ES2656020T3 - Variantes de GDNF humano - Google Patents

Abstract

Una variante GDNF humana que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No: 23:**Fórmula** en la que: i) Xaa84 es K o A; ii) Xaa88 es R o K; iii) Xaa90 es R o K; iv) Xaa125 es K o E; y v) Xaa130 es R o E.

Description

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DESCRIPCION

Variantes de GDNF humano

La presente invención pertenece al campo de la medicina, particularmente al campo de las proteínas terapéuticas. Específicamente, la presente invención se refiere a variantes novedosas del factor neurotrófico derivado de células gliales humanas (GDNF). Las variantes novedosas del GDNF pueden ser útiles para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.

El GDNF es un factor neurotrófico bien conocido que se informa proporciona soporte trófico a neuronas dopaminérgicas in vitro e in vivo. Adicionalmente, se ha informado que el GDNF proporciona mejoras funcionales y tiene acciones neuroprotectoras en modelos de primates y roedores de la enfermedad de Parkinson. La proteína GDNF tipo silvestre de E. coli se ha administrado centralmente a pacientes que sufren de la enfermedad de Parkinson con resultados mixtos. En dos estudios etiquetados abiertos pequeños, se informa que el GDNF tipo silvestre produce mejora de larga duración en la función motriz. Sin embargo, en un ensayo, aleatorizado, controlado por placebo, fase IIa de 34 pacientes, el suministro intraputamenal del GDNF no mostro mejora sintomática en 6 meses. Un aumento en la señal biomarcadora fue solamente evidente en el tejido inmediato circundante en el sitio de infusión. Un informe reciente indica que el GDNF puede ser una molécula promisoria para rescatar los nervios que mueren; sin embargo, suministrar la molécula al área correcta del cerebro permanece siendo un reto desalentador. Naturaleza, Vol 466:19 de agosto de 2010.

En el documento WO97/11964(PCT/US96/14915) se reportan proteínas GDNF truncadas; sin embargo, continúa siendo una necesidad las variantes novedosas de GDNF con propiedades de biodistribución y estabilidad, propiedades farmacológicas deseadas: subsiste la necesidad de una variante del GDNF que es estable en un dispositivo de suministro, y facilite la biodistribución cerebral deseada, mientras que demuestre propiedades inmunogenicidad aceptables y de potencias deseadas. Las variantes GDNF ofrecen una o más de estas propiedades deseables que pueden ser una nueva terapia medica farmacéuticamente útil, particularmente para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.

La presente invención proporciona una variante GDNF truncada novedosa del dominio GDNF humano maduro que carece de los primeros 31 aminoácidos en el terminal N (“GDNF truncado de terminal N A31”), con determinadas substituciones de aminoácidos introducidas para proporcionar variantes GDNF, de potencia adecuada, estables, que ofrecen propiedades de bio-distribución deseables y un perfil de inmunogenicidad farmacéuticamente aceptable. La presente invención proporciona determinadas variantes de GDNF humano que imparten una o más ventajas sobre el GDNF tipo natural humano maduro que incluye variantes que tienen estabilidad farmacéutica mejorada, así como bio-distribución mejorada, reducción de unión a heparina, reducción de des amidación, susceptibilidad reducida a formación de succinimida, y reducción potencial inmunogenicidad en comparación con GDNF tipo silvestre humano. Determinadas variantes GDNF nuevas pueden ser una opción de tratamiento útil para pacientes con enfermedad de Parkinson.

La presente invención proporciona variantes GDNF humanas que comprende la SEQ ID NO: 23 RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILXaa84

NLSXaa88NXaa9oRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRXaai25HSAKXaai3oCGCI (SEQ ID NO: 23), en las que:

i) Xaa84 K es A;

II) Xaa88 es R o K;

III) Xaa9o es R o K;

IV) Xaai25 es K o E; y v) Xaai3o es R o E.

La invención proporciona adicionalmente una variante GDNF humana en la que dicha variante se selecciona del grupo que consistente de

RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNL SRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI (SEQ ID NO:9),

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RGQRGKQRGC VLT AIHLN VTDLGLG YETKEELIFRY C S G S CD A AETT YDKIL ANL SKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI (SEQ ID NO: 12), y

RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILANL SKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILREHSAKECGCI (SEQ ID NO: 15).

En un aspecto, la invención proporciona una variante GDNF humana que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 9:

RGQRGKQRGC VLT AIHLN VTDLGLG YETKEELIFRY C S G S CD A AETT YDKILKNL SRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI.

La invención proporciona adicionalmente un intermedio, útil para preparar una variante truncada de terminal -N-A31 de GDNF humano maduro. El intermedio comprende la serie de aminoácidos SEQ ID no: 23 RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILXaa84

NLSXaa88NXaa9oRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRXaai25HSAKXaai30CGCI (SEQ ID NO: 23), que se extiende en el terminal -N con un péptido de secreción de señal. Los números de la secuencia de péptidos de señal se puede utilizar aquí: secuencias de péptidos de secreción de señal de ejemplo incluyen del péptido de secreción de señal líder kappa de murino que tienen una secuencia de METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO: 25), y el péptido de secreción de señal de hormonas de crecimiento humano en una secuencia de MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA (SEQ ID NO: 32).

Los intermedios que tienen estos péptidos de secreción de señal pueden producir las variantes GDNF humanas reivindicadas con un aumento de producción sobre las construcciones GDNF truncadas que tienen otras secuencias líderes. Los intermedios divulgados incluyen el péptido de secreción de señal que pueden tener de esta manera una secuencia de aminoácidos de

METDTLLLWVLLLWVPGSTGRGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIF RYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVY HILRKHSAKRCGCI (SEQ ID NO: 28);

o

MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSARGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYET KEELIFRY CSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLV SEKVGQACCRPIAFDDDLSFLD DNLVYHILRKHSAKRCGCI (SEQ ID NO: 35).

La invención proporciona una composición farmacéutica, que comprende una variante de GDNF humano como se reivindica por la presente invención y uno o más diluyentes, vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. La invención proporciona una variante de GDNF humano para su uso como un medicamento. La invención proporciona finalmente una variante de GDNF humano para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. La invención proporciona una variante de GDNF para su uso como terapia.

Se prefiere una variante en la que Xaa84 es A, Xaa88 es K y Xaa9o es K.

Se prefiere una variante en la que Xaa84 es K, Xaa88 es R y Xaa9o es R.

Se prefiere una variante en la que Xaai25 es K y Xaai3o es R.

Se prefiere una variante en la que Xaa84 es A, Xaa88 es K y K Xaa9o es, E Xaai25 es y E Xaai3o es.

Descripción detallada

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Se ha reportado que el GDNF tipo silvestre se une a la matriz extracelular y heparina, probablemente a través de cargas positivas ubicadas en los residuos de aminoácidos 1-31 del terminal-N, limitando por lo tanto la distribución de GDNF luego del suministro cerebro (Lin et al., J Neurochem 63, 758-768, 1994; Rickard et al., Glycobiology 13, 419-426, 2003; Piltonen et al., Experimental Neurology 219, 499-506, 2009). También se ha informado que el GDNF proporciona mejoras funcionales y tiene acciones neuroprotectoras en modelos de roedores y primates de la enfermedad de Parkinson (Tomac et al, 1995; Gash et al., 1996): la proteína GDNF tipo silvestre de E. coli se ha administrado centralmente a pacientes que sufren de la enfermedad de Parkinson con resultados mesclados. En dos estudios etiquetados abiertos pequeños, el GDNF produjo una mejora de larga duración en la función motriz (Gill et al., 2003, Slevin et al., 2005). Adicionalmente, el aumento de la proliferación de neuronas dopaminérgicas fue evidente en un paciente que murió de causas no relacionadas - infarto de miocardio (Love et al 2005). Sin embargo, en un ensayo de fase dos a, controlado por placebo, aleatorizado, de 34 pacientes conducido por Amgen, en suministro de intra-putamen de GDNF (Liatermin) no mostró mejora sintomática en 6 meses (Lang et al., 2006). Las variantes GDNF reivindicada presentan propiedades mejoradas en comparación con la proteína GDNF tipo silvestre probada anteriormente E. coli.

La secuencia (211aa) de construcción de longitud completa de GDNF tipo silvestre que contiene el péptido señal (los primeros 19 aminoácidos, SEQ ID NO: 4), Pro-dominio (cursiva, SEQ ID NO: 5) y péptido maduro (subrayado, SEQ ID NO: 3) se indica como SEQ ID NO: 1:

MKLWDVVAVCLVLLHTASAFPLPAGKRPPEAPAEDRSLGRRRAPFALSSDSNMPE

DYPDQFDDVMDFIQATIKRLKRSPDKQMALPRRERNRQAAAANPENSRGKGRR

GQRGKNRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLS

RNRRLVSDKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI.

La secuencia de ADN de longitud completa de GDNF tipo silvestre se indica como SEQ ID NO: 2:

AT GA AGCT GT GGGACGT GGT GGCCGT GTGCCT GGTGCTGCTGCAC ACCGCCA GCGCTTTCCCACTGCCAGCCGGCAAGAGACCCCCAGAGGCCCCAGCCGAGGA CAGAAGCCTGGGCAGGCGGAGGGCCCCATTCGCCCTGAGCAGCGACAGCAAC ATGCCAGAGGACTACCCCGACC AGTT CGACG ACGT CATGGACTT CAT CCAGG CCACCATCAAGAGGCTGAAGAGGTCACCCGACAAGCAGATGGCCGTGCTGCC CAGGCGGGAGAGGAACAGGCAGGCCGCCGCCGCCAACCCAGAGAATTCCAG GGGCAAGGGCAGAAGGGGTCAACGGGGCAAGAACAGGGGCTGCGTGCTGAC CGCCATCCACCTGAACGTGACCGACCTGGGCCTGGGCTACGAGACCAAGGAG GAGCT GAT CTT CAGGT ACT GCAGCGGC AGCT GCGACGCCGCCGAGACC ACCT ACGACAAG AT CCT GAAGAACCTG AGC AGGAACAGGCGGCT GGT CT CCGACA A GGTGGGCCAGGCCTGCTGCAGGCCC AT CGCCTT CG ACGACGACCT GAGCTT C CT GGACG AC AACCT GGT GT ACCACAT CCT GAGGAAGCAC AGCGCC AAGAGAT GCGGCT GCAT C.

