ES2657862T3

ES2657862T3 - Anticuerpos contra HER3

Info

Publication number: ES2657862T3
Application number: ES12719763.0T
Authority: ES
Inventors: Abdelhakim Kharrat; Olivier Dubreuil; Yassamine LAZREK; Philippe Mondon; Khalil Bouayadi; Thierry Chardes; André Pelegrin; Christel Larbouret; Nadège A. GABORIT
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Gamamabs Pharma SA
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Gamamabs Pharma SA
Priority date: 2011-05-13
Filing date: 2012-05-11
Publication date: 2018-03-07
Anticipated expiration: 2032-05-11
Also published as: WO2012156309A1; NO2707391T3; EP2707391A1; EP2707391B1; PT2707391T; US9346883B2; US20140141019A1; PL2707391T3; DK2707391T3

Abstract

Un anticuerpo anti-HER3 que comprende: - una cadena pesada en la que el dominio variable comprende el SEQ ID NO: 1 para H-CDR1, el SEQ ID NO: 2 para H-CDR2 y el SEQ ID NO: 3 para H-CDR3; y - una cadena ligera en la que el dominio variable comprende el SEQ ID NO: 4 para L-CDR1, el SEQ ID NO: 5 para L-CDR2 y el SEQ ID NO: 6 para L-CDR3.

Description

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La presente invención se refiere a un anticuerpo anti-HER3 que comprende una cadena pesada en la que el dominio variable comprende el SEQ ID NO: 1 para H-CDR1, el SEQ ID NO: 2 para H-CDR2 y el SEQ ID NO: 3 para H-CDR3; y una cadena ligera en la que el dominio variable comprende el SEQ ID NO: 4 para L-CDR1, el SEQ ID NO: 5 para L-CDR2 y el SEQ ID NO: 6 para L-CDR3.

Además, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La invención también se refiere a un anticuerpo de la invención para uso como fármaco y, en particular, para uso en el tratamiento del cáncer.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

El término «anticuerpo anti-HER3» hace referencia a un anticuerpo dirigido contra HER3, en particular, HER3 humano. El anticuerpo anti-HER3 podría dirigirse contra un monómero de HER3 o HER3 en un heterodímero que comprende HER3 seleccionado del grupo que consiste en HER2-HER3, también denominado en la presente complejo HER2-HER3, EGFR-HER3 y HER4-HER3.

La secuencia de HER3 se describe en Uniprot con el número de referencia P21860. De aquí en adelante, los aminoácidos de HER3 se enumeran en referencia a Uniprot.

En una realización específica, el término «anticuerpo anti-HER3» hace referencia a un anticuerpo que se une al dominio extracelular del polipéptido de HER3 humano según se define en el SEQ ID NO: 32 (Tabla A).

Tabla A: Secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de HER3 20-643 secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de HER3 humano 20-643 ; P21860 Uniprot): imagen2

Según la presente invención, «anticuerpo» o «inmunoglobulina» tienen el mismo significado, y se utilizarán de igual forma en la presente invención. El término «anticuerpo», según se usa en la presente memoria, hace referencia a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de las moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une de forma inmunoespecífica a un antígeno. Así, el término anticuerpo abarca no solo las moléculas de anticuerpo enteras, sino también fragmentos de anticuerpo, incluidos fragmentos de unión a antígeno, así como variantes (incluidos derivados) de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo. En anticuerpos convencionales, dos cadenas pesadas se enlazan entre sí mediante enlaces disulfuro y cada cadena pesada se enlaza a una cadena ligera mediante un enlace disulfuro. Existen dos tipos de cadena ligera, lambda (l) y kappa (k). Existen cinco clases principales de cadena pesada (o isotipos) que determinan la actividad funcional de una molécula de anticuerpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Cada cadena contiene dominios de secuencia distintos. La cadena ligera incluye dos dominios, un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL). La cadena pesada incluye cuatro dominios, un dominio variable (VH) y tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3, denominados de forma colectiva CH). Las regiones variables de las cadenas ligera (VL) y pesada (VH) determinan el reconocimiento y la especificidad de unión para el antígeno. Los dominios de región constante de las cadenas ligera (CL) y pesada (CH) confieren importantes propiedades biológicas tales como asociación de cadena de anticuerpo, secreción, movilidad transplacentaria, unión a complemento y unión a receptores Fc (FcR). El

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Tabla 2: Dominios VH, VL y CDR de mAb H3A-32:

Dominios de MAb H3A-32: imagen5

VH: imagen6

VH CDR1: DYAMH (SEQ ID NO: 1)

VH CDR2: ISWNSGSIGYADSVKG (SEQ ID NO: 2)

VH CDR3: EGQWPNYGMDV (SEQ ID NO: 3)

VL: imagen7

VL CDR1: SGSSSNIGSDPVN (SEQ ID NO: 11)

VL CDR2: SNNQRPS (SEQ ID NO: 12)

VL CDR3: AAWDDSLRGYV (SEQ ID NO: 13)

Tabla 3: Dominios VH, VL y CDR de mAb H3A-76:

