ES2655857T3 - Nueva cepa de bifidobacterium animalis subsp. lactis cect 8145 y su uso para el tratamiento y/o prevención de sobrepeso y obesidad y enfermedades asociadas - Google Patents

Abstract

La presente invención se enmarca dentro de la industria alimentaria y farmacéutica. Se refiere en concreto a una nueva cepa de la especie

Description

DESCRIPCIÓN

Nueva cepa de bifidobacterium animalis subsp. lactis cect 8145 y su uso para el tratamiento y/o prevención de sobrepeso y obesidad y enfermedades asociadas

SECTOR TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se enmarca dentro de la industria alimentaria y farmacéutica. Se refiere en concreto a una 5 nueva cepa de la especie Bifidobacterium animalis subsp. lactis CECT 8145, sobrenadantes y/o cultivo, así como extractos y/o compuestos bioactivos que comprenden la cepa, que, incorporados a formulaciones alimentarias y/o farmacéuticas, inducen saciedad, reducen el apetito, la grasa corporal y el riesgo cardiovascular, provocan pérdida de peso, tienen actividad antioxidante y anti-inflamatoria y, en consecuencia, tienen aplicación en el tratamiento y/o prevención de sobrepeso y/o obesidad y/o sus enfermedades asociadas. 10

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La obesidad y el sobrepeso son un trastorno metabólico y nutricional de serias consecuencias para la salud, siendo el sobrepeso un grado de obesidad. A pesar de existir un mejor conocimiento clínico y epidemiológico del problema, la prevalencia de la obesidad y el sobrepeso ha aumentado significativamente en países industrializados y en desarrollo. Se reconoce el alto riesgo que representa la obesidad en la incidencia de varias enfermedades crónicas: 15 hipertensión arterial, enfermedad isquémica coronaria, accidentes cerebro-vasculares, diabetes tipo 2 y ciertas formas de cáncer, que son causa importante de morbilidad y mortalidad en los países del hemisferio occidental.

En la lucha contra el sobrepeso y la obesidad, la industria alimentaria ha incorporado nuevos ingredientes con el objetivo de ayudar a los consumidores a obtener un peso adecuado. En el ámbito del desarrollo e investigación de nuevos productos, una opción es que ciertos ingredientes puedan añadirse para que actúen inhibiendo la 20 acumulación de energía en forma de grasa, bien disminuyendo la absorción o formación de grasa, bien estimulando la movilización de la grasa con una lipolisis aumentada o bien mejorando sus tasas de oxidación lipídica.

Otro de los aspectos que inciden de forma positiva en la prevención o tratamiento del sobrepeso y la obesidad es controlar y/o reducir el apetito a través de la inducción de un efecto saciante en el individuo activando la regulación metabólica del apetito. 25

Igualmente, algunos estudios sugieren que la obesidad se acompaña de un estado de estrés oxidante crónico, el cual se ha propuesto como el nexo de unión entre la obesidad y algunas comorbilidades asociadas tales como la resistencia insulínica y las patologías cardiovasculares. (Molnar D, Decsi T, Koletzko B. “Reduced antioxidant status in obese children with multimetabolic síndrome”. Int J Obes Relat Metab Disord 2004; 28:1197-202). Por ello, en los últimos años también se están llevando a cabo diferentes investigaciones sobre el posible papel de la 30 suplementación con diferentes antioxidantes dietéticos en la mejoría y prevención del sobrepeso y la obesidad.

Por otra parte, la microbiota intestinal y los probióticos producen un efecto positivo para la salud regulando las funciones inmunológicas del individuo y protegiéndolo de infecciones y procesos de inflamación crónica. Hay estudios que señalan a la microbiota intestinal como un nuevo factor que podría estar implicado en la regulación del peso corporal y las enfermedades asociadas a la obesidad. Por ello, la manipulación intencionada de la microbiota 35 intestinal a través de la dieta se propone como una posible nueva herramienta para prevenir o modificar el riesgo de obesidad y, en particular, las enfermedades metabólicas asociadas a ésta.

En este sentido, se han atribuido numerosos efectos beneficiosos a cepas de la especie Bifidobacterium animalis subsp. lactis en relación con el tratamiento o prevención de sobrepeso y obesidad así como con sus enfermedades asociadas. El documento de patente estadounidense US2011027348 describe el microorganismo Bifidobacterium 40 animalis subsp. lactis (no especifica una cepa en concreto), con actividad frente a inflamación, síndrome metabólico, obesidad e hipertensión.

Además, otros ejemplos concretos en este mismo ámbito de aplicación son las cepas Bifidobacterium animalis subsp. lactis B420 y Bb12.

Así, el artículo con título “Study of Danisco probiotics shows positive impact on metabolic síndrome (MetS)”, Food 45 Engineering & Ingredients, 2010, Vol. 35, Issue 2, p.9, DuPont, describe la cepa Bifidobacterium animalis subsp. lactis B420 y su actividad frente a síndrome metabólico, inflamación, endotoxemia metabólica, etc.

Igualmente, el documento de patente estadounidense US20120107291 describe la cepa Bifidobacterium animalis subsp. lactis B420 con actividad frente a diabetes, síndrome metabólico, obesidad, inflamación de tejidos, etc.

De acuerdo con la información contenida en dicha solicitud de patente, la cepa B420 actúa influenciando de forma positiva el sistema inmune a través del tejido linfoide asociado al intestino y muestra capacidad para inducir una mejora en la tolerancia a la glucosa, la reducción del tejido adiposo mesentérico, la reducción en los índices de 5 inflamación, etc. No obstante, en la información disponible respecto a esta cepa no se contiene mención alguna respecto a una posible capacidad para inducir reducción de apetito o aumento de efecto saciante así como capacidad antioxidante de la cepa.

La referencia no patente con título “Bifidobacterium lactis Bb12 enhances intestinal antibody response in formula-fed infants: a randomized, doublé-blind, controlled trial”, Holscher et al., describe la cepa Bifidobacterium lactis Bb12 y su 10 actividad frente a la pérdida de función inmune.

El documento de patente estadounidense US2008267933 describe la cepa Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb12 con actividad frente al control de peso y obesidad a través de la inducción de efecto saciante, la mejora del metabolismo energético, la mejora de la sensibilidad a la insulina, el síndrome metabólico, etc. Los efectos producidos por esta cepa pueden ser el resultado de la sobreexpresión de ciertos genes relacionados con el 15 metabolismo energético -grasa, azúcar e insulina además de la saciedad-, tales como Scd1, Acrp30, Adn, Thrsp, Car3 y Apoa-4. No obstante, en la información disponible respecto a esta cepa no se contiene mención alguna respecto a una posible capacidad antioxidante de la cepa.

En relación a la capacidad antioxidante de las bacterias, la solicitud de patente WO2011083353 describe un método que emplea Caenorhabditis elegans para el cribado y selección de bacterias que tienen efecto protector frente al 20 estrés oxidativo. Sin embargo, en este documento las cepas de Bifidobacterium ensayadas no confirieron resistencia al estrés oxidativo. Únicamente unas pocas cepas de Streptococcus y Lactobacillus fueron capaces de conferir resistencia al estrés oxidativo.

Por tanto, el problema técnico de la presente invención se refiere a la provisión de nuevos microorganismos con capacidad para ser utilizados como ingredientes en formulaciones farmacéuticas y alimentarias con mejor actividad 25 terapéutica y/o preventiva frente al sobrepeso y la obesidad así como a sus enfermedades asociadas.

Dicho problema técnico se ha resuelto con la provisión de la cepa Bifidobacterium animalis subsp. lactis depositada el 14/05/12 con número de acceso: CECT8145 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Parc Cientific Universitat de Valencia, c/ Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna – Valencia, España, según las disposiciones del Tratado de Budapest, así como composiciones alimenticias y farmacéuticas que la contengan. 30

A diferencia de las cepas de la misma especie conocidas del estado de la técnica, la cepa de la presente invención, así como las composiciones alimenticias y farmacéuticas que las contengan, además de reducir la grasa corporal, presentan capacidad para inducir saciedad y reducir el apetito y aumentar la capacidad de resistencia al estrés oxidativo en mamíferos tras su ingesta. Adicionalmente, la cepa de la presente invención, así como las composiciones alimenticias y farmacéuticas que las contengan reducen la concentración de colesterol total y 35 triglicéridos en sangre, además de reducir la concentración de glucosa y algunos marcadores de inflamación. Todo ello lleva a concluir que los efectos de la cepa de la presente invención, así como las composiciones alimenticias y farmacéuticas que las contengan, en el control del sobrepeso, esto es, en el tratamiento y/o prevención de la obesidad y las enfermedades asociadas es efectiva y superior a otras cepas de la misma especie conocidas del estado de la técnica. 40

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una nueva cepa de la especie Bifidobacterium animalis subsp. lactis, depositada el 14/05/12 con número de acceso: CECT8145 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Parc Cientific Universitat de Valencia, c/ Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna – Valencia, España, según las disposiciones del Tratado de Budapest, los compuestos bioactivos, los sobrenadantes y los cultivos comprendiendo 45 la cepa, los extractos que contengan los compuestos biaoactivos, los sobrenadantes y/o los cultivos, y la cepa y la formulación de cualquiera de ellos en composiciones alimenticias y farmacéuticas.