Las posiciones de aminoácidos de las variantes de la presente invención se determinan a partir del polipéptido de aminoácido 134 de GDNF tipo silvestre humano maduro (SEQ ID NO: 3). Las mutaciones se diseñan mediante el aminoácido original, seguido por el número de posiciones de aminoácidos, seguido por los aminoácidos de reemplazo. La designación numérica de cada variante se basa en la secuencia madura tipo silvestre (“GDNF WT maduro") antes de truncación. Por ejemplo, una sustitución para Lys (K) en la posición 84 (es decir K84) con Ala (A) se designa como K84A. En una forma similar, las múltiples substituciones para Lys (K) en la posición 84 con Ala (A), Arg (R) en la posición 88 con Lys (K), Arg (R) en la posición 90 con Lys (K) y Asp (D) en la posición 95 con Glu (E) se designa como K84A/R88K/R90K/D95E. Como se utiliza aquí, la abreviatura “KaKkE” se refiere a K84A-R88K- R90K-D95E.

Como se utiliza aquí, “GDNF de longitud completa'' se refiere a la secuencia de proteína completa, que, incluyendo el péptido señal, prodominio y dominio maduro.

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Como se utiliza aquí, “GDNF maduro” o “GDNF maduro de longitud completa” se refiere al dominio maduro de GDNF completo (con el péptido señal y predominio dividido).

Como se utiliza aquí, “GDNF truncado de terminal N A31” se refiere al dominio maduro GDNF que carece de los primeros 31 aminoácidos en el terminal N. Como se utiliza aquí, “GDNF truncado de terminal N A31” y “variante de GDNF humano” (o “GDNFv”) se utiliza intercambiablemente.

Las construcciones de GDNF de longitud completa cuando se transfectan en células HEK293 durante 5 días producen GDNF maduro de longitud completa predominantemente. Cuando las construcciones de GDNF de longitud completa se transfectan en células CHO durante un largo periodo de tiempo y durante la generación de estirpes celular estable, las formas truncadas de GDNF son las formas predominantes (Lin et al., Science 260, 1130-1132, 1993). Delta31 (“A31”), una forma variante truncada del GDNF maduro humano en el que los residuos de aminoácidos número 1 a 31 se han eliminado en el terminal N, tiene la SEQ ID NO: 8 y se pueden purificar a partir de la mezcla.

La variante GDNF A31 truncada de terminal N se puede producir en un sistema de expresión bacteriano o de mamífero al eliminar tanto la secuencia del péptido de predominio como los 31 primeros residuos de aminoácidos del péptido GDNF maduro en el nivel de ADN y utilizando un número de péptidos de secuencia de señal de secreción, tal como el péptido de señal de secreción GDNF natural (SEQ ID NO: 4: MKLWDVVAVCLVLLHTASA); el péptido de señal de secreción líder kappa de murino (SEQ ID NO: 25: METDTLLLWVLLLWVPGSTG); y el péptido de señal de secreción de hormona de crecimiento humana (SEQ ID NO: 32: MATGSRTSLLLAFgLlCLPWLQEGSA). Estas construcciones pueden producir variantes de GDNF truncadas de terminal N A31 homogéneas de especie individual.

Un experto en la técnica comprenderá que las variantes GDNF reivindicadas no excluyen la posibilidad de glicosilación. Las variantes GDNF reivindicadas pueden ser glicosiladas según sea adecuado, dependiendo del sistema de expresión utilizado. Por ejemplo, variantes GDNF expresadas en mamíferos se glicosilan en la posición N49 mientras que las variantes expresadas bacterianas no.

Cuando se utiliza la construcción de secuencia natural de longitud completa (SEQ ID NO: 2) durante expresión, una mezcla de especies GDNF con diversas truncaciones de terminal N se producen, así como la forma madura (no truncada) con o sin la región de predominio.

Los siguientes ejemplos, realizados esencialmente como se describe adelante, se pueden utilizar para evaluar determinadas características de variantes GDNF humanas de la invención.

Ejemplo 1

Expresión de proteína, purificación y análisis de inmunogenicidad

a. Subclonación, mutación, expresión, despliegue, repliegue, y purificación de GDNFv expresado en E. coli

Subclonación. La cepa de E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL que alberga el plásmido pET-30a (+)/rhGDNF se cultiva en medio de caldo de cultivo Luria-Bertani que contiene kanamicina en una concentración final de 30 pg/ml durante la noche a 37 °C. Después de cosechar las células por centrifugación se aísla el vector de plásmido al utilizar un kit QIAquick Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo el protocolo del fabricante. Luego se utiliza el ADN del plásmido aislado para reacción de extensión de cebador de los genes A31-GDNF y A31-N38Q-GDNF que codifican una proteína A31-GDNF (31 residuos truncados del terminal N de GDNF humano maduro) y la proteína A31-N38Q- GDNF (31 residuos truncados del terminal N del GDNF humano maduro en el que el residuo asparagina en la posición 38 se sustituye por glutamina), respectivamente. Esto se puede lograr utilizando los cebadores de oligonucleótidos A31-for, A31-rev, A31-N38Q-for, y A31-N38Q-rev (SeQ ID NOs: 6, 7, 39, y 40, respectivamente) que contienen los sitios de endonucleasa de restricción Ndel y Xhol diseñados para hibridar los extremos 5' y 3' del gen. Los sitios de restricción NdeI y XhoI se introducen en los extremos 5' de los cebadores codificantes y anticodificantes que permiten clonación de A31-GDNF y A31-N38Q-GDNF en los sitios correspondientes del vector pET-30a(+). Se realiza la reacción de extensión de cebador durante 3 min a 94 °C, seguido por 16 ciclos de etapa tres de 1 min a 94 °C, 0,5 min a 55 °C, y 1 min a 72 °C, con una etapa final de 10 min a 72 °C, en un volumen total de 100 pl al utilizar un ADN plantilla de 80 ng, cebadores directos e inversos, y Supermix PCR (Invitrogen #10572- 014). Los amplicones resultantes varían en electroforesis de gel de agarosa y se limpian utilizando el kit de purificación QIAquick PCR (Qiagen) siguiendo el protocolo del fabricante.

Tanto el gen A31-GDNF o A31-N38Q-GDNF amplificados como el vector pET-30a(+) se digieren durante 2 h a 37 °C con NdeI y XhoI, seguido por purificación del ADN mediante electroforesis de gel de agarosa utilizando el kit de extracción de Gel QIAquick. Luego se liga el A31 GDNF o A31-N38Q-GDNF en el plásmido pET-30a(+) utilizando ligasa de ADN T4 y siguiendo el protocolo del fabricante. Se utiliza 2-5 pl de mezclas de reacción de ligación para transformar directamente 50-100 pl de cepas de E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL, células químicamente competentes siguiendo el protocolo del fabricante (Agilent #230280). Las colonias transformantes resultantes obtenidas al colocar en platos en placas agar Luria-Bertani que contienen kanamicina en una concentración final de 30 pg/ml se tamizan para detectar la presencia de construcciones correctas a través del secuenciamiento del

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plásmido extraído en ambas direcciones al utilizar los cebadores de oligonucleótidos terminadores T7 y promotores T7 estándar.

Mutaciones. La mutagénesis dirigida a sitio se lleva a cabo utilizando el kit de mutagénesis QuikChange Multi Site- Directed Mutagénesis (Stratagene, La Jolla, CA) para preparar A31-N38Q-D95E-GDNF y A31-N38Q-K84A-R88K- R90K-D95E-GDNF. El procedimiento utiliza A31-N38Q-GDNF, insertado en el pET-30a(+) como una plantilla, y los oligonucleótidos A31-N38Q-D95E-for y A31-N38Q-D95E-rev (tabla 1, SEQ ID N°: 41 y 42) como cebadores directos e inversos, respectivamente. Posteriormente, el gen A31-N38Q-D95E mutado exitosamente se inserta en el pET- 30a(+) se utiliza como plantilla, y los oligonucleótidos A31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E-for y A31-K84A-R88K- R90K-D95E-D95E-rev (tabla 1, SEQ ID N°: 43 y 44) como cebadores directos e inversos, respectivamente, para producir A31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E-GDNF. La secuencia de ADN se confirma y el plásmido se transforma en la cepa de E. coli BL21-CodonPlus (DE3)- RIPL células químicamente competentes.

Expresión de proteína. Reservas congeladas permanentes de células de E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL que albergan el plásmido pET-30a(+)/GDNFv se utilizan para inocular 50 ml de medio de caldo de cultivo 2xTY que contiene kanamicina en concentraciones finales de 30 pg/ml a 37 °C. Después de 9 h, se utilizan 5 ml de cultivo iniciador para inocular 6 x 2 litros del mismo medio de cultivo líquido a 37 °C. Cuando el cultivo alcanza una densidad óptica de 600 nm entre 0,8 y 1,4, normalmente después de 16 h, se agrega IPTG a una concentración final de 1 mM y la temperatura de cultivo se reduce entre 27 y 30 °C durante 5 h. Las células se cosechan mediante centrifugación a 10.000 g durante 20 min a 4 °C y se almacenan a -80 °C.

Solubilización de replegado. Se suspende pasta celular en 2-3 volúmenes de una solución de 0,2 mg/ml de lisozima, 5 MgCh y 50 mM Tris-Cl en pH 8 y se le permite incubar con agitación durante 30 min en hielo. La suspensión resultante se sónica en hielo durante 10 min (pulsos de 5 seg, intervalos de 2 seg, 30-40 % de amplitud). Después de eso, el GDNFv se recupera en la forma de cuerpos de inclusión que se aíslan del lisado celular mediante centrifugación a 20.000 g durante 20 min y se solubiliza en guanidina 4 M, cisteína 90 mM, Tris-Cl 20 mM, pH 8,5. La proteína se repliega hasta la forma activa mediante dilución 10X con guanidina 0,2 M, urea 2M, Tris-Cl 20 mM, pH 8,75. La mezcla replegada se mantiene a 4 °C durante 2 días.

