ES2656988T3

ES2656988T3 - Biomarcador para el cáncer de mama

Info

Publication number: ES2656988T3
Application number: ES12770851.9T
Authority: ES
Inventors: Hitoshi Endou; Isao Okayasu
Original assignee: J Pharma Co Ltd
Current assignee: J Pharma Co Ltd
Priority date: 2011-04-15
Filing date: 2012-04-13
Publication date: 2018-03-01
Anticipated expiration: 2032-04-13
Also published as: EP2698634A4; EP2698634B1; JPWO2012141285A1; KR20140019833A; EP2698634A1; WO2012141285A1; CN103547923A; JP6075881B2; KR101976219B1; CN103547923B; US9618512B2; US20140106377A1

Abstract

Uso de un kit para el diagnóstico del tumor de glándula mamaria, en donde el tumor de glándula mamaria es cáncer de mama triple negativo que es negativo para el receptor de estrógeno, el receptor de progesterona, y HER2, comprendiendo el kit un anticuerpo monoclonal anti-LAT1 para detectar, identificar, o cuantificar LAT1.

Description

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finamente en láminas con un micrótomo, y se prepara el portaobjetos con el espécimen. El portaobjetos con el espécimen preparado se somete a tratamiento de desparafinización según un método convencional, y se lleva a cabo la inmunohistoquímica de fluorescencia. Posteriormente, se observa el espécimen bajo un microscopio de fluorescencia y se evalúa la presencia o ausencia de células cancerosas. Se pueden detactar tejidos de cáncer de mama mediante el método de la presente invención usando la técnica de inmunohistoquímica y similares.

(4) Detección de células cancerosas mediante un método que usa ELISA

Se pueden cuantificar los niveles de proteína de LAT1 en el tejido extraído mediante la detección de la proteína LAT1 presente en el tejido extraído por un método de ELISA, por lo tanto se hace factible una evaluación más cuantitativa. La muestra se trata con tensioactivo y ultrasonidos, y se separa con una ultracentrífuga a una temperatura de 4ºC a 100.000 x g para obtener un sedimento de proteína desechando el sobrenadante. Al sedimento se le añade PBST/BSA al 10% en una cantidad apropiada y se resuspende por el tratamiento de ultrasonidos. Este se usa como una muestra y se lleva a cabo un método de ELISA.

En primer lugar, se añade la muestra a una placa inmunológica a una concentración de 100 l/pocillo y se deja a temperatura de 4ºC durante toda la noche. La solución de muestra se descarta y se añade una solución de bloqueo, y la placa se deja después a temperatura ambiente durante 1 hora. Se desecha la solución de bloqueo en el pocillo y se añade una solución de anticuerpo primario anti-LAT1 apropiadamente diluido, y la placa se deja después a temperatura ambiente durante 2 horas (durante esta reacción, el anticuerpo anti-LAT1 se une de forma independiente a la proteína LAT1 pegada sobre el fondo del pocillo). El anticuerpo primario se descarta y se lava con PBST, y después se añade un anticuerpo secundario marcado diluido arbitrariamente, y la placa se deja después a temperatura ambiente durante 1 hora. Se lava el interior del pocillo con PBST y se añade una solución de sustrato para que produzca color o quimioluminiscencia. La presencia o ausencia de proteína LAT1 se confirma y se evalua midiendo las cantidades de colorante o las intensidades de luminiscencia con un espectrofotómetro o con un luminómetro.

Una característica de la presente invención es que se pueden evaluar los grados de malignidad de tumores en tejidos intraductales de mama. El método de evaluación de los grados de malignidad de tumores en tumores intraductales de mama en la muestra incluye la medida cuantitativa de LAT1. Es decir, se puede obtener la cantidad de células normales cuantificando LAT1 expresado en células normales, y se puede obtener también la cantidad de células tumorales cuantificando LAT1 expresado en células tumorales. Además, estas células requieren el mismo tipo de LAT; por lo tanto los valores cuantitativos de ambas células pueden indicar el porcentaje de las células que se convierten en células tumorales. Por lo tanto, la presente invención también proporciona un método de evaluación del grado de malignidad de las células tumorales de la muestra cuantificando LAT1 expresado en células tumorales.

