ES2657053T3

ES2657053T3 - Agente de formación de inmunoimágenes para el uso con la terapia de conjugado de anticuerpo-fármaco

Info

Publication number: ES2657053T3
Application number: ES14717073.2T
Authority: ES
Inventors: Jochen Kruip; Susanta K. Sarkar; Mathias Gebauer; Christian Lange; Ingo Focken
Original assignee: Sanofi SA
Current assignee: Sanofi SA
Priority date: 2013-02-05
Filing date: 2014-02-05
Publication date: 2018-03-01
Anticipated expiration: 2034-02-05
Also published as: PL2953977T3; SG10201707391QA; JP6605331B2; KR20150113197A; DK2953977T3; WO2014122529A1; CN105229034A; HUE037909T2; SI2953977T1; RU2015137858A; AU2014213687B2; EP2953977B1; LT2953977T; AU2014213687A1; CN105229034B; CA2900154A1; EP2953977A1; SG11201506054XA; JP2016509606A; MX2015010145A

Abstract

Una proteína de unión similar a un anticuerpo que se une específicamente al sialoglicotopo de MUC1 asociado al tumor CA6, caracterizada por que la proteína de unión similar a anticuerpo comprende dos polipéptidos que tienen las estructuras representadas por las fórmulas [I] y [II] a continuación: VL1-L1-VL2-CL [I] VH1-L2-VH2-CH1 [II ] en las que: VL1 es un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina derivado del anticuerpo DS6; VL2 es un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina derivado del anticuerpo DS6; VH1 es un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina derivado del anticuerpo DS6; VH2 es un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina derivado del anticuerpo DS6; CL es un dominio constante de cadena ligera de inmunoglobulina, tal como un dominio constante de cadena ligera de inmunoglobulina IGKC humana; CH1 es un domino constante de cadena pesada CH1 de inmunoglobulina, tal como un dominio constante de cadena pesada CH1 de una inmunoglobulina humana; L1 y L2 son enlazadores de aminoácidos; y en la que los polipéptidos de fórmula I y los polipéptidos de fórmula II forman una proteína de unión similar a un anticuerpo de inmunoglobulina en tándem monoespecífica bivalente, en la que el polipéptido de fórmula [I] comprende una secuencia al menos 80% idéntica a SEQ ID NO: 1, y el polipéptido de fórmula [II] comprende una secuencia al menos 80% idéntica a SEQ ID NO: 7.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

formación de bioimágenes PET. La proteína de unión similar a un anticuerpo para el diagnóstico acompañante facilitará la estratificación de pacientes y la evaluación temprana de la eficacia terapéutica del inmunoconjugado de fármaco-anticuerpo DS6, huDS6-DM4, que consiste en un anticuerpo monoclonal humanizado contra el sialoglicotopo de MUC1 asociado a tumor CA6, conjugado con el maitansinoide citotóxico DM4. El inmunoconjugado de fármaco-anticuerpo huDS6-DM4 se describe, por ejemplo, en la publicación internacional nº WO 2005/009369. El anticuerpo DS6 y el antígeno tumoral CA6 se describen, por ejemplo, en Kearse et al. (Int J Cancer. 15 de diciembre de 2000; 88(6):866-72).

El huDS6-DM4 es un innovador inmunoconjugado de fármaco-anticuerpo que consiste en un anticuerpo monoclonal humanizado (huDS6) contra el sialoglicotopo de MUC1 asociado a tumor CA6, conjugado con el maitansinoide citotóxico DM4. Las proteínas de mucina desempeñan un papel fundamental en la formación de barreras mucosas protectoras sobre superficies epiteliales, y se expresan sobre la superficie apical de las células epiteliales que tapizan las superficies mucosas de muchos tejidos diferentes, que incluyen pulmón, mama, ovario, estómago y páncreas. Se sabe que la MUC1 (mucina-1) está sobreexpresada en una serie de cánceres epiteliales, y la sobreexpresión de CA6 está relacionada con un comportamiento agresivo en cánceres humanos y un mal desenlace para los pacientes. El CA6 presenta una distribución limitada entre los tejidos de adultos normales, y por tanto, el anticuerpo DS6 se constituye en un agente prometedor para el tratamiento selectivo de tumores positivos a CA6 (por ejemplo, tumores de los ovarios, útero, páncreas, mama o pulmón). Después de la unión del anticuerpo/antígeno y la internalización, el inmunoconjugado huDS6-DM4 libera DM4, que se une a la tubulina y altera la dinámica de ensamblaje/desensamblaje de los microtúbulos, lo cual produce una detención mitótica de las células tumorales que expresan CA6. El huDS6-DM4 está siendo sometido en la actualidad a un ensayo clínico de fase I en pacientes diagnosticados con tumores sólidos positivos al antígeno CA6.

