ES2658596T3 - Formulación líquida estable de anticuerpos - Google Patents

Abstract

Una composición líquida de anticuerpo anti-NGF que comprende: un anticuerpo, un agente de tonicidad, un tampón, un agente quelante, un tensioactivo, en la que el pH de dicha composición es de 5,8 a 6,8, en la que el tensioactivo es polisorbato 20, en la que el tampón es histidina, en la que el agente de tonicidad es trehalosa y en la que el anticuerpo comprende una secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID N.º: 1 y una secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID N.º: 2.

Description

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En otro aspecto, la divulgación proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID Nº: 11, en la que G98 es G, S, A, C, V, N, D o T ; en la que G99 es G, S, A, C, V, N, D o T ; en la que Y100 es Y, L o R; en la que Y101 es Y o W; en la que G103 es G, A o S; en la que T104 es T o S; en la que S105 es S, A o T; en la que Y106 es Y, R, T o M; en la que Y107 es Y o F; en la que F108 es F o W; en la que D109 es S, A, C, G, D, N, T o G; y en la que Y110 es cualquier aminoácido.

En otro aspecto, la divulgación proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID Nº: 12, en la que S26 es S o F; D28 es D, S, A o Y; y H32 es H, N o Q.

En otro aspecto, la divulgación proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID Nº: 13, en la que I51 es I, T, V o A; y S56 es S o T.

En otro aspecto, la divulgación proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID Nº: 14, en la que S91 es S o E; K92 es K, H, R o S; y en la que Y96 es Y o R.

En otro aspecto, la divulgación proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID Nº: 14, en la que S91 es S o E; K92 es cualquier aminoácido; T93 es cualquier aminoácido; y en la que Y96 es Y o R.

En un aspecto, la divulgación proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 9, en la que I34 es S, L, V, A o I; y N35 es N, T o S.

En otro aspecto, la divulgación proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 10, en la que M50 es M, I, G, Q, S o L; A62 es A o S; y L63 es L o V.

En otro aspecto, la divulgación proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 11, en la que Y100 es Y, L o R; en la que Y101 es Y o W; en la que G103 es G, A o S; en la que T104 es T o S; en la que S105 es S, A o T; en la que Y106 es Y, R, T o M; en la que Y107 es Y o F; en la que F108 es F o W; en la que D109 es D, N o G ; y en la que Y110 es Y, K, S, R o T.

En otro aspecto, la divulgación proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 11, en la que Y100 es Y, L, o R; en la que Y101 es Y o W; en la que G103 es G, A o S; en la que T104 es T o S; en la que S105 es S, A o T; en la que Y106 es Y, R, T o M; en la que Y107 es Y o F; en la que F108 es F o W; en la que D109 es S, A, C, G, D, N, T o G; y en la que Y110 es cualquier aminoácido.

En otro aspecto, la divulgación proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 11, en la que G98 es G, S, A, C, V, N, D o T; en la que G99 es G, S, A, C, V, N, D o T; en la que Y100 es Y, L o R; en la que Y101 es Y o W; en la que G103 es G, A o S; en la que T104 es T o S; en la que S105 es S, A o T; en la que Y106 es Y, R, T o M; en la que Y107 es Y oF; en la que F108 es F o W; en la que D109 es S, A, C, G, D, N, T o G; y en la que Y110 es cualquier aminoácido.

En otro aspecto, la divulgación proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 12, en la que S26 es S o F; D28 es D, S, A o Y; y H32 es H, N o Q.

En otro aspecto, la divulgación proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 13, en la que I51 es I, T, V o A; y S56 es S o T.

En otro aspecto, la divulgación proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 14, en la que S91 es S o E; K92 es K, H, R o S; y en la que Y96 es Y o

R.

En otro aspecto, la divulgación proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 14, en la que S91 es S o E; K92 es cualquier aminoácido; T93 es cualquier aminoácido; y en la que Y96 es Y o R.

En otro aspecto, la divulgación proporciona polipéptidos (tales como anticuerpos, incluyendo anticuerpos humanizados) que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende la región CDR1 de la SEC ID Nº: 9, en la que I34 es S, L, V A o I; y N35 es N, T o S; la región CDR2 de la SEC ID Nº: 10, en la que M50 es M, I, G, Q, S o L; A62 es A o S; y L63 es L o V; y la región CDR3 de la SEC ID Nº: 11, en la que Y100 es Y, L o R; en la que Y101 es Y o W; en la que G103 es G, A o S; en la que T104 es T o S; en la que S105 es S, A o T; en la que Y106 es Y, R, T o M; en la que Y107 es Y o F; en la que F108 es F o W; en la que D109 es D, N o G; en la que Y110 es Y, K, S, R o T. En algunas realizaciones, la región variable de cadena pesada comprende la región CDR3 de la SEC ID Nº: 11, en la que Y100 es Y, L o R; en la que Y101 es Y o W; en la que G103 es G, A o S; en la que T104 es T o S; en la que S105 es S, A o T; en la que Y106 es Y, R, T o M; en la que Y107 es Y o F; en la que F108 es F o W; en la que D109 es S, A, C, G, D, N, T o G; en la que Y110 es cualquier aminoácido. En otras realizaciones, la región

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anti-NGF que comprende una región variable de cadena ligera que comprende:

(a)

una región CDR1 mostrada en la SEC ID Nº: 6;

(b)

una región CDR2 mostrada en la SEC ID Nº: 7; y

(c)

una región CDR3 mostrada en la SEC ID Nº: 8, 14, 55, 57, 59, 61 o 63.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-NGF que comprende una región variable de cadena pesada que comprende:

(a)

una región CDR1 mostrada en la SEC ID Nº: 3;

(b)

una región CDR2 mostrada en la SEC ID Nº: 4; y

(c)

una región CDR3 mostrada en la SEC ID Nº: 5.

De acuerdo con la presente invención, el anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-NGF que comprende una región variable de cadena ligera que comprende:

(a)

una región CDR1 mostrada en la SEC ID Nº: 6;

(b)

una región CDR2 mostrada en la SEC ID Nº: 7; y

(c)

una región CDR3 mostrada en la SEC ID Nº: 8.

El anticuerpo anti-NGF puede comprender además una región variable de cadena pesada que comprende:

(a)

una región CDR1 mostrada en la SEC ID Nº: 3;

(b)

una región CDR2 mostrada en la SEC ID Nº: 4; y

(c)

una región CDR3 mostrada en la SEC ID Nº: 5.

De acuerdo con la presente divulgación el anticuerpo anti-NGF puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de cualquiera de al menos aproximadamente el 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 y/o una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de cualquiera de al menos aproximadamente el 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, en la que el anticuerpo se une específicamente a NGF. La región variable de cadena pesada y/o región variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-NGF humanizado puede comprender una o más mutaciones de la región flanqueante respectiva. En un aspecto, la mutación de la región flanqueante puede sustituir un resto de región flanqueante humana con el resto de la región flanqueante de ratón complementario. La mutación puede comprender la sustitución V71K en la región variable de la cadena pesada. De acuerdo con la presente invención el anticuerpo anti-NGF puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 y/o puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2.

De acuerdo con la presente invención el anticuerpo anti-NGF comprende las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC ID Nº: 1 y 2.

El anticuerpo anti-NGF puede comprender una región de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de cualquiera de al menos aproximadamente el 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 16 y/o una región de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de cualquiera de al menos aproximadamente el 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 17, en la que el anticuerpo se une específicamente a NGF.

El anticuerpo anti-NGF puede comprender una región de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 16 y/o puede comprender una región de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 17.

El anticuerpo anti-NGF puede ser un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC ID Nº: 16 y 17.

De acuerdo con la presente divulgación el anticuerpo anti-NGF puede competir por la unión a NGF con un anticuerpo anti-NGF como se define en el presente documento. El anticuerpo anti-NGF puede competir por la unión a NGF con un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 y/o una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2.

El anticuerpo anti-NGF puede ser un anticuerpo humanizado y madurado por afinidad, E3, que se une específicamente a NGF humano y de roedor. El anticuerpo E3 se describe en el documento WO2004/058184. Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena ligera y de cadena pesada de E3 se muestran en

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las SEC ID Nº: 1 y 2 (Figuras 1A y 1B del documento WO2004/058184), respectivamente. Las porciones CDR del anticuerpo E3 (incluyendo CDR de Chothia y Kabat) se representan en forma esquemática en las Figuras 1A y 1B del documento WO2004/058184. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada de E3 y de las CDR extendidas individuales también se muestran a continuación (véase, “secuencias de anticuerpo” a continuación). El anticuerpo E3 es muy potente para secuestrar NGF e impedir la interacción con su receptor. E3 y su anticuerpo precursor murino 911 han demostrado ser un analgésico eficaz en modelos animales no clínicos de dolor patológico incluyendo artritis, dolor por cáncer y dolor postquirúrgico.

El anticuerpo anti-NGF también puede comprender un fragmento o una región del anticuerpo E3 (denominados indistintamente “E3” en el presente documento). En una realización, el fragmento es una cadena ligera del anticuerpo E3 como se muestra en la Figura 1B del documento WO2004/058184 y en la SEC ID Nº: 17 en el presente documento. En otra realización, el fragmento es una cadena pesada del anticuerpo E3 como se muestra en la Figura 1A del documento WO2004/058184 y en la SEC ID Nº: 16 en el presente documento. En otra realización más, el fragmento contiene una o más regiones variables de una cadena ligera y/o una cadena pesada del anticuerpo E3. En otra realización más, el fragmento contiene una o más CDR de una cadena ligera y/o una cadena pesada del anticuerpo E3, como se muestra en las Figuras 1A y 1B del documento WO2004/058184 y en las SEC ID Nº: 17 y 16, respectivamente, en el presente documento.

