ES2655840T3 - Receptores olfativos implicados en la percepción de ácidos carboxílicos del sudor y uso de los mismos - Google Patents

Abstract

Método para identificar un agente que puede contrarrestar el mal olor a sudor que comprende identificar un agente que modula la función de uno o más receptores olfativos (OR) seleccionado del grupo que consiste en: OR52L1, OR52E8, OR52B2, OR52E1, OR52A5 y OR56A5 que comprende las etapas de: a) poner en contacto los 6 de dichos OR con uno o más ácidos carboxílicos presente(s) en el sudor humano seleccionado(s) del grupo que consiste en: ácido butanoico, ácido isovalérico, ácido pentanoico, ácido hexanoico, ácido 2-metilhexanoico, ácido 3-metilhexanoico, ácido (E)-3-metil-2-hexenoico, ácido 3-hidroxi- 3-metilhexanoico, ácido heptanoico, ácido 2-metilheptanoico, ácido octanoico, ácido 4-etiloctanoico, ácido nonanoico, ácido decanoico, ácido undecanoico y ácido benzoico, en presencia y en ausencia de dicho agente en condiciones que permiten la unión de dicho(s) ácido(s) carboxílico(s) a dichos OR o que permiten la activación de dichos OR mediante dicho(s) ácido(s) carboxílico(s), b) comparar la unión de los 6 de dichos uno o más OR con dichos uno o más ácidos carboxílicos, o la actividad de dichos OR, en presencia y en ausencia de dicho agente, en el que una diferencia en la unión o actividad en presencia de dicho agente, con respecto a la unión o actividad en ausencia del agente, identifica al agente como un agente que modula la función de dichos uno o más OR en respuesta a dichos uno o más ácidos carboxílicos.

Description

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presentan un olor acre y se conoce que ambos son factores contribuyentes importantes al mal olor axilar (Zeng et al. 1991; J. Chem. Ecolog. Vol. 17 págs. 1469-1492; Gautschi et al., 2007, Chimia, Vol. 61 págs. 27-32). El ácido isovalérico, otro ácido carboxílico de cadena corta, se ha identificado como la principal molécula responsable del olor a queso característico liberado por pies sudorosos (Ara et al. 2006. Can. J. Microbiol. Vol. 52 págs. 357-364). Los ácidos no se producen directamente por las glándulas apocrinas. Aparecen en forma de conjugados de glutamina y se liberan bajo la acción de enzimas de bacterias cutáneas. Por tanto, la abundancia de varios compuestos que producen mal olor puede variar de un individuo a otro, dependiendo de la composición de su flora bacteriana.

Tabla 1: Ácidos carboxílicos que contribuyen al mal olor del sudor

Molécula

Referencias Descriptor del olor

ácido acético

1, 2, 3 intenso, acre, agrio, vinagre

ácido propanoico

2, 3 acre, ácido, queso, vinagre

ácido butanoico

1, 2, 3 intenso, acético, queso, mantequilla, afrutado

ácido isovalérico

2, 3 agrio, apestoso, pies, sudor, queso, tropical

ácido pentanoico

3 nauseabundo, pútrido, ácido, sudor, rancio

ácido hexanoico

2, 3, 4, 5 agrio, graso, sudor, queso

ácido 2-metilhexanoico

4 ácido, animales, miel, almizcle, dulce

ácido 3-metilhexanoico

4 sudor, butírico

ácido (E)-3-metil-2-hexenoico

4, 6 ácido, sudor, afrutado, graso, ládano, heno, sopa

ácido 3-hidroxi-3-metilhexanoico

6 acre, sudor

ácido heptanoico

4, 5 rancio, agrio, queso, sudor

ácido 2-metilheptanoico

4 agrio-afrutado, dulce, ligeramente graso-aceitoso

ácido octanoico

2, 3, 4, 5 graso, ceroso, rancio, aceitoso, vegetal, queso

ácido 4-etiloctanoico

4, 6 costo, graso, grasiento

ácido nonanoico

4 ceroso, sucio, queso, producto lácteo cultivado

ácido decanoico

3, 4 ácido, hierro caliente, metálico, ceroso, jabonoso, metal, vela

ácido undecanoico

5 ceroso, cremoso, queso, graso, coco

ácido benzoico

2 dulce; benzoína; polvo

ácido fenilacético

6 dulce, miel animal

1. Yamazaki et al. (2010) Anti-Aging Medicine. 7(6): 60-652. 2. Gallagher et al. (2008) Br. J. Dermatol. 159(4) : 780-7913. 3. Ara et al. (2006) Can. J. Microbiol. 52 : 357-3644. 4. Zeng et al. (1991) J. Chem. Ecol. 17(7): 146914925. 5. Labows et al. (1999) Antiperspirants and Deodorants, 2ª edición ed K. Laden, Cosmetic Science and Technogy Series Vol. 20 Marcel Dekker Inc, Nueva York, 59-826. 6. Natsch et al (2006) Chem. & Biodiv. 3 : 1-20

Se han desarrollado diferentes estrategias para contrarrestar los malos olores del sudor. Las más convencionales consisten en vencer al mal olor con una fragancia agradable. En un enfoque más sofisticado, la fragancia está diseñada para combinarse bien con el mal olor y desplazar la percepción hacia un carácter más agradable. En este caso, no se necesita que la fragancia sea un odorizante fuerte en sí misma.

Una manera alternativa para reducir el mal olor consiste en limitar la producción de moléculas odorizantes. Esto puede lograrse o bien limitando la población de bacterias cutáneas con agentes bacteriostáticos o bien bloqueando las enzimas responsables de la liberación de compuestos que producen mal olor.

También puede considerarse el desarrollo de antagonistas y/o bloqueantes que bloquearán específicamente los receptores para una molécula que produce mal olor. Un bloqueante ideal no tendrá ningún olor en sí mismo, no afectará al buqué y por tanto dará una total libertad creativa a los perfumistas.