Para identificar pacientes que muestran la expresión de CA6 en tumores y, por tanto, que pueden responder al tratamiento con huDS6-DM4, se ha desarrollado una herramienta de diagnóstico acompañante que se une a CA6 con una alta afinidad. Además, esta proteína de unión similar a un anticuerpo para el diagnóstico acompañante actúa como un marcador temprano de la eficacia, proporcionando una herramienta auxiliar para controlar, de modo no invasivo, la respuesta de un paciente a la terapia con huDS6-DM4, facilitando con ello la estratificación de pacientes en ensayos clínicos o en tratamientos clínicos (es decir, una disminución en la señal de CA6 se correlaciona con un encogimiento del tumor o la infrarregulación del objetivo, acoplado a una eficacia insuficiente). Este diagnóstico acompañante puede reducir el desgaste y ayudar a administrar una medicina eficaz a los pacientes con mayor rapidez. La proteína de unión similar a un anticuerpo para el diagnóstico acompañante, según se describe en la presente, también puede utilizarse para la detección de CA6 in vivo mediante la formación de bioimágenes PET. Para conseguir unos tiempos de exposición cortos y una formación de imágenes rápida, por ejemplo, en 48 a 24 horas o menos, con una alta señal de tumor a sangre, es necesario un ligante muy específico con la cinética de eliminación apropiada.

Se han desarrollado diferentes proteínas de unión similares a anticuerpos nuevas a partir de la secuencia del anticuerpo DS6, junto con un quelante adecuado y un radiomarcador, para cumplir con los requisitos de la formación de imágenes PET (por ejemplo, mejor penetración en el tumor, una cinética de eliminación más rápida, y una excelente proporción de tumor a sangre). Basándose en un factor de calidad de formación de imágenes (IFOM) predeterminado, se eligió un fragmento de anticuerpo de 70 kDa (una inmunoglobulina en tándem monoespecífica bivalente, denominada B-Fab) para la evaluación de la especificidad y, en último término, la traducción clínica. El formato de B-Fab proporciona las ventajas de: (1) una alta estabilidad frente al estrés térmico (incubación a 42ºC durante una semana); (2) alta estabilidad en suero humano (incubación a 37ºC durante 24 h); y (3) productividad razonable en cultivo de células provisional (2 mg/l). Comparados con los anticuerpos de longitud completa (150 kDa), los fragmentos de anticuerpos (50-75 kDa) muestran unas velocidades de eliminación renal y de eliminación sanguínea más rápidas, lo cual produce unas proporciones de señal a ruido más altas durante la formación de bioimágenes PET.

La proteína de unión similar a un anticuerpo B-Fab DS6 contiene dos sitios de reconocimiento del antígeno CA6 basados en los sitios de reconocimiento del antígeno CA6 del anticuerpo monoclonal humanizado DS6, y muestra una alta afinidad de unión con el antígeno CA6. Después de la conjugación con un quelante (por ejemplo, DOTA, NOTA, DTPA, o TETA), el DS6 B-Fab se radiomarcó y se usó para experimentos de formación de bioimágenes PET in vivo.

Se emplearon metodologías de ADN recombinante convencionales para construir los polinucleótidos que codifican los polipéptidos que forman el anticuerpo para el diagnóstico acompañante (basado en el anticuerpo DS6) de la invención, para incorporar estos polinucleótidos en vectores de expresión recombinantes, y para introducir dichos vectores en células hospedantes. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3a ed.). Pueden realizarse reacciones enzimáticas y técnicas de purificación según las especificaciones del fabricante, tal como se llevan a cabo habitualmente en la técnica, o según se describe en la presente. A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada con relación a la química analítica, la química orgánica sintética y la química médica y farmacéutica, y los procedimientos y técnicas de laboratorio que implican, son muy conocidos y se emplea habitualmente en la técnica. De modo similar, pueden emplearse técnicas convencionales para la síntesis química, los análisis químicos, la preparación, formulación y administración de productos farmacéuticos, y el tratamiento de pacientes.

imagen6

imagen7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

en la que los polipéptidos de fórmula I y los polipéptidos de fórmula II forman un fragmento Fab (un fragmento de inmunoglobulina en tándem monoespecífica bivalente).

En ciertos aspectos, VL1 y VL2 son polipéptidos idénticos, y en ciertos aspectos, VH1 y VH2 son polipéptidos idénticos.

En ciertos aspectos, o típicamente, los dominios CL y CH1 están enlazados mediante un enlace de disulfuro.

En ciertos aspectos, cada uno de L1 y L2 tiene una longitud de al menos 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos.

En ciertos aspectos, cada uno de L1 y L2 es GGGGS o GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 3).

En ciertos aspectos, el polipéptido de fórmula [I] comprende una secuencia al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a SEQ ID NO:1.

En ciertos aspectos, el polipéptido de fórmula [II] comprende una secuencia al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a SEQ ID NO:7.

En ciertos aspectos, dicha proteína de unión similar a un anticuerpo comprende además al menos un radiomarcador, un agente de formación de imágenes, un agente terapéutico, o un agente de diagnóstico.

En ciertos aspectos, dicha proteína de unión similar a un anticuerpo tiene una actividad específica de al menos 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4 o 1,5 Ci/moles.

