ES2655687T3 - Composiciones terapéuticas para el tratamiento de enfermedades causadas por HPV - Google Patents

Composiciones terapéuticas para el tratamiento de enfermedades causadas por HPV Download PDF

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Juan José LASARTE SAGASTIBELZA
Cristina Mansilla Puerta
Jesús María PRIETO VALTUEÑA
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Abstract

La invención se relaciona con conjugados inmunogénicos que comprenden una región inmunogénica de la proteína E7 del virus del papiloma humano y la región EDA de fibronectina, así como a composiciones que comprende dichos conjugados y células dendríticas obtenidas mediante estimulación con dichos conjugados y composiciones. Asimismo la invención se relaciona con métodos para el tratamiento de enfermedades causadas por HPV mediante el uso de dichos conjugados, composiciones y células dendríticas.

Description

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5
10
15
20
25
30
CAQ16108, CAQ16107, CAQ16106, CAQ16105, CAQ16104, CAQ16103, CAQ16102, CAQ16101, CAQ16100 ), E7 del serotipo HPV humano 94 (GenBank: CAF05710), E7 del serotipo HPV humano 95 (GenBank: CAF05703), E7 del serotipo HPV humano 43 (GenBank: CAF05784), E7 del serotipo HPV humano 5b (GenBank: BAA42818), E7 del serotipo HPV humano 103 (GenBank: YP_656493), E7 del serotipo HPV humano 101 (GenBank: AAZ39507), E7 del serotipo HPV humano 103 (GenBank: AAZ39485).
La expresión “péptido antigénico”, tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula de naturaleza peptídica que comprende uno o más epítopos capaces de estimular el sistema inmune de un organismo para generar una respuesta humoral o celular específica del antígeno. Como resultado de la puesta en contacto del péptido antigénico con las células apropiadas en un sujeto, el antígeno genera un estado de sensibilidad o capacidad de respuesta inmune en dicho sujeto de forma que tanto anticuerpos como células inmunes obtenidas a partir de dicho sujeto son capaces de reaccionar de forma específica con el antígeno.
La expresión “péptido antigénico derivado de la proteína E7 de HPV”, tal como se utiliza en el presente documento, se entiende como un fragmento de la proteína E7 de HPV que es capaz de estimular el sistema inmunitario de un mamífero de forma que se genere una respuesta inmune frente a dicha proteína capaz de inhibir el crecimiento de tumores ocasionados por la expresión de E7 o de inhibir la proliferación de HPV.
Se apreciará que el antígeno o los antígenos puede(n) ser la proteína E7 completa, así como dominios aislados de dicha proteína, fragmentos peptídicos de la proteína E7 o proteínas de fusión poliepitópicas que comprenden múltiples epítopos (por ejemplo desde 5 hasta 100 epítopos diferentes). El polipéptido puede incluir opcionalmente segmentos adicionales, por ejemplo, puede incluir al menos 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 90 o incluso 100
o más segmentos, siendo cada uno una parte de la proteína E7 que se produce de manera natural de un agente patógeno y/o de un antígeno tumoral que se produce de manera natural que puede ser el mismo o diferente de la(s) proteína(s) de las que se deriva(n) los otros segmentos. Cada uno de estos segmentos puede tener al menos 8 aminoácidos de longitud, y cada uno contiene al menos un epítopo (preferiblemente dos o más) diferente de los epítopos de los otros segmentos. Al menos uno (preferiblemente al menos dos o tres) de los segmentos en el polipéptido híbrido puede contener, por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7 o incluso 10 o más epítopos, particularmente epítopos de unión a MHC de clase I o de clase II. Dos, tres o más de los segmentos pueden ser contiguos en el polipéptido híbrido, es decir, pueden estar unidos extremo con extremo, sin espaciador entre ellos. Alternativamente, dos segmentos adyacentes cualesquiera pueden estar unidos por un aminoácido espaciador o un péptido espaciador.
Ejemplos de péptidos antigénicos derivados de E7 HPV se encuentran en la tabla I.
