 Core Suite (DNASTAR, Inc., 3801 Regent Street, Madison, WI 53705, EE. UU. de A.).

Los algoritmos de programación dinámica dan diferentes tipos de alineamientos. Algoritmos como los propuestos por Needleman y Wunsch y por Sellers alinean toda la longitud de dos secuencias proporcionando un alineamiento global de las secuencias. El algoritmo de Smith-Waterman da alineamientos locales. Un alineamiento local alinea el par de regiones dentro de las secuencias que son las más similares dada la elección de la matriz de puntuación y las penalizaciones por hueco. Esto permite una búsqueda en bases de datos para enfocarse a las regiones más altamente conservadas de las secuencias. También permite que se identifiquen dominios similares dentro de las secuencias. Para acelerar los alineamientos usando el algoritmo de Smith-Waterman tanto BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) como FASTA imponen restricciones adicionales a los alineamientos.

Dentro del contexto de la presente invención, los alineamientos se pueden realizar usando BLAST, un conjunto de programas de búsqueda de similitud diseñados para explorar todas las bases de datos de secuencias disponibles independientemente de si el interrogante es proteína o ADN. La versión BLAST 2.2 (Gapped BLAST) de esta herramienta de búsqueda se ha hecho públicamente disponible (actualmente
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST o
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.cgi). Usa un algoritmo heurístico que busca alineamientos locales en oposición a los globales y por lo tanto es capaz de detectar relaciones entre secuencias que comparte solamente regiones aisladas. Las puntuaciones asignadas en una búsqueda por BLAST tienen una interpretación estadística bien definida. Particularmente útiles dentro del alcance de la presente invención son el programa blastp que permite la introducción de huecos en los alineamientos de secuencia locales y el programa PSI-BLAST, comparando ambos programas una secuencia de aminoácidos interrogante frente a una base de datos de secuencias proteínicas, así como un programa variante blastp que solamente permite el alineamiento local de dos secuencias.

Los alineamientos de secuencias, preferiblemente usando BLAST, también pueden tener en cuenta si es probable que la sustitución de un aminoácido por otro conserve las propiedades físicas y químicas necesarias para mantener la estructura y la función de una proteína o es más probable alterar características estructurales y funcionales esenciales. Por ejemplo, se pueden producir sustituciones no conservativas con una frecuencia baja y se pueden realizar sustituciones conservativas entre aminoácidos dentro de los siguientes grupos: (i) serina y treonina; (ii) ácido glutámico y ácido aspártico; (iii) arginina y lisina; (iv) asparagina y glutamina; (v) isoleucina, leucina, valina y metionina; (vi) fenilalanina, tirosina y triptófano (vii) alanina y glicina.

Esta similitud de secuencia se cuantifica en cuento al porcentaje de aminoácidos positivos, en comparación con el porcentaje de aminoácidos idénticos.

Sin embargo, las variantes polinucleotídicas o polipeptídicas usadas en la presente invención, a pesar de sus desviaciones estructurales también son capaces de exhibir la misma o esencialmente la misma actividad biológica que los polinucleótidos o polipéptidos definidos en los protocolos de identidad de secuencias.

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En el contexto de la presente invención, el término "actividad biológica" se refiere a la capacidad del polinucleótido o polipéptido de la presente invención o sus variantes para inducir apomixis en una planta. El término "inducir apomixis en una planta" se refiere a la capacidad de un polinucleótido o polipéptido o variante del mismo para inducir una producción asexual de semillas viables en una planta, en particular en el óvulo de una planta, en particular la capacidad para inducir apomeiosis o partenogénesis o tanto apomeiosis como partenogénesis en un óvulo de planta, en particular al codificar o ejercer una actividad de exonucleasa en el óvulo.

Se divulga en la presente un polinucleótido capaz de inducir apomixis en un óvulo de planta al activar o desreprimir, en particular al cambiar estructuralmente, un elemento regulador de un gen endógenamente presente que codifica una proteína con una actividad de exonucleasa ovular, preferiblemente actividad de exonucleasa específica del óvulo, capaz de inducir apomixis en una planta. Este gen se caracteriza en particular por tener una secuencia polinucleotídica que permite, con la desrepresión, esto es la inducción, la expresión de dicha proteína endógenamente codificada con una actividad de exonucleasa ovular, preferiblemente una actividad de exonucleasa específica del óvulo, capaz de inducir apomixis en la planta.

En una realización particularmente preferida, la actividad biológica ejercida por un polipéptido usado en la presente invención, esto es una proteína capaz de inducir apomixis en una planta, es una actividad de exonucleasa específica caracterizada por la expresión al menos en el óvulo, preferiblemente por una especificidad ovular, en la medida que su expresión es activada en el óvulo, preferiblemente específicamente en el óvulo, de una planta apomíctica y reprimida o inactivada en una planta sexual.

La presente proteína, a saber la proteína apolo, que es capaz de inducir apomixis en una planta, en particular un óvulo de planta y que tiene una actividad de exonucleasa específica, parece ser, sin limitarse por una teoría, una exonucleasa DEDD 3'^ 5', también denominada una proteína Q de ADN, que se caracteriza preferiblemente por cuatro residuos de aminoácido, a saber tres aspartatos (D) y glutamato (E) distribuidos en tres segmentos de secuencia separados, a saber exo I, exo II y exo III (Moser y cols., Nucl. Acids. Res 25 (1997), 5110-5118). Por otra parte, estas proteínas se caracterizan por un aminoácido bien tirosina (y) o bien histidina (h) situado en su lado activo determinante para ser una proteína DEDDy o DEDDh. El presente polipéptido capaz de inducir apomixis en un óvulo de planta puede ser una exonucleasa DEDDh, que comprende preferiblemente la secuencia de aminoácidos que se da en una cualquiera de SEQ ID N° 1 a 3, 10 a 12 o 16 a 18, que cataliza preferiblemente la escisión de monofosfatos de nucleósido en los extremos de ADN o ARN en la dirección 3'-5'. Se divulga que la exonucleasa es una exonucleasa DEDDh de planta.

Se divulga en la presente la actividad biológica específica realizada por el polipéptido capaz de inducir apomixis en el óvulo de planta en dicho óvulo de planta, esto es la proteína apolo, que parece ser una actividad modificadora de la meiosis, en particular alteradora, cambiadora o variadora de la meiosis, en particular es una actividad inhibidora de la meiosis, evitando de ese modo la reducción del número de cromosomas en las células germinales.

Las moléculas de ácido nucleico aisladas usadas en la presente invención se pueden presentar en forma aislada. Sin embargo, las moléculas de ácido también se pueden combinar con otras moléculas de ácido nucleico, por ejemplo elementos reguladores o vectores, formando de ese modo otra molécula que comprende no solamente la molécula de ácido nucleico usada en la presente invención. En este caso, la "molécula de ácido nucleico" también se denomina una "secuencia de ácido nucleico".

En el contexto de la presente invención, se entiende que el término "que comprende" tiene el significado de "que incluye" o "que contiene", lo que significa que una primera entidad contiene una segunda entidad, en donde dicha primera entidad puede además de la segunda entidad contener además una tercera entidad. Así, en particular, el término "una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido" significa que la molécula de ácido nucleico usada en la presente invención contiene un polinucleótido o una variante polinucleotídica, pero puede contener además otros nucleótidos o polinucleótidos. En una realización preferida particular, también se entiende que el término "que comprende", según se usa en la presente, significa "que consiste en", excluyendo de ese modo la presencia de otros elementos además del elemento mencionado explícitamente. Así, la presente invención también se refiere al uso de moléculas de ácido nucleico que consisten en polinucleótidos o variantes polinucleotídicas como las definidas en las reivindicaciones, lo que significa que la molécula de ácido nucleico solamente está compuesta por el polinucleótido o la variante polinucleotídica según se define en las reivindicaciones y no comprende nucleótidos, polinucleótidos u otros elementos adicionales. Según esta realización, la molécula de ácido nucleico usada en la presente invención es el polinucleótido o la variante polinucleotídica definidos en la presente.

Tanto la molécula de ácido nucleico usada en la presente invención como el polinucleótido comprendido en la misma exhiben la actividad biológica deseada de ser capaz de inducir apomixis.

El término "apomixis" se refiere a la sustitución de la reproducción sexual normal por reproducción asexual, esto es preferiblemente reproducción sin fertilización de la célula huevo, en particular, esto es, solo la fertilización de la célula central que es un episodio pseudogámico, en particular sin fertilización, en particular el término se refiere a la

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reproducción asexual a través de semillas, conduciendo a descendencias o progenie producidas apomícticamente genéticamente idénticas a la planta parental, en particular la planta hembra.