En ciertos aspectos, dicha proteína de unión similar a un anticuerpo puede tener una Kd aparente como máximo de 8, 7, 6, 5 o 4 nM cuando la unión se mide mediante FACS, por ejemplo, con una proteína de unión similar a un anticuerpo libre.

En ciertos aspectos, dicha proteína de unión similar a un anticuerpo presenta una alta estabilidad al estrés térmico. De modo más específico, puede perderse menos del 25, 20, 15, 10 o 5% de proteína de unión similar a un anticuerpo soluble después de una incubación a 42ºC durante una semana.

En ciertos aspectos, dicha proteína de unión similar a un anticuerpo presenta una alta estabilidad en suero humano. De modo específico, al menos 70, 75, 80, 85, 90 o 95% de la proteína de unión similar a un anticuerpo puede ser monomérica después de una incubación a 37ºC durante 24 horas en suero humano.

Una proteína de unión similar a un anticuerpo “aislada” es una proteína que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos de diagnóstico o terapéuticos para la proteína de unión similar a un anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, la proteína de unión similar a un anticuerpo estará purificada: (1) hasta más del 95% en peso del anticuerpo, según se determina mediante el método de Lowry, y lo más preferiblemente en más del 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente como para obtener al menos 15 restos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o una secuencia de aminoácidos interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras empleando tinción de azul de Coomassie o, preferiblemente, de plata. Las proteínas de unión similares a anticuerpos aisladas incluyen la proteína de unión similar a un anticuerpo in situ dentro de células recombinantes, puesto que al menos un componente del entorno natural de la proteína de unión similar a un anticuerpo no estará presente.

Las expresiones “sustancialmente puro” o “sustancialmente purificado”, tal como se emplean en la presente, se refieren a un compuesto o especie que es la especie predominante presente (es decir, en una base molar, la que es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición). En algunas realizaciones, una fracción sustancialmente purificada es una composición en la que la especie comprende al menos aproximadamente 50% (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. En otras realizaciones, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, o 99% de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. En todavía otras realizaciones, la especie se purifica hasta una homogeneidad fundamental (no pueden detectarse especies contaminantes en la composición mediante métodos de detección convencionales), en la que la composición consiste fundamentalmente en especies macromoleculares individuales.

El término “antígeno” o la expresión “antígeno objetivo”, tal como se emplea en la presente, se refiere a una molécula, o a una porción de una molécula, que es capaz de ser unida por un anticuerpo o por una proteína de unión similar a un anticuerpo, y que además es capaz de ser empleada en un animal para producir anticuerpos capaces de unirse a un epítopo de este antígeno. Un antígeno objetivo puede tener uno o más epítopos. Con respecto a cada antígeno objetivo reconocido por una proteína de unión similar a un anticuerpo, la proteína de unión similar a un anticuerpo es capaz de competir con un anticuerpo intacto que reconozca al antígeno objetivo. Se entiende que una proteína de unión similar a un anticuerpo “bivalente”, distinta de una proteína de unión similar a un anticuerpo “multiespecífica” o “multifuncional”, comprende sitios de unión al antígeno que tienen especificidad antigénica idéntica.

imagen8

imagen9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

de origen, pero estas células siguen incluyéndose en el alcance de la expresión “célula hospedante”, tal como se emplea en la presente. Puede utilizarse una amplia diversidad de sistemas de expresión de células hospedantes para expresar las proteínas de unión similares a anticuerpos de la invención, que incluyen sistemas de expresión bacterianos, de levadura, baculovirales y de mamífero (así como sistemas de expresión de presentación de fagos). Un ejemplo de un vector de expresión bacteriano adecuado es pUC19. Para expresar una proteína de unión similar a un anticuerpo de modo recombinante, una célula hospedante se transforma o se transfecta con uno o más vectores de expresión recombinantes que portan fragmentos de ADN que codifican las cadenas polipeptídicas de la proteína de unión similar a un anticuerpo, de modo que las cadenas polipeptídicas se expresen en la célula hospedante y, preferiblemente, sean segregadas hacia el medio en el que se cultivan las células hospedantes, a partir del cual puede recuperarse la proteína de unión similar a un anticuerpo.

El término “transformación”, tal como se emplea en la presente, se refiere a un cambio en las características genéticas de una célula, y una célula se ha transformado cuando se ha modificado para que contenga una nuevo ADN. Por ejemplo, una célula se transforma cuando se modifica genéticamente partiendo de su estado nativo. Después de la transformación, el ADN transformante puede recombinarse con el de la célula mediante su integración física en un cromosoma de la célula, o puede ser mantenido de forma transitoria como un elemento episómico sin que sea replicado, o puede replicarse independientemente como un plásmido. Se considera que una célula se ha transformado de modo estable cuando el ADN se replica con la división de la célula. El término “transfección”, tal como se emplea en la presente, se refiere a la captación de ADN extraño o exógeno por una célula, y una célula ha sido “transfectada” cuando el ADN exógeno ha sido introducido dentro de la membrana celular. En la técnica se conocen una serie de técnicas de transfección. Estas técnicas pueden emplearse para introducir una o más moléculas de ADN exógeno en células hospedantes adecuadas.

