ES2659424T3

ES2659424T3 - Terapia de combinación para el cáncer

Info

Publication number: ES2659424T3
Application number: ES15708638.0T
Authority: ES
Inventors: Edward Michael Chan
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2014-02-26
Filing date: 2015-02-19
Publication date: 2018-03-15
Anticipated expiration: 2035-02-19
Also published as: TWI558399B; BR112016016880A2; CA2936558A1; EA201691385A1; MY176219A; KR20160111001A; AU2015223359B2; EP3110444A1; MA39294A1; IL246761A0; JP2016521262A; SG11201606958YA; EP3110444B1; CN106029097A; MX2016011045A; US20170173013A1; TW201542209A; WO2015130540A1; AU2015223359A1; US10238656B2

Abstract

Un compuesto de la fórmula:**Fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de cáncer de pulmón no microcítico en combinación con un anticuerpo que comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) cuya secuencia de aminoácidos es la proporcionada en la SEC ID Nº: 2, y una región variable de cadena pesada (HCVR) cuya secuencia de aminoácidos es la proporcionada en la SEC ID Nº: 4, en el que el anticuerpo se une a VEGFR2.

Description

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del 20%, la suma debe demostrar también un aumento absoluto de al menos 5 mm (Nota: la aparición de una o más lesiones nuevas se considera también progresión).

Como se usa en el presente documento, la expresión "enfermedad estable" (SD) se refiere a aquellas con una contracción no suficiente para ser calificadas como PR y con un aumento no suficiente para ser calificadas como PD, tomando como referencia los diámetros más pequeños de la suma durante el estudio.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "respuesta objetiva" (OR) se refiere a la suma de CR más PR.

El experto en la materia apreciará que los términos CR, PR, PD, SD y OR corresponden a las definiciones según RECIST v1.1, Eisenhauer y otros, European Journal of Cancer, 2009, 45, 228-247.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "tiempo hasta la progresión de la enfermedad" o "TTP" se refiere al tiempo, generalmente medido en semanas o meses, desde el momento del tratamiento inicial, hasta que el cáncer progresa o empeora. Dicha progresión puede ser evaluada por el médico experto.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "extensión del TTP" se refiere a aumentar el tiempo hasta la progresión de la enfermedad en un paciente tratado con relación a i) un paciente o pariente no tratado, o ii) un paciente tratado con menos agentes que todos los agentes antitumorales en una terapia de combinación particular.

Como se usa en la presente memoria, el término "supervivencia" se refiere al paciente que permanece vivo, e incluye la supervivencia global, así como la supervivencia sin progresión

Como se usa en el presente documento, la expresión "supervivencia global" se refiere al paciente que permanece con vida durante un período de tiempo definido, como 1 año, 5 años, etc. desde el momento del diagnóstico o del tratamiento.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "supervivencia sin progresión" se refiere a que el paciente permanece con vida, sin que el cáncer progrese o empeore.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "extensión de la supervivencia" significa incrementar la supervivencia global o sin progresión en un paciente tratado con relación a i) un paciente no tratado, ii) un paciente tratado con menos agentes que todos los agentes antitumorales en una terapia de combinación particular, o iii) un protocolo de tratamiento de control. La supervivencia se supervisa durante al menos aproximadamente un mes, al menos aproximadamente un mes, al menos aproximadamente dos meses, al menos aproximadamente cuatro meses, al menos aproximadamente seis meses, al menos aproximadamente nueve meses, o al menos aproximadamente 1 año, o al menos aproximadamente 2 años, o al menos aproximadamente 3 años, o al menos aproximadamente 4 años, o al menos aproximadamente 5 años, o al menos aproximadamente 10 años, etc., después del inicio del tratamiento o después del diagnóstico inicial de cáncer.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "tumor primario" o "cáncer primario" se refiere al cáncer original y no a una lesión metastásica situada en otro tejido, órgano o ubicación en el cuerpo del sujeto.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad o dosis de [5-(4-etilpiperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina,

o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, y a la cantidad o dosis de un anticuerpo anti-VEGFR2 que, tras la administración una sola dosis o múltiples dosis al paciente, proporciona una respuesta efectiva en el paciente bajo diagnóstico o tratamiento. Como se usa en la presente memoria, el término "cantidad efectiva" se refiere también a la cantidad o dosis de [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, y a la cantidad o dosis de ramucirumab, que, tras la administración una sola dosis o múltiples dosis al paciente, proporciona una respuesta efectiva en el paciente bajo diagnóstico o tratamiento. Se entiende que una terapia de combinación de la presente invención se lleva a cabo administrando [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, junto con un anticuerpo anti-VEGFR2 de cualquier manera que proporcione niveles efectivos de [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)pirimidin-2-il]-amina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y el anticuerpo anti-VEGFR2 en el cuerpo. Se entiende también que una terapia de combinación de la presente invención se lleva a cabo administrando [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5il)-pirimidin-2-il]-amina, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, junto con ramucirumab en cualquier manera que proporcione niveles efectivos de [5-(-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y ramucirumab en el cuerpo.

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Technology", Eds. J. Swarbrick y J.C. Boylan, Vol. 13, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, Basilea, Hong Kong 1995, pp. 453-499.; S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 66, Nº 1, Enero de 1977. Las sales de clorhidrato y mesilato son sales preferentes. La sal de mesilato es una sal especialmente preferente.