La solicitud de patente PCT WO2012/029922 da a conocer un método para buscar un agente de control de malos olores, que usa la respuesta de un receptor olfativo como medida, en el que dichos receptores olfativos se seleccionan de OR51E1, OR2W1, OR10A6, OR5112 y OR51L1. Sin embargo, estos receptores no son totalmente específicos de sustancias que producen mal olor tales como los ácidos carboxílicos presentes en el sudor humano.

En la presente invención se ha descubierto sorprendentemente que siete receptores olfativos que pertenecen a la clase 1 de OR se activan mediante ácidos carboxílicos presentes en el sudor humano.

Este descubrimiento inesperado permite la identificación de compuestos, lo cual es de interés para las empresas perfumistas y fabricantes de sabores. De hecho, se sabe que los ligandos naturales identificados de estos siete receptores olfativos son constituyentes importantes del mal olor del sudor. La identificación y el uso de bloqueantes

o antagonistas de estos receptores olfativos en una composición de fragancia con el fin de modificar la percepción del mal olor del sudor representan un concepto original que puede abrir una nueva posibilidad para el desarrollo de desodorantes.

Sumario de la invención

El alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

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Según la presente divulgación, cuando se usan métodos de unión el ácido carboxílico puede marcarse de manera detectable. En dichos métodos, el ácido carboxílico puede marcarse de manera detectable con un resto seleccionado del grupo que consiste en un radioisótopo, un fluoróforo y un agente de extinción de la fluorescencia.

En una realización de uno cualquiera de los métodos anteriores, la puesta en contacto se realiza en o sobre una célula que expresa dicho polipéptido de OR. Según la presente divulgación, dicha célula puede ser, pero no se limita a, células de riñón embrionario humanas (Hek293), células de hámster chino (CHO), células de mono (COS), células olfativas primarias, células de Xenopus, células de insecto, levaduras o bacterias.

En otra realización de uno cualquiera de los métodos anteriores, la puesta en contacto se realiza en o sobre liposomas sintéticos (véase Tajib et al., 2000, Nature Biotechnology 18: 649-654, que se incorpora en el presente documento como referencia) o membranas en gemación inducidas por virus que contienen un polipéptido de OR (véase el documento WO0102551, 2001, incorporado en el presente documento como referencia).

En otra realización de uno cualquiera de los métodos anteriores, el método se realiza usando una fracción de membrana de células que expresan dicho polipéptido de OR.

En una realización preferida de uno cualquiera de los métodos anteriores, el método se realiza sobre un chip de proteína.

En otra realización preferida de uno cualquiera de los métodos anteriores, la medición se realiza usando un método seleccionado de desplazamiento de marcador, resonancia de plasmón superficial, transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, extinción de fluorescencia y polarización de fluorescencia.

En otra realización de uno cualquiera de los métodos anteriores, el agente se selecciona del grupo que consiste en un péptido, un polipéptido, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, un lípido, un hidrato de carbono, un ácido nucleico y una molécula orgánica pequeña.

Según la presente divulgación, cuando se usa un ensayo funcional, la etapa de medir una actividad de señalización de los OR definidos en el presente documento puede comprender detectar un cambio en el nivel de un segundo mensajero.

En otra realización, la etapa de medir una actividad de señalización comprende la medición de unión/acoplamiento o intercambio de nucleótido de guanina, actividad adenilato ciclasa, cAMP, actividad proteína cinasa C, actividad proteína cinasa A descomposición de fosfatidilinositol, diacilglicerol, trifosfato de inositol, calcio intracelular, flujo de calcio, ácido araquidónico, actividad MAP cinasa, actividad tirosina cinasa, ensayo de melanóforos, ensayo de inicialización de receptores o expresión de gen indicador. Cuando se mide la unión/acoplamiento o intercambio de proteína G, de todas las subunidades G posibles, preferiblemente se estudian los comportamientos de la subunidad alfa-olf (olfativa) de proteína G de proteína de unión a GTP, también G-olf. La secuencia de la subunidad G-olf humana se ha depositado anteriormente en el Genebank con el número de registro L10665. Sin embargo, pueden usarse y estudiarse subunidades G-olf de otras especies.

En una realización preferida, la medición de la actividad de señalización comprende usar un ensayo de fluorescencia

o luminiscencia. Los ensayos de fluorescencia y luminiscencia pueden comprender el uso de fluoróforos sensibles a Ca2+ incluyendo fluo3, Fluo4 o Fura, (Molecular probes); familia de Ca3-kit (Molecular Device) y aequorina. Además, dichos ensayos pueden aplicar un lector fluorométrico o luminiscente automatizado tal como FDSS (Hammamatsu) o FLIPR (Molecular Device).

La divulgación abarca además un método de modulación de la actividad de un OR definido en el presente documento en una célula, comprendiendo dicho método la etapa de administrar a dicha célula, un ácido carboxílico

o agente que modula la actividad de un polipéptido de OR, de manera que se modula la actividad del OR.

En otra realización de uno cualquiera de los métodos anteriores, el método es un método de examen de alto rendimiento.

En otra realización de uno cualquiera de los métodos anteriores, el agente es parte de una biblioteca química o extractos de órganos de animales.

Según la presente divulgación, el agente identificado o detectado mediante cualquiera de los métodos anteriores, o la composición que comprende dicho agente, puede usarse para contrarrestar el mal olor a sudor. Alternativamente, estos pueden usarse para la preparación de bloqueantes de odorizantes o antagonistas de odorizantes. Por ejemplo, puede usarse un bloqueante o antagonista de OR como desodorante. Puede añadirse un bloqueante o antagonista de OR a una formulación de fragancia o de perfume ya usada como desodorante para reforzar su eficacia.

La presente divulgación también abarca una composición que comprende un polipéptido de OR aislado y un ácido carboxílico. En una realización preferida, dicha composición abarca los 7 OR identificados en el presente documento, o cualquier combinación de los mismos de 2, 3, 4, 5 ó 6 receptores. Preferiblemente, dicho grupo de 6 OR consiste en: OR52L1, OR52E8, OR52B2, OR52E1, OR52A5 y OR56A5.