Dominios de MAb H3A-76: imagen8

VH: imagen9

VH CDR1: DYAMH (SEQ ID NO : 1)

VH CDR2: ISWNSGSIGYADSVKG (SEQ ID NO : 2)

VH CDR3: EGQWPNYGMDV (SEQ ID NO : 3)

VL: imagen10

Dominios de MAb H3A-76

imagen11: imagen12

VL CDR1: SGSSSNIGSNSLN (SEQ ID NO : 18)

VL CDR2: SNNQRPP (SEQ ID NO : 19)

VL CDR3: AAWDDSLKGYV (SEQ ID NO : 20)

Tabla 4: Dominios VH, VL y CDR de mAb H3A-81:

Dominios de MAb H3A-81

VH: imagen13

VH CDR1: DYAMH (SEQ ID NO:1)

VH CDR2: ISWNSGSIGYADSVKG (SEQ ID NO: 2)

VH CDR3: EGQWPNYGMDV (SEQ ID NO: 3)

VL: imagen14

VL CDR1: SGSSSNIGGDTVN (SEQ ID NO: 25)

VL CDR2: SNNQRPS (SEQ ID NO: 12)

VL CDR3: AAWDDSLNGYV (SEQ ID NO: 26)

Tabla 5: Dominios VH, VL y CDR de mAb H4B-05:

imagen15

Dominios de MAb H4B-05: imagen16

VH: imagen17

imagen18: imagen19

VH CDR1: DYAMH (SEQ ID NO : 1)

VH CDR2: ISWNSGSIGYADSVKG (SEQ ID NO : 2)

VH CDR3: EGQWPNYGMDV (SEQ ID NO : 3)

VL: imagen20

VL CDR1: SGSRSNIGSNTVS (SEQ ID NO : 29)

VL CDR2: SNNQRPS (SEQ ID NO : 12)

VL CDR3: AAWDDSLNGYV (SEQ ID NO : 26)

Tabla 6: Dominios VH, VL y CDR de mAb H4B-121: 5

Dominios de MAb H4B-121: imagen21

VH: imagen22

VH CDR1: DYAMH (SEQ ID NO: 1)

VH CDR2: ISWNSGSIGYADSVKG (SEQ ID NO: 2)

VH CDR3: EGQWPNYGMDV (SEQ ID NO: 3)

VL: imagen23

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Por lo tanto, se describe en particular el dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 7, el SEQ ID NO: 14 y el SEQ ID NO: 21.

Según una realización específica de la invención, el dominio variable de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 7.

También se describe el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo que comprende una cadena ligera cuyo dominio variable comprende:

-L-CDR1 seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 4, el SEQ ID NO: 11, el SEQ ID NO: 18, el SEQ ID NO: 25 y el SEQ ID NO: 29,

-L-CDR2 seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 5, el SEQ ID NO: 12 y el SEQ ID NO: 19 y

-L-CDR3 seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 6, el SEQ ID NO: 13, el SEQ ID NO: 20 y el SEQ ID NO: 26.

Se describe el dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 8, el SEQ ID NO: 15, el SEQ ID NO: 22, el SEQ ID NO: 27 y el SEQ ID NO: 30.

En una realización de la invención, el dominio variable de cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 8.

El presente texto también describe el anticuerpo anti-HER3 seleccionado del grupo que consiste en:

-un anticuerpo que comprende el dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos que se establece en el SEQ ID NO: 7, y el dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 8 y el SEQ ID NO: 30,

-un anticuerpo que comprende el dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos que se establece en el SEQ ID NO: 14, y el dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 15 y el SEQ ID NO: 27 y

-un anticuerpo que comprende el dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos que se establece en el SEQ ID NO: 21, y el dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 22.

En una realización específica, el anticuerpo anti-HER3 según la invención es un anticuerpo humano.

Dichos anticuerpos se pueden producir usando cualquier técnica conocida en la técnica. En particular, dichos anticuerpos se producen mediante técnicas tales como las descritas más adelante en la presente memoria.

La invención proporciona, además, fragmentos de dichos anticuerpos que incluyen, pero no se limitan a, Fv, Fab, F(ab’)2, Fab’, dsFv, scFv, sc(Fv)2 y diacuerpos; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

Los anticuerpos y polipéptidos de la invención se pueden utilizar en forma aislada (p. ej., purificados) o contenidos en un vector, tal como una membrana o vesícula lipídica (p. ej., un liposoma).