La [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin2-il]-amina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y un anticuerpo anti-VEGFR2, preferentemente ramucirumab, se formulan preferentemente como composiciones farmacéuticas administradas mediante cualquier vía que haga que el compuesto esté biodisponible. La vía de administración puede variarse de cualquier manera, limitada por las propiedades físicas de los fármacos y la conveniencia del paciente y del cuidador. Preferentemente, la [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3Hbenzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma se administra por vía oral. Preferentemente, las composiciones de anticuerpo anti-VEGFR2, preferentemente ramucirumab, se formulan para administración parenteral, como administración intravenosa o subcutánea. Además, la [5-(4-etil-piperazin-1ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, se formula para la administración oral o parenteral, incluyendo la administración intravenosa o subcutánea. Dichas composiciones farmacéuticas y dichos procedimientos para prepararlas son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, editor, 21ª edición, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006).

Como se usa en la presente memoria, la frase "en combinación con" se refiere a la administración de [5-(4-etilpiperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina,

o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, con un anticuerpo anti-VEGFR2 de manera simultánea. Como se usa en la presente memoria, la frase "en combinación con" se refiere también a la administración de [5(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]amina, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, con un anticuerpo anti-VEGFR2 de manera secuencial, en cualquier orden. Como se usa en la presente memoria, la frase "en combinación con" se refiere también a la administración de [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3Hbenzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, con un anticuerpo anti-VEGFR2 en cualquier combinación de los mismos. Como se usa en la presente memoria, la frase "en combinación con" se refiere también a la administración de [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, con ramucirumab, de manera simultánea. Como se usa en la presente memoria, la frase "en combinación con" se refiere también a la administración de [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, con ramucirumab de manera secuencial, en cualquier orden. Como se usa en la presente memoria, la frase "en combinación con" se refiere a la administración de [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, con ramucirumab, en cualquier combinación de los mismos. La [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina y un anticuerpo anti-VEGFR2 pueden administrarse como parte de la misma composición farmacéutica o en composiciones farmacéuticas separadas. La [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin2-il]-amina y ramucirumab pueden administrarse como parte de la misma composición farmacéutica o en composiciones farmacéuticas separadas. La [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina puede administrarse antes de la administración de un anticuerpo anti-VEGFR2. La [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3Hbenzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina puede administrarse al mismo tiempo que la administración de un anticuerpo anti-VEGFR2. La [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3Hbenzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina puede administrarse después de la administración de un anticuerpo anti-VEGFR2. La [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5il)-pirimidin-2-il]-amina puede administrarse antes, al mismo tiempo o después de la administración de un anticuerpo anti-VEGFR2 o en alguna combinación de los mismos. La [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina puede administrarse antes de la administración de ramucirumab. La [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina puede administrarse al mismo tiempo que la administración de ramucirumab. La [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3Hbenzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina puede administrarse después de la administración de ramucirumab. La [5(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]amina puede administrarse antes, al mismo tiempo o después de la administración de ramucirumab, o en alguna combinación de los mismos. Cuando se administra un anticuerpo anti-VEGFR2 a intervalos repetidos (por ejemplo, durante un ciclo de tratamiento estándar), la [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina puede administrarse antes de cada administración de

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un anticuerpo anti-VEGFR2. Cuando un anticuerpo anti-VEGFR2 se administra a intervalos repetidos (por ejemplo, durante un ciclo de tratamiento estándar), la [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina puede administrarse al mismo tiempo que cada administración de un anticuerpo anti-VEGFR2. Cuando un anticuerpo anti-VEGFR2 se administra a intervalos repetidos (por ejemplo, durante un ciclo de tratamiento estándar), la [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina puede administrarse después de cada administración de un anticuerpo anti-VEGFR2. Cuando un anticuerpo anti-VEGFR2 se administra a intervalos repetidos (por ejemplo, durante un ciclo de tratamiento estándar), la [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina puede administrarse antes, al mismo tiempo o después de cada administración de un anticuerpo anti-VEGFR2 o alguna combinación de los mismos. Cuando un anticuerpo anti-VEGFR2 se administra a intervalos repetidos (por ejemplo, durante un ciclo de tratamiento estándar), la [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3Hbenzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina puede administrarse en diferentes intervalos con relación a la terapia con un anticuerpo anti-VEGFR2. Cuando un anticuerpo anti-VEGFR2 se administra a intervalos repetidos (por ejemplo, durante un ciclo de tratamiento estándar), la [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina puede administrarse en una única dosis o en una serie de dosis antes de, en cualquier momento durante, o después del ciclo del tratamiento con un anticuerpo anti-VEGFR2. Cuando un anticuerpo anti-VEGFR2 se administra a intervalos repetidos (por ejemplo, durante un ciclo de tratamiento estándar), la [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3Hbenzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina puede administrarse en una única dosis antes de, en cualquier momento durante o después del ciclo de tratamiento con un anticuerpo anti-VEGFR2. Cuando un anticuerpo anti-VEGFR2 se administra a intervalos repetidos (por ejemplo, durante un ciclo de tratamiento estándar), la [5-(4-etil-piperazin-1ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina puede administrarse en una única dosis antes del ciclo de tratamiento con un anticuerpo anti-VEGFR2. Cuando un anticuerpo anti-VEGFR2 se administra a intervalos repetidos (por ejemplo, durante un ciclo de tratamiento estándar), la [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5il)-pirimidin-2-il]-amina puede administrarse en una única dosis en cualquier momento durante el ciclo de tratamiento con un anticuerpo anti-VEGFR2. Cuando un anticuerpo anti-VEGFR2 se administra a intervalos repetidos (por ejemplo, durante un ciclo de tratamiento estándar), la [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina puede administrarse en una única dosis después del ciclo de tratamiento con un anticuerpo anti-VEGFR2. Cuando un anticuerpo anti-VEGFR2 se administra a intervalos repetidos (por ejemplo, durante un ciclo de tratamiento estándar), la [5-(4-etil-piperazin-1ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina puede administrarse en una serie de dosis antes del ciclo del tratamiento con un anticuerpo anti-VEGFR2. Cuando un anticuerpo anti-VEGFR2 se administra a intervalos repetidos (por ejemplo, durante un ciclo de tratamiento estándar), la [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5il)-pirimidin-2-il]-amina puede administrarse en una serie de dosis después del ciclo de tratamiento con un anticuerpo anti-VEGFR2.