El término "gen" se refiere a una secuencia nucleotídica codificante y secuencias nucleotídicas reguladoras asociadas. La secuencia codificante se transcribe en ARN, que, dependiendo del gen específico, será ARNm, ARNr, ARNt, ARNsn, ARN de sentido o ARN antisentido. Ejemplos de secuencias reguladoras, en lo sucesivo también denominadas elementos reguladores, son secuencias promotoras, secuencias no traducidas 5' y 3' y secuencias de terminación. Elementos adicionales que pueden estar presentes son, por ejemplo, intrones o potenciadores. Un gen estructural puede constituir una región codificante ininterrumpida o puede incluir uno o más intrones unidos por juntas de corte y empalme apropiadas. El gen estructural puede ser un material compuesto de segmentos derivados de fuentes diferentes, presentes en la naturaleza o sintéticos.

El gen que se va a expresar se puede modificar en que los motivos de inestabilidad o las señales de poliadenilación de ARNm conocidos se retiran o se pueden usar codones que son preferidos por la planta en la que se va a insertar la secuencia.

Se divulgan en la presente moléculas de ácido nucleico, en particular un polinucleótido o una variante polinucleotídica, en particular una secuencia de ADN, en donde dicha molécula de ácido nucleico o secuencia codifica un polipéptido capaz de inducir apomixis, en particular en una planta, preferiblemente un óvulo de planta, y que tienen, preferiblemente que comprenden, la secuencia de aminoácidos representado en SEQ ID N° 1, 2, 3, 10, 11, 12, 16, 17 o 18, o una variante polipeptídica de la misma, esto es un equivalente funcional de un polipéptido, preferiblemente un polipéptido que es similar al mismo en cuanto a la actividad biológica. La divulgación también proporciona una variante polipeptídica, en particular que tiene una longitud de al menos 150, al menos 200, al menos 250, al menos 300, al menos 350, al menos 400, al menos 450, al menos 500 aminoácidos que después del alineamiento revela al menos 30% o 40% y preferiblemente al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% o más de identidad de secuencia con el polipéptido, preferiblemente de longitud completa, en particular según se caracteriza en una cualquiera de SEQ ID N° 1 a 21, preferiblemente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 13, 14, 15, 19, 20 o 21.

Los términos "proteína" y "polipéptido" se usan intercambiablemente y se refieren a una molécula con una secuencia de aminoácidos particular que comprende al menos 20, 30, 40, 50 o 60 residuos de aminoácido.

El término "polipéptido" significa así proteínas usadas en la presente invención y variantes de las mismas, en particular fragmentos de proteínas, proteínas modificadas, secuencias de aminoácidos y secuencias de aminoácidos sintéticas. El polipéptido puede estar glicosilado o no.

Una variante polipeptídica que está truncada también se denomina un "fragmento". Así, el término "fragmento" se refiere a una porción de una secuencia polinucleotídica o una porción de un polipéptido, esto es una secuencia de aminoácidos y de ahí el polipéptido codificado por la misma. Fragmentos de una secuencia polinucleotídica tales como SEQ ID N° 26, 31, 36, 39, 42, 45, 48, 51 o 54 pueden codificar fragmentos de polipéptido que retienen la actividad biológica del polipéptido, tal como el dado por una cualquiera de SEQ ID N° 1, 2, 3, 10, 11, 12, 16, 17 o 18. Alternativamente, los fragmentos de una secuencia polinucleotídica que son útiles como sondas de hibridación generalmente no codifican fragmentos de un polipéptido que retiene la actividad biológica. Los fragmentos de una secuencia polinucleotídica son generalmente mayores de 20, 30, 50, 100, 150, 200 o 300 nucleótidos y hasta la secuencia nucleotídica entera que codifica el polipéptido. Generalmente, los fragmentos tienen una longitud de menos de 1.000 nucleótidos y preferiblemente menos de 500 nucleótidos. Los fragmentos incluyen secuencias antisentido usadas para disminuir la expresión de los presentes polinucleótidos. Tales fragmentos antisentido pueden variar en longitud oscilando de al menos 20 nucleótidos, 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, hasta e incluyendo la secuencia codificante entera.

El término "elemento regulador" se refiere a una secuencia, preferiblemente una secuencia nucleotídica, situada aguas arriba (5'), dentro y/o agua abajo (3') con respecto a una secuencia nucleotídica, preferiblemente una secuencia codificante, cuya transcripción y expresión es controlada por el elemento regulador, potencialmente junto con el aparato biosintético de proteínas de la célula. "Regulación" o "regular" se refieren a la modulación de la expresión del gen inducida por elementos de la secuencia de ADN situados principalmente, pero no exclusivamente, agua arriba (5') del inicio de la transcripción del gen de interés. La regulación puede dar como resultado en una respuesta de todo o nada a un estímulo, o puede dar como resultado variaciones en el nivel de expresión génica.

Se dice que un elemento regulador, en particular una secuencia de ADN, tal como un promotor, está "conectado operativamente a" o "asociado con" una secuencia de ADN que codifica un ARN o una proteína, si las dos secuencias están situadas y orientadas de modo que la secuencia de ADN reguladora afecte a la expresión de la secuencia de ADN codificante.

Un "promotor" es una secuencia de ADN que inicia la transcripción de una secuencia de ADN asociada, en particular que está situada aguas arriba (5') desde el inicio de la transcripción y que está implicada en el reconocimiento y que

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es de la ARN polimerasa. Dependiendo de la región promotora específica, también puede incluir elementos que actúan como reguladores de la expresión génica tales como activadores, potenciadores y/o represores.

Un "elemento regulador 3'" (o "extremo 3'") se refiere a la porción de un gen que comprende un segmento de ADN, excluyendo la secuencia 5' que conduce el inicio de la transcripción y la porción estructural del gen, que determina el sitio de terminación correcto y contiene una señal de poliadenilación y cualesquiera otras señales reguladoras capaces de afectar al procesamiento de ARN mensajero (ARNm) o la expresión génica. La señal de poliadenilación se caracteriza habitualmente por afectar a la adición de tramos de poli(ácido adenílico) al extremo 3' del precursor de ARNm. Las señales de poliadenilación a menudo son reconocidos por la presencia de homología con la forma canónica 5'-AATAAA-3'.

El término "secuencia codificante" se refiere a la porción de un gen que codifica una proteína, un polipéptido, o una porción de los mismos, y excluyendo las secuencias reguladoras que conducen el inicio o la terminación de la transcripción.

El gen, la secuencia codificante o el elemento regulador pueden ser los encontrados normalmente en la célula, en cuyo caso se llama "autólogo", o pueden no encontrarse normalmente en una posición celular, en cuyo caso se denomina "heterólogo" o "transgénico".

Un gen, una secuencia codificante o un elemento regulador "heterólogo" también puede ser autólogo para la célula pero, sin embargo, está dispuesto en un orden y/o una orientación o en una posición genómica o ambiente no encontrados o presentes normalmente en la célula en la que se transfiere.

El término "vector" se refiere a una construcción de ADN recombinante que puede ser un plásmido, un virus, una secuencia que se replica autónomamente, un cromosoma artificial, tal como el cromosoma artificial bacteriano BAC, un fago u otra secuencia nucleotídica, en la que al menos dos secuencias nucleotídicas, al menos una de las cuales es una molécula de ácido nucleico usada en la presente invención, se han enlazado o recombinado. Un vector puede ser lineal o circular. Un vector puede estar comprendido por un ADN o ARN de una sola hebra o de doble hebra. Un vector se puede derivar de cualquier fuente. Este vector preferiblemente es capaz de introducir el elemento regulador, por ejemplo un fragmento promotor, y la molécula de ácido nucleico usada en la presente invención, preferiblemente una secuencia de ADN para inducir apomixis, en una planta, en orientación de sentido o antisentido junto con la secuencia no traducida 3' apropiada en una célula, en particular una célula de planta.

El término "expresión" se refiere a la transcripción y/o traducción de un gen endógeno o un transgén en plantas.

Los "genes marcadores" codifican habitualmente un rasgo seleccionable o cribable. Así, la expresión de un "gen marcador seleccionable" da a la célula una ventaja selectiva que se puede deber a su capacidad para crecer en presencia de un agente selectivo negativo, tal como un antibiótico o un herbicida, en comparación con el crecimiento de células no transformadas. La ventaja selectiva poseída por las células transformadas, en comparación con células no transformadas, también se puede deber a su capacidad potenciada o nueva para utilizar un compuesto añadido como un nutriente, un factor de crecimiento o una fuente de energía. Gen marcador seleccionable también se refiere a un gen o una combinación de genes cuya expresión en una célula de planta da a la célula una ventaja selectiva tanto negativa como positiva. Por otra parte, "gen marcador cribable" no confiere una ventaja selectiva a una célula transformada, sino que su expresión hace a la célula transformada fenotípicamente distinta de las células no transformadas.