Como la mayoría de cánceres de mama triple negativos expresan LAT1 a un nivel alto, se encuentra que el tratamiento que se dirige a LAT1 es eficaz para el cáncer de mama triple negativo para el que no hay tratamiento apropiado hasta ahora. Es más, si el cáncer de mama en general es triple negativo o no, el tratamiento que se dirige a LAT1 es eficaz probando la presencia o ausencia de la expresión de LAT1.

Una característica de la presente invención es que el diagnóstico del cáncer de mama puede ser factible combinando una tinción inmunológica de ER (receptor de estrógeno), una tinción inmunológica de PgR (receptor de progesterona), una tinción inmunológica de HER2, y una tinción inmunológica de LAT1. En la presente invención, el diagnóstico del cáncer de mama se puede realizar de modo más preciso mediante la tinción inmunológica de LAT1 que usa el anticuerpo monoclonal anti-LAT1 además de la tinción inmunológica que usa ER, PgR y HER2. Se pueden usar materiales comercialmente disponibles para la tinción inmunológica de ER, PgR y HER2. Por ejemplo, se puede usar un sistema Ventana XT (Ventana Japan, Tokio, Japón) para la tinción inmunológica de ER y PgR; además, se puede usar un kit DAKO EGFR pharm Dx (Dako North America Inc., Carpinteria, CA, E.E.U.U.) como kit de tinción inmunológica para HER2. Sin embargo, no se limita a estos siempre y cuando signifique que pueden medir ER, PgR y HER2. En caso de que se usen estrógeno, progesterona o análogos de estas hormonas, se puede estimar el efecto de la terapia hormonal evaluando la presencia o ausencia de la expresión de ER y PgR. El efecto de agentes farmacéuticos anti-HER2 en el cáncer de mama se puede estimar evaluando la presencia o ausencia de la expresión del gen HER2. Similar a estos, se puede estimar el efecto de agentes reguladores del transportador LAT1 evaluando la presencia o ausencia de la expresión de LAT1 mediante un kit de tinción inmunológica de LAT1 que usa el anticuerpo monoclonal anti-LAT1. Se puede realizar esta tinción inmunológica al mismo tiempo o de modo independiente.

(Kit)

Además, la presente invención proporciona el uso de un kit de diagnóstico para realizar cualquiera de los métodos de la presente invención previamente mencionado. Es decir, la presente invención se refiere al uso de un kit para el diagnóstico que incluye un anticuerpo monoclonal anti-LAT1 para detectar, identificar, o cuantificar LAT1 para el diagnóstico de tumores de glándula mamaria. Un kit de diagnóstico de este tipo puede ser uno para diagnosticar los grados de malignidad en tumor de glándula mamaria, en donde el tumor de glándula mamaria es un tumor intraductal de mama, o cáncer de mama triple negativo que es negativo para todos los receptores de estrógeno, receptor de progesterona y HER2. Es más, la presente invención se refiere al uso de un kit para el diagnóstico de

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tumor de glándula mamaria que incluye la combinación de un kit de tinción inmunológica del receptor de estrógeno, un kit de tinción inmunológica del receptor de progesterona y un kit de tinción inmunológica de HER2 y un kit de tinción inmunológica de LAT1. También, la presente invención se refiere al uso de un kit para identificar la expresión de LAT1 si el resultado del receptor de estrógeno, el receptor de progesterona y HER2 en tumores de glándula mamaria es o positivo o negativo.