Ácidos nucleicos, vectores y células hospedadoras recombinantes

Se describe, además, un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica para al menos la cadena pesada del anticuerpo según la invención o un fragmento de unión a antígeno de este. El presente texto describe una secuencia de ácido nucleico que codifica para el dominio VH o el dominio VL del mAb

H3A-32, mAb H3A-76, mAb H3A-81, mAb H4B-05 y mAb H4B-121, según se describen en la Tabla 7. Tabla 7: Ácidos nucleicos de los dominios VH y VL de mAb de la invención

mAb H3A-32: Dominio VH: imagen25

imagen26: Dominio VL: imagen27

mAb H3A-76: Dominio VH: imagen28

imagen29: imagen30 imagen31

imagen32: Dominio VL: imagen33

mAb H3A-81: Dominio VH: imagen34

imagen35: Dominio VL: imagen36

mAb H4B-05: Dominio VH: imagen37

Dominio VL:: imagen38

imagen39: imagen40 imagen41

mAb H4B-121: Dominio VH: imagen42

Dominio VL:: imagen43

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Tabla 8: Resumen de los núms. de SEQ ID NO. de los mAb

mAb
mAb
mAb
mAb
mAb

H3A-32: H3A-76 H3A-81 H4B-05 H4B-121

Dominio VH: 14 21 14 7 7

Ácido nucleico del dominio VH: 16 23 16 9 9

Dominio VL: 15 22 27 30 8

Ácido nucleico del dominio VL: 17 24 28 31 10

H-CDR1: 1 1 1 1 1

H-CDR2: 2 2 2 2 2

H-CDR3: 3 3 3 3 3

L-CDR1: 11 18 25 29 4

L-CDR2: 12 19 12 12 5

L-CDR3: 13 20 26 26 6

Típicamente, dicho ácido nucleico es una molécula de ADN o ARN, que se puede incluir en cualquier vector 5 adecuado, tal como un plásmido, cósmido, episoma, cromosoma artificial, fago o un vector viral.

Los términos «vector», «vector de clonación» y «vector de expresión» significan el vehículo por medio del cual una secuencia de ADN o ARN secuencia (p. ej., un gen foráneo) se puede introducir en una célula hospedadora, con el fin de transformar el hospedador y promover la expresión (p. ej., transcripción y traducción) de la secuencia introducida.

10 Por lo tanto, el presente texto describe un vector que comprende un ácido nucleico de la invención.

Dichos vectores pueden comprender elementos reguladores, tales como un promotor, potenciador, terminador y similares, para provocar o dirigir la expresión de dicho anticuerpo tras la administración a un sujeto. Los ejemplos de

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promotores y potenciadores utilizados en el vector de expresión para la célula animal incluyen el promotor temprano y promotor de SV40 (Mizukami T. et al. 1987), el promotor y potenciador LTR del virus de la leucemia de ratón Moloney (Kuwana Y et al. 1987), promotor (Mason JO et al. 1985) y potenciador (Gillies SD et al. 1983) de la cadena H de inmunoglobulina y similares.

Se puede utilizar cualquier vector de expresión para una célula animal, siempre que se pueda insertar y expresar un gen que codifica para la región C del anticuerpo humano. Los ejemplos de vectores adecuados incluyen pAGE107 (Miyaji H et al. 1990), pAGE103 (Mizukami T et al. 1987), pHSG274 (Brady G et al. 1984), pKCR (O'Hare K et al. 1981), pSG1 beta d2-4-(Miyaji H et al. 1990) y similares.

Otros ejemplos de plásmidos incluyen plásmidos de replicación que comprenden un origen de replicación, o plásmidos integradores, tales como por ejemplo pUC, pcDNA, pBR y similares.

Otros ejemplos de vector viral incluyen vectores adenovirales, retrovirales, del virus del herpes y del AAV. Dichos virus recombinantes se pueden producir mediante técnicas conocidas en la técnica, tal como células de envoltorio transfectantes o mediante transfección transitoria con plásmidos auxiliares o virus. Los ejemplos típicos de células de envoltorio de virus incluyen células PA317, células PsiCRIP, células GPenv+, células 293, etc. Se pueden encontrar protocolos detallados para producir dichos virus recombinantes con defecto de replicación, por ejemplo, en WO 95/14785, WO 96/22378, US 5 882 877, US 6 013 516, US 4 861 719, US 5 278 056 y WO 94/19478.

El presente texto describe, además, una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico o un vector según la invención.

Típicamente, la célula hospedadora se ha transfectado, infectado o transformado mediante un ácido nucleico o un vector descrito anteriormente.

El término «transformación» significa la introducción de un gen, secuencia de ADN o ARN «foráneo» (es decir, extrínseco o extracelular) en una célula hospedadora, de manera que la célula hospedadora expresará el gen o secuencia introducido para producir una sustancia deseada, típicamente una proteína o enzima codificada por el gen

o secuencia introducido. Una célula hospedadora que recibe y expresa el ADN o ARN introducido se ha «transformado».

Los ácidos nucleicos descritos se pueden utilizar para producir un anticuerpo de la invención en un sistema de expresión adecuado. El término «sistema de expresión» significa una célula hospedadora y un vector compatible en condiciones adecuadas, p. ej., para la expresión de una proteína codificada por el ADN foráneo que lleva el vector y que se introduce en la célula hospedadora.