Purificación. El GDNFv replegado Ese purifica hasta homogeneidad a través de 3 etapas de cromatografía de columna:

1. Cromatografía de intercambio de cationes (CEX) en columna SP

2. Cromatografía de Interacción hidrófoba (HIC) en columna fenilo

3. Cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) en columna Superdex-75.

La proteína renaturalizada se aplica en primer lugar a una columna de flujo rápido Sefarosa SP equilibrada en 20 mM de acetato de sodio, pH 5. El GDNFv se eluye con un gradiente de sal lineal ascendente de 0,3 para NaCl 1 M en 20 mM de acetato de sodio, pH 5. El grupo de corriente principal CEX se complementa con NaCl hasta una concentración final de 2,5 M y luego aplicada hasta una columna de cromatografía de interacción hidrófoba Fenil Sefarosa HP en 20 mM citrato de sodio, pH 5. La columna HIC se eluye con un gradiente de sal lineal descendente de 2,5 hasta 0 M de NaCl en 20 mM de citrato de sodio, pH 5. El GDNFv se une estrechamente a la columna HIC. El grupo de corriente principal del HIC se concentra luego y se aplica finalmente a una columna de Superdex-75 y la proteína se eluye con PBS, pH 7,4. El producto final se concentra, se filtra a través de una membrana de 0,22 micrómetros y se almacena a -80 °C.

b. Expresión y purificación de GDNFv en células de mamíferos

Se pueden preparar variantes GDNF que codifican genes utilizando técnicas de biología molecular estándar o mediante síntesis génica en un vector de expresión de mamífero controlado por promotor CMV. Los plásmidos recombinantes se utilizan para transfectar transitoriamente células 293EBNA (HEK293) de riñón embriónico humano y el medio se cosecha 5 días después. En otro procedimiento, se generan estirpes de células de ovario de hámster chino (CHO) estables para expresar variantes de GDNF. Los genes que codifican para las proteínas variantes se subclonan en las estructuras principales de plásmidos de supresión que contienen glutamina sintetasa (GS) (plásmidos basados en pEE12.4, Lonza Biologics, Slough, UK)) en marco con la secuencia de señal GDNF natural con prodominio de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las construcciones GDNF de longitud completa (SEQ ID NO: 2) en vectores basados en pEE12.4 se transfectan en CHO y producen formas truncadas de GDNF en el que A31 es la forma predominante y se puede purificar a partir de la mezcla. Cuando el prodominio y los primeros 31 aminoácidos terminal N se eliminan, entonces la variante GDNF truncada del terminal N-A31 se produce eficientemente y limpiamente en un sistema de expresión de mamífero sin la necesidad de purificación desde una mezcla de longitud completa y productos truncados como se informó anteriormente. El péptido de señal de secreción GDNF natural también se puede reemplazar con números de péptidos de señal de secreción, que incluyen el péptido señal de secreción líder Kappa de murino o péptido de señal de secreción de hormona de crecimiento humano. La variante GDNF truncada de terminal N-A31 produce aun eficientemente y limpiamente con todos los péptidos de señal de secreción divulgados, pero con niveles de expresión variables. Las variantes GDNF que

incorporan mutaciones deseadas se subclonan en vectores de expresión adecuados (tal como pEMK-NF2, Lonza) en marco con la secuencia de señal Kappa de murino.

Purificación. El GDNFv se purifica hasta homogeneidad a través de cromatografía de lecho de 4 etapas:

1. Cromatografía de intercambio de cationes (CEX) sobre columna SP 5 2. Cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) sobre columna de fenilo

3. Cromatografía de intercambio de cationes (CEX) sobre columna Capto multi modelo MMC

4. Cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) sobre columna Superdex-75.

En resumen, el medio de cultivo cosechado que contiene proteínas variantes GDNF se aplica en primer lugar a una columna de flujo rápido Sefarosa SP equilibrada en 20 mM de acetato de sodio pH 5. El GDNFv se eluye con un 10 gradiente de sal lineal de NaCl 0 hasta 1M en 20 mM de acetato de sodio pH 5. El grupo de corriente principal CEX

se complementa con NaCl hasta una concentración final de 2,5 M y luego se aplica a una columna de cromatografía de interacción hidrófoba HP Fenil Sefarosa en 20 mM de acetato de sodio, pH 5. La columna HIC se eluye con un gradiente de sal lineal inverso de NaCl 2,5 a 0 M en 20 mM de acetato de sodio, pH 5. El GDNFv se une débilmente a la columna HIC. Un grupo del flujo a través de fracciones de elución temprana se aplica luego a la resina 15 multimodelo de la columna Capto MMC en pH 5. La columna se lava con 50 mM de Tris-Cl, pH 8, y luego se eluye

GDNFv con un gradiente de sal lineal de NaCl 0 a 1 M en 50 mM Tris-Cl, pH 8. La corriente principal de Capto MMC

se aplica finalmente a una columna Superdex-75 y la proteína se eluye con PBS, pH 7,4. El grupo final se filtra a través de una membrana de 0,22 micrómetros y se almacena a 2-8 °C.

Tabla 1. Cebadores de oligonucleótidos utilizados para niutagénesis dirigida a sitio y PCR

Cebador

Secuencia de Nucleótidos

Propósito

Aj l -fiK Aj l nV

A31 -NJRQ-lbr'^ Ajl-h¡j&CJj-rcvJ

A31-K3SQ-D«K-for<r A J l -M jHy-I >9S lí-rcv *

A3l-N3ftQ-kAK.KK-

íbr*

A31-N38Q-KAKXB

5 TATAC.f T i rtiCCiTCjtjACAACtrPCKjTAAA AA CCOTGrtiTTCrTCrTCrC I_ G-3' lli IVn: (i)

5 ■-GOTQCTGGA GTTATTA AATQCAGCCaCAACÜTTTCaOaCT-3'

(SHO ÍLJ Nu:7l

5’-

T A TACAT A TO CCrTCrO ACAACGTGGTAAAC.'C'\CG TCrO TTCi T13 T OCTCi

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5’-

cr ittctce ¡c tcaccaí íacci rnTrmcrit ¡ctCaíK ITTn.t caí « ¡a r¡

TTATCATAQG-3’ (SI5Q I L> No: 44)

PCR

PC’lt

PCR

PCR

Mutagéne-sis

MHtagfnesis

Huta

MuLagóric-sii

'■Sitios de restricción Ce endonucteasa para enzimas Wdet y Xhol se encuentran en cursiva * Las leiras subrayadas indican emparejamientos incorrectos.

20 Análisis Epivax de potencial de inmunogenicidad

Las variantes GDNF humanas seleccionadas con una probabilidad reducida de unión HLA-DR se hacen (SEQ ID no: 12 y 15) y comparan con el GDNF tipo silvestre en el GFRa y el ensayo de unión de heparina.

Ejemplo 2

Estabilidad de GDNF tipo silvestre y variante y GDNF A31

25 La estabilidad de las variantes GDNF truncadas de terminal N A31 y tipo silvestre GDNF madura de longitud completa se pueden evaluar utilizando una serie de técnicas analíticas tal como RP-HPLC, SE-HPLC, HPLC de Intercambio de Cationes y espectrometría de masas para identificar cualesquiera sitios de degradación en estas moléculas. Luego se hacen mutaciones para retirar los sitios de degradación química para mejorar la estabilidad de la variante GDNF humano.

30 Cromatografía de fase inversa analítica (RP-HPLC). En columna Zorbax Ce SB-300Á, 3,5 micrómetros, 4,6 x 50 mm calentada a 60 °C (Agilent Technologies # 865973-909). La fase móvil es 0,1 % TFA en H2O. El GDNFv se eluye

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como un único pico en 214 nm con un tiempo de retención de 19-20 min mediante un gradiente de acetonitrilo lineal de 5 al 50 % durante 30 min en un indica de fluidez de 1 ml/min durante 35 minutos.

Cromatografía de exclusión de tamaño analítica (SEC-HPLC). En columna TSK-G-2000-SW-XL, 5 micrómetros, 7,8 x 300 mm (TOSOH BIOSEP #08540). Fase móvil: PBS + 350 mm de NaCl, pH 7,4, en un índice de fluidez de 0,5 ml/min durante 35 min. El GDNFv eluye como un único pico en 214 nm con un tiempo de retención de —16-17 min.

Cromatografía de intercambio de cationes analítica (CEX-HPLC). En columna Dionex, Propac WCX-10, 4 x 250 mm (Dionex #054993). La fase móvil es de 20 mM de fosfato de sodio, acetonitrilo al 10 %, pH 7. El GDNFv eluye como un pico de complejo con un tiempo de retención de 25-30 min mediante un degradado de sal lineal de NaCl de 0,15 a 0,6 M durante 45 minutos con un índice de fluidez de 1 ml/min durante 52 minutos.

Análisis de estabilidad química (LC-MS) de tipo silvestre (GDNF bacteriano de longitud total) vs GDNFv CHO tipo silvestre (GDNF truncado A31 terminal N).

Se estresa GDNFv CHO tipo silvestre (GDNF truncado A31 terminal N) versus tipo silvestre (GDNF bacteriano de longitud completa) a 37 °C durante 4 semanas para identificar aminoácidos que se pueden asociar con inestabilidad química.

Muestras

1 GDNF de longitud completa de E. coli WT a 4 °C durante 4 semanas, 1,0 mg/ml

2 GDNF de longitud completa de E. coli WT a 37 °C durante 4 semanas, 1,0 mg/ml

3 GDNFv A31 de CHO WT a 4 °C durante 4 semanas, 1,0 mg/ml

4 GDNFv A31 de CHO WT a 37 °C durante 4 semanas, 1,0 mg/ml

Análisis molecular parcial e intacto. Se mezcla una alícuota de 10 jl de cada muestra (la solución se mezcla con 20 |jl de agua o 10 jl de alícuota de cada solución) con 40 jl de 100 mm de regulador tris-HCl, Ph 8, 1,0 jl de 50 mg/ml de DTT a temperatura ambiente durante 30 minutos. Cada muestra se presente para el análisis LC/MS.

