ES2657236T3 - Tipificaciones de aloantígenos plaquetarios y pruebas de anticuerpos plaquetarios - Google Patents
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Abstract
Un método para la detección de anticuerpos humanos dirigidos contra aloantígenos de plaquetas humanas (HPA), en una muestra, que comprende las etapas: (a) proporcionar al menos una superficie que tenga al menos plaquetas humanas o fracciones de membrana de plaquetas unidas a la misma, en donde los HPA de interés que están presentes en dichas plaquetas o fracciones de membrana de plaquetas son conocidos; (b) poner en contacto dicha superficie con dicha muestra, en el que los anticuerpos humanos dirigidos contra los HPA que están presentes en dichas plaquetas o fracciones de membrana de plaquetas, contenidos en dicha muestra, se inmovilizan sobre dicha superficie uniéndose específicamente a las plaquetas o fracciones de membranas de plaquetas de la etapa (a); (c) poner en contacto dicha superficie con un agente de detección marcado con fluorescencia, en el que dicho agente de detección se une específicamente a anticuerpos humanos dirigidos contra los HPA que están presentes en dichas plaquetas o fracciones de membrana de plaquetas, y en el que dicho agente de detección, los respectivos anticuerpos humanos contenidos en dicha muestra, y las plaquetas humanas o fracciones de membrana de plaquetas de la etapa (a) forman un complejo unido a la superficie; (d) excitar dicho complejo unido a la superficie con un campo evanescente de una fuente de luz; (e) medir la fluorescencia emitida a partir de dicho complejo unido a la superficie; y (f) detectar los anticuerpos humanos contra los HPA que están presentes en dicho plaquetas o fracciones de membrana de plaquetas en base a la fluorescencia emitida medida en la etapa (e), en donde las plaquetas o fracciones de membrana de plaquetas son plaquetas o fragmentos de plaquetas que comprenden glicoproteínas nativas.
Description
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Las superficies proporcionadas en el método anterior están hechas de materiales que no están particularmente limitados y que se conocen en la técnica. Preferiblemente, tales materiales son de vidrio o de un plástico, preferiblemente un plástico, tal como poliestireno, polipropileno, polietileno, tereftalato de polietileno, policicloolefina, poliacrilonitrilo, polimetilmetacrilato y/o mezclas y combinaciones de estos plásticos. En principio, cualquier plástico que, básicamente, no absorba la luz en el rango visible es adecuado. En una realización, el plástico también se puede teñir de color azul claro, por ejemplo, con el fin de filtrar una emisión causada por la luz de dispersión. Preferiblemente, la superficie de arriba es el interior de un recipiente cóncavo, como una cubeta o un pocillo de una placa de microtitulación o de un cartucho de prueba, por ejemplo. Tales cubetas, placas de microtitulación y los cartuchos de prueba pueden ser obtenidos económicamente por moldeo por inyección y preferiblemente tienen un volumen de reacción para el líquido de 1 a 400 l, especialmente preferido de 5 a 100 l, y lo más preferido de 10 a 40 l. Preferiblemente, las cubetas, placas de microtitulación o cartuchos de prueba se hacen en una sola pieza. En este contexto, la expresión "cartucho de prueba" no se limita específicamente e incluye cualquier objeto que pueda ser utilizado para proporcionar una superficie en la que el anticuerpo de la etapa (a) del método anterior se una y que pueda ser puesto en contacto con las soluciones o reactivos respectivos. Por ejemplo, el cartucho de prueba puede ser un cartucho desechable de medición de una sola vía, que contenga varios pocillos de medición totalmente separados, que son pre-condicionados a las necesidades específicas de la medición.
Tal como se utiliza en este aspecto, el término "unido" significa preferiblemente que el anticuerpo de la etapa (a) se adhiere a la superficie mediante absorción (absorción directa). Sin embargo, dicho anticuerpo también se puede unir a la superficie a través de un elemento de puente, por ejemplo una proteína, tal como un anticuerpo adicional o un antígeno. Dicho anticuerpo también puede unirse a la superficie por un enlace covalente. Esto puede ser, por ejemplo, producido usando una superficie de acrilato mediante la conversión con una carbodiimida. Además, el término "unido" en el sentido de la presente invención incluye la adhesión a una superficie o a otro ligando, e incluye tanto interacciones covalentes como no covalentes, como, por ejemplo, las interacciones basadas en interacciones iónicas, polares o no polares.
