ES2660429T3 - Métodos, reactivos y kits para detectar enfermedad residual mínima - Google Patents

Abstract

Un kit de diagnóstico, que comprende dos composiciones reactivas de 8 colores para la detección por citometría de flujo de mieloma múltiple (MM) o trastornos de células plasmáticas (PCD) en un sujeto humano, comprendiendo las composiciones reactivas de 8 colores distintos paneles de anticuerpos conjugados con fluorocromo dirigidos contra las siguientes combinaciones de marcadores: (i) CD138, CD27, CD38, CD56, CD45, CD19, CD117 y CD81; y (ii) CD138, CD27, CD38, CD56, CD45, CD19, CyIgκ y CyIgλ.

Description

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ficoeritrina (PE), (5) proteína de clorofila peridinina/ cianina 5.5 (PerCP-Cy5.5), PerCP o PE-TexasRed, (6) ficoeritrina/cianina 7 (PE-Cy7), (7) aloficocianina (APC) o Alexa647, y (8) aloficocianina/hilita 7 (APC-H7), APC-Cy7, Alexa680, APC-A750, APC-C750 o Alexa700. Después de múltiples rondas de prueba, los presentes inventores observaron que se pueden obtener muy buenos resultados si se escogen los siguientes fluorocromos: Azul pacífico, violeta brillante 421 o Horizon V450, PacO o Horizon V500, FITC, PE, PerCPCy5.5, PE-Cy7, APC, y APC-H7 o APC-A750 o APC-C750.

En un aspecto específico, se proporciona aquí una composición de reactivo mostrada en la Tabla 2.

Tabla 2. Composiciones de reactivos de ejemplo para detección de MRD en B-CLL

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Panel 2A. Composición de panel con MRD de CLL de 8 colores

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BV421 BV510 FITC PE PerCPCy5. Cy5. PECy 7 APC APCC750

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CD27 CD3 CD79b CD5 CD22 CD19 CD200 CD81

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CD5 CD3 CD79b ROR1 CD27 CD19 CD200 CD81

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Panel 2B. Composición de tubo con MRD de CLL de 10 colores

F1

imagen9 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10

CD27

imagen10 CD3 CD79b ROR1 CD5 CD22 CD19 CD20 CD200 CD81

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imagen12 Panel 2C. Composición de tubo con MRD de CLL de 12 colores

F1

imagen13 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12

CD 27

imagen14 CD3 CD79b ROR1 CD5 CD22 CD19 CD20 CD200 CD43 CD81 CD38

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Detección de MRD por citometría de flujo en mieloma múltiple/enfermedad celular en plasma (MM/PCD)

Un aspecto de la invención se relaciona con una composición de reactivo para detectar células de MM o PCD. El panel comprende anticuerpos contra los cuatro “marcadores de núcleo” CD 138, CD38, CD56 y CD19, complementados con por lo menos cuatro marcadores adicionales seleccionados del grupo que consiste de CD27, CD117, CD81, CD229,

15 CD45, CyIgκ y CyIgλ. El CD45 es un quinto marcador preferido, preferiblemente en combinación con CD27, CD117 y CD81 o CD229, CyIgκ y CyIgλ.

Se proporciona una composición de reactivo con anticuerpos conjugados a fluorocromo distintos contra cualquiera de uno de los siguientes paneles de marcadores:

(n)

CD45 CD138 CD38 CD56 CD27 CD19 CD117 CD81

(o)

CD45 CD138 CD38 CD56 CD229 CD19 CyIgκ CyIgλ

(p)

CD138 CD27 CD38 CD56 CD45 CD19 CD117 CD81

(q)

CD138 CD27 CD38 CD56 CD229 CD19 CyIgκ CyIgλ

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Un aspecto adicional de la invención se relaciona con un kit de diagnóstico para detectar MM/PCD MRD que comprende una o más de las composiciones de reactivos descritas anteriormente, opcionalmente junto con instrucciones para uso, regulador, y/o muestras de control (véase: Kalina et al. Leukemia 2012: 26: 1986-2010). Se proporciona un kit de PCD que comprende una o más composiciones de reactivos de la Tabla 3.

