ES2659363T3 - Infusión intracoronaria de IGF-1 para la reparación del miocardio - Google Patents
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Abstract
IGF-1 para uso en el tratamiento de un mamífero que ha sufrido un infarto de miocardio para estimular la reparación o supervivencia del músculo cardiaco, o para estimular la remodelación ventricular izquierda, en que el IGF-1 es administrado al individuo mediante infusión intracoronaria aguas arriba del infarto de miocardio en una cantidad suficiente para reducir los efectos del infarto de miocardio sobre el individuo.
Description
presente memoria descriptiva, está previsto que abarque los elementos citados con posterioridad y sus equivalentes así como elementos adicionales.
5 Se investigaron los efectos cardiotróficos de medios acondicionados (CM) derivados de células progenitoras en circulación autólogas (CPC) en un modelo de infarto de miocardio (MI) porcino y los factores celulares TGFβ1 e IGF1 fueron implicados para desempeñar una función en los efectos beneficiosos observados. Cerdos Landrace (25-28 kg) experimentaron una generación de MI a través de oclusión de balón transluminal percutáneo de la arteria
10 coronaria durante 80 minutos, seguido de 120 minutos de reperfusión. Se administraron medios acondicionados (CM) intracoronarios a partir de CPC autólogas o CM + anti-TGFβ1 o CM + anti-IGF1 o X-vivo 15 (testigo) durante la oclusión con balón de la arteria relacionada con el infarto. A las 24 horas o las 8 semanas posteriores al MI los animales fueron sacrificados y los corazones experimentaron una cuantificación del infarto. La apoptosis de cardiomiocitos en la zona limítrofe de MI (50% MI/ 50% miocardio normal/ campo de potencia alta) se evaluó
15 mediante tinción TUNEL expresión de caspasa 9 y proteína BC1-2 junto con ensayo de actividad de caspasa 3 y 9. Se realizó un análisis funcional usando catéteres de presión/volumen de conductancia. La terapia de CM redujo significativamente el tamaño del infarto a las 8 semanas. Además, el CM redujo significativamente la señal apoptótica a las 24 horas y se observó una mejora significativa en la función cardiaca a las 24 horas así como a las 8 semanas posteriores al MI. Los efectos beneficiosos de los CM fueron atenuados bloqueando TGFβ1 e IGF1. Por
20 tanto, los medios acondicionados derivados de CPC reducen la apoptosis de cardiomiocitos en la zona limítrofe del MI 24 horas después de la generación del MI, conduciendo a una mejora en la función ventricular izquierda. Estos efectos beneficiosos de los CM están mediados sustancialmente a través de TGβ1 e IGF1.
Materiales y métodos 25
Aislamiento y caracterización de células progenitoras en circulación a partir de sangre periférica:
Se aislaron células progenitoras en circulación (CPC) a partir de 30-40 ml de sangre extraída de una vena de la oreja de cerdos Landrace hembras bajo una técnica aséptica 48 horas antes de la generación del infarto, como se 30 describió anteriormente (Doyle BJ. et al., Stem Cells Dev. 18 de junio de 2008). Las células sanguíneas mononucleares fueron recogidas a partir de preparaciones de capas leucocitarias periféricas usando una separación Ficoll-Paque Plus (15 cc). Las células fueron analizadas en cuanto a la expresión de marcadores de CPC (CD133, CD34, cKit, FLK1, VE-Cadherin y eNOS) mediante RT PCR y se compararon con CPC humanas. Se aisló RNA total a partir de CPC humanas y de cerdo cultivadas 24 horas usando un estuche de aislamiento SV Total RNA 35 (Progema, Southampton, Reino Unido). Se sometieron a transcripción inversa 5 µg de RNA total usando un estuche de síntesis SuperScript III First-Strand con cebadores poli-dT (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se usaron 2 µl de cDNA para cada reacción de PCR para marcadores de células madre/endoteliales usando polimerasa Platium Taq (Invitrogen, Carlsbad, CA) con los cebadores y temperaturas de hibridación indicadas en la tabla 1 siguiente. Los amplicones fueron visualizados en gel de agarosa al 1,5% teñido con tinción de ácidos nucleicos SybrGreen I