Tabla I
Secuencia
SEQ ID NO Secuencia SEQ ID NO
HEYMLDLQPETTDLY
2 KDYILDLQPETTDLH 27
TLRLCVQSTHVDIRT
3 LRTLQQMLLGTLQVV 28
IRTLEDLLMGTLGIV
4 LQQMLLGTLQVVCPG 29
LEDLLMGTLGIVCPI
5 QMLLGTLQVVCPGCA 30
DLLMGTLGIVCPICS
6 VPTLQDVVLELTPQT 31
KATLQDIVLHLEPQN
7 LQDVVLELTPQTEID 32
IDGVNHQHLPARRAE
8 QDVVLELTPQTEIDL 33
LRAFQQLFLNTLSFV
9 CKFVVQLDIQSTKED 34
FQQLFLNTLSFVCPW
10 VVQLDIQSTKEDLRV 35
QDYVLDLQPEATDLH
11 TLHEYMLDL 36
DIRILQELLMGSFGI
12 YMLDLQPET 37
IRILQELLMGSFGIV
13 MLDLQPETT 38
ELLMGSFGIVCPNCS
14 QAEPDRAHYNI 39
KEYVLDLYPEPTDLY
15 QAEPDRAHYNIVTFCCKCD 40
LRTIQQLLMGTVNIV
16 QAEPDRAHYNIVTF 41
7
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35
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la invención. En principio, cualquier promotor puede ser utilizado para las construcciones génicas de la presente invención siempre que dicho promotor sea compatible con las células en las que se desea expresar el polinucleótido. Así, promotores adecuados para la realización de la presente invención incluyen, sin estar necesariamente limitados, promotores constitutivos tales como los derivados de los genomas de virus eucariotas tales como el virus del polioma, adenovirus, SV40, CMV, virus del sarcoma aviar, virus de la hepatitis B, el promotor del gen de la metalotioneina, el promotor del gen de la timidina kinasa del virus del herpes simplex, regiones LTR de los retrovirus, el promotor del gen de la inmunoglobuina, el promotor del gen de la actina, el promotor del gen EF-1alpha así como promotores inducibles en los que la expresión de la proteína depende de la adición de una molécula o de una señal exógena, tales como el sistema tetraciclina, el sistema NFκB/luz UV, el sistema Cre/Lox y el promotor de los genes de choque térmico, los promotores regulables de la ARN polimerasa II descritos en WO/2006/135436 así como promotores específicos de tejido.
Otros ejemplos de promotores que son específicos de tejido incluyen el promotor del gen de la albúmina (Miyatake et al., 1997, J. Virol, 71:5124-32), el promotor central del virus de la hepatitis (Sandig et al, 1996, Gene Ther., 3:1002-9); el promotor del gen de la fetoproteína alfa (Arbuthnot et al., 1996, Hum.GeneTher., 7:1503-14), y el promotor del gen de la proteína de unión a la globulina que une tiroxina (Wang, L., et al., 1997, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:11563-11566). Preferiblemente, las construcciones de la invención contienen promotores específicos de células dendrítocas tales como el promotor CD11c (Masood, R., et al. 2001. Int J MoI Med 8:335-343; Somia, N.V., et al. 1995. Proc Acad Sci USA 92:7570-7574), el promotor de fascina (Sudowe, S., et al., 2006. J Allergy Clin Immunol. 117:196-203), el promotor del gen CD83, el promotor del gen CD36 o el promotor de Dectina-2 (Gene Ther., 2001, 8:1729-1737).