La cepa de la invención, así como los productos comprendiendo la misma objeto de la presente invención, actúan modulando la expresión diferenciada de ciertos genes que inciden de forma positiva en la reducción de grasa corporal, lo cual hace especialmente efectiva a la cepa de la presente invención en el tratamiento y/o prevención del 50

sobrepeso y/o la obesidad así como las enfermedades asociadas, tales como: síndrome metabólico, hipertensión, glucemia, inflamación, diabetes tipo II, enfermedades cardiovasculares, hipercolesterolemia, alteraciones hormonales, infertilidad, etc.

Tras su ingesta en mamíferos, la cepa de la presente invención actúa reduciendo la grasa corporal, el peso, el nivel de triglicéridos totales, el colesterol total, la glucosa, el factor TNFα e incrementando la adiponectina. 5 Adicionalmente, produce un aumento de la saciedad, tal y como se desprende de la reducción en los niveles de grelina, y aumenta la resistencia al estrés oxidativo, tal y como se demuestra a través de una reducción en la concentración de malondialdehido en mamíferos tratados con la cepa de la presente invención.

El estudio transcriptómico de la cepa de la presente invención muestra que la ingesta de la cepa induce un incremento en rutas y procesos metabólicos relacionados con el metabolismo de carbohidratos (entre otros, 10 fosforilación oxidativa y síntesis de ATP), el metabolismo del glutatión (reducción de los niveles de estrés oxidativo), la biosíntesis de cofactores y vitaminas, el metabolismo de lípidos, el metabolismo de nucleótidos, la glicosilación y el metabolismo de membrana.

Además, tal y como se confirma a partir del estudio metabolómico realizado con la cepa de la presente invención y detallado en la parte de experimental de la memoria de patente, la ingesta de esta cepa induce una serie de cambios 15 metabólicos relacionados con el metabolismo antioxidante y con el metabolismo de carbohidratos y nucleótidos. Se identifica el metabolismo del glutatión como una diana de la presente cepa para reducir los niveles de estrés oxidativo y se destaca también un incremento en la actividad de la ruta de las pentosas fosfato y en la glicosilación, siendo también aparentes diversas alteraciones en el metabolismo del glucógeno, de los nucleótidos, de los lípidos y de los cofactores. 20

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

El objeto de la presente invención es un microorganismo así como las composiciones alimenticias y farmacéuticas que lo contengan, con utilidad en el tratamiento y prevención en mamíferos del sobrepeso y la obesidad así como sus enfermedades relacionadas.

Dicho microorganismo se refiere, en concreto, a una nueva cepa de la especie Bifidobacterium animalis subsp. 25 lactis, depositada el 14/05/12 con número de acceso: CECT8145 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Parc Cientific Universitat de Valencia, c/ Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna – Valencia, España, según las disposiciones del Tratado de Budapest.

En la presente memoria de solicitud de patente, la cepa de la invención Bifidobacterium animalis subsp. lactis CECT8145 aparecerá también referida con la denominación BIF-1. 30

A los efectos de la presente invención, los términos “enfermedades relacionadas o asociadas” y “enfermedades causadas por el sobrepeso y/o la obesidad” comprenden: síndrome metabólico, hipertensión, glucemia, inflamación, diabetes tipo II, enfermedades cardiovasculares, hipercolesterolemia, alteraciones hormonales, infertilidad, etc.

A los efectos de la presente invención, se entiende por productos bioactivos que comprenden la cepa de la presente invención, tanto componentes celulares, compuestos y moléculas que formen parte de la cepa, como los metabolitos 35 y las moléculas secretadas por la misma, tales como: componentes intracelulares (por ej., ADN, péptidos, ácidos grasos, etc.) como componentes de la pared celular (proteínas, péptidos, ácidos grasos, etc.) que confieran la actividad preventiva o terapéutica deseada y que además comprendan la cepa de la invención.

Se entiende por composición alimenticia, los alimentos funcionales, probióticos, sinbióticos, suplementos dietéticos y/o nutracéuticos que incorporan la cepa de la presente invención, los productos bioactivos, el sobrenadante y/o el 40 extracto y/o el cultivo comprendiendo la misma.

En el contexto de la presente invención, se entiende por composiciones farmacéuticas aquellas que incorporan la cepa de la presente invención, los productos bioactivos, el sobrenadante y/o el extracto y/o el cultivo que comprenden la misma junto con, al menos, un vehículo y/o un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables a utilizar en la presente invención son conocidos en el 45 estado de la técnica para un experto en la materia.

Los inventores de la presente invención han conseguido identificar una nueva cepa CECT8145 de la especie Bifidobacterium animalis subsp. lactis que posee actividades biológicas novedosas frente a otras cepas de la misma especie pertenecientes al estado de la técnica, que la hacen especialmente efectiva en el tratamiento y/o prevención

del sobrepeso y/o la obesidad así como de enfermedades causadas por y/o relacionadas con el sobrepeso y/o la obesidad.

Estudios genómicos comparativos entre la cepa de la presente invención y otras cepas pertenecientes a la misma especie del estado de la técnica, en concreto, las cepas B420 y Bb12, demuestran que la cepa de la presente invención presenta regiones y genes que son únicos en ella y no tienen homólogos correspondientes en las otras 5 dos cepas. En concreto, y a partir de los estudios genómicos realizados, se ha podido determinar que la cepa de la presente invención, a diferencia de las cepas B420 y Bb12, no tiene genes con función molecular de unión a lípidos (“lipid-binding”).

Una de las actividades biológicas novedosas en la cepa de la presente invención es su actividad antioxidante y, en definitiva, la capacidad de aumentar la resistencia al estrés oxidativo. 10

El estrés oxidativo está causado por un desequilibrio entre la producción de radicales libres y las defensas antioxidantes del organismo responsable de la detoxificación de dichos radicales. En pacientes obesos, el estrés oxidativo no se genera por un único mecanismo, sino por la confluencia de varios factores que, en definitiva, se pueden resumir como una disminución de agentes antioxidantes de forma paralela a un aumento de elementos pro-oxidantes. Diversos estudios avalan la existencia de una relación directa entre la obesidad y una reducción de la 15 actividad de las principales enzimas antioxidantes.

La actividad biológica de resistencia al estrés oxidativo inducida por la cepa de la presente invención se demuestra a través de una reducción en la concentración de malondialdehido en mamíferos tratados con la cepa de la presente invención (figura 16).

El malondialdehido es un marcador indicativo del grado de oxidación a nivel corporal; a mayor grado de oxidación, 20 se incrementa el nivel de este marcador y se produce una menor protección frente a estrés oxidativo; y viceversa.

En la figura 5 se demuestra, mediante la supervivencia en Caenorhabditis elegans, un incremento de protección frente a estrés oxidativo.

Otra de las actividades biológicas novedosas de la cepa de la presente invención es la capacidad para inducir un aumento de saciedad tras su ingesta, disminuyendo los niveles de grelina (figura 17). 25

Actualmente, la grelina es la única hormona circulante con potencial para aumentar o estimular el apetito y, en consecuencia, actúa como reguladora del hambre y del peso corporal. Es un neuropéptido gastrointestinal (ligando endógeno del receptor del secretagogo de la GH) aislado recientemente de la mucosa oxíntica producida principalmente en el estómago. Su concentración sanguínea depende de la dieta, la hiperglucemia y la adiposidad y la leptina. Se secreta 1-2 horas antes de la comida y su concentración disminuye drásticamente después de comer. 30 Actúa en hipotálamo lateral y, teóricamente, inhibe la secreción de citoquinas proinflamatorias y antagoniza a la leptina. La grelina, fisiológicamente, aumenta la secreción ácida gástrica y tiene otras funciones hormonales y cardiovasculares.

La cepa de la presente invención es capaz de disminuir los niveles de grelina, induciendo un incremento de saciedad. 35

Adicionalmente, la cepa de la presente invención actúa reduciendo el nivel de triglicéridos totales, colesterol, glucosa, factor TNFα, e incrementando los niveles de adiponectina (figuras 12, 9, 13, 14 y 15, respectivamente).

