ES2656852T3 - Ensayo de liberación de neuropéptidos para canales de sodio - Google Patents

Ensayo de liberación de neuropéptidos para canales de sodio Download PDF

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ES2656852T3 ES12198404.1T ES12198404T ES2656852T3 ES 2656852 T3 ES2656852 T3 ES 2656852T3 ES 12198404 T ES12198404 T ES 12198404T ES 2656852 T3 ES2656852 T3 ES 2656852T3
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Abstract

Un kit que comprende un antagonista de NaV1.7, una célula neuronal no humana que comprende en un locus de NaV1.7 endógeno, una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína NaV1.7 humana o quimérica o una variante de dicha proteína con hasta 20 diferencias en la secuencia de aminoácidos, y uno o más mediadores seleccionados de prostaglandina E2, bradiquinina, capsaicina, protones, y un factor neurotrófico.

Description

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DESCRIPCION
Ensayo de liberación de neuropéptidos para canales de sodio Campo de la invención
Se describen animales no humanos genéticamente modificados que expresan canales de sodio dependientes de voltaje (Nay) humanos o fragmentos de estos, en particular Nav1.7 (Scn9A). Se describen ratones genéticamente modificados útiles para la identificación y prueba de antagonistas para tratar estados de dolor crónico o trastornos que se asocian con una actividad y/o función aberrante de Nav1.7. Se describen métodos para generar animales no humanos genéticamente modificados que expresan la proteína Nav1.7 humana, y, alternativamente, que expresan una proteína Nav1.7 parcialmente humana. Se describen animales no humanos que no expresan una proteína Nav1.7 endógena.
Antecedentes de la invención
Los canales de sodio son proteínas de membrana integrales que forman canales iónicos en la membrana plasmática de las células excitables. Se clasifican como canales de sodio dependientes de voltaje (Nav), que permiten el influjo de iones Na+ que media los potenciales de acción en las células excitables; y canales de sodio dependientes de ligando, que se unen a un ligando que desencadena el influjo de iones que conduce a potenciales de acción similares.
Los canales Nav, al igual que los canales de calcio y potasio, se componen de una subunidad a muy grande y compleja en la superficie de la célula que incluye cuatro dominios (DI-Div), cada uno con seis segmentos de a-hélice de transmembrana (S1-S6) e incluye un poro que permite el influjo de los iones Na+ a la célula (Fig. 1; ver, además, Clare 2010 Expert Opin. Investig. Drugs 19(1): 45-62). Para los canales Nav, un solo gen codifica todos estos dominios. El segmento de transmembrana 4 (S4) dentro de cada dominio de los canales Nav contiene aminoácidos cargados positivamente (Fig. 1) que actúan como un sensor de voltaje. El bucle intracelular que conecta los dominios III y iv contiene secuencias que, según los informes, participan en la inactivación. Los canales Nav interactúan con otras proteínas en la superficie celular que se denominan subunidades p, que participan en las funciones de activación dependientes del voltaje y la cinética del canal. Los canales Nav presentan, según los informes, diversas propiedades funcionales y patrones de expresión distintos, que implican funciones especializadas entre los canales y predisponen a algunos a funciones en la transmisión de señales específicas, por ejemplo, señales de dolor.
A pesar de muchos esfuerzos para dilucidar las propiedades y funciones de los canales Nav humanos, el tamaño grande y la naturaleza compleja de su estructura dificulta el estudio de los aspectos globales de su actividad biológica y de su participación en la respuesta al dolor. Esta dificultad aumenta por el hecho de que la eliminación global es letal; las crías Scn9A-l~ mueren poco después del nacimiento, aparentemente, debido a su incapacidad de alimentarse. Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de composiciones y métodos que complementen y potencien los sistemas in vitro actuales (por ejemplo, células transfectadas in vitro que contienen construcciones que expresan canales Nav humanos en cultivo) mediante el empleo de enfoques más sensibles biológicamente para la generación de animales y células no humanas que incluyan canales Nav humanos completos o canales Nav quiméricos que contengan fragmentos humanos específicos que se asocian con la activación de los canales Nav y que puedan funcionar para facilitar la respuesta al dolor.
La patente núm. WO 2010/087864 describe métodos de ensayo que emplean un antagonista de Nav1.7 y células que expresan una proteína Nav1.7 humana o quimérica y su uso en ensayos de tamizaje de alto rendimiento. La patente núm. WO 2007/109324 describe la relación entre las mutaciones en Nav1.7 y la indiferencia congénita al dolor en humanos, así como métodos para identificar inhibidores de moléculas pequeñas de polinucleótidos y polipéptidos de Nav17.
Breve descripción de la invención
La invención se define por las reivindicaciones adjuntas.
Se describen células, tejidos y animales no humanos genéticamente modificados que expresan una subunidad a de Nav humana, o un fragmento funcional de esta, en la superficie de una célula. En diversas modalidades, la subunidad a de Nav es una subunidad a de Nav1.7.
En un aspecto, se describen animales no humanos genéticamente modificados que expresan una subunidad a de Nav1.7 en la superficie de una célula y proporcionan un sistema in vivo para identificar antagonistas del canal, e identificar agentes terapéuticos para el tratamiento de trastornos o síndromes de dolor, tales como, por ejemplo, dolor crónico, eritromelalgia (IEM) y trastorno de dolor extremo paroxístico (PEPD).
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En un aspecto, se describen animales no humanos genéticamente modificados que expresan una subunidad a de Navl .7 en la superficie de una célula y proporcionan un sistema para probar selectivamente la eficacia y toxicidad de un producto terapéutico en formas mutantes o variantes de la NaV1.7 humana. El agente terapéutico puede ser un compuesto que funciona como un bloqueador de canales de sodio. En una modalidad específica, el compuesto es un compuesto sintético. El compuesto sintético puede seleccionarse de lidocaína, mexiletina, carbamazepina, amitriptilina y bifenilpirazoles, o una combinación de estos. El compuesto puede ser una toxina. La toxina puede seleccionarse de tetrodotoxina y neosaxitosina o una combinación de estas.
Además, se describen animales no humanos genéticamente modificados que expresan una subunidad a de NaV1.7 en la superficie de una célula y proporcionan un sistema para probar selectivamente la funcionalidad (por ejemplo, eficacia) y/o toxicidad de combinaciones de agentes terapéuticos en formas mutantes o variantes de una NaV1.7 humana. La combinación de agentes terapéuticos puede comprender proporcionar un efecto sinérgico después de la administración al animal no humano genéticamente modificado. La combinación de agentes terapéuticos puede comprender al menos dos de un compuesto sintético, una toxina natural, o una proteína (por ejemplo, un anticuerpo anti-NaV).
En un aspecto, se describen ratones genéticamente modificados que expresan una proteína canal NaV humana, específicamente, una subunidad a de NaV1.7 humana. Los ratones se modifican genéticamente para incluir el gen de NaV1.7 humano completo o sustancialmente completo.
El gen de NaV1.7 humano puede reemplazar un gen de NaV1.7 endógeno de ratón en el locus de NaV1.7 endógeno de ratón.
En un aspecto, se describen ratones genéticamente modificados que expresan una subunidad a de NaV1.7 quimérica, en donde los ratones incluyen una subunidad a de NaV1.7 de ratón modificada con uno o más bucles extracelulares del poro que contienen una secuencia correspondiente de un gen de NaV17 humano.
La subunidad a de NaV1.7 quimérica puede comprender un bucle extracelular del poro que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio I que comprende la secuencia correspondiente del gen de NaV1.7 humano. La subunidad a de NaV1.7 quimérica puede comprender un bucle extracelular del poro que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio III que comprende la secuencia correspondiente del gen de NaV1.7 humano.
En un aspecto, se describe un ratón genéticamente modificado que comprende sustancialmente todo el ADN genómico humano que codifica una proteína NaV1.7. En otro aspecto, el ratón genéticamente modificado comprende una porción de ADN genómico humano, y el ratón expresa una proteína NaV1.7 quimérica.
La porción de ADN genómico humano puede comprender una secuencia humana que codifica el bucle extracelular del poro que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio I del gen de NaV1.7 humano. La porción de ADN genómico humano puede comprender una secuencia humana que codifica el bucle extracelular del poro que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio III del gen de NaV1.7 humano.
En un aspecto, se describe un ratón genéticamente modificado que es capaz de expresar una proteína NaV17 quimérica o humana en la superficie de una célula del ratón.
La NaV1.7 puede ser quimérica y comprender un bucle extracelular del poro humano. El bucle extracelular del poro humano puede ser el bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio I. El bucle extracelular del poro humano puede ser, además, el bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio III.
La célula puede ser una célula excitable. La célula puede ser una célula no excitable. La célula puede ser una neurona. La célula puede ser una neurona de los ganglios de las raíces dorsales (GRD). La célula puede ser una neurona ganglionar simpática.
El gen de NaV1.7 humano o quimérico puede unirse operativamente a una secuencia líder humana o de ratón. La secuencia líder puede ser una secuencia líder de ratón.
El gen de NaV1.7 humano o quimérico puede unirse operativamente a un promotor humano o de ratón. El promotor puede ser un promotor del gen de NaV1.7 endógeno de ratón.
El ratón genéticamente modificado puede comprender un locus del gen de NaV1.7 humano que codifica una proteína NaV1.7 humana. El ratón genéticamente modificado puede comprender un locus del gen de NaV1.7 quimérico que comprende una secuencia humana que codifica un bucle extracelular del poro que es sustancialmente humano. La secuencia humana puede codificar un bucle extracelular del poro que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio I de la proteína NaV1.7 quimérica. La secuencia humana puede codificar, además, un bucle extracelular del poro que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio III de la proteína NaV1.7 quimérica.
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El locus del gen de Nav1.7 puede comprender un fragmento genómico humano que comprende aproximadamente 113 kb de ADN que codifica una proteína NaV1.7 humana. El locus del gen de NaV1.7 puede comprender los exones del 2 al 28 del gen de NaV1.7 humano.
El locus del gen de NaV1.7 puede comprender una secuencia de ácido nucleico de un locus del gen de Nav1.7 humano que comprende aproximadamente 10 kb de ADN que codifica un bucle extracelular del poro de una proteína NaV1.7. La secuencia de ácido nucleico puede comprender los exones del 7 al 9 de un gen de NaV1.7 humano. El bucle extracelular del poro puede ser el bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio I de una proteína NaV1.7 humana.
El locus del gen de NaV1.7 puede comprender una secuencia de ácido nucleico genómica humana que comprende aproximadamente 2.8 kb de ADN que codifica un bucle extracelular del poro de una proteína NaV1.7 humana. La secuencia de ácido nucleico genómica humana puede comprender los exones del 23 al 25 de un gen de NaV1.7 humano. El bucle extracelular del poro puede ser el bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio III de una proteína NaV1.7 humana.
El ratón genéticamente modificado puede ser capaz de expresar una proteína NaV1.7 completamente humana. El ratón genéticamente modificado puede ser capaz de expresar una proteína NaV1.7 parcialmente humana. El ratón genéticamente modificado puede ser capaz de expresar una proteína NaV1.7 quimérica que comprende una secuencia extracelular de una proteína NaV1.7 humana.
La proteína NaV1.7 parcialmente humana puede comprender un bucle extracelular del poro que contiene una secuencia humana. El bucle extracelular del poro puede seleccionarse del grupo que consiste en el bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio I, y el bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio III. El bucle extracelular del poro humano puede ser el bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio I. El bucle extracelular del poro humano puede ser, además, el bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio III.
El ratón puede comprender una célula que expresa una proteína NaV1.7 humana. El ratón puede comprender una célula que expresa una proteína NaV1.7 quimérica que comprende uno o más bucles extracelulares del poro humanos. Los bucles extracelulares del poro humanos pueden seleccionarse del grupo que consiste en el bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio I, el bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio III, y una combinación de estos. El bucle extracelular del poro humano puede ser el bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio I. El bucle extracelular del poro humano puede ser, además, el bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio III. La célula puede ser una célula excitable. La célula puede ser, además, una célula no excitable. La célula puede ser una neurona. La neurona puede ser una neurona de GRD. La neurona puede ser una neurona ganglionar simpática.
El ratón puede comprender una combinación de una o más modalidades y/o aspectos descritos en esta descripción.
El ratón genéticamente modificado puede ser una cepa C57BL, por ejemplo, seleccionada de C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn,
C57BL/10Cr, C57BL/Ola. El ratón genéticamente modificado puede ser una mezcla de una cepa 129 mencionada anteriormente y una C57BL/6 mencionada anteriormente. El ratón puede ser, además, una mezcla de las cepas 129 mencionadas anteriormente, o una mezcla de las cepas BL/6 mencionadas anteriormente. La cepa 129 de la mezcla puede ser una cepa 129S6 (129/SvEvTac).
En un aspecto, se describe una célula de ratón que se aísla de un ratón como se describe en la presente descripción. La célula puede ser una célula ES. La célula puede ser una célula excitable. La célula puede ser, además, una célula no excitable. La célula puede ser una neurona. La neurona puede ser una neurona de GRD. La neurona puede ser, además, una neurona ganglionar simpática.
En un aspecto, se describe una célula; en donde la célula porta una proteína NaV1.7 que comprende una secuencia humana correspondiente a un bucle extracelular del poro de la proteína canal NaV1.7.
La célula puede ser una célula neuronal. La célula puede seleccionarse de una célula de los ganglios de las raíces dorsales (GRD), una célula ganglionar del trigémino y una neurona ganglionar simpática. La célula puede ser una célula de GRD que expresa una proteína NaV1.7 que comprende un bucle humano que se selecciona del bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio I, el bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio II, el bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio III, el bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio IV, y una combinación de estos. El bucle humano puede ser el bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio I. El bucle humano puede ser el bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio III.
La célula puede inmortalizarse.
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En un aspecto, se describe un embrión de ratón, en donde el embrión comprende una célula ES donante que se deriva de un ratón como se describe en la presente descripción.
En un aspecto, se describe un vector de transformación, que comprende una secuencia de ácido nucleico genómica humana que contiene un gen de Nay1.7 humano o un fragmento de este y un casete de selección. En un aspecto, se describe un vector de transformación, que comprende una secuencia de ácido nucleico genómica humana de —113 kb que comprende los exones del 2 al 28 de un gen de NaV1.7 humano y un casete de resistencia a higromicina. En otro aspecto, se describe un vector de transformación, que comprende una secuencia de ácido nucleico genómica humana de —10 kb que comprende los exones del 7 al 9 de un gen de NaV1.7 humano y un casete de resistencia a neomicina. En otra descripción, se proporciona un vector de transformación, que comprende una secuencia de ácido nucleico genómica humana de —2.8 kb que comprende los exones del 23 al 25 de un gen de NaV1.7 humano y un casete de resistencia a neomicina.
En un aspecto, se describe una proteína NaV1.7 que se produce por un ratón como se describe en la presente descripción, en donde la proteína NaV1.7 comprende una secuencia humana codificada por un fragmento de un gen de NaV1.7 humano que se selecciona del grupo que consiste en los exones del 2 al 28, exones del 7 al 9 y exones del 23 al 25 de un gen de NaV1.7 humano. En un aspecto, el fragmento del gen de NaV1.7 humano es de los exones del 2 al 28. En otro aspecto, el fragmento del gen de NaV1.7 humano es de los exones del 7 al 9. En otro aspecto, el fragmento humano del gen de NaV1.7 humano es de los exones del 23 al 25.
La proteína NaV1.7 puede reconstituirse en una vesícula. La NaV1.7 puede estar presente en una preparación de vesículas de un ratón como se describe en la presente descripción.
En un aspecto, se describe un método para generar un ratón que expresa una proteína NaV1.7 completamente o parcialmente humanizada en una superficie de una célula excitable, que comprende (a) modificar genéticamente una célula ES de ratón mediante el reemplazo de una o más secuencias de ADN de NaV1.7 de ratón con una o más secuencias de ADN de NaV1.7 humanas para formar una célula ES donante de ratón; (b) introducir la célula ES donante de ratón en un embrión de ratón huésped para formar un embrión modificado; (c) gestar el embrión modificado en un ratón adecuado; y, (d) obtener una cría de ratón que expresa la proteína NaV1.7 completamente o parcialmente humanizada en la superficie de una célula excitable de la cría de ratón.
La una o más secuencias de ADN de NaV1.7 humanas pueden seleccionarse de los exones del 2 al 28 de un gen de NaV1.7 humano, de los exones del 7 al 9 de un gen de NaV1.7 humano y de los exones del 23 al 25 de un gen de NaV1.7 humano.
La una o más secuencias de ADN de NaV1.7 humanas pueden ser una secuencia de ADN Nav1.7 humana completa o sustancialmente completa. La secuencia puede ser de los exones del 2 al 28 de un gen de NaV1.7 humano. La secuencia puede ser, además, de los exones del 7 al 9 de un gen de NaV1.7 humano. La secuencia puede ser, además, de los exones del 23 al 25 de un gen de NaV1.7 humano.
En un aspecto, se describe un ratón que expresa una subunidad a de NaV1.7 humana a partir de un locus de NaV1.7 endógeno de ratón, en donde el ratón expresa una subunidad p de NaV endógena de ratón, y en donde el ratón expresa una proteína NaV endógena que se selecciona del grupo que consiste en NaV1.6, NaV1.8, y NaV1.9.
La subunidad a de NaV1.7 humana puede ser una variante de la subunidad a de NaV1.7, en donde la variante comprende una sustitución de aminoácido que comprende una Q10R, I136V, F216S, S241T, N395K, V400M, L823R, I848T, L858H, L858F, A863P, V872G, F1449V, o una combinación de estas.
La subunidad a de NaV1.7 humana puede ser una variante de la subunidad a de NaV1.7, en donde la variante comprende una sustitución de aminoácido que comprende una R996C, V1298D, V1298F, V1299F, I1461T, F1462V, T1464I, M1627K, A1632E, o una combinación de estas.
La subunidad a de NaV1.7 humana puede ser una variante de la subunidad a de NaV1.7, en donde la variante comprende una sustitución de aminoácido que comprende una F1200L, I1235L, o una combinación de estas.
La subunidad a de NaV1.7 humana puede ser una subunidad a de NaV1.7 truncada, en donde la proteína subunidad a de NaV1.7 termina en un residuo de aminoácido que se selecciona de 259, 277, 328, 459, 693, 767, 830, 897, 1488, 1659 y 1689. La proteína subunidad a de NaV1.7 truncada puede terminar en el residuo de aminoácido 693. La proteína subunidad a de NaV1.7 truncada puede terminar, además, en el residuo de aminoácido 1488.
En un aspecto, se describe un método para generar una línea celular a partir de una célula que expresa una secuencia de NaV1.7 humana, que comprende obtener una célula que expresa un secuencia de NaV1.7 humana a partir de un ratón como se describe en la presente descripción, aislar y clonar la célula, y mantener la célula aislada y clonada en cultivo. El método puede comprender, además, inmortalizar la célula. La célula puede ser una célula neuronal, por ejemplo, una neurona de los ganglios de las raíces dorsales (GRD).
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En un aspecto, se describe un método para generar una línea celular inmortalizada a partir de una célula aislada de un ratón como se describe en la presente descripción, que comprende proporcionar una célula aislada que expresa un canal NaV1.7 humano, variante de humano o quimérico, transfectar la célula aislada con un vector que codifica un oncogén y un marcador de selección (por ejemplo, neomicina), cultivar las células en cultivo bajo selección para permitir la expansión de las células que se transfectaron con el vector retroviral, seleccionar una célula transfectada del cultivo que contiene el vector, aislar las células que contienen el vector mediante tripsinización y dilución limitante de la célula transfectada en cultivo, y crear una línea celular clonal a partir del clon aislado que sobrevive a la selección al pasar a un nuevo cultivo.
La célula aislada puede ser una neurona. La célula aislada puede ser una neurona de GRD.
El canal NaV1.7 humano puede codificarse por los exones 2 - 28 de un gen de NaV1.7 humano. El canal NaV1.7 quimérico puede codificarse por una secuencia genómica que comprende una secuencia de un gen de NaV1.7 humano que codifica una secuencia extracelular de un gen de NaV1.7 humano.
La secuencia extracelular puede codificar una secuencia de bucle del poro. La secuencia de bucle del poro puede seleccionarse de un bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio I y un bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio III. El bucle del poro puede ser el bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio I. El bucle del poro puede ser, además, el bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio III.
En un aspecto, se describe un método para identificar un antagonista de una proteína NaV1.7 humana, que comprende exponer un ratón como se describe en la presente descripción a un supuesto antagonista de la NaV1.7 humana, y determinar un efecto del antagonista en la función de la NaV1.7 en el ratón.
La determinación del efecto del antagonista puede comprender medir la presencia o ausencia de un potencial de acción tras la estimulación de una célula que comprende la NaV1.7 humana.
El antagonista puede ser específico para NaV1.7 y no presentar actividad antagonista con respecto a NaV1.6, NaV1.8, y NaV1.9.
En un aspecto, se describe un método para determinar la actividad de unión de un agente terapéutico que se une a una secuencia de NaV1.7 humana, que comprende poner en contacto el agente terapéutico con una célula que expresa una secuencia de NaV1.7 humana, y determinar si el agente terapéutico se une a la secuencia de NaV1.7 humana. La célula puede derivarse de un ratón como se describe en la presente descripción.