La expresión “de origen natural”, tal como se emplea y se aplica a un objeto en la presente, se refiere al hecho de que el objeto puede encontrarse en la naturaleza y aún no ha sido manipulado por el ser humano. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido que está presente en un organismo (incluyendo virus) que se puede aislar a de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificado intencionadamente por el ser humano es de origen natural. De modo similar, “de origen no natural”, tal como se emplea en la presente, se refiere a un objeto que no se encuentra en la naturaleza o que ha sido modificado estructuralmente o que ha sido sintetizado por el ser humano.

Tal como se emplea en la presente, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas se ajustan a su utilización convencional. Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales, tales como aminoácidos ,-disustituidos, N-alquilaminoácidos, el ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales también pueden resultar componentes adecuados para las cadenas polipeptídicas de las proteínas de unión similares a anticuerpos de la invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, -carboxiglutamato, -N,N,N-trimetil-lisina, -N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-methilhistidina, 5-hidroxil-lisina, -N-metilarginina, y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos empleada en la presente, la dirección hacia la izquierda es la dirección hacia el amino-terminal, y la dirección hacia la derecha es la dirección hacia el carboxilo-terminal, según la convención y el uso convencional.

Los restos de origen natural pueden dividirse en clases basándose en las propiedades comunes de sus cadenas laterales:

(1): hidrófobos: Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Tyr, Pro;

(2): hidrófilos polares: Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Lys, Ser, Thr;

(3): alifáticos: Ala, Gly, Ile, Leu, Val, Pro;

(4): hidrófobos alifáticos: Ala, Ile, Leu, Val, Pro;

(5): hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(6): ácidos: Asp, Glu;

(7): básicos: His, Lys, Arg;

(8): restos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;

(9): aromáticos: His, Trp, Tyr, Phe; y

(10): hidrófobos aromáticos: Phe, Trp, Tyr.

Las sustituciones de aminoácidos conservativas pueden implicar intercambiar un miembro de una de estas clases por otro miembro de la misma clase. Las sustituciones de aminoácidos conservativas pueden incluir restos de aminoácidos no naturales, que generalmente se incorporan mediante síntesis peptídica sintética y no mediante síntesis en sistemas biológicos. Éstos incluyen peptidomiméticos y otras formas revertidas o invertidas de restos de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

aminoácidos. Las sustituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase.

Los expertos en la técnica serán capaces de determinar las variantes adecuadas de las cadenas polipeptídicas de las proteínas de unión similares a anticuerpos de la invención empleando técnicas muy conocidas. Por ejemplo, los expertos en la técnica pueden identificar áreas adecuadas de una cadena polipeptídica que pueden cambiarse sin destruir la actividad localizando regiones que se cree que no son importantes para la actividad. Como alternativa, los expertos en la técnica pueden identificar restos y porciones de las moléculas que están conservados entre polipéptidos similares. Además, incluso las áreas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden someterse a sustituciones de aminoácidos conservativas sin destruir la actividad biológica ni afectar de modo adverso a la estructura del polipéptido.

El término “quelante” describe un compuesto químico en forma de un anillo heterocíclico que puede contener un metal coordinado con al menos dos iones no metálicos. La presencia de restos quelantes de cationes de ácidos duros en la proteína de unión similar a un anticuerpo ayuda a asegurar la rápida eliminación in vivo del compuesto para el diagnóstico acompañante.

Los quelantes se unen covalentemente al anticuerpo o a la proteína de unión similar a un anticuerpo empleando métodos convencionales de bioconjugación. Los restos que contienen amina (por ejemplo, lisina o el N-terminal) del anticuerpo forman un enlace amida con un quelante que contiene un éster activado (por ejemplo, un éster Nhidroxisuccinimidílico). Los restos que contienen azufre (por ejemplo, cisteína) se conjugan con quelantes que contienen un éster activado o un resto de maleimida. Como alternativa, los bioconjugados se forman cuando restos de carboxilato activados en el anticuerpo forman una amida o tioéster con grupos amina o tiol, respectivamente, del quelante. Se emplean enlazadores bifuncionales tales como, por ejemplo PEG-maleimida (PEG-Mal), 4-(Nmaleimidometil)ciclohexan-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC) o 3-(2-piridiltio)propionato de N-succinimidilo (SPDP) cuando es necesario.