El kit para el diagnóstico con el fin de detectar, identificar, o cuantificar LAT1 incluye materiales que pueden detectar, identificar, o cuantificar LAT1. Por ejemplo, contiene el anticuerpo marcado y similares, que incluyen las etapas de marcar con una sustancia marcadora por sí misma o que reacciona con otras sustancias que pueden proporcionar señales detectables. En el kit de la presente invención, tanto un kit para detectar, identificar, o cuantificar LAT1 expresado en células normales como un kit para detectar, identificar, o cuantificar LAT1 expresado en células tumorales son un tipo de kit para detectar, identificar, o cuantificar LAT1. Se usa preferiblemente un grupo del mismo tipo de kit para la medición con el fin de cuantificar LAT1 pero no se limita a este.

Por ejemplo, mientras que puede estar contenido en el kit un material marcado con sustancia fluorescente para detectar, identificar, o cuantificar LAT2 expresado en células normales, puede estar contenido en el kit un material radioisótopo marcado para detectar, identificar, o cuantificar LAT1 expresado en células tumorales. Sin embargo, el anticuerpo marcado con radioisótopo es preferiblemente diferente del anticuerpo marcado con una sustancia fluorescente con una diferente longitud de onda en el kit.

(Métodos experimentales)

En la presente invención se explica además en detalle el efecto de LAT1. En primer lugar, los autores de la presente invención revisaron un estudio inmunohistológico de LAT1. Se extraen células tumorales de glándula mamaria en un procedimiento quirúrgico y se preparó un espécimen de tejido incluido en parafina. El espécimen de tejido incluido en parafina de células tumorales de glándula mamaria se somete a las etapas de desparafinar y bloquear, y tratar con un anticuerpo anti-LAT1 a la concentración final de 2 g/ml (para el estudio de LAT1, se usó un anticuerpo monoclonal de ratón anti-LAT1 humano (consúltese la Bibliografía de No Patente 1, pag. 23, en la Fig. 3A pag. 631), se usó un anticuerpo de conejo policlonal anti-LAT2 humano para el estudio de LAT2 (anticuerpo anti-hEST3A-N, TransGenic Inc., Kumamoto)) a una temperatura de 4ºC durante toda la noche. Después de lavar el espécimen con PBS, se añade un anticuerpo universal contenido en un kit ChemMate DAKO ENVISION System (kit de DAKO ChemMate ENVISION System HRP) al espécimen de tejido en cualquiera de los casos de estudio de LAT1 o de LAT2, y se trata el espécimen de tejido con el anticuerpo universal a temperatura ambiente durante 30 minutos. Entonces se desarrolla el color mediante la reacción con una solución de sustrato DAB (tetrahidrocloruro de 3,3’diaminobencidina).

Como resultado, mientras que se reconoció la tinción específica por reacción con el anticuerpo LAT1 en el espécimen preparado a partir de cálulas cancerosas, no se encontró la tinción específica por reacción con LAT2. Las Figs. de 1 a 5 muestran los resultados de las pruebas de tinción que usan el anticuerpo monoclonal anti-LAT1. Por ejemplo, la Fig. 1 muestra fotos que indican la línea de base para las intensidades de expresión de LAT1, la Fig. 2 muestra un caso que expresa LAT1 en carcinoma ductal in situ maligno, la Fig. 3 muestra un caso con la sobreexpresión de LAT1 en cáncer de mama triple negativo, la Fig. 4 muestra un caso que expresa LAT1 en cáncer de mama HER2 negativo, la Fig. 5 muestra un caso que expresa LAT1 en cáncer de mama HER2 positivo. De aquí en adelante, se explica cada uno de ellos.

La Fig. 1 muestra la línea de base que indica las intensidades de expresión de LAT1. La expresión de LAT1 se obtiene a partir del valor obtenido de la multiplicación de la intensidad de expresión (intensidad) [0 (negativo), 1 (positivo débil), 2 (positivo moderado), 3 (intensamente positivo)] y el área de región de expresión (área) [0 (negativo), 1 (regional, la región de expresión es menor del 10%), 2 (parcial, la región de expresión es mayor del 10% y menor del 30%) y 3 (difusa, la región de expresión es mayor del 30%)] como un valor evaluado (puntuación) mediante un método modificado (consúltese la Bibliografía de No Patente 4) de un método de Sinicrope (consúltese la Bibliografía de No Patente 11). La incidencia de LAT1 se determina en base al grado de esta tinción. La Fig. 1 indica las intensidades de expresión de LAT1 como referencia que muestra la intensidad 0, intensidad 1, intensidad 2, e intensidad 3 desde la izquierda de la foto.

