ES2657220T3

ES2657220T3 - Proteínas de unión multi-diana antagonistas de CD86

Info

Publication number: ES2657220T3
Application number: ES09793296.6T
Authority: ES
Inventors: Peter Armstrong Thompson; Peter Robert Baum; Philip Tan; John W. Blankenship; Sateesh Kumar Natarajan
Original assignee: Aptevo Research and Development LLC
Current assignee: Aptevo Research and Development LLC
Priority date: 2008-10-02
Filing date: 2009-10-02
Publication date: 2018-03-02
Anticipated expiration: 2029-10-02
Also published as: EA024877B1; KR101900953B1; WO2010040105A3; BRPI0920749A2; KR20170091801A; CN107056951A; JP6521915B2; JP2016188249A; EP2344540B1; JP2014239700A; CA2739460A1; DK2344540T3; JP2012504425A; KR20160120812A; CN102227447A; KR20190064664A; BRPI0920749A8; SI2344540T1; JP5840494B2; EP2344540A2

Abstract

Una proteína de fusión multi-específica, que comprende un dominio de unión a CD86 unido a un dominio de unión heterólogo mediante un dominio intermedio, en donde el dominio de unión heterólogo es una molécula IL-10 o es un anticuerpo anti-IL10R agonista.

Description

Proteínas de unión multi-diana antagonistas de CD86

Antecedentes

Campo de la técnica

Esta divulgación se refiere en general al campo de las moléculas de unión multi-específicas y a las aplicaciones terapéuticas de las mismas, y más específicamente a una proteína de fusión compuesta por un dominio de unión antagonista de CD86 unido a un dominio de unión heterólogo mediante un dominio intermedio, en donde el dominio de unión heterólogo es una molécula IL-10 o es un anticuerpo anti-IL10R agonista, así como a las composiciones y usos terapéuticos de las mismas.

Descripción de la técnica relacionada

El sistema inmunológico humano protege generalmente al organismo del daño frente a sustancias y patógenos externos. Una manera mediante la cual el sistema inmunológico protege al organismo es mediante la producción de células especializadas, referidas como linfocitos T o células T. Las interacciones intercelulares entre células T y células que presentan antígeno (APCs) generan en las células T señales coestimuladoras que conducen a su vez a respuestas de las células T frente a los antígenos. La activación completa de la célula T requiere tanto de la unión del receptor de la célula T (TCR) al complejo antígeno-MHC presente en las células que presentan el antígeno, como de la unión del receptor CD28 en la superficie de la célula T a los ligandos CD86 y/o CD80 presentes en las células que presentan el antígeno, particularmente en células dendríticas.

CD80 (también conocido como B7-1) se describió originalmente como una célula B humana asociada a la activación del antígeno y posteriormente se encontró que era un receptor relacionado con las moléculas CD28 de células T y del antígeno 4 asociado al linfocito T citotóxico (CTLA4). En posteriores estudios, se identificó otro receptor contrario al CTLA4 conocido como CD86 (también conocido como B7-0 o B7-2). El CD86 comparte aproximadamente el 25% de la identidad de secuencia con el CD80 en su región extracelular. Aunque generalmente se piensa que el CD80 y el CD86 son equivalentes funcionalmente en su capacidad para iniciar y mantener la proliferación de células T CD4(+) (Vasilevko et al. (2002) DNA Cell Biol. 21:137-49), y los datos clínicos con una proteína de fusión Ig CTLA4 que bloquea esta actividad han mostrado beneficios clínicos para ambas moléculas (Genovese et al. (2005) NEJM 353:114-1123), hay ciertas evidencias de que la inhibición específica de CD86 podría ser beneficiosa. Por ejemplo, la implicación de CD86 o CD80 tiene diferentes efectos sobre las células B. Específicamente, CD80 ha mostrado proporcionar una señal negativa para la proliferación y la secreción de IgG tanto de células B como de linfomas de células B, mientras que CD86 mejora la actividad de células B (Suvas et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:7766-7775). Existe cierta evidencia de que la implicación de CD80 sobre células T es inmunosupresora (Lang et al. (2002) J. Immunol. 168:3786-3792; Taylor et al. (2004) J. Immunol. 172:34-39; Paust et al. (2004) PNAS 101:10398-10403) y que de puede mediar además la inmunosupresión a través de la señalización de PD-L1 (CD274) en las células APCs o T (Butte et al. (2007) Immunity 27:111-122; Keir (2008) Ann. Rev. Immunol. 26:677-704). Por consiguiente, la inhibición de CD86 en ausencia de inhibición de CD80 puede ser beneficiosa en el tratamiento de enfermedades autoinmunes e inflamatorias, así como para linfomas de células B.

El CTLA4 es un tipo 1 de proteína transmembrana de la superfamilia de las inmunoglobulinas que se expresa principalmente en células T activadas, habiéndose encontrado también algo de expresión en el subgrupo de las células T reguladoras CD4+CD25+ (Treg). Se cree que CD86 y CD80 son sólo ligandos endógenos de CTLA4. Se ha demostrado que el CTLA4 se une a CD86 y CD80 con mayor afinidad y avidez en comparación con CD28 (Linsley et al. (1991) J. Exp. Med. 174:561-69; Linsley et al. (1994) Immunity 1:793-801), y juega un papel clave como un regulador negativo en la activación de células T. Específicamente, la unión de CTLA4 a CD80/CD86 conduce a la regulación a la baja de las respuestas de las células T y en la preservación de la homeostasis de células T y en la tolerancia periférica. Se cree que esto es debido tanto al antagonismo de la coestimulación dependiente de CD28 como a la señalización negativa directa a través de la cola citoplasmática de CTLA4. Para la reseña de la estructura y de la función de CTLA4, véase Teft et al. (2006) Annu. Rev. Immunol. 24:65-97.

Como se mencionó anteriormente, una respuesta inmune productiva requiere tanto de la implicación del TCr como de la unión de CD28 a CD80 y/o CD86. La unión de TCR en ausencia de unión a CD28 conduce a las células T bien a sufrir apoptosis o bien a convertirse anérgico. Además, la señalización de CD28 ha demostrado incrementar la producción de citoquinas mediante las células T. Específicamente, la estimulación de CD28 ha demostrado incrementar la producción de 5 a 50 veces de IL-2, TNFα, linfotoxina, IFNγ y GM-CSF en células T activadas. Además, se ha demostrado que la inducción de la expresión genética de linfoquinas y/o citoquinas por el CD28 ocurre incluso en presencia de ciclosporina inmunosupresora (Thompson et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86:1333-1337). El CD28 ha demostrado también promover la supervivencia de células T mediante la inducción de la regulación al alza de BCL-XL anti-apoptótica (Alegre et al. (2001) Nature Rev. Immunol. 1:220-228).

Las formas solubles de CTLA4 se han constituido mediante la fusión del dominio extracelular variable del CTLA4 a los dominios constantes de la inmunoglobulina para proporcionar proteínas de fusión CTLA4-Ig. La CTLA-4-Ig soluble ha demostrado prevenir la coestimulación dependiente de CD28 mediante la unión tanto a CD86 como a

CD80 (Linsley et al. (1991) J. Exp. Med., 174:561-69), e inhibir la coestimulación de células T, y tener efectos beneficiosos en la inmunosupresión en seres humanos (Bruce y Boyce (2007) Ann. Pharmacother. 41:1153-1162). La proteína de fusión abatacept CTLA4-Ig se emplea normalmente para el tratamiento de la artritis reumatoide en casos de respuesta inadecuada a la terapia con anti-TNFα. Sin embargo, no todos los pacientes responden a CTLA4-Ig, y la respuesta continuada requiere de la administración frecuente del fármaco, quizás en parte debido a que el bloqueo de la interacción de CD28 con CD86/CD80 es un inductor débil de células Tregs, y es insuficiente para bloquear las respuestas de las células T efectoras activadas en el entorno de la enfermedad.

La Patente US2002/0150559 proporciona un ligando capaz de unirse al antígeno CD40 humano y al antígeno CD86 humano, y opcionalmente al antígeno CD80, localizándose los antígenos en la superficie de los linfocitos humanos. Se ha descrito el empleo de los ligandos en la tolerancia inducida de células T.

La Patente WO2004/076488 proporciona moléculas que se unen a los antígenos CD80 y CD86 para usarse en la inhibición de reacciones inmunes mediadas por células T.

Van Gool et al. (1999) Eur. J. Immunol. 29:2367-75 sugiere que el bloqueo de las interacciones CD40-CD154 y CD80/CD86-CD28 durante la estimulación alogénica primaria da como resultado la anergia de células T y una mayor producción de IL-10.

Gao et al. (1999) Immunology 98:159-170 sugiere que las células dendríticas deficientes en CD40 producen IL-10, pero no IL-12, inducen hiposensibilidad de las células T in vitro y previenen el rechazo del aloinjerto.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la unión de CD80 mediante varias proteínas, que incluyen abatacept, una CTLA4-Ig(N2) (SEQ ID NO:11), y una proteína de fusión exceptora multi-específica que contiene un ectodominio CTLA4 fusionado a una IL10 (SEQ ID NO:9).

La Figura 2 muestra que CTLA4-Ig(N2) (SEQ ID NO:11) y una proteína de fusión exceptora multi-específica que

contiene un ectodominio CTLA4 unido a una IL10 (SEQ ID NO:9) puede unirse a una IL10Ra soluble (sIL10Ra). Las Figuras 3 y 4 muestran que una proteína de fusión exceptora multi-específica que contiene un ectodominio CTLA4 fusionado a una IL10 (SEQ ID NO:9) puede inducir la fosforilación STAT3 en PBMC.

La Figura 5 muestra que exceptores que contienen dominios de unión anti-CD86 a partir de 3D1 y anticuerpos

monoclonales FUN1 humanizados se unen a CD86 en células WIL2-S. La Figura 6 muestra que un exceptor que contiene un dominio de unión a CD86 e IL10 pueden unirse simultáneamente en la superficie celular de CD86 y sIL10Ra.

La Figura 7 muestra que varias versiones diferentes SMIPs de FUN1 anti-CD86 se pueden unir a CD86. La Figura 8 muestra que moléculas exceptoras CTLA4:IL10 que tienen varios enlazadores de unión de IL10 al

carboxilo terminal (BD2) del exceptor se puede unir a IL10R1-Ig. Δ-SEQ ID NO:9; ◊-SEQ ID NO:171; •-SEQ ID NO:302; ▲-SEQ ID NO:173. La Figura 9 muestra que moléculas exceptoras CTLA4:IL10 que tienen enlazadores de unión de IL10 al carboxilo

terminal (BD2) del exceptor más cortos, se pueden unir a IL10R1-Ig. Δ-SEQ ID NO:171; ◊-SEQ ID NO:175; •-SEQ ID NO:177; ▲-SEQ ID NO:179. La Figura 10 muestra que varias proteínas exceptoras se unen a CD80. La Figura 11 muestra que varias proteínas exceptoras se unen a CD86. La Figura 12 muestra que varias proteínas exceptoras se unen a sIL10Ra. La Figura 13 muestra que varias proteínas exceptoras se pueden unir simultáneamente a CD80 y a sIL10Ra. La Figura 14 muestra que varias proteínas exceptoras tienen reactividad cruzada con CD80 de ratón.

La Figura 15 muestra que varias proteínas exceptoras tienen reactividad cruzada con CD86 de ratón. Las Figuras 16 y 17 muestran que varias proteínas exceptoras bloquean una respuesta de células T humanas en un ensayo MLR.

Las Figuras 18 a 20 muestran que varias proteínas exceptoras bloquean una respuesta de células T de ratón en un ensayo MLR.

Las Figuras 21 y 22 muestran que varias proteínas exceptoras que contienen una variante de IL10 (bien IL10 con una mutación I87 o bien una mutación monoIL10) o una variante CTLA4, bloquean una respuesta de células T humanas.

Las Figura 23 muestra que varias proteínas exceptoras que contienen una variante de IL10 (bien IL10 con una mutación I87 o bien una mutación monoIL10) son menos inmunoestimuladoras que la de IL10 de ratón en un ensayo de proliferación celular MC/9.

La Figura 24 muestra que varias proteínas exceptoras que contienen una variante de IL10 (bien IL10 con una mutación I87 o bien una mutación monoIL10) son menos inmunoestimuladoras que la de IL10 humana en un ensayo de proliferación celular MC/9.

Descripción detallada

La presente invención proporciona una proteína de fusión multi-específica, que comprende un dominio de unión CD86 unido a un dominio de unión heterólogo mediante un dominio intermedio, en donde el dominio de unión heterólogo es una molécula IL-10 o es un anticuerpo anti-IL10R agonístico según las reivindicaciones, composiciones que comprenden uno o más de tales proteínas de fusión multi-específicas, polinucleótidos que codifican tales proteínas de fusión, los vectores de expresión que comprenden tales polinucleótidos, y las células huésped que comprenden tales vectores. También se proporcionan los usos médicos de las proteínas de fusión o de las composiciones según las reivindicaciones.

La presente divulgación hace posible la orientación de las células que presentan el antígeno (APCs) para alterar la actividad. Por ejemplo, la actividad de células T se pueden modular proporcionando una proteína de fusión exceptora multi-específica que comprende un primer y un segundo dominio de unión, un primer y un segundo enlazador, y un dominio intermedio, en donde un extremo del dominio intermedio se fusiona a través de un enlazador al primer dominio de unión que es un dominio de unión a CD86, y el otro extremo se fusiona a través de un enlazador al segundo dominio de unión que es una IL-10 agonista.

En determinadas realizaciones, el dominio de unión CD86 es un ectodominio CTLA4, un ectodominio CD28, o un dominio de unión de una región variable de inmunoglobulina (tal como un scFv) específica para CD86 (por ejemplo, a partir de anticuerpos monoclonales 3D1 o FUN1). En algunas realizaciones, se emplea menos de un ectodominio entero. Por ejemplo, se pueden usar dominios dentro del ectodominio CTLA4 que se unen a CD86 y previenen la unión de CD86 a CD28. En otras realizaciones, la IL10 agonista es una IL10 o una región funcional de la misma. Ejemplos de estructuras de tales proteína de fusión multi-específicas, referidas aquí en lo sucesivo como moléculas exceptoras, incluyen N-BD-ID-ED-C, N-ED-ID-BD-C, N-BD1-ID-BD2-C, y N-ED-ID-ED-C, en donde N-y C-se refiere al amino y al carboxilo terminales, respectivamente; BD es un dominio de unión a una región variable de inmunoglobulina o similar a inmunoglobulina; ID es un dominio intermedio; y ED es un dominio extracelular o ectodominio, tal como un dominio de unión a un ligando receptor, un ligando, un dominio de lectina tipo-C, semaforina o dominio similar a semaforina, o similares. En algunas construcciones, el ID puede comprender una región o sub-región constante de inmunoglobulina dispuesta entre el primer y segundo dominio de unión. En otras construcciones, el BD y el ED se unen cada uno al ID a través del mismo o diferente enlazador (por ejemplo, un enlazador que comprende de uno a 50 aminoácidos), tal como una región bisagra de inmunoglobulina (formada por, por ejemplo, las regiones superiores y centrales) o una variante funcional de la misma, o una región interdominio de lectina o variante funcional de la misma, o una región de un cúmulo de diferenciación molecular (CD) o variante funcional de la misma.

Antes de establecer esta divulgación en más detalle, puede ser útil, para la compresión de la misma, proporcionar definiciones de determinados términos que se emplean en la presente memoria. Se establecen definiciones adicionales a través de esta divulgación.

En la presente descripción, se entiende que cualquier intervalo de concentración, intervalo de porcentaje, intervalo de proporción, o intervalo de un número entero, incluye el valor de cualquier número entero dentro del intervalo enumerado y, cuando sea apropiado, a fracciones de los mismos (tal como una décima y una centésima de un número entero), a menos que se indique de otra manera. También, cualquier intervalo numérico enumerado en la presente memoria relacionado con cualquier característica física, tal como subunidades poliméricas, tamaño o espesor, se entiende que incluye cualquier número entero dentro del intervalo enumerado, a menos que se indique de otra manera. Como se emplea en la presente memoria, “aproximadamente” o “que consiste fundamentalmente de” significa ± 20% del intervalo, valor, o estructura indicada, a menos que se indique de otra manera. Se deberá entender que los términos “un” y “uno” como se emplean en la presente memoria se refieren a “uno o más” de los componentes enumerados. El empleo de la alternativa (por ejemplo, “o”) deberá entenderse por significar bien uno, ambos, o cualquier combinación de los mismos de las alternativas. Como se emplea en la presente memoria, los términos “incluyen” y “comprenden” se emplean de forma sinónima. Además, se entenderá que los componentes individuales, o grupos de compuestos, derivados a partir de varias combinaciones de las estructuras y los sustituyentes descritos en la presente memoria, se describen mediante la presente solicitud en el mismo grado que si cada compuesto o grupo de compuestos fuese establecido de manera individual. Por tanto, la selección de estructuras particulares o de sustituyentes particulares está dentro del alcance de la presente divulgación.

Un “dominio de unión” o “región de unión” según la presente divulgación puede ser, por ejemplo, cualquier proteína, polipéptido, oligopéptido, o péptido que posea la capacidad de reconocer y unirse específicamente a una molécula biológica (por ejemplo, CD86) o a un complejo de más de una de las mismas o diferentes moléculas o conjunto o agregado, ya sea estable o transitorio (por ejemplo, complejo CD86/CD28). Tales moléculas biológicas incluyen proteínas, polipéptidos, oligopéptidos, péptidos, aminoácidos, o derivados de los mismos, lípidos, ácidos grasos, o derivados de los mismos; carbohidratos, sacáridos, o derivados de los mismos; nucleótidos, nucleósidos, ácidos nucleicos peptídicos, moléculas de ácido nucleico, o derivados de los mismos; glicoproteínas, glicopéptidos, lipoproteínas, proteolípidos, o derivados de los mismos; otras moléculas biológicas que puedan estar presentes en, por ejemplo, una muestra biológica; o cualquier combinación de las mismas. Una región de unión incluye cualquier pareja de unión de origen natural, sintética, semisintética o producida recombinantemente para una molécula biológica, u otra diana de interés. Para identificar los dominios de unión de la presente divulgación se conoce una variedad de ensayos que se unen específicamente con una diana particular, que incluyen el análisis FACS, Western blot, ELISA, o Biacore.

Los dominios de unión y las proteínas de fusión de los mismos de esta divulgación pueden ser capaces de unirse en un grado deseado, incluyendo la “unión de manera específica o selectiva” a una diana aunque no se una de manera significativa a otros componentes presentes en una muestra de ensayo, ellos si se unen a una molécula diana con una afinidad o Ka (es decir, una constante de equilibrio de asociación de una interacción de unión particular con unidades de 1/M) de, por ejemplo, superior o igual a aproximadamente 105 M-1, 106 M-1, 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1 , 1010 M-1, 1011 M-1, 1012 M-1, o 1013 M-1. Dominios de unión de “alta afinidad” se refiere a aquellos dominios de unión con un Ka de al menos 107 M-1, al menos 108 M-1, al menos 109 M-1, al menos 1010 M-1, al menos 1011 M-1, al menos 1012 M-1, al menos 1013 M-1, o superior. Alternativamente, la afinidad se puede definir como una constante de equilibrio de disociación (Kd) de una interacción de unión particular con unidades de M (por ejemplo, 10-5 M a 10-13 M). Las afinidades de los dominios de unión de los polipéptidos y proteínas de fusión según la presente divulgación se pueden determinar fácilmente empleando técnicas convencionales (véase, por ejemplo, Scatchard et al. (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660; y las Patentes de EE.UU Nos 5.283.173; 5.468.614, o equivalentes).

Los dominios de unión de esta divulgación se pueden generar como se describe en la presente memoria o mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, las Patentes de EE.UU Nos 6.291.161; 6.291.158). Fuentes que incluyen secuencias genéticas de anticuerpos a partir de varias especies (que se pueden formatear como anticuerpos, sFvs, scFvs o Fabs, tales como en una biblioteca de fagos), incluyendo el ser humano, camélidos (a partir de camellos, dromedarios, o llamas; hamers-Casterman et al. (1993), Nature, 363:446 y Nguyen et al. (1998) J. Mol. Biol., 275:413), tiburón (Roux et al. (1998) Proc. Nat’l. Acad. Sci. (EE.UU) 95:11804, peces (Nguyen et al. (2002) Immunogenetics, 54:39), roedores, aves, ovinos, secuencias que codifican bibliotecas peptídicas al azar o secuencias que codifican una diversidad de aminoácidos modificados genéticamente en regiones en bucle de estructuras alternativas que no son un anticuerpo, tales como dominios de fibrinógeno (véase, por ejemplo, Weisel et al. (1985) Science 230:1388), dominios de Kunitz (véase, por ejemplo, la Patente US No 6.423.498), dominios de lipocalina (véase, por ejemplo, la Patente WO 2006/095164), dominios similares a V (véase, por ejemplo, la Publicación de la Solicitud de Patente US Nº 2007/0065431), dominios de lectina tipo-C (Zelensky y Gready (2005) FEBS J. 272:6179), mAb2 o FcabTM (véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente PCT

Nos

WO 2007/098934; WO 2006/072620). Adicionalmente, se pueden emplear estrategias tradicionales para el desarrollo del hibridoma usando, por ejemplo, una única cadena sintética CD86 como un inmunogen en sistemas convenientes (por ejemplo, ratones, HuMAb de ratón®, TC de ratónTM, KM-de ratón®, llamas, pollos, ratas, hámsters, conejos, etc.) para desarrollar los dominios de unión de esta divulgación.

Los términos entendidos por los expertos en la técnica en referencia a la tecnología de anticuerpos tienen el significado adquirido en la técnica, a menos que se defina expresamente en la presente memoria. Por ejemplo, los términos “VL” y “VH” se refieren a la región de unión variable derivada a partir de una cadena ligera y pesada de un anticuerpo, respectivamente. Las regiones de unión variable están formadas de sub-regiones discretas, bien definidas conocidas como “regiones determinantes complementarias” (CDRs) y “regiones estructurales” (FRs). Los términos “CL” y “CH” se refieren a una “región constante de inmunoglobulina”, es decir, una región constante derivada de una cadena ligera o pesada de un anticuerpo, respectivamente, con la región posterior entendida por ser además divisible en dominios de región constante CH1, CH2, CH3 y CH4, dependiendo del isotipo del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM) a partir de las cuales deriva la región. Una parte de los dominios de región constante constituye la región Fc (la región de “fragmento cristalizable”), que contiene los dominios responsables de las funciones del efector de una inmunoglobulina, tal como ADCC (anticuerpo dependiente de la citotoxicidad mediada por células), CDC (citotoxicidad dependiente del complemento) y fijación del complemento, unión a receptores Fc, mayor vida media in vivo relacionada a un polipéptido que carece de una región Fc, unión a proteína A, y quizás incluso la transferencia placentaria (véase Capon et al. (1989) Nature, 337:525). Además, un polipéptido que contiene una región Fc permite la dimerización o multimerización del polipéptido. Una “región bisagra”, también referida en la presente memoria como un “enlazador”, es una secuencia de aminoácidos que se interpone y conecta las regiones de unión variable y las constantes de una cadena única de un anticuerpo, que es conocido en la técnica por proporcionar flexibilidad en forma de una bisagra a los anticuerpos o moléculas similares a anticuerpos. La estructura del dominio de inmunoglobulinas es susceptible de modificarse genéticamente, en la que los dominios de unión al antígeno y los dominios que confieren las funciones efectoras se pueden intercambiar entre clases y subclases de inmunoglobulinas. La estructura y la función de las inmunoglobulinas se evalúan, por ejemplo, en

Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Capítulo 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988). Se puede encontrar una introducción extensiva, así como información detallada sobre todos los aspectos de la tecnología del anticuerpo recombinante, en el manual Recombinant Antibodies (Jogn Wiley e Hijos, NY, 1999). Se puede encontrar una completa colección de Protocolos de laboratorio para anticuerpos de modificación genética en

R. Kontermann y S. Dübel, Eds., The Antibody Engineering Lab Manual (Springer Verlag, Heidelberg/Nueva York, 2000). Otros protocolos relacionados están también disponibles en Current Protocols in Immunology (Agosto 2009) publicados por John Wiley e Hijos, Inc., Boston, MA.

“Derivado” como se emplea en la presente memoria se refiere a una versión de un compuesto modificada química o biológicamente que es estructuralmente similar a un compuesto parental y (real o teóricamente) derivable del compuesto parental. Generalmente, un “derivado” difiere de un “análogo” en que un compuesto parental puede ser el material de partida para generar un “derivado”, mientras que el compuesto parental puede no usarse necesariamente como el material de partida para generar un “análogo”. Un análogo puede tener diferentes propiedades químicas o físicas al compuesto parental. Por ejemplo, un derivado puede ser más hidrofílico o puede tener la actividad alterada (por ejemplo, un CDR que tiene un aminoácido cambiado que altera su afinidad por una diana) en comparación con el compuesto parental.

El término “muestra biológica” incluye una muestra sanguínea, muestra de biopsia, explante tisular, cultivo de un órgano, fluido biológico (por ejemplo, suero, orina, CSF) o cualquier otro tejido o célula u otra preparación a partir de un sujeto o una fuente biológica. Un sujeto o fuente biológica puede ser, por ejemplo, un ser humano o un animal no humano, un cultivo celular primario o una línea celular adaptada a un cultivo que incluye líneas celulares modificadas genéticamente que pueden contener secuencias de aminoácidos integradas en los cromosomas o recombinantes episomales, líneas celulares híbridas de células somáticas, líneas celulares inmortalizadas o inmortalizables, líneas celulares diferenciadas o diferenciables, líneas celulares transformadas, o similares. En otras realizaciones de esta divulgación, un sujeto o fuente biológica puede ser sospechosa de tener o estar en riesgo de tener una enfermedad, trastorno o afección, incluyendo una enfermedad, trastorno o afección maligna o un trastorno de células B. En determinadas realizaciones, un sujeto o fuente biológica puede ser sospechoso de tener o correr el riesgo de tener una enfermedad hiperproliferativa, inflamatoria, o autoinmune, y en determinadas realizaciones de esta divulgación el sujeto o fuente biológica puede ser conocida por ser libre de un riesgo o presencia de tal enfermedad, trastorno, o afección.

Dominios de unión a CD86

Como se establece en la presente memoria, el CD86 comprende un tipo de proteína de membrana I que es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas. CD86 se expresa por las células que presentan el antígeno, y es el ligando para las dos proteínas CD28 y CTLA4 de células T. La unión de CD28 con CD28 es una señal coestimuladora para la activación de células T, aunque la unión de CD28 con CTLA4 regula a la baja la activación de células T y reduce la respuesta inmune. La unión alternativa da como resultado dos variantes de transcripción que codifican diferentes isoformas (Accesos al Banco de genes NP_787058.3 y NP_008820.2).

Un dominio de unión a CD86 de esta divulgación puede bloquear la unión de CD86 a CD28 y regular así a la baja la activación de células T. Los dominios de unión a CD86 contemplados incluyen un dominio extracelular CTLA4, o un sub-dominio del mismo, un dominio o sub-dominio extracelular CD28, o un dominio de unión derivado del anticuerpo específico de CD86 (tal como el derivado del anticuerpo monoclonal FUN1 (véase, por ejemplo, J Pathol. 1993 Mar;169(3):309-15); o derivado del anticuerpo monoclonal anti-CD86 3D1.

En algunas realizaciones, un dominio de unión a CD86 es un dominio extracelular (“ectodominio”) o un CTLA4 humano (Acceso al Banco de genes NP_005205), tal como la secuencia polipeptídica madura de SEQ IN NO:1 (péptido señal: de 1-37 aminoácidos). La secuencia de aminoácidos del ectodominio de CTLA4 sin el péptido señal se proporciona en SEQ ID NO:410. Los solicitantes apuntan que ciertos estudios indican que el polipéptido maduro del ectodominio CTLA4 empieza en la metionina en la posición 38 de SEQ ID NO:1, otros estudios indican que el polipéptido maduro empieza en la alanina en la posición 37. En otras realizaciones, un dominio de unión a CD86 es un ectodominio de CTLA4 que ha mutado para tener una mayor avidez por CD86 que el de tipo salvaje, o no ha mutado, como se describe para CTLA4, por ejemplo, en la Publicación de Patente US Nº US 2003/0035816. En determinadas realizaciones, el ectodominio CTLA4 mutado comprende una alanina o tirosina en el aminoácido en posición 29, y/o ácido glutámico, asparragina, ácido aspártico, glutamina, isoleucina, leucina o treonina en la posición 104 de SEQ ID NO:410. La secuencia de aminoácidos para la variante del ectodominio A29Y L104E CTLA 4 se proporciona en SEQ ID NO:411. En determinadas realizaciones, un dominio de unión a CD86 es un dominio similar al CTLA-4 variable, tal como la secuencia proporcionada en SEQ ID NO:3, o un CDR de un dominio similar al CTLA-4 variable, tal como SEQ ID NO:4 (CDR1), SEQ ID NO:5, (CDR2) o SEQ ID NO:6 (CDR3). Tales CDRs se describen, por ejemplo, en la Patente US 7.405.288. En realizaciones alternativas, un dominio de unión a CD86 es un dominio extracelular (“ectodominio”) de un CD28 (Acceso al Banco de genes NP_006130.1), tal como la secuencia proporcionada en SEQ ID NO:2. Los aminoácidos 1-18 de la SEQ ID NO:2 son el péptido señal. La secuencia de aminoácidos del ectodominio de CD28 sin el péptido señal se proporciona en SEQ ID NO:412.