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Tal como se usan en el presente documento, los términos “cambio”, “diferencia”, “disminución” o “aumento” aplicados, por ejemplo, a la unión o actividad de señalización o cantidad de una sustancia se refieren a un aumento

o disminución de al menos el 10% en la unión, actividad de señalización o por ejemplo, nivel de ARNm, polipéptido o ligando con respecto a un patrón en un ensayo dado.

Tal como se usa en el presente documento, el término “condiciones que permiten la unión de ácido carboxílico a un OR definido en el presente documento” se refiere a condiciones, por ejemplo, de temperatura, concentración de sal, pH y concentración de proteína en las que el OR se une a un ácido carboxílico. Las condiciones de unión exactas variarán dependiendo de la naturaleza del ensayo, por ejemplo, si el ensayo usa células viables o sólo una fracción de membrana de células. Sin embargo, dado que los OR definidos en el presente documento son proteínas de superficie celular, las condiciones favorecidas incluirán generalmente sal fisiológica (90 mM) y pH (de aproximadamente 7,0 a 8,0). Las temperaturas para la unión pueden variar entre 15ºC y 37ºC, pero estarán preferiblemente entre temperatura ambiente y aproximadamente 30ºC. La concentración de ácido carboxílico en una reacción de unión también variará entre aproximadamente 0,5 y 2 M, pero será preferiblemente de aproximadamente 1 M.

Tal como se usa en el presente documento, el término “muestra” se refiere a la fuente de moléculas que están sometiéndose a prueba para determinar la presencia de un agente o compuesto modulador que modula la unión a, actividad de señalización de, un OR definido en el presente documento. Una muestra puede ser una muestra del entorno, un extracto natural de células o tejidos animales, vegetales, de levaduras o bacterianos, una muestra clínica, una muestra sintética o un medio acondicionado para células recombinantes o de un procedimiento de fermentación.

Tal como se usa en el presente documento, un “tejido” es un agregado de células que realiza una función particular en un organismo. El término “tejido” tal como se usa en el presente documento se refiere a material celular de una región fisiológica particular. Las células en un tejido particular pueden comprender varios tipos de células diferentes. Un ejemplo no limitativo de esto sería el tejido cerebral que comprende además neuronas y células de la glía, así como células endoteliales capilares y células sanguíneas, todas contenidas en una muestra o sección de tejido dada. Además de tejidos sólidos, también se pretende que el término “tejido” abarque tejidos no sólidos, tales como la sangre.

Tal como se usa en el presente documento, el término “fracción de membrana” se refiere a una preparación de membranas lipídicas celulares que contienen un OR definido en el presente documento. Tal como se usa el término en el presente documento, una “fracción de membrana” es distinto de un homogeneizado celular, ya que se ha retirado al menos una parte (es decir, al menos el 10%, y preferiblemente más) de constituyentes celulares no asociados con membrana. El término “asociado con membrana” se refiere a los constituyentes celulares que o bien están integrados en una membrana lipídica o bien están físicamente asociados con un componente que está integrado en una membrana lipídica.

Tal como se usa en el presente documento, el término “ensayo de segundo mensajero” comprende preferiblemente la medición de unión o intercambio de nucleótido de guanina, adenilato ciclasa, cAMP intracelular, fosfato de inositol intracelular, concentración de diacilglicerol intracelular, concentración de ácido araquidónico, MAP cinasa(s) o tirosina cinasa(s), actividad proteína cinasa C o expresión de gen indicador o un ensayo basado en aequorina según métodos conocidos en la técnica y definidos en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, el término “segundo mensajero” se refiere a una molécula, generada o cuya concentración se hace que varíe mediante la activación de un receptor acoplado a proteína G que participa en la transducción de una señal de ese GPCR. Los ejemplos no limitativos de segundos mensajeros incluyen cAMP, diacilglicerol, trifosfato de inositol, liberación de ácido araquidónico, trifosfato de inositol y calcio intracelular. El término “cambio en el nivel de un segundo mensajero” se refiere a un aumento o disminución de al menos el 10% en el nivel detectado de un segundo mensajero dado con respecto a la cantidad detectada en un ensayo realizado en ausencia de un modulador candidato.

Tal como se usa en el presente documento, el término “ensayo basado en aequorina” se refiere a un ensayo para determinar la actividad de GPCR que mide el flujo de calcio intracelular inducido por GPCR activados, en el que el flujo de calcio intracelular se mide mediante la luminiscencia de aequorina expresada en la célula.

Tal como se usa en el presente documento, el término “unión” se refiere a la asociación física de una molécula (por ejemplo, un ligando tal como un ácido carboxílico o un anticuerpo) con un receptor (por ejemplo, OR definido en el presente documento). Tal como se usa el término en el presente documento, la unión es “específica” si se produce con una CE50 o una Kd de 1 mM menos, generalmente en el intervalo de 1 mM a 10 nM. Por ejemplo, la unión es específica si la CE50 o Kd es de 1 mM, 500 M, 100 M, 10 M, 9,5 M, 9 M, 8,5 M, 8 M, 7,5 M, 7 M, 6,5 M, 6 M, 5,5 M, 5 M, 4,5 M, 4 M, 3,5 M, 3 M, 2,5 M, 2 M, 1,5 M, 1 M, 750 nM, 500 nM, 250 nM o 100 nM o menos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “CE50” se refiere a la concentración de un compuesto a la que una actividad dada, incluyendo unión de un ácido carboxílico u otro ligando y una actividad funcional de un OR, es el

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interacción de OR y ácidos carboxílicos.

A. Polipéptidos de OR.

Los ensayos que usan la interacción de polipéptidos de OR y ácidos carboxílicos requieren una fuente de polipéptidos de OR. La secuencia de polinucleótido y polipéptido de OR humanos se presentan en el presente documento en la figura 1. Las secuencias de polinucleótido de OR52L1, OR52E8, OR52B2, OR51I2, OR52E1, OR52A5 y OR56A5 humanos también están disponibles en GenBank, n.os de registro NM_001005173 (SEQ ID NO: 1), NM_001005168 (SEQ ID NO: 3), NM_001004052 (SEQ ID NO: 5), NM_001004754 (SEQ ID NO: 7), NG_033197 (SEQ ID NO: 9), NM_001005160(SEQ ID NO: 11), NM_001146033 (SEQ ID NO: 13), respectivamente. Las secuencias de polipéptido también están registradas con los n.os de registro Q8NGH7 (SEQ ID NO: 2), Q6IFG1 (SEQ ID NO: 4), Q96RD2 (SEQ ID NO: 6), Q9H344 (SEQ ID NO: 8), Q8NGJ3 (SEQ ID NO: 10), Q9H2C5 (SEQ ID NO: 12), y P0C7T3 (SEQ ID NO: 14) respectivamente en la base de datos Uniprot.