La célula puede ser una célula neuronal. La célula puede seleccionarse de una célula de los ganglios de las raíces dorsales (GRD), una célula ganglionar del trigémino y una neurona ganglionar simpática. La célula puede ser una célula de GRD que expresa una proteína NaV1.7 que comprende un bucle humano que se selecciona del bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio I, el bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio II, el bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio III, el bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio IV, y una combinación de estos. El bucle humano puede ser el bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio I. El bucle humano puede ser el bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio III.
La célula puede inmortalizarse.
El agente terapéutico puede unirse a una NaV1.7 humana pero no se une a una secuencia de NaV1.7 que se selecciona de un ratón, rata, mono y una combinación de estos.
El agente terapéutico que se une a la secuencia de NaV1.7 humana puede seleccionarse de una benzodiazepina, una benzazepinona, una tetrodotoxina, una bifenilpirazol dicarboxamida, un bloqueador de canales de sodio (por ejemplo, amitriptilina, mexiletina, lidocaína, carbamazepina, bifenilpirazoles), un antagonista del tipo T de piperidina (por ejemplo, Z123212), y análogos de estos.
El agente terapéutico que se une a la secuencia de NaV1.7 humana puede seleccionarse de una proteína de unión que comprende una VH y/o VL de inmunoglobulina o un fragmento de unión a NaV1.7 de esta, un anticuerpo, un anticuerpo biespecífico, una inmunoadhesina, un cuerpo ligando, un pepticuerpo y un anticuerpo de dominio (por ejemplo, dAb). En una modalidad específica, el agente terapéutico comprende una región variable de un receptor de células T o de una inmunoglobulina humana. En una modalidad específica, el agente terapéutico es un anticuerpo humano.
En un aspecto, se describe un sistema in vitro para identificar un antagonista de una proteína NaV1.7 humana, que comprende aislar un componente que contiene la NaV1.7 de un ratón como se describe en la presente descripción, exponer el componente a un supuesto antagonista de la NaV1.7 humana, y determinar un efecto del antagonista en la función de NaV1.7. El componente que contiene la NaV1.7 puede ser una fracción de membrana. El componente
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que contiene la Nav1.7 puede ser una célula. El componente que contiene la Nav1.7 puede ser un tejido del ratón.
La determinación del efecto puede comprender medir la presencia o ausencia de una respuesta dependiente de NaV1.7 en una célula derivada de un ratón como se describe en esta descripción. La respuesta puede ser un potencial de acción.
En un aspecto, se describe un método para identificar un modulador del canal NaV1.7 humano, quimérico o variante, que comprende exponer un ratón como se describe en la presente descripción a un compuesto de prueba y detectar la actividad o inactividad del canal NaV1.7. El método puede comprender el ensayo de compuestos de prueba que modulan el flujo de iones de sodio del canal NaV1.7. El método puede comprender el empleo de la tecnología de fijación de membranas. El método puede usarse para identificar compuestos fisiológicamente activos útiles para el tratamiento de una afección por enfermedad del cerebro. La afección por enfermedad del cerebro puede seleccionarse de convulsiones, ataques, trastornos de pánico, trastornos de hiperactividad, depresión, trastornos obsesivos compulsivos, demencia, déficit de memoria, déficit de atención, obesidad, ansiedad, trastornos de la alimentación, adicción y uso indebido de drogas, alteración del impulso sexual, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Alzheimer. La afección por enfermedad puede relacionarse, además, con una respuesta visceral que se origina en el sistema límbico. La respuesta visceral puede seleccionarse de la respiración y la función gastrointestinal.
El modulador puede aumentar la actividad del canal NaV1.7. El modulador puede, además, disminuir la actividad del canal NaV1.7.
El canal NaV1.7 humano, quimérico o variante de humano puede asociarse con un trastorno de dolor. El trastorno de dolor puede seleccionarse de insensibilidad congénita al dolor (CIP), eritromelalgia (IEM), y trastorno de dolor extremo paroxístico (PEPD).
En un aspecto, se describe un método para determinar la probabilidad de enfermedad resultante de una variante del canal NaV1.7, que comprende identificar mutaciones en uno o más sitios dentro de una secuencia de ácido nucleico de un gen de NaV1.7 que se aisló de una célula de un ratón como se describe en la presente descripción que codifica una región N-terminal intracelular, un bucle extracelular en el dominio I, un bucle intracelular entre los dominios I y II, un bucle intracelular entre los dominios II y III, una región intramembrana del dominio II, o cualquier combinación de estos, en donde las mutaciones identificadas codifican una proteína canal NaV17 que muestra un cambio en la función que no se observa en un canal NaV1.7 no variante.
El canal NaV1.7 humano, quimérico o variante de humano puede asociarse con un trastorno de dolor. El trastorno de dolor puede seleccionarse de insensibilidad congénita al dolor (CIP), eritromelalgia (IEM), y trastorno de dolor extremo paroxístico (PEPD).
En un aspecto, se describe un método para seleccionar un lote de una preparación farmacéutica que contiene un agente terapéutico que se une a una secuencia de NaV1.7 humana, que comprende exponer una célula que porta una proteína NaV1.7 que comprende al menos una secuencia humana contigua a una muestra del lote de la preparación farmacéutica, determinar si la muestra se une a la célula, y seleccionar un lote que corresponda a la muestra que se une a la al menos una secuencia humana contigua. En una modalidad, la al menos una secuencia humana contigua codifica un bucle extracelular del poro de la proteína NaV1.7. El bucle extracelular del poro de la proteína NaV1.7 puede seleccionarse del bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio I, el bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio II, el bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio III, el bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio IV, y una combinación de estos. El bucle extracelular del poro puede ser el bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio I. El bucle extracelular del poro puede ser el bucle que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio III.
El lote de la preparación farmacéutica puede comprender un compuesto de unión a NaV17 humana no proteico. El lote de la preparación farmacéutica puede comprender una proteína que se une a una NaV1.7 humana. La preparación farmacéutica que comprende una proteína puede incluir un anticuerpo.
La célula que porta una proteína NaV1.7 que comprende al menos una secuencia humana contigua puede estar en un ratón en el momento en que la muestra del lote de la preparación farmacéutica se expone a la célula.
En un aspecto, se describe un método para determinar la eficacia de una proteína de unión a NaV1.7 para mediar una respuesta que resulta de un estímulo nociceptivo, que comprende exponer un ratón como se describe en la presente descripción a la proteína de unión a NaV1.7 y medir la respuesta nociceptiva del ratón al estímulo, en donde una respuesta nociceptiva atenuada del ratón es un indicador de la eficacia de la proteína de unión a NaV1.7.
La eficacia puede determinarse para un lote de la preparación farmacéutica. La eficacia puede determinarse como una etapa de aseguramiento de la calidad o de control de la calidad en la fabricación de la preparación farmacéutica para su uso en humanos.
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En un aspecto, se describe un método para interactuar selectivamente con un receptor diana en la superficie de una célula neuronal, que comprende: poner en contacto una célula aislada de un ratón como se describe en la presente descripción con uno o más mediadores de la inflamación, que de esta manera interactúan selectivamente con el receptor diana; y medir la liberación de un neuropéptido.
El método puede emplearse como un ensayo funcional para seleccionar un antagonista del receptor diana.
El receptor diana puede ser un canal de sodio. El canal de sodio puede ser Nav1.7.
La célula neuronal puede ser una célula de los ganglios de las raíces dorsales (GRD).
El uno o más mediadores de la inflamación pueden seleccionarse de prostaglandina E2, bradiquinina, capsaicina, protones, pH bajo, y un factor neurotrófico.
El neuropéptido puede ser un péptido relacionado con el gen de calcitonina (CGRP).
En una modalidad, se describe un método para interactuar selectivamente con una proteína Nay1.7 en la superficie de una célula de GRD, que comprende exponer un GRD aislado de un ratón como se describe en la presente descripción, a uno o más mediadores de la inflamación, que de esta manera interactúan selectivamente con Nay1.7 y medir la liberación de CGRP.
El uno o más mediadores de la inflamación pueden comprender prostaglandina E2, bradiquinina y capsaicina.
El método puede emplearse como un ensayo funcional para seleccionar un antagonista de Nay1.7. En una modalidad específica, el antagonista es un anticuerpo.
En un aspecto, se describe un método para identificar un antagonista de Nay1.7, que comprende: proporcionar ex vivo una célula que expresa una proteína NaV1.7 humana o quimérica; poner en contacto la célula con un agente que se une a la proteína Nay1.7 humana o quimérica; después de un período de tiempo posterior, poner en contacto la célula con uno o más mediadores de la inflamación; después de otro período de tiempo posterior, determinar la cantidad de péptido relacionado con el gen de calcitonina (CGRP) liberado de la célula; y, comparar la cantidad de CGRP liberado de la célula en presencia del agente que se une a la proteína Nay17 humana o quimérica con una muestra de referencia, en donde un aumento en la liberación de CGRP respecto a la muestra de referencia indica la inhibición de NaV1.7; y, determinar si el agente inhibe la función de NaV1.7.
La célula puede ser una célula no humana, preferentemente, una célula animal no humana. La célula puede ser una célula humana o no humana que expresa exógenamente la proteína NaV1.7 humana o quimérica. "Expresión exógena" significa que la célula se modifica genéticamente para expresar la proteína NaV1.7 humana o quimérica y que no expresará esta proteína sin la modificación genética. La modificación genética puede incluir la introducción de un gen que codifica la proteína NaV1.7 humana o quimérica en una célula que no contiene dicho gen en su genoma (tal como una célula no humana), o cualquiera de sus precursores. La modificación genética puede incluir, además, la introducción de un gen que codifica la proteína NaV1.7 humana o quimérica en una célula que ya contiene dicho gen en su genoma (tal como una célula humana), o cualquiera de sus precursores, en donde el gen introducido está bajo el control de un promotor o promotores diferentes de aquellos que controlan dicho gen ya presente en el genoma. Como ejemplo, las células humanas que expresan exógenamente una proteína NaV1.7 humana o quimérica pueden ser células HEK293 modificadas para expresar de manera estable la proteína NaV1.7 humana.
El agente puede ser un anticuerpo. El anticuerpo puede ser humano. El agente puede ser un péptido. El agente puede ser un compuesto orgánico no proteico. El compuesto orgánico no proteico puede seleccionarse del grupo que consiste en ácidos 2-alquil-alcanoicos (por ejemplo, ácido valproico y análogos de este), ácidos 3-alquilamino- alcanoicos (por ejemplo, gabapentina y análogos de este), 1-benzazapin-2-onas, bupivicaína, capsaicinas, flecainida, flunarizina, lidocaína, mexiletina, fenitoína, propafenfenona, prostaglandinas, quinidina, saxitoxina, tetracaína, tetrodotoxina y análogos de estas.
El uno o más mediadores de la inflamación pueden seleccionarse de prostaglandina E2, bradiquinina, capsaicina, protones, pH bajo, y un factor neurotrófico. En una modalidad específica, el uno o más mediadores de la inflamación son prostaglandina E2, bradiquinina y capsaicina.
La célula puede ser una célula neuronal. La célula neuronal puede ser una célula de los ganglios de las raíces dorsales (GRD). La célula puede ser una célula de GRD de ratón. La célula puede aislarse de un ratón como se describe en la presente descripción. La célula puede ser una célula de GRD aislada de un ratón como se describe en la presente descripción.
La cantidad de CGRP liberado en presencia del agente que se une a la proteína NaV1.7 humana o quimérica puede ser aproximadamente 1.5 veces, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces,
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aproximadamente 5 veces, aproximadamente 6 veces, aproximadamente 7 veces, aproximadamente 8 veces, aproximadamente 9 veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 15 veces, o de aproximadamente 15 veces a aproximadamente 20 veces más alta que la muestra de referencia. El agente puede ser una molécula no proteica. La molécula no proteica puede ser una toxina que se selecciona de tetrodotoxina y ProTx-II. El agente puede ser un anticuerpo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-Nay1.7.
La muestra de referencia puede contener un bloqueador de canales de sodio. El bloqueador de canales de sodio puede inhibir una o más funciones de una proteína canal de sodio mediante la unión a y la inhibición de la apertura extracelular del poro de la proteína canal. El bloqueador de canales de sodio que inhibe una o más funciones de una proteína canal de sodio mediante la unión a y la inhibición de la apertura extracelular del poro de la proteína canal puede ser una toxina basada en un alcaloide (por ejemplo, tetrodotoxina o saxitoxina). El bloqueador de canales de sodio puede inhibir una o más funciones de un canal de sodio mediante la unión a y la inhibición de una porción intracelular del canal. El bloqueador de canales de sodio que inhibe una o más funciones de un canal de sodio mediante la unión a y la inhibición de una porción intracelular del canal puede ser un anestésico local (por ejemplo, lidocaína). El bloqueador de canales de sodio que inhibe una o más funciones de un canal de sodio mediante la unión a y la inhibición de una porción intracelular del canal puede ser un anticonvulsivo (por ejemplo, gabapentina, carbamazepina, clonazepam, divalproex, lamotrigina, fenitoína, oxcarbazepina, tiagabina, topiramato y ácido valproico).
La muestra de referencia puede contener una toxina aislada del veneno de un artrópodo, un invertebrado, un pez, o un reptil. El veneno tóxico puede derivarse de una tarántula (porejemplo, ProTx-II).
En un aspecto, se describe un método para identificar un antagonista de Nay1.7, que comprende proporcionar ex vivo una célula de los ganglios de las raíces dorsales (GRD) que expresa una proteína Nay1.7 humana o quimérica, poner en contacto el GRD con un agente que se une a la proteína Nay1.7 humana o quimérica y esperar un primer período de tiempo, y, después del primer período de tiempo, poner en contacto el GRD con uno o más mediadores de la inflamación y esperar un segundo período de tiempo, determinar la cantidad de péptido relacionado con el gen de calcitonina (cGrp) liberado de la célula de GRD, comparar la cantidad de CGRP liberado del GRD en presencia del agente que se une a la proteína Nay1.7 humana o quimérica con una muestra de referencia, en donde un aumento en la liberación de CGRP respecto a la muestra de referencia indica la inhibición de Nay1.7, y determinar si el agente inhibe la función de Nay1.7 en el GRD.
La célula de GRD puede ser una célula de GRD no humana. La célula de GRD puede ser, además, una célula de GRD humana o no humana que expresa exógenamente la proteína NaV1.7 humana o quimérica. "Expresión exógena" significa que la célula de GRD se modifica genéticamente para expresar la proteína Nay1.7 humana o quimérica y no expresará esta proteína sin la modificación genética. La modificación genética puede incluir la introducción de un gen que codifica la proteína Nay1.7 humana o quimérica en una célula de GRD que no contiene dicho gen en su genoma (tal como una célula de GRD no humana), o cualquiera de sus precursores. La modificación genética puede incluir, además, la introducción de un gen que codifica la proteína Nay1.7 humana o quimérica en una célula de GRD que ya contiene dicho gen en su genoma (tal como una célula de GRD humana), o cualquiera de sus precursores, en donde el gen introducido está bajo el control de un promotor o promotores diferentes de aquellos que controlan dicho gen ya presente en el genoma.
El agente puede ser un anticuerpo. El anticuerpo puede ser humano. El agente puede ser un péptido. El agente puede ser un compuesto orgánico.
El uno o más mediadores de la inflamación pueden ser prostaglandina E2, bradiquinina y capsaicina.
El GRD puede aislarse de un miembro del grupo que consiste en humanos, ratones, ratas, o monos. El GRD puede aislarse a partir de un ratón como se describe en la presente descripción. El ratón puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una subunidad a de Nay17 humana o un fragmento de esta que se une operativamente a un promotor de NaV.
En un aspecto, se describe un complejo ex vivo; en donde el complejo ex vivo comprende una célula de ratón que expresa una proteína NaV1.7 que comprende un dominio de transmembrana de ratón y un dominio de bucle humano; y, un antagonista de NaV1.7 unido al bucle humano. En una modalidad, la célula de ratón es una célula inmortalizada. En una modalidad, el antagonista de NaV1.7 comprende un dominio variable de inmunoglobulina que se une específicamente a un bucle de NaV1.7 humano pero no a un bucle de NaV1.7 de ratón.
En un aspecto, se describe un complejo ex vivo; en donde el complejo ex vivo comprende una membrana o un fragmento de esta que comprende una proteína NaV1.7 que comprende un dominio de transmembrana de ratón y un dominio de bucle humano; y, un antagonista de NaV1.7 unido al bucle humano. En una modalidad, el antagonista de NaV1.7 comprende un dominio variable de inmunoglobulina que se une específicamente a un bucle de NaV1.7 humano pero no a un bucle de NaV1.7 de ratón.
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Cualquiera de las modalidades y aspectos descritos en la presente descripción pueden usarse conjuntamente entre sí, a menos que se indique lo contrario o sea evidente a partir del contexto. Otras modalidades serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de una revisión de la siguiente descripción. Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la descripción detallada siguiente son ilustrativas y explicativas solamente y no son restrictivas.
Breve descripción de las figuras
La Fig. 1 muestra un diagrama de un canal NaV.
La Fig. 2 muestra el locus del gen de NaV1.7 murino (parte superior) con los exones numerados arriba y debajo del locus. El vector de transformación de NaV1.7 de ratón (parte intermedia se usó para reemplazar una región de 81 kb del locus endógeno que abarca los exones 6-28 con un casete de resistencia a neomicina flanqueado por sitios loxP. El alelo transformado da como resultado un locus de NaV1 7 endógeno eliminado (parte inferior). La Fig. 3 muestra el locus de NaV1.7 endógeno eliminado (superior) transformado con un vector de transformación de NaV1.7 humana (parte intermedia). El locus endógeno eliminado previamente transformado con un casete de resistencia a neomicina se reemplazó con un vector de transformación que comprende los exones 2-28 de un locus de NaV1.7 humano. El alelo transformado da como resultado un locus endógeno que expresa la proteína NaV1.7 humana.
La Fig. 4 muestra el locus de NaV1.7 de ratón (superior) transformado con un vector de transformación de NaV1.7- DI/S5-S6 humana (parte intermedia). El alelo transformado da como resultado un locus de NaV1.7 endógeno parcialmente humanizado que expresa una proteína NaV1.7 quimérica que incluye un bucle extracelular S5-S6 del poro humano en el dominio I.
La Fig. 5 muestra el locus de NaV1.7 de ratón (parte superior) transformado con un vector de transformación de NaV1.7-DIII/S5-S6 humana (parte intermedia). El alelo transformado da como resultado un locus del gen de NaV1.7 endógeno parcialmente humanizado que expresa una proteína NaV1.7 quimérica que incluye un bucle extracelular S5-S6 del poro humano en el dominio III.
La Fig. 6A muestra la latencia de retirada de cola (en segundos) en respuesta a un estímulo nociceptivo (golpe de la cola) en cohortes masculinas y femeninas de tipo silvestre (Scn9A+l+) y ratones heterocigóticos para el gen de NaV1.7 humano de longitud completa (Scn9Ahum/+).
La Fig. 6B muestra el umbral de retirada (en gramos) en respuesta a un estímulo nociceptivo (pellizco de la cola) en cohortes masculinas y femeninas de tipo silvestre (Scn9A+l+) y ratones heterocigóticos para el gen de NaV1.7 humano de longitud completa (Scn9Ahuml+).
La Fig. 6C muestra la latencia de retirada de la pata (en segundos) en respuesta a un estímulo nociceptivo (placa caliente a 52 °C y 55 °C) en cohortes de tipo silvestre (Scn9A+l+) y ratones heterocigóticos para el gen de NaV1.7 humano de longitud completa (Scn9Ahumh).
La Fig. 7A muestra la latencia de retirada de la cola (en segundos) en respuesta a un estímulo nociceptivo (golpe de la cola) en cohortes femeninas de tipo silvestre (Scn9A+l+) y ratones homocigóticos para el gen de NaV1.7 quimérico que contiene un bucle extracelular del poro humano que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio I (Scn9A31131).
La Fig. 7B muestra el umbral de retirada (en gramos) en respuesta a un estímulo nociceptivo (pellizco de la cola) en cohortes femeninas de tipo silvestre (Scn9A+/+) y ratones homocigóticos para el gen de NaV1.7 quimérico que contiene un bucle extracelular del poro humano que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio
I (Scn9A31131).
La Fig. 7C muestra la latencia de retirada de la pata (en segundos) en respuesta a un estímulo nociceptivo (placa caliente a 52 °C y 55 °C) en cohortes femeninas de tipo silvestre (Scn9A+/+) y ratones homocigóticos para el gen de NaV1.7 quimérico que contiene un bucle extracelular del poro humano que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio I (Scn9A31131).
La Fig. 7D muestra la alodinia mecánica medida como umbral de retirada de la pata (en gramos) antes (condiciones iniciales) y después de la administración (posterior al ACF) del adyuvante completo de Freund en cohortes femeninas de tipo silvestre (Scn9A+l+) y ratones homocigóticos para el gen de NaV1.7 quimérico que contiene un bucle extracelular del poro humano que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio
I (Scn9A3.1/3.1).
La Fig. 7E muestra la hiperalgesia térmica medida como umbral de retirada de la pata (en gramos) antes (condiciones iniciales) y después de la administración (posterior al ACF) del adyuvante completo de Freund en cohortes femeninas de tipo silvestre (Scn9A+l+) y ratones homocigóticos para el gen de NaV1.7 quimérico que contiene un bucle extracelular del poro humano que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio
I (Scn9A3.1/3.1).