En otras realizaciones, un dominio de unión a CD86 comprende un dominio similar a una única cadena de inmunoglobulina, tal como un scFv, que es específica para CD86. En determinadas realizaciones, el dominio de

unión a CD86 contiene los dominios de unión variable pesado y ligero a partir del anticuerpo monoclonal FUN1 o 3D1. La secuencia para la cadena pesada, la cadena ligera, el enlazador scFv, y CDRs a partir de los anticuerpos monoclonales anti-CD86 FUN1 y 3D1 se establecen en SEQ ID NOS:305-313 y 318-326, respectivamente, que se pueden emplear en moléculas exceptoras de la inmediata divulgación.

En un aspecto, un dominio de unión a CD86 o una proteína de fusión del mismo de esta divulgación es específica para CD86, y tiene una afinidad con una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 10-3 M a menos de aproximadamente 10-8 M. En determinadas realizaciones preferidas, el dominio de unión a CD86 o la proteína de fusión del mismo se une así a CD86 con una afinidad de aproximadamente 0,3 µM.

En un ejemplo ilustrativo, los dominios de unión a CD86 de la divulgación se pueden identificar empleando una biblioteca de fragmentos de un fago Fab (véase, por ejemplo, Hoet et al. (2005) Nature Biotechnol. 23:344) mediante cribado para unirse a un CD86 sintético o recombinante (empleando una secuencia de aminoácidos o fragmento de la misma como el establecido en el Nº de Acceso al Banco de genes NP_787058.3 o NP_008820.2). En determinadas realizaciones, una molécula CD86 empleada para generar un dominio de unión a CD86 puede comprender además un dominio intermedio o un dominio de dimerización, como se describe en la presente memoria, tal como un dominio o fragmento Fc de inmunoglobulina del mismo.

En algunas realizaciones, los dominios de unión de CD86 de esta divulgación comprenden dominios VH y VL como se describen en la presente memoria (por ejemplo, FUN1, 3D1, o derivados humanizados de los mismos). Otros ejemplos de dominios VH y VL incluyen aquellos descritos en la Patente US 6.827.934. En determinadas realizaciones, los dominios VH y VL son humanos. En otras realizaciones, se proporcionan dominios de unión a CD86 de esta divulgación que tienen una secuencia que es al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, al menos 99,5%, o al menos 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de uno o más regiones variables de la cadena ligera (VL) o uno

o más regiones de la cadena pesada (VH), o de ambas, de SEQ ID NOS:305 y 306, SEQ ID NOS:318 y 319, o de aquellos descritos en la Patente US 6.827.934, en donde cada CDR puede tener cero, uno, dos, o tres aminoácidos cambiados (es decir, la mayoría de los cambios están en la región o regiones estructurales).

Los términos “idéntico” o “porcentaje de identidad”, en el contexto de dos o más secuencias de moléculas de polipéptido o de ácidos nucleicos, significa que dos o más secuencias o subsecuencias que son del mismo o tienen un porcentaje determinado de restos de aminoácidos o nucleótidos que están sobre la misma región determinada (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntico), cuando se compara y se alinean para una correspondencia máxima en una ventana de comparación, o región designada, como medida empleando métodos conocidos en la técnica, tales como un algoritmo de comparación de secuencia, mediante un alineamiento manual, o mediante inspección visual. Por ejemplo, algoritmos preferidos adecuados para determinar el porcentaje de identidad de la secuencia y las secuencias similares son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25:3389 y Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403, respectivamente.

En cualquiera de estas u otras realizaciones descritas en la presente memoria donde los dominios VL y VH pueden ser deseados, los dominios VL y VH se pueden disponer en cualquier orientación y se pueden separar mediante hasta un enlazador de aproximadamente 30 aminoácidos como se describe en la presente memoria, o por cualquier secuencia de aminoácidos capaz de proporcionar una función separadora compatible con la interacción de los dos dominios de sub-unión. En determinadas realizaciones, un enlazador que une a los dominios VL y VH comprende una secuencia de aminoácidos como la que se establece en cualquiera de una o más de SEQ ID NOS:43-166, 244, 307, 320, 355-379 y 383-398, tal como un Enlazador 46 (SEQ ID NO:88), Enlazador 130 (SEQ ID NO:163), Enlazador 131 (SEQ ID NO:164), Enlazador 115 (SEQ ID NO:148), o el enlazador proporcionado en SEQ ID NO:244. Los dominios de unión multi-específicos tendrán al menos dos dominios de sub-unión específicos, por analogía a la organización del anticuerpo camélido, o al menos cuatro dominios de sub-unión, por analogía a la organización de las cadenas apareadas VH y VL de los anticuerpos de mamíferos convencionales.

Los CDRs se definen en la técnica de varias maneras, incluyendo las definiciones de contacto de Kabat, Chothia, AbM. La definición de Kabat se basa en la variabilidad de secuencias y es la definición comúnmente más usada para predecir las regiones CDR (Johson et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:214). La definición de Chothia se basa en la localización de las regiones del bucle estructural (Chothia et al. (1986) J. Mol. Biol. 196:901; Chothia et al. (1989) Nature 342:877). La definición AbM, un equilibrio entre las definiciones de Kabat y Chothia, es un conjunto integral de programas para la modelación de la estructura del anticuerpo producido mediante el Grupo Molecular de Oxford (Martin et al. (1989) Proc. Nat’l. Acad. Sci. (EE.UU) 86:9268; Rees et al., ABMTM, un programa informático para el modelado de regiones variables de anticuerpos, Oxford, Reino Unido; Oxford Molecular, Ltd.). Se ha introducido recientemente una definición adicional, conocida como la definición de contacto, (véase, MacCallum et al. (1996) J. Mol. Biol. 5:732), que se basa en el análisis de estructuras cristalinas complejas disponibles.

Por convenio, los dominios CDR en la cadena pesada se refieren como H1, H2, y H3, que se enumeran secuencialmente desde el amino terminal hasta el carboxilo terminal. La CDR-H1 es de aproximadamente diez a 12 restos de longitud y comienza cuatro restos después de una Cys según las definiciones de Chothia y AbM, o cinco restos después según la definición de Kabat. El H1 puede continuarse por un Trp, Trp-Val, Trp-Ile, o Trp-Ala. La

longitud de H1 es de aproximadamente diez a 12 restos según la definición AbM, mientras que la definición de Chothia excluye los últimos cuatro restos. La CDR-H2 empieza 15 restos después del final de H1 según las definiciones de Kabat y AbM, que generalmente está precedida por la secuencia Leu-Glu-Trp-lle-Gly (pero se conocen varias variaciones) y generalmente va seguida de una secuencia Lys/Arg-Leu/lle/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/lle/Ala. Según la definición de Kabat, la longitud de H2 es de aproximadamente 16 a 19 restos, mientras que la definición de AbM predice que la longitud sea de nueve a 12 restos. La CDR-H3 normalmente empieza 33 restos después del final de H2, generalmente está precedida por la secuencia de aminoácidos Cys-Ala-Arg y continúa por el aminoácido Gly, y tiene una longitud que varía de tres a aproximadamente 25 restos.

Por convenio, las regiones CDR en la cadena ligera se refieren como L1, L2 y L3, que se enumeran secuencialmente desde el amino terminal hasta el carboxilo terminal. La CDR-L1 (aproximadamente de diez a 17 restos de longitud) generalmente empieza aproximadamente en el resto 24 y generalmente sigue una Cys. El resto después de CDR-L1 es siempre Trp, que empieza una de las siguientes secuencias: Trp-Tyr-Gln, Trp-Leu-Gln, Trp-Phe-Gln, o Trp-Tyr-Leu. La CDR-L2 (aproximadamente siete restos de longitud) empieza aproximadamente 16 restos después del final de L1, y generalmente seguirá a los restos Ile-Tyr, Val-Tyr, Ile-Lys, o Ile-Phe. La CDR-L3 normalmente empieza 33 restos después del final de L2, y generalmente sigue una Cys, que generalmente va seguida por la secuencia Phe-Gly-XXX-Gly, y tiene una longitud de aproximadamente siete a 11 restos.

Por tanto, un dominio de unión de esta divulgación puede comprender una sola CDR a partir de una región variable de un anticuerpo anti-CD86, o puede comprender múltiples CDRs que pueden ser iguales o diferentes. En determinadas realizaciones, los dominios de unión de esta divulgación comprenden dominios VH y VL específicos para un CD86 que comprende regiones estructurales y regiones CDR1, CDR2 y CDR3, en donde (a) el dominio VH comprende una secuencia de aminoácidos de una CDR3 de cadena pesada; o (b) el dominio VL comprende una secuencia de aminoácidos de una cadena ligera CDR3; o (c) el dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos VH de (a) y una secuencia de aminoácidos VL de (b); o el dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos VH de (a) y una secuencia de aminoácidos VL de (b) y en donde VH y VL se encuentran en la misma secuencia de referencia. En otras realizaciones, los dominios de unión de esta divulgación comprenden dominios VH y VL específicos para un CD86 que comprende regiones estructurales y regiones CDR1, CDR2 y CDR3, en donde

(a) el dominio VH comprende una secuencia de aminoácidos de una cadena pesada CDR1, CDR2, y CDR3; o (b) el dominio VL comprende una secuencia de aminoácidos de una cadena ligera CDR1, CDR2, y CDR3; o (c) el dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos VH de (a) y una secuencia de aminoácidos VL de (b); o el dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos VH de (a) y una secuencia de aminoácidos VL de (b), en donde las secuencias de aminoácidos VH y VL son de la misma secuencia de referencia.

En cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria que comprenden CDRs específicos, un dominio de unión puede comprender (i) un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticos a la secuencia de aminoácidos de un dominio VH; o (ii) un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntico a la secuencia de aminoácidos de un dominio VL; o (iii) tanto un dominio VH de (i) como un dominio VL de (ii); o tanto un dominio VH de (i) como un dominio VL de (ii) en donde VH y VL son de la misma secuencia de referencia, en donde cada CDR tiene hasta tres cambios de aminoácidos (es decir, muchos de los cambios están en la región o regiones estructurales).

Un dominio de unión a CD86 en las proteínas de fusión exceptoras de esta divulgación puede ser un dominio similar a inmunoglobulina, tal como una estructura de inmunoglobulina. Las estructuras de inmunoglobulina contempladas por esta descripción incluyen un scFv, un anticuerpo de dominio, o un anticuerpo sólo de cadena pesada. En un scFv, esta divulgación contempla que las regiones variables de la cadena pesada y ligera están unidas por cualquier péptido enlazador descrito en la presente memoria, o conocido en la técnica como compatible con los dominios o regiones de unión en una molécula de unión. Ejemplos de enlazadores son los enlazadores basados en el enlazador Gly4Ser, tal como (Gly4Ser)n, donde n=1-5. Si un dominio de unión de una proteína de fusión de esta divulgación se basa en una inmunoglobulina no humana, o incluye CDRs no humanas, el dominio de unión se puede "humanizar" según los métodos conocidos en la técnica.

Alternativamente, un dominio de unión a CD86 de proteínas de fusión de esta divulgación puede ser una estructura diferente a una estructura de inmunoglobulina. Otras estructuras contempladas por esta divulgación presentan una CDR o CDRs específicas de CD86 en una conformación funcional. Otras estructuras contempladas incluyen, pero no se limitan a, una molécula de dominio A, un dominio de fibronectina III, una anticalina, una molécula de unión modificada genéticamente por repetición de anquirina, una adnectina, un dominio de Kunitz o un affibody de dominio de proteína AZ.

IL10

Como se indicó anteriormente, la presente divulgación proporciona polipéptidos que contienen una región o dominio de unión que es un agonista de IL10 (es decir, puede aumentar la señalización de IL10). En algunas realizaciones, el dominio de unión al agonista de IL10 es una IL10 o un IL10Fc. En otras realizaciones, el dominio de unión al agonista de IL10 es una proteína de unión de cadena simple, tal como un scFv, que se une específicamente a IL10R1 o IL10R2. En algunas realizaciones, el dominio de unión al agonista de IL10 es una IL10 que contiene una

mutación puntual en la posición 87 de SEQ ID NO:7, tal como de "I" a "A" o "S" (referido en la presente memoria como I87A o I87S, respectivamente). Se sabe que las moléculas de IL10 de la variante I87 son menos inmunoestimuladoras en comparación con el tipo salvaje IL10 (Ding et al., J. Exp. Med. 191: 213, 2000). Adicionalmente, IL10 normalmente forma un homodímero con el dominio amino terminal de cada molécula monomérica que se une al dominio carboxilo terminal del otro monómero). En una realización, también se estudió el dominio de unión al agonista de IL10, es una molécula de IL10 que tiene un enlazador corto (gggsgg SEQ ID NO:379) que separa los dos subdominios de la molécula (dominios de los extremos amino y carboxilo) para que estos subdominios puedan formar un dímero intramolecular. Éstos se denominan en la presente memoria como moléculas monoIL10.

IL10 (Acceso al Banco de genes Nº NP_000563.1, SEQ ID NO:7) es un miembro de una superfamilia de citoquinas que comparten una estructura alfa-helicoidal. Los aminoácidos 1-18 de SEQ ID NO:7 son el péptido señal de la proteína precursora IL10. La secuencia de aminoácidos de la proteína IL10 madura se proporciona en SEQ ID NO:418. Aunque no existe evidencia empírica, se ha sugerido que todos los miembros de la familia poseen seis hélices alfa (Fickenscher, H. et al., (2002) Trends Immunol. 23:89). IL10 tiene cuatro cisteínas, de las cuales sólo una se conserva entre los miembros de la familia. Dado que IL10 demuestra un pliegue en forma de V que contribuye a su dimerización, parece que los enlaces disulfuro no son críticos para esta estructura. La identidad de aminoácidos de los miembros de la familia con la IL10 oscila entre el 20% (IL-19) y el 28% (IL-20) (Dumouter et al., (2002) Eur. Cytokine Netw. 13:5).

La IL10 se describió primero como una citoquina Th2 en ratones que inhibía la producción de citoquina IFN-α y GM-CSF por las células Th1 (Moore et al., 2001, Annu. Rev. Immunol., 19:683; Fiorentino et al., (1989) J. Exp. Med. 170:2081). La IL10 humana tiene una longitud de 178 aminoácidos con una secuencia señal de 18 aminoácidos y un segmento maduro de 160 aminoácidos. Su peso molecular es de aproximadamente 18 kDa (monómero). La IL10 humana no contiene ningún sitio de glicosilación unido a N potencial, y no está glucosilada (Dumouter et al., (2002) Eur. Cytokine Netw. 13:5; Vieira et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88:1172). Contiene cuatro restos de cisteína que forman dos enlaces disulfuro intracatenarios. Las Hélices A --> D de un monómero interaccionan de forma no covalente con las hélices E y F de un segundo monómero, formando un homodímero en forma de V no covalente. Se han mapeado las áreas funcionales en la molécula IL10. En el N terminal, los restos # 1-9 de la prehélice A están implicados en la proliferación de los mastocitos, mientras que en el extremo C, los restos # 152-160 de la hélice F median en la secreción y quimiotaxis de los leucocitos.

Las células que se sabe que expresan IL10 incluyen células T CD8+, microglia, monocitos CD14+ (pero no CD16+), células Th2 CD4+ (ratones), queratinocitos, células estrelladas hepáticas, células T Th1 y Th2 CD4+ (humanas), células de melanoma, macrófagos activados, células NK, células dendríticas, células B (CD5+ y CD19+), y eosinófilos. En las células T, ahora se sugiere que la observación inicial de la inhibición de IL10 de la producción de IFN-gamma es un efecto indirecto mediado por células accesorias. Sin embargo, los efectos adicionales sobre las células T, incluyen: quimiotaxis de células T CD8+ inducida por IL10, una inhibición de la quimiotaxis de células T CD4+ hacia IL-8, supresión de la producción de IL-2 después de la activación, una inhibición de la apoptosis de células T a través de la regulación al alza de Bcl-2, y una interrupción de la proliferación de células T después de una baja exposición al antígeno acompañado de coestimulación CD28 (Akdis et al., (2001) Immunology 103:131).

En las células B, IL10 tiene una serie de funciones relacionadas, pero distintas. Junto con TNF-β y CD40L, IL10 induce la producción de IgA en células B (IgD+) sin tratamiento previo. Se cree que TGF-β/CD40L promueve la conmutación de clase, mientras que IL10 inicia la diferenciación y el crecimiento. Cuando TGF-β no está presente, IL10 coopera con CD40L en la inducción de IgG1 y IgG3 (humana), y por lo tanto, puede ser un factor de cambio directo para los subtipos de IgG. Curiosamente, IL10 tiene efectos divergentes sobre la secreción de IgE inducida por IL-4. Si IL10 está presente en el momento de la conmutación de clase inducida por IL-4, invierte el efecto; si está presente después de la participación de IgE, aumenta la secreción de IgE. Finalmente, la interacción de CD27/CD70 en presencia de IL10 promueve la formación de células plasmáticas a partir de células B de memoria (Agematsu et al., (1998) Blood 91:173).

Los mastocitos y las células NK también se ven afectadas por IL10. En los mastocitos, IL10 induce la liberación de histamina, mientras que bloquea la liberación de GM-CSF y TNF-α. Este efecto puede ser autocrino, ya que se sabe que IL10 es liberado por los mastocitos en la rata. Como evidencia de su naturaleza pleiotrófica, IL10 tiene los efectos opuestos sobre las células NK. En lugar de bloquear la producción de TNF-α y GM-CSF, IL10 realmente promueve esta función en las células NK. Además, potencia la proliferación de células NK inducida por IL-2, y facilita la secreción de IFN-γ en células NK preparadas mediante IL-18. En concierto con IL-12 y/o IL-18, IL10 potencia la citotoxicidad de las células NK (Cai et al., 1999, Eur. J. Immunol. 29:2658).

La IL10 tiene un pronunciado efecto anti-inflamatorio sobre los neutrófilos. Inhibe la secreción de las quimioquinas MIP-1α, MIP-1β e IL-8, y bloquea la producción de los mediadores proinflamatorios IL-1β y TNF-α. Además, disminuye la capacidad de los neutrófilos para producir superóxido, y como resultado, interfiere con la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos mediada por PMN. También bloquea la quimiotaxis inducida por IL-8 y fMLP, posiblemente a través de CXCR1 (Vicioso et al., (1998) Eur. Cytokine Netw. 9:247).

En las células dendríticas (DCs), la IL10 generalmente presenta efectos inmunosupresores. Parece promover la diferenciación de macrófagos CD14+ en detrimento de DCs. La IL10 parece disminuir la capacidad de las DCs para estimular las células T, particularmente para las células de tipo Th1. En relación con la expresión de MHC-II, se puede regular a la baja, no regular, o regular al alza (Sharma et al., (1999) J. Immunol. 163:5020). Con respecto a CD80 y CD86, IL10 regulará al alza o la baja su expresión. B7-2/CD86 desempeña un papel clave en la activación de células T. Para esta molécula, IL10 participa tanto en la regulación al alza como a la baja. Quizás la modulación más significativa, sin embargo, se produce con CD40 (IL10 parece reducir su expresión). A nivel regional, IL10 puede bloquear la inmunoestimulación inhibiendo la migración de células de Langerhans en respuesta a citoquinas proinflamatorias. Alternativamente, la IL10 bloquea una etapa de maduración de DC inducida por inflamación que normalmente implica la regulación a la baja de CCR1, CCR2 y CCR5 y la regulación al alza de CCR7. Este bloqueo, con la retención de CCR1, CCR2 y CCR5, da como resultado un fallo de las DCs para migrar a los ganglios locales. El resultado es una DC inmóvil que no estimulará las células T, pero se unirá (y eliminará) las quimioquinas proinflamatorias sin responder a ellas (D-Amico et al., (2000) Nat. Immunol. 1:387).

En monocitos, IL10 tiene una serie de efectos documentados. Por ejemplo, IL10 parece reducir claramente la expresión de MHC-II en la superficie celular. También inhibe la producción de IL-12 después de la estimulación. Si bien promueve una transición de monocitos a macrófagos junto con M-CSF, el fenotipo del macrófago no es claro (es decir, CD16+/citotóxico frente a CD16-). La IL10 también reduce la secreción de GM-CSF de monocitos y la producción de IL-8, mientras que promueve la liberación de IL-1ra (Gesser et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94:14620). Ahora se sabe que la hialuronectina, un componente del tejido conectivo, es secretada por monocitos en respuesta a IL10. Esto puede tener cierta importancia en la migración celular, particularmente en la metástasis de células tumorales, donde se sabe que la hialuronectina interrumpe la migración celular a través del espacio extracelular (Gesser et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94:14620).

Se ha demostrado que las proteínas de fusión de IL10 con regiones Fc murinas o de macaco (referidas como IL10Fc) inhiben la función de los macrófagos y prolongan la supervivencia del xenoinjerto de islotes pancreáticos (Feng et al., (1999) Transplantation 68:1775; Asiedu et al., (2007) Cytokine 40:183), así como reduce el choque séptico en un modelo murino (Zheng et al. (1995) J. Immunol. 154:5590).

La IL10R1 humana es una glicoproteína transmembrana de tipo I de paso único de 90-110 kDa que se expresa en un número limitado de tipos de células (Liu et al., 1994, J. Immunol. 152:1821). Se observa una expresión débil en páncreas, músculo esquelético, cerebro, corazón y riñón. La placenta, pulmón e hígado mostraron niveles intermedios. Los monocitos, las células B, los linfocitos granulares grandes, y las células T expresan altos niveles (Liu et al., 1994, J. Immunol., 152:1821). La proteína expresada es una proteína de 578 aminoácidos que contiene un péptido señal de 21 aminoácidos, una región extracelular de 215 aminoácidos, un segmento transmembrana de 25 aminoácidos, y un dominio citoplásmico de 317 aminoácidos. Hay dos diseños de FNIII dentro de la región extracelular, y un sitio de acoplamiento STAT3 más una región de asociación JAK1 dentro del dominio citoplásmico (Kotenko et al., 2000 Oncogene 19:2557; Kotenko et al., 1997, EMBO J. 16:5894). La IL10R1 se une a la IL10 humana con una Kd de 200 pM.

En algunas realizaciones, los dominios de unión de esta divulgación comprenden dominios VL y VH específicos para un IL10R1 o IL10R2 como se describe en la presente memoria. En determinadas realizaciones, los dominios VL y VH son humanos. Los dominios VL y VH se pueden disponer en cualquier orientación y pueden separarse mediante un enlazador de hasta aproximadamente 30 aminoácidos como se describe en la presente memoria, o por cualquier otra secuencia de aminoácidos capaz de proporcionar una función espaciadora compatible con la interacción de los dos dominios de sub-unión. En determinadas realizaciones, un enlazador que une los dominios VL y VH comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NOs: 43-166, 244, 307, 320, 355-379 y 383-398, tal como el enlazador proporcionado en SEQ ID NO:244, el Enlazador 46 (SEQ ID NO:88), el Enlazador 130 (SEQ ID NO:163), o el Enlazador 131 (SEQ ID NO:164). Los dominios de unión multi-específicos pueden tener al menos dos dominios de sub-unión específicos, por analogía a la organización de anticuerpos camélidos, o al menos cuatro dominios de sub-unión específicos, por analogía a la organización de anticuerpos de mamíferos convencionales de cadenas VL y VH emparejadas. Los dominios de unión específicos para IL10R1 o IL10R2 de esta divulgación pueden comprender una o más regiones determinantes de complementariedad ("CDR"), o copias múltiples de una o más de tales CDRs, que se han obtenido, derivado o diseñado a partir de variables regiones de un fragmento scFv o Fab anti-IL10R1 o IL10R2 o a partir de regiones variables de la cadena pesada o ligera de las mismas. Por tanto, un dominio de unión de esta divulgación puede comprender una única CDR a partir de una región variable de un anti-IL10R1 o IL10R2, o puede comprender múltiples CDRs que pueden ser iguales o diferentes. Los dominios de unión de esta divulgación pueden comprender dominios VL y VH específicos para un IL10R1 o IL10R2 que comprende regiones estructurales y regiones CDR1, CDR2 y CDR3.

Proteínas de fusión multi-específicas

La presente divulgación proporciona proteínas de fusión multi-específicas que comprenden un dominio que se une a CD86 ("dominio de unión a CD86") y un dominio que es un agonista de IL-10 ("dominio de unión heterólogo"). El dominio de unión heterólogo es un agonista de IL10, tal como IL10, IL10Fc o un dominio de unión de cadena única que se une específicamente a IL10R1 o IL10R2.

Generalmente, las proteínas de fusión de la presente invención hacen uso de proteínas maduras que no incluyen el péptido líder (péptido señal). Por consiguiente, aunque ciertas secuencias proporcionadas en la presente memoria para proteínas de dominio de unión (tales como CTLA4, CD28, HLA-G1 y HLA-G5, y otras descritas en la presente memoria) incluyen el péptido líder, el experto en la técnica entenderá fácilmente cómo determinar la secuencia de proteína madura a partir de secuencias que incluyen un péptido señal. En determinadas realizaciones, puede ser útil incluir la secuencia líder.

Se contempla que un dominio de unión a CD86 puede estar en el extremo amino, y el dominio de unión heterólogo en el extremo carboxilo de una proteína de fusión. En determinadas realizaciones, la molécula exceptora es como se establece en SEQ ID NO:9, 13, 17, 24, 28, 31, 35, 42, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 187, 189, 191, 193, 219, 221, 223, 237, 262, 302, 330, 336, 338, 340, ó 400. También se contempla que el dominio de unión heterólogo puede estar en el extremo amino, y el dominio de unión a CD86 puede estar en el extremo carboxilo. En determinadas realizaciones, la molécula exceptora es como se establece en SEQ ID NO:183, 185, 199, 201, 203, 205, 207, 211, 213, 254, 258, 266, 276, 350, 352, ó 354. Como se establece en la presente memoria, los dominios de unión de esta divulgación se pueden fusionar a cada extremo de un dominio intermedio (por ejemplo, una región constante de inmunoglobulina o sub-región de la misma). Además, los dos o más dominios de unión se pueden unir cada uno a un dominio intermedio a través de un enlazador, como se describe la presente memoria.

Como se emplea en la presente memoria, un "dominio intermedio" se refiere a una secuencia de aminoácidos que simplemente funciona como una estructura para uno o más dominios de unión de modo que la proteína de fusión existirá principalmente (por ejemplo, 50% o más de una población de proteínas de fusión) o sustancialmente (por ejemplo, 90% o más de una población de proteínas de fusión) como un polipéptido monocatenario en una composición. Por ejemplo, ciertos dominios intermedios pueden tener una función estructural (por ejemplo, espaciamiento, flexibilidad, rigidez) o una función biológica (por ejemplo, una semivida incrementada en plasma, tal como en la sangre humana). Ejemplos de dominios intermedios que pueden aumentar la semivida de las proteínas de fusión de esta divulgación en plasma incluyen albúmina, transferrina, un dominio de estructura que se une a una proteína sérica, o similar, o fragmentos de los mismos.

En determinadas realizaciones, el dominio intermedio contenido en una proteína de fusión multi-específica de esta divulgación es un "dominio de dimerización", que se refiere a una secuencia de aminoácidos que es capaz de promover la asociación de al menos dos polipéptidos o proteínas monocatenarios a través de interacciones nocovalentes o covalentes, tales como por enlaces de hidrógeno, interacciones electrostáticas, fuerzas de Van der Waal, enlaces disulfuro, interacciones hidrófobas, o similares, o cualquier combinación de las mismas. Ejemplos de dominios de dimerización incluyen regiones o sub-regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina. Debe entenderse que un dominio de dimerización puede promover la formación de dímeros o complejos multímeros de orden superior (tales como trímeros, tetrámeros, pentámeros, hexámeros, septámeros, octámeros, etc.).

Una "sub-región constante" es un término definido en la presente memoria para referirse a una secuencia peptídica, polipeptídica o proteica que corresponde o se deriva de una parte o la totalidad de uno o más dominios de la región constante, pero no todos los dominios de la región constante de una fuente anticuerpo. En una realización preferida, la sub-región constante es una IgG CH2CH3, preferiblemente una IgG1 CH2CH3. En algunas realizaciones, los dominios de la región constante de una proteína de fusión de esta divulgación pueden carecer o tener funciones efectoras mínimas de citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) y activación del complemento, y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), conservando la capacidad de unir algunos receptores de Fc (tal como la unión de FcRn) y de retener una semivida relativamente larga in vivo. En determinadas realizaciones, un dominio de unión de esta divulgación se fusiona a una región o sub-región constante de una IgG1 humana, en donde la región o sub-región constante de IgG1 tiene uno o más de los siguientes aminoácidos mutados: leucina en la posición 234 (L234), leucina en la posición 235 (L235), glicina en la posición 237 (G237), glutamato en la posición 318 (E318), lisina en la posición 320 (K320), lisina en la posición 322 (K322), o cualquier combinación de los mismos (numeración según Kabat). Por ejemplo, uno o más de estos aminoácidos se pueden cambiar por alanina. En otra realización, un dominio Fc de IgG1 tiene cada uno L234, L235, G237, E318, K320, y K322 (según la numeración UE) mutado a una alanina (es decir, L234A, L235A, G237A, E318A, K320A y K322A, respectivamente), y opcionalmente una mutación N297A (es decir, eliminando esencialmente la glicosilación del dominio CH2).