(Discriminación entre malignidad y benignidad en tumores intraductales de mama)

La Fig. 2 muestra una comparación entre papiloma intraductal de mama y carcinoma ductal in situ, que son ambos categorizados como tumor intraductal de mama. En la parte superior de la foto se muestra la tinción HE (hematoxilina-eosina), en la parte inferior de la foto se muestra el resultado de una tinción inmunológica tratada con LAT1. La parte superior izquierda es una foto de tinción HE de papiloma intraductal de mama, que es benigno, y la parte superior derecha es la de carcinoma ductal in situ, que es maligno. En la izquierda, la foto muestra el papiloma intraductal de mama tratado con la tinción inmunológica de LAT1; en la parte inferior derecha de la foto es la de carcinoma ductal in situ. Como es obvio en la Fig. 2, mientras que la expresión de LAT1 es poco frecuente en el papiloma intraductal de mama, la intensa expresión de LAT1 se observa en la membrana celular del carcinoma ductal in situ. Las puntuaciones de la expresión de LAT1 en el grupo de carcinoma ductal in situ son significativamente más altas en comparación con aquellas del grupo de papiloma intraductal de mama. Por lo tanto,

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la aplicación de LAT1 como un biomarcador permite el diagnóstico del papiloma intraductal de mama y del carcinoma ductal in situ en un método simple, para los que la discriminación de estos era hasta ahora difícil.

Entre los tumores intraductales de mama, la discriminación en el diagnóstco de tejidos entre el papiloma intraductal de mama, que es benigno, y el carcinoma ductal in situ, que es maligno, es importante y esencial para juzgar el requisito de resección operativa. Sin embargo, en caso de un método histopatológico que usa especímenes tratados con una tinción HE convencional para discriminar entre los dos tumores, los elementos definidos de la discriminación no están claros, y existen una gran cantidad de lesiones donde es difícil la discriminación. La presente invención ha encontrado que la expresión de LAT1 era extremadamente baja en papiloma intraductal de mama benigno, que estaba en claro contraste con el carcinoma ductal in situ maligno que presentaba la expresión de LAT1 en un nivel alto. Por lo tanto, la evaluación de la expresión inmunohistológica de LAT1 permite la discriminación entre benignidad y malignidad.

(Diagnóstico del cáncer de mama triple negativo)

La Fig. 3 muestra hallazgos de la expresión de LAT1 en células de cáncer de mama triple negativo, que son negativas para todos los ER (receptor de estrógeno), PgR (receptor de progesterona), y HER2. Los hallazgos en el caso de tinción HE (hematoxilina-eosina) (tinción estándar), y tratado con HER2, ER, PgR, y LAT1 se muestran en orden a partir de la izquierda. Este es un caso que se muestra positivo a LAT1 a la intensidad de 3 (alta intensidad) en células de cáncer de mama triple negativo que son negativas a la totalidad de ER, PgR y HER2. Ya que 14 de 17 casos en el grupo de triple negativo (aproximadamente 83%) tienen la expresión de LAT1 en un nivel alto (puntuación de 6 o más), se cree que LAT1 es un biomarcador útil para el cáncer de mama triple negativo.

Entre los cánceres infiltrantes, no había una terapia molecular dirigida para cánceres de mama triple negativos hasta ahora. Sin embargo, la expresión de LAT1 en un nivel alto se reconoció en muchos en el grupo de cáncer de mama triple negativo. Ya que muchos pacientes con cánceres de mama triple negativos tienen clínicamente un mal pronóstico, este hallazgo es consistente con el hecho de que pacientes con cáncer de próstata cuya expresión de LAT1 estaba en un nivel alto tenían un mal pronóstico en comparación con casos que expresan LAT1 en un nivel bajo. Por consiguiente, se ha sugerido que la terapia molecular dirigida anti-LAT1 (que incluye sustancias que reaccionan con anticuerpo anti-LAT1, transportador LAT1, y similares) sería útil para el tratamiento de cánceres de mama triple negativos, y cabría esperar en un futuro la introducción de quimioterapia cuya diana es LAT1.