Los quelantes se eligen por sus propiedades de unión a metales, y pueden cambiarse a voluntad. Pueden emplearse quelantes tales como NOTA (ácido 1,4,7-triaza-ciclononan-N,N’,N”-triacético), DOTA (ácido 1,4,7,10tetraazaciclododecan-1,4,7,10-tetraacético), DTPA (ácido 1,1,4,7,7-dietilentriaminapentaacético), y TETA (ácido pbromoacetamidobenciltetraetilaminatetraacético), con una diversidad de radiomarcadores, radionúclidos, radioisótopos, metales y radiometales. Los quelantes de tipo DOTA, cuando el ligando incluye funciones quelantes de bases fuertes, tales como grupos carboxilato o amina, son los más eficaces para quelar cationes de ácidos duros, en especial cationes de metales del Grupo IIa y del Grupo IIIa. Estos complejos de metal-quelato pueden hacerse muy estables adaptando el tamaño del anillo al metal de interés. Además, puede conjugarse más de un tipo de quelante con la construcción objetivo para unir múltiples iones metálicos, por ejemplo, radionúclidos de diagnóstico y/o radionúclidos terapéuticos.

Los radiomarcadores, radionúclidos o radioisótopos de diagnóstico particularmente útiles que pueden unirse a los agentes quelantes del anticuerpo o de la proteína de unión similar a un anticuerpo modificada incluyen, pero no se limitan a, 110In, 111In, 177Lu, 18F, 52Fe, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 86Y, 90Y, 89Zr, 94Tc, 94Tc, 99mTc, 120I, 123I, 124I, 125I,131I, 154-158Gd, 32P, 11C, 13N, 15O, 186Re, 188Re, 51Mn, 52mMn, 55Co, 72As, 75Br, 76Br, 82mRb, 83Sr, u otros emisores de rayos gamma, beta, o de positrones. Los radiomarcadores de diagnóstico incluyen una energía de descomposición en el intervalo de 25 a 10.000 keV, más preferiblemente en el intervalo de 25 a 4.000 keV, y aún más preferiblemente en el intervalo de 20 a 1.000 keV, y aún más preferiblemente en el intervalo de 70 a 700 keV. Las energías de descomposición totales de los radionúclidos emisores de positrones útiles son preferiblemente < 2.000 keV, más preferiblemente menores que 1.000 keV, y lo más preferiblemente < 700 keV. Los radiomarcadores útiles como agentes de diagnóstico que emplean la detección por rayos gamma incluyen, pero no se limitan a: Cr-51, Co57, Co-58, Fe-59, Cu-67, Ga-67, Se-75, Ru-97, Tc-99m, In-111, In-114m, I-123, I-125,1-131, Yb-169, Hg-197, y T1

201. Las energías de descomposición de los radiomarcadores emisores de rayos gamma útiles son preferiblemente de 20 a 2000 keV, más preferiblemente de 60 a 600 keV, y lo más preferiblemente de 100 a 300 keV.

El término “paciente”, tal como se emplea en la presente, incluye, pero no se limita a, sujetos humanos y animales.

Un “trastorno” es cualquier afección que se beneficiaría de un tratamiento que emplee el anticuerpo o la proteína de unión similar a un anticuerpo modificada de la invención. “Trastorno” y “afección” se emplean de modo intercambiable en la presente e incluyen trastornos o enfermedades crónicas y agudas, incluyendo las afecciones patológicas que predisponen a un paciente al trastorno en cuestión. En ciertos aspectos, el trastorno es un cáncer, tal como un cáncer de tumor sólido. En ciertos aspectos específicos, el cáncer es cáncer de mama, cáncer de colon, carcinoma ovárico, cáncer endometrial, osteosarcoma, cáncer cervical, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, carcinoma sinovial, cáncer pancreático, cáncer de riñón, un cáncer del sistema linfático, un sarcoma o un carcinoma en el que se expresa CA6, u otro cáncer que aún deba determinarse, en el que el glicotopo CA6 se exprese predominantemente. El cáncer puede ser, por ejemplo, un carcinoma ovárico seroso, carcinoma ovárico endometrioide, neoplasia del cuello uterino, neoplasia del endometrio, neoplasia de la vulva, carcinoma de mama, tumor pancreático, y tumor del urotelio.

imagen10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Las proteínas de unión similares a anticuerpos modificadas de la invención pueden emplearse en cualquier método de ensayo conocido, tal como ensayos de unión competitiva, ensayos de “sándwich” directos e indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación para la detección y la cuantificación de uno o más antígenos objetivo. Las proteínas de unión similares a anticuerpos modificadas se unirán a uno o más antígenos objetivo con una afinidad que es apropiada para el método de ensayo que se está empleando.

Para aplicaciones de diagnóstico, en ciertas realizaciones, las proteínas de unión similares a anticuerpos modificadas pueden marcarse con un resto detectable. El resto detectable puede ser cualquier resto que sea capaz de producir, de modo directo o indirecto, una señal detectable. Por ejemplo, el resto detectable puede ser un radiomarcador, un radioisótopo, un radionúclido, un agente de formación de imágenes, un agente terapéutico o un agente de diagnóstico, tal como 3H, 14C, 32P, 35S, 125I, 99Tc, 111In, 18F, 11C, 68Ga, 64Cu, 89Zr, 124I o 67Ga; un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina, o luciferina; o una enzima, tal como fosfatasa alcalina, -galactosidasa, o peroxidasa de rábano picante.