Un experto en la técnica puede amplificar fácilmente una secuencia de OR a partir de una muestra que contiene ARNm que codifica para la proteína mediante técnicas básicas de PCR y clonación molecular usando cebadores o sondas diseñados a partir de las secuencias conocidas. Además, dado que los genes de OR son genes sin intrones, un experto en la técnica puede amplificar una secuencia de OR a partir de ADN genómico.

La expresión de polipéptidos recombinantes se conoce bien en la técnica. Los expertos en la técnica pueden seleccionar fácilmente vectores y secuencias de control de la expresión para la expresión de polipéptidos de OR definidos en el presente documento en células eucariotas o procariotas. Los polipéptidos de OR están preferiblemente asociados con la membrana celular o liposomas sintéticos con el fin de tener función de señalización

o unión. En la técnica se conocen métodos para la preparación de fracciones de membrana celular, por ejemplo, el método notificado por Hubbard & Cohn, 1975, J. Cell Biol. 64: 461-479, que se incorpora en el presente documento como referencia. Con el fin de producir membranas que comprenden polipéptidos de OR, puede aplicarse por ejemplo tales técnicas de aislamiento de membrana a células que expresan de manera endógena o recombinante uno de los polipéptidos de OR definidos en el presente documento. Alternativamente, pueden integrarse polipéptidos de OR en preparaciones de membrana mediante dilución de disolución de detergente del polipéptido (véase, por ejemplo, Salamon et al., 1996, Biophys. J. 71:283-294, que se incorpora en el presente documento como referencia).

B.

Ácidos carboxílicos presentes en sudor.

La estructura de tales ácidos carboxílicos la conoce bien un experto. Además, el experto en la técnica puede derivar fácilmente ácidos equivalentes a partir de dicha estructura y puede someter a prueba fácilmente si dichos equivalentes pueden unirse a y/o modular los polipéptidos de OR. Pueden aislarse ácidos carboxílicos de muestras naturales o sintetizarse químicamente.

Los métodos que pueden usarse para cuantificar dichos ácidos pueden ser, pero no se limitan a, a) para la extracción y purificación: extracción con disolvente, extracción con aceite, extracción con vapor, extracción con CO2 supercrítico, cromatografía de líquidos, destilación, cromatografía de gases; b) para la cuantificación: cromatografía de gases, cromatografía de líquidos y espectrometría de masas. Dichos métodos se conocen bien en la técnica.

Pueden usarse ácidos carboxílicos en forma purificada o usarse como composiciones. Las cantidades del ácido necesarias en un ensayo de unión o funcional dado variarán dependiendo del ensayo, pero usarán generalmente de 1 M a 1000 M de ácido marcado y de 10 M a 10 mM de ácido sin marcar por ensayo. Si es necesario para un ensayo dado, un ácido carboxílico puede marcarse mediante la incorporación o adición de marcadores radiactivos tal como se indicó anteriormente.

C. Ensayos para identificar moduladores de la actividad de OR

El descubrimiento de que los ácidos carboxílicos son ligandos de siete OR que pertenecen a la familia de receptores olfativos de clase 1 permite el desarrollo de ensayos de examen para identificar moduladores de la actividad de OR. Los ensayos de examen tendrán dos enfoques generales.

1) Ensayos de unión de ligando, en los que células que expresan uno o más OR definidos en el presente documento, extractos de membrana de tales células, o membranas lipídicas inmovilizadas que comprenden uno o más OR definidos en el presente documento se exponen a un ácido carboxílico marcado que se sabe que se une a dichos uno o más OR y un compuesto candidato. Tras la incubación, se mide la mezcla de reacción para determinar la unión específica del ácido carboxílico marcado a dichos OR. Los compuestos que interfieren con, o desplazan, ácido carboxílico marcado de los OR pueden identificarse como moduladores, preferiblemente bloqueantes o antagonistas de actividades de OR. Puede realizarse un análisis funcional con compuestos positivos para determinar a cuál de estas categorías pertenecen.

La unión de un compuesto puede clasificarse en 3 categorías principales: unión competitiva, unión no competitiva y unión sin competencia. Un compuesto de unión competitiva se parece a un segundo compuesto (de referencia) y se une a la misma cavidad de unión de una molécula diana (en este caso, receptor). Tras la adición, el compuesto de unión competitiva desplaza a dicho segundo compuesto de dicha diana. Un compuesto de unión no competitiva no

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El ensayo de aequorina aprovecha la sensibilidad de apoaequorina mitocondrial o citoplasmática a la liberación de calcio intracelular o al flujo de calcio (entrada) inducido por la activación de GPCR (Stables et al., 1997, Anal. Biochem. 252:115-126; Deteux et al., 2000, J. Exp. Med., 192 1501-1508; ambos de los cuales se incorporan en el presente documento como referencia). En resumen, se transfectan clones que expresan OR para coexpresar apoaequorina mitocondrial o citoplasmática y G-alfa-16 o G-olf. Se incuban las células con coelenterazina H 5 M o derivados (Molecular Probes) durante 4 horas a temperatura ambiente, se lavan en medio de cultivo DMEM-F12 y se resuspenden a una concentración de 0,5 x 106 células/ml. Después se mezclan las células con péptidos agonistas de prueba y se registra la emisión de luz de la aequorina con un luminómetro durante 30 s. Los resultados se expresan como unidades de luz relativas (RLU). Los controles incluyen ensayos usando membranas aisladas de células que no expresan C356 (sometidas a transfección simulada), con el fin de excluir posibles efectos no específicos del compuesto candidato.