Cuando se administra ramucirumab a intervalos repetidos (por ejemplo, durante un ciclo de tratamiento estándar), la [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin2-il]-amina puede administrarse antes de cada administración de ramucirumab. Cuando se administra ramucirumab a intervalos repetidos (por ejemplo, durante un ciclo de tratamiento estándar), la [5-(4-etil-piperazin1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina puede administrarse al mismo tiempo que cada administración de ramucirumab. Cuando se administra ramucirumab a intervalos repetidos (por ejemplo, durante un ciclo de tratamiento estándar), la [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina puede administrarse después de cada administración de un ramucirumab. Cuando se administra ramucirumab a intervalos repetidos (por ejemplo, durante un ciclo de tratamiento estándar), la [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina puede administrarse antes, al mismo tiempo

o después de cada administración de ramucirumab o alguna combinación de los mismos. Cuando se administra ramucirumab a intervalos repetidos (por ejemplo, durante un ciclo de tratamiento estándar), la [5-(4-etil-piperazin1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina puede administrarse a diferentes intervalos con relación a la terapia con ramucirumab. Cuando se administra ramucirumab a intervalos repetidos (por ejemplo, durante un ciclo de tratamiento estándar), la [5-(4-etil-piperazin1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina puede administrarse en una única dosis o en una serie de dosis antes de, en cualquier momento durante o después del ciclo de tratamiento con ramucirumab. Cuando se administra ramucirumab a intervalos repetidos (por ejemplo, durante un ciclo de tratamiento estándar), la [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina puede administrarse en una única dosis antes de, en cualquier momento durante o después del tratamiento con ramucirumab. Cuando se administra ramucirumab a intervalos repetidos (por ejemplo, durante un ciclo de tratamiento estándar), la [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin

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2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina puede administrarse en una única dosis antes del ciclo de tratamiento con ramucirumab. Cuando se administra ramucirumab a intervalos repetidos (por ejemplo, durante un ciclo de tratamiento estándar), la [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina puede administrarse en una única dosis en cualquier momento durante el ciclo del tratamiento con ramucirumab. Cuando se administra ramucirumab a intervalos repetidos (por ejemplo, durante un ciclo de tratamiento estándar), la [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina puede administrarse en una única dosis después del ciclo de tratamiento con ramucirumab. Cuando se administra ramucirumab a intervalos repetidos (por ejemplo, durante un ciclo de tratamiento estándar), la [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina puede administrarse en una serie de dosis antes del ciclo de tratamiento con ramucirumab. Cuando se administra ramucirumab a intervalos repetidos (por ejemplo, durante un ciclo de tratamiento estándar), la [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina puede administrarse en una serie de dosis después del ciclo de tratamiento con ramucirumab.

La [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin2-il]-amina o sus sales farmacéuticamente aceptables pueden prepararse mediante una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica.

Las siguientes preparaciones y ejemplos ilustran adicionalmente la invención. A menos que se indique lo contrario, los compuestos ilustrados en la presente memoria se nombran y se numeran usando ChemDraw® Ultra 5.0.

Preparación 1

1-(6-bromo-piridin-3-ilmetil)-4-etil-piperazina

Se añadió 1-etilpiperazina pura (5,6 kg) a una mezcla de 6-bromo-piridin-3-carbaldehído (8,3 kg) y diclorometano (186 kg). A continuación, se añadió triacetoxiborohidruro de sodio (10,9 kg) en porciones y se agitó a 20-30°C durante 12 horas. La reacción se desactivó en una mezcla de diclorometano (36 kg) y una solución acuosa de hidróxido de sodio 2 N (46 kg). Las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo dos veces con diclorometano (24 X 2 kg). Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con salmuera (50 X 2 kg) y el disolvente se eliminó bajo vacío para proporcionar 11,5 kg del compuesto del título. MS (ES+): m/z = 285 (M+H)+.

Preparación 2

5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-ilamina

Se añadió amoníaco líquido (50,0 kg) a una mezcla desgasificada de 1-(6-bromo-piridin-3-ilmetil)-4-etil-piperazina (14,2 kg), óxido cuproso (200 g) y MeOH (57 kg) a T ≤ 40°C. La mezcla se calentó a 65-75°C durante la noche. Se enfrió a 20-30°C y se filtró sobre una almohadilla CELITE®. El filtrado se concentró y se añadió diclorometano (113 kg) y el pH se ajustó a 12-14 con hidróxido de sodio 2 N (23 kg), las fases se separaron y la fase orgánica se lavó con diclorometano (58 X 2 kg) y las capas orgánicas se combinaron. La mezcla se filtró a través de CELITE® y se concentró. El residuo se disolvió en tolueno (9,7 kg) y se cristalizó mediante la adición de metil tert-butil éter (8,3 kg) para dar 6,0 kg del compuesto del título. Se obtuvo una purificación adicional mediante una recristalización de tolueno. MS (ES+): m/z = 221 (M+H)+.