Se conocen métodos en la técnica para hacer mutaciones dentro o fuera de un dominio Fc que pueden alterar las interacciones de Fc con los receptores de Fc (CD16, CD32, CD64, CD89, FcεR1, FcRn) o con el componente del complemento C1q (véase, por ejemplo, la Patente US Nº 5.624.821; Presta (2002) Curr. Pharma. Biotechnol. 3:237). Las realizaciones particulares de esta divulgación incluyen composiciones que comprenden inmunoglobulinas o proteínas de fusión que tienen una región o sub-región constante de la IgG humana en donde la unión a FcRn y proteína A se conservan, y en donde el dominio Fc ya no interacciona o interacciona mínimamente con otros receptores Fc o C1q. Por ejemplo, un dominio de unión de esta divulgación puede fusionarse a una región o subregión constante de IgG1 humana en donde la asparagina en la posición 297 (N297 bajo la numeración de Kabat) ha mutado a otro aminoácido para reducir o eliminar la glicosilación en este sitio y, por lo tanto, anula la unión eficaz de Fc a FcγR y C1q. Otro ejemplo es una mutación P331S, lo que disminuye la unión a C1q, pero no afecta a la unión de Fc.

En otras realizaciones, una región Fc de inmunoglobulina puede tener un patrón de glicosilación alterado con respecto a una secuencia de referencia de inmunoglobulina. Por ejemplo, se puede emplear cualquier variedad de las técnicas genéticas para alterar uno o más restos de aminoácidos particulares que forman un sitio de glicosilación (véase, Co et al. (1993) Mol. Immunol. 30:1361; Jacquemon et al. (2006) J. Thromb. Haemost. 4:1047; Schuster et al. (2005) Cancer Res. 65:7934; Warnock et al. (2005) Biotechnol. Bioeng. 92:831), tales como N297 del dominio CH2 (numeración UE). Alternativamente, las células huésped que producen las proteínas de fusión de esta divulgación pueden modificarse por ingeniería genética para producir un patrón de glicosilación alterado. Un método conocido en la técnica, por ejemplo, proporciona una glicosilación alterada en forma de variantes divididas, no fucosilados que aumentan ADCC. Las variantes son el resultado de la expresión en una célula huésped que contiene una enzima que modifica el oligosacárido. Alternativamente, la tecnología Potelligent de BioWa/Kyowa Hakko se contempla para reducir el contenido de fucosa de moléculas glicosiladas según esta divulgación. En un método conocido, se proporciona una célula huésped CHO para la producción de inmunoglobulina recombinante que modifica el patrón de glicosilación de la región Fc de inmunoglobulina, a través de la producción de GDP-fucosa.

Alternativamente, las técnicas químicas se usan para alterar el patrón de glicosilación de las proteínas de fusión de esta divulgación. Por ejemplo, una variedad de inhibidores de glucosidasa y/o manosidasa proporcionan uno o más de los efectos deseados de aumentar la actividad de ADCC, aumentar la unión al receptor de Fc, y alterar el patrón de glicosilación. En determinadas realizaciones, las células que expresan una proteína de fusión multiespecífica de la presente divulgación (que contiene un dominio antagonista de CD86 unido a un agonista de IL-10) crecen en un medio de cultivo que comprende un modificador de carbohidrato a una concentración que aumenta la ADCC de moléculas de inmunoglicoproteína producidas por dicha célula hospedadora, en donde dicho modificador de carbohidrato está en una concentración de menos de 800 μM. En una realización preferida, las células que expresan estas proteínas de fusión multiespecíficas se cultivan en un medio de cultivo que comprende castanospermina o kifunensina, más preferiblemente castanospermina a una concentración de 100-800 μM, tal como 100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM, 600 μM, 700 μM, o 800 μM. Los métodos para alterar la glicosilación con un modificador de carbohidrato, tal como castanospermina, se proporcionan en la Publicación de Solicitud de Patente US Nº 2009/0041756 o la Publicación PCT Nº WO 2008/052030.

En otra realización, la región Fc de inmunoglobulina puede tener modificaciones de aminoácidos que afectan a la unión a receptores Fc de células efectoras. Estas modificaciones se pueden realizar usando cualquier técnica conocida en la técnica, tal como el enfoque divulgado en Presta et al. (2001) Biochem. Soc. Trans. 30:487. En otro enfoque, está disponible la tecnología Xencor XmAb™ para modificar genéticamente sub-regiones constantes correspondientes a los dominios Fc para mejorar la función efectora de destrucción celular (véase, Lazar et al., (2006) Proc. Nat'l. Acad. Sci. (EE.UU.) 103:4005). Usando este enfoque se pueden generar, por ejemplo, subregiones constantes con especificidad y unión mejoradas para FCγR, mejorando así la función efectora de destrucción celular.

En otras realizaciones, una región o subregión constante puede aumentar opcionalmente la semivida en plasma o la transferencia placentaria en comparación con una proteína de fusión correspondiente que carece de dicho dominio intermedio. En determinadas realizaciones, la semivida en plasma extendida de una proteína de fusión de esta divulgación es al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos diez, al menos 12, al menos 18, al menos 20, al menos 24, al menos 30, al menos 36, al menos 40, al menos 48 horas, al menos varios días, al menos una semana, al menos dos semanas, al menos varias semanas, al menos un mes, al menos dos meses, al menos varios meses o más, en un ser humano.

Una sub-región constante puede incluir parte o la totalidad de cualquiera de los siguientes dominios: un dominio CH2, un dominio CH3 (IgA, IgD, IgG, IgE, o IgM), y un dominio CH4 (IgE o IgM). Una sub-región constante como se define en la presente memoria, por lo tanto, puede referirse a un polipéptido que corresponde a una parte de una región constante de inmunoglobulina. La sub-región constante puede comprender un dominio CH2 y un dominio CH3 derivado de las mismas, o diferentes inmunoglobulinas, isotipos de anticuerpos, o variantes alélicas. En algunas realizaciones, el dominio CH3 está truncado y comprende una secuencia carboxilo terminal enumerada en la Solicitud de Patente US Nº US2009-0175861 A1 (que es un CIP de PCT/US2007/071052) como SEQ ID NOS:366-371. En determinadas realizaciones, una sub-región constante de un polipéptido de esta divulgación tiene un dominio CH2 y un dominio CH3, que puede tener opcionalmente un enlazador en el amino terminal, un enlazador en el carboxilo terminal, o un enlazador en ambos extremos.

Un "enlazador" es un péptido que se une o enlaza otros péptidos o polipéptidos, tales como un enlazador de aproximadamente 2 a aproximadamente 150 aminoácidos. En las proteínas de fusión de esta divulgación, un enlazador puede unirse a un dominio intermedio (por ejemplo, una sub-región constante derivada de inmunoglobulina) a un dominio de unión, o un enlazador puede unir dos regiones variables de un dominio de unión,

o dos regiones dentro de una única cadena de polipéptido formado a partir de una molécula heterodimérica, tal como EBI3 (SEQ ID NO:25) y la subunidad p35 de IL12 (SEC ID NO:26) de IL35. Por ejemplo, un enlazador puede ser una secuencia de aminoácidos obtenida, derivada, o diseñada a partir de una secuencia de la región bisagra del anticuerpo, una secuencia que une un dominio de unión a un receptor, o una secuencia que une un dominio de unión a una región transmembrana de la superficie celular o de anclaje a membrana. En algunas realizaciones, un enlazador puede tener al menos una cisteína capaz de participar en al menos un enlace disulfuro en condiciones fisiológicas u otras condiciones peptídicas estándar (por ejemplo, condiciones de purificación de péptidos,

condiciones de almacenamiento de péptidos). En determinadas realizaciones, un enlazador correspondiente o similar a un péptido bisagra de inmunoglobulina conserva una cisteína que corresponde a la cisteína bisagra dispuesta hacia el extremo amino terminal de dicha bisagra. En otras realizaciones, un enlazador es de una bisagra IgG1 o IgG2A, y tiene una cisteína o dos cisteínas correspondientes a la bisagra de cisteínas. En determinadas realizaciones, uno o más enlaces disulfuro se forman como enlaces disulfuro entre cadenas entre los dominios intermedios. En otras realizaciones, las proteínas de fusión de esta divulgación pueden tener un dominio intermedio fusionado directamente a un dominio de unión (es decir, en ausencia de un enlazador o bisagra). En algunas realizaciones, el dominio intermedio es un dominio de dimerización, tal como una parte de IgG1 CH2CH3 Fc.

El dominio intermedio o de dimerización de las proteínas de fusión multi-específicas de la presente divulgación puede estar conectado mediante un enlazador peptídico a uno o más dominios de unión terminales. Además de proporcionar una función de separación, un enlazador puede proporcionar flexibilidad o rigidez adecuada para orientar correctamente el dominio o dominios de unión de una proteína de fusión, tanto dentro de la proteína de fusión, como entre o en las proteínas de fusión y su diana o dianas. Además, un enlazador puede apoyar la expresión de una proteína de fusión de longitud completa, y la estabilidad de la proteína purificada tanto in vitro como in vivo después de la administración a un sujeto que necesita del mismo, tal como un ser humano, y es preferiblemente no inmunogénico o pobremente inmunogénico en esos mismos sujetos. En determinadas realizaciones, un enlazador de un dominio intermedio o de dimerización de proteínas de fusión multi-específicas de esta divulgación, puede comprender parte o la totalidad de una bisagra de inmunoglobulina humana.

Adicionalmente, un dominio de unión puede comprender un dominio VH y VL, y estos dominios de la región variable se pueden combinar por un enlazador. Ejemplos de enlazadores del dominio de unión de la región variable son los que pertenecen a la familia (GlynSer), tal como (Gly3Ser)n(Gly4Ser)1, (Gly3Ser)1(Gly4Ser)n, (Gly3Ser)n(Gly4Ser)n, o (Gly4Ser)n, en donde n es un número entero de 1 a 5 (véase, por ejemplo, los Enlazadores 22, 29, 46, 89, 90, 116, 130, y 131 correspondientes a SEQ ID NOS:64, 71, 88, 131, 132, 149, 163 y 164, respectivamente). En realizaciones preferidas, estos enlazadores basados en (Gly4Ser) se utilizan para unir dominios variables y no se utilizan para unir un dominio de unión (por ejemplo, scFv) a un dominio intermedio (por ejemplo, una IgG CH2CH3).

Ejemplos de enlazadores que se pueden usar para unirse a un dominio intermedio (por ejemplo, una sub-región constante derivada de inmunoglobulina) a un dominio de unión, o un enlazador que puede unir dos regiones variables de un dominio de unión, se enumeran en SEQ ID NOS:43-166, 244, 307, 320, 355-379 y 383-398).

Enlazadores que se contemplan en esta divulgación incluyen, por ejemplo, péptidos derivados a partir de cualquier región inter-dominio de un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas (por ejemplo, una región bisagra de un anticuerpo) o una región de lectinas tipo C, una familia de proteínas de membrana tipo II. Estos enlazadores tienen una longitud que oscila de aproximadamente dos a aproximadamente 150 aminoácidos, o de aproximadamente dos a aproximadamente 40 aminoácidos, o de aproximadamente ocho a aproximadamente 20 aminoácidos, preferiblemente de aproximadamente diez a aproximadamente 60 aminoácidos, más preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 aminoácidos, y lo más preferiblemente de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 aminoácidos. Por ejemplo, el Enlazador 1 tiene dos aminoácidos de longitud y el Enlazador 116 tiene 36 aminoácidos de longitud (los Enlazadores 1-133 se proporcionan en SEQ ID NOS:43-166, respectivamente; se proporcionan ejemplos adicionales de enlazadores en SEQ ID NOS:244, 307, 320, 355-379, y 383-398.

Más allá de consideraciones de longitud generales, un enlazador adecuado para usar en las proteínas de fusión de esta divulgación incluye una región de bisagra del anticuerpo seleccionado a partir de una bisagra de IgG, bisagra IgA, bisagra IgD, bisagra IgE, o variantes del mismo. En determinadas realizaciones, un enlazador puede ser una región bisagra del anticuerpo (región superior y central) seleccionada de IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana, IgG4 humana, o fragmentos o variantes de las mismas. Como se emplea en la presente memoria, un enlazador que es una "región bisagra de inmunoglobulina" se refiere a los aminoácidos que se encuentran entre el extremo carboxilo de CH1, y el extremo amino terminal de CH2 (para IgG, IgA, y IgD) o el extremo terminal amino de CH3 (para IgE y IgM). Una "región bisagra de inmunoglobulina tipo salvaje" como se emplea en la presente memoria, se refiere a una secuencia de aminoácidos de origen natural interpuesta entre, y que conecta, las regiones CH1 y CH2 (para IgG, IgA y IgD) o interpuesta entre, y que conecta, las regiones CH2 y CH3 (para IgE y IgM) que se encuentran en la cadena pesada de un anticuerpo. En realizaciones preferidas, las secuencias de la región bisagra de inmunoglobulina tipo salvaje, son humanas.

Según estudios cristalográficos, un dominio de bisagra de IgG puede estar funcional y estructuralmente subdividido en tres regiones: la región bisagra superior, la región bisagra central o intermedia, y la región bisagra inferior (Shin et al. (1992) Immunological Reviews 130:87). Ejemplos de regiones bisagra superiores incluyen EPKSCDKTHT (SEQ ID NO:383) como se encuentra en IgG1, ERKCCVE (SEQ ID NO:384) como se encuentra en IgG2, ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO:385) o EPKSCDTPPP (SEQ ID NO:386) como se encuentra en IgG3, y ESKYGPP (SEQ ID NO:387) como se encuentra en IgG4. Ejemplos de regiones bisagra intermedias incluyen CPPCP (SEQ ID NO:398) como se encuentra en IgG1 y IgG2, CPRCP (SEQ ID NO:388) como se encuentra en IgG3, y CPSCP (SEQ ID NO:389) como se encuentra en IgG4. Mientras que los anticuerpos IgG1, IgG2 y IgG4 parecen tener cada uno una sola bisagra superior y una intermedia, IgG3 tiene cuatro en tándem -una de ELKTPLGDTTHTCPRCP (SEQ ID NO:390) y tres de EPKSCDTPPPCPRCP (SEQ ID NO:391).

Los anticuerpos IgA y IgD parecen carecer de una región central similar a IgG, y IgD parece tener dos regiones de bisagra superiores en tándem (véase, SEQ ID NOS:392 y 393). Ejemplos de regiones de bisagra superiores de tipo salvaje que se encuentran en los anticuerpos IgA1 y IgA2 se exponen en SEQ ID NOS:394 y 395, respectivamente.

Los anticuerpos IgE y IgM, en cambio, en lugar de una región bisagra típica tienen una región CH2 con propiedades similares a la bisagra. Ejemplos de secuencias de tipo CH2 de IgE e IgM similares a la bisagra superior de tipo salvaje, se exponen en la SEQ ID NO:396 (VCSRDFTPPT VKILQSSSDG GGHFPPTIQL LCLVSGYTPG TINITWLEDG QVMDVDLSTA STTQEGELAS TQSELTLSQK HWLSDRTYTC QVTYQGHTFE DSTKKCA) y SEQ ID NO:397 (VIAELPPKVS VFVPPRDGFF GNPRKSKLIC QATGFSPRQI QVSWLREGKQ VGSGVTTDQV QAEAKESGPT TYKVTSTLTI KESDWLGQSM FTCRVDHRGL TFQQNASSMC VP), respectivamente.

Una "región bisagra de inmunoglobulina alterada tipo salvaje" o "región bisagra de inmunoglobulina alterada" se refiere a (a) una región bisagra de tipo inmunoglobulina salvaje con cambios de aminoácidos hasta el 30% (por ejemplo, hasta un 25%, 20%, 15%, 10 %, o 5% de sustituciones o deleciones de aminoácidos), (b) una porción de una región bisagra de inmunoglobulina de tipo salvaje que tiene al menos 10 aminoácidos (por ejemplo, al menos 12, 13, 14 ó 15 aminoácidos) de longitud con hasta 30% de cambios de aminoácidos (por ejemplo, hasta un 25%, 20%, 15%, 10%, o 5% de sustituciones o deleciones de aminoácidos), o (c) una porción de una región de bisagra de inmunoglobulina de tipo salvaje que comprende la región bisagra central (cuya porción puede ser de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ó 15, o al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ó 15 aminoácidos de longitud). En determinadas realizaciones, uno o más restos de cisteína en una región bisagra de inmunoglobulina de tipo salvaje pueden estar sustituidos por uno o más restos de otros aminoácidos (por ejemplo, uno o más restos de serina). Una región bisagra de inmunoglobulina alterada puede tener alternativa o adicionalmente, un resto de prolina de una región bisagra de inmunoglobulina tipo salvaje, sustituido por otro resto de aminoácido (por ejemplo, un resto de serina).

Se pueden producir secuencias bisagra y enlazadores alternativos que se pueden utilizar como regiones de conexión, a partir de porciones de receptores de superficie celular que conectan dominios similares a IgV o similares a IgC. Se podrían emplear también como regiones de conexión o péptidos de unión, regiones entre dominios similares a IgV, donde el receptor de la superficie celular contiene varios dominios en tándem similares a IgV, y entre los dominios similares a IgC, donde el receptor de superficie celular contiene múltiples regiones en tándem similares a IgC. En determinadas realizaciones, las secuencias de la bisagra y del enlazador, son de cinco a 60 aminoácidos de longitud, y pueden ser principalmente flexibles, pero también pueden proporcionar características más rígidas, y pueden contener principalmente una estructura α-helicoidal con una estructura mínima en lámina β. Preferiblemente, las secuencias son estables en plasma y suero, y son resistentes a la escisión proteolítica. En algunas realizaciones, las secuencias pueden contener un diseño que aparece de forma natural o un diseño añadido, tal como CPPC (SEQ ID NO:422) que confiere la capacidad para formar un enlace disulfuro o enlaces disulfuro múltiples para estabilizar el C-terminal de la molécula. En otras realizaciones, las secuencias pueden contener uno o más sitios de glicosilación. Ejemplos de secuencias de bisagra y enlazadoras, incluyen regiones de interdominio entre los dominios similares a IgV y similares a IgC, o entre los dominios similares a IgC o los dominios de CD2, CD4, CD22, CD33, CD48, CD58, CD66, CD80, CD86, CD96, CD150, CD166, y CD244 similares a IgV. Se pueden diseñar también bisagras alternativas a partir de las regiones que contienen disulfuro de los receptores Tipo II a partir de miembros de la superfamilia no inmunoglobulina, tales como CD69, CD72, y CD161.

En determinadas realizaciones, un enlazador de la presente invención comprende un enlazador de escorpión. Los enlazadores escorpión incluyen péptidos derivados de regiones interdominio de un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas, por ejemplo, péptidos similares a los de bisagra derivados de regiones de bisagra de inmunoglobulina, tales como regiones bisagra IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA y IgE. En determinadas realizaciones, un enlazador de escorpión de tipo bisagra contendrá al menos una cisteína capaz de formar un enlace disulfuro intercadena en condiciones fisiológicas. Los enlazadores de escorpión derivados de IgG1 pueden tener 1 cisteína o dos cisteínas, y pueden contener la cisteína correspondiente a una cisteína de bisagra N-terminal de IgG1 de tipo salvaje. También se contemplan como enlazadores escorpión los péptidos no bisagra, siempre y cuando tales péptidos proporcionen suficiente espacio y flexibilidad como para proporcionar una proteína monocatenaria capaz de formar dos dominios de unión, uno localizado hacia cada extremo proteico (N y C) en relación con un dominio de sub-región constante localizado más centralmente. Ejemplos de enlazadores de escorpión no bisagra incluyen péptidos a partir de la región del tallo de regiones del tallo de lectina de tipo C de proteínas de membrana Tipo II, tales como las regiones del tallo de CD69, CD72, CD94, NKG2A y NKG2D. En algunas realizaciones, el enlazador escorpión comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:355-359 y 365.

En algunas realizaciones, un enlazador tiene un único resto de cisteína para la formación de un enlace disulfuro intercadena. En otras realizaciones, un enlazador tiene dos restos de cisteína para la formación de enlaces disulfuro intercadena. En otras realizaciones, un enlazador se deriva de una región interdominio de inmunoglobulina (por ejemplo, una región bisagra de anticuerpo) o una región del tallo de lectina tipo C de Tipo II (derivada de una proteína de membrana Tipo Il; véase, por ejemplo, ejemplos de secuencias de región del tallo de lectina expuestos en la Publicación de Solicitud PCT Nº WO 2007/146968, tal como SEQ ID NOS:111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 287, 289, 297, 305, 307, 309-311, 313-331, 346, 373-377, 380, ó 381 partir de esta publicación).

La proteína de fusión multi-específica de esta divulgación tiene un dominio de unión a CD86 unido por un dominio intermedio a un dominio de unión que es un agonista de IL-10.

En determinadas realizaciones, una proteína de fusión multi-específica comprende un primer y un segundo dominio de unión, un primer y segundo enlazador, y un dominio intermedio, en donde un extremo del dominio intermedio se fusiona a través del primer enlazador con un primer dominio de unión que es un dominio de unión a CD86 (por ejemplo, un ectodominio de CTLA4, un ectodominio de CD28, un anti-CD86) y en el otro extremo se fusiona a través del segundo enlazador al agonista de IL-10.

En determinadas realizaciones, el primer enlazador y el segundo enlazador de una proteína de fusión multiespecífica de esta divulgación se seleccionan cada uno independientemente a partir de, por ejemplo, los Enlazadores 1-133 como se proporcionan en SEQ ID NOS:43-166 y los enlazadores proporcionados en SEQ ID NOS:244, 307, 320, 355-379 y 383-398. Por ejemplo, el primer o segundo enlazador puede ser cualquiera de los Enlazadores 47, 58, 126-131 (SEQ ID NOS: 89, 100, y 159-164, respectivamente), o los enlazadores proporcionados en SEQ ID NO: 244 ó 355-379, o cualquier combinación de los mismos. En otros ejemplos, un enlazador es el Enlazador 47 (SEQ ID NO:89) o el Enlazador 132 (SEQ ID NO:165) y el otro enlazador es el enlazador proporcionado en SEQ ID NO:355, o el Enlazador 127 (SEQ ID NO:160) o un enlazador es el Enlazador 58 (SEQ ID NO:100) o el Enlazador 133 (SEQ ID NO:166) y el otro enlazador es el Enlazador 126 (SEQ ID NO:159),

: o un enlazador es el Enlazador 58 (SEQ ID NO:100) o el Enlazador 133 (SEQ ID NO:166) y el otro enlazador es el Enlazador 127 (SEQ ID NO:160), o un enlazador es el Enlazador 58 (SEQ ID NO:100) o el Enlazador 133 (SEQ ID NO:166) y el otro enlazador es el Enlazador 128 (SEQ ID NO:161), o un enlazador es el Enlazador 58 (SEQ ID NO:100) o el Enlazador 133 (SEQ ID NO:166) y el otro enlazador es el Enlazador 129 (SEQ ID NO:162). En otros ejemplos, los dominios de unión de esta divulgación que comprenden dominios VH y VL, tales como los específicos para CD86, pueden tener un enlazador adicional (tercero) entre los dominios VH y VL, tal como el enlazador proporcionado en SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:89, Enlazador 46 (SEQ ID NO:88), Enlazador 130 (SEQ ID NO:163),

: o Enlazador 131 (SEQ ID NO:164). En cualquiera de estas realizaciones, los enlazadores pueden estar flanqueados internamente por uno a cinco aminoácidos adicionales (por ejemplo, el Enlazador 131 tiene una alanina interna a la secuencia central (G4S)), en cada extremo (por ejemplo, el enlazador 130 tiene una serina en el extremo amino de la secuencia central (G4S), o en ambos extremos (por ejemplo, el Enlazador 120 tiene dos aminoácidos (asparaginatirosina) en un extremo, y tres aminoácidos (glicina-asparagina-serina) en el otro extremo de la secuencia central (G4S)), que puede ser simplemente el resultado de la creación de dicha molécula recombinante (por ejemplo, el uso de un sitio de una enzima de restricción particular para unir moléculas de ácido nucleico puede dar como resultado la inserción de uno a varios aminoácidos), y para los propósitos de esta divulgación se puede considerar una parte de cualquier secuencia central de un enlazador particular.

En otras realizaciones, el dominio intermedio de una proteína de fusión multi-específica de esta divulgación está compuesto por una región o sub-región constante de inmunoglobulina, en donde el dominio intermedio está dispuesto entre un dominio de unión a CD86, y un dominio de unión que es un IL-10 agonista. En determinadas realizaciones, el dominio intermedio de una proteína de fusión multi-específica de esta divulgación tiene un dominio de unión a CD86 en el extremo amino, y un dominio de unión que es agonista de IL-10 en el extremo carboxilo. En otras realizaciones, el dominio intermedio de una proteína de fusión multi-específica de esta divulgación tiene un dominio de unión que es un agonista de IL-10, en el extremo amino, y un dominio de unión a CD86 en el extremo carboxilo.

En otras realizaciones, la sub-región de la región constante de inmunoglobulina incluye los dominios CH2 y CH3 de la inmunoglobulina G1 (IgG1). En realizaciones relacionadas, los dominios CH2 y CH3 de IgG1 tienen uno o más de los siguientes aminoácidos mutados (es decir, tienen un aminoácido diferente en esa posición): leucina en la posición 234 (L234), leucina en la posición 235 (L235), glicina en la posición 237 (G237), glutamato en la posición 318 (E318), lisina en la posición 320 (K320), lisina en la posición 322 (K322), o cualquier combinación de los mismos (numeración según Kabat). Por ejemplo, cualquiera de estos aminoácidos se puede cambiar a alanina. En otra realización, según la numeración de Kabat, el dominio CH2 tiene L234, L235 y G237 mutados a una alanina (es decir, L234A, L235A y G237A, respectivamente), y el dominio CH3 de IgG1 tiene E318, K320 y K322 mutados a una alanina (es decir, E318A, K320A, y K322A, respectivamente).

En determinadas realizaciones, una proteína de fusión multi-específica de esta divulgación puede comprender un “módulo pequeño inmunofarmacéutico” (SMIP™). En este sentido, el término SMIP™ se refiere a una clase de compuesto altamente modular que tiene propiedades de fármaco potenciadas frente a anticuerpos monoclonales y recombinantes. Los SMIP comprenden una única cadena polipeptídica que incluye un dominio de unión específico a la diana, basado, por ejemplo, en un dominio variable de anticuerpo, en combinación con una región FC variable que permite el reclutamiento específico de una clase deseada de células efectoras (tales como, por ejemplo, macrófagos y células asesinas naturales (NK)) y/o el reclutamiento de células asesinas mediadas por el complemento. Según la elección de las regiones bisagra y diana, los SMIPs pueden señalizar o bloquear la señalización a través de receptores de superficie celular. Como se emplea en la presente memoria, las proteínas de fusión genéticamente modificadas, denominadas “módulos pequeños inmunofarmacéuticos" o "productos SMIP™", se describen en las Publicaciones de Patente US NOS 2003/133939, 2003/0118592, y 2005/0136049, y las Publicaciones de Patente Internacional WO02/056910, WO2005/037989, y WO2005/017148.

En algunas realizaciones, una proteína de fusión multi-específica puede comprender una molécula de PIMS tal como las descritas en la Publicación de Patente US Nº 2009/0148447 y la Publicación de Patente Internacional WO2009/023386.

En determinadas realizaciones, las proteínas de fusión muti-específicas de la invención se pueden modificar genéticamente con diferentes afinidades de los extremos frontal y final, con el fin de dirigirse a tipos de células específicas. Por ejemplo, el uso de un dominio de unión anti-CD86 (por ejemplo, 3D1, FUN1 o variantes humanizadas de los mismos) que tiene una afinidad mayor por CD86 que el que un agonista de IL10 modificado genéticamente (por ejemplo, que tiene una mutación I87A o I87S, o una estructura monoIL10) tiene para huIL10R1, y se puede usar la combinación de tales moléculas en una molécula exceptora de esta divulgación para favorecer la selección de un tipo de célula específico de interés, tal como células presentadoras de antígeno (APCs). A este respecto, se pueden preparar proteínas de fusión que tienen mayor o menor afinidad por CD86 o afinidad superior o inferior por cualquiera de las proteínas diana heterólogas descritas en la presente memoria, dependiendo del tipo de célula diana deseada. En realizaciones preferidas, el dominio de unión al antagonista de CD86 se dirige preferentemente a la molécula exceptora específica de múltiples diana hacia las APCs al tener una afinidad mayor por CD86 que la que tiene el dominio de unión heterólogo por su pareja de unión.

