ES2655668T3

ES2655668T3 - Tratamiento del IBS con probióticos

Info

Publication number: ES2655668T3
Application number: ES12797955.7T
Authority: ES
Inventors: Barry Edward SMITH
Original assignee: Multigerm UK Enterprises Ltd
Current assignee: Multigerm UK Enterprises Ltd
Priority date: 2011-11-16
Filing date: 2012-11-16
Publication date: 2018-02-21
Anticipated expiration: 2032-11-16
Also published as: EP3329927B1; PL3329927T3; EP3329927A1; DK3329927T3; EP2780023A1; ES2963547T3; SI3329927T1; EP2780023B1; PL2780023T3; FI3329927T3; HUE064428T2; WO2013072654A1; PT3329927T

Abstract

Una preparación probiótica que comprende bacterias probióticas metabólicamente activas, viables en un sustrato líquido no lácteo, para su uso en el tratamiento del Síndrome de Colon Irritable, donde la preparación probiótica comprende una mezcla de Enterococcus faecium, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, y Lactobacillus casei o Lactobacillus rhamnosus o ambos Lactobacillus casei y Lactobacillus rhamnosus

Description

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síntomas de IBS, y también que mejora las valoraciones de calidad de vida en pacientes de IBS, en el estudio clínico descrito en el presente documento. La cepa de Lactobacillus casei en el Symprove™ se caracterizó originalmente como Lactobacillus casei pero ahora se ha re-clasificado como que está estrechamente relacionada con Lactobacillus rhamnosus.

5 Un factor clave para conseguir una eficacia terapéutica en el tratamiento del IBS, como se mide por la reducción en la gravedad de los síntomas de IBS según el índice de gravedad de síntomas de IBS, es la capacidad para suministrar una alta cantidad de bacterias probióticas metabólicamente activas viables en el tracto gastrointestinal del paciente que se somete a tratamiento. Con el fin de conseguir esto, en realizaciones ejemplares, la población total de bacterias metabólicamente activas de la preparación probiótica puede estar en el intervalo de desde 1,0 x 106 a 1,0 x 109 células viables por mililitro, preferentemente en el intervalo de desde 1,0 x 107 a 1,0 x 109 células viables por mililitro. Cada cepa individual de bacterias metabólicamente activas presentes en la preparación probiótica puede estar presentes en el intervalo de desde 1,0 x 105 a 1,0 x 109 células viables por mililitro, más preferentemente en el intervalo de desde 1,0 x 107 a 1,0 x 109 células viables por mililitro.

15 En el caso de Enterococcus faecium, Lactobacillus plantarum, y Lactobacillus casei o Lactobacillus rhamnosus o ambos Lactobacillus casei y Lactobacillus rhamnosus, se prefiere que el menos uno y preferentemente cada una de estas cepas estén presentes en el intervalo de desde 1,0 x 106 a 1,0 x 109 células viables por mililitro, preferentemente en el intervalo de desde 1,0 x 107 a 1,0 x 109 células viables por mililitro.

La población de L. acidophilus, puede ser menor de 1,0 x 105 células viables por mililitro.

En una realización ejemplar, la preparación puede comprender una combinación de Enterococcus faecium, Lactobacillus plantarum, y Lactobacillus casei o Lactobacillus rhamnosus o ambos Lactobacillus casei y

25 Lactobacillus rhamnosus, donde la cantidad de bacterias de cada una de estas cepas bacterianas está en el intervalo de desde 1,0 x 105 a 1,0 x 109 células viables por mililitro, más preferentemente en el intervalo de desde 1,0 x 107 a 1,0 x 109 células viables por mililitro, y contiene adicionalmente Lactobacillus acidophilus. La población de L. acidophilus puede ser menor de 1,0 x 105 células viables por mililitro.

Aunque la cantidad total de bacterias en la preparación descrita en el presente documento puede parecer que es más baja que la de las preparaciones probióticas típicas secadas por congelación, es importante señalar que las bacterias son viables. Como se señaló en otra parte del presente documento, se cree que la naturaleza viable de las bacterias en la preparación probiótica descrita en el presente documento y que han demostrado ser eficaces en el tratamiento del IBS les permite establecerse más rápidamente en el tracto gastrointestinal de un paciente, quizá a

35 los 15 a 20 minutos de la ingestión. Se cree que dicho establecimiento rápido contribuye a los efectos beneficiosos de la preparación en el tratamiento del IBS.

