ES2656037T3

ES2656037T3 - Cepas bacterianas aisladas de cerdos

Info

Publication number: ES2656037T3
Application number: ES12737592.1T
Authority: ES
Inventors: Denise Kelly
Original assignee: 4D Pharma Research Ltd
Current assignee: 4D Pharma Research Ltd
Priority date: 2011-07-14
Filing date: 2012-07-13
Publication date: 2018-02-22
Anticipated expiration: 2032-07-13
Also published as: WO2013008039A2; BR112014000835A2; RU2014105461A; US9539293B2; SI2732023T1; RU2019100532A; GB201112091D0; CN104080903B; LT2732023T; CN104080903A; US20190216865A1; US20170173089A1; US10183046B2; NO2732023T3; CY1119911T1; DK2732023T3; RU2677890C2; EP2732023B1; RS56853B1; US20150050254A1

Abstract

Una cepa bacteriana de ácido láctico porcino que se selecciona de: (i) NCIMB 41846; (ii) NCIMB 41847; (iii) NCIMB 41848; (iv) NCIMB 41849; (v) NCIMB 41850; (vi) NCIMB 42008; (vii) NCIMB 42009; (viii) NCIMB 42010; (ix) NCIMB 42011; (x) NCIMB 42012; y cualquier combinación de dos o más de los mismos.

Description

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Cepas bacterianas aisladas de cerdos Descripción

[0001] La presente invención se refiere a cepas bacterianas aisladas de cerdos. Más específicamente, la invención se refiere al aislamiento de bacterias de ácido láctico de cerdos criados orgánicamente. Las bacterias de ácido láctico reivindicadas tienen aplicaciones probióticas y terapéuticas útiles.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] La composición de la flora microbiana de los cerdos, su función inmune innata de intestino y la posible susceptibilidad a la infección está fuertemente influenciada por el entorno en el que se criaron durante la vida temprana (Mulder et al, 2009). Los cerdos criados al aire libre generalmente tienen un sistema inmune intestinal más desarrollado, funcionan mejor y son más saludables que sus homólogos criados en el interior. El ambiente al aire libre influye dramáticamente en la diversidad microbiana del intestino y se asocia con altos niveles de Firmicutes, en particular Bacterias de Ácido Láctico [LAB].

[0003] Los LAB comprenden un clado de bacterias gram-positivas, bajas en GC, tolerantes a los ácidos, generalmente no esporulantes, que no respiran, que están asociadas con ciertas características metabólicas y fisiológicas comunes. LAB son bacilos en forma de bastón o coccus que se caracterizan por una mayor tolerancia a un rango de pH inferior. LAB produce ácido láctico como el principal producto metabólico de la fermentación de carbohidratos y se encuentra entre los grupos más importantes de microorganismos utilizados en la industria alimentaria.

[0004] Los lactobacilos son predominantes en la flora intestinal de cerdos criados orgánicamente (al aire libre). En contraste, el número de estas bacterias es bajo en cerdos criados en interiores y los niveles de filotipos potencialmente patógenos son altos (Mulder et al, 2009). Además, se sabe que el desarrollo inmune y la función de los cerdos criados en interiores se desvían de lo normal. En particular, se sabe que está aumentada la expresión de los genes de interferón tipo 1, complejo mayor de histocompatibilidad clase I y varias quimiocinas (Mulder et al, 2009).

[0005] Las bacterias de ácido láctico pueden modificar la estructura y función de la flora y la tripa de varias maneras (Cotter et al, 2005; Ohashi y Ushida, 2009). Por ejemplo, pueden competir con bacterias dañinas por nutrientes clave o sitios de fijación en el intestino, lo que resulta en su exclusión. Alternativamente, pueden producir sustancias bioactivas que ayudan o promueven la colonización por bacterias beneficiosas o que matan/interfieren con el crecimiento de bacterias potencialmente dañinas o patógenas. Alternativamente, estos factores bioactivos pueden ser inmunomoduladores que promueven el desarrollo inmune y la integridad de la barrera del intestino.

[0006] Las cepas de LAB varían mucho en su actividad biológica. La presente invención busca proporcionar cepas de LAB que tengan propiedades terapéuticamente útiles. Más específicamente, la invención busca proporcionar cepas de LAB que sean capaces de promover el desarrollo y la salud del intestino y el sistema inmune, teniendo así un potencial terapéutico considerable como probióticos.

[0007] El documento WO 2002/070670 describe una cepa L. reuteri y pone a prueba su actividad antimicrobiana frente a E. coli y S. Enteritidis y su susceptibilidad a varios antibióticos.

DECLARACIÓN DE LA INVENCIÓN

[0008] El presente solicitante ha demostrado que la microbiota de cerdos criados exteriores contienen cepas de LAB que producen factores bioactivos potentes y específicos anti-microbianos o de inmuno-moduladores/ moduladores de células.

[0009] Los aspectos de la invención, junto con las realizaciones preferidas, se establecen en las reivindicaciones adjuntas.

[0010] Un primer aspecto de la invención se refiere a una cepa bacteriana de ácido láctico porcino que se selecciona de:

(i) NCIMB 41846;

(ii) NCIMB 41847;

(iii) NCIMB 41848;

(iv) NCIMB 41849;

(v) NCIMB 41850;

(vi) NCIMB 42008;

(vii) NCIMB 42009;

(viii) NCIMB 42010;

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(ix) NCIMB 42011;

(x) NCIMB 42012; y cualquier combinación de dos o más de los mismos.

[0011] Un segundo aspecto se refiere a una composición que comprende una o más cepas bacterianas del ácido láctico de acuerdo con el primer aspecto de la invención y un excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente.

[0012] Un tercer aspecto se refiere a una composición probiótica que comprende una o más cepas bacterianas del ácido láctico de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

[0013] Un cuarto aspecto se refiere a una o más cepas bacterianas del ácido láctico de acuerdo con el primer aspecto de la invención para uso en la medicina.

[0014] Un quinto aspecto se refiere a una o más cepas bacterianas del ácido láctico de acuerdo con el primer aspecto de la invención para uso en el tratamiento de un trastorno intestinal en un sujeto.

[0015] Un sexto aspecto se refiere al uso de una o más cepas bacterianas del ácido láctico de acuerdo con el primer aspecto de la invención en la preparación de un medicamento para tratar un trastorno intestinal en un sujeto.

[0016] Un octavo aspecto de la invención se refiere a una o más cepas bacterianas del ácido láctico de acuerdo con el primer aspecto de la invención para mejorar la microbiota intestinal.

[0017] Un décimo aspecto se refiere a un alimento que comprende una o más cepas bacterianas del ácido láctico de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

[0018] Un undécimo aspecto se refiere a un producto alimenticio que comprende una o más cepas bacterianas del ácido láctico de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

[0019] Un aspecto duodécimo refiere a un suplemento dietético que comprende una o más cepas bacterianas del ácido láctico de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

[0020] Un aspecto decimotercero se refiere a un aditivo alimentario que comprende una o más cepas bacterianas del ácido láctico de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

[0021] Un aspecto decimocuarto refiere a un procedimiento para la producción de un probiótico, comprendiendo dicho procedimiento el cultivo de una cepa bacteriana de ácido láctico de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0022] Como se ha mencionado anteriormente, la presente invención se refiere a una o más cepas bacterianas del ácido láctico de la especie porcina. La cepa bacteriana de ácido láctico de la invención se puede caracterizar por una o más de las siguientes características:

(i) la capacidad de mostrar actividad antimicrobiana contra E. coli;

(ii) la capacidad para exhibir la actividad antimicrobiana frente a S. enteritidis;

(iii) la capacidad de suprimir la inflamación en células IPEC inducidas por 12-O-tetradecaboilforbol-13-acetato (PMA);

(iv) la capacidad de bloquear la unión o la invasión de las células del IPEC por S. enteritidis;

(v) la capacidad de bloquear la unión o invasión de células IPEC por E. coli;

(vi) la ausencia de resistencia a antibióticos a uno o más antibióticos seleccionados de los siguientes: ampicilina; cefotaxima; cloranfenicol; eritromicina; gentamicina; tetraciclina; vancomicina; ácido nalidíxico metronizado; y kanamicina; y

(vii) la capacidad de exhibir estabilidad al calor cuando se somete a tres ciclos de calentamiento, comprendiendo cada ciclo de calentamiento a una temperatura de 70°C durante un período de 15 minutos.

[0023] Como se usa en el presente documento, el término "porcina" significa "de o referente a porcina", es decir, de o referente a cualquiera de varios mamíferos de la familia Suidae, especialmente el cerdo casero, Sus scrofa domesticus, o Sus domesticus cuando joven o de tamaño comparativamente pequeño.

[0024] Preferiblemente, el cerdo tiene menos de 3 meses de edad, preferiblemente, menos de 2 meses de edad.

[0025] Preferiblemente, la cepa bacteriana de ácido láctico porcino es de un cerdo criado orgánicamente. En este sentido, preferiblemente, los cerdos son criados al aire libre, afuera (con exposición al suelo) y en ausencia de antibióticos, promotores del crecimiento y/o potenciadores del crecimiento.

[0026] Preferiblemente, la cepa bacteriana de ácido láctico porcino es de un cerdo criado al aire libre.

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Preferiblemente, los cerdos se crían en el exterior durante al menos el 60% de sus vidas. Más preferiblemente, los animales se crían en el exterior durante al menos el 80% de sus vidas, más preferiblemente, al menos el 90% de sus vidas, incluso más preferiblemente todavía, el 100% de sus vidas.

[0027] En otra realización preferida, la cepa bacteriana de ácido láctico está en la forma de una población bacteriana viva, una población bacteriana liofilizada, una preparación bacteriana no viable, o los componentes celulares de los mismos. Preferiblemente, cuando la cepa bacteriana está en forma de una preparación bacteriana no viable, se selecciona entre bacterias muertas por calor, bacterias irradiadas y bacterias lisadas.

[0028] En una realización preferida, la cepa bacteriana de ácido láctico es en forma de una bacteria viva, una bacteria muerta, o componentes celulares de los mismos.

[0029] En una realización preferida, la cepa bacteriana de ácido láctico está en forma aislada. Como se usa en este documento, el término "aislado" significa aislado de su entorno nativo.

[0030] En una realización preferida, la cepa bacteriana de ácido láctico es en forma biológicamente pura. Como se usa en el presente documento, el término "biológicamente puro" se refiere a una cepa bacteriana en forma de un cultivo de laboratorio que está sustancialmente libre de otras especies de organismos. Preferiblemente, la cepa bacteriana de ácido láctico está en forma de un cultivo de una única especie de organismo.

[0031] Tal como se utiliza aquí, el término "cepa bacteriana de ácido láctico" también abarca los mutantes de dicho cepa bacteriana de ácido láctico. Como se usa en este documento, el término "mutante" incluye cepas bacterianas derivadas que tienen al menos 93% de homología, preferiblemente al menos 96% de homología, más preferiblemente 98% de homología con la secuencia de polinucleótidos de una cepa referenciada, pero que comprenden mutaciones en otras secuencias en la genoma bacteriana. Los mutantes pueden obtenerse mediante técnicas de ingeniería genética que infieren la alteración del material genético de las cepas de la invención o que infieren una recombinación del material genético de las cepas de la invención con otras moléculas. Típicamente, para obtener tales cepas mutantes, una persona experta en la técnica puede usar técnicas de mutagénesis estándar tales como radiación UV o exposición a productos químicos mutagénicos.

[0032] Tal como se utiliza aquí, el término "mutaciones" incluye mutaciones naturales o inducidas que comprenden al menos alteraciones de una sola base que incluyen deleciones, inserciones, transversiones, y otras modificaciones conocidas por los expertos en la técnica, incluyendo modificación genética introducida en un nucleótido padre o secuencia de aminoácidos mientras que se mantiene al menos el 50% de homología con la secuencia original. Preferiblemente, la secuencia que comprende la mutación o mutaciones tiene al menos 60%, más preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente todavía 85% de homología con la secuencia parental. Como se usa en el presente documento, la secuencia "homología" puede determinarse usando técnicas estándar conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la homología se puede determinar usando el programa "BLAST" del algoritmo de homología en línea, disponible públicamente en http)://
www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.

[0033] Tal como se utiliza aquí, el término "cepa bacteriana de ácido láctico" también abarca homólogos de las cepas bacterianas de ácido láctico. Como se usa en este documento, el término "homólogo" se refiere a una cepa bacteriana de ácido láctico que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene un grado de identidad de secuencia u homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la cepa bacteriana de ácido láctico parental (en lo sucesivo denominada "secuencia homóloga (s))"). Aquí, el término "homólogo" significa una entidad que tiene una cierta homología con la secuencia de nucleótidos diana. Aquí, el término "homología" se puede equiparar con "identidad".

[0034] En el presente contexto, se considera que una secuencia homóloga incluye una secuencia de nucleótidos que puede ser al menos 50, 60, 70, 75, 80, 85 o 90% idéntica, preferiblemente al menos 95%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de nucleótidos de la cepa bacteriana de ácido láctico original (la secuencia de sujeto).

[0035] Las comparaciones de homología se pueden realizar a simple vista, o más habitualmente, con la ayuda de programas de comparación de secuencias fácilmente disponibles. Estos programas informáticos disponibles comercialmente pueden calcular el % de homología entre dos o más secuencias. El % de homología puede calcularse sobre secuencias contiguas, es decir, una secuencia se alinea con la otra secuencia y cada aminoácido en una secuencia se compara directamente con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia, un residuo a la vez. Esto se llama una alineación "desacoplada". Típicamente, tales alineaciones no acumuladas se realizan solo en un número relativamente corto de residuos.

[0036] Aunque este es un método muy simple y consistente, falla al tomar en consideración que, por ejemplo, en un par por lo demás idéntico de secuencias, una inserción o deleción provocará que los siguientes restos de aminoácidos se coloquen fuera de la alineación, lo que potencialmente da como resultado una gran reducción en el % de homología cuando se realiza una alineación global. El cálculo del máximo % de homología, por lo tanto, en primer lugar requiere la producción de una alineación óptima, teniendo en cuenta las penalizaciones de hueco. Un programa informático adecuado para llevar a cabo dicha alineación es el Vector NTI (Invitrogen Corp.). Los ejemplos

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de software que pueden realizar comparaciones de secuencias incluyen, pero no se limitan al paquete BLAST (véase Ausubel et al. 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4a Ed - Capítulo 18), BLAST 2 (véase FEMS Microbiol Lett 1999 174 (2) : 247 - 50; FEMS Microbiol Lett 1999 177 (1): 187 - 8), FASTA (Altschul y col., 1990, J. Mol. Biol. 403 - 410) y AlignX, por ejemplo. Al menos BLAST, BLAST 2 y FASTA están disponibles para la búsqueda fuera de línea y en línea (véase Ausubel et al. 1999, páginas 7-58 a 7-60).

[0038] Preferiblemente, el grado de identidad con respecto a una secuencia de nucleótidos se determina sobre por lo menos 20 nucleótidos contiguos, preferentemente sobre al menos 30 nucleótidos contiguos, preferentemente sobre al menos 40 nucleótidos contiguos, preferentemente sobre al menos 50 nucleótidos contiguos, preferiblemente por encima de al menos 60 nucleótidos contiguos, preferiblemente sobre al menos 100 nucleótidos contiguos. Preferiblemente, el grado de identidad con respecto a una secuencia de nucleótidos se puede determinar a lo largo de toda la secuencia.

[0039] La identificación tradicional de bacterias sobre la base de características fenotípicas generalmente no es tan precisa como la identificación basada en métodos genotípicos. La comparación de la secuencia de gen 16S ARNr bacteriano ha surgido como una técnica genética preferida y permite identificar nuevas cepas mediante la comparación de secuencias con secuencias de ADN bacterianas conocidas mediante BLAST (
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). La secuencia del gen 16S ARNr es universal en bacterias, por lo que las relaciones se pueden medir a través de muchas bacterias diferentes. En general, la comparación de la secuencia de 16S ARNr permite la diferenciación entre organismos a nivel de género en todos los principales phyla de bacterias, además de clasificar las cepas en múltiples niveles, incluido el nivel de especies y subespecies. La secuencia del gen 16S ARNr se ha determinado para una gran cantidad de cepas. GenBank, el mayor banco de datos de secuencias de nucleótidos, tiene más de 20 millones de secuencias depositadas, de las cuales más de 90,000 son de genes 16S ARNr. Esto significa que hay muchas secuencias previamente depositadas contra las cuales se compara la secuencia de una cepa desconocida.

[0040] La cepa bacteriana de ácido láctico tiene una secuencia de gen 16S ARNr seleccionada de SEQ ID NOS 187. Otra realización de la invención se refiere a una cepa bacteriana de ácido láctico que comprende una secuencia de gen 16S ARNr seleccionada de SEQ ID NOS 1-87 Usos/métodos preferidos se aplican a este aspecto mutatis mutandis.

[0041] El término "homólogo" es como se define anteriormente en esta memoria. Como se usa en este documento, el término "variante" incluye cualquier variación en la que: (a) uno o más nucleótidos están sustituidos por otro nucleótido o eliminados, (b) el orden de dos o más nucleótidos está invertido, (c) tanto (a) como (b) están presentes juntos. Preferiblemente, las variantes surgen de uno de (a), (b) o (c). Más preferiblemente, uno o dos nucleótidos están sustituidos o delecionados. Incluso más preferiblemente, un nucleótido se sustituye por otro.

[0042] En una realización preferida de la invención, la cepa bacteriana de ácido láctico se caracteriza por la capacidad de mostrar actividad antimicrobiana frente a E. coli. La actividad antimicrobiana observada es muy probablemente en virtud de sustancias antimicrobianas producidas por las cepas bacterianas de ácido láctico de la invención, aunque la naturaleza de estas sustancias antimicrobianas no ha sido determinada.

[0043] En el contexto de la presente invención, la capacidad de mostrar actividad antimicrobiana frente a E. coli puede ser determinada midiendo la inhibición del crecimiento de E. coli en un ensayo de difusión de pocillo in vitro. Detalles adicionales del ensayo de difusión del pocillo se exponen en los ejemplos adjuntos. El ensayo se lleva a cabo usando Escherichia coli K88 en agar MacConkey No 3, incubando las placas durante 16 horas a 37°C. Más específicamente, se agrega Escherichia coli K88 al agar (1 ml de una dilución 1: 1000 de un cultivo nocturno de Escherichia coli K88 en 200 ml de agar para dar el equivalente a 106 CFU/ml). El agar se vierte en placas de Petri y se deja fraguar. Las placas se marcan en cuadrantes y se recortan aproximadamente 5 mm en cada cuadrante. Se agrega una alícuota (60 pl) de medios acondicionados o caldo MRS a los pocillos. Las placas se cubren e incuban durante 16 horas a 37°C. Son fotografiados usando una cámara digital. Las imágenes se transfieren a Photoshop, y el diámetro del pocillo y la zona de inhibición se determinaron utilizando la herramienta de medición.

[0044] En el contexto de matar E. coli en el ensayo de difusión muy por encima, preferiblemente la cepa bacteriana de ácido láctico de la invención exhibe <20000 unidades de inhibición, más preferiblemente 20000-40000 unidades, incluso más preferiblemente 40000-60000 unidades, más preferiblemente 60000-80000 unidades, más preferiblemente 80000-100000 unidades de inhibición, incluso más preferiblemente aún> 100000 unidades de inhibición.

[0045] En una realización preferida de la invención, la cepa bacteriana de ácido láctico se caracteriza por la capacidad de mostrar actividad antimicrobiana frente a S. enteritidis. De nuevo, la actividad antimicrobiana observada es muy probablemente en virtud de sustancias antimicrobianas producidas por las cepas bacterianas de ácido láctico de la invención, aunque no se ha determinado la naturaleza de estas sustancias antimicrobianas.

[0046] En el contexto de la presente invención, la capacidad de mostrar actividad antimicrobiana frente a S. enteritidis puede determinarse midiendo la capacidad de inhibir el crecimiento de S. enteritidis en un ensayo de

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difusión de pocilio in vitro. Detalles adicionales del ensayo de difusión del pocilio se exponen en los ejemplos adjuntos. El ensayo se lleva a cabo utilizando Salmonela enteritidis S1400 en agar XLD, incubando las placas durante 16 horas a 37°C. El agar XLD se prepara según las instrucciones del fabricante y se enfría a 45°C. Se agrega Salmonela enteritidis S1400 al agar XlD (1 ml de una dilución 1: 1000 de un cultivo nocturno de Salmonela enteritidis S1400 en 200 ml de agar para dar el equivalente a 106 UFC/ml). El agar XLD se vierte en placas de Petri y se deja fraguar. Las placas se marcan en cuadrantes y se recortan aproximadamente 5 mm en cada cuadrante. Se agrega una alícuota (60 ml) de medio acondicionado o caldo MRS a los pocillos. Las placas se cubren e incuban durante 16 horas a 37°C y los datos se analizan como se describió anteriormente para el ensayo de E. coli.

[0047] En el contexto de matar Salmonela enteritidis en el ensayo de difusión en pocillo anteriormente, preferiblemente la cepa bacteriana de ácido láctico de la invención exhibe <20000 unidades de inhibición, más preferiblemente 20000-40000 unidades, incluso más preferiblemente 40000-60000 unidades, más preferiblemente 60000-80000 unidades, más preferiblemente 80000-100000 unidades de inhibición, incluso más preferiblemente todavía >100000 unidades de inhibición.

[0048] En una realización alternativa, la capacidad de exhibir una actividad antimicrobiana contra S. enteritidis se puede determinar mediante la medición de la capacidad de inhibir S. enteritidis in vivo en ratones C3H/HeN o C57BI/6. Detalles adicionales de ensayos apropiados in vivo se exponen en los ejemplos adjuntos.

[0049] Específicamente, C3H/HeN y ratones C57BL/6 se tratan con una cepa bacteriana de ácido láctico de acuerdo con la invención antes y después de la estimulación con Salmonela enteritidis. Los ratones se sacrifican y se disecan 6 (C57BI/6) o 10 (C3H/HeN) días después de la infección y se detecta salmonela viable en tejidos sistémicos (p.ej., nódulo linfático mesentérico, hígado y bazo) en el intestino (por ejemplo, ciego, colon) y en las heces en comparación con los controles apropiados. La actividad in vivo de la cepa bacteriana de ácido láctico de la invención también se puede medir determinando el nivel de mieloperoxidasa [MPO], un marcador para neutrófilos, en el intestino de ratones C3H/HeN tratados con Salmonela o Salmonela más LAB. La MPO en el intestino aumenta mucho debido a la infección por salmonela, debido al reclutamiento de neutrófilos en el intestino, parte de la respuesta del huésped a la infección. El tratamiento conjunto con una cepa bacteriana de ácido láctico de acuerdo con la invención reduce la actividad de MPO en el intestino de ratones infectados con salmonela, lo que indica que las respuestas inflamatorias intestinales a la infección disminuyen en estos animales, en relación con los experimentos de control.

[0050] En una realización preferida de la invención, la cepa bacteriana de ácido láctico se caracteriza por la capacidad para suprimir la inflamación en las células IPEC inducidas por 12-O-tetradecaboilforbol-13-acetato (PMA). En el contexto de la presente invención, esto se refiere a la capacidad de la cepa bacteriana de ácido láctico para bloquear la expresión génica de interleuquina-8 (ILO-8) desencadenada por PMA. Más específicamente, se puede determinar midiendo la supresión de la inflamación en células IPEC-J2 inducidas por PMA, cuando se incuba durante 2 horas a 37°C, 5% de CO2, 95% de humedad. Después del ARN y la transcripción inversa, la PCR en tiempo real se lleva a cabo en un sistema de PCR rápida en tiempo real 7500 que funciona con el software 7500 Fast System v 1.4.0 Sequence Detection Software versión 1.4 (Applied Biosystem), utilizando cebadores para ILO-8 porcina y TNF-a (preparado por Sigma Aldrich). La mezcla de reacción es: 10 pl de mezcla maestra Power Sybergreen, 2,5 pl de cebador directo, 2,5 pl de cebador inverso y 5 pl de ADNc, la PCR en tiempo real se ejecuta según el protocolo estándar 7500 (95°C, 10 min, 1 ciclo, 95°C, 15 segundos, 40 ciclos, 60°C, 1 min, 40 ciclos, 95°C, 15 segundos, 1 ciclo, 60°C, 1 min, 1 ciclo, 95°C, 15 segundos, 1 ciclo. 60°C, 15 segundos, 1 ciclo). La expresión de los genes de ILO-8 y TNF-a se analiza y compara con el gen "de mantención" p-actina. Para comparación, los valores se dan como la relación de ILO-8 y TNF-a por p-actina o cambio de pliegue. Detalles adicionales de este ensayo se exponen en los ejemplos adjuntos.

[0051] En una realización preferida de la invención, la cepa bacteriana de ácido láctico se caracteriza por la capacidad de bloquear la unión o la invasión de las células del IPEC por S. enteritidis. Esto se puede medir mediante el ensayo expuesto en los ejemplos adjuntos. Específicamente, se cultivan monocapas de células IPEC-J2 hasta 3 días después de la confluencia en placas de 24 pocillos y se sincronizan mediante la adición de medio DTS 24 horas antes de su uso. Los cultivos nocturnos de LAB LABORATORIO (10 ml) se centrifugan y la bacteria se resuspende en solución salina tamponada con fosfato [PBS]. Se agrega una alícuota (50 pl) de LAB a los pocillos. Las placas se incuban durante 2 horas a 37°C, 5% de CO2, 95% de humedad. Un cultivo de una noche de Salmonella enterica serovar Enteritidis S1400 [S. enteritidis S1400] se subcultiva (0,5 ml en 10 ml) en medio Luria Bertani (LB) y se incuba aeróbicamente durante 2-3 horas a 37°C hasta que alcanza una densidad óptica (560 nm) de 0,8 (una concentración equivalente a 1 x 108 CFU/ml). El cultivo se centrifuga y la bacteria se resuspende en PBS. Se agrega una alícuota (50 ml) a los pocillos de las células IPEC-J2. Las placas se incuban durante otras 2 horas a 37°C, 5% de CO2, 95% de humedad. Las monocapas de células IPEC-J2 se lavan con HBSS. Se agrega una solución (0,5 ml) de PBS que contiene Triton-X100 (10 ml/litro) a cada pocillo, la monocapa se raspa y se dispersa. La salmonela viable se estima en placas de agar XLD (incubadas durante 24 horas a 37°C) por el método Miles y Misra. Las bacterias del ácido láctico se determinan por el mismo procedimiento (incubadas anaeróbicamente durante 48 horas a 37°C).

[0052] Preferiblemente, en el contexto de la adhesión/invasión de células IPEC por S. enteritidis, la cepa bacteriana

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de ácido láctico de la invención exhibe 0-20% de inhibición de adherencia/invasión, más preferiblemente 20-40%, incluso más preferiblemente 40-60%, más preferiblemente aún, 60-80%, incluso más preferiblemente aún, 80 -100% de inhibición de la adherencia/invasión medida por el ensayo anterior.

[0053] En una realización preferida de la invención, la cepa bacteriana de ácido láctico se caracteriza por la capacidad de bloquear la unión o la invasión de las células del IPEC por E. coli. Esto se puede medir mediante un ensayo similar al descrito anteriormente para S. Enteritidis, y como se establece en los ejemplos adjuntos.

[0054] Preferiblemente, en el contexto de la adhesión/invasión de células IPEC por E. coli K88, la cepa bacteriana de ácido láctico de la invención exhibe 0-20% de inhibición de adherencia/invasión, más preferiblemente 20-40%, incluso más preferiblemente 40-60%, más preferiblemente todavía, 60-80%, incluso más preferiblemente aún, 80- 100% de inhibición de la adherencia/invasión medida por el ensayo anterior.

[0055] En una realización preferida de la invención, la cepa bacteriana de ácido láctico se caracteriza por la ausencia de resistencia a los antibióticos a uno o más antibióticos seleccionados entre los siguientes: ampicilina; cefotaxima; cloranfenicol; eritromicina; gentamicina; tetraciclina; vancomicina; ácido nalidíxico metronizado; y kanamicina. En el contexto de la presente invención, la resistencia a antibióticos puede determinarse midiendo el efecto de varios discos que contienen antibióticos en un cultivo de placa de agar MRS de la cepa bacteriana de ácido láctico, cuando se coloca en un recipiente anaeróbico y se incuba durante 24 horas a 37°C. Detalles adicionales del ensayo se exponen en los ejemplos adjuntos. Más específicamente, se extiende cerdo LAB [0,5 ml de una dilución 1: 100 de un cultivo de una noche] sobre la superficie de una placa de agar MRS y se seca. Las placas se marcan en 4 cuadrantes y en cada cuadrante se coloca un disco que contiene antibióticos [ampicilina, 10 |jg. Cefotaxima, 30 jg. Cloranfenicol, 10 |jg. Eritromicina, 15 |jg. Gentamicina, 10 |jg. Kanamicina, 30 |jg. Metronizado, 50 jig. Ácido nalidíxico, 30 jig. Tetraciclina, 30 jig. Vancomicina, 30 jig]. Las placas se cubren, se colocan en un recipiente anaeróbico y se incuban durante 24 horas a 37°C. Las placas son fotografiadas usando una cámara digital. Las imágenes se transfieren a Photoshop, y el diámetro de la zona de inhibición se determina utilizando la herramienta de medida. Para cada antibiótico, se toma el área de exclusión para la cepa de prueba y se divide con el área máxima de exclusión obtenida para ese antibiótico.