La Fig. 7F muestra el cambio porcentual desde la línea base en respuesta a estímulos nociceptivos en cohortes femeninas de tipo silvestre (Scn9A+l+) y ratones homocigóticos para el gen de NaV1.7 quimérico que contiene un bucle extracelular del poro humano que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio I
(Scn9A31/31).
La Fig. 8 muestra la concentración (pg/ml) de péptido relacionado con el gen de calcitonina (CGRP) liberado de tres poblaciones de ganglios de las raíces dorsales (GRD) aisladas de ratones de tipo silvestre en respuesta a la exposición a una mezcla inflamatoria (IM), 20 minutos de preincubación con TTX 1 pM seguido de la adición de una mezcla inflamatoria (TTX 1 pM e IM) o incubación con TTX 1 pM más una mezcla inflamatoria durante 20 minutos (TTX 1 pM + IM).
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Descripción detallada de la invención
El alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos y frases que se usan en la presente descripción incluyen los significados que se atribuyen a los términos y frases en la técnica, a menos que se indique claramente lo contrario o sea claramente evidente a partir del contexto en el que se usa el término o frase.
La frase "vector de transformación" o "construcción de transformación” incluye una molécula de polinucleótido que comprende una región de transformación. Una región de transformación comprende una secuencia que es idéntica o sustancialmente idéntica a una secuencia en una célula, tejido o animal diana y proporciona la integración de la construcción de transformación en una posición dentro del genoma de la célula, tejido o animal por medio de recombinación homóloga.
Se incluyen, además, las regiones de transformación que transforman mediante el uso de sitios de reconocimiento de recombinasas específicas del sitio (por ejemplo, sitios lox o FRT).
En una modalidad específica, la construcción de transformación comprende, además, una secuencia de ácido nucleico o gen de particular interés, un marcador de selección, secuencias de control y/o reguladoras, y otras secuencias de ácidos nucleicos que permiten la recombinación mediada por la adición exógena de proteínas que ayudan o facilitan la recombinación en la que participan tales secuencias. En otra modalidad específica, la construcción de transformación comprende, además, un gen de interés, en donde el gen de interés es un gen heterólogo que codifica una proteína que tiene una función similar a la de una proteína codificada por la secuencia endógena.
El término "reemplazo" incluye en donde una secuencia de ADN se coloca en un genoma de una célula de tal manera que reemplaza una secuencia dentro de un genoma, en el locus de la secuencia genómica, con una secuencia heteróloga (por ejemplo, una secuencia humana en un ratón). La secuencia de ADN que se coloca de esta manera puede incluir una o más secuencias reguladoras que son parte del ADN de origen que se usó para obtener la secuencia que se coloca de esta manera (por ejemplo, promotores, potenciadores, regiones no traducidas 5' o 3', etc.). Por ejemplo, en diversas modalidades, el reemplazo es una sustitución de una secuencia endógena por una secuencia heteróloga que da como resultado la producción de un producto génico a partir de la secuencia de ADN que se coloca de esta manera (que comprende la secuencia heteróloga), pero no la expresión de la secuencia endógena; el reemplazo es de una secuencia genómica endógena con una secuencia de ADN que codifica una proteína que tiene una función similar a la de una proteína codificada por la secuencia genómica endógena (por ejemplo, la secuencia genómica endógena codifica un canal NaV, y el fragmento de ADN codifica uno o más canales Nay). En diversas modalidades, un gen endógeno o un fragmento de este se reemplaza con un gen humano correspondiente o un fragmento de este. Un gen humano correspondiente o un fragmento de este es un gen humano o un fragmento que es un ortólogo, o es sustancialmente similar o igual en estructura y/o función, con el gen endógeno o fragmento de este que se reemplaza.
La frase "canal Nav" incluye un canal de sodio dependiente de voltaje, por ejemplo, un canal Nav1.7. Los genes de canal Nav incluyen una subunidad a que se expresa en la superficie de la célula y sirve como una compuerta que permite el influjo de Na+ a la célula a través de un poro formado por segmentos de transmembrana que son parte de la subunidad a. La subunidad a se asocia con otras subunidades, por ejemplo, p1, p2, p3 y p4, para llevar a cabo los potenciales de acción. Existen varios genes de canal de Nav diferentes y pueden clasificarse por la sensibilidad a la toxina del pez globo (tetrodotoxina o TTX). Los canales sensibles a TTX, es decir, aquellos bloqueados por bajas concentraciones nanomolares de TTX, incluyen Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.6 y Nav1.7. Los canales resistentes a TTX, es decir, aquellos bloqueados por concentraciones pM de TTX, incluyen Nav1.5, Nav1.8 y Nav1.9. Dentro de los genes de canal de Nav, se describen subtipos o mutantes en sujetos humanos. A modo de ilustración, las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de un gen de Nav1.7 humano se proporcionan en las SEQ ID NO: 42 y 43, respectivamente. Al leer esta descripción las personas expertas reconocerán que uno o más genes de canal Nav endógenos en un genoma (o todos) pueden reemplazarse por uno o más genes de canal Nav heterólogos (por ejemplo, subtipos o mutantes, genes de otras especies, formas quiméricas, etc.).
El término "variantes" incluye las variaciones de una secuencia normal de un gen que dan como resultado una serie de formas diferentes del mismo gen. Las formas diferentes pueden comprender diferencias de hasta, por ejemplo, 20 aminoácidos en la secuencia de una proteína de un gen. Por ejemplo, puede entenderse que los alelos son secuencias de ADN alternativas en el mismo locus físico del gen, que pueden o no dar como resultado rasgos diferentes (por ejemplo, características fenotípicas heredables) tales como la susceptibilidad a ciertas enfermedades o afecciones que no dan como resultado otros alelos para el mismo gen o que dan como resultado grados variables en los otros alelos.
Una "célula excitable" incluye una célula que participa en la generación de potenciales de acción en la estimulación. Las células excitables ilustrativas incluyen neuronas, miocitos y electrocitos. Las células excitables cambian el potencial eléctrico de sus membranas en la estimulación de manera repentina y reversible para transmitir señales
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eléctricas a otras células excitables y proporcionan de esta manera la comunicación de célula a célula. Por ejemplo, la contracción muscular voluntaria se controla por potenciales de acción a través de neuronas que inervan las fibras musculares. En diversas modalidades, los animales no humanos genéticamente modificados de la presente descripción muestran potenciales de acción controlados por la expresión de proteínas Nav1.7 humanas y/o quiméricas en la superficie de las neuronas en varios tipos de tejidos, por ejemplo, músculo, en el animal no humano.
Una "neurona" incluye una célula nerviosa y es una célula especializada que presenta, por ejemplo, excitabilidad eléctrica. Las neuronas, como se describe en la presente descripción, forman uniones de membrana complejas con otras neuronas para formar un contacto y permitir de esta manera que una neurona transmita señales a otra. Tales contactos entre neuronas se denominan en la técnica sinapsis, que pueden ser excitatorias o inhibitorias. Las neuronas pueden ser parte del sistema nervioso central de un animal o encontrarse en la periferia del animal en otro tejido nervioso especializado, por ejemplo, en los ganglios. Por ejemplo, algunas neuronas se sitúan en órganos sensoriales tales como la retina y la cóclea.
El término "interrupción" se usa para referirse a cuando un fragmento de ADN se recombina con una secuencia endógena homóloga, por ejemplo, un gen o locus del gen. Estas interrupciones de secuencia pueden incluir inserciones, eliminaciones, sustituciones, reemplazos, mutaciones con cambio de sentido, o un desplazamiento del marco de lectura de la secuencia de ADN, o cualquier combinación de estas. Las inserciones pueden incluir la inserción de genes completos o fragmentos de genes, por ejemplo, exones, que pueden ser de un origen distinto al de la secuencia endógena. La interrupción de una secuencia homóloga endógena puede alterar la proteína producida a partir de un gen normal de modo que se inhibe por completo o en parte, o porque la producción de la proteína a partir de un gen alterado puede potenciarse respecto al nivel normal de producción a partir de la secuencia homóloga endógena no interrumpida. En una modalidad, la interrupción da como resultado una carencia de la proteína funcional que se produce a partir de la secuencia homóloga endógena. En otra modalidad, la interrupción no tiene un efecto significativo sobre la expresión del gen.
La frase "locus endógeno" se refiere al locus genético natural que se encuentra en un animal huésped de tipo silvestre que se va a interrumpir, eliminar, reemplazar o alterar. En una modalidad, el locus endógeno se elimina. En otra modalidad, el locus endógeno se altera, en donde una porción del locus endógeno se reemplaza con una secuencia heteróloga. En otra modalidad, el locus endógeno completo o sustancialmente completo se reemplaza con un locus heterólogo. En una modalidad, el locus heterólogo es un locus humano.
El término "heterólogo" cuando se usa conjuntamente con un polipéptido o gen se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos o un ADN que codifica el polipéptido que no se encuentra en el animal huésped no humano. Así, un ratón genéticamente modificado que tiene un gen de canal NaV humano puede describirse como que tiene un gen de canal NaV heterólogo. El gen de canal NaV reemplazado puede detectarse mediante el uso una variedad de métodos que incluyen, por ejemplo, PCR, transferencia Western, transferencia Southern, polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), o un ensayo de ganancia o pérdida de alelos.
La frase "promotor endógeno" se refiere al promotor que se asocia naturalmente, por ejemplo, en un organismo de tipo silvestre, con la secuencia de polinucleótido que codifica la proteína endógena.
El término "célula" incluye cualquier célula que sea adecuada para expresar una secuencia de ácido nucleico recombinante. Las células incluyen las de procariontes y eucariontes (unicelulares o multicelulares), células bacterianas (por ejemplo, cepas de E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etc.), células de micobacterias, células de hongos, células de levaduras (por ejemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etc.), células vegetales, células de insectos (por ejemplo, SF-9, SF-21, células de insectos infectadas con baculovirus, Trichoplusia ni, etc.),células animales no humanas, células humanas o fusiones celulares tales como, por ejemplo, hibridomas o cuadromas. En algunas modalidades, la célula es una célula humana, de mono, simio, hámster, rata, o ratón. En algunas modalidades, la célula es eucariota y se selecciona de las siguientes células: CHO (por ejemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por ejemplo, COS-7), células de la retina, Vero, CV1, renal (por ejemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL- 60, (por ejemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmica), CV-1, U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, células de Sertoli, células BRL 3A, células HT1080, células de mieloma, células tumorales, y una línea celular derivada de una célula mencionada anteriormente. En algunas modalidades, la célula comprende uno o más genes virales, por ejemplo, una célula de la retina que expresa un gen viral (porejemplo, una célula PER.C6™).
La frase "animales no humanos" pretende incluir cualquier vertebrado como ciclóstomos, peces óseos, peces cartilaginosos tales como tiburones y rayas, anfibios, reptiles, mamíferos y aves. Los mamíferos adecuados incluyen primates no humanos, cabras, ovejas, cerdos, perros, vacas, y roedores. Los animales no humanos adecuados se seleccionan de la familia de los roedores que incluyen la rata y el ratón. En una modalidad, los animales no humanos son ratones.
El término "conservadora", cuando se usa para describir una sustitución de aminoácido conservadora, incluye la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo de aminoácido que tiene un grupo R de cadena lateral con
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propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácido conservadora no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de interés de una proteína, por ejemplo, la capacidad de una región variable de unirse específicamente a un epitopo diana con una afinidad deseada. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen cadenas laterales alifáticas tales como glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; cadenas laterales hidroxialifáticas tales como serina y treonina; cadenas laterales que contienen grupo amida tales como asparagina y glutamina; cadenas laterales aromáticas tales como fenilalanina, tirosina, y triptófano; cadenas laterales básicas tales como lisina, arginina e histidina; cadenas laterales ácidas tales como ácido aspártico y ácido glutámico; y, cadenas laterales que contienen azufre tales como cisteína y metionina. Los grupos de sustituciones conservadoras de aminoácidos incluyen, por ejemplo, valina/leucina/isoleucina, fenilalanina/tirosina, lisina/arginina, alanina/valina, glutamato/aspartato, y asparagina/glutamina. En algunas modalidades, una sustitución de aminoácido conservadora puede ser una sustitución de cualquier residuo nativo en una proteína con alanina, como se usa, por ejemplo, en la mutagénesis por barrido de alanina. En algunas modalidades, se realiza una sustitución conservadora que tiene un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 descrita en Gonnet, G.H., Cohen, M.A., y Benner, S.A. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45. En algunas modalidades, la sustitución es una sustitución moderadamente conservadora en donde la sustitución tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.
El término "identidad" cuando se usa en conexión con una comparación de secuencias, incluye la identidad tal como se determina mediante una serie de algoritmos diferentes que se conocen en la técnica que pueden usarse para medir la identidad de secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos. En algunas modalidades descritas en la presente descripción, las identidades se determinan mediante el uso de un alineamiento (lento) con ClustalW v. 1.83 que emplea una penalización de apertura de interrupción de 10.0, una penalización de extensión de interrupción de 0.1 y mediante el uso de una matriz de similitud de Gonnet (MacVector™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008).
El término "anticuerpo", como se usa en la presente descripción, pretende referirse a moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (Vh) y una región constante de cadena pesada (Ch). La región constante de cadena pesada comprende tres dominios para IgG, Ch1, Ch2 y Ch3 y un cuarto dominio, Ch4, en el caso de las regiones constantes de IgM e IgE. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (V l ) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio de tipo k o A (Ck o CA). Las regiones VH y VL pueden subdividirse, además, en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones más conservadas, que se denominan regiones marco (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestos desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
El término "anticuerpo humano", como se usa en la presente descripción, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana, y pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o sitio específica in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR y en particular en la CDR3. Sin embargo, el término "anticuerpo humano", como se usa en la presente descripción, no pretende incluir anticuerpos en los que las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se injertaron en las secuencias marco humanas.
Un anticuerpo "neutralizante" o "bloqueador", como se usa en la presente descripción, pretende referirse a un anticuerpo cuya unión a una molécula diana (por ejemplo,NaV1.7) da como resultado la inhibición de al menos una función de la molécula diana. Por ejemplo, no es necesario que la inhibición causada por un anticuerpo neutralizante o bloqueador de NaV1.7 sea completa siempre que sea detectable mediante el uso de un ensayo apropiado. Los ensayos ilustrativos para detectar la inhibición de NaV1.7 se describen en otra parte de esta descripción.
La frase "intervalo micromolar" pretende significar 1-999 micromolar; la frase "intervalo nanomolar" pretende significar 1-999 nanomolar; la frase "intervalo picomolar" pretende significar 1-999 picomolar.
Expresión y función del canal Nav
Hay nueve miembros conocidos en la familia de los canales NaV. Los nombres de los genes son SCN1A a SCN11A, y las proteínas respectivas se designan NaV1.1-NaV1.9. Cada uno se clasifica, además, según la sensibilidad a la toxina del pez globo (tetrodotoxina, o TTX). Se reportó que los nueve canales NaV presentan diversas propiedades funcionales y patrones de expresión distintos, que implican funciones especializadas entre los canales. La expresión de los canales NaV puede detectarse, por ejemplo, en neuronas del sistema nervioso central y periférico, miocitos cardíacos, músculo esquelético, células gliales y células de Schwann. El NaV1.7, un canal NaV sensible a TTX que se conoce, además, como PN1 y SCN9A, se detectó en neuronas simpáticas, células de Schwann, células neuroendocrinas y ganglios de las raíces dorsales (GRD). El Nav1.7 se expresa casi exclusivamente en GRD y se concentra en las puntas de estas neuronas especializadas. Tal distribución predispone a este canal a desempeñar
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una función en la transmisión de señales de dolor.
Los canales NaV contienen una subunidad a (Fig. 1) que forma un poro en la membrana de las células que permite el flujo de iones Na+ y media de esta manera los potenciales de acción. Esta subunidad a se asocia, además, con una o dos subunidades p, que funcionan en la regulación de la activación del canal. La expresión de la subunidad a en la superficie de la célula parece ser necesaria para la función del canal. Los canales NaV se abren y cierran a través de un poro, que se compone de los segmentos de transmembrana 5 (S5) y 6 (S6) de cada uno de los dominios (Fig. 1). Es a través de este poro formado por la disposición cíclica de los cuatro dominios en la superficie celular que los iones Na+ se mueven a la célula y causan la despolarización de la membrana celular. Esta acción cambia el gradiente electroquímico de la célula y genera un potencial de acción, que conduce a la transmisión de señales eléctricas entre las células. Los estudios de mutaciones demostraron que los aminoácidos que forman los bucles que conectan los segmentos de transmembrana tanto en el lado extracelular como en el lado intracelular de la célula regulan la apertura y el cierre del canal en un manera del tipo receptor de compuerta. Tales mutaciones alteran y/o desestabilizan el estado del canal y dejan el canal en un estado "activado" o "desactivado" perpetuo, por lo tanto, causan lo que se denomina canalopatías, por ejemplo, hiperexcitabilidad, que conduce a estados de dolor severos y persistentes.
Nav1.7 y vías del dolor
Entre los canales NaV, el NaV1.7 se asocia con activación e inactivación rápidas, y se postula que actúa como un canal de umbral. Los estudios genéticos vinculan al NaV1.7 tanto con el dolor severo como con la indiferencia ante el dolor. Por ejemplo, la eritromelalgia (IEM) y el trastorno de dolor extremo paroxístico (PEPD) son el resultado de mutaciones de NaV1.7 que aumentan la actividad del canal por desplazamiento de la activación del canal a un potencial más negativo o afectación de la inactivación. Se describen otras mutaciones que conducen a una proteína NaV1.7 no funcional y por lo tanto a una completa ausencia de dolor, llamada indiferencia congénita al dolor (CIP). Las mutaciones de CIP, aunque afectan la capacidad de oler, parecen no tener ningún efecto sobre las funciones motoras, cognitivas y cardíacas. Se reportaron varias mutaciones del NaV17 que se relacionan con IEM, PEPD y CIP y el efecto aberrante resultante en la función de NaV1.7. Se sugirió, además, que el NaV1.7 tiene un papel en la metástasis debido al hallazgo de que NaV1.7 se regula positivamente en algunas líneas celulares de cáncer. Además, se demostró que el factor de crecimiento nervioso (NGF) aumenta los niveles de NaV1.7, lo que sugiere una relación con el dolor inflamatorio. En consecuencia, estos hallazgos indican que NaV1.7 participa en varios puntos de control críticos para la percepción del dolor, la inflamación y, quizás, la persistencia del cáncer.
Las terapias convencionales que emplean inhibidores no selectivos del canal de sodio tales como, por ejemplo, lidocaína, mexiletina y carbamazepina, muestran algún valor en el tratamiento del dolor, sin embargo tienen limitaciones debido a efectos secundarios motores, cognitivos y cardíacos significativos a partir de su inhibición en los canales NaV que no participan en la respuesta al dolor. Se encontró que el uso de analgésicos, anticonvulsivos y antiarrítmicos para tratar anormalidades de la actividad de NaV tiene resultados similares. Esto revela la importancia y la necesidad inmediata de inhibidores de NaV. La identificación de productos terapéuticos que inhiban selectivamente a NaV1.7 podría ser eficaz para tratar el dolor y la inflamación en humanos y la evaluación de tales productos terapéuticos requiere un modelo animal adecuado que exprese la proteína NaV1.7 humana. La presente invención cumple esta y otras necesidades.
Se demostró que las líneas celulares que expresan de manera estable las proteínas canales NaV son difíciles de construir y por lo tanto el desarrollo de modelos animales adecuados para dilucidar la función de los canales NaV e identificar inhibidores específicos de los canales NaV se ha afectado negativamente. Además, la eliminación del NaV1.7 murino es letal, causada por una supuesta disminución en el olfato, que se postula que da como resultado la incapacidad de alimentarse. Las eliminaciones de NaV1.7 dentro de subconjuntos de células se lograron y confirmaron una función en los mecanismos de dolor, pero la aplicabilidad de este enfoque no es sin limitación. Un ratón en el que se expresa la proteína NaV1.7 humana completa y/o porciones específicas de esta, en diversas modalidades podría usarse para reflejar con precisión los mecanismos y patologías del dolor humano que se asocian con trastornos resultantes de las mutaciones de NaV1.7. Tal ratón serviría como una herramienta vital en la ingeniería, análisis y evaluación de terapias para el tratamiento de trastornos de dolor humanos tales como, por ejemplo, IEM, PEPD, dolor crónico y agudo, y dolor inflamatorio, al proporcionar un modelo animal capaz de lograr un perfil funcional y de expresión más precisos de los procesos del canal Nav en humanos. Además, las líneas celulares derivadas de tales ratones serían herramientas excepcionalmente útiles para evaluar los productos terapéuticos humanos.
Ratones que expresan canales Nav1.7 heterológos