En otro aspecto, el anticuerpo comprende una cadena ligera que está codificada por un polinucleótido que se produce por una célula huésped con un número de depósito de la ATCC Nº PTA-4893 o ATCC Nº PTA-4894. En otro aspecto, el anticuerpo comprende una cadena pesada que está codificada por un polinucleótido que se produce por una célula huésped con un número de depósito de la ATCC Nº PTA-4895. En otro aspecto, el anticuerpo comprende (a) una cadena ligera que está codificada por un polinucleótido que se produce por una célula huésped con un número de depósito de la ATCC Nº PTA-4894 o ATCC Nº PTA-4893; y (b) una cadena pesada que está codificada por un polinucleótido que se produce por una célula huésped con un número de depósito de la ATCC Nº PTA-4895 (por comodidad en el presente documento, el polinucleótido o polinucleótidos producidos por una célula huésped depositada se denominan con el número de depósito de la ATCC Nº PTA-4894, PTA-4893 y PTA-4895). En otro aspecto, el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera de una cadena ligera que está codificada por un polinucleótido que se produce por una célula huésped con un número de depósito de la ATCC Nº PTA-4894 o ATCC Nº PTA-4893. En otro aspecto, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada de una cadena pesada que está codificada por un polinucleótido que se produce por una célula huésped con un número de depósito de la ATCC Nº PTA-4895. En otro aspecto, el anticuerpo comprende (a) una región variable de cadena ligera de una cadena ligera que está codificada por un polinucleótido que se produce por una célula huésped con un número de depósito de la ATCC Nº PTA-4894 o ATCC Nº PTA-4893, y (b) una región variable de cadena pesada de una cadena pesada que está codificada por un polinucleótido que se produce por una célula huésped con un número de depósito de la ATCC Nº PTA-4895. En otro aspecto más, el anticuerpo comprende una o más CDR codificadas por (a) un polinucleótido que se produce por una célula huésped con un número de depósito de la ATCC Nº PTA-4894; y/o (b) una cadena pesada que está codificada por un polinucleótido que se produce por una célula huésped con un número de depósito de la ATCC Nº PTA-4895.

En otro aspecto, el anticuerpo comprende una o más de cualquiera de las siguientes: a) una o más CDR de anticuerpo E3 mostradas en las SEC ID Nº: 1-8 o SEC ID Nº: 3-8 (Figuras 1A y 1B del documento WO2004/058184); b) la CDR H3 de la cadena pesada del anticuerpo E3 mostrada en las SEC ID Nº: 1 y 5 (Figura 1A del documento WO2004/058184); c) la CDR L3 de la cadena ligera del anticuerpo E3 mostrada en las SEC ID Nº: 2 y 8 (Figura 1B del documento WO2004/058184); d) tres CDR de la cadena ligera del anticuerpo E3 mostradas en las SEC ID Nº: 2, 6-8 (Figura 1B del documento WO2004/058184); e) tres CDR de la cadena pesada del anticuerpo E3 mostradas en las SEC ID Nº: 1, 3-5 (Figura 1A del documento WO2004/058184); y f) tres CDR de la cadena ligera y tres CDR de la cadena pesada del anticuerpo E3 mostradas en las SEC ID Nº: 1-8 (Figuras 1A y 1B del documento WO2004/058184). En otro aspecto, el anticuerpo puede comprender una o más de cualquiera de las siguientes: a) una o más (una, dos, tres, cuatro, cinco o seis) CDR derivadas del anticuerpo E3 mostradas en las SEC ID Nº: 1-8 (Figuras 1A y 1B del documento WO2004/058184); b) una CDR derivada de la CDR H3 de la cadena pesada del anticuerpo E3 mostrada en las SEC ID Nº: 1 y 5 (Figura 1A del documento WO2004/058184); y/o c) una CDR derivada de la CDR L3 de la cadena ligera del anticuerpo E3 mostrada en las SEC ID Nº: 2 y 8 (Figura 1B del documento WO2004/058184). En algunas realizaciones, las CDR pueden ser CDR de Kabat, CDR de Chothia o una combinación de CDR de Kabat y Chothia (denominadas CDR “extendidas” o “combinadas” en el presente documento). En algunas realizaciones, los polipéptidos comprenden cualquiera de las configuraciones de CDR (incluyendo combinaciones, variantes, etc.) descritas en el presente documento.

En otra divulgación, el anticuerpo puede comprender:

(a)

una región variable de cadena pesada que comprende:

(i)

una región CDR1 de la SEC ID Nº: 30;

(ii)

una región CDR2 que comprende la secuencia de la SEC ID Nº: 31;

(iii) una región CDR3 seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 11, 56, 58, 60, 62 y 64; y

(b)

una región variable de cadena ligera que comprende:

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11, 12, 13, 14 o 15 ciclos de congelación-descongelación. Más preferentemente, el anticuerpo es resistente a la agregación durante al menos quince ciclos de congelación y descongelación de la composición líquida, preferentemente además cuatro o quince ciclos.

Preferentemente además, el anticuerpo demuestra un aumento de la agregación de menos de aproximadamente el 10% después de los múltiples ciclos de congelación y descongelación de la composición líquida en comparación con la misma composición, o una muestra equivalente de idéntica o aproximadamente idéntica composición, antes de la congelación y descongelación, más preferentemente un aumento de la agregación de menos de o aproximadamente el 9, 8, 7 ,6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 o 0% después de los múltiples ciclos de congelación y descongelación de la composición líquida en comparación con la misma composición, o una muestra equivalente de idéntica o aproximadamente idéntica composición, antes de la congelación y descongelación.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición líquida de la invención en la que la composición puede almacenarse durante un periodo de al menos aproximadamente 26 o 52 semanas a una temperatura de cualquiera de aproximadamente 5, 25 o 40ºC, y en la que existe un aumento en la agregación del anticuerpo de la composición de menos de aproximadamente el 35%, más preferentemente menos de aproximadamente el 10%. Preferentemente, la concentración del anticuerpo es de aproximadamente 10 mg/ml o de aproximadamente 50 mg/ml.

Preferentemente, existe un aumento en la agregación del anticuerpo de la formulación líquida de menos de aproximadamente el 35%, más preferentemente menos de aproximadamente el 10%, cuando se almacena durante un periodo de cualquiera de aproximadamente 2, 4, 8, 9, 13, 26 o 52 semanas a una temperatura de cualquiera de aproximadamente 5, 25 o 40oC en comparación con la misma composición, o una muestra equivalente de idéntica o aproximadamente idéntica composición, antes del periodo de almacenamiento. Preferentemente, la concentración del anticuerpo es de aproximadamente 10 mg/ml o aproximadamente 50 mg/ml.

Más preferentemente, el anticuerpo de la composición líquida demuestra un aumento de la agregación de menos de aproximadamente el 35%, más preferentemente menos de aproximadamente el 10%, más preferentemente menos de cualquiera de aproximadamente el 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, más preferentemente menos de aproximadamente el 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0,5% o igual a aproximadamente el 0% después del periodo de almacenamiento de 2, 4, 8, 9, 13, 26 o 52 semanas a una temperatura de cualquiera de aproximadamente 5, 25 o 40ºC, más preferentemente, menos de aproximadamente el 20% a 40ºC durante 52 semanas, o menos de aproximadamente el 10% a 40ºC durante 26 semanas, en comparación con la misma composición, o una muestra equivalente de idéntica o aproximadamente idéntica composición, antes del periodo de almacenamiento. Preferentemente, la concentración del anticuerpo es de aproximadamente 10 mg/ml o de aproximadamente 50 mg/ml.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición líquida de la invención en la que la composición puede almacenarse durante un periodo de al menos aproximadamente 26 o 52 semanas a una temperatura de cualquiera de aproximadamente 5, 25 o 40ºC, y en la que existe un aumento en la oxidación del anticuerpo de la composición de menos de aproximadamente el 35%, más preferentemente menos de aproximadamente el 10%, en comparación con la misma composición, o una muestra equivalente de idéntica o aproximadamente idéntica composición, antes del periodo de almacenamiento. Preferentemente, la concentración del anticuerpo es de aproximadamente 10 mg/ml o de aproximadamente 50 mg/ml.

Preferentemente, el anticuerpo de la composición líquida demuestra un aumento de la oxidación de menos de aproximadamente el 35%, más preferentemente menos de aproximadamente el 10%, más preferentemente menos de cualquiera de aproximadamente el 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, más preferentemente menos de aproximadamente el 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0,5%, o igual a aproximadamente el 0%, después del periodo de almacenamiento de cualquiera de aproximadamente 2, 4, 8, 9, 13, 26 o 52 semanas a una temperatura de cualquiera de aproximadamente 5, 25 o 40ºC, más preferentemente, menos de aproximadamente el 31% o 30% durante 52 semanas, o menos de aproximadamente el 11% o 10% a 40ºC durante 26 semanas, en comparación con la misma composición, o una muestra equivalente de idéntica o aproximadamente idéntica composición, antes del periodo de almacenamiento. Preferentemente, la concentración del anticuerpo es de aproximadamente 10 mg/ml o de aproximadamente 50 mg/ml.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición líquida de la invención en la que la composición puede almacenarse durante un periodo de al menos aproximadamente 26 o 52 semanas a una temperatura de cualquiera de aproximadamente 5, 25 o 40ºC, y en la que existe una disminución en la actividad del anticuerpo de la composición de menos del 30%.