Digestión de Lys-C. Se liofiliza una alícuota de 20 jl de cada muestra hasta secado bajo un sistema de vacío de velocidad y luego se reconstituye el material en 0,5 jl de 50 mg/ml de DTT y 4,5 jl de guanidina-HCl 6 M, regulador tris-HCl 0,5 M, pH 8. La mezcla se incuba a 37 °C durante 30 minutos y cada solución se diluye luego con 93 jl de agua y se trata con 2 jl de 0,2 mg/ml de Lys-C (Wako) a 37 °C durante 2 horas. Para GDNFv de CHO, se tratan 30 jl de digestiones trípticas con 0,5 jl de PNGasa F a 37 °C durante 1 hora (para evaluar el perfil de carbohidratos). La digestión se acidifica con 2 jl de TFA al 10 % en H2O antes de análisis LC/MS.

Análisis LC/MS. Las soluciones de muestra se analizan mediante un espectrómetro de masa Waters SYNAPT acoplado con un UPLC Waters Acquity o un espectrómetro de masa premier Waters LCT acoplado con un HPLC Waters 2795.

Análisis descendente. Se obtienen productos de división para GDNF tipo silvestre mediante análisis LC-MS para GDNF parcialmente reducido. Se identifican múltiples productos de división y los datos cuantitativos para aquellas divisiones se muestran en la tabla 2. Diversas divisiones (divisiones entre N15/R16, N22/P23, N25/S26 y N38/R39) tienen rutas de degradación similares como desamidación a través de la formación de succinimida. Para el GDNFv A31 de CHO tipo silvestre, los primeros 31 residuos de aminoácidos se dividen del terminal N, aunque el GDNFv CHO tiene dos sitios de N-glicosilación potenciales por cadena, solamente se N-glicosila un sitio. Los glicanos principales observados son oligosacáridos di- o tri-antennarios con diferentes galactosilación. De manera interesante, no se detectan glicanos significativamente aislados. (Tabla 3)

Análisis ascendente (mapeo de péptidos). Cromatogramas UV de digestión de Lys-C de muestras de estabilidad de GDNF reducidas muestran que, con la excepción del péptido 126-129 de GDNF, todos los péptidos esperados se detectan. Para material CHO, no se detectan péptidos de terminal N (antes R32). Péptidos 38-60 que contienen N49 se glicosilan y se ocupa más del 95 % del Asn49. El péptido 85-96 que contiene N85 no se glicosila. Estos resultados son consistentes con análisis LC/MS para muestras GDNF reducidas.

En general, el homodímero para materiales CHO y tipo silvestre es el componente principal. El componente menor, que se eluye temprano, es el monómero. De acuerdo con el análisis de espectroscopia de masa, el Cys41 de GDNF Cys41 forma un enlace de disulfuro con un residuo Cys libre para el monómero. El porcentaje relativo para picos de monómero es muy bajo y son <1 % para CHO y <0,5 % para el tipo silvestre mediante análisis ultravioleta. El contenido de monómero no se cambia para los materiales estresados.

Las degradaciones, tal como oxidación, desamidación e isomerización, también se obtienen a partir del mapeo de péptidos. Los resultados se muestran en la tabla 4. El GDNF de longitud completa tipo silvestre de E. coli contiene dos residuo MET, M(-1) y M6, y la oxidación para estos sitios es relativamente baja. El GDNF no contiene ningún residuo de Trp. El GDNF tiene ocho residuos Asp para el monómero de longitud completa. Los sitios de

desamidación principales son N25 y N38. En razón a que las desamidación ocurre mucho más rápido en un regulador de pH alto, el porcentaje relativo para aquellos sitios debe ser bajo cuando se estresa en regulador de pH 5 o 6. Un péptido isómero, 85-96, se identifica, pero no es claro debido a la isomerización de Asp a Iso-Asp o racemización del residuo de aminoácido. Es bien sabido que el alto estrés del pH es generalmente la racemización y 5 el bajo estrés del pH es la isomerización de Asp. Para el GDNF de longitud completa tipo silvestre, diversos péptidos muestran las diferentes masas para las muestras de control (4 °C) y de estrés (37 °C). Los más probable es que

estén mal incorporadas durante la biosíntesis de E. coli._________________________________________________

Tabla 2. Porcentaje relativo de división de GDNF

Péptidos GDNF

GDNF de E. coli WT, 4 semanas, 4 °C GDNF de E. coli WT, 4 semanas, 37 °C GDNFv A31 de CHO, semanas 4, 37 °C

Met+1 -134

90,9 57,6 NA

1-134

2,8 4,1 NA

2-134

2,5 4,2 NA

3-134

<0,5 1,5 NA

7-134

0,5 2,4 NA

16-134

<0,5 2,9 NA

Piro E17, 17-134

<0,5 2,9 NA

18-134

0,6 2,0 NA

19-134

1,7 4,1 NA

20-134

<0,5 3,8 NA

26-134

<0,5 2,7 NA

32-134

<0,5 2,9 97,3

39-134

<0,5 4,5 2,7

Tabla 3. GDNFv A31 de CHO: Glicanos en sitio N49 de Glicosilación

Fórmula de glicano N49

Porcentaje relativo ( %)

NeuAc HexNAc

Hex Fc 4 °C durante 4 semanas 37 °C durante 4 semanas

0

2 3 0 0,5 0,5

0

2 3 1 4,3 4,4

0

3 3 0 1,9 2,2

0

3 3 1 15,1 14,8

0

4 3 0 1,8 1,5

0

3 4 1 2,6 3,1

0

4 3 1 9,4 10,0

0

5 3 0 1,3 1,5

0

4 4 1 3,4 3,5

0

5 3 1 6,6 7,0

0

4 5 1 6,3 6,5

0

5 4 1 3,4 3,7

(continuación)

Fórmula de glicano N49 Porcentaje relativo ( %)

NeuAc HexNAc Hex Fc 4 °C durante 4 semanas 37 °C durante 4

semanas

0

6 3 1 1,3 1,4

0

5 5 1 4,0 4,5

0

5 6 0 3,4 3,1

0

6 4 1 1,5 1,5

0

5 6 1 22,5 20,9

0

6 7 0 0,7 0,6

0

6 7 1 5,1 4,6

0

7 8 1 0,5 0,8

Aglicosilación en N49 4,3 4,1

Tabla 4. Mapeo de péptidos LC-MS.

Residuos/Péptidos

Porcentaje relativo (%)

GDNF de E. coli WT

GDNFv A31-de CHO

4 °C, 4 semanas

37 °C, 4 semanas 4 °C, 4 semanas 37 °C, 4 semanas

Oxidación

Met(-1)

1,4 2,5 naa naa

Met6

6,4 11,2 naa naa

Desamidación

N15/N25, N25 Principal

2,8 61,5 na na

N38

1,9 20,3 6,7 27,6

N89

<0,5 4,0 1,2 3,5

Isomerización

Péptido 85-96 de GDNF

<0,5 14,4 3,6 17,7

a No disponible

5

Estos datos indican que la variante GDNF truncada de terminal N-A31 producida en células CHO tiene estabilidad química mejorada debido a la eliminación de los primeros 31 residuos de aminoácidos que incluyen oxidación desamidación significativa de sitios de incremento de frecuencia de mutación de ADN, según se compara con GDNF humano maduro tipo silvestre longitud completa producido por E. coli cuando se estresa durante 4 semanas a 37 °C.

10 Adicionalmente, como se muestra en la tabla 5, la mejora significativa en las propiedades bioquímicas y biofísicas de dos variantes GDNF truncadas de terminal N-A31 mutadas (N38Q y D95E, respectivamente) se observan después de mutación cuando se comparan con el GDNF de E. coli tipo silvestre de longitud completa o la variante GDNF truncada de terminal N-A31 antes de mutación.

Tabla 5. Propiedades biofísicas y bioquímicas mejoradas de las variantes GDNF versus GDNF tipo silvestre después de incubación de 4 semanas a 37 °C con relación a las muestras de 4 °C

GDNF E. coli de WT (SEQ ID NO: 3) GDNFv A31 de CHO (SEQ ID NO: 8) GDNFv D95E- N38Q-A31 de CHO (SEQ ID NO: 9) GDNFv D95E- R90K-R88K- K84A N38Q -A31 de CHO (SEQ ID NO: 12)

o O 37 °C o O 37 °C o O 37 °C o O 37 °C

A- De agregado de alto peso molecular (SEC) a- 0,5 mg/ml

na na 1,2 % 2,7 % 0,7 % 1,4 % 0,9 % 1,7 %

b- 0,1 mg/ml

na na <2 % <2 % <2 % <2 % <2 % <2 %

d-15 mg/ml

na na 0,68 % na 0,43 % na 0,47 % na

e-15 mg/ml (3 congelamiento/descongelamiento)

na na 0,66 % na 0,41 % na 0,43 % na

B- degradación química (RP, % pico no principal) a- 0,5 mg/ml

na na 4,3 % 5,7 % 0,3 % 1,5 % 0% 1,9 %

b- 0,1 mg/ml

na na na >90 % na >90 % na >90 %

C- Estabilidad química y modificación (CEX, % de pico principal) a- 0,5 mg/ml

na 8% 82,3 % 30 % 86 % 57 % 90 % 62 %

b- 0,1 mg/ml

na na na <30 % na 55 % na 53 %

D- Acortamiento de terminal N (Secuencia de péptido de GDNF maduro LC-MS, 1 mg/ ml) a-Met-1-134

91 % 58 % na na na na na na

b-1-134

2,8 % 4,1 % na na na na na na

c- 32-134

<0,5 % 3,0 % 98,2 % 92,8 % 99,6 % 96,0 % 98,4 % 94,9 %

d- 33-134

na na 1,8 % 3,3 % 0,4 % 2,1 % 1,5 % 3,2 %

e-34-134

na na 0,0 % 1,8 % 0,0 % 1,9 % 0,1 % 1,9 %

f-39-134

na na 0,0 % 2,1 % 0,0 % 0,0 % 0,0 % 0,0 %

(continuación)

Tabla 5. Propiedades biofísicas y bioquímicas mejoradas de las variantes GDNF versus GDNF tipo silvestre después de incubación de 4 semanas a 37 °C con relación a las muestras de 4 °C