Los sistemas de expresión comunes incluyen células hospedadoras y vectores plasmídicos de E. coli, células hospedadoras de insectos y vectores de Baculovirus, y células hospedadoras y vectores de mamíferos. Otros ejemplos de células hospedadoras incluyen, sin limitación células procariontes (tales como bacterias) y células eucariontes (tales como células de levadura, células de mamíferos, células de insectos, células vegetales, etc.). Los ejemplos específicos incluyen E.coli, las levaduras Kluyveromyces o Saccharomyces, las líneas celulares de mamíferos (p. ej., células Vero, células CHO, células 3T3, células COS, etc.), así como cultivos de células de mamíferos primarios o establecidos (p. ej., producidos a partir de linfoblastos, fibroblastos, células embrionarias, células epiteliales, células nerviosas, adipocitos, etc.). Los ejemplos también incluyen la célula SP2/0-Ag14 de ratón (ATCC CRL1581), la célula P3X63-Ag8.653 de ratón (ATCC CRL1580), la célula CHO en la que un gen de dihidrofolato reductasa (denominado en la presente memoria «gen DHFR») presenta defecto (Urlaub G et al; 1980), la célula YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 de rata (ATCC CRL1662, denominada en la presente memoria «célula YB2/0») y similares.

El presente texto también describe un método para producir una célula hospedadora recombinante que expresa un anticuerpo según la invención, dicho método comprende las etapas de: (i) introducir in vitro o ex vivo un ácido nucleico recombinante o un vector tales como se describieron anteriormente en una célula hospedadora competente, (ii) cultivar in vitro o ex vivo la célula hospedadora recombinante obtenida y (iii), opcionalmente, seleccionar las células que expresan y/o secretan dicho anticuerpo. Dichas células hospedadoras recombinantes se pueden utilizar para la producción de anticuerpos de la invención.

Métodos para producir anticuerpos de la invención

Los anticuerpos de la invención se pueden producir mediante cualquier técnica conocida en la técnica, tal como, sin limitación, cualquier técnica química, biológica, genética o enzimática, ya sea sola o en combinación.

Al conocer la secuencia de aminoácidos del anticuerpo deseado, un experto en la técnica puede producir fácilmente dichos anticuerpos mediante técnicas estándares de producción de polipéptidos. Por ejemplo, se pueden sintetizar al utilizar un método en fase sólida conocido, preferiblemente al utilizar un aparto de síntesis peptídica disponible en el mercado (tal como el fabricado por Applied Biosystems, Foster City, California) y seguir las instrucciones del

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El anticuerpo anti-HER3 de la invención se une al epítopo que está comprendido entre los aminoácidos 352 a 357 de HER3 (SEQ ID NO: 36).

El epítopo que está comprendido entre los aminoácidos 352 a 357 de HER3 (SEQ ID NO: 36) no está en el sitio de unión de heregulina a HER3.

Tabla 9: Secuencias de aminoácidos en las que están comprendidos los epítopos Secuencia de aminoácidos del dominio r extracelular de HER3 humano 20-643; P21860 Uniprot): imagen48

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Secuencia de HER3 humano Uniprot): aminoácidos de 214-231; P21860 GGCSGPQDTDCFACRHFN (SEQ ID NO: 33)

Secuencia de HER3 humano Uniprot): aminoácidos del 343-357; P21860 DFLITGLNGDPWHKI (SEQ ID NO: 34)

Secuencia de HER3 humano Uniprot): aminoácidos del 342-358; P21860 LDFLITGLNGDPWHKIP (SEQ ID NO: 35)

Secuencia de HER3 humano Uniprot): aminoácidos del 352-357; P21860 DPWHKI (SEQ ID NO: 36)

Por consiguiente, se pueden identificar anticuerpos adicionales en función de su capacidad para competir de forma cruzada (p. ej., para inhibir de forma competitiva la unión de, en una manera estadísticamente significativa) con otros 10 anticuerpos de la invención en ensayo de unión a HER3 estándares. La capacidad de un anticuerpo de prueba para inhibir la unión de anticuerpos de la presente invención a HER3 humano demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir con dicho anticuerpo por la unión a HER3 humano; dicho anticuerpo, según la teoría no limitante, puede unirse al mismo epítopo o a uno relacionado (p. ej., uno estructuralmente similar o espacialmente próximo) en HER3 humano como el anticuerpo con el cual compite. Por lo tanto, otro aspecto del presente texto describe

15 anticuerpos que se unen al mismo antígeno que, y compiten con, los anticuerpos descritos en mediante secuencia. En una realización determinada, el anticuerpo que se une al mismo epítopo en HER3 humano que los anticuerpos de la presente invención es un anticuerpo recombinante humano. Dichos anticuerpos recombinantes humanos se pueden preparar y asilar según se describe en los Ejemplos.

Manipulación del marco o Fc

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Los anticuerpos manipulados de la invención incluyen aquellos en los que se han hecho modificaciones en los residuos del marco dentro de VH y/o VL, p. ej., para mejorar las propiedades del anticuerpo. Típicamente, dichas modificaciones en el marco se hacen para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, una estrategia es «retromutar» uno o más residuos del marco hasta la secuencia de línea germinal correspondiente. Más específicamente, un anticuerpo que se ha experimentado una mutación somática puede contener residuos de marco que difieren con respecto a la secuencia de la línea germinal de la cual se derivó el anticuerpo. Dichos residuos se pueden identificar al comparar las secuencias del marco del anticuerpo con las secuencias de la línea germinal de la cual se derivó el anticuerpo. Para hacer que las secuencias de la región de marco vuelvan a su configuración de línea germinal, las mutaciones somáticas se pueden «retromutar» hasta la secuencia de línea germinal, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida a sitio o mutagénesis mediada por PCR. También se pretende que dichos anticuerpos «retromutados» estén comprendidos por la invención. Otro tipo de modificación de marco implica mutar uno o más residuos dentro de la región de marco, o incluso dentro de una o más regiones CDR, para retirar los epítopos para linfocitos T y reducir, de esta manera, la potencial inmunogenicidad del anticuerpo. Esta estrategia también se denomina «desinmunización» y se describe más detalladamente en la publicación de patente estadounidense N.º 20030153043 de Carr et al.