El término "expresión en la proximidad del saco embrionario" se refiere a la expresión en el carpelo, los integumentos, el óvulo, el primordio ovular, la pared ovular, la cálaza, la nucela, el funículo o la placenta. El término "integumentos" se refiere a tejidos que se derivan de los mismos, tales como el endotelio. El término "embriogénico" se refiere a la capacidad de las células para desarrollarse en un embrión bajo condiciones permisivas.

El término "planta" se refiere a cualquier planta, pero particularmente plantas de semilla.

El término "planta transgénica" o "célula de planta transgénica" o "material de planta transgénica" se refiere a una planta, célula de planta o material de planta que se caracteriza por la presencia de un polinucleótido o una variante polinucleotídica de la presente invención, que puede - en caso de que sea autólogo para la planta - estar situado bien en otro lugar o bien en otra orientación que la encontrada habitualmente en la planta, la célula de planta o el material de planta o que es heterólogo para la planta, la célula de planta o el material de planta. Preferiblemente, la planta, la célula de planta o el material de planta transgénica expresa el polinucleótido o sus variantes de modo que induce apomixis.

Una planta transgénica, célula de planta transgénica o material de planta transgénica se puede identificar a nivel fenotípico, por ejemplo mediante la observación de la producción de semillas apomícticas, o a nivel proteínico, por ejemplo mediante inmunodetección, o a nivel de aDn o ARN, por ejemplo con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Incluso en el caso de que el transgén en la planta transgénica, la célula de planta transgénica o el material de planta transgénica tenga un homólogo natural en el mismo con una similitud muy alta, se puede usar

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PCR para discriminar este transgén mediante al menos una diferencia de nucleótidos. En particular, el SNP (polimorfismo de un solo nucleótido) existente entre alelos hospedadores y alelos transformantes se puede usar para detectar plantas transformadas simplemente mediante PCR.

El término "célula de planta" describe la unidad estructural y fisiológica de la planta, y comprende un protoplasto y una pared celular. La célula de planta puede estar en la forma de una célula individual aislada, tal como células oclusivas del estoma o una célula cultivada, o como una parte de una unidad organizada superior tal como, por ejemplo, un tejido de planta o un órgano de planta.

El término "material de planta" incluye partes de plantas, en particular células de planta, tejido de planta, en particular material de propagación de plantas, preferiblemente hojas, ramas, raíces, radículas emergidas, flores o partes de flores, pétalos, frutos, polen, tubos polínicos, filamentos de anteras, óvulos, sacos embrionarios, células huevo, ovarios, cigotos, embriones, embriones cigóticos de por sí, embriones somáticos, secciones hipocotíleas, meristemos apicales, haces vasculares, periciclos, semillas, raíces, esquejes, cultivos celulares o tisulares, o cualquier otra parte o producto de una planta.

Así, la presente invención también proporciona material de propagación de plantas de las plantas transgénicas de la presente invención. Se entiende que dicho "material de propagación de plantas" es cualquier material de planta que se pueda propagar sexualmente o asexualmente in vivo o in vitro. Particularmente preferidos dentro del alcance de la presente invención son protoplastos, células, callos, tejidos, órganos, semillas, embriones, polen, células huevo, cigotos, junto con cualquier otro material de propagación obtenido de plantas transgénicas. También son un objeto de la presente invención partes de plantas, tales como, por ejemplo, flores, ramas, frutos, hojas, raíces que se originan en plantas transgénicas o su progenie previamente transformadas por medio de los métodos de la presente invención y que consisten por lo tanto al menos en parte en células transgénicas. Materiales de planta, en particular materiales de propagación de planta, especialmente preferidos son semillas apomícticas.

Plantas particularmente preferidas son plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas. Se prefieren particularmente plantas de cultivo o agrícolas, tales como girasol, cacahuete, maíz, patata, batata, judía, guisante, escarola, lechuga, endivia, col, coliflor, brécol, nabo, rábano, espinaca, cebolla, ajo, berenjena, apio, zanahoria, calabacín, calabaza, calabacita, pepino, manzana, pera, melón, fresa, uva, frambuesa, piña, soja, Cannabis, Humulus (lúpulo), tomate, sorgo, caña de azúcar y árboles sin frutos tales como álamo, caucho, Paulownia, pino, olmo, Lolium, Festuca, Dactylis, alfalfa, cártamo, tabaco, mandioca, café, coco, piña, cítricos, cacao, té, plátano, aguacate, higo, guayaba, mango, oliva, papaya, anacardo, macadamia, almendra, judías verdes, judías blancas, guisantes, abeto, cicuta, picea, secoya, en particular maíz, trigo, cebada, sorgo, centeno, avena, gramíneas de césped y forrajeras, mijo, arroz y caña de azúcar. Se prefieren especialmente maíz, trigo, sorgo, centeno, avena, gramíneas de césped y arroz.

También se prefieren particularmente plantas ornamentales tales como flores ornamentales y cultivos ornamentales, por ejemplo begonia, clavel, crisantemo, dalia, gardenia, espárrago, geranio, margarita, gladiolo, petunia, gipsófila, lilium, jacinto, orquídea, rosa, tulipán, afelandra, aspidistra, aralia, clivia, coleo, polinesia, ciclamen, drácena, diefembaquia, ficus, filodendro, flor de pascua, helecho, hiedra, hortensia, limonium, costilla de Adán, palmera, palmera datilera, potho, singonio, violeta, trompón, lavanda, lirio, narciso, azafrán, iris, peonías, cefirante, anturio, gloxinia, azalea, ageratum, bambú, camelia, dianto, balsamina, lobelia, pelargonio, lila, lirio del valle, jazmín de Madagascar, hidrangea, girasol, gerbera, oxalis, caléndula e hibisco.

Entre las plantas dicotiledóneas, se prefieren más en la presente Arabidopsis, Boechera, soja, algodón, remolacha azucarera, colza oleaginosa, tabaco, pimiento, melón, lechiga, brasicáceas, en particular Brassica napus, remolacha azucarera, colza oleaginosa y girasol.

"Transformación", "transformar" y "transferir" se refiere a métodos para transferir moléculas de ácido nucleico, en particular ADN, a células, incluyendo, pero no limitados a, enfoques biolísticos tales como bombardeo de partículas, microinyección, permeabilización de la membrana celular con diversos tratamientos físico, por ejemplo electroporación, o químicos, por ejemplo tratamientos con polietilenglicol o PEG; la fusión de protoplastos o transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens o rhizogenes. Para la inyección y la electroporación de ADN en células de planta, no hay requisitos específicos para los plásmidos usados. Se pueden usar plásmidos tales como derivados de pUC. Si se van a regenerar plantas enteras a partir de estas células transformadas, se prefiere el uso de un marcador seleccionable. Dependiendo del método para la introducción de genes deseados en la célula de planta, pueden ser necesarias secuencias de ADN adicionales; si, por ejemplo, se usa el plásmido Ti o Ri para la transformación de la célula de planta, al menos el límite derecho, sin embargo, a menudo el límite derecho y el izquierdo del T-ADN del plásmido Ti y Ri se tienen que conectar como región de flanqueo a los genes que se van a introducir. Preferiblemente, las moléculas de ácido nucleico transferidas se integran establemente en el genoma o plastoma de la planta receptora.

La expresión "progenie" o "descendencia" se refiere a progenie de plantas transgénicas generada tanto "asexualmente" como "sexualmente". Se entiende además que esta definición incluye todos los mutantes y variantes obtenibles por medio de procedimientos conocidos, tales como, por ejemplo, fusión celular o selección de mutantes,

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y que todavía exhiben las propiedades características de la planta transformada inicial según la presente invención, junto con todos los productos de cruce y de fusión del material de planta transformado. Esto también incluye plantas de progenie que resultan de un retrocruzamiento, con la condición de que dichas plantas de progenie todavía contengan el polinucleótido y/o polipéptido usado según la presente invención.

La molécula de ácido nucleico aislada usada en la presente invención puede ser un ADN, preferiblemente un ADN de una planta, preferiblemente de Brassicaceae, en particular Boechera, en particular Boechera holboellii, Boechera divaricarpa o Boechera stricta, en una molécula de la secuencia de ADN genómico o c. Sin embargo, también puede ser un ARN, en particular ARNm.

La presente invención también proporciona en una realización preferida un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico según la invención reivindicada. Bien el polinucleótido específico o bien la variante polinucleotídica que se definen en las reivindicaciones pueden estar contenidos en el vector en orientación de sentido o antisentido con respecto a un elemento regulador.

El vector de la presente invención comprende la secuencia de ácido nucleico, en particular el polinucleótido específico o su variante que codifica la proteína inductora de apomixis de la presente invención, conectados operativamente a al menos un elemento regulador, por ejemplo un promotor, un potenciador y/o una señal de poliadenilación.

