ES2661055T3 - Determinación de haplotipos de KIR por amplificación de exones - Google Patents

Determinación de haplotipos de KIR por amplificación de exones Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para determinar genotipos de KIR mediante el análisis de uno y el mismo exón en los 16 genes KIR para uno o más individuos en paralelo, comprendiendo el procedimiento: (a) para cada individuo, realizar una reacción de amplificación con al menos un par de cebadores que consisten en un cebador directo y un cebador inverso, comprendiendo cada cebador una secuencia adaptadora, una secuencia de identificación individual y una secuencia de hibridación con KIR, para amplificar las secuencias de exones de los genes KIR que comprenden sitios polimórficos para obtener amplicones de KIR; (b) combinar los amplicones de KIR de cada uno de los uno o más individuos obtenidos en la etapa (a); (c) realizar PCR en emulsión; (d) determinar la secuencia de cada amplicón de KIR para cada individuo usando pirosecuenciación en paralelo; y (e) asignar los alelos de KIR a cada individuo comparando la secuencia de los amplicones de KIR determinada en la etapa (d) con secuencias de KIR conocidas para determinar qué alelos de KIR están presentes en el individuo, en el que al menos uno de dichos cebadores es genérico para todos o para un subconjunto de genes KIR y en el que dichos cebadores se seleccionan de manera que cada uno de los al menos un exón en cada uno de los 16 genes KIR se amplifica con especificidad suficiente para permitir la determinación inequívoca del genotipo de KIR a partir de los amplicones.

Description

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DESCRIPCIÓN
Determinación de haplotipos de KIR por amplificación de exones
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere a los procedimientos de diagnóstico molecular y, más específicamente, a la determinación de genotipos de individuos en los que se sabe que genotipos particulares están asociados a enfermedad.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La presente invención es un procedimiento para determinar las secuencias de genes que codifican los receptores de tipo inmunoglobulina de células NK o genes «KIR» (del inglés natural killer cell immunoglobulin-like receptor) en un único individuo o en cada uno de múltiples individuos sometidos a prueba simultáneamente.
Células NK
Las células NK (del inglés natural killer) o linfocitos citolíticos naturales son parte del sistema inmunitario innato y están especializadas en la defensa temprana contra infecciones y tumores. Las células NK se descubrieron por primera vez como resultado de su capacidad para destruir células tumorales. A diferencia de los linfocitos T citolíticos, las células NK pueden destruir dianas de forma no restringida al complejo mayor de histocompatibilidad (no-CMH). Como parte importante del sistema inmunitario innato, las células NK comprenden aproximadamente un 10 % de los linfocitos circulantes totales del organismo humano.
Debido a su capacidad para destruir otras células, las células NK normalmente se mantienen bajo un estricto control. Todas las células normales del organismo expresan las moléculas del CMH de clase I en su superficie. Estas moléculas protegen a las células normales de la destrucción por las células NK, ya que sirven como ligandos para muchos de los receptores que se encuentran en las células NK. Las células que carecen de suficiente CMH de clase I en su superficie son reconocidas como «anómalas» por las células NK y son destruidas. Al mismo tiempo que destruyen las células anómalas, las células NK también provocan una respuesta de las citocinas.
Las células NK constituyen una fuerza de respuesta rápida contra el cáncer y las infecciones víricas. Estos glóbulos blancos especializados se originan en la médula ósea, circulan por la sangre y se concentran en el bazo y otros tejidos linfoides. Las células NK regulan sus actividades en un subconjunto de las proteínas del antígeno leucocitario humano (HLA) que se producen en la superficie de las células sanas, pero de las que las células debilitadas por virus y cáncer se desprenden. Las proteínas de HLA están codificadas por los genes del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). Cuando las células NK encuentran células que carecen de proteínas de HLA, las atacan y destruyen, impidiendo de este modo que las células propaguen aún más el virus o el cáncer. Las células NK se distinguen de otras células del sistema inmunitario por la prontitud y la amplitud de su respuesta protectora. Otros glóbulos blancos entran en juego más lentamente y se dirigen a patógenos específicos (cánceres, virus o bacterias) en lugar de a células dañadas en general.