Se proporcionan animales no humanos genéticamente modificados que expresan una proteína NaV1.7 completamente o parcialmente humana. La proteína NaV1.7 puede expresarse en la superficie de las células excitables, por ejemplo, neuronas del sistema nervioso del animal.
La modificación genética, en diversas modalidades, comprende una eliminación de un gen de NaV1.7 de ratón funcional en su totalidad o en parte, y en algunas modalidades una modificación adicional que comprende un
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reemplazo con un gen de Nav1.7 humano en su totalidad o en parte, en donde el animal no humano expresa subunidades p de ratón funcionales. Se proporcionan, además, embriones no humanos genéticamente modificados, células y construcciones de transformación para generar los animales no humanos, embriones no humanos y células.
Se proporcionan las composiciones y métodos para generar un ratón que expresa una proteína NaV1.7 humana, que incluye variantes específicas (por ejemplo, diferencias de un solo aminoácido), que incluyen composiciones y métodos para generar un ratón que expresa tales genes a partir de un promotor de ratón y una secuencia reguladora de ratón. Los métodos incluyen obtener selectivamente un gen de NaV1.7 endógeno de ratón no funcional (por ejemplo, por la eliminación de su subunidad a), y emplear una subunidad a de un gen de NaV1.7 humano en el locus del gen de v17 endógeno de ratón para expresar un gen de la subunidad a de NaV1.7 humana en un ratón. La eliminación del gen de NaV1.7 de ratón se realiza por eliminación del gen de la subunidad a, pero no de un gen de la subunidad p. El enfoque obtiene selectivamente el gen de la subunidad a de NaV1.7 no funcional mientras mantiene una subunidad p endógena funcional.
El enfoque del reemplazo de la subunidad a de NaV17 endógena emplea una interrupción relativamente mínima en la transducción natural de señales mediadas por NaV1.7 en el animal, en diversas modalidades, porque la secuencia genómica de las subunidades a de NaV1.7 se reemplazan en un solo fragmento y por lo tanto mantienen la funcionalidad normal al incluir las secuencias reguladoras necesarias. Así, en tales modalidades, la modificación de la subunidad a de NaV1.7 no afecta otros genes de canales NaV endógenos dependientes de las subunidades p funcionales. Además, en diversas modalidades la modificación no afecta el ensamblaje de un complejo receptor funcional en el que participa una subunidad a de NaV1.7 y una subunidad p endógena, que se cree que es necesaria para la activación adecuada del canal y la modulación de la expresión del canal de las subunidades a de NaV1.7 en la superficie celular y para la señalización corriente abajo resultante de un canal activado. Debido a que las subunidades p no se eliminan, los animales que contienen un reemplazo de un gen de la subunidad a de NaV1.7 endógeno con un gen de la subunidad a de NaV1.7 humano deben ser capaces de procesar las funciones normales del canal NaV dependiente de voltaje del paso de Na+ a la célula a través del poro de la subunidad a de NaV1.7 humana presente en la superficie de las neuronas.
Una ilustración esquemática (no a escala) de un gen de NaV1.7 endógeno de ratón eliminado se proporciona en la Fig. 2. Como se ilustra, la subunidad a de NaV1.7 de ratón se codifica por 28 exones que abarcan más de 80 kb de secuencia. El gen de NaV1.7 endógeno de ratón se elimina por una construcción de transformación (Vector de transformación de NaV1.7 de ratón) con un casete de resistencia a neomicina flanqueado por sitios de recombinación. Este locus endógeno codifica la subunidad a del gen de NaV1.7 de ratón responsable de la generación de potenciales de acción desencadenados por la despolarización de la membrana celular en respuesta al flujo de iones Na+ al interior de la célula.
Un ratón genéticamente modificado que carece de una secuencia de nucleótidos que codifica una subunidad a del gen de NaV1.7 endógeno puede generarse mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, puede generarse un vector de transformación que elimine el gen de NaV1.7 de ratón con un gen de marcador de selección. La Fig. 2 ilustra un genoma de ratón (parte inferior) transformado por una construcción de transformación que tiene un brazo de homología en 5' que contiene la secuencia corriente arriba del exón 6 del locus de NaV17 endógeno, seguido de un casete de selección por fármaco (por ejemplo, un gen de resistencia a neomicina flanqueado por secuencias loxP), y un brazo de homología en 3' que contiene la secuencia corriente abajo del exón 27 del locus de NaV1.7 endógeno. Tras la recombinación homóloga en el locus, el locus de NaV1.7 endógeno se reemplaza por un casete de selección por fármaco (Fig. 2, parte inferior). El locus de NaV1.7 endógeno se elimina de esta manera y da como resultado una célula o animal no humano que no expresa la subunidad a de NaV1.7 endógena. El casete de selección por fármaco puede eliminarse opcionalmente mediante la adición posterior de una recombinasa (por ejemplo, mediante tratamiento con Cre).
La modificación genética de un ratón para obtener un gen de NaV1.7 endógeno no funcional, en diversas modalidades, da como resultado un ratón que presenta defectos en los procesos del sistema nervioso, por ejemplo, en la transmisión de la información nociceptiva, lo que hace que el ratón sea útil para evaluar la función del gen de NaV1.7 endógeno en la función neuronal normal y trastornada. En diversas modalidades, modificar la subunidad a del gen de NaV1.7 endógeno, pero no las subunidades p, evita la reducción potencial de otros genes de NaV (por ejemplo, NaV1.6, NaV1.8, NaV1.9, etc.) que requieren las subunidades p para regular la activación dependiente de voltaje del canal, y mantiene de esta manera otras funciones y procesos diversos mediados por procesos dependientes de la subunidad p.
De acuerdo con los informes, las eliminaciones completas del gen de NaV1.7 endógeno en los ratones es letal. Sin embargo, se lograron eliminaciones en subconjuntos específicos de células y parecen normales. Los ratones de acuerdo con la presente descripción tienen un locus de NaV1.7 endógeno funcionalmente silenciado debido a que carecen de la capacidad de producir una subunidad a de NaV1.7 funcional en la superficie celular.
Una ilustración esquemática (no a escala) de un gen de NaV1.7 endógeno de ratón reemplazado con un gen de NaV1.7 humano se proporciona en la Fig. 3. Como se ilustra, un locus de NaV1.7 endógeno de ratón que se eliminó
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se reemplaza por una construcción de transformación (Vector de transformación de NaV1.7 humana) con un casete de resistencia a higromicina flanqueado por sitios de recombinación. El locus reemplazado resultante codifica una proteína subunidad a de NaV1.7 humana que se expresa en la superficie de las neuronas en el animal huésped capaz de mediar los potenciales de acción desencadenados por la despolarización de la célula en respuesta al flujo de iones Na+ en la célula en el animal huésped.
Un ratón genéticamente modificado que expresa una subunidad a de NaV1.7 humana en el locus de NaV1.7 endógeno de ratón puede generarse mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, puede generarse un vector de transformación que introduce el gen de NaV1.7 humano con un gen de marcador de selección. La Fig. 3 ilustra un genoma de ratón que comprende un reemplazo del locus de NaV1.7 endógeno (parte inferior). La construcción de transformación contiene un brazo de homología en 5' que contiene la secuencia corriente arriba del locus de NaV1.7 endógeno de ratón, seguido de un fragmento genómico que contiene un gen de NaV1.7 humano, un casete de selección por fármaco (por ejemplo un gen de resistencia a higromicina flanqueado en ambos lados por secuencias loxP), y un brazo de homología en 3' que contiene la secuencia corriente abajo del locus de NaV1.7 endógeno de ratón. Tras la recombinación homóloga en el locus endógeno, el casete de selección por fármaco se reemplaza por la secuencia contenida en el vector de transformación (parte inferior de la Fig. 3). El locus de NaV1.7 endógeno eliminado se reemplaza de esta manera con un gen de NaV1.7 humano y da como resultado una célula o animal que expresa un gen de NaV1.7 humano. El casete de selección por fármaco puede eliminarse opcionalmente mediante la adición posterior de una recombinasa (por ejemplo, mediante tratamiento con Cre).
Pueden lograrse otras modificaciones en el locus endógeno con un esfuerzo mínimo mediante el uso de técnicas similares para crear un locus que comprende un gen quimérico. Por ejemplo, ilustraciones esquemáticas del reemplazo de dos bucles extracelulares del poro entre los segmentos de transmembrana 5 y 6 de los dominios I y III del gen de NaV1.7 endógeno de ratón se proporcionan en la Fig. 4 y la Fig. 5, respectivamente. Como se ilustra, porciones discretas de un gen de NaV1.7 humano se insertan en el locus de NaV1.7 endógeno de ratón por otras construcciones de transformación (Vector de transformación de NaV1.7 DI/S5-S6 humana y vector de transformación de NaV1.7 DIII/S5-S6 humana) con fragmentos genómicos que codifican cada uno un bucle extracelular de un gen de NaV1.7 humano ubicado en el poro del canal y responsable de permitir el paso de iones Na+ al espacio intracelular. Tras la recombinación con cualquiera de los vectores de transformación ilustrados, un fragmento genómico del locus de NaV1.7 endógeno, que codifica un bucle extracelular del poro de la proteína NaV1.7 endógena, se reemplaza por un fragmento genómico humano que codifica el bucle del poro correspondiente en una proteína NaV1.7 humana. Esto crea un locus quimérico que produce una proteína NaV1.7 quimérica que comprende bucles extracelulares humanos en el poro de una proteína canal NaV1.7.
Un ratón genéticamente modificado que expresa un bucle extracelular del poro de un canal NaV1.7 humano en el locus de NaV1.7 endógeno de ratón puede generarse mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, puede generarse un vector de transformación que introduce un fragmento genómico que codifica un bucle extracelular del poro de un canal NaV1.7 humano con un gen de marcador de selección. Las Fig. 4 y 5 ilustran cada una un genoma de ratón que comprende reemplazos independientes de bucles extracelulares ubicados en el poro de una proteína canal NaV1.7. Cada construcción de transformación contiene un brazo de homología en 5' que contiene la secuencia corriente arriba de la secuencia de NaV17 endógena de ratón a reemplazar, seguido de un fragmento genómico que contiene una secuencia humana correspondiente a la secuencia del gen de NaV1.7 endógeno de ratón que codifica un bucle extracelular del poro específico, un casete de selección por fármaco (por ejemplo, un gen de resistencia a la neomicina flanqueado en ambos lados por secuencias loxP), seguido de un brazo de homología en 3' que contiene la secuencia corriente abajo de la secuencia de NaV1.7 endógena de ratón. Tras la recombinación homóloga en el locus endógeno con cualquiera de los vectores de transformación, se inserta un fragmento genómico en el locus de NaV1.7 endógeno de ratón lo que da como resultado un locus quimérico capaz de expresar una proteína canal NaV1.7 que comprende una secuencia humana correspondiente a un bucle extracelular del poro (Fig. 4 y 5, parte inferior). El casete de selección por fármaco puede eliminarse opcionalmente mediante la adición posterior de una recombinasa (por ejemplo, mediante tratamiento con Cre).
Modelos experimentales de ratones con Nav1.7 humanizada
Los animales no humanos genéticamente modificados que expresan genes de NaV1.7 humanos son útiles, por ejemplo, para dilucidar las diversas funciones de NaV1.7 en las células del sistema nervioso, para medir la eficacia de un agente terapéutico que se une a la proteína NaV1.7 que se expresa en la superficie celular, para determinar una función del canal NaV1.7 en mecanismos de dolor y trastornos de dolor, para servir como modelos de dolor agudo y/o dolor crónico, y para servir como parejas de cría para generar otros ratones genéticamente modificados de interés. Son útiles, además, para preparar fracciones de membrana o vesículas que comprenden proteínas NaV1.7 completamente humanas o quiméricas humana-murina, para identificar antagonistas de NaV1.7 humana.
En una modalidad, un ratón de acuerdo con la descripción se usa para determinar el mecanismo de activación del canal que se regula por los bucles extracelulares ubicados en el poro de los canales NaV humanos. En una modalidad, un ratón de la presente descripción se inyecta con toxinas que se unen a bucles extracelulares del poro de un canal NaV humano en la superficie celular y, después de un período de tiempo posterior, se somete a un
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intervalo de estímulos para activar el disparo de potenciales de acción. La identidad de la toxina se conoce antes de la inyección y los animales se analizan en cuanto a la afectación de las respuestas eléctricas dependientes de NaV1.7 por comparación con las respuestas eléctricas observadas en animales de tipo silvestre.
En otro aspecto, se proporcionan animales no humanos genéticamente modificados que comprenden un reemplazo del gen de NaV1.7 endógeno con un gen de NaV1.7 humano. Tales animales son útiles para estudiar la eficacia de los agentes terapéuticos para bloquear la función de NaV1.7. Además, se demostró que la proteína NaV1.7 humana presenta formas mutantes asociadas con la enfermedad (por ejemplo IEM, PEPD y CIP). Así, los animales no humanos genéticamente modificados que comprenden un reemplazo del gen de NaV1.7 endógeno con formas mutantes específicas de los genes de NaV1.7 humanos pueden usarse para estudiar trastornos humanos asociados con mutaciones de NaV1.7 en el animal. En una modalidad específica, las formas mutantes de la proteína NaV1.7 humana se asocian con la respuesta al dolor.
Las variantes adecuadas incluyen formas mutantes de NaV1.7 humana que se conocen en la técnica. Las variantes asociadas con el trastorno IEM incluyen, por ejemplo, mutaciones que desplazan la activación de NaV1.7 a un potencial más negativo. Las mutaciones de NaV1.7 ilustrativas que conducen a IEM incluyen Q10R, 1136V, F216S, S241T, N395K, V400M, L823R, I848T, L858H, L858F, A863P, V872G y F1449V. En una modalidad, la secuencia de NaV1.7 humana comprende una mutación con cambio de sentido que causa el trastorno IEM. En una modalidad específica, la mutación con cambio de sentido que causa el trastorno IEM se selecciona de I848T y L858H.
Las variantes asociadas con el trastorno PEPD incluyen, por ejemplo, mutaciones que comprometen la inactivación de una subunidad a de NaV1.7. Se demostró que las mutaciones que causan PEPD desplazan la inactivación rápida en estado estable de una subunidad a de NaV1.7 hacia un estado caracterizado por potenciales más despolarizados que causan un aumento notable en la corriente continua. Se informó que tales mutaciones ocurren, por ejemplo, en los aminoácidos que unen DIII y DIV, que contienen un motivo de inactivación asociado con la inactivación de la subunidad a de NaV1.7. Las mutaciones de NaV1.7 ilustrativas que conducen a PEPD incluyen R996C, V1298D, V1298F, V1299F, I1461T, F1462V, T1464I, M1627K y A1632E. En una modalidad, la secuencia de NaV1.7 humana comprende una mutación seleccionada de I1461T, M1627K y A1632E.
Las variantes asociadas con el trastorno CIP incluyen, por ejemplo, mutaciones sin sentido homocigóticas de un solo nucleótido y mutaciones heterocigóticas combinadas, que incluyen mutaciones sin sentido en un alelo y una mutación por eliminación en el otro alelo. La mutación por eliminación puede ser de secuencias codificantes o no codificantes, la última de las cuales puede conducir a empalmes defectuosos que silencian funcionalmente la subunidad a de NaV1.7. Las mutaciones sin sentido son cambios en la secuencia de ADN, que introducen codones de parada prematuros, y causan que cualquier proteína resultante se acorte anormalmente. Esto puede causar una pérdida de la función en la proteína, ya que las partes críticas de la cadena de aminoácidos ya no se traducen. En consecuencia, los animales no humanos de la presente descripción que comprenden una subunidad a de NaV1.7 humana con una mutación que silencia funcionalmente a la subunidad a de NaV1.7 humana demuestran una ausencia de dolor en respuesta a estímulos nociceptivos.
Las mutaciones silenciadoras ilustrativas en un gen de NaV1.7 incluyen mutaciones sin sentido, eliminaciones de uno o más nucleótidos en una secuencia de ADN de NaV17, mutaciones en la unión de empalme de los exones y mutaciones de desplazamiento del marco de lectura. En una modalidad, el animal no humano genéticamente modificado es heterocigótico para una mutación silenciadora que conduce a CIP, en donde un alelo de un gen de NaV1.7 comprende una mutación sin sentido y el otro alelo de NaV1.7 comprende una mutación de desplazamiento del marco de lectura seleccionada de F1200L e I1235L. En otra modalidad, el animal no humano genéticamente modificado es homocigótico para una mutación sin sentido que conduce a CIP. En una modalidad, la mutación sin sentido comprende una proteína subunidad a de NaV1.7 truncada que termina en un residuo de aminoácido seleccionado de 259, 277, 328, 459, 693, 767, 830, 897, 1488, 1659 y 1689. En una modalidad específica, la proteína subunidad a de NaV1.7 humana termina en un residuo de aminoácido que se selecciona de 693 y 1488.
La expresión de la proteína NaV1.7 de ratón en ratones enteros se analizó mediante el uso de un sistema reportero que comprende una fusión de un gen reportero LacZ con NaV1.7 de ratón. El análisis de la señal de LacZ en ratones enteros reveló que NaV1.7 se expresa en todo el sistema nervioso del ratón, que incluye en el cerebro (incluidos los ganglios del bulbo olfatorio), tálamo, hipotálamo, mesencéfalo, puente, médula, colículo, núcleo óptico, corteza cerebral y sustancia gris de la médula espinal (por ejemplo, dorsal/sensorial), ganglios de las raíces dorsales, cadena ganglionar simpática, ganglios del trigémino, ganglio celíaco, plexo nervioso del intestino, y en ganglios más pequeños en todo el cuerpo (por ejemplo, lengua, esófago, tráquea, bronquios, corazón).
Así, pueden generarse células, líneas celulares y cultivos celulares a partir de los tejidos mencionados anteriormente como fuente de la proteína NaV1.7 de ratón. Además, los ratones genéticamente modificados de acuerdo con la descripción expresan una NaV1.7 parcialmente o completamente humanizada en los tejidos mencionados anteriormente. Así los tejidos y células de los ratones genéticamente modificados, que incluyen líneas celulares y cultivos celulares, pueden generarse para servir como fuente de NaV1.7 humanizada para su uso en ensayos de unión y funcionales, por ejemplo, para ensayar la unión o función de un agonista o antagonista de NaV1.7, particularmente cuando el agonista o antagonista es específico para una secuencia de NaV1.7 humana.
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Las células de ratones genéticamente modificados pueden aislarse y usarse de forma ad hoc, o pueden mantenerse en cultivo durante muchas generaciones. En una modalidad, las células de los ratones genéticamente modificados se inmortalizan y se mantienen en cultivo indefinidamente. (por ejemplo, en cultivos seriados).
En un aspecto, los ratones genéticamente modificados se usan para generar ganglios de las raíces dorsales modificados (GRD) que comprenden una o más de las proteínas Nay1.7 modificadas. Los GRD modificados se emplean en ensayos ex vivo para determinar el efecto de un agente de unión a Nay1.7 en la función de la proteína Nay1.7 y en la función de otras proteínas, por ejemplo, otros miembros de la familia de NaV. En una modalidad, los GRD modificados de un ratón se aíslan y se ensayan para comprobar una o más funciones de NaV1.7 en presencia y ausencia de un agente de unión a NaV1.7 (por ejemplo, un agonista o antagonista de Nav1.7). En una modalidad, los GRD modificados se aíslan y ensayan para comprobar la función de uno o más miembros de la familia de NaV en presencia y ausencia de un agente de unión a NaV1.7. En una modalidad, los GRD modificados se ensayan en presencia del agente de unión para comprobar la función de un canal o proteína de una familia que no es la de NaV.
En una modalidad, se proporciona un método para determinar el efecto de un agente de unión a NaV1.7 en un canal de GRD que no es un miembro de la familia de NaV, que comprende exponer los GRD modificados que comprenden a un agente de unión a NaV1.7, y medir la función de un canal de GRD de un miembro de una familia que no es la de NaV.
En otro aspecto, se proporciona un método para determinar el efecto de un producto terapéutico humano en una NaV1.7 humana, en donde el producto terapéutico humano no se une a una proteína NaV1.7 humana, que comprende exponer un GRD modificado al producto terapéutico humano en un ensayo ex vivo, y medir un efecto del producto terapéutico humano en una función de la proteína NaV1.7 humana.
En diversas modalidades y aspectos, se ensaya un GRD o un GRD modificado o se determina una función de una proteína de GRD o una proteína de GRD modificado en un protocolo de fijación de membranas, un protocolo de obtención de imágenes de calcio, un protocolo de tinción sensible a membrana, en un ensayo ex vivo.
En un aspecto, se proporciona un cultivo celular, en donde el cultivo celular comprende una célula de un ratón genéticamente modificado como se describe en la presente descripción, en donde un número sustancial de las células en el cultivo expresa una secuencia de NaV1.7 humana. En una modalidad, las células que expresan la secuencia de NaV1.7 humana se inmortalizan. En una modalidad, las células se derivan de un tejido que se selecciona de cerebro (que incluye los ganglios del bulbo olfatorio), tálamo, hipotálamo, mesencéfalo, puente, médula, colículo, núcleo óptico, corteza cerebral, sustancia gris de la médula espinal (por ejemplo, dorsal/sensorial), ganglios de las raíces dorsales, cadena ganglionar simpática, ganglios del trigémino, ganglio celíaco, plexo nervioso del intestino, y en ganglios más pequeños de todo el cuerpo (por ejemplo, lengua, esófago, tráquea, bronquios, corazón).
En un aspecto, se proporciona un método para determinar si un posible agonista o antagonista de NaV1.7 se une a una proteína NaV1.7 humana, que comprende exponer el posible agonista o antagonista de NaV1.7 a una célula como se describe en la presente descripción, y determinar si el posible agonista o antagonista de NaV1.7 se une a la célula.
En una modalidad, el agonista o antagonista de la NaV1.7 humana se selecciona de una proteína, un péptido, y una molécula pequeña (por ejemplo, un compuesto orgánico no proteico). En una modalidad específica, la proteína comprende un dominio variable de inmunoglobulina o un fragmento de unión a NaV1.7 de este. En una modalidad específica, la proteína es un anticuerpo anti-NaV1.7 humana.
En un aspecto, se proporciona un método para determinar si una preparación farmacéutica afecta una función de una NaV1.7 humana, que comprende exponer la preparación farmacéutica a una célula como se proporciona en la presente descripción que expresa una proteína NaV1.7 humana, y medir una función de la NaV1.7 de la célula.
En una modalidad, la función de NaV1.7 que se mide es la activación de nociceptores primarios. En una modalidad específica, la función que se mide es la liberación del péptido relacionado con el gen de calcitonina (CGRP) por la célula.