Las polinucleótidos de la invención o las construcciones génicas que las constituyen pueden estar formando parte de un vector. Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un vector que comprende un polinucleótido o una construcción génica de la invención. El experto en la materia apreciará que no existe limitación en cuanto al tipo de vector que puede ser utilizado ya que dicho vector puede ser un vector de clonaje adecuado para la propagación y para obtener los polinucleótidos o construcciones génicas adecuadas o vectores de expresión en distintos organismos heterólogos adecuados para la purificación de los conjugados. Así, vectores adecuados de acuerdo a la presente invención incluyen vectores de expresión en procariotas tales como pUC18, pUC19, Bluescript y sus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, CoIEl, pCRl , RP4, fagos y vectores “shuttle” tales como pSA3 and pAT28, vectores de expresión en levaduras tales como vectores del tipo de plásmidos de 2 micras, plásmidos de integración, vectores YEP, plásmidos centroméricos y similares, vectores de expresión en células de insectos tales como los vectores de la serie pAC y de la serie pVL, vectores de expresión en plantas tales como vectores de la serie pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE y similares y vectores de expresión en células eucariotas superiores bien basados en vectores virales (adenovirus, virus asociados a los adenovirus así como retrovirus y lentivirus) así como vectores no virales tales como pSilencer 4.1-CMV (Ambion), pcDNA3, pcDNA3.1/hyg pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl, pZeoSV2, pCI, pSVL and pKSV-10, pBPV-1, pML2d y pTDTl.
El vector de la invención puede ser utilizado para transformar, transfectar o infectar células susceptibles de ser transformadas, transfectadas o infectadas por dicho vector. Dichas células pueden ser procariotas o eucariotas. A modo de ejemplo, el vector donde se introduce dicha secuencia de ADN puede ser un plásmido o un vector que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra en el genoma de dicha célula y se replica junto con el cromosoma (o cromosomas) en el que (o en los que) se ha integrado. La obtención de dicho vector puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia (Sambrook et al., 2001, “Molecular cloning, a Laboratory Manual”, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. Vol 1-3 a).
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una célula que comprende un polinucleótidos, una construcción génica o un vector de la invención, para lo cual dicha célula ha podido ser transformada, transfectada o infectada con una construcción o vector proporcionado por esta invención. Células transformadas, transfectadas o infectadas pueden ser obtenidas por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia (Sambrok et al., 2001, citado supra). En una realización particular, dicha célula hospedadora es una célula animal transfectada o infectada con un vector apropiado.
Células hospedadoras adecuadas para la expresión de los conjugados de la invención incluyen, células de mamíferos, plantas, insectos, de hongos y de bacterias. Células bacterianas incluyen, células de bacterias Gram positivas tales como especies del género Bacillus, Streptomyces y Staphylococcus y células de bacterias Gram negativas tales como células del género Escherichia y Pseudomonas. Células de hongos incluyen, preferiblemente, células de levaduras tales como Saccharomyces, Pichia pastoris y Hansenula polymorpha. Células de insectos incluyen, sin limitación, células de Drosophila y células Sf9. Células de plantas incluyen, entre otros, células de plantas de cultivos tales como cereales, plantas medicinales, ornamentales o de bulbos. Células de mamíferos adecuadas para en la presente invención incluyen líneas celulares epiteliales (porcinas, etc.), líneas celulares de osteosarcoma (humanas, etc.), líneas celulares de neuroblastoma (humanas, etc.), carcinomas epiteliales (humanos, etc.), células gliales (murinas, etc.), líneas celulares hepáticas (de mono, etc.). células CHO (Chinese Hamster Ovary), células COS, células BHK, células HeLa, 911, AT1080, A549, 293 o PER.C6, celulas ECCs humana NTERA-2, células D3 de la línea de mESCs, células troncales embrionarias humanas tales como HS293 y BGV01, SHEF1, SHEF2 y HS181, células NIH3T3, 293T, REH y MCF-7 y células hMSCs.
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25
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35
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Composiciones inmunogénicas de la invención
Los inventores han observado que la combinación del conjugado de la invención y de un agonista de receptores de tipo toll (TLR) permitía generar una respuesta inmune superior a la obtenida cuando cada uno de dichos componentes se administraba por separado. Así, según se observa en el ejemplo 3, las composiciones formadas por la proteína de fusión EDA-HPVE7 y poliI:C son capaces de erradicar tumores que no son tratables cuando se administra únicamente la proteína de fusión.