GDNF E. coli de WT (SEQ ID NO: 3) GDNFv A31 de CHO (SEQ ID NO: 8) GDNFv D95E- N38Q-A31 de CHO (SEQ ID NO: 9) GDNFv D95E-R90K- R88K-K84A N38Q -A31 de CHO (SEQ ID NO: 12)

o O 37 °C o O 37 °C o O 37 °C o O 37 °C

E- Oxidación (LC-MS) a- Met (-1)

1,4 % 2,5 % na na na na na na

b- Met (6)

6,4 % 11,2 % na na na na na na

F- Desamidación (LC-MS) a- N15/25

2,8 % 61,5 % na na na na na na

b- N38/Q38

1,9 % 20,3 % 3,2 % 25,9 % 0,7 % 0,7 % 0,5 % 0,6 %

c- N89/N85

<0,5 % 4 % 1,3 % 2,2 % 1,0 % 1,7 % 1,2 % 1,9 %

G- Isomerización/ Racemización (LC-MS)

a- péptido 85-96

<0,5 % 14,4 % 0,9 % 12,0 % 0,0 % 0,2 % 0,1 % 0,8 %

H- Glicosilación (LC-MS) a- Ocupación - N49

na na 99,3 % 99,3 % 99,6 % 99,7 % 98,1 % 97,9 %

b- Acido Siálico (mol/glicano)

na na 0,9 0,9 0,6 0,6 1,4 1,4

c- Di-antenario

na na 7,8 % 7 % 10,8 % 10,5 % 9,8 % 9,2 %

d- Tri-antenario

na na 54,9 % 54,5 % 49,5 % 50,9 % 55,9 % 55,8 %

e- Tetra-antenario

na na 37,2 % 38,5 % 38,5 % 37,5 % 33,1 % 33,7 %

No disponible (na)

Ejemplo 3

Actividades de unión in vitro

5 Los siguientes ensayos demuestran que determinadas variantes de GDNF humano reducen la unión a heparina mientras conservan la unión del receptor GFRa1 para proporcionar una variedad de características de unión de receptor y heparina diferenciales.

• Cinéticas de unión de GDNFv a GFRs en Biacore

Se pueden expresar variantes de GDNF (GDNFv: truncada A31 terminal N) en células de mamíferos o E. coli 10 (bacteriana) (células CHO o células EBNA HEK293) y purificar como se describe en el ejemplo 1. Las secuencias primarias de las variantes permanecen iguales independientemente de qué sistema de expresión se utilice.

Se utiliza un instrumento Biacore® 2000 para medir las cinéticas de unión de GDNFv a los receptores de la familia GDNF humano y de rata (GFRa1 y GFRa2). Se realizan mediciones a 25 °C. Las muestras se disuelven en regulador HBS-EP (150 mm de cloruro de sodio, 3 mM de EDTA, surfactante P-20 al 0,005 % (p/v), pH 7,4). Se inmoviliza la proteína A, Staphylococcus aureus en células de flujo 1 a 4 de un chip sensor CM4 (GE Healthcare 5 #BR-1005-39) en un nivel de ~200 unidades de respuesta (RU) utilizando química de acoplamiento de aminas para

capturar la quimera GFR Fc (quimera R a-1 fc GDNF/GFR a-1 humana recombinante; quimera Ra-2 Fc GDNF/GFR a-2 humana recombinante; quimera Ra-1 Fc GDNF/GFRa-1 de rata recombinante; quimera Ra-2 GDNF / GFRa-2) de ratón recombinante.

La unión se evalúa utilizando múltiples ciclos. Cada ciclo consiste de las siguientes etapas: 1) inyección de 10 aproximadamente 10 pl de GFR en una concentración de ~1,0 |J g/ml y un índice de fluidez de 10 jL/min, dirigido a una captura de 120-150 RU; 2) inyección de 250 jL de GDNFv en un índice de fluidez de 50 jL/min., en un rango de concentración final entre 10 nM y 0,04 nM seguido por 20 min. para disociación; y 3) regeneración utilizando aproximadamente 30 pl de 10 mm de clorhidrato de glicina, pH 1,5. Se evalúan los índices de asociación y disociación para cada ciclo utilizando un modelo de “unión 1:1 (Langmuir)” en el software BIAevaluation, versión 4.1.

15 Los resultados se muestran en las tablas 6-8 adelante.

Tabla 6. GDNFv: Cinéticas de Unión y Afinidad a GFRa-1 Humano

GDNFv fon (M-1 s-1)

foff (s-1) Kd (pM)

E.Coli-WT-GDNFa (SEQ ID NO:3)

E.Col/-A31-GDNF (SEQ ID NO:8)

E.col/-A31-N38Q-D95E-GDNF (SEQ ID NO:9)

E.Col/-A31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E-GDNF (SEQ ID NO: 12)

CHO-A31-GDNF (SEQ ID NO:8)

CHO-A31-N38Q-D95E-GDNF (SEQ ID NO:9)

CHO-A31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E-GDNF (SEQ ID NO: 12)

(6,0 ± 2,3) x 106

(3,5 ± 0,8) x 10-4 64 ± 23

(4,2 ± 1,3) x 106

(1,7 ± 0,7) x 10-4 44 ± 30

(3,9 ± 1,3) x 106

(1,6 ± 0,3) x 10-4 47 ±25

(5,0 ± 1,8) x 106

(1,6 ± 0,2) x 10-4 35 ±18

(3,8 ± 1,5) x 106

(0,9 ± 0,1 x 10-4 29 ±17

(4,5 ± 2,1) x 106

(1,1 ± 0,2) x 10-4 30 ±14

(6,2 ± 3,2) x 106

(1,4 ± 0,4) x 10-4 29 ±15

a Determinado en la presencia de 400 mm de NaCl.

Tabla 7. GDNFv: Cinéticas de Unión y Afinidad a GFRa-2 Humano.

GDNFv

kOn (M-1 s-1) kOff (s-1) Kd (pM)

E.Coli-WT-GDNF (SEQ ID NO:3)

2,4 x 106 2,6 x 10'4 100

CHO-A31-GDNF (SEQ ID NO:8)

5,3 x 106 2,5 x 10-4 47

CHO-A31-N38Q-D95E-GDNF (SEQ ID NO:9)

7,6 x 106 3,5 x 10-4 47

CHO-A31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E-GDNF (SEQ ID NO:12)

9,6 x 106 4,2 x 10'4 44

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Tabla 8. Cinéticas de Unión y Afinidad de GDNFv a GFRa-1 de rata.

GDNFv

kOn (M-1 s-1) kOff (s-1 3) Kd (pM)

CHO-A31-GDNF (SEQ ID NO:8)

5,6 x 106 2,4 x 10-4 * 44

CHO-A31-N38Q-D95E-GDNF (SEQ ID NO:9)

9,4 x 106 1,9 x 10-4 20

CHO-A31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E-GDNF(SEQ ID NO:12)

9,9 x 106 2,1 x 10-4 21

Unión de variantes GDNF humano a GFR a 1 utilizando ELISA

Se prueba GDNF tipo silvestre variantes y en un ensayo ELISA, en el que se mide la unión de las proteínas GDNF al receptor unido a placa (GFRa1). Se utiliza la condición “no GDNF” y/o una condición de “proteína irrelevante” como controles negativos.

Cada pozo de una placa de 96 pozos (placas ELISA Immunobind Greiner 655081) se recubren con 70 jl de GFRal humano (quimera GFRa1-Fc humana recombinante, libre de portador) en 1 jg/ml en regulador de carbonato, pH 9,6. Si se recubre un receptor irrelevante, es una quimera Fc irrelevante y se recubre en la misma concentración que el GFRal. Las placas se sellan y se incuban a 4°C durante la noche. Los pozos se aspiran y se lavan dos veces con regulador de lavado (20 mm Tris (hidroximetilo) aminometano, pH 7,4, NaCl 0,15M, Tween-20 al 0,1 %), utilizando un lavador de placas automático. Las placas se bloquean con 200 jl de regulador de bloqueo por pozo (leche instantánea de clavel al 3 % en el anterior regulador de lavado) durante por lo menos 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan dos veces con regulador de lavado.

Las proteínas GDNF se diluyen en serie en regulador de bloqueo en un rango de concentración adecuado, normalmente empezando en 5 jg/ml y diluyendo en serie 1:10. Se utiliza control no GDNF, que consiste en regulador de bloqueo solo. Se agrega 50 jl de cada solución GDNF a pozos recubiertos con GFRa1 por triplicado. Las placas se incuban durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Los pozos se lavan luego 3 veces con regulador de lavado.

Una alícuota de 50 jl de anticuerpo GDNF antihumano biotinilado (R&D Systems, anticuerpo policlonal GDNF antihumano de cabra biotinilado, catálogo # BAF212) diluido hasta una concentración de 1 jg/ml en regulador de bloqueo, se agrega a cada pozo y se incuba durante 45 minutos a temperatura ambiente. Luego se lavan los pozos

3 veces con regulador de lavado.

Se agrega una alícuota de 50 jl de estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano (Jackson ImmunoResearch, catálogo # 016-030-084), diluido 1:1.000 en regulador de bloqueo, a cada pozo y se incuba durante 20-30 minutos a temperatura ambiente. Alternativamente, se puede utilizar una dilución de 1:2.000, con un tiempo de incubación de 30-90 minutos. Luego se lavan los pozos 3 veces con regulador de lavado. Se agrega 50 jl de sustrato cromogénico (es decir, sustrato OPD) a cada pozo y se deja desarrollar a temperatura ambiente durante 2-3 minutos. La reacción se detiene al agregar 100 jl de HCl 1N a cada pozo. La absorbancia de los pozos se lee a 490 nm sobre un lector de placas a Molecular Devices SpectraMax250. El promedio de absorbancia para los pozos triplicados para cada condición se determina, y los valores resultantes se procesan para cálculo EC50 con software Graph Pad Prism para proporcionar un rango de confidencia del 95 %. Aquellos rangos se resumen en la tabla 9 adelante.