De forma ventajosa, se ha podido constatar que los niveles de reducción de grasa corporal alcanzados por la cepa de la presente invención son sorprendentemente superiores a los niveles alcanzados a través de otras cepas del genero Bifidobacterium y, en especial, con respecto a la cepa comercial perteneciente a la misma especie 40 denominada Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb12 (figura 2).

Los resultados ilustrados en el ejemplo 1 de la presente memoria confirman que la ingesta de la cepa de la presente invención provoca en el nematodo Caenorhabditis elegans una reducción de grasa corporal en, al menos, un 40% respecto a condiciones de alimentación estándar. Comparativamente a la reducción de grasa corporal producida por otras cepas de la misma especie conocidas del estado de la técnica y, en concreto, de la cepa Bb12, la cepa de la 45 presente invención es capaz de producir un efecto reductor de grasa corporal superior al 28,5% respecto a esta cepa Bb12; lo cual demuestra una mayor efectividad de la cepa BIF-1 de la presente invención frente a cepas de su misma especie.

Del mismo modo, cuando la cepa de la presente invención es incorporada a un producto alimenticio, como por ejemplo, yogur, soja fermentada o zumo, su efecto sobre la reducción de grasa corporal es superior al 11%, en comparación al efecto producido por un alimento convencional, ya sea yogur, soja fermentada o zumo.(figuras 20, 21 y 22).

Según se detalla en la parte experimental aportada a modo de ejemplo, el estudio transcriptómico muestra que la 5 ingesta de la cepa de la presente invención induce un incremento en rutas y procesos metabólicos relacionados con el metabolismo de carbohidratos (entre otros, la fosforilación oxidativa y la síntesis de ATP), el metabolismo del glutatión (reducción de los niveles de estrés oxidativo), la biosíntesis de cofactores y vitaminas, el metabolismo de lípidos, el metabolismo de nucleótidos, la glicosilación y el metabolismo de membrana.

Además, tal y como se confirma a partir del estudio metabolómico realizado y detallado en la parte experimental de 10 la memoria de patente, la ingesta de esta cepa induce una serie de cambios metabólicos relacionados con el metabolismo antioxidante y con el metabolismo de carbohidratos y de nucleótidos. Se identifica el metabolismo del glutatión como una diana de la presente cepa para reducir los niveles de estrés oxidativo y se destaca también un incremento en la actividad de la ruta de las pentosas fosfato y en la glicosilación, siendo también aparentes diversas alteraciones en el metabolismo del glucógeno, de los nucleótidos, de los lípidos y de los cofactores. Dichos cambios 15 metabolómicos confirman las actividades biológicas de reducción de grasa corporal y protección frente a estrés oxidativo inducidas por la cepa de la presente invención.

Estos resultados se han podido confirmar a través de un ensayo realizado con mutantes del nematodo C. elegans según se detalla en el ejemplo 8, que ha permitido identificar diversos genes que se hallan diferencialmente expresados tras la ingesta de la cepa BIF-1 de la presente invención y que explicarían las actividades biológicas 20 proporcionadas por la cepa, así como su superior efectividad frente al sobrepeso y la obesidad.

En concreto, se han identificado los genes diferencialmente expresados como los siguientes: Acox-1, Acs-5, Daf-22, Fat-7, Daf-16, Sod-4, Trxr-2, Asg-2 y Tph-1.

Los genes Acox-1, Acs-5 y Daf-22 codifican para enzimas de la beta oxidación de ácidos grasos en peroxisoma; los genes Fat-7 y Daf-16 codifican para enzimas que actúan en el proceso de desaturación de los ácidos grasos; los 25 genes Sod-4, Trxr-2 y Asg-2 codifican para enzimas involucradas en mantener el balance celular redox y eliminar especies reactivas del oxígeno; el gen Asg-2, por sí solo, codifica para una enzima involucrada en procesos de fosforilación oxidativa; y el gen Tph-1 codifica para una enzima implicada en el metabolismo del triprófano y, por tanto, en la síntesis de serotonina.

La cepa de la presente invención y los productos bioactivos comprendiendo la misma, así como los sobrenadantes, 30 los cultivos y/o los extractos comprendiendo la cepa, pueden formularse e incorporarse, de forma individual o en combinación con otros microorganismos y/o ingredientes funcionales, a composiciones alimenticias así como a composiciones farmacéuticas, para ser utilizados de acuerdo con la presente invención.

Cuando la cepa de la presente invención se incorpora en combinación con otros microorganismos, éstos pertenecen preferiblemente a los géneros Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium, Saccharomyces y/o Kluyveromyces, 35 como por ejemplo: L. rhamnosus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. kefir, L. parakefir, L. brevis, L. casei, L. plantarum, L. fermentum, L. paracasei, L. acidophilus, L. paraplantarum, L. reuteri, St. thermophilus, B. longum, B. breve, B. bifidum, B. catenulatum, B. adolescentis, B. pseudocatenulatum, S. cerevisiae, S. boulardii, K. lactis, y K. marxianus.

La presente invención también se refiere a una composición que incorpora los compuestos bioactivos 40 comprendiendo la cepa de la presente invención, los sobrenadantes y/o los cultivos que comprenden la cepa, así como los extractos comprendiendo la cepa de la invención.

Las composiciones de la presente invención, que incorporan la cepa de la presente invención y/o los productos bioactivos y/o los sobrenadantes y/o los cultivos y/o los extractos comprendiendo la cepa, pueden ser composiciones alimenticias o farmacéuticas. 45

Dichas composiciones alimenticias o farmacéuticas puede presentarse en forma líquida o sólida, incluyendo pero no limitándose a, cápsulas y/o comprimidos.

Las composiciones alimentarias y/o farmacéuticas de la presente invención incorporan la cepa de la presente invención en una cantidad de entre 105 ufc y 1012 ufc por gramo o mililitro de la composición y, preferiblemente, entre 107 y 1011 ufc/g o ufc/ml. 50

Cuando las composiciones alimentarias y/o farmacéuticas de la presente invención incorporan los compuestos bioactivos comprendiendo la cepa de la presente invención, tales como sobrenadantes, extractos, péptidos, etc., estos se incorporan a la composición en una proporción de entre 0,01 – 99% en peso sobre el total de la composición y, preferiblemente, en una proporción de entre 0,01 – 40%. De forma preferente, las composiciones alimenticias que incorporan la cepa de la presente invención, así como los compuestos bioactivos, los 5 sobrenadantes, los extractos de cultivo y/o el cultivo comprendiendo la cepa, pueden seleccionarse del grupo que comprende: zumos de frutas o vegetales, helados, formulaciones infantiles, leche, yogur, queso, leche fermentada, leche en polvo, cereales, productos de repostería, productos en base a leche y/o cereales, complementos nutricionales, bebidas refrescantes y/o suplementos dietéticos, etc.

Los productos alimenticios lácteos a los cuales hace referencia la presente invención, tales como leche fermentada, 10 quesos frescos o yogures o sus equivalentes, secados o liofilizados, representan de forma preferente sistemas de suministro adecuados que incorporan la cepa de la presente invención y/o los compuestos bioactivos y/o los sobrenadantes y/o los extractos y/o el cultivo comprendiendo la cepa.

La cepa de la presente invención y/o los compuestos bioactivos y/o los sobrenadantes y/o los extractos y/o el cultivo comprendiendo la cepa pueden, en su caso, ser envasados en cápsulas de celulosa o gelatina, capsulas de gel o 15 comprimidos, entre otros, con fines alimentarios y farmacéuticos.

La cepa de la invención, así como las composiciones que la contengan, están especialmente destinadas para ser utilizadas en mamíferos, esto es, animales y humanos, para el tratamiento del sobrepeso y la obesidad y las enfermedades relacionadas.

Son por tanto objetos de la presente invención la cepa Bifidobacterium animalis subsp. lactis CECT8145, 20 composiciones alimenticias y farmacéuticas que la comprendan, en forma activa e inactiva, y opcionalmente en combinación con otros microorganismos. La presente descripción también se refiere a un método para el tratamiento y/o prevención en mamíferos del sobrepeso y/o la obesidad así como enfermedades asociadas, tales como: síndrome metabólico, hipertensión, glucemia, inflamación, diabetes tipo II, enfermedades cardiovasculares, hipercolesterolemia, alteraciones hormonales e infertilidad, caracterizado por comprender la administración de una 25 cantidad eficaz de la cepa de la invención Bifidobacterium animalis subsp. lactis CECT8145 así como de las composiciones alimenticias y farmacéuticas que la contengan de acuerdo con la presente invención

En el contexto de la presente descripción es también un objeto de la descripción un método para la reducción de peso, colesterol total, triglicéridos y glucosa en sangre, niveles de factor TNFα, malondialdehido y grelina, así como incremento de adiponectina en mamíferos, caracterizado por comprender la administración de una cantidad eficaz 30 de la cepa de la invención Bifidobacterium animalis subsp. lactis CECT8145, así como de las composiciones alimenticias y farmacéuticas que la contengan de acuerdo con la presente invención.