Dicho promotor puede ser un promotor inducible o constitutivo. El promotor puede ser un promotor regulable. El promotor también puede ser un promotor específico del óvulo, que es un promotor que permite la expresión de una secuencia codificante conectada operativamente en el óvulo de planta de una planta, pero no en otros tejidos de la planta. El promotor puede ser el promotor de ubiquitina, ocs, mas, actina, ADH, NOS o CaMV355. A fin de obtener la expresión de la presente molécula de ácido nucleico en una planta regenerada, en particular el óvulo de la misma, de un modo específico del tejido, el polinucleótido o la variante polinucleotídica está preferiblemente bajo el control de la expresión un elemento regulador, por ejemplo de un promotor inducible o regulado con respecto al desarrollo.

Se divulga en la presente que un polinucleótido, en particular el polinucleótido específico o la variante polinucleotídica, que codifica una proteína con actividad de exonucleasa está conectado operativamente a un polinucleótido o una variante polinucleotídica de la presente invención que es capaz de actuar como un elemento regulador, en particular un promotor.

Se divulga en la presente un vector que comprende un polinucleótido, en particular el polinucleótido específico o la variante polinucleotídica de la presente invención capaz de actuar como un elemento regulador conectado operativamente a una proteína que codifica una secuencia de ácido nucleico deseada para expresarse en una planta, en particular un óvulo de planta.

La presente invención también proporciona en una realización preferida una célula hospedadora que contiene el vector de la presente invención. Preferiblemente, la célula hospedadora no es una célula humana, preferiblemente no es una célula madre, una célula germinal o una célula embriogénica humana.

La presente invención también proporciona una planta, célula de planta, o material de planta, en particular una semilla de planta, transgénica que comprende al menos una molécula de ácido nucleico usadas según la presente invención o el vector de la presente invención. La presente invención también proporciona en una realización preferida un cultivo celular, preferiblemente un cultivo de células de planta que comprende una célula según la presente invención.

En una realización particularmente preferida, la presente invención proporciona una planta, una célula de planta, un material de planta, en particular una semilla de planta, transgénica, en donde el polinucleótido, el polipéptido o la variante del mismo exhiben su función biológica. En la presente invención, se proporciona una planta o semilla de planta que comprende el polinucleótido, el polipéptido o variantes de los mismos según se definen en las reivindicaciones y que muestran apomixis debido a la presencia de dicho polinucleótido o polipéptido o variante de los mismos.

También se divulgan proteínas, en particular polipéptidos o variantes polipeptídicas, esto es equivalentes funcionales de los polipéptidos de la presente invención, esto es polipéptidos capaces de inducir apomixis en una planta o in vitro, que son codificados por las moléculas de ácido nucleico de la presente invención.

Así, la presente invención las presentes proteínas capaces de inducir apomixis en una planta son proteínas apolo, esto es comprenden una secuencia de aminoácidos como la caracterizada por una cualquiera de SEQ ID N° 4, 5, 6, 7, 8, 9, 13, 14, 15, 19, 20 o 21, preferiblemente 4, 5, 6. También se divulgan proteínas capaces de inducir apomixis en una planta tienen, preferiblemente comprenden, una secuencia de aminoácidos como la indicada en una cualquiera de SEQ ID N° 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21, preferiblemente 13, 14, 15, 19, 20 o 21. También se divulgan proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos que se da en SEQ ID N° 1, 2 o 3.

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La presente invención también proporciona un método para inducir apomixis en una planta, en donde la expresión de una secuencia nucleotídica que codifica una proteína capaz de inducir apomixis en la planta, en particular la proteína apolo, en particular en el óvulo de la planta, se induce en dicho óvulo, en donde dicha proteína tiene la secuencia de aminoácidos que se especifica en una cualquiera de SEQ ID N° 4 a 9, 13 a 15 o 19 a 21, preferiblemente 4, 5, 6, 7.

Así, la presente invención prevé un método según el cual en un óvulo de planta se proporciona la expresión de los polinucleótidos usados en la presente invención, en particular la presencia de la proteína de la presente invención capaz de inducir apomixis, a fin de inducir apomixis y de ese modo dichos polinucleótidos se han transformado en dicha planta en un estado expresable, esto es en una forma capaz de inducir apomixis. Según la divulgación, dichos polinucleótidos alternativamente están presente endógenamente y se activan, en particular sus elementos reguladores, mediante mutación, por ejemplo mediante radiación, agentes químicos o polinucleótidos transformados exógenamente. La presente invención proporciona la enseñanza de inducir la expresión de polinucleótidos usados en la presente invención en el óvulo de planta a fin de permitir la inducción de apomixis en el óvulo de planta.

En una realización particularmente preferida de la presente invención, la presente invención prevé por los tanto inducir la expresión de polinucleótidos que codifican polipéptidos capaces de inducir apomixis en un óvulo de planta al transformar una planta con polinucleótidos como los definidos en la reivindicaciones que están bajo un control regulador apropiado, en particular bajo el control de un promotor, polinucleótido que codifica una proteína capaz de inducir apomixis en una planta, a fin de permitir e inducir la expresión del polinucleótido transformado en el óvulo de planta induciendo de ese modo apomixis en la planta.

La presente invención también proporciona un método como el definido en las reivindicaciones para inducir apomixis en una planta al transformar una célula de planta con la molécula de ácido nucleico aislada y definida según la presente invención o el vector según la presente invención y regenerar la célula de planta transformada en una planta transformada que contiene, en particular contiene y expresa, la al menos una secuencia de ácido nucleico a fin de inducir apomixis en la planta.

También se divulga un método para inducir apomixis en una planta, en donde se induce la regulación de polinucleótidos endógenamente presentes que tienen la misma secuencia de ADN que los polinucleótidos actualmente aislados de la presente invención para que se expresen en un óvulo de planta. Así, se divulga la inducción de la expresión de polinucleótidos endógenamente presentes que codifican proteínas capaces de inducir apomixis en un óvulo de planta, en particular al alterar estructuralmente los elementos reguladores de dicha secuencia polinucleotídica endógenamente presente, en particular su promotor, a fin de permitir la expresión a partir de los mismos.

Se divulga en la presente la alteración estructural de los elementos reguladores de dicha secuencia polinucleotídica endógenamente presente que codifica una proteína capaz de inducir apomixis en la planta al transformar la planta con cualquier secuencia de ADN capaz de modificar estructuralmente los elementos reguladores endógenamente presente de dicho polinucleótido capaz de expresar una proteína capaz de inducir apomixis en una planta o al transformar los elementos reguladores específicos de la presente invención a fin de inducir apomixis en la planta.

Así, la presente invención también se refiere a un método como el reivindicado para la producción de una planta apomíctica al transformar una célula de planta con la molécula de ácido nucleico aislada o el vector que se definen en las reivindicaciones y regenerar la célula de planta transformada en una planta transformada que contiene, en particular contiene y expresa, la al menos una secuencia de ácido nucleico a fin de inducir apomixis en la planta.

Se divulga en la presente un método para inducir la reproducción vegetativa a través de semillas en una generación de planta, que comprende transformar una célula de planta con la molécula de ácido nucleico aislada según la presente invención o el vector según la presente invención y regenerar la célula de planta transformada que contiene, en particular contiene y expresa, la al menos una secuencia de ácido nucleico a fin de inducir apomixis en la planta.

Se divulga en la presente un método para inducir apomixis al inducir la reproducción vegetativa de una generación de planta nueva o adicional, que comprende expresar transgénicamente una molécula de ácido nucleico, en particular una secuencia de ácido nucleico de la presente invención, en particular en una planta o célula de planta.

Según la presente invención, el polinucleótido o la variante polinucleotídica transgénicos definidos en las reivindicaciones se expresan transgénicamente en el óvulo, en particular en la proximidad del saco embrionario.

La presente invención también proporciona en una realización preferida un método como el reivindicado para aislar una molécula de ácido nucleico inductora de apomixis de una planta, en donde la molécula de ácido nucleico aislada usada en la presente invención se usa para cribar y aislar moléculas de ácido nucleico derivadas de planta. Así, la presente invención proporciona la enseñanza sobre la identidad de una molécula de ácido nucleico para el uso en la inducción de apomixis en plantas que permite que el experto diseñe basándose en dichas moléculas de ácido

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nucleico uno o más cebadores para identificar una secuencia similar mediante PCR en una genoma o una parte del mismo.

Se divulga en la presente un método para identificar, en particular cribar, un efector de apomixis, en particular un fenotipo apomíctico, en donde una planta, célula de planta o material de planta transgénica según la invención se usa, en particular se cultiva, preferiblemente se cultiva y se analiza.

Los efectores de apomixis se pueden detectar mediante diferentes tecnologías, preferiblemente dependiendo de la información inicial disponible, por ejemplo mediante una proteína o inmunodetección.

Así, se divulgan medios y métodos para identificar y obtener sustancias adicionales, en particular proteínas o secuencias de ácido nucleico, que están implicadas en el desarrollo de un fenotipo apomíctico, en particular que están asociados, en particular se refieren al desarrollo de una fenotipo apomíctico.