Además o alternativamente a las modificaciones hechas dentro de las regiones de marco o CDR, los anticuerpos de la invención se pueden manipular para incluir modificaciones dentro de la región Fc, típicamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tales como semivida en suero, fijación en complemento, unión a receptor Fc y/o citotoxicidad celular dependiente de antígeno. Además, un anticuerpo de la invención se puede modificar químicamente (p. ej., se pueden acoplar uno o más restos químicos al anticuerpo) o se puede modificar para alterar su glicosilación, nuevamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas realizaciones se describe con más detalle a continuación. La numeración de los residuos en la región Fc es la del índice EU de Kabat.

En una realización, la región bisagra de CH1 se modifica de manera que la cantidad de residuos de cisteína en la región bisagra se altere, p. ej., aumente o disminuya. Esta estrategia se describe adicionalmente en la patente estadounidense N.º 5 677 425 de Bodmer et al. La cantidad de residuos de cisteína en la región bisagra de CH1 se altera para, por ejemplo, facilitar el montaje de las cadenas ligera y pesada, o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.

En otra realización, la región bisagra Fc de un anticuerpo se muta para disminuir la semivida biológica del anticuerpo. Más específicamente, se introduce una o más mutaciones de aminoácido en la región de interfaz del dominio CH2-CH3 del fragmento Fc-bisagra de manera que el anticuerpo tenga una unión a la proteína A de Staphylococcyl (SpA) deteriorada con respecto a la unión a SpA unión del dominio Fc-bisagra natural. Esta estrategia se describe con mayor detalle en la patente estadounidense n.º 6 165 745 de Ward et al.

En otra realización, el anticuerpo se modifica para aumentar su semivida biológica. Existen diversas estrategias posibles. Por ejemplo, se puede introducir una o más de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, según se describe en la patente estadounidense n.º 6 277 375 de Ward. Alternativamente, para aumentar la semivida biológica, el anticuerpo se puede alterar dentro de la región CH1 o CL para contener un epítopo de unión a receptor de recuperación tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, según se describe en las patentes estadounidenses núms. 5 869 046 y 6 121 022 de Presta et al.

En otras realizaciones adicionales, la región Fc se altera al reemplazar al menos un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido diferente para alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más aminoácidos se pueden reemplazar con un residuo de aminoácido diferente, de manera que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector, pero conserve la capacidad de unión a antígeno del anticuerpo primario. El ligando efector con respecto al cual se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor Fc o el componente C1 del complemento. Esta estrategia se describe más detalladamente en las patentes estadounidenses N.º 5 624 821 y 5 648 260, ambas de Winter et al.

En otra modalidad, uno o más aminoácidos seleccionados de los residuos de aminoácidos se pueden reemplazar con un residuo de aminoácido diferente, de manera que el anticuerpo presente unión a C1q alterada y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) reducida o suprimida. Esta estrategia se describe con mayor detalle en la patente estadounidense n.º 6 194 551 de ldusogie et al.

En otra modalidad, uno o más residuos de aminoácidos se alteran para alterar así la capacidad del anticuerpo para fijar el complemento. Esta estrategia se describe adicionalmente en la publicación PCT WO 94/29351 de Bodmer et al.

En otra modalidad adicional, la región Fc se modifica para aumentar la capacidad del anticuerpo de mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo con un receptor Fc mediante la modificación de uno o más aminoácidos. Esta estrategia se describe adicionalmente en la publicación PCT WO 00/42072 de Presta Además, se han mapeados los sitios de unión en la

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IgGI humana para FcγRI, FcγII, FcγRIII y FcRn y se han descrito variantes con unión mejorada (véase Shields, R. L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604, WO2010106180).

En otra modalidad adicional, se modifica la glicosilación de un anticuerpo. Por ejemplo, se puede producir un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilación). La glicosilación se puede alterar, por ejemplo, para aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Dichas modificaciones de carbohidratos se pueden lograr, por ejemplo, al alterar uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se puede realizar una o más sustituciones de aminoácidos que resultan en la eliminación de uno o más sitios de glicosilación de marco de región variable para eliminar así la glicosilación en dicho sitio. Dicha aglicosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Esta estrategia se describe con mayor detalle en las patentes estadounidenses núms. 5 714 350 y 6 350 861 de Co et al.