Preferentemente, existe una disminución en la actividad del anticuerpo de la formulación líquida de menos de aproximadamente el 30%, más preferentemente de menos de aproximadamente el 25%, más preferentemente del 20%, más preferentemente una disminución en la actividad del anticuerpo de la formulación de menos de aproximadamente el 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 o 0% cuando se almacena

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En algunas realizaciones, el patrón de administración del medicamento comprende la administración de una dosis del medicamento una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada cinco semanas, una vez cada seis semanas, una vez cada siete semanas, una vez cada ocho semanas, una vez cada nueve semanas, una vez cada diez semanas, una vez cada quince semanas, una vez cada veinte semanas, una vez cada veinticinco semanas o una vez cada veintiséis semanas. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-NGF se administra una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada cuatro meses, una vez cada cinco meses o una vez cada seis meses. Más preferentemente, en el patrón de administración del medicamento comprende la administración de una dosis del medicamento una vez cada ocho semanas.

En algunas realizaciones, el volumen de una dosis es inferior a o igual a aproximadamente 20 ml, aproximadamente 15 ml, aproximadamente 10 ml, aproximadamente 5 ml, aproximadamente 2,5 ml, aproximadamente 1,5 ml, aproximadamente 1,0 ml, aproximadamente 0,75 ml, aproximadamente 0,5 ml, aproximadamente 0,25 ml o aproximadamente 0,01 ml. En algunas realizaciones, el volumen de una dosis es de aproximadamente 20 ml, aproximadamente 19 ml, aproximadamente 18 ml, aproximadamente 17 ml, aproximadamente 16 ml, aproximadamente 15 ml, aproximadamente 14 ml, aproximadamente 13 ml, aproximadamente 12 ml, aproximadamente 11 ml, aproximadamente 10 ml, aproximadamente 9 ml, aproximadamente 8 ml, aproximadamente 7 ml, aproximadamente 6 ml, aproximadamente 5 ml, aproximadamente 4 ml, aproximadamente 3 ml, aproximadamente 2 ml o aproximadamente 1 ml. Como alternativa, de aproximadamente 20,5 ml, aproximadamente 19,5 ml, aproximadamente 18,5 ml, aproximadamente 17,5 ml, aproximadamente 16,5 ml, aproximadamente 15,5 ml, aproximadamente 14,5 ml, aproximadamente 13,5 ml, aproximadamente 12,5 ml, aproximadamente 11,5 ml, aproximadamente 10,5 ml, aproximadamente 9,5 ml, aproximadamente 8,5 ml, aproximadamente 7,5 ml, aproximadamente 6,5 ml, aproximadamente 5,5 ml, aproximadamente 4,5 ml, aproximadamente 3,5 ml, aproximadamente 2,5 ml, aproximadamente 1,5 ml o aproximadamente 0,5. Como alternativa, de aproximadamente 900 microlitros, aproximadamente 800 microlitros, aproximadamente 700 microlitros, aproximadamente 600 microlitros, aproximadamente 500 microlitros, aproximadamente 400 microlitros, aproximadamente 300 microlitros, aproximadamente 200 microlitros o aproximadamente 100 microlitros, como alternativa, de aproximadamente 950 microlitros, aproximadamente 850 microlitros, aproximadamente 750 microlitros, aproximadamente 650 microlitros, aproximadamente 550 microlitros, aproximadamente 450 microlitros, aproximadamente 350 microlitros, aproximadamente 250 microlitros, aproximadamente 150 microlitros o aproximadamente 50 microlitros. Más preferentemente, el volumen de la dosis es inferior a o igual a aproximadamente 2,5 ml.

De acuerdo con una realización preferida, la concentración de anticuerpo puede variar de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 200 mg/ml. Preferentemente, la concentración de anticuerpo es de aproximadamente 0,5 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml, aproximadamente 2 mg/ml, aproximadamente 2,5 mg/ml, aproximadamente 3 mg/ml, aproximadamente 3,5 mg/ml, aproximadamente 4 mg/ml, aproximadamente 4,5 mg/ml, aproximadamente 5 mg/ml, aproximadamente 5,5 mg/ml, aproximadamente 6 mg/ml, aproximadamente 6,5 mg/ml, aproximadamente 7 mg/ml, aproximadamente 7,5 mg/ml, aproximadamente 8 mg/ml, aproximadamente 8,5 mg/ml, aproximadamente 9 mg/ml, aproximadamente 9,5 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml, aproximadamente 11 mg/ml, aproximadamente 12 mg/ml, aproximadamente 13 mg/ml, aproximadamente 14 mg/ml, aproximadamente 15 mg/ml, aproximadamente 16 mg/ml, aproximadamente 17 mg/ml, aproximadamente 18 mg/ml, aproximadamente 19 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 21 mg/ml, aproximadamente 22 mg/ml, aproximadamente 23 mg/ml, aproximadamente 24 mg/ml, aproximadamente 25 mg/ml, aproximadamente 26 mg/ml, aproximadamente 27 mg/ml, aproximadamente 28 mg/ml, aproximadamente 29 mg/ml, aproximadamente 30 mg/ml, aproximadamente 31 mg/ml, aproximadamente 32 mg/ml, aproximadamente 33 mg/ml, aproximadamente 34 mg/ml, aproximadamente 35 mg/ml, aproximadamente 36 mg/ml, aproximadamente 37 mg/ml, aproximadamente 38 mg/ml, aproximadamente 39 mg/ml, aproximadamente 40 mg/ml, aproximadamente 41 mg/ml, aproximadamente 42 mg/ml, aproximadamente 43 mg/ml, aproximadamente 44 mg/ml, aproximadamente 45 mg/ml, aproximadamente 46 mg/ml, aproximadamente 47 mg/ml, aproximadamente 48 mg/ml, aproximadamente 49 mg/ml, aproximadamente 50 mg/ml, aproximadamente 51 mg/ml, aproximadamente 52 mg/ml, aproximadamente 53 mg/ml, aproximadamente 54 mg/ml, aproximadamente 55 mg/ml, aproximadamente 56 mg/ml, aproximadamente 57 mg/ml, aproximadamente 58 mg/ml, aproximadamente 59 mg/ml, aproximadamente 60 mg/ml, aproximadamente 70 mg/ml, aproximadamente 80 mg/ml, aproximadamente 90 mg/ml, aproximadamente 100 mg/ml

o aproximadamente 110 mg/ml. Más preferentemente, la concentración de anticuerpo es inferior a o igual a 50 mg/ml y puede seleccionarse del grupo que comprende aproximadamente 2 mg/ml, aproximadamente 2,5 mg/ml, aproximadamente 5 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml, aproximadamente 19 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 22 mg/ml y aproximadamente 50 mg/ml.

De acuerdo con una realización preferida, la dosis contiene menos de o es igual a aproximadamente 0,5 mg, aproximadamente 1 mg, aproximadamente 2 mg, aproximadamente 3 mg, aproximadamente 4 mg, aproximadamente 5 mg, aproximadamente 6 mg, aproximadamente 7 mg, aproximadamente 8 mg, aproximadamente 9 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 11 mg, aproximadamente 12 mg, aproximadamente 13 mg, aproximadamente 14 mg, aproximadamente 15 mg, aproximadamente 16 mg, aproximadamente 17 mg, aproximadamente 18 mg, aproximadamente 19 mg, aproximadamente 20 mg, aproximadamente 21 mg, aproximadamente 22 mg, aproximadamente 23 mg, aproximadamente 24 mg, aproximadamente 25 mg, aproximadamente 26 mg, aproximadamente 27 mg, aproximadamente 28 mg,

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aproximadamente 29 mg, aproximadamente 30 mg, aproximadamente 31 mg, aproximadamente 32 mg, aproximadamente 33 mg, aproximadamente 34 mg, aproximadamente 35 mg, aproximadamente 36 mg, aproximadamente 37 mg, aproximadamente 38 mg, aproximadamente 39 mg, aproximadamente 40 mg, aproximadamente 41 mg, aproximadamente 42 mg, aproximadamente 43 mg, aproximadamente 44 mg, aproximadamente 45 mg, aproximadamente 46 mg, aproximadamente 47 mg, aproximadamente 48 mg, aproximadamente 49 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 51 mg, aproximadamente 52 mg, aproximadamente 53 mg, aproximadamente 54 mg, aproximadamente 55 mg, aproximadamente 56 mg, aproximadamente 57 mg, aproximadamente 58 mg, aproximadamente 59 mg, aproximadamente 60 mg, aproximadamente 70 mg, aproximadamente 80 mg, aproximadamente 90 mg, aproximadamente 100 mg o aproximadamente 110 mg de anticuerpo. Más preferentemente la dosis contiene menos de o es igual a aproximadamente 50 mg de anticuerpo.

De acuerdo con una realización preferida, la dosis contiene una cantidad de anticuerpo que es de aproximadamente 1 g/kg, aproximadamente 10 g/kg, aproximadamente 20 g/kg, aproximadamente 25 g/kg, aproximadamente 50 g/kg, aproximadamente 100 g/kg, aproximadamente 200 g/kg, aproximadamente 250 g/kg, aproximadamente 500 g/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 6 mg/kg, aproximadamente 7 mg/kg, aproximadamente 8 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg o aproximadamente 11 mg/kg (de masa del mamífero al que se va a administrar la dosis). Más preferentemente, la dosis contiene aproximadamente 20 g/kg, aproximadamente 25 g/kg, aproximadamente 50 g/kg, aproximadamente 100 g/kg, aproximadamente 200 g/kg, aproximadamente 250 g/kg, 1 mg/kg o aproximadamente 2 mg/kg.