Se divulgan en la presente: 1: Un método para inducir apomixis en una planta, en donde una secuencia nucleotídica que codifica una proteína capaz de inducir apomixis en una planta es inducida para ser expresada en el óvulo de dicha planta y en donde dicha secuencia nucleotídica comprende un polinucleótido, que codifica una proteína con actividad de exonucleasa, polinucleótido que se selecciona del grupo que consiste en

xa) el polinucleótido definido en una cualquiera de SEQ ID N° 22 a 54 o una hebra totalmente complementaria del mismo,

xb) un polinucleótido que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos definida en una cualquiera de SEQ ID N° 1 a 21 o una hebra totalmente complementaria del mismo, y

xc) una variante polinucleotídica que tiene un grado de identidad de secuencia de más de 30%, 40%, 50% o preferiblemente 70% con la secuencia de ácido nucleico definida en xa) o xb), o una hebra totalmente complementaria de la misma.

2: El método de 1, en el que el polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en

xa1) el polinucleótido definido en una cualquiera de SEQ ID N° 26, 31, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54 o una hebra totalmente complementaria del mismo,

xb1) un polinucleótido que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos definida en una cualquiera de SEQ ID N° 1, 2, 3, 10, 11, 12, 16, 17, 18 o una hebra totalmente complementaria del mismo, y

xc1) una variante polinucleotídica que tiene un grado de identidad de secuencia de más de 30%, 40%, 50% o preferiblemente 70% con la secuencia de ácido nucleico definida en xa1) o xb1), o una hebra totalmente complementaria de la misma.

3: El método de 1, en el que el polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en

xa2) el polinucleótido definido en una cualquiera de SEQ ID N° 22, 23, 27, 28, 32, 33 o una hebra totalmente complementaria del mismo,

xb2) un polinucleótido que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos definida en una cualquiera de SEQ ID N° 4, 5, 6 o una hebra totalmente complementaria del mismo, y

xc2) una variante polinucleotídica que tiene un grado de identidad de secuencia de más de 70% con la secuencia de ácido nucleico definida en xa2) o xb2), o una hebra totalmente complementaria de la misma.

4: Una molécula de ácido nucleico aislada para el uso en la inducción de apomixis en una planta, que comprende un polinucleótido, polinucleótido que es capaz de actuar como un elemento regulador y se selecciona del grupo que consiste en

a3) el polinucleótido definido en una cualquiera de SEQ ID N° 55 a 62 o 65 o una hebra totalmente complementaria del mismo y

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b3) una variante polinucleotídica que tiene un grado de identidad de secuencia de más de 70% con la secuencia de ácido nucleico definida en a3), o una hebra totalmente complementaria del mismo.

5: Una molécula de ácido nucleico aislada para el uso en la inducción de apomixis en una planta, que comprende un polinucleótido que codifica una proteína con actividad de exonucleasa, polinucleótido que se selecciona del grupo que consiste en

xa4) el polinucleótido definido en una cualquiera de SEQ ID N° 26, 31, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54 o una hebra totalmente complementaria del mismo,

xb4) un polinucleótido que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos definida en una cualquiera de SEQ ID N° 1, 2, 3, 10, 11, 12, 16, 17, 18 o una hebra totalmente complementaria del mismo, y

xc4) una variante polinucleotídica que tiene un grado de identidad de secuencia de más de 98% con la secuencia de ácido nucleico definida en xa4) o xb4), o una hebra totalmente complementaria del mismo.

6: Una molécula de ácido nucleico aislada para el uso en la inducción de apomixis en una planta, que comprende un polinucleótido que codifica una proteína con actividad de exonucleasa, polinucleótido que se selecciona del grupo que consiste en

xa5) el polinucleótido definido en una cualquiera de SEQ ID N° 22, 23, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 46, 47, 49, 50, 52, 53 o una hebra totalmente complementaria del mismo,

xb5) un polinucleótido que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos definida en una cualquiera de SEQ ID N° 4, 5, 6, 7, 8, 9, 13, 14, 15, 19, 20, 21 o una hebra totalmente complementaria del mismo, y

xc5) una variante polinucleotídica que tiene un grado de identidad de secuencia de más de 90% con la secuencia de ácido nucleico definida en xa5) o xb5), o una hebra totalmente complementaria de la misma.

7: Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de 4 a 6.

8: Una célula hospedadora que contiene el vector de 7.

9: Una proteína codificada por una secuencia de ácido nucleico según uno cualquiera de 5 o 6.

10: Una planta, célula de planta o material de planta transgénica que comprende al menos una molécula de ácido nucleico transgénica de una cualquiera de las realizaciones 4 a 6 o el vector de 7.

11: Un cultivo celular, preferiblemente un cultivo celular de planta que comprende una célula según 8.

12: El método para inducir apomixis en una planta según uno cualquiera de 1 a 3, en donde la expresión se induce al transformar una célula de planta con una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que codifica una proteína con actividad de exonucleasa según se define en uno cualquiera de 1 a 3, 5 o 6, con la molécula de ácido nucleico aislada de 4 o con el vector según 7 y regenerar la célula de planta transformada en una planta transformada que contiene la al menos una secuencia de ácido nucleico transformada a fin de inducir apomixis en la planta.

13: Un método para la producción de una planta apomíctica, en el que una célula de planta se transforma con una molécula de ácido nucleico capaz de inducir la expresión de una secuencia nucleotídica que codifica una proteína capaz de inducir apomixis en una planta y regenerar la célula de planta transformada en una planta transformada que contiene la molécula de ácido nucleico transformada a fin de inducir apomixis en la planta, en donde la secuencia nucleotídica que codifica la proteína capaz de inducir apomixis en la planta es un polinucleótido, que codifica una proteína con actividad de exonucleasa, polinucleótido que se selecciona del grupo que consiste en

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xa) el polinucleótido definido en una cualquiera de SEQ ID N° 22 a 54 o una hebra totalmente complementaria del mismo,

xb) un polinucleótido que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos definida en una cualquiera de SEQ ID N° 1 a 21 o una hebra totalmente complementaria del mismo, y

xc) una variante polinucleotídica que tiene un grado de identidad de secuencia de más de 70% con la secuencia de ácido nucleico definida en xa) o xb), o una hebra totalmente complementaria de la misma.

14: El método para la producción de una planta apomíctica mediante una transformación según 13, en donde la célula de planta se transforma con una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido, que codifica una proteína con actividad de exonucleasa, polinucleótido que se selecciona del grupo que consiste en

xa) el polinucleótido definido en una cualquiera de SEQ ID N° 22 a 54 o una hebra totalmente complementaria del mismo,

xb) un polinucleótido que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos definida en una cualquiera de SEQ ID N° 1 a 21 o una hebra totalmente complementaria del mismo, y

xc) una variante polinucleotídica que tiene un grado de identidad de secuencia de más de 70% con la secuencia de ácido nucleico definida en xa) o xb), o una hebra totalmente complementaria de la misma

o con la molécula de ácido nucleico aislada de la realización 4 o con el vector de la realización 7 y la célula de planta transformada se regenera en una planta transformada que contiene la al menos una secuencia de ácido nucleico a fin de inducir apomixis en la planta.

15: Un método para aislar una molécula de ácido nucleico inductora de apomixis de una planta, en donde una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido, que codifica una proteína con actividad de exonucleasa, polinucleótido que se selecciona del grupo que consiste en

xa) el polinucleótido definido en una cualquiera de SEQ ID N° 22 a 54 o una hebra totalmente complementaria del mismo,

xb) un polinucleótido que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos definida en una cualquiera de SEQ ID N° 1 a 21 o una hebra totalmente complementaria del mismo, y

xc) una variante polinucleotídica que tiene un grado de identidad de secuencia de más de 70% con la secuencia de ácido nucleico definida en xa) o xb), o una hebra totalmente complementaria de la misma

o la molécula de ácido nucleico aislada de 4 o el vector de 7 se usa para cribar y aislar secuencias de ácido nucleico derivadas de la planta.

16: Una planta, célula de planta o material de planta transgénica que comprende una célula según una cualquiera de la realización 8 o producida según un método según uno cualquiera de 13 o 14 o progenie de la misma.

17: La planta, célula de planta o material de planta transgénica según 16, que expresa transgénicamente la secuencia de ácido nucleico de uno cualquiera de 5 o 6.

18: Un método para identificar un efector para apomixis en una planta, en donde se cultiva la planta, célula de planta o material de planta transgénica según uno cualquiera de 16 o 17.

La invención se ilustrará ahora a modo de ejemplo.