En este sentido, es importante destacar que la presente invención contempla la utilización de la cepa Bifidobacterium animalis subsp. lactis CECT 8145, tanto en su forma de célula viable como no viable (figura 4).

Las células no viables de la invención, inactivadas por distintos procedimientos (congelación, calor, radiación, etc.), 35 pueden utilizarse según la presente invención y forman parte de la presente invención, ya que los efectos deseados son ejercidos, al menos, en parte, por componentes estructurales (como ADN, componentes de la pared celular, etc.). Esto hace posible que la cepa de la presente invención mantenga parte de las propiedades frente a síndrome metabólico y enfermedades relacionadas sin que mantenga necesariamente la viabilidad. Así, tal y como se muestra en el ejemplo 4, un cultivo inactivado de la cepa de la presente invención reduce la grasa corporal en el modelo 40 animal C. elegans; lo cual podría inducir a pensar que el efecto funcional no se debe solamente al metabolismo de la cepa, sino a la presencia de ciertos compuestos en la pared celular.

Se aportan a continuación las siguientes figuras y ejemplos al objeto de ilustrar la presente invención. En ningún caso se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS 45

Figura 1: Escrutinio de 23 cepas del género Lactobacillus sobre la reducción de grasa corporal en C. elegans.

Figura 2: Escrutinio de 15 cepas del género Bifidobacterium sobre la reducción de grasa corporal en C. elegans.

Figura 3: Cuantificación de triglicéridos en C. elegans N2 alimentado con la cepa CECT8145 (BIF-1) o sometidos a dieta estándar (medio NG).

Figura 4: Efecto sobre la reducción de grasa en C. elegans de un cultivo de la cepa CECT8145 (BIF-1) inactivado a 70ºC “overnight”.

Figura 5: Actividad antioxidante de la cepa CECT8145 (BIF-1) estimada tras aplicar un estrés oxidativo con agua oxigenada a C. elegans (N2).

Figura 6: Reducción de grasa corporal respecto a C. elegans (N2; cepa salvaje) y mutantes. 5

Figura 7: Determinación de peso corporal en ratas Zücker obesas tratadas con 1010 UFC/día ( ) de la cepa CECT8145 (BIF-1) durante las 17 semanas del ensayo. Se incluye un grupo control de ratas Zücker obesas ( ) y el grupo de ratas Zücker delgadas ( ).

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Figura 8: Ingesta sólida observada en ratas Zücker obesas tratadas con 1010 UFC/día ( ) de la cepa CECT8145 (BIF-1). Se incluye un grupo control de ratas Zücker obesas ( ) y el grupo de ratas Zücker delgadas ( ). 10

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Figura 9: Colesterol total determinado en ratas Zücker obesas tratadas con 1010 UFC/día de la cepa CECT (BIF-1) (barra gris), respecto a ratas Zücker control (barra negra). Se incluye el control de ratas Zücker delgadas (barra blanca).

Figura 10: Colesterol HDL determinado en ratas Zücker obesas tratadas con 1010 UFC/día de la cepa CECT8145 (BIF-1) (barra gris), respecto a ratas Zücker control (barra negra). Se incluye el control de ratas Zücker delgadas 15 (barra blanca).

Figura 11: Ratio Colesterol total/Colesterol HDL (Índice de Riesgo Cardiovascular) determinado en ratas Zücker obesas tratadas con 1010 UFC/día de la cepa CECT8145 (BIF-1) (barra gris), respecto a ratas Zücker control (barra negra). Se incluye el control de ratas Zücker delgadas (barra blanca).

Figura 12: Concentración de triglicéridos determinado en ratas Zücker obesas tratadas con 1010 UFC/día de la cepa 20 CECT8145 (BIF-1) (barra gris), respecto a ratas Zücker control (barra negra). Se incluye el control de ratas Zücker delgadas (barra blanca).

Figura 13: Concentración de glucosa determinada en ratas Zücker obesas tratadas con 1010 UFC/día de la cepa CECT8145 (BIF-1) (barra gris), respecto a ratas Zücker control (barra negra). Se incluye el control de ratas Zücker delgadas (barra blanca). 25

Figura 14: Niveles de TNFα (marcador de inflamación) determinados en ratas Zücker obesas tratadas con 1010 UFC/día de la cepa CECT8145 (BIF-1) (barra gris), respecto a ratas Zücker control (barra negra). Se incluye el control de ratas Zücker delgadas (barra blanca).

Figura 15: Niveles de adiponectina determinados en ratas Zücker obesas tratadas con 1010 UFC/día de la cepa CECT8145 (BIF-1) (barra gris), respecto a ratas Zücker control (barra negra). Se incluye el control de ratas Zücker 30 delgadas (barra blanca).

Figura 16: Concentración de malondialdehído (marcador de oxidación) determinado en ratas Zücker obesas tratadas con 1010 UFC/día de la cepa CECT8145 (BIF-1) (barra gris), respecto a ratas Zücker control (barra negra). Se incluye el control de ratas Zücker delgadas (barra blanca).

Figura 17: Niveles de grelina (marcador de apetito) determinados en ratas Zücker obesas tratadas con 1010 UFC/día 35 de la cepa CECT8145 (BIF-1) (barra gris), respecto a ratas Zücker control (barra negra). Se incluye el control de ratas Zücker delgadas (barra blanca).

Figura 18: Resistencia de la cepa BIF-1 a pHs ácidos.

Figura 19: Resistencia de la cepa BIF-1 a sales biliares.

Figura 20: El yogur fermentado con la cepa BIF-1 produce mayor reducción de grasa corporal en C. elegans (11,4%) 40 que el yogur convencional comercial.

Figura 21: Efecto reductor de grasa en C. elegans de leche de soja fermentada con la cepa BIF-1.

Figura 22: Efecto reductor de grasa en C. elegans de zumo con la cepa BIF-1 viva e inactiva.

EJEMPLO 1

Escrutinio de bacterias sobre la reducción de grasa corporal en Caenorhabditis elegans.

Se realizó un escrutinio de 23 cepas del género Lactobacillus y 15 cepas del género Bifidobacterium para analizar su efecto sobre la reducción de grasa corporal en el nematodo Caenorhabditis elegans tras su ingesta. Se incluyeron 5 dos cepas comerciales en el estudio, LGG (Lactobacillus rhamnosus) y Bb12 (B. animalis subsp. lactis).

Caenorhabditis elegans acumula grasa en forma de gotas que pueden ser visualizadas mediante tinción con Rojo Nilo (fluorescente). La fluorescencia emitida por dicho colorante se puede cuantificar por fluorimetría. Por tanto, la evaluación del efecto de los distintos microorganismos sobre la acumulación de grasa corporal en el nematodo, se ha llevado a cabo analizando la reducción de fluorescencia en gusanos alimentados con los distintos 10 microorganismos con respecto a gusanos alimentados en condiciones control (medio NG + Escherichia coli).

Los ensayos han consistido en alimentar a C. elegans con los distintos microorganismos desde la fase huevo a la fase de adulto joven (3 días). La alimentación estándar del nematodo ha sido el medio NG, que contenía un césped de la bacteria Escherichia coli.

La tinción de las gotas de grasa se ha realizado mediante adición directa del colorante Rojo Nilo a las placas de 15 medio NG. Los nematodos se incubaron a 20ºC en las distintas condiciones durante la duración del ensayo, y tras el periodo de ingesta, se tomaron muestras de cada condición y se cuantificó la fluorescencia emitida en cada caso. Se ha tomado la condición de alimentación control (medio NG + Escherichia coli) como referencia para cuantificar la fluorescencia en el resto de condiciones.

La Figura 1 muestra los resultados obtenidos con las cepas de Lactobacillus en la reducción de grasa corporal de C. 20 elegans (expresados como porcentaje de reducción de fluorescencia cuantificada en gusanos teñidos con el colorante Rojo Nilo). El mayor porcentaje de reducción de grasa lo proporcionó la cepa LAC-1 (32,4% respecto a condiciones de alimentación estándar).