Así, en otro aspecto la invención se relaciona con una composición (en adelante composición primera de la invención o primera composición de la invención) que comprende, en conjunto o por separado:
(i)
un conjugado de la invención, un polinucleótido o construcción génica de la invención, un vector de la invención, una célula hospedadora según la invención y
(ii)
un ligando de TLR.
Las concentraciones molares de los componentes que forman parte de la primera composición de la invención, pueden variar, pero preferentemente incluyen ratios de los dos componentes entre 50:1 y 1:50, mas preferiblemente entre 20:1 y 1:20, entre 1:10 y 10:1, entre 5:1 y 1:5.
El primer componente i) de la composición ha sido descrito en detalle en el contexto del péptido de la invención. En una realización particular preferida, dicho primer componente comprende la región EDA de fibronectina de origen humano. En otra forma de realización, el primer componente de la composición de la invención comprende los aminoácidos 1 a 29 de la proteína E7 y/o los aminoácidos 43 a 98 de la proteína E7. En una realización aún más preferida, el primer componente del conjugado que forma parte de la composición de la invención comprende la región EDA flanqueada por dos péptidos antigénicos de HPV E7, tal y como se describe en SEQ ID NO: 53 (que comprende adicionalmente una cola de 6 histidinas) o en SEQ ID NO: 72.
En la presente invención se entiende por “ligando del receptor TLR” a una molécula que se une específicamente a al menos uno de los receptores TLR (receptor toll like) y que al unirse es capaz de estimular algunas de las señales de co-estimulación características de la unión de dicho receptor con su ligando natural u otras señales que resultan de la unión de dicho receptor con un agonista de TLR.
Los receptores tipo Toll (o Toll-like receptor, TLRs) son una familia de proteínas transmembrana de tipo I que forman parte del sistema inmunitario innato. En los vertebrados también posibilitan la adaptación del sistema inmune. Los TLR junto con los receptores de interleuquina forman una superfamilia conocida como Interleukina-1/toll-like receptor. Todos los miembros de esta familia tienen en común el dominio llamado Toll-IL-1 receptor (TIL).
Se ha estimado que la mayoría de los mamíferos poseen entre 10 y 15 tipos de TLRs. En humanos y ratones se han identificado hasta el momento 13 tipos de TLRs (Du X, et al. 2000, Eur.Cytokine Netw. 11: 362–71; Chuang TH. et al, 2000. Eur. Cytokine Netw. 11: 372–378; Tabeta K, et al; 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:3516–3521).
Los ligandos de TLR inducen diversas respuestas inmunes dependiendo de la células donde el TLR esté expresada así como dependiendo del origen del ligando del TLR. Por ejemplo, en el caso de ligandos de origen microbiano, las células inmunes pueden producir citoquinas que van a provocar inflamación. En el caso de un factor viral, las células pueden sufrir apoptosis.
En una realización particular, los ligandos son ligandos agonistas. Los ligandos agonistas de los receptores TLR son
(i) los ligandos naturales del propio receptor TLR, o una variante funcionalmente equivalente del mismo que conserve la capacidad de unirse al receptor TLR e inducir señales de coestímulo sobre él, o (ii) un anticuerpo agonista frente al receptor TLR, o una variante funcionalmente equivalente del mismo capaz de unirse específicamente al receptor TLR y, más particularmente, al dominio extracelular de dicho receptor, e inducir algunas de las señales inmunes controladas por este receptor y proteínas asociadas. La especificidad de unión puede ser para el receptor TLR humano o para un receptor TLR homólogo al humano de una especie diferente.
Ejemplos de ligandos de los distintos TLR se encuentran esquematizados en la Tabla 2.
TLR (Nº)
Ligando
TLR 1
Multiples Lipopéptidos de triacilo.
TLR 2
Multiple glicopéptidos, lipopéptidos y lipoproteínas. Acido lipotechoic, HSP70, zymosano de las células anfitrionas.