[0056] Preferiblemente, el LAB de la invención se caracteriza por la ausencia de resistencia a los antibióticos ampicilina, cefotaxima, cloranfenicol, eritromicina, gentamicina, tetraciclina, vancomicina, metronizadol, ácido nalidíxico y kanamicina. Más preferiblemente, el LAB de la invención se caracteriza por la ausencia de resistencia a los antibióticos ampicilina, cefotaxima, cloranfenicol, eritromicina, gentamicina, tetraciclina y vancomicina.

[0057] En una realización preferida de la invención, la cepa bacteriana de ácido láctico se caracteriza por la capacidad de exhibir estabilidad al calor cuando se somete a tres ciclos de calentamiento, comprendiendo cada ciclo el calentamiento a una temperatura de 70°C durante un período de 15 minutos. Más detalles de los estudios de estabilidad térmica se exponen en los ejemplos adjuntos. Más específicamente, en el contexto de la presente invención, la estabilidad térmica se mide centrifugando un cultivo de una noche (10 ml) de LAB de cerdo aislado y resuspendiendo el sedimento en caldo MRS reciente (10 ml). Una alícuota (1 ml) se calienta a 70°C durante 15 minutos y luego se coloca en placa (0,5 ml) en agar MRS y se incuba en un recipiente anaeróbico durante 48 horas a 37°C. Se detecta un pequeño número de colonias, se recogen, se siembran en tubos Hungate que contienen caldo MRS y se incuban durante 48 horas a 37°C. Este cultivo se centrifuga, se resuspende en caldo MRS, se calienta de nuevo a 70°C durante 15 min, se coloca en placas sobre agar MRS, se incuba en un recipiente anaeróbico durante 48 horas a 37°C, se recoge y se siembra en tubos Hungate que contienen MRS caldo e incubado durante 48 horas a 37°C. Este cultivo se centrifuga, se resuspende en caldo mRs, se vuelve a calentar a 70°C durante 15 minutos, se coloca en placas (0,5 ml) en agar MRS, se incuba en un recipiente anaeróbico durante 48 horas a 37°C, se elimina, se sembra en tubos Hungate que contienen caldo MRS y se incuban durante 48 horas a 37°C.

[0058] En una realización preferida, la cepa bacteriana de ácido láctico tiene dos cualquiera de los característicos seleccionados del grupo que consiste en (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) y (vii) expuesto más arriba.

[0059] En una realización preferida, la cepa bacteriana de ácido láctico tiene tres cualesquiera de los característicos seleccionados del grupo que consiste en (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) y (vii) expuesto más arriba.

[0060] En una realización preferida, la cepa bacteriana de ácido láctico tiene cualquier cuatro de los característicos seleccionados del grupo que consiste en (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) y (vii) expuesto más arriba.

[0061] En una realización preferida, la cepa bacteriana de ácido láctico tiene cualquier cinco de los característicos seleccionados del grupo que consiste en (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) y (vii) expuesto más arriba.

[0062] En una realización preferida, la cepa bacteriana de ácido láctico tiene cualquier seis de los característicos seleccionados del grupo que consiste en (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) y (vii) expuesto más arriba.

[0063] En una realización preferida, la cepa bacteriana de ácido láctico tiene los siete de los rasgos caracterizadores

(i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) y (vii) antes expuestos.

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[0064] En una realización particularmente preferida, (A), características (i) y (ii) anterior.

[0065] En una realización particularmente preferida, (B), características (iv) y (v) anteriores.

[0066] En una realización particularmente preferida, (C), características (iv) y (v) anteriores.

[0067] En una realización particularmente preferida, la características indicadas (D) a (G) del siguiente modo:

(D) (i) y (iv); o

(E) (i) y (v); o

(F) (ii) y (iv); o

(G) (ii) y (v);

[0068] Más preferiblemente, la cepa bacteriana de ácido láctico se caracteriza además por la característica (vi) además de las características mencionadas en cualquiera de las realizaciones (A) a (G) anteriormente.

[0069] Aún más preferiblemente, la cepa bacteriana de ácido láctico se caracteriza además por la característica (iii), además de aquellas características mencionadas en cualquiera de las realizaciones (A) a (G) anteriores. Aún más preferiblemente, la cepa bacteriana de ácido láctico se caracteriza adicionalmente por la característica (vii) además de las características enumeradas en cualquiera de las realizaciones (A) a (G) anteriores.

5 Depósitos biológicos

[0070] Una realización de la invención se refiere a una cepa bacteriana de ácido láctico aislado de las heces de los cerdos criados ecológicamente y seleccionados del grupo que consiste en cepas depositadas el 27 de junio de 2011 bajo los términos del Tratado de Budapest en la National Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria (NCIMB) en NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, UK, AB21 9YA, bajo los siguientes números de acceso:

NCIMB 41846: Lactobacillus reuteri GGDK31;

NCIMB 41847: Lactobacillus plantarum/pentosus/paraplantarum GGDK161;

NCIMB 41848: Lactobacillus johnsonii/taiwanensis/acidophilus/gasseri GGDK255;

NCIMB 41849: Lactobacillus plantarum/pentosus/helveticus/paraplantarum GGDK258;

NCIMB 41850: Lactobacillus johnsonii GGDK266.

[0071] Los depósitos superiores NCIMB 41846, NCIMB 41847, NCIMB 41848, NCIMB 41849 y NCIMB 41850, fueron hechos por el Dr. George Grant del Instituto Rowett de Nutrición y Salud de la Universidad de Aberdeen, Greenburn Road, Aberdeen, AB21 9SB en nombre del solicitante, GT Biologies Limited.

[0072] Estudios posteriores por el solicitante revelan que la cepa depositada como NCIMB 41847 fue una mezcla de Lactobacillus paraplantarum y Lactobacillus reuteri. Estudios posteriores por el solicitante revelan que la cepa depositada como NCIMB 41850 fue una mezcla de Lactobacillus johnsonii y Lactobacillus reuteri. Estudios posteriores por el solicitante revelaron que la cepa depositada como NCIMB 41848 fue Lactobacillus reuteri. Cepas aisladas para los componentes respectivos de las cepas NCIMB 41847 y NCIMB 41850 se depositaron posteriormente (véase abajo).

[0073] Otra realización de la invención se refiere a una cepa bacteriana de ácido láctico aislado de las heces de los cerdos criados ecológicamente y seleccionado del grupo que consiste en cepas depositadas el 12 de julio de 2012 bajo los términos del Tratado de Budapest en la National Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria (NCIMB) en NCIMB Ltd., Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, Reino Unido, AB21 9YA, bajo los siguientes números de acceso:

NCIMB 42008 Lactobacillus johnsonii;

NCIMB 42009 Lactobacillus reuteri;

NCIMB 42010 Lactobacillus plantarum;

NCIMB 42011 Lactobacillus reuteri;

NCIMB 42012 Lactobacillus reuteri

[0074] Los depósitos anteriores NCIMB 42008, NCIMB 42009, NCIMB 42010 y NCIMB 42011 y NCIMB 42012, fueron hechos por el profesor Denise Kelly de GT Biologics Limited, c/o Instituto de Ciencias Médicas, Universidad de Aberdeen, Foresterhill, Aberdeen, Aberdeensshire, AB25 2ZD, Reino Unido, en nombre de la solicitante, GT Biologies Limited.

[0075] También se describe en la presente invención cepas mutantes, que se pueden obtener a partir de dichas cepas, y las cepas que muestran una homología del ADN-ADN de al menos 70% y/o una identidad de 16S ARN de

la cepa bacteriana de ácido láctico se caracteriza por las

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al menos 99,5% con una cepa seleccionada de los depositados bajo los números de acceso anteriores.

[0076] Tal como se utiliza aquí, el término "identidad 16S ARNr" se refiere al porcentaje de identidad con una cepa bacteriana conocida. Una cepa bacteriana de ácido láctico puede tener una identidad de 16S ARNr de al menos 85% o al menos 90%, o al menos 95, 96, 97, 98 o 99% con una cepa seleccionada de los depositados bajo los números de acceso anteriores.

Una cepa bacteriana de ácido láctico puede tener una identidad de 16S ARNr de al menos 99,5% con una cepa seleccionada de los depositados bajo los números de acceso anteriores.

[0077] En el contexto de la presente descripción, el término "homología de ADN-ADN" se refiere a lo estrechamente relacionadas que están dos o más hebras separadas de ADN la una a la otra, en base a su secuencia de nucleótidos. Típicamente, esto se mide en términos de su identidad de %. Una cepa bacteriana de ácido láctico puede tener una homología de ADN-ADN de al menos 70% con una cepa seleccionada de los depositados bajo los números de acceso anteriores, más preferiblemente, al menos el 80%, o al menos 85%, aún más preferiblemente, al menos 90, 95, 97, 98 o 99% de homología con una cepa seleccionada de los depositados bajo los números de acceso anteriores.

[0078] Una cepa bacteriana de ácido láctico puede tener una homología de ADN-ADN de al menos 70% y una identidad de 16s ARNr de al menos 99,5% con una cepa seleccionada de los depositados bajo los números de acceso anteriores.

Composiciones

[0079] Otro aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende una o más cepas bacterianas del ácido láctico tal como se describe anteriormente y un excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente. Los excipientes adecuados, diluyentes, portadores se describen a continuación.

[0080] La composición puede ser cualquier composición, pero es preferiblemente una composición para ser administrada por vía oral, por vía enteral o por vía rectal. Por ejemplo, la composición puede ser una composición comestible. "Comestible" significa un material que está aprobado para el consumo humano o animal.

[0081] Otro aspecto de la invención se refiere a una composición probiótica que comprende una cepa bacteriana de ácido láctico como se describe anteriormente.

[0082] Otro aspecto de la invención se refiere a combinaciones de dos más cepas bacterianas del ácido láctico tal como se describe en el presente documento. En una realización particularmente preferida, tales combinaciones exhiben una funcionalidad sinérgica, por ejemplo, la combinación es sinérgica, es decir, el efecto resultante es mayor que los efectos aditivos simples atribuibles a los componentes bacterianos de ácido láctico individuales en la combinación.

[0083] Una realización preferida de la invención se refiere a una combinación de dos, tres, cuatro o cinco diferentes bacterias del ácido láctico, más preferiblemente, dos, tres o cuatro diferentes bacterias del ácido láctico, más preferiblemente, dos o tres bacterias del ácido láctico diferentes. Cuando la invención se refiere a una combinación de más de una cepa bacteriana de ácido láctico, los componentes individuales de la combinación pueden estar presentes en cualquier proporción.

[0084] Más preferentemente todavía, la invención se refiere a una combinación de dos bacterias del ácido láctico diferentes. Preferiblemente, las dos bacterias del ácido láctico diferentes están presentes en una relación de 1 /99,9 a 99,9/1 en peso, por ejemplo, 1/99 a 99/1 o 10/90 a 90/10, o 20/80 a 80/20, o 30/70 a 70/30 y similares.

[0085] En una realización altamente preferida, la combinación es una mezcla de Lactobacillus johnsonii y Lactobacillus reuteri. Incluso más preferiblemente, la combinación es NCIMB 41850: Lactobacillus johnsonii y Lactobacillus reuteri GGDK266 como se describe anteriormente. Sorprendentemente, esta combinación particular de bacterias de ácido láctico da lugar inesperadamente a respuestas in vivo beneficiosas en cerdos destetados tempranamente (véase ejemplos).

[0086] En otra forma de realización altamente preferida, la combinación es una mezcla de Lactobacillus plantarum y Lactobacillus reuteri. Incluso más preferiblemente, la combinación es NCIMB 41847: Lactobacillus plantarum/pentosus/paraplantarum y Lactobacillus reuteri GGDK161 como se describe anteriormente.

[0087] Tal como se utiliza aquí, el término "probiótico" significa preparaciones de células microbianas o componentes de células microbianas con un efecto beneficioso sobre la salud o el bienestar del huésped. (Salminen S, Ouwehand A. Benno Y. et al "Probiotics: How should they be defined" Trends Food Sci. Technol. 1999: 10 10710).

[0088] Preferiblemente, la composición probiótica es una composición administrable por vía oral de bacterias

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probióticas metabólicamente activas, es decir, vivas y/o o liofilizadas, o no viables, irradiadas o lisadas muertas por calor. La composición probiótica puede contener otros ingredientes. La composición probiótica de la invención se puede administrar por vía oral, es decir, en la forma de un comprimido, cápsula o polvo. Alternativamente, la composición probiótica de la invención se puede administrar por vía oral como un producto alimenticio o nutricional, tal como leche o producto lácteo fermentado basado en suero de leche, o como un producto farmacéutico.

[0089] Una dosis diaria adecuada de las bacterias probióticas es de aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 1 x 1011 unidades formadoras de colonias (CFU), más preferiblemente de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1010 CFU, más preferiblemente, aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 1010 CFU. En una realización preferida, la composición contiene cepas bacterianas y/o sus componentes celulares, como ingredientes activos, en una cantidad de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 1012 CFU/g, respecto al peso de la composición, preferiblemente de aproximadamente 1 x 108 a aproximadamente 1 x 1010 CFU/g. La dosis puede ser de 1 g, 3 g, 5 g, y 10 g, a modo de ejemplo.

[0090] Típicamente, un probiótico se combina opcionalmente con al menos un compuesto prebiótico adecuado. Un prebiótico es normalmente un carbohidrato no digerible tal como un oligo- o polisacárido, o un alcohol de azúcar que no se degrada o se absorbe en el tracto digestivo superior. Prebióticos conocidos incluyen productos comerciales tales como la inulina y transgalacto-oligosacáridos.

[0091] Preferiblemente, la composición de la presente invención incluye un prebiótico en una cantidad de desde aproximadamente 1 a aproximadamente 30% en peso, respecto al peso de la composición total, preferiblemente de 5 a 20% en peso. Los carbohidratos preferidos se seleccionan de: fructo-oligosacáridos (o FOS), de cadena corta fructo-oligosacáridos, inulina, isomalta-oligosacáridos, pectinas, xilo-oligosacáridos (o XOS), quitosano- oligosacáridos (o COS), beta-glucanos, goma de cultivo modificado y almidones resistentes, polidextrosa, D- tagatosa, fibras de acacia, de algarroba, la avena y fibras de cítricos. Particularmente prebióticos preferidos son los de cadena corta fructo-oligosacáridos (por simplicidad se muestran en lo que sigue como FOS-c.c); dichos FOS-c.c no son glúcidos digeribles, obtenidos generalmente mediante la conversión del azúcar de remolacha y que incluyen una molécula de sacarosa a la que se unen tres moléculas de glucosa.

Preparación de bacterias del ácido láctico

[0092] Un aspecto adicional de la invención se refiere a un procedimiento para la producción de un probiótico, comprendiendo dicho procedimiento el cultivo de una cepa bacteriana de ácido láctico de acuerdo con la invención. La persona experta en la técnica estará familiarizada con las técnicas y condiciones estándar adecuadas para el cultivo de una cepa bacteriana de acuerdo con la invención.

[0093] Un método de preparación de una o más cepas bacterianas de acuerdo con la invención comprende las etapas de:

(i) la obtención de las heces de un cerdo orgánicamente criado;

(ii) la congelación de las heces y de dispersión en un diluyente adecuado;

(iii) la aplicación de las heces dispersas obtenidas en la etapa (ii) a un agar adecuado, opcionalmente en presencia de hidratos de carbono de calostro de cerdo suplementarios, y la incubación bajo condiciones anaeróbicas;

(v) la selección de distintas colonias de bacterias formadas durante la etapa (iv) y la siembra en un caldo adecuado, opcionalmente en presencia de hidratos de carbono de calostro de cerdo suplementarios;

(vi) incubar las colonias sin semillas obtenidas en la etapa (v).

[0094] Agares adecuados incluyen, por ejemplo, placas de agar de MRS o LAMVAB. Sin embargo, otros agares adecuados también se pueden utilizar, y serían familiares para la persona experta.

[0095] Caldos adecuados incluyen, por ejemplo, caldo MRS. Sin embargo, otros caldos adecuados también se pueden utilizar, y serían familiares para la persona experta.

[0096] La etapa (iii) puede implicar la incubación del agar durante al menos 72 horas a una temperatura de alrededor de 37°C.

[0097] La etapa (vi) puede implicar la incubación de las colonias sembradas durante al menos 48 horas a una temperatura de alrededor de 37°C.

[0098] La descripción se refiere a un procedimiento para la obtención de una cepa bacteriana de ácido láctico porcino, comprendiendo dicho proceso la obtención de las heces de un cerdo orgánicamente criado y la extracción de una o más cepas bacterianas del ácido láctico de la especie porcina de dicho heces.

[0099] El procedimiento comprende las etapas de:

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(i) la obtención de las heces de un cerdo orgánicamente criado;

(ii) la congelación de las heces y de dispersión en un diluyente adecuado;

(vi) la incubación de las colonias sin semillas obtenidas en la etapa (v).

[0100] La descripción se refiere a una cepa bacteriana de ácido láctico porcino obtenida por, o que puede obtenerse por el proceso descrito anteriormente.

Aplicaciones terapéuticas

[0101] Otro aspecto de la invención se refiere a una o más cepas bacterianas del ácido láctico tal como se define anteriormente para su uso en medicina.

[0102] Otro aspecto de la invención se refiere a una o más cepas bacterianas del ácido láctico tal como se define anteriormente para su uso en el tratamiento de un trastorno intestinal.

[0103] Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una o más cepas bacterianas de ácido láctico o una composición como se define anteriormente en la preparación de un medicamento para tratar un trastorno intestinal.

[0104] El término "medicamento", como se usa en este documento abarca medicamentos para uso tanto humano como animal en medicina humana y veterinaria. Además, el término "medicamento", como se usa en este documento significa cualquier sustancia que proporciona un efecto terapéutico y/o beneficioso. El término "medicamento", como se usa en el presente documento no se limita necesariamente a las sustancias que necesitan la aprobación de comercialización, pero puede incluir sustancias que pueden ser utilizadas en cosméticos, nutracéuticos, alimentos (incluyendo alimentos y bebidas, por ejemplo), cultivos probióticos y remedios naturales. Además, el término "medicamento", como se usa en este documento abarca un producto diseñado para su incorporación en la alimentación animal, por ejemplo de alimentación de ganado y/o alimentos para mascotas.

[0105] Otro aspecto de la descripción se refiere a un método de tratamiento de un trastorno intestinal en un sujeto, comprendiendo dicho método administrar al sujeto una cantidad farmacéuticamente eficaz de una o más cepas bacterianas de ácido láctico o una composición farmacéutica o una composición probiótica como se describe encima.

[0106] Preferiblemente, el trastorno intestinal se selecciona de entre el síndrome del intestino irritable (IBS), enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), dispepsia funcional, estreñimiento funcional, diarrea funcional (incluyendo la diarrea asociada a antibióticos, diarrea del viajero y diarrea pediátrica), dolor abdominal funcional, hinchazón funcional, síndrome de dolor epigástrico, síndrome de dificultad postprandial, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad de reflujo gastrointestinal (ERGE), alergias, enfermedades atópicas, por ejemplo, dermatitis atópica, enterocolitis necrotizante, otras infecciones, y combinaciones de los mismos.

[0107] En una realización preferida, el trastorno intestinal es IBS. La fisiopatología precisa de IBS que queda por esclarecer. Estudios recientes han descrito inflamación de la mucosa y alteraciones en la microbiota intestinal en pacientes con SII y una correlación de la enfermedad con infecciones intestinales.

[0108] En una realización altamente preferida, el trastorno es la salmonelosis. La salmonelosis es una enfermedad causada por varias cepas de salmonela que se caracteriza por fiebre y trastornos intestinales.

[0109] Otro aspecto de la invención se refiere a una o más cepas bacterianas de ácido láctico como se define anteriormente para mejorar la microbiota intestinal.

[0110] Otro aspecto de la descripción se refiere a un método para mejorar la microbiota intestinal en un sujeto, comprendiendo dicho método administrar al sujeto una composición que comprende una o más cepas bacterianas de ácido láctico o una composición farmacéutica o una composición probiótica de acuerdo con la invención.

[0111] Las cepas bacterianas de ácido láctico de acuerdo con la invención también se pueden usar en aplicaciones profilácticas. En aplicaciones profilácticas, las composiciones de acuerdo con la invención se administran a un paciente susceptible a, o de otro modo en riesgo de una enfermedad particular en una cantidad que es suficiente para al menos parcialmente reducir el riesgo de desarrollar una enfermedad. Tal cantidad se define para ser "una dosis efectiva profiláctica". Las cantidades precisas dependen de un número de factores específicos del paciente, tales como estado de salud y el peso del paciente.

[0112] Las cepas bacterianas de ácido láctico y composiciones probióticas según la invención también se pueden

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usar en la alimentación animal (por ejemplo en la nutrición de cerdo), en particular en el período de destete temprano y creciente período de engorde. Se espera que los probióticos mejoren la función inmune para reducir y prevenir enfermedades infecciosas, beneficiosamente alterar la composición de la microbiota, y mejorar el crecimiento y el rendimiento de los animales, por ejemplo, mediante una mayor eficiencia de conversión del pienso. El término "animal" incluye todos los animales incluyendo seres humanos. Ejemplos de animales son no rumiantes y rumiantes. Animales rumiantes incluyen, por ejemplo, ovejas, cabras, y ganado, por ejemplo, vaca como el ganado vacuno y vacas lecheras. En una realización particular, el animal es un animal no rumiante. Los animales no rumiantes incluyen los animales de compañía, por ejemplo, caballos, gatos y perros; por ejemplo cerdos o puercos monogástricos (incluyendo pero no limitado a cerdos lechones y cerdos de crecimiento); aves de corral tales como pavos, patos y pollos (incluyendo pero no limitado a pollos de engorde, capas); peces (incluyendo pero no limitado a salmón, trucha, tilapia, siluro y carpas); y crustáceos (incluyendo pero no limitado a los camarones y gambas).

Piensos/productos

[0113] Un aspecto adicional de la invención se refiere a productos alimenticios, piensos, suplementos dietéticos, aditivos alimentarios, probióticos y los medicamentos que contienen una o más cepas bacterianas de acuerdo con la invención.

[0114] En una realización preferida, la composición comprende adicionalmente al menos otro tipo de otra bacteria de calidad alimentaria, en el que la bacteria de grado alimentario se selecciona preferiblemente del grupo que consiste de bacterias de ácido láctico, bifidobacterias, bacterias propiónicas o mezclas de los mismos.

[0115] Un aspecto de la invención se refiere a un producto alimenticio que comprende una o más cepas bacterianas del ácido láctico de acuerdo con la invención. El término "producto alimenticio" se destina a cubrir todos los productos consumibles que pueden ser sólidos, gelatinosos o líquidos. Productos alimenticios adecuados pueden incluir, por ejemplo, productos funcionales de alimentos, composiciones de alimentos, alimentos para mascotas, alimento para ganado, alimentos saludables, alimentos para animales y similares. En una realización preferida, el producto alimenticio es un alimento saludable.

[0116] Tal como se utiliza aquí, el término "producto alimenticio funcional" significa comida que es capaz de proporcionar no sólo un efecto nutricional, sino también es capaz de suministrar un efecto beneficioso adicional al consumidor. Por consiguiente, los alimentos funcionales son alimentos ordinarios que tienen componentes o ingredientes (tales como los descritos en el presente documento) incorporados a los que imparten a la comida un beneficio funcional específico - médico o fisiológico, por ejemplo - con excepción de un efecto puramente nutritivo.

[0117] Ejemplos de productos específicos de alimentos que son aplicables a la presente invención incluyen productos a base de leche, listos para comer postres, polvos para reconstitución con, por ejemplo, leche o agua, bebidas de leche de chocolate, bebidas de malta, platos listos para comer, platos instantáneos o bebidas para seres humanos o composiciones alimenticias que representan una dieta completa o parcial destinada a animales domésticos o ganado.

[0118] En una realización preferida, la composición de acuerdo con la presente invención es un producto alimenticio destinado a seres humanos, animales domésticos o ganado. La composición puede estar destinada a animales seleccionados del grupo que consiste en perros, gatos, cerdos, ganado, caballos, cabras, ovejas o aves de corral. En una realización preferida, la composición es un producto alimenticio destinado a especies de adultos, en particular los humanos adultos.

[0119] En la presente invención, "producto a base de leche" significa cualquier producto a base de leche o suero de leche líquida o semi-sólida que tiene un contenido de grasa variable. El producto a base de leche puede ser, leche por ejemplo, leche de vaca, leche de cabra, leche de oveja, desnatada, leche entera, leche recombinada a partir de leche en polvo y suero de leche sin ningún procesamiento, o un producto procesado, tales como yogur, leche cuajada, requesón, leche agria, leche entera agria, suero de mantequilla y otros productos de leche agria. Otro grupo importante incluye bebidas de leche, tales como bebidas de suero de leche, leches fermentadas, leches condensadas, infantiles o leches para bebés; leches aromatizadas, helado; alimentos como los dulces que contienen leche.

[0120] Un aspecto de la invención se refiere a un alimento que comprende una o más cepas bacterianas de acuerdo con la invención.

[0121] Piensos pueden ser un aditivo alimentario, una premezcla de pienso o un alimento para animales. Los ejemplos particulares de alimentos de acuerdo con la invención incluyen los siguientes: aditivo para la alimentación animal, que comprende (a) las bacterias del ácido láctico de la especie porcina de acuerdo con la presente invención (b) la vitamina soluble al menos una grasa (c) vitamina soluble en al menos uno de agua (d) a menos una traza mineral y/o al menos un mineral macro; una composición de pienso animal que comprende bacterias porcinas del ácido láctico según la presente invención y un contenido de proteína cruda de 50-88g/kg de alimento. Las llamadas premezclas son ejemplos de aditivos de alimentos para animales de la invención. Una premezcla designa una

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mezcla preferiblemente uniforme de uno o más micro-ingredientes con diluyente y/o vehículo. Premezclas se utilizan para facilitar la dispersión uniforme de micro-ingredientes en una mezcla más grande.

[0122] Otros agentes, ingredientes opcionales, alimentación de aditivos son colorantes, por ejemplo carotenoides tales como beta-caroteno, astaxantina, y luteína; compuestos de aroma; estabilizantes; péptidos antimicrobianos; ácidos grasos poliinsaturados; oxígeno reactivo generador de especie; y/o al menos una enzima seleccionada de entre fitasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26); xilanasa (EC 3.2.1.8); galactanasa (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidasa (EC 3.2.1.22); proteasa (EC 3.4.), fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5); fosfolipasa C (EC 3.1.4.3); fosfolipasa D (EC 3.1.4.4); amilasa tal como, por ejemplo, alfa-amilasa (EC 3.2.1.1); y/o beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6).

[0123] Los ejemplos de ácidos grasos poliinsaturados son ácidos grasos poliinsaturados C18, C20 y C22, tales como ácido araquidónico, ácido docosahexaenoico, ácido eicosapentaenoico y ácido gamma-linoleico.

[0124] Ejemplos de especies que generan oxígeno reactivo son productos químicos tales como perborato, persulfato, o percarbonato; y enzimas tales como una oxidasa, una oxigenasa o una sintetasa.

[0125] Por lo general, la grasa y las vitaminas solubles en agua, así como oligoelementos forman parte de una denominada premezcla destinada a la adición al alimento, mientras que los macrominerales normalmente se añaden por separado a la alimentación. Cualquiera de estos tipos de composición, cuando se enriquece con bacterias porcinas del ácido láctico según la presente invención, es un aditivo para la alimentación animal.

[0126] Las siguientes son listas no exclusivas de ejemplos de estos componentes: Ejemplos de vitaminas liposolubles son vitamina A, vitamina D3, vitamina E, y vitamina K, por ejemplo, vitamina K3. Ejemplos de vitaminas solubles en agua son la vitamina B12, biotina y colina, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico y pantotenato, por ejemplo Ca-D-pantotenato. Ejemplos de minerales traza son manganeso, zinc, hierro, cobre, yodo, selenio, y cobalto. Ejemplos de macrominerales son el calcio, fósforo y sodio.