La Fig. 4 muestra un caso de cáncer de mama con HER2 negativo (puntuación 0 en un Hercep Test) y LAT1 positivo entre los cánceres infiltrantes. En orden a partir de la izquierda, un panel muestra los casos tratados con ER, PgR, HER2 y LAT1. Este caso mostró positividad para ER y PgR, y negatividad para HER2 en el núcleo, positividad para LAT1 (intensidad 2) en la membrana celular.

La Fig. 5 muestra un caso de cáncer de mama con HER2 positivo (puntuación 3 en el Hercep Test) y LAT1 positivo a una alta expresión entre los cánceres infiltrantes. En orden a partir de la izquierda, la figura muestra el caso tratado con tinción HE (hematoxilina-eosina), tratado con HER2 y LAT1. Como resultado, se reconoció una fuerte tinción de la muestra tratada con el anticuerpo LAT1 a la intensidad de 3 (alta intensidad) en el caso de HER2 positivo (puntuación 3 en el Hercep Test). Entre los cánceres infiltrantes en las Figs. 4 y 5, las puntuaciones de expresión de LAT1 en el grupo de casos HER2 positivos (puntuación 3 en el Hercep Test) fueron significativamente más altas en comparación con aquellas en el grupo de casos HER2 negativos (puntuación 0 en el Hercep Test).

A partir de estos resultados, LAT1 puede ser una nueva herramienta de diagnóstico para discriminar entre benignidad y malignidad de tumores intraductales de mama que son difíciles de diagnosticar hasta ahora. Es más, LAT1 puede ser un biomarcador extremadamente prometedor para el tratamiento de cánceres de mama triple negativos, que son negativos para la totalidad de ER, PgR y HER2.

Ejemplos

De aquí en adelante, la presente invención se explica específicamente mediante los Ejemplos. La presente invención, sin embargo, no se limita a esos ejemplos.

Ejemplo de referencia 1. Extracción de muestras experimentales

Se extrajeron aleatoriamente lesiones neoplásicas de glándulas mamarias, que se extirparon quirúrgicamente entre 2005 y 2009 en una instalación donde pertenecían los presentes inventores. Se usaron muestras patológicas de materiales quirúrgicos en un total de 87 casos que incluyen 10 casos de papiloma intraductal de mama, 10 casos de carcinoma ductal in situ (DCIS), y 67 casos de cáncer infiltrante (carcinoma invasivo). Entre ellos, 17 casos eran carcinomas infiltrantes triple negativos que eran negativos para la totalidad de ER, PgR, y HER2.

Ejemplo 1. Tinción que usa un anticuerpo anti-LAT1

Todas las lesiones neoplásicas extraídas de glándulas mamarias en el Ejemplo de Referencia 1 se sometieron a fijación con formalina al 10% y se preparó un bloque incluido en parafina, se preparó además una sección finamente laminada con 3 m de espesor a partir de un bloque típico que tenía un cara dividida máxima de lesiones

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neoplásicas. Además, después de la activación con microondas durante 5 minutos, se incubó la sección laminada con el anticuerpo monoclonal de ratón anti-LAT1 (consúltese la Bibliografía de No Patente 1, pag. 23, en la Fig. 3A pag. 631) preparado por los autores de la presente invención a una temperatura de 4ºC o más baja durante toda la noche. Además, se le añadió a la sección un anticuerpo universal contenido en un kit DAKO ChemMate ENVISION System HRP, y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos, y luego se desarrolló el color mediante la reacción con una solución de sustrato DAB (tetrahidrocloruro de 3,3’-diaminobencidina). Para la tinción del núcleo, se llevó a cabo la tinción con verde de metilo o con Hematoxilina de Mayer. Para la tinción inmunológica de ER y PgR, se usó un sistema Ventana XT (Ventana Japan, Tokio, Japón), y se llevó a cabo la tinción inmunológica de HER2 usando un kit DAKO EGFR pharmDx (Dako North America Inc., Carpinteria, CA, E.E.U.U.). Se usó un anticuerpo policlonal de conejo anti-LAT2 humano (anticuerpo anti-hEST3A-N, TransGenic Inc., Kumamoto) para la tinción inmunológica de LAT2.

