ES2661089T3 - Métodos de tratamiento o prevención de los efectos secundarios adversos asociados con la administración de un agente anti-hialuronano - Google Patents

Métodos de tratamiento o prevención de los efectos secundarios adversos asociados con la administración de un agente anti-hialuronano Download PDF

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Abstract

El uso de un glucocorticoide para la formulación de un medicamento para mejorar un efecto secundario adverso asociado con el tratamiento con una enzima que degrada hialuronano, en donde la enzima que degrada hialuronano está conjugada con un polímero.

Description

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DESCRIPCION
Métodos de tratamiento o prevención de los efectos secundarios adversos asociados con la administración de un agente anti-hialuronano
Campo de la invención
Se proporcionan métodos asociados con el uso de agentes antihialuronano, tales como enzimas que degradan hialuronano, para terapia de agente único o terapia combinada.
Antecedentes
El hialuronano (ácido hialurónico; HA) es un polisacárido que se encuentra en la matriz extracelular de muchos tejidos, especialmente en los tejidos conectivos blandos. El Ha también se encuentra predominantemente en la piel, el cartílago y el líquido sinovial en los mamíferos. El hialuronano también es el constituyente principal del humor vítreo del ojo. El HA tiene un papel en diversos procedimientos fisiológicos, tal como en la homeostasis de proteínas plasmáticas y del agua (Laurent TC et al. (1992) FASEB J 6: 2397-2404). Ciertas enfermedades y trastornos están asociados con la expresión y/o la producción de hialuronano. Las hialuronidasas son enzimas que degradan el hialuronano. Al catalizar la descomposición de HA, las hialuronidasas pueden utilizarse solas o combinadas con otros agentes terapéuticos para tratar enfermedades o trastornos asociados con la acumulación de HA u otros glicosaminoglicanos.
Compendio
En la presente invención se proporciona el uso de un glucocorticoide para la formulación de un fármaco para mejorar un efecto secundario adverso asociado con el tratamiento con una enzima que degrada hialuronano, en donde la enzima que degrada hialuronano está conjugada con un polímero. Por ejemplo, el glucocorticoide puede ser cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona y prednisona, y en particular es dexametasona. En un ejemplo, el corticosteroide se administra por vía oral.
En algunos ejemplos del uso proporcionado en la presente memoria, el efecto adverso es un efecto secundario musculoesquelético. Por ejemplo, el efecto adverso es dolor muscular y articular, rigidez de las extremidades superiores, rigidez de las extremidades inferiores, calambres, miositis, malestar muscular y sensibilidad en todo el cuerpo, debilidad, fatiga y disminución del rango de movimiento en las articulaciones de la rodilla o del codo. Típicamente, el efecto adverso es aquel que da como resultado una toxicidad limitante de la dosis (TLD) de la enzima que degrada hialuronano conjugada con un polímero. El glucocorticoide se debe administrar en una cantidad para eliminar o aumentar la dosis que da como resultado la TLD de la enzima que degrada hialuronano conjugada con un polímero. En otro ejemplo, el efecto adverso es un Grado 3 en una escala de toxicidad y el glucocorticoide se administra en una cantidad para reducir el Grado a Grado 1 o Grado 2 o a Grado 3 que se resuelve a las pocas horas de la administración del glucocorticoide. La enzima que degrada hialuronano conjugada con un polímero puede administrarse por vía oral, intravenosa (IV), subcutánea, intramuscular, intratumoral, intradérmica, tópica, transdérmica, rectal o subepidérmica. El polímero puede ser un PEG y el agente anti-hialuronano una enzima PEGilada que degrada hialuronano. En la presente memoria se describen métodos para mejorar un efecto adverso de la administración sistémica de una enzima PEG que degrada hialuronano a un sujeto. Los métodos implican administrar sistémicamente una enzima PEGilada que degrada hialuronano, particularmente una hialuronidasa PEGilada, tal como cualquiera de las hialuronidasas animales o bacterianas, al sujeto y administrar una cantidad de un glucocorticoide suficiente para mejorar el efecto adverso. En un ejemplo de los métodos proporcionados, el glucocorticoide se administra por vía oral. En otro ejemplo, la enzima PEGilada que degrada hialuronano se administra por vía intravenosa. La administración del glucocorticoide y/o la enzima PEGilada que degrada hialuronano puede efectuarse sistémicamente por cualquier ruta adecuada, tal como, por ejemplo, por vía intravenosa, oral o intramuscular.