[0127] Los requisitos nutricionales de estos componentes (ejemplificados con aves de corral y lechones/cerdos) se enumeran en la Tabla A de WO 01/58275. El requerimiento nutricional significa que estos componentes deben estar provistos en la dieta en las concentraciones indicadas. En la alternativa, el aditivo para piensos para animales de la invención comprende al menos uno de los componentes individuales especificados en la tabla A de WO 01/58275. Al menos un medio cualquiera de, uno o más de, uno, o dos, o tres, o cuatro etcétera hasta los trece, o hasta los quince componentes individuales. Más específicamente, este al menos un componente individual está incluido en el aditivo de la invención en una cantidad tal como para proporcionar una concentración en el alimento dentro de la gama indicada en la columna cuatro, o columna cinco, o columna seis de la tabla A de WO 01/58275.

[0128] Composiciones de alimentación animal o dietas típicamente tienen un contenido relativamente alto de proteína. Avícolas y porcinas dietas pueden ser caracterizadas como se indica en la Tabla B de WO 01/58275, columnas 2-3. Dietas de peces pueden ser caracterizadas como se indica en la columna 4 de esta Tabla B.

[0129] Además, tales dietas de peces normalmente tienen un contenido de grasa cruda de 200-310 g/kg. WO 01/58275 corresponde a US 09/779334.

[0130] Una composición de pienso según la invención tiene típicamente un contenido de proteína cruda de 50-800 g/kg, y comprende además bacterias porcinas del ácido láctico según la presente invención del mismo como se describe en este documento.

[0131] Además, o en la alternativa (al contenido de proteína bruta indicado anteriormente), la composición de alimento para animales de la invención puede tener un contenido de energía metabolizable de 10-30 MJ/kg; y/o un contenido de calcio de 0,1-200 g/kg; y/o un contenido de fósforo disponible de 0,1-200 g/kg; y/o un contenido de metionina de 0,1-100 g/kg; y/o un contenido de metionina más cisteína de 0,1-150 g/kg; y/o un contenido de lisina de 0,5-50 g/kg.

[0132] En ciertas realizaciones preferidas, el contenido de energía metabolizable, proteína cruda, calcio, fósforo, metionina, metionina más cisteína, y/o lisina está dentro de cualquiera de las gamas 2, 3, 4 o 5 en la Tabla B de WO 01/58275 (R. 2-5). La proteína cruda se calcula como nitrógeno (N) multiplicado por un factor 6,25, es decir proteína bruta (g/kg) = N (g/kg) x 6,25. El contenido de nitrógeno se determina por el método Kjeldahl (AOAC, 1984, Métodos Oficiales de Análisis 14a ed., Asociación de Químicos Analíticos Oficiales, Washington DC). Energía metabolizable puede calcularse sobre la base de los requisitos de publicación de NRC en el ganado porcino, novena edición revisada 1988, subcomisión sobre la nutrición porcina, comité sobre nutrición animal, tablero de la agricultura, Consejo Nacional de Investigación. National Academy Press, Washington, DC, pp. 2-6, y la mesa europea de valores de energía para aves de corral, piensos, centro Spelderholt para la investigación de aves de corral y extensión, 7361 DA Beekbergen, Países Bajos. Grafisch Bedrijf Ponsen y Looijen bv, Wageningen. ISBN 90-7146312-5.

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[0133] El contenido dietético de calcio, fósforo y aminoácidos disponibles en dietas para animales completas se calcula sobre la base de tablas de alimentación tales como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7.

[0134] En una realización preferida, la composición de pienso para animales de la invención contiene al menos una proteína vegetal o fuente de proteína. También puede contener proteína animal, como carne y hueso, y/o harina de pescado, típicamente en una cantidad de 0-25%. El término proteínas vegetales como se utiliza aquí se refiere a cualquier compuesto, composición, preparación o mezcla que incluye al menos una proteína derivada de o procedente de un vegetal, incluyendo proteínas modificadas y derivadas de proteína. En ciertas realizaciones particularmente preferidas, el contenido de proteína de las proteínas vegetales es al menos 10, 20, 30, 40, 50, o

60% (p/p).

[0135] Las proteínas vegetales pueden derivarse de fuentes de proteínas vegetales, tales como leguminosas y cereales, por ejemplo materiales de plantas de las familias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae, y Poaceae, tales como harina de soja, harina de lupino y harina de colza. En una realización particular, la fuente de proteína vegetal es material de una o más plantas de la familia Fabaceae, por ejemplo semilla de soja, altramuz, guisante, o fríjol. Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal son semilla de colza, semilla de girasol, semilla de algodón, y repollo. Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal son los cereales como la cebada, el trigo, el centeno, la avena, el maíz (maíz), arroz, triticale y sorgo.

[0136] Las dietas para animales pueden por ejemplo ser fabricadas como alimentación en puré (no granulada) o pienso granulado. Típicamente, los productos alimenticios molidos se mezclan y se agregan cantidades suficientes de vitaminas esenciales y minerales según las especificaciones para las especies en cuestión. Una bacteria del ácido láctico de la especie porcina de acuerdo con la presente invención de los mismos se pueden añadir como formulaciones sólidas o líquidas.

Las composiciones de la presente invención pueden ser - o se puede añadir a - suplementos alimenticios, también denominados aquí como suplementos dietéticos o aditivos alimentarios. Por lo tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un suplemento o aditivo alimentario dietético que comprende una o más cepas bacterianas de acuerdo con la invención.

[0137] Otra realización de la invención se refiere al uso de un pienso como se describe anteriormente para mejorar el rendimiento del crecimiento animal, medido por el aumento de peso diario y/o la relación de conversión de alimento.

[0138] En una realización preferida, la invención se refiere a métodos para el uso de un pienso que comprende una o más bacterias del ácido láctico de la especie porcina de acuerdo con la presente invención en la alimentación animal para mejorar la ganancia diaria de peso, la mejora de la tasa de conversión alimenticia (FCR) y/o para la modulación de la microflora intestinal.

[0139] En realizaciones preferidas alternativas, el pienso que comprende una o más bacterias del ácido láctico de la especie porcina de acuerdo con la presente invención mejora la digestibilidad del alimento de animales, y/o mantiene la salud de los animales, ayudando en la digestión apropiada y/o el apoyo a la función del sistema inmunológico.

[0140] El FCR se puede determinar sobre la base de una prueba de crecimiento de los lechones que comprende un primer tratamiento en el que el pienso que comprende bacterias porcinas de ácido láctico según se añade la presente invención a la alimentación animal en una concentración adecuada por kg de pienso, y un segundo tratamiento (control) sin adición de bacterias porcinas del ácido láctico según la presente invención a la alimentación animal. En el presente contexto, el término Relación de Conversión de Pienso, o FCR, se utiliza como sinónimo del pienso de conversión de la alimentación. El FCR se calcula como el consumo de pienso en g/animal en relación con el aumento de peso en g/animal. Como se sabe en general, una mejor FCR es menor que la FCR control. En realizaciones particulares, la FCR se mejora (es decir, reducida) en comparación con el control por parte de al menos 1,0%, preferiblemente al menos 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, 2,0%, 2,1%, 2,2%, 2,3%, 2,4%, o al menos 2,5%.

[0141] El término "intestino" como se utiliza aquí designa el tracto gastrointestinal o digestivo (también denominado el canal alimentario) y se refiere al sistema de órganos dentro de los animales multicelulares que absorbe alimentos, los digiere para extraer energía y nutrientes, y expulsa los residuos restantes.

[0142] El término "microflora" intestinal tal como se utiliza aquí se refiere a los cultivos microbianos naturales que residen en el intestino y mantenimiento de la salud por ayudar en la digestión apropiada y/o el apoyo a la función del sistema inmunológico.

[0143] El término "modular" tal como se utiliza aquí en relación con la microflora intestinal generalmente significa cambiar, manipular, alterar o ajustar la función o el estado de la misma en un animal sano y que funcione

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normalmente, es decir, un uso no terapéutico.

Diluyentes, excipientes y portadores

[0144] Como se mencionó anteriormente, la invención también se refiere a composiciones, más preferiblemente composiciones farmacéuticas, que comprende una cepa bacteriana de ácido láctico de acuerdo con la invención. Las cepas bacterianas de ácido láctico de la presente invención se administran generalmente en mezcla con un portador, excipiente o diluyente, en particular para la terapia humana. Las composiciones farmacéuticas pueden ser para uso humano o animal en medicina humana y veterinaria.

[0145] Los ejemplos de tales excipientes adecuados para las diversas formas diferentes de composiciones farmacéuticas descritas aquí se pueden encontrar en el "Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2a edición, (1994), editado por A Wade y PJ Weller.

[0146] Los vehículos aceptables o diluyentes para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica, y se describen, por ejemplo, en Remington Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (AR Gennaro edit. 1985).

[0147] Los ejemplos de vehículos adecuados incluyen lactosa, almidón, glucosa, metilcelulosa, estearato de magnesio, manitol, sorbitol y similares. Ejemplos de diluyentes adecuados incluyen etanol, glicerol y agua.

[0148] La elección del vehículo, excipiente o diluyente farmacéutico puede seleccionarse con respecto a la vía de administración prevista y la práctica farmacéutica estándar. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender como, o además de, el portador, excipiente o diluyente cualquier aglutinante, lubricante, agente de suspensión, agente de recubrimiento, agente solubilizante.

[0149] Los ejemplos de aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales tales como glucosa, lactosa anhidra, lactosa de flujo de libre, beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas, tales como acacia, tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa y polietilenglicol.

[0150] Los ejemplos de lubricantes adecuados incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato sódico, acetato sódico, cloruro sódico y similares.

[0151] Los conservantes, estabilizantes, colorantes e incluso agentes aromatizantes pueden proporcionarse en la composición farmacéutica. Los ejemplos de conservantes incluyen benzoato sódico, ácido sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. Los antioxidantes y agentes de suspensión también pueden usarse.

Administración

[0152] Las composiciones de la presente invención pueden adaptarse para administración oral, rectal, vaginal, parenteral, intramuscular, intraperitoneal, intraarterial, intratecal, intrabronquial, subcutánea, intradérmica, intravenosa, nasal, o rutas de administración sublingual. Preferiblemente, las composiciones de la presente invención están adaptadas para administración oral, rectal, vaginal, parenteral, nasal, bucal o sublingual de administración.

[0153] Para la administración oral, se hace uso particular de tabletas comprimidas, píldoras, tabletas, píldoras, gotas y cápsulas.

[0154] Otras formas de administración comprenden soluciones o emulsiones que se pueden inyectar por vía intravenosa, intraarterial, intratecal, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal o intramuscular, y que se preparan a partir de soluciones estériles o esterilizables. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden estar en forma de supositorios, pesarios, suspensiones, emulsiones, lociones, pomadas, cremas, geles, pulverizaciones, soluciones o polvos de espolvoreo.

[0155] Un medio alternativo de administración transdérmica es mediante el uso de un parche cutáneo. Por ejemplo, el ingrediente activo se puede incorporar en una crema que consiste en una emulsión acuosa de polietilenglicoles o parafina líquida. La cepa bacteriana de ácido láctico también se puede incorporar en un ungüento que consiste en una cera blanca o base de parafina blanda blanca junto con los estabilizantes y conservantes que puedan ser necesarios.

[0156] Las composiciones pueden formularse en forma de dosificación unitaria, es decir, en forma de porciones discretas que contienen una dosis unitaria, o una unidad múltiple o subunidad de una dosis unitaria.

Dosificación

[0157] Una persona de experiencia ordinaria en la técnica puede determinar fácilmente una dosis apropiada de una de las composiciones instantáneas para administración a un sujeto sin experimentación excesiva. Típicamente, un

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médico determinará la dosis real que será la más adecuada para un paciente individual y dependerá de una variedad de factores incluyendo la actividad de la cepa bacteriana específica empleada, la estabilidad metabólica y la duración de acción de esa cepa, la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, modo y tiempo de administración, velocidad de excreción, combinación de fármacos, la gravedad de la afección particular y la terapia individual. Las dosis descritas en este documento son ejemplares del caso medio. No puede, por supuesto, haber casos individuales donde se requieran intervalos de dosificación superiores o inferiores.

[0158] La dosis diaria efectiva habitual en los seres humanos o en animales es de aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 1x 1011, más preferiblemente, de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1x 1011, incluso más preferiblemente, de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 1010 CFU.

Combinaciones

[0159] En una realización preferida, las composiciones de la invención se administran en cualquier combinación, por ejemplo, dos o más de las bacterias del ácido láctico se pueden administrar en cualquier combinación o proporción.

[0160] En otra realización particularmente preferida, las composiciones de la invención se administran en combinación con uno o más de otros agentes activos. En tales casos, las composiciones de la invención pueden administrarse consecutivamente, simultáneamente o secuencialmente con uno o más de otros agentes activos.

Aislamiento y caracterización de cepas bacterianas

[0161] Las cepas de laboratorio aislado (total de 436 picos de colonias individuales) a partir de heces de los cerdos criados orgánicamente fueron predominantemente L. reuteri, L. johnsonii, L. gasseri, L. pentosus, cepas con un pequeño número de L. plantarum, L. acidophilus, L. vaginalis, un solo L. mucosae y varias cepas no cultivadas.

[0162] La mayor parte del LAB produce sustancias que podrían inhibir el crecimiento de S. enteritidis y/o E. coli K88 in vitro. La potencia de estos efectos anti-patógenos varió mucho entre las cepas bacterianas individuales.

[0163] Se seleccionaron ciertas cepas sobre la base de la potencia antimicrobiana tal como se determina in vitro. Estas bacterias se seleccionaron adicionalmente para determinar su capacidad para bloquear la adhesión/invasión de las células epiteliales de cerdo intestinal (IPEC) por patógenos in vitro y su susceptibilidad a los antibióticos.

[0164] Ciertas cepas se sometieron a ensayo para la gama de sustrato y especificidad y su capacidad para suprimir la inflamación en las células IPEC in vitro. De estos, se identificaron catorce de laboratorio (5 L. johnsonii, 6 L. reuteri y 3 de L. plantarum) con propiedades favorables. Dos de estas cepas [GGDK266 y GGDK31] se prepararon en el bulto para evaluación in vivo en lechones destetados de nueva emisión. Otros candidatos potencialmente importantes estaban presentes entre este conjunto de 14 LAB.

[0165] Las pequeñas pérdidas en la viabilidad fueron evidentes en el secado y el almacenamiento de LAB se seca en la leche desnatada en polvo de congelación. Una combinación de leche desnatada en polvo y azúcares simples fue ligeramente más eficaz, pero difícil de mantener. Preparativos a granel de GGDK266 y GGDK31 se liofilizaron y se almacenan en este medio.

[0166] Se obtuvieron cinco cultivos acondicionados de calor de LAB. Sin embargo, las propiedades biológicas in vitro y el potencial probiótico de tres cepas se vieron afectados adversamente por el tratamiento térmico. Sin embargo, dos de las bacterias retuvieron las propiedades biológicas de las formas no tratadas por calor nativas.

[0167] El tratamiento oral de ratones con LAB cerdo (L. reuteri o L. mucosas) redujo en gran medida la patogenicidad de S. enteritidis en formas agudas (ratón C57BI/6) y crónicas (ratón C3H/HeN) de salmonelosis.

[0168] Los datos indican que LAB de cerdos criados orgánicamente tienen un potencial considerable como fuente de probióticos novelos y potentes.

[0169] Los estudios realizados por el solicitante implicaron aislar un gran número de LAB de cerdos criados orgánicamente y la detección de cepas de LAB probióticas potentes mediante la evaluación de su potencia biológica y modo de acción, tanto in vitro como in vivo.

[0170] Más específicamente, se llevaron a cabo experimentos para establecer cultivos de LAB derivados de heces de cerdos orgánicamente criados. Las cepas de LAB fueron seleccionados para la actividad anti-microbiana contra un número de patógenos en vitro. Se llevaron a cabo experimentos para determinar si las cepas de LAB podrían bloquear la unión de patógenos a las células epiteliales de cerdo in vitro. También se realizaron estudios para evaluar la capacidad de LAB para bloquear las respuestas inflamatorias en las células epiteliales de cerdo in vitro. Las cepas que muestran un buen perfil bioactivo in vitro se seleccionaron y se cultivaron en grandes cantidades para un estudio a gran escala in vivo.

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[0171] Se describen más detalles sobre las técnicas experimentales en la sección de ejemplos que se acompañan. En resumen, las cepas de LAB se aislaron y cultivaron a partir de heces de cerdos utilizando medios microbiológicos selectivos. Colonias bacterianas individuales se aislaron y se analizaron las secuencias de genes de ARNr 16S para permitir la identificación genotípica de cepas bacterianas. La característica fenotípica de probióticos potenciales se determinó aún más tras la medición de la adherencia, las actividades anti-bacterianas y anti-inflamatorias, la susceptibilidad a los antibióticos y, finalmente, calentar la estabilidad. La actividad anti-bacteriana de medios acondicionados derivados de LAB se evaluó usando ensayos bien de difusión para determinar la actividad de matar contra los patógenos entéricos Salmonela enteritidis y E. coli K88. También se evaluó la capacidad de cepas LAB para bloquear o interferir con adherencia/invasión S. enteritidis y E. coli K88 de cerdo epitelial (IPEC), como era su capacidad para suprimir la inflamación en las células IPEC inducidas por 12-O-Tetradecaboilforbol-13-acetato [PMA]. Además, las propiedades metabólicas de cepas de laboratorio (API CH 50 kit) y su susceptibilidad a los antibióticos, se determinó. Se estableció un sistema de clasificación, basado en anotar las propiedades biológicas de LAB y se utiliza para la selección de cepas de LAB candidatos para la evaluación probiótica in vivo.

[0172] Se describen más detalles sobre los resultados de los experimentos anteriores en los ejemplos adjuntos.

[0173] El LAB (436 selecciones de colonias individuales) aislado de heces de los cerdos criados orgánicamente eran predominantemente L. johnsonii o relacionados con L. johnsonii y L. reuteri o L. reuteri- relacionados con pequeños números de L. relacionados con plantarum y cepas no cultivadas. Esto representó una gama mucho más estrecha de LAB porcina asociada a la reportada por otros (Martin et al, 2009; Yun et al, 2009; Lahteinen et al, 2010; Yao et al, 2011). Sin embargo, en comparación con cerdos criados convencionalmente/intensivamente, cerdos criados orgánicamente en el exterior tenían altos niveles de LAB y función inmune más desarrollada intestinal (Mulder et al,

2009) . Los datos actuales indican que cepas bacterianas L. johnsonii y L. reuteri son de particular importancia en el desarrollo adecuado del intestino y el sistema inmune en los cerdos jóvenes. Además, la inclusión de otras bacterias de ácido láctico derivadas de la tripa o heces de cerdos criados orgánicamente, en particular, Lactobacillus delbrueckii y Lactobacillus amylovorous puede mejorar las propiedades homeostáticas inmunes de Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum y Lactobacillus johnsonii.

[0174] Todos las sustancias aisladas producidas de cerdo LAB que podrían matar o interferir con el crecimiento de S. enteritidis en un ensayo de difusión de pocillo y la mayoría mataron o suprimieron el crecimiento de E. coli K88. La potencia de las actividades anti-microbianas variaron enormemente entre las colonias individuales, independientemente de si eran L. reuteri, L. johnsonii o L. plantarum. No hubo correlación general entre la potencia anti-salmonela y anti-E.coli K88 de cada uno de los LAB. LAB son conocidos para producir una gama de factores activos, incluyendo ácidos orgánicos, pequeños compuestos anti-microbianos y péptidos anti-bacterianos (Cintas et al, 2001). La naturaleza de estas sustancias anti-microbianas producidas por LAB de cerdos criados orgánicamente no se ha establecido.

[0175] Treinta y tres cepas de LAB de cerdo, seleccionadas sobre la base de la actividad anti-patógena, se ensayaron para la capacidad de bloquear la unión/invasión de células IPEC por S. enteritidis y E. coli K88. Todos ellos fueron capaces de reducir drásticamente la fijación/invasión de células IPEC por salmonela. La mayoría también podría bloquear E. coli K88. Al igual que matar patógenos, no hubo correlación general entre las habilidades del LAB para bloquear la Salmonela y E. coli K88. Sin desear estar ligado por la teoría, se cree que el LAB puede limitar el acceso de patógenos a la capa epitelial mediante la ocupación de sitios de unión en la monocapa de células o por producción de factores que interfieren con la unión del patógeno a las células epiteliales, tales como el bloqueo de sitios de unión de adhesinas de superficie (Ljungh y Wadstrom, 2006; Blandino et al, 2008; Williams,

2010) .

LAB de cerdo también puede bloquear o suprimir expresión de genes inflamatorios (interleucina-8, ILO-8) activada en células IPEC por PMA. Cultivos individuales variaron en gran medida en su capacidad de afectar a la inflamación, pero cinco cepas (RINH vial 29, 30, 31 86 y 266) tenían propiedades antiinflamatorias potentes. Se sabe que ciertas cepas de LAB tienen inmuno-moduladores o propiedades anti-inflamatorias (Cotter et al, 2005; Blandino et al, 2008; Ohashi y Ushida, 2009; Elmadfa et al, 2010; Liu et al, 2010). Los mecanismos implicados siguen sin estar claros, pero es probable que implican la modulación de los sistemas de señalización molecular por factores bioactivos producidos por el lAb.

[0176] La resistencia a antibióticos es un problema creciente y puede extenderse entre las bacterias por la transferencia de genes (Korhonen et al, 2007; Gousia et al, 2011; Nicolau, 2011). Idealmente, los probióticos candidatos deben tener poca o ninguna resistencia a los antibióticos para reducir al mínimo el riesgo de transferencia de genes de resistencia a la flora de acogida. LAB de cerdo (33 cepas) fueron seleccionados para la resistencia a 10 antibióticos individuales. Una cepa (RINH vial 266) era susceptible a todos los antibióticos ensayados. La mayoría eran susceptibles a la ampicilina, cefotaxima, cloranfenicol, eritromicina, gentamicina, tetraciclina y vancomicina. Sin embargo, la mayoría exhibieron resistencia a metronizadol, ácido nalidíxico y en un grado menor a la kanamicina. Esta relativamente baja incidencia de resistencia a los antibióticos entre estos aislados LAB puede estar vinculada con el medio ambiente en el que los lechones de origen se criaron [criados orgánicamente fuera de la puerta] (Mulder et al, 2009).

[0177] L. johnsonii, L. reuteri y L. plantarum, como se esperaba, mostraron perfiles de reacción de sustrato general

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de la cepa específica, cuando se ensayaron usando un kit CH API 50. Sin embargo, la mayoría de las cepas de genotipo mostraron diferencias finas en su reactividad de sustrato. Esto indicó que eran cepas individuales únicas del genotipo.

[0178] Sobre la base de sus actividades biológicas in vitro, catorce LAB [relacionado con 4 L. plantarum, relacionado con 3 L. johnsonii y 1 L. reuteri] fueron identificados por tener potencial para las pruebas in vivo. Dos de estas cepas de LAB [GGDK266 y GGDK31] se prepararon a granel. Curiosamente, 7 de los catorce LAB (viales RINH 85, 86, 131, 230, 255, 266) se habían aislado a partir de agares selectivos de LAB suplementados con fracciones de carbohidratos del calostro porcino. El perfil de crecimiento y bioactividad de LAB es, en parte, dependiente del sustrato de hidrato de carbono en el que se cultiva (Gopal et al, 2001; Tzortzis et al, 2004), los presentes datos pueden indicar que algunos de los LAB están adaptado por huesped y requieren ciertos hidratos de carbo asociados por cerdo para el crecimiento o la bioactividad óptima.

Es ventajoso si el LAB puede soportar liofilización para permitir su manipulación y procesamiento como probióticos. Sin embargo, su viabilidad se puede reducir en gran medida durante la congelación y el secado (Tomas et al, 2009; Strasser et al, 2009; Reddy et al, 2009). Leche desnatada en polvo, solo o en combinación con azúcares simples, se utiliza a menudo como un crio-protector para preservar la viabilidad de las bacterias (Tomas et al, 2009; Strasser et al, 2009). En el presente estudio, pequeñas pérdidas en la viabilidad fueron evidentes en el secado y el almacenamiento de LAB de cerdo solo en polvo de leche desnatada. La sacarosa o lactosa en combinación con leche desnatada en polvo fue ligeramente más protectora. Sin embargo, el producto era higroscópico y difícil de almacenar o manejar. Por ello se decidió secar y almacenar LAB de cerdo en la leche desnatada en polvo.

[0179] Piensos suplementarios para animales se dan a menudo en forma de gránulos, cuya producción implica altas temperaturas (De Angelis et al, 2006). LAB que se añaden a los alimentos para animales, por lo tanto deben tener un grado significativo de estabilidad térmica para minimizar la pérdida de viabilidad durante el procesamiento. En el presente estudio, cinco LAB fueron objeto de calentamiento tres veces durante 15 minutos a 70°C. Todas las bacterias que se recuperaron después del tercer tratamiento térmico eran viables y en la mayoría de los casos crecieron a tasas similares a las formas nativas de las bacterias. Dos de las bacterias retuvieron las propiedades biológicas de las formas nativas no tratadas por calor. Sin embargo, una de las cepas tratadas con calor habían perdido la capacidad de bloquear la unión del patógeno a las células epiteliales in vitro y otra había reducido en gran medida la actividad de bloqueo. Una cepa adicional era incapaz de bloquear la inflamación inducida por PMA en células epiteliales in vitro, aunque la forma nativa era un potente supresor de la inflamación. El tratamiento térmico puede pues afectar diferencialmente las propiedades biológicas de LAB individual. Esto necesita ser tenido en cuenta cuando se considera la inclusión de LAB en alimentos para animales granulados.

[0180] Los experimentos demostraron que la patogenicidad de S. enteritidis fue atenuada si los ratones fueron cotratados con LAB derivado de cerdos criados orgánicamente. El vial RINH 323 (L. Mucosae) reduce en gran medida la capacidad de S. enteritidis para invadir, extender y proliferar en los tejidos sistémicos en salmonelosis aguda (ratón C57BI/6) y crónica (ratón C3H/Hen). Además, vial RINH 31 [GGDK31], vial RINH 32, vial RINH 46 o vial RINH 47 (todo el L. reuteri) redujo la colonización del intestino grueso, invasión y propagación sistémica y proliferación en ratones C3H/HeN por S. enteritidis. En general, vial RINH 31 [GGDK31] y vial RINH 32 fueron los más eficaces en este modelo crónico de la salmonelosis. Estos LAB tiene potencial como nuevos probióticos para promover la salud intestinal o aumentar la resistencia a la infección in vivo.

[0181] La infección por salmonela es un proceso multifactorial (Naughton y Grant, 2005). S. enteritidis coloniza todo el tracto gastro-intestinal, mueve a través de la capa de moco y se adhiere a la mucosa. El intestino grueso actúa como un depósito para el patógeno, pero la invasión es principalmente a través de las células M, presentes en los parches del íleon de Peyer. La mayoría de salmonela invadida diseminó a los ganglios linfáticos mesentéricos y luego hacia el hígado y el bazo (Naughton y Grant, 2005). Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que LAB podría estar bloqueando la salmonela en las diversas etapas de la infección (Cintas et al, 2001; Cotter et al, 2005; Ohashi y Ushida, 2009). Al competir por los nutrientes, causando la muerte del agente patógeno o el bloqueo de sitios de unión, LAB podría limitar el número de la salmonela en el gran depósito delgado. LAB también puede impedir la adhesión a células de la mucosa del íleon, de una manera similar a la observada aquí con células IPEC- J2 y con células Caco-2 (Neeser et al, 2000) y de este modo limitar la invasión. Alternativamente, LAB puede modular directamente las respuestas del huésped a la infección, en particular, la supresión de la inflamación. Al limitar el daño intestinal y preservar la integridad de barrera (Smith et al, 2008; Schreiber et al, 2009), se reduciría en gran medida la capacidad de la salmonela de invadir y diseminar.

[0182] La presente invención se describe adicionalmente a modo de ejemplo no limitativo, y con referencia a las figuras siguientes no limitantes, en las que:

La Figura 1 muestra un ensayo de actividad antibacteriana de medio acondicionado a partir de bacterias de ácido

láctico.

Las Figuras 2a y b muestran actividad inhibidora frente a S. enteritidis S1400 (expresado como área de la

inhibición en un ensayo de difusión en pocillo) de medio condicionado de las LAB individuales cultivadas a partir

de heces de los cerdos criados orgánicamente.

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Las Figuras 3a y b muestran actividad inhibidora frente a E. coli K88 (expresado como área de la inhibición en un ensayo de difusión en pocillo) de medio condicionado de LAB individuales cultivados a partir de heces de los cerdos criados orgánicamente.

Las Figuras 3c y d muestran la actividad inhibidora (expresada como zona de inhibición en un ensayo de difusión en pocillo) de medio condicionado de LAB individuales cultivados a partir de heces de los cerdos criados orgánicamente.

Las Figuras 4a, b, c muestran la inhibición de la adhesión de (a) S. enteritidis S1400; y (b) E. coli K88 a las células IPEC en cultivo por LAB cultivadas a partir de heces de los cerdos criados orgánicamente; (c) comparación entre la inhibición de S. enteritidis S1400 y (b) E. coli K88.