Otra ventaja clave de la preparación probiótica descrita en el presente documento, y que ha demostrado ser útil en el tratamiento del IBS, es que las cepas probióticas son significativamente más estables a pH 3 que los productos probióticos de propiedad basados en leche o secados por congelación, y por lo tanto será más probablemente capaz de tolerar las duras condiciones que se encuentran en el tracto GI humano. En particular, se ha demostrado que las bacterias probióticas descritas en la preparación del presente documento son estables tanto a pH 6 como a pH 3. En realizaciones ejemplares las bacterias probióticas de la preparación probiótica son estables cuando se mantienen en cultivo a pH 3 durante un periodo de al menos 6 horas. En este contexto “estable” se considera que significa que

45 cuando las bacterias se cultivan a pH 3, 37 ⁰C, en un medio de cultivo convencional (por ejemplo, en caldo MRS) durante un periodo de al menos 6 horas, el recuento bacteriano (ufc/ml) no baja más de 0,5 log10 unidades por debajo del recuento bacteriano (ufc/ml) en el tiempo cero. En realizaciones específicas el recuento bacteriano debería mantenerse por encima de 106 ufc/ml durante al menos 6 horas cuando se cultiva a un pH 3, 37 ⁰C, en caldo MRS convencional. De hecho, puede observarse que el recuento bacteriano aumenta cuando se cultiva en estas condiciones.

Composición de la preparación probiótica

La preparación probiótica descrita en el presente documento y que ha demostrado ser clínicamente eficaz en el

55 tratamiento del IBS comprende bacterias probióticas metabólicamente activas viables en un sustrato líquido no lácteo. La función del sustrato es sustentar y mantener la viabilidad de las bacterias probiótica, particularmente durante el almacenamiento de la preparación, de manera que se puede mantener las bacterias probióticas, y luego suministrarse al paciente, en una forma viable, metabólicamente activa. Para conseguir este objetivo, el sustrato líquido contiene normalmente una mezcla de carbohidratos complejos y azúcares simples. En particular, el sustrato puede comprender una mezcla de polisacáridos, oligosacáridos, disacáridos y monosacáridos.

En ciertas realizaciones, la preparación probiótica se puede caracterizar por la relación de contenido total de carbohidratos respecto al contenido de azúcares reductores de la preparación, que refleja la mezcla compleja de polisacáridos, oligosacáridos, disacáridos y monosacáridos presentes. En realizaciones ejemplares, la relación de

65 contenido total de carbohidratos respecto al contenido de azucares reductores de la preparación está en el intervalo de desde 8:1 a 2:1, más típicamente en el intervalo de desde 5:1 a 2,5:1, o en el intervalo de desde 4:1 a 3:1. Los

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Tratamiento del IBS

Preferentemente, el tratamiento del Síndrome de Colon Irritable comprende la mejora de los síntomas asociados con la afección. Por lo tanto, el tratamiento del IBS puede incluir la mejora de uno o más de dolor estomacal, dolores

5 cólicos de estómago, diarrea, estreñimiento o hinchazón. El tratamiento de IBS incluye el tratamiento de ambas formas de la afección dominante en diarrea y dominante en estreñimiento. Como se demuestra en el presente documento, el tratamiento de los pacientes con IBS establecida, incluyendo los individuos con un diagnóstico de acuerdo con los criterios de Roma III en los que han fallado los tratamientos de primera y segunda línea, puede dar como resultado una mejoría significativa de la gravedad de los síntomas de IBS.

La dosificación precisa dependerá de muchos factores, no solo el mínimo de la gravedad de una afección del paciente individual. La dosis más apropiada puede determinarla un médico encargado y en general debería ser una dosis que dé como resultado un efecto beneficioso, por ejemplo, una mejora de los síntomas del IBS. Normalmente, la dosificación del producto Symprove™ que se prepara de acuerdo con los ejemplos podría ser de 1 ml/kg de peso

15 corporal por día o 50 ml por día para un paciente adulto. La frecuencia y la duración del tratamiento variarán de un paciente a otro. Un periodo de tratamiento típico es de 12 semanas, pero el periodo puede ser más largo o más corto. Normalmente, la frecuencia de dosificación será diariamente, aunque también se pueden utilizar otras frecuencias de dosificación.

En una realización, el Síndrome de Colon Irritable es un Síndrome de Colon Irritable clasificado por Roma III. En otra realización preferida, el paciente que necesita tratamiento es un paciente en el que han fallado los tratamientos de primera y segunda línea.

Para el tratamiento de pacientes humanos con IBS, la preparación probiótica se administra normalmente por vía

25 oral, por ejemplo, como una bebida. Si es conveniente, la preparación probiótica se puede incorporar a productos alimentarios o bebidas para consumo humano a condición de que no afecte la viabilidad de las bacterias en la preparación.

Para su uso en seres humanos, en el tratamiento de IBS, puede ser conveniente formular la preparación probiótica en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en una alícuota de dosis única de la preparación líquida que esté lista para beber.