Un resto indicador apropiado puede ser detectado mediante una técnica de formación de imágenes concreta (por ejemplo, un indicador radiomarcado con 18F/11C/68Ga/64Cu/89Zr/124I para la formación de imágenes PET, un indicador marcado con 99mTc/111In para la formación de imágenes SPECT, un indicador marcado con un tinte fluorescente para la formación de imágenes ópticas, o un indicador marcado con un material paramagnético para MRI). Se recomienda una correspondencia apropiada entre la semivida biológica del anticuerpo o la proteína de unión similar a un anticuerpo y el período de semidesintegración físico del radiomarcador (véase la Tabla 1).

Tabla 1. Ejemplos de radiomarcadores y su período de semidesintegración

Radiomarcador: Período de semidesintegración

68Ga: 68 min.

18F: 109 min.

64Cu: 12,7 h

89Zr: 78,4 h

124I: 100,2 h

El desarrollo de una proteína de unión similar a un anticuerpo o sonda para el diagnóstico acompañante de formación de imágenes fundamentalmente requiere un proceso similar al descubrimiento de fármacos (por ejemplo, comenzando a partir de una sonda objetivo, dosimetría de radiación, estudios de toxicidad realizados con prácticas de laboratorio correctas, producción con prácticas de fabricación correctas, evaluación preclínica, validación preclínica de la sonda objetivo y evaluación clínica). Otros parámetros que pueden evaluarse son: el momento óptimo para realizar la formación de las imágenes con relación a la administración del trazador, la correlación con análisis ex vivo, la biodistribución del trazador y la especificidad de objetivo (ensayados con un fragmento radiomarcado no pertinente). Tras haber sido totalmente desarrollada, la sonda de formación de imágenes moleculares puede emplearse como prueba de diagnóstico acompañante de formación de imágenes moleculares para un agente o fármaco concreto.

Las proteínas de unión similares a anticuerpos modificadas de la invención también son útiles para la formación de imágenes in vivo. Una proteína de unión similar a un anticuerpo marcada con un resto detectable puede administrarse a un animal, preferiblemente a la corriente sanguínea, y ensayarse la presencia y la localización del anticuerpo marcado. La proteína de unión similar a un anticuerpo puede marcarse con cualquier resto que sea detectable en un animal, mediante resonancia magnética nuclear, tomografía de emisión de positrones, u otros medios de detección conocidos en la técnica.

La técnica de formación de imágenes in vivo puede utilizarse para formar la imagen de un tejido, tal como un tejido tumoral, para evaluar el nivel de expresión del glicotopo CA6 en el tejido. La determinación del nivel de expresión de CA6 en el tejido es útil, por ejemplo, para determinar si un paciente, tal como un paciente de cáncer, sería un buen candidato para el tratamiento con un fármaco dirigido a un glicotopo CA6. Por ejemplo, la proteína de unión similar a un anticuerpo es útil como prueba de diagnóstico acompañante para un agente citotóxico huDM6-DM4.

En una realización, un paciente se evalúa para un tratamiento con una molécula dirigida a CA6, tal como huDM6-DM4. El paciente se evalúa, por ejemplo, mediante la adquisición de información con respecto al nivel de expresión de CA6 en un tejido enfermo, tal como un tejido tumoral (por ejemplo, una biopsia de un tejido), y si se determina que el nivel de expresión de CA6 es mayor que 10% del nivel de expresión de referencia (por ejemplo, mayor o igual a 10%, 20%, 30%, 40% o más que un nivel de referencia), entonces se determina que el paciente es un buen candidato para un tratamiento con la molécula dirigida a CA6. Se predice que un paciente que es un buen candidato para un tratamiento con la molécula dirigida a CA6 responderá positivamente al tratamiento con la molécula. Se

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

determina que un paciente que no presenta un nivel adecuado de expresión de CA6, por ejemplo, menor que 10% de expresión de CA6, comparado con un estándar de referencia, no es un buen candidato para un tratamiento con una molécula dirigida a CA6.

Un nivel de expresión de referencia puede ser, por ejemplo, el nivel de expresión de CA6 en un tejido no enfermo del paciente (por ejemplo, del mismo tipo de tejido que el que contiene el tumor), o el estándar de referencia puede ser determinado, por ejemplo, a partir de un estándar aceptado en la técnica, tal como el derivado de los niveles de expresión en tejidos no enfermos procedentes de una población de individuos.

En una realización, el nivel de expresión de CA6 en un tejido de un sujeto se adquiere indirectamente, tal como a partir de un proveedor de servicios, una institución médica, un hospital o una clínica o la consulta de un médico, o a partir de un profesional sanitario, tal como un médico o un enfermero, o a partir de un agente de seguros, o a partir de una base de datos. En otra realización, el nivel de expresión de CA6 se determina directamente, tal como mediante la administración al sujeto de la proteína de unión similar a un anticuerpo incluida en la invención, y determinar el nivel de expresión de CA6 mediante una técnica de formación de bioimágenes.