La Figura 5 muestra un ensayo de la susceptibilidad a los antibióticos de bacterias de ácido láctico utilizando discos impregnados con una cantidad definida de un antibiótico.

La Figura 6 muestra una evaluación de perfil de sustrato de LAB utilizando un API CH 50 kit [49 sustratos, color pálido indicó que la reacción positiva, excepto 25, donde la reacción positiva es de color negro, color oscuro no indica reacción].

La Figura 7 muestra la ACt (a), relación (b) y cambio de veces (c) para expresión génica IL-8 en células IPEC tratadas con PMA y LAB de cerdo.

La Figura 8 muestra la estabilidad de LAB de cerdo después de la liofilización en la leche desnatada en polvo (SKP, (100 g/l), SKP + lactosa (ambos 100 g/l), SKP + sacarosa (ambos 100 g/l) o SKP (200 g/l).

La Figura 9 muestra la estabilidad de LAB aislado a tratamiento térmico (a), la relación (b) y cambio de veces (c) para expresión génica IL-8 en células IPEC tratadas con PMA y LAB de cerdo ingenuo o tratados con calor; (d) la susceptibilidad a los antibióticos de vial RINH 31 nativo y tratado con calor.

La Figura 10 muestra un protocolo para el estudio de ratones C3H/HeN para evaluar la eficacia de vial 323 (L. mucosae) para contrarrestar infección por salmonela en vivo.

Las Figuras 11a-c muestran la distribución de S. enteritidis S1400 en los tejidos a los 10 días post-infección en ratones C3H/HeN que habían o no habían sido co-tratados con 323 (L. mucosae, LM).

Las Figuras 12a-b muestran el peso del bazo (mg/100 g BW) y mieloperoxidasa intestinal (ileal) (|jg) a los 10 días post-infección en ratones C3H/HeN que habían o no habían sido co-tratados con vial 323 (L. mucosae).

La Figura 13 muestra un protocolo para el estudio de ratón C57 BI/6 para evaluar la eficacia de vial 323 (L. mucosae) para contrarrestar infección por salmonela aguda in vivo.

Las Figuras 14a-c muestran la distribución de S. enteritidis S1400 en los tejidos a los 6 días post-infección en ratones C57BI/6 que habían o no habían sido co-tratados con vial RINH 323.

La Figura 15 muestra el peso del bazo (mg/100 g BW) a los 6 días post-infección en ratones C57BI/6 que habían o no habían sido co-tratados con vial 323 (L. mucosae).

La Figura 16 muestra un protocolo para el estudio de ratones C3H/HeN para evaluar la eficacia de LAB seleccionado de heces de cerdos criados orgánicamente para contrarrestar la infección por Salmonela in vivo.

Las Figuras 17a y b muestran excreción de S. enteritidis en las heces a los 7-8 días después de la infección por los ratones C3H/HeN que habían o no habían sido co-tratados con LAB seleccionado.

Las Figuras 18a-b muestran la distribución de S. enteritidis (Log10 CFU/g) en el íleon (a), ciego (b) y colon (c) a los 10 días después de la infección de los ratones C3H/HeN que habían o no habían sido co-tratados con LAB seleccionado.

Las Figuras 19a-c muestran la distribución de S. enteritidis (Log10 CFU/g) en los ganglios linfáticos mesentéricos (a), el hígado (b) y el bazo (c) a los 10 días después de la infección de los ratones C3H/HeN que habían o no habían sido co-tratados con LAB seleccionado.

La Figura 20 muestra el rendimiento de los cerdos alimentados con GGDK266 y GGDK31 frente a un control (aumento de peso diario, DWG, en g/día) para los días 0-7, 7-14 y 0-14.

La Figura 21 muestra el análisis de la diversidad microbiana utilizando electroforesis desnaturalizante en

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gradiente de gel (DGGE; Ensayo 1). DGGE utilizando cebadores universales no reveló diferencias en la diversidad microbiana general entre los tratamientos y el placebo. Bandas en el gel se visualizaron mediante tinción con plata.

La Figura 22 muestra el análisis de la diversidad microbiana mediante DGGE. DGGE utilizando cebadores específicos a bacterias de ácido láctico (LAB) reveló diferencias significativas en la diversidad LAB entre el tratamiento con GGDK266 y placebo en ambas muestras cecales y ileales. Bandas en el gel se visualizaron mediante tinción con plata.

La Figura 23 muestra el análisis de la diversidad microbiana mediante DGGE. DGGE utilizando cebadores específicos a bacterias de ácido láctico (LAB) reveló diferencias significativas en la diversidad LAB entre el tratamiento con GGDK266 y placebo en muestras ileales. Bandas en el gel se visualizaron mediante tinción con plata.

La Figura 24 muestra el análisis de la diversidad microbiana mediante DGGE. DGGE utilizando cebadores específicos a bacterias de ácido láctico (LAB) reveló diferencias significativas en la diversidad LAB entre el tratamiento con GGDK266 y placebo en muestras cecales. Bandas en el gel se visualizaron mediante tinción con plata.

La Figura 25 muestra los procesos biológicos de ontología de genes significativamente regulados hacia abajo por la administración oral de GGDK266.

La Figura 26 muestra los cambios en la respuesta y la respuesta inmune a los estímulos en animales tratados con GGDK266 frente a los animales tratados con placebo (por ciento de genes frente a una gama de diferentes anotaciones GO).

La Figura 27 muestra los procesos biológicos de genes de ontología enriquecidos significativamente por la administración oral de GGDK266.

EJEMPLOS

Materiales y métodos

[0183] Materiales: Muestras de heces de cerdo recogidas durante el curso del estudio de cerdos criados en el exterior e interior (Mulder et al, 2009) se utilizaron en estos estudios. La colección de cultivo se basa principalmente en LAB recogidas a partir de muestras congeladas 411, 412 y 416, que eran de cerdos criados al aire libre con niveles particularmente altos de LAB en sus heces. Premezcla de caldo MRS, agar y vancomicina, los paquetes de gas anaerobio y el indicador y discos de antibióticos se adquirieron de Oxoid, catalizador anaerobio de Fisher Scientific y cisteína-HCL, verde de bromocresol y leche desnatada en polvo de Sigma-Aldrich. Fracciones de carbohidratos de calostro de cerdo se prepararon como parte del programa de SMART 163 de D. Kelly. Kits de extracción de ADN se adquirieron de MP Biomedicals y reactivos de PCR y kits de limpieza de Promega. Kits de API CH 50 fueron adquiridos de Biomerieux UK Ltd.

[0184] Medios estándares: caldo MRS y agar MRS se prepararon de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Agar LAMVAB se preparó de acuerdo con el método de Jackson et al. (2002). Las placas de agar se prepararon inmediatamente antes del uso. El caldo MRS se decantó (10 ml por tubo) en tubos de Hungate estériles en condiciones anaeróbicas y se almacenó a temperatura ambiente.

[0185] Medios de carbohidratos suplementados: Precipitado de sulfato de amonio SMART 163 de calostro de cerdo: precipitado a 0, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 55 o 65% de saturación o soluble a 65% de saturación se pesaron en proporción a las cantidades recuperadas a partir de 15 ml o 50 ml de calostro. Fracciones de carbohidratos fueron dispersadas en 15 ml de MRS o agar LAMVAB, celebrada en 45°C, y luego las placas individuales se vertieron para cada fracción. También se dispersaron en caldo MRS (50 ml) y el caldo suplementado decantado a ocho (6 ml/tubo) tubos de Hungate estériles en condiciones anaeróbicas.

[0186] Animales: Ratones hembra C3H/HeN y C57BI/6 (5-6 semanas de edad) fueron adquiridos de Harlan UK. Se alojaron como grupos o pares en jaulas estándar dentro de aisladores flexifilm con filtros HEPA situados en una instalación de contención de clase 2. Tenían acceso libre a un pienso para roedores de alta calidad y agua desionizada estéril en todo momento y se les permitió aclimatarse durante 7 a 10 días antes del comienzo de los experimentos. El Instituto Rowett de Nutrición y Salud (RINH) está sujeto a la Ley de Animales del Reino Unido (Procedimientos Científicos) de 1986. Estudios en el presente documento se llevaron a cabo bajo los auspicios de una Licencia de Proyecto del Ministerio del Interior aprobada por personal con la necesaria Licencia Personal del Ministerio del Interior (como se define y se establece en la Ley de Animales del Reino Unido (Procedimientos Científicos) de 1986), y fueron revisados y aprobados por el Comité de Revisión Ética RINH.

Métodos

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[0187] Cultivo de LAB: En estudios iniciales, una pequeña cantidad de heces congeladas (100 mg) se dispersó en 1 ml de diluyente de recuperación máxima (MRD). Se hicieron otras dos diluciones de diez veces secuenciales. Las tres suspensiones se sembraron en estrías sobre MRS o placas de agar LAMVAB. En estudios posteriores, la muestra de heces se dispersó en 5 ml de MRD, diluido adicionalmente (1:40) en MRD y 0,5 ml de esta dilución distribuido por la superficie de MRS o placas de agar LAMVAB con o sin hidratos de carbono de calostro de cerdo suplementarios. En todos los casos, las placas se incubaron en un recipiente anaeróbico durante 72 horas a 37°C. Distintas colonias se recogieron (al menos 8 por placa) de las placas de agar y se sembraron en tubos de Hungate que contienen caldo MRS o donde caldo MRS apropiado que contiene hidratos de carbono de cerdos de calostro. Los tubos se incubaron durante 48 horas a 37°C.

[0188] Depósito congelado: Una alícuota (0,7 ml) de cada cultivo se extrajo con una jeringa y aguja estériles y se dispensan en un tubo de plástico que se purgó con CO2 y contenía 0,3 ml de glicerol y 2 mg de L-cisteína. El tubo se cerró herméticamente con un tapón de plástico, con la etiqueta, el contenido se mezclaron, se congelaron y se almacenaron a -80°C.

[0189] Medio acondicionado: El cultivo restante se transfirió a un tubo de centrífuga Corning de 15 ml, se centrifugaron a 1000 g x 5 min a temperatura ambiente, el sobrenadante se decantó, se dividió en alícuotas y se congeló. Los gránulos se extrajeron inmediatamente para el análisis de genes 16S ARNr o se congelaron.

[0190] Análisis del gen 16S ARNr (Clarridge, 2004): El ADN bacteriano se extrajo utilizando un kit de Spin FastDNA® para suelo en conjunción con un sistema de cordón de batidor Fastprep 120, de acuerdo con el protocolo suministrado con el kit. PCR se llevó a cabo (mezcla de reacción: tampón, 10 pl. dNTPs (2 mM), 5 pl. 27F cebador (20 pmol/ pl), 2 pl. 1492R cebador (20 pmol/ pl) 2 pl polimerasa Go Taq Flexi, 0,5 pl. MgCl2, 5 pl. H2O, 23,5 pl y 2 pl de ADN extraído) usando MJ Research PTC-200 Peltier Thermal Cycler se ejecutan a través de 35 ciclos de 95°C durante 3 minutos, 95°C durante 30 segundos, 57°C durante 30 segundos y 72°C durante dos minutos. Cebador: 27F (F01) AGAGTTTGATCCTGGCTCAG; 1492R (RP2) ACGGCTACCTTGTTACGACTT. El producto de limpieza PCR se realiza con un Gel Wizard®SV y kit de limpieza PCR (Promega), que se utiliza de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Productos 16S de PCR se secuenciaron utilizando analizadores genéticos totalmente automatizados basados en tecnología de electroforesis capilar (Sección Genómica, RINH, UoA) usando los cebadores inversos y delanteros 519R y 926F. Las cepas bacterianas fueron identificadas por comparación de secuencias con secuencias conocidas de ADN bacteriano utilizando BLAST (
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

[0191] Actividad antibacteriana: Agar XLD se preparó según las instrucciones del fabricante y se enfrió a 45°C. Salmonella enteritidis S1400 se añadió a agar xLd [1 ml de una dilución 1: 1000 de un cultivo nocturno de Salmonela en 200 ml de agar XLD para dar el equivalente de 106 CFU/ml]. El agar se vierte en placas de petri y se deja fraguar. Las placas fueron marcadas en 4 cuadrantes y un pocillo de aproximadamente 5 mm cortado en cada cuadrante. Una parte alícuota (60 pl) de medios acondicionados o caldo MRS se añadió a los pocillos. Las placas se cubrieron y se incubaron durante 16 horas a 37°C. Fueron fotografiados con una cámara digital. Las imágenes transferidas a Photoshop, y el diámetro del pocillo y zona de inhibición se determinaron usando la herramienta de medición. Los valores se calcularon y se almacenaron en una hoja de cálculo de Excel. El mismo procedimiento se utilizó con Escherichia coli K88, excepto que se usó agar MacConkey No 3.

[0192] Susceptibilidad a los antibióticos: LAB de cerdo [0,5 ml de una dilución 1: 100 de un cultivo de una noche] se extendió sobre la superficie de una placa de agar mRs [90mm] y se secó. Las placas fueron marcadas en 4 cuadrantes y en cada cuadrante se colocó un disco que contiene antibiótico [ampicilina, 10 pg. Cefotaxima, 30 pg. Cloranfenicol, 10 pg. Eritromicina, 15 pg. Gentamicina, 10 pg. Kanamicina, 30 pg. Metronizadol, 50 pg. Ácido nalidíxico, 30 pg. Tetraciclina, 30 pg. Vancomicina, 30 pg]. Las placas se cubrieron, se colocaron en un frasco anaeróbico y se incubaron durante 24 horas a 37°C. Fueron fotografiados con una cámara digital. Las imágenes se transfirieron a Photoshop, y se determinó el diámetro de la zona de inhibición usando la herramienta de medida. Los valores se calcularon y se almacenaron en una hoja de cálculo de Excel.

[0193] Prevención de la adhesión/invasión por salmonela in vitro: Monocapas de células IPEC-J2 se cultivaron a 3 días post-confluencia en placas de 24 pocillos y se sincronizaron por la adición de medios DTS 24 horas antes de uso. Se centrifugaron cultivos de una noche de LAB de cerdo (10 ml) [1000g x 5 min a temperatura ambiente] y las bacterias se resuspendieron en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato [PBS]. Una parte alícuota (50 pl) de LAB se añadió a los pocillos. Las placas se incubaron durante 2 horas a 37°C, 5% de CO2, 95% de humedad. Un cultivo de una noche de Salmonella enterica serovar Enteritidis S1400 [S. enteritidis S1400] fue sub-cultivado (0,5 ml en 10 ml) en un medio de Luria Bertani (LB) y se incubaron aeróbicamente durante 23 horas a 37°C hasta que se alcanzó una densidad óptica (560 nm) de 0,8. Esto dio una concentración equivalente a 1x108 CFU/ml. El cultivo se centrifugó [1000g x 5 min a temperatura ambiente], las bacterias se resuspendieron en 10 ml de PBS. Una parte alícuota (50 pl) a los pocillos de células IPEC-J2. Pocillos tratados con PBS se utilizaron como controles. Las placas se incubaron durante otras 2 horas a 37°C, 5% de CO2, 95% de humedad. Las monocapas de células IPEC-J2 se lavaron 5 veces con HBSS. Se añadió una solución (0,5 ml) de PBS que contenía Triton-X100 (10 ml/litro) a cada pocillo, la monocapa se raspó y se dispersó. Salmonela viable se estimó en placas de agar XLD [incubada durante 24 horas a 37°C] por el método de Miles y Misra [Robertson et al, 2003]. LAB se determinaron por el mismo

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procedimiento [incubados anaeróbicamente durante 48 horas a 37°C].

[0194] Inhibición de las respuestas inflamatorias: Monocapas de células IPEC-J2 se cultivaron a 3 días postconfluencia en placas de 24 pocillos y se sincronizaron por la adición de medios DTS 24 horas antes de uso. Se centrifugaron cultivos de una noche de LAB de cerdo (10 ml) [1000g x 5 min a temperatura ambiente] y las bacterias se resuspendieron en 1 ml de PBS. Una parte alícuota (50 pl) se añadió de LAB a cada pocillo [3 pocillos para cada muestra] junto con 220 ng de 12-O-Tetradecaboilforbol-l3-acetato [PMA] por pocillo. PMA o PBS solo sirvieron como controles. Las placas se incubaron durante 2 horas a 37°C, 5% de CO2, 95% de humedad. Los medios de cultivo se retiraron de los platos y las células se lavaron dos veces con PBS. Se añadió tampón RLT (0,5 ml) que contiene mercaptoetanol a cada pocillo, las células se rasparon y se transfirieron a un tubo eppendorf [por cada raspado de muestra se combinaron 3 pocillos]. La extracción de ARN se realizó utilizando RNeasy® Mini kit de acuerdo con los protocolos del fabricante y la transcripción inversa con una alta capacidad de cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). PCR de tiempo real se realizó en un sistema de PCR de tiempo real 7500 Fast operativo con el sistema 7500 Fast v 1.4.0 versión de software de detección de secuencia 1.4 (Applied Biosystems). Los cebadores para IL-8 y TNF-a porcinos [IPEC-J2, SY100604186-096 IL-8-2 inversa, SY100604186- 090 TNF1 a inversa, SY100604186-095 IL-8 2 delante, SY100604186-089 TNFa1 delante, y SY100604186-093] se prepararon por Sigma Aldrich. La mezcla de reacción fue: 10 pl Power Sybergreen Master mix, 2,5 pl de cebador directo, 2,5 pl de cebador inverso y 5 pl de ADNc, el PCR de tiempo real fue se ejecutó a continuación de acuerdo con el protocolo estándar 7500 [95°C, 10 min, 1 ciclo. 95°C, 15 seg, 40 ciclos. 60°C, 1 min, 40 ciclos. 95°C, 15 seg, 1 ciclo. 60°C, 1 min, 1 ciclo. 95°C, 15 seg, 1 ciclo. 60°C, 15 seg, 1 ciclo]. La expresión de IL-8 y genes TNF-a se analizaron y se compararon con el gen "de mantenimiento" p-actina. Para la comparación, los valores se dan como la relación de IL-8 y TNF-a por p-actina o factor de cambio.

[0195] Por ejemplo:

a. Calcular ACt (2H) para IL-8 [Ct IL-8 menos Ct p-acción]

b. Calcular ACt (2h) para PMA [Ct PMA menos Ct p-actina]

c. Dividir ACt (IL-8) con ACt (PMA)

d. Redondear valor al número entero

[0196] Reactividad de sustrato: Se determinó la reactividad de carbohidratos de LAB individual usando un kit API Ch 50 (Biomerieux UK Ltd). Los ensayos se realizaron según las instrucciones y las reacciones del fabricante se registraron después de la incubación durante 24 y 48 horas a 37°C. Hay 50 cápsulas en una placa API CH 50. Éstas contienen diversos sustratos potenciales y controles negativos. La gama de sustratos es la siguiente: monosacáridos 16" Monosacaridoslalcoholes 4, disacáridos 8, trisacáridos 2, polisacáridos 3, alcoholes 6, Otros 7. Para cada grupo de sustrato, se cuenta el número de reacciones positivas. Esto se divide por el máximo posible para dar el rango para ese grupo de sustrato. La suma de todas las puntuaciones de sustrato da la clasificación general para la bacteria. Alta clasificación indica el amplio espectro de reactividad de sustrato tratamiento térmico de LAB: Una pequeña cantidad de heces congeladas (100 mg) se dispersó en 5 ml de diluyente de recuperación máxima (MRD). El sedimento se dejó sedimentar y la capa superior se decantó en tubos eppendorf (1 ml/tubo). Los tubos se calentaron a 50°C, 60°C o 70°C durante 10 min. Una alícuota (0,4 ml) de cada uno se sembró en agar MRS y se incubaron en un recipiente anaeróbico durante 72 horas a 37°C. Se detectaron un pequeño número de colonias después de calentarse a 70°C. Distintas colonias se seleccionaron, se sembraron en tubos de Hungate que contienen caldo MRS y se incubaron durante 48 horas a 37°C.

[0197] En un segundo estudio, una pequeña cantidad de heces congeladas (100 mg) se dispersó en 5 ml de diluyente de recuperación máxima (MRD). El sedimento se dejó sedimentar y la capa superior se decantó en tubos eppendorf (1 ml/tubo). Los tubos se calentaron a 50°C durante 20 min, 50°C durante 20 min más 60°C durante 20 min o 50°C durante 20 min más 60°C durante 20 min más 70°C durante 20 min. Una alícuota (0,5 ml) de cada uno se sembró en agar MRS y se incubaron en un recipiente anaeróbico durante 48 horas a 37°C. Se detectaron un pequeño número de colonias, interceptado, se sembraron en tubos de Hungate que contienen caldo MRS y se incubaron durante 48 horas a 37°C.

[0198] En el tercer estudio, se centrifugó un cultivo de una noche (10 ml) de LAB de cerdo aislado (1000g x 5 min a temperatura ambiente), el sedimento se resuspendió en caldo MRS fresco (10 ml)). Una alícuota (1 ml) se calentó a 70°C durante 15 min y después se sembró (0,5 ml) en MRS agar y se incubó en un recipiente anaeróbico durante 48 horas a 37°C. Se detectó un pequeño número de colonias, interceptado, se sembraron en tubos de Hungate que contienen caldo MRS y se incubaron durante 48 horas a 37°C. Este cultivo se centrifugó, se volvió a suspender en caldo MRS, se calentó de nuevo a 70°C durante 15 min, se sembraron en agar MRS, se incubaron en un recipiente anaeróbico durante 48 horas a 37°C, se seleccionaron, se sembraron en tubos de Hungate que contienen MRS caldo y se incubaron durante 48 horas a 37°C. Como antes, este cultivo se centrifugó, se resuspendió en caldo MRS, se recalentó a 70°C durante 15 min, se plaqueó (0,5 ml) en agar MRS, se incubó en un recipiente anaeróbico durante 48 horas a 37°C, se interceptó, se sembró en tubos de Hungate que contienen caldo MRS y se incubó durante 48 horas a 37°C.

[0199] Estabilidad de las bacterias liofilizadas: Se centrifugaron cultivos de una noche de LAB (1000 gx 5 min a

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temperatura ambiente. Los sedimentos se resuspendieron en 2 ml de PBS estéril y se volvieron a centrifugar. Los sedimentos posteriores fueron luego resuspendidos en 5 ml de solución de congelación [leche desgrasada desnatada en polvo (SKP), 100 g/l; SKP + lactosa, ambos 100 g/l; SKP + sacarosa, ambos 100 g/l; o SKP, 200 g/l]. Las muestras se congelaron a -20°C (2-3 horas) y después se almacenaron a -80°C durante la noche. Se liofilizaron durante 48 horas y el material seco se almacenó a temperatura ambiente. Bacterias viables en las muestras se determinaron a 0 y aproximadamente 40 y 80 días después de finalización de liofilización. Se sembraron en agar MRS y se incubaron anaeróbicamente durante 48 horas a 37°C.

[0200] Preparación a granel de GGDK31 y GGDK266: Dos lotes de 500 ml de caldo MRS se prepararon en botellas con tapa de rosca de vidrio de 500 ml, se autoclavaron y se dejaron enfriar a temperatura ambiente (en la proximidad de la llama de gas), mientras que se lavaron con CO2. Se añadieron cuatro ml de un cultivo de 24 horas de GGDK31 o GGDK266 a cada una de botellas de MRS y las tapas ligeramente cerradas. Las botellas se colocaron en un frasco anaeróbico y se incubaron a 37°C durante 24 horas. El cultivo se centrifugó [1000g x 5 min a temperatura ambiente] en 6 tubos de 50 ml de centrífuga estériles. El sobrenadante se descartó, los tubos se rellenaron con el cultivo y se recentrifugaron hasta que todas las bacterias habían sido recuperadas. Cada uno de los 6 tubos contenían cantidades casi iguales de las bacterias. Las bacterias en cada tubo se resuspendieron en 40 ml de PBS estéril, se volvió a centrifugar y el sobrenadante se descartó. Bacterias en cada tubo se resuspendieron en 20 ml de SKM (100 g/l), se congelaron a -20°C (2-3 horas) y luego durante la noche a -80°C, se liofilizaron durante 48-72 horas y se almacenaron a 4°C. Para evaluar bacterias viables en la muestra, un tubo de material liofilizado se resuspendió en 20 ml de caldo MRS, se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas, se diluyeron, se plaquearon en agar MRS y se incubaron anaeróbicamente durante 48 horas a 37°C.

[0201] L. mucosae in vivo Estudio 1: Dieciséis (6 semanas) ratones C3H/HeN hembra viejos se dosificaron con un cultivo de una noche de vial 323 (L. mucosae; 50 pl; >109 CFU) en el día -7, -4, -2 y 0 y después diariamente hasta el día 9. A otros 16 ratones (de control) se les dio medios. En el día 0, a ocho ratones (tratados con L. mucosae) y ocho ratones de control, se les dio, mediante sonda nasogástrica, una dosis única de Salmonela enteritidis S1400 (50 pl; > 108 CFU). Además, a ocho ratones (tratados con L. mucosae) y a ocho ratones de control se les dio una dosis única de medio de cultivo. El peso corporal y la puntuación de la salud fueron monitorizados post-infección por salmonela dos veces al día. Los ratones fueron sacrificados (sobredosis de isoflurano y exanguinación) y se diseccionaron a los 10 días después de la infección de salmonela. Estómago, porciones representativas de yeyuno e íleon, ciego, más contenidos, colon además de contenidos, el bazo y el hígado y un riñón y el ganglio linfático mesentérico se recogieron bajo condiciones casi asépticas para microbiología. Porciones representativas de yeyuno superior, yeyuno medio, íleon, ciego y colon ascendente y descendente se colocaron en formalina tamponada neutra o ARN-más tarde y se almacenaron para el análisis futuro.

[0202] L. mucosae in vivo Estudio 2: Cinco ratones C57BI/6 (de 6 semanas de edad) se dosificaron con un cultivo de una noche de vial 323 (L. mucosae; 50 pl; >109 CFU) en el día -7, - 4, -2 y 0 y después diariamente hasta el día

5. Otros 5 ratones recibieron medios. En el día 0, se les dio a los diez ratones, mediante alimentación forzada, una sola dosis de Salmonela enteritidis S1400 (50 pl; > 107CFU). Los ratones fueron sacrificados y disecados en el día

6, de acuerdo con el procedimiento para el estudio 1.

[0203] Cerdo novelo de LAB in vivo: Cuatro ratones C3H/HeN hembra (de 6 semanas de edad) se dosificaron con un cultivo durante la noche de vial RINH 31 (L. reuteri; 50 pl; >109 CFU), cuatro con vial RINH 32 (L. reuteri). Cuatro con vial 323 (L. mucosae), cuatro con vial RINH 46 (L. reuteri), cuatro con vial RINH 47 (L. reuteri) y ocho con MRS. Esto se hizo en el día -6, -4, -2 y 0 y diariamente a partir de entonces hasta el día 9. En el día 0, se les dio a todos los ratones tratados con lactobacilos y cuatro ratones de control, mediante sonda nasogástrica, una dosis única de Salmonella enteritidis S1400 (50 pl; > 108 CFU). Además, a los cuatro ratones de control restantes se les dio una dosis única de medio de cultivo. Los ratones se sacrificaron y se diseccionaron el día 10, de acuerdo con el procedimiento para el estudio 1. Microbiología: Los tejidos se homogeneizaron [1: 100 p/v] en MRD usando un homogeneizador de tejido Janke-Kunkel Ultra-Turrax T25 a 20.000 rpm durante 30 segundos, como eran contenidos yeyuno e íleon. Hasta ocho diluciones secuenciales (1:10 v/v) de los homogeneizados primarios se hicieron, se plaquearon sobre agar XLD y MacConkey N° 3 agar y se incubaron durante la noche a 37°C. Los recuentos viables se calcularon como antes [Robertson et al, 2003].

[0204] Análisis estadístico: Cuando los datos apropiados se evaluaron inicialmente mediante análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) con respecto a los resultados del tratamiento. Si ANOVA indicó que no había diferencias significativas (p <0,05) entre todos los grupos, los datos se analizaron por prueba de comparaciones múltiples de Tukey-Kramer o la prueba de comparaciones múltiples de Kruskal-Wallis según sea apropiado. Esto se realizó mediante el paquete estadístico Instat (GraphPad Software Inc, San Diego, EE.UU.).

[0205] Sobre la base de las salidas de las pruebas de comparación múltiple, promedios en tablas o gráficos fueron marcados con letras en superíndice. Medios que diferían significativamente entre sí (p <0,05) se asignaron letras de superíndice distintas. Medios que no difirieron significativamente entre sí se asignaron superíndices comunes.

Resultados

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1. Aislamiento de LAB

[0206] Las heces de los lechones criados orgánicamente se sembraron sobre agares selectivos y se incubaron en condiciones anaerobias. De todos los estudios, un total de 436 colonias individuales de bacterias de ácido láctico [LAB] fueron seleccionadas, sembradas en caldo MRS y se incubaron en condiciones anaerobias. A cada cultivo se le da un número vial RINH único y una parte alícuota se congeló en medios MRS que contenían 30% de glicerol y L- cisteína (~ 2 mg/ml) y se almacenó a -80°C. El análisis de genes 16S ARNr estaba hecho y cepas bacterianas fueron identificadas por comparación de secuencias con las secuencias de ADN bacterianas conocidas (Tabla 1).