La preparación probiótica que se va a utilizar en el tratamiento del IBS como se describe en el presente documento es una preparación basada normalmente en un líquido que ventajosamente no se seca por congelación.

35 Las preparaciones de bacterias secadas por congelación que se utilizan actualmente contienen normalmente pocas, si es que hay alguna, bacterias metabólicamente activas. Además, las preparaciones de bacterias secadas por congelación pierden algunas de sus características y actividad al rehidratarse. También, las bacterias reactivadas tienen una vida de almacenaje corta y se pueden mantener en almacenamiento solo durante un corto espacio tiempo. Las bacterias secadas por congelación a menudo no se re-hidratan para su uso en el animal huésped. Si se re-hidratan, entonces se tienen que utilizar el mismo día, de otra manera pueden tener una pérdida de viabilidad rápida y el deterioro por organismos contaminantes.

Un problema adicional con las preparaciones secadas por congelación anterior es que son higroscópicas (atraen el

45 polvo del aire) y por lo tanto se tiene que utilizar un paquete en unos pocos días de la apertura, de otra manera la hidratación parcial producirá una perdida rápida de viabilidad.

La preparación probiótica basada en un líquido que se proporciona en el presente documento para su uso en el tratamiento del IBS evita los problemas enumerados anteriormente asociados con el uso de cultivos bacterianos secados por congelación. Además, también se ha demostrado que los cultivos bacterianos basados en un líquido preparados como se describe en el presente documento son más robustos que las bacterias preparadas por los métodos conocidos en la técnica anterior, lo que posibilita que las bacterias se establezcan más rápidamente en los animales huéspedes y toleren el duro ambiente del tracto digestivo de los mamíferos.

55 Fabricación de la preparación probiótica

La preparación probiótica para su uso en el tratamiento del IBS como se describe en el presente documento, se puede preparar cultivando una o más cepas bacterianas probióticas en un sustrato de cultivo, tal como por ejemplo, un extracto de cebada germinada. El sustrato de cultivo puede prepararse comenzando con semillas de cebada o malteando la muestra utilizando el procedimiento de fabricación descrito posteriormente en el presente documento. Este método es sustancialmente como se describe en el documento WO 2006/035218.

El sustrato de cultivo se puede preparar de acuerdo con un método que comprende:

65 someter el cereal malteado a una etapa de macerado en el que el cereal malteado se mezcla con líquido acuoso y se somete a condiciones de tiempo y temperatura que limitan la extensión de conversión de carbohidratos

complejos en azúcares simples de manera que se obtiene una mezcla de carbohidratos complejos, azúcares simples, proteínas y péptidos; y separar la mezcla de carbohidratos complejos y azúcares sencillos, proteínas y péptidos del cereal malteado gastado para obtener un sustrato de cultivo

5 Las expresiones “cereal malteado” o “malta” como se utiliza en el presente documento se refiere al producto del procedimiento de malteado aplicado a los granos de cereal. El malteado es un procedimiento bien conocido en la técnica de la cerveza.

En un procedimiento típico de malteado los granos de cereal (por ejemplo, semillas de cebada o muestras de malteado) se germinan para inducir la movilización de los nutrientes almacenados. Las semillas germinadas producen varias enzimas para movilizar los almacenes de proteínas y carbohidratos, que incluyen α-amilasas que hidrolizan el almidón en maltosa. Un cereal ejemplar es la cebada, pero se pueden utilizar también otros cereales, tales como arroz, trigo, maíz y avena o incluso mezclas de los mismos. El proceso de germinación es bien conocido

15 en general. Se apreciará que el método puede llevarse a cabo proporcionando granos malteados o un sustrato sintético que comprenda una mezcla de carbohidratos, proteínas y enzimas.

Normalmente, los granos malteados se pasan por un rodillo antes de procesarlos adicionalmente. La rotura de los granos pasándolos por un rodillo facilita el acceso del agua y la extracción de nutrientes durante la etapa de macerado, mientras que evitando el aplastamiento de los granos ayuda a la separación posterior del sustrato de cultivo de los granos malteados gastados.

La malta preparada se somete a la etapa de macerado que se parece a la etapa de macerado utilizada en los métodos cerveceros (véase por ejemplo, Kunze, W. Technology Brewing and Malting (1996)). El término “macerado”

25 es bien conocido en el campo de la cerveza y se refiere a un procedimiento en el que los granos se agitan en presencia de agua calentada a temperaturas determinadas con el fin de preparar un mosto. Durante la etapa de macerado los carbohidratos de los granos malteados se rompen dando lugar a maltosa.