La Figura 2 muestra el escrutinio de cepas del género Bifidobacterium. La cepa más efectiva en la reducción de grasa corporal fue BIF-1 (40,5% respecto a condiciones de alimentación estándar) 25

En base a los resultados obtenidos con las 38 cepas analizadas, se seleccionó la cepa Bifidobacterium BIF-1 como la más efectiva frente a reducción de grasa, por lo que se procedió a una mayor caracterización funcional y tecnológica de la misma.

EJEMPLO 2 30

Identificación taxonómica y secuenciación genómica

2.1. Identificación

La identificación inequívoca de la cepa BIF-1 se realizó a nivel de género y especie mediante secuenciación del ADN ribosómico (ADNr) 16S. La secuencia obtenida permitió su identificación mediante la comparación de la secuencia de la cepa BIF-1 con el total de secuencias del gen depositadas en las bases de datos públicas utilizando la 35 herramienta en línea BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), obteniéndose la mayor homología (99%) con las secuencias públicas pertenecientes a la especie B. animalis subsp. lactis.

2.2. Secuenciación del genoma

Con el objetivo de caracterizar a nivel genómico tanto la seguridad como la funcionalidad de la cepa BIF-1, se llevó a cabo la secuenciación del genoma completo de la cepa BIF-1 mediante pirosecuenciación en la plataforma 454 Life 40 Science-Roche. Tras la secuenciación, se obtuvieron un total de 434581 secuencias crudas. El ensamblaje de novo posterior permitió organizar las secuencias en 5 scaffolds, siendo el de mayor tamaño de 1.923.368 nucleótidos. El tamaño del genoma de la cepa BIF-1 se ha estimado en 2,1 Mb. No se ha detectado la presencia de genes que codifiquen para factores de virulencia, ni genes de resistencia a antibióticos localizados en zonas con riesgo de transferencia horizontal. 45

EJEMPLO 3

Cuantificación de la reducción de triglicéridos en C. elegans tratado con BIF-1

Se analizó el efecto de la ingesta de la cepa BIF-1 sobre la reducción de triglicéridos en la cepa salvaje N2 de C. elegans.

La determinación de triglicéridos se realizó a partir de poblaciones sincronizadas de C. elegans en fase adulto joven. 5 Los nematodos de cada condición se lavaron en tampón PBS y se sonicaron para su lisado. Las muestras lisadas se utilizaron para determinar los triglicéridos totales mediante un kit comercial basado en una determinación fluorimétrica. Todas las muestras se normalizaron en cuanto a concentración de proteína.

La Figura 3 muestra la cuantificación de triglicéridos en nematodos con alimentación estándar (medio NG) o alimentados con la cepa BIF-1. Se observó una reducción de los triglicéridos totales en nematodos alimentados con 10 la bifidobacteria BIF-1.

EJEMPLO 4

Reducción de grasa corporal en C. elegans con cultivo inactivado de BIF-1

Se analizó el efecto funcional sobre la reducción de grasa en C. elegans tras inactivar a la cepa BIF-1 mediante tratamiento térmico de 70ºC durante 18 horas. 15

Los ensayos consistieron en alimentar a C. elegans con la cepa BIF-1 activada e inactivada desde la fase huevo a la fase de adulto joven (3 días). La alimentación estándar del nematodo se llevó a cabo en medio NG, que contenía un césped de la bacteria Escherichia coli.

La tinción de las gotas de grasa se realizó mediante adición directa del colorante Rojo Nilo a las placas de medio NG. Los nematodos se incubaron a 20ºC en las distintas condiciones durante la duración del ensayo, y tras el 20 periodo de ingesta, se tomaron muestras de cada condición y se cuantificó la fluorescencia emitida en cada caso. Se tomó la condición de alimentación control (medio NG + Escherichia coli) como referencia para cuantificar la fluorescencia en el resto de condiciones.

Los resultados (Figura 4) mostraron que la cepa inactivada a 70ºC mantenía el efecto reductor de grasa en el nematodo, observándose el mismo porcentaje de fluorescencia que con el cultivo fresco. 25

EJEMPLO 5

Actividad antioxidante de la cepa BIF-1 en C. elegans

Se analizó si la ingesta de la cepa BIF-1 producía en C. elegans (N2) una mayor resistencia al estrés oxidativo agudo.

Los ensayos se llevaron a cabo siguiendo la metodología descrita por Martorell y colaboradores (2011). Se utilizó la 30 cepa salvaje N2 de C. elegans. Los ensayos incluyeron una condición control (medio NG al que se adicionó en césped la cepa de E. coli OP50) y la cepa BIF-1. Los ensayos se iniciaron con poblaciones de nematodos sincronizados en edad, que se cultivaron en placas de NG con las distintas condiciones de alimentación. Las placas se incubaron a 20ºC durante 7 días. Tras este periodo, se aplicó un estrés oxidativo con H2O2 (2 mM), y se determinó la viabilidad de los nematodos tras 5 horas de incubación. La Figura 5 muestra los resultados obtenidos 35 en supervivencia de nematodos tras aplicar un estrés con agua oxigenada. Los nematodos alimentados durante 7 días con BIF-1 fueron mucho más resistentes al estrés oxidativo, ya que se contabilizó una supervivencia mayor que en la población sometida a alimentación estándar.

EJEMPLO 6

Estudio transcriptómico en C. elegans con la cepa Bifidobacterium animalis subsp. lactis BIF-1 40

Se estudió el efecto de la ingesta de B. animalis subsp. lactis BIF-1 sobre el transcriptoma de C. elegans. Mediante tecnología de “chips”, se estudiaron los cambios en la expresión génica, en rutas metabólicas y en procesos

biológicos de nematodos alimentados con BIF-1 frente a nematodos con alimentación estándar. En el análisis estadístico, el nivel de significancia utilizado fue de P≤0,05.

6.1. Expresión génica diferencial en nematodos tratados con BIF-1

Se determinó que los nematodos alimentados con la cepa BIF-1 presentaban un perfil de expresión génica diferente a los nematodos con alimentación control. Así, presentaron 296 genes sobre-expresados y 26 genes reprimidos 5 respecto a los nematodos control (Tabla 1).

Tabla 1. Expresión génica diferencial observada en C. elegans alimentado con la cepa BIF-1.

Nº genes reprimidos Nº genes sin expresión diferencial Nº genes sobre-expresados

Tratado BIF-1 vs. Control

26 22303 296

10

El escrutinio de los 296 genes que aparecían sobre-expresados en presencia de BIF-1 reveló distintas agrupaciones 15 funcionales. Así, dichos genes están relacionados con proteólisis, reproducción, desarrollo embrionario, metabolismo de carbohidratos, ciclo de muda, morfogénesis corporal, locomoción, procesos de óxido-reducción, metabolismo de proteínas, transporte, metabolismo de glutatión, metabolismo de aminoácidos aromáticos, respuesta a la radiación gamma, metabolismo de ácidos grasos y rutas de señalización de neuropéptidos.

En cuanto a los 26 genes reprimidos en C. elegans tratados con BIF-1, éstos están relacionados mayoritariamente 20 con la regulación positiva del crecimiento.

6.2. Rutas metabólicas

En cuanto a las rutas metabólicas, se determinó que los nematodos alimentados con BIF-1 presentaban 23 rutas metabólicas sobre-expresadas y 20 reprimidas respecto a nematodos con alimentación control (Tabla 2).

Las Tablas 3 y 4 muestran el listado de las correspondientes rutas metabólicas reguladas al alza o a la baja tras el 25 tratamiento con la bifidobacteria BIF-1.

Tabla 2. Número de rutas metabólicas diferencialmente expresadas en C. elegans alimentado con la cepa BIF-1.

NºRutas metabólicas reprimidas NºRutas metabólicas no afectadas NºRutas metabólicas sobre-expresadas

Tratado BIF-1 vs. control

20 55
23

30

Tabla 3. Lista de rutas metabólicas sobre-expresadas en C. elegans tras el tratamiento con BIF-1 respecto a alimentación control. ID: identificación según base de datos KEGG.