En este aspecto, el anticuerpo de la etapa (a) se puede colocar en la superficie por un método común. Por ejemplo, dicho anticuerpo se puede recubrir en la superficie. Después de esta etapa, la superficie se trata preferiblemente con otra solución, y los sitios en la superficie no adheridos a dicho anticuerpo se bloquean o se bloquearán, por ejemplo, otra proteína o un compuesto químico tal como un detergente.
De acuerdo con el método anterior, el anticuerpo de la etapa (a) puede formar un complejo, en el que este complejo al menos incluye, además de dicho anticuerpo, el anticuerpo marcado con fluorescencia de la etapa (d) y la glicoproteína que lleva el HPA a detectar. Con el anticuerpo de la etapa (a) unido a la superficie, el complejo con la glicoproteína que lleva el HPA a detectar es "anclado" a la superficie, es decir, fijado a la misma y puede al mismo tiempo ser detectado mediante el marcado con el anticuerpo de la etapa (d) que contiene el fluoróforo.
El anticuerpo de la etapa (a) del método anterior de la presente invención no está particularmente limitado, con tal que se dirija contra la glicoproteína que lleva al menos un HPA a detectar, es decir, a condición de que se una específicamente a dicha glicoproteína. Los anticuerpos adecuados se conocen en la técnica y pueden ser obtenidos por ejemplo, comercialmente. Estos anticuerpos no están restringidos específicamente en relación con su isotipo o su origen. Entre los anticuerpos ejemplares en este contexto podrían estar, por ejemplo, los anticuerpos IgG murinos. Las glicoproteínas de interés a este respecto son conocidas en la técnica e incluyen, en particular, gpIIbIIIa, gpIaIIa, gpIbIX y HLA/beta-2-microglobulina. Los anticuerpos particulares que se pueden utilizar a este respecto son el anticuerpo monoclonal anti-gpIIbIIIa RFGP56 y el anticuerpo monoclonal anti-gpIaIIa AK7. Otros anticuerpos adecuados son, por ejemplo, el clon anti-gpIIbIIIa P2 Immuntech o los clones anti-gpIaIIa Gi9 y Y418. Muchos anticuerpos más adecuados los pueden encontrar las personas expertas en la técnica.
Además, el anticuerpo marcado con fluorescencia de la etapa (d) del método anterior no está particularmente limitado, con tal que se dirija contra el HPA a detectar, es decir, a condición de que se una específicamente a dicho HPA. Los anticuerpos adecuados no están restringidos específicamente en relación con su isotipo y origen, y son conocidos en la técnica. Además, el marcador fluorescente de dicho anticuerpo no está particularmente restringido, siempre que pueda emitir luz fluorescente cuando se excita con un campo evanescente de una fuente de luz. Los marcadores fluorescentes adecuados son conocidos en la técnica. En una realización preferida, dicho marcador fluorescente es alo-ficocianina (APC).
Preferiblemente, en el método anterior, el anticuerpo de la etapa (a) y el anticuerpo de la etapa (d) tienen diferentes especificidades, es decir, se unen a diferentes epítopos.
En el método anterior, el anticuerpo de la etapa (a) y el anticuerpo de la etapa (d) se pueden intercambiar, es decir, el anticuerpo de la etapa (a) está dirigido contra al menos un HPA a detectar, y el anticuerpo marcado con fluorescencia de la etapa (d) se dirige contra la glicoproteína que lleva al menos un HPA a detectar. En esta realización particular, dichos anticuerpos, así como el marcador fluorescente, son como se definen anteriormente.
Tal como se utiliza en este documento, el término "anticuerpo" no sólo se refiere al anticuerpo respectivo como tal, sino que también incluye cualquier fragmento y derivado de dicho anticuerpo, siempre que dichos fragmentos conserven la capacidad de unirse específicamente al mismo epítopo. Los fragmentos respectivos pueden ser
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fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), o fragmentos F(ab')2. Además, en lugar de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, se puede utilizar cualquier otra macromolécula que tenga la capacidad de unirse específicamente a un epítopo. Tales macromoléculas incluyen, por ejemplo, aptámeros de nucleótidos, aptámeros de péptidos, nanocuerpos, aficuerpos, anticalins, DARPins, Phylomers, AdNectins y proteína A.
De acuerdo con el método anterior, en la etapa (b) las plaquetas contenidas en la muestra se lisan y las proteínas de la membrana de dichas plaquetas se solubilizan. Los métodos y agentes para la lisis y la solubilización no están particularmente limitados y se conocen en la técnica. Incluyen, por ejemplo, el tratamiento de dichas plaquetas con concentraciones adecuadas de tensioactivos tales como Tween 20 (polisorbato 20; polioxietileno (20) monolaurato de sorbitán) o NP40 (nonil fenoxipolietoxiletanol).