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Ejemplos

Ejemplo 1: Cribado y aislamiento de gen inductor de apomixis (gen apolo)

1.a) Material de planta y análisis por cribado de semillas

Se cultivaron plantas desde las plántulas en adelante en un fitotrón bajo condiciones ambientales controladas. El cribado de semillas por citometría de flujo se usó para analizar la variabilidad reproductiva en 18 registros de Boechera (Tabla IV).

Tabla IV. Registros de Boechera usados en micromatrices y análisis por RT-PCR.

Tabla IV - Registros de Boechera usados en micromatrices y análisis por RT-PCR.

Registro

Frecuencia de apomeiosis Localidad de recogida

B08-1

1 Birch Creek, Montana

B08-11

1 Sliderock, Ranch Creek, Granite, Montana

B08-33

1 Mule Ranch, Montana

B08-111

1 Morgan Switch Back, Idaho

B08-81

1 Vipond Park, Beaverhead, Montana

B08-168

1 Vipond Park, Beaverhead, Montana

B08-43

1 Mule Ranch, Montana

B08-66

1 Highwood Mtns, Montana

B08-104

1 Lost Trail Meadow

B08-215

1 Blue Lakes road, California

B08-369

0 Twin Saddle, Idaho

B08-376

0 Sagebrush Meadow, Montana

B08-380

0 Buffalo Pass, Colorado

B08-355

0 Gold Creek, Colorado

B08-329

0 Big Hole Pass, Montana

B08-385

0 Parker Meadow, Idaho

B08-344

0 Bandy Ranch, Montana

B08-390

0 Panther Creek

Semillas simples se trituraron individualmente con tres cuentas de acero inoxidable de 2,3 mm en cada pocillo de una placa de 96 pocillos (PP-Master-block 128.0/85MM, placa de 96 pocillos de 1,0 ml de Greiner bio-one,
www.gbo.com) que contienen 50 pl de tampón de extracción-aislamiento de núcleos (véase posteriormente) usando un Geno-Grinder 2000 (SPEX Certi-Prep) a una velocidad de 150 golpes/minuto durante 90 segundos.

Se usó un procedimiento en dos etapas que consistía en un tampón de aislamiento y tinción: (a) tampón de aislamiento I - 0,1 M de monohidrato de ácido cítrico y 0,5% v/v de Tween 20 disueltos en H2O y ajustado hasta pH 2,5); y (b) tampón de tinción II - 0,4 M de Na2HPO4.12H2O disueltos en H2O más 4 pg/ml de 4',6-diamidinofenilindol (DAPI) y se ajustó hasta pH 8,5. Se añadieron 50 pl de tampón de aislamiento I a cada semilla por pocillo en una placa de 96 pocillos antes de la trituración, y se añadieron 160 pl adicionales de tampón I después de la trituración para recuperar suficiente volumen a través de filtración (usando filtros de nailon de anchura de malla 30 pm Partec). A continuación, se añadieron 100 pl de tampón de tinción II a 50 pl de la suspensión resultante (núcleos aislados) y se incubaron sobre hielo durante 10 minutos antes del análisis por citometría de flujo. Para evitar la degradación de la muestra a lo largo del período de 2 horas requerido para el análisis de las 96 muestras, la placa de muestra se selló con cinta selladora de aluminio.

Todas las placas de muestras se analizaron en un automuestreador Robby-Well enfriado a 4°C conectado a un citómetro de flujo Partec PAII (Partec GmbH, Munster, Alemania). Dos semillas individuales de SAD 12, una Boechera autofértil sexual conocida, se incluían siempre como una referencia externa en las posiciones de los pocillos 1 y 96 a fin de normalizar otros picos y corregir desviaciones de picos a lo largo del período de análisis. Las

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semillas de SAD 12 estaban compuestas exclusivamente por una relación de embriones 2C a endospermos 3C, que reflejaba una composición de embriones de genomas maternos C (C indica contenido de ADN monoploide) (Cm) + genomas paternos C (Cp) = 2C, y una composición de endospermos de 2Cm + Cp = 3C.

Basándose en los presentes datos citométricos de flujo de cribado de semillas de alto rendimiento, se muestra que todos loa registros apomícticos se caracterizan por 100% de producción de semillas apomícticas.

1.b) Microdisección ovular

Se seleccionaron óvulos en la megaesporogénesis entre las fases 2-II a 2-IV en los que el megaesporocito está diferenciado, el integumento interno y externo está iniciado a fin de examinar cambios en la expresión génica asociada con la meiosis y la apomeiosis. Los gineceos de Boechera sexual y apomíctica se diseccionaron de flores no polinizadas en la fase de megaesporogénesis en solución estéril en manitol 0,55 M, en un momento estandarizado (entre 8 y 9 a.m.) a lo largo de múltiples días. Las microdisecciones se realizaron en una cabina de flujo de aire laminar estéril usando un microscopio estereoscópico (1000 Stemi, Carl Zeiss, Jena, Alemania) bajo 2 aumentos. El gineceo se mantuvo con fórceps mientas se usaba un bisturí eléctrico para cortar longitudinalmente de modo que las mitades de la silicua junto con los óvulos se expusieran inmediatamente al manitol. Posteriormente, se recogieron óvulos vivos individuales bajo un microscopio invertido (Axiovert 200M, Carl Zeiss) en condiciones estériles, usando agujas de vidrio estériles (de fabricación propia usando un extractor Narishige PC-10, y curvadas hasta un ángulo de aproximadamente 100°) para aislar los óvulos del tejido placentario. Usando un capilar de vidrio (con una abertura de diámetro interior de 150 pm) interconectado a una Eppendorf Cell Tram Vario, los óvulos se recogieron en tubos de Eppendorf estériles que contenían 100 pl de tampón estabilizador de ARN (RNA later, Sigma). Se recogieron de este modo entre 20 y 40 óvulos por registro, se congelaron directamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C.

1.c) Aislamiento de ARN ovular

Se llevaron a cabo extracciones de ARN total usando un estuche de aislamiento de ARN PicoPure (Arcturus Bioscience, CA). La integridad y la cantidad del ARN se verificó en un bioanalizador Agilent 2100 usando los RNA Pico chips (Agilent Technologies, Palo Alto, CA).

1.d) Micromatriz

1.d.i) Diseño de la micromatriz

Se usó la tecnología 454 (FLX) para secuenciar los transcriptomas completos de 3 registros de Boechera sexuales y 3 apomícticos, como una primera etapa en el diseño de micromatrices específicas para Boechera de alta densidad para el uso en comparaciones de la variación de la expresión génica y el número de copias. El objetivo de la secuenciación de transcriptomas era así identificar todos los genes que se puedan expresar durante el desarrollo de las flores, seguido por el análisis por gotas de todos los genes identificados en una micromatriz (Agilent).

Esto se efectuó al reunir flores en múltiples fases de desarrollo separadamente para plantas apomícticas y sexuales, seguido por un procedimiento de normalización de ADNc a fin de equilibrar los niveles de transcritos para incrementar la posibilidad de que todas las especies de ARNm observables se secuencien. Por otra parte, se empleó un procedimiento 454 anclado a 3'-UTR (región no traducida) de modo que las secuencias de ARNm se desviaran hacia sus 3'-UTRs, regiones que muestran niveles relativamente altos (pero no aleatorios) de variabilidad, para permitir la identificación de la variación alélica.

Las secuencias 454 se ensamblaron usando el banco de trabajo CLC Genomics usando parámetros de ensamblaje estándar para secuencias de alto rendimiento de lectura larga, después de recortar todas las lecturas usando puntuaciones de calidad de secuencias internas. Al hacer esto, se obtuvieron 36.289 cóntigos y 154.468 secuencias de instancia única ("singleton") no ensambladas. Estos datos se suministraron a ImaGenes (GmbH, Alemania) para el desarrollo de micromatrices usando su servicio de estrategia de preselección (PSS).

El servicio de PSS funcionaba como sigue: 14 oligonucleótidos diferentes (cada uno de 60 pb de longitud) por cóntigo y 8 oligonucleótidos por singleton, incluyendo la secuencia "antisentido" de cada oligonucleótido, se diseñaron bioinformáticamente y se analizaron por gotas en dos matrices de prueba de 1 millón de gotas. Estas matrices de prueba se sondaron usando (1) una "mezcla compleja de ARNc" (obtenida al reunir tejidos y recoger todos los ARN de ellos), y (2) ADN genómico extraído de tejido foliar reunido de un individuo sexual y uno apomíctico. Basándose en los resultados de hibridación separados procedentes de las muestras de ARNc y ADN genómico, y después de todas las pruebas de calidad, se diseño una matriz final de 2 X 105.000 gotas. Esta matriz debe contener múltiples oligonucleótidos (es decir, réplicas técnicas) de cada gen expresado durante el desarrollo de flores de Boechera.

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l.d.ii) Hibridación

Se preparó y se marcó ARNc usando el Quick-Amp One-Color Labeling Kit (Agilent Technologies, CA) y se hibridó a las matrices de Boechera habituales de Agilent (8 y 10 réplicas biológicas se hibridaron para los genotipos sexual y apomíctico, respectivamente).