TLR 3
ARN de doble cadena, poli I:C (ácido polinosinico-policitidilico o ácido de la sal de sodio de polinosinico-policitidilico)
TLR 4
Lipopolisacáridos (bacterias gram negativas), diferentes proteínas heat shock(bacterias y células anfitrionas), fibrinogeno de las células anfitrionas, fragmentos de heparan sulfato de las células
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de una vez cada 2, 4, 8 o 30 días. Alternativamente, es posible administrar una dosis inicial seguida de una o varias dosis de mantenimiento, generalmente de menos cantidad que la dosis inicial. El régimen de mantenimiento puede implicar tratar al paciente con dosis que oscilan entre 0,01 µg y 1,4 mg/kg de peso corporal por día, por ejemplo 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001, o 0,00001 mg por kg de peso corporal por día. Las dosis de mantenimiento se administran, preferiblemente, como mucho una vez cada 5, 10 ó 30 días. El tratamiento se debe continuar durante un tiempo que variará según el tipo de alteración que sufra el paciente, su severidad y el estado del paciente. Tras el tratamiento, se debe monitorizar la evolución del paciente para determinar si se debe incrementar la dosis en caso de que la enfermedad no responda al tratamiento o se disminuye la dosis si se observa una mejora de la enfermedad o si se observan efectos secundarios indeseados.
En una realización particular, los componentes de las composiciones de la invención pueden ser administrados de forma simultánea, secuencial o separada. En una forma preferida de realización, se administra el agente quimioterapéutico (preferiblemente la ciclofosfamida) en primer lugar y posteriormente tras un periodo de tiempo variable, se administran el resto de componentes de las composiciones de la invención, es decir, conjugado, polinucleótido, construcción génica, vector o célula hospedadora según la invención y el ligando de TLR. La administración del conjugado, polinucleótido, construcción génica, vector o célula hospedadora y del TLR puede llevarse a cabo de forma simultanea, separada o secuencial. En una forma preferida de realización, el ligando de TLR (preferiblemente pI:C o CpG-B/DOTAP) y el conjugado, polinucleótido, construcción génica, vector o célula hospedadora de la invención (preferiblemente la proteína de fusión) se administran simultáneamente. En el caso de las composiciones de la invención que comprenden un agente quimioterapeútico y, en concreto, ciclofosfamida (CPA), en una forma preferida de realización, la CPA se utiliza a una concentración subóptima, denominada "dosis metronómica", que es capaz de matar selectivamente a las células Treg (Ghiringhelli et al., Cancer Immunol. Immunother.2007, 56:641-8).
Las composiciones de la invención pueden administrarse en forma de una única dosis, o alternativamente, como una primera dosis y una o más dosis de recuerdo. Así, en una forma preferida de realización, las composiciones de la invención se administran en una primera dosis y en una segunda dosis de recuerdo. En el caso de que las composiciones de la invención se administren de forma separada en el tiempo, se entiende que se administra, a lo largo del tiempo, una primera dosis del primer componente de la invención, una segunda dosis del segundo componente de la invención, una dosis de recuerdo del primer componente de la invención, una dosis de recuerdo del segundo componente de la invención y así sucesivamente. En una forma de realización aún más preferida, la terapia incluye una primera administración en donde se administra el agente quimioterapéutico (preferiblemente la ciclofosfamida), una segunda administración en donde se administra, conjuntamente, el conjugado, polinucleótido, construcción génica, vector o célula hospedadora según la invención y el ligando de TLR; una tercera administración que incluye el agente quimioterapéutico (preferiblemente la ciclofosfamida) y una cuarta administración en donde se administra de nuevo el conjugado, polinucleótido, construcción génica, vector o célula hospedadora conjuntamente con el ligando de TLR (preferiblemente pI:C o CpG-B/DOTAP). En la segunda y cuarta administración, el ligando de TLR (preferiblemente pI:C o CpG-B/DOTAP) y el conjugado, polinucleótido, construcción génica, vector o célula hospedadora de la invención (preferiblemente la proteína de fusión) se administran de forma simultánea, separada o secuencial.
En una forma preferida de realización, el ligando de TLR (preferiblemente pI:C o CpG-B/DOTAP) y el conjugado, polinucleótido, construcción génica, vector o célula hospedadora de la invención (preferiblemente la proteína de fusión) se administran simultáneamente.