El método descrito en el presente documento también implica una etapa de maceración en la que los granos de cereal malteados se mezclan con un líquido acuoso (normalmente agua) y la mezcla se calienta a temperaturas determinadas. Esta etapa de maceración, sin embargo, no es conforme al procedimiento de macerado típico de los cerveceros. Los cerveceros tienen como objetivo convertir tanto carbohidrato en azucares simples como sea posible, para la posterior fermentación en alcohol. Por el contrario, las condiciones de la etapa de maceración descrita en el presente documento se escogen específicamente para limitar la extensión de la conversión en azúcares simples,

35 dejando cantidades significativas de carbohidratos en formas más complejas oligoméricas y poliméricas.

La extensión de la conversión del carbohidrato se puede limitar de manera que la cantidad de azúcares reductores presentes en el sustrato de cultivo resultante, expresado como un porcentaje (p/p) del contenido total de carbohidratos esté en el intervalo de desde un 10 % (p/p) a un 50 % (p/p). Como se ha señalado anteriormente, el contenido de azucares reductores medido por el método de Nelson-Somogyi es una buena aproximación de la cantidad total de azucares simples presentes.

El límite de conversión deseado de azucares complejos en simples se puede conseguir aumentado la temperatura de la etapa de maceración durante un corto periodo de tiempo, normalmente 30 minutos, sin permitir que la mezcla

45 de granos malteados/agua repose a temperaturas intermedias. Los procesos de cerveceros tradicionales incluyen un reposo a 60-65 ⁰C y 70-74 ⁰C, ya que esto permite que las enzimas produzcan altas concentraciones de azúcares simples (principalmente maltosa). En consecuencia, la etapa de macerado descrita en el presente documento no comprende reposos a temperaturas en el intervalo de desde 60 ⁰C a 65 ⁰C y/o a temperaturas en el intervalo de desde 70 ⁰C a 74 ⁰C.

La etapa de maceración puede comprender mezclar el cereal malteado con agua a una temperatura en el intervalo de desde 30 ⁰C a 45 ⁰C, el reposo de la mezcla durante 1 a 2 horas, aumento de la temperatura a una temperatura en el intervalo de desde 75 ⁰C a 85 ⁰C durante un periodo de tiempo de desde 20 a 60 minutos, preferentemente 30 minutos, y después reposo de la muestra a una temperatura en el intervalo de desde 75 ⁰C a 85 ⁰C durante un

55 periodo de tiempo en el intervalo de desde 30 a 90 minutos. A la temperatura más alta, cualquiera de las enzimas presentes en la mezcla se inactiva y se pueden extraer los nutrientes. Las temperaturas más altas en el intervalo de desde 76 ⁰C a 80 ⁰C y específicamente 78 ⁰C se prefieren en general. La temperatura en esta etapa tiene que ser lo suficientemente alta durante un periodo lo suficientemente largo para inactivar todas las enzimas presentes en la preparación. Se apreciará que la temperatura precisa y los tiempos que se utilizan pueden variar de alguna manera de acuerdo con el tipo de cereal que se utilice.

El procedimiento descrito en el presente documento limita específicamente la cantidad de conversión de azúcares complejos en azúcares simples. Además, el reposo inicial a una temperatura en el intervalo de 30 ⁰C a 45 ⁰C proporciona una ventaja adicional ya que maximiza la liberación de aminoácidos y péptidos. Las temperaturas hacia 65 el extremo más alto de este intervalo, es decir, desde 40 ⁰C a 45 ⁰C o específicamente aproximadamente 45 ⁰C se prefieren en general. El fin de esta etapa es hidrolizar las proteínas almacenadas presentes en los granos de

cereales en aminoácidos y péptidos disponibles. La combinación óptima de tiempo y temperatura para conseguir la hidrólisis deseada puede variar de alguna manera dependiendo del tipo de granos utilizado.

La presencia de altas concentraciones de proteínas, péptidos y aminoácidos es deseable en un sustrato de cultivo

5 que se va a utilizar para sustentar el crecimiento de microorganismos ya que proporciona una fuente útil de nitrógeno. Los procedimientos de macerado típicos que se utilizan en la fabricación de cerveza tradicional no incluirían en general un reposo a una temperatura en este intervalo, ya que los cerveceros normalmente no buscan conseguir un alto contenido en proteínas o aminoácidos en un mosto que se pretende para la fermentación para producir alcohol.