La invención también se relaciona con un método para detección por citometría de flujo de MRD, que comprende las etapas de proporcionar una muestra biológica de un sujeto humano y poner en contacto por lo menos una porción (alícuota) de la muestra con una composición de reactivo proporcionada aquí. Se puede utilizar directamente cualquier tipo de muestra conocida o que se sospecha contiene los leucocitos, o después de lisis de los glóbulos rojos no nucleados, o después de centrifugación de densidad, o después de células procedimientos de clasificación. Por ejemplo, la muestra es sangre periférica, médula ósea, muestra de tejido, tales como los ganglios linfáticos, adenoides, bazo o hígado, u otro tipo de fluido corporal tal como líquido cefalorraquídeo, líquido vítreo, líquido sinovial, derrame pleural o ascitis. Se prefiere la sangre periférica o médula ósea.

Se proporciona un método de citometría de flujo multi-color para detectar enfermedad residual mínima (MRD) en una muestra biológica que comprende células, preferiblemente células de linaje B (Precursores de células B, linfocitos B, y células de plasma), que comprende las etapas de:

(i)

teñir la muestra con una composición de reactivo de acuerdo con la invención,

(ii)

someter la muestra a citometría de flujo;

(iii) activar sobre células para expresión de los marcadores seleccionados detectados por los anticuerpos presentes en la composición de reactivo;

(iv) distinguir entre células normales y malignas, con base en el perfil de expresión de los marcadores múltiples.

Preferiblemente, el análisis en la etapa (iv) involucra análisis multivariante, preferiblemente análisis de componente principal (PCA), en donde cada marcador ha agregado valor en el proceso de distinción a través del análisis de componente principal. Ventajosamente, se utiliza vista APS que utiliza separación de población automatizada, por ejemplo, empleando el software Infinicyt, o el análisis de escalamiento multidimensional (MDS).

El PCA es un procedimiento matemático que utiliza una transformación ortogonal para convertir un conjunto de observaciones de las variables posiblemente correlacionadas en un conjunto de valores de las variables no correlacionadas llamadas componentes principales. El número de componentes principales es menor que o igual al número de variables originales. Esta transformación se define de tal manera que el primer componente principal tiene tan alta una varianza como sea posible (es decir, representa tanta variabilidad en los datos como sea posible), y cada componente subsiguiente a su vez tiene la varianza más alta posible bajo restricción de que sea ortogonal a (correlacionada con) los componentes anteriores. Se garantiza que los componentes principales sean independientes sólo si el conjunto de datos se distribuye normalmente en forma conjunta. El PCA es sensible a la escala relativa de las variables originales. Dependiendo del campo de aplicación, que también se llama la transformada de Karhunen-Loève discreta (KLT), la transformada de Hotelling o descomposición ortogonal adecuada (POD). Como alternativa al PCA, se pueden utilizar SMD o cualquier otro tipo de análisis multivariante bien establecido (véase: Pedreira et al. Trends Biotechnol 2013).

En una realización, se proporciona un método de citometría de flujo multi-color para detectar enfermedad residual mínima (MRD) en una muestra biológica que comprende linfocitos, en donde MRD es BCP-ALL, que comprende las etapas de:

(i)

teñir la muestra con una composición de reactivo para BCP-ALL de acuerdo con la invención, preferiblemente una composición seleccionada de uno cualquiera de los paneles 1A, 1B o 1C,;

(ii)

someter la muestra a citometría de flujo; (iii) activación sobre células B maduras y células de BCP para expresión de los marcadores detectados por los anticuerpos presentes en la composición de reactivo; (iv) distinción entre células de BCP normales y malignas, con base en la aplicación de múltiples marcadores, cada uno tiene valor agregado en el proceso de distinción a través del análisis de componente principal. Véanse ejemplos en el Ejemplo 1 y Figuras 1 y 2 para un ejemplo de análisis que permite detección de MRD en pacientes con BCP-ALL.