La dosis diaria se puede administrar en una única dosis o en dos o más dosis según las circunstancias particulares. Si se desea una administración repetida o administraciones frecuentes, es aconsejable la implantación de un dispositivo de administración tal como una bomba, un catéter semipermanente (intravenoso, intraperitoneal, intracisternal o intracapsular) o un reservorio.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un conjugado de la invención, un polinucleótido de la invención, una construcción génica de la invención, un vector de la invención, una célula de la invención, una composición de la invención o una composición farmacéutica de la invención para la fabricación de una vacuna. Dicho de otro modo, la invención se relaciona con un conjugado de la invención, un polinucleótido de la invención, una construcción génica de la invención, un vector de la invención, una célula de la invención, una composición de la invención o composición farmacéutica de la invención para su uso como vacuna.
Por “vacuna” se entiende un preparado de antígenos que una vez dentro del organismo provoca una respuesta de ataque, denominada anticuerpo. Esta respuesta genera memoria inmunológica produciendo, en la mayoría de los casos, inmunidad permanente.
La vacuna se administra de manera sistémica o local. La administración de la vacuna puede realizarse mediante administración única, o con refuerzo mediante múltiples administraciones tal y como se ha descrito anteriormente para la administración de las composiciones de la invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un conjugado de la invención, un polinucleótido de la invención, una construcción génica de la invención, un vector de la invención, una célula de la invención, una
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Los productos bacterianos y virales, así como las citoquinas inflamatorias y otras moléculas propias, inducen la maduración de las células dendríticas mediante interacción directa con los receptores de superficie de las células dendríticas innatas. Los linfocitos T, a través de vías dependientes e independientes de CD40, y las células endoteliales, contribuyen a la maduración final de las células dendríticas mediante contacto directo célula a célula y mediante secreción de citoquinas. Poco tiempo después de que surja una señal de peligro, se modifican la eficiencia de la captura de antígenos, el transporte intracelular y la degradación, y el tráfico intracelular de moléculas MHC. Se incrementa la carga de péptidos, así como la vida media y el traslado a la superficie celular de las moléculas MHC. También aumenta la expresión en superficie de las moléculas co-estimuladoras de células T. De este modo, las células dendríticas se convierten en las APC más potentes, y las únicas capaces de activar a los linfocitos T no activados e iniciar la respuesta inmunológica. Junto a la modificación de sus capacidades en la presentación de antígenos, la maduración induce también la migración masiva de células dendríticas fuera de los tejidos periféricos. Las modificaciones en la expresión de receptores de quimioquinas y moléculas de adhesión, así como los importantes cambios en la organización del citoesqueleto, contribuyen a la migración de las células dendríticas a través de la linfa hasta los órganos linfáticos secundarios.
Las células dendríticas responden a dos tipos de señales: al reconocimiento directo de patógenos (mediante receptores con patrón de reconocimiento específico) y al reconocimiento indirecto de la infección (mediante citoquinas inflamatorias, compuestos celulares internos y respuestas inmunitarias específicas). En respuesta a estas señales, las células dendríticas se activan e inician su proceso de maduración, que las transforma en estimuladores eficientes de células T. Una de las señales más eficientes para la maduración de las DC está mediada por las interacciones de los receptores tipo peaje (“toll-like receptors”), TLR, (TLR1-9) con sus respectivos ligandos (revisado por Kaisho y Akira, Biochimica et Biophysica Acta, 2002, 1589: 1-13).
Las células dendríticas inmaduras utilizadas en la presente invención pueden ser células de cultivos primarios. Así, las células dendríticas utilizadas en el método de la invención pueden ser de origen autológo o heterólogo.
El término “autólogo” tal como se usa en el presente documento significa que las células provienen del mismo individuo.
El término “heterólogo” tal como se usa en el presente documento significa que las células provienen de un individuo diferente.