Los regímenes de dosificación pueden depender del patrón de declive farmacocinético que desee conseguir el médico. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se contempla una dosificación de una-cuatro veces por semana. Puede usarse una dosificación aún menos frecuente. En algunas realizaciones, la dosis se administra una vez cada 2 semanas, cada 3 semanas, cada 4 semanas, cada 5 semanas, cada 6 semanas, cada 7 semanas, cada 8 semanas, cada 9 semanas, cada 10 semanas, cada 15 semanas, cada 20 semanas, cada 25 semanas o más tiempo. En algunas realizaciones, la dosis se administra 1 vez al mes, cada 2 meses, cada 3 meses, cada 4 meses, cada 5 meses, cada 6 meses o más tiempo. Más preferentemente, la dosis se administra una vez cada ocho semanas. El progreso de esta terapia se controla fácilmente por técnicas y ensayos convencionales. El régimen de dosificación puede variar con el tiempo.

Para los fines de la presente invención, la dosificación apropiada del medicamento dependerá del anticuerpo empleado, del tipo y gravedad del dolor a tratar, de si el agente se administra con fines terapéuticos o preventivos, de la terapia previa, de la historia clínica del paciente y de la respuesta al agente, y del juicio del médico adjunto. Típicamente, el clínico administrará el medicamento hasta que se alcance una dosificación que consiga el resultado deseado. Las dosificaciones pueden determinarse empíricamente, por ejemplo, se administra a individuos dosificaciones crecientes para evaluar la eficacia del medicamento, puede seguirse un indicador de dolor, tal como un cambio en una escala de calificación numérica del dolor (ECN).

La dosis y/o frecuencia pueden variar con el transcurso del tratamiento. Consideraciones empíricas tales como la semivida del anticuerpo contribuirán generalmente a la determinación de la dosificación. La frecuencia de dosificación puede determinarse y ajustarse con el transcurso de la terapia y, generalmente, pero no necesariamente, se basa en el tratamiento y/o supresión y/o mejoría y/o retraso del dolor. En algunos individuos, puede ser necesaria más de una dosis. La frecuencia de administración puede determinarse y ajustarse con el transcurso de la terapia. Para administraciones repetidas a lo largo de varios días o más tiempo, dependiendo del dolor y de su gravedad, el tratamiento se mantiene hasta que se produce la supresión de síntomas deseada o hasta que se consiguen niveles terapéuticos suficientes para reducir el dolor.

La administración de un medicamento que comprende la composición líquida puede ser continua o intermitente, dependiendo, por ejemplo, del estado fisiológico del receptor, de si el propósito de la administración es terapéutico o profiláctico y de otros factores conocidos por los expertos en la materia. La administración del medicamento que comprende la composición líquida puede ser esencialmente continua a lo largo de un periodo de tiempo preseleccionado o puede ser una serie de dosis espaciadas, por ejemplo, antes, durante o después del desarrollo del dolor.

Preferentemente, la administración de la dosis es una administración parenteral, preferentemente seleccionada de intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, intraesternal, intracraneal, intramuscular, intraósea, intradérmica y subcutánea. Preferentemente, el medicamento está en una forma líquida estéril de dosificación unitaria para su administración parenteral.

La eficacia del tratamiento puede evaluarse por control del alivio del dolor. El alivio del dolor puede caracterizarse por el curso de tiempo de alivio. Por consiguiente, en algunas realizaciones, se observa alivio en aproximadamente 24 horas después de la administración. En otras realizaciones, se observa alivio en aproximadamente 36, 48, 60, 72 horas o 4 días después de la administración. En algunas realizaciones, se disminuye la frecuencia y/o intensidad del dolor y/o se aumenta la calidad de vida de aquellos que padecen dolor. En algunas realizaciones, se proporciona alivio del dolor por una duración de al menos aproximadamente 7 días, al menos aproximadamente 14 días, al

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menos aproximadamente 21 días, al menos aproximadamente 28 días, al menos aproximadamente 35 días, al menos aproximadamente 42 días, al menos aproximadamente 49 días, al menos aproximadamente 56 días, al menos aproximadamente 63 días, al menos aproximadamente 70 días, al menos aproximadamente 77 días, al menos aproximadamente 84 días, al menos aproximadamente 180 días o más tiempo después de una sola dosis del medicamento.

COMBINACIONES

La composición líquida de acuerdo con cualquier aspecto o realización puede combinarse provechosamente con otro compuesto farmacológicamente activo, o con dos o más compuestos farmacológicamente activos distintos, particularmente en el tratamiento del dolor en un mamífero, y puede administrarse simultáneamente, de forma secuencial o por separado en combinación con uno o más agentes seleccionados de:

(i)

un analgésico opioide, por ejemplo, morfina, heroína, hidromorfona, oximorfona, levorfanol, levalorfano, metadona, meperidina, fentanilo, cocaína, codeína, dihidrocodeína, oxicodona, hidrocodona, propoxifeno, nalmefeno, nalorfina, naloxona, naltrexona, buprenorfina, butorfanol, nalbufina o pentazocina;

(ii)

un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), por ejemplo, aspirina, diclofenaco, diflusinal, etodolaco, fenbufén, fenoprofeno, flufenisal, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, ketoprofeno, ketorolaco, ácido meclofenámico, ácido mefenámico, nabumetona, naproxeno, oxaprozina, fenilbutazona, piroxicam, sulindaco, tolmetina o zomepiraco, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

(iii) un sedante barbitúrico, por ejemplo, amobarbital, aprobarbital, butabarbital, butabital, mefobarbital, metarbital, metohexital, pentobarbital, fenobartital, secobarbital, talbutal, teamilal o tiopental o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

(iv)

una benzodiazepina que tiene una acción sedante, por ejemplo, clordiazepóxido, clorazepato, diazepam, flurazepam, lorazepam, oxazepam, temazepam o triazolam, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

(v)

un antagonista de H1 que tiene una acción sedante, por ejemplo, difenhidramina, pirilamina, prometazina, clorfeniramina o clorciclizina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

(vi)

un sedante tal como glutetimida, meprobamato, metacualona o dicloralfenazona o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

(vii) un relajante del músculo esquelético, por ejemplo, baclofeno, carisoprodol, clorzoxazona, ciclobenzaprina, metocarbamol u orfrenadina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

(viii) un antagonista de receptor de NMDA, por ejemplo, dextrometorfano ((+)-3-hidroxi-N-metilmorfinano) o su metabolito dextrorfano ((+)-3-hidroxi-N-metilmorfinano), ketamina, memantina, pirroloquinolina quinona o ácido cis-4-(fosfonometil)-2-piperidinecarboxílico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; �

(ix)

un alfa-adrenérgico, por ejemplo, doxazosina, tamsulosina, clonidina o 4-amino-6,7-dimetoxi-2-(5metanesulfonamido-1,2,3,4-tetrahidroisoquinol-2-il)-5-(2-piridil)quinazolina;

(x)

un antidepresivo tricíclico, por ejemplo, desipramina, imipramina, amitriptilina o nortriptilina;

(xi)

un anticonvulsionante, por ejemplo, carbamazepina o valproato;

(xii) un antagonista de taquiquinina (NK), particularmente un antagonista de NK-3, NK-2 o NK-1, por ejemplo, (R,9R)-7-[3,5-bis(trifluorometil)bencil]-8,9,10,11-tetrahidro-9-metil-5-(4-metilfenil)-7H-[1,4]diazocino[2,1g][1,7]naftridin-6-13-diona (TAK-637), 5-[[(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-bis(trifluorometil)fenil]etoxi-3-(4-fluorofenil)-4morfolinil]metil]-1,2-dihidro-3H-1,2,4-triazol-3-ona (MK-869), lanepitant, dapitant o 3-[[2-metoxi-5(trifluorometoxi)fenil]metilamino]-2-fenil-piperidina (2S,3S);

(xiii) un antagonista muscarínico, por ejemplo, oxibutina, tolterodina, propiverina, cloruro de tropsio o darifenacina;

(xiv) un inhibidor de COX-2, por ejemplo, celecoxib, rofecoxib o valdecoxib;

(xv) un inhibidor de COX no selectivo (preferentemente con protección GI), por ejemplo, nitroflurbiprofeno (HCT1026);

(xvi) un analgésico de alquitrán de hulla, en particular paracetamol;

(xvii) un neuroléptico tal como droperidol;

(xviii) un agonista (por ejemplo, resinferatoxina) o antagonista (por ejemplo, capsazepina) del receptor vaniloide;

(xix) un beta-adrenérgico tal como propranolol;

(xx) un anestésico local, tal como mexiletina;

(xxi) un corticosteroide, tal como dexametasona

(xxii) un agonista o antagonista del receptor de serotonina;

(xxiii) un analgésico colinérgico (nicotínico);

(xxiv) Tramadol (marca comercial);

(xxv) un inhibidor de PDEV, tal como sildenafilo, vardenafilo o taladafilo;

(xxvi) un ligando alfa-2-delta tal como gabapentina o pregabalina; y

(xxvii) un canabinoide.

Descripción de las figuras

Figura 1 Resumen de los Datos de % de Agregación (mediante CET) de anticuerpo anti-NGF 50 mg/ml: Estudio de Exploración de Agente de Tonicidad a 40ºC.

Figura 2 Resumen de los Datos de % de Fragmentos (mediante ECG reducido) de anticuerpo anti-NGF 50

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mg/ml: Estudio de Exploración de Agente de Tonicidad a 40ºC.

Figura 3 Resumen de los Datos de % de Agregación (mediante CET) de anticuerpo anti-NGF 22 mg/ml sometido a 15 Ciclos de Congelación-Descongelación.