Preparación 3

N-(4-bromo-2,6-difluoro-fenil)-N'-isopropil-acetamidina

Se añadió trietilamina (10,05 ml) a una mezcla de 4-bromo-2,6-difluoro-fenilamina (10,0 g), N-isopropil acetamida (9,73 g), cloruro de fosforilo (6,70 ml) en tolueno (150 ml). La mezcla se calentó a reflujo durante 3 horas. La mezcla se enfrió y el disolvente se eliminó bajo vacío. El crudo se disolvió en diclorometano, se lavó con una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio varias veces para eliminar todas las trazas de ácido. Se secó sobre sulfato de sodio y el disolvente se eliminó bajo vacío para proporcionar 14 g del compuesto del título. MS (ES+): m/z = 292 (M+H)+.

Preparación 4

6-bromo-4-fluoro-1-isopropil-2-metil-1H-benzoimidazol

Se añadió tert-butóxido de potasio (6,9 kg) en porciones a una solución de N-(4-bromo-2,6-difluoro-fenil)-N'isopropil-acetamidina (16,2 kg) en N-metil formamida (76 kg) mientras se mantenía la temperatura a T<30°C. La mezcla se calentó a 70-75°C hasta que se completó como se determinó mediante HPLC. Se enfrió a 20-30°C y se desactivó añadiendo al agua (227 kg) y a continuación se extrajo con metil tert-butil éter (37 X 4 kg). Las fases

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orgánicas combinadas con salmuera (49 X 2 kg) se lavaron y se concentraron a 25-30 l, se añadió n-hexano (64 kg) y la suspensión se filtró para dar 11 kg del compuesto del título. MS (ES+): m/z = 272 (M+H)+.

Se obtuvo una purificación adicional disolviendo el compuesto crudo en diclorometano y filtrando a través de un gel de sílice y una almohadilla CELITE®, seguido del aislamiento de una mezcla de metil tert-butil éter/hexano.

Preparación 5

4-fluoro-1-isopropil-2-metil-6-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2] dioxaborolan-2-il)-1H-benzoimidazol

Se burbujeó nitrógeno en una mezcla de 6-bromo-4-fluoro-1-isopropil-2-metil-1H-benzoimidazol (30,0 g), bis(pinacolato)diboro (42,15 g), triciclohexilfosfina (5,43 g), acetato de potasio (32,58 g) y dimetilsulfóxido (200 ml). Se añadió acetato de paladio (2,8 g) y se calentó en baño de aceite precalentado a 90°C durante 1 hora. Se diluyó con acetato de etilo (200 ml) y se filtró sobre una almohadilla CELITE®. La mezcla se lavó con salmuera (100 ml), se secó sobre sulfato de sodio y el disolvente se eliminó bajo vacío. El sólido se trituró con hexano y se filtró para proporcionar 27 g del compuesto del título. MS (ES+): m/z = 319 (M+H)+.

Preparación 6

6-(2-cloro-5-fluoro-pirimidin-4-il)-4-fluoro-1-isopropil-2-metil-1H-benzoimidazol

Se burbujeó nitrógeno en una mezcla de 2,4-dicloro-5-fluoro-pirimidina (12,7 g), cloruro de bis(trifenilfosfina)paladio (II) (4,9 g), carbonato de sodio 2 M en agua (103,7 ml) y 1,2-dimetoxietano (120 ml). Se calentó en un baño de aceite precalentado a 80°C y se añadió gota a gota una solución de 4-fluoro-1-isopropil-2metil-6-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-1H-benzoimidazol (22 g) en 1,2-dimetoxietano (200 ml). La mezcla se agitó a 84°C durante 1 hora. Se enfrió a temperatura ambiente, se añadió acetato de etilo (800 ml) y se lavó dos veces con salmuera (100 ml). Se secó sobre sulfato de magnesio y el disolvente se eliminó bajo vacío. Se trituró con acetonitrilo para proporcionar 14,4 g del compuesto del título. MS (ES+): m/z = 323 (M+H)+.

Ejemplo de referencia 1

[5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2il]-amina

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Se burbujeó nitrógeno en una mezcla de 6-(2-cloro-5-fluoro-pirimidin-4-il)-4-fluoro-1-isopropil-2-metil-1Hbenzoimidazol (15,9 g), 5-(4-etil -piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-ilamina (10,85 g), carbonato de cesio (32,10 g), tris(dibencilidenacetona)dipaladio (1,82 g), 4,5-bis(difenilfosfino)-9,9-dimetilxanteno (2,35 g) en 1,4-dioxano (197,06 ml). La mezcla se calentó en un baño de aceite precalentado a 110°C durante 2 horas. Se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con diclorometano y se filtró sobre una almohadilla CELITE®. El disolvente se eliminó bajo vacío y se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice, eluyendo con diclorometano/metanol (2%) y a continuación diclorometano/metanol-NH3 2 M 2% para proporcionar 22,11 g del compuesto del título. MS (ES+): m/z = 507 (M+H)+.

Ejemplo de referencia 1A

Metanosulfonato de [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3Hbenzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina

Se añadió ácido metanosulfónico (63,59 ml) a una solución de [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)pirimidin-2-il]-amina (17,3 g) en una mezcla de diclorometano (100 ml) y metanol (100 ml). La solución se agitó durante 1 hora y el disolvente se eliminó bajo vacío. Se trituró con metil tert-butil éter y el sólido se filtró para proporcionar 20,4 g del compuesto del título. MS 35 (ES+): m/z = 507 (M+H)+.