Cuando se completa la etapa de maceración, por ejemplo, cuando se han extraído todos los nutrientes deseados de los ahora granos malteados “gastados”, la mezcla resultante que comprende carbohidratos complejos y azucares simples, proteínas y péptidos se puede separar de los granos gastados para obtener un sustrato de cultivo utilizando medios adecuados. Normalmente, esto implica la filtración grosera, por ejemplo utilizando un filtro de 1 mm tal como

15 una cesta de hilo trenzado, dando lugar a una solución que contiene partículas gruesas. Una característica del procedimiento descrito en el presente documento es que el sustrato de cultivo no se clarifica, lo que sería en general el caso de del mosto preparado durante la fabricación de cerveza tradicional. En la fabricación de cerveza tradicional el mosto se clarifica en general para retirar todas las partículas groseras, produciendo de esta manera un líquido claro.

La presencia de alguna materia particulada en un sustrato de cultivo que se prepara de acuerdo con el procedimiento descrito en el presente documento es ventajosa con respecto al uso posterior en el sustento del crecimiento de bacterias ya que proporciona tanto nutrientes de liberación lenta como superficies particuladas para la adhesión de los cultivos bacterianos.

25 Si fuera necesario, el sustrato de cultivo que se prepara de acuerdo con el procedimiento descrito en el presente documento se puede esterilizar antes de su uso posterior. Como se apreciará esto se puede llevar a cabo cociendo durante una hora o por autoclave a 120 ⁰C durante aproximadamente 20 minutos.

Se puede añadir un tampón o varios componentes tampón al sustrato de cultivo si es necesario. Los tampones preferidos son tampones de citrato tri-sódico, o fosfato. Si el sustrato de cultivo se va a esterilizar, el tampón(es) se puede añadir antes, durante o después de la esterilización como sea conveniente.

El sustrato de cultivo preparado se inocula con las cepas bacterianas probióticas deseadas y se cultivaron hasta que

35 alcanzaron el recuento bacteriano deseado necesario para la preparación probiótica. En una realización específica, las bacterias probióticas se cultivan en el sustrato de cultivo hasta que alcanzan una concentración de entre 1 x 106 y 1 x 109 unidades formadoras de colonias por mililitro. En este punto el cultivo (o la fermentación) se puede enfriar hasta aproximadamente 4 ⁰C y la combinación de temperatura, pH, fase de crecimiento y composición de sustrato residual proporciona las condiciones de equilibrio que permiten el mantenimiento de un estado de crecimiento cerca del equilibrio durante el almacenamiento a largo plazo. En este estado cercano al equilibrio, que se puede mantener durante un periodo de al menos 5-6 meses, se mantiene la población de bacterias probióticas metabólicamente activas, normalmente en un intervalo de 106 a 109 células viables por mililitro. Se apreciará que el número preciso de células viables en un estado cercano al equilibrio puede variar de alguna manera dependiendo de las especies de bacterias probióticas utilizadas. Normalmente, que el recuento bacteriano (ufc/ml) sea “estable” significa que no

45 varían más de 1 unidad de log10, o más preferentemente más de 0,5 unidades log10, cuando el producto se almacena a 4 ⁰C durante 5 meses y/o cuando se almacenan a 25 ⁰C durante 4 meses.

El método de fabricación implica una etapa de cultivo en el que las bacterias probióticas se cultivan en un sustrato de cultivo hasta que alcanzan una concentración que hace posible que se consiga la condición cercana al equilibrio durante el almacenamiento posterior. Una característica importante del método es que el sustrato que se utiliza proporciona un suministro equilibrado de nutrientes que contiene una mezcla de carbohidratos complejos y azúcares simples donde una alta proporción del contenido de carbohidratos está en forma de carbohidratos complejos que se pueden utilizar como fuente de energía por las bacterias probióticas. Esta mezcla ayuda a limitar la energía disponible inmediata durante la etapa de cultivo. La composición y las características preferidas del sustrato de

55 cultivo es/son preferentemente como se ha descrito anteriormente. El sustrato de cultivo se prepara preferentemente de granos de cereales malteados utilizando el método de fabricación descrito en el presente documento, y es normalmente un extracto de cebada germinada. Se apreciará, sin embargo, que no es estrictamente necesario utilizar un sustrato de cultivo preparado de acuerdo con este método. Se pueden conseguir resultados similares utilizando un sustrato de cultivo preparado sintéticamente mezclando las proporciones necesarias de carbohidratos complejos y azúcares simples, proteínas y péptidos.

La etapa de cultivo se debe llevar a cabo de tal manera que se tenga cuidado de no cultivar bacterias durante mucho tiempo, para evitar la producción de condiciones acidas que inhibirían de otra manera el crecimiento posterior así como limitaría el periodo de almacenamiento de la preparación resultante. Por otra parte, si la etapa de cultivo se 65 termina prematuramente, esto limitará la producción de biomasa. El pH de la preparación durante el cultivo de las bacterias probióticas se puede utilizar como un indicador del estado cercano al equilibrio. En una realización típica,

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partida es un exceso de 106 células viables por mililitro.