Figura 4 Datos de % de Agregación (mediante CET) a 5ºC durante un Estudio de Estabilidad a Largo Plazo de una formulación de anticuerpo anti-NGF E3 que contiene trehalosa, EDTA, polisorbato 20 en tampón de histidina a pH 6,0 a 2,5, 5, 10, 20 y 50 mg/ml

Figura 5 Datos de % de Fragmentación (mediante ECG reducido) a 5ºC durante un Estudio de Estabilidad a Largo Plazo de una formulación de anticuerpo anti-NGF E3 que contiene trehalosa, EDTA, polisorbato 20 en tampón de histidina a pH 6,0 a 2,5, 5, 10, 20 y 50 mg/ml

Figura 6 Datos de % de Oxidación a 5ºC durante un Estudio de Estabilidad a Largo Plazo de una formulación de anticuerpo anti-NGF E3 que contiene trehalosa, EDTA, polisorbato 20 en tampón de histidina a pH 6,0 a 2,5, 5, 10, 20 y 50 mg/ml.

Definiciones

Como se usan en el presente documento, los términos “formulación” o “composición” en lo que se refieren a un anticuerpo pretenden describir al anticuerpo en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable, que comprende al menos un agente de tonicidad, al menos un tampón, al menos un agente quelante, al menos un tensioactivo, en la que el pH es como se ha definido.

La expresión “composición farmacéutica” se refiere a preparaciones que están en una forma tal que permite que la actividad biológica de los principios activos sea eficaz.

Los “excipientes farmacéuticamente aceptables” (vehículos, aditivos) son aquellos que pueden administrarse con seguridad a un sujeto para proporcionar una dosis eficaz del principio activo empleado. El término “excipiente” o “vehículo”, como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia inerte, que se usa comúnmente como diluyente, vehículo, conservante, aglutinante o agente estabilizante para fármacos. Como se usa en el presente documento, el término “diluyente” se refiere a un disolvente farmacéuticamente aceptable (seguro y no tóxico para su administración a un ser humano) y que es útil para la preparación de las formulaciones líquidas del presente documento. Los diluyentes ejemplares incluyen, pero sin limitación, agua estéril y agua bacteriostática para inyección (ABPI).

Como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” se refiere a un anticuerpo intacto o a una porción de unión a antígeno que compite con el anticuerpo intacto por una unión específica. Véase, en general, Fundamental Immunology, Cap. 7 (Paul, W., ed., 2ª ed. Raven Press, N.Y. (1989). Pueden producirse porciones de unión a antígeno mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. En algunas realizaciones, las porciones de unión a antígeno incluyen Fab, Fab’, F(ab’)2, Fd, Fv, dAb, y fragmentos de región determinante de complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena sencilla (scFv), anticuerpos quiméricos, diacuerpos y polipéptidos que contienen al menos una porción de un anticuerpo que es suficiente para conferir una unión a antígeno específica al polipéptido. Del extremo N-terminal al C-terminal, ambos dominios variables de cadena pesada y ligera maduros comprenden las regiones FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio es de acuerdo con las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), Chothia y Lesk, J. MoI. Biol. 196:901-917 (1987) o Chothia y col., Nature 342: 878-883 (1989). Como se usa en el presente documento, el término “polipéptido” incluye proteínas artificiales o nativas, fragmentos proteicos y análogos polipeptídicos de una secuencia proteica. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico.

Como se usa en el presente documento, un fragmento Fd se refiere a un fragmento de anticuerpo que consiste en los dominios VH y CH1; un fragmento Fv consiste en los dominios V1 y VH de un solo brazo de un anticuerpo; y un fragmento dAb (Ward y col., Nature 341: 544-546 (1989)) consiste en un dominio VH.

La expresión “o una porción de unión a antígeno del mismo”, cuando se usa con el término “anticuerpo”, se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino-terminal y/o carboxi-terminal, pero en el que la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia de origen natural. En algunas realizaciones, los fragmentos tienen al menos 5, 6, 8 o 10 aminoácidos de longitud. En otras realizaciones, los fragmentos tienen al menos 14, al menos 20, al menos 50 o al menos 70, 80, 90, 100, 150 o 200 aminoácidos de longitud.

Como se usa en el presente documento, la expresión “anticuerpo monoclonal” se refiere a una población de anticuerpo homogénea en la que el anticuerpo monoclonal está compuesto por aminoácidos (de origen natural y de origen no natural) que están implicados en la unión selectiva de un antígeno. Una población de anticuerpos monoclonales es altamente específica, estando dirigida contra un solo sitio antigénico. La expresión “anticuerpo monoclonal” incluye no solo anticuerpos monoclonales intactos y anticuerpos monoclonales de longitud completa, sino también fragmentos de los mismos (tales como Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv), cadena sencilla (ScFv), mutantes de los

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constante de disociación que es  1 M, preferentemente  1 nM y, más preferentemente,  10 pM. Un epítopo que "se une específicamente” o “se une preferentemente” (usadas indistintamente en el presente documento) a un anticuerpo o un polipéptido es una expresión bien entendida en la técnica, y también se conocen bien en la técnica procedimientos para determinar dicha unión específica o preferente. Se dice que una molécula muestra una “unión específica” o “unión preferente” si reacciona o se asocia más frecuentemente, más rápidamente, con mayor duración y/o con mayor afinidad con una célula o sustancia particular de lo que lo hace con células o sustancias alternativas. Un anticuerpo “se une específicamente” o “se une preferentemente” a una diana si se une con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración de lo que se une a otras sustancias. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente o preferentemente a un epítopo de NGF es un anticuerpo que se une a este epítopo con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración de lo que se une a otros epítopos de NGF o epítopos que no sean de NGF. También se entiende al leer esta definición que, por ejemplo, un anticuerpo (o resto o epítopo) que se une específicamente o preferentemente a una primera diana puede o no unirse específicamente o preferentemente a una segunda diana. Como tal, una “unión específica” o “unión preferente” no requiere necesariamente (aunque puede incluir) una unión exclusiva.

Como se usa en el presente documento, una unión “inmunoespecífica” de anticuerpos se refiere a la interacción de unión específica de antígeno que se produce entre el sitio de combinación con antígeno de un anticuerpo y el antígeno específico reconocido por ese anticuerpo (es decir, el anticuerpo reacciona con la proteína en un ELISA u otro inmunoensayo y no reacciona de forma detectable con proteínas no relacionadas). El término “competir”, como se usa en el presente documento con respecto a un anticuerpo, significa que un primer anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, se une a un epítopo de una forma lo bastante similar a la unión de un segundo anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, de modo que el resultado de la unión del primer anticuerpo con su epítopo afín se disminuye de forma detectable en presencia del segundo anticuerpo en comparación con la unión del primer anticuerpo en ausencia del segundo anticuerpo. La alternativa, en la que la unión del segundo anticuerpo a su epítopo también se disminuye de forma detectable en presencia del primer anticuerpo puede ser, pero no tiene por qué ser el caso. Es decir, un primer anticuerpo puede inhibir la unión de un segundo anticuerpo a su epítopo sin que el segundo anticuerpo inhiba la unión del primer anticuerpo a su epítopo respectivo. Sin embargo, cuando cada anticuerpo inhibe de forma detectable la unión del otro anticuerpo con su epítopo o ligando afín, ya sea en el mismo, mayor o menor grado, se dice que los anticuerpos presentan “competición cruzada” entre sí por la unión de su epítopo o epítopos respectivos. Tanto los anticuerpos de competición como los de competición cruzada se incluyen en la presente divulgación. Independientemente del mecanismo por el que se produzca dicha competición o competición cruzada (por ejemplo, impedimento estérico, cambio conformacional o unión a un epítopo común o porción del mismo), el experto apreciará, basándose en los contenidos proporcionados en el presente documento, que dichos anticuerpos de competición y/o competición cruzada se incluyen y pueden ser útiles para los procedimientos desvelados en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, las expresiones “factor de crecimiento nervioso” y “NGF” se refieren al factor de crecimiento nervioso y a variantes del mismo que conservan al menos parte de la actividad biológica del NGF. Como se usa en el presente documento, el NGF incluye todas las especies de mamífero de NGF de secuencia nativa, incluyendo ser humano, canino, felino, equino o bovino. El “receptor de NGF” se refiere a un polipéptido que se une por o se activa por NGF. Los receptores de NGF incluyen el receptor TrkA y el receptor p75 de cualquier especie de mamífero, incluyendo, pero sin limitación, ser humano, canino, felino, equino, primate o bovino. Como se usa en el presente documento, un “anticuerpo anti-NGF” (denominado indistintamente “anticuerpo antagonista anti-NGF”) se refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse a NGF e inhibir, bloquear, antagonizar, suprimir o reducir la actividad biológica de NGF y/o una ruta o rutas aguas abajo mediadas por la señalización de NGF. En algunas realizaciones, la expresión “anticuerpo antagonista anti-NGF” incluye todos los términos, títulos y estados funcionales identificados anteriormente y características por las que el propio NGF, una actividad biológica de NGF (incluyendo, pero sin limitación, su capacidad para mediar cualquier aspecto del dolor postquirúrgico) o las consecuencias de la actividad biológica, se anulan, disminuyen o neutralizan sustancialmente en cualquier grado significativo. En algunas realizaciones, un anticuerpo antagonista anti-NGF se une a NGF e impide la dimerización de NGF y/o la unión a un receptor de NGF (tal como p75 y/o trkA). En otras realizaciones, un anticuerpo anti-NGF se une a NGF e impide la dimerización del receptor trkA y/o la autofosforilación de trkA. Se proporcionan en el presente documento ejemplos de anticuerpos antagonistas anti-NGF. El término “identidad” se refiere al porcentaje de “identidad” de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácido nucleico. El porcentaje de identidad se determina generalmente por alineamiento de las secuencias con el fin de una comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en la primera secuencia para un mejor alineamiento con la segunda secuencia) y comparación de los restos aminoacídicos o nucleótidos en las posiciones correspondientes. El “mejor alineamiento” es un alineamiento de dos secuencias que da como resultado el mayor porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se determina por comparación del número de restos aminoacídicos o nucleótidos idénticos dentro de las secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones x 100).