En otra realización, se proporciona un método de citometría de flujo multi-color para detectar enfermedad residual mínima (MRD) en una muestra biológica que comprende linfocitos, en donde la MRD es CLL, que comprende las etapas de:

(i)

teñir la muestra con una composición de reactivo de CLL de acuerdo con la invención, preferiblemente una composición seleccionada de uno cualquiera de los paneles 2A, 2B o 2C;

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discriminar las células de BCP-ALL de las células BCP normales (ver a continuación), también pueden contribuir a la activación de la población de células BCP totales (por ejemplo CD34+, CD10+, CD20-para atenuar, CD38+). Marcadores para distinguir células precursoras de células B normales versus malignas Lista de marcadores y aberración fenotípica más frecuente: CD38: subexpresado en células precursoras de célula B de BCP-ALL/malignas vs. Normales CD10: sobre o subexpresado en células precursoras de célula B de BCP-ALL/malignas CD45: subexpresado (usualmente negativo) en células precursoras de célula B de BCP-ALL/malignas vs. normales CD20: sub o sobreexpresado en células precursoras de célula B de BCP-ALL/malignas vs. Normales

CD81: sobre o subexpresado en células precursoras de célula B de BCP-ALL/malignas vs. normales CD66c: sobreexpresado en células precursoras de célula B de BCP-ALL/malignas vs. normales (particularmente BCR-ABL positivo ALL; generalmente negativo en TEL-AML1-positivo o MLL-AF4-positivo ALL)

CD123: sobreexpresado en células precursoras de célula B de BCP-ALL/malignas vs. normales (particularmente en ALL hiperdiploide) CD304: sobreexpresado en células precursoras de célula B de BCP-ALL/malignas vs. Normales CD73: sobreexpresado en células precursoras de célula B de BCP-ALL/malignas vs. Normales CD34: sub o sobreexpresado en células precursoras de célula B de BCP-ALL/malignas vs. Normales SSC: aumento o reducción de intensidad en células precursoras de célula B de BCP-ALL/malignas vs. normales. FSC: aumento o reducción de intensidad en células precursoras de célula B de BCP-ALL/malignas vs. normales. Ejemplo 2. Paneles de anticuerpo y método de diagnóstico para detección de MRD en pacientes con CLL. Marcadores para identificación de células B totales en sangre periférica y médula ósea:

Lista de marcadores de identificación: CD19, CD3 (marcador de exclusión) Cómo utilizarlos: La pre-activación utilizando este marcador es esencial para la identificación de una población de células B puras, y la eliminación de dobletes de células B/células T. Estos marcadores se pueden utilizar también en combinación con dispersión lateral de luz (SSC) o dispersión de luz frontal (FSC) o ambas FSC y SSC para identificar las células B en sangre periférica o médula ósea u otros tipos de muestras (por ejemplo, biopsia de tejido, líquido cefalorraquídeo). Para una activación más refinada con un mejor enriquecimiento de células de CLL, se pueden utilizar CD5 y CD27.

Marcadores para distinguir las células B normales de las células de CLL: Lista de marcadores fenotípicos y aberración más frecuente: CD27: positivo sobre células de CLL y una pequeña fracción de células B normales CD5: positivo sobre células de CLL y una pequeña fracción de células B normales CD79b: subexpresado sobre células de CLL en comparación con linfocitos B maduros y de transición normales CD22: subexpresado sobre células de CLL en comparación con linfocitos B maduros y de transición normales CD20: subexpresado sobre células de CLL en comparación con linfocitos B maduros y de transición normales CD200: sobreexpresado sobre células de CLL en comparación con linfocitos B maduros y de transición normales

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