En una modalidad, la preparación farmacéutica comprende una proteína, un péptido, o un análogo peptídico. En una modalidad específica, la proteína comprende un dominio variable de inmunoglobulina o un fragmento de unión a NaV1.7 de este. En una modalidad específica, la proteína es un anticuerpo anti-NaV1.7 humana.
En un aspecto, se proporciona un ensayo de aseguramiento de la calidad para una preparación farmacéutica que comprende un agente que se une a una secuencia de NaV1.7 humana, que comprende obtener una muestra de una preparación farmacéutica y exponer la preparación a un ratón o a una célula como se describe en la presente descripción, donde el ratón o la célula expresa una secuencia de NaV1.7 humana, y determinar (a) si la preparación farmacéutica se une a la célula, y/o (b) determinar si la preparación farmacéutica afecta a una función de la NaV1.7 de la célula.
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En una modalidad, la preparación farmacéutica es un anticuerpo humano aislado o un fragmento de este. En una modalidad, la preparación farmacéutica es un bloqueador de canales iónicos que no es un anticuerpo o un análogo de este.
Liberación de neuropéptidos de neuronas de ratones con Nav1.7 humanizada
Las neuronas nociceptivas primarias son susceptibles de varias técnicas de investigación bien establecidas, tales como registros de electrofisiología, obtención de imágenes de calcio y medición de liberación de neuropéptidos espontánea y estimulada, que proporcionan información sobre funciones celulares y moleculares de neuronas individuales o subpoblaciones neuronales.
El péptido relacionado con el gen de calcitonina (CGRP), un péptido de 37 aminoácidos, se sintetiza predominantemente y se almacena en las neuronas sensoriales y puede liberarse desde los axones centrales y periféricos. (Poyner, D.R. 1992. Calcitonin gene-related peptide: multiple actions, multiple receptors. Pharmacol. Ther. 56(1): 23-51). La liberación de CGRP desde las terminales de los nervios sensoriales en los tejidos periféricos desempeña una función clave en la inflamación neurogénica, mientras que la liberación desde las terminales en el asta dorsal de la médula espinal modula la transmisión del dolor. (Oku, R., M. Satoh, N, Fujii, A. Otaka, H. Yajima, y H. Takagi. 1987. El péptido relacionado con el gen de calcitonina promueve la nocicepción mecánica al potenciar la liberación de la sustancia P del asta dorsal espinal en las ratas. Brain Res. 403(2): 350-354). Los ratones con desactivación génica de CGRP muestran una respuesta atenuada al dolor químico y a la inflamación (Salmon, A., M.I. Damaj, L.M. Marubio, M.P. Epping-Jordan, E. Merlo-Pich, y J.P. Changeux. 2001. Altered neuroadaptation in opiate dependence and neurogenic inflammatory nociception in aCGRP-deficient mice. Nature Neuroscience 4(4): 357-358), que implica que CGRP participa en la regulación de la respuesta al dolor.
Una variedad de mediadores de la inflamación, como la prostaglandina E2, bradiquinina, y protones, u otros estimulantes tales como el pH bajo, factores neurotróficos y capsaicina desempeñan una función esencial en la inducción del dolor. Además, se sabe que los mediadores de la inflamación inducen la liberación de neuropéptidos mediante la activación de receptores de membrana específicos. Por ejemplo, los mediadores de la inflamación tales como la prostaglandina E2 y la bradiquinina excitan y sensibilizan las neuronas de GRD lo que conduce a potenciales de acción bloqueados por la tetrodotoxina (Noda, K., Y. Ueda, K. Suzuki, y K. Yoda. 1997. Excitatory effects of algesic compounds on neuronal processes in murine dorsal root ganglion cell culture. Brain Res. 751 (2): 348-351; Nicol G.D. y M. Cui. 1994. Enhancement by prostaglandin E2 of bradykinin activation of embryonic rat sensory neurons. Journal Physiol. 480(Pt 3): 485-492; Momin A. y P.A. McNaughton. 2009. Regulation of firing frequency in nociceptive neurons by pro-inflammatory mediators. Exp Brain Res. 196(1): 45-52). Se demostró, además, que estos mediadores regulan la expresión de CGRP en neuronas de ganglios de las raíces dorsales (GRD) cultivadas (Supowit S.C., H. Zhao, K.A. Katki, P. Gupta, y D. J. Dipette 2011. Bradykinin and prostaglandin E1 regulate calcitonin gene-related peptide expression in cultured rat sensory neurons. Regul Pept. 167(1): 105-111; Averbeck, B., I. Izydorczyk, y M. Kress. 2000. Inflammatory mediators release calcitonin gene-related peptide from dorsal root ganglion neurons of the rat. Neuroscience 98(1): 135-140). Más aún, la prostaglandina E2 potencia la liberación de CGRP estimulada por bradiquinina y capsaicina (Vasko M.R., W. B. Campbell, y K. J. Waite. 1994. Prostaglandin E2 enhances bradykinin-stimulated release of neuropeptides from rat sensory neurons in culture. J. Neurosci. 14(8): 4987-4997; Southhall, M.D. y M. R. Vasko. 2001. Prostaglandin receptor subtypes EP3C and EP4 mediate the prostaglandin E2-induced cAMP production and sensitization of sensory neurons. J. Biol. Chem. 276: 16083-16091). La liberación de CGRP de los nervios estimulados se bloquea por el antagonista del canal de sodio tetrodotoxina (TTX) y por la conotoxina omega (CTX) pero no por la nifedipina, un bloqueador de canales de calcio conocido. (Lundberg, J. M., A. Franco-Cereceda, K. Alving, P. Delay-Goyet, y Y. Lou. 1992. Release of Calcitonin Gene-Related Peptide from Sensory Neurons. Ann NY Acad. Sci. 657:187-93). Estos últimos hallazgos sugieren que si bien los canales de calcio de tipo N son importantes para la exocitosis del péptido desde los depósitos ubicados en las vesículas con núcleo denso grandes de los aferentes primarios, los canales de sodio también desempeñan una función en la liberación de CGRP. Se demostraron características similares para la liberación de péptido evocada por bajas concentraciones de capsaicina, que también es sensible tanto a TTX como a CTX. Sin embargo, la alta concentración de capsaicina causa una liberación masiva de CGRP que solo se inhibe marginalmente, en todo caso, por TTX o CTX. (Lou Y.P., A. Franco-Cereceda, y J. M. Lundberg. 1992. Different ion channel mechanisms between low concentrations of capsaicin and high concentrations of capsaicin and nicotine regarding peptide release from pulmonary afferents. Acta Physiol. Scand. 146(1): 119-127). Estos informes sugieren que la liberación de CGRP inducida por diferentes agentes inflamatorios depende de diferentes canales/receptores y/o vías. Así, la estimulación correcta para la interacción de receptores diana específicos conocidos por su asociación con las respuestas al dolor puede identificarse a través de la medición de la liberación de CGRP desde las neuronas. Esto permite el análisis funcional específico de un receptor diana y el descubrimiento de cómo funciona el receptor diana en las respuestas al dolor.
La despolarización de neuronas conduce a un aumento en la expresión y liberación de neuropéptidos, en particular un aumento en la expresión de CGRP. La liberación de CGRP se usó en varios estudios para evaluar la mediación de la respuesta al dolor y la caracterización de la función neuronal que incluye la generación de potenciales de acción con respecto a otros canales (aunque no en canales de sodio). Como se describió anteriormente, se demostró que los mediadores de la inflamación, por ejemplo, bradiquinina y prostaglandina E2, inducen la liberación
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de CGRP del ganglio de la raíz dorsal (GRD) en cultivo (Averbeck, B. et al., supra; Tumati, S., W. R. Roeske, T. W. Vanderah, y E. V. Varga. 2010. Sustained morphine treatment augments prostaglandin E2-evoked calcitonin gene- related peptide release from primary sensory neurons in a PKA-dependent manner. Eur. J. Pharmacol. 648(1-3):95- 101). Aunque la liberación de CGRP in vitro a partir de GRP reveló una función esencial para los canales de calcio, la participación en los canales de sodio se mantuvo menos clara (Ai, X., S. E. MacPhedran, y A. K. Hall. 1998. Depolarization stimulates initial CGRP expression by embryonic sensory neurons in vitro. J. Neurosci. 18(22): 92949302; Strecker, T., K. Messlinger, M. Weyand, y P. W. Reeh. 2005. Role of different proton-sensitive channels in releasing calcitonin gene-related peptide from isolated hearts of mutant mice. Cardiovasc. Res. 65(2):405-410; Spitzer, M. J., P. W. Reeh, y S. K. Sauer. 2008. Mechanisms of potassium- and capsaicin-induced axonal calcitonin gene-related peptide release: involvement of L- and T-type calcium channels and TRPV1 but not sodium channels. Neurosci. 151(3):836-842). Así, se mantiene la necesidad de desarrollar ensayos que evalúen la función neuronal mediada por canales de sodio, en particular mediante la aplicación de GRD que expresan una proteína NaV1.7 humana.
Los métodos para la medición de la liberación de neuropéptidos de neuronas aisladas de ratones que expresan NaV1.7 humana son útiles, por ejemplo, para dilucidar la función de las neuronas nociceptivas que expresan una proteína NaV1.7 humana en respuesta a mediadores de la inflamación mediante la medición de la liberación de CGRP. Son útiles, además, para la identificación de antagonistas específicos para NaV1.7 a través de la evaluación de su capacidad para alterar o modificar la liberación de CGRP inducida por un mediador de la inflamación en un GRD aislado de ratones que expresan una proteína NaV1.7 humana.
Las neuronas de GRD, conocidas por expresar NaV1.7, liberan CGRP después de la despolarización. Esta propiedad de las neuronas de GRD sugiere que los GRD que expresan NaV1.7 humana pueden usarse en un ensayo como un medio para identificar antagonistas de NaV1.7 mediante el uso de la medición del CGRP liberado del GRD aislado en cultivo. Así, las neuronas (por ejemplo, las neuronas de GRD) que expresan una NaV1.7 humana o una NaV1.7 quimérica pueden emplearse en un ensayo para identificar antagonistas de NaV1.7 que interactúan con los canales NaV1.7 humanos o quiméricos en las neuronas de GRD y evaluar la actividad funcional del canal a través de la medición de la liberación de CGRP. En tal ensayo, por ejemplo, la NaV1.7 humana o quimérica se incuba con un inhibidor de NaV1.7 (por ejemplo, tetrodotoxina) durante aproximadamente veinte minutos, seguido de la estimulación con uno o más mediadores de la inflamación (por ejemplo, prostaglandina E2, bradiquinina y capsaicina) durante otros veinte minutos. En este ensayo pueden emplearse antagonistas candidatos adicionales para evaluar su potencial terapéutico y su capacidad para bloquear la función del canal NaV1.7. Una vez que se determinan las mediciones basales de la liberación de CGRP de las neuronas que expresan una NaV1.7 humana o quimérica tanto en presencia de un inhibidor de NaV1.7 conocido (por ejemplo, TtX) como en la ausencia de un inhibidor conocido (es decir, con mediadores de la inflamación solamente), el aumento en la liberación de CGRP puede determinarse fácilmente cuando se emplean antagonistas candidatos en este ensayo. Así, un ensayo adaptado para la interacción con una proteína canal NaV tal como NaV1.7 es útil, por ejemplo, para la identificación de antagonistas específicos para NaV1.7 a través de la evaluación de su capacidad de alterar o modificar el nivel de liberación de CGRP en un GRD aislado de ratones que expresa una proteína NaV1.7 humana que se expone a mediadores de la inflamación.
En la presente descripción se describen ensayos que miden la liberación de neuropéptidos en células neuronales en respuesta a uno o más mediadores de la inflamación, que pueden usarse como pruebas funcionales para seleccionar antagonistas para un receptor diana. Específicamente, en la presente descripción se describen ensayos que miden la liberación de CGRP a partir de GRD cultivados para la evaluación de la función del canal de sodio en presencia y ausencia de antagonistas específicos, en particular los GRD expresan una proteína NaV1.7 humana, y que proporcionan nuevos métodos in vitro para la evaluación de la activación de nociceptores primarios. En una modalidad, las neuronas de GRD se ponen en contacto con uno o más mediadores de la inflamación (por ejemplo, prostaglandina E2, bradiquinina y capsaicina, para interactuar específicamente con canales NaV sensibles a TTX, específicamente a NaV1.7) y se determina la liberación de CGRP inducida por los mediadores de la inflamación.
Las neurotrofinas tales como GDNF, neurturina y artemina demostraron potenciar la liberación de CGRP que se induce por capsaicina (Schmutzler, B. S., S. Roy, y C. M. Hingtgen. 2009. Glial cell line-derived neurotrophic factor family ligands enhance capsaicin-stimulated release of calcitonin gene-related peptide from sensory neurons. Neurosci. 161:148-156; Schmutzler, B. S., S. Roy, S. K. Pittman, R. M. Meadows, y C. M. Hingtgen. 2011. Ret- dependent and Ret-independent mechanisms of Gfl-induced sensitization. Molecular Pain 7:1-22). Las neurotrofinas se unen, preferentemente, a su propio receptor de la familia GDNF (GFRa1, GFRa2 y GFRa3), y existe una coexpresión del 90 % de GFRa3 con TRPV1, que se conoce, además, como el receptor de capsaicina. La capsaicina es un agonista de TRPV1 y casi todas las neuronas que expresan TRPV1 también expresan CGRP. La artemina sola no cambia el nivel basal de la liberación de CGRP. Sin embargo, la preincubación con artemina durante diez minutos antes de la estimulación con 1 pM de capsaicina potencia significativamente la liberación de CGRP. Así, un ensayo en el que las neuronas se incuban con artemina (por ejemplo, a 10 ng/ml) o GDNF (por ejemplo, a 10 ng/ml) durante diez minutos, seguido de la estimulación con capsaicina durante otros diez minutos, puede emplearse para interactuar específicamente con GFRa3 y evaluar la actividad funcional del receptor a través de la medición de la liberación de CGRP de las neuronas de GRD in vitro. Además, el ensayo puede emplear antagonistas específicos de, por ejemplo, GFRa3 para determinar su capacidad para bloquear la actividad y/o
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función del receptor.
El principio del ensayo puede adaptarse a otro receptor diana, por ejemplo, TRPA1. Se demostró que el aceite de mostaza, un agonista específico de TRPA1, induce la liberación de CGRP de la piel aislada de las patas traseras de las ratas (Ruparel, N. B., A. M. Patwardhan, A. N. Akopian, y K. M. Hargreaves. 2008. Homologous and heterologous desensitization of capsaicin and mustard oil responses utilize different cellular pathways in nociceptors. Pain 135:271-279). Así, un ensayo en el que las neuronas de GRD aisladas de un ratón como se describe en la presente descripción, se exponen al aceite de mostaza podría usarse para interactuar específicamente con TRPA1 para que sirva como un medio para evaluar funcionalmente la actividad de TRPA1 a través de la medición de la liberación de CGRP de las neuronas de GRD in vitro. Además, podrían emplearse antagonistas específicos en el ensayo para determinar su capacidad de bloquear la actividad y/o función de TRPA1.
El principio del ensayo puede adaptarse para otro receptor diana, por ejemplo, ASIC1 y/o ASIC3. ASIC1 y ASIC3 son canales catiónicos activados por protones que se activan mediante variaciones de pH externas en el intervalo de pH 6.8 a 4.0. Se demostró que un pH bajo desencadena la liberación de CGRP. Así, un ensayo en el que las neuronas de GRD aisladas de un ratón como se describe en la presente descripción, se exponen a condiciones de pH bajo en cultivo podría usarse para interactuar específicamente con ASIC1 (o ASIC3) para servir como un medio para evaluar funcionalmente la actividad de ASIC1 (o ASIC3) a través de la medición de la liberación de CGRP de las neuronas de GRD in vitro. Además, podrían emplearse antagonistas específicos en el ensayo para determinar su capacidad de bloquear la actividad y/o función de ASIC1 (o ASIC3).
En un aspecto, se proporciona un método para medir la actividad de un receptor diana, que comprende poner en contacto un mediador de la inflamación con una célula que tiene un receptor diana codificado por un gen de ratón humanizado, en donde el mediador de la inflamación se une al receptor diana, y determinar la liberación de neuropéptidos mediada por el receptor de la célula. En una modalidad, el mediador de la inflamación es un ligando de NaV1.7, y el receptor diana es una NaV1.7 de ratón humanizada.
En un aspecto, se proporciona un método para interactuar selectivamente con un receptor diana, que comprende poner en contacto una célula aislada de un ratón como se describe en la presente descripción con uno o más mediadores de la inflamación, para de esta manera interactuar selectivamente con el receptor diana y determinar la liberación de un neuropéptido de la célula aislada.
En una modalidad, el receptor diana es un canal de sodio. En una modalidad específica, el canal de sodio es NaV1.7.
En una modalidad, la célula es una célula neuronal. En una modalidad específica, la célula neuronal es una célula de los ganglios de las raíces dorsales (GRD). En una modalidad, la célula es una célula inmortalizada.
En una modalidad, el uno o más mediadores de la inflamación se seleccionan de prostaglandina E2, bradiquinina, capsaicina, protones, pH bajo, un factor neurotrófico y una combinación de estos.
En una modalidad, el neuropéptido es un péptido relacionado con el gen de calcitonina (CGRP).
En una modalidad, el método se emplea como un ensayo funcional para seleccionar un antagonista del receptor diana.
En una modalidad, se proporciona un método para interactuar selectivamente con una proteína NaV1.7 en la superficie de un GRD aislado de un ratón como se describe en la presente descripción, que comprende poner en contacto el GRD con uno o más mediadores de la inflamación y de esta manera estimular selectivamente a NaV1.7 y determinar la liberación de CGRP.
En una modalidad, el uno o más mediadores de la inflamación comprenden prostaglandina E2, bradiquinina y capsaicina.
En una modalidad, el método se emplea como un ensayo funcional para seleccionar un antagonista de NaV1.7. En una modalidad específica, el antagonista es un anticuerpo.
En un aspecto, se proporciona un método para medir la liberación de CGRP a partir de un GRD aislado de un ratón como se describe en la presente descripción, en particular para determinar el efecto de un antagonista específico para NaV en la liberación de CGRP que se asocia con la despolarización de una proteína canal NaV1.7, en particular a través de la estimulación con uno o más mediadores de la inflamación (por ejemplo, prostaglandina E2, bradiquinina, serotonina, histamina y capsaicina).
En una modalidad, el GRD se inmortaliza.
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En una modalidad, el antagonista específico para Nav se selecciona de una proteína, una molécula pequeña, y un ARN interferente pequeño (siARN). En una modalidad específica, el antagonista específico para NaV es una proteína.
En una modalidad, un GRD aislado de un ratón como se describe en la presente descripción se cultiva en presencia
de una toxina específica para NaV y, después de un período de tiempo posterior, se determina la liberación de
CGRP, en donde un nivel de expresión de CGRP elevado indica inhibición de la función específica de NaV en la célula de GRD. La identidad del antagonista específico para NaV se conoce antes del cultivo con el GRD y el GRD se analiza en cuanto a los niveles basales de la expresión de CGRP en presencia y ausencia de uno o más mediadores de la inflamación.
En una modalidad, la toxina específica para NaV se selecciona de tetrodotoxina (TTX), ProTx-II y lidocaína. En una modalidad específica, la toxina específica para NaV es TTX.
En una modalidad, un GRD aislado de un ratón como se describe en la presente descripción se cultiva en presencia
de un anticuerpo específico para NaV1.7, y se determina la liberación de CGRP, en donde un nivel de expresión de
CGRP elevado indica la inhibición de la función de NaV1.7 en la célula de GRD. La identidad y el perfil bioquímico (por ejemplo, afinidad, especificidad, etc.) del anticuerpo específico para NaV1.7 se conoce antes del cultivo con el GRD y el GRD se analiza en cuanto al nivel basal de expresión de CGRP en presencia y en ausencia del uno o más mediadores de la inflamación.
En una modalidad el anticuerpo específico para NaV1.7 es un anticuerpo humano. En una modalidad el anticuerpo específico para NaV1.7 es un anticuerpo de ratón. En una modalidad el anticuerpo específico para NaV1.7 es un anticuerpo biespecífico.
Ejemplos
A menos que se indique lo contrario, la temperatura se indica en grados Celsius, y la presión es igual o cercana a la atmosférica. Los ejemplos que no entran dentro del alcance de las reivindicaciones son solo para fines ilustrativos.
Ejemplo I
Eliminación de un locus de Nav1.7 endógeno
El vector de transformación para introducir una eliminación del gen de NaV1.7 endógeno se generó mediante el uso de la tecnología VELOCIGENE® (ver, por ejemplo, la patente de los EE.UU. núm. 6,586,251 y Valenzuela, D.M., Murphy, A.J., Frendewey, D., Gale, N.W., Economides, A.N., Auerbach, W., Poueymirou, W.T., Adams, N.C., Rojas, J., Yasenchak, J., Chernomorsky, R., Boucher, M., Elsasser, A.L., Esau, L., Zheng, J., Griffiths, J.A., Wang, X., Su, H., Xue, Y., Dominguez, M.G., Noguera, I., Torres, R., Macdonald, L.E., Stewart, A.F., DeChiara, T.M., Yancopoulos, G.D. 2003. High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nature Biotech. 21(6): 652-659) para modificar el cromosoma artificial bacteriano (BAC) RP23-454H3 (Invitrogen). El ADN de BAC RP23-454H3 se modificó para eliminar el gen de NaV17 endógeno que comprende la subunidad a de este gen del canal NaV que se expresa en la superficie celular (Fig. 2).
Brevemente, brazos de homología corriente arriba y corriente abajo se derivaron para el ADN de BAC de ratón a partir de las ubicaciones 5' del exón 6 y 3' del exón 28 del locus de NaV1.7, respectivamente. Estos brazos de homología se usaron para generar un casete que eliminó ~81 kb del locus de NaV1.7 endógeno que comprende los exones del 6 al 28. Esta región se reemplazó con un casete de resistencia a neomicina flanqueado por sitios loxP (Fig. 2, parte intermedia). El vector de transformación final de 5' a 3' incluía un brazo de homología de 17 kb que comprendía la secuencia genómica de ratón 5' al exón 6 del locus de NaV1.7 endógeno, un sitio loxP 5', un casete de resistencia a neomicina, un sitio loxP 3' y un brazo de homología de 29 kb que comprende la secuencia genómica de ratón 3' al exón 28 del locus de NaV1.7 endógeno. El vector de transformación se linealizó mediante la digestión con Agel y después se usó en la recombinación homóloga en células bacterianas que contienen el clon BAC RP23- 454h3 de ratón para lograr una eliminación dirigida del locus de NaV1.7 endógeno (Fig. 2, parte inferior).
El ADN de BAC transformado (que se describió anteriormente) se usó para electroporar células ES de ratón para crear células ES modificadas que comprenden una eliminación del locus de NaV1.7 endógeno. Las células ES positivas que contienen un locus de NaV1.7 endógeno eliminado se identificaron por el ensayo de PCR cuantitativa mediante el uso de sondas TAQMAN® (Lie, Y. S. y C. J. Petropoulos. 1998. Curr. Opin. Biotechnology 9: 43-48). La región corriente arriba del locus eliminado se confirmó por PCR mediante el uso de los cebadores 867TUP2F (GGGACTTCTC TGGGTTCAGT TA; SEQ ID NO: 1) y 867TUP2R (AAAGGCTCTC AATGGGAAAC AAG; SEQ ID NO: 2) y la sonda 867TUP2P (TCAATGACTT GACATAATGC ATGCACTCC; SEQ ID NO: 3), mientras que la región corriente abajo del locus eliminado se confirmó mediante el uso de los cebadores 867TDPF (ATGTCAGCCA ATCCTTCTAA AGTG; SEQ ID NO: 4) y 867TDPR (CGTTTTGCCT AAGGCGGTAC; SEQ ID NO: 5) y la sonda 867TDPP (TCCTATGAGC CCATCACaAc CACAC; SEQ ID NO: 6). La presencia del casete de resistencia a neomicina del vector de transformación se confirmó mediante el uso de los cebadores NEOF (GGTGGAGAGG