La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede lograrse usando un algoritmo matemático conocido por los expertos en la materia. Un ejemplo de un algoritmo matemático para comparar dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, modificado como en Karlin y

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Las composiciones que comprenden dichos vehículos se formulan por procedimientos convencionales bien conocidos (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª edición, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; y Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20ª Ed. Mack Publishing, 2000).

El término “Koff”, como se usa en el presente documento, pretende referirse a la constante de velocidad de disociación para la disociación de un anticuerpo del complejo de antígeno/anticuerpo.

El término “Kd”, como se usa en el presente documento, pretende referirse a la constante de disociación de una interacción de antígeno-anticuerpo. Un modo para determinar la Kd o la afinidad de unión de anticuerpos a NGF es midiendo la afinidad de unión de fragmentos Fab monofuncionales del anticuerpo. Para obtener fragmentos Fab monofuncionales, un anticuerpo (por ejemplo, IgG) puede escindirse con papaína o expresarse de forma recombinante. La afinidad de un fragmento Fab anti-NGF de un anticuerpo puede determinarse por resonancia de plasmón superficial (sistema de resonancia de plasmón superficial (RPS) BlAcore3000™, BIAcore, INC, Piscaway NJ). Pueden activarse microplacas CM5 con clorhidrato de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-carbodiinida (EDC) y Nhidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Puede diluirse NGF humano (o cualquier otro NGF) en acetato sódico 10 mM pH 4,0 e inyectarse sobre la microplaca activada a una concentración de 0,005 mg/ml. Usando un tiempo de flujo variable a través de los canales individuales de la microplaca, pueden conseguirse dos intervalos de densidad de antígeno: 100-200 unidades de respuesta (UR) para estudios cinéticos detallados y 500-600 UR para ensayos de exploración. Se inyectan diluciones seriadas (0,1-10x KD estimada) de muestras de Fab purificados durante 1 min a 100 microlitros/min y se permiten tiempos de disociación de hasta 2 h. Las concentraciones de las proteínas Fab se determinan por ELISA y/o electroforesis SDS-PAGE usando un Fab de concentración conocida (según se determinó por análisis de aminoácidos) como patrón. Las velocidades de asociación (kon) y velocidades de disociación (koff) cinéticas se obtienen simultáneamente por ajuste de los datos a un modelo de unión de Langmuir 1:1 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) usando el programa BIAevaluation. Los valores de la constante de disociación en equilibrio (KD) se calcular como koff/kon. Este protocolo es adecuado para su uso en la determinación de la afinidad de unión de un anticuerpo a cualquier NGF, incluyendo NGF humano, NGF de otro vertebrado (en algunas realizaciones de mamífero) (tal como NGF de ratón, NGF de rata, NGF de primate), así como para su uso con otras neurotrofinas, tales como las neurotrofinas relacionadas NT3, NT4/5 y/o BDNF.

Los anticuerpos antagonistas anti-NGF para su uso en la invención pueden identificarse o caracterizarse usando procedimientos conocidos en la técnica, por los que se detecta y/o mide la reducción, mejoría o neutralización de una actividad biológica de NGF. Pueden usarse los procedimientos descritos en el documento PCT WO 04/065560. Otro procedimiento, por ejemplo, un ensayo de activación de receptor de quinasa (KIRA), descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 5.766.863 y 5.891.650, puede usarse para identificar agentes anti-NGF.

También pueden identificarse anticuerpos antagonistas anti-NGF por incubación de un agente candidato, por ejemplo, un anticuerpo, o anticuerpo anti-NGF, con NGF, y control de una o más de cualquiera de las siguientes características: (a) unión a NGF e inhibición de la actividad biológica de NGF o de rutas aguas abajo mediadas por la función de señalización de NGF; (b) inhibición, bloqueo o disminución de la activación del receptor de NGF (incluyendo dimerización y/o autofosforilación de TrkA); (c) aumento del aclaramiento de NGF; (d) tratamiento o prevención del dolor; (e) inhibición (reducción) de la síntesis, producción o liberación de NGF. La capacidad de un anticuerpo antagonista anti-NGF para bloquear o neutralizar una actividad biológica de NGF también puede evaluarse por control de la capacidad del agente candidato para inhibir la supervivencia mediada por NGF en el bioensayo de supervivencia de ganglios de las raíces dorsales de rata embrionaria, como se describe en Hongo y col., Hybridoma 19: 215-227 (2000).

La “reducción de la incidencia” de dolor se refiere a cualquiera de reducir la gravedad (que puede incluir reducir la necesidad y/o la cantidad de (por ejemplo, exposición a) otros fármacos y/o terapias usados generalmente para estas afecciones, incluyendo, por ejemplo, opiatos), duración y/o frecuencia (incluyendo, por ejemplo, retrasar o aumentar el tiempo hasta el dolor postquirúrgico en un individuo). Como entienden los expertos en la materia, los individuos pueden variar en términos de su respuesta al tratamiento y, como tal, por ejemplo, un “procedimiento de reducción de la incidencia de dolor por artritis reumatoide o dolor por artrosis en un individuo” refleja administrar el anticuerpo antagonista anti-NGF basándose en una esperanza razonable de que dicha administración pueda causar probablemente una reducción en la incidencia en ese individuo particular.

La “mejoría” de un dolor o de uno o más síntomas de un dolor (tal como dolor por artritis reumatoide o dolor por artrosis) se refiere a disminuir la gravedad o mejorar uno o más síntomas de un dolor en comparación con la no administración de un anticuerpo antagonista anti-NGF. La “mejoría” también incluye el acortamiento o la reducción de la duración de un síntoma.

La “paliación” de un dolor o uno o más síntomas de un dolor (tal como dolor por artritis reumatoide o dolor por artrosis) se refiere a disminuir el grado de una o más manifestaciones clínicas no deseables de dolor postquirúrgico en un individuo o población de individuos tratados con un anticuerpo antagonista anti-NGF de acuerdo con la invención.

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WO2004/058184 para ilustrar los anticuerpos para su uso en la presente invención.

Ejemplos

Ejemplo 1 Producción y purificación de anticuerpo

Para la expresión de anticuerpos completos, se clonaron las regiones variables de cadena ligera y pesada en dos vectores de expresión de mamífero (Eb.911.E3 o Eb.pur.911.3E para la cadena ligera y Db.911.3E para la cadena pesada; descritos en el presente documento) y se usaron para transfectar, usando lipofectamina, células HEK 293 para su expresión transitoria. Los anticuerpos se purificaron usando proteína A usando procedimientos convencionales.

La generación, producción, purificación y caracterización del anticuerpo anti-NGF E3 se describe en los Ejemplos del documento WO2004/0581. Se han depositado vectores que incorporan la cadena ligera de E3 y la cadena pesada de E3 en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, Estados Unidos

(ATCC):

Material Eb.911.3E Eb.pur.911.3E Db.911.3E

cadena ligera de E3 cadena ligera de E3 cadena pesada de E3 Nº de Acceso ATCC PTA-4893 PTA-4894 PTA-4895 Fecha de Depósito 8 de enero de 2003 8 de enero de 2003 8 de enero de 2003

Pueden encontrarse detalles en relación con estos depósitos en el documento WO2004058184.

Se diseñaron y construyeron tres vectores de expresión de mamífero para su uso en la expresión de anticuerpo E3 en células de mamífero.

El vector Db.911.3E es un vector de expresión que comprende la región variable de la cadena pesada del anticuerpo E3 y la región constante de IgG2a humana, y es adecuado para la expresión transitoria o estable de la cadena pesada. El Db.911.3E consiste en las secuencias de nucleótidos correspondientes a las regiones siguientes: la región promotora de citomegalovirus murino (nucleótidos 1-612); un intrón sintético (nucleótidos 619-1507); la región codificante de DHFR (nucleótidos 707-1267); el péptido señal de la hormona de crecimiento humana (nucleótidos 1525-1602); la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 3E (nucleótidos 1603-1965); la región constante de IgG2a de cadena pesada humana que contiene las mutaciones siguientes: A330P331 a S330S331 (numeración de aminoácidos respecto a la secuencia de IgG2a de tipo silvestre; véase Eur. J. Immunol. (1999) 29: 2613-2624); señal de poliadenilación tardía de SV40 (nucleótidos 2974-3217); región potenciadora de SV40 (nucleótidos 32183463); región de fago f1 (nucleótidos 3551-4006) y región codificante de beta lactamasa (AmpR) (nucleótidos 44435300). El Db.911.3E se depositó en la ATCC el 8 de enero de 2003 y se le asignó el Nº de Acceso de la ATCC PTA4895.

El vector Eb.911.3E es un vector de expresión que comprende la región variable de la cadena ligera del anticuerpo E3 y la región constante de la cadena kappa humana, y es adecuado para la expresión transitoria de la cadena ligera. El Eb.911.3E consiste en las secuencias de nucleótidos correspondientes a las regiones siguientes: la región promotora de citomegalovirus murino (nucleótidos 1-612); intrón EF-1 humano (nucleótidos 619-1142); péptido señal de la hormona de crecimiento humana (nucleótidos 1173-1150); región variable de la cadena ligera del anticuerpo E3 (nucleótidos 1251-1571); región constante de la cadena kappa humana (nucleótidos 1572-1892); señal de poliadenilación tardía de SV40 (nucleótidos 1910-2153); región potenciadora de SV40 (nucleótidos 2154-2399); región de fago f1 (nucleótidos 2487-2942) y región codificante de beta lactamasa (AmpR) (nucleótidos 3379-4236). El Eb.911.3E se depositó en la ATCC el 8 de enero de 2003 y se le asignó el Nº de Acceso de la ATCC PTA-4893.

