ES2656509T3 - Dispositivo de guiado de la migración celular y método de guiado que emplea dicho dispositivo - Google Patents
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Abstract
Dispositivo de guiado de la migración celular que comprende un sustrato que presenta una superficie texturizada concebida para ser puesta en contacto con células, teniendo dicha superficie texturizada una estructura tridimensional anisótropa constituida por una red de proyecciones inclinadas con respecto a la normal al plano constituido por dicha superficie texturizada, en la dirección conferida por dicha estructura anisótropa.
Description
concretamente mediante litografía óptica autoalineada,
ii. el moldeo del material que constituye dicha estructura tridimensional,
iii. el desprendimiento del molde de silicona.
5 En particular, pueden prepararse moldes de silicona (PDMS) mediante litografía óptica autoalineada, que comprende concretamente las etapas siguientes:
i. el depósito, de una capa de resina fotosensible sobre una máscara óptica,
ii. la irradiación de dicha capa de resina a través de la máscara óptica mediante una fuente de luz, con un ángulo incidente (que corresponde al ángulo formado por el rayo incidente y la normal al plano constituido por la máscara), condicionando dicho ángulo incidente el ángulo de inclinación de los pilares de la estructura tridimensional anisótropa,
iii. opcionalmente, el recubrimiento de dicha superficie tridimensional de resina con un material antiadherente,
iv. el vertido de una capa de PDMS sobre dicha superficie tridimensional de resina para obtener dichos moldes 15 de silicona (PDMS),
v. después de la polimerización, desprendimiento del molde de PDMS obtenido de este modo (figura 4 (H))
La máscara óptica utilizada en la etapa i. puede ser un sustrato transparente utilizado habitualmente para las máscaras ópticas, como por ejemplo una placa de vidrio, en el que se realizan patrones que constituyen la máscara de un material metálico que absorbe la luz, por ejemplo cromo. Estas máscaras son clásicas para la fotolitografía y están disponibles en el mercado o pueden producirse mediante métodos conocidos por el experto en la materia.
El experto en la materia puede, por ejemplo, producir una máscara óptica depositando una capa metálica que absorbe la luz (concretamente cromo) sobre un sustrato transparente tal como una placa de vidrio y formando
25 patrones (por ejemplo una matriz de agujeros) en dicha capa metálica, por ejemplo mediante grabado con una solución que graba el cromo como ChromeEtch, comercializada por MicroChem.
Para ello, se forman patrones mediante barrido de un haz láser enfocado sobre una capa de resina fotosensible depositada sobre el sustrato transparente (placa de vidrio) recubierto previamente por una capa de cromo. Después de la revelación de la resina, se transfieren estos motivos sobre la capa de cromo sumergiendo el sustrato de vidrio en un baño de ChromeEtch. Para acabar, los patrones de resina que han servido de máscara se eliminan con ayuda de un disolvente adaptado. Un máscara virgen de tipo PR-AZ1518 Cr (placa de vidrio cubierta de una capa fina de cromo y de una capa de resina), comercializada par Micro Chem, puede utilizarse, por ejemplo, para la producción de máscaras ópticas.
35 En la etapa i, el espesor de la capa de resina aplicada se selecciona concretamente según la altura de los pilares deseada. La resina es, por ejemplo, una resina epoxi SU-8 3000 comercializada por la compañía Micro-Chem.
Una vez reticulada la resina en la etapa ii, se puede eliminar preferentemente, con ayuda de un disolvente apropiado, la parte de la resina que no ha sido irradiada.
El ángulo seleccionado para la irradiación en la etapa ii define el ángulo de inclinación de las proyecciones con respecto a la normal al plano constituido por dicha superficie texturizada (figura 4 (E)). Estando la luz refractada en el sustrato transparente utilizado, el ángulo de los pilares no es siempre exactamente el ángulo de la luz; esto depende
45 de la naturaleza del material que constituye el sustrato. El experto en la materia ajustará, por lo tanto, el ángulo incidente en función del sustrato utilizado para obtener la inclinación de los pilares deseada.
El ángulo seleccionado para la irradiación en la etapa ii puede ser concretamente inferior a 90°, preferentemente inferior a 45°, y más preferentemente comprendido entre 10° y 45°.
El material antiadherente opcionalmente añadido en la etapa iii puede ser, por ejemplo, trimetilclorosilano (TMCS).