En algunas realizaciones, una proteína de fusión multi-específica de esta divulgación tiene un dominio de unión a CD86 que comprende un dominio o sub-dominio extracelular de CTLA4, un dominio o sub-dominio extracelular de CD28, o un dominio de unión derivado de anticuerpo específico de CD86. En determinadas realizaciones, un dominio de unión derivado de anticuerpo específico de CD86 se deriva del anticuerpo monoclonal FUN1 (véase, por ejemplo, J. Pathol., 1993 Mar;169(3):309-15); o derivado del anticuerpo monoclonal 3D1 anti-CD86. En determinadas realizaciones, un dominio de unión a CD86 es una sCTLA4, tal como la secuencia polipeptídica madura de SEQ ID NO:1. En determinadas realizaciones, el dominio de unión a CD86 es una sCTLA4, tal como la secuencia de SEQ ID NO:1 o un dominio de tipo variable de CTLA4, tal como SEQ ID NO:3, o un sub-dominio de la misma. En otras realizaciones, un dominio de unión a CD86 es una sCD28, tal como la secuencia polipeptídica madura de SEQ ID NO:2 (péptido señal: 1-18 aminoácidos). En otras realizaciones, el dominio de unión a CD86 comprende dominios variables de cadena ligera y pesada de FUN1 (por ejemplo, SEQ ID NOS:305 y 306) o 3D1 (por ejemplo, SEQ ID NOS:318 y 319), preferiblemente en la forma de un scFv.

En otras realizaciones, una proteína de fusión multi-específica de esta divulgación tiene un dominio de unión a CD86 y un dominio de unión heterólogo que es un agonista de IL-10 (véase, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos del dominio de unión heterólogo proporcionado en SEQ ID NO:7).

Ejemplos de estructuras de tales proteínas de fusión multi-específicas, referidas en la presente memoria como moléculas exceptoras, incluyen N-BD1-ID-BD2-C, N-BD2-ID-BD1-C, en donde N y C representan el extremo amino y el extremo carboxilo, respectivamente; BD1 es un dominio de unión a CD86, tal como uno similar a inmunoglobulina

o un dominio de unión de una región variable similar a inmunoglobulina, o un ectodominio; X es un dominio intermedio, y BD2 es un dominio de unión que es un agonista de IL-10. En algunas construcciones, X puede comprender una región o sub-región constante de inmunoglobulina dispuesta entre el primer y segundo dominio de unión. En algunas realizaciones, una proteína de fusión multi-específica de esta divulgación tiene un dominio intermedio (X) que comprende, desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo, una estructura como la que sigue: -L1-X-L2-, en donde L1 y L2 son cada uno independientemente un enlazador que comprende de dos a aproximadamente 150 aminoácidos; y X es una región o sub-región constante de inmunoglobulina. En otras realizaciones, la proteína de fusión multi-específica tendrá un dominio intermedio que es albúmina, transferrina u otra proteína de unión a proteína sérica, en donde la proteína de fusión permanece principalmente o sustancialmente como un polipéptido monocatenario en una composición.

Ejemplos de secuencias de aminoácidos de proteínas de fusión exceptoras se proporcionan en SEQ ID NOS:9, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 209, 211, 213, 215, 219, 221, 223, 237, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 276, 302, 330, 334, 350, 352 y 354; codificado por las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en SEQ ID NOS: 8, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 208, 210, 212, 214, 218, 220, 222, 236, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 275, 301, 329, 333, 349, 351, y 353, respectivamente.

En otras realizaciones, una proteína de fusión multi-específica de esta divulgación tiene la siguiente estructura: NBD1-X-L2-BD2-C, en la que BD1 es un dominio de unión a CD86, tal como un dominio de unión que es al menos aproximadamente 90% idéntico a un ectodominio de CTLA4; -X-es -L1-CH2CH3-, en donde L1 es una primera bisagra de IgG1, opcionalmente mutada al sustituir la primera o segunda cisteína, y en donde -CH2CH3-es la región CH2CH3 de un dominio Fc de IgG1; L2 es un enlazador seleccionado de SEQ ID NOS:43-166, 244, 307, 320, 355379 y 383-398; y BD2 es un dominio de unión que es un agonista de IL-10 descrito en la presente memoria.

En realizaciones particulares, una proteína de fusión exceptora multi-específica tiene (a) un dominio de unión a CD86 que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o al menos 100 % idéntica a una secuencia polipeptídica madura de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2, y (b) un dominio de unión que es un agonista de IL-10, que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o al menos 100% idéntica a una secuencia polipeptídica madura correspondiente de las proteínas de unión heterólogas anteriormente mencionadas como se proporciona en SEQ ID NO:7), en donde, desde el

extremo amino al extremo carboxilo o desde el extremo carboxilo al extremo amino, (i) un dominio de unión a CD86 de (a) o un dominio de unión de (b) se fusiona con un primer enlazador, (ii) el primer enlazador se fusiona con un región de CH2 y CH3 constante de la cadena pesada de inmunoglobulina como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO:409 y 415-417, (iii) el polipéptido de la región constante CH2CH3 se fusiona con un segundo enlazador, y (iv) el segundo enlazador se fusiona con un dominio de unión a CD86 de (a) o a un dominio de unión de (b). En determinadas realizaciones, el primer enlazador es el Enlazador 47 (SEQ ID NO:89), el Enlazador 132 (SEQ ID NO:165) o el Enlazador 133 (SEQ ID NO:166), el segundo enlazador es uno cualquiera de los Enlazadores 126-129 (SEQ ID NOS:159-162), y un enlazador adicional (tercero) entre los dominios VH y VL del dominio de unión a CD86 es el Enlazador 130 (SEQ ID NO:163) o el Enlazador 131 (SEQ ID NO:164).

Ejemplos de secuencias de aminoácidos de proteínas de fusión exceptoras se proporcionan en SEQ ID NOS:9, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 209, 211, 213, 215, 219, 221, 223, 237, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 276, 302, 330, 334, 350, 352, y 354; codificado por las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en SEQ ID NOS: 8, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 208, 210, 212, 214, 218, 220, 222, 236, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 275, 301, 329, 333, 349, 351 y 353, respectivamente.

Fabricación de proteínas de fusión multi-específicas

Para producir de manera eficiente cualquiera de los polipéptidos de dominio de unión o proteínas de fusión descritos en la presente memoria, se usa un péptido líder para facilitar la secreción de las proteínas de fusión y los polipéptidos expresados. Se espera que el uso de cualquiera de los péptidos líder convencionales (secuencias señal) dirija a los polipéptidos o a las proteínas de fusión expresados de manera encipiente a una ruta secretora, y produzca la escisión del péptido líder del polipéptido maduro o proteína de fusión en la unión o cerca de la unión entre el péptido líder y el polipéptido o la proteína de fusión. Se elegirá un péptido líder en particular en base a consideraciones conocidas en la técnica, tales como el uso de secuencias codificadas por polinucleótidos que permiten la fácil inserción de endonucleasa en sitios de escisión al principio o al final de la secuencia codificante para el péptido líder para facilitar la ingeniería molecular, siempre que tales secuencias introduzcan aminoácidos específicos que, o bien no dificulten inaceptablemente cualquier procesamiento deseado del péptido líder de la proteína expresada de manera incipiente, o bien no dificulten inaceptablemente cualquier función deseada de una molécula de polipéptido o proteína de fusión si el péptido líder no se escinde durante la maduración de los polipéptidos o proteínas de fusión. Ejemplos de péptidos líder de esta divulgación incluyen secuencias líder naturales (es decir, los expresados con la proteína nativa) o el uso de secuencias líder heterólogas, tales como H3N-MDFQVQIFSFLLISASVIMSRG(X)n-CO2H, en donde X es cualquier aminoácido, y n es de cero a tres (SEQ ID NOS:167, 419, 420 y 421) o H3N-MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG-CO2H (SEQ ID NO:168).

Como se indica en la presente memoria, se contemplan variantes y derivados de dominios de unión, tales como ectodominios, regiones variables ligeras y pesadas, y CDRs descritas en la presente memoria. En un ejemplo, se proporcionan variantes de inserción en las que uno o más restos de aminoácidos complementan una secuencia de aminoácidos de un agente de unión específico. Las inserciones se pueden localizar en uno o en ambos extremos de la proteína, o se pueden posicionar dentro de las regiones internas de la secuencia de aminoácidos del agente de unión específico. Los productos variantes de esta divulgación también incluyen productos de agentes de unión maduros específicos, es decir, productos de agentes de unión específicos en donde se elimina una secuencia líder o señal, y la proteína resultante tiene restos amino terminales adicionales. Los restos amino terminales adicionales se pueden derivar de otra proteína, o pueden incluir uno o más restos que no son identificables como derivados de una proteína específica. Se contemplan polipéptidos con un resto de metionina adicional en la posición -1, como lo son los polipéptidos de esta divulgación con restos de metionina y lisina adicionales en las posiciones -2 y -1. Las variantes que tienen restos Met, Met-Lys, o Lys adicionales (o uno o más restos básicos en general) son particularmente útiles para la producción mejorada de proteína recombinante en células huésped bacterianas.

Como se emplea en la presente memoria, "aminoácidos" se refiere a un aminoácido natural (los que se encuentran en la naturaleza), un aminoácido natural sustituido, un aminoácido no natural, un aminoácido no natural sustituido, o cualquier combinación de los mismos. Las designaciones para aminoácidos naturales se establecen en la presente memoria como el código estándar de una o tres letras. Los aminoácidos polares naturales incluyen asparagina (Asp

: o N) y glutamina (Gln o Q); así como aminoácidos básicos tales como arginina (Arg o R), lisina (Lys o K), histidina (His o H), y derivados de los mismos; y aminoácidos ácidos tales como ácido aspártico (Asp o D) y ácido glutámico (Glu o E), y derivados de los mismos. Los aminoácidos hidrofóbicos naturales incluyen triptófano (Trp o W), fenilalanina (Phe o F), isoleucina (Ile o I), leucina (Leu o L), metionina (Met o M), valina (VaI o V), y derivados de los mismos; así como otros aminoácidos no polares tales como glicina (Gly o G), alanina (Ala o A), prolina (Pro o P), y derivados de los mismos. Los aminoácidos naturales de polaridad intermedia incluyen serina (Ser o S), treonina (Thr

: o T), tirosina (Tyr o Y), cisteína (Cys o C), y derivados de los mismos. A menos que se especifique de otra manera, cualquier aminoácido descrito en la presente memoria puede estar en la configuración D o L.

Las variantes de sustitución incluyen aquellas proteínas de fusión en donde uno o más restos de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos, se eliminan y reemplazan con restos alternativos. En algunas realizaciones, las sustituciones son de naturaleza conservadora; sin embargo, esta divulgación abarca sustituciones que también son no conservadoras. Los aminoácidos se pueden clasificar según las propiedades físicas y la contribución a la estructura secundaria y terciaria de la proteína. Una sustitución conservadora se reconoce en la técnica como una

sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades similares. En la Tabla 1 de a continuación se exponen ejemplos de sustituciones conservadoras (véase WO 97/09433, página 10, publicado el 13 de marzo de 1997).

Tabla 1. Sustituciones Conservadoras I

Cadena Lateral: Característica Aminoácido

No-polar: G, A, P, I, L, V

Alifática: Polar -sin carga S, T, M, N, Q

Polar-cargada: D, E, K, R

Aromática: H, F, W, Y

Otra: N, Q, D, E

Alternativamente, los aminoácidos conservadores se pueden agrupar como se describe en Lehninger (Biochemistry, Segunda Edición, Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp.71-77) como se expone en la Tabla 2 de a continuación.

Tabla 2. Sustituciones Conservadoras II

Cadena Lateral: Característica Aminoácido

No polar (hidrofóbica): Alifática A, L, I, V, P

Aromática: F, W

Que contiene azufre: M

Dudosa: G

Sin carga-polar: Hidroxilo S, T, Y

Amidas: N, Q

Sulfhidrilo: C

Dudosa: G

Cargada positivamente (Básica): K, R, H

Cargada Negativamente (Ácida): D, E

Las variantes o derivados también pueden tener restos de aminoácidos adicionales que surgen del uso de sistemas de expresión específicos. Por ejemplo, el uso de vectores disponibles comercialmente que expresan un polipéptido

10 deseado como parte de un producto de fusión de glutatión-S-transferasa (GST) proporciona el polipéptido deseado que tiene un resto de glicina adicional en la posición -1 después de la escisión del componente GST del polipéptido deseado. También se contemplan variantes que resultan de la expresión en otros sistemas vector, que incluyen aquellas en donde se incorporan marcadores de histidina en la secuencia de aminoácidos, generalmente en el extremo carboxilo y/o amino de la secuencia.

15 También se contemplan variantes de deleción en donde se eliminan uno o más restos de aminoácidos en un dominio de unión de esta divulgación. Las deleciones se pueden efectuar en uno o en ambos extremos de la proteína de fusión, o a partir de la eliminación de uno o más restos dentro de la secuencia de aminoácidos.

En ciertas realizaciones ilustrativas, las proteínas de fusión de esta divulgación están glicosiladas, dependiendo el patrón de glucosilación de una variedad de factores que incluyen la célula hospedadora en la que se expresa la

20 proteína (si se prepara en células hospedadoras recombinantes) y las condiciones de cultivo.

Esta divulgación también proporciona derivados de proteínas de fusión. Los derivados incluyen polipéptidos de dominio de unión específica que llevan modificaciones distintas a la inserción, deleción o sustitución de restos de aminoácidos. En determinadas realizaciones, las modificaciones son de naturaleza covalente e incluyen, por ejemplo, enlaces químicos con polímeros, lípidos, y otros restos orgánicos e inorgánicos. Los derivados de esta

25 divulgación se pueden preparar para aumentar la semivida en circulación de un polipéptido de dominio de unión específico, o se pueden diseñar para mejorar la capacidad de dirección del polipéptido a las células, tejidos u órganos deseados.

Esta divulgación abarca además proteínas de fusión que se modifican o derivatizan covalentemente para incluir una

o más uniones de polímero solubles en agua, tales como polietilenglicol, polioxietilenglicol, o polipropilenglicol, como se describe en las Patentes de EE.UU. Nos: 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 y 4.179.337. Otros polímeros útiles conocidos en la técnica incluyen monometoxi-polietilenglicol, dextrano, celulosa, y otros polímeros basados en carbohidratos, poli-(N-vinilpirrolidona) polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) y alcohol polivinílico, así como mezclas de estos polímeros. Son particularmente preferidas las proteínas derivatizadas con polietilenglicol (PEG). Los polímeros solubles en agua se pueden unir en posiciones específicas, por ejemplo en el extremo amino de las proteínas y polipéptidos según esta divulgación, o se pueden unir aleatoriamente a una o más cadenas laterales del polipéptido. El uso de PEG para mejorar las capacidades terapéuticas se describe en la Patente US. Nº 6.133.426.

Una realización particular de esta divulgación es una inmunoglobulina o una proteína de fusión Fc. Dicha proteína de fusión puede tener una semivida larga, por ejemplo, varias horas, un día o más, o incluso una semana o más, especialmente si el dominio Fc es capaz de interactuar con FcRn, el receptor de Fc neonatal. El sitio de unión para FcRn en un dominio Fc es también el sitio en el que se unen las proteínas bacterianas A y G. La fuerte unión entre estas proteínas se puede usar como un medio para purificar anticuerpos o proteínas de fusión de esta divulgación, por ejemplo, empleando cromatografía de afinidad de proteína A o proteína G durante la purificación de proteínas.

Las técnicas de purificación de proteínas son bien conocidas por los expertos en la técnica. Estas técnicas implican, en un nivel, el fraccionamiento crudo de las fracciones polipeptídicas y no polipeptídicas. Con frecuencia se desea una purificación adicional empleando técnicas cromatográficas y electroforéticas para lograr la purificación parcial o completa (o purificación para homogeneidad). Los métodos analíticos particularmente adecuados para la preparación de una proteína de fusión pura son la cromatografía de intercambio iónico; cromatografía de exclusión; electroforesis en gel de poliacrilamida; y enfoque isoeléctrico. Los métodos particularmente eficaces para purificar péptidos son la cromatografía líquida de proteínas rápida y la HPLC.

Determinados aspectos de la presente divulgación se refieren a la purificación, y en realizaciones particulares, a la purificación sustancial de una proteína de fusión. El término "proteína de fusión purificada" como se emplea en la presente memoria, se refiere a una composición, aislable de otros componentes, en donde la proteína de fusión se purifica en cualquier grado en relación a su estado que se puede obtener de forma natural. Por lo tanto, una proteína de fusión purificada también se refiere a una proteína de fusión, libre del entorno en el que puede aparecer de forma natural.

Generalmente, "purificada" se referirá a una composición de proteína de fusión que se ha sometido a fraccionamiento para eliminar otros componentes, y cuya composición conserva sustancialmente su actividad biológica expresada. Cuando se emplea el término "sustancialmente purificada", esta designación se refiere a una composición de proteína de unión de fusión en la que la proteína de fusión forma el componente principal de la composición, tal como constituir aproximadamente el 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 99% o más de la proteína, en peso, en la composición.

Varias métodos adecuados para cuantificar el grado de purificación son conocidos por los expertos en la técnica a la luz de la presente divulgación. Estos incluyen, por ejemplo, determinar la actividad de unión específica de una fracción activa, o evaluar la cantidad de proteína de fusión en una fracción por análisis SDS/PAGE. Un método preferido para evaluar la pureza de una fracción de proteína es calcular la actividad de unión de la fracción, compararla con la actividad de unión del extracto inicial, y así calcular el grado de purificación, evaluado en la presente memoria mediante un "número de purificación múltiple". Las unidades reales usadas para representar la cantidad de actividad de unión dependerán, por supuesto, de la técnica de ensayo particular elegida para seguir la purificación, y de si la proteína de fusión expresada muestra o no una actividad de unión detectable.

Diversas técnicas adecuadas para emplear en la purificación de proteínas son bien conocidas por los expertos en la técnica. Estas incluyen, por ejemplo, la precipitación con sulfato de amonio, PEG, anticuerpos, o por desnaturalización por calor, seguido de centrifugación; etapas de cromatografía, tales como intercambio iónico, filtración en gel, fase inversa, hidroxiapatita, y cromatografía de afinidad; enfoque isoeléctrico; electroforesis en gel; y combinaciones de estas y otras técnicas. Como se conoce generalmente en la técnica, se cree que el orden de llevar a cabo las diversas etapas de purificación se puede cambiar, o que se pueden omitir ciertas etapas, y todavía se da como resultado un método adecuado para la preparación de una proteína sustancialmente purificada.

No existe un requisito general para que la proteína de fusión siempre se proporcione en su estado más purificado. De hecho, se contempla que las proteínas sustancialmente menos purificadas tendrán utilidad en determinadas realizaciones. La purificación parcial se puede lograr empleando menos etapas de purificación en combinación, o utilizando diferentes formas del mismo esquema de purificación general. Por ejemplo, se aprecia que una cromatografía en columna de intercambio catiónico realizada utilizando un aparato de HPLC generalmente dará como resultado una mayor purificación que la misma técnica que utiliza un sistema de cromatografía de baja presión. Los métodos que presentan un menor grado de purificación relativa pueden tener ventajas en la recuperación total del producto proteico, o en el mantenimiento de la actividad de unión de una proteína expresada.

Se sabe que la migración de un polipéptido puede variar, a veces significativamente, con diferentes condiciones de SDS/PAGE (Capaldi et al. (1977) Biochem. Biophys. Res. Comm. 76:425). Por lo tanto, se apreciará que bajo diferentes condiciones de electroforesis, los pesos moleculares aparentes de los productos de expresión de la proteína de fusión, purificados o parcialmente purificados, pueden variar.

Polinucleótidos, vectores de expresión, y células hospedadoras

Esta divulgación proporciona polinucleótidos (polinucleótidos aislados o purificados o puros) que codifican la proteína de fusión multi-específica de esta divulgación, vectores (que incluyen vectores de clonación y vectores de expresión) que comprenden tales polinucleótidos, y células (por ejemplo, células hospedadoras) transformadas o transfectadas con un polinucleótido o vector según esta divulgación.

En determinadas realizaciones, se contempla un polinucleótido (ADN o ARN) que codifica un dominio de unión de esta divulgación, o una proteína de fusión multi-específica que contiene uno o más de tales dominios de unión. Los casetes de expresión que codifican construcciones de proteínas de fusión multi-específicas se proporcionan en los ejemplos adjuntos.

La presente divulgación también se refiere a vectores que incluyen un polinucleótido de esta divulgación y, en particular, a construcciones de expresión recombinantes. En una realización, esta divulgación contempla un vector que comprende un polinucleótido que codifica una proteína de fusión multi-específica que contiene un dominio de unión a CD86 y un dominio agonista de IL-10 de esta divulgación, junto con otras secuencias de polinucleótidos que causan o facilitan la transcripción, traducción, y procesamiento de tales secuencias de codificación de proteínas de fusión multi-específicas.

Se describen vectores de clonación y expresión apropiados para usar con huéspedes procariotas y eucariotas, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, NY, (1989). Ejemplos de vectores de clonación/expresión incluyen vectores de clonación, vectores lanzadera y construcciones de expresión, que pueden estar basados en plásmidos, fagémidos, fásmidos, cósmidos, virus, cromosomas artificiales o cualquier vehículo de ácido nucleico conocido en la técnica adecuado para la amplificación, transferencia, y/o expresión de un polinucleótido contenido en ella.

Como se emplea en la presente memoria, "vector" significa una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Ejemplos de vectores incluyen plásmidos, cromosomas artificiales de levadura, y genomas virales. Ciertos vectores pueden replicarse de forma autónoma en una célula hospedadora, mientras que otros vectores pueden integrarse en el genoma de una célula hospedadora y, de ese modo, replicarse con el genoma huésped. Además, ciertos vectores se denominan en la presente memoria "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente, "vectores de expresión"), que contienen secuencias de ácido nucleico que están operativamente unidas a una secuencia de control de la expresión y, por lo tanto, son capaces de dirigir la expresión de esas secuencias.

En determinadas realizaciones, las construcciones de expresión se derivan de vectores plasmídicos. Construcciones ilustrativas incluyen un vector pNASS modificado (Clontech, Palo Alto, CA), que tiene secuencias de ácido nucleico que codifican un gen de resistencia a ampicilina, una señal de poliadenilación, y un sitio promotor de T7; pDEF38 y pNEF38 (CMC ICOS Biologics, Inc.), que tienen un promotor CHEF1; y pD18 (Lonza), que tiene un promotor CMV. Otros vectores de expresión de mamífero adecuados son bien conocidos (véase, por ejemplo, Ausubel et al., 1995; Sambrook et al., supra; véase también, por ejemplo, catálogos de Invitrogen, San Diego, CA; Novagen, Madison, Wl; Pharmacia, Piscataway, NJ). Se pueden preparar construcciones útiles que incluyen una secuencia que codifica dihidrofolato reductasa (DHFR) bajo control regulador adecuado, para promover niveles de producción mejorados de las proteínas de fusión, cuyos niveles resultan de la amplificación génica después de la aplicación de un agente de selección apropiado (por ejemplo, metotrexato).

Generalmente, los vectores de expresión recombinantes incluirán orígenes de replicación y marcadores seleccionables que permiten la transformación de la célula hospedadora, y un promotor derivado de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural transformadora, como se describió anteriormente. Un vector en enlace operable con un polinucleótido según esta divulgación produce una construcción de clonación o expresión. Ejemplos de construcciones de clonación/expresión que contienen al menos un elemento de control de la expresión, por ejemplo, un promotor, unido operativamente a un polinucleótido de esta divulgación. Se contemplan también elementos de control de expresión adicionales, tales como potenciadores, sitios de unión específicos de factor, terminadores, y sitios de unión a ribosoma, en los vectores y construcciones de clonación/expresión según esta divulgación. La secuencia estructural heteróloga del polinucleótido según esta divulgación se ensambla en la fase apropiada con las secuencias de iniciación y terminación de la traducción. Por lo tanto, por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican la proteína de fusión como se proporcionan en la presente memoria, se pueden incluir en cualquier variedad de construcciones de vectores de expresión como una construcción de expresión recombinante para expresar dicha proteína en una célula huésped.

La secuencia o secuencias de ADN apropiadas pueden insertarse en un vector, por ejemplo, mediante una variedad de procedimientos. En general, una secuencia de ADN se inserta en un sitio o sitios de escisión de endonucleasa de

restricción apropiados mediante procedimientos conocidos en la técnica. Se contemplan técnicas estándar para la clonación, aislamiento de ADN, amplificación y purificación, para reacciones enzimáticas que implican ADN ligasa, ADN polimerasa, endonucleasas de restricción, y diversas técnicas de separación. Se describen varias técnicas estándar, por ejemplo, en Ausubel et al.(Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley e Hijos, Inc., Boston, MA, 1993); Sambrook et al.(Molecular Cloning, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY, 1989); Maniatis et al.(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY, 1982); Glover (Ed.) (DNA Cloning Vol. I y II, IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1985); Hames y Higgins (Eds.) (Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1985); y en otros lugares.

La secuencia de ADN en el vector de expresión está operativamente unida a al menos una secuencia de control de la expresión apropiada (por ejemplo, un promotor constitutivo o un promotor regulado) para dirigir la síntesis de ARNm. Ejemplos representativos de tales secuencias de control de la expresión incluyen promotores de células eucariotas o sus virus, como se describió anteriormente. Las regiones promotoras se pueden seleccionar a partir de cualquier gen deseado usando vectores CAT (cloranfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables. Los promotores eucarióticos incluyen CMV temprano inmediato, timidina quinasa de HSV, SV40 temprano y tardío, LTRs de retrovirus, y metalotioneína-I de ratón. La selección del vector y promotor apropiados, y la preparación de ciertas construcciones de expresión recombinantes particularmente preferidas que comprenden al menos un promotor o un promotor regulado operativamente unido a un ácido nucleico que codifica una proteína o polipéptido según la divulgación que se describe en la presente memoria, están dentro del nivel de los expertos en la técnica.

Se contemplan también las variantes de los polinucleótidos de esta divulgación. Los polinucleótidos variantes son al menos 90%, y preferiblemente 95%, 99%, o 99,9% idénticos a uno de los polinucleótidos de secuencia definida como se describe en la presente memoria, o que se hibrida con uno de esos polinucleótidos de secuencia definida bajo condiciones de hibridación rigurosas de cloruro de sodio 0,015M, citrato de sodio 0,0015 M a aproximadamente 65-68ºC o cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M, y formamida al 50% a aproximadamente 42ºC. Las variantes de polinucleótidos conservan la capacidad de codificar un dominio de unión o proteína de fusión del mismo teniendo la funcionalidad descrita en la presente memoria.

El término "riguroso" se usa para referirse a condiciones que se entienden comúnmente en la técnica como rigurosas. La rigurosidad de la hibridación se determina principalmente por la temperatura, la fuerza iónica, y la concentración de agentes desnaturalizantes, tales como formamida. Ejemplos de condiciones restrictivas para la hibridación y el lavado son cloruro sódico 0,015 M, citrato sódico 0,0015 M a aproximadamente 65-68ºC o cloruro sódico 0,015 M, citrato sódico 0,0015 M, y formamida al 50% a aproximadamente 42ºC (véase Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y, 1989).

También se pueden usar condiciones más rigurosas (tales como temperatura más alta, fuerza iónica más baja, formamida más alta, u otro agente desnaturalizante); sin embargo, la tasa de hibridación se verá afectada. En casos en donde se refiere a la hibridación de desoxioligonucleótidos, ejemplos de las condiciones de hibridación rigurosas adicionales incluyen lavado en 6x SSC, pirofosfato de sodio 0,05% a 37ºC (para oligonucleótidos de 14 bases), 48ºC (para oligonucleótidos de 17 bases), 55ºC (para oligonucleótidos de 20 bases), y 60ºC (para oligonucleótidos de 23 bases).

Un aspecto adicional de esta divulgación proporciona una célula hospedadora transformada o transfectada con, o que contiene de otro modo, cualquiera de los polinucleótidos o construcciones de clonación/expresión de esta divulgación. Los polinucleótidos o construcciones de clonación/expresión de esta divulgación se introducen en células adecuadas empleando cualquier método conocido en la técnica, que incluye la transformación, transfección y transducción. Las células hospedadoras incluyen las células de un sujeto sometidas a terapia celular ex vivo que incluye, por ejemplo, la terapia génica ex vivo. Las células hospedadoras eucarióticas contempladas como un aspecto de esta divulgación cuando albergan un polinucleótido, vector, o proteína según esta divulgación incluyen, además de las propias células del sujeto (por ejemplo, células de un paciente humano), células VERO, células HeLa, líneas celulares de ovario (CHO) de hámster chino (que incluyen células CHO modificadas capaces de modificar el patrón de glicosilación de moléculas de unión multivalentes expresadas, véase la Publicación de Solicitud de Patente US Nº 2003/0115614), células COS (tales como COS-7), W138, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562, células HEK293, células HepG2, células N, células 3T3, células de Spodoptera frugiperda (por ejemplo, células Sf9), células de Saccharomyces cerevisiae, y cualquier otra célula eucariota conocida en la técnica como útil para expresar, y opcionalmente aislar, una proteína o péptido según esta divulgación. También se contemplan las células procariotas, que incluyen Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, un Streptomycete, o cualquier célula procariota conocida en la técnica que sea adecuada para expresar, y opcionalmente aislar, una proteína o péptido según esta divulgación. Al aislar proteína o péptido de células procariotas se contempla, en particular, que se puedan emplear técnicas conocidas en la técnica para extraer proteína a partir de cuerpos de inclusión. La selección de un huésped apropiado está dentro del alcance de los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente memoria. Se contemplan células hospedadoras que glicosilan las proteínas de fusión de esta divulgación.