[0207] La mayoría de las colonias de LAB cultivadas fueron L. johnsonii y cepas relacionadas con L. johnsonii [L. johnsonii, L. johnsonii/gasseri, L. johnsonii/taiwanensis] (240/436) y L. reuteri o relacionados con L. reuteri [L. reuteri, L. reuteri/pontis, L. reuteri/vaginalis, L. reuteri/acidophilus (169/436)]. Hubo 7 colonias L. plantarum/pentosus, otras 19 especies y 5 cepas no cultivadas.

2. Actividad anti-salmonela in vitro

[0208] Los medios acondicionados a partir de LAB aislado se cribaron para la actividad anti-bacteriana contra Salmonela enteritidis S1400 usando un ensayo de difusión de pocillos (Figura 1).

Los medios acondicionados a partir de colonias individuales de LAB variaron en gran medida en su actividad frente a S. enteritidis (Figuras 2a). Esto no fue dependiente de la cepa. La gama de actividades anti-salmonela entre L. johnsonii fue similar a la entre L. reuteri. Sobre una base arbitraria, los cultivos se separaron en grupos sobre la base de su capacidad para inhibir la salmonela in vitro (Figura 2b). El Grupo 1 tenía <20000 unidades de inhibición, el Grupo 2 20.000-40.000 unidades de inhibición, un Grupo 3 4-60000 unidades de inhibición, Grupo 4 6-80000 unidades de inhibición, Grupo 5 80000-100000 unidades de inhibición y Grupo 6 >>100000 unidades de inhibición (Figura 2b). Grupo 1 compuesto de 14 cepas (3,4% del total), el grupo 2 de 95 cepas (22,8%), Grupo 3 de 99 cepas (23,7%), Grupo 4 de 99 cepas (23,7%), Grupo 5 de 86 cepas (20,6 %) y el Grupo 6 de 24 cepas (5,8%). El último grupo compuesto por diecisiete L. johnsonii y relacionados con L. johnsonii, seis L. reuteri o cepas relacionadas con L. reuteri y una cepa no cultivada.

3. Actividad K88 anti-E. coli in vitro

[0209] Los medios acondicionados a partir de LAB también fueron seleccionados para actividad K88 anti- Escherichia coli por el ensayo de difusión en pocillo. Actividad contra E. coli K88, como con salmonela, variaba en gran medida entre las colonias individuales de LAB (Figura 3a). La gama y la variación en la actividad fue similar entre el L. johnsonii y cepas L. reuteri. En general, no hubo correlación directa entre actividades anti-salmonela y anti E. coli K88 para cualquier LAB individual (Figura 3c, 3d). Sin embargo una de las diez cepas de E. coli K88 grupo 5 (Figura 3b), siete tenían actividades relativamente altas contra ambos patógenos, dos tenían alta actividad contra E. coli K88 pero la actividad moderada contra la salmonela y era activa principalmente contra E. coli K88.

4. Selección inicial del candidato LAB

[0210] Se identificaron treinta y tres cepas de realizar más pruebas in vitro (Tabla 2). Estas comprendían 18 L. johnsonii y cepas relacionadas con L. johnsonii, 11 L. reuteri o relacionados con L. reuteri la y 4 L. plantarum y cepas relacionadas con L. plantarum (Tabla 2a).

5. Adjunto/invasión de células epiteliales de intestino de cerdo [IPEC-J2]

[0211] La capacidad de LAB para bloquear la adhesión/invasión de células IPEC por S. enteritidis y E. coli se evaluó K88 (Figura 4a, 4b, 4c). El LAB candidato redujo en gran medida unión e invasión de células IPEC por la salmonela. La mayoría eran también muy eficaces contra E. coli K88. Sin embargo, 3 de las cepas tenían solamente efectos limitados sobre la adhesión/invasión de células IPEC por E. coli K88.

6. Susceptibilidad de LAB a los antibióticos.

[0212] La susceptibilidad del candidato LAB a un rango de antibióticos se evaluó (Tabla 4, Figura 5). Todas menos una cepa (vial RINH 266) mostraron algún grado de resistencia a los antibióticos individuales. Todos eran susceptibles a la ampicilina (10 |jg), cefotaxima (30 |jg) y cloranfenicol (10 |jg). La mayoría eran susceptibles a la eritromicina (15 jg), gentamicina (10 jg), tetraciclina (30 jg) y vancomicina (30 jg). La mayoría de las cepas fueron resistentes a metronizadol (50 jg) y ácido nalidíxico (30 jg) y en menor medida a la kanamicina (30 jg). 23

7. Selección refinada de candidato LAB

[0213] Se identificaron veintitrés altas cepas de clasificación para la prueba adicional in vitro.

8. Especificidad de sustrato de LAB

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[0214] Los LAB candidatos se cribaron para la reactividad del sustrato usando un kit API CH 50 (Tabla 5, 6, Figura 6). L. johnsonii, L. reuteri y L. plantarum exhibieron perfiles de reacción de sustrato general de la cepa específica. Además, la mayoría de las cepas de cada genotipo mostraron diferencias finas en su reactividad de sustrato, indicativo de que eran cepas individuales únicas.

9. Supresión de la inflamación en células epiteliales intestinales de cerdo [IPEC-J2]

[0215] La capacidad de LAB candidato para bloquear o suprimir las respuestas inflamatorias desencadenadas en células IPEC por 12-O-Tetradecaboilforbol-13-acetato [PMA] fue probado (Figura 7; Tabla 7). Las cepas candidatas variaron en gran medida en su capacidad para bloquear la interleucina-8 (IL-8) de expresión génica provocada por PMA. Cinco cepas (vial RINH 29, 30, 31 86 y 266) tenían efectos antiinflamatorios potentes.

10. Selección final del candidato LAB

[0216] Se identificaron catorce cepas que tienen matanza y actividades contra Salmonela y el bloqueo de E. coli K88, susceptibilidad a la reactividad de hidratos de carbono antibióticos y la capacidad para suprimir la inflamación in vitro. Siete de estos eran particularmente preferidos. El último conjunto comprendió 4 relacionados con L. plantarum, 3 relacionados con L. johnsonii y uno de L. reuteri. Dos de estas cepas de LAB [GGDK266 y GGDK31] se prepararon a granel para la evaluación en un ensayo con lechones recién destetados (Tabla 8).

11. Liofilización y almacenamiento de LAB

[0217] La supervivencia y viabilidad de laboratorio después de liofilización en leche desnatada en polvo [SKP], SKP plus lactosa o SKP más sacarosa fue evaluado (Figura 8). Las pequeñas pérdidas en la viabilidad fueron evidentes en el almacenamiento durante 42 y 84 días a temperatura ambiente de las muestras secas en SKP. Esto fue menos marcado cuando la leche en polvo desnatada y azúcares se utilizan en combinación. Sin embargo, las 24 últimas preparaciones tendían a ser higroscópicas y difíciles de mantener. Por lo tanto, preparaciones a granel del GGDK266 y GGDK31 se prepararon por secado de las bacterias en la leche desnatada en polvo [100 g/l] (Tabla 8).

12. Estudios de termotratamiento

[0218] Las suspensiones de heces de los cerdos criados ecológicamente fueron tratados durante períodos variables de tiempo a 50-70°C térmico, se plaquearon en agar MRS, las colonias se seleccionaron y se cultivaron en caldo MRS [vial RINH 417-506]. Los tipos de cepas recuperadas fueron variables y especies de clostridium formaron una alta proporción, las cepas aisladas se mantuvieron sensibles al calor.

[0219] Cultivos aislados de LAB fueron objeto de calentamiento tres veces durante 15 minutos a 70°C Figura 9). Bacterias viables se disminuyeron en 3-4 órdenes de registro después del tratamiento térmico la primera vez. Sin embargo, las bacterias sobrevivientes tenían un grado de resistencia al calor. Con una excepción, las pérdidas de bacterias viables eran bajas cuando las bacterias fueron recultivadas y reclimatizadas otras dos veces.

[0220] El tratamiento térmico tres veces a 70°C alteró las actividades biológicas de las cepas de la Figura 9. El vial RINH 521 (vial 255 tratado térmicamente) no fue capaz de bloquear la unión de patógenos a las células IPEC y la capacidad de vial RINH 520 (vial 230 tratado térmicamente) para impedir la adhesión se redujo. La capacidad de vial RINH 517 (vial 31 tratado térmicamente) para abolir respuestas inflamatorias desencadenadas en células IPEC fue abolida. En contraste, las propiedades biológicas de vial RINH 518 (vial 85 tratado térmicamente) y vial RINH 519 (vial 86 tratado térmicamente) eran similares a las de las cepas nativas.

13. Estudios de infección de ratones 13.1 L. mucosae (vial RINH 323)

[0221] Ratones C3H/HeN desarrollan una infección persistente pero no letal, intestinal y sistémica, que tiene muchas características de la forma principal de la salmonelosis humana, cuando fueron estimulados con altos niveles de Salmonella enteritidis S1400. En contraste, los ratones C57BL/6 desarrollan una infección severa principalmente sistémica, una reminiscencia de la infección aguda en los seres humanos, cuando fueron estimulados con el mismo patógeno. Para evaluar la capacidad de L. mucosae (vial 323) para mejorar la salmonelosis, C3H/HeN y ratones C57BL/6 fueron tratados con L. mucosae antes y después de la estimulación con Salmonella enteritidis (Figuras 10, 13). Los ratones se sacrificaron y se diseccionaron 6 (C57BI/6) o 10 (C3H/HeN) días después de la infección.

[0222] Tejidos sistémicos: El tratamiento oral con L. mucosae limitó la capacidad de S. enteritidis para causar la infección sistémica tanto en ratones C3H/HeN como C57BI/6 (Figura 11a-c; 14a-c). Se detectaron altos números de salmonela viable en el nódulo linfático mesentérico, el hígado y el bazo de los ratones. En contraste, los números presentes en estos tejidos se redujeron en gran medida si los ratones habían sido co-tratados con vial RINH 323 (L. Mucosae). Infección por salmonela causó agrandamiento del bazo (Figura 12a; 15). Esta respuesta de los tejidos se

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redujo significativamente en los ratones tratados con tanto vial RINH 323 (L. mucosae) como salmonela.

[0223] Intestino: Mieloperoxidasa intestinal [MPO], un marcador para los neutrófilos, se determinó en ratones C3H/HeN tratados con salmonela o salmonela más vial RINH 323 (L. Mucosae). MPO en el intestino se incrementó en gran medida por la infección por salmonela, debido al reclutamiento de neutrófilos a la parte de intestino de la respuesta del huésped a la infección (Figura 12b), Co-tratamiento con vial RINH 323 (L. mucosae) redujo la actividad MPO en el intestino de ratones de salmonela infectados, lo que indica que las respuestas inflamatorias intestinales a la infección se redujeron en estos animales.

13.2 LAB de cerdo novelo

[0224] Se seleccionaron cuatro LAB: vial RINH 31, vial RINH 32, vial RINH 46 y vial RINH 47 (Todo el L. reuteri; LR31, LR 32, LR 36 y LR47 respectivamente). Para evaluar su eficacia para mejorar una infección por patógenos, ratones C3H/HeN fueron tratados con estos LAB o vial RINH 323 (L. mucosae, LM] antes y después de la estimulación con Salmonella enteritidis (Figura 16). Los ratones se sacrificaron y se diseccionaron 10 días después de la infección. Se redujo la excreción fecal de S. enteritidis, si los ratones habían sido co-tratados con LAB (Figura 17a, b). LR31 y LR32 tendían a tener los mayores efectos en las salidas de salmonela fecal.

[0225] Intestino: El tratamiento con LR31, LR32, LM, LR46 o LR47 redujo significativamente el número de salmonella en el ciego (Figura 18a). Además, LR31, LR32, LR47 y LR46 pero no LM rebajó números de salmonela en el colon (Figura 18b). Las reducciones tendieron a ser mayores con LR31 y LR32. En contraste con el intestino grueso, el laboratorio no tuvo efectos significativos sobre los números de la salmonela en el intestino delgado.

[0226] Tejidos sistémicos: El tratamiento con LR31, LR32, LM, LR46 o LR47 redujo en gran medida los números de salmonela detectados en el bazo y el hígado (Figuras 19a-c). Las reducciones fueron más marcadas con LR31 y LR32 con LM, LR46 o LR47. Números de salmonela en el nódulo linfático mesentérico se redujeron después del tratamiento con LR31, LR32 y LR46 pero no con LM o LR47.

Discusión

[0227] Las cepas de LAB aisladas (total de 436 selecciones de colonias individuales) a partir de heces de los cerdos criados orgánicamente fueron predominantemente L. reuteri, L. johnsonii, L. gasseri, L. pentosus, cepas con un pequeño número de L. plantarum, L. acidophilus, L. vaginalis, un solo L. mucosae y varias cepas no cultivadas. La mayoría de las sustancias LAB producidas que podrían inhibir el crecimiento de S. enteritidis y/o E. coli K88 in vitro. La potencia de estos efectos anti-patógenos varió mucho entre las cepas bacterianas individuales. Una proporción de LAB tenía alta actividad contra S. enteritidis pero baja actividad frente a E. coli K88 y viceversa, pero la mayoría tenía actividades similares contra ambos patógenos.

[0228] Se seleccionaron treinta y tres cepas sobre la base de la potencia antimicrobiana tal como se determina in vitro. Estas bacterias se seleccionaron adicionalmente para determinar su capacidad para bloquear la adhesión/invasión de las células epiteliales de cerdo intestinal (IPEC) por patógenos in vitro y su susceptibilidad a los antibióticos.

[0229] Veinte y tres cepas se sometieron a ensayo para la gama de sustrato y especificidad y su capacidad para suprimir inflamación en células IPEC in vitro. De estos, se identificaron catorce LAB (5 L. johnsonii, 6 L. reuteri y 3 L. plantarum) con propiedades particularmente favorables.

[0230] Dos cepas de LAB [GGDK266 y GGDK31 se prepararon a granel para evaluación in vivo en lechones recién destetados. Otras cepas candidatos potencialmente importantes estaban presentes en este conjunto de 14 LAB.

[0231] También se evaluó la supervivencia y viabilidad de laboratorio después de la liofilización en varias soluciones. Las pequeñas pérdidas en la viabilidad fueron evidentes en el almacenamiento prolongado de las muestras secas con leche desnatada en polvo. Esto fue menos marcado cuando se utilizaron leche en polvo desnatada y azúcares. Sin embargo, las últimas preparaciones eran higroscópicas y eran difíciles de mantener. Por lo tanto, se decidió utilizar una suspensión de leche desnatada en polvo para el liofilización y el almacenamiento de LAB. Las preparaciones a granel del GGDK266 y GGDK31 se liofilizaron en este medio.

[0232] La estabilidad de calor es una característica útil para LAB para ser utilizado en alimentos de origen animal sedimentados. Se obtuvieron cinco cepas viables acondicionadas de calor de aislado LAB de cerdo. Sin embargo, las propiedades biológicas in vitro y el potencial probiótico de tres de las cepas se vieron afectadas adversamente por el tratamiento térmico. Sin embargo, dos de las bacterias retuvieron las propiedades biológicas de sus formas no tratadas por calor nativas.

[0233] Cinco LAB de cerdo (L. Reuteri [4] o L. mucosae [1]) se ensayaron para la capacidad de mejorar la salmonelosis in vivo. El tratamiento de ratones con estos LAB reduce en gran medida la patogenicidad de S. enteritidis.

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14. Evaluación de la administración oral de cepas probióticas orgánicas de lactobacilos en la modulación de la microbiota intestinal y el rendimiento de los cebadoros lechones destetados

[0234] Ensayos in vivo se llevaron a cabo en lechones destetados tempranamente para probar el efecto de dos cepas probióticas de acuerdo con la invención, Cepas de lactobacilos GGDK266 y GGDK31.

Diseño del ensayo

Animales:

[0235]

• 24 lechones grandes - blancos x redon

• Recién destetados (21 días de edad, = 7 - 8 kg), nacidos en una granja local

• Ponderados luego distribuidos por igual entre los diferentes grupos

• 3 tratamientos experimentales (n = 8):

A - Dieta basal + Placebo

B - Dieta basal + GDDK probiótico 266 - dosis 10x 1012 C - Dieta basal + GDDK probiótico 31- dosis 10x 1012

• Período de observación: 14 días Dieta:

[0236] Las dietas basadas en la cebada, el trigo y la harina de soja • Composición de pienso (%):

Cebada: 36,5

Trigo: 21

SBM 48: 19

Maíz: 10

Aceite de soja: 4

Azucar: 4

Proteína de Patata: 2

Premezcla: 3,5

• pienso ad libitum en forma de granulado Muestras de tejido y medidas

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Masacre de 6 lechones "naíve" para la recolección de la recolección individual de ciego de heces (si es posible)

Colección individual de heces durante

medición de peso

Masacre de 24 lechones para colección de:

Contenido (5g):_______Tejidos (10 cm):______

- Gástrico - Yeyuno

- Yeyuno - Íleon

- Íleon - Ciego

- Ciego - Nodos linfáticos

(nivel de íleon distal)

Todas las muestras se pesaron, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a - 80°C.

Rendimiento: (1er Ganancia diaria de peso (GDP), consumo de alimento (FI) y la tasa de

paso) conversión alimenticia (FCR)

Análisis: (2° paso) • Determinación del perfil de la microbiota en las diferentes muestras de contenido intestinal por la electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante de técnica molecular de microbiología (DGGE).

• El análisis molecular del gen de datos de expresión utilizando ensayos de expresión génica de affymetrix de cerdo para determinar los patrones de modulación de genes.

• Determinación de marcadores de inmunidad en los tejidos intestinales

[0238] Análisis microbiano mediante desnaturalización en gel de gradiente de electroforesis DGGE (Ensayo 1)

Metodología DGGE

[0239] Se extrae el ADN de muestras fecales o de tejidos que utilizan el kit de giro MP Bio FastDNA™ para muestra de suelo - 116560000. El ADN se amplifica entonces usando cebadores Muyzer, ya que es imprescindible el uso de cebadores con una abrazadera GC a ejecutarse en la gel. Para las muestras de lactobacilos, se utilizaron cebadores de lactobacilos especializados con una abrazadera de GC.

Muestreo: Día 0

Día 7 Día 14

Almacenamiento:

Grupo diana: Cebador Secuencia de cebador (5'-3') Amplicon Tamaño (pb) Temperatura de recocido (°C) Gradiente DGGE (%)

Todas las Bacterias: MF MR- GCa ATTACCGCGGCTGCTGG GC- clamp- CCTACGGGAGGCAGCAG 233 55 35-70

LAB: Lac1 AGCAGTAGGGAATCTTCC A

: Lac2- GCa Abrazadera GC- ATTYCACCGCTACACATGc 327 55 30-50

Anotaciones:

a La abrazadera GC es el siguiente:

CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG c Y = C o T

[0240] Programa de PCR:

Hora: Temperatura Ciclos

5 minutos: 94°C 1

30 segundos: 94°C

30 segundos: 55°C 35

2 minutos: 72°C

10 minutos: 72°C 1

[0241] DGGE es una técnica de análisis genético en el que productos de PCR amplificados se separan por los desnaturalizantes de formamida y urea dentro del gel, basado en la secuencia genética por tan poco como una única diferencia de base. DGGE se puede utilizar para visualizar las diferencias en la diversidad microbiana entre muestras. ADN obtenido a partir de una gama de muestras se puede utilizar en DGGE por ejemplo, tejido y

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muestras fecales. Bandas en el gel se visualizaron mediante tinción con plata.

Análisis molecular y perfiles de expresión de genes de los tejidos del cerdo Extracción de ARN y análisis de microensayos affymetrix

[0242] Se aisló ARN de los dos tejidos animales y las células cultivadas para su uso en GeneChips de Affymetrix. Para el tejido animal, aproximadamente 200 mg de muestra de tejido fue eliminado de RNAlater (Ambion) y se lisó en Trizol (Invitrogen) usando un homogeneizador Polytron. El tejido se homogeneizó adicionalmente haciendo pasar el lisado a través de una jeringa equipada con una aguja 19G 3-5 veces. Las muestras se incubaron durante 5 min a TA para permitir la disociación completa de los complejos de nucleoproteínas. Entonces, cloroformo, isopropanol y pasos de etanol se realizaron según instrucciones del fabricante. Brevemente, se añadió 0,2 ml de cloroformo por 1 ml de Trizol, se agitó en vórtex y se incubó a TA durante 5 min. Las muestras se centrifugaron a 12.000 xg durante 15 min a 4°C. La fase acuosa resultante se transfirió a un tubo fresco, y el ARN se precipitó por la adición de 0,5 ml de isopropanol por 1 ml de Trizol. Los tubos se agitaron vigorosamente a mano durante 10 s, se incubaron a 4°C durante 10 min y se centrifugaron a 12.000 xg durante 10 min a 4°C. El precipitado de ARN se lavó con etanol helado al 75%, la adición de al menos 1 ml de etanol al 75% por 1 ml de Trizol. Las muestras se agitaron con vórtex y se centrifugaron a 7400 xg durante 5 min a 4°C. Después de secarse por aire el sedimento de ARN resultante, el ARN se resuspendió en hasta 100 pL de agua libre de RNasa L. El ARN total se extrajo adicionalmente con el kit RNeasy (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, incluyendo una etapa de digestión de RNasa I libre de ADNasa (Qiagen).

[0243] Las células cultivadas se homogeneizaron mediante la adición de 350 pl de tampón RLT + 1% p- mercaptoetanol. Las células se rasparon de las placas de cultivo con una punta de filtro y se homogeneizaron más pasando el lisado a través de una jeringa equipada con una aguja 19G 3-5 veces. El lisado de células se procesa adicionalmente usando el kit RNeasy (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, incluyendo una etapa de digestión de ADNasa libre de RNasa I (Qiagen).

[0244] La concentración de ARN y la integridad se comprobó usando un instrumento Nanodrop y/o Agilent Bioanalyzer, y el ARN purificado se almacenó a -70°C.

[0245] 250 ng de ARN se procesó para Affymetrix GeneChips utilizando el GeneChip 3' IVT Express Kit (Affymetrix) según las instrucciones del fabricante. La calidad de ARNa se determina por Agilent 2100 Bioanalyzer. La hibridación con la genoma del ratón GeneChip 430 2.0 y GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 (Affymetrix) en una estación de fluidos 450 GeneChip (Affymetrix) se llevó a cabo en el Institute of Medical Sciences Microarray Core Facility (Universidad de Aberdeen, Reino Unido). Fichas fueron escaneadas con un escáner Affymetrix GeneChip 3000 (Affymetrix). Análisis de la calidad de imágenes se realizó usando Gene Chip de software operativo (GCOS) (Affymetrix). Un análisis más detallado de la calidad, la normalización (gcRMA), análisis estadístico y generación de mapa de calor se realizó con los paquetes de software disponibles libremente R (
http://www.r- project.org) y Bioconductor (
http://www.bioconductor.org). Microensayos de datos se presentaron al National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo).

Resultados

Rendimiento de los cerdos alimentados con GGDK266 y GGDK31 probióticos

[0246] Los resultados para los cerdos alimentados con GGDK266 y GGDK31 probióticos se muestran en la Figura 20.

[0247] DWG (ganancia diaria de peso), FI (ingesta de alimentos) y FCR (relación de conversión del pienso) se muestran a continuación:

GGDK266: DWG FI FCR

D0-D7: +++ (*) + +

D7-D14: = + +

D0-D14: + + +

[0248] Los lechones alimentados con GGDK266 exhibieron ganancia de peso diaria mejorada significativamente (DWG) durante el post-destete de la primera semana en relación con GGDK31 y lechones alimentados con placebo.

Análisis de la diversidad microbiana mediante DGGE (Ensayo 1)

[0249] DGGE utilizando cebadores universales no reveló diferencias en la diversidad microbiana general entre los tratamientos y el placebo (véase la Figura 21).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

[0250] DGGE utilizando cebadores específicos a bacterias de ácido láctico (LAB) reveló diferencias significativas en la diversidad LAB entre el tratamiento con GGDK 266 y placebo en ambas muestras cecales e íleon (véase Figura 22).

[0251] DGGE utilizando cebadores específicos a LAB revelaron diferencias significativas en la diversidad LAB entre el tratamiento con GGDK266 y placebo en muestras de íleon (véase Figura 23).

[0252] DGGE utilizando cebadores específicos a LAB revelaron diferencias significativas en la diversidad LAB entre el tratamiento con 266 y placebo en muestras cecales (véase Figura 24).

[0253] En general, el análisis de la diversidad microbiana reveló la agrupación significativa de la población LAB en los lechones alimentados GGDK266 que indican que las poblaciones de animales individuales en este tratamiento tiene una microbiota similar y estable.

Análisis molecular de muestras de tejido ileal: Ensayos de cerdo Affymetrix Regulado hacia abajo en GDK266 versus placebo

[0254] Análisis de ontología de gen de gen expresado diferencialmente reveló que una reducción significativa en los procesos del sistema inmune y la activación pro-inflamatoria en respuesta a la alimentación de lechones jóvenes con GGDK266 probiótico en relación con el placebo (véase la Figura 25).

[0255] Los resultados revelan que GGDK266 tenía un efecto muy específico en el sistema inmune y los grupos funcionales asociados con la respuesta a los estímulos (véase la Figura 26).

Regulado hacia arriba en GGDK266 versus placebo

[0256] En contraste con los efectos sobre el sistema inmune, GGDK266 promovió procesos metabólicos particularmente en relación con nitrógeno (véase la Figura 27). Sin desear estar ligado por la teoría, se cree que estos efectos podrían explicar la mejor DWG en los animales alimentados con GGDK266.

Principales genes expresados diferencialmente entre GGDK266 y placebo

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

affy.id: Nombre del gen Producto FC Valor p

Ssc.645.1.S1 at: CSTA Cistatina A 44,06 0,00000

Ssc.11608.1.A1_at: TIP_HUMAN Precursor de proteína inmunomoduladora de células T 28,92 0,00030

Ssc.10837.1.A1 at: ROBO1 Precursor de homología 1 indirecto 13,35 0,00178

Ssc.8960.1.A1_at: BPI Permeabilidad de bactericida-incremento de precursor de proteína 11,65 0,00476

Ssc.16234.1.S1 at: TCN1 Precursor de transcobalamina I 11,48 0,00023

Ssc.1411.1.S1 at: THBS4 Precursor de tromboesporadina 4 8,92 0,00198

Ssc.837.1.A1_at: BPI Permeabilidad de bactericida-incremento de precursor de proteína 4,55 0,00573

Ssc.30008.1.A1 at: ESR1 Receptor de estrógenos 4,48 0,00053

Ssc.13539.1.A1 at: PLAGL1 Proteína de dedo zinc PLAGL1 4,42 0,00881

Ssc.26324.1.S1_at: NP_981932 Proteína de deshalogenasa de yodotirosina 1 4,26 0,00200

Ssc.29413.1.A1_at: B3GALT2 UDP-Gal: betaGlcNAc beta 1,3 galactosiltransferasa 2 4,00 0,00046

Ssc.27410.1.S1 at: MYCN Proteína n-myc proto-oncogén 3,80 0,00261

Ssc.25176.1.A1 at: GOLPH4 Golgi fosfoproteína 4 3,80 0,00009

Ssc.15890.1.S1 at: VNN1 Precursor de panteteinasa 3,61 0,00271

Ssc.23427.1.A1_at: Citocromo b561 Citocromo b561 3,29 0,01512

Ssc.16186.1.S1_at: CD3e Superficie de células T CD3 glicoproteína precursor de la cadena epsilon -2,62 0,00764

Ssc.22676.1.S1 at: CXCR6 C-X-C de quimiocinas receptor de tipo 6 -2,63 0,01652

Ssc.15565.1.S1 at: LCP2 Proteína citosólica de linfocitos 2 -2,76 0,00024

Ssc.18652.1.S1 at: IL16 Precursor de interleucina-16 -2,97 0,01132

Ssc.181.1.S1_at: TRGV9 Receptor de células T de cadena gamma región V de precursor 1/2 PT-gamma -3,04 0,01615

Ssc.23489.1.S1_at: CD8A Superficie de células T glicoproteína precursor de la cadena alfa CD8 -3,08 0,00071

Ssc.428.6.S1_a_at: TCA_HUMAN Región C de cadena alfa de receptor de células T -3,15 0,00027

affy.id: Nombre del gen Producto FC Valor p

Ssc.10357.1.A1 at: FMN2 Formina 2 -3,46 0,00308

Ssc.27354.1.S1 at: STXBP5 Tomosina -3,88 0,02438

Ssc.28909.3.A1 at: TPH2 Triptófano 5-hidroxilasa 2 -4,36 0,00717

Ssc.25976.1.S1 at: GZMH Precursor de granzima H -5,46 0,00179

Ssc.11070.1.S1 at: IGHM Región C de cadena Ig alfa-1 -9,07 0,00115

Ssc.16566.1.S1 at: LCT Precursor de hidrolasa lactasa-florizina -11,31 0,00328

Ssc.13273.1.A1_at: GCNT3 Glucosaminilo (N-acetilo) transferasa 3, tipo mucina -19,75 0,00016

Ssc.11098.1.S1_at: IFITM3 Proteína de transmembrana inducida por interferón 3 -51,36 0,00044

[0258] Los datos de expresión génica revelaron que un número de genes se incrementaron significativamente incluyendo péptidos antimicrobianos (por ejemplo. CSTA, BP1) y genes inmunorreguladores (TIP). En contraste GGDK266 redujo la expresión de un panel diverso de genes implicados en la inmunidad pro-inflamatoria (IFITM3, IL- 16).