La actividad de aequorina o los niveles de calcio intracelular “cambian” si la intensidad de la luz aumenta o disminuye en el 10% o más en una muestra de células, que expresan un polipéptido de OR y tratadas con un modulador candidato, con respecto a una muestra de células que expresan el polipéptido de OR pero no tratadas con el modulador candidato o con respecto a una muestra de células que no expresan el polipéptido de OR (células sometidas a transfección simulada) pero tratadas con el modulador candidato.

Cuando se realiza en ausencia de un ácido carboxílico, el ensayo puede usarse para identificar un agonista o agonista inverso de una actividad de OR. Cuando el ensayo se realiza en presencia de un ácido carboxílico, puede usarse para someter a ensayo para detectar un antagonista.

1) Un ensayo basado en Fluo3, 4, Fura2 y calcio3 (Molecular Device).

Los ensayos basados en fluorescencia aprovechan los flujos de calcio desencadenados por la activación de receptor: o bien entrada de calcio a través de CNG por ejemplo o bien liberación de calcio a partir del retículo endoplasmático. Se sabe que algunos fluoróforos, incluyendo, pero sin limitarse a, Fluo3, Fluo4 y Fura2 (Molecular Probes) y la serie de kits calcio3 (Molecular Device) se unen a calcio. Tales complejos de fluoróforo-calcio emiten fluorescencia a longitudes de onda específicas. De ese modo, tras la activación de un receptor acoplado a proteína G, el calcio liberado del retículo endoplasmático o que entra a través de CNG se une a fluoróforo conduciendo a emisión de fluorescencia específica. Se incuban las células que sobreexpresan OR durante de 30 a 60 minutos con una disolución de fluoróforo a de 1 a 8 M a 37ºC. Tras lavar exhaustivamente con tampón de solución salina, se vierten 50 l del mismo tampón en cada pocillo que contiene células (de 6 a 1536). Después se inyectan los agonistas sometidos a prueba en tales células cargadas y la activación de un OR va seguida por la medición de fluorescencia.

Los niveles de calcio intracelular “cambian” si la intensidad de fluorescencia aumenta o disminuye en el 10% o más en una muestra de células, que expresan un polipéptido de OR y se tratan con un modulador candidato, con respecto a una muestra de células que expresan un polipéptido de OR pero no tratadas con el modulador candidato

o con respecto a una muestra de células que no expresan un polipéptido de OR (células sometidas a transfección simulada) pero tratadas con el modulador candidato.

2) Ensayo de membrana de despolarización/hiperpolarización (fluoróforo DiBac, por ejemplo).

El principio de este ensayo es seguir la despolarización de la membrana celular. La sonda aniónica DiBAC4(3) se reparte entre compartimentos intra y extracelular de una manera dependiente del potencial de membrana. Con potencial de membrana creciente (despolarización), la sonda se reparte adicionalmente en la célula dando como resultado un aumento de fluorescencia. A la inversa, la hiperpolarización conduce a una disminución de la fluorescencia debido a la extrusión de colorante.

La sonda DiBAC4(3) se excita con una longitud de onda de 488 nm, y emite a una longitud de onda de 540 nm.

En el día del experimento, se añade la glucosa al tampón de ensayo (tampón de solución salina) hasta una concentración final de 10 mM y la sonda DiBAC4(3) hasta una concentración final de 5 M. Se mantiene el tampón de ensayo a 37ºC. Se retira el medio de cultivo celular y se aclara dos veces cada pocillo que contiene células que sobreexpresan OR con 200 l de tampón de ensayo previamente calentado. Se colocan 180 l de tampón de ensayo que contiene DiBAC4(3) y se incuban las células durante 30 min a la temperatura apropiada. Las placas celulares estarán listas para el ensayo después de esta incubación de 30 min. Se recopila el nivel inicial durante 2 min antes de cualquier adición. Se añaden 20 l de moduladores candidatos al pocillo apropiado y se recopilan los datos durante 25 min adicionales.

La polarización de membrana “cambia” si la intensidad de fluorescencia aumenta o disminuye en el 10% o más en una muestra de células, que expresan un polipéptido de OR y tratadas con un modulador candidato, con respecto a una muestra de células que expresan un polipéptido de OR pero no tratadas con el modulador candidato o con respecto a una muestra de células que no expresan un polipéptido de OR (células sometidas a transfección simulada) pero tratadas con el modulador candidato.

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3) Ensayo de melanóforos. El ensayo de melanóforos es un ensayo basado en color. Básicamente, las células usadas para este ensayo se derivan de la piel de la rana Xenopus Laevis. Estas células inmortalizadas contienen melanosomas, que son orgánulos que contienen un pigmento oscuro. La activación de GPCR endógeno o recombinante que desencadena la activación de adenilato ciclasa o fosfolipasa C conduce a la dispersión de melanosoma y por tanto al oscurecimiento de las células. Alternativamente, un GPCR que inhibe adenilato ciclasa o fosfolipasa C conduce al aclaramiento de las células. De ese modo, en lugar de medir concentraciones de segundo mensajero, pueden localizarse fácilmente resultados positivos observando el cambio de coloración de las células. Este cambio de color puede cuantificarse fácilmente con un lector de microplacas que mide la absorbancia a 650 nM

o examinando en un sistema de imágenes de vídeo.

b.