•Unión de variantes GDNF humanas a heparina utilizando ELISA

Se prueba GDNF tipo silvestre y variantes en un ensayo ELISA, en el que se mide la unión de las proteínas GDNF a heparina unida a placas. Se utiliza una condición “no GDNF” como un control negativo.

Cada pozo de una placa de Unión de Heparina de 96 pozos (Placas de Unión de Heparina BD BioSciences, catálogo # 354676) con 70 jl de heparina ((heparina de peso molecular mixto de Sigma, Sal de Sodio de Heparina de Mucosa Intestinal de Porcino, catálogo # H-3149) en 5 jg/ml en PBS. Las placas se sellan e incuban a temperatura ambiente durante la noche, protegidas de la luz. Los pozos se aspiran y lavan tres veces con regulador de lavado utilizando un lavador de placas automático. Las placas se bloquean con 200 jl de regulador de bloqueo por pozo durante 90-120 minutos a 37 °C (las placas se sellan durante esta incubación). Las placas se lavan dos veces con regulador de lavado.

Proteínas GDNF se diluyen en serie en regulador de bloqueo en un rango de concentración apropiado, normalmente empezando en 5 jg/ml y diluyendo serialmente, 1:10. Se utiliza un control de “no GDNF”, que consiste de solo regulador de bloqueo. Se agrega una alícuota de 50 jl de cada solución de GDNF a pozos recubierto con heparina por triplicado. Las placas se incuban durante 1,5-2 horas a temperatura ambiente. Los pozos se lavan 3 veces con regulador de lavado.

Se agrega una alícuota de 50 |jl de anticuerpo GDNF antihumano biotinilado, diluido a una concentración de 1 |jg/ml en regulador de bloqueo, a cada pozo y se incuba durante 45 minutos hasta 1 hora a temperatura ambiente. Luego se lavan los pozos 3 veces con regulador de lavado.

Se agrega una alícuota de 50 jl de estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano, se diluye 1:1.000 en 5 regulador de bloqueo, a cada pozo y se incuba durante 20-30 minutos a temperatura ambiente. Alternativamente, se puede utilizar una dilución 1:2.000, con un tiempo de incubación de 30-90 minutos. Los pozos se lavan luego 3 veces con regulador de lavado. Se agrega una alícuota de 50 jl de sustrato cromogénico (es decir, sustrato OPD) a cada pozo y se deja desarrollar a temperatura ambiente durante 2-3 minutos. La reacción se detiene al agregar 100 jl de HCl 1N a cada pozo. La absorbancia de los pozos se lee en 490 nm sobre un lector de placas. Se determina la 10 absorbancia promedio para los pozos triplicados para cada condición, y los valores resultantes se procesan para cálculo EC50 con el software Graph Pad Prism para proporcionar un rango de confidencia de 95 %. Aquellos rangos se resumen en la tabla 9 adelante.

Tabla 9

Variantes

# de Experimentos (n) Unión GFRa1, EC50 rango de confidencia de 95 % # de Experimentos (n) Unión a heparina, EC50 rango de confidencia del 95 %

E.Co/i-WT-GDNF (SEQ ID NO:3)

8 0,3 -0,4 nM 10 0,2 -0,4 nM

CHO A31 GDNF (SEQ ID NO:8)

14 0,3 -0,6 nM 16 2,0 -5,0 nM

CHO A31-N38Q-D95E GDNF (SEQ ID NO:9)

4 0,3 -1,9 nM 3 19,8 -41,3 nM

CHO A31-N38Q-K84A- R88KR90K-D95E GDNF (SEQ ID NO: 12)

5 No se puede determinar; no hay meseta máxima para 4 de 5 experimentos 5 No se puede determinar; no hay meseta máxima para 4 de 5 experimentos

CHO A31-N38Q-K84A- R88K- R90K-D95E-K125E-R130E GDNF (SEQ ID NO:15)

1 Poca a ninguna unión vista mediante este ELISA 1 Poca a ninguna unión vista mediante este ELISA

*se hicieron 2 experimentos individuales, ningún compuesto

15 Estos datos muestran que la eliminación de los 31 aminoácidos de terminal N (variante denominada “GDNF A31 de CHO”) del GDNF tipo silvestre (denominado “GDNF de E. Coli WT”) pueden reducir significativamente la unión a heparina (aproximadamente 10 veces) mientras que mantiene la unión del receptor GFRa1, y estos datos indican adicionalmente que una variedad de características de unión de receptor y heparina diferenciales se pueden alcanzar a través de variantes adicionales de GDNF humano.

20 Ejemplo 4

Actividades in vitro

•Ensayo de crecimiento de Neuritas NS-1

Se evalúa la actividad GDNF para diferenciación neuronal utilizando células Neuroscreen-1 de rata (subclon PC12). Las células se mantienen en medio basal F-12K, suero de caballo inactivado por calor al 12,5 %, suero bovino fetal 25 inactivado por calor al 2,5 % (FBS), GlutaMAX™ 1X (Invitrogen, CAT. # 35050061) y anti-anti 1X (Invitrogen, Cat. #15240) a 37 °C, 95 % de humedad en frascos recubiertos con colágeno. Para medir el crecimiento de neuritas, se siembran células Neuroscreen-1 en placas de 96 pozos collagen I en 2.200 células por pozo en medio de cultivo utilizando solamente 60 pozos interiores. Después de 24 horas de adhesión celular, se retira el medio y el medio de

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crecimiento nuevo que contiene GFRa1-Fc en 1 pg/ml más GDNF se diluye en una serie de dilución de 8 puntos se agrega a la placa en pozos triplicados, o seis pozos por concentración. Se incluye el medio más 1 pg/ml de GFRa1- Fc como un control negativo, y el medio más 25 ng/ml de factor de crecimiento de neurita se incluye como un control positivo para la respuesta celular en el ensayo. Las placas se incuban durante 96 horas a 37 °C, 95 % de humedad y se fijan luego al agregar 45 pl de solución fijadora a cada pozo y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavan dos veces con regulador de lavado 1x de Neurite Outgrowth Hit Kit™ (Celómica, Cat. #K07- 0001-1) y se lava luego dos veces con regulador 1X del kit. Las células se inmuno-tiñen con reactivos de crecimiento de neuritas del kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las placas se cargan en un Arrayscan Instrument y se analizan utilizando el software Arrayscan y el algoritmo Neuronal Profiling de Cellomics. Se procesan los datos generados mediante el algoritmo para el cálculo EC50 con el software Graph Pad Prism.

Se prueban múltiples variantes para actividad en diferenciación neuronal y se observan EC50 para cada variante que se enumera en la tabla 10A.

Table 10A. GDNFv: Crecimiento de Neuritas NS-1

GDNFv

Repet/c/ones EC50 (rango de confidencia del 95 %)

£.Co//-WT-GDNF (SEQ ID NO:3)

3 33 -200 pM

CHO-A31-GDNF (SEQ ID NO:8)

17 42 - 82 pM

CHO-A31-N38Q-D95E-GDNF (SEQ ID NO:9)

5 47 - 227 pM

CHO-A31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E-GDNF (SEQ ID NO:12)

5 52 - 384 pM

CHO-A31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E-K125E-R130E-GDNF (SEQ ID NO:15)

2 nda

a No determinado debido a su baja potencia o falla al alcanzar la meseta máxima.

Todas las muestras GDNF aquí han tenido actividad en el ensayo de crecimiento de neuritas, en grados variables. Las curvas de dosis para la variante A31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E-K125E-R130E no alcanzan una meseta en una dosis máxima en los dos experimentos realizados, de tal manera que no se puede calcular EC50. Los intervalos de confidencia de 95 % de EC50 para las otras cuatro variantes GDNF se sobreponen en rango, demostrando niveles de actividad similares en este ensayo.

• Fosforilación del Receptor C-ret

Se puede utilizar el ensayo de fosforilación del receptor c-Ret para demostrar la inducción de fosforilación del receptor c-Ret en la posición Y1016. Se evalúa la actividad GDNF para fosforilación del receptor c-Ret en células de la estirpe de células de neuroblastoma humano SH-SY5Y (ATCC) que han sido transfectadas establemente para sobreexpresión del c-Ret humano. Las células se mantienen en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), FBS al 10 %, 3 pg/ml de Blasticidina. Para fosforilación c-Ret, las células se siembran en 5 x 105 por pozo en placas recubiertas de colágeno de 24 pozos en medio de crecimiento sin Blasticidina y se dejan unir durante la noche. El medio se cambia a DMEM bajo en glucosa + BSA al 0,25 % (albúmina de suero bovino) durante 24 horas. Se elimina el medio de inanición, y las células se tratan con GDNF en DMEM sin glucosa, BSA al 0,25 %, pg/ml GFRa1 Fc durante 30 minutos a 37 °C. Cada variante GDNF se prueba en múltiples concentraciones. El medio de tratamiento se retira, y las células se raspan de la superficie de la placa en regulador de lisis enfriado con hielo de reactivo de extracción M-Per + cóctel Inhibidor de Proteasa, Inhibidor Fosfatasa 1, cóctel Inhibidor de Fosfatasa 2, y coctel Inhibidor de Fosfatasa 3 (Sigma™). Las suspensiones celulares se centrifugan para completar la lisis, se centrifugan a 14.000 x g para sedimentar residuos celulares, y se cuantifica el sobrenadante para determinar la concentración de proteínas utilizando reactivos de ensayo de ácido bicinconinico (BCA). Para cada lisato GDNF, 10 pg de proteína se separan mediante geles NuPAGE® Novex® Bis-Tris al 4-12 % (Invitrogen, cat. # NP0322) y se transfieren por transferencias PVDF. Se detecta tirosina 1016 Fosfo-Ret con anticuerpo policlonal de conejo y anticuerpo de cabra anti-conejo-HRP; y se detecta c-Ret con un anticuerpo monoclonal de ratón y un anticuerpo de cabra-anti-ratón-HRP. Las transferencias se desarrollan con reactivos Supersignal West Pico™ (Thermo Scientific, CAT. # 34081) y se exponen a películas de rayos x. Se prueban cinco variantes GDNF (WTE.coliGDNF CHO A31 GDNF, CHO 431-N38Q-D95E GDNF, GDNF A31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E CHO y CHO A31-N38Q-K84A- R88K-R90K-D95E-K125E-R130E GDNF) en DMEM sin glucosa, medio BSA al 0,25 % + 1 pg/ml de GFRa1-Fc para actividad de fosforilación c-Ret en cuatro concentraciones de 0,8, 2,0, 4,0, 10, 20, 50 y 100 ng/ml. También se prueba el medio solo, medio + pg/ml GFRa1-Fc, y medio 100 ng/ml de GDNF A31 de CHO como controles negativos. Cada una de las cinco variantes GDNF inducen fosforilación con c-Ret con un EC50 de 8-15 ng/ml. Estos

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datos demuestran que todas las cinco variantes GDNF inducen fosforilación c-Ret en Y1016 en una forma dependiente de dosis.