En el método anterior, las etapas (c) y (d) pueden llevarse a cabo posteriormente o al mismo tiempo. En particular, en una realización preferida, el anticuerpo marcado con fluorescencia de la etapa (d) puede estar contenido en la solución de lisis y solubilización formada en la etapa (b), de manera que las etapas (c) y (d) se ejecutan simultáneamente, cuando la solución respectiva se pone en contacto con la superficie.
Preferiblemente, el método anterior no requiere más de dos, más preferiblemente más de una, etapas de manipulación de líquidos. En este contexto, la expresión "paso de manipulación de líquidos", como se usa en este documento generalmente, incluye cualquier paso que transfiera, elimine o añada un líquido desde y/o hacia un sitio de acción. Por ejemplo, las etapas de manipulación de líquido de acuerdo con la presente invención incluyen la adición, por ejemplo, pipeteando, un líquido en el pocillo de una cubeta, una placa de microtitulación o un cartucho de ensayo, o eliminando un líquido de tal pocillo. Además, de acuerdo con otra realización preferida, el método anterior no incluye ninguna etapa de lavado.
En particular, el método anterior preferiblemente no requiere etapas para retirar el volumen que contienen los reactivos en exceso, tales como el anticuerpo marcado con fluorescencia de la etapa (d), y/o el lavado de la superficie en la que el anticuerpo de la etapa (a ) y/o el complejo que se mide están unidos. Esto acelera ventajosamente el método anterior para obtener rápidamente los resultados de las mediciones deseadas, evita la acumulación de residuos líquidos y los errores operacionales al llevar a cabo el método.
En este contexto, el método como se define anteriormente es preferiblemente un método de un solo paso. Según la presente invención, método de "un solo paso" significa que sólo se lleva a cabo una reacción de formación de complejo, lo que generalmente requiere sólo una o, como mucho, dos etapas de manipulación de líquidos que se llevan a cabo por el operador con el fin de obtener el resultado de la medición deseada. Por lo tanto, etapas adicionales de reacción, tales como la adición de más reactivos después de la formación del complejo inicial se evitan ventajosamente.
Por otra parte, una realización adicional del método como se define anteriormente, dicho método no incluye la agitación del líquido. En este contexto, la expresión "agitación del líquido" no está limitada específicamente e incluye cualquier tipo de agitación que se produzca en el líquido, a excepción de la difusión natural. Por ejemplo, la agitación del líquido en el sentido de la presente invención incluye agitación, bombeo, centrifugación, agitación ultrasónica, etc. Al evitar cualquier agitación del líquido, a excepción de la difusión natural que ocurre, el método puede llevarse a cabo de una manera simple y eficaz, y por lo tanto evita configuraciones técnicas complicadas incluyendo los dispositivos de agitación respectivos.
De acuerdo con una realización adicional del método anteriormente definido, el resultado determinado en la etapa
(g) se obtiene a los 30 minutos, preferiblemente 20 minutos, más preferiblemente 10 minutos o menos a partir del inicio de la etapa (c). Según la presente invención, se obtiene el resultado cualitativo o cuantitativo a los 30 minutos, preferiblemente 20 minutos, más preferiblemente 10 minutos o menos después de que la solución que contiene la muestra lisada y solubilizada y el anticuerpo marcado con fluorescencia de la etapa (d) se haya puesto en contacto con la superficie a la que el anticuerpo de la etapa (a) es unido. Preferiblemente, el resultado se obtiene a los 9 minutos o menos, 8 minutos o menos o 7 minutos o menos. Otros ejemplos incluyen períodos de 6 minutos o menos, 5 minutos o menos o 4 minutos o menos.