Ensayo de adenilato ciclasa:

Se describen ensayos para detectar actividad adenilato ciclasa por Kenimer & Nirenberg, 1981, Mol. Pharmacol. 20: 585-591, incorporado en el presente documento como referencia. Ese ensayo es una modificación del ensayo enseñado por Solomon et al., 1974, Anal. Biochem. 58: 541-548, también incorporado en el presente documento como referencia. En resumen, reacciones de 100 l contienen Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), MgCl2 5 mM, fosfato de creatina 20 mM (sal de disodio), 10 unidades (71 g de proteína) de creatina fosfocinasa, -32P-ATP 1 mM (sal de tetrasodio, 2 Ci), AMP cíclico 0,5 mM, AMP cíclico marcado con G-3H (aproximadamente 10.000 cpm), Ro20-1724 0,5 mM, etanol al 0,25% y 50-200 g de homogeneizado de proteína que va a someterse a prueba (es decir, homogeneizado a partir de células que expresan o que no expresan un polipéptido de OR, tratadas o no tratadas con ácido carboxílico con o sin un modulador candidato). Normalmente se incuban las mezclas de reacción a 37ºC durante 6 minutos. Tras la incubación, se desproteinizan las mezclas de reacción mediante la adición de 0,9 ml de ácido tricloroacético al 6% frío. Se centrifugan los tubos a 1800 x g durante 20 minutos y se añade cada disolución sobrenadante a una columna Dowex AG50W-X4. Se eluye la fracción de cAMP de la columna con 4 ml de imidazol-HCl 0,1 mM (pH 7,5) en un vial de recuento. Deben realizarse los ensayos por triplicado. También deben realizarse reacciones de control usando homogeneizado de proteína de células que no expresan un polipéptido de OR.

Deben realizarse ensayos usando células o extractos de células que expresan un OR, tratadas o no tratadas con un ácido carboxílico con o sin un modulador candidato. Deben realizarse reacciones de control usando células sometidas a transfección simulada, o extractos de las mismas con el fin de excluir posibles efectos no específicos de algunos moduladores candidatos.

La actividad adenilato ciclasa “cambia” si aumenta o disminuye en el 10% o más en una muestra tomada de células tratadas con un modulador candidato de la actividad de OR, con respecto a una muestra similar de células no tratadas con el modulador candidato o con respecto a una muestra de células que no expresan un polipéptido de OR (células sometidas a transfección simulada) pero tratadas con el modulador candidato. Alternativamente, puede someterse a prueba una disminución de la actividad en el 10% o más mediante el modulador candidato de polipéptidos de OR en una muestra tratada con un compuesto de referencia.

c. Ensayo de cAMP:

Se mide el cAMP intracelular usando un radioinmunoensayo de cAMP (RIA) o proteína de unión a cAMP según métodos ampliamente conocidos en la técnica. Por ejemplo, Horton & Baxendale, 1995, Methods Mol. Biol. 41: 91105, que se incorpora en el presente documento como referencia, describen un RIA para cAMP.

Hay varios kits para la medición de cAMP comercialmente disponibles, tales como el ensayo homogéneo basado en polarización de fluorescencia de alta eficacia comercializado por LJL Biosystems y NEN Life Science Products. Deben realizarse reacciones de control usando extractos de células sometidas a transfección simulada para excluir posibles efectos no específicos de algunos moduladores candidatos.

Deben realizarse ensayos usando células o extractos de células que expresan un polipéptido de OR, tratadas o no tratadas con un ácido carboxílico con o sin un modulador candidato. Deben realizarse reacciones de control usando células sometidas a transfección simulada, o extractos de las mismas con el fin de excluir posibles efectos no específicos de algunos moduladores candidatos

El nivel de cAMP “cambia” si el nivel de cAMP detectado en células, que expresan un polipéptido de OR y tratadas con un modulador candidato de la actividad de OR (o en extractos de tales células), usando el ensayo basado en RIA de Horton & Baxendale, 1995, citado anteriormente, aumenta o disminuye en al menos el 10% con respecto al nivel de cAMP en células similares no tratadas con el modulador candidato.

d. Descomposición de fosfolípidos, producción de DAG y niveles de trifosfato de inositol:

Pueden monitorizarse receptores que activan la descomposición de fosfolípidos para detectar cambios debidos a la actividad de moduladores conocidos o sospechados de un OR monitorizando la descomposición de fosfolípidos, y la producción resultante de segundos mensajeros DAG y/o trifosfato de inositol (IP3). Se describen métodos de medición de cada uno de ellos en Phospholipid Signaling Protocols, editado por Ian M. Bird. Totowa, NJ, Humana Press, 1998, que se incorpora en el presente documento como referencia. Véase también Rudolph et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 11824-11831, incorporado en el presente documento como referencia, que también describe un

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ensayo para detectar la descomposición de fosfatidilinositol. Deben realizarse ensayos usando células o extractos de células que expresan un OR, tratadas o no tratadas con ácido carboxílico con o sin un modulador candidato. Deben realizarse reacciones de control usando células sometidas a transfección simulada, o extractos de las mismas con el fin de excluir posibles efectos no específicos de algunos moduladores candidatos.

La descomposición de fosfatidilinositol, y los niveles de diacilglicerol y/o trifosfato de inositol “cambian” si aumentan o disminuyen en al menos el 10% en una muestra de células que expresan un polipéptido de OR y tratadas con un modulador candidato en presencia o en ausencia de ácido carboxílico, con respecto al nivel observado en una muestra de células que expresan un polipéptido carboxílico que no se trata con el modulador candidato.

e. Ensayos de activación de PKC:

Las tirosina cinasas receptoras de factor de crecimiento tienden a señalizar a través de una ruta que implica la activación de proteína cinasa C (PKC), que es una familia de proteína cinasas activadas por fosfolípidos y calcio. La activación de PKC da como resultado en última instancia la transcripción de una matriz de genes que codifican para factor de transcripción de protooncogenes, incluyendo c-fos, c-myc y c-jun, proteasas, inhibidores de proteasa, incluyendo inhibidor de activador del plasminógeno y colagenasa tipo I, y moléculas de adhesión, incluyendo molécula de adhesión intracelular I (ICAM I). Pueden usarse ensayos diseñados para detectar aumentos en productos génicos inducidos por PKC para monitorizar la activación de PKC y de ese modo la actividad de receptor. Además, puede monitorizarse la actividad de receptores que señalizan a través de PKC mediante el uso de constructos de genes indicadores impulsados por las secuencias de control de genes activados mediante la activación de PKC. Este tipo de ensayo basado en genes indicadores se comenta en más detalle a continuación.

Para una medición más directa de la actividad de PKC, puede usarse el método de Kikkawa et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 13341, incorporado en el presente documento como referencia. Este ensayo mide la fosforilación de un péptido sustrato de PKC, que posteriormente se separa mediante unión a papel de fosfocelulosa. Este sistema de ensayo de PKC puede usarse para medir la actividad de cinasa purificada, o la actividad en extractos celulares en bruto. La muestra de proteína cinasa C puede diluirse en HEPES 20 mM/DTT 2 mM inmediatamente antes del ensayo.