La invención se entenderá adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos experimentales no limitantes:

5 Ejemplo 1. Producción de un sustrato de cultivo, utilizando un medio basado en cebada

(A) Germinación (malteado)

Día 1

La cebada (semillas o granos de una muestra malteada) se empaparon con agua durante 2 a 24 horas, dependiendo del lote del grano. Se puede incluir en el agua un 0,1 % (p/v) de hipoclorito sódico (lejía) para inhibir el crecimiento de contaminantes durante la fase de germinación. Después de 4 horas, el agua se drena de los granos y se dejan los granos en reposo a temperatura ambiente de 10 a 30 ⁰C durante aproximadamente 1 día.

15 Día 2

Los granos se empapan en agua limpia durante otro periodo de 4 horas. Se puede añadir al agua peróxido de hidrógeno (un 0,1 % p/v) para este y los remojos posteriores. El peróxido de hidrógeno proporciona oxígeno a los granos geminados, y actúa como un desinfectante. De manera alternativa, se puede utilizar hipoclorito sódico. Después de 4 horas, se drena el agua de los granos y se dejan los granos en reposo durante aproximadamente 1 día. El agitado ocasional (por ejemplo, cada 4 horas) de los granos puede mejorar la germinación aumentando el intercambio gaseoso, proporcionando oxígeno y retirando el dióxido de carbono.

25 Día 3 en adelante

El ciclo de empapado, drenaje y reposo se continúa hasta que las raicillas que emergen de los granos en germinación tiene 2 a 4 mm de longitud. Este estado de crecimiento indicaba que los granos habían producido enzimas para la movilización de nutrientes almacenados. Estas enzimas son centrales para la producción posterior del medio de cultivo, durante el ‘macerado’. Se podría permitir una modificación más extensa de los granos, dejando la fase de germinación hasta que las raicillas tienen varios milímetros de longitud. Sin embargo demasiado crecimiento simplemente convertirá los nutrientes en raíces y brotes vegetales, que no se pueden utilizar en la fermentación.

35 (B) Paso del rodillo

Cuando los granos habían germinado suficientemente, se molieron con una moledora de rodillo. El molido se ajustó de manera que los granos se abran por rotura pero no se destruyan ni se aplanen completamente. La rotura de los granos permite el acceso del agua y la extracción de nutrientes durante el macerado, mientras que evitando la destrucción de los granos ayuda en las etapas de filtración.

(C) Preparación de un sustrato de cultivo

Los granos geminados molidos, se mezclaron con agua suficiente para cubrirlos, a 45 ⁰C, y se dejó la mezcla a 45 45 ⁰C durante 1 hora.

Después de 1 hora a 45 ⁰C, la temperatura se aumentó hasta 78 ⁰C durante un periodo de 30 minutos.

Se permitió que la muestra reposara a 78 ⁰C durante 1 hora. Después del reposo a 78 ⁰C, los granos gastados se separaron por filtración. Se utilizó un filtro relativamente grueso (por ejemplo, una cesta de hilo trenzado de 1 mm de hueco) dando lugar a una solución que contenía cantidades significativas de sólidos suspendidos. Los granos gastados se desecharon y el líquido se trató entonces por calor para pasteurizarlo o esterilizarlo. En este experimento particular el líquido se coció durante 45 minutos. Se añadió entonces un tampón (un 0,5 % (p/v) de citrato tri-sódico) y la mezcla se coció durante 15 minutos adicionales para dar lugar al sustrato de cultivo final.

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Ejemplo 2: Análisis del sustrato de cultivo

(a) Análisis de carbohidratos:

El contenido total de carbohidratos se determinó utilizando el ensayo de ácido sulfúrico-fenol, con glucosa como referencia convencional (Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A. y Smith, F. (1956) Analytical Chemistry, vol. 28., p. 350).

Los azúcares reductores se determinaron utilizando el método de Nelson-Somogyi, de nuevo con glucosa como

65 referencia convencional (Somogyi, M. (1952) Journal of Biological Chemistry., vol. 195., p. 19). Ambos azúcares complejos y simples tienen extremos reductores, pero los azúcares simples tienen un número mayor de extremos

reductores por unidad de masa. Por lo tanto, mientras que el método de Nelson-Somogyi detecta azúcares complejos, la señal es tan baja que es insignificante. El método de Nelson-Somogyi da por lo tanto una buena aproximación del nivel de azucares simples en una muestra.

5 Resultados:

Los azúcares totales en el sustrato están en el intervalo de 20 a 40 mg/ml (miligramos por mililitro)

Los azúcares reductores están en el intervalo de 5 a 20 mg/ml.