El término "célula hospedadora recombinante" (o simplemente "célula hospedadora") se refiere a una célula que contiene un vector de expresión recombinante. Debe entenderse que tales términos están destinados a referirse no

sólo a la célula objeto particular, sino también a la progenie de tal célula. Ya que en generaciones sucesivas pueden aparecer ciertas modificaciones debido bien a la mutación o bien a influencias ambientales, tal progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula parental, pero todavía están incluidas dentro del alcance del término "célula hospedadora" como se emplea en la presente memoria.

Las células hospedadoras recombinantes pueden cultivarse en un medio nutritivo convencional modificado según sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes, o amplificar genes particulares. Las condiciones de cultivo para células hospedadoras particulares seleccionadas para la expresión, tales como la temperatura, pH, serán fácilmente evidentes para el experto en la técnica. Se pueden emplear también diversos sistemas de cultivo de células de mamífero para expresar proteína recombinante. Ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñón de mono, descritos por Gluzman (1981) Cell 23:175, y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo, C127, 3T3, CHO, HeLa y líneas celulares BHK. Los vectores de expresión de mamíferos comprenderán un origen de replicación, un promotor adecuado y, opcionalmente, un potenciador, y también cualquier sitio de unión a ribosoma necesario, sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de empalme, secuencias de terminación transcripcional, y secuencias no transcritas flanqueantes en 5', por ejemplo, como se describe en la presente memoria con respecto a la preparación de construcciones de expresión de proteína de unión multivalente. Las secuencias de ADN derivadas del empalme de SV40, y los sitios de poliadenilación se pueden usar para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos. La introducción de la construcción en la célula hospedadora puede efectuarse mediante una diversidad de métodos con los que los expertos en la técnica estarán familiarizados, incluida la transfección con fosfato cálcico, la transfección mediada por DEAE-dextrano, o la electroporación (Davis et al., (1986) Basic Methods in Molecular Biology).

En una realización, una célula hospedadora es transducida mediante una construcción viral recombinante que dirige la expresión de una proteína o polipéptido según esta divulgación. La célula hospedadora transducida produce partículas virales que contienen proteínas expresadas o polipéptidos derivados de porciones de una membrana de la célula hospedadora incorporada por las partículas virales durante la gemación viral.

Composiciones y Usos Médicos

Para tratar mamíferos humanos o no humanos que padecen un estado de enfermedad asociado con la desregulación de CD86 o IL-10, se administra al sujeto una proteína de fusión multi-específica de esta divulgación en una cantidad que es eficaz para mejorar los síntomas del estado de la enfermedad siguiendo un curso de una o más administraciones. Al ser polipéptidos, las proteínas de fusión multi-específicas de esta divulgación se pueden suspender o disolver en un diluyente aceptable farmacéuticamente, que incluye opcionalmente un estabilizante de otros excipientes aceptables farmacéuticamente, que pueden usarse para administración intravenosa mediante inyección o infusión, como se analiza más detalladamente a continuación.

Una dosis eficaz farmacéuticamente es la dosis requerida para prevenir, inhibir la aparición de, o tratar (aliviar un síntoma hasta cierto punto, preferiblemente todos los síntomas) un estado de enfermedad. La dosis eficaz farmacéuticamente depende del tipo de enfermedad, la composición utilizada, la vía de administración, el tipo de sujeto que se trata, las características físicas del sujeto específico bajo consideración para el tratamiento, la medicación simultánea, y otros factores que los expertos en la técnica médica reconocerán. Por ejemplo, se puede administrar una cantidad entre 0,1 mg/kg y 100 mg/kg de peso corporal (que puede administrarse como una dosis única, o en dosis múltiples administradas por hora, diariamente, semanalmente, mensualmente, o cualquier combinación de las mismas que esté en un intervalo apropiado) de ingrediente activo dependiendo de la potencia de un polipéptido de dominio de unión o fusión de proteína multi-específica de esta divulgación.

En determinados aspectos, las composiciones de las proteínas de fusión se proporcionan mediante esta divulgación. Las composiciones farmacéuticas de esta divulgación generalmente comprenden uno o más tipos de dominio de unión o proteína de fusión en combinación con un vehículo, excipiente o diluyente aceptable farmacéuticamente. Tales vehículos no serán tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas. Los vehículos aceptables farmacéuticamente para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica, y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R Gennaro (Ed.) 1985). Por ejemplo, se puede usar solución salina estéril y solución salina tamponada con fosfato a pH fisiológico. Se pueden proporcionar conservantes, estabilizantes, colorantes y similares en la composición farmacéutica. Por ejemplo, se pueden añadir benzoato de sodio, ácido sórbico, o ésteres de ácido p-hidroxibenzoico como conservantes. Id. en 1449. Además, se pueden usar antioxidantes y agentes de suspensión. Id. Los compuestos de la presente invención se pueden usar bien en forma de base libre o de sal, considerándose ambas formas dentro del alcance de la presente invención.

Las composiciones farmacéuticas también pueden contener diluyentes tales como tampones; antioxidantes, tales como ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos), proteínas, aminoácidos, carbohidratos (por ejemplo, glucosa, sacarosa, o dextrinas), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), glutatión u otros estabilizadores o excipientes. Son ejemplos de diluyentes apropiados la solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con albúmina sérica no específica. Preferiblemente, el producto se formula como un liofilizado usando soluciones de excipientes apropiadas como diluyentes.

Las composiciones de esta divulgación se pueden usar para tratar estados de enfermedad en mamíferos humanos y no humanos que son resultado de, o están asociados con la desregulación de CD86 o IL-10. Como se discutió anteriormente, se ha demostrado que el bloqueo de la unión de CD86 a CD28, por ejemplo mediante la administración de CTLA4Ig, es eficaz en el tratamiento de trastornos autoinmunes, tales como la artritis reumatoide. Se sabe que IL10 tiene propiedades inmunosupresoras (Commins et al. (2008) J. Allergy Clin. Immunol. 121:110811; Ming et al., (2008) Immunity 28:468-476), y se han observado respuestas beneficiosas después de la administración de IL10 a pacientes con psoriasis (Asadullah et al. (1999) Arch. Dermatol. 135:187-92) y en la enfermedad intestinal inflamatoria (Schreiber et al. (2000) Gastroenterology 119:1461-72).

Por lo tanto, las proteínas de fusión multi-específicas de esta divulgación son útiles en el tratamiento de diversos trastornos autoinmunitarios y/o inflamatorios, tales como la artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, asma, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad intestinal inflamatoria (incluida la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa), enfermedad de injerto contra huésped, psoriasis, esclerosis múltiple, dermatomiositis, polimiositis, anemia perniciosa, cirrosis biliar primaria, encefalomielitis aguda diseminada (EMAD), enfermedad de Addison, espondilitis anquilosante, síndrome de anticuerpos antifosfolípidos (SAFL), hepatitis autoinmune, diabetes mellitus tipo 1, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré (GBS, de sus siglas en inglés), enfermedad de Hashimoto, púrpura trombocitopénica idiopática, lupus eritematoso, pénfigo vulgar, síndrome de Sjögren, arteritis temporal (también conocida como "arteritis de células gigantes"), anemia hemolítica autoinmune, penfigoide bulloso, vasculitis, enfermedad celíaca, endometriosis, hidradenitis supurativa, cistitis intersticial, morfea, esclerodermia, narcolepsia, neuromiotonía, vitíligo y enfermedad autoinmune del oído interno. Además, las proteínas de fusión multi-específicas de esta divulgación son útiles para suprimir la alorespuesta inmune perjudicial en el trasplante de órganos (incluyendo el trasplante de órgano sólido o aloinjerto), trasplante de células, o similares.

"Sal aceptable farmacéuticamente" se refiere a una sal de un polipéptido de dominio de unión o proteína de fusión de esta divulgación que es aceptable farmacéuticamente y que posee la actividad farmacológica deseada del compuesto original. Dichas sales incluyen lo siguiente: (1) sales de adición de ácido, formadas con ácidos inorgánicos, tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico; o formada con ácidos orgánicos, tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido hexanoico, ácido ciclopentanopropiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido láctico, ácido malónico, ácido succínico, ácido málico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, benzoico ácido, ácido 3-(4-hidroxibenzoil)benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido 1,2-etano-disulfónico, ácido 2-hidroxietanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido 4-clorobencenosulfónico, ácido 2-naftalenosulfónico, ácido 4-toluenosulfónico, ácido canforsulfónico, ácido 4-metilbiciclo [2.2.2]-oct-2-eno-1-carboxílico, ácido glucoheptónico, ácido 3-fenilpropiónico, ácido trimetilacético, ácido terc-butilacético, ácido lauril sulfúrico, ácido glucónico, ácido glutámico, ácido hidroxinaftoico, ácido salicílico, ácido esteárico, ácido mucónico; o (2) sales formadas cuando un protón ácido presente en el compuesto original se reemplaza bien por un ion metálico, por ejemplo, un ión de metal alcalino, un ión alcalinotérreo, o un ión de aluminio; o bien se coordina con una base orgánica, tal como etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, N-metilglucamina, o similares.

En realizaciones ilustrativas particulares, un polipéptido o proteína de fusión de esta divulgación se administra por vía intravenosa mediante, por ejemplo, inyección en bolo o infusión. Las vías de administración además de las intravenosa incluyen la oral, tópica, parenteral (por ejemplo, sublingual o bucal), sublingual, rectal, vaginal e intranasal. El término parenteral, como se emplea en la presente memoria, incluye inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraesternal, intracavernosa, intratecal, intrameatal, intrauretral o técnicas de infusión. La composición farmacéutica se formula de modo que permita que los ingredientes activos contenidos en la misma estén biodisponibles tras la administración de la composición a un paciente. Las composiciones que se administrarán a un paciente toman la forma de una o más unidades de dosificación, donde por ejemplo, un comprimido puede ser una única unidad de dosificación, y un recipiente de uno o más compuestos de esta divulgación en forma de aerosol puede contener una pluralidad de unidades de dosificación.

Para administración oral, puede estar presente un excipiente y/o aglutinante, tal como sacarosa, caolín, glicerina, almidón dextrano, ciclodextrinas, alginato de sodio, etilcelulosa y carboximetilcelulosa. Pueden estar presentes opcionalmente agentes edulcorantes, conservantes, tinte/colorante, potenciador del sabor, o cualquier combinación de los mismos. También se puede usar opcionalmente una cubierta de recubrimiento.

En una composición destinada a administrarse por inyección, se pueden incluir opcionalmente uno o más de un tensioactivo, conservante, agente humectante, agente dispersante, agente de suspensión, tampón, estabilizador, agente isotónico, o cualquier combinación de los mismos.

Para formulaciones basadas en ácidos nucleicos, o para formulaciones que comprenden productos de expresión según esta divulgación, se administrarán aproximadamente de 0,01 μg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, por ejemplo, por vía intradérmica, subcutánea, intramuscular, o intravenosa, o mediante cualquier vía conocida en la técnica que sea adecuada bajo un conjunto dado de circunstancias. Una dosificación preferida, por ejemplo, es de aproximadamente 1 μg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, siendo particularmente preferida de aproximadamente 5 μg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Será evidente para los expertos en la técnica que el número y la frecuencia de administración dependerán de la respuesta del huésped.

Las composiciones farmacéuticas de esta divulgación pueden estar en cualquier forma que permita la administración a un paciente, tal como, por ejemplo, en forma de un sólido, líquido o gas (aerosol). La composición puede estar en forma de un líquido, por ejemplo, un elixir, jarabe, disolución, emulsión o suspensión, para la administración por cualquier vía descrita en la presente memoria.

Una composición farmacéutica líquida como se emplea en la presente memoria, ya sea en forma de una disolución, suspensión u otra forma similar, puede incluir uno o más de los siguientes componentes: diluyentes estériles, tales como agua para inyección, solución salina (por ejemplo, solución salina fisiológica), solución de Ringer, cloruro sódico isotónico, aceites fijados, tales como mono o diglicéridos sintéticos que pueden servir como disolvente o medio de suspensión, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes; agentes antibacterianos, tales como alcohol bencílico o metilparabeno; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos; agentes quelantes, tales como ácido etilendiaminotetraacético; y agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como sodio, cloruro o dextrosa. La preparación parenteral se puede encerrar en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico. La solución salina fisiológica es un aditivo preferido. Una composición farmacéutica inyectable es preferiblemente estéril.

También puede ser deseable incluir otros componentes en la preparación, tales como vehículos de reparto que incluyen sales de aluminio, emulsiones de agua en aceite, vehículos de aceite biodegradables, emulsiones de aceite en agua, microcápsulas biodegradables, y liposomas. Ejemplos de adyuvantes para usar en taless vehículos incluyen N-acetilmuramil-L-alanina-D-isoglutamina (MDP), lipopolisacáridos (LPS), glucano, IL-12, GM-CSF, interferón-γ, y IL-15.

Aunque en las composiciones farmacéuticas de esta divulgación se puede emplear cualquier vehículo adecuado conocido por los expertos en la técnica, el tipo de vehículo variará dependiendo del modo de administración y de si se desea una liberación sostenida. Para la administración parenteral, el vehículo puede comprender agua, solución salina, alcohol, una grasa, una cera, un tampón, o cualquier combinación de los mismos. Para la administración oral, puede emplearse cualquiera de los vehículos anteriores o un vehículo sólido, tal como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio, o cualquier combinación de los mismos.

También se contempla la administración de composiciones de proteínas de fusión multi-específicas de esta divulgación en combinación con un segundo agente. Un segundo agente puede ser uno aceptado en la técnica como un tratamiento estándar para un estado de enfermedad particular, tal como inflamación, autoinmunidad, y cáncer. Ejemplos de segundos agentes secundarios contemplados incluyen citoquinas, factores de crecimiento, esteroides, AINEs, FAMEs (fármacos modificadores de la enfermedad), quimioterapéuticos, radioterapéuticos, u otros agentes activos y auxiliares.

Esta divulgación contempla una unidad de dosificación que comprende una composición farmacéutica de esta divulgación. Dichas unidades de dosificación incluyen, por ejemplo, un vial o jeringa de dosis única o de dosis múltiple, que incluye un vial o jeringa de dos compartimentos, uno que comprende la composición farmacéutica de esta divulgación en forma liofilizada, y el otro un diluyente para la reconstitución. Una unidad de dosificación multidosis también puede ser, por ejemplo, una bolsa o tubo para conexión a un dispositivo de infusión intravenosa.

Esta divulgación también contempla un kit que comprende una composición farmacéutica en un recipiente de dosis unitaria o multi-dosis, por ejemplo, un vial, y un conjunto de instrucciones para administrar la composición a pacientes que padecen un trastorno como se describe en la presente memoria.

Ejemplos

Secuencias exceptoras

Ejemplos de casetes de expresión de nucleótidos y secuencias de aminoácidos de las proteínas de fusión multiespecíficas que tienen un ectodominio de CTLA4, se proporcionan en SEQ ID NOS:8, 12, 16, 23, 27, 30, 34, 37, y 41, y SEQ ID NOS:9, 13, 17, 24, 28, 31, 35, 38, y 42, respectivamente. La actividad de estos ejemplos de proteínas de fusión multi-específicas se ensayó como se describe en los Ejemplos 1 a 6 de a continuación. Las abreviaturas usadas en los siguientes ejemplos incluyen los siguientes términos: PBS-T: PBS, pH 7,2-7,4 y Tween®20 al 0,1%; tampón de trabajo: PBS-T con BSA 1%; tampón de bloqueo: PBS-T con BSA 3%.

Ejemplo 1

Dominios de unión anti-CD86

Se utilizaron los hibridomas 3D1 y FUN1 para clonar los dominios de unión variables anti-CD86 de estos anticuerpos monoclonales. Las secuencias para la cadena pesada, cadena ligera, enlazador scFv, y CDRs a partir de FUN1, y de los anticuerpos monoclonales 3D1 anti-CD86 se encuentran en SEQ NOS:305-313 y 318-326, respectivamente.

Se utilizaron los siguientes dominios de unión variables anti-CD86 de los anticuerpos monoclonales FUN1 humanizados para construir proteínas SMIP y exceptores. Los CDRs de FUN1 se injertaron en secuencias de la

línea germinal humana como sigue: (1) FUN1-11 tiene Igkv4-1*01 FR para la cadena ligera, y IgHV1-F*01 FR para la cadena pesada; (2) FUN1-21 tiene Igkv4-1*01 FR para la cadena ligera, y IgHV1-2* 02 FR para la cadena pesada;

(3) FUN1-31 tiene Igkv4-1*01 FR para la cadena ligera, y IgHV3-11*01 FR para la cadena pesada; (4) FUN1-12 tiene Igkv1-27*01 FR para la cadena ligera, y IgHV1-F*01 FR para la cadena pesada; (5) FUN1-22 tiene Igkv1-27*01 FR para la cadena ligera, y IgHV1-2*02 FR para la cadena pesada; y (6) FUN1-32 tiene Igkv1-27*01 FR para la cadena ligera, y IgHV3-11*01 FR para la cadena pesada. Los CDRs de la línea germinal para las moléculas humanizadas son similares a las moléculas FUN1 originales.

En consecuencia, se generaron también seis versiones de proteínas FUN1 SMIP humanizadas, de la siguiente manera: (1) FUN1-11 (SEQ ID NO:225); (2) FUN1-21 (SEQ ID NO:227); (3) FUN1-31 (SEQ ID NO:229); (4) FUN112 (SEQ ID NO:231); (5) FUN1-22 (SEQ ID NO:233); y (6) FUN1-32 (SEQ ID NO:235). La actividad de unión de estas moléculas FUN1 SMIP humanizadas se muestra en la Figura 7. Además, los dominios variables FUN1 (scFv) y FUN1 scFv humanizado se utilizaron para hacer exceptores, tales como IL10::FUN1 (SEQ ID NO:183); FUN1::IL10 (SEQ ID NO:187); FUN1-21::IL10 (SEQ ID NO:237); IL10::FUN1-21 (SEQ ID NO: 254); IL10 I87A::FUN1-21 (SEQ ID NO:258); y el dominio de unión monolL10::FUN1-21 también se realizó utilizando una bisagra corta A2 (SEQ ID NO:276) (en donde la secuencia de aminoácidos bisagra A2 se expone en SEQ ID NO:364).

Estas, y las demás construcciones descritas en la presente memoria, se clonaron dentro de vectores de expresión de mamíferos adecuados, y se expresaron en diversas líneas celulares para producir la proteína para ensayos funcionales particulares.

Ejemplo 2

Unión del exceptor a IL10-R1 mediante BIACORE™

Se examinó la actividad de unión de IL10-R1 para un exceptor incluyendo un ectodominio CTLA4, y un dominio de IL10 (SEQ ID NO:9), sustancialmente como sigue.

Se realizaron mediciones de resonancia del plasmón superficial (SPR, de sus siglas en inglés) en un BIAcore™ T100 SPR (Pharmacia Biotech AB, Uppsala) usando HBS-P+ (GE Healthcare) como tampón de migración. La IL10R1 (25 µg/mL en acetato de sodio 10 mM, pH 4,0; R&D Systems) se inmovilizó directamente sobre un chip CM5 utilizando química de acoplamiento de amina estándar (Kit Biacore Amina de Acoplamiento, GE Healthcare), con niveles de inmovilización finales de 867, 2687, y 6719 Ru (unidades de resonancia). Se inyectaron construcciones que contienen IL-10 durante 300 segundos, a una velocidad de flujo de 50 µl/min, en una serie de concentraciones de 100 pM a 10 nM. La disociación se monitoreó durante 1200 segundos, y la superficie se regeneró mediante la inyección de cloruro de magnesio 2 M, pH 7,58, durante 60 segundos, seguido de la inyección de EDTA 20 mM (en HBS-P+) durante 60 segundos. Las interacciones de unión con la superficie eran estables a través de al menos 30 ciclos de regeneración. Los datos se analizaron utilizando Biaevaluation para el T100, versión 2.0 (GE Healthcare). Las cinéticas de unión del Exceptor CTLA4/IL10 para IL-10R1 inmovilizada no se podían ajustar al modelo de unión

1:1 de Langmuir, pero se podían ajustar con gran precisión a un modelo de unión de analito bivalente. Las constantes de equilibrio de disociación (KD) para cada construcción se podían calcular con gran precisión mediante el ajuste de la respuesta observada en la saturación para un modelo de equilibrio de estado estable, y se proporcionan a continuación en la Tabla 3. La inclusión del ectodominio de CTLA4 en la proteína de fusión Exceptora no tuvo ningún efecto aparente sobre la interacción IL10/IL10R1.

Tabla 3

Proteína Inmovilizada: Analito Primer Sitio Ka (M-1s-1) Primer Sitio Kd (s-1) SegundoSiti o Ka (s-1) SegundoSiti o Kd (s-1) KD (nM)

IL10-R1: IL10* 5,7 x 105 2,6 x 10-4 - - 0,46

IL10-R1: SEQ ID NO:9 7 x 105 2,9 x 10-4 18 x 10-3 8,6 x 10-3 0,41**

*Valor Bibliografía(Yoon et al. (2006) J. Biol. Chem 281:35088-35096) **Calculado a partir de ka1 y kd1 Ejemplo 3 Unión mediante ELISA del exceptor a CD80, y tanto a CD80 como a IL10 Se examinó la actividad de unión a CD80 y IL10R mediante ELISA para abatacept, una construcción de CTLA4-lg

referido como CTLA4-N2 (SEQ ID NO:10 y 11), y el Exceptor CTLA4/IL10 de SEQ ID NO:9, sustancialmente como

sigue.

Unión a CD80

Cada pocillo de una placa CD80 negra Maxisorp de 96 pocillos (Nunc Catálogo #437111) se recubrió con CD80-mlg (Ancell Catálogo #510-020) en 2 µg/mL de disolución, y se incubó durante la noche a 4ºC. La placa se bloqueó entonces con tampón de bloqueo (PBS-T con 3% de leche seca no grasa). Las muestras de las proteínas a ensayar se diluyeron por orden correlativo en tampón de bloqueo, y se añadieron en pocillos duplicados a la placa recubierta con CD80-mlg, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora. Después del lavado, se añadieron en el tampón de bloqueo 100 µl por pocillo de IgG (gamma) peroxidasa de rábano picante de cabra anti-humano diluido 1:1.000, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante 60 minutos, seguido de una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente en Sustrato de Peroxidasa Fluorogénico QuantaBlu™ (Thermo Scientific Catálogo #15169). La absorbancia de cada pocillo se leyó a 420 nm. La proteína de fusión no relacionada TRU-015 se empleó como control negativo.

Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 1. Se encontró que CTLA4-N2 se une a CD80-mlg, así como abatacept para en este formato ELISA, mientras que el Exceptor CTLA4/IL10 parecía mostrar una unión a CD80 más débil.

Unión del exceptor tanto a sIL10R1 como a sCD80

Cada pocillo de una placa CD80 negra Maxisorp de 96 pocillos (Nunc Catálogo #437111) se recubrió con sIL10Ra (R&D Systems Catálogo #510-020) en 2 µg/ml de disolución, y se incubó durante la noche a 4ºC. La placa se bloqueó con tampón de bloqueo (PBS-T con leche seca no grasa al 3%). Las muestras de las proteínas a ensayar se diluyeron por orden correlativo en tampón de bloqueo, y se añadieron en pocillos duplicados a la placa recubierta con sIL10Ra, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora. Después del lavado, se añadió el anticuerpo anti-CD152 (Ancell #359-020) a 10 ng/ul o CD80-mlg (Ancell #510-020) a 5 ug/ml seguido de la adición de IgG peroxidasa de rábano picante de cabra anti-ratón (Fc) (Pierce #31439) diluido 1:10.000 en tampón de bloqueo, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante 60 minutos, seguido de una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente en Sustrato de Peroxidasa Fluorogénico QuantaBlu™ (Thermo Scientific Catálogo #15169). La absorbancia de cada pocillo se leyó a 420 nm. La proteína de fusión no relacionada TRU-015 se empleó como control negativo.

La Figura 2 muestra los resultados obtenidos para CTLA4-N2 y el exceptor CTLA4::IL10 de SEQ ID NO:9. Estos resultados demuestran que tanto los dominios de CTLA4 como los de IL10 del Exceptor CTLA4-Ig-IL10 son capaces de unirse simultáneamente a su ligando/receptor.

Ejemplo 4

Fosforilación de STAT3 inducida por el exceptor

La unión de IL10 a IL10-R1 es conocida por activar Jak-1 y Tyk a la vez que conducen la activación de STAT3 (véase, por ejemplo, Williams et al. (2007) J. Biol. Chem. 282:6965-6975). Además, los estudios han demostrado que la citometría de flujo se puede emplear para estudiar la fosforilación de STAT3 en PBMC (Lafarge et al. (2007) BMC Mol. Biol. 8:64). La capacidad de las diversas construcciones que contienen IL10, incluyendo el Exceptor CTLA4/IL10 de SEQ ID NO:9, para inducir la fosforilación de STAT3 en PBMC humano se examinó sustancialmente como sigue.

Se aislaron PBMCs de un donante humano, y se cultivaron durante la noche en medio completo (RPMI, 10% FBS, penicilina/estreptomicina) a 2x106 células/ml. A la mañana siguiente, las PBMCs se lavaron una vez, se resuspendieron con RPMI 1640 pre-calentado (sin suplementos) a 4x106 células/ml, y se incubaron a 37ºC durante 2,5 horas. Los tratamientos se prepararon a una concentración 2X en 0,25mL de RPMI 1640, y se mezclan con 1x106 PBMCs en 0,25 mL de RPMI 1640. Las muestras se incubaron luego durante 15 minutos a 37ºC. Una vez completada la incubación de 15 minutos, se añadieron 0,5mL de Búfer BD Cytofix enfriado en hielo (BD Biosciences, cat #554655) a cada tubo. Las células se incubaron en hielo durante 30 minutos, y después se lavaron con 2 ml de DPBS+2,5% de FBS (tampón FACS). Después de decantar y agitar con vórtex las muestras, se añadieron 0,5mL de BD PERM BÚFER III enfriado en hielo (BD Biosciences, cat #558050) a cada tubo, y las muestras se incubaron a continuación en hielo durante 30 minutos. Las muestras se lavaron 3 veces con 2mL de tampón FACS, y se resuspendieron en ~0,2 mL de tampón FACS después del lavado final. Se añadió a cada muestra 20µL de mAb STAT3 conjugado con FITC (isotiocinato de fluoresceína) anti-humano (BD Biosciences, clon PY705). Las células se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las muestras se lavaron 3 veces con tampón FACS para eliminar cualquier anticuerpo no unido. Las muestras se analizaron en un citómetro de flujo LSRII. Se aplicó una puerta para los linfocitos vivos en base a SSC y los perfiles FSC, y se determinó el MFI para FITC.

Como se muestra en la Figura 3 y la Figura 4, todas las construcciones que contienen IL-10 aumentan la fosforilación de STAT3 en una manera dependiente de la dosis.

Ejemplo 5

Unión del Exceptor a CD86, y tanto a CD86 como a IL10

Se utilizó una línea celular humana linfoblastoide B que expresa CD86 (WIL2-S) para examinar la unión a CD86, y se utilizó una línea celular CHO que expresa CD86 (células HuCD86-2A2) en la superficie en combinación con el Receptor1 IL10 soluble (IL10R1) de la proteína de fusión unida a una IgG Fc murina o a un anticuerpo anti-IL10, para examinar la unión simultánea del antagonista de CD86 y del agonista de IL10 que se encuentran en las moléculas exceptoras. Brevemente, las células WIL2-S o HuCD86-2A2 se incubaron con las moléculas de ensayo que contienen un antagonista de CD86 en concentraciones que oscilan de la saturación a niveles de base. A las células HuCD86-2A2, se añadieron además una proteína de fusión IL10R1-mulg o un anticuerpo anti-IL10 murino para formar un complejo con las moléculas de ensayo que se habían unido a la superficie celular a través del CD86. Después de la incubación, las células se lavaron y se marcaron con fluoróforo (R-ficoeritrina) F(Ab')2 anticuerpo específico para la porción Fc de la molécula exceptora, la proteína de fusión IL10R-Ig, o el anticuerpo anti-IL10. Las células marcadas pasaron luego a través de un citómetro de flujo, y los datos se analizaron mediante el trazado de la Intensidad de fluorescencia media de cada muestra.