40 (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Tabla 1. Se usaron las siguientes secuencias de cebadores y condiciones de RT PCR
- Marcador/Cebador
- Secuencia Tamaño de producto Tm de hibridación (ºC) Secuencia ID Nº
- CD133
- For 5'-TCCTGGGGTTGCTGTTTATT-3' 157 bp 58 1
- Rev
- 5'-CATATCACCAAGAGGGAAACG-3' 2
- cKit
- For 5'-GAGGAGATAAATGGAAAC-3' 385 bp 51 3
- Hum -Rev
- 5'-GAATCACGTTTTCTTCTC-3' 4
- Cerdo-Rev
- 5'-GAATCACGTTTCCGTCTC-3'5' 5
- CD34
- Hum -F 5’-CCTGATGAATCGCCGCAGCTGGAGC-3’ 201 bp 58 6
- Hum -R
- 5’-CCAGAAACGGCCATTCAGCAAGACA-3’ 7
- Cerdo-F
- 5’-GCTGATGAACCGTCGGAGTTGGAGC-3’ 8
- Cerdo-R
- 5’-CCAGAAACGGCCATTCAGCGCAGGCA-3’ 9
- Flk-1
- For TTATCGGAGAAGAACGTGGT 412 bp 55 10
- Rev
- TAATGCTCAGCAGGATGGCA 11
- eNOS
- For 5'-GGTATGGATGAGTATGACGTG-3' 171 bp 51 12
- Rev
- 5'-TGTTCCGGCCGAGGG-3' 13
7
- VE-Cadheri n
- For 5'-AACTTCCCCTTCTTCACCC-3' 368 bp 51 14
- Rev
- 5-'AAGGCTGCTGGAAAATG-3' 15
- G3PDH
- For 5'-CCATGTCGTCATGGGTGTGAACCA-3' 251 bp 59.9 16
- Rev
- 5’-GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3’ 17
Generación de medios acondicionados a partir de células progenitoras en circulación:
Para generar los medios acondicionados, las CPC se lavaron tres veces en MCDB 131 complementado con
5 hidrocortisona, antibióticos y 10 ng/ml de VEGF. A continuación de esta etapa, las células se pusieron posteriormente en suspensión en medio X-vivo 15 (BioWhittaker) complementado con VEGF (1 ng/ml) y se sembraron en placas revestidas con fibronectina a una densidad de 4,9 x 103 células por mm2 en una modificación de la metodología anteriormente expuesta (Assmus B. et al., Circulation. 2002; 106: 3009-17; Doyle BJ. et al., Stem Cells Dev. 18 de junio de 2008). Después de 48 de cultivo, los medios exentos de células acondicionadas se
10 recogieron del cultivo celular por centrifugación (600x g durante 5 minutos) y filtración (0,2 µm) de los medios. Los medios acondicionados fueron seleccionados en cuanto a la presencia de citoquinas usando un estuche de conjuntos de anticuerpos de citoquinas humanas RayBio.
Selección in vitro en cuanto a efectos antiapoptóticos de medios acondicionados usando cardiomiocitos neonatales:
15 Se extirparon corazones de ratas Fisher de 1 día de edad y los cardiomiocitos se aislaron y se cultivaron como se describió anteriormente (Doyle BJ. et al., Stem Cells Dev. 18 junio 2008; Perez-Terzic C. et al., Circ Res. 1999; 84: 1292-301). En línea con una preparación de cardiomiocitos puros, estas células no mostraron evidencia de contaminación celular neural o vascular. Los cardiomiocitos se incubaron bajo condiciones hipóxicas (95% de CO2,
20 5% de O2) durante 24 horas a 37 ºC, seguido de condiciones durante 24 horas a 37 ºC para inducir la muerte celular mediante apoptosis. Antes de la inducción de hipoxia los cardiomiocitos fueron tratados con las siguientes soluciones: medios de nueva aportación (X vivo-15 con 1 ng/ml de VEGF), medios acondicionados (CM) obtenidos a partir de cultivos de CPC porcinas (como se describió anteriormente), medios acondicionados que contenían un exceso 100 veces de anticuerpo neutralizante para TGFβ o IGF1 o IgG y TGFβ porcino purificado (10-1.000 pg/ml) o
25 IGF1 (1-100 pg/ml). La señal de apoptosis en los cardiomiocitos se cuantificó usando un estuche de ensayo de actividad de caspasa 9 comercial (Chemicon International, California, EE.UU.) y los datos se expresan como porcentaje de grupo tratado con X-vivo.