Genes KIR
La familia de genes que codifican los receptores de tipo inmunoglobulina de células NK o genes «KIR» (del inglés natural killer cell immunoglobulin-like receptor) es una de varias familias de receptores que codifican proteínas importantes que se encuentran en la superficie de las células NK. Un subconjunto de los genes KIR, concretamente los genes KIR inhibidores, interactúan con las moléculas de HLA de clase I, que son codificadas dentro del CMH humano. Dichas interacciones permiten la comunicación entre las células NK y otras células del organismo, incluidas células normales, células infectadas por virus o células cancerosas. Esta comunicación entre las moléculas de KIR en las células NK y las moléculas de HLA de clase I en todas las demás células ayuda a determinar si las células NK reconocen o no a las células del organismo como propias o no propias. Las células que se consideran «no propias» son seleccionadas para su destrucción por las células NK.
Estructura de los genes KIR y sus proteínas
La familia de genes KIR consiste en 16 genes (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DL1/S1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIR2DP1 y KIR3DP1). El grupo de genes KIR se localiza dentro de una región de 100-200 kb del complejo de receptores leucocitarios (LRC) localizado en el cromosoma 19 (19q13.4) (Trowsdale J. (2001) Genetic and functional relationships between MHC and NK receptor genes. Immunity, Sep;15(3):363-374). Se cree que el complejo génico ha surgido por eventos de duplicación génica que ocurrieron después de la división evolutiva entre mamíferos y roedores (Barten R., et al. (2001) Divergent and convergent evolution of NK-cell receptors. Trends Immunol., Jan;22(1):5257). Los genes KIR están dispuestos en una configuración de cabeza a cola, con solo 2,4 kb de secuencia separando los genes, a excepción de una secuencia de 14 kb entre 3DP1 y 2DL4. Debido a que los genes KIR
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aminopurina, 2,6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina y xantina; derivados 7-desaza-8-aza de adenina, guanina, 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina y xantina; 6azacitidina; 5-fluorocitidina; 5-clorocitidina; 5-yodocitidina; 5-bromocitidina; 5-metilcitidina; 5-propinilcitidina; 5bromoviniluracilo; 5-fluorouracilo; 5-clorouracilo; 5-yodouracilo; 5-bromouracilo; 5-trifluorometiluracilo; 5metoximetiluracilo; 5-etiniluracilo; 5-propiniluracilo y similares.
El término «nucleótido natural» se refiere a nucleótidos que contienen purina y pirimidina que se encuentran naturalmente en el ADN y ARN celulares: citosina (C), adenina (A), guanina (G), timina (T) y uracilo (U).
El término «nucleótido no natural» o «nucleótido modificado» se refiere a un nucleótido que contiene un grupo de base, azúcar o fosfato modificado, o que incorpora un resto no natural en su estructura. El nucleótido no natural se puede producir mediante una modificación química del nucleótido bien como parte del polímero de ácido nucleico o bien antes de la incorporación del nucleótido modificado al polímero de ácido nucleico. En otro abordaje, un nucleótido no natural se puede producir incorporando un nucleósido trifosfato modificado a la cadena polimérica durante la síntesis enzimática o química del ácido nucleico. Los ejemplos de nucleótidos no naturales incluyen didesoxinucleótidos y nucleótidos biotinilados, aminados, desaminados, alquilados, bencilados y marcados con fluoróforo.