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8,98: 9,84 1,5

11,20: 7,89 2,3

12,57: 7,04 1,9

13,09: 6,76 7

15,93: 5,56 3

16,31: 5,43 4,4

17,01: 5,21 1,9

18,58: 4,77 3,1

18,82: 4,71 3,6

20,86: 4,26 1,5

21,90: 4,06 2,2

23,12: 3,84 2,4

23,53: 3,78 3,7

26,71: 3,33 2,4

26,85: 3,32 2

Una muestra preparada de la Forma Cristalina III de [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina se caracteriza por un patrón de XRD usando radiación CuKα que tiene picos de difracción (valores 2-theta) como se describen en la Tabla 2 dada a continuación, y en particular, tiene picos en 21,29 en combinación con uno o más de los picos en 11,54, 10,91 y 12,13; con una tolerancia para los ángulos de difracción de 0,1 grados.

Tabla 2: Picos de difracción de rayos X en polvo de la Forma cristalina III de [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina.

Ángulo °2θ: valor de Angstrom Intensidad %

7,44: 11,87 8

10,91: 8,11 19

11,54: 7,66 38

12,13: 7,29 18

13,89: 6,37 25

14,91: 5,94 20

15,63: 5,67 27

16,06: 5,52 11

18,59: 4,77 21

18,94: 4,68 26

20,43: 4,34 21

21,29: 4,17 100

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Se burbujeó nitrógeno en una mezcla de 6-(2-cloro-5-fluoro-pirimidin-4-il)-4-fluoro-1-isopropil-2-metil-1Hbenzoimidazol (465 g), 5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-ilamina (321 g), carbonato de potasio (403 g), 4,5bis(difenilfosfino)-9,9-dimetilxanteno (17 g) en alcohol t-amílico (2,3 l). Se calentaron tris(dibencilidenacetona)dipaladio (13,2 g) y la mezcla a 100 ± 5°C hasta que se completó como se determinó mediante cromatografía líquida de alta resolución. Se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con diclorometano (1,2 l) y se filtró sobre una almohadilla CELITE®. El filtrado se extrajo con HCl 4M (2,3 l X 2). Las capas acuosas se combinaron y se mezclaron con carbón (32 g). Se filtraron a través de CELITE®, se añadió diclorometano (1,7 l) y el pH se ajustó con NaOH (28% ac., 1,5 l). La capa orgánica se recogió y la capa acuosa se lavó con diclorometano (1,7 l). Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con salmuera (1 l) y se secaron sobre sulfato de magnesio. Se usó un tratamiento sólido con Si-Tiol para eliminar el paladio residual y el solvente se intercambió a acetona. La suspensión se filtró y se secó para dar 605 g de producto crudo como la Forma I. Se mezclaron 605 g de la Forma I y 4,3 l de acetona seca. La suspensión se suspendió a 56-57°C (reflujo) durante al menos 18 horas y a continuación a temperatura ambiente durante 4 horas. El sólido se aisló mediante filtración bajo vacío, produciendo una torta de color amarillo claro. El sólido se secó en un horno de vacío a 35°C hasta que se obtuvo un peso constante de 570 g. Se confirmó mediante XRPD que el material era la Forma III del compuesto del título. MS (ES+): m/z = 507 (M+H)+.

Los siguientes ejemplos ilustran la mejora inesperada de la combinación de un anticuerpo anti-VEGFR2, incluyendo, pero sin limitarse a, ramucirumab (mediante el anticuerpo monoclonal de rata dirigido contra VEGFR2 de ratón que puede usarse en experimentos como sustituto en ratones para ramucirumab, DC101) y [5-(4-etilpiperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina. La forma de sal mesilato de [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-isopropil-2-metil-3Hbenzoimidazol]-5-il)-pirimidin-2-il]-amina se usa en algunos de los ensayos siguientes y se designa como el Compuesto A.

Ejemplo 1

Efectos antitumorales del compuesto A en combinación con DC101 en modelos de Xenoinjerto de ratón (NCI-H441 y NCI-H2122) para el cáncer de pulmón no microcítico

Información general:

Implantación y tratamiento del tumor:

Se cultivó la línea NSCLC humana NCI-H441 o NCI-H2122 en medio RPMI 1640 + suero fetal bovino al 10%. Se cosecharon las células sub-confluentes con tripsina y se aclararon dos veces con medio de crecimiento sin suero. Para tumores subcutáneos, el crecimiento se inició mediante inyección subcutánea de 5 x 106 células en una mezcla 1:1 de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) y Matrigel (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ) en el flanco trasero de cada animal. Cuando los volúmenes de tumor promedio alcanzaron un tamaño de aproximadamente 150-200 mm3, los animales se aleatorizaron por tamaño de tumor y peso corporal mediante técnicas de aleatorización bien conocidas en la técnica y se colocaron en sus grupos de tratamiento respectivos usando el número de animales por grupo, como se indica.

Captura de datos:

El tamaño del tumor y el peso corporal se capturaron usando Web Director. El volumen (V) del tumor se estimó usando la fórmula: V = 0,536L x W2 en la que L = el mayor diámetro medido y W = el menor diámetro perpendicular. Los datos de volumen tumoral se transformaron a una escala logarítmica para igualar la varianza a lo largo del tiempo y los grupos de tratamiento. Los datos de volumen registrados se analizaron con un análisis de varianza en el tiempo de medidas repetidas dos veces y un tratamiento usando los procedimientos MIXED en el software SAS (Versión 9.3). El modelo de correlación para las medidas repetidas fue Spatial Power. Los grupos tratados se compararon en comparación con el grupo de control en cada punto de tiempo. El procedimiento MIXED se usó también por separado para cada grupo de tratamiento para calcular las medias ajustadas y los errores

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volumen tumoral y el peso corporal se midieron dos veces por semana durante la duración del período de tratamiento.