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CTATTCGGC, SEQ ID NO: 7) y NEOR (GAACACGGCG GCATCAG; SEQ ID NO: 8) y la sonda NEOP (TGGGCACAAC AGACAATCgG CTG; SEQ ID NO: 9). La secuencia de nucleótidos a través del punto de eliminación corriente arriba incluyó la siguiente, que indica la secuencia endógena de ratón corriente arriba del punto de eliminación (contenido entre paréntesis a continuación) unida contiguamente a la secuencia del casete presente en el punto de eliminación: (CTAGCTGAGC TGTCACCACA CATTGCTCCT ACCACGTATT GTACAGCTAC TGCAAGAGCA CCACAGTTGG CTTTCTGTAT C) ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTAT (SEQ ID NO: 10). La secuencia de nucleótidos a través del punto de eliminación corriente abajo incluyó la siguiente, que indica la secuencia del casete contigua con la secuencia endógena de ratón corriente abajo del punto de eliminación (contenido entre paréntesis a continuación): ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGaAg tTaT (AGCTTCGGTT TTGATACACT GTTTACAGCC TGCGAAGGTG ACTCACTCGT GTTAATAAGA CTCTTTTACG GAGGTCTATG CCAAACTCTT TTTATCAAAT ATTCTCAAAG GCAG) (SEQ ID NO: 11). Después se usaron clones positivos de células ES para implantar en ratones hembras mediante el uso del método VELOCIMOUSE® (que se describe a continuación) para generar una camada de crías que contienen una eliminación del locus de Nay1.7 endógeno.
Las células ES transformadas que se describieron anteriormente se usaron como células ES donantes y se introdujeron en un embrión de ratón en etapa de 8 células mediante el método VELOCIMOUSE® (ver, por ejemplo, la patente de los EE.UU. núm. 7,294,754 y Poueymirou, W.T., Auerbach, W., Frendewey, D., Hickey, J.F., Escaravage, J.M., Esau, L., Dore, A.T., Stevens, S., Adams, N.C., Dominguez, M.G., Gale, N.W., Yancopoulos, G.D., DeChiara, T.M., Valenzuela, D.M. 2007. F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene- targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses. Nature Biotech. 25(1): 91-99). Los ratones que portan una eliminación de los exones del 6 al 28 en el locus de Nay1.7 endógeno se identificaron por genotipificación mediante el uso de un ensayo de modificación de alelos (Valenzuela et al., supra) que detectó la presencia del casete de resistencia a neomicina y confirmó la ausencia de las secuencia de NaV1.7 endógenas.
Los ratones que portan una eliminación de los exones del 6 al 28 en el locus de NaV1.7 endógeno pueden cruzarse con una cepa de ratón de eliminación con Cre (ver, por ejemplo, la publicación de la solicitud de patente internacional núm. WO 2009/114400) para eliminar cualquier casete de resistencia a neomicina flanqueado por sitios lox P introducido por el vector de transformación que no se elimine,por ejemplo, en la etapa de células ES o en el embrión. Opcionalmente, el casete de resistencia a higromicina se mantiene en los ratones.
Las crías se genotipifican y una cría heterocigótica para las secuencias de NaV1.7 endógenas eliminadas se selecciona para caracterizar la eliminación de la NaV1.7 endógena.
Ejemplo II
Humanización de un locus de Nav1.7 endógeno
Un vector de transformación para el reemplazo del locus de NaV1.7 endógeno con el locus de NaV1.7 humano (Fig. 3) se construyó mediante el uso de un proceso de dos etapas que involucra la ligación del ADN de BAC y la reparación de GAP (Zhang, Y., J. P. P. Muyrers, G. Testa, y F. A. Stewart. 2000. ADN cloning by homologous recombination in Escherichia coli. Nature Biotechnology 18:1314-1317; Zhang, Y., F. Buchholz, J. P. P. Muyrers, y F. A. Stewart. 1998. A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli. Nature Genetics 20:123- 128).
La primera etapa en la construcción del vector de transformación de reemplazo se realizó por la ligación de un fragmento de ADN del clon de ADN de BAC RP23-454H3 de ratón con un fragmento de ADN humano del clon BAC RP11-1002M1 humano (Invitrogen). Esta ligación de fragmentos de ADN de BAC de ratón y humano creó un clon BAC modificado que contiene un reemplazo de los exones del 5 al 28 del locus de NaV1.7 de ratón (aproximadamente 81 kb) con los exones del 5 al 28 del locus de NaV1.7 humano (aproximadamente 100 kb).
La segunda etapa en la construcción del vector de transformación de reemplazo se realizó mediante la reparación de GAP (a la que se hizo referencia anteriormente) mediante el uso del clon BAC RP23-454H3 de ratón y el clon BAC RP11-45AJ20 humano para añadir exones adicionales del locus de NaV1.7 humano al clon BAC modificado que se generó en la primera etapa. La reparación de GAP se realizó mediante el uso de estos clones BAC humano y de ratón para reemplazar los exones del 2 al 7 del locus de NaV1.7 endógeno con los exones del 2 al 7 del locus de NaV1.7 humano (~13 kb). Esta segunda etapa añadió ~13 kb de la secuencia de NaV1.7 humana a los ~100 kb de la secuencia de NaV1.7 humana para hacer el reemplazo del locus de NaV1.7 endógeno. Se añadió un casete de resistencia a higromicina flanqueado por sitios loxP al extremo 3' del fragmento de BAC de ~113 kb que contenía el locus de NaV1.7 humano (Fig. 3, parte intermedia)
Los brazos de homología corriente arriba y corriente abajo se derivaron del ADN de BAC de ratón en las posiciones 5' y 3' del locus de NaV1.7 endógeno para la adición al casete de resistencia a higromicina con el fragmento de ADN humano para crear el vector de transformación final para el reemplazo del locus de NaV1.7 endógeno que contenía de 5' a 3' un brazo de homología 5' que contiene 70 kb de ADN de ratón 5' del locus de NaV1.7 endógeno, un fragmento de ADN de ~ 113 kb que contiene los exones del 2 al 28 del locus de NaV1.7 humano, un casete de resistencia a higromicina flanqueado por sitios loxP, y un brazo de homología en 3' que contiene 147 kb de ADN de
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ratón 3' del locus de Nav1.7 endógeno. El vector de transformación se linealizó mediante la digestión con Notl y después se usó en la recombinación homóloga en células bacterianas para lograr un reemplazo dirigido del locus de NaV1.7 endógeno con los exones del 2 al 28 del locus de NaV1.7 humano (Fig. 3, parte inferior).
El ADN de BAC transformado (que se describió anteriormente) se usó para electroporar células ES de ratón para crear células ES modificadas que comprenden un reemplazo del locus de NaV1.7 endógeno de ratón con un fragmento genómico que comprende un locus de NaV1.7 humano. Las células ES positivas que contienen una eliminación del locus de NaV1.7 endógeno reemplazado por un fragmento genómico que comprende un locus de NaV1.7 humano se identificaron mediante un ensayo cuantitativo de PCR mediante el uso de sondas Taqman^ (Lie y Petropoulos, supra). Las regiones corriente arriba y corriente abajo fuera del locus modificado se confirmaron mediante PCR mediante el uso de los mismos cebadores y sondas que se describen en el Ejemplo 1 (867TUP2F/867TUP2R/867TUP2P and 867TDPF/867TDPR/867TDPP). La inserción de la secuencia de NaV1.7 humana se confirmó por PCR mediante el uso de los cebadores 935HF (ATCAAAGGAA CCCAAAGAAG; SEQ ID NO: 12) y 935HR (GAAGGGCAGC TGTTTGCCAG; SEQ ID NO: 13) y la sonda 935HP (ATGAAGAAGC CCCAAAGCCA AGCA; SEQ ID NO: 14). La presencia del casete de resistencia a higromicina del vector de transformación se confirmó con los cebadores HYGF (TGCGGCCGATCTTAGCC; SEQ ID NO: 15) y HYGR (TTGACCGATTCCTTGCGG; SEQ ID NO: 16) y la sonda HYGP (ACGAGCGGGTTCGGCCCATTC; SEQ ID NO: 17). La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción corriente arriba incluyó la siguiente, que indica la secuencia endógena de ratón corriente arriba del punto de inserción (contenido entre paréntesis a continuación) unida contiguamente a la secuencia genómica de la NaV1.7 humana presente en el punto de inserción: (TTAGGTAAGG ATCCGAAGGG GAAATAAAAC CTACAGGATG AGAAG) ATGGCAATGT TGCCTCCCCC AGGACCTCAG AGCTTTGTCC ATTTCACAAA ACAG (SEQ ID NO: 18). La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción corriente abajo en el extremo 5' del casete de resistencia a higromicina incluyó la siguiente, que indica la secuencia genómica de la NaV1.7 humana contigua con la secuencia del casete corriente abajo del punto de inserción (contenido entre paréntesis a continuación): GTATGAATAA AAAAGCATTG AAATAgGgAT TCTTGCCAAC TTGCTC (TCTCGAGATA ACTTCGTATA ATGTATGCTA TACGAAGTTA T) (SEQ ID NO: 19). La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción corriente abajo en el extremo 3' del casete de resistencia a higromicina incluyó la siguiente, que indica la secuencia del casete contigua con la secuencia genómica del ratón en el extremo 3' del locus de NaV1.7 endógeno (contenido entre paréntesis a continuación): TATACGAAGT TATGCTAGTA ACTATAACGG TCCTAAGGTA GCGAGCTAG (CAGCTTCGGT TTTGATACAC TGTTTACAGC CTGCGAAGGT G) (SEQ ID NO: 20). Después se usaron clones positivos de células ES para implantar en ratones hembras mediante el uso del método VELOCIMOUSE® (supra) para generar una camada de crías que contiene un reemplazo del locus de NaV1.7 endógeno con un locus de NaV1.7 humano.
Las células ES transformadas que se describieron anteriormente se usaron como células ES donantes y se introdujeron en un embrión de ratón en la etapa de 8 células mediante el método VELOCIMOUSE® (supra). Los ratones que portan un locus de NaV1.7 humano se identificaron por genotipificación mediante el uso de un ensayo de modificación de alelos (Valenzuela et al., supra) que detectó la presencia de un locus de NaV1.7 humano.
Los ratones que portan el locus de NaV1.7 humano pueden cruzarse con una cepa de ratón de eliminación con Cre (ver, por ejemplo, la publicación de la solicitud de patente internacional núm. WO 2009/114400) para eliminar cualquier casete de resistencia a higromicina flanqueado por sitios loxP introducido por el vector de transformación que no se elimine,por ejemplo, en la etapa de células ES o en el embrión. Opcionalmente, el casete de resistencia a higromicina se mantiene en los ratones.
Las crías se genotipifican y una cría heterocigótica para un locus de NaV1.7 humano se selecciona para caracterizar la humanización de NaV1.7.
Ejemplo III
Humanización del bucle extracelular de los segmentos de transmembrana del 5 al 6 en el dominio I de un locus de NaV1.7 endógeno
Un vector de transformación para la humanización del bucle extracelular del poro que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio I (DI/S5-S6) se construyó mediante el método de reparación de GAP (que se describió anteriormente) mediante el uso del clon BAC RP23-20C24 de ratón y el clon bAc RP11-45AJ20 humano (Fig. 4). El método de reparación de GAP se usó para reemplazar un fragmento de ADN de 13.8 kb que contiene los exones del 7 al 9 del locus de NaV1.7 endógeno con un fragmento de ADN de 10 kb que contiene los exones del 7 al 9 del locus de NaV1.7 humano. Se añadió un casete de resistencia a neomicina flanqueado por sitios loxP en el extremo del fragmento de ADN humano de 10 kb que contiene los exones del 7 al 9 del locus de NaV1.7 humano (Fig. 4, parte intermedia).
Los brazos de homología corriente arriba y corriente abajo se derivaron del ADN de BAC de ratón en las posiciones 5' y 3' de los exones 7 y 9, respectivamente, y se añadieron al casete de resistencia a neomicina con el fragmento humano de 10 kb para crear el vector de transformación final para la humanización del bucle extracelular del poro que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio I del locus de NaV1.7 endógeno que contenía de 5'
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a 3' un brazo de homología en 5' que contiene 35 kb de ADN de ratón 5' del exón 7 del locus de NaV1.7 endógeno, un fragmento de ADN de 10 kb que contiene los exones del 7 al 9 del locus de Nav1.7 humano, un casete de resistencia a neomicina flanqueado por sitios loxP, y un brazo de homología en 3' que contiene 27 kb de ADN de ratón 3' del exón 9 del locus de Nav1.7 endógeno. El vector de transformación se linealizó por digestión con PspX y Sal I y después se usó en la recombinación homóloga en células bacterianas para lograr un reemplazo dirigido de los exones del 7 al 9 en el locus de Nav1.7 endógeno con los exones del 7 al 9 de un gen de Nav1.7 humano (Fig. 4, parte inferior).
El ADN de BAC transformado (que se describió anteriormente) se usó para electroporar células ES de ratón para crear células ES modificadas que comprenden un reemplazo de los exones del 7 al 9 en el locus de Nav1.7 endógeno de ratón con un fragmento genómico que comprende los exones del 7 al 9 de un locus de Nav1.7 humano. Las células ES positivas que contienen un fragmento genómico que comprende los exones del 7 al 9 de un gen de Nav1.7 humano se identificaron por el ensayo de PCR cuantitativa mediante el uso de sondas Taqman^ (Lie y Petropoulos, supra). La región corriente arriba fuera de la región modificada del locus endógeno se confirmó mediante PCR mediante el uso de los cebadores 869TUPF (GGACTACAAC TGTTTATGGG CAAC; SEQ ID NO: 21) y 869TUPR (TCAATTCTTC TTCACTCTCA GCAG; SEQ ID NO: 22) y la sonda 869TUPP (TCCGGAAGGA CCTTGAGCAG AATGA; SEQ ID NO: 23), mientras que la región corriente abajo fuera de la región modificada del locus endógeno se confirmó con los cebadores 869TDPF (CAACAGGTGA GCAGCAACAG; SEQ ID NO: 24) y 869TDPR (GCAGGAGACA CATACACCAG AC; SEQ ID NO: 25) y la sonda 869TDPP (AAACACGCAT GTCTGAAGGC AGTCGG; SEQ ID NO: 26). La presencia del casete de resistencia a neomicina del vector de transformación se confirmó mediante el uso de los mismos cebadores y de la sonda que se describen en el Ejemplo 1. La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción corriente arriba incluyó la siguiente, que indica la secuencia endógena de ratón corriente arriba del punto de inserción (contenido entre paréntesis a continuación) unida contiguamente a la secuencia genómica de la Nav1.7 humana presente en el punto de inserción: (TACATTTTAA GGACTAAAAA CCATCGTGGG GGCCCTGATC CAATCAGTGA AGAAGCTCTC TGACGTCATG ATCCTCACTG TGTTCTGTCT CAGTGTGTTC) GCACTAATTG GACTACAGCT GTTCATGGGA AACCTGAAGC ATAAATGTTT TCGAAATTCA CTTGAAAATA ATGAAACATT AGAAAGCATA ATGAATACCC T (SEQ ID NO: 27). La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción corriente abajo en el extremo 5' del casete de resistencia a neomicina incluyó la siguiente, que indica la secuencia genómica de Nav1.7 humana contigua con la secuencia del casete corriente abajo del punto de inserción (contenido entre paréntesis a continuación): AGGTGAGTAC CAAGAGAAAC ATGCATTGTA TTTTTGAATG GCATATGTAC CTGGTGTATG TTAAGAGCCT GTATTAGGAG GTTTTTTATT TATTTGAGAA TGGAGGAAAC TCTATTA (CTCGAGATAA CTTCGTATAA TGTATGCTAT ACGAAGTTAT) (SEQ ID NO: 28). La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción corriente abajo en el extremo 3' del casete de resistencia a neomicina incluyó la siguiente, que indica la secuencia del casete contigua con la secuencia genómica de ratón 3' del exón 9 del locus de Nav1.7 endógeno (contenido entre paréntesis a continuación): TATACGAAGT TATGCTAGC (TCTGCAGACA GTCTGGGACT CCCTAATGTG CATTATTAAA ATTACAGGCA ATTTACTTGG CTGATATGAG AACAGATAGT TCTGAAGTCA TCAATAATTT TCTGCTGTGT CTGACCAGCG TT) (SEQ ID NO: 29). Después se usaron clones positivos de células ES para implantar en ratones hembras mediante el uso del método vElOCIMOUSE® (que se describe a continuación) para generar una camada de crías que contienen un reemplazo de los exones del 7 al 9 del locus de Nav1.7 endógeno con los exones correspondientes del locus de Nav1.7 humano.
Las células ES transformadas que se describieron anteriormente se usaron como células ES donantes y se introdujeron en un embrión de ratón en la etapa de 8 células mediante el método VELOCIMOUSE® (supra). Los ratones que portaban la humanización de los exones del 7 al 9 del locus de Nav1.7 endógeno se identificaron por genotipificación mediante el uso de un ensayo de modificación de alelos (Valenzuela et al., supra) que detectó la presencia de secuencias de Na v1.7 humanas.
Los ratones que portan la DI/S5-S6 humanizada en el locus de NaV1.7 endógeno pueden cruzarse con una cepa de ratón de eliminación con Cre (ver, por ejemplo, la publicación de la solicitud de patente internacional núm. WO 2009/114400) para eliminar cualquier casete de resistencia a neomicina flanqueado por sitios loxP introducido por el vector de transformación que no se elimine, por ejemplo, en la etapa de células ES o en el embrión. Opcionalmente, el casete de resistencia a neomicina se mantiene en los ratones.
Las crías se genotipifican y una cría heterocigótica para la DI/S5-S6 humanizada en el locus de Nav1.7 endógeno se selecciona para caracterizar la humanización de Nav1.7 DI/S5-S6.
Ejemplo IV
Humanización del bucle extracelular de los segmentos de transmembrana del 5 al 6 en el dominio III de un locus de NaV1.7 endógeno
Un vector de transformación para la humanización del bucle extracelular del poro que conecta los segmentos de transmembrana 5 y 6 del dominio III (DIII/S5-S6) se construyó por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante el uso del clon BAC BMQ-311E20 de ratón y el clon BaC RP11-746P5 humano (Fig. 5). Los exones del 23 al 25 del locus de Nav1.7 humano se amplificaron a partir del clon BAC RP11-746P5 humano. Un casete de
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resistencia a neomicina flanqueado por sitios loxP se ligó al extremo 3' del fragmento de PCR de 2.8 kb (Fig. 5, parte intermedia). Este fragmento de ADN ligado que contiene los exones del 23 al 25 del locus de NaV1.7 humano y el casete de resistencia a neomicina se usó para reemplazar una sección de 2.4 kb del locus de NaV1.7 endógeno de ratón que contiene los exones del 23 al 25 en el clon BAC BMQ-311E20 de ratón (Fig. 5).
Los brazos de homología corriente arriba y corriente abajo se derivaron del ADN de BAC de ratón en las posiciones 5' y 3' de los exones 23 y 25, respectivamente, y se añadieron al casete de resistencia a neomicina con el fragmento de ADN humano para crear el vector de transformación final para la humanización de DIII/S5-S6 del locus de NaV1.7 endógeno que contenía de 5' a 3' un brazo de homología en 5' que contiene 21 kb de ADN de ratón 5' del exón 23 del locus de NaV1.7 endógeno, un fragmento de ADN de 2.8 kb que contiene los exones del 23 al 25 del locus de NaV1.7 humano, un casete de resistencia a neomicina flanqueado por sitios loxP, y un brazo de homología en 3' que contiene 108 kb de ADN de ratón 3' del exón 25 del locus de NaV1.7 endógeno. El vector de transformación se linealizó por digestión con NotI y después se usó en la recombinación homóloga en células bacterianas para lograr un reemplazo dirigido de los exones del 23 al 25 en el locus de NaV1.7 endógeno con los exones del 23 al 25 del locus de NaV1.7 humano (Fig. 5, parte inferior).
El ADN de BAC transformado (que se describió anteriormente) se usó para electroporar células ES de ratón para crear células ES modificadas que comprenden un reemplazo de los exones del 23 al 25 en el locus de NaV1.7 endógeno de ratón con un fragmento genómico que comprende los exones del 23 al 25 de un locus de NaV1.7 humano. Las células ES positivas que contienen un fragmento genómico que comprende los exones del 23 al 25 de un gen de NaV1.7 humano se identificaron por el ensayo de PCR cuantitativa mediante el uso de sondas TAQMAN® (Lie y Petropoulos, supra). La región corriente arriba fuera de la región modificada del locus endógeno se confirmó por PCR mediante el uso de los cebadores 892TUPF (GCTTGGGCTT GCACCTTTA; SEQ ID NO: 30) y 892TUPR (TGCGTTGACC ACTACCTGAT AC; SEQ ID NO: 31) y la sonda 892TUPP (TCTGCATTGG CGTCTGTTTG TCA; SEQ ID NO: 32), mientras que la región corriente abajo fuera de la región modificada del locus endógeno se confirmó con los cebadores 892TDP3F (TGACTTGCCC TATCAATCTG AGATC; SEQ ID NO: 33) y 892TDP3R (GCTCACACTG TATACACACA AAATCTTC; SEQ ID NO: 34) y la sonda 892TDP3P (TCACTGCCTA TGATAAAGT; SEQ ID NO: 35). La presencia del casete de resistencia a neomicina del vector de transformación se confirmó mediante el uso de los mismos cebadores y de la sonda que se describen en el Ejemplo 1. La inserción de los exones del 23 al 25 del gen de NaV1.7 humano se confirmó por PCR mediante el uso de los cebadores 892HF (CACGGTTTCC TGCAAGTCAA; SEQ ID NO: 36) y 892HR (GGGACACTTA CAACTTGAAG CA; SEQ ID NO: 37) y la sonda 892HP (TCGTTCCGAA TGTTTTGCCC TTATGA; SEQ ID NO: 38). La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción corriente arriba incluyó la siguiente, que indica la secuencia genómica de ratón corriente arriba del exón 23 del locus de NaV1.7 endógeno (contenido entre paréntesis a continuación) unida contiguamente a la secuencia genómica de NaV1.7 humana presente en el punto de inserción: (TTTCATTTAT TTGAAGTGCA ATATCATCTT GGCCATCTAC TCCTCTGTAT GCTAGTAG) GTAAGCCTGG TGATCACAGA (SEQ ID NO: 39). La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción corriente abajo en el extremo 5' del casete de resistencia a neomicina incluyó la siguiente, que indica la secuencia genómica de NaV1.7 humana contigua con la secuencia del casete corriente abajo del punto de inserción (contenido entre paréntesis a continuación): GACTAGTATA CAATTACAAA TATGC (CTCGAGATAA CTTCGTATAA TGTATGCTAT ACGAAGTTAT) (SEQ ID NO: 40). La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción corriente abajo en el extremo 3' del casete de resistencia a neomicina incluyó la siguiente, que indica la secuencia del casete contigua a la secuencia genómica de ratón 3' del exón 25 del locus de NaV1.7 endógeno (contenido entre paréntesis a continuación): TATACGAAGT TATGCTAGC (TTTCCTGCTA ACCATCATTC TGGGGTATGT GTTATGATGG AAGTTAAGTG ACAGTTACTT ATAATATGGC TGCT) (SEQ ID NO: 41). Después se usaron clones positivos de células ES para implantar en ratones hembras mediante el uso del método vElOCIMOUSE® (que se describe a continuación) para generar una camada de crías que contienen un reemplazo de los exones del 23 al 25 del locus de Nav1.7 endógeno con los exones correspondientes del locus de Nav1.7 humano.
Los ratones que contienen una humanización de los exones del 23 al 25 en el locus de NaV1.7 endógeno con el vector de transformación de NaV1.7-DIII/S5-S6 humana se generaron por electroporación de un ADN de BAC transformado (que se describió anteriormente) en células ES de ratón. Los clones positivos de células ES se confirmaron mediante tamizaje con Taqman™ y cariotipaje. Después se usaron clones positivos de células ES para implantar en ratones hembras mediante el uso del método VELOCIMOUSE® (que se describe a continuación) para generar una camada de crías que contienen una humanización de los exones del 23 al 25 en el locus de Nav1.7 endógeno.
Las células ES transformadas que se describieron anteriormente se usaron como células ES donantes y se introdujeron en un embrión de ratón en etapa de 8 células mediante el método VELOCIMOUSE® (ver, por ejemplo, la patente de los EE.UU. núm. 7,294,754 y Poueymirou et al., supra). Los ratones que portan la humanización de los exones del 23 al 25 del locus de Nav1.7 endógeno se identificaron por genotipificación mediante el uso de un ensayo de modificación de alelos (Valenzuela et al., supra) que detectó la presencia de las secuencias de NaV1.7 humanas.
Los ratones que portan la DIII/S5-S6 humanizada en el locus de Nav1.7 endógeno pueden cruzarse con una cepa de ratón de eliminación con Cre (ver, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente internacional núm. WO 2009/114400) para eliminar cualquier casete de resistencia a neomicina flanqueado por sitios loxP introducido por el