El término «ácido nucleico polimerasas» o simplemente «polimerasas» se refiere a enzimas, por ejemplo, ADN polimerasas, que catalizan la incorporación de nucleótidos a un ácido nucleico. Las ADN polimerasas termoestables ejemplares incluyen las de Thermus thermophilus, Thermus caldophilus, Thermus sp. ZO5 (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.º 5 674 738) y mutantes de la polimerasa de Thermus sp. ZO5 (véase, por ejemplo, la solicitud de patente de EE. UU. n.º 11/873.896, presentada el 17 de octubre de 2007), Thermus aquaticus, Thermus flavus, Thermus filiformis, Thermus sp. sps17, Deinococcus radiodurans, familia Hot Spring B/clon 7, Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax, Escherichia coli, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana y Thermosipho africanus. Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos completas para numerosas ADN polimerasas termoestables están disponible en las bases de datos públicas.
Los términos «condiciones de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa» o «condiciones de PCR» se refieren a condiciones en las cuales los cebadores que hibridan con un ácido nucleico molde se extienden mediante una polimerasa durante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los expertos en la técnica apreciarán que dichas condiciones pueden variar y, en general, están influidas por la naturaleza de los cebadores y el molde. Diversas condiciones de PCR se describen en PCR Strategies (M. A. Innis, D. H. Gelfand y J. J. Sninsky eds., 1995, Academic Press, San Diego, CA) en el capítulo 14; PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications (M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky y T. J. White eds., Academic Press, NY, 1990).
El término «muestra» se refiere a cualquier composición que contenga o se sospeche que contiene ácido nucleico de un individuo. La muestra se puede obtener por cualquier medio conocido por los expertos en la técnica. Dicha muestra puede ser una cantidad de tejido o líquido, o una fracción purificada de la misma, aislada de un individuo o individuos, incluyendo tejido o líquido, por ejemplo, piel, plasma, suero, sangre entera y componentes sanguíneos, líquido cefalorraquídeo, saliva, líquido peritoneal, líquido linfático, humor acuoso o vítreo, líquido sinovial, orina, lágrimas, semen, flujo vaginal, derrame pulmonar, líquido seroso, órganos, lavado broncoalveolar, tumores y tejidos incluidos en parafina. Las muestras también pueden incluir constituyentes y componentes de cultivos in vitro de células obtenidas de un individuo, que incluyen, pero sin limitación, medio acondicionado que resulta del crecimiento de células en el medio de cultivo celular, células recombinantes y componentes celulares.
II. Introducción
Aunque un gran grupo de alelos de los genes KIR se ha descrito por procedimientos en los que genes KIR individuales se secuencian de uno en uno (Tabla 1: 335 alelos), no se han desarrollado procedimientos que permitan determinar todos los alelos de KIR presentes en muestras de pacientes de una manera rápida.
Tabla 1. Número de polimorfismos de KIR identificados hasta la fecha.
Gen KIR
2DL1 2DL2 2DL3 2DL4 2DL5 2DS1 2DS2 2DS3
Alelos
25 11 9 25 21 12 12 9
Proteínas
18 7 8 12 11 8 6 3
Nulos
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datos. El programa informático identifica a continuación las etiquetas de las muestras (etiquetas MID) y los cebadores. El uso de etiquetas permite que varias muestras se analicen juntas en una sola placa. El programa informático se puede diseñar para permitir la omisión de bases o la inserción de bases dentro de los sitios de etiquetas y para garantizar que esto no dé lugar a una asignación incorrecta de etiquetas.
El programa informático es capaz de evaluar la homología de secuencia con el locus diana y los genes relacionados que se pueden coamplificar, para asignar la referencia apropiada a cada secuencia clonal. Dado que los clones de ADN de todos los locus diana y coamplificados se mezclan en la PCR en emulsión, es necesario identificar las secuencias sometiéndolas a prueba contra cada uno de los locus que se pueden amplificar, para obtener una asignación única. Este procedimiento puede estar asistido por el examen de secuencias de intrones, para distinguir entre locus.
El programa informático es además capaz de generar una secuencia consenso para cada locus diana. Esta secuencia contiene una combinación de bases de cada uno de los dos alelos en cada locus. En la etapa de emparejamiento inicial no se tienen en cuenta las relaciones de fase entre secuencias.