Resultados: El tratamiento con 10, 20 o 40 mg/kg de DC101 resultó en una inhibición significativa del crecimiento tumoral. Los cambios en el volumen tumoral (%T/C) observados al final del período de dosificación (día 42) fueron del 25,6%, 10,4% y 9,0% para dosis de 10, 20 y 40 mg/kg, respectivamente. Se observó una inhibición del crecimiento estadísticamente significativa (p <0,001) de los tumores de xenoinjerto NCI-H441 en comparación con el grupo de control con vehículo (p <0,001%) para todos los grupos tratados con DC101. El tratamiento con un solo agente con DC101 resultó en una tendencia dependiente de la dosis con respecto a la frecuencia de la enfermedad estable y respuestas parciales de manera que la frecuencia combinada para enfermedad estable y para la respuesta parcial fue de 2/8, 5/8 y 6/8 en los grupos tratados con 10, 20 y 40 mg/kg, respectivamente. No hubo problemas de tolerabilidad significativos con ninguno de los tratamientos con agente único con DC101: la pérdida de peso corporal relativa máxima fue del 1,3% para la dosis de 10 mg/kg, del 1,5% para la dosis de 20 mg/kg y del 0,5% para la dosis de 40 mg/kg. La pérdida de peso corporal se midió como el cambio porcentual de los pesos corporales medios registrados al inicio (día 14) versus el último día de tratamiento (día 42).

Combinación con el Compuesto A y DC101

Se trataron ratones atímicos desnudos Hsd hembra (n = 8) que portaban tumores de xenoinjerto NCI-H441 con Compuesto A mediante sonda oral una vez al día durante 28 días a una dosis de 50 mg/kg usando 0,2 ml/dosis y se inyectó intraperitonealmente DC101 dos veces por semana a una dosis de 20 mg/kg. Ambos se administraron comenzando el día 15 después de la implantación del tumor, terminando el tratamiento con el Compuesto A el día 42 y el tratamiento con DC101 el día 39. El volumen tumoral se midió dos veces por semana durante la duración del período de tratamiento y medir el peso corporal.

Resultados: El tratamiento de combinación con 50 mg/kg de Compuesto A y 20 mg/kg de DC101 resultó en una mejora en la eficacia antitumoral en comparación con cada uno de los grupos de monoterapia. El volumen tumoral al final del período de dosificación (día 42) mostró una regresión del 42,9% (es decir, %T/C = -42,9%) en el grupo de combinación en comparación con una regresión del 8,1% en el grupo tratado con 50 mg/kg de Compuesto A solo y un %T/C observado del 10,4% en el grupo tratado con 20 mg/kg de DC101 solo. La diferencia en la eficacia antitumoral entre cada grupo de monoterapia en comparación con el grupo de combinación era estadísticamente significativa (p <0,001). El tratamiento de combinación resultó en una respuesta parcial en 8/8 de los animales tratados. Por el contrario, solo 2/8 animales mostraron una respuesta parcial a la monoterapia con DC101, tres animales mostraron enfermedad estable (3/8) y tres animales mostraron enfermedad progresiva (3/8). 6/8 animales mostraron una respuesta parcial a la monoterapia con Compuesto A y 2 animales mostraron una enfermedad estable (2/8). Para la terapia de combinación, hubo un aumento en la frecuencia de animales con respuesta parcial (8/8), así como un aumento estadísticamente significativo (p <0,001) en la magnitud de la regresión (5/8 animales que recibieron terapia de combinación tenían tasas de regresión mejores que la mejor respuesta observada en el grupo tratado con agente único de Compuesto A (50 mg/kg)). No se observaron cambios estadísticamente significativos en la tolerabilidad con relación a la monoterapia o los controles con el tratamiento de combinación. Específicamente, la pérdida de peso corporal relativa máxima en el grupo de combinación fue del 3,0% en comparación con el 2,7% para la monoterapia del tratamiento con el Compuesto A y el 1,5% para el tratamiento con monoterapia con DC101. La pérdida de peso corporal se midió como el cambio porcentual de los pesos corporales medios registrados al inicio (día 14) versus el último día de tratamiento (día 42).

Estudio 2:

Compuesto de monoterapia A

Se trataron ratones atímicos desnudos Hsd hembra (n = 7) que portaban tumores de xenoinjerto NCI-H441 con Compuesto A mediante sonda oral (PO) una vez al día durante 28 días a una dosis de 50 o 75 mg/kg usando 0,2 ml/dosis. El Compuesto A se administró comenzando después de que los volúmenes tumorales medios alcanzaran un tamaño de aproximadamente 150-200 mm3 (día 36 después de la implantación del tumor) y terminando el tratamiento 28 días después (el día 63). El volumen tumoral y el peso corporal se midieron dos veces por semana durante la duración del período de tratamiento.

Resultados: Al final del período de dosificación (Día 67) los xenoinjertos NCI-H441 tratados con 50 o 75 mg/kg de Compuesto A resultaron en una inhibición significativa del crecimiento tumoral. El tratamiento de 50 mg/kg mostró un %T/C del 7,0% mientras que el tratamiento de 75 mg/kg resultó en una regresión del -4,8%, en comparación con los controles con vehículo. Se determinó que estos valores eran estadísticamente significativos (p <0,001) en comparación con el control. El volumen tumoral relativo al final del período de tratamiento indicó que la monoterapia con 50 o 75 mg/kg de Compuesto A resultó en una tendencia dependiente de la dosis con relación a

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la frecuencia de enfermedad estable y respuestas parciales de manera que la frecuencia combinada para enfermedad estable y la respuesta parcial era 4/7 y 6/7 respectivamente. 2/7 y 3/7 de los ratones alcanzaron la regresión completa para las monoterapias con Compuesto A de 50 mg/kg y 75 mg/kg. La pérdida de peso corporal relativa máxima fue del 5,5% y del 5,1% para las monoterapias con Compuesto A de 50 y 75 mg/kg, que no fue estadísticamente diferente de los animales de control.