Las células dendríticas pueden ser generadas in vitro a partir de células mononucleares de la sangre periférica (PBMCs) usando un protocolo que básicamente consistiría en sembrar las células PBMCs en una botella de cultivo de manera que se permita la adhesión de dichas células. Tras ello las células serían tratadas con interleuquina 4 (IL4) y factor estimulador de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) que lleva consigo la diferenciación de las células a células inmaduras dendríticas (iDCs) en aproximadamente una semana. Opcionalmente, las células pueden ser maduradas tratándolas con factor de necrosis tumoral alfa (TNFα).
Las células dendríticas se pueden obtener usando métodos estándar a partir de las fuentes adecuadas. Estos tejidos adecuados para el aislamiento de células dendríticas incluyen la sangre periférica, la médula espinal, células que infiltran tumores, células que infiltran tejidos peritumorales, biopsias de nódulos linfáticos, timo, bazo, piel, sangre del cordón umbilical, monocitos obtenidos de la sangre periférica, células positivas para CD34 o CD14 obtenidas de la sangre periférica, así como cualquier otro tejido o fluido adecuado.
Opcionalmente, se pueden utilizar cultivos celulares estables. En el documento WO9630030 se describen métodos para conseguir hibridomas de células de tipo dendrítico/célula tumoral y pluralidades de híbridos de célula de tipo dendrítico/célula tumoral. Estos híbridos e hibridomas son generados por la fusión de células tumorales con células de tipo dendrítico. Por ejemplo, se pueden fusionar células tumorales inmortales de una línea celular tumoral autóloga con células de tipo dendrítico alogénicas emparejadas con HLA autólogas. Las líneas de células tumorales autólogas se pueden obtener de tumores primarios y de sus metástasis. Alternativamente, se pueden fusionar células de tipo dendrítico inmortales de una línea celular de tipo dendrítico emparejada con HLA alogénica o autóloga con células tumorales autólogas. En el documento WO/2002/048167 también se describen métodos para generar líneas estables de células dendríticas. Otra linea celular que se puede utilizar es la CB1 (Paglia P. et al 1993. Journal of Experimental Medicine, Vol 178, 1893-1901).
Una primera etapa del método de la invención consiste en poner en contacto células dendríticas con un conjugado de la invención, un polinucleótido de la invención, un vector de la invención, una construcción génica de la invención, una célula de la invención, una composición de la invención o una composición farmacéutica de la invención en condiciones adecuadas para que tenga lugar la maduración de las células dendríticas.
La invención contempla cualquier posible forma de poner en contacto las células dendríticas con un conjugado de la invención, un polinucleótido de la invención, un vector de la invención, una construcción génica de la invención, una célula de la invención, una composición de la invención o una composición farmacéutica de la invención. El experto en la materia apreciará que, dependiendo del tipo de compuesto, la puesta en contacto se lleva a cabo de forma distinta. Así, en el caso de que se trate del conjugado de la invención o un péptido de la invención, estos pueden ser directamente añadidos al medio de cultivo en el que se encuentren las células o pueden ser unidos a una superficie
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ventajoso el uso de vacunas en donde al menos algunos de los alelos de HLA Clase I en la células dendríticas de la invención (especialmente en el locus A y más particularmente en el alelo A2) sean compartidos con el paciente. De esta manera al menos algunos de los antígenos tumorales serán presentados en moléculas de clase I autólogas, con lo que la respuesta antitumoral se verá aumentada y la respuesta anti-alotípica disminuida.
Una coincidencia parcial puede ser obtenida usando una vacuna con DCs hecha con células que posean dos o más de los alotipos HLA-A más comunes (HLA-A2, A1, A19, A3, A9, and A24). Una coincidencia total para la mayoría de los pacientes puede ser conseguida proporcionando al médico una batería de DCs diferentes de donde se puede seleccionar diferentes posibilidades que posean solo un alotipo en el locus HLA-A. El tratamiento llevará consigo la identificación de uno o más alotipo(s) HLA en el paciente usando métodos estándar de “tissue–taping”, y el tratamiento de los pacientes con las DCs que tengan el o los alotipos HLA que coincidan con los del paciente. Por ejemplo un paciente que sea HLA-A2 y HLA-A19 puede ser tratado o con células homocigóticas para HLA-A2 o para HLA-A19 o con una mezcla de ambas.