A un paciente que se ha determinado que es un buen candidato para un tratamiento con una molécula dirigida a CA6 opcionalmente se le puede administrar después la molécula dirigida a CA6. En algunas realizaciones, un paciente tratado con una molécula dirigida a CA6 se controlará a intervalos (por ejemplo, cada semana, cada dos semanas, cada mes, cada dos meses) después de la administración de la molécula dirigida a CA6 para determinar si el nivel de expresión de CA6 está cambiando (por ejemplo, está disminuyendo) después del tratamiento con la molécula dirigida a CA6. Si después de una cierta cantidad de tiempo, o después de que el paciente presente acontecimientos adversos, si el nivel de expresión de CA6 en el tejido enfermo sigue sin cambiar, puede tomarse la decisión de detener o de continuar el tratamiento con la molécula dirigida a CA6.

En una realización, un paciente se controla durante el tratamiento con una molécula dirigida a CA6, tal como huDM6-DM4. El paciente se controla, por ejemplo, adquiriendo información con respecto al nivel de expresión de CA6 en un tejido enfermo, tal como un tejido tumoral, después de la administración de una molécula dirigida a CA6 o un tratamiento con una molécula dirigida a CA6, tal como huDM6-DM4, y si se determina que el nivel de expresión de CA6 es mayor que 10% del nivel de expresión de referencia (por ejemplo, mayor o igual a 10%, 20%, 30%, 40%

o mayor que un nivel de referencia), entonces se determina que el paciente es un buen candidato para un tratamiento continuado con la molécula dirigida a CA6. Si se determina que el nivel de expresión de CA6 ha disminuido durante el tratamiento con una molécula dirigida a CA6, tal como huDM6-DM4, entonces se determina que el paciente ha respondido positivamente al tratamiento con la molécula, y que el tratamiento con huDS6-DM4 debe continuar. Se determina que un paciente que no presenta un nivel adecuado de expresión de CA6, por ejemplo, menor que 10% de expresión de CA6, comparado con un estándar de referencia, o que presenta un mayor nivel de expresión de CA6, no es un buen candidato para un tratamiento continuado con una molécula dirigida a CA6.

La invención, según se describe en la presente, también se refiere a un kit que comprende una proteína de unión similar a un anticuerpo y otros reactivos útiles para detectar niveles de antígenos objetivo en muestras biológicas. Estos reactivos pueden incluir un marcador detectable, suero de bloqueo, muestra de control positivo y negativo, y reactivos de detección.

4. Composiciones de proteínas de unión similares a anticuerpos modificadas y su administración

Las composiciones que comprenden proteínas de unión similares a un anticuerpo modificadas están dentro del alcance de la invención. Estas composiciones de diagnóstico, terapéuticas o farmacéuticas pueden comprender una cantidad diagnóstica o terapéuticamente eficaz de una proteína de unión similar a un anticuerpo, o un conjugado de fármaco-proteína de unión similar a un anticuerpo, mezclado con un agente de formulación farmacéutica o fisiológicamente aceptable seleccionado por su idoneidad con respecto al modo de administración.

Los materiales de formulación aceptables preferiblemente no son tóxicos para los receptores en las dosis y las concentraciones empleadas.

La composición de diagnóstico o farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la transparencia, el color, la isotonicidad, el olor, la esterilidad, la estabilidad, la velocidad de disolución o liberación, la adsorción, o la penetración de la composición. Los materiales de formulación adecuados incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina, o lisina), antimicrobianos, antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito de sodio, o bisulfito de sodio), amortiguadores (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos, u otros ácidos orgánicos), agentes de relleno (tal como manitol o glicina), agentes quelantes (tales como ácido etilendiaminatetraacético (EDTA)), agentes formadores de complejo (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina, o hidroxipropilbeta-ciclodextrina), cargas, monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono (tales como glucosa, manosa, o dextrinas), proteínas (tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas), agentes colorantes, aromatizantes y diluyentes, agentes emulgentes, polímeros hidrófilos (tales como polivinilpirrolidona), polipéptidos de bajo peso molecular, contraiones formadores de sales (tales como sodio), conservantes (tales como cloruro de

imagen11

imagen12

La proteína de unión similar al anticuerpo DS6 B-Fab se produjo mediante la transfección transitoria de células HEK293 en medio FreeStyle F17 (Invitrogen). Siete días después de la transfección se recolectó el sobrenadante y se sometió a centrifugación y una filtración de 0,2 m para eliminar las partículas. La purificación se realizó mediante una captura sobre KappaSelect (GE Healthcare). Después de la unión en la columna KappaSelect, la columna se 5 lavó con PBS o amortiguador HEPES (HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2, FP12016), seguido de una elución con glicina 0,1 M (pH 2,5) y una neutralización con Tris 1 M/HCl, pH 9. La etapa de refinamiento de la purificación consistió en una cromatografía de exclusión molecular empleando Superdex 200 (GE Healthcare) con PBS o amortiguador HEPES (HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2, FP12016). Después de la etapa de refinamiento, el producto de la purificación se concentró mediante ultrafiltración, y por último el DS6 B-Fab se esterilizó mediante

10 filtración empleando una membrana de 0,22 m.