Monoterapia DC101

Se trataron ratones atímicos desnudos Hsd hembra (n = 7) que portaban tumores de xenoinjerto NCI-H441 con DC101 dos veces por semana durante cuatro semanas mediante inyección intraperitoneal a una dosis de 20 mg/kg. Se administró DC101 comenzando después de que los volúmenes tumorales medios alcanzaran un tamaño de aproximadamente 150-200 mm3 (día 36 después de la implantación del tumor). El volumen tumoral y el peso corporal se midieron dos veces por semana durante el período de tratamiento.

Resultados: El tratamiento con 20 mg/kg de DC101 resultó también en una inhibición significativa del crecimiento tumoral con un %T/C del 5,6% en comparación con los controles con vehículo. Se determinó que estos valores eran estadísticamente significativos (p <0,001) en comparación con el control. El volumen tumoral relativo al final del período de tratamiento indicó que la monoterapia con DC101 resultó en 2/6 ratones con enfermedad progresiva, 2/6 con enfermedad estable y 2/6 ratones consiguiendo una respuesta parcial. La pérdida de peso corporal relativa máxima fue del 3,9% para la monoterapia con DC101, que no fue estadísticamente diferente de los animales de control.

Combinación de compuesto A y DC101

Se trataron ratones atímicos desnudos Hsd hembra (n = 7) que portaban tumores de xenoinjerto NCI-H441 con Compuesto A mediante sonda oral una vez al día durante 28 días con una dosis de 50 mg/kg o 75 mg/kg usando 0,2 ml/dosis y se inyectó intraperitonealmente DC101 dos veces a la semana a una dosis de 20 mg/kg. Ambos se administraron comenzando después de que los volúmenes tumorales medios alcanzaran un tamaño de aproximadamente 150-200 mm3 (día 36 después de la implantación del tumor) y terminando el tratamiento el día

63. El volumen tumoral y el peso corporal se midieron dos veces por semana durante la duración del período de tratamiento.

El tratamiento de combinación con 20 mg/kg de DC101 y el Compuesto A mostró una eficacia antitumoral que era significativamente mejor que cualquiera de los grupos de monoterapia en los que los tratamientos de combinación que incluían 50 o 75 mg/kg de Compuesto A resultaron en regresiones tumorales de -48,6% y -38,9%, respectivamente. Estos efectos sobre el crecimiento del tumor fueron estadísticamente significativos cuando se compararon con el grupo de control con vehículo (p <0,001), así como con sus respectivos grupos de monoterapia. En particular, cuando se comparó con la monoterapia con DC101, la combinación con 50 o 75 mg/kg fue estadísticamente significativa con p <0,001 y p = 0,033, respectivamente; cuando se compararon con sus respectivos grupos de monoterapia con Compuesto A, los tratamientos de combinación con 50 y 75 mg/kg fueron también estadísticamente significativos con p <0,001 y p = 0,006, respectivamente.

Las mediciones del volumen tumoral relativo al final del período de tratamiento indicaron que la terapia de combinación con DC101 con 50 o 75 mg/kg del Compuesto A resultó en una tasa de control de la enfermedad del 100%, en la que 7/7 ratones de cada grupo tenían enfermedad estable o consiguieron una respuesta parcial. Esto muestra una mejora significativa en la respuesta en comparación con la monoterapia con DC101 o con el Compuesto A, donde las tasas de control de la enfermedad (enfermedad estable + respuesta parcial) observadas fueron 4/7, 6/7 y 4/6 para la monoterapia con 50 mg/kg del Compuesto A, 75 mg/kg de Compuesto A y 20 mg/kg de DC101, respectivamente.

Los cambios en el peso corporal relativo en los grupos de combinación no fueron estadísticamente diferentes de los grupos de control o de monoterapia.

Tumores de xenoinjerto NCI-H2122

Compuesto de monoterapia A

Se trataron ratones atímicos desnudos Hsd hembra (n = 8) que portaban tumores de xenoinjerto NCI-H2122 con Compuesto A mediante sonda oral (PO) una vez al día durante 28 días a una dosis de 50 o 75 mg/kg usando 0,2 ml/dosis. El Compuesto A se administró comenzando después de que los volúmenes tumorales medios alcanzaran un tamaño de aproximadamente 150-200 mm3 (día 16 después de la implantación del tumor) y terminando el tratamiento el día 43. El volumen tumoral y el peso corporal se midieron dos veces por semana durante la duración del período de tratamiento.

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50 ml de PBS. Se colocaron en una botella de vidrio siliconado y autoclave durante 15 minutos a 120°C y se almacenaron a 4°C.

El día del ensayo, las perlas se mezclaron suavemente y se transfirieron 1,2 ml de perlas a un tubo de 50 ml (Falcon, #352098), y se permitió que se asentaran de manera natural. El PBS se aspiró y las perlas se lavaron con 20 ml de medio basal endotelial completo precalentado 2 (EBM2). Se permitió que las perlas se sedimentaran, se aspiró suavemente el medio y se añadió 15 ml de EBM2 completo.