ID KEGG

Rutas metabólicas sobre-expresadas en tratados BIF-1 vs. Control

00190

Fosforilación oxidativa

00480

Metabolismo Glutatión

00982

Metabolismo fármacos-citocromo P450

00980

Metabolismo de xenobióticos por citocromo P450

00983

Metabolismo fármacos – otras enzimas

00670

Biosíntesis folato (Metabolismo, cofactores y vitaminas)

04142

Lisosoma

00260

Metabolismo de glicinina, serina y treonina

00330

Metabolismo de arginina y prolina

00860

Metabolismo de porfirina y clorofila

00270

Metabolismo de cisteína y metionina

01040

Biosíntesis de ácidos grasos insaturados

00040

Interconversiones pentosa y glucuronato

04146

Peroxisoma

00590

Metabolismo ácido araquidónico

00053

Metabolismo ascorbato y aldarato

00514

Otros tipos de biosíntesis de O-glicano

00910

Metabolismo de nitrógeno

00250

Metabolismo de alanina, aspartato y glutamato

00380

Metabolismo del triptófano

00620

Metabolismo del piruvato

00650

Metabolismo del butanoato

00410

Metabolismo de beta-alanina

Tabla 4. Lista de rutas metabólicas reprimidas en C. elegans tras el tratamiento con BIF-1 respecto a alimentación control. ID: identificación según base de datos KEGG.

ID KGGE

Rutas metabólicas reprimidas en tratados BIF-1 vs. Control

04330

Ruta de señalización Notch

03440

Recombinación homóloga

04340

Ruta de señalización Hedgehog

03410

Reparación DNA dañado (Base excision repair)

04310

Ruta de señalización Wnt

03018

Degradación RNA

04710

Ritmo circadiano

04150

Ruta de señalización mTOR

03430

Reparación DNA dañado (Mismatch repair)

03420

Reparación de nucleótidos por escisión

03050

Proteosoma

03013

Transporte RNA

04350

Ruta de señalización TGF-beta

03015

Rutas de vigilancia de mRNA

03040

Spliceosoma

04120

Proteolisis mediada por ubiquitina

03030

Replicación DNA

04141

Procesado proteínas en retículo endoplasmático

04144

Endocitosis

04914

Maduración de oocitos mediada por progesterona

6.3. Procesos biológicos 5

Se determinó en nematodos alimentados con la cepa BIF-1 un total de 26 procesos biológicos regulados al alza y 76 procesos regulados a la baja respecto a nematodos con alimentación control (Tabla 5).

Tabla 5. Número de procesos biológicos diferencialmente expresados en C. elegans alimentado con la cepa BIF-1, frente a nematodos con alimentación control.

10

GO Reprimidos GO Sobreexpresados

Tratados BIF-1 vs. control

76
26

5

Las Tablas 6 y 7 muestran el listado detallado de los procesos sobre-expresados o reprimidos observados en nematodos tratados con BIF-1.

Tabla 6. Lista de los 26 procesos biológicos sobre-expresados en C. elegans tratado con BIF-1. GO: Gene Ontology (base de datos).

GO

Nombre

GO:0030259

Glicosilación de lípidos

GO:0006937

Regulación de la contracción del músculo

GO:0042775

Síntesis de ATP mitocondrial acoplado a cadena de transporte de electrones

GO:0009156

Procesos biosintéticos de ribonucleósido monofosfato

GO:0034220

Transporte transmembrana de iones

GO:0009072

Procesos de metabolismo de aminoácidos aromáticos

GO:0030241

Ensamblaje de miosina del músculo esquelético en filamentos gruesos

GO:0009112

Procesos de metabolismo de nucleobases

GO:0015992

Transporte de protones

GO:0006508

Proteolisis

GO:0040018

Regulación positiva del crecimiento de organismo multicelular

GO:0034607

Comportamiento implicado en apareamiento

GO:0007218

Ruta de señalización de neuropéptido

GO:0046942

Transporte de ácido carboxílico

GO:0072529

Procesos catabólicos de compuestos que contienen pirimidina

GO:0042398

Procesos biosintéticos de aminoácidos modificados

GO:0015833

Transporte de péptidos

GO:0006754

Procesos de biosíntesis de ATP

GO:0009063

Procesos catabolismo de aminoácidos celulares

GO:0048521

Regulación negativa del comportamiento

GO:0055074

Homeostasis del ion calcio

GO:0006637

Procesos del metabolismo de acyl-
CoA

GO:0042338

Desarrollo de cutícula (ciclo de muda) basado en colágeno y cuticulina.

GO:0006814

Transporte de ion sodio

GO:0036293

Respuesta a niveles reducidos de oxigeno

GO:0009069

Procesos metabólicos de metabolismo de aminoácidos de la familia serina

Tabla 7. Lista de los 76 procesos biológicos regulados a la baja en C. elegans tratado con BIF-1. GO: Gene Ontology (base de datos).

GO

Nombre

GO:0016477

Migración celular

GO:0008406

Desarrollo gónadas

GO:0040027

Regulación negativa del desarrollo de la vulva

GO:0042127

Regulación proliferación celular

GO:0040020

Regulación de la meiosis

GO:0006511

Procesos catabólicos de proteínas dependientes de ubiquitina

GO:0045167

Localización asimétrica de proteínas implicada en destino celular

GO:0000070

Segregación de cromátidas hermanas en mitosis

GO:0051729

Ciclo celular germinal

GO:0007052

Organización de mitosis

GO:0007098

Ciclo del centrosoma

GO:0070918

Producción de pequeños RNA implicados en silenciamiento génico

GO:0045144

Segregación de cromátidas hermanas en mitosis

GO:0032465

Regulación de la citocinesis

GO:0000079

Regulación actividad proteína quinasa dependiente de ciclina

GO:0009410

Respuesta a xenobióticos

GO:0030261

Condensación cromosómica

GO:0007606

Percepción sensorial a estímulos químicos

GO:0035046

Migración pronuclear

GO:0090387

Ensamblaje fagolisosoma eliminación células apoptóticas

GO:0045787

Regulación positiva ciclo celular

GO:0006261

Replicación DNA

GO:0006898

Endocitosis mediada por receptores

GO:0001714

Destino celular

GO:0032320

Regulación positiva actiivdad
GTPasa

GO:0000281

Citoquinesis después de mitosis

GO:0090068

Regulación positiva del ciclo celular

GO:0030703

Formación de envoltura del huevo

GO:0018991

Ovoposición

GO:0006997

Organización del núcleo

GO:0000132

Orientación del eje mitótico

GO:0040022

Línea germinal

GO:0006030

Metabolismo de quitina

GO:0032506

Citoquinesis

GO:0032880

Regulación localización proteínas

GO:0040015

Regulación negativa crecimiento organismo multicelular

GO:0045944

Regulación positiva transcripción

GO:0008630

Respuesta al daño a DNA

GO:0000122

Regulación negativa transcripción

GO:0043066

Regulación negativa apoptosis

GO:0010638

Regulación positivia organización orgánulo

GO:0000398

“Eliminación de intrones vía Spliceosoma

GO:0042464

Compensación de dosis por hipoactivación del cromosoma X

GO:0007127

Meiosis

GO:0042693

Destino células del músculo

GO:0032012

Regulación proteina ARF señal de trasducción

GO:0006310

Recombinación DNA

GO:0038032

Ruta de señalización de receptor acoplado a proteína G

GO:0016331

Morfogénesis de epitelio embrionario

GO:0007219

Ruta de señalización Notch

GO:0008356

División celular asimétrica

GO:0042026

Replegamiento de proteínas

GO:0007040

Organización de lisosoma

GO:0045595

Regulación de la diferenciación celular

GO:0032446

Modificación de proteínas por conjugación de proteínas pequeñas

GO:0034968

Metilación de histonas

GO:0008595

Especificación del eje anterior/posterior en embrión

GO:0001703

Gastrulación con formación de boca

GO:0042176

Regulación de catabolismo de proteínas

GO:0006606

Importe proteínas al núcleo

GO:0031114

Regulación de la depolimerización de microtúbulos

GO:0007411

Orientación axón

GO:0006200

Catabolismo de ATP

GO:0016055

Ruta de señalización del receptor Wnt

GO:0000212

Organización del eje mitótico

GO:0006911

Fagocitosis

GO:0046777

Autofosforilación de proteínas

GO:0035194

Silenciamiento génico post-transcripcional mediante RNA

GO:0032269

Regulación negativa del metabolismo de proteínas celulares

GO:0006289

Reparación por escisión de nucleótidos

GO:0006661

Biosíntesis de fosfatidil inositol

GO:0048557

Morfogénesis tracto digestivo embrionario

GO:0051295

Establecimiento de localización del eje meiótico

GO:0006906

Fusión de vesículas

GO:0030071

Regulación de la transición metafase/anafase mitótica

GO:0051053

Regulación negativa del metabolismo de DNA

En resumen, los resultados del estudio transcriptómico muestran que nematodos sometidos a dieta con la cepa BIF-1 presentan un incremento en rutas y procesos metabólicos relacionados con el metabolismo de carbohidratos (fosforilación oxidativa, síntesis ATP, etc.), metabolismo del glutatión (reducción de los niveles de estrés oxidativo), 5 biosíntesis de cofactores y vitaminas, metabolismo de lípidos, metabolismo de nucleótidos, glicosilación y metabolismo de membrana.