En una realización específica, los efectos adversos asociados con la administración de una enzima PEGilada que degrada hialuronano son efectos secundarios musculoesqueléticos. Los efectos secundarios musculoesqueléticos incluyen, por ejemplo, dolor muscular y articular, rigidez de extremidades superiores e inferiores, calambres, miositis, malestar muscular y sensibilidad en todo el cuerpo, debilidad, fatiga y/o disminución en la amplitud de movimiento en las articulaciones de rodilla y codo .
En algunos ejemplos, el glucocorticoide se selecciona entre cortisonas, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona y prednisona. En un ejemplo particular, el glucocorticoide es una dexametasona.
En los métodos descritos, el glucocorticoide se administra antes, junto con, intermitentemente o después de la administración de la enzima PEGilada que degrada hialuronano. En una realización de los métodos, el glucocorticoide se coadministra con la enzima PEGilada que degrada hialuronano. Por ejemplo, el glucocorticoide se
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administra antes de la administración de la enzima PEGilada que degrada hialuronano. En este ejemplo, el corticosteroide se administra a, o aproximadamente a, 0,5 minutos, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 6 minutos, 7 minutos, 8 minutos, 9 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 25 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas o más antes de la administración de la enzima PEGilada que degrada hialuronano. En un ejemplo concreto, la administración del glucocorticoide es al menos a, o aproximadamente a, 1 o más horas antes de la administración de la enzima PEGilada que degrada hialuronano.
En otra descripción de los métodos, el glucocorticoide se administra posteriormente a la administración de la enzima PEGilada que degrada hialuronano. Por ejemplo, el glucocorticoide se administra a aproximadamente 0,5 minutos, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 6 minutos, 7 minutos, 8 minutos, 9 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 25 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas o más después de la administración de la enzima PEGilada que degrada hialuronano. En otro ejemplo, la administración del glucocorticoide es al menos de 8 horas a 12 horas después de la administración de la enzima PEGilada que degrada hialuronano.
En otra descripción más de los métodos, el glucocorticoide se administra antes y después de la administración de la enzima PEGilada que degrada hialuronano. Por ejemplo, el glucocorticoide se administra de uno a cinco minutos inmediatamente antes de la administración de la enzima PEGilada que degrada hialuronano y ocho horas después de la administración de la enzima PEGilada que degrada hialuronano. En otro ejemplo, el glucocorticoide se administra una hora antes de la administración de la enzima PEGilada que degrada hialuronano y de ocho a doce horas después de la administración de la enzima PEGilada que degrada hialuronano. En los métodos proporcionados en la presente memoria, se contempla cualquier régimen de dosificación siempre que el tiempo de dosificación del glucocorticoide mejore los uno o más efectos secundarios asociados con la administración de la enzima PEGilada que degrada hialuronano.
En alguna descripción de los métodos, el glucocorticoide se administra en una cantidad entre, o aproximadamente entre, 0,1 y 20 mg, 0,1 y 15 mg, 0,1 y 10 mg, 0,1 y 5 mg, 0,2 y 20 mg, 0,2 y 15 mg, 0,2 y 10 mg, 0,2 y 5 mg, 0,4 y 20 mg, 0,4 y 15 mg, 0,4 y 10 mg, 0,4 y 5 mg, 0,4 y 4 mg, 1 y 20 mg, 1 y 15 mg o 1 y 10 mg. En una realización concreta, el corticosteroide se administra en una cantidad entre, o aproximadamente entre, 0,4 y 20 mg. Las dosis ilustrativas de glucocorticoides son cualquier dosis que mejore los uno o más efectos secundarios asociados con la administración de la enzima PEGilada que degrada hialuronano.