Las células HUVEC se recogieron de los matraces de cultivo, se aclararon con PBS y se añadió y se aspiró TrypLE (Gibco #126051-010) en cuanto las células se redondearon. Se volvieron a suspender suavemente las células HUVEC en 20 ml de medio completo, se determinó el recuento de células viables y se añadió una suspensión de 2,5x107 células a las perlas, hasta un volumen final de 24 ml. Se colocó el tubo tumbado a 37°C en 5% de CO2 durante 4 horas, y se invirtió suavemente varias veces cada 20 minutos. Las perlas y la suspensión celular se transfirieron a 2 ml/matraz en 12 matraces T75 (Nunc #156499). El tubo se enjuagó con 20 ml de medio y se distribuyó por igual entre los 12 frascos. Los medios se completaron hasta 10 ml y los matraces se incubaron a 37°C en 5% de CO2 durante la noche.

El medio que contenía HUVEC/perlas se pipeteó desde 2 matraces T75 hacia arriba y hacia abajo varias veces para liberar HUVEC/perlas desde el matraz. La solución se transfirió a un tubo de 50 ml y los matraces se lavaron con 5 ml de medio y se transfirieron al mismo tubo. Se permitió que las perlas se asentaran y se mezcló adicionalmente 2 veces con EBM2 fresco usando una pipeta de 1 ml para separar las perlas según fuese necesario. Se volvieron a suspender las perlas en 2x15 ml de solución de fibrinógeno, que consistía en 50 ml de fibrinógeno a 2 mg/ml (Sigma #F4883), complementado con 1,875 μl de Aprotinina a 4U/ml (concentración final de 0,15 unidades/ml) (Sigma #A3428). Filtrado estéril con un filtro de 0,22 micrómetros.

Las células CAF de los matraces T150 se recogieron, se enjuagaron con PBS y se añadió y se aspiró TrypLE (Gibco #126051-010) en cuanto las células se redondearon. Se añadió 2 ml de medio completo (EBM2 complementado con SINGLEQUOTS™ y 2% de SFB) y se determinó el recuento de células viables y se añadieron células a 4x104 células/ml a la solución de fibrinógeno.

Se añadieron 12 μl de trombina (Sigma #T4393-100 unidades) hasta una concentración final de 0,6 unidades/0,5 ml de solución de coágulo a placas de fondo de vidrio de 24 pocillos (In Vitro Scientific #P24-1.5H-N). Se añadieron rápidamente 0,5 ml de suspensión de fibrinógeno-perla/CAF a cada pocillo para permitir el mezclado y prevenir la formación de burbujas. Las placas se colocaron en la campana durante 20 minutos para coagular sin perturbaciones y, a continuación, las placas se movieron a una incubadora (37°C, 5% de CO2) durante 20 minutos. Se añadieron, gota a gota, 0,5 ml de medio completo a cada pocillo para evitar la interrupción del coágulo. Se añadió ramucirumab a una concentración de 10 μg/ml a cada pocillo. Se añadió el Compuesto A a los pocillos que contenían ramucirumab a concentraciones de 3, 10, 30, 100 y 500 nM. Los compuestos se diluyeron en serie en dimetilsulfóxido y a continuación ser transfirieron a la placa de ensayo de manera que la concentración final del dimetilsulfóxido en el ensayo fuese del 0,05%. Las placas se incubaron a 37°C en 2% de CO2. El día 4 después del tratamiento, el medio se reemplazó con medios frescos y tratamientos.

El día 7 después del tratamiento, los pocillos se fijaron durante la noche a 4°C en paraformaldehído (PFA) al 4% (Electron Microscopy Sciences #15710). Las placas se lavaron con 0,5 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) (HyClone SH30264.01, Lote Nº AVJ79791) y se permeabilizaron con 0,5% de TRITON™ X-100/PBS (Sigma #T9284) durante 10 minutos a 4°C. Las placas se enjuagaron 3X durante 10-15 minutos cada una con 1 ml de glicina/DPBS (Bio-Rad #161-0718) y se bloquearon durante la noche con 0,5 ml por pocillo de tampón IF que consistía en 0,1% de BSA, 0,2% de TRITON™ X-100, 0,05% de Tween-20 en DPBS + 10% de suero de cabra (Invitrogen #16210). El tampón se retiró y las placas se incubaron durante la noche a 4°C con anticuerpos primarios, anticuerpo de oveja dirigido contra CD31 humano (1:100) (R&D Systems #BAF806) y anti-α-actina de músculo liso, Cy3 (1:200) (Sigma #C6198) en el tampón anterior. Los pocillos se enjuagaron 3X durante 20 minutos cada uno con tampón IF a temperatura ambiente con balanceo suave. Se añadió anticuerpo de burro contra IgC de oveja Alexa Fluor 488 (H+L) (1:200) (Molecular Probes #A-11015) en tampón de incubación y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Los pocillos se enjuagaron como se ha indicado anteriormente, y se incubaron en 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1:10000) (Invitrogen #D1306) en DPBS durante 1 a 2 horas a temperatura ambiente. Los pocillos se enjuagaron con DPBS durante 5 minutos. Se añadieron 0,5 ml de DPBS y las placas se escanearon en CELLINSIGHT™ (Thermal Science) usando el Objetivo 2X. El ensayo de detección de neuritas CELLINSIGHT™ se usó para obtener imágenes y cuantificar la proliferación de células endoteliales. Los datos se analizaron estadísticamente usando JMP 9 (SAS, 9.0.3).

Cada experimento representa la media de triplicados que se expresa como medias geométricas y pueden calcularse intervalos de confianza del 95%. El porcentaje de reducción se calculó con la fórmula ((ramucirumab tratado con control)/(control con ramucirumab)) * 100.

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Claims

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