(b) Análisis de proteínas y péptidos:

La proteína total se determinó utilizando dos ensayos, con albúmina sérica bovina como referencia convencional:

15 (i) El reactivo Biuret (Itzhaki, R. F y Gill, D. M. (1964) Analytical Biochemistry, Vol. 9., p. 401-410.

(ii) El método Lowry, modificado por Ohnishi y Barr. (Ohnishi, S. T. y Barr, J. K. (1978) Journal of Biological Chemistry, Vol. 193, p. 265).

Los péptidos con peso molecular por encima de 5000 daltons se determinaron utilizando el reactivo de Bradford (Bradford, M. M. (1976) Analytical Biochemistry, Vol. 72, p. 248-254).

Resultados:

La proteína total y los péptidos están en el intervalo de 1 a 2 miligramos por mililitro.

25 Los péptidos de alto peso molecular (mayores de 5000 daltons) están en el intervalo de 100 a 300 microgramos por mililitro.

Ejemplo 3: Producción de un cultivo bacteriano metabólicamente activo

(A) Fermentación

El sustrato de cultivo preparado de acuerdo con el ejemplo 1 se enfrió a 37 ⁰C y se añadieron los cultivos bacterianos. Ejemplos de un inóculo adecuado son bacterias secadas por congelación o cultivos de partida líquidos

35 (normalmente un 1 % (v/v) de un cultivo de una noche en caldo de nutrientes).

En este ejemplo se cultivaron las siguientes bacterias en dos matraces:

(i): Enterococcus faecium, Lactobacillus plantarum;

(ii): Una cepa de Lactobacillus casei que ahora se ha re-clasificado como Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus.

Se llevó a cabo la fermentación durante 16-20 horas, hasta que el pH alcanzó 4,5 +/-0,3 unidades. La mezcla de fermentación se enfrió a 4 ⁰C y se sometió a técnicas convencionales para evaluar la calidad (para determinar la

45 pureza y el recuento de las bacterias).

En este punto, se puede añadir sorbato potásico estéril (un 0,005 % p/v de concentración final) al caldo fermentado. Esto actúa para inhibir el crecimiento de cualquier hongo o levadura que pueda aparecer debido a contaminación durante el manejo por el usuario final. También se puede añadir vitamina C (un 0,01 % p/v de concentración final) como antioxidante.

A continuación de los ensayos para asegurar la calidad, se pueden mezclar diferentes lotes para dar los productos con mezclas complejas de especies bacterianas, si fuera necesario.

55 En el ejemplo que se presenta aquí, la mezcla de dos lotes de bacterias daba lugar a un producto final que contenía las bacterias Enterococcus faecium, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus y la cepa de Lactobacillus casei que se ha re-clasificado ahora como Lactobacillus rhamnosus.

Los lotes de este producto final contienen normalmente 2,3 g de carbohidratos por 100 ml, de los cuales 0,7 g son azúcares y 1,6 g son de almidón. El recuento bacteriano en el producto final es normalmente menor de 1,0 x 105 de

L. acidophilus y normalmente al menos 1,0 x 107 de cada uno de L. plantarum, E. faecium y la cepa de Lactobacillus casei que ahora se ha re-clasificado como Lactobacillus rhamnosus.

Los lotes del producto final se ensayaron en cuanto a la presencia utilizando el ensayo ELISA de Gliadina y se

65 determinó que contenían menos de 15 ppm de gluten, y más habitualmente menos de 10 ppm de gluten, satisfaciendo la definición del Codex Alimentarius de libre de gluten.

El producto Symprove™ descrito en el presente documento está disponible en el mercado en Multigerm UK Enterprises Ltd.

Ejemplo 4: Efectos beneficiosos de la preparación en el tratamiento del Síndrome de Colon Irritable

5 Un estudio de 186 pacientes con IBS clasificado como Roma III, demostraba que un producto preparado de acuerdo con el ejemplo 3 (al que se hace referencia en el presente documento como Symprove™, disponible en el mercado en Multigerm UK Enterprises Ltd.), que comprende una mezcla de Enterococcus faecium, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum y una cepa de Lactobacillus casei que ahora se ha re-clasificado como Lactobacillus rhamnosus, puede mejorar incluso los síntomas de IBS más graves.