Como se muestra en la Figura 5, la unión de CD86 en las células WIL2-S mediante las moléculas exceptoras que contienen un dominio de unión anti-CD86 (por ejemplo, a partir de anticuerpos de hibridoma 3D1 y FUN1) mostraron mayor afinidad que la unión del ectodominio de CTLA4 que contiene moléculas exceptoras. Más específicamente, el exceptor 3D1::IL10 (SEQ ID NO:189) que contiene 3D1 anti-CD86 tenía una afinidad ligeramente superior por CD86 que el exceptor FUN1::IL10 (SEQ ID NO:187) que contiene FUN1 anti-CD86, mientras que CTLA4-lg (SEQ ID NO:11) y un exceptor que contiene CTLA4 (SEQ ID NO:173) tenían una afinidad mucho menor por CD86 que los dominios de unión anti-CD86 a partir de los anticuerpos de hibridoma 3D1 y FUN1.

Como se muestra en la Figura 6, las moléculas exceptoras que contienen un antagonista de CD86 y un agonista de IL10 podían unirse simultáneamente a CD86 en las células HuCD86-2A2 (células CHO que expresan CD86 en la superficie celular desarrollada en el huésped) y en IL10R1 soluble. Además, la Figura 6 muestra que las variantes de IL10 tenían diferentes afinidades de unión para IL10R1. Por ejemplo, las moléculas exceptoras CTLA4::monoIL10 (SEQ ID NO:181) y (CTLA4::IL10)-75 (SEQ ID NO:173) tenían afinidades similares para IL10R1, pero los exceptores que contienen la forma IL10 mutada viral, CTLA4::IL10I87A (SEQ ID NO:191) y CTLA4::IL10I87S (SEQ ID NO:193),mostró una afinidad mucho menor para IL10R1.

En otro experimento se ensayó la unión a CD86 en diferentes versiones de SMIPs FUN1 humanizados. Se examinaron para la unión a CD86 los sobrenadantes de células HEK293 transfectadas transitoriamente con las seis versiones diferentes de SMIPs FUN1 humanizados usando células HuCD86-2A2. La Figura 7 muestra que FUN1-21 (SEQ ID NO:227) tenía la mejor afinidad de unión a CD86, seguido de FUN1-22 (SEQ ID NO:233) y después FUN111 (SEQ ID NO:225); el resto de las proteínas SMIP FUN1 humanizado (FUN1-12, SEQ ID NO:229; FUN1-31, SEQ ID NO:231; FUN1-32, SEQ ID NO:235) no mostraron una unión detectable.

Ejemplo 6

Diferentes longitudes del enlazador dominio de unión en proteínas exceptoras

Se examinó la estabilidad del enlazador para las moléculas de CTLA4::IL10. Todas las variantes del enlazador se transfectaron de forma estable en células CHOK1SV, y las poblaciones estables se cultivaron a 37ºC y se llevaron a 34ºC en el día 3. Las proteínas se purificaron por columna de Proteína A, y a continuación mediante una segunda etapa en columna SEC. Se realizaron ensayos ELISA para medir la unión de IL10 a la proteína de fusión IL10R1mlg. Los resultados en la Figura 8 mostraron que el exceptor (CTLA4::IL10)-65 (SEQ ID NO:9) había reducido la unión a IL10 debido a la inestabilidad del enlazador, pero (CTLA4::IL10)-68 (SEQ ID NO:171), (CTLA4::IL10)-69 (SEQ ID NO:302), y (CTLA4::IL10)-75 (SEQ ID NO:173) eran estables en estas condiciones de cultivo.

Se ensayaron también mediante ELISA las variantes más cortas del enlazador en proteínas exceptoras CTLA4::IL10 para la unión a IL10R1. Las variantes más cortas del enlazador se transfectaron transitoriamente, y las proteínas se purificaron en una columna A. Se realizaron ensayos ELISA para medir la unión de IL10 a la proteína de fusión IL10R1-mlg. Los resultados en la Figura 9 mostraron que las variantes más cortas del enlazador (CTLA4::IL10)-77 (SEQ ID NO:175), Q0033 (CTLA4::IL10)-78 (SEQ ID NO:177), y (CTLA4::IL10)-79 (SEQ ID NO:179) funcionaban tan bien como los enlazadores más largos para la afinidad de unión a IL10 del extremo posterior (por ejemplo, en comparación con (CTLA4::IL10)-68; SEQ ID NO:171).

Ejemplo 7

Estabilidad sérica y farmacocinética de proteínas exceptoras

Se ensayó la estabilidad sérica de (CTLA4::IL10)-75 (SEQ ID NO:173). En este experimento, la proteína purificada de SEQ ID NO:173 se trató en suero de ratón a 37ºC durante 24 horas, 72 horas y F/T (congelación/descongelación) y el pico en el momento de ensayo (T0). Se ensayó la estabilidad de todas las muestras para determinar su unión a CD80 (utilizando células CHO 1F6 que expresan CD80), así como para la unión simultánea a CD80 y la unión del anticuerpo anti-IL10 a IL10 en el exceptor. Los resultados mostraron que SEQ ID NO:173 era muy estable y conservó la unión anti-IL10 después de la incubación en suero de ratón a las concentraciones ensayadas (de aproximadamente 0,01 nM a aproximadamente 10 nM).

Los estudios farmacocinéticos (PK) para (CTLA4::IL10)-68 (SEQ ID NO:171) y (CTLA4::IL10)-75 (SEQ ID NO:173) se llevaron a cabo en ratones hembra Balb/c, utilizando 3 ratones por punto de tiempo. Los ratones se inyectaron por vía intravenosa con 200 µg/ratón. El suero de ratón se recogió a los 15 minutos, 2 horas, 6 horas, 24 horas, 48 horas, 96 horas, 7 días, y 14 días después del tratamiento. Las muestras se ensayaron para la unión a CD80 (ensayo de CTLA4) y la unión simultánea a CD80 y al anticuerpo anti-IL10 (ensayo IL10). Los resultados se resumen en la Tabla 4 de a continuación.

Tabla 4. Resumen del Estudio PK

PK Estimados para Abatacept, (CTLA4::IL10)-68 y (CTLA4::IL10)-75: Parámetros PK Estimados para Abatacept Parámetros PK Estimados para (CTLA4::IL10)-68 Parámetros PK Estimados para (CTLA4::IL10)-75

Parámetro: Unidades Ensayo CTLA4 Ensayo CTLA4 Ensayo IL-10 Ensayo CTLA4 Ensayo IL-10

HL_Lambda_z: hr 45,49 32,62 29,36 34,59 31,48

Vz_obs: mL/kg 117,30 84,571 158,57 206,48 285,30

Cl_obs: mL/hr/kg 1,79 1,797 3,74 4,14 6,28

Ejemplo 8

Unión del exceptor a CD80, CD86 y IL10R1

La unión de CD80 y IL10R1 se examinó mediante ELISA, y/o se examinó la unión de CD86 y IL10R1 usando células CHO que expresan CD86, y bien IL10R1-Ig o bien anti-IL10. La unión a CD80 y CD86 de ratón se examinó mediante ELISA usando anticuerpos de ratón marcados con biotina. Las moléculas examinadas incluían la proteína de fusión control CTLA4-Ig (SEQ ID NO:11), y las siguientes moléculas exceptoras de ensayo: (CTLA4::IL10)-65 (SEQ ID NO:9); (CTLA4::IL10)-68 (SEQ ID NO:171); (CTLA4::IL10)-69 (SEQ ID NO:302), (CTLA4::PDL2)-65 (SEQ ID NO:336), sustancialmente como se describe en los Ejemplos 3 y 5.

Como se muestra en las Figuras 10 y 11, todas las moléculas exceptoras (CTLA4::IL10)-65, (CTLA4:: IL10)-68, y (CTLA4::IL10)-69 se unen a CD80 por ELISA y a CD86 en las células. Los resultados en la Figura 12 muestran que las moléculas exceptoras de CTLA4::IL10 pueden interactuar con huIL10R1. Además, como se muestra en la Figura 13, los exceptores de CTLA4::IL10 pueden participar tanto en BD1 (dominio de unión en el amino terminal) como en BD2 (dominio de unión en el carboxilo terminal) simultáneamente para CD80 y IL10R1 mediante ELISA. Además, las Figuras 14 y 15 muestran que las moléculas exceptoras (CTLA4::IL10)-65, (CTLA4::IL10)-68, y (CTLA4::IL10)-69, específicas para las moléculas humanas, son capaces de reaccionar de forma cruzada tanto con CD80 de ratón como con CD86 de ratón.

Ejemplo 9

Unión del exceptor a CD80 mediante BIACORE™

Se examinó la actividad de unión a CD80 para abatacept (Orencia®, Bristol-Myers Squibb), una fusión de CTLA4-Fc que contiene las mutaciones L104E A29Y, análoga a belatacept (SEQ ID NO:217), tres variantes del enlazador exceptor de CTLA4::IL10 teniendo cada una un ectodominio de CTLA4 y un dominio de IL10: (CTLA4::IL10)-65 (SEQ ID NO:9), (CTLA4::IL10)-68 (SEQ ID NO:171), y (CTLA4::IL10)-75 (SEQ ID NO:173); un exceptor que incluye un ectodominio de CTLA4 con las mutaciones L104E A29Y y un dominio IL10 (SEQ ID NO:219), y un exceptor que contiene un ectodominio de CTLA4 y un dominio PD-L1 (SEQ ID NO:13), sustancialmente como se describe en la presente memoria. El examen de la unión de CTLA4-Fc a CD80/86 mediante BIAcore se ha descrito previamente (Greene et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:26762-26771; van der Merwe et al. (1997) J. Exp. Med. 185:393-403; Collins et al. (2002) Immunity 17:201-210). La unión de CD80 por CTLA4 es de afinidad moderada (Kd = ~200 nM), y se caracteriza por una velocidad rápida (4-8x105 M-1s-1) y una velocidad de desactivación moderada (0,090 s-1). La unión dimérica de CTLA4-Fc a CD80 es bifásica, y se ha informado de dos velocidades de inactividad (0,004, 0,086 s-1). Se ha informado que las mutaciones L104E A29Y en CTLA4-Fc aumentan la afinidad por CD80 el doble que sobre CTLA4-Fc de tipo salvaje (Larsen et al. (2005) Am. J. Transplant. 5:443-453), principalmente al disminuir la tasa de desactivación inicial (reportada como 0,00108 vs 0,00221s-1).

Se realizaron mediciones de resonancia del plasmón superficial (SPR) en un BIAcore™ T100 SPR (Pharmacia Biotech AB, Uppsala) usando HBS-EP+ (GE Healthcare) como un tampón de migración. El CD80-mlgG (25 μg/mL en acetato de sodio 10 mM, pH 4,0; Ancell, Inc) se inmovilizó directamente en un chip CM5 usando química de

acoplamiento de amina estándar (Kit Biacore Amina de Acoplamiento, GE Healthcare), con niveles de inmovilización finales de 317, 973, y 1678 Ru (unidades de resonancia). Las construcciones que contienen CTLA4 se inyectaron durante 150 segundos, a una velocidad de flujo de 10 μl/min, en una serie de concentraciones de 5 nM a 1 μM. La disociación se controló durante 600 segundos, y la superficie se regeneró inyectando citrato de sodio 50 mM, cloruro

5 de sodio 500 mM, pH 4,0, durante 60 segundos. Las interacciones de unión con la superficie fueron estables a lo largo de al menos 75 ciclos de regeneración. Los datos se analizaron utilizando el programa informático BiaEvaluation para T100 (versión 2.0.1, GE Healthcare).

Las cinéticas de unión de las construcciones de CTLA4 para el CD80 inmovilizado no podían ajustarse a una proporción 1:1 del modelo de unión Langmuir, pero se podían ajustar con alta precisión a un modelo de unión de

10 analito bivalente. El aumento de la fase de asociación al aumentar la duración de la inyección no alteró los parámetros cinéticos calculados. Las constantes de disociación de equilibrio (KD) podrían calcularse con alta precisión para cada construcción ajustando la respuesta observada en la saturación a un modelo de equilibrio en estado estable. Los resultados para todas las moléculas de unión a CD80 se resumen en la Tabla 5 de a continuación.

Tabla 5

Proteína Inmovilizada: Analito ka Primer Sitio (M-1s-1) kd Primer Sitio (s-1) ka Segundo Sitio (s-1) kd Segundo Sitio (s-1) KD (nM)

CD80: abatacept 5,5 ± 0,02 x 105 0,006 0,00019 9,4 ± 0,08 x 10-4 130 ± 10

CD80: SEQ ID NO:9 1,9 ± 0,01 x 105 0,008 0,0045 ± 0,0001 0,015 ± 0,0003 233 ± 27

CD80: SEQ ID NO:13 0,36 ± 0,002 x 105 7,4 ± 0,047 x 10-4 0,0057 0,064 176 ± 29

CD80: SEQ ID NO:171 9,77 ± 5,83 x 105 0,0145 0,0190 0,0434 37,5 ± 9,5

CD80: SEQ ID NO:173 12,1 ± 6,81 x 105 0,0124 0,0207 0,0431 28,0 ± 6,5

CD80: SEQ ID NO:217 1,55 ± 0,203 x 105 0,00373 0,00102 0,00332 13,3 ± 6,2

CD80: SEQ ID NO:219 0,908 ± 0,307 x 105 0,00235 0,00406 0,00706 19,1 ± 5,3

30

Se determinó que las afinidades de equilibrio para los Exceptores se asemejan a las de abatacept y la afinidad reportada por CTLA4-Fc (200 nM; Greene et al., 1996, Ibid). Las cinéticas de unión para el exceptor CTLA4::PDL1 eran diferentes a las de abatacept o al exceptor CTLA4::IL10, aunque la tasa de activación/desactivación proporciona una afinidad similar. Esto puede deberse al hecho de que PD-L1 se une a CD80 con una afinidad más débil que CTLA4 (KD de 2,5 μM). De manera similar a estudios previos, las variantes de CTLA4 que contienen la mutación L104E A29Y (SEQ ID NOS:217 y 219) tenían una afinidad más alta por CD80, con una mejora de aproximadamente dos veces en la tasa de desactivación inicial (0,00373 s-1 para SEQ ID NO:217 comparado con 0,006 s-1 para abatacept).

Ejemplo 10

Unión del exceptor a CD86 mediante BIACORE™

La actividad de unión a CD86 se examinó para abatacept, una fusión CTLA4-Fc que contiene las mutaciones L104E A29Y, análoga a belatacept (SEQ ID NO:217), un exceptor que contiene un ectodominio CTLA4 y un dominio IL10 (SEQ ID NO:9), un exceptor que contiene un ectodominio de CTLA4 con las mutaciones L104E A29Y y un dominio IL10 (SEQ ID NO:219), y diferentes construcciones (SMIP, PIMS, y exceptor) que contienen dominios variables de anticuerpos a partir de los anticuerpos anti-CD86 3D1 y FUN1, sustancialmente como se describe en la presente memoria. La unión de CD86 por CTLA4 es de baja afinidad (Kd = ~2,2 μM), y se caracteriza por una velocidad rápida (2-13x105 M-1s-1) y una velocidad de desactivación moderada (0,42 s-1). Se ha informado que las mutaciones L104E A29Y en CTLA4-Fc aumentan la afinidad por CD86 cuatro veces más que CTLA4-Fc de tipo salvaje (Larsen et al. (2005) Am. J. Transplant. 5:443-453), principalmente al disminuir la tasa de desactivación inicial (reportada como 0,00206 vs 0,00816 s-1). Aparentemente, no se han publicado previamente datos de afinidad cinética o de equilibrio para los anticuerpos 3D1 o FUN1, por lo que se determinaron sus afinidades relativas.

Menor afinidad a CD86 de los dominios de unión basados en el ectodominio de CTLA4. Se realizaron mediciones de SPR en un BIAcore ™ T100 SPR (Pharmacia Biotech AB, Uppsala) usando HBS-EP+ (GE Healthcare) como tampón de migración. Se inmovilizó CD86-mlgG (25 µg/mL en acetato de sodio 10 mM, pH 4,0, Ancell, Inc) directamente sobre un chip CM5 utilizando química de acoplamiento de amina estándar (Kit Biacore Amina de Acoplamiento, GE Healthcare), con niveles de inmovilización finales de 37, 373, y 903 Ru. Se inyectaron construcciones que contienen CTLA4 durante 150 Segundos, a una velocidad de flujo de 10 µl/min, en una serie de concentraciones de 4 nM a 10 µM. La disociación se monitoreó durante 600 segundos, y la superficie se regeneró bien mediante inyección de citrato sódico 50 mM, cloruro de sodio 500 mM, pH 5,0, durante 60 segundos (CTLA4 de tipo salvaje) o glicina 10 mM, pH 1,7 (L104E A29Y CTLA4). Las interacciones de unión con la superficie, y los niveles de inmovilización, eran estables a lo largo de al menos 100 ciclos de regeneración. Los datos se analizaron utilizando el programa informático BiaEvaluation para T100 (versión 2.0.1, GE Healthcare). Debido a la baja afinidad de CTLA4 por CD86, y a las rápidas tasas de activación y desactivación (los valores de bibliografía son 0,2-1,3x106

M-1

s-1 para ka y 0,42 s-1 para kd, en el límite de detección para el Instrumento BIAcore T100™) las cinéticas de unión de abatacept a CD86 inmovilizado no se pudieron determinar. Las cinética de unión de las construcciones con el dominio L104E A29Y CTLA4 (SEQ ID NO:217; SEQ ID NO:219) para CD86 inmovilizado se pudo determinar con una precisión razonable mediante el ajuste de la respuesta observada con el modelo del analito bivalente, sin embargo las constantes de equilibrio de disociación (KD) se pudieron calcular con gran precisión para todas las construcciones ajustando la respuesta observada en la saturación a un modelo de equilibrio de estado estable. Los resultados se muestran en la Tabla 6, de a continuación.

Mayor afinidad a CD86 de los dominios de unión basados en dominios variables del anticuerpo 3D1 y FUN1. Se realizaron mediciones de SPR como se indica anteriormente, con las siguientes excepciones: se utilizó HBS-P + (GE Healthcare) como tampón de migración; disociación se monitoreó durante 1200 segundos; y la superficie se regeneró mediante la inyección de glicina 10 mM, pH 1,7, durante 60 segundos. Las cinéticas de unión para CD86 inmovilizada se pudieron determinar en todos los casos. Sin embargo, las constantes de equilibrio de disociación (KD) podían calcularse con gran precisión para cada construcción mediante el ajuste de la respuesta observada en la saturación a un modelo de equilibrio de estado estable. Los resultados se muestran en la Tabla 6 a continuación.

Tabla 6

Proteína Inmovilizada: Analito Ka Primer Sitio (M1s-1) Kd Primer Sitio (s-1-) Ka Segundo Sitio (s1) Kd Segundo Sitio (s-1-) KD (nM)

CD86: abatacept - - - - 3200 ± 1600

CD86: SEQ ID NO:217 0,847 x 105 0,01016 0,0298 0,0344 722 ± 300

CD86: SEQ ID NO:219 0,451 x 105 0,00910 ± 0,0001 0,011 0,0221 670 ± 180

CD86: 3D1 SMIP 3,23 x 105 4,40 ± 0,05 x 10-5 0,0055 0,0276 11,7 ± 1,2

CD86: SEQ ID NO:189 9,74 ± 0,066 x 105 7,06 ± 0,04 x 10-5 0,0094 0,0462 26,5 ± 2,9

CD86: SEQ ID NO:328 1,12 x 105 2,37 ± 0,13 x 10-5 0,00077 0,00377 28,0 ± 1,9

CD86: SEQ ID NO:185 6,17 ± 0,12 x 105 8,30 ± 0,12 x 10-5 0,0124 0,102 35,7 ± 2,5

CD86: FUN1 mAb 1,29 ± 0,69 x 105 2,28 ± 0 x 10-5 0,00278 0,0154 36,0 ± 5,5

CD86: SEQ ID NO:225 0,139 ± 0,556 x 105 35,0 x 10-5 7,5 x 10-5 1,25 ± 0,25 x 10-6 119 ± 40

CD86: SEQ ID NO:227 1,86 ± 0,951 x 105 13,9 x 10-5 0,00578 0,0127 26,9 ± 5,4

CD86: SEQ ID NO:402 0,5 x 105 9,1 x 10-5 0,00113 0,00837 70,9 ± 5,9

CD86: muIL10-Ig 0,941 x 105 18 x 10-5 0,0203 0,0722 50,6 ± 7

CD86: SEQ ID NO:254 1,58 x 105 12,8 x 10-5 0,0064 0,0387 98,6 ± 10

CD86: SEQ ID NO:258 0,407 x 105 43,3 ± 1,2 x 10-5 0,0198 0,0579 88,5 ± 19

CD86: SEQ ID NO:276 0,126 x 105 34,4 x 10-5 0,011 0,0111 178 ± 18

32

Las afinidades de equilibrio para abatacept (3,2 µM) se parecían a la afinidad reportada para CTLA4-Fc (2,2 µM; Greene et al. 1996, Ibid). Igual que en estudios anteriores, las variantes CTLA4 que contienen la mutación L104E A29Y (SEQ ID NO:217; SEQ ID NO:219) tenían una afinidad de cuatro a cinco veces mayor por CD86 (670 -772 nM). Las construcciones que contienen fragmentos de anticuerpos de cadena única de ratón 3D1 (scFvs) en el Nterminal (3D1 SMIP, SEQ ID NO:317; 3D1::IL10, SEQ ID NO:189) tenían afinidades más altas (11,7, 26,5 nM) que las construcciones correspondientes con el 3D1 scFv en el C-terminal (3D1 PIMS, SEQ ID NO:319; IL10::3D1, SEQ ID NO:185); examinando la cinética de unión, esto parecía alcanzarse tanto a partir de una tasa de activación inicial mayor, como a partir de una tasa de activación inicial menor, aunque en todos los casos, la afinidad era al menos 100 veces mayor para CD86 que para abatacept. Para el anticuerpo FUN1, el anticuerpo monoclonal parental murino se examinó junto con las proteínas SMIP que contienen dos fragmentos de anticuerpos FUN1 de cadena única humanizada (SEQ ID NOS:225 y 227); el último de los dos (SEQ ID NO:227) mostró una cinética de unión similar y una afinidad general por CD86 como mAb FUN1 parental (26,9, 36 nM, respectivamente), que, de nuevo, era significativamente mayor que para abatacept. Las moléculas PIMS o exceptoras que contienen fragmentos de anticuerpos FUN1 humanizados en el extremo carboxilo terminal (IL10::FUN1-21, SEQ ID NO: 254; (IL10 I87A::FUN1-21)-75, SEQ ID NO:258; (monoIL10-A2 bisagra::FUN1-21)-75, (SEQ ID NO:276); FUN1-21 PIMS, SEQ ID NO:402) tenían afinidades más bajas que la del exceptor que contiene la secuencia del anticuerpo parental en el extremo amino (FUN1::IL10, SEQ ID NO:187)) o la misma secuencia de unión FUN1-21 en una proteína SMIP (SEQ ID NO:227).

Ejemplo 11

Unión del exceptor a CD86 murino mediante BIAcore™

Se examinó la actividad de unión a CD86 murino para abatacept, una fusión CTLA4-Fc que contiene las mutaciones L104E A29Y, análoga a belatacept (SEQ ID NO:217), dos exceptors que contienen diferentes enlazadores BD2 pero los mismos dominios CTLA4 y IL10 (SEQ ID NOS:171 y 173), un exceptor que contiene un ectodominio CTLA4 con las mutaciones L104E A29Y y un dominio de IL10 (SEQ ID NO:219), una fusión de CTLA4 murino al dominio Fc humano (SEQ ID NO:404), y diferentes construcciones que contienen dominios variables de anticuerpos a partir del anticuerpo CD86 anti-murino GL1 de rata, que incluye dos exceptores que contienen un fragmento de anticuerpo GL1 y un dominio IL10 humano (GL1::IL10, SEQ ID NO:252; y IL10::GL1, SEQ ID NO:256), sustancialmente como se describe abajo. El CTLA4 humano es conocido por tener una reacción cruzada con CD86 murino, pero, hasta donde sepamos, no se han descrito anteriormente mediciones cinéticas o de afinidad. De forma similar, el anticuerpo GL1 de rata se ha descrito por ser específico para CD86 murino, pero no se han reportado mediciones cinéticas o de afinidad.

Se realizaron mediciones de SPR en un BIAcore™ T100 SPR (Pharmacia Biotech AB, Uppsala) usando HBS-EP+ (GE Healthcare) como tampón de migración. Se inmovilizó CD86-mlgG (25 µg/mL en acetato de sodio 10 mM, pH 4,0,R&D Systems, Inc) directamente sobre un chip CM5 utilizando química de acoplamiento de amina estándar (Kit Biacore Amina de Acoplamiento, GE Healthcare), con niveles de inmovilización finales de 150, 493, y 746 Ru. Se inyectaron las construcciones que contienen CTLA4 durante 150 segundos, a una velocidad de flujo de 10 µl/min, en una serie de concentraciones de 4 nM a 8 µM. La disociación se monitoreó durante 600 segundos (construcciones de CTLA4) o 1200 segundos (construcciones GL1), y la superficie se regeneró inyectando, glicina 10 mM, pH 1,7, durante 60 segundos. Las interacciones de unión con la superficie, y los niveles de inmovilización, eran estables a lo largo de al menos 100 ciclos de regeneración. Los datos se analizaron utilizando el programa informático BiaEvaluation para T100 (versión 2.0.1, GE Healthcare). Las cinéticas de unión para el CD86 murino inmovilizado se pudo determinar para todas las construcciones, y ajustarse con alta precisión a un modelo de analito bivalente (Tabla 7). Las constantes de disociación de equilibrio (KD) podrían calcularse con alta precisión para cada construcción ajustando la respuesta observada en la saturación a un modelo de equilibrio de estado estable. Para las variantes de CTLA4 (SEQ ID NOS:171, 173, 217, 219, y 404), el equilibrio simultáneo se ajusta en las tres células de flujo en tres densidades de inmovilización diferentes dando resultados más precisos que se ajustan a cualquier célula de flujo (ajuste denominado 'Rmax múltiple'), y así se enumeran las afinidades. Los resultados se muestran en la Tabla 7, de a continuación.

Tabla 7

Proteína Inmovilizada: Analito Ka Primer Sitio (M1s-1) Kd Primer Sitio (s-1-) Ka Segundo Sitio (s-1) Kd Segundo Sitio (s1-) KD (nM)

muCD86: SEQ ID NO:171 0,104 x 105 0,0241 0,0398 0,0627 1540 ± 210

muCD86: SEQ ID NO:173 0,132 x 105 0,0228 0,0405 0,0625 1810 ± 230

muCD86: SEQ ID NO:217 0,278 x 105 0,0787 0,0728 ± 0,0023 0,168 920 ± 88

muCD86: SEQ ID NO:219 0,321 x 105 0,0418 0,00026 0,00193 870 ± 160

muCD86: muCTLA4-Ig 0,278 x 105 0,0386 0,000659 0,00311 2250 ± 190

muCD86: GL1 mAb 0,789 ± 0,346 x 105 10,6 x 10-5 0,00879 0,00635 37,7 ± 4,4

muCD86: GL1 SMIP 1,18 ± 0,427 x 105 6,2 x 10-5 0,00964 ± 0,00031 0,0185 26,2 ± 5,4

muCD86: GL1 PIMS 1,77 x 105 1,25 x 10-4 0,0431 0,0977 78,3 ± 20

muCD86: SEQ ID NO:252 2,19 x 105 1,9 x 10-4 0,00943 0,0182 86,4 ± 8,3

muCD86: SEQ ID NO:256 6,73 x 104 4,4 x 10-5 0,0271 0,088 95,1 ± 13

34

Los exceptores que contienen los dominios CTLA4 humana y de IL10 humana (SEQ ID NOS:171 y 173) tenían afinidades ligeramente superiores a CD86 murino (1,54, 1,81 µM) que la afinidad reportada para CTLA4-Fc humano por CD86 humano (2,2 µM; Greene et al. 1996). Las variantes CTLA4 humanas que contienen la mutación L104E A29Y (SEQ ID NOS:217 y 219) tenían una afinidad sólo dos veces mayor por CD86 murino (870 -920 nM); esto parece alcanzarse a partir de una combinación de una tasa de activación inicial superior beneficiosa para CD86 murino, y una tasa de desactivación inicial perjudicial más alta. CTLA4 murino parece tener una afinidad total análoga o ligeramente más baja por CD86 murino que por CTLA4 humano. Para el anticuerpo GL1, el anticuerpo monoclonal de rata parental se examinó junto con un SMIP que contiene un fragmento de anticuerpo GL1 de cadena única (GL1 SMIP, SEQ ID NO:239); ambos mostraron cinéticas de unión similares, y una afinidad general por CD86 murino (37,7, 26,2 nM, respectivamente), que, era significativamente mayor (~50 veces) que la de construcciones que contienen CTLA4 humano o murino. Los exceptores que contienen IL-10 y el fragmento del anticuerpo GL1 (SEQ ID NOS:252 y 256) mostraron una afinidad 3 veces menor por CD86 murino en comparación con el anticuerpo parental o SMIP, aunque esto parecía alcanzarse a partir de o bien una tasa de activación inicial reducida, o bien a partir de una tasa de desactivación inicial reducida, en cada caso.