1. d.iii) Análisis estadístico

Los análisis se realizaron usando software GeneSpring GX (versión 10) y las posibles sondas expresadas diferencialmente significativamente (p < 0,05) entre plantas apomícticas y sexuales se seleccionaron basándose en los siguientes parámetros: (a) percentil de normalización de cambio 75, mediana como valor de referencia, modo reproductivo (apomíctico o sexual) como interpretación (1° nivel), Prueba de la T desapareada como análisis estadístico y correcciones de prueba múltiples de Bonferroni FWER. Usar el nivel más alto de corte significativo condujo a la identificación de 4 gotas diferentes en la micromatriz (p < 0,01 para las tres primeras y p < 0,05 para la cuarta). De forma importante, las secuencias oligonucleotídicas de estas 4 gotas se analizaron con BLAST hasta una base de datos de secuencias de ADNc 454, las 4 analizadas con blast hasta el mismo transcrito de Boechera. Así, el presente experimento no solo se ha corregido con respecto al ruido biológico, además, se detectó un solo transcrito expresado diferencialmente entre los óvulos microdiseccionados de todos los genotipos sexuales y apomícticos, con 4 réplicas técnicas para el gen específico en la micromatriz. Este gen se expresa de un modo similar cuando se comparan óvulos apomícticos tanto diploides como triploides con los sexuales, y de ahí que su comportamiento de expresión aparentemente no esté influenciado por la ploidía. Finalmente, una búsqueda de este transcrito de Boechera demostraba que está implicado en el ciclo celular en otras especies, apoyando así la evidencia relativa a la desregulación de la ruta sexual como un medio para producir apomixis.

Ejemplo 2: Caracterización del gen inductor de apomixis

2. a) Caracterización de posibles genes 2.a.i) Nivel genómico

2.a.i.1) Clonación

El transcrito de longitud completa procedentes de los 18 registros se clonó y se secuenció (TOPO-TA Cloning kit, Invitrogen) usando polimerasa a prueba de lectura (Accuprime). El transcrito es muy polimórfico, y se caracteriza por niveles comparables de polimorfismos de un solo nucleótido entre sexuales y apomícticos. No obstante, se encuentra un solo "polimorfismo de apomixis" en los 10 registros apomícticos, pero no en el registro sexual. SEQ ID N° 46 a 54 muestran la secuencia genómica y la codificante de tres alelos sexuales, a saber S011a, S355a y S390a. SEQ ID N° 37 a 45 muestran la secuencia genómica y la codificante de tres alelos apomícticos, a saber A011a, A043a y A081a. Considerando que los puntos geográficos de recogida de todos los registros varían de California al medio oeste estadounidense (es decir 1000's de kilómetros), la compartición de este polimorfismo en todos los apomícticos es muy significativa. Finalmente, el espectro de polimorfismo SNP que rodea al "polimorfismo de apomixis" refleja el encontrado en todos los otros alelos en los registros tanto sexuales como apomícticos. De ahí que el "polimorfismo de apomixis" parece haber sufrido recombinación durante la evolución de Boechera, pero que sin embargo es compartido por todos los apomícticos, independientemente de los diferentes antecedentes genéticos, de ploidía o geográficos.

2.a.i.2) BAC

ADN reunido de todos los registros tisulares se usó como una plantilla para la generación de sondas de hibridación. Dos sondas de diferente tamaño (1,6 y 2,3 kb) se prepararon mediante amplificación por PCR usando dos pares de cebadores específicos de la secuencia genómica del posible gen. Ambas sondas se marcaron y se usaron para la hibridación sobre una biblioteca de BAC de Boechera apomíctica. Había 8 hibridaciones positivas. Los BACs aislados respectivos (estuche de purificación de ADN plasmídico PureLink) se denominaron 1, 2a, 2b, 3, 4, 5, 6 y 7. Los BACs seleccionados se probaron de nuevo usando cebadores específicos para el posible gen. Todos los BACs se confirmaron excepto el BAC-3. Los otros siete BACs se identificaron genéticamente mediante digestión con enzimas de restricción. BAC-1 y BAC-2a parecían ser redundantes con los otros BACs. Los BACs: 2b, 4, 5, 6 y 7 se secuenciaron.

Las secuencias de BAC se podían ensamblar entre sí para los pares 2b_4 y 5_7, mientras que BAC-6 permanecía solo.

Las secuencias de BAC se caracterizaron por comparación con otras secuencias de planta.

2.a.ii) Nivel transcriptómico

Se realizaron experimentos de RACE (SMARTer RACE cDNA Amplification Kit).

Los resultados revelaban que ARNm correspondiente a registros apomícticos tiene un extremo 5' truncado aguas 5 arriba del "polimorfismo de apomixis" mientras que los registros sexuales tienen ~200 pb de longitud adicional.

Una vez que se conocían los extremos 5' y 3' de ARNm, se realizaron PCRs adicionales sobre todo de ADNc de los tejidos para la caracterización del perfil completo de corte y empalme.

2.b) Validación

10 2.b.i) QRT-PCR

Se completó un análisis de qRT-PCR específico de alelos del posible gen sobre los óvulos vivos microdiseccionados (fase de megaesporocito) de 6 registros de Boechera sexuales y 10 apomícticos diploides (3 réplicas técnicas por registro). Usando dos cebadores de PCR directos diferentes que abarcaban el polimorfismo específico de apomixis que se identificaba a partir de las secuencias génicas, era posible medir la abundancia de transcritos para los alelos 15 tanto sexuales como apomícticos separadamente.

Se preparó ADNc usando transcriptasa inversa RevertAid H Minus.

Para reacciones de PCR en tiempo real, se usó la SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, 20 CA). Se llevaron a cabo amplificaciones por QRT-PCR en una máquina 7900HT Fast RT-PCR System (Applied Biosystems) con el siguiente perfil de temperatura para los ensayos SYBRgreen: desnaturalización inicial a 90°C durante 10 min, seguida por 40 ciclos de 95°C durante 15 s y 60°C durante 1 min. Para comprobar la calidad de los amplicones, se obtuvo un gradiente de la curva de fusión a partir del producto al final de la amplificación. El Ct, definido como el ciclo de PCR en el que se detecta en primer lugar un incremento estadísticamente significativo de 25 fluorescencia indicadora, se usó como una medida del número de copias de partida del gen diana. Se calculó el nivel de expresión medio y la desviación estándar para cada grupo de tres réplicas técnicas para cada ADNc. Se realizaron cuantificación relativa y normalización de las diana amplificadas mediante el método AACt comparativo usando una muestra calibradora en referencia a los niveles de expresión del gen constitutivo UBQ10.

30 Los resultados son concluyentes: el alelo apomíctico se expresa exclusivamente en los óvulos microdiseccionados de todos los registros apomícticos, mientras que el alelo sexual nunca se expresa en ningún óvulo, esto es sexual o apomíctico. Ambos alelos se expresan en otros tejidos, a saber tejido somático. De ahí que parezca muy razonable suponer que el alelo sexual es inactivo/sinónimo durante el desarrollo del óvulo sexual normal, mientras que la expresión del alelo apomíctico se correlaciona con el desarrollo del óvulo apomeiótico.

35 Ejemplo 3: Construcción de vectores de transformación y transformación de Arabidopsis thaliana con gen inductor de apomixis

Transformación de plantas

Las transformaciones de Arabidopsis thaliana (sexo) (híbridos F1) y Boechera (sexo) con el gen de la presente invención son capaces de mostrar un cambio de su modo reproductivo en la producción de semillas apomícticas. 40 Para esto, el alelo genómico completo (incluyendo el promotor completo) se ha clonado en pNOS-ABM.

Además, se usan diferentes construcciones para caracterizar el papel de los presentes elementos reguladores, en particular el promotor de la presente invención, en su expresión. Para esto, promotores tanto de apo como de sexo se han conectado exactamente con el ATG frente a gus en pGUS-ABM.

Asimismo, se usa BAC-4 completo para las transformaciones.