En una descripción de los métodos, la enzima PEGilada que degrada hialuronano se administra en una cantidad de, o de aproximadamente, 0,0005 mg/kg, 0,0006 mg/kg, 0,0007 mg/kg, 0,0008 mg/kg, 0,0009 mg/kg, 0,001 mg/kg, 0,0016 mg/kg, 0,002 mg/kg, 0,003 mg/kg, 0,004 mg/kg, 0,005 mg/kg, 0,006 mg/kg, 0,007 mg/kg, 0,008 mg/kg, 0,009 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,016 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,07 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,09 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,30 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,40 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,55 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,7 mg/kg, 0,8 mg/kg, 0,9 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1,7 mg/kg, 1,8 mg/kg, 1,9 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 3,5 mg/kg, 4 mg/kg, 4,5 mg/kg, 5 mg/kg, 5,5 mg/kg, 6 mg/kg, 6,5 mg/kg, 7 mg/kg, 7,5 mg/kg, 8 mg/kg, 8,5 mg/kg, 9 mg/kg, 9,5 mg/kg o 10 mg/kg de la masa del sujeto a quien se administra.
En otra descripción de los métodos, la enzima PEGilada que degrada hialuronano se administra en una cantidad de, o de aproximadamente 10 Unidades/kg (U/kg), 16 U/kg, 32 U/kg, 64 U/kg, 100 U/kg, 200 U/kg, 300 U/kg, 400 U/kg, 500 U/kg, 600 U/kg, 700 U/kg, 800 U/kg, 900 U/kg, 1.000 U/kg, 2.000 U/kg, 3.000 U/kg, 4.000 U/kg, 5.000 U/kg,
6.000 U/kg, 7.000 U/kg, 8.000 U/kg, 9.000 U/kg, 10.000 U/kg, 12.800 U/kg, 20.000 U/kg, 32.000 U/kg, 40.000 U/kg,
50.000 U/kg, 60.000 U/kg, 70.000 U/kg, 80.000 U/kg, 90.000 U/kg, 100.000 U/kg, 120.000 U/kg, 140.000 U/kg,
160.000 U/kg, 180.000 U/kg, 200.000 U/kg, 220.000 U/kg, 240.000 U/kg, 260.000 U/kg, 280.000 U/kg, 300.000 U/kg,
320.000 U/kg, 350.000 U/kg, 400.000 U/kg, 450.000 U/kg, 500.000 U/kg, 550.000 U/kg, 600.000 U/kg, 650.000 U/kg,
700.000 U/kg, 750.000 U/kg, 800.000 U/kg de la masa del sujeto a quien se administra.
En una descripción concreta del método, la enzima PEGilada que degrada hialuronano se administra en una
cantidad entre, o de aproximadamente, 10 y 320.000 Unidades/kg de la masa del sujeto y el glucocorticoide se administra en una cantidad de, o de aproximadamente, 0,4 a 20 mg.
En alguna descripción del método, la enzima PEGilada que degrada hialuronano utilizada en los métodos es una hialuronidasa, por ejemplo, cualquier hialuronidasa animal o bacteriana. En algunos ejemplos, la hialuronidasa es una hialuronidasa soluble. Por ejemplo, la hialuronidasa es hialuronidasa PH20 soluble que se selecciona entre una PH20 humana, de mono, de bóvido, de óvido, de rata, de ratón o de cobaya. En un ejemplo concreto, la hialuronidasa es PH20 humana. En otros ejemplos, la hialuronidasa es una hialuronidasa derivada de un animal. Por ejemplo, la hialuronidasa es una hialuronidasa derivada de un animal seleccionada entre una hialuronidasa testicular bovina purificada o una hialuronidasa testicular ovina purificada. En un aspecto particular del método, la enzima PEGilada que degrada hialuronano es PH20 PEGilada (PH20PEG) y el glucocorticoide es dexametasona.
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En una realización, la hialuronidasa utilizada en los métodos descritos en la presente memoria es neutra activa y N- glicosilada. En algunos aspectos, el polipéptido de hialuronidasa neutra activa y N-glicosilada es una PH20 completa o es una forma truncada C-terminal de PH20, en donde PH20 completa tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEC ID NO: 1. En otros aspectos, el polipéptido de hialuronidasa neutra activa y N-glicosilada tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con el polipéptido o la forma truncada de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1. En otro aspecto más, el polipéptido de hialuronidasa neutra activa y N- glicosilada es una PH20 completa o es una forma truncada C-terminal de PH20, que tiene sustituciones de aminoácidos, por lo que el polipéptido de hialuronidasa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85%, 86%, 87 %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 1 o el con sus correspondientes formas truncadas. En algunos aspectos, el polipéptido de hialuronidasa utilizado en los métodos descritos en la presente memoria está codificado por una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 49. En algunos aspectos, el polipéptido de hialuronidasa utilizado en los métodos descritos en la presente memoria se secreta en células CHO. En un ejemplo concreto, la PH20 se designa rHuPH20.