De acuerdo con una realización adicional del método anterior de la presente invención, dicha superficie se pone en contacto antes de la etapa (e) con al menos un colorante que absorbe en el intervalo de absorción y/o emisión del marcador fluorescente del anticuerpo de la etapa (d). Según la presente invención, la excitación del fluoróforo en el volumen, es decir, del fluoróforo que no forma parte del complejo unido a la superficie, se puede suprimir si la solución que se coloca en contacto con la superficie tiene al menos un colorante añadido a la misma que tiene una absorción en el intervalo de absorción y/o emisiones de dicho fluoróforo. La absorción del colorante añadido al volumen se coordina con el intervalo de absorción y/o emisión de dicho fluoróforo. Se puede utilizar un colorante individual o una mezcla de colorantes. El intervalo de absorción del fluoróforo se correlaciona generalmente con la longitud de onda de la fuente de luz utilizada. No es necesario que el colorante tenga un máximo de absorción en este intervalo especial; un hombro en el espectro de absorción puede ser suficiente. Por ejemplo, si se utilizan fluoróforos como APC o Cy5, el colorante utilizado puede tener la absorción entre 600 nm y 700 nm, como, por ejemplo, Brilliant Blue FCF. Otro ejemplo de un colorante que se puede utilizar a este respecto es Brilliant Black BN. La concentración de colorante añadido depende tanto del coeficiente de absorción de cada colorante en solución
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como de la frecuencia de la luz irradiada. La concentración de colorante puede ajustarse, dependiendo del colorante, de modo que la luz que penetra, básicamente, pueda ser absorbida en un grado de más del 90% de absorbancia en 0,1 mm por encima de la superficie.
De acuerdo con las etapas (e) a (g) del método anterior, el complejo unido a la superficie generado en la etapa (a) a
(d) de dicho método se excita con un campo evanescente de una fuente de luz, la fluorescencia emitida por dicho complejo se mide, y al menos un HPA de interés se detecta basándose en la fluorescencia emitida medida, en el que una señal de fluorescencia positiva indica la presencia de dicho complejo y, por tanto, la presencia de al menos una HPA de interés.
En este contexto, la expresión "fuente de luz", como se usa en el presente documento, no se limita específicamente e incluye cualquier fuente de luz que sea adecuada para crear un campo evanescente y excitar el fluoróforo unido al anticuerpo de la etapa (d). Por ejemplo, se puede usar luz monocromática como fuente de luz. La luz debe ser utilizada para que tenga una longitud de onda que preferiblemente no interfiera con la emisión del fluoróforo y, preferiblemente que se cruce con la banda de absorción del colorante. Un láser es especialmente preferido como fuente de luz, cuya luz emite una longitud de onda de 635 nm.
El método anterior se basa en una nueva tecnología para el análisis de biomoléculas mediante la excitación de campo evanescente de fluoróforos unidos y la medición directa de los sucesos de unión a tiempo real como se describe en las patentes europeas EP 1 079 226 B1, EP 1 204 856 B1 y EP 1 371 967 B1. El principio funcional de este biosensor de campo evanescente es la interacción de un analito unido a la superficie con un ligando en solución mediante una interacción no covalente. El ligando en solución se une covalentemente a una molécula fluorescente. La excitación preferida de la molécula fluorescente es coherente con la luz tal como se genera, por ejemplo, por un diodo láser y luego se detectan los fotones emitidos. Los fluoróforos adecuados para ello son, por ejemplo, los colorantes Cy5, Alexa o la proteína captadora de luz alo-ficocianina (APC).
La reacción bioquímica se lleva a cabo en un pequeño pocillo, similar a un pocillo de ELISA en forma y dimensiones con una entidad óptica adicional en la parte inferior. Como en el ELISA, el pocillo del biosensor y su parte inferior óptica se producen mediante moldeo por inyección del material termoplástico, como, por ejemplo, poliestireno. Las principales diferencias entre el método de ELISA y los métodos evanescencia de biosensores son los marcadores del ligando en solución. Para ELISA, el marcador es una enzima y para la tecnología de evanescencia el ligando está marcado con una molécula fluorescente. La medición del fluoróforo unido, es decir, el ligando fluorescente en solución que se une al analito inmovilizado en la superficie evanescente, se logra mediante la excitación específica del ligando marcado de manera fluorescente unido utilizando el principio de excitación del campo evanescente. La excitación selectiva del fluoróforo unido se produce por un campo evanescente de la luz utilizando una construcción óptica resultante en una excitación específica de una capa gruesa de aproximadamente 200 nm de líquido situada en el fondo del pocillo y que no excita al ligando marcado de manera fluorescente en exceso presente en el solución por encima de la superficie de unión. Sólo los ligandos marcados con fluorescencia que están en el campo evanescente se excitan y emiten fotones. Este método permite la observación de una reacción de unión del ligando soluble con el ligando inmovilizado en tiempo real.
Aunque la mayoría de los ensayos inmunológicos utilizados en pruebas diagnósticas in vitro tienen un procedimiento largo y tedioso que implica tiempos de incubación, lavados, adición de reactivos o soluciones secundarias o terciarias para obtener un resultado de un biomarcador, el biosensor de evanescencia permite realizar ensayos diagnósticos in vitro en poco tiempo. La instrumentación compleja y costosa de la automatización del ELISA o de los ensayos inmunológicos basados en perlas no es requerida ni necesaria cuando se utiliza el biosensor de evanescencia para aplicaciones de diagnóstico.