Claims (12)

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   1. Un método para inducir apomixis en una planta transgénica, en el que una secuencia nucleotídica exógena que codifica una proteína capaz de inducir apomixis en una planta se introduce en la planta y se expresa en el óvulo de dicha planta, y en el que dicha secuencia nucleotídica comprende un polinucleótido, que codifica una proteína con actividad de exonucleasa DEDD 3' a 5', polinucleótido que se selecciona del grupo que consiste en

   a) el polinucleótido definido en una cualquiera de SEQ ID N° 22 a 25, 27 a 30, 32 a 35, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 46, 47, 49, 50, 52 o 53 o una hebra totalmente complementaria del mismo,

   b) un polinucleótido que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos definida en una cualquiera de SEQ ID N° 4 a 9, 13 a 15, 19 a 21 o una hebra totalmente complementaria del mismo, y

   c) una variante polinucleotídica que tiene un grado de identidad de secuencia de más de 70% con la secuencia de ácido nucleico definida en a) o b), o una hebra totalmente complementaria de la misma.
2. 2. El método según la reivindicación 1, en el que el polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en

   a) el polinucleótido definido en una cualquiera de SEQ ID N° 22, 23, 27, 28, 32, 33 o una hebra totalmente complementaria del mismo,

   b) un polinucleótido que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos definida en una cualquiera de SEQ ID N° 4, 5, 6 o una hebra totalmente complementaria del mismo, y

   c) una variante polinucleotídica que tiene un grado de identidad de secuencia de más de 70% con la secuencia de ácido nucleico definida en a) o b), o una hebra totalmente complementaria de la misma.
3. 3. Uso de una molécula de ácido nucleico aislada para inducir apomixis en una planta, que comprende transformar dicho ácido nucleico en una célula de planta para producir dicha planta, en el que dicho ácido nucleico comprende un polinucleótido que codifica una proteína con actividad de exonucleasa DEDD 3' a 5' y es un polinucleótido que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos definida en una cualquiera de SEQ ID N° 4 a 9, 13 a 15 o 19 a 21, en donde el polinucleótido está bajo el control de un promotor constitutivo o específico del óvulo y la proteína se expresa en el óvulo.
4. 4. Uso de una molécula de ácido nucleico aislada para inducir apomixis en una planta, que comprende un polinucleótido que codifica una proteína con actividad de exonucleasa DEDD 3' a 5', polinucleótido que se selecciona del grupo que consiste en

   a) el polinucleótido definido en una cualquiera de SEQ ID N° 22, 23, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 37, 38, 40, 41,43, 44, 46, 47, 49, 50, 52, 53 o una hebra totalmente complementaria del mismo,

   b) un polinucleótido que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos definida en una cualquiera de SEQ ID N° 4, 5, 6, 7, 8, 9, 13, 14, 15, 19, 20, 21 o una hebra totalmente complementaria del mismo, y

   c) una variante polinucleotídica que tiene un grado de identidad de secuencia de más de 90% con la secuencia de ácido nucleico definida en a) o b), o una hebra totalmente complementaria de la misma, en donde la proteína con actividad de exonucleasa DEDD 3' a 5' se expresa en un óvulo de planta.
5. 5. Un vector para inducir apomixis en una planta, que comprende un primer polinucleótido que es capaz de actuar como un elemento regulador que conduce a la expresión en el óvulo de un polinucleótido conectado operativamente y es un promotor constitutivo o específico del óvulo,

   en donde el primer polinucleótido está conectado operativamente a un segundo polinucleótido que codifica una proteína con actividad de exonucleasa DEDD 3' a 5' y se selecciona del grupo que consiste en:

   i) el polinucleótido definido en una cualquiera de SEQ ID N° 22 a 25, 27 a 30, 32 a 35, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 46, 47, 49, 50, 52 o 53 o una hebra totalmente complementaria del mismo,

   ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos definida en una cualquiera de SEQ ID N° 4 a 9, 13 a 15, 19 a 21 o una hebra totalmente complementaria del mismo, y

   iii) una variante polinucleotídica que tiene un grado de identidad de secuencia de más de 70% con la secuencia de ácido nucleico definida en i) o ii), o una hebra totalmente complementaria de la misma.
6. 6. Una célula hospedadora que contiene el vector según la reivindicación 5.

   5 7. Una planta, célula de planta o material de planta transgénica que comprende al menos una molécula de ácido

   nucleico transgénica según una cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, en donde la molécula de ácido nucleico está dispuesta en un orden o una orientación, o en una posición genómica, que normalmente no se encuentra en la planta, célula de planta o material de planta a los que se transfiere o el vector según la reivindicación 5.

   10 8. Un cultivo celular, preferiblemente un cultivo de células de planta, que comprende una célula según la

   reivindicación 6.
7. 9. El método para inducir apomixis en una planta según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la expresión se induce al transformar una célula de planta con una molécula de ácido nucleico aislada que comprende

   15 un polinucleótido que codifica la proteína con actividad de exonucleasa DEDD 3' a 5' según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4, con la molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 3 o con el vector según la reivindicación 5 y regenerar la célula de planta transformadas en una planta transformada que contiene la secuencia de ácido nucleico transformada a fin de expresar la proteína con actividad de exonucleasa DEDD 3' a 5' en un óvulo de planta e inducir apomixis en la planta.

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8. 10. Un método para la producción de una planta apomíctica, en el que una célula de planta se transforma con una molécula de ácido nucleico capaz de inducir la expresión de una secuencia nucleotídica que codifica una proteína capaz de inducir apomixis en una planta y regenerar la célula de planta transformada en una planta transformada que contiene la molécula de ácido nucleico transformada a fin de expresar una proteína con actividad de

   25 exonucleasa DEDD 3' a 5' en un óvulo de planta w inducir apomixis en la planta, en donde la secuencia nucleotídica que codifica la proteína capaz de inducir apomixis en la planta es un polinucleótido, que codifica una proteína con actividad de exonucleasa DEDD 3' a 5', polinucleótido que se selecciona del grupo que consiste en

   a) el polinucleótido definido en una cualquiera de SEQ ID N° 22 a 25, 27 a 30, 32 a 35, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 46, 47, 49, 50, 52 o 53 o una hebra totalmente complementaria del mismo,

   30 b) un polinucleótido que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos definida en una cualquiera

   de SEQ ID N° 4 a 9, 13 a 15 o 19 a 21 o una hebra totalmente complementaria del mismo, y

   c) una variante polinucleotídica que tiene un grado de identidad de secuencia de más de 70% con la secuencia de ácido nucleico definida en a) o b), o una hebra totalmente complementaria de la misma.
9. 11. El método para la producción de una planta apomíctica al transformar una célula de planta según la 35 reivindicación 10, en donde la célula de planta se transforma con una molécula de ácido nucleico aislada que

   comprende un polinucleótido, que codifica una proteína con actividad de exonucleasa DEDD 3' a 5', polinucleótido que se selecciona del grupo que consiste en

   a) el polinucleótido definido en una cualquiera de SEQ ID N° 22, 23, 27, 28, 32 o 33 o una hebra totalmente complementaria del mismo,

   40 b) un polinucleótido que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos definida en una cualquiera

   de SEQ ID N° 4, 5 o 6 o una hebra totalmente complementaria del mismo, y

   c) una variante polinucleotídica que tiene un grado de identidad de secuencia de más de 70% con la secuencia de ácido nucleico definida en a) o b), o una hebra totalmente complementaria de la misma

   o con la molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 3 o con el vector según la reivindicación 5 y la 45 célula de planta transformada se regenera en una planta transformada que contiene la al menos una secuencia de ácido nucleico a fin de expresar la proteína con actividad de exonucleasa DEDD 3' a 5' en un óvulo de planta e inducir apomixis en la planta.
10. 12. Un método para aislar una molécula de ácido nucleico inductora de apomixis de una planta, en el que la 50 molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que codifica una proteína con actividad de

    exonucleasa DEDD 3' a 5', polinucleótido que se selecciona del grupo que consiste en

    a) el polinucleótido definido en una cualquiera de SEQ ID N° 22 a 54 o una hebra totalmente complementaria del mismo,

    b) un polinucleótido que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos definida en una cualquiera de SEQ ID N° 1 a 21 o una hebra totalmente complementaria del mismo, y

    5 c) una variante polinucleotídica que tiene un grado de identidad de secuencia de más de 70% con la

    secuencia de ácido nucleico definida en a) o b), o una hebra totalmente complementaria de la misma,

    o la molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 3, o el vector según la reivindicación 5, se usa para cribar y aislar secuencias de ácido nucleico derivadas de la planta.

    10 13. Una planta, célula de planta o material de planta transgénica que comprende una célula según la reivindicación

    6, que se produce según un método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10, o progenie del mismo que contiene el vector según la reivindicación 5 o que contiene el polinucleótido que codifica una proteína con actividad de exonucleasa DEDD 3' a 5' según una cualquiera de las reivindicaciones 1,2, 4 o 10, en donde el polinucleótido está dispuesto en un orden o una orientación, o en una posición genómica, que normalmente no se encuentra en la 15 planta, la célula de planta o el material de planta al que se transfiere y en donde la proteína con actividad de exonucleasa DEDD 3' a 5' se expresa en un óvulo de planta.
11. 14. La planta, célula de planta o material de planta transgénica según la reivindicación 13, que expresa transgénicamente la secuencia polinucleotídica según la reivindicación 4.

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12. 15. Uso de la planta, célula de planta o material de planta transgénica según una cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14 para cribar con respecto a un efector de apomixis.