EJEMPLO 7

Estudio metabolómico en C. elegans con la cepa BIF-1 10

Se analizó el cambio en el perfil metabólico de C. elegans tras la ingesta de la cepa BIF-1 comparado con el perfil de nematodos con alimentación control (medio NG + E. coli OP50).

Los ensayos consistieron en alimentar a C. elegans con la cepa BIF-1 desde la fase huevo a la fase de adulto joven (3 días). La alimentación estándar del nematodo fue medio NG, que contenía un césped de la bacteria Escherichia coli. 15

Los nematodos obtenidos a este tiempo, fueron sometidos a un análisis metabolómico mediante la aplicación de distintas técnicas analíticas, LC-MS/MS (+ESI) (-ESI) y GC-MS, y un posterior tratamiento bioinformático.

Los resultados mostraron cambios estadísticamente significativos, que se detallan a continuación:

- Metabolismo del glutatión (GSH) y estrés oxidativo: En el estudio, los niveles de γ-glutamileucina y γ-glutamilmetionina fueron mayores en nematodos alimentados con BIF-1 comparado con el grupo de alimentación control, lo que sería consistente con un posible incremento de la actividad γ-glutamiltransferasa (GGT), y por tanto, reciclaje de glutatión (GSH) en respuesta a BIF-1. Además, el oftalmolato, un metabolito que se utiliza para la síntesis de GSH, mostró un descenso significativo en el 5 grupo alimentado con BIF-1, lo que es consistente con el descenso de biosíntesis de GSH. Esto se debe probablemente a una menor demanda de glutatión producida por un menor nivel de estrés oxidativo. Esto se refuerza con el hecho de observar menores niveles de GSSG (GSH oxidado) y cisteina-glutation disulfido, biomarcadores de estrés oxidativo, en el grupo alimentado con la cepa BIF-1.

- Metabolismo de carbohidratos: Muchos metabolitos que participan en el metabolismo de carbohidratos 10 mostraron cambios en el grupo alimentado con BIF-1. Los niveles de maltotetraosa y maltopentosa mostraron altos niveles, mientras que la trealosa 6-fosfato y la glucosa mostraron menores niveles en el grupo alimentado con la cepa BIF-1 respecto a condiciones control. Otras rutas afectadas fueron el metabolismo del glucógeno y la ruta de las pentosas fosfato. Así, el 6-fosfogluconato, mostró un incremento significativo en el grupo BIF-1. Este hecho junto con los altos niveles de ribosa y bajos niveles de ribulaso-5 15 fosfato, serían consistentes con un posible incremento de la actividad de la ruta de las pentosas fosfato en presencia de BIF-1.

- Metabolismo de nucleótidos: Una de las consecuencias de los cambios observados en la actividad de la ruta de las pentosas fosfato es la alteración del metabolismo de nucleótidos. Los nematodos alimentados con BIF-1 mostraron mayores niveles de N-carbamoilaspartato y orotato, dos intermediarios de la síntesis 20 de pirimidinas. También se observaron cambios similares en el metabolismo de las purinas. Así, la alantoína (producto de degradación de purinas) presentó niveles inferiores en nematodos tratados con BIF-1. Además, se determinaron niveles mayores de nucleósidos de purina (adenosina y guanosina), bases (adenina e hipoxantina) y nucleótidos [adenosina 5’-monophosphate (AMP) y guanosina 5’-monofosfate (GMP)] en el grupo tratado con BIF-1. Estos resultados junto con el incremento en precursores de 25 aminoácidos (glutamato y glutamina) observado, y el posible incremento en la actividad de la ruta de pentosas fosfato, darían soporte a la idea de un incremento en la biosíntesis de purinas acompañadas con una disminución de la degradación de las mismas.

- Metabolismo de membrana y colesterol: Se observó en nematodos sometidos a alimentación con BIF-1 un incremento de colina y acetilcolina, que participan no sólo en procesos de glicosilación, sino también en 30 el metabolismo de membrana. Además, el 7-dihidrocolesterol, un intermediario en la biosíntesis de colesterol, se encontró en niveles mayores en nematodos alimentados con BIF-1, lo que es consistente con el efecto de este probiótico sobre la modulación de la biosíntesis del colesterol. Cambios en el contenido de colesterol en la membrana podrían afectar al ambiente de los receptores, los canales de iones u otras proteínas de membrana, y por tanto alterar su función. Además, el metabolismo del colesterol afecta a 35 procesos relacionados con lípidos y hormonas.

- Observaciones adicionales: BIF-1 produce en C. elegans un incremento de los niveles de fosfopanteteina, 3’-defosfocoenzima A y coenzima A (CoA). Además, también produce un aumento de flavin mononucleótido (FMN) y flavin adenina dinucleótido (FAD), consistente con la regulación al alza de la biosíntesis de FAD. El CoA y FAD participan en el metabolismo de carbohidratos, lípidos y aminoácidos. 40

En resumen, la alimentación con la cepa BIF-1 produce un serie de cambios metabólicos en C. elegans relacionados con el metabolismo antioxidante, metabolismo de carbohidratos y nucleótidos. El metabolismo del glutatión parece ser una diana del probiótico para reducir los niveles de estrés oxidativo. Además, la dieta con BIF-1 produce un incremento en la actividad de la ruta de las pentosas fosfato y en la glicosilación. Se observaron adicionalmente 45 alteraciones en el metabolismo del glucógeno, nucleótidos, lípidos y cofactores.

Estos resultados concuerdan con los observados en el estudio transcriptómico (ejemplo 6).

EJEMPLO 8

Identificación de genes diferencialmente expresados

Con el objeto de explicar el mecanismo de acción a partir de los resultados de transcriptómica descrito en el ejemplo 50 6, se abordó un ensayo de reducción de grasa corporal en C. elegans alimentado con la cepa BIF-1. En este ensayo se utilizó tanto la cepa salvaje de C. elegans N2, como distintos mutantes en aquellos genes que se consideraron clave en el estudio transcriptómico. Un gen es clave en el mecanismo de acción de un determinado ingrediente,

cuando el efecto funcional observado en la cepa salvaje N2 de C. elegans, desaparece total o parcialmente. Los resultados que se indican en la tabla 8 abajo y Figura 6 permiten identificar algunos de los genes mutados diana en C. elegans y que se hallan diferencialmente expresados tras la ingesta de la cepa BIF-1 en C. elegans (estudio transcriptómico). Estos resultados permiten explicar las actividades biológicas asociadas a la ingesta de la cepa de la presente invención. 5

Tabla 8: Lista de genes mutados diana en C. elegans

ENSAYOS BIF 1 (B. animalis subsp lactis CECT 8145)

Procesos biológicos

C. elegans (entre paréntesis: nombre del gen mutado) OBESIDAD % reducción respecto a su control

N2 Cepa salvaje 29.21

Β-oxidación ac.grasos en peroxisoma

VC1785(Acox-1) -15.36

RB2015(Acs-5)

12.59

RB859(Daf-22)

19.03

Desaturación ac.grasos

BX153(Fat-7) 0.56

GR1307(Daf-16)

-2.63

Mecanismos homeostais REDOX

VC175(Sod-4) 3.63

RB1764(Trxr-2)

-3.3

Fosforilación oxidativa

RB2434(Asg-2) 5.39

Metabolismo del triptofano

GR1321(Tph-1) 18,19

La Figura 6 ilustra de forma cuantitativa la proporción de reducción de grasa corporal en función de la expresión diferencial de los genes relacionados en la tabla 8.

EJEMPLO 9 10

Estudio pre-clínico en modelo murino

Se abordó un estudio en modelo de rata Zücker obesa, en el que se suministraron tres dosis distintas del probiótico BIF-1 (108, 109 y 1010 UFC/día). El estudio incluyó como control dos grupos de ratas Zücker delgadas. La duración del ensayo fue de 12 semanas, determinándose el peso corporal, y también la ingesta sólida y líquida durante la duración del ensayo. Adicionalmente se realizaron determinaciones bioquímicas al final del ensayo: colesterol total, 15 colesterol HDL, triglicéridos, factor TNFα (marcador inflamación), malondialdehído (marcador de estrés oxidativo), adiponectina y grelina (marcadores de saciedad).

Los resultados se muestran en las Figuras 7 a 17.