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vector de transformación que no se elimine, por ejemplo, en la etapa de células ES o en el embrión. Opcionalmente, el casete de resistencia a neomicina se mantiene en los ratones.
Las crías se genotipifican y una cría heterocigótica para la DIII/S5-S6 humanizada en el locus de NaV1.7 endógeno se selecciona para caracterizar la humanización de NaV1.7 DIII/S5-S6.
Ejemplo V
Fenotipaje del comportamiento de los ratones con Nav1.7 humanizada
Los métodos actuales para estudiar los efectos de la manipulación farmacológica de la NaV1.7 humana se basan en células transfectadas que se cultivan in vitro. Estas células que se modifican para expresar la proteína NaV1.7 humana carecen de proteínas auxiliares y pueden no ser completamente representativas de los mecanismos por los cuales la NaV1.7 funciona in vivo. Así, se generaron ratones modificados para expresar la NaV1.7 humana o NaV1.7 quimérica que tienen un bucle extracelular del poro humanizado como se describe en los Ejemplos 2 - 4 y se analizaron para comprender la función de NaV1.7 in vivo.
Brevemente, dos grupos (n=6/6 cada uno; machos/hembras con 10-20 semanas) de ratones, tipo silvestre (Scn9a+I+) y ratones heterocigóticos para el reemplazo de un gen de NaV1.7 de ratón con un gen de NaV1.7 humano (Scn9ahuml+), se sometieron cada uno a una variedad de estímulos nocifensivos (térmico con placa caliente, golpe térmico de la cola y presión mecánica nociva). Los resultados se muestran en las Fig. 6A - 6C.
En un experimento similar, dos grupos (n=10 cada uno; hembras con 10-20 semanas) de ratones, tipo silvestre (Scn9a+I+) y ratones homocigóticos para un gen de NaV1.7 quimérico que contiene una secuencia humana que codifica un bucle extracelular del poro (DI/S5-S6; Scn9a31131), cada uno de ellos se sometió a una variedad de estímulos nocifensivos (térmico con placa caliente, golpe térmico de la cola, mecánico nocivo, e hipernocicepción inflamatoria mediante el uso del adyuvante completo de Freund). Los resultados se muestran en las Fig. 7A - 7D.
No se observó diferencia significativa en ninguno de los criterios de valoración agudos entre los ratones Scn9a+I+ y Scn9ahuml+ o Scn9a+I+ y Scn9a31131. Estos resultados demuestran que los ratones humanizados que contienen un gen de Nav1.7 humano de longitud completa en lugar del gen endógeno (como se describe en el Ejemplo 2) o una secuencia humana que codifica un bucle extracelular del poro (como se describe en el Ejemplo 3) muestran comportamientos nociceptivos normales en respuesta a estímulos nocifensivos en comparación con ratones de control de tipo silvestre.
Como se muestra en este ejemplo, los ratones modificados para expresar la proteína Nav1.7 completamente o parcialmente humana en la superficie de las neuronas responden a los estímulos nociceptivos de una manera similar en comparación con el tipo silvestre y así proporcionan una plataforma para identificar antagonistas de la subunidad a de Nav1.7 ylo un bucle extracelular del poro particular. Tales antagonistas pueden ser útiles para bloquear funciones específicas y actividades neuronales asociadas en el tratamiento de varios síndromes de dolor clínicos.
Ejemplo VI
Identificación y función de GRD en ratones con NaV1.7 humanizadas
Se generaron anticuerpos específicos para la Nav1.7 humana y se analizaron en cuanto a la unión a las células neuronales aisladas de ratones con Nav1.7 humanizada que se describen en los ejemplos 2 - 4.
Brevemente, a ratones VELOCIMMUNE®(patente de los EE.UU. núm. 6,596,541) se les administró el antígeno Nav1.7 (hNav1.7) humana con adyuvante (por ejemploadyuvante completo o incompleto de Freund, sistema adyuvante MPL+TDM (Sigma), o RlBl (muramil dipéptidos) (ver O'Hagan 2000 Vaccine Adjuvant, por Human Press, Totowa, NJ)). Se monitoreó la respuesta inmunitaria y se aislaron anticuerpos que contienen regiones variables humanas y regiones constantes de ratón a partir de líneas celulares de hibridoma generadas a partir de células B que expresan anticuerpos recolectadas a partir de ratones inmunizados. Alternativamente, las células de hibridoma específicas de antígeno pueden aislarse por citometría de flujo. Los anticuerpos específicos para hNav1.7 pueden identificarse, además, a través del aislamiento directo de esplenocitos (por ejemplo, ver la patente de los EE.UU. núm. 7,582,298). Numerosos anticuerpos anti-hNaV1.7 se obtuvieron por los métodos anteriores y células HEK293 modificadas para expresar de manera estable la Nav1.7 humana o la Nav1.7 humana se usaron para identificar los anticuerpos que se unen específicamente a la Nav1.7 pero no a Nav1.7 según se determinó por citometría de flujo.
Los anticuerpos anti-hNav1.7 seleccionados se probaron para determinar su capacidad para bloquear la función electrofisiológica (por ejemplo corriente, flujo de iones, etc.) del canal Nav1.7 mediante el uso del sistema IONWORKS QUaTtRO™ (IWQ, Molecular Devices), el sistema Port-a-Patch® (Nanion Technologies) y el sistema QPatch (Sophion Bioscience). La Tabla 1 expone el porcentaje de inhibición promedio para cinco anticuerpos anti- hNav1.7 seleccionados: menos del 15 % (-), 15-30 % (+), mayor que 30 % (++). nd: no determinado.
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Tabla 1
Anticuerpo
IWQ (222 nM) Port-a-Patch (50 nM) QPatch (100 nM)
Ab1
+ + + + +
Ab2
+ + nd +
Ab3
+ + + + +
Ab4
+ + + +
Ab5
- + +
Inmunohistoquímica. El procesamiento del dolor es el resultado de interacciones complejas entre varias proteínas, receptores y canales que se expresan en las neuronas nociceptivas de los ganglios de las raíces dorsales (GRD). Se evaluaron los anticuerpos anti-hNaV1.7 seleccionados en cuanto a la unión a las neuronas de GRD recolectadas a partir de ratones modificados para expresar NaV1.7 humana (Scn9ahurm+, Ejemplo 2), ratones modificados para expresar una NaV1.7 quimérica que contiene un bucle extracelular del poro humano (Scn9a31131, Ejemplo 3) y ratones tipo silvestre (Scn9a+/+).
Brevemente, GRD lumbares recolectados de ratones Scn9ahuml+, Scn9a31l31y Scn9a+I+ y ratas Scn9a+I+ (rScn9a+l+) se disociaron y sembraron a una densidad de 5.5x104 células/pocillo en placas de 96 pocillos tratadas con poli-DL- ornitina (0.1 mg/ml) y laminina (5 pg/ml) seguido de incubación a 37 °C en aire al 96.5 % y CO2 al 3.5 %. Las neuronas se mantuvieron en cultivo durante de 3 a 8 días en DMEM complementado con 50 ng/ml de factor de crecimiento nervioso, 100 U/ml de penicilina/estreptomicina, vitaminas mEm y 10 % de suero fetal de ternera inactivado por calor. Las células que se sembraron se fijaron después en PFA al 4 % y sacarosa al 4 % en PBS pH 7.2 durante 30 minutos. Después, las células se lavaron en PBS seguido del bloqueo en suero de cabra normal al 20 % durante una hora a temperatura ambiente. Después, las neuronas se permeabilizaron en suero de cabra normal al 10 % con Tritón X-100 al 0.1 % antes de la inmunotinción para confirmar la actividad de unión a la Nav17 humana o quimérica (o ratón y/o rata) en la superficie celular de las neuronas de GRD. La Tabla 2 expone la unión específica de la especie (+) o ninguna unión (-) a las neuronas de GRD para los anticuerpos anti-NaV1.7 seleccionados.
Tabla 2
Anticuerpo
Genotipo de GRD
Scn9anumi+
Scn9aJllJ1 Scn9a+'+ rScn9a'rn'
Ab1
- - -
Ab2
+ -
Ab3
+ - +/-
Ab4
+ + + +
Ab5
+/- - -
Los anticuerpos anti-hNav1.7 seleccionados demostraron su unión a las neuronas de GRD que expresan una proteína Nav1.7 humana (por ejemplo, Ab3, Ab4, y Ab5), una proteína Nav1.7 quimérica (por ejemplo, Ab4) o una proteína Nav1.7 de ratón (por ejemplo,Ab2) en la superficie celular, mientras que no se observó unión a las neuronas de GRD que expresan una proteína Nav1.7 de ratón o rata para otros anticuerpos (por ejemplo, Ab1 y Ab5). Otros anticuerpos anti-hNav1.7 demostraron reactividad cruzada entre las especies dado que los anticuerpos mostraron unión a las neuronas de GRD de ratones con Nav1.7 humanizada, ratones y ratas de tipo silvestre (por ejemplo, Ab3 y Ab4).
Ensayo de liberación del péptido relacionado con el gen de calcitonina (CGRP). El neuropéptido péptido relacionado con el gen de calcitonina (CGRP) se libera de los terminales periféricos y espinales de las neuronas nociceptivas de fibras peptidérgicas A y C en respuesta a los estímulos. La liberación de neuropéptidos inicia la inflamación neurogénica, la desgranulación de los mastocitos, y otras reacciones inflamatorias, lo que da como resultado hiperalgesia/sensación de dolor. Los mediadores de la inflamación tales como prostaglandina E2, bradiquinina, serotonina, histamina y capsaicina sensibilizan y estimulan directamente los GRD nociceptivos in vitro e in vivo lo que conduce de esta manera a la liberación de CGRP. Los nociceptores sensibilizados muestran un umbral de activación reducido, actividad espontánea aumentada y una respuesta aumentada a los estímulos supraumbrales. Así, puede lograrse la sensibilización de los GRD y el disparo de los potenciales de acciónin vitro con diferentes mediadores de la inflamación lo que da como resultado la liberación de CGRP y de esta manera sirven como un medio para medir la función nociceptiva de los GRD. La activación de nociceptores primarios se determinó en cultivos de GRD in vitro primarios aislados de ratones con Nav1.7 humanizada y de tipo silvestre mediante la medición de la liberación de CGRP mediante el uso de un kit de inmunoensayo enzimático (EIA) (Cayman, distribuido por SPIbio, Francia).
Brevemente, los GRD de entre 3 y 8 días de edad se lavaron una vez en tampón de ensayo y se mantuvieron a 37 °C hasta la adición de una mezcla inflamatoria (por ejemplo, prostaglandina E2 10 pM, bradiquinina 10 pM y capsaicina 1 pM). Dos inhibidores conocidos de los canales Nav, tetrodotoxina (TTX) y ProTx-II, se usaron para determinar si Nav1.7 desempeña una función en una liberación de CGRP inducida por la mezcla inflamatoria in vitro. TTX se probó a concentraciones de 1 pM, una concentración inhibidora eficaz para canales sensibles a TTX, y 10 pM. ProTx-II inhibe en gran medida a Nav1.7 a 10 nM (Schmalhofer, W.A, Calhoun, J., Burrows, R., Bailey, T., Kohler, M.G., Weinglass, A.B., Kaczorowski, G.J., Garcia, M.L., Koltzenburg, M., Priest, B.T. (2008) ProTx-II, a
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Selective Inhibitor of NaV1.7 Sodium Channels, Blocks Action Potential Propagation in Nociceptors. Molecular Pharmacology 74(5):1476-1484). Las neuronas se incubaron durante 20 minutos con el inhibidor (TTX o ProTx-II), seguido de la estimulación con la mezcla inflamatoria durante 20 minutos o con el inhibidor combinado con la mezcla inflamatoria durante 20 minutos. Se prepararon diluciones del compuesto en tampón de ensayo y se añadieron muestras por duplicado en una placa de EIA de CGRP humana y se incubaron durante la noche. La concentración de CGRP liberado por los GRD se midió al día siguiente mediante el uso de un ensayo ELISA. Se calcularon los promedios (media +/desviación estándar) para cada grupo de condiciones. La Fig. 8 muestra la respuesta a la dosis para diferentes concentraciones de GRD en los ensayos de CGRP mediante el uso de TTX en las condiciones mencionadas anteriormente. Los resultados para TTX se muestran en la Tabla 3. Los resultados para ProTx-II se muestran en la Tabla 4. IM: mezcla inflamatoria.
En un experimento similar la función de NaV1.7 en la liberación de CGRP potenciada por TTX en GRD recolectados a partir de ratones Scn9a3'113'1 se probaron mediante el uso de un anestésico local tipo aminoamida (lidocaína). Este experimento se realizó para confirmar que la potenciación de la liberación de CGRP no se debía a un efecto no específico de las toxinas en las neuronas de GRD. Los resultados se muestran en la Tabla 5. IM: mezcla inflamatoria.
En otro experimento similar, se analizaron anticuerpos anti-hNaV1.7 seleccionados en cuanto a su efecto en la liberación in vitro de CGRP en GRD aislados de ratones Scn9a+I+, Scn9ahuml+ y Scn9a31131. Los resultados se muestran en las Tablas 6 - 9. IM: mezcla inflamatoria.
Como se muestra en este Ejemplo, cuando las neuronas (GRD) que expresan una proteína NaV1.7 de tipo silvestre o quimérica en la superficie celular se preincuban con inhibidores conocidos de NaV1.7 (TTX o ProTx-II, Tabla 3 o 4, respectivamente) o un anestésico local no específico para NaV1.7 (lidocaína, Tabla 5), la liberación de CGRP inducida por la mezcla inflamatoria se potencia notablemente. Sin embargo, cuando se añadió un inhibidor de NaV1.7 o un anestésico local a la mezcla inflamatoria antes de la exposición a las neuronas, no se observó potenciación de la liberación de CGRP inducida por inflamación. Así, estos experimentos muestran que la inhibición de NaV1.7 antes de la estimulación con mediadores de la inflamación (prostaglandina E2, bradiquinina y capsaicina) potencia la liberación de CGRP en neuronas de GRD de ratones de tipo silvestre y humanizados.
Además, cuando las neuronas (GRD) se preincuban con un anticuerpo anti-hNaV1.7, la liberación de CGRP inducida por la mezcla inflamatoria se potencia notablemente (Tablas 6 - 9). Estos experimentos demuestran que las proteínas NaV1.7 humanas y quiméricas que se expresan en la superficie de los GRD en ratones humanizados son funcionales. Este ejemplo demuestra que los anticuerpos anti-hNaV1.7 fueron capaces de imitar la potenciación mediada por TTX de la liberación de CGRP inducida por mediadores de la inflamación en neuronas de GRD de ratones Scn9ahuml+ y Scn9a31131. Así, los ratones con NaV1.7 humanizada (Scn9ahuml+, Scn9a31131 y Scn9a33133 que se describen en la presente descripción proporcionan un sistema para la caracterización in vitro de la unión a anticuerpos anti-hNaV1.7 y de la inhibición de la función del canal in vivo. Además, estos ratones representan un sistema de modelo in vivo para el examen de nuevos antagonistas específicos para NaV1.7 y para la evaluación de su potencial terapéutico para tratar las respuestas mediadas por NaV1.7.
___________________Tabla 3 _______________
CGRP liberado de GRD Scn9a*'* expuestos a TTX
Condiciones
CGRP (pgiml)
Tampón
3 ± 1
IM
11 ± 1
preincubación con TTX 1 pM e IM
76 ± 14
TTX 1 pM + IM
10 ± 4
IM
11 ± 4
preincubación con TTX 10 pM e IM
44 ± 7
Tabla 4
CGRP liberado de GRD Scn9ári+ expuestos a Pro-TxII
Condiciones
CGRP (pgiml)
IM
55 ± 5
preincubación con Pro-TXII 10 nM e IM
186 ± 40
preincubación con Pro-TXII 100 nM e IM
1 126±25
Tabla 5
CGRP liberado de GRD Scn9a3 expuestos a lidocaína
Condiciones
CGRP (pgiml)
preincubación con lidocaína 5 mM e IM
40 ± 6
Lidocaína 5 mM + IM
12 ± 1
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15
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25
30
Tabla 6
CGRP liberado de GRD Scn9a
+l+ expuestos a anticuerpo anti-hNav1.7
Condiciones
CGRP (pglml)
IM
172 ± 17
Ab1
29 ± 4
preincubación con Ab1 e IM
168 ± 11
Ab2
35 ± 2
preincubación con Ab2 e IM
522 ± 32
Ab4
21 ± 5
preincubación con Ab4 e IM
430 ± 2
Ab5
39 ± 6
preincubación con Ab5 e IM
62 ± 2
Tabla 7
CGRP liberado de GRD Scn9anumi+ expuestos al anticuerpo anti-hNaV1.7
Condiciones
CGRP (pglml)
Tampón
2 ± 1
IM
21 ± 1
preincubación con Ab1 e IM
97 ± 14
Ab1 + IM
19 ± 10
preincubación con Ab4 e IM
122 ± 35
Ab4 + IM
26 ± 1
preincubación con Ab5 e IM
82 ± 19
Ab5 + IM
20 ± 1
Tabla 8
CGRP liberado de GRD Scn9anumi+ expuestos al anticuerpo anti-hNav1.7
Condiciones
CGRP (pglml)
IM
30 ± 7
preincubación con Ab4 e IM
81 ± 12
preincubación con Ab5 e IM
117 ± 1
Tabla 9
CGRP liberado de GRD Scn9a3 expuestos al anticuerpo anti-hNav1.7
Condiciones
CGRP (pglml)
IM
27 ± 3
Ab1 + IM
12 ± 2
preincubación con Ab1 e IM
38 ± 7
preincubación con Ab4 e IM
101 ± 2
preincubación con Ab5 e IM
47 ± 6
Ejemplo VII
Generación de líneas de células de GRD inmortalizadas de ratones humanizados
Las neuronas de GRD de ratones humanizados pueden aislarse e inmortalizarse para plazo de la función del canal NaV1.7 humano in vitro.
Las neuronas de GRD pueden inmortalizarse mediante cualquier método conocido en la patente de los EE.UU. núm. 2009/0298095A1). Típicamente, la inmortalización de GRD el empleo de un vector de origen retroviral que se modifica con secuencias de ADN que codifican un oncogén. (por ejemplo myc) y un marcador de selección (por ejemplo, neomicina). Los oncogenes adecuados que pueden clonarse en un vector para inmortalizar una célula de GRD aislada incluyen factores de crecimiento o mitógenos (por ejemplo, c-Sis), receptores del tipo tirosina quinasa (por ejemplo, receptor del factor de crecimiento epidérmico, receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas y receptor del factor de crecimiento endotelial vascular), tirosina quinasas citoplásmicas (por ejemplo, Familia Src, familia Syk-ZAP-70 y familia BTK de tirosina quinasas), serina/treonina quinasas citoplásmicas y sus subunidades reguladoras (por ejemplo, sobreexpresión de Raf quinasa y quinasas dependientes de ciclina), GTPasas reguladoras (por ejemplo, Ras), y factores de transcripción (por ejemplo, myc). Una vez que el vector se construye para albergar ambas secuencias de ADN de modo que sean capaces de transcribirse dentro de la célula, este puede usarse para crear una línea de células de GRD inmortalizadas por transfección en GRD aislados de un ratón humanizado como se describe en los Ejemplos 2 - 4.
Brevemente, las neuronas de GRD primarias disociadas pueden prepararse mediante métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, ver Wood J.N., Bevan, S.J., Coote, P.R., Dunn, P.M., Harmar, A. Hogan, P., Latchman, D.S., Morrison, C., Rougon, G., Theveniau, M., Wheatley, S. 1990. Novel Cell lines display properties of nociceptive
el estudio continuo a largo
técnica (por ejemplo, ver la aislados se logra mediante
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sensory neurons. Proceedings of Biological Sciences, The Royal Society 241(1302):187-94; Raymond, H.K., Thode, S., Zhou, J., Friedman, G.C., Pardinas, J.R., Barrere, C., Johnson, R.M., Sah, D.W.Y. 1999. Immortalized human dorsal root ganglion cells differentiate into neurons with nociceptive properties. Journal of Neuroscience 19(13):5420- 5428; Chen, W., Mi, R., Haughey, N., Oz, M., Hoke, A. 2007. Immortalization and characterization of a nociceptive dorsal root ganglion sensory neuronal line. J of the Peripheral Nervous System 12:121-130). Los cultivos de GRD aislados que expresan una Nav1.7 humana como se describe en los Ejemplos 2 - 4, se transfectan después, por ejemplo, por electroporación, con un vector candidato modificado como se describió anteriormente.
Después de la transfección, los cultivos celulares se cultivan en medio de selección y se mantienen en el medio de selección durante hasta 1-2 semanas hasta que se forman colonias aisladas con 200-300 células. Las colonias se recolectan y expanden mediante el uso de métodos de cultivo estándar cuando alcanzan aproximadamente 80-90 % de confluencia. Las células del cultivo pueden tamizarse para detectar la expresión de la proteína Nav1.7 humana por transferencia Western o Southern mediante el uso de sondas diseñadas a partir de la secuencia de la Nav1.7 humana. Alternativamente, la confirmación de la proteína canal Nav1.7 en las células transfectadas puede lograrse mediante la reacción en cadena de la polimerasa del ADN o ARN aislado de las células transfectadas.
Una vez que la línea celular neuronal de GRD inmortalizada demuestra la capacidad de autorreplicación durante múltiples generaciones, será adecuada para varios ensayos diferentes, que incluyen, por ejemplo, el análisis de las propiedades neuronales del canal Nav1.7 humano, ensayos de toxicidad neuronal, medición de la respuesta de GRD a estímulos nociceptivos, ensayos de fijación de membranas, tamizaje de fármacos de alto rendimiento, y pruebas de bloqueadores específicos de Nav1.7 (por ejemplo, un anticuerpo anti-Nav1.7).
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
<120> ENSAYO DE LIBERACIÓN DE NEUROPÉPTIDOS PARA CANALES DE SODIO
<130> 210-002EPT1
<150> EP 12167014.5 <151 >
<150> US 13/236.117 <151 >
<150> US 13/155.491 <151 >
<150> US 61/485.488 <151 >
<160> 43
<170> FastSEQ para Windows versión 4.0
<210> 1 <211 > 22 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400> 1
gggacttctc tgggttcagt ta 22
<210>2 <211 > 23 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400>2
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aaaggctctc aatgggaaac aag 23
<210>3 <211 > 29 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400> 3
tcaatgactt gacataatgc atgcactcc 29
<210> 4 <211 > 24 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400> 4
atgtcagcca atccttctaa agtg 24
<210> 5 <211 > 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400> 5
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<210> 6 <211 > 25 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400> 6
tcctatgagc ccatcacaac cacac 25
<210>7 <211> 19 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400> 7
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<213> Secuencia artificial <220>
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gaacacggcg gcatcag 17
<210>9 <211 > 23 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400> 9
tgggcacaac agacaatcgg ctg 23
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<213> Secuencia artificial <220>
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<210> 11 <211 >148 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400> 11
ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatagcttc ggttttgata cactgtttac 60 agcctgcgaa ggtgactcac tcgtgttaat aagactcttt tacggaggtc tatgccaaac 120 tctttttatc aaatattctc aaaggcag 148
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<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400> 12
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<213> Secuencia artificial <220>
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gaagggcagc tgtttgccag 20
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atgaagaagc cccaaagcca agca 24
<210> 15 <211> 17 <212> ADN
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<223> Sintético <400> 15
tgcggccgat cttagcc 17
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<223> Sintético <400> 16
ttgaccgatt ccttgcgg 18
<210> 17 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400> 17
acgagcgggt tcggcccatt c 21
<210> 18 <211 > 99 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400> 18
ttaggtaagg atccgaaggg gaaataaaac ctacaggatg agaagatggc aatgttgcct 60
cccccaggac ctcagagctt tgtccatttc acaaaacag 99
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<213> Secuencia artificial <220>
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cgtataatgt atgctatacg aagttat 87
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<213> Secuencia artificial <220>
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tatacgaagt tatgctagta actataacgg tcctaaggta gcgagctagc agcttcggtt 60
ttgatacact gtttacagcc tgcgaaggtg 90
<210> 21 <211 > 24 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400> 21
ggactacaac tgtttatggg caac 24
<210> 22 <211 > 24 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400> 22
tcaattcttc ttcactctca gcag 24
<210> 23 <211 > 25 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400> 23
tccggaagga ccttgagcag aatga 25
<210> 24 <211 > 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400> 24
caacaggtga gcagcaacag 20
<210> 25 <211 > 22 <212> ADN
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400> 25
gcaggagaca catacaccag ac 22
<210> 26 <211 > 26 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400> 26
aaacacgcat gtctgaaggc agtcgg 26
<210> 27 <211 > 201 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400> 27