Además o alternativamente, se puede producir un anticuerpo que tenga un tipo de glicosilación alterado, tal como un anticuerpo hipofucosilado o no fucosilado que tiene cantidades reducidas de residuos fucosilados o ninguno o un anticuerpo que tenga más estructuras GlcNAc bisectantes. Se ha demostrado que estos patrones de glicosilación alterados aumentan la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Estas modificaciones de carbohidratos se pueden lograr a través, por ejemplo, de la expresión del anticuerpo n una célula hospedadora con maquinaria de glicosilación alterada. En la técnica se han descrito células con maquinaria de glicosilación alterada y se pueden utilizar como células hospedadoras en las cuales se pueden expresar los anticuerpos recombinantes de la invención para producir así un anticuerpo con glicosilación modificada. Por ejemplo, EP 1 176 195 de Hang et al. Describe una línea celular con un gen FUT8 funcionalmente alterado, que codifica para una fucosil transferasa, de manera que los anticuerpos expresados en dicha línea celular exhiben hipofucosilación o carecen de residuos fucosildos. Por lo tanto, en una realización, los anticuerpos de la invención se pueden producir mediante expresión recombinante en una línea celular que exhibe un patrón de hipofucosilación o no fucosilación, por ejemplo, una línea celular de mamífero con expresión deficiente del gen FUT8 que codifica para la fucosiltransferasa. La publicación PCT WO 03/035835 de Presta describe una línea celular CHO variante, las células Lecl3, con capacidad reducida para acoplar fucosa a carbohidratos enlazados a Asn(297), que también resulta en la hipofucosilación de anticuerpos expresados en dicha célula hospedadora (véase también Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740). La publicación PCT WO 99/54342 de Umana et al. Describe líneas celulares manipuladas para expresar glicosil transferasas que modifican glicoproteínas (p. ej., beta(1,4)-N acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)) de manera que los anticuerpos expresados en las líneas celulares manipuladas exhiben estructuras GlcNac bisectantes aumentadas que resultan en una actividad ADCC aumentada de los anticuerpos (véase también Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180). Eureka Therapeutics describe, además, células de mamífero CHO manipuladas genéticamente capaces de producir anticuerpos con un patrón de glicosilación alterado carentes de residuos fucosilo http://www.eurekainc.com/a&boutus/companyoverview.html). Alternativamente, los anticuerpos de la invención se pueden producir en levaduras u hongos filamentosos manipulados para tener un patrón de glicosilación similar al de mamíferos y capaces de producir anticuerpos que carecen de fucosa como patrón de glicosilación (véase, por ejemplo EP1297172B1).

Otra modificación de los anticuerpos en la presente memoria que se contempla en la invención es la pegilación. Un anticuerpo se puede pegilar, por ejemplo, para aumentar la semivida biológica (p. ej., en suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo o fragmento de este, típicamente se hace reaccionar con polietilenglicol (PEG), tal como un éster o aldehído reactivo derivado de PEG, en condiciones en las que uno o más grupos PEG se acoplan al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. La pegilación se puede llevar a cabo mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo). Según se usa en la presente memoria, el término «polietilenglicol» pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han utilizado para derivar otras proteínas, tal como mono (C1-C10) alcoxi-o ariloxipolietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En determinadas modalidades, el anticuerpo que se pegilará es un anticuerpo aglicosilado. Los métodos para pegilar proteínas se conocen en la técnica y se pueden aplicar a los anticuerpos de la invención. Véase, por ejemplo, EP O 154 316 de Nishimura et al. y EP 0 401 384 de Ishikawa et al.

Otra modificación de los anticuerpos que se contempla en la invención es un conjugado o una proteína de fusión de al menos la región de unión a antígeno del anticuerpo de la invención con proteína sérica, tal como seroalbúmina humana o un fragmento de esta para aumentar la semivida de la molécula resultante. Dicha estrategia se describe, por ejemplo, en Ballance et al. EP0322094.

Otra posibilidad es una fusión de al menos la región de unión a antígeno del anticuerpo de la invención con proteínas capaces de unirse a proteínas séricas, tales como seroalbúmina humana para aumentar la semivida de la molécula resultante. Dicha estrategia se describe, por ejemplo, en Nygren et al., EP 0 486 525.

Usos terapéuticos de los anticuerpos de la invención

Un objeto adicional de la invención proporciona un anticuerpo anti-HER3 para uso como fármaco.

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La invención se refiere al uso de un anticuerpo anti-HER3 según la invención como fármaco.

Según se describió anteriormente, se sabe que HER3 tiene una función clave en el cáncer.

Por lo tanto, el presente texto describe métodos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento del cáncer u otros trastornos relacionados donde se ha demostrado que el complejo HER2-HER3 y/o HER3 constituye una diana terapéutica.

Por consiguiente, la invención se refiere a un anticuerpo de la invención para uso en el tratamiento del cáncer.

El presente texto también describe el uso de un anticuerpo anti-HER3 según la invención en la preparación de un fármaco útil para el tratamiento del cáncer. El texto también describe un método para tratar el cáncer que comprende la etapa de administrar a un sujeto que lo necesita un anticuerpo de la invención.

Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende dichos anticuerpos de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Por lo tanto, los anticuerpos de la invención opcionalmente se pueden combinar con matrices de liberación sostenida, tales como polímeros biodegradables, para formar las composiciones terapéuticas.