Modelo porcino de infarto de miocardio:
30 Se usaron en este estudio 39 cerdos Landrace hembras que pesaban 25-30 kg de acuerdo con las normas del Comité Ético para animales experimentales de la University College Cork. 20 cerdos Landrace jóvenes criados en granja consanguíneos experimentaron una oclusión de balón percutáneo de la arteria coronaria circunfleja izquierda proximal (LCx) durante 80 minutos. El grupo de infarto crónico que comprendía 19 cerdos similares tuvo una
35 oclusión por balón de la arteria coronaria descendente (LAD) anterior izquierda proximal percutánea durante un periodo de inflamiento de balón idéntico. Este protocolo experimental ha sido descrito en detalle previamente (Klein HH. et al., Basic Res Cardiol. 1984; 79: 440-7). Brevemente, todos los animales fueron previamente medicados con amiodarona 400 mg, aspirina 75 mg y clopidogrel 75 mg diariamente durante 8-10 días antes de la generación del infarto. A continuación de una inyección intramuscular de cetamina y xilazina, los animales recibieron propofol
40 intravenoso. Se llevó a cabo una ventilación mecánica usando un ventilador Harvard Apparatus para animales grandes y oxígeno complementario (4-6 l/min) combinado con isoflurano (1-4%) para mantener la anestesia general. Bajo fluoroscopio a 3,0 x 13mm (Boston Scientific, Galway, Irlanda) se insertó un balón de angioplastia en la LCx proximal (grupo de infarto agudo) o LAD proximal (grupo crónico) usando un catéter de guía 6F IMA (Boston Scientific, Galway Irlanda) introducido a través de una envoltura arterial 7Fr desde la arteria carótida interna derecha.
45 El balón se infló a 6-8 atm, asegurando una oclusión angiográfica completa del vaso diana con una angiografía de verificación realizada cada 15-20 minutos durante el periodo de generación del infarto. La elevación significativa de segmento ST se confirmó sobre electrocardiografía en todos los casos. Las arritmias malignas fueron desfibriladas en la medida necesaria. Seguidamente el balón se desinfló y se retiró para permitir una reperfusión durante un total de 120 minutos. Una angiografía de verificación confirmó un flujo de TIMI-3 en la arteria relacionada con el infarto al
50 inicio de la reperfusión. Seguidamente se colocó un balón coronario sobre el catéter (3,0 x 12 mm, Boston Scientific Galway, Irlanda) en el sitio de la oclusión del vaso previa. Se realizaron tres ciclos de inflamiento del balón de 4 minutos con infusión intracoronaria de 4 ml de X-vivo/VEGF, medios acondicionados, CM + anti-IGF1, CM + anti-TGFβ1 o CM + IgG, con un periodo de 4 minutos de desinflamiento del balón entre cada ciclo. Para el grupo CM + anti-IGF1, CM + anti-TGFβ1 o CM + IgG, el anticuerpo bloqueante o el IgG se mezcló en los CM 15 minutos antes
55 del suministro intracoronario. Finalmente, una angiografía de verificación confirmó la permeabilidad de la arteria relacionada con el infarto (flujo de TIMI-3) y el animal se recuperó.
A las 24 horas (estudio agudo) o a las 8 semanas (estudio crónico) después de la generación del infarto, los animales experimentaron una angiografía coronaria repetida para confirmar la permeabilidad a TIMI-3 de la arteria
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