Conclusiones

[0259]

• Procesos celulares y metabólicos, en particular en relación con nitrógeno, se incrementan en los animales tratados con GGDK266 en relación con el placebo.

• Procesos del sistema inmunológico se regulan hacia abajo en animales tratados con GGDK266 en relación con el placebo. Ejemplos incluyen marcadores de células T CD3 y CD8, cadenas de receptor de células T, quimioquinas/citoquinas y genes relacionados con IFN.

5

10

15

20

25

30

35

40

• Animales administrados con GGDK266 exhibieron una población estable de bacterias del ácido láctico reveladas por la agrupación del perfil bacteriano del individuo inducida por la administración de GGDK266 probiótico.

• FCR y el rendimiento se han mejorado significativamente durante las primeras semanas de vida postdestete.

• Esta mejora en el rendimiento del crecimiento correlacionado con la disminución de la respuesta inmune inflamatoria y el incremento en el procesamiento metabólico específico.

Tabla 1: Resumen de las colonias de bacterias seleccionadas a partir de cultivos de heces de cerdos criados

orgánicamente.

Número total de selecciones de colonias cultivadas: 443

: Medios:

Agar LAMVAB: 55

Agar LAMVAB + carbohidratos de calostro de cerdo: 88

Agar MRS: 29

Agar MRS + carbohidrato de calostro de cerdo: 176

Agar MRS libre de glucosa + carbohidrato: 57

Agar MRS después del tratamiento térmico de hasta: 38

70°C

Cepas principales identificadas:

Lactobacillus reuteri

Lactobacillus johnsonii

Lactobacillus plantarum

[0260] Cinco LAB aislados se calentaron una vez, dos veces o tres veces a 70°C durante 15 min.

[0261] Bacterias supervivientes se recultivaron.

En existencia

[0262]

5 LAB calentados una vez a 70°C 5 LAB calentados dos veces a 70°C 5 LAB calentados tres veces a 70°C

Tabla 2: cepas de LAB candidatos para el estudio adicional seleccionado sobre la base de matar a la actividad en ensayos de difusión pocillos (cuenta 266 y 161 contienen LR)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

N° de vial RINH

85

LR

Matanza de patógenos (unidades) Ensayo de difusión de pocilios

anti-SE anti-KSS

129886 60168

255: U

266: U

436: u

161: LP

12: u

16: u

29: LR

31: LR

86: LR

230: U

256: U

314: u

361: u

17: u

30: LR

32: LR

253: LP

260: LP

320: U

364: u

433: u

15: LP

218: u

220: u

356: u

363: u

131: LR

434: LR

166: U

431: LR

47: LR

46: LR

LJ. L. johnsonii. LR. L. reuteri. LP. L. Plantarum

101477

101335

61656

77694

162709

117621

174471

116667

B8520

95705

94012

103497

100770

144765

125463

166692

70724

78197

66350

99137

95063

77459

62329

68612

72986

79125

42223

10OOO

17064

48657

20722

19667

64390

60168

85010

103346

42977

41365

45720

46907

75147

64340

77459

43936

40254

23072

36050

32572

63612

63562

78044

55123

51461

53669

50416

53834

55302

45555

44108

81656

79621

31674

34633

Tabla 2a: Identificación de las cepas candidato de LAB (secuencia del gen 16S ARNr) seleccionado sobre la base de matar a la actividad en ensayos de difusión de pocillo (nota 266 y 161 contienen LR)

N° de vial RINH: Secuencia delantera Secuencia inversa

85: Lactobacillus reuteri Lactobacillus reuteri

255: Lactobacillus johnsonii, taiwanensis, acidophilus Lactobacillus johnsonii. gasseri

266: Lactobacillus johnsonii Lactobacillus johnsonii

436: lactobacillus johnsonii str. 466 lactobacillus johnsonii F19785

161: Lactobacillus plantarum. pentosus. paraplantarum Lactobacillus plantarum, pentosus

12: Lactobacillus johnsonii. gasseri. taiwanensis Lactobacillus johnsonii. gasseri

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

N° de vial RIMH: Secuencia delantera Secuencia inversa

16: Lactobacillus johnsonii. gasseri, taiwanensis Lactobacillus johnsonii

29: Lactobacillus reuteri. pontis. vaginalis, fhimend Lactobacillus reuteri

31: Lactobacillus reuteri Lactobacillus reuteri

86: Lactobacillus neuteri Lactobacillus reuteri

230: Lactobacillus johnsonii. taiwanensis. acidophilus Lactobacillus johnsonii

256: Lactobacillus johnsonii. taiwanensis. acidophilus Lactobacillus johnsonii

314: lactobacillus johnsonii BR0315 uncultured bacterium

361: lactobacillus johnsonii str. NCC2822 lactobacillus johnsonii F19785

17: Lactobacillus johnsonii. gasseri. taiwanensis Lactobacillus johnsonii

30: Lactobacillus reuteri. pontis Lactobacillus reuteri

32: Lactobacillus neuteri Lactobacillus reuteri

258: Lactobacillus plantarum, pentosus. helveticus Lactobacillus plantarum. pentosus. paraplantarum

260: Lactobacillus plantarum, pentosus. paraplantarum Lactobacillus pentosus. plantarum. paraplantarum

320: lactobacillus johnsonii NCC2822 Lactobacillus johnsonii F19785

364: lactobacillus johnsonii 466 lactobacillus johnsonii F10785

433: lactobacillus johnsonii str. CECT 289 lactobacillus johnsonii F19785

15: Lactobacillus plantarum. pentosus Lactobacillus plantarum. pentosus

218: Lactobacillus johnsonii. taiwanensis uncultured Firmicutes. Lactobacillus johnsonii

220: Lactobacillus johnsonii. taiwanensis uncultured Firmicutes. Lactobacillus johnsonii

356: lactobacillus johnsonii NCC2822 lactobacillus johnsonii F19785

363: lactobacillus johnsonii 466 lactobacillus johnsonii F10785

131: Lactobacillus reuteri Lactobacillus reuteri

434: Lactobacillus reuteri NM99-1 lactobacillus reuteri

166: Lactobacillus johnsonii. taiwanensis. acidophilus Lactobacillus johnsonii

431: lactobacillus reuteri str.Probio-16 lactobacillus reuteri JCM 1112

47: Lactobacillus neuteri Lactobacillus reuteri

46: Lactobacillus reuteri Lactobacillus reuteri

Tabla 3: Cepas candidato LAB para estudio adicional seleccionado sobre la base de matar actividad en ensayos de difusión en pocillo y la capacidad para bloquear la adhesión de patógenos a las células IPEC

N° de vial RINH: Inhibición de adherencia (%)

SE: KSS

85: 88.31 87.93

255: 82.37 99.93

266: 88.03 98.09

161: 98.32 96.94

12: 96.89 99.92

29: 93.7 99.91

31: 98.64 99.75

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

RINH Inhibición de adherencia (%

86: 81

256: 82

361: 85

17: 84

30: 96

32: 87

230: 78

258: 96

260: 90

314: 79

433: 99

16: 87

218: 91

363: 85

364: 82

15: 79

131: 95

220: 91

320: 92

356: 82

434: 94

436: 99

166: 91

431: 96

47: 90

46: 83

: 99.98

.47: 99.92

07: 99.44

.56: 99.66

.44: 99.91

.74: 99.86

89: 82.45

37: 86.5

22: 88.79

68: 94.2

.99: 96.23

68: 45.38

53: 86.49

61: 99.93

13: 78.12

19: 99.52

.5: 96.03

04: 78.6

7: 44.17

15: 78.4

78: 98.85

97: 1

.45: 95.97

35: 86.47

.47: 99.47

51: 99.7

Tabla 4: Area de inhibición de LAB por cantidades definidas de antibiótico (unidades artibrarias)

ampicilina cefotaxima cloranfenicol eritromicina gentamicina kanamicina metronizadol nal. ácido de tetraciclina vancomicina

12

15

16 17

29

30

31

32

46

47

85

86 131 161 166 218 220 230

244011

277117

266033

387224

410335

292728

334789

404496

359232

328283

356114

250812

349955

338497

268783

209117

209371

254614

340402

311725

294166

400570

444193

335927

410966

402291

402588

410579

369916

381270

473065

412977

417393

271547

319970

335143

186699

204282

187805

235430

190293

77133

165904

247436

210421

185515

204992

183399

248521

258724

185508

148617

165815

164405

13151

214008

64681

277145

114511

208117

262226

350238

251461

270105

309439

250805

123562

261133

251607

0

34230

51078

0

17000

9193

0

31261

38221

71608

29550

30342

0

41858

82466

51991

61136

0

58814

65717

0

7157

0

23786

0

14932

4536

17671

0

32572

45705

0

31264

0

29126

0

37668

0

50328

252497

187805

214037

261979

21382

211556

276800

16643

19354

20435

24606

88668

34636

36644

22581

0

105209

117741

11483

31402

24901

10691

25069

22231

3971

13355

7479

5542

0

122870

111666

41991

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

255

256 258 260 266 314 356 361

363

364 431

433

434 436

330364

456892

401257

286400

287070

297057

291920

320695

275304

288514

339016

241710

198112

290458

392169

502325

271932

364573

322869

332853

339895

323713

308159

341651

380459

203588

261065

287331

217758

228531

195909

203796

198614

154830

203692

201886

193271

194320

226484

174124

172223

185812

59224

71258

233326

33393

247085

44115

62656

234140

44491

143978

311725

63381

68052

56563 93058

28608 78821 54008 0

10472 0

86683 45880 74991 0

19139 0

8486

0

78364

3079

0

5890

0

6437

0

6049

0

2737

0

29872

20955

223143

21757

48286

24194

28212

18322

0

19965

60344

52279

0

42203

0

62792

107882

90259

8202

91863

18146

103995

26302

79034

45863

61810

Ácido Nal., ácido de naladixie

Tabla 5: Sustratos en cápsulas de Kit API CH 50

Sustratos en cápsulas de kit API CH 50

1 glicerol: poliol

2 eritritol: poliol

3 D-arabinosa: monosacárido

4 L-arabinosa: monosacárido

5 D-ribosa: monosacárido

6 D-xilosa: monosacárido

7 L-xilosa: monosacárido

8 D-adonotol: alcohol

9 Metilo- pD-xilopiranósido: cíclico

10 D-galactosa: monosacárido

11 D-glucosa: monosacárido

12 D-fructosa: monosacárido

13 D-Mamose: monosacárido

14 L-sorbosa: monosacárido

15 L-ramosa: monosacárido

16 dulcitol: monosacárido/alcohol

17 inositol: poliol

18 D-mamitol: poliol

19 D-sorbitol: azúcar/alcohol

20 Metilo-aD-manopiranósido: cíclico

21 Metilo-aD-glucopiranósido: cíclico

22 N-acetilglucosamina: monosacárido

23 amigdalina: glicósido

24 arbutina: glicósido

25 esculina citrato férrico

26 salicina: glucósido

27 D-celobiosa: disacárido

28 D-maltosa: disacárido

29 D-lactosa (bovina): disacárido

30 D-melibiosa: disacárido

31 D-SACCH se levantó: disacárido

32 D-trehalosa: disacárido

33 inulina: polisacárido

34 D-melecitosa: trisacárido

35 D-rafinosa: trisacárido

36 Amidon (almidón): polisacárido

37 glucógeno: polisacárido

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

(continuación)

Sustratos en cápsulas de kit API CH 50

38 xilitol: monosacárido/alcohol

39 gentiobiosa: disacárido

40 D-turanosa: disacárido

41 D-lixosa: monosacárido

42 D-tagatosa: monosacárido

43 D-fucosa: monosacárido

44 L-fucosa: monosacárido

45 D-arabitol: monosacárido/alcohol

46 L-arabitol: monosacárido/alcohol

47 gluconato de potasio: secuestrante

48 2-cetogluconato de potasio: secuestrante

49 5-cetogluconato de potasio: secuestrante

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

TonosacáridoB aleono ¿merosacáridcs disscáricos tnsacáridos poliíccáncloo alcoholes Giras

Tabla 6: Perfil del sustrato de LAB usando un kit API CH 50

óóóóóóóóóóóóóóóóóóóócó

00000000 rn m O O OOf^N-OOOO OOOOOOOO O O O o CJOOOOOOO

r* rg

G O

ooooooooooh-oocooh-ononrto oooooooooooooooo — oooco

in q in in in in q in q q q in w q q q q us w q ir q

□ U U lí) IJ lí] PJ U] (_J UJ G£J LÍJ CU U) IÍJ U ü) U) IÍJ Cü 0L IjfJ)

OOOOOOOO*— 000000^-000000

qqqqqcoqqqcoqqqqqqíqqqqcq

ooooooooooooooooooooco

t£NO«^{Nr«tr-t<"rtr(Nífltrtrtt,ífJ

ooooooooooooooooooooco

'-^-íDOOLflíDCOOCDOCO’íCO

NOrOIQNlDCDPHDfD^^lfllDlíJtDtDtNtD'in

^£¥i£^£¥]iiT^j-ooio3iT=^T=(rMrsjErijrsjErijcMtrvjeg£vPí¥;Tj-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Tabla 7: Cepas de LAB candidato seleccionadas sobre la base de la actividad de matar, la capacidad para bloquear la adhesión de patógenos a las células IPEC, susceptibilidad a los antibióticos, la reactividad del sustrato y su capacidad para suprimir la inflamación (nota 266 y 161 contiene LR)

N° de Vial RINH: Secuencia delantera Secuencia Inversa

266: Lactobacillus johnsonii Lactobacillus johnsonii

31: Lactobacillus reuterí Lactobacillus reuteri

258: Lactobacillus plantarum, pentosus. helveticus Lactobacillus plantarum, pentosus, paraplanta rum

260: Lactobacillus plantarum, pentosus, paraplanta rum Lactobacillus pentosus, plantarum, paraplanta rum

255: Lactobacillus johnsonii, taiwanensis, acidophilus Lactobacillusjohnsonii, gasserí

161: Lactobacillus plantarum, pentosus, paraplanta rum Lactobacillus plantarum, pentosus

256: Lactobacillus johnsonii, taiwanensis, acidophilus Lactobacillus johnsonii

86: Lactobacillus reuterí Lactobacillus reuteri

85: Lactobacillus reuterí Lactobacillus reuteri

32: Lactobacillus reuterí Lactobacillus reuteri

230: Lactobacillus johnsonii, taiwanensis, acidophilus Lactobacillus johnsonii

131: Lactobacillus reuterí Lactobacillus reuteri

30: Lactobacillus reuterí, pontis Lactobacillus reuteri

364: lactobacillus johnsonii 466 lactobacillus johnsonii F10785

Tabla 8: Identidad para las cepas de LAB de cerdo seleccionadas para preparación a granel (nota 266 y 161

contienen LR)

GGDK266

N° de vial RINH: Cebador de código Seq 926F Bacterias identificadas por BLAST Cebador de código Seq 519R Bacterias identificadas por BLAST

266: S10CM218 Lactobacillus johnsonii S10CM171 Lactobacillus johnsonii

GGDK31

31: S10BL123 Lactobacillus reuteri S10BL141 Lactobacillus reuteri

SEQ ID NO: 1 31 S10BL123 con 926F

G3TG0ÁGCATGT6GHTAATTC6AAGCTACGCGMGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTT3CGCTAACCTTAGAGATAAG 3CGTT CCCTT CGGGGACGCAAT gacaggt ggt gcat ggt cgt cgtcagct cgt gt cgt gagat gtt gggttaagt cccgc AáCGAG03CAACCCTTGTtACTAGT~GCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAG GT GGGGACGACGTCAGAT CAI CAI GCCCCTTATGACCT GGGCTACACACGT GCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCAA GGT CGCG AGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCGTT CT CAGTT CGGACT GTAGGCTGCAACT CGCCTACACGAAGT CGGAAT CGCTAGTAAT CGCGGAT CAGCAT GCCGCGGTGA ATACGTT CCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGT CACACCAT GGGAGTT

TGTAACGGCCAAAGTCGGTGGCCTAACCATTATGGAGGGAGCCGCCTAAGTGCGGGACAGATGACTGGGGTGAAGTCGTA

ACAAGGTAGCCTGTATTTTCTTGCGGTTGTTCGCCCCCCNGGCGGGACTGCCTTACTCCTnCACCNCCCGCGCCCCTGG

AGGGGGCCGGAACCCCCCTCCCAACCCCCCTAACCCACCTCCTTCCTTTTMCCNGCT

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

GACTTTCTAGGTTGGATACCGTCACTGCGTGAACAGTTACTCTCACGCACGTTCTTCTCCAACAACAGAGCTTTACGAGC

CGAAACCCTT CTT CACT CACGCGGTGTT GCTCCATCAGGCTTGCGCCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGT AGGAGTAT GGACC GTGTGT CAGTTCCATTGTGGCCG AT CAGT CTCT CAACT CGGCTATGCAT CAT CGCCTTGGTAAGCCG TTACCTTACCAACTAGCTAAT GCACCGCAGGTCCAT CCCAG AGTGATAGCCAAA6CCAT CTTTCAAACAAAAGCC ATGTG GACTTT CTTG“TAT GCGGTATTAGC AT CT GTTTCCAAAT GTTATCCCCCGCTCCGGGGCAGGTTACCTACGTGTTACT CA

C C(3 G TC CG CC A CTC A CTG GT G ATC C ATCG TC A ATC A G GTG C A AG C ACC AT C A AT C A G TTG GG CC AG TG CGTA CG A CTTGC A7GTATTAGG CAC ACCGCCGGCGTTCAT CCTGAGCC AT GAT CAA ACTCTAN GCGT CAGTTTTACGGT CTCGGCT CGTTTC TGTGTTMCTGACATCAACGTGCGTTACATTTGCGGTTTACGCATTGATTGTACTCCCTCCACATAGGTGGC66CATACC

CTTCGT GCT CCT CTACT CAT CTCGTT CATTACAACTCGCTTT GTTACCTTCCCGGT GGGGTTCT CTACCT CCTTCGTTTT

CT C~ CA CCTC A JTCTCT CTC CCAT CCTCTC N C TTTCCTCTTG CTC

SEQ ID NO: 3

161 S10BL282 con 926F

GGTGGAGCATGT GGTTTAATT CGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTT GACATACTATGCAAATCTMGAGATTAG ACG TT C-CCTT CG GGGACAT GGATACAGGTGGTGCATGGTTGTAGT CAGCTCGTGTCGT GAGATGTT GGGTTAAGTCCCGC AACGAGCGCAACCCTTGTTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAG G TG G G GAT GA CG T C A AAT CAT CAT G C CC CTT GAT GA CCTG G G CTA G A CA CGTGCTAC A AT G GAT GGTA CAA CGAGTTGCG AACTCGCGAGAGTAA6CTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTACGGATGTGTAGGCTGCAACTCGCCATACATGAA6TCG GAATCGCTAGTAATCGCGGATACAGCATGCCGCGGTGAATACTGTTCCCGGGCCTATGTGACACACCGCCCGTCACACCA TGAGCAGTTTGTAATCACCCACACAGTCGGTGGGGTAACCTTTATAGGAACCAGCCGCCTACAGTGCGGGACCGATGATT AT GGGTGCACTCGTAT CACT GTA ACTTAAACCCTTGCGG CCGTACTCCCCAGGCGG AATGCTTA ATACGTTACCTGCAAC CCT GAAGGGCGGAAT CCCTCCAACGATTAT CAAT

SEQ ID NO: 4

161 S10BL300 con 519R

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

GTGGCTTTCTGGTTAAATACCGTCAATACCTGAACAGTTACTCTCAGATATGTTCTTCTTTAACAACAGAGTTTTACGAG

CCGAAACCCTTCTTCACTCAC6CGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCG

TA6GAGTTTGGGCCGT GTCTC AGT CCCMT GT GGCCGATTACCCT CT CAGGT CGGCTACGTAT CATT GCCAT GGT GAGCC G TTACCCCACCATCIAG CTAATACGCC GCG GGACCAT CCAAMGT GATA GCCGAAGCCAT CTTT CA AGCT CGG ACCAT GC GGT CCAAGTT GTTAT GCGGTATTAGCAT CTGTTT CCAGGT GTTATCCCCCGCTT CT GGGCAGGTTTCCC AC6T GTTACTC ACCAGTT C6CCACT OACT CAAAT GTAAATCAT GAT GAAGCACCAAT CAATACCAAGTT CGTT CGACTT GCATGTATTA GGCACGGCGCCAGCGTTCGTCGCTGAGCCAT6ATCAAACTACTAAAGGCCCCCNATGCCTCCCACCCGCTTTGTTGCCGG GGCCCCCCGTTCCCATACCCCTTTTGGACGTTTTCCAGCCCCTTGGCGGGCCCTGTACCTCCCCCCAGGGCGGGGAATGC CTTAATTGCGTTNACCTTGCACCCCCTGAAGGGGCG6AATCCCTCCAACGATTACCT

SEQ ID NO: 5

255 S10BL504 con 926F

GGT GGAGC AT GT GGTTTAATT CGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTT GACAT CCAGT CGCATAACCTAAGAGATT

AGGTGTTCCCTTCGGGGACGCTGAGACAGGTGGTGCATG6CTGTCGTCAGCTCGTGTCGTCACATGTTGGGTTAAGTCCC G CAACGAGCGCAA CCCTT GT CATTAGTTGCCAT CATTAAGTT GGGCACT CTAAT GA GACT GCCGGT GACAAAGCGG AGGA AGGTGGGG AT GACGT C A AG ATC AT CATGCGCCTTAT GAíXT GGGCTACAC ACGTGCTAGA ATGGACGGTACAACGAGATA GCGAACCTGCGAAGAGGTAAGCGGATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGC TTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCA6CACTGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCA T G AGAGT CT GTAACTCCCAAAGTCGGT GGGATAACCTT CTATAGCGAGTGAGTCCGTTCGATGGGTAGGGACAAGAT GAA T GAGCGGT GAAAGGT CGTTAAACCAAGGGTAGCAAGTAAGG ATCCCTTTGGGGGTTTTAT CTCCACGGGGGGGGT GTTTC TTTTCTGTCTTTA

SEQ ID NO: 6

255 S10BL530 con 519R

ACTTCTAGAGTTAG AT GATACCGTTC AACATGACAGATGGCCACGTTTACTTACTCTCACT GACTACTGTTCTTTCATC

T CA CACA A CAGA G CTTTACG AGCCGAA A CCCTT CTT CA CT C ACGCGGC G TT GC TC C AT CA G AG CTTT G GGT C CCATT GT G G AAC ATTCCCTACT GCT GCCT CCCGTAGGAGTAT GGGCCGT GT CT CAGT CCCATT GT GGCCGATC AGTCT CTCAACTCGG CTATGCAT CATCGCCTTGGTAAGCCGTTACCTTACCA ACTAGCTAAT GC ACCGC AGGTCCAT CCAAG AGT GATAGCCGAA CCATCTTTCACAACTCTAAACATGCTTGTAGTGTTGTTATTCCGGTATTAACATTCTGTTTCCAGGTTGTTATTCCCAGC

T GAT CTCGG G G C A G G G TTTA CCC CA A CGTTG G TTTAC CTT C AC CCCCG G TTN CG GCCCG G CTT CGNCCTTGGGTTAGTAC T N A C G ATT CTG C TAT T ATATAC G AT GG G CTAG ACG ACC AGC C TA AC AC AAT TT C AATTT CGT NA AGT GT CGAG AGGN CCT ACGGTCGTCCCGTTAACGTGTAGNCNATTT6GCTTATTTGTTAAGTTGTCCANC6GGCCACCGACCCCCAGGGCCCGGTT GGTCCGGGTTTCCCCCATTGCMCGTCGeCAMGTGCGGAAAHTCGAAMTACCCTTAACCAATGAAAAAMCATA

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

GGTGG AGC ATGT GGTTTMJT C GAAGCTACGC6AAGAACCTTACCAGGTCTTG ACATACTAT GCAAAT CTAAGAGATTAG ACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCA6CTCGTGTCGTGAGATGTT6G6GTTAAGTCCCT CAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAA

G GTGG G GAT G.A CGT CA AAT CAÍ CAT GCCCCTTAT GA CCT G GGCTACA CACGT GCTACA AT GGATGGTACAACGA GTT GCG AACT CGCGA GAGTAAGCTA ATCTCTTAA AGCCATTCTCAGTTCX3 GATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAA T CGGTAGTAAT CGCGGAT CAGCAT GCCGGGGT GAATAGGTT CCCGGGCCTT GTACACACCGCCCGTCACACCAT G AGAGT TT GTA ACACCCA AAGTCGGT GGGGGTAACCTTTTTAG GA AAÍXAGCCCGCCCTAAAGGGT GGGGAACAAGAATGAATTAA GGGGGTTGAAAAGTTCCGTTAAACCAAAAGGGGTTAGCCCCNGNTNNGANNNNNNNNNGAC

SEQ ID NO: 8

258 S10BL438 con 519R

GCTTTCTGGTTAAATACCGTCAATACCTGAACAGTTACTCTCAGATATGTGTCTTCTTTAACAACAGAGTTTTACGAGCC G A A ACCCTT CTT CACT CACG CGGCGTTGCT CCATCAGACTTTCGT CCATTGTGGAAGATT CCCTACTGCT GCCT CCCGTA GGAGTTT GG GCCGT GIGTC AGÍ CCCAATGTG GCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATT GCX ATGGTGAGCCGT TACGCCAGCAT CTA GGTAATACGCCGCGGG ACCAT CCAAAAGTGATAGCCGAAÍKC ATCTTTCAAGCTCG6ACCATGGGG T CCA AGTT GTTAT GCG GTATTAGC AT CT GTTTCCAGGGTGTTATTCCCCCXaCTT CGTGGGCAGGGTTTCCCACGT GTTAC T CACCAGTTCGCC ACT CACT CAAAT GTAAAT CAT GAT GCAAGCACCAAT CAATACCAGAGTT CGTT CGACTTGCAT GTAT TAGGCACGCCGCC AGCGTT CGT CC'!' GAGCCATGAT CAAACTCNGA

NCIMB 41846 GGDK31- Lactobacillus reuteri

SEQ ID NO: 10

S12KG200 GGDK 31-1 27F

TGCCTAATACATGCAAGTCGTACGCACTGGCCCAACT6ATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGACGATGGATCACCAGTGA

GTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCCGGAGCGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCAT

AACAACAAAAGCCACATGGCmTGTTTGAAAGATGGCmGGCTATCACTCTGGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTAG

TTGGTAAGGTAACGGCrTACCMGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGAACTGAGACACG

GTCCATACTCCTACGGGA6GCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGA

AGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTGGAGAAGAACGTGCGTGAGAGTAACTGTTCACGCAGTGACGGTATCCA

ACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGT

AAAGCGAGCGCAGGCGGTTGCTTAGGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACCGGGCGAC

TTGA6TGCAGAAGAGGACAGTGGAACTC

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ATC6GAAACCGGGCGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTA6ATATATGGAAG

aacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgcaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgmcaggattagata

CCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCrAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAA

GCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTG

GTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCTAACCTTAGAGATAA6GCGTTCCGTCG

GGGAC6CAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGT6AGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAAC

CCTTGTTACTAGTrGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACG

TCAGATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTA

SEQ ID NO: 12

S12KG202 GGDK 31-1926F

GAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAA6AACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCTAACCTTAGA6ATAAGGCGT

TCCCTTCGGGGACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACG

AGCGCAACCCrTGTTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGG

6GACGACGTCAGATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACG6TACAACGAGTCGCAAGCTC

gcgagagtaagctaatctcttaaagccgttctcagttcggactgtaggctgcaactcgcctacacgaagtcggmtcgct

agtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtttgta

acgcccaaagtcggtggcctaaccattatggagggagccgcctaaggcgggacagatgactggggtgaagtcgtaacaag

GTAGCCGTA

SEQ ID NO: 13

S12KG203 GGDK 31-1926R

CTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTCCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCACTCATCGTTTAC

GGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCFCAGCGTCAGTTGCAGACCAGACAGCCG

CCTTCGCCACTGGTGTTCrTCCATATATCTACGCATTCCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCrGCACTCAA

GTCGCCCGGTTTCCGATGCACTTCrTCGGTTAAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACCTAAGCAACCGCCTGCGCTCGCTTT

ACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCCACCrACGTATTACCGCGGCTGCÍGGCACGTAGTTAGCCGTGACTTTCTGGT

TGGATACCGTCACrGCGTGAACAGTTACTCTCACGCACGTTCTTCTCCAACAACAGAGCnTACGAGCCGAAACCCTTCT

TCACTCACGCGGTGTTGCTCCATCAGGCTTGCGCCCATTGTG6AAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTATGGAC

CGTGTCTCAGTTCCATTGTGGCCGATCAGTCTCTCAACTCGGCTATGCATCATCGCCTTGGTAAGCCGTTACCTTACCAA

CTAGCTAATGCACCGCAGGTCCATCCCAGAGTGATAGCCAAAGCCATCTTTCAAACAAAAGCCATGTGGCTTTTGTTGT

TATGC

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

acccttcttcactcacgcggtgttgctccatcaggcttgcgcccattgtggaagattccctactgctgcctcccgtagga

GTATGGACCGTGTCTCAGTTCCATTGTGGCCGATCAGTCTCTCAACTCGGCTATGCATCATCGCCTTGGTAAGCCGTTAC

CTTACCAACTAGCTAATGCACCGCAGGTCCATCCCAGAGTGATAGCCAAAGCCATCTTTCAAACAAAAGCCATGTGGCTT

TTGTTGTTATGCGGTATrrAGCATCTGTTrCCAAATCTTATCCCCCGCTCCGGGGCAGGTrACCTAGGTCTTACTCACCCG

TCCGCCACTCACTGGT6ATCCATCGTCAATCAGGTGCAAGCACCATCAATCAGTTGGGCCAGTGCGTACGACTTGCATGT

ATTAGGCACACCGCCGGCGTTCATCCTGAGCCATGATCAAAC

SEQ ID NO: 15

RP2 S12KG205 GGDK 31-1

CCGCCTTAGGCGGCTCCCTCCATAATGGTTAGGCCACCGACTTTGGGCGTTACAAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGT

GTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACrrCGTGTAGGCGAGTTGC

AGCCTACA6TCCGAACTGA6AACGGCTTTAAGAGATTAGCTTACTCTCGCGAGCTTGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGT

AGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATCTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTC

TCACTAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTA6TAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGA

CACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTCATTGCGTCCCCGAAGG6AACGCCTTATCTCTAAGGTTAGCGCAAGATG

TCAA6ACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTT

GAGTTTCCACCrTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTCCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCr

CCAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGG

NCIMB 41847 GGDK161 - contiene tanto Lactobacillus plantarum como Lactobacillus reuteri

Lactobacillus plantarum

[0263]

SEQ ID NO: 16

S12KG218 GGDK 161-1 27F

GTGCCTAATACATGCAA6TCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTCCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAA

CTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTT

GGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTmGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGAG

GTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAAC

TCCTACG6GAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGT

TTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCrGAGAGTAACJTGTrCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAA

AGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGA

GCGCAGGCGG) I I í I tAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTG6GAAGCTTGAGTG

CAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGT '

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAG

AACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAMCAGGATTAGATA

CCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTrCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAA

GCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTG6AGCATGTG

GTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACrATGCAAATCTAAGAGATrAGACGTTCCCTTCGG

GGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC

CTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGA

SEQ ID NO: 18

S12KG220 GGDK 161-1 926F

TGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCrTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGAC

GTOCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTrGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAA

CGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGT6ACAAACCGGAGGAAGGT

GGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCFGGGCTACACACGTGCTACAATG6ATGGTACAACGAGTTGCGAAC

TCGCGA6AGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGA1TGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCG

CTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTG

TAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCmTAGGAACCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAGTCGTAAC

AAGGTAGCCCGTA

SEQ ID NO: 19

S12KG221 GGDK 161-1 926R

ACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCATTCATCGTTTA

CGGTATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACCCATACTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCC

GCCTTCGCCACrGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCA

AGTTTCCCAGTTTCCGATGCACTTCTTCGGTTGAGCCGAAGGCniTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTT

TACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGG

TTAAATACCGTCAATACCTGAACAGTTACTCTCAGATATGTTCTTCTTTAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTC

TrCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGG

CCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCATGGTGAGCCGTTACCCCACCA

TCTAGCTAATACGCCGCGGGACCATCCAAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTCAAACTCGGACCATGCGGTCCAAGTTG

T

5

10

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20

25

30

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55

60

65

GCTTTCTGGTOAATACCGTCAATACCTGAAttGTTACTCTCAGATATGWCTTCmAACAACAGAGTTTrACGAGCCG AAACCCTTCrrCACTCACGCGGCGTTG CTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTG CTGCCTCCCGTAG

GAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCATGGTGAGCCGTT

ACCCCACCATCTAGCTAATACGCCGC6GGACCATCCAAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTCAAACTCGGACCATGCGGT

CCAAGTTGTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAGGTGTTATCCCCCGCTTCTGGGCAGGnTCCCACGTGTTACTCAC

CAGTTCGCCACTCACTCAAATGTAAATCATGATGCAAGCACCAATCAATACCAAAGTTCGTTCGACTTGCATGTATTAG

GCACGCCGCCAGC6TTCGTCCTGAGCCAGATCAAACTCTAA

SEQ ID NO: 21

RP2 S12KG223 GGDK 161-1

CCACCTTAGGCGGCTGGTTCCTAAAAGGTTACCCCACCGACTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGT

GTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACrFCATGTAGGCGAGTTGC

AGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTACrCTCGCGAGTTCGCAACTCGTTGTACCATCCATTGT

AGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGAnTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTC

TCACCAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTGATAATAAGGGTTGCGCTCGTrGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGA

CACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTATCCATGTCCCCGAAGGGAACGTCTAATCTCTTAGATTTGCATAGTATG

TCAAGACCTGGTAAGGTTCTrCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCT

TTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTC

CAÁCACTTAGCATTCATCGTTTACGGTATGGACTACCAGGGTATCTA

NCIMB 41847 GGDK161-contiene tanto Lactobacillus plantarum como Lactobacillus reuteri Lactobacillus reuteri

[0264]

SEQ ID NO: 22

S12KG309 cGGDK 161-1 27F

ATGCTAGTCGTACGCACTGGCCCAACTGATTGATGGTGCTTeCACCTGATTGACGAT

GGATCACCAGTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCT6CCCCGGAGCGGGGGATAACATTTGGAAACAGAT

GCTAATACCGCATAACAACAAAAGCCACATGGCTmGTTTGAAAGATGGCnTGGCTATCACTCTGGGATGGACCTGCG

GTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGÁTGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATG

GAACTGAGACACGGTCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAAC

ACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTtTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTGGAGAAGAACGTGCGTGAGAGTAACTGTTCACGCA

GTGACGGTATCCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGG

ATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTGCTTAGGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGAAGAAGTGCATCG

GAAACCGGGCGACTTGAGTGCA6AAGAGGACAGTGGAAC

5

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30

35

40

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50

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60

65

CATCGGAAACCGGGCGACTTGA6TGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAA

GAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTG6TCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGAT

ACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAAC6ATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCC6CCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTA

agcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgt

GGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCTAACCTTAGAGATAAGGCGTTCCCTTCG

GGGACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTrGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAAC

CCTTGTTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTA6TGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGMGGTGGGGACGACG

imagen1

SEQ ID NO: 24

S12KG311 cGGDK 161-1 926F

GGAGCATGTGGmAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCTAACCTTAGAGATAAGGCG

TTCCCTTCGGGGACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAAC

GAGCGCAACCCTTGTrACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTG

GGGACGACGTCAGATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCAAGCT

CGCGAGAGTAAGCTAATCTCTrAAAGCCGTTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGC

TAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGT

AACGCCCAAAGTCGGTGGCCTAACCTTTATG6AGGGAGCCGCCTAAGGCGGGACAGATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAA

GGTAGCCGTA

SEQ ID NO: 25

S12KG312 cGGDK 161-1 926R

TCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTCCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCrCCAACACCTAGCACTCATCGTTTACG

GCATGGACTACCAGGGTATCrAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTGCAGACCAGACAGCCGC

CTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTCCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACrCAAG

tcgcccggtttccgatgcacttcttcggttaagccgaaggctttcacatcagacctaagcaaccgcctgcgctcgcttta

cgcccaataaatccggataacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtgactttctggtt

GGATACCGTCACTGCGTGAACAGTTACTCTCACGCACGTTCTTCTCCAACAACAGAGCTTTACGAGCCGAAACCCTTCrr

CACTCACGCGGTGTTGCTCCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGGAAGA7TCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTATGGACC

GTGTCTCAGTTCCATTGTGGCCGATCAGTCTCTCAACTCGGCTATGCATCATCGCCTTGGTAAGCCGTTACCTTACCAAC

TAGCTAATGCACCGCAGGTCCATCCCAGAGTGATAGCCAAAGCCATCmCAAACAAAAGCCATGTGGCTTTT

5

10

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50

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60

65

CTTACCAACTAGCTAATGCACCGCA6GTCCATCCCAGAGTGATAGCCAAAGCCATCTTTCAAACAAAAGCCATGT6GCTT

TTGTTGTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAAATGTTATCCCCCGCTCCGGGGCAGGTTACCTACGTGTTACTCACCCG

TCCGCCACTCACTGGTAATCCATCGTCAATCAGGTGCAAGCACCATCAATCAGTTGGGCCAGTGCGTACGACTTGCATG

TATTAGGCACACCGCCGGCGTTCATCCTGAGCCATGATCAAAC

SEQ ID NO: 27

RP2 S12KG314 cGGDK 161-1

GCGGCTCCCTCCATAAAGGTTAGCGCCACCGACTTTGGGCGTTACAAACTCCCATGGTGTGACGGGCG

GTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCrGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGTAGGCGAG

TTGCAGCCTACAGTCCGAACTGAGAACGGCnTAAGAGATTAGCTTACTCTCGCGAGCTTGCGACTCGTTGTACCGTCCA

TTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATCTGACGTCGTCCCCACCTTCCrCCGGTTTGTCACCGGC

AGTCTCACTAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTAGTAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACrrAACCCAACATCTC

ACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTCA7TGCGTCCCCGAAGGGAACGCCTTATCTCTAA6GTTAGCGCAA

GATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCA

ATTCCTTTGAGTTTCAACCrrGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTCCGGCACTGAAGGGCGGAA

ACCCTCCAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCAT

NCIMB 41848 GGDK255 - Lactobacillus reuteri

[0265]

SEQ ID NO: 28

S12KG237 GGDK 255-1 27F

GTGTGCCTAATACATGCAAGTCGTACGCACJGGCCCAACTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGACGATGGATCACCAG

tgagtggcggacgggtgagtaacacgtaggtaacctgccccggagcgggggataacatttggaaacagatgctaataccg

CATAACAACAAAAGCCACATGGCTTTTGTrTGAAAGATGGCTTTGGCTATCACTCTGGGATGGACCTGCGGTGCATTAGC

TAGTTG6TAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGATGATGCATAGCC6AGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGAACTGAGAC

ACGGTCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGT6AG

TGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTGGAGAAGAACGTGCGTGAGAGTAACrGTTCACGCAGTGACGGTAT

CCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATnATTGGG

CGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTGCTTAGGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACCGGGC

GACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTG

5

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30

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65

ATCGGAAACCGGGCGACTTGAGTGCAGÁAGÁGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGÁTATATGGAAG

AACACCAGTGGCGMGGCGGCTGTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGMCAGGATTAGATA

CCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATrAA

GCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGT6

GnTAATTCGAAGCTÁCGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCTAACCTTAGAGATAAGGCGTTCCCTTCGG

GGACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC

CTTGTTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGA6ACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACG

TCAGATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTAC

SEQ ID NO: 30

S12KG239 GGDK 255-1 926F

TGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGMGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCTMCCTTAGAGATMGGC

GTTCCCTTCGGGGACGCAATGAGAGGTGGTGCA'rGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGIGAGATGTrGGGTTAAGTCCCGCAA

CGAGCGCAACCCTT6TTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAÁACCGGAGGAAGGT

GGGGACGACGTCAGATCATCATGCCCPTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCAAGC

TCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACrCGCCTACACGAAGTCGGAATCG

CTAGTAATC6CGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTG

TAACGCCCAAAGTCGGTGGCCTAACCTTTATGGAGGGAGCCGCCTAAGGCGGGACAGATGACTGGGGTGAAGTCGTAACA

A6GTAGCCGTA

SEQ ID NO: 31

512KG240 GGDK 255-1 926R

TACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTCCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCMCACCTAGCACTCATCGTTT

acggcatggactaccagggtatctaatcctgttcgctacccatgctttcgagcctcagcgtcagttgcagaccagacagc

CGCCTrCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTCCACCGCTÁCACATGGAGTTCGACTGTCCTCTTCTGCACTC

AAGTCGCCCGGTTTCCGATGCACTTCTTCGGTTAAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACCTAAGCAACCGCCTGCGCTCGCT

TTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTrGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGACnTCTG

GTTGGATACCGTCACrGCGTGAACAGTTACTCTCACGCACGTTCTTCTCCAACAACAGAGCTrTACGAGCCGAAACCCTT

CTTCACTCACGCGGTGTTGCTCCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGGAA6ATTCCCTACTGCrGCCTCCCGTAGGAGTATGG

ACCGTGTCTCAGTTCCATTGTGGCCGATCAGTCTCTCAACTCGGCTATGCATCATCGCCTTG6TAÁGCCGTTACCTTACC

AACTAGCTAATGCACCGCAGGTCCATCCCAGAGTGATAGCCAAAGCCATCTTTCAAACAAAAGCCAT6TGGCTTTTG

5

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65

CTTACCAACTAGCTAATGCACCGCAG6TCCATCCCAGAGTGATAGCCAAAGCCATCTTTCAAACAAAAGCCATGTGGCT

nTGTTGTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAAATGTTATCCCCCGCTCCGGGGCAGGTTACCTACGTGTTACTCACC

CGTCCGCCACTCACTGGTGATCCATCGTCAATCAGGTGCAAGCACCATCAATCAGTrGGGCCAGTGCGTACGACTTGCAT

GTATTAGGCACACCGCC6GCGTCCATCCTGAGCCATGATCAAAC

SEQ ID NO: 33

RP2 512KG242 GGDK 255-1

CCGCCTTAGGCGGCTCCCTCCATAAAGGTTAGGCCACCGACTTTGGGCGTTACAAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGT

gtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccgacttcgtgtaggcgagttgc

AGCCTACAGTCCGAACTGAGAACGGCnTAAGAGATTAGCTTACTCTCGCGAGCTTGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGT

AGCACGTGT6TAGCCCAGGTCATAAGGGGCAT6ATGATCTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTC

TCACTAGAGTGCCCAACTTAATGCTSGCAACTAGTAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGA

CACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTCATTGCGTCCCCGAAGGGAACGCCTrATCTCTAAGGTTAGCGCAAGATG

TCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCT

TTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTCCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAA

CACCTAGCACTCATCGTT

NCIMB 41849 GGDK 258 - Lactobacillus plantarum

r02661

SEQ ID NO: 34

S12KG267 GGDK 258-3 27F

GTGCCTAATACATGCAAGTCGMCGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTrGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAA

CTGGT6AGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTT

GGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACnTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGAG

TCCrACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGT TTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTrAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTÁTTTAACCAGAAA GCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATT6GGCGTAAAGCGAG CGCA6GCGGÍ TI i 11 AAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACrTGAGTGC AGAAGAGGACAGTGGAACTC

5

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CGGAAACTGG6AAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAA

CACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACC

CTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTrTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGC

ATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGA6CATGTGGT

TTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTrGACATACTATGCAAATCTAAGAGATrAGACGTTCCCTTCGGGG

ACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGrTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCT

TATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCA

AATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTAC

SEQ ID NO: 36

S12KG269 GGDK 258-3 926F

GTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGÁCATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGA

CGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCA

ACGAGCGCAACCCrTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGG

TGGGGAT6ACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAA

CTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAG6CTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATC

GCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTT

GTAACACCCAMGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAGTCGTAA

CAAG GT AGCCCGTA

SEQ ID NO: 37

S12KG270 GGDK 258-3 926R

ACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCATTCATCGTnA

CGGTATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACCCATACTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTrACAGACCAGACAGCC

GCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCA

AGTTTCCCAGTTTCCGATGCACTTCTTCGGTTGAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTT

TACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTrGCCACCrACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTrAGCCGTGGCTTTCrGG

TTAAATACCGTCAATACCTGAACAGTTA€TCTCAGATATGTTCTTCTTTAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTC

TTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACmCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTrrGGG

CCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCATGGTGAGCCGTTACCTCACCA

TCTAGCTAATACGCCGCGGGACCATCCAAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTCAAACTCGGACCATGCGGTCCAAGTTG

TTATGCGGTATTAG CATCTGTTTC

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ACCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATrGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGA

GTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCATGGTGAGCCGTTAC

CTCACCATCTAGCTAATACGCCGCGGGACCATCCAAAAGTGATA6CCGAAGCCATCTTTCAAACTCGGACCATGCGGTCC

AAGTT6TTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAGGTGTTATCCCCCGCTTCTGGGCAGGTTTCCCACGTGTTACTCACCAG

TTCGCCACTCACrCAAATGTAAATCATGATGCAAGCACCAATCAATACCAGAGTTCGTTCGACrTGCATGTATTAGGCAC

GCCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCCATGATCAAAC

SEQ ID NO: 39

RP2 512KG272 GGDK 258-3

CCACCTTAGGCGGCTGGTTCCTAAAAGGTTACCCCACCGACTTTGG6TGTTACAAACTCTCATG6TGTGACGGGCGGTGT

GTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGC

AGCCrACAATCCGAACTGAGAATGGCTrTAAGAGATTAGCTTACTCTCGCGAGTTCGCAACTCGTTGTACCATCCATTGT

AGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTC

TCACCAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTGATAATAAGGGTT6CGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGA

CAACACTTAGCATTCATCGTTTACGGTATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACCCATACTTTCGAGCCTCAGC

GTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCT

NCIMB 41850 GGDK 266 - contiene tanto Lactobacillus ¡ohnsonii como Lactobacillus reuteri Lactobacillus ¡ohnsonii

r02671

SEQ ID NO: 40

S12KG273 GGDK 266-127F - repetición

GTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAGCrTGCCTAGATGATrTTAGTGCTTGCACTAAATGAAACTAGATACAAGCGAGC

GGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCAAGAGACTGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGGATAA

CAACACTAGACGCATGTCTAGAGTTTGAAAGATGGTTCTGCrATCACTCTTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTAGTTG

GTAAGGTAACGGCrTACCAAGGCAATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCC

CAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGA

AGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCT6TTGGTAGTGAAGAAAGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATTACTT

AGAMGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAA

AGCGAGTGCAGGCGGTTCAATAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGGAGAAT .

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CATCAGAAACTGTTGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAA

GAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGAT

ACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTMGTGTTGGGAGGTTTCCeCCTCTCAGTGCTGCASCTMCGCATTA

GGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCAGTGCAAACCTAA6AGATTAGGTGTTCCCTTC

ggggacgctgagacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgt

SEQ ID NO: 42

S12KG275 GGDK 266-1 926F - repetición

ggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatccagtgcaaacctaagagattaggtg

TGTCCCTTCGGGGACGCTGA6ACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAA6TCCCGCAA

CGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAATGA6ACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGT

GGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGAAGCGAAC

CTGCGAAGGCAAGCGGATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGCTGGAATCG

CTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAG

TCTGTA

SEQ ID NO: 43

S12KG276 GGDK 266-1926R

ACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAGAGGCGGAAACCTCCCAACACTTAGCACTCATCGTTTA

CGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTGCAGACCAGAGAGCC

GCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTCCACCGCTACACATGGAGTTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCA

AGTTCAACAGTTTCTGATGCAATTCTCCGGTTGAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTATTGAACCGCCTGCACTCGCTT

TACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCrACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGACTTTCTAA

GTAATTACCGTCAAATAAAGGCCAGTTACTACCTCTATCTrTCTTCACTACCAACAGAGCTTTACGAGCCGAAACCCTTC

TTCACrCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACmCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGG

CCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCAGTCTCTCAACTCGGCTATGCATCATTGCCTTGGTAAGCCGTTACCTTACCA

ACTAGCrAATGCACCGCAGGTCCATCCAAGAGTGATAGCAGAACCATCTTTCAAACTCTAGACATGCGTCTAGTGTTGT

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ACnTCTAAGTAATTACCGTCAAATAAAGGCCAGTTACTACCTCTATCTTTCTTCACTACCAACAGAGCTTTACGAGCCG

AAACCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAG

GAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCAGTCTCTCAACTCGGCTATGCATCATTGCCTTGGTAAGCCGTT

ACCTTACCAACTAGCTAATGCACCGCAGGTCCATCCAAGAGTGATAGCAGAACCATCTTTCAAACrCTAGACATGCGTCT

AGTGTTGTTATCCGGTATTAGCATCTGTTTCCAGGTGTTATCCCAGTCTCTTGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCC

GTCCGCCGCTCGCTTGTATCTAGTTTCATTTAGTGCAAGCACTAAAATCATCTAGGCAAGCTCGCTCGAC1TGCATGTAT

TAGGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCCATGATCAAACT

SEQ ID NO: 45

RP2 S12KG278 GGDK 266-1

CTACCTTAGACGGCTGACTCCTATAAAGGTTATCCCACCGGCTTTGGGTGTTACAGACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTG

TGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCGTGTAGGCGAGTTG

CAGCCTACAGTCCGAACTGAGAACGGCTTTAAGAGATCCGCTTGCCTTCGCAGGTTCGCTTCTCGTTGTACCGTCCATTG

TAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCrTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGT

CTCATrAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAATGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACG

ACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTCrCAGCGTCCCCGAAGGGAACACCTAATCTCTTAGGmGCACTGGAT

gtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcitcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcc

TTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAGAGGCGGAAACCrC

CCMCACTTAGCACTCATCGTTrACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCmCGAGCCTCA

GCGTCAGTTGCAGACCAGAGAGCCGCCT

NCIMB 41850 GGDK 266-contiene tanto Lactobacillus ¡ohnsonii y Lactobacillus reuteri Lactobacillus reuteri

r02681

SEQ ID NO: 46

S12KG279 GGDK-266-2 27F

GTGTGCCTAATACATGCAAGTCGTACGCACTGGCCCAACTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGACGATGGATCACCAG

TGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCCGGAGCGGG6GATAACATTTGGAAACAGATGCTÁATACCG

CATAACAACAAAAGCCACATGGCmTGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTCTGGGATGGACCTGCGGTGCATTAGC

TAGTrGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGAACTGAGAC

ACGGTCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAG

TGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCrCTGTTGTrGGAGAAGAACGTGCGTGAGAGTAACTGTTCACGCAGTGACGGTAT

CCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAnTATTGGG

CGTAAAGCGAGCGCAGGCGGITGCTTAGGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTrAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACCGGGC

GACTtGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTA

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

TCGGAAACCGGGCGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGA

ACACCAGTG6CGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATAC

CCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTG6AGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAG

CACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGG6GGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTG

GTTTAATTCG

SEQ ID NO: 48

S12KG281 GGDK-266-2 926F - repetición

GAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACC7TACCAGGTCTTGACATCTTGCGCTAACCTTAGAGATAAGGCGT

AGCGCAACCCTTGTTACTAGTTGCCAGCATOAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCG6AGGAAGGTGG

GGACGACGTCA6ATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCAAGCT

CGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGACTGTAGGCT6CAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGC

TAGTAATCGCG6ATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACC

SEQ ID NO: 49

S12KG282 GGDK-266-2 926R - repetición

ACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTCCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCACTCATCGnTA

CGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCrGTrCGCTACCCATGCmCGAGCCTCAGCGTCAGTTGCAGACCAGACAGCC

GCCrrCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTCCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCA

AGTCGCCCGGTTTCCGATGCACTTCTTCGGTTAAGCCGAAGGCTTTCACATCA6ACCTAAGCAACCGCCTGCGCTCGCTT

TACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCC6TGACTTTCTGG

TTGGATACCGTCACTGCGTGAACAGTTACTCTCACGCACGTTCTTCTCCAACAACAGAGCTTTACGAGCCGAAACCCTTC

TTCACTCACGCGGTGTTGCTCCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGGMGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTATGGA

CCGTGTCrCAGTTCCATTGTGGCCGATCAGTCTCTCAACTCGGCTATGCATCATCGCCTTGGTAAGCCGTTACCTÍACCA

ACTAGCTAAT GCACCGCAGGT

SEQ ID NO: 50

S12KG283 GGDK-266-2 519R

TTTCTGGTTGGATACCGTCACTGCGTGAACAGTTACTCTCACGCAC6TTCTTCTCCAACAACAGAGCTTTACGAGCCGAA

CrrACCAACTAGCTAATGCACCGCAGGTCCATCCCAGAGTGATAGCCAAAGCCATCTTTCAAACAAAAGCCATGTGGCTT

TTGTrGTrATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAAATGTTATCCCCCGCTCCGGGGCAGGTTACCTACGTGTTACTCACCCG

TCCGCCACTCACTGGTGATCCATCGTCAATCAGGTGCAAGCACCATCAATCAGTTGGGCCAGTGCGTACGACTTGCATGT

ATTAGGCACACCGCCGGCGTTCATCCTGAGCCATGATCAAACTCT

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

TCCCGCCTTAGGC6GCTCCCTCCATAATGGTTAGGCCACCGACTTTGGGCGTTACAAACTCCCATGGT6TGACGGGCGGT

GTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCrGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGTAGGCGAGTT

GCAGCCTACAGTCCGAACTGAGAACGGCTTTAAGAGATTAGCTTACTCTCGCGAGCTTGCGACTCGTTGTACCGTCCATT

GTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATCTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAG

TCTCACTAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTAGTAACAAGGGTT6CGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCAC

gacacgagctgacgacgaccatgcaccacctgtcattgcgtccccgaagggaacgcctTatctctaaggttagcgcaaga

tgtcaagacctggtaaggttcttcgcgtagcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattc

ctttgagtttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctccggcactgaagggcggaaaccc

TCCAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTC

agcgtcagttgcagaccagacagccgccttcgccactggtg

NCIMB 41850 GGDK 266-contiene tanto Lactobacillus ¡ohnsonii como Lactobacillus reuteri

Lactobacillus reuteri

r02691

SEQ ID NO: 52

S12KG381 27F

GTGTGCCTAATACATGCMGTCGTACGttCTGGCCCMCTGATTGAíGGTGCTTGCACCTGATTGACGATGGATCACCAGTGAGTGGCGGACG

GGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCCGGAGCGGGGGATAACAnTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACAAAAGCCACATGGCTTT

TGTrTGAAAGATGGCnTGGCTATCACTCTGGGATGGACCTGCGGTGCATíAGCTAG'TTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGATGATGCAT

AGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGAACIGAGACACGGTCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTrCCACAATGGGC

GCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTntGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTGGAGAAGAACGTGCGTGAGAGTAACTGT

TCACGCAGTGACGGTATCCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTAT

tgggcgtaaagcgagcgcaggcggttgcttaggtctgatgtgaaagccttcgottaaccgaagaagtkatcggaaaccgggcgacttgag

TGC

SEQ ID NO: 53

S12KG382 519F

nATCCGGAWATTGGGCGTMAGCGAGCGCAGGCGGTFGCTTAGGTCTGATGTGAAAGCCrTCGGCTTAACCGAAGAÁGTGCATCGGAAAC

CGGGCMCTT6AGTGCAGAAGAGGACAGTGGMCTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGG

CTGTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCT

AGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCrGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGA

ATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGmAAITCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCTAACCTT

AGAGATAAGGCGTCCCTTCGGGGACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCrCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACG

AGCGCAACCOTGTTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACrCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCA

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

GSTSSAGCATGT<3GTrTMTTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGQTCTT6ACATCTTGCGCTAACCTTAGAGATAA6GCGTTCCOTC6GG

GACGCAATGACAGGTG6TGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGT6AGATGTT6GGTTAAGTCCC6CAM^AGCGCAACCCrT6TTACTAGTTG

CCAGCATTMGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCC6GTGACAAACCGGAGGAAGGIGGGGACGACGTCA6ATCATCATGCCCCTTATGACCTG

GGCÍACACACGTGCTACAATGGACGGTACMCGAGTCGCMGCTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTrAAAGCCGTTCTCAGTTCGGACTGTAGG

CTGCAACTCGCCIACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGIGAATACGTTCCCGGGCCTFGTACACACCGCCCGTC

ACACCATGGGAGTTTGTAACGCCCAAAGTCGGTG6CCTAACCATTATGGAGGGAGCCGCCTAAGGC6GGACAGATGACTGGGGTGAAGTCGT

AACAAGGTAGCCGTA

SEQ ID NO: 55

S12KG384 926R

TACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTGAGCTCCGGCACTGAAG6GCGGAAACCCTCCAACACCTAGCACTCATC6TTTACGGCATGGACTA

CCAGGGTATCTAATCCTGTÍCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTGCAGACCAGACAGCCGCCrTCGCCACTGGTGTTCTTCCATAT

ATCTACGCATTCCACCGCTACACATGGAGTrCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCGCCCGGTTTCCGATGCACTTCrTCGGTTAAGCCGAAGG

CTTTCACATCAGACCÍAAGCAACCGCCTGCGCTCGCnTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCA

CGTAGTTAGCCGTGACTTTCÍGGTTGGATACCGTCAP'GCGTGAACAGTTACTCTCACGCACGTTCTTCTCCAACAACAGAGCrTTACGAGCCGA

AACCCTTCTTCACrCACGCGGTGTíGCTCCATCAGGCrrGCGCCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTATGGACCGTGTC

TCAGTTCCATTGT6GCCGATCAGTCTCTCAA(JCGGCTATGCATCATCGCCÍT6GTAAGCCGTTACC1TACCAACTAGCTAATGCACC6CAGGTC

catcccagagtgatagccaaagccatctttcaaacaaaagcc

SEQ ID NO: 56

S12KG385 519R

GTGACTTTCrGGTTGGATACCGTCACTGCGTGAACAGTTACTCTCACGCACGTGCTTCTCCAACAACAGAGCnTACGAGCCGAMCCCnCTTC

ACTCACGCGGTGTTGCTCCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCÍ6CCTCCCGTAGGAGTATGGACCGTGTCTCAGTTCCATT

GTGGCCGATCAGTCTCTCAACTCGGCrATGCATCATCGCCTTGGTAAGCCGTTACCTTACttACTAGCTAATGCACCGCAGGTCCATCCCAGAGT

GATAGCCAMGCCATCnTCAMCAAAAGCCATGTGGCrmGTTGTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAAATGTTATCCCCCGCTCCGGGGC

aggfacctacgtgttactcacccgtccgccactcactggtgatccatcgtcaatcaggtgcaagcaccatcmtcagttgggccagtgcgtac

gacttgcatgtattaggcacaccgccggcgttcatcctgagccatgatcaaac

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

TCCCGCACTTAGGCGGCTCCCTCCATAATGGTrAGSCCACCGACrrTGGGCGTTACAAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACMeGCC

CGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAGTCCGAACTGAGAAC

6GCTTTAAGAGATTAGCTTACTCTCGCGAGCTTGCGACTCGTTGTACCGTCCATT6TAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGA

TCTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACTAGA6TGCCCAACTTAATGCT66CAACTAGTAACAAGGGTTGCGCTCG

TTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCAT6CACCACCTGTCATTGCGTCCCCGAAGGGMCGCCTTATCTCTAAG

GTTAGCGCAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTrCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCT

TTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTCCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCACT

CATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCrGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCC

NCIMB 42008 GGDK266a - L. ¡ohnsonii (muestra 4a) r02701

SEQ ID NO: 58

S12KG399 27F

GCGTGCCTAAIACATGCAAGTCGAGCGAGCTTGCCTAGATGATTrTAGTGCTTGCACTAAATGAAACTAGATACAAGCGAGCGGCGGACGGGT

GAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCAAGAGACTGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGGATAACAACACTAGACGCATGTCTAGAG

nTGAMGATGGTTCTGCTATCACTCTTGGATGGACCrGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCITACCAAGGCAATGATGCATAGCC

GAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAG6CAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAA

GTCTGATGGAGCAACGCCGC6TGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGGTAGTGAAGAAAGATAGAGGTAGTAACTGGCCTT

TATTTGACGGTAA1TACTTAGAAA6TCACGGCTAACTACGT6CCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCC6GATTTATTGGG

CGTAAAGCGAGTGCAGGCGGTTCAATAAGTCTGATGTGAMGCCTTCGGCrCAACCGGAGAATTGCATCAGAAACTGTrGAAOTGAGTGCAG

aagaggagagtggaactccatgtgtagcggiggaatgcgta

SEQ ID NO: 59

S12KG400 519F

TGTCCGGATTTATTGGGCGTMAGCGAGTGCAGGCGGTrCAATAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGGAGAATTGCATCAGAAACT

gttgmcttgagtgcagaagaggagagtggaactccatgtgtagcggtggaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggc

TCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCrCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAMCGATGAGTGCTA

AGTGnGG6AGGTTTCCGCCTCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTMGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCMGGTTGAAACTtAAAGGAAT

TGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGnTAATTCGAAGCAACGCGAAGMCCTTACCAGGTCITGACATCCAGTGCAAACCTAA

GAGATTAGGTGTTCCCTTCGGGGACGCTGAGACAGGT6GTGCATG6CTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGA6ATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA

GCGCAACCCTTGTCATrAGTTGCCATCATTMGTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGAT

SEQ ID NO: 60

S12KG401 926F

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

GGT6QAGCATGTG6TTTMTTCGAAGCAACGC6AAGAACCTTACCAGGTCTT6ACATCCAGTGCAMCCTAAGA6ATTA6GTGTTCCCTTCGS

GGACGCTGAGACAGGTGGTGCATGGCrGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCAITAGTr

GCCATCAlTAAGTTGGGCACTCTAATGAGACrGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCrTATGACCTG

GGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGAAGCGAACCTGCGAAGGCAAGCGGATCTCTTAAA6CC6ITCTCAGTTCGGACTGTAG

GCTGCAACTCGCCTACACGAAGCrGGAATCGCTAGrAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGMTACGTTCCCGGGCCrTGTACACACCGCCCG

TCACACCATGAGAGTCTGTAACACCCAAAGCCGGTGGGATMCCnTATAGGAGTCAGCCGTCTAAGGTAGGACAGATGATrAGGGTGMGTC

GTAACAAGGTAG

SEQ ID NO: 61

S12KG402 926R

TACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAGAGGCGGAAACCrCCCAACACTTAGCACrCATCGTTTACGGCATGGACTAC

CAGGGTATCTAATCCTGTrCGCTACCCATGCnTCGAGCCTCAGCGTCAGTTGCAGACCAGAGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCrrCCATATA

TCTACGCATrCCACCGCTACACATGGAGTTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCAACAGTnCTGATGCAATTCrCCGGTrGAGCCGAAGGCT

TTCACATCAGACTTATTGAACCGCCTGCACT€G€TTTACGCCCMTAAATCCGGACAACGCTTGCCACCrACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACG

TAGTTAGCCGTGACTTTCTAAGTAATTACCGTCAAATAAAGGCCAGTTACTACCTCTATCnTCTTCACTACCAACAGAGCmACGAGCCGAAA

CCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTrTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACrGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTC

AGTCCCAATGTGGCCGATCAGTCTCTCAACTCGGCTATGCATCATTGCCTTGGTAAGCCGTTACCTTACCAACTAGCTAATGCACCGCAGGTCCA

TCCAAGAGTGAIAGCAGANCCATCmCAAACTCtAGACATGCGTCTAGTG

SEQ ID NO: 62

S12KG403 519R

GTGACTTTCTAAGTAATrACCGTCAAATAAA6GCCAGTTACTACCTCTATCmCTTCACrACCAACAGAGCTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCA

CTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACnTCfiTCCATTGTQGAAGATTCCCTACTGCrGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATG

TGGCCGATCAGTCTCTCAACTCGGCTÁTGCATCATTGCCTTGGTAAGCCGTTACCTTACCAACTAGCTMTGCACCGCAGGTCCATCCAAGAGTG

ATAGCAGAACCATCTTTCAAACTCTAGACATGCGTCTAGTGTTGTTATCCGGTATTAGCATCTGTTTCCAGGTGTTATCCCAGTCrCTTGGGCAG

GTrACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTCGCTTGTATCTAGTTTCATTTAGTGCAAGCACTAAAATCAICTAGGCAAGCTCGCTCGACTTG

CATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCCA

SEQ ID NO: 63

S12KG404 RP2

TCCTACACTTAGACGGCTGACTCCTATAAAGGTTATCCCACCGGCTTTGGGTGTTACAGACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCC

CGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCGTGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAGTCCGAACTGAGAAC

GGCTnAAGAGATCCGCrTGCCTTCGCAGGTTCGCTTCTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGtAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGA

CTTGACGTCATCCCCACCTTCaCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCATTAGAGTGCCCAACrTAATGATGGCAACTAATGACAAGGGTTGCGCTCG

TrGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTCTCAGCGTCCCCGAAGGGAACACCTAATCTCTTAG

GTTTGCACTGGATGTCAAGACCrGGTAAGGTTCTTCGCGTrGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTT

TGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGT6CTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAGAGGCGGAAACCTCCCAACACTTAGCACTC

ATCGTTTACGGCATGGACTACCAGG6TATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGC

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

SEQ ID NO: 64

NCIMB 42009 GGDK266b - L. reuteri (muestra 6a)

S12KG411 27F

GTGT6CCTAATACATGCAAGTCG!ACGCACT66CCCAACTGATTGAT66T6CTrGCACCTGATTGAC6ATMATCACCAGTGA6TG6CG6ACG

GGTGAGTAACAC6TAGGTAACCT6CCCCG6AGC66GG6ATAACATTTG6AAACA6ATGCTAATACCGCATMCAACMM6CCACAT6GCTTT

TGTTTGAAAGATGGCTTTGGCTATCACTCTGGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCfAGTTGGTAAGSIAACGGCTTACCAAGGCGATGATGCAT

AGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGAACTGAGACACGGTCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCrTCCACAATGGGC

GCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAA5CTCTGTTGTTGGAGAAGAACGTGCGTGAGAGTAACTGT

TCACGCAGTGACGGTATCCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTG6CAAGCGT

SEQ ID NO: 65

S12KG412519F

TATCCGGATTTATrGGGCGTAAAGC6AGCGCAG6CSGTTGCTTAGQTCTGATGTQAAA6CCTTC6GCTTAACCGAA6AA6TGCATCGGAAACC

GGGCGACTrGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGC

TGTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTA

GGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCnCAGTGCCGGAGCTMCGCATTAAGCACrCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAMCTCAAAGGAAT

TGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCnGCGCTAACCTTAG

AGATAAGGCGTTCCCTTCGGGGACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA

GCGCAACCCTTGTTACrAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACrCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGA

SEQ ID NO: 66

S12KG413 926F

GTGSAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGC6AAGAACCTTACCAG6TCTTGACATCTTGCGCTAACCTTAGAGATAAGGCGTTCCCTTCGQSS

ACGCAAT6ACAGGTGGTGCATG6TCGTCGTCAGCTC6TGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGC6CAACCCTTGTTACrAGTT6C

CAGCATTAAGTK3GGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGASGAA6GTG66GACGAC6TCAGATCATCATGCCCCTTAT6ACCTGG

GCTACACACGTGCTACMTGGACSGTACMCGAGTCGCAAGCTCGCGASAGTAAGCTMTCTCTTAAA6CCG1TCTCA6TTCG6ACTGTAGGC

TGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCQTGTACACACCGCCCGTC

ACACCATGGGAGnTGTAACGCCCMAGTCGGTGGCCTAACCATTATGGAGGGAGCCGCCTAAGGCGGGACAGATGACTGGGGTGAAGTCGT

SEQ ID NO: 67

S12KG414 926R

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

TÁCTCCCCAGGCGGAGTGCWAATGCGTTAGCTCCGGCACTGMGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTAC

CAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTrGCAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCrTCCATATA

TCTACGCATTCCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCGCCCGGTTTCCGATGCACTTCTTCGGTTAAGCCGAAGGC

TTTCACATCAGACCTAAGCAACCGCCTGCGCTCGCTTrACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC

GTAGTTAGCCGTGACTTrCTGGTTGGATACCGTCACTGCGTGAACAGTTACTCTCACGCACGTTCTTCTCCAACAACAGAGCmACGAGCCGAA

ACCCiTCTTCACTCACGCGGTGTTGCTCCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGGAAGATTCCCrACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTATGGACCGTGTCr

CAGTrCCATTGTGGCCGATCAGTCTCTCAACTCGGCTATGCATCATCGCC

SEQ ID NO: 68

S12KG415519R

GTGACmcrfiGTTSGATACC6TCACTGCGTGAACAGTTACTCTCACGCAC6TTCTTCTCCAACAACA6A6CnTACGAGCC6AAACCCTTaTC

ACTCACGCGGTGTTGCICCATCAGGCrTGCGCCCATTGTGGMGATTCCCTACrGCTGCCTCCCGTAGGAGTATGGACCGTGTCTCAGTTCCAÍÍ

GTGGCCGATCAGTCTCTCAACTCGGCTATGCATCATCGCOTGGTAAGCCCTTACCTTACCAACTAGCTAATGCACCKA56TCCATCCCA6A6T

GATAGCCAAAGCCATCTTTCAAACAAAAGCCATGTGGCnTTGTTGTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAAATGTTATCCCCCGCTCCGGGGC

AGGTTACCTACGTGTTACTCACCCGTCCGCCACTCACTGGTGATCCATCGTCAATCAGGTGCAAGCACCATCAATCAGTTGGGCCAGTGCGTAC

GAOTGCATGTATTAGGCACACCGCCGGCGTTCAT

SEQ ID NO: 69

S12KG416 RP2

TCCCGCCTTAGGCGGCTCCCTCCATMTGGTTAGGCCACCGACTTTGGGCGTTACAAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCC

GGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACrAGCGATTCCGACTTCGTGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAGTCCGAACTGAGAACG

GCTTTAAGAGATTAGCTTACrCTCGCGAGCTTGCGACrCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGAT

CTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTrGTCACCGGCAGTCrCACTAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTAGTAACAAGGGTTGCGCTCGT

TGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTCATTGCGTCCCCGAAGGGAACGCCTTATCTCrAAGG

TTAGCGCAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTT

G AG1TT CAACCTT GCGGT CGTACTCC

SEQ ID NO: 70

NCIMB 42010 GGDK161a - L.plantarum (muestra 7a)

S12KG41727F

GTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAACTCrGGTATTGATTGGTGCTTGGATCATGATrTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACAC

GTGGGÁMCCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGA

TGGCTTCGGCTATCACmTGGATGGTCCCGCGGCGTA'rTAGCTAGATGGTGAGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGA

GAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATGTCCACAATGGACGAAAGTCTGAT

GGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTnCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGAC

GGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGT6CCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGC

GAGCGCAGGCGGTmTTAAGTCTGATGTGAAAGCCrTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGA

CAGTGGAACTCATGTGT

5

10

15

20

25

30

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40

45

50

55

60

65

TCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTMGTCTGATGTGMAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGG

GAAACFTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACrCCATGTGTAGCGGTGAAATGCSTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTG

TCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGÁAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTG6TAGTCCATACCGTAAACGAT6AATGCTAAG

TGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATrCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACrCAAAGGAATTG

ACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATrCGAAGCrACGCGAAGAACCTTACCAGGTCrTGACATACTATGCAAATCTAAGAG

ATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCG

CAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTrGGGCACTaGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCAT

CATGCCCCTTATGACCTG6GCTACACAC

SEQ ID NO: 72

S12KG419 926F

GGTGGAGCATGTGGTrTAATTCGAAGCTACGCGAAGMCCrTACCAGGTCTTCSACATACTATGCAAATCTAAGÁSATTAGACGTTCCCTTCGGG

GACATGGATACAGGTGGTGCATGGTÍGTCGTCAGCTCGIGTCGIGAGATGTrGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTG

CCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCG6TGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCC1TATGACCTG

GGCTACACACGTGCrACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTMGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGG

CTGCAACTCGCCTACATGAAGTCG6AATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGC6GTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTC

ACACCÁTGAGAGTTTGTMCACCCAMGTCGGTGGGGTAACCmTAGGAACCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTACGGTGAAGTCGTA

ACAAGGTAGCCCGTA

SEQ ID NO: 73

S12KG420 926R

GTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACrTAGCATrCATCGTTTACGGTATGGACTA

CCAGGGTATCTAATCOrGTTTGCrACCCATACmC6AGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCn,CGCCACrGGTGTTCrrCCATAT

ATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGICCTCTTCTGCACTCMGTnCCCAGTTTCCGATGCACTTCTTCGGTTGAGCCGAAGGC

TTTCACATCAGACTTAMAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC

GTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTrAAATACCGTCAATACCTGAACAGTTACTCTCAGATATGTTCTTCmAACAACAGAGTmACGAGCCGAA

ACCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACT5CTGCCTCCCGTA6GA6TTTGGGCCGTGTCT

CAGTCCCAATCTGGCCGATTACCCTCrCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCATGGTGAGCCGTTACCrCACCATCTAGCTAATACGCCGCGGGAC

CATCCAMAGTGATA

SEQ ID NO: 74

S12KG421 519R

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

TGGCTTTCTGGTTAAATACCGTCAATACCrGAACAGTTACTCTCAGATATGITCTTCnTAACAACAGAGnTTACGAGCCGAAACCCTTCrrCAC TCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTrrCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGT , GGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCÍACGTATCATTGCCATGGTGAGCCGTTACCTCACCATCTAGCTAATACGCCGCGGGACCATCTAAAAGTG ATAGCCGAAGCCATCnTCAAACTCGGACCATGCGGTCCAAGTTGTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAGGTGTTATCCCCCGCTrCTGGGCA

GGTnCCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCACTCAAATGTAAATCATGATGCAAGCACCAATCAATACCAGAGTTCGTTCGACTTGCATGT

ATTAGGCACGCC6CCAGCGTTCGTCCTGAGCCATGATCAAACTCTA

SEQ ID NO: 75

S12KG422 RP2

ACTTAGGCGGCTGGTTCCTAAMGGTTACCCCACCGACTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAA

CGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGCTTTA

AGAGATTAGCTTACTCTCGCGAGTTCGCAACrCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACG

TCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACCAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTGATAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGG

GACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTATCCATGTCCCCGAAG6GAACGTCTAATCTCTTAGATTTGC

ATAGTATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTT

TCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCG6AAACCCTCCA

NCIMB 42011 GGDK161b-L. reuteri (muestra 11a) r0271l

SEQ ID NO: 76

S12KG441 27F

TAATACATGCAAGTCGTACGCACTGGCCCAACrGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGACGATGGATCACCAGTGAGTGGCGGACGGGTGAGT

AACACGTAGGTAACCTGCCCCGGAGCGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACAAAAGCCACATGGCTTTTGTTTGA

AAGATGGCTTTGGCTATCACTCTGGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAG

TTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGAACTGAGACACGGTCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCC

TGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTGGAGAAGAACGTGCGTGAGAGTAACTGTTCACGCA

GTGACGGTATCCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTGATCCGGATTTATTGGGCG

TAAAGCGAGCGCAGGCGGTTGCTTAGGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGAAGAAGTGCATCGGAGACGGGCGACTTGAGTGCA

SEQ ID NO: 77

S12KG442 519F

™TCCG6ATTTATTGGGCGTAAAGCGACCGCAGGCGGTT6CTTAG6TCTGATGTGAAASCCTTCGGCTTAACCGAAGAAGTGCATCGGAAAC

CGGGCGACTTGAGTGCAGAA6AG6ACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGT6GMTGCGTAGATATAT6GAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGG

CTGTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGMCAGGATTAGATACCCrGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCT

AGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTAC6ACCGCAAGGTTGAAACGCAAAGGA

ATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCrTGCGCTAACCTT

ANMGGCGTCCCCTTCGGGGACTCAATGACAGGTGGTGCATGGTT

5

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GGT6GAGCATGTGGTTTAATTC6AAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTr6CQCTAACCTTA6AGATÁAGGCGiTTCCCTTC6GG

GACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTrGGGTrMGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTACTAGTTG

CCAGCATTAAGTTGGGCACrCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAGATCATCATGCCCCTTATGACCrG

GGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCAAGCTCGCGAGAGTAAGCrAATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGACTGTAGG

ctgcaactcgcctacacgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtc

ACACCATGGGAGTTTGTAACGCCCAAAGTCGGTGGCCTAACCnTATGGAGGGAGCCGCCTAAGGCGGGACAGATGACTGGGGTGAAGTCGT

AACAAGGTAG

SEQ ID NO: 79

S12KG444 926R Sin resultado SEQ ID NO: 80

S12KG445 519R

GTGACmaGGTTGGATACCGTCACrGCGTGMCAGTTACTCTCACGCACGTTCTTCTCCAACAACAGAGCmACGAGCCGAAACCCTTCTTC

ACTCACGCGGTGTTGCTCCATCAGGOTGCGCCCAWGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTATGGACCGTGTCTCAGTTCCATT

GTGGCCGATCAGTCTCTCAACTCGGCTATGCATCATCGCCTTGGTAAGCCGTTACCTTACCAACTAGCTAATGCACCGCAGGTCCATCCCAGAGT

GATAGCCAAAGCCATCTTTCAAACAAAAGCCATGTGGCTTTrGTrGTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCMATGTTATCCCCCGCTCCGGGGC

AGGTTACCTACGTGTTACTCACCCGTCCGCCACTCACTGGTAATCCATCGTCAATCAGGTGCAAGCACCATCAATCAGTTGGGCCAGTGCGTAC

GACTTGCATGTATTAGGCACACCGCCGGCGTTCATCCTGAGCCA

SEQ ID NO: 81

S12KG446 RP2

CTCCCTCCATAAAGGTrAGGCCACCGACTTTGGGCGTTACAAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACC

GCGGCATGCTGATCCGCGATrACTAGCGATTCCGACTTCGTGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAGTCCGAACTGAGAACGGCTTTÁAGAGATTAG

CTrACrCTCGCGAGCTTGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATCTGACGTCGTCCCCA

CGTCCrCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACrAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACrAGTAACAAGGGTrGCGCTCGTTGCGGGACTTAACC

CAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTCATTGCGTCCCCGAAGGGAACGCCTTATCTCTAAGGTTAGCGCAAGATGT

CAAGACCrGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCrCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTG

GCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTCCGGCACTGAAGGGCGGAA

NCIMB 42012 GGDK266c-L. reuteri (muestra 1a)

102721

SEQ ID NO: 82

S12KG381 27F

5

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GTGTGCCTAATACATGCAAGTCGTACGCACTGGCCCAACTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGACGATGGATCACCAGTGAGTGGCGGACG

GGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCCGGAGCGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACAAAAGCCACATGGCTTT

TGTTTGAAAGATGGCTTTGGCTATCACTCTGGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGATGATGCAT

AGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGAACTGAGACACGGTCCATACrCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGC

GCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTGGAGAAGAACGTGCGTGAGAGTAACTGT

TCACGCAGTGACGGTATCCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATrTAT

TGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGC6G1TGCTTAGGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACCGGGCGACTTGAG

TGC

SEQ ID NO: 83

S12KG382 519F

TTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTT6CTTAGGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGAAGAAGTGCATCGGAAAC

CG66CAACTTGAGTGCAGAAGA6GACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGT6GCGAAGGCGG

AGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCrAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGA

ATT6ACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAG€TACGCGAA6AACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCrAACCTT

AGAGATAAGGCGTCCCTTCGGGGACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACG

AGCGCAACCCTTGTTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCA

SEQ ID NO: 84

S12KG383 926F

GGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCTAACCTTAGAGATAAGGCGTTCCCTTCGGG

GACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTrGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTACTAGTTG

CCAGCATTAAGTTGGGCACrCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAGATCATCATGCCCCTTATGACCTG

GGCTACACACGTGCTACAATGGACG6TACAACGAGTCGCAAGCTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGACTGTAGG

ACACCATGGGAGTTTGTAACGCCCAAAGTCGGTGGCCTAACCATTATGGAGGGAGCCGCCTAAGGCGGGACAGATGACTGGGGTGAAGTCGT

AACAAGGTAGCCGTA

SEQ ID NO: 85

S12KG384 926R

TACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTGAGCTCCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTA

CCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCmCGAGCCTCAGCGTCAGTTGCAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATAT

ATCTACGCATTCCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCGCCCGGTrTCCGATGCACTTCTTCGGTTAAGCCGAAGG

CTrrCACATCAGACCTAAGCAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCA

CGTAGTTAGCCGTGACnTCTGGTTGGATACCGTCACTGCGTGAACAGTTACTCTCACGCACGTTCTTCTCCAACAACAGAGCTTTACGAGCCGA

AACCCTTCnCACTCACGCGGTGTTGCTCCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTATGGACCGTGTC

TCAGTTCCATTGTGGCCGATCAGTCTCTCAACTCGGCTATGCATCATCGCCTTGGTAAGCCGTTACCTTACCAACTAGCTAATGCACCGCAGGTC

CATCCCAGAGTGATAGCCAAAGCCATCTTTCAAACAAAAGCC

SEQ ID NO: 86

S12KG385 519R

5

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GTGACTTTCTGGTTGGATACCGTCACTGCGTGAACAGTTACTCTCACGCACGTGCrrCTCCAACAACAGAGCTTTACGAGCCGAAACCCrTCTTC

ACTCACGCGGTGirGCTCCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGGMGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTATGGACCGTGTCTCAGTTCCATT

GTGGCCGATCAGTCTCTCAACTCGGCTATGCATCATCGCCTTGGTAAGCCGTTACCTTACCAACrAGCTAATGCACCGCAGGTCCATCCCAGAGT

GATAGCCAAAGCCATCTTTCAAACAAAAGCCATGTGGCmTGTrGTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAAATGTTATCCCCCGCTCCGGGGC

GACTTGCATGTATTAGGCACACCGCCGGCGTTCATCCTGAGCCATGATCAAAC

SEQ ID NO: 87

S12KG386 RP2

TCCCGCACTTAGGCGGCTCCCTCCATAATGGTTAGGCCACCGACTTTGGGCGTTACAAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCC

GGCTTTAAGAGATTAGCTTACTCTCGCGAGCTTGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGA

TCIGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACTAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTAGTAACAAGGGTTGCGCTCG

TTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTCATTGCGTCCCCGAAGGGAACGCCTTATCTCTAAG

GTTAGCGCAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCT

rTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCrCCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCACT

CATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCC

REFERENCIAS

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Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Reivindicaciones

1. Una cepa bacteriana de ácido láctico porcino que se selecciona de:

(i) NCIMB 41846;

(ii) NCIMB 41847;

(iii) NCIMB 41848;

(iv) NCIMB 41849;

(v) NCIMB 41850;

(vi) NCIMB 42008;

(vii) NCIMB 42009;

(viii) NCIMB 42010;

(ix) NCIMB 42011;

(x) NCIMB 42012;

y cualquier combinación de dos o más de los mismos.
2. Una composición que comprende uno o más de ácido láctico las cepas bacterianas según la reivindicación 1 y un excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente.
3. Una composición probiótica que comprende una o más cepas bacterianas de ácido láctico según la reivindicación 1.
4. Una o más cepas bacterianas del ácido láctico de acuerdo con la reivindicación 1 para uso en medicina.
5. Una o más cepas bacterianas de ácido láctico para su uso según la reivindicación 4, en que una o más cepas bacterianas de ácido láctico son para su uso en la mejora de la microbiota intestinal, y en que una o más cepas bacterianas de ácido láctico exhiben actividad antimicrobiana contra E. coli y/o S. enteritidis.
6. Una o más cepas bacterianas de ácido láctico según la reivindicación 1 para uso en el tratamiento de un trastorno intestinal en un sujeto.
7. Una o más cepas bacterianas de ácido láctico para uso de acuerdo con la reivindicación 6, en que el sujeto es un mamífero, preferiblemente un humano.
8. Una o más cepas bacterianas del ácido láctico para uso de acuerdo con la reivindicación 6, en que el trastorno intestinal es la salmonelosis, síndrome del intestino irritable (IBS), trastorno intestinal inflamatorio (IBD), dispepsia funcional, estreñimiento funcional, diarrea funcional (incluyendo diarrea asociada a antibióticos, diarrea de viajero y diarrea pediátrica), dolor abdominal funcional, distensión funcional, síndrome de dolor epigástrico, síndrome de dificultad postprandial, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enterocolitis necrotizante, y combinaciones de los mismos.
9. Un pienso que comprende una o más cepas bacterianas de acuerdo con la reivindicación 1.
10. Un producto alimenticio que comprende una o más cepas bacterianas de acuerdo con la reivindicación 1.
11. Un suplemento dietético que comprende una o más cepas bacterianas de acuerdo con la reivindicación 1.
12. Un aditivo alimentario que comprende una o más cepas bacterianas de acuerdo con la reivindicación 1.
13. Un proceso para producir un probiótico, comprendiendo dicho proceso el cultivo de una cepa bacteriana de acuerdo con la reivindicación 1