«Farmacéuticamente» o «farmacéuticamente aceptable» hace referencia a entidades moleculares y composiciones que no producen reacciones adversas, alérgicas u otras inapropiadas cuando se administran a un mamífero, especialmente un humano, según corresponda. Un vehículo farmacéuticamente aceptable hace referencia a una carga, diluyente, material encapsulante o formulación auxiliar sólido, semisólido o líquido no tóxico de cualquier tipo.

La forma de las composiciones farmacéuticas, la vía de administración, la dosificación y el régimen dependen naturalmente de la afección que se tratará, la gravedad de la enfermedad, la edad, el peso y el sexo del paciente, etc.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden formular para una administración tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea o intraocular y similares.

Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas contienen vehículos que son farmacéuticamente aceptables para una formulación que se puede inyectar. Estos pueden ser, en particular, disoluciones salinas, estériles, isotónicas (fosfato monosódico o disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares o mezclas de dichas sales), o composiciones secas, especialmente liofilizadas, que tras la adición, dependiendo del caso, de agua esterilizada o disolución salina fisiológica, permite la constitución de disoluciones inyectables.

Las dosis utilizadas para la administración se pueden adaptar en función de diversos parámetros y, en particular, en función del modo de administración utilizado, de la patología relevante o, alternativamente, de la duración del tratamiento deseada.

Para preparar composiciones farmacéuticas, se puede disolver o dispersar una cantidad eficaz del anticuerpo en un vehículo o medio acuoso farmacéuticamente aceptable.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen dispersiones o disoluciones acuosas estériles; formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de cacahuate o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de dispersiones o disoluciones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y fluida en la medida en que exista la posibilidad de colocarla en una jeringa fácilmente. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se debe preservar contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos.

Las disoluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacéuticamente aceptables se pueden preparar en agua mezclada de forma adecuada con un tensioactivo, como hidroxipropilcelulosa. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de estos, así como en aceites. En condiciones habituales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

Un anticuerpo de la invención se puede formular en una composición en forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico y bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.

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El vehículo también puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de estos y aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, al mantener el tamaño de partícula necesario en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, se preferirá incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede lograr mediante el uso en las composiciones de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las disoluciones inyectables estériles se preparan al incorporar los compuestos activos en la cantidad necesaria en el disolvente adecuado con varios de los ingredientes adicionales enumerados anteriormente, según sea necesario, y posteriormente someterlos a esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan al incorporar los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son las técnicas de secado al vacío y liofilización que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una disolución previamente esterilizada por filtración de estos.

También se contempla la preparación de disoluciones más o altamente concentradas para inyección directa, donde se prevé el uso de DMSO como disolvente para resultar en una penetración extremadamente rápida que suministra concentraciones altas de los agentes activos a un área tumoral pequeña.

Tras la formulación, las disoluciones se administrarán en un modo compatible con la formulación de dosificación y en la cantidad que resulte terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación, tales como el tipo de disoluciones inyectables descritas anteriormente, pero también se pueden emplear cápsulas de liberación de fármaco y similares.

Para la administración parenteral en una disolución acuosa, por ejemplo, la disolución se debería tamponar de manera adecuada, si es necesario, y el diluyente líquido se debería volver isotónico en primer lugar con disolución salina o glucosa suficiente. Estas disoluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. En este sentido, los medios acuosos estériles que se pueden emplear serán conocidos para los expertos en la técnica en virtud de la presente descripción. Por ejemplo, se podría disolver una dosificación en 1 ml de disolución de NaCl isotónica y agregarse a 1000 ml de fluido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de la infusión (véase, por ejemplo, «Remington’s Pharmaceutical Sciences», 15ª edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Alguna de variación en la dosificación se producirá según la afección del sujeto que se esté tratando. La persona responsable de la administración podrá, en cualquier caso, determinar la dosis adecuada para el sujeto individual.

Los anticuerpos de la invención se pueden formular dentro de una mezcla terapéutica que comprende alrededor de 0,0001 a 1,0 miligramos, o alrededor de 0,001 a 0,1 miligramos, o alrededor de 0,1 a 1,0 o incluso alrededor de 10 miligramos por dosis o similar. También se pueden administrar múltiples dosis.

Además de los compuestos formulados para administración parenteral, tal como inyección intravenosa o intramuscular, otras formas farmacéuticamente aceptables incluyen, p. ej., comprimidos u otros sólidos para administración oral; cápsulas de liberación temporizada; y cualquier otra forma utilizada actualmente.

En determinadas realizaciones, se contempla el uso de liposomas y/o nanopartículas para la introducción de los anticuerpos en células hospedadoras. Los expertos en la técnica conocen sobre la formación y uso de liposomas y/o nanopartículas.

Las nanocápsulas pueden generalmente atrapar compuestos de modo estable y reproducible. Para evitar efectos secundarios debido a una sobrecarga polimérica intracelular, se diseñan partículas ultrafinas (con un tamaño de alrededor de 0,1 µm) en general utilizando polímeros capaces de degradarse in vivo. Las nanopartículas de polialquil-cianoacrilato biodegradables que cumplen con estos requisitos se contemplan para uso en la presente invención y dichas partículas se pueden producir fácilmente.