Como se resume en la Tabla 10B, las variantes GDNF truncadas de terminal N-A31 diseñadas con ingeniería que muestran mejora significativa en propiedades biofísicas y bioquímicas (tablas 5, 6, 9, y 10A) conservan propiedades biológicas optimizadas, por ejemplo, en comparación con la unión del receptor GFRal, reducen la unión a heparina, y el crecimiento de neuritas comparable, después de 4 semanas de incubación a 37 °C.

Tabla 10B: Comparación de Bioactividad de GDNF de E. coli WT y variantes de GDNF truncadas terminal N- A31 Después de 4 Semanas de Incubación a 37 °C con Relación a las muestras de 4 °C

WT- E. coli GDNF (SEQ ID NO: 3) CHO-A31- GDNFv (SEQ ID NO: 8) CHO-A31-N38Q- D95E-GDNFv (SEQ ID NO: 9) CHO-A31-N38Q- K84AR88K-R90K- D95EGDNFv (SEQ ID NO:12)

0 O 37 °C 0 O 37 °C 0 O 37 °C 0 O 37 °C

GFRa-1 (Biacore, Kd, pM)

64 ± 23 nc 29 ± 17 nc 30 ± 14 nc 29 ± 14 nc

GFRa-1 (ELISA, EC50, nM)

0,4 nc 0,6 nc 0,8 nc nd nd

Heparina (ELISA, EC50, nM)

0,3 0,4 2,7 5,1 18,0 nc nd nd

Crecimiento de Neuritas (rango EC50, pM)

33-200 nc 42-82 nc 47-227 nc 52-384 na

No disponible (na); No determinado (nd); y sin cambio (nc)

Ejemplo 5

Actividad de la variante GDNF en ensayos de recambio de DA

Se anestesian ratas Sprague-Dawley macho utilizando isoflurano (3 % en O2). Se afeita la cabeza y se esteriliza con solución de yodo antes que se posicione al animal en una estructura estereotáxica con una manta de temperatura controlada. Se protegen los ojos con gel oftálmico y se conserva la anestesia utilizando isoflurano (1-2 % en O2).

Se realiza una incisión en la línea media sobre la cabeza del animal, el cuero cabelludo y el tejido subyacente se retraen y se seca el cráneo para visualizar el bregma. Se miden las coordenadas para el núcleo caudado del bregma y la superficie dural para infusión de GDNF. Se desciende lentamente una cánula de infusión calibre 28 hasta esta posición, y empieza la infusión un minuto después utilizando una bomba. Se infunde un bolo de 2 pl del GDNF de prueba dentro del hemisferio izquierdo durante 4 minutos en 0,5 pl/min, y la cánula permanece en el lugar durante 3 minutos adicionales una vez termina la infusión. Después que se ha retirado la cánula se cierra el sitio de incisión, se administra un analgésico posoperativo y se deja que se recupere el animal en una jaula a temperatura controlada antes de transferir a una jaula casera. Los animales se controlan posoperativamente de acuerdo con las directrices éticas locales. En un intervalo adecuado luego de la infusión, se sacrifica al animal, se retira el cerebro y se diseca precisamente el núcleo caudado, se pesa y congela pendiente de análisis HPLC de metabolitos y dopamina. El tejido congelado se deja descongelar rápidamente y se homogeneiza en 0,5 ml de regulador de homogenización (ácido perclórico 0,1 M (PCA), 0,1 mM de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), 2,5 mg/L de ácido ascórbico) antes de centrifugación en 20.000 g durante 15 minutos. Se retira el sobrenadante y se filtra a través de un dispositivo de filtración sin jeringas. Se lleva a cabo análisis de dopamina (DA), ácido dihidroxifenilacético (DOPAC) y ácido homovanílico (HVA) utilizando HPLC acoplado para detección electroquímica. Se inyecta una alícuota de 20 pl de cada muestra y se cuantifica contra una curva de calibración externa (LC4C, BAS, USA). La fase móvil consiste de 100 mm de NaH2PO4, 100 mm de H3PO4, 2 mm de OSA, 1mm de EDTA, metanol al 13 % (MeOH), pH 2,8 utilizando un Hypersil BDS (Base Deactivated Silica) (Thermo Scientific, Cat. # 28105) 150 x 3,0 mm C18 columna de partículas de 3p a 40 °C. Se recolectan datos utilizando un software de cromatografía Empower. Se realiza ajuste logístico de 4 parámetros en todos los datos antes de expresión como tejido en peso húmedo ng/g. La

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medición de recambio de dopamina se expresa como (DOPAC+HVA)/DA y se realizan comparaciones con hemisferio izquierdo (Tratado) versus hemisferio derecho (intacto).

Tabla 11

Variante

Recambio de dopamina Recambio de dopamina

Tratado (izquierda) Intacto (derecha)

E. coli-WT GDNF (SEQ ID NO:3)

0,25 ± 0,025 *** 0,15 ± 0,008

CHO- A 31-GDNF (SEQ ID NO:8)

0,25 ± 0,016 *** 0,14 ± 0,006

CHO-A31-N38Q-D95E-GDNF (SEQ ID NO: 9)

0,25 ± 0,018 *** 0,13 ± 0,007

CHO-A31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E -GDNF (SEQ ID NO: 12)

0,20 ± 0,015 *** 0,13 ± 0,012

CHO-A31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E-K125E-R130EGDNF (SEQ ID NO:15)

0,19 ± 0,021 ** 0,14 ± 0,011

Los valores son media ± e.e.m. n=5 por grupo

** p<0,01 o *** p<0,001 vs lado intacto

Los datos demuestran que cada una de las variantes GDNF mencionadas en la tabla 11 aumentan significativamente el recambio de dopamina en el hemisferio tratado, en comparación con el hemisferio intacto.

Ejemplo 6

Ensayos in vivo

• Modelo de lesión retrógrada inducida por 6-Hidroxi dopamina (6-OHDA)

Se anestesian ratas Sprague-Dawley macho utilizando isoflurano (3 % en O2). Se afeita la cabeza y se esteriliza con solución de yodo antes que se posicione al animal sobre un marco estereotáxico con esterilla de temperatura controlada. Se protegen los ojos con gel oftálmico y se conserva la anestesia utilizando isoflurano (1-2 % en O2).

Se hace una incisión en la línea media en la cabeza del animal, se retira el cuero cabelludo y el tejido subyacente y se seca el cráneo para visualizar el bregma. Se miden las coordenadas para el núcleo caudado desde el bregma y la superficie dural para infusión de 10 ug de 6-Hidroxidopamina (6-OHDA). Se baja lentamente la cánula de infusión del calibre 28 a esta posición y comienza la infusión 1 minuto después. Se infunde un bolo de 2 pl de 6-OHDA dentro del hemisferio izquierdo durante 4 minutos a 0,5 pl/min y la cánula permanece en el lugar durante 3 minutos adicionales una vez termina la infusión.

A 30 minutos después de la infusión de 6-OHDA se infunde el GDNF de prueba utilizando el mismo protocolo. Las coordenadas para la infusión GDNF son Anterior-Posterior + 1,0, LM-2,5, DV-4,5 mm desde el bregma y la superficie dural como se hizo anteriormente.

Una vez se ha retirado la cánula se cierra el sitio de incisión, se administra un analgésico posoperativo y se permite al animal recuperarse en una jaula de temperatura controlada antes de transferencia a una jaula doméstica. Los animales se controlan posoperativamente de acuerdo con las directrices de ética local. En un intervalo adecuado después de la infusión se sacrifica el animal, se extrae el cerebro y el núcleo y la substantia nigra disecados en forma precisa, pesados y congelados, pendiente análisis HPLC de dopamina y metabolitos.

El tejido congelado se deja descongelar rápidamente y se homogeneiza en 0,5 ml de regulador de homogenización (PCA 0,1 M, 0,1 mm de EDTA, 2,5 mg/L de ácido ascórbico) antes de centrifugación a 20.000 xg durante 15 minutos. El sobrenadante se retira y filtra a través de dispositivos de filtración sin jeringa. Se lleva a cabo análisis de dopamina (DA), DOPAC y HVA utilizando HPLC acoplado para detección electroquímica. Se inyecta una alícuota de 20 pl de cada muestra y se cuantifica contra una curva de calibración externa. La fase móvil consiste de 100 mm de NaH2PO4, H3PO4 de 100 mm, 2 mM OSA, 1 mM EDTA, MeOH al 13 %, pH 2,8 utilizando un BDS Hypersil 150 x 3,0 mm C18 columna de 3 p de partícula a 40 °C. Los datos se recolectan utilizando software de cromatografía

Empower. Se realiza ajuste logístico de 4 parámetros en todos los datos antes de expresión como tejido pesado en húmedo ng/g. Se realizan comparaciones con el hemisferio izquierdo (Tratado) versus hemisferio derecho (intacto).