El método anterior se puede poner en práctica en conexión con un dispositivo de prueba diagnóstico para llevar a cabo dicho método, comprendiendo al menos una superficie que tenga al menos el anticuerpo de la etapa (a) unido a la misma.
En este contexto, la superficie, el anticuerpo de la etapa (a), agentes de lisis y solubilización adecuados utilizados en la etapa (b), y el anticuerpo marcado con fluorescencia de la etapa (d) son como se definen anteriormente. Además, las definiciones dadas anteriormente se aplican también a este dispositivo.
Preferiblemente, el dispositivo de prueba de diagnóstico anterior tiene la forma de una cubeta, placa de microtitulación o cartucho de prueba, preferentemente está hecho de vidrio o de un plástico, preferiblemente un plástico, tal como poliestireno, polipropileno, polietileno, tereftalato de polietileno, policicloolefina, poliacrilnitrilo, polimetilmetacrilato y/o mezclas y composiciones de estos plásticos. En principio, cualquier plástico que, básicamente, no absorba luz en el rango visible es adecuado. El plástico también se puede teñir de color azul claro, por ejemplo, con el fin de filtrar alguna emisión causada por la luz de dispersión. Las cubetas de plástico, placas de microtitulación y los cartuchos de prueba pueden ser obtenidos económicamente por moldeo por inyección y preferiblemente tienen un volumen de reacción de 1 a 400 l, especialmente preferido de 5 a 100 l, y lo más preferido de 10 a 40 l. Preferiblemente, las cubetas, placas de microtitulación o cartuchos de prueba se hacen en una sola pieza.
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A continuación, el ensayo se realizó diluyendo el plasma humano marcado M del Ejemplo 6 tomando una parte de plasma en 200 partes de FCS suplementado con EDTA 10 mM. Se prepararon dos muestras, en la que la primera muestra utilizó plasma M y a la segunda muestra se le añadió un anticuerpo HPA-1a anti-humano. Se añadió IgG APC anti-humano (Jackson) a una concentración final de 20 microgramos por mililitro y la mezcla se analizó con un
5 biosensor recubierto de plaquetas. Tres revestimientos diferentes se utilizaron para este ensayo, las plaquetas HPA1a positivos, plaquetas HPA 1a negativos y pocillos no recubiertos vacíos como control negativo para el biosensor y la línea de fondo del instrumento. Las mezclas se pipetearon en los pocillos y se midieron como se describe en los ejemplos anteriores durante 10 minutos en un instrumento biosensor de evanescencia y los resultados se registraron.
10 La figura 9 muestra una señal sólo para el biosensor revestido con las plaquetas HPA1a+ con plasma M añadido mientras que el plasma M no añadido dio un resultado negativo. El biosensor de plaquetas HPA1a negativo y el biosensor solo dieron como resultado sólo la señal de fondo. Esto confirma la sensibilidad y la especificidad de las pruebas del biosensor de evanescencia según la presente invención en un ensayo de anticuerpo de una sola etapa. Se ha demostrado a través del ejemplo de tipificación del aloantígeno HPA-1a que el método de evanescencia es
15 adecuado para todas las tipificaciones de aloantígeno de plaquetas y pruebas de anticuerpos.
Ejemplo 8 (Ejemplo de referencia)
Se realiza un ensayo de anticuerpos de doble antígeno de una sola etapa para la toxoplasmosis mediante el cultivo de toxoplasma en un cultivo de células y se lleva a cabo la purificación del antígeno a partir del cultivo por repetidas etapas de sonicación y centrifugación (DiaMed Eurogen, Turnhout, Bélgica). El antígeno está en la forma de una 20 materia especial y se utiliza tal como está. Una alícuota se utiliza para recubrir el chip biosensor a 10 microgramos por mililitro. Una segunda alícuota se marca con APC como se describe. La prueba se realiza tomando dos partes de estándar IgG anti-toxoplasmosis y mezclando con una parte de una mezcla de detección triple concentrada tamponada con Tris caseína al 1%, el 3% de BSA y el 0,9% de Tween 20 y 10 microgramos por mililitro de antígeno-APC de toxoplasmosis. Esta mezcla se transfiere a un pocillo recubierto de antígeno de toxoplasmosis y se mide.
25 Los resultados se muestran en la Fig. 10.
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