Ejemplo 12

Unión del exceptor a PD1 mediante BIACORE™

Se examinó la actividad de unión de PD1 para PDL1-Fc (SEQ ID NO:268) y PDL2-Fc (SEQ ID NO:270), así como para los exceptores que contienen un ectodominio CTLA4, y o bien dominios PDL1 (SEQ ID NO:13) o PDL2 (SEQ ID NO:336), sustancialmente como sigue. La unión de PD1 por PDL2 se ha reportado generalmente por tener mayor afinidad que la unión de PD1 por PDL1; un análisis cinético anterior (Youngnak et al., (2003) Biochem. Biophys. Res. Comm. 307, 672) sugirió afinidades moderadas (112 nM para PDL1, 37 nM para PDL2), mientras que un análisis de equilibrio realizado en un formato alternativo (Butte et al., (2007) Immunity 27, 111) sugirió afinidades más débiles (770 nM para PDL1, 590 nM para PDL2).

Las mediciones de SPR se realizaron en un BIAcore™ T100 SPR (Pharmacia Biotech AB, Uppsala) usando HBS-P+ (GE Healthcare) como tampón de migración. Una construcción con el ectodominio PD1 fusionado a un C-terminal AviTag™ (SEQ ID NO: 406) se biotiniló inicialmente utilizando la enzima BirA (Avidity, Inc., Aurora, CO) en Tris 10 mM, pH 8,0, y el tampón se reemplazó por PBS. La neutravidina (100 µg/mL en acetato de sodio 10 mM, pH 4,0, Thermo Scientific, Rockford, IL) se inmovilizó directamente sobre un chip CM5 utilizando química de acoplamiento de amina estándar (Kit Biacore de Acoplamiento de Amina, GE Healthcare), con niveles de inmovilización finales de 191, 771, y 1522 Ru, y se utilizó para capturar PD1 biotinilado a niveles de 171, 597, y 1244 Ru, respectivamente. Las construcciones que contienen PDL1/2 se inyectaron durante 120 segundos, a una velocidad de flujo de 30 µl/min, en una serie de concentraciones de 6 nM a 2 µM. La disociación se monitoreó durante 1200 segundos, y la superficie se regeneró mediante la inyección de NaOH 50 mM, NaCl 1 M durante 30 segundos. Las interacciones de unión con la superficie, y los niveles de inmovilización, eran estables a lo largo de al menos 50 ciclos de regeneración.

Los datos se analizaron utilizando el programa informático BiaEvaluation para el T100 (versión 2.0.1, GE Healthcare). Las cinéticas de unión para PD1 inmovilizado se pudieron determinar para todas las construcciones, y se ajustan ya sea con alta precisión a un modelo de analito bivalente (SEQ ID NOS:268 y 270) o a un modelo de unión 1:1 (SEQ ID NOS: 13 y 336) (Tabla 8). Las constantes de equilibrio de disociación (KD) también se podían calcular con gran precisión para cada construcción mediante el ajuste de la respuesta observada en la saturación a un modelo de equilibrio de estado estable. Los resultados se muestran en la Tabla 8, de a continuación.

Tabla 8

Proteína Inmovilizada: Analito Ka Primer Sitio (M1s-1) Kd Primer Sitio (s-1) Ka Segundo Sitio (s-1) Kd Segundo Sitio (s1-) KD (nM)

PD1: SEQ ID NO:13 0,699 x 105 0,165 n/a n/a 2360**

PD1: SEQ ID NO:336 1,16 x 105 0,0395 n/a n/a 340**

PD1: SEQ ID NO:268 0,96 ± 0,54 x 105 0,0544 3,18 x 10-6 0,000191 246 ± 27

PD1: PDL1-Fc* 1,07 x 105 0,010 n/a n/a 112**

PD1: SEQ ID NO:270 1,65 x 105 0,00724 0,0352 0,395 42 ± 4,4

PD1: PDL2-Fc* 1,22 x 105 0,0032 n/a n/a 26**

*Valor de la bibliografía (Youngnak et al., (2003) Biochem. Biophys. Res. Comm. 307, 672) **KD cinética calculada a partir de ka y kd del primer sitio

36

PDLI-Fc (SEQ ID NO:268) y PDL2-Fc (SEQ ID NO:270) mostraron similares cinéticas de unión y afinidades generales a los reportados en labibliografía. Los exceptors que contienen CTLA4 con dominios PDL1 o PDL2 fusionados en el extremo carboxilo terminal (SEQ ID NOS:13 y 336) tenían afinidades notablemente más débiles (~10 veces) a PD1 (2,36, 0,34 M) que las fusiones PDL1/PDL2 amino terminales (246, 42 nM); esto surge principalmente de un aumento notable en la tasa de desactivación inicial (0,165, 0,0395 vs 0,0544, 0,00724), indicando que el complejo PDL1/2:PD1 se puede desestabilizar cuando el dominio de unión está en la posición BD2 (carboxilo terminal).

Ejemplo 13

Respuestas de células T humanas que bloquean a las proteínas de fusión exceptoras

Este ejemplo demuestra que las proteínas de fusión exceptoras de esta divulgación pueden bloquear una respuesta de células T humanas. Para ensayar el bloqueo por proteínas de fusión exceptoras se utilizó una reacción de linfocitos mixta (MLR, de sus siglas en inglés). En resumen, se aislaron las células mononucleares de sangre periférica humanas (PBMC, de sus siglas en inglés) a partir de dos donantes utilizando métodos estándar, y se mantuvieron por separado. En base a estudios anteriores, las PBMC de un donante se designaron como la población "de respuesta" y las PBMC del segundo donante se designaron como la población "estimuladora". Ambos donantes de PBMC se marcaron con CFSE utilizando métodos estándar. Para evitar la división celular, las PBMC estimuladoras se trataron con mitomicina-C (MMC). La MMC (Sigma #M4287-2mg) se reconstituyó en agua destilada estéril (Gibco #15230) a una concentración de 0,5 mg/ml. Las PBMC estimuladoras se suspendieron a una concentración de 1x106/ml en un medio de cultivo completo (CM), (RPMI-1640 que contiene suero B humano al 10%, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, L-glutamina 2 mM, NEAA, piruvato de sodio, CM 0,2 µm filtrado), y se añadió MMC a una concentración final de 25 µg/ml. Después, la mezcla PBMC/MMC estimuladora se incubó a 37ºC, 5% de CO2, durante 30 minutos, después de lo cual las células se lavaron tres veces con CM. Las células de respuesta y las estimuladoras se suspendieron a una concentración de 4x106/ml en CM, y se añadió por pocillo 0,05 ml de cada población celular en una placa de cultivo de tejido de fondo plano de 96 pocillos hasta un final de 2x105 células/pocillo/donante. Todos los tratamientos a las concentraciones designadas mostradas en las figuras se añadieron a la placa al mismo tiempo que las células (las concentraciones anotadas para los anticuerpos y las proteínas de fusión se muestran en equivalentes molares). Se incubaron entonces a condiciones de MLR (montaje del tratamiento en una placa PBMC de 96 pocillos) a 37ºC, 5% de CO2, durante la duración del experimento. Los experimentos de MLR se recogieron a los 7-8 días en los cuales las células se tiñeron con anticuerpos marcados fluorescentemente contra CD5 (e-Bioscience) y CD25 (BD Biosciences) y se hicieron correr en un citómetro de flujo (LSR II, Becton Dickenson). Los datos se analizaron utilizando el programa informático de citometría de flujo FlowJo (TreeStar). La estrategia de entrada fue como sigue: las células que caen dentro de la puerta de linfocitos FSC:SSC se analizaron para la expresión de CD5, las células que luego caen posteriormente dentro de la puerta CD5 + se analizaron para la dilución CFSE y la regulación al alza de CD25. Las células que eran CD5+, CFSEbajo y CD25alto se consideraron células T activadas.

Las figuras 16, 17, 21, y 22 muestran que muchos tipos diferentes de proteínas de fusión exceptoras que contienen un antagonista de CD86 en combinación con un dominio de unión heterólogo, son capaces de bloquear una respuesta de células T para condiciones de MLR respuesta/estimuladora.

Ejemplo 14

Respuesta de células T de ratón que bloquean exceptores antagonistas de CD86

Se aislaron los esplenocitos de ratones de dos cepas diferentes, C57BL/6 (o B6D2F1) y BALB/c, utilizando la combinación de bisturí/nylon y el método de lisis RBC. En base a estudios anteriores, los esplenocitos a partir de la cepa de ratón C57BI/6 (o B6D2F1) se designaron como la población “De respuesta” y los esplenocitos a partir de la cepa BALB/c se designaron como la población “Estimuladora”. Ambos esplenocitos de las cepas de ratón se marcaron con CFSE como se describe anteriormente. Para prevenir la división celular, los esplenocitos estimuladores se trataron con mitomicina-C (MMC). La MMC (Sigma #M4287-2mg) se reconstituyó en agua destilada estéril (Gibco #15230) a una concentración de 0,5 mg/ml. Los esplenocitos estimuladores se suspendieron a una concentración de 5x107/ml en medio de cultivo completo (CM), (RPMI-1640 que contiene 10% de FBS, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, L-glutamina 2 mM, NEAA, piruvato de sodio, y 2-mercaptoetanol 0,05 mM) y se añadió MMC a una concentración final de 50 µg/ml. Después, la mezcla de esplenocitos estimuladores/MMC se incubó a 37ºC, 5% de CO2, durante 20 minutos después de lo cual las células se lavaron tres veces con CM. Las células respondedoras y estimuladoras se suspendieron a una concentración de 8x106/ml en CM y se añadió 0,05 ml de cada población celular por pocillo de una placa de cultivo de tejido de fondo plano de 96 pocillos hasta un final de 4x105 células/pocillo/cepa. Todos los tratamientos a las concentraciones designadas mostradas en las Figuras 18-20 se añadieron a la placa al mismo tiempo que las células (las concentraciones anotadas para los anticuerpos y las proteínas de fusión se muestran en equivalentes molares). Se incubaron entonces a condiciones de MLR (montaje del tratamiento en una placa de 96 pocillos con esplenocitos) a 37ºC, 5% de CO2, durante la duración del experimento. Los experimentos de MLR se recogieron a los 4-5 días en los cuales las células se tiñeron con anticuerpos marcados fluorescentemente contra CD5 (BD Biosciences) y CD25 (BD Biosciences) y se hicieron correr en un citómetro de flujo (LSR II, Becton Dickenson). Los datos se analizaron

utilizando el programa informático de citometría de flujo FlowJo (TreeStar). La estrategia de entrada fue como sigue: las células que caen dentro de la puerta de linfocitos FSC:SSC se analizaron para la expresión de CD5, las células que luego caen posteriormente dentro de la puerta CD5+ se analizaron para la dilución CFSE y la regulación al alza de CD25. Las células que eran CD5+, CFSEbajo y CD25alto se consideraron células T activadas.

Las figuras 18-20 muestran que muchos tipos diferentes de proteínas de fusión exceptoras que contienen un antagonista de CD86 en combinación con un dominio de unión heterólogo, son capaces de bloquear una respuesta de células T de ratón para condiciones de MLR (B6D2F1 respondedor/estimulador (BALB/c).

Ejemplo 15

Actividad inmunoestimuladora de moléculas exceptoras que contienen IL10

Se evaluó la actividad inmunoestimuladora de IL10 en diversas proteínas de fusión exceptoras en un ensayo de proliferación celular in vitro. En particular, se utilizó la línea celular MC/9 de hígado de ratón como sigue: la línea celular MC/9 (American Type Culture Collection #CRL-8306) se cultivó en DMEM o RPMI más 10% de FBS y 5% T-STIM de rata (BD #354115). Las células MC/9 se lavaron y reposaron en medios sin T-STIM de rata durante la noche (se incubó a 37ºC, 5% de CO2, en una placa de fondo plano de 96 pocillos a 1 x 105 células/pocillo, 100 µl/pocillo). Se incubaron varias concentraciones de proteína y de proteínas de fusión exceptoras IL10 durante 24 horas, y se evaluó la proliferación mediante la incorporación de [3H] timidina después de 6 horas.

La variante I87 de IL10 es conocida por ser menos inmuno-estimuladora en comparación con IL10 de tipo salvaje (Ding et al., J. Exp. Med. 191:213, 2000). La IL10 normalmente forma un homodímero con el dominio del amino terminal de cada molécula de monómero que se une al dominio carboxilo terminal del otro monómero). La variante IL10 I87 (I87A y I87S), junto con una molécula de IL10 que tiene un enlazador corto (gggsgg; SEQ ID NO:379) que separa además los dos subdominios de IL10 permitiendo que estos subdominios formen un dímero intramolecular, se examinaron en el formato exceptor para la actividad inmunoestimuladora.

La Figura 23 muestra que IL10 de ratón es capaz de potenciar la proliferación de células MC/9 en mayor medida que el exceptor CTLA4::IL10-I87A (SEQ ID NO:191), que contiene una única mutación en el aminoácido 87 de IL10. La Figura 24 muestra que tanto IL10 humana como (CTLA4::IL10)-75 (SEQ ID NO:173) son capaces de aumentar la proliferación de células MC/9 más que CTLA4::IL10-I87A (SEQ ID NO:191) o CTLA4::monoIL-10 (SEQ ID NO:181).

Ejemplo 16

Moléculas exceptoras modificadas genéticamente para tipos de células diana específicas

Este Ejemplo describe proteínas de fusión exceptoras modificadas genéticamente para dirigirse a tipos celulares específicos. Esto se logra mediante la modificación genética de las afinidades de BD1 y BD2. Se diseñaron cuatro moléculas exceptoras con diferente afinidad por CD86 y huIL10R1. La Tabla 9 muestra las diferentes relaciones de afinidad para estas cuatro moléculas. Al mejorar la afinidad por CD86 mediante el uso de, por ejemplo, un dominio de unión a CD86 (por ejemplo, 3D1 o FUN1 humanizado) y una molécula de IL10 modificada genéticamente (I87A) con menor afinidad por huIL10R1, entonces una disposición de este tipo se puede utilizar para favorecer la orientación a un tipo específico de célula de interés, tal como una APC.

Tabla 9

CD86: IL10R1 IL10R1/CD86

BD1: BD2 Afinidad (nM) Afinidad (nM) Relación de afinidad

CLTA4: IL10 2000* 0,1& 0,00005

CTLA4: IL10 I87A 2000* 10# 0,005

anti-CD86: IL10 40* 0,1& 0,0025

anti-CD86: IL10 I87A 40* 10# 0,25

*Afinidad de equilibrio aproximada a partir de la medición local de CTLA4, 3D1 y FUN1 humanizado unido a CD86 & Afinidad aproximada basada en Tan et al. (J. Biol. Chem. 268:21053, 1993) # Afinidad aproximada basada en Ding et al. (J. Exp. Med. 191:213, 2000) Ejemplo 17

Actividad exceptora en modelos animales in vivo con artritis reumatoide

Artritis Reumatoide

La eficacia terapéutica de cualquiera de las moléculas exceptoras descritas en la presente memoria se examina en al menos uno de los dos modelos murinos de artritis reumatoide (RA, de sus siglas en inglés), concretamente los modelos de artritis inducida por colágeno (CIA), y el de la glucosa-6-fosfato isomerasa (G6PI). Cada uno de estos modelos se ha demostrado ser útil para predecir la eficacia de ciertas clases de fármacos terapéuticos en la AR (véase Holmdahl (2000) Arthritis Res. 2:169; Holmdahl (2006) Immunol. Lett. 103:86; Holmdahl (2007) Methods MoI. Med. 136:185; McDevitt, H. (2000) Arthritis Res. 2:85; Kamradt y Schubert (2005) Arthritis Res. Ther. 7:20).

Modelo CIA

El modelo CIA es el mejor modelo de artritis de ratón caracterizado en términos de su patogenésis y base inmunológica. Además, es el modelo de AR más ampliamente utilizado y, aunque no es perfecto para predecir la capacidad de los fármacos para inhibir la enfermedad en pacientes, es considerado por muchos como el modelo de elección para investigar posibles nuevas terapias de la AR (Jirholt et al. (2001) Arthritis Res. 3:87; Van den Berg,

W.B. (2002) Curr. Rheumatol. Rep. 4:232; Rosloniec (2003) Collagen-Induced Arthritis. En Current Protocols in Immunology, eds. Coligan et al., John Wiley e Hijos, Inc, Hoboken, NJ).

En el modelo de CIA, la artritis se induce mediante la inmunización de ratones DBA/1 macho con colágeno Il (CII) en Adyuvante Completo de Freund (CFA). Específicamente, los ratones se inyectan por vía intradérmica/subcutánea con CII en CFA el Día 21, y se reforzaron con CII en Adyuvante Incompleto de Freund (IFA) el Día 0. Los ratones desarrollan signos clínicos de artritis dentro de días del refuerzo con CII/IFA. Un subconjunto de los ratones (0% a 10%) inmunizados con CII/CFA desarrollan signos de artritis en, o alrededor de, el Día 0 sin un refuerzo, y se excluyen de los experimentos. En algunos experimentos CIA, el refuerzo se omite y los ratones se tratan con el exceptor o el control de inicio 21 días después de la inmunización con CII/CFA (es decir, el primer día de tratamiento es el Día 0).

Los ratones se tratan con el exceptor, el vehículo (PBS), o un control negativo o positivo en un régimen preventivo y/o terapéutico. El tratamiento preventivo comienza en el Día 0 y continúa a lo largo del pico de la enfermedad en los ratones control (sin tratar). El tratamiento terapéutico comienza cuando la mayoría de los ratones muestran signos leves de artritis. Enbrel®, que ha demostrado tener buena eficacia tanto en modelos de artritis CIA como en los inducidos por G6PI, se usa como un control positivo. Los datos recogidos en cada experimento incluyen las puntuaciones clínicas y de incidencia acumulada de la artritis. Los signos clínicos de la artritis en el modelo CIA se puntúan empleando una escala de 0 a 4 como se muestra en la Tabla 10 de a continuación.

Tabla 10

Puntuación: Observaciones

0: Sin inflamación o enrojecimiento aparentes

1: Inflamación/enrojecimiento en uno de los tres dedos

2: Enrojecimiento y/o inflamación en más de tres dedos, inflamación leve que se extiende a la pata, tobillo inflamado o enrojecido, o inflamación/enrojecimiento leve de las patas delanteras

3: Pata inflamada con enrojecimiento leve a moderado

4: Enrojecimiento extremo e inflamación en toda la pata

Modelo G6PI

En el modelo G6PI, la artritis se induce por inmunización de ratones DBA/1 con G6PI en adyuvante (Kamradt y Schubert (2005) Arthritis Res. Ther. 7:20; Schubert et al., (2004) J. Immunol. 172:4503; Bockermann, R. et al., (2005) Arthritis Res. Ther. 7:R1316; Iwanami et al., (2008) Arthritis Rheum. 58:754; Matsumoto et al., (2008) Arthritis Res. Ther. 10:R66). La G6PI es una enzima presente en prácticamente todas las células del cuerpo, y no se sabe por qué la inmunización induce una enfermedad específica de la articulación. Un número de agentes, tales como CTLA4-lg, antagonistas de TNF (por ejemplo, Enbrel®) y el anticuerpo monoclonal del receptor anti-IL6, han demostrado inhibir el desarrollo de la artritis en el modelo G6PI.

Los ratones DBA/1 macho se inmunizaron con G6PI en Adyuvante Completo de Freund (CFA) con el fin de inducir la artritis. Específicamente, los ratones se inyectan por vía intradérmica/subcutánea con G6PI en CFA el Día 0, y desarrollan signos clínicos de artritis dentro de unos días tras la inmunización. Al igual que se discutió anteriormente con el modelo CIA, los ratones se tratan con el exceptor, el vehículo (PBS), o un control negativo o positivo en un

régimen preventivo y/o terapéutico. El tratamiento preventivo comienza en el Día 0, y continúa a lo largo del pico de la enfermedad en los ratones de control. El tratamiento terapéutico comienza cuando la mayoría de los ratones muestran signos leves de artritis. Enbrel®, que ha demostrado tener buena eficacia tanto en modelos de artritis CIA como en los inducidos por G6PI, se usa como un control positivo. Los datos recogidos en cada experimento incluyen las puntuaciones clínicas y de incidencia acumulada de la artritis. Los signos clínicos de la artritis en el modelo G6PI se puntúan empleando una escala similar a la empleada para el modelo CIA.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Thompson, Peter A. Baum, Peter R. Tan, Phillip

5 Blankenship, John W. Natarajan, Sateesh

<120> Proteínas de unión multi-diana antagonistas de CD86

10 <130> 910180.421PC

<140> PCT

<141>

15 <160> 422

<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

<210> 1 20 <211> 161

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 152

<212> PRT 30 <213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 115 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 4

<210> 5 20 <211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT 30 <213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<211> 178

<212> PRT 40 <213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 8 5 <211> 1700

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 10 <223> Proteína de fusión que codifica polinucleótidos que tiene un ectodominio CTLA4 y un dominio IL10

<400> 8

<210> 9

<211> 537

<212> PRT 20 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Proteína de fusión que tiene un ectodominio CTLA4 y un dominio IL10

<400> 9

<210> 10

<211> 1158 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polinucleótido que codifica el constructo CTLA4-Ig 10

<400> 10

<210> 11 15 <211> 356

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> Constructo CTLA4-Ig

<400> 11

<210> 12 5 <211> 1880

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

10 <223> Casete de expresión de nucleótidos de una proteína de fusión que tiene un ectodominio CTLA4 y un dominio PDL1

<400> 12

<210> 13

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Proteína de fusión que tiene un ectodominio CTLA4 y un dominio PDL1 10

<400> 13

<210> 14

<211> 338

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 318

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

<210> 16

<211> 2105 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Casete de expresión de nucleótidos de una proteína de fusión que tiene un ectodominio CTLA4 y un dominio 10 HLA-G5

<400> 16

15 <210> 17

<211> 672

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

20 <220>

<223> Proteína de fusión que tiene un ectodominio CTLA4 y un dominio HLA-G5

<400> 17

<210> 18

<211> 728

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

<210> 19

<211> 290

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

<210> 20

<211> 723 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

<210> 21

<211> 285 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

<210> 22

<211> 210

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 22

<210> 23

<211> 3794 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Casete de expresión de nucleótidos de una proteína de fusión que tiene un ectodominio CTLA4 y un dominio 10 HGF

<400> 23

<210> 24

<211> 1074 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Proteína de fusión que tiene un ectodominio CTLA4 y un dominio HGF 10

<400> 24

<210> 25

<211> 229

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

<210> 26

<211> 253

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 26

<210> 27

<211> 2486

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 5

<220>

<223> Casete de expresión de nucleótidos de una proteína de fusión que tiene un ectodominio CTLA4 y un dominio IL35

10 <400> 27

<210> 28

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Proteína de fusión que tiene un ectodominio CTLA4y un dominio IL35 20

<400> 28

<210> 29

<211> 200

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 29

<210> 30

<211> 1707 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Casete de expresión de nucleótidos de una proteína de fusión que tiene un ectodominio CTLA4 y un 10 ectodominio HVEM

<400> 30

15 <210> 31

<211> 539

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

20 <220>

<223> Proteína de fusión que tiene un ectodominio CTLA4 y un ectodominio HVEM

<400> 31

<210> 32

<211> 238 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32

5 <210> 33

<211> 230

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10 <400> 33 <210> 34

<211> 1823

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 5

<220>

<223> Casete de expresión de nucleótidos de una proteína de fusión que tiene un ectodominio CTLA4y un dominio PDL2

10 <400> 34

<210> 35

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Proteína de fusión que tiene un ectodominio CTLA4y un dominio PDL2 20

<400> 35

<210> 36

<400> 36

000 5

<210> 37

<220>

<223> Casete de expresión de nucleótidos de una proteína de fusión que tiene un ectodominio CTLA4y un 10 ectodominio HVEM

<400> 37 000

15 <210> 38

<220>

<223> Proteína de fusión que tiene un ectodominio CTLA4y un ectodominio HVEM

20 <400> 38 000

<210> 39

<213> Homo sapiens

<400> 39

<210> 40

<211> 255

<212> PRT

<213> Homo sapiens 35

<400> 40 <210> 41

<211> 1631 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Casete de expresión de nucleótidos de una proteína de fusión que tiene un ectodominio CTLA4y un dominio 10 GITR

<400> 41

<210> 42

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Proteína de fusión que tiene un ectodominio CTLA4 y un dominio GITR 10

<400> 42

<210> 43

<211> 2

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<210> 44

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<210> 45

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 45

<210> 46

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 46

<210> 47

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 47

<210> 48

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 48

<210> 49

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 49

<210> 50

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 50

<210> 51

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 51

<210> 52

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 52

<210> 53

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 53

<210> 54

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 54

<210> 55

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 55

<210> 56

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 56

<210> 57

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 57

<210> 58

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 58

<210> 59

<211> 12

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 59

<210> 60

<211> 12

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 60

<210> 61

<211> 12

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 61

<210> 62

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 62

<210> 63

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 63

<210> 64

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 64

<210> 65

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 65

<210> 66

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 66

<210> 67

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 67

<210> 68

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 68

<210> 69

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 69

<210> 70

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 70

<210> 71

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 71

<210> 72

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 72

<210> 73

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 73

<210> 74

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 74

<210> 75

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 75

<210> 76

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 76

<210> 77

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 77

<210> 78

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 78

<210> 79

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 79

<210> 80

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 80

<210> 81

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 81

<210> 82

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 82

<210> 83

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 83

<210> 84

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 84

<210> 85

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 85

<210> 86

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 86

<210> 87

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 87

<210> 88

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 88

<210> 89

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 89

<210> 90

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 90

<210> 91

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 91

<210> 92

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 92

<210> 93

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 93

<210> 94

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 94

<210> 95

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 95

<210> 96

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 96

<210> 97

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 97

<210> 98

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 98

<210> 99

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 99

<210> 100

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 100

<210> 101

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 101

<210> 102

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 102

<210> 103

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 103

<210> 104

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 104

<210> 105

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 105

<210> 106

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 106

<210> 107

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 107

<210> 108

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 108

<210> 109

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 109

<210> 110

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 110

<210> 111

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 111

<210> 112

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 112

<210> 113

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 113

<210> 114

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 114

<210> 115

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 115

<210> 116

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 116

<210> 117

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 117

<210> 118

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 118

<210> 119

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 119

<210> 120

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 120

<210> 121

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 121

<210> 122

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 122

<210> 123

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 123

<210> 124

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 124

<210> 125

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 125

<210> 126

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 126

<210> 127

<211> 18

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 127

<210> 128

<211> 18

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 128 <210> 129

<211> 18

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 129

<210> 130

<211> 18

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 130

<210> 131

<211> 18

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 131

<210> 132

<211> 19

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 132

<210> 133

<211> 19

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 133 <210> 134

<211> 19

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 134

<210> 135

<211> 20

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 135

<210> 136

<211> 20

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 136

<210> 137

<211> 20

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 137

<210> 138

<211> 20

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 138 <210> 139

<211> 20

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 139

<210> 140

<211> 20

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 140

<210> 141

<211> 20

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 141

<210> 142

<211> 20

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 142

<210> 143

<211> 21

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 143

<210> 144

<211> 21

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 144

<210> 145

<211> 21

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 145

<210> 146

<211> 21

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 146

<210> 147

<211> 21

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 147

<210> 148

<211> 21

<212> PRT <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 148

<210> 149 10 <211> 36

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Enlazador

<400> 149

20 <210> 150

<211> 122

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

25 <220>

<223> Enlazador

<210> 151

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador 40

<400> 151

<210> 152 45 <211> 39

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 152

<210> 153

<211> 20

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Enlazador

<400> 153

<210> 154

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<210> 155

<211> 17

<212> PRT 35 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 155

<210> 156

<211> 17 45 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 156

<210> 157

<211> 19

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 157

10

<210> 158

<211> 12

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15

<220>

<223> Enlazador

<210> 159

<211> 22

<212> PRT 25 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

30 <400> 159

<210> 160

<211> 118 35 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador 40

<400> 160

<210> 161 45 <211> 35

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 161

<210> 162

<211> 25

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 162

<210> 163

<211> 26

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Enlazador

<400> 163

<210> 164

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

35 <220>

<223> Enlazador

<400> 164

<210> 165

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 165

<210> 166

<211> 18

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 166

<210> 167

<211> 22

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia líder heteróloga

<400> 167

<210> 168

<211> 20

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia líder heteróloga

<400> 168

<210> 169

<211> 60

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polinucleótido que codifica una secuencia líder heteróloga

<400> 169 atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt 60

<210> 170

<211> 1611

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión CTLA4::IL10 con enlazador H68

<400> 170 5 <210> 171

<211> 536

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

10 <220>

<223> Una proteína de fusión CTLA4::IL10 con enlazador H68

<400> 171 5 <210> 172

<211> 1614 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión CTLA4::IL10 con enlazador H75

<400> 172

10 <210> 173

<211> 537

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Una proteína de fusión CTLA4::IL10 con enlazador H75