Tabla 12: núcleo caudado

Variante

Dopamina (ng/g) Dopamina (ng/g) % de agotamiento

Tratado (izquierda) Intacto (derecha)

Vehículo

2617,59 ± 526,91 14033,40 ± 408,75 81,35

***

E.coli-WT-GDNF (SEQ ID NO:3)

2707,72 ± 725,92 14805,36 ± 536,71 81,71

***

CHO-A31-GDNF (SEQ ID NO:8)

2023,86 ± 818,03 14456,09 ± 691,53 86,00

***

CHO-A31-N38Q-D95E-GDNF (SEQ

2676,57 ± 558,37 14986,15 ± 931,85 82,14

ID NO:9)

***

CHO-A31-N38Q-K84A-R88K-R90K-

3112,14 ± 717,45 13730,74 ± 1238,50 77, 33

D95E-GDNF (SEQ ID NO: 12)

***

Los valores son media ± e.e.m. n=8 por grupo

***p<0,001 vs lado intacto

5 Tabla 13: Sustancia Negra

Variante

Dopamina (ng/g) Dopamina (ng/g) % de agotamiento

Tratado (izquierdo) Intacto (derecho)

Vehículo

571,33 ± 90,65 *** 990,73 ± 134,48 42,33

E.Coli-WT-GDNF (SEQ ID NO: 3)

836,51 ± 97,15 ** # 1167,38 ± 62,07 28,34

CHO-A31-GDNF (SEQ ID NO: 8)

856,48 ± 75,45 ** # 1160,82 ± 100,56 26,22

CHO-A31-N38Q-D95E-GDNF (SEQ ID NO: 9)

903,68 ± 52,60 * # 1152,24 ± 115,61 21,57

CHO-A31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E -GDNF (SEQ ID NO: 12)

970,06 ± 108,05 ## 1174,45 ± 134,94 17,40

Lo valores son media ± e.e.m. n=8 por grupo *p<0,05, ** p< 0,01 o *** p<0,001 vs lado intacto # p<0,05, ## p<0,01 vs vehículo (lado tratado)

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La administración de 6-OHDA en el núcleo caudado resulta en una reducción significativa en los niveles de dopamina en el lado tratado en comparación con el lado intacto (tabla 12). También se observa un déficit significativo en la sustancia negra (Tabla 13), que se evita mediante la administración de GDNF. Todas las variantes de GDNF probadas aquí son significativamente diferentes del vehículo, en comparación con los lados tratados.

• Biodistribución aguda en cerebro de ratas

Se anestesian ratas Sprague-Dawley macho utilizando isoflurano (3 % en O2). Se afeita la cabeza y se esteriliza con solución de yodo antes que el animal se posicione sobre un marco estereotáxico con esterilla de temperatura controlada. Los ojos se protegen con gel oftálmico y se mantiene la anestesia utilizando isoflurano (1-2 % en O2).

Se realiza una incisión en la línea media sobre la cabeza del animal, se retira el cuero cabelludo y el tejido subyacente y se seca el cráneo para visualizar el bregma. Las coordenadas del núcleo caudado se miden desde el bregma y la superficie dural para infusión de GDNF (Anterior-Posterior + 0,5, Lateral Medial -3,0, DorsalVentral-5,5 mm). Se baja lentamente una cánula de infusión calibre 30 hasta esta posición, y comienza la infusión 1 minuto después (utilizando una bomba). Se infunde un bolo de 2 pl del GDNF de prueba en el hemisferio izquierdo durante 4 minutos a 0,5 pl/min, y la cánula permanece en el lugar durante 3 minutos adicionales una vez termina la infusión. Una vez se ha retirado la cánula se cierra el sitio de incisión, se administra un analgésico posoperativo, luego se deja recuperar al animal en una jaula de temperatura controlada. En un intervalo adecuado después de infusión, se sacrifica el animal y se extrae el cerebro y congela pendiente de crio seccionamiento para inmunohistoquímica.

• Inmunohistoquímica GDNF (IHC) en cerebro de rata

Se prueba la biodistribución de GDNF infundido en un ensayo de inmunohistoquímica, en el que se mide la unión del anticuerpo al antígeno infundido (GDNF y variantes de GDNF) en cerebros de rata. Se utiliza un anticuerpo de control de isotipo como un control negativo.

El crioseccionamiento de los cerebros de rata congelados comienza con el recorte del cerebelo mientras está dentro de un criostato a -20 grados C, utilizando una matriz de cerebro de rata para hacer una superficie plana. Optimal cutting Temperature™ (OCT, Sakura u otros vendedores similares) se coloca sobre un portaobjetos de criostato enfriado. Cuando el OCT empieza a congelar, La superficie plana del caudado del cerebro de rata se coloca sobre el portaobjetos utilizando fórceps a -20 grados C, de tal manera que el OCT vire el cerebro en su lugar con el cerebro rostral orientado lejos del portamuestras. El portamuestras se coloca en el portaobjetos y se ajusta. Después de que se ha insertado una cuchilla de micrótomo en el portacuchillas, la función de corte en el criostato se utiliza para descartar el bulbo olfatorio, así como el cerebro, rostralmente a la pista de infusión. Se toman secciones de 8um de espesor a intervalos de 300 pm y se colocan en portaobjetos de vidrio cargados positivamente. Se colocan dos a tres secciones de intervalos adyacentes en cada portaobjeto de vidrio para cada cerebro de rata. Luego se colocan los portaobjetos en paraformaldehído al 4 % a temperatura ambiente durante 20 minutos y se enjuaga en regulador de lavado tween-20 de solución salina tris regulada (TBST). Utilizando una solución de tinción a temperatura ambiente, se incuban los portaobjetos durante 10 minutos con un bloque de enzima endógena Dual, enjuagada con regulador de lavado TBST, se incuba durante 15 minutos cada uno del bloque avidina y biotina, se lava con regulador de lavado TBST, se bloquea con bloque de proteína durante 60 minutos y se sopla el portaobjetos utilizando una cuchilla de aire. El GDNF anti humano biotinilado o un IgG de cabra biotinilado se diluye en Diluyente de Anticuerpo con agentes de reducción de fondo hasta 2 pg/ml y se incuba en el portaobjetos durante 60 minutos, luego se enjuaga con regulador de lavado TBST 3 veces. Los portaobjetos se incuban con biotina 2 estreptavidina etiquetada (LSAB2) (Dako, CAT. # K0609) durante 10 minutos y se enjuaga con regulador de lavado TBST. Los portaobjetos se incuban con DAB+ (2 gotas de DAB en diluyente DAB durante 5 minutos, luego se enjuagan con regulador de lavado TBST, seguido por un enjuague con agua destilada. Después se retiran los portaobjetos del sistema de tinción automática luego se contratiñen con Hematoxylin™ y se cubren con Cytoseal XYL™ (Stephens Scientific, CAT # 8312-4). Se dejan secar y luego se analizan utilizando Aperio XT para cuantificar la biodistribución.

• Cuantificación de biodistribución de GDNF en cerebro de rata

Se adquieren imágenes de portaobjetos en la configuración de magnificación 20X en un Aperio ScanScope XT (que ejecuta v10.00.00.1805 del software del controlador). Los metadatos acerca del portaobjetos se almacenan en el software basado en red de Aperio, Spectrum (v10.0.1346.1806).

Cada sección de cerebro se subraya manualmente utilizando el software de visor de imagen de Aperio, ImageScope (v10.0.36.1805). Para el primer estudio, la sección de cerebro completa con la última cantidad de artefacto de seccionamiento visible se subraya. Para el segundo estudio, la sección de cerebro completa más cercana a la etiqueta de portaobjetos se subraya. Cada región subrayada se analiza utilizando el algoritmo “Conteo de Píxel Positivo” de Aperio (v9) [con todos los parámetros mantenidos en su configuración predeterminada, excepto Image Zoom =,01 y Umbral de Intensidad DÉBIL (Límite Superior) = 235].

El área de distribución GDNF en mm2 para cada rata se calcula al sumar las áreas positiva y positiva fuerte generadas del algoritmo de pixel positivo. Se utiliza la prueba t de Student pareada para determinar la significancia estadística.

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una variante GDNF humana que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No: 23:

   RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYD KILXaag^NLSXaassNXaagoRLVSEKVGQACCRPTAFDDDLSFLDDNLVYHI LRXaa,25HSAKXaai3oCGCI en la que:

   5 i) Xaa84 es K o A;

   ii) Xaa88 es R o K;

   iii) Xaa90 es R o K;

   iv) Xaa-125 es K o E; y

   v) Xaa-130 es R o E.

   10 2. La variante GDNF humana de acuerdo con la Reivindicación 1, en la que dicha variante se selecciona del grupo

   que consiste en

   RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEEL1FRYCSGSCDAAETTYD KILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAK RCGCI (SEQ ID NO: 9),

   RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEEL1FRYCSGSCDAAETTYD

   KILANLSKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAK

   RCGCI (SEQ ID NO: 12),

   y

   RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYD KILANLSKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILREHSAK ECGCI (SEQ ID NO: 15).

   15 3. La variante GDNF humana de acuerdo con la Reivindicación 2, en la que dicha variante es

   RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYD KILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAK RCGCI (SEQ. ID: 9).
2. 4. La variante GDNF humana de acuerdo con la Reivindicación 2, en la el que dicha variante es

   RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYE KJLANLSKJSIKRLVSEK.VGQACCRP1AFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAK. RCGCI (SEQ ID NO: 12).
3. 5. La variante GDNF humana de acuerdo con la Reivindicación 2, en la que dicha variante es

   RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYD KJLANLSKJSIKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYH1LREHSAK ECGCI (SEQ ID NO: 15).

   5
4. 6. Un intermedio para preparar una variante GDNF truncada de terminal N-A31 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en

   METDTLLLWVLLLWVPGSTGRGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYET

   KEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDD

   DLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI (SEQ ID NO: 28);

   y

   MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSARGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDL GLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDK1LKNLSRNRRLVSEKVGQACC RPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI (SEQ ID NO: 35).
5. 7. Un intermedio de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la secuencia de aminoácidos es

   MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSARGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDL GLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKJLKNLSRNRRLVSEKVGQACC RPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI (SEQ ID NO: 35).

   10 8. Una composición farmacéutica que comprende una variante GDNF humana de acuerdo con una cualquiera de

   las Reivindicaciones 1 a 5 y uno o más diluyentes , vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
6. 9. Una composición farmacéutica de acuerdo con la Reivindicación 8, para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson en un paciente humano.
7. 10. Una variante GDNF humana de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, para su uso como un 15 medicamento.
8. 11. Una variante GDNF humana de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.