Efectos negativos potenciales de la falta de coincidencia de HLA puede también ser tratado generando inmunotolerancia contra los alotipos extraños. Durante la preparación de la vacuna las células DCs se dividen en dos grupos: una para generar células inmaduras toleragénicas y otras para general DCs maduras para la presentación del antígeno. Las células toleragénicas están diseñadas de manera que generen una aceptación de las células maduras. Las células toleragénicas van a ser administradas una o más veces al paciente de manera que se genere un grado suficiente de ausencia de respuesta inmune (medida por ejemplo en una reacción de linfocitos mixta). Una vez que el paciente es tolerante (tras una semana o un mes) se administra al sujeto las células maduras presentadoras de antígeno en la cantidad y en la frecuencia que sea necesaria para una respuesta inmune contra el antígeno diana tumoral.
En una realización particular, las células dendríticas presentadoras de antígeno de la invención son autólogas al sujeto a ser tratado. La composición de la vacuna puede incluir un adyuvante. El adyuvante puede ser cualquier adyuvante disponible o una combinación de estos. Ejemplos de adyuvantes se han citado en el apartado de usos médicos de los conjugados y composiciones de la invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de células dendríticas de la invención para la fabricación de un medicamento para la prevención y el tratamiento de una infección causada por el virus del papiloma humano y/o del cáncer de cérvix asociado a infecciones por HPV. Alternativamente, la invención se refiere a células dendríticas de la invención para su uso en la prevención y el tratamiento de una infección causada por el virus del papiloma humano y/o del cáncer de cérvix asociado a infecciones por HPV. Por último, la invención se relaciona con un método de tratamiento de una infección causada por el virus del papiloma humano y/o del cáncer de cérvix asociado a infecciones por HPV en un sujeto que comprende la administración a dicho sujeto de células dendríticas de acuerdo a la invención.
La invención se describe a continuación mediante los siguientes ejemplos que deben ser considerados como meramente ilustrativos.
Ejemplos
Materiales y procedimientos
Ratones y líneas celulares
Se adquirieron ratones C57BL/6 hembra de 5 semanas de edad exentos de patógenos específicos en Harlan Laboratories (Barcelona, España) y se mantuvieron en las instalaciones para animales del CIMA en condiciones exentas de patógenos con agua y alimento a voluntad. Se realizaron los experimentos que implican animales según las directrices internacionales para cuidado animal.
Se usaron células THP1 (American Type Culture Collection ATCC, Manassas, VA) para ensayos in vitro de activación monocítica por proteínas de fusión derivadas de EDA. Las TC-1, células tumorales que expresan proteínas HPV16-E6 y HPV16-E7 derivadas de células epiteliales pulmonares primarias de ratón, se obtuvieron en la American Type Culture Collection (LGC Promochem, Molsheim, Francia). Se mantuvieron las células en RPMI 1640 con GlutaMAX suplementado con suero fetal de ternera termoinactivado al 10%, 100 unidades/ml de penicilina, estreptomicina 100 µg/ml, geneticina 0,4 mg/ml y 2-mercaptoetanol 5 x 10-5 mol/l (Life Technologies, Cergy-Pontoise, Francia). Se inyectaron 5 x 105 células TC-1 en el lomo afectado (lado izquierdo) de ratones C57BL/6 en 200 µl de PBS. Se midió el tamaño tumoral, presentado como la media de dos diámetros perpendiculares (milímetros) a intervalos regulares. Las células tumorales EL-4 (timoma de ratón) se obtuvieron en la American Type Culture Collection (LGC Promochem, Molsheim, Francia) y se utilizaron como células diana en ensayos de citotoxicidad (incubadas con o sin péptidos DTc) y como control tumoral negativo ya que no expresan ninguna proteína del HPV.
Reactivos
Se adquirió el péptido sintético E749-57 [RAHYNIVTF (SEQ ID NO: 67) código de una letra para aminoácidos]
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