<400> 173 5 <210> 174

<211> 1602 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión CTLA4::IL10 con enlazador H77

<400> 174

10 <210> 175

<211> 533

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Una proteína de fusión CTLA4::IL10 con enlazador H77

<400> 175

<210> 176

<211> 1593 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión CTLA4::IL10 con enlazador H78 10

<400> 176

<210> 177

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Una proteína de fusión CTLA4::IL10 con enlazador H78 10

<400> 177 <210> 178

<211> 1584 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión CTLA4::IL10 con enlazador H79 10

<400> 178

<210> 179

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Una proteína de fusión CTLA4::IL10 con enlazador H79 10

<400> 179 <210> 180

<211> 1629 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión CTLA4::monoIL10 10

<400> 180

<210> 181

<211> 542

<212> PRT 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Una proteína de fusión CTLA4::monoIL10

10 <400> 181 <210> 182

<211> 2013 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión IL10::FUN1 10

<400> 182

<210> 183

<211> 670

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Proteína de fusión IL10::FUN1

<400> 183

<210> 184

<211> 1983 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión IL10::3D1 10

<400> 184

<210> 185

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Proteína de fusión IL10::3D1 10

<400> 185 <210> 186

<211> 2013 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión FUN1::IL10 10

<400> 186

<210> 187

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Proteína de fusión FUN1::IL10 10

<400> 187 <210> 188

<211> 1983 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Secuencia de nucleótidosque codifica la proteína de fusión 3D1::IL10 10

<400> 188

<210> 189

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Proteína de fusión 3D1::IL10 10

<400> 189 <210> 190

<211> 1611 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión CTLA4::IL10 I87A 10

<400> 190

<210> 191

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Proteína de fusión CTLA4::IL10 I87A 10

<400> 191 <210> 192

<211> 1611 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Secuencia de nucleótidosque codifica la proteína de fusión CTLA4::IL10 I87S 10

<400> 192

<210> 193

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Proteína de fusión CTLA4::IL10 I87S 10

<400> 193 <210> 194

<211> 1635 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión CTLA4 de ratón:: IL10 de ratón con H68 10 enlazador

<400> 194

<210> 195

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Proteína de fusión CTLA4 de ratón:: IL10 de ratón con enlazador H68 10

<400> 195 <210> 196

<211> 1638 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión CTLA4 de ratón:: IL10 de ratón con enlazador 10 H75

<400> 196

15 <210> 197

<211> 545

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

20 <220>

<223> Proteína de fusión CTLA4 de ratón:: IL10 de ratón con enlazador H75

<400> 197

<210> 198

<211> 1920 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión GITR::3D1 10

<400> 198

<210> 199 15 <211> 639

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> Proteína de fusión GITR::3D1

<400> 199

<210> 200

<211> 1989 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión HVEM::3D1 10

<400> 200

<210> 201 15 <211> 662

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Proteína de fusión HVEM::3D1

<400> 201 <210> 202

<211> 2163 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión PDL1::3D1 10

<400> 202

<210> 203

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Proteína de fusión PDL1::3D1 10

<400> 203 <210> 204

<211> 2106 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión PDL2::3D1 10

<400> 204

<210> 205

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Proteína de fusión PDL2::3D1 10

<400> 205 <210> 206

<211> 1806 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión TGFBetaR1::3D1 10

<400> 206 <210> 207

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Proteína de fusión TGFBetaR1::3D1 10

<400> 207 <210> 208

<211> 1629 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión CTLA4::monoIL10 I87A 10

<400> 208

<210> 209

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Proteína de fusión CTLA4::monoIL10 I87A 10

<400> 209 <210> 210

<211> 2001 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión monoIL10::3D1 10

<400> 210

<210> 211

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Proteína de fusión monoIL10::3D1 10

<400> 211 <210> 212

<211> 1983 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión IL10 I87A::3D1 10

<400> 212 <210> 213

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Proteína de fusión IL10 I87A::3D1 10

<400> 213 5 <210> 214

<211> 2001

<212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión monoIL10 I87A::3D1

<400> 214

<210> 215 10 <211> 666

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Proteína de fusión monoIL10 I87A::3D1

<400> 215

<210> 216

<211> 1071 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> variante LEA29-Fc -a CTLA4 10

<400> 216

<210> 217 15 <211> 356

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> variante LEA29-Fc -a CTLA4

<400> 217 <210> 218

<211> 1614 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión LEA29Y::IL10 con enlazador H75 10

<400> 218

<210> 219

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Proteína de fusión LEA29Y::IL10 con enlazador H75 10

<400> 219 <210> 220

<211> 1602 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión CTLA4::monoIL10 con enlazador H79 10

<400> 220

<210> 221 15 <211> 533

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

20 <223> Proteína de fusión CTLA4::monoIL10 con enlazador H79

<400> 221 5 <210> 222

<211> 1608 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión CTLA4::monoIL10 con enlazador H80

<400> 222

10 <210> 223

<211> 535

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Proteína de fusión CTLA4::monoIL10 con enlazador H80

<400> 223

<210> 224

<211> 1473 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: FUN1 SMIP M0114 humanizada – una variante generada de FUN1 humanizada 10

<400> 224

<210> 225

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: FUN1 SMIP M0114 humanizada -una variante generada de FUN1 humanizada 10

<400> 225 <210> 226

<211> 1473 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: FUN1 SMIP M0115 humanizada -una variante generada de FUN1 humanizada 10

<400> 226

<210> 227

<213> Secuencia Artificial

<220>

<400> 227 <210> 228

<211> 1473 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> FUN1 SMIP M0116 humanizada -una variante generada de FUN1 humanizada 10

<400> 228

<210> 229 15 <211> 490

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

20 <223> FUN1 SMIP M0116 humanizada -una variante generada de FUN1 humanizada

<400> 229 5 <210> 230

<211> 1473

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

10 <220>

<223> FUN1 SMIP M0117 humanizada -una variante generada de FUN1 humanizada

<400> 230

5 <210> 231

<211> 490

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

10 <220>

<223> FUN1 SMIP M0117 humanizada -una variante generada de FUN1 humanizada

<400> 231

<210> 232

<211> 1473 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: FUN1 SMIP M0118 humanizada -una variante generada de FUN1 humanizada 10

<400> 232

<210> 233

<213> Secuencia Artificial

<220>

<400> 233 <210> 234

<211> 1473 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> FUN1 SMIP M0119 Humanizada -una variante generada de FUN1 humanizada 10

<400> 234

<210> 235 15 <211> 490

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

20 <223> FUN1 SMIP M0119 humanizada -una variante generada de FUN1 humanizada <400> 235

<210> 236

<211> 2013

<212> ADN 10 <213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de nucleótidosque codifica la proteína de fusión FUN1 M0115::IL10 humanizada

<210> 237

<211> 670

<212> PRT 10 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Proteína de fusión FUN1 M0115::IL10 humanizada

15 <400> 237

<210> 238

<211> 1443 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> anti-SMIP de ratón CD86 (GL1) 10

<400> 238

<210> 239 15 <211> 480

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> anti-SMIP de ratón CD86 (GL1)

<400> 239 <210> 240

<211> 345 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos que codifica anti-CD86 (GL1) de ratón cadena pesada 10

<400> 240 <210> 241

<211> 115 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Anti-CD86 (GL1) de ratón cadena pesada 10

<400> 241

<210> 242 15 <211> 339

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> Secuencia de nucleótidos que codifica Anti-CD86 (GL1) de ratón cadena ligera

<400> 242

25 <210> 243

<211> 113

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

30 <220>

<223> Anti-CD86 (GL1) de ratón cadena ligera

<400> 243 <210> 244

<211> 20

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Anti-CD86 (GL1) de ratón enlazador scFv

<400> 244

<210> 245

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Anti-CD86 (GL1) de ratón HCDR1

<210> 246

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Anti-CD86 (GL1) de ratón HCDR2

<400> 246

<210> 247

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Anti-CD86 (GL1) de ratón HCDR3

<210> 248

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Anti-CD86 (GL1) de ratón LCDR1

<400> 248

<210> 249

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Anti-CD86 (GL1) de ratón LCDR2

<210> 250

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Anti-CD86 (GL1) de ratón LCDR3

<400> 250

<210> 251

<211> 1983

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión anti-CD86 de ratón::IL10

<400> 251

<210> 252

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Proteína de fusión anti-CD86 de ratón::IL10 10

<400> 252 <210> 253

<211> 2013 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión IL10:: Fun1 M0115 humanizada 10

<400> 253

<210> 254

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Proteína de fusión IL10:: Fun1 M0115 humanizada 10

<400> 254

5: <210> 255 <211> 1983 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

10: <220>

171

<223> Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión IL10::anti-CD86 de ratón

<400> 255

<210> 256

<211> 660

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial 10

<220>

<223> Proteína de fusión IL10::anti-CD86 de ratón

<210> 257

<211> 2016 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión IL10 I87A:: Fun1 M0115 humanizada con 10 enlazador H75

<400> 257

15 <210> 258

<211> 671

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

20 <220>

<223> Proteína de fusión IL10 I87A:: Fun1 M0115 humanizada con enlazador H75

<400> 258

<210> 259

<211> 1986 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión IL10 I87A::anti-CD86 de ratón con enlazador 10 H75

<400> 259

<210> 260

<211> 661

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Proteína de fusión IL10 I87A::anti-CD86 de ratón con enlazador H75

<400> 260

<210> 261

<211> 1614 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión CTLA4::IL10 I87A con enlazador H75 10

<400> 261

<210> 262

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Proteína de fusión CTLA4::IL10 I87A con enlazador H75 10

<400> 262 <210> 263

<211> 1380 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>Receptor beta de linfotoxina (LTBetaR) -Ig molécula sintetizada 10

<400> 263

<210> 264 15 <211> 459

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

20 <223> Receptor beta de linfotoxina (LTBetaR) -Ig molécula sintetizada

<400> 264

<210> 265

<211> 2217 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión LTBetaR::M0115 10

<400> 265

<210> 266

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Proteína de fusión LTBetaR::M0115 10

<400> 266

<210> 267

<211> 1359 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> PDL1 Ig molécula sintentizada 10

<400> 267

<210> 268 15 <211> 452

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> PDL1 Ig molécula sintetizada

<400> 268 <210> 269

<211> 1302 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: PDL2 Ig molécula sintetizada 10

<400> 269

<210> 270

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: PDL2 Ig molécula sintetizada 10

<400> 270

<210> 271

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: (GITR-L)-AFH molécula sintetizada 10

<400> 271

<210> 272 15 <211> 177

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> (GITR-L)-AFH molécula sintetizada

<400> 272 <210> 273

<211> 1281 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> mIg LIGHT molécula sintetizada 10

<400> 273

<210> 274 15 <211> 426

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> mIg LIGHT molécula sintetizada

<400> 274 <210> 275

<211> 2022 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión monoIL10-A2 bisagra::M0115 con enlazador H75 10

<400> 275

<210> 276

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Proteína de fusión monoIL10-A2 bisagra::M0115 con enlazador H75 10

<400> 276 <210> 277

<211> 1185 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: HVEM Ig molécula sintetizada 10

<400> 277

<210> 278

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: HVEM Ig molécula sintetizada 10

<400> 278 <210> 279

<211> 1179 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> IL10-Fc molécula sintetizada 10

<400> 279

<210> 280 15 <211> 392

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> IL10-Fc molécula sintetizada

<400> 280 <210> 281

<211> 1179 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: IL10 I87A-Fc molécula sintetizada 10

<400> 281

<210> 282

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: IL10 I87A-Fc molécula sintetizada 10

<400> 282 <210> 283

<211> 1197 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> monoIL10-Fc molécula sintetizada 10

<400> 283

<210> 284 15 <211> 398

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> monoIL10-Fc molécula sintetizada

<400> 284 <210> 285

<211> 1197 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> monoIL10 I87A-Fc molécula sintetizada 10

<400> 285

<210> 286 15 <211> 398

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> monoIL10 I87A-Fc molécula sintetizada

<210> 287

<211> 1239

<212> ADN 10 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Fc-IL10 molécula sintetizada

15 <400> 287 <210> 288

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Fc-IL10 molécula sintetizada 10

<400> 288 <210> 289

<211> 1236 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Fc-IL10 I87A molécula sintetizada 10

<400> 289

<210> 290 15 <211> 411

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> Fc-IL10 I87A molécula sintetizada

<400> 290 <210> 291

<211> 1254 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Fc-monoIL10 molécula sintetizada 10

<400> 291

<210> 292

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Fc-monoIL10 molécula sintetizada 10

<400> 292 <210> 293

<211> 1254 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Fc-monoIL10 I87A molécula sintetizada 10

<400> 293

<210> 294 15 <211> 417

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> Fc-monoIL10 I87A molécula sintetizada

<400> 294 <210> 295

<211> 1200 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: IL10 de ratón -null Fc de ratón molécula sintetizada 10

<400> 295

<210> 296

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: IL10 de ratón -null Fc de ratón molécula sintetizada 10

<400> 296 <210> 297

<211> 1095 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> CTLA4 de ratón -null2 Fc de ratón molécula sintetizada 10

<400> 297

<210> 298 15 <211> 364

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> CTLA4 de ratón -null2 Fc de ratón molécula sintetizada

<400> 298 <210> 299

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> NHP CD86-AFH molécula sintetizada 10

<400> 299

<210> 300 15 <211> 285

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> NHP CD86-AFH molécula sintetizada

<400> 300 <210> 301

<211> 1629 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión CTLA4::IL10 con enlazador H69 10

<400> 301

<210> 302

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Proteína de fusión CTLA4::IL10 con enlazador H69 10

<400> 302 <210> 303

<211> 1473 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> FUN1 SMIP molécula sintetizada 10

<400> 303

<210> 304 15 <211> 490

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> FUN1 SMIP molécula sintetizada

<400> 304

<210> 305

<211> 125 10 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> FUN1 cadena pesada

<400> 305

<210> 306

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> FUN1 cadena ligera 15

<400> 306

<210> 307 20 <211> 20

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> FUN1 enlazador scFV

<400> 307

30 <210> 308

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

35 <220>

<223> FUN1 HCDR1 <400> 308

<210> 309

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> FUN1 HCDR2

<400> 309

<210> 310

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> FUN1 HCDR3

<400> 310

<210> 311

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> FUN1 LCDR1

<400> 311

<210> 312

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> FUN1 LCDR2

<210> 313

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> FUN1 LCDR3

<400> 313

<210> 314

<211> 1530

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> FUN1 PIMS molécula sintetizada

<400> 314

10 <210> 315

<211> 509

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> FUN1 PIMS molécula sintetizada

<400> 315

5 <210> 316

<211> 1443

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> 3D1 SMIP molécula sintetizada

<210> 317

<211> 480

<212> PRT 10 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> 3D1 SMIP molécula sintetizada

15 <400> 317 <210> 318

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> 3D1 cadena pesada 10

<400> 318 <210> 319

<211> 112 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> 3D1 cadena ligera 10

<400> 319

<210> 320 15 <211> 20

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> Enlazador 3D1scFv

<400> 320

25 <210> 321

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

30 <220>

<223> 3D1 HCDR1

<400> 321

<210> 322

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> 3D1 HCDR2 <400> 322

<210> 323

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> 3D1 HCDR3

<210> 324

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> 3D1 LCDR1

<400> 324

<210> 325

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> 3D1 LCDR2

<210> 326

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> 3D1 LCDR3

<400> 326

<210> 327

<211> 1500

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> 3D1 PIMS molécula sintetizada

<400> 327

<210> 328

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> 3D1 PIMS molécula sintetizada 10

<400> 328 <210> 329

<211> 2016 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión M0115::IL10 I87A con enlazador H75 10

<400> 329

<210> 330

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Proteína de fusión M0115::IL10 I87A con enlazador H75 10

<400> 330 <210> 331

<211> 1500 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: GL1 PIMS molécula sintetizada 10

<400> 331

<210> 332

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: GL1 PIMS molécula sintetizada 10

<400> 332 <210> 333

<211> 1986 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión GL1::IL10 I87A con enlazador H75 10

<400> 333

<210> 334

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Proteína de fusión GL1::IL10 I87A con enlazador H75 10

<400> 334 <210> 335

<211> 1737 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión CTLA4::PDL2 con enlazador H65 10

<400> 335

<210> 336

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Proteína de fusión CTLA4::PDL2 con enlazador H65 10

<400> 336 <210> 337

<211> 1551 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión CTLA4::GITR con enlazador H65 10

<400> 337

<210> 338

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Proteína de fusión CTLA4::GITR con enlazador H65 10

<400> 338 <210> 339

<211> 1437 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión CTLA4::TGFBetaR1 con enlazador H65 10

<400> 339

<210> 340 15 <211> 478

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

20 <223> Proteína de fusión CTLA4::TGFBetaR1 con enlazador H65 <400> 340

<210> 341

<211> 798

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 10

<220>

<223> CD86 humano -AFH molécula sintetizada

<400> 341

<210> 342 5 <211> 265

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 10 <223> CD86 humano -AFH molécula sintetizada

<400> 342

<210> 343

<211> 801

<212> ADN 20 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> CD86 de ratón -AFH molécula sintetizada

25 <400> 343 <210> 344

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: CD86 de ratón -AFH molécula sintetizada 10

<400> 344

<210> 346

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: GITR Ig molécula sintetizada 10

15

<210> 345

<211> 1116

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

20

<220>

<223> GITR Ig molécula sintetizada

<400> 345

<400> 346 <210> 347

<211> 1137 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> PD1 Ig molécula sintetizada 10

<400> 347

<210> 348 15 <211> 378

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> PD1 Ig molécula sintetizada

<400> 348

<210> 349

<211> 1995

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 10

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión IL10 I87A::M0115 con enlazador H81

<400> 349 <210> 350

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223 > Proteína de fusión IL10 I87A::M0115 con enlazador H81 10

<400> 350 5 <210> 351

<211> 1986

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

10 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión IL10 I87A::M0115 con enlazador H82

<400> 351

5 <210> 352

<211> 661

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

10 <220>

<223> Proteína de fusión IL10 I87A::M0115 con enlazador H82

<400> 352

<210> 353

<211> 2001 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión IL10 I87A::M0115 con enlazador H83 10

<400> 353

<210> 354 15 <211> 666

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

20 <223 > Proteína de fusión IL10 I87A::M0115 con enlazador H83 <400> 354

<210> 355

<211> 20

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador H68

<400> 355

<210> 356

<211> 26

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador H69

<400> 356

<210> 357

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador H77

<400> 357

<210> 358

<211> 14

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador H78

<400> 358

<210> 359

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador H79

<400> 359

<210> 360

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador H80

<400> 360

<210> 361

<211> 14

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador H81

<400> 361

<210> 362

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador H82

<400> 362

<210> 363

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador H83

<400> 363

<210> 364

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Bisagra A2

<400> 364

<210> 365

<211> 21

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador H75

<400> 365

<210> 366

<211> 21

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador H75a

<400> 366

<210> 367

<211> 21

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador H75b

<400> 367

<210> 368

<211> 21

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador H75c

<400> 368 <210> 369

<211> 21

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador H75d

<400> 369

<210> 370

<211> 21

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador H75e

<400> 370

<210> 371

<211> 21

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador H75f

<400> 371

<210> 372

<211> 21

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador H75g

<400> 372

<210> 373

<211> 21

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador H75h

<400> 373

<210> 374

<211> 20

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador H68a

<400> 374

<210> 375

<211> 20

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador H68b

<400> 375

<210> 376

<211> 20

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador H68c

<400> 376

<210> 377

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Enlazador H68s

<400> 377

<210> 378

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Subunidad de enlazador de región variable

<210> 379

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> monoIL10 Enlazador

<400> 379

<210> 380

<211> 166

<212> PRT 20 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> monoIL10 molécula sintetizada

25 <400> 380

30 <210> 381

<211> 160

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

35 <220>

<223> IL10 I87A molécula sintetizada

<400> 381

<210> 382

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> IL10 I87S molécula sintetizada 10

<400> 382

<210> 383

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens 20

<400> 383

<210> 384 25 <211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 384 <210> 385

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 385

<210> 386

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 386

<210> 387

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 387

<210> 388

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 388

<210> 389

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 389

<210> 390

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 390

<210> 391

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 391

<210> 392

<211> 34

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 392

5 10: <210> 393 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 393

15: <210> 394 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 394

20

25: <210> 395 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 395

30: <210> 396 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens

35: <400> 396

<210> 397

<211> 112 40 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 397 5 <210> 398

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10 <400> 398

<210> 399

<211> 1614 15 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión CTLA4 x IL10 IgA 20

<400> 399

<210> 400 25 <211> 537

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 30 <223> CTLA4 x IL10 IgA Proteína de fusión

<400> 400

<210> 401

<211> 1530

<212> ADN 10 <213> Secuencia Artificial <220>

<400> 401

<210> 402

<211>: 509 10 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<400> 402 <210> 403

<211> 1095 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Secuencia de nucleótidos que codifica fusión CTLA4 murino a dominios Fc humanos 10

<400> 403

<210> 404

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Fusion CTLA4 murino a dominios Fc humanos 10

<400> 404 <210> 405

<211> 570 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos que codifica el ectodominio PD1 fusionado a un AviTag C-terminal 10

<400> 405

<210> 406 15 <211> 189

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> Ectodominio PD1 fusionado a un AviTag C-terminal

<400> 406

25 <210> 407

<211> 19

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

30 <220>

<223> Enlazador H75i

<400> 407

<210> 408 5 <211> 21

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 10 <223> Enlazador H75j

<400> 408

15 <210> 409

<211> 217

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

20 <220>

<223> IgG1 humana regiones CH2 y CH3

<210> 410

<213> Homo sapiens

<400> 410 <210> 411

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> CTLA4 con mutaciones A29Y L104E 10

<400> 411

<210> 413

<211> 1530

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> FUN1 PIMS M0115 molécula sintetizada

<400> 413

10

<210> 414

<211> 509

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15

<220>

<223> FUN1 PIMS M0115 molécula sintetizada

<210> 415

<211> 216 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: IgG1 humana CH2CH3 desLys 10

<400> 415

<210> 416

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: IgG1 humana CH2CH3 Null2 10

<400> 416

<210> 417

<211> 216

<212> PRT

<213> IgG1 humana CH2CH3 Null2 desLys Secuencia Artificial

<220>

<223> IgG1 humana CH2CH3 Null2 desLys

<400> 417

<210> 418 10 <211> 160

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 418

<210> 419 20 <211> 23

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Secuencia líder heteróloga <220>

<221> VARIANT

<222> 23

<223> Xaa = Cualquier aminoácido

<400> 419

<210> 420

<211> 24

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia líder heteróloga

<220>

<221> VARIANTE

<222> 23, 24

<223> Xaa = Cualquier aminoácido

<400> 420

<210> 421

<211> 25

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia líder heteróloga

<220>

<221> VARIANTE

<222> 23, 24, 25

<223> Xaa = Cualquier aminoácido

<400> 421

<210> 422

<211> 4

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Un motivo natural o añadido que confiere la capacidad de formar un enlance disulfuro

<400> 422

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Una proteína de fusión multi-específica, que comprende un dominio de unión a CD86 unido a un dominio de unión heterólogo mediante un dominio intermedio, en donde el dominio de unión heterólogo es una molécula IL-10 o es un anticuerpo anti-IL10R agonista.
2.

La proteína de fusión multi-específica de la reivindicación 1, en donde el dominio de unión a CD86 es un ectodominio de CTLA4 o un sub-dominio de un ectodominio de CTLA4.
3.

La proteína de fusión multi-específica de la reivindicación 1, en donde el dominio de unión a CD86 es un Fab, scFv, un anticuerpo de dominio, o un anticuerpo de una sola cadena pesada específico para CD86, en donde preferiblemente el dominio de unión a CD86 comprende dominios variables de cadena ligera y pesada del anticuerpo FUN1 anti-CD86 o una variante humanizada del mismo, más preferiblemente en donde el dominio de unión a CD86 comprende de 1 a 258 aminoácidos de SEQ ID NO:187 ó 237.
4.

La proteína de fusión multi-específica de la reivindicación 1, en donde el dominio de unión a CD86 comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOS:1-6.
5.

La proteína de fusión multi-específica según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el dominio de unión heterólogo comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en:SEQ ID NO:7 y una variante de SEQ ID NO:7 que comprende una mutación puntual en la posición 87.
6.

La proteína de fusión multi-específica según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el dominio intermedio comprende una región constante de inmunoglobulina o una sub-región constante dispuesta entre el dominio de unión a CD86 y el dominio de unión heterólogo, en donde preferiblemente la sub-región constante de inmunoglobulina es o comprende IgG1 CH2CH3.
7.

La proteína de fusión multi-específica según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el dominio intermedio comprende una región constante de inmunoglobulina dispuesta entre un primer y un segundo enlazador, en donde el primer y el segundo enlazador se selecciona independientemente del grupo que consiste en: SEQ ID NOS:43-166, 244, 307, 320, 355-379, y 383-398, en donde preferiblemente el dominio intermedio comprende una región Fc de inmunoglobulina humana, albúmina, transferrina, o un dominio estructural o una combinación de los mismos que se une a una proteína sérica, o una combinación de los mismos.
8.

La proteína de fusión multi-específica según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el dominio intermedio comprende una estructura, desde el amino terminal al carboxilo terminal, como sigue:

-

L1-X-L2, en donde:

L1 y L2 son cada uno independientemente un enlazador que comprende de dos a 150 aminoácidos; y

X se selecciona del grupo que consiste en: una región constante de inmunoglobulina, una sub-región constante de inmunoglobulina, albúmina, transferrina, y otra proteína sérica que se une a proteína, en donde preferiblemente la región constante de inmunoglobulina o sub-región constante comprende dominios IgG1 CH2 y CH3, más preferiblemente en donde L1 es una región bisagra de inmunoglobulina humana, y cero, uno, o más restos de cisteína en la región bisagra de inmunoglobulina humana se sustituyen cada uno por otro aminoácido, más preferiblemente en donde X es un dominio Fc de IgG1 humana o al menos un dominio CH de la misma, opcionalmente mutado para eliminar la interacción FcγRI-III manteniendo la interacción FcRn.
9.

La proteína de fusión multi-específica según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el dominio intermedio es un dominio de dimerización.
10.

La proteína de fusión multi-específica de la reivindicación 1, que tiene la siguiente estructura:

N-BD1-X-L2-BD2-C, en donde:

BD1 es el dominio de unión a CD86, en donde el dominio de unión a CD86 es al menos 90% idéntico al ectodominio de CTLA4;

-X-es –L1-CH2CH3-, en donde L1 es una región bisagra IgG1, opcionalmente mutada mediante la sustitución de la primera cisteína y en donde –CH2CH3-es la región CH2CH3 de un dominio Fc IgG1, opcionalmente mutado para eliminar la interacción FcγRI-III manteniendo la interacción FcRn;

L2 es un enlazador que se selecciona del grupo que consiste en: SEQ ID NOS:43-166, 244, 307, 320, 355379, y 383-398; y

BD2 es el dominio de unión heterólogo.
11.

La proteína de fusión multi-específica de la reivindicación 1, en donde la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en: SEQ ID NOS:9, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 209, 211, 213, 215, 219, 221, 223, 237, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 276, 302, 330, 334, 350, 352, y 354.
12.

Una composición que comprende una o más proteínas de fusión multi-específicas según cualquiera de las reivindicaciones precedentes y un vehículo, diluyente, o excipiente aceptable farmacéuticamente.
13.

Un polinucleótido que codifica la proteína de fusión multi-específica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde preferiblemente el polinucucleótido comprende una secuencia de ácidos nucleicos que se selecciona del grupo que consiste en: SEQ ID NOS:8, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 208, 210, 212, 214, 218, 220, 222, 236, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 275, 301, 329, 333, 349, 351, y 353.
14.

Un vector de expresión que comprende el polinucleótido según la reivindicación 13 operablemente unido a una secuencia de control de la expresión.
15.

Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión según la reivindicación 14.
16.

La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, o la composición de la reivindicación 12 para usar en el tratamiento de una enfermedad autoinmune que se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, asma, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad inflamatoria intestinal (que incluye la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa), enfermedad de injerto contra huésped, psoriosis, esclerosis múltiple, dermatomiositis, polimiositis, anemia perniciosa, cirrosis biliar primaria, encefalomielitis aguda diseminada (EMAD), enfermedad de Addison, espondilitis anquilosante, síndrome de anticuerpos antifosfolípidos (SAFL), hepatitis autoinmune, diabetes mellitus tipo 1, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré (GBS), enfermedad de Hashimoto, púrpura trombocitopénica idiopática, lupus eritematoso, pénfigo vulgar, síndrome de Sjögren, arteritis temporal (también conocida como "arteritis de células gigantes"), anemia hemolítica autoinmune, penfigoide bulloso, vasculitis, enfermedad celíaca, endometriosis, hidradenitis supurativa, cistitis intersticial, morfea, esclerodermia, narcolepsia, neuromiotonía, vitíligo y enfermedad autoinmune del oído interno.

270