El sustrato para el ensayo es el péptido Ac-FKKSFKL-NH2 (SEQ ID NO: 15), derivado de la proteína sustrato de proteína cinasa rica en alanina miristoilada (MARCKS). La Km de la enzima para este péptido es de aproximadamente 50 M. También pueden usarse otros péptidos básicos selectivos para proteína cinasa C conocidos en la técnica, a una concentración de al menos 2-3 veces su Km. Los cofactores requeridos para el ensayo incluyen calcio, magnesio, ATP, fosfatidilserina y diacilglicerol. Dependiendo de la intención del usuario, el ensayo puede realizarse para determinar la cantidad de PKC presente (condiciones de activación) o la cantidad de PCK activa presente (condiciones no activantes). Para la mayoría de los fines, se usarán condiciones no activantes, de tal manera que se mide la PKC que está activa en la muestra cuando se aísla, en vez de medir la PKC que puede activarse. Para condiciones no activantes, se omite el calcio en el ensayo en favor de EGTA.

El ensayo se realiza en una mezcla que contiene HEPES 20 mM, pH 7,4, DTT 1-2 mM, MgCl2 5 mM, ATP 100 M, -32P-ATP ∼1 Ci, sustrato peptídico 100 g/ml (∼100 M), membranas de fosfatidilserina/diacilglicerol 140 M/3,8 M, y calcio 100 M (o lo más preferiblemente EGTA 500 M). Se usan 48 l de muestra, diluidos en HEPES 20 mM, pH 7,4, DTT 2 mM en un volumen de reacción final de 80 l. Se realizan reacciones a 30ºC durante 5-10 minutos, seguido por adición de 25 l de una disolución que contiene ATP 100 mM y EDTA 100 mM con un valor de pH de 8,0, lo cual detiene las reacciones.

Tras detenerse la reacción, se colocan una parte (85 l) de cada reacción sobre un filtro de fosfato de celulosa de Whatman P81, seguido por lavados: cuatro veces con 500 ml de ácido fosfórico al 0,4%, (5-10 min por lavado); y un lavado final en 500 ml de EtOH al 95%, durante 2-5 min. Se mide la radiactividad unida mediante recuento de centelleo. Se determina la actividad específica (cpm/nmol) del ATP marcado colocando una muestra de la reacción sobre papel P81 y realizando el recuento sin lavar. Las unidades de actividad de PKC, definidas como nmol de fosfato transferido por min, se calculan de la siguiente manera:

La actividad, en UNIDADES (nmol/min) es:

= _(cpm sobre papel) x (105 l totales / 85 l colocados)_

(tiempo de ensayo, min)(actividad específica de ATP, cpm/nmol).

Puede realizarse un ensayo alternativo usando un kit de ensayo de proteína cinasa C comercializado por PanVera (n.º de cat. P2747).

Se realizan los ensayos con extractos de células que expresan un polipéptido de OR, tratadas o no tratadas con un ácido carboxílico con o sin un modulador candidato. Deben realizarse reacciones de control usando células sometidas a transfección simulada, o extractos de las mismas con el fin de excluir posibles efectos no específicos de algunos moduladores candidatos.

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(menos el blanco) entre la actividad específica para determinar los moles de fosfato transferidos en la reacción.

Deben realizarse ensayos usando células o extractos de células que expresan un OR, tratadas o no tratadas con un ácido carboxílico con o sin un modulador candidato. Deben realizarse reacciones de control usando células sometidas a transfección simulada, o extractos de las mismas con el fin de excluir posibles efectos no específicos de algunos moduladores candidatos.

La actividad tirosina cinasa “cambia” si el nivel de cinasa actividad aumenta o disminuye en el 10% o más en una muestra de células, que expresan un polipéptido de OR, tratadas con un modulador candidato con respecto a cinasa actividad en una muestra de células similares no tratadas con el modulador candidato.

h. Indicadores de la transcripción para la activación de la ruta aguas abajo:

La señal intracelular iniciada por la unión de un modulador a un receptor, por ejemplo, un polipéptido de OR definido en el presente documento, pone en movimiento una cascada de acontecimientos intracelulares, cuya consecuencia final es un cambio rápido y detectable en la transcripción y/o traducción de uno o más genes. Por tanto, la actividad del receptor puede monitorizarse midiendo la expresión de un gen indicador impulsada por secuencias de control sensibles a la activación de OR.

Tal como se usa en el presente documento “promotor” se refiere a los elementos de control de la transcripción necesarios para la regulación mediada por el receptor de la expresión génica, incluyendo no sólo el promotor basal, sino también cualquier potenciador o sitio de unión a factor de transcripción necesario para la expresión regulada por receptor. Al seleccionar promotores que son sensibles a las señales intracelulares resultantes de la unión de agonistas, y unir operativamente los promotores seleccionados a genes indicadores cuya transcripción, traducción o actividad final puede detectarse y medirse fácilmente, el ensayo de indicador basado en la transcripción proporciona una rápida indicación de si un receptor dado está activado.

En la técnica se conocen bien genes indicadores tales como luciferasa, cloranfenicol acetil transferasa (CAT), proteína verde fluorescente (GFP), beta-lactamasa o beta-galactosidasa, al igual que se conocen ensayos para la detección de sus productos.

Genes particularmente bien adecuados para monitorizar la actividad de receptor son los genes “inmediatos tempranos”, que se inducen rápidamente, generalmente en el plazo de minutos tras el contacto entre el receptor y la proteína o el ligando efector. La inducción de la transcripción de genes inmediatos tempranos no requiere la síntesis de nuevas proteínas reguladoras. Además de la rápida sensibilidad a la unión de ligando, las características de genes preferidos útiles para producir constructos de indicador incluyen: expresión baja o no detectable en células quiescentes; inducción que es transitoria e independiente de la síntesis de nuevas proteínas; la desactivación posterior de la transcripción requiere la síntesis de nuevas proteínas; y los ARNm transcritos a partir de estos genes tienen una semivida corta. Se prefiere, pero no es necesario, que un elemento de control de la transcripción tenga todas estas propiedades para que sea útil.