En una descripción de los métodos, la hialuronidasa es un polipéptido de hialuronidasa soluble activa neutra que contiene al menos un radical de azúcar ligado a N. En un aspecto particular, el radical de azúcar ligado a N se une covalentemente a un residuo de asparragina del polipéptido. En otro aspecto, la hialuronidasa está glicosilada en al menos dos sitios.
En algunos aspectos, la hialuronidasa utilizada en los métodos descritos en la presente memoria, la hialuronidasa soluble tiene una secuencia de aminoácidos incluida en SEQ ID NO: 1 o una secuencia que tiene al menos aproximadamente 91% de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos incluida en SEQ ID NO: 1, por lo que la hialuronidasa es soluble y está truncada en el extremo C en un residuo de aminoácido que se encuentra entre los residuos de aminoácido 467 a 483, inclusive, de SEQ ID NO: 1 o residuos correspondientes en un polipéptido que tiene aproximadamente 91% de identidad de secuencia con el mismo. En un ejemplo concreto, la hialuronidasa está codificada por una molécula de ácido nucleico que codifica los aminoácidos 1-482 de SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos 36-482 de SEQ ID NO: 1. En otros ejemplos, la hialuronidasa soluble incluye al menos los residuos de aminoácido 36-464 de SEQ ID NO: 1. En otros ejemplos, la hialuronidasa incluye una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 que está truncada en un residuo de aminoácido que está o está entre los residuos de aminoácido 467 a 483. Por ejemplo, la hialuronidasa puede incluir una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 que está truncada en un residuo de aminoácido seleccionado entre los residuos de aminoácido 467, 477, 478, 479, 480, 481, 482 y 483. En otros ejemplos, la hialuronidasa incluye una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 que está truncada en un residuo seleccionado entre los residuos de aminoácido 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 y 500. En algunos aspectos, el polipéptido de hialuronidasa utilizado en los métodos proporcionados en la presente memoria es una forma truncada C-terminal producida y secretada en células de mamífero. En un ejemplo concreto, las células de mamífero son células CHO.
En los métodos descritos en la presente memoria, la enzima que degrada hialuronano está PEGilada. En un ejemplo concreto, los radicales de PEG son ramificados. En algunos ejemplos, los radicales de PEG se seleccionan entre mPEG-SBA (5 kDa), mPEG-SBA (20 kDa), mPEG-SBA (30 kDa), mPEG-SMB (20 kDa), mPEG-SMB (30 kDa), mPEG-butiraldehído (30 kDa), mPEG-SPA (20 kDa), mPEG-SPA (30 kDa), mPEG2-NHS (10 kDa ramificado), mPEG2-NHS (20 kDa ramificado), mPEG-NHS (40 kDa ramificado), mPEG2-NHS (60 kDa ramificado), PEG-NHS- biotina (5 kDa biotinilado), PEG-p-nitrofenil-carbonato (30 kDa) y PEG-propionaldehído (30 kDa).
En los métodos descritos en la presente memoria, los efectos adversos pueden ser el resultado del tratamiento por el agente anti-hialuronano de una enfermedad o afección asociadas a hialuronano. En un ejemplo, la enfermedad o afección asociadas al hialuronano es una que está asociada con una alta presión de fluido intersticial, un cáncer, edema, presión del disco y una enfermedad inflamatoria. Por ejemplo, una enfermedad o afección que son edema pueden ser causadas por un trasplante de órgano, accidente cerebrovascular o trauma cerebral. En otro ejemplo, una enfermedad o afección inflamatoria incluyen artritis reumatoide, esclerodermia, periodontitis, psoriasis, aterosclerosis, heridas crónicas, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y enfermedad inflamatoria intestinal.
En un ejemplo adicional, el efecto adverso es el resultado del tratamiento por el agente anti-hialuronano de un cáncer que es un tumor, por ejemplo, un tumor sólido. El tumor puede ser uno que tiene un aumento de expresión celular y/o estromal de un hialuronano, en comparación con un tejido no canceroso del mismo tipo de tejido o en comparación con un tumor no metastásico del mismo tipo tumoral. En un ejemplo, el cáncer es un cáncer