El vector Eb.pur.911.3E es un vector de expresión que comprende la región variable de la cadena ligera del anticuerpo E3 y la región constante kappa humana y es adecuado para la expresión estable de la cadena ligera. Eb.pur.911.3E consiste en las secuencias de nucleótidos correspondientes a las regiones siguientes: la región promotora de citomegalovirus murino (nucleótidos 1-612); intrón EF-1 humano (nucleótidos 619-1758); región codificante del gen pac (puromicina R) (nucleótidos 739-1235); región 5’UTR de hsp70 humano (nucleótidos 17711973); péptido señal de la hormona de crecimiento humana (nucleótidos 1985-2062); región variable de la cadena ligera del anticuerpo E3 (nucleótidos 2063-2383); región constante de la cadena kappa humana (nucleótidos 23842704); señal de poliadenilación tardía de SV40 (nucleótidos 2722-2965); región potenciadora de SV40 (nucleótidos 2966-3211); región de fago f1 (nucleótidos 3299-3654) y región codificante de beta lactamasa (AmpR) (nucleótidos 4191-5048). El Eb.pur.911.E3 se depositó en la ATCC el 8 de enero de 2003 y se le asignó el Nº de Acceso de la ATCC PTA-4894.

La expresión celular transitoria se realizó de la forma siguiente: células CHO y HEK293T en placas de 150 mm se cotransfectaron de forma transitoria con 25 ug de cada plásmido (es decir, un plásmido que contiene la cadena pesada y un plásmido que contiene la cadena ligera). El ADN se mezcló con 100 ul de lipofectamina 2000

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(Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se dejó que los complejos de ADN-lípido contactasen con las células en medio DMEM/F12 sin suero o antibióticos durante 5 horas. Después de esta incubación, los medios se cambiaron para la expresión a Opti-MEM (Invitrogen) sin ningún aditivo durante dos días. Los sobrenadantes celulares que contenían anticuerpo se recogieron secuencialmente hasta cuatro veces con sustitución de medios posterior. Los sobrenadantes se purificaron por cromatografía de afinidad usando resina de Proteína A MapSelect (Amersham biosciences 17-5199-02). El anticuerpo se unió a la resina de proteína A en glicina 0,3 M, tampón de NaCl 0,6 M a pH 8, después se eluyó con tampón citrato 0,1 M a pH 3. Las fracciones que contenían anticuerpos se neutralizaron inmediatamente con tampón Tris 1 M a pH 8,0. Después, las fracciones de anticuerpo se dializaron y se concentraron en PBS. Los anticuerpos se seleccionaron y se ensayaron de la forma siguiente:

Ensayo de Biacore

Se determinaron las afinidades de anticuerpos monoclonales y Fab anti-NGF usando el sistema de resonancia de plasmón superficial (RPS) BlAcore3000™ (BIAcore, INC, Piscaway NJ). Se activaron microplacas CM5 con clorhidrato de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-carbodiinida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se diluyó NGF humano en acetato sódico 10 mM pH 4,0 y se inyectó sobre la microplaca activada a una concentración de 0,005 mg/ml. Usando un tiempo de flujo variable a través de los canales individuales de la microplaca, se consiguieron dos intervalos de densidad de antígeno: 100-200 unidades de respuesta (UR) para estudios cinéticos detallados y 500-600 UR para ensayos de exploración. La microplaca se bloqueó con etanolamina. Los estudios de regeneración mostraron que una mezcla de tampón de elución Pierce (Producto Nº 21004, Pierce Biotechnology, Rockford, IL) y NaCl 4 M (2:1) eliminaba eficazmente el Fab unido al tiempo que mantenía la actividad del hNGF en la microplaca durante más de 200 inyecciones. Se usó tampón HBS-EP (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15, EDTA 3 mM, Tensioactivo P29 al 0,005%) como tampón de procesamiento para todos los ensayos de BIAcore.

Ensayo de Exploración

Se optimizó un ensayo de exploración de BIAcore para determinar la afinidad de clones de Fab de bibliotecas. Se inyectaron los sobrenadantes de lisados de cultivos pequeños a 50 l/min durante 2 min. Se usaron tiempos de disociación de 10 a 15 minutos para la determinación de una sola velocidad de disociación exponencial (koff) usando el software BIAevaluation. Las muestras que mostraban velocidades de koff en el mismo intervalo que el molde usado para crear la biblioteca (clon 8L2-6D5, koff 1 x 10-3 s-1) se inyectaron para su confirmación y se permitieron tiempos de disociación de hasta 45 min para obtener mejores valores de koff. Los clones que mostraban valores de koff mejorados (más lentos) se expresaron a gran escala y los parámetros cinéticos completos, la kon y la koff, se determinaron sobre proteína purificada. El ensayo era capaz de detectar diferencias en la afinidad que eran de aproximadamente 2 veces o mayores.

Ensayo de determinación de la afinidad

Se inyectaron diluciones seriadas (0,1-10x KD estimada) de muestras de Fab purificados durante 1 min a 100 microlitros/min y se permitieron tiempos de disociación de hasta 2 h. Las concentraciones de las proteínas Fab se determinan por ELISA y/o electroforesis SDS-PAGE usando como patrón un Fab de concentración conocida (según se determinó por análisis de aminoácidos). Se obtuvieron las velocidades de asociación (kon) y velocidades de disociación (koff) cinéticas simultáneamente por ajuste de los datos a un modelo de unión de Langmuir 1:1 (Karlsson,

R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) usando el programa BIAevaluation. Los valores de la constante de disociación en equilibrio (KD) se calcularon como koff/kon.

Ejemplo 2 Análisis de Tampones y pH

Se realizó un estudio para evaluar el efecto de cuatro tampones diferentes sobre la agregación y fragmentación de anticuerpos.

En concreto, se prepararon cuatro formulaciones líquidas que comprendían anticuerpo anti-NGF E3 y tamponadas con acetato, succinato, histidina o citrato. Después, las formulaciones se almacenaron a 5, 25 y 40ºC y se tomaron mediciones de la agregación, fragmentación y oxidación de anticuerpo a las 0, 4, 9 y 13 semanas.

El procedimiento de fabricación puede resumirse de la forma siguiente: se prepara el tampón, se ajusta al pH y se esteriliza por filtración (véase las Tablas 2.1 y 2.2 para detalles). El anticuerpo se concentra y después se cambia el tampón. El anticuerpo se analiza con UV y después se diluye con el tampón respectivo a 20 mg/ml. Después, la solución de 20 mg/ml se esteriliza por filtración. Finalmente, la solución estéril se rellena, se tapona y se cubre con un sello de aluminio.

Análisis de Agregación:

Las formulaciones de anticuerpo de la Tabla 2.2 se almacenaron a una temperatura de 5, 25 y 40ºC durante 0, 4, 9 y 13 semanas.

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Cada formulación se analizó para determinar la agregación usando cromatografía de exclusión por tamaño (CET). La cromatografía de exclusión por tamaño se llevó a cabo usando una columna de gel TSK G3000SWXL-G2000SWXL, fase móvil tampón fosfato sódico 0,2 M a pH 7,0, un caudal de 1 ml/min y detección UV a 214 nm.

Se calcularon los niveles de agregación por integración de las áreas bajo los picos del cromatograma para cada formulación y descripción de las áreas integradas bajo los picos de especies de alto peso molecular como porcentaje del área total de picos. Como puede observarse en la Tabla 2.3, las formulaciones tamponadas con histidina, particularmente a pH 6, mostraban los menores niveles de agregación, seguidas del acetato, succinato, y después formulaciones tamponadas con citrato, en ese orden.

Análisis de Fragmentación:

Las formulaciones de anticuerpo de la Tabla 2.2 se almacenaron a una temperatura de 5, 25 y 40ºC durante 0, 4, 9 y 13 semanas.

Cada formulación se analizó también para determinar la fragmentación usando electroforesis capilar en gel reducido (ECGr). Las proteínas se despliegan (desnaturalizan) y se convierten en estructuras “tipo bacilo” después de la escisión de sus enlaces disulfuro en ECG-red. La proteína “reducida” se separa en sus cadenas pesada y ligera permitiendo su cuantificación junto con especies fragmentadas. La ECG reducido se considera un procedimiento fiable para cuantificar el porcentaje de fragmentos (% impurezas). El porcentaje de fragmentación se midió a los tiempos pertinentes para cada una de las formulaciones. Los niveles de fragmentación se calcularon como porcentaje del volumen total de bandas. Como puede observarse en la Tabla 2.4, las formulaciones tamponadas con histidina, particularmente a pH 6, mostraban los menores niveles de fragmentación.

Análisis de oxidación:

Se midieron los niveles de oxidación de restos de metionina en las posiciones aminoacídicas X e Y en el anticuerpo anti-NGF E3 mediante un procedimiento de mapeo de Lisina-C después del almacenamiento a 5, 25 y 40ºC durante 0, 4, 9 y 13 semanas. Las muestras de cada formulación ensayada se digirieron después con enzima Lyc-C en tampón tris a pH 8,0 en condiciones convencionales y se analizaron por cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa. La separación se logró usando una columna analítica de Proteína C4 Grace Vydae con elución en gradiente de TFA al 0,1% en agua y TFA al 0,085% en acetonitrilo. Se registró el porcentaje de oxidación de aminoácidos de metionina en el anticuerpo anti-NGF E3.