tacattttaa ggactaaaaa ccatcgtggg ggccctgatc caatcagtga agaagctctc 60

tgacgtcatg atcctcactg tgttctgtct cagtgtgttc gcactaattg gactacagct 120

gttcatggga aacctgaagc ataaatgttt tcgaaattca cttgaaaata atgaaacatt 180

agaaagcata atgaataccc t 201
<210> 28 <211 > 157 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400> 28

aggtgagtac caagagaaac atgcattgta tttttgaatg gcatatgtac ctggtgtatg 60

ttaagagcct gtattaggag gttttttatt tatttgagaa tggaggaaac tctattactc 120

gagataactt cgtataatgt atgctatacg aagttat 157
<210> 29 <211> 141 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400> 29

tatacgaagt tatgctagct ctgcagacag tctgggactc cctaatgtgc attattaaaa 60

ttacaggcaa tttacttggc tgatatgaga acagatagtt ctgaagtcat caataatttt 120

ctgctgtgtc tgaccagcgt t 141
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 30 <211> 19 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400> 30
gcttgggctt gcaccttta 19
<210> 31 <211 > 22 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400> 31
tgcgttgacc actacctgat ac
<210> 32 <211 > 23 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400> 32
tctgcattgg cgtctgtttg tca
<210> 33 <211 > 25 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400> 33
tgacttgccc tatcaatctg agatc
<210> 34 <211 > 28 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400> 34
gctcacactg tatacacaca aaatcttc
<210> 35 <211> 19 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400> 35
tcactgccta tgataaagt 19
22
23
25
28
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<210> 36 <211 > 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400> 36
cacggtttcc tgcaagtcaa 20
<210> 37 <211 > 22 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400> 37
gggacactta caacttgaag ca 22
<210> 38 <211 > 26 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400> 38
tcgttccgaa tgttttgccc ttatga 26
<210> 39 <211 > 78 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400> 39
tttcatttat ttgaagtgca atatcatctt ggccatctac tcctctgtat gctagtaggt 60 aagcctggtg atcacaga 78
<210> 40 <211 > 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintético <400> 40
gactagtata caattacaaa tatgcctcga gataacttcg tataatgtat gctatacgaa 60 gttat 65
<210> 41 <211 > 93 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético 5 <400> 41
tatacgaagt tatgctagct ttcctgctaa ccatcattct ggggtatgtg ttatgatgga 60 agttaagtga cagttactta taatatggct gct 93
<210> 42
10 <211 > 9771
<212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
15 <223> Sintético
<400> 42
cggggctgct
tcgccagcgc
gctagcctgg
gaaaaagaag
ccagattctg
gtgaggagct
caggacctca
ttgctgaaag
caaagccaag
ctcccggcat
ctttcatagt
atatgctttc
tattcagcat
acccaccgga
cacttgtaaa
cgtggaactg
taggcaatgt
taatcccagg
atgtcatgat
tcatgggaaa
aaagcataat
aaggatccaa
ggtacacctg
tcagctgggc
accaacagac
tcctgggctc
aacagaacca
tagaccgtct
atacaagtat
aactgagctc
agctctccag
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agaggttgtc
ggcgaagcag
agactgaatt
cactgtttgt
ggtccccacc
tggtctccct
agggcacgac
acctccacgg
tccagcggcg
gtgccagtgg
cagccctgag
caggtgcact
gaagaggaat
gagctttgtc
aaaatcaaag
cagtgacttg
ggtgtcagag
attgaacaaa
tcctttcagt
gctcatcatg
ctggaccaaa
aatccttgca
gctggatttt
ttcagctctt
cctgaagaca
cctgactgtg
cctgaagcat
gaatacccta
agatgctctc
tgtgaaaatt
cttcttagcc
gctgcgtgct
cttttatcta
ggcaaacatt
taaaaaagag
taggagaagc
taaaagtgct
tggagaggaa
aagaaaaagt
tacccccaat
cagaacaagt
tgccgatgat
gccccacaga
aatgctgccg
ggttgatgga
caatcaaata
gcgcgccctg
gctgtcggct
ctgctagcgg
agagcgccgg
gggtggggat
taaaatatac
catttcacaa
gaacccaaag
gaagctggca
cccctggagg
gggaaaacaa
cctctaagaa
tgcactattc
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agaggcttct
gtcgtcattg
cgaactttca
attgtagggg
ttctgtctga
aaatgttttc
gagagtgaag
ctttgtggtt
ggcagaaacc
ttgtttaggc
gctggcaaaa
ataaacttga
gaagaagcta
caagaagaag
agaattatgg
aaagaaagaa
aagggagatg
ttccaccttg
cagtcaccac
ctttttagtt
gagcacagca
ccccaggagc
gtgaacggga
cgctcagccc
cacaagaaaa
gcaggagggg
ttccaattcc
caggcgtccc
ggaaggagag
gatcggcggg
aggatgaaaa
aacagtctct
aagaaaagaa
aacagctgcc
acttggaccc
tcttccgttt
gaatatctat
tgacaaactg
acacttttac
gtgtaggaga
tttttgcgta
gagtattgag
ctttgatcca
gtgtgtttgc
gaaattcact
aagactttag
tcagcacaga
ctgattatgg
taatgaccca
cctacatgat
tcctggctgt
aacagaaaga
ctgaggcaat
gcctctcaga
gaaacagaag
ctgagaaatt
gtgtcgaagg
tcagcattcg
tcaaaggcag
tttttggaga
gacgcagcag
aaatgcacag
tcatgctccc
ggcgttgtag
cgcagtctgc
gccagctcgg
ctgagcaaca
gcccgcgccc
ctaggttgca
gatggcaatg
tgccctcatt
agatgatgat
cttcatctat
ctactatgca
caatgccaca
taagatttta
catatttatg
tggaatatat
attcactttt
tttaacagaa
agctttgaaa
gtcagtgaag
actaattgga
tgaaaataat
aaaatatttt
ttcaggtcag
ctacacgagc
agattactgg
cttctttgtc
ggttgccatg
attagaattt
tgcagcggca
gagttcttct
aaagaaaaag
gtcgaaatca
gcataggcga
tggctccttg
aggaagagat
caatgagagc
taacatcagc
tgctgtggac
caatggacag
ttcctatctc
ttgcaggcgg
ctgaggctgg
ggagcccaga
tctcctggag
agcctcttat
ttgcctcccc
gaacaacgca
gaagaagccc
ggggacattc
gacaaaaaga
cctgctttat
gtacactcct
accatgaata
acttttgaat
cttcgtgacc
tttgtaaacc
actatttctg
aagctttctg
ctacagctgt
gaaacattag
tattacttgg
tgtccagagg
tttgacactt
gaaaaccttt
gtagtgattt
gcatatgaag
caacagatgt
gcggctgaat
gaaacatcca
aatcaaaaga
gaatcagagg
gcacatgaaa
ttttctgcaa
ataggatctg
agaaggggct
caagccagta
tgcaacggtg
cttctgccag
ctttcagagg
60 120 180 240 300 3 60 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340

Claims (12)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1. Un kit que comprende un antagonista de Nav1.7, una célula neuronal no humana que comprende en un locus de Nav1.7 endógeno, una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína NaV1.7 humana o quimérica o una variante de dicha proteína con hasta 20 diferencias en la secuencia de aminoácidos, y uno o más mediadores seleccionados de prostaglandina E2, bradiquinina, capsaicina, protones, y un factor neurotrófico.
  2. 2. El kit de la reivindicación 1, en el que la célula neuronal es una célula neuronal de ratón.
  3. 3. El kit de la reivindicación 2, en el que la célula neuronal es una célula de los ganglios de las raíces dorsales (GRD).
  4. 4. El kit de la reivindicación 1, en el que la célula neuronal es de un GRD aislado de un miembro del grupo que consiste en ratón, rata o mono, en el que preferentemente el GRD se aísla de un ratón.
  5. 5. El kit de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la célula está inmortalizada.
  6. 6. El kit de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el antagonista de NaV17 es un anticuerpo anti- NaV1.7.
  7. 7. El kit de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha secuencia de nucleótidos codifica una proteína NaV1.7 quimérica que comprende una secuencia humana del bucle extracelular del poro.
  8. 8. El kit de la reivindicación 7, en el que la secuencia humana del bucle extracelular del poro se corresponde con la secuencia del bucle extracelular del poro del dominio I o del dominio III de una proteína NaV1.7.
  9. 9. El kit de la reivindicación 1, en el que la proteína NaV17 es una proteína NaV1.7 quimérica codificada por el exón 1 del gen de NaV1.7 de ratón y los exones del 2 al 28 del gen de NaV1.7 humano.
  10. 10. El kit de la reivindicación 9, en el que la proteína NaV1.7 quimérica comprende una sustitución de aminoácidos seleccionada de una Q10R, I136V, F216S, S241T, N395K, V400M, L823R, I848T, L858H, L858F, A863P, V872G, F1449V, o una combinación de las mismas.
  11. 11. El kit de la reivindicación 9, en el que la proteína NaV1.7 quimérica comprende una sustitución de aminoácidos seleccionada de una R996C, V1298D, V1298F, V1299F, I1461T, F1462V, T1464I, M1627K, A1632E, o una combinación de las mismas.
  12. 12. El kit de la reivindicación 9, en el que la proteína NaV1.7 quimérica comprende una sustitución de aminoácidos seleccionada de F1200L, I1235L, o una combinación de las mismas.
    imagen1
    en
    o
    Bkb
    ^~ft
    81 kb
    -HH4
    10
    X
    INI t l H-H--------f-
    2 3-5 7 V 39 11 1213 14-17 IB
    26/27
    H---------l-H--------ttt—H—p
    1fl 20 21 22 23-25 ' 28
    x.
    'KÑeotK
    Vectordetransformadón de Navl.7 de ratón
    I
    *
    6 kb
    #
    1
    2 3-5 28
    imagen2
    s.
    Vector de transformación de Navl.7 humana
    ---fl m H-H—F
    4---------M I llí
    ---- 113
    Kb
    i
    ADN de NAvl.7 humano
    6 kb
    #
    4-M-----II II! lili i
    4-----1 I i M-
    I' |fl --------
    2%
    13,8 Kb ■«----------------1
    Gkb 2 6
    10 12
    26/27
    b
    #
    ■HHf
    3 5 7
    HH 11 II M----F
    -I--------1—t—í-
    -HF
    39 11 sjí t4'1*
    16
    19
    20 21 22 23-25
    28
    _,**■
    Vector de transformación de Mavl.7-DI/S5-S6 humana
    10 Kb
    I
    ADN de NAt/l*7 humano
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    ■ if i"1*
    ^TñT^i i i i ihi—i-------------1—i—i—r-
    26/27
    ■4H------M
    3*5
    11 13 14-17 18
    19 20 21 22 23*25
    28
    en
    CO
    Skb 6
    I //---------HHf
    1 2 3-5 7
    6 kb
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    1
    ■hA
    2 3-5 7
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    10
    ■IIII 1 1 INI---1-------1----1-
    89 11 12 1J 14-17 18 19 20
    Vector de transformación de Navl.7-DI/S5-S6 j j ¡
    humana +-------------------
    2,6 Kb
    I
    ADN deNAvl.7 humano
    10 *------\
    ni i -1 'i-im—i---------------1—mi ■ '
    89 11 1213 14-17 18 19 20 21 22
    imagen3
    imagen4
    Latericia de retirada de la cola (seg)
    imagen5
    8L03-L0-6L
    *0*861.21.3
    * I
    ca co
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    C C
    U il
    CO co
    imagen6
    (0) epejpaj ap |Ejqujn
    imagen7
    imagen8
    (Gas) E|03 B| 9p epei^dJ 0p ei3U3}e"|
    en
    oo
    Umbral de retirada (g)
    imagen9
    Scn9a+'+ Scn9a3-1/31
    Figura 7B
    imagen10
    O)
    o
    Umbral de retirada de la pata |g)
    imagen11
    Posterior al ACF
    | | Scn9a+,+ Scn9a3m1
    15n
    Umbral de retirada de la pata (g)
    imagen12
    Condiciones iniciales
    Q Scn9a+'* fy ScnSa3-1'3-1
    imagen13
    % de cambio respecto a las condiciones iniciales
    imagen14
    O)
    co
    Concentración de CGRP (pg/ml)
    imagen15
    niM
    m TTX l|iM e IM ■ TTX l\xM + IM
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