Para terminar, sobre la base de los moldes de PDMS obtenidos de este modo, la superficie tridimensional anisótropa según la invención se realiza mediante moldeo de un material (PDMS o PLGA) que constituye dicha estructura
55 tridimensional según la invención, por ejemplo mediante vertido de un polímero siliconado sobre el molde de silicona previamente puesto al vacío, o mediante moldeo térmico en el caso de un copolímero de ácido poli(láctico-coglicólico) (PLGA).
Después del endurecimiento del material que constituye la superficie tridimensional, el molde de PDMS se separa de la muestra de superficie tridimensional que presenta, de este modo, una red de proyecciones inclinadas con respecto a la normal al plano constituido por dicha superficie texturizada, en la dirección conferida por dicha estructura anisótropa (figura 4 (J)).
Cuando la superficie tridimensional anisótropa según la invención se realiza mediante moldeo térmico de un 65 copolímero de PLGA, dicho moldeo se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 80 y 100 °C (preferentemente de 60 a 90 °C, y más preferentemente aproximadamente 90 °C), y a una presión comprendida
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tridimensional anisótropa constituida por una red de proyecciones inclinadas con respecto a la normal al plano constituido por dicha superficie texturizada, en la dirección conferida por dicha estructura anisótropa, para su utilización en un método de guiado de la migración celular.
5 Aplicaciones
El dispositivo según la invención puede encontrar concretamente numerosas aplicaciones de guiado de la migración de células in vivo o in vitro.
Se entiende por guiado in vitro, el guiado de la migración de células en cultivo en un medio completamente artificial.
Las células pueden cultivarse, por ejemplo, sobre una superficie de soporte artificial tal como una superficie de cultivo celular (por ejemplo un gel), aplicándose entonces la superficie texturizada sobre la superficie de soporte para confinar las células.
15 En otra realización, la superficie texturizada puede estar integrada en una de las caras de un canal microfluídico para guiar la migración de células en dicho canal microfluídico.
Las superficies texturizadas del dispositivo según la invención pueden utilizarse, bien para el estudio de los mecanismos biológicos y físicos de migración y de proliferación de las células en cultivo, o bien para realizar la clasificación celular separando las células según sus características de migración.
Como alternativa, el dispositivo según la invención puede permitir guiar células sobre soportes bidimensionales o tridimensionales cubiertos al menos parcialmente por una superficie de guiado texturizada para la producción de 25 órganos artificiales (ingeniería tisular).
El dispositivo según la invención puede encontrar aplicación en cualquier dominio que necesita guiar las células artificialmente e independientemente de su comportamiento quimiotáctico.
Se entiende por guiado in vivo el guiado de la proliferación y de la migración de células en un ser vivo, por ejemplo en el ser humano.
En este caso, la superficie de soporte está constituida por el soporte fisiológico natural de las células sobre el que se aplica la superficie texturizada.
35 Según una realización preferida de guiado in vivo, la superficie texturizada puede utilizarse para guiar las células presentes en la superficie de una herida para favorecer la distribución de las células en la herida. El dispositivo es, entonces, un apósito que presenta microestructuras o nanoestructuras en su superficie.
Según otra realización de guiado in vivo, la superficie texturizada puede utilizarse para guiar las células alrededor de una prótesis para favorecer la distribución de las células alrededor de la prótesis.
Según aún otra realización de guiado in vivo, la superficie texturizada puede utilizarse para guiar las células alrededor de una película o de un apósito interno colocado en el interior del cuerpo de un ser vivo para favorecer la 45 distribución de las células en o alrededor de un órgano.
El dispositivo según la invención puede presentarse, concretamente, en forma de un apósito, de un implante, de una prótesis, de un soporte de tejidos artificiales, de un canal microfluídico, de un laboratorio en chip que integra canales y, preferentemente, dicho dispositivo es un apósito.
El efecto de guiado de la migración celular del dispositivo según la invención se ha establecido en cultivos celulares de fibroblastos normales de piel humanos (NHDF) en laboratorio.
55 Se cubrieron cultivos celulares de NHDF con una superficie de silicona (polidimetilsiloxano PDMS) tapizada con una red cuadrada de cilindros inclinados. La red de cilindros inclinados presenta las siguientes propiedades: 4 µm de periodo, 1,5 µm de diámetro, 5 µm de altura y presentando una inclinación de 40° con respecto a la normal al plano constituido por dicha superficie (véase la figura 2).
La red de cilindros inclinados se preparó mediante vertido de un polímero de silicona PDMS sobre un molde de silicona (PDMS), como se ilustra en la figura 4.
Los moldes de silicona (PDMS) se prepararon a partir de un molde realizado mediante litografía óptica autoalineada. 65 Para ello, una máscara óptica constituida por una placa de vidrio recubierta por una capa fina de cromo y por una
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