Los resultados de la Tabla 2.5 indican que el porcentaje de oxidación de la formulación de citrato es el mayor.

Tabla 2.1. Tabla de Preparación de Tampón: Resumen de las cantidades de componentes de tampón registradas a partir de los registros de fabricación para preparar 250 ml de tampón.

Número de Lote de Formulación

pH Acetato (mg/ml) Ácido Acético(mg/ml) Histidina(mg/ml) Histidina HCl(mg/ml) Citrato (mg/ml) Ácido Cítrico(mg/ml) Succinato (mg/ml) Ácido Succínico(mg/ml)

Acetato pH 5,0

5,0 435,58 104,14 - - - - - --

Acetato pH 5,5

5,5 577,75 34,59 - - - - - --

Acetato pH 6,0

6,0 644,28 15,07 - - - - - --

Acetato pH 6,5

6,5 668,51 10,32 - - - - - --

Histidina pH 5,0

5,0 - - 70,45 839,27 - - - --

Histidina pH 5,5

5,5 - - 186,9 751,9 - - - --

Histidina pH 6,0

6,0 - - 387,5 454,1 - - - --

Histidina pH 6,5

6,5 - - 588,75 220,87 - - - --

Citrato pH 5,0

5,0 - - - - 233,63 107,18 - --

Citrato pH 5,5

5,5 - - - - 279,09 79,01 - --

Citrato pH 6,0

6,0 - - - - 321,25 42,51 - --

Citrato pH 6,5

6,5 - - - - 348,77 20,52 - --

Succinato pH 5,0

5,0 - - - - - - 585,18 176,86

Succinato pH 5,5

5,5 - - - - - - 679,4 80,83

Succinato pH 6,0

6,0 - - - - - - 756,23 34,73

Succinato pH 6,5

6,5 - - - - - - 791,83 11,60

Tabla 2.2. Tabla de Matriz de Formulación:

Número de Lote de Formulación

pH Con. AcM (mg/ml)(mg/ml) Acetato (mg/ml) Ácido Acético(mg/ml) Histidina(mg/ml) Histidina HCl(mg/ml) Citrato (mg/ml) Ácido Cítrico(mg/ml) Succinato (mg/ml) Ácido Succínico(mg/ml)

Acetato pH 5,0

5,0 20 1,7423 0,4323 - - - - - --

Acetato pH 5,5

5,5 20 2,3110 0,1813 - - - - - --

Acetato pH 6,0

6,0 20 2,5771 0,0639 - - - - - --

Acetato pH 6,5

6,5 20 2,6744 0,0210 - - - - - --

Histidina pH 5,0

5,0 20 - - 0,2818 3,8182 - - - --

Histidina pH 5,5

5,5 20 - - 0,7448 3,1909 - - - --

Histidina pH 6,0

6,0 20 - - 1,5500 2,1000 - - - --

Histidina pH 6,5

6,5 20 - - 2,3552 1,0091 - - - --

Citrato pH 5,0

5,0 5 - - - - 0,9345 0,3821 - --

Citrato pH 5,5

5,5 5 - - - - 1,1164 0,2530 - --

Citrato pH 6,0

6,0 5 - - - - 1,2850 0,1325 - --

Citrato pH 6,5

6,5 5 - - - - 1,3951 0,0538 - --

Succinato pH 5,0

5,0 20 - - - - - - 2,3407 0,6561

Succinato pH 5,5

5,5 20 - - - - - - 2,7183 0,3809

Succinato pH 6,0

6,0 20 - - - - - - 3,0249 0,1575

Succinato pH 6,5

6,5 20 - - - - - - 3,1673 0,0537

Tabla 2.3. Resumen de los datos de % de Agregación (mediante CET) de anticuerpo anti-NGF 20 mg/ml: Estudio de Exploración de Tampón y pH

Condición

5ºC 25ºC 40ºC

Semanas

0 13 0 9 13 0 4 9 13

Nº Lote

Acetato pH 5,0

1,6 1,8 1,6 2,2 2,5 1,6 3,2 5,1 8,1

Acetato pH 5,5

1,8 2,1 1,8 2,7 3,0 1,8 3,4 4,9 7,1

Acetato pH 6,0

2,0 2,4 2,0 3,2 3,3 2,0 4,3 5,5 7,0

Acetato pH 6,5

2,0 2,5 2,0 3,5 3,9 2,0 4,4 5,8 7,0

Histidina pH 5,0

1,6 1,8 1,6 2,0 2,3 1,6 2,7 3,9 7,0

Histidina pH 5,5

1,6 1,8 1,6 2,2 2,4 1,6 2,7 3,4 5,1

Histidina pH 6,0

1,8 2,1 1,8 2,5 2,7 1,8 3,0 3,5 4,8

Histidina pH 6,5

1,9 2,2 1,9 2,8 3,1 1,9 3,4 4,2 5,6

Citrato pH 5,0

1,6 1,9 1,6 2,4 2,8 1,6 4,6 8,5 15,0

Citrato pH 5,5

1,8 2,2 1,8 3,0 3,3 1,8 4,9 8,7 12,2

Citrato pH 6,0

2,0 2,5 2,0 3,3 3,7 2,0 4,4 6,5 8,4

Citrato pH 6,5

2,1 2,8 2,1 3,7 4,2 2,1 4,8 6,5 8,4

Succinato pH 5,0

1,6 1,9 1,6 2,3 2,7 1,6 3,5 6,1 11,2

Succinato pH 5,5

2,0 2,2 2,0 2,8 3,2 2,0 3,9 5,7 8,4

Succinato pH 6,0

1,8 2,5 1,8 3,1 3,6 1,8 4,3 5,8 7,8

Succinato pH 6,5

2,2 2,8 2,2 3,7 4,1 2,2 4,8 5,9 7,5

Tabla 2.4. Resumen de los datos de % de Fragmentación (mediante ECG reducido) de anticuerpo anti-NGF 20 mg/ml: Estudio de Exploración de Tampón y pH

Condición

5 C 25 C 40 C

Semanas

0 13 0 9 13 0 4 9 13

Nº Lote

Acetato pH 5,0

1,1 1,1 1,1 1,4 1,0 1,1 4,2 7,0 10,3

Acetato pH 5,5

1,1 1,0 1,1 1,0 1,7 1,1 4,4 5,2 9,4

Acetato pH 6,0

1,1 1,1 1,1 1,4 1,3 1,1 3,6 5,9 7,2

Acetato pH 6,5

1,1 1,2 1,1 1,0 2,2 1,1 4,1 6,4 8,1

Histidina pH 5,0

1,1 1,0 1,1 1,0 1,8 1,1 5,8 7,5 11,2

Histidina pH 5,5

1,1 1,1 1,1 0,9 1,5 1,1 4,3 6,4 7,9

Histidina pH 6,0

1,1 1,0 1,1 1,6 1,5 1,1 3,1 3,8 6,1

Histidina pH 6,5

1,0 1,2 1,0 1,6 2,2 1,0 3,7 6,1 9,7

Citrato pH 5,0

1,0 1,0 1,0 1,0 2,1 1,0 5,4 9,1 14,5

Citrato pH 5,5

1,0 1,1 1,0 1,1 1,4 1,0 4,6 7,6 11,5

Citrato pH 6,0

1,1 1,6 1,1 2,0 1,6 1,1 3,7 6,9 10,6

Citrato pH 6,5

1,5 1,0 1,5 1,3 9,1 1,5 3,4 8,2 10,9

Succinato pH 5,0

1,2 1,0 1,2 2,1 7,9 1,2 5,4 8,8 13,1

Succinato pH 5,5

1,2 1,5 1,2 0,9 0,9 1,2 3,1 5,8 9,0

Succinato pH 6,0

1,2 1,0 1,2 1,3 6,8 1,2 3 5,0 8,0

Succinato pH 6,5

1,2 1,1 1,2 1,5 11,8 1,2 3,5 7,2 8,0

Tabla 2.5. Resumen de los datos de % de Oxidación de anticuerpo anti-NGF 20 mg/ml: Estudio de Exploración de Tampón y pH

Condición

5 C 25 C 40 C

Semanas

0 9 13 0 9 13 0 4 9 13

Nº Lote

Acetato pH 5,0

2,8 2,1 2,8 2,3 2,8 3,3 4,1

Acetato pH 5,5

2,8 2,1 2,8 2,3 2,8 3,3 4,1

Acetato pH 6,0

2,3 2,0 2,3 2,2 2,3 3,1 3,4

Acetato pH 6,5

2,3 2,1 2,3 2,5 2,3 3,5 4,1

Histidina pH 5,0

2,2 2,0 2,2 2,5 2,2 4,1 6,4

Histidina pH 5,5

2,6 1,8 2,6 2,3 2,6 3,9 5,7

Histidina pH 6,0

2,0 1,9 2,0 2,3 2,0 3,9 6,1

Histidina pH 6,5

2,4 2,1 2,4 2,5 2,4 4,7 7,1

Citrato pH 5,0

2,1 2,1 2,1 2,8 2,1 7,2 9,7

Citrato pH 5,5

2,8 2,1 2,8 2,9 2,8 8,0 10,1

Citrato pH 6,0

2,4 1,8 2,4 2,7 2,4 6,6 7,9

Citrato pH 6,5

2,4 1,8 2,4 2,6 2,4 6,3 8,1

Succinato pH 5,0

3,9 1,8 3,9 2,2 3,9 4,0 5,5

Succinato pH 5,5

2,7 1,9 2,7 2,3 2,7 4,1 4,6

Succinato pH 6,0

2,1 2,1 2,1 2,1 2,1 3,8 3,4

Succinato pH 6,5

2,7 2,1 2,7 2,1 2,7 3,5 3,1

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Claims (1)

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