Con el fin de someter a ensayo la actividad de OR con constructo de indicador de la transcripción sensible a ácido carboxílico, se transfectan de manera estable células que expresan de manera estable un polipéptido de OR con el constructo de indicador. Para examinar para detectar agonistas, se exponen células no tratadas a moduladores candidatos, o se exponen a un ácido carboxílico, y se mide la expresión del indicador. Los cultivos tratados con ácido carboxílico sirven como patrón para el nivel de transcripción inducido por un agonista conocido. Un aumento de al menos el 10% en la expresión de indicador en presencia de un modulador candidato en comparación con la expresión de indicador en ausencia de cualquier modulador indica que el candidato es un modulador de la actividad de OR. Un agonista inducirá al menos tanta, y preferiblemente la misma cantidad o más de, expresión de indicador que el ácido carboxílico. Los agonistas parciales pueden activar el receptor en menor medida en comparación con el ácido carboxílico. Este enfoque también puede usarse para examinar para detectar agonistas inversos en los que las células expresan un polipéptido de OR a niveles tales que hay una actividad basal elevada del indicador en ausencia de ácido carboxílico u otros agonistas. Una disminución de la actividad de indicador del 10% o más en presencia de un modulador candidato, con respecto a su ausencia, indica que el compuesto es un agonista inverso.

Para examinar para detectar antagonistas, las células que expresan un OR y que portan el constructo de indicador se exponen a un ácido carboxílico (u otro agonista) en presencia y ausencia de un modulador candidato. Una disminución del 10% o más en la expresión de indicador en presencia de modulador candidato, con respecto a la ausencia del modulador candidato, indica que el candidato es un antagonista de la actividad de OR.

Los controles para ensayos de transcripción incluyen células que no expresan un OR definido en el presente documento pero que portan el constructo de indicador, así como células con un constructo de indicador sin promotor. Los compuestos que se identifican como moduladores de la transcripción regulada por OR también deben analizarse para determinar si afectan a la transcripción impulsada por otras secuencias reguladoras y por otros receptores, con el fin de determinar la especificidad y el espectro de su actividad.

El ensayo de indicador de la transcripción, y la mayoría de los ensayos basados en células, están bien adecuados para examinar bibliotecas químicas de compuestos químicos para seleccionar aquellos que modulan la actividad de

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(R)-(+)-Citronelal

(R)-(+)-Pulegona

(S)-(-)-Citronelol

1,4-Butanodiol

1-amino-2-feniletano

1-Butanotiol

1-ciclohexiletanol

1-Furfurilpirrol

1-hepten-3-ol

1-Propanol

2,6-Dimetiltiofenol

2-Butanona

2-ciclohexiletanol

Acetato de 2-metilbutilo

2-Metilpiridina

2-Nonanona

3,4-Dimetoxifenil-acetona

3-Octanona

4-(4-Metoxifenil)-3-butanona

4-(Metiltio)butanol

4-hidroxi-3-metoxifenilacetona

4-Hidroxibenzaldehído

4-Propilfenol

5-Hexen-1-ol

Acetofenona

-ionona

Ciclohexilpropionato de alilo

Alilmercaptano

Sulfuro de alilo

alfa-Alcohol metilbencílico

BENZOATO DE AMILO

Salicilato de amilo

Androstanolona

Acetato de anisilo

-pineno

-terpineol

Benzofenona

Acetato de bencilo

Bencilmercaptano

Butiraldehído

Carvacrol

Cariofileno

Acetato de cinamilo

cis-6-Nonenal

DIMETILACETAL DE CITRAL

Cumarina

Ciclamal

Ciclopentadecanona

D-Carvona

DELTA-DECALACTONA

ACETATO DE DECILO

fumarato de dihexilo

Dihidroanetol

Dihidroeugenol

Sulfuro de dimetilo

DIONA

2-Mercaptopropionato de etilo

p-Anisato de etilo

Fenilacetato de etilo

Etilvainillina

Eucaliptol

Floridile

Frutonile

Butirato de furfurilo

Sulfuro de furfurilo y metilo

Gamma-jazmolactona

gamma-undecalactona

Acetato de geranilo

Guayacol

Heptaldehído

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Alcohol heptílico

Hexanal

Octanoato de hexilo

Laurato de isoamilo

Isobornilciclohexanol

Benzoato de isobutilo

Jasmacyclene

Jasmatone

JAZMOLACTONA

Jessate

Alcohol laurílico

L-Nicotina

Lyral

Mentalactona

Mentol

3-Nonenoato de metilo

Antranilato de metilo

Benzoato de metilo

METIL-HEPTENONA PURA

Metil-lactona

Salicilato de metilo

Nectaryl

2,6-NONADIENOL

Nonanal

Alcohol nonílico

n-Valeraldehído

Ocimeno

o-cresol

Octanal

Propionato de octilo

FORMIATO DE OXIOCTALINA

Para-metoxiacetofenona

p-cresil metil éter

p-Dimetoxibenceno

2-Furoato de fenetilo

Acetato de fenilo

Feniletanol

Acetato de piperonilo

Isobutirato de piperonilo

p-Menta-8-tiol-3-ona

BENZOATO DE PRENILO

Propenilguaetol

PROPILIDEN-FTALIDA

Pirrol

Cetona de frambuesa

Rositol

Stemone

Terpinen-4-ol

Tetrahidrogeraniol

Tetrahidromircenol

Timol

tridecenonitrilo

undecanal

UNDECATRIENO

Undecavertol

Undeceno-2-nitrilo

Vainillina

Propionato de verdilo

Acetato de vetiverilo

Tabla 3: Lista completa de moléculas odorizantes sometidas a prueba con los 7 OR definidos en el presente documento. gamma-Dodecalactona (natural) Isobutirato de hexilo 3-Acetil-2,5-dimetiltiofeno Etil-feniletil-acetal de acetaldehído

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