En resumen, los resultados del estudio pre-clínico en modelo murino mostraron un efecto positivo en la reducción de peso en ratas Zücker obesas alimentadas con el probiótico BIF-1 a la dosis de 1010 UFC/día (reducción de ganancia 20 de peso de un 6,42% durante el tratamiento frente al grupo control). Además, los animales sometidos a dicha dieta presentaron una menor ingesta sólida. Por otra parte, la determinación de parámetros bioquímicos mostró una reducción de colesterol total, acompañado con un incremento del colesterol HDL. También se observó una ligera

tendencia reductora de triglicéridos y glucosa. Finalmente, el tratamiento con el probiótico BIF-1 dio lugar a una reducción de los niveles de factor TNFα, malondialdehído y grelina, así como un incremento de los niveles de adiponectina.

EJEMPLO 10

Estudio de seguridad 5

El estudio de seguridad de la cepa BIF-1 se realizó siguiendo las directrices marcadas por FAO/OMS (FAO/WHO, 2002). En concreto, se evaluó la producción de metabolitos indeseados: isómeros del ácido láctico (Tabla 9), capacidad de desconjugación de sales biliares (Tabla 10) y aminas biógenas (Tabla 11), y se obtuvo su perfil de resistencia a antibióticos (Tabla 12).

10

Tabla 9. Producción de isómeros de ácido láctico por la cepa BIF-1.

Ácido láctico (g/L de sobrenadante)

CEPA

D-Láctico L-Láctico

BIF-1

0,020 ± 0,000 2,158 ± 0,025

Tabla 10. Capacidad de hidrólisis de sales biliares por la cepa BIF-1 (ND: no detectada).

Actividad BSH (U.I./mg de proteína en el extracto celular) Actividad BSH (U.I./ml de sobrenadante)

CEPA

Glicocolato sódico Taurocolato sódico Glicocolato sódico Taurocolato sódico

BIF-1

0,597 ± 0,028 0,127 ± 0,004 ND 0,0 ± 0,0

Tabla 11. Producción de aminas biógenas por la cepa BIF-1 (ND: no detectada).

Áminas biógenas (μg/ml de sobrenadante)

CEPA

Putrescina Cadaverina Histamina Tiramina

BIF-1

ND ND ND 0,38 ± 0,14

Tabla 12. Concentración mínima inhibitoria de distintos antibióticos obtenida para la cepa BIF-1.

Antibiótico

CMI (µg/mL)

Gentamicina

64

Estreptomicina

128

Eritromicina

0,5

Vancomicina

1

Ampicilina

2

Tetraciclina

8

Kanamicina

128

Cloranfenicol

4

Clindamicina

0,25

5

10

EJEMPLO 11

Propiedades probióticas de la cepa BIF-1

Uno de los principales requerimientos de una cepa probiótica es que pueda permanecer viva durante el tránsito grastrointestinal. Por ello, la cepa BIF-1 se sometió a ensayos de resistencia a condiciones digestivas. En este 15 punto, se realizaron dos ensayos, uno de resistencia a pHs bajos, y un ensayo de resistencia a sales biliares. En el primero, la cepa se puso en contacto con solución salina (0,09% NaCl) a pHs decrecientes durante 15 minutos y se evaluó el número de células presentes (Figura 18). En el segundo caso, se puso a la cepa BIF-1 en contacto 15 minutos con solución salina adicionada de sales biliares (Oxgall) en cantidades crecientes (Figura 19). No se observaron grandes diferencias de supervivencia a excepción de la incubación a pH 4 donde se detectó una ligera 20 pérdida de viabilidad.

EJEMPLO 12

Obtención de un yogur funcional con la cepa BIF-1 (Bifidobacterium animalis subps. lactis CECT 8145)

En un primer paso, se analizó la capacidad fermentativa de BIF-1 sobre la matriz láctea. Para ello, se inoculó un volumen de leche desnatada comercial con distintas dosis de la bacteria (106, 107 y 108 UFC/mL), incubando 24 h a 25 37ºC. Los resultados mostraron una fermentación positiva del probiótico al inocular 107 ó 108 UFC/mL.

Posteriormente, se elaboró un yogur funcional adicionando 108 UFC/mL de la bifidobacteria BIF-1 y una mezcla de fermentos de yogur comercial sobre una base de leche desnatada comercial y leche en polvo (0,6%). Se incluyó en el estudio una fermentación control que únicamente contenía los fermentos de yogur comercial (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus). Mediante recuento en placa selectivo para 30 Bifidobacterium se comprobó la presencia de la cepa BIF-1 al final de la fermentación.

Finalmente, con el yogur obtenido, se abordó un estudio funcional en el modelo pre-clínico de C. elegans para analizar su efecto sobre la reducción de grasa corporal. Los resultados mostraron que el yogur fermentado con la cepa BIF-1 producía una reducción de grasa corporal en C. elegans mayor (11,4%) que el yogur convencional comercial (Figura 20). 35

Además, se determinó el mismo grado de reducción de grasa en C. elegans alimentados con leche de soja fermentada con la cepa BIF-1 (Figura 21).

EJEMPLO 13:

Obtención de un zumo con la cepa BIF-1 (Bifidobacterium animalis subps. lactis CECT 8145).

Se utilizó un zumo de naranja comercial suplementado con distintas dosis (106, 107 y 108 UFC/mL), de la cepa BIF-1 40 (Bifidobacterium animalis subps. lactis CECT 8145) tanto activa como inactiva. La inactivación se realizó mediante

tratamiento del cultivo en autoclave a 121ºC, 30 min. Para el análisis funcional, el zumo suplementado con la cepa BIF-1 a una DO: 30, se adicionó sobre la superficie del medio de cultivo de C. elegans (medio NGM). Se estudió el efecto sobre la reducción de grasa corporal de C. elegans alimentados con zumo que contenía tanto bacterias vivas como inactivadas térmicamente.

Los resultados (Figura 22) mostraron que el zumo suplementado con 107 UFC/mL de la cepa BIF-1 viva producía 5 una reducción de la grasa en el nematodo de un 10,3% respecto a condiciones control (medio NG). Además, el grado de reducción observado en el caso del zumo con 107 UFC/mL de la cepa BIF-1 inactivada fue muy similar, determinándose un 7,2% de reducción de grasa respecto al control.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Cepa de la especie Bifidobacterium animalis subsp. lactis, depositada el 14/05/12 con número de acceso: CECT8145 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT).
2. 2. La cepa de acuerdo con la reivindicación 1, en forma de células viables. 5
3. 3. La cepa de acuerdo con la reivindicación 1, en forma de células no viables.
4. 4. Sobrenadante y/o cultivo y/o extracto y/o compuesto bioactivo que comprende la cepa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 10
5. 5. Composición que comprende la cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
6. 6. Composición según la reivindicación 5, donde la cepa se halla presente en una cantidad entre 105 ufc y 1012 ufc por gramo o mililitro de la composición. 15
7. 7. Composición que comprende el sobrenadante y/o cultivo y/o extracto y/o los compuestos bioactivos según la reivindicación 4.
8. 8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, donde dicha composición es una composición 20 farmacéutica.
9. 9. Composición de acuerdo con la reivindicación 8, que además comprende al menos un vehículo y/o un excipiente farmacéuticamente aceptable.

   25
10. 10. Composición según las reivindicaciones 5 a 7, donde dicha composición es una composición alimentaria.
11. 11. Composición según la reivindicación 10, donde la composición alimentaria se selecciona del grupo que comprende: zumos de frutas o vegetales, helados, formulaciones infantiles, leche, yogur, queso, leche fermentada, leche en polvo, cereales, productos de repostería, productos en base a leche y/o cereales, 30 complementos nutricionales, bebidas refrescantes y/o suplementos dietéticos.
12. 12. Composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11 caracterizada por comprender al menos otro microorganismo seleccionado del grupo que comprende los géneros Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium, Saccharomyces y/o Kluyveromyces, L. rhamnosus, L. delbrueckii subsp. 35 bulgaricus, L. kefir, L. parakefir, L. brevis, L. casei, L. plantarum, L. fermentum, L. paracasei, L. acidophilus, L. paraplantarum, L. reuteri, S. thermophilus, B. longum, B. breve, B. bifidum, B. catenulatum, B. adolescentis, B. pseudocatenulatum, S. cerevisiae, S. boulardii, K. lactis, y K. marxianus.
13. 13. Composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12 para su uso en el tratamiento y/o 40 prevención del sobrepeso y/o la obesidad y/o sus enfermedades relacionadas.
14. 14. Composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, donde las enfermedades relacionadas se seleccionan del grupo que comprende: síndrome metabólico, hipertensión, glucemia, inflamación, diabetes tipo II, enfermedad cardiovascular, hipercolesterolemia, alteraciones hormonales y/o infertilidad. 45