Como resultado, se encontró la expresión de LAT1 (las puntuaciones de expresión de LAT1 estaban en el intervalo de 0 a 9) en muchas de las células de cáncer de mama, LAT2 también estaba expresado aunque era débil (las puntuaciones de expresión de LAT2 estaban en el intervalo de 0 a 3). Mientras tanto, las puntuaciones de expresión de LAT1 en células normales estaban en el intervalo de 0 a 1, las puntuaciones para LAT2 estaban en el intervalo de 1 a 4.

La expresión de LAT1 se obtuvo mediante multiplicación de la intensidad de expresión (intensidad) [0 (negativo), 1 (positivo débil), 2 (positivo moderado), 3 (intensamente positivo)] y el área de la región de expresión (área) [0 (negativo), 1 (regional, la región de expresión es menor de 10%), 2 (parcial, la región de expresión es 10% y, menos de 30%), 3 (difusa, la región de expresión es 30% o más)] como un valor evaluado (puntuación) mediante un método modificado (consúltese la Bibliografía de No Patente 4) de un método de Sinicrope (consúltese la Bibliografía de No Patente 11). Se llevó a cabo el tratamiento estadístico de manera que los valores se expresaron como media ± SD en cada grupo. Se llevó a cabo la prueba no paramétrica de Mann-Whitney U para comparar los dos grupos, y se determinó un nivel de significancia que era menos del 5%.

Resultados

El resultado obtenido en el Ejemplo 1 se muestra en la Fig. 6, que muestra la comparación de la expresión de LAT1 en tumores de glándula mamaria.

(1): Comparación de las expresiones de LAT1 entre los grupos de carcinoma ductal in situ y papiloma intraductal de mama.

La puntuación de la expresión de LAT1 en el grupo de carcinoma ductal in situ (DCIS), que es maligno, era significativamente alta (p = 0,0156) que indicaba 5,1 ± 3,2 en comparación con 1,5 ± 2,1 en el grupo de papiloma intraductal de mama (papiloma intraductal de mama), que es benigno.

(2): La comparación de las expresiones de LAT1 entre casos con HER2 positivo y negativo.

Entre los cánceres infiltrantes (carcinoma invasivo), la puntuación de la expresión de LAT1 fue de 6,6 ± 2,8 en el grupo de casos con HER2 positivo (puntuación 3 en Hercep Test), que fue significativamente mayor en comparación con 3,6 ± 2,4 en el grupo de casos con HER2 negativo (puntuación 0 en Hercep Test) (p = 0,0008). A partir de este resultado, la puntuación de LAT1 es alta en los casos con HER2 positivo, y se dice que los grados de malignidad son altos en términos de proliferación celular.

(3): Expresión de LAT1 en el grupo de cánceres de mama triple negativos

Muchos cánceres de mama triple negativos, que eran negativos para la totalidad de ER, PgR y HER2, fueron los casos con LAT1 sobreexpresado (14 de 17 casos tuvieron la puntuación 6 o más, p. ej., aproximadamente el 83%), las puntuaciones de expresión de LAT1 en los 17 casos fue de 6,8 ± 2,6 en un nivel alto. A partir de este resultado, muchos de los cánceres de mama triple negativos tienen LAT1 con una alta puntuación, y por lo tanto, la terapia molecular dirigida cuya diana es LAT1 parece ser eficaz para los cánceres de mama triple negativos.

Claims

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