Este ensayo estaba controlado por placebo, aleatorizado, con ocultación doble en un único centro que implicaba el tratamiento con Symprove™ (1 ml/kg de peso corporal) frente a un placebo durante 3 meses. Los pacientes se reclutaron de dos grandes GP prácticos de Londres y de las referencias de los GP al Departamento del King’s 15 College Hospital, Londres. En todos los pacientes habían fallado los tratamientos de primera y segunda línea convencionales para los GP. Se exploraron 391 pacientes iniciales para el ensayo y 186 eran elegibles y consintieron al ensayo (cumplían los criterios de ROMA III, exclusión de enfermedad orgánica por extensa investigación incluyendo permeabilidad intestinal, calprotectina fecal, endoscopia, endoscopia de cápsula sin cables, colonoscopia y radiología cuando estaba indicada). Utilizando un protocolo de aleatorización por computadora de dos estadios, simple no estratificado (el generador de números pseudo-aleatorio tornado Mersenne) 124 recibieron el tratamiento activo y 62 el placebo. La medición del resultado principal era la reducción de la valoración de gravedad de síntomas de IBS (IBS-SSS) a los 3 meses. Todos los pacientes eran sintomáticos con una IBS-SSS >

150.

25 No había diferencias significativas entre los dos grupos de tratamiento con respecto a los detalles demográficos (relación masculino/femenino, edad media, duración de la enfermedad o tratamientos previos). No había diferencias significativas (p > 0,1) en las valoraciones IBS-SSS pre-tratamiento entre los pacientes tratados con el activo 303 ± 68 de la media ± SD) y el placebo (306 ± 80) (p = 0,841). Durante la última semana de tratamiento (la semana 12) había una mejora mayor estadísticamente significativa (p < 0,027) en la media de IBS-SSS (230 ± 109) en los pacientes tratados con Symprove™ en comparación con el placebo 270 ± 103). El número de salidas durante el estudio no se diferenciaba significativamente entre los 2 grupos y no fueron evidentes eventos adversos graves.

Los datos recopilados de este estudio dirigido por investigadores con doble ocultación utilizando un comparador enmascarado, demuestra una mejoría estadísticamente significativa en la gravedad de los síntomas de IBS (pre

35 ensayo frente a las dos últimas semanas de tratamiento; medida por el índice de gravedad de síntomas de IBS) con el producto preparado de acuerdo con el ejemplo 3 (al que se hace referencia en el presente documento como Symprove™) cuando se comparaba con el placebo (p = 0,012). El estudio era más robusto que la mayoría de otros estudios de probióticos en IBS, e implicaba un periodo de tratamiento de 3 meses en pacientes con IBS en los que habían fallado los tratamientos de primera y segunda línea y en los que los síntomas eran suficientemente graves para que los GP los refirieran al hospital. Esos pacientes constituyen el tope del 1 % de gravedad de síntomas.

El éxito de este ensayo indica que la patología subyacente del IBS – cualquiera que sea su naturaleza exacta – se afrontó por tratamiento con el producto del ejemplo 3.

45 Ejemplo 5: Comparación del producto del ejemplo 3 con otros probióticos a pH fisiológico

Se compararon un producto probiótico secado por congelación multi-cepa de propiedad (al que se hace referencia en el presente documento como MS-FD), un producto probiótico basado en leche de una única cepa (al que se hace referencia en el presente documento como SS-MB) y el producto final del ejemplo 3 (identificado en el presente documento como Symprove™, un probiótico de múltiples cepas que contiene células bacterianas metabólicamente activas, viables), inoculando un caldo MRS de pH conocido mantenido a 37 ⁰C con cada producto de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Se colocaron en placas entonces alícuotas de cada uno en gel de agar cada 30 minutos durante 6 horas, se incubaron y se llevó a cabo el recuento de las ufc.

55 A un pH 6 ambos probióticos de múltiples cepas alcanzaban recuentos de ufc estables, el MS-FD alcanzaba el pico a 2,2 x 106 y el Symprove™ alcanzaba 1,1 x 109 ufc sobre las seis horas, el probiótico de una única cepa (SS-MB) daba lugar a un recuento más bajo con como mucho 2,4 x 106 ufc detectable sobre las 6 horas. A un pH 3 tanto MS-FD como SS-MB presentaban un rápido descenso de los recuentos de ufc en cada punto de datos sucesivo de 30 minutos, ambos cayeron por debajo de las 1000 ufc a las 6 horas. El producto Symprove™ mantenía recuentos de ufc estables por encima de 106 en todos los puntos de datos con un aumento de las ufc que se volvía aparente después de 4 horas y alcanzaba 4,8 x 107 a las seis horas. Los resultados se representan en las figuras 1 y 2.

En este modelo, el producto Symprove™ era el único probiótico que demostraba la capacidad de suministrar recuentos de ufc consistentes inmediatamente después, y durante seis horas a continuación de la inoculación a dos

65 niveles de pH fisiológicos. En este experimento, el producto Symprove™ suministraba el recuento final de ufc más alto tanto a pH 3 como a pH 6.

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Claims

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