Los liposomas se forman a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas multilamelares concéntricas de doble capa (también denominadas vesículas multilamelares (MLV, por sus siglas en inglés)). Las MLV generalmente tienen diámetros de 25 nm a 4 µm. La sonicación de MLV resulta en la formación de vesículas unilamerales pequeñas (SUV, por sus siglas en inglés) con diámetros en el intervalo de 200 a 500 Å, que contienen una disolución acuosa en el núcleo. Las características físicas de los liposomas dependen del Ph, la resistencia iónica y la presencia de cationes divalentes.

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El texto también describe kits que comprenden al menos un anticuerpo de la invención. Los kits que contienen anticuerpos de la invención se utilizan en ensayos terapéuticos.

La invención se ilustrará en mayor detalle mediante las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no deben interpretarse en ningún modo como limitantes del alcance de la presente invención.

Figuras

La figura 1 muestra el resultado de la especificidad de unión por Fago-ELISA para diversos anticuerpos según la invención.

La figura 2 muestra un ejemplo de los resultados del ELISA competitivo. El ELISA competitivo se llevó a cabo mediante una competencia por la unión a HER3 (EbB3) entre fago-scFv de H3A-81 y sus otros Fab humanos. La unión residual del fago-scFv-H3A-81 a una concentración de 2µg/ml de Fab utilizados como competidor se asignó en porcentaje. Se utilizó un Fab irrelevante (clon H3A-02) como testigo negativo. El Fab H3A-81 se utilizó como testigo positivo (competencia consigo mismo: fago-scFv-H3A-81 contra Fab-H3A-81).

La figura 3 muestra los resultados de las curvas de unión de ELISA para la IgG humana purificada de la invención. El clon H3A-02 es un anticuerpo irrelevante utilizado como testigo negativo.

La figura 4 muestra las curvas de unión curves de H4B-121 en comparación otros dos anticuerpos anti-HER3 (Ab n.º 6 y U1-59).

La figura 5 muestra la reactividad de los anticuerpos IgG humanos purificados de la invención para HER3 humano con respecto a HER3 de ratón. Los anticuerpos D, E, G y H son anti-HER3 testigos positivos.

La figura 6 muestra la reactividad con dependencia de dosis del anticuerpo H4B-121 para HER3 humano y HER3 de ratón.

Las figuras 7A-F muestran el perfil de unión específico por citometría de flujo de la IgG H3A-81, H3A-32, H4B-05, H3A-76 y H4B-121 humana purificada para natural (A), EGFR (B), HER2 (C), EGFR/HER4 (D), HER3 (E) y el complejo HER2/HER3 (F) transfectado en células NIH 3T3. T-es el clon H3A-02 testigo negativo.

La figura 8 muestra el experimento de competencia por FACS entre el anticuerpo específico para HER3 H4B-121, dos anti-HER3 adicionales (D y G), usados como anticuerpos testigo, y heregulina en células SKBR3.

La figura 9 muestra los resultados del ensayo TR-FRET para el análisis de heterodimerización HER2-HER3 en células NIH-3T3 transfectadas. Los anticuerpos anti-HER2 trastuzumab y pertuzumab se utilizaron como testigo positivo. El mAb Px irrelevante fue el testigo negativo.

La figura 10 muestra el análisis de epítopos reconocidos por el anticuerpo H4B-121. La unión puntual se midió mediante cuantificación de píxeles de unión de H4B-121 a HER3 (programa informático peptides 5imageJ).

La figura 11 identifica los residuos que contribuyen al punto (SCR, por sus siglas en inglés) en el receptor HER3 que interactúan con el anticuerpo H4B-121.

Las figuras 12A-B muestran la inhibición de la progresión tumoral mediante el anticuerpo H4B-121 en ratones lampiños con xenoinjertos con células cancerosas epidermoides A431 (A) y la correspondiente curva de supervivencia de Kaplan-Meier (B). La expresión relativa de los receptores EGFR, HER2 y HER3 en la superficie de las células A431 también se indica.

Las figuras 13 muestran la inhibición de la progresión tumoral mediante el anticuerpo H4B-121 en ratones lampiños con xenoinjertos con células cancerosas pancreáticas BxPC3 (A) y la correspondiente curva de supervivencia de Kaplan-Meier (B). La transferencia interna en la figura 13B muestra el nivel de fosforilación del receptor HER3 en los xenoinjertos de BxPC3 extraídos de los ratones tratados con vehículo o H4B-121.

La figura 14A muestra la inhibición inducida por H4B-121 de la internalización de HER3 en el carcinoma pancreático BxPC3 mediante transferencia western y la figura 14B cuantifica la internalización de HER3 inducida por el anticuerpo dependiente del tiempo.

EJEMPLO

Especificidad por Fago-ELISA

Se sometió a barrido una biblioteca de fagos de scFv humano con respecto a la proteína HER3-Fc (R&D Systems) para seleccionar anticuerpos anti-HER3. Se seleccionaron 105 clones.

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Claims

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