La concentración de proteínas se determinó mediante la medida de la absorbancia a 280 nm. Cada lote se analizó mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras y no reductoras para determinar la pureza y el peso molecular de cada subunidad y del monómero. La calidad del DS6 B-Fab purificado se comprobó mediante los métodos analíticos descritos a continuación.

15 Tabla 2. Secuencias de ADN y de los polipéptidos para B-Fab basado en DS6

Secuencia de aminoácidos para: VL1-L1-VL2-CL (SEQ ID NO: 1)

Secuencia de aminoácidos para: VL1 anti-CA6 (SEQ ID NO: 2)

Secuencia de aminoácidos para: Enlazador L1 (SEQ ID NO: 3): GGGGSGGGGS

Secuencia de aminoácidos para: VL2 anti-CA6 (SEQ ID NO: 2)

Secuencia de aminoácidos para: CL de IGKC humana (SEQ ID NO: 4)

Secuencia codificante de ADN para: VL1-L1-VL2-CL (SEQ ID NO: 5)

Secuencia codificante de ADN para: VL1-L1-VL2-CL (SEQ ID NO: 6) Con secuencia señal: imagen13

Secuencia de aminoácidos para:: imagen14

VH1-L2-VH2-CH1 (SEQ ID NO: 7)

Secuencia de aminoácidos para: VH1 anti-CA6 (SEQ ID NO: 8)

Secuencia de aminoácidos para: Enlazador L2 (SEQ ID NO: 3): GGGGSGGGGS

Secuencia de aminoácidos para: VH2 anti-CA6 (SEQ ID NO: 8)

Secuencia de aminoácidos para: Domino constante de cadena pesada humano CH1 (SEQ ID NO: 9)

Secuencia codificante de ADN para VH1-L2-VH2-CH1 (SEQ ID NO: 10)

imagen15

imagen16

Tabla 5. Resumen de las actividades de las proteínas de unión similares a un anticuerpo modificadas de DS6

B-Fabs

Pureza (SEC): >95%

Estabilidad in vitro: Estrés de congelación/descongelación (3x -80ºC/RT) Estrés térmico (1 semana a 42ºC): Bien tolerado Bien tolerado

Estabilidad sérica (24 horas a 37ºC): >90% monomérica

Afinidades de unión FACS (estirpe celular WISH, CA6+): 2 nM

Rendimiento radioquímico: 60-80%

Parámetros de formación de imágenes Tumor (WISH, CA6+) Tumor (A2780, CA6-): 7,5-10,4% ID/g 4-5,6% ID/g

Biodistribución Hígado Riñón Sangre Músculo: 7-10% ID/g 57-73% ID/g 2-3% ID/g 1% ID/g

Proporción de tejido tumoral WISH a tejido normal: Tumor/sangre Tumor/músculo: 4-6 9-11

Proporción de tumor WISH (CA6+) a tumor A2780 (CA6-): 1,7-1,9

WISH es una estirpe celular positiva para el antígeno CA6. A2780 es una estirpe celular negativa para el antígeno CA6.

Todas las anteriores proteínas de unión similares a anticuerpos y sus correspondientes conjugados con DOTA (1,52,5 DOTA/fragmento) presentan una alta afinidad (Kd = 4-20 nM) por las células CA6-positivas (estirpe celular 5 WISH), lo cual indica que la derivación con DOTA no afecta de modo adverso a la afinidad por el antígeno. Los fragmentos presentan una baja afinidad por las células CA6-negativas (estirpe celular A2780). Los agentes marcados con 64Cu se evaluaron mediante estudios de estabilidad en suero humano y formación de imágenes in vivo y estudios de biodistribución a las 24 horas en ratones atímicos que portan tumores subcutáneos WISH o A2780. El 64Cu-DOTA-B-Fab se sintetizó con un alto rendimiento (RCY -80%, SA -55 GBq/moles, >99% de 10 pureza) y produjo unos buenos resultados en los ensayos de estabilidad en suero a las 24 horas (94 ± 5%, n = 3). Los experimentos de biodistribución in vivo (véase la Tabla 6) en ratones que portan tumores de xenoinjertos mostraron una captación relativamente alta en el tumor WISH (7,6 ± 0,87% ID/g, n = 4, 20-206 mg) y una captación baja en el tumor A2780 (5,1 ± 0,92% ID/g, n = 3, 50-270 mg), combinado con unas altas proporciones de tumor/músculo (8,7:1), tumor/sangre (3,6:1) y tumor positivo/negativo (1,8, p <0,05, n = 7). La captación por el tumor

15 solo fue sobrepasada por los riñones (62 ± 4% ID/g) y el hígado (10 ± 0,75% ID/g).

imagen17

imagen18

Claims

imagen1

imagen2