En algunas partes de la divulgación se puede realizar un tipado inicial basado en la secuencia procedente de cada locus. Esta etapa es necesaria cuando la genoteca de referencia está incompleta, y realizar un emparejamiento completo en las secuencias genómicas sesgará los resultados en favor de los alelos que no están referenciados en las regiones no codificantes. En algunas partes de la divulgación se puede acometer un segundo nivel de tipado, basado en la información en los intrones. Esto permite refinar el resultado del tipado inicial para proporcionar una mejor resolución.
En algunas partes de la divulgación, la información de fase de las secuencias clonales se puede usar para proporcionar coincidencias de alelos completas e inequívocas dentro de la región secuenciada. El programa informático tratará automáticamente los casos en los que las posiciones de secuencias heterocigóticas están demasiado separadas para permitir la resolución de fase completa a lo largo de todo el consenso.
El desarrollo de la secuenciación alélica de alto rendimiento del complejo de KIR como se enseña en la presente invención es útil en estudios de asociación con enfermedades. En algunos modos de realización, la secuenciación alélica de alto rendimiento del complejo de KIR permite pronosticar una enfermedad o afección en un individuo o predecir la respuesta de un individuo a un tratamiento basándose en la identidad de los alelos de los genes KIR presentes en la muestra del individuo.
IV. Conjuntos y kits
En una parte, la divulgación comprende un conjunto de cebadores oligonucleotídicos para la secuenciación de KIR. El conjunto comprende cebadores que amplifican una parte particular de los genes KIR. Más específicamente, el conjunto incluye uno o más pares de cebadores adecuados para la amplificación de exones
o partes de exones en genes KIR. En algunas partes de la divulgación, el conjunto incluye pares de cebadores para amplificar cada exón (o parte de cada exón) en cada gen KIR presente en un paciente. Los cebadores del conjunto son preferentemente (pero no necesariamente) genéricos para todos los genes KIR, es decir, pueden amplificar el mismo exón en todos los genes KIR. Los cebadores contienen además secuencias adicionales útiles para PCR en emulsión y secuenciación clonal de alto rendimiento. Las secuencias adicionales incluyen una etiqueta de identificación individual (etiqueta MID) y un adaptador, que incluye una etiqueta de genoteca.
En algunos modos de realización, la invención es, como se define en la reivindicación 6, para amplificar y secuenciar los genes KIR. El kit de la invención típicamente comprende múltiples pares de cebadores adecuados para amplificar los exones o partes de exones de genes KIR. Los pares de cebadores comprenden un cebador directo, que comprende una región adaptadora, una etiqueta de identificación individual (etiqueta MID) y una región de hibridación con KIR; y un cebador inverso, que comprende una región adaptadora, una etiqueta de identificación individual (etiqueta MID) y una región de hibridación con KIR. El kit de la invención a menudo comprende pares de cebadores que amplifican más de un exón de más de un gen KIR de múltiples sujetos. A menudo, el kit de la invención comprende un número suficiente de pares de cebadores para determinar el genotipo de KIR para todos los genes KIR en múltiples individuos, por ejemplo, 12 o más individuos. Los cebadores pueden ser genéricos para más de un gen KIR, como se ejemplifica en la tabla 2.
En algunas partes de la divulgación, un kit puede comprender adicionalmente una o más poblaciones de microesferas que se pueden usar en PCR en emulsión. Cada microesfera se conjuga con un cebador capaz de hibridar con regiones adaptadoras de cebadores de amplificación. En algunos modos de realización, un kit puede comprender uno o más recipientes con componentes de reacción, por ejemplo, enzimas, tampones, nucleótidos, polinucleótidos de control y similares. El kit también puede incluir reactivos adicionales necesarios para PCR en emulsión y pirosecuenciación, como se describe, por ejemplo, en la publicación de solicitud de EE. UU. n.º 20100086914 y las referencias citadas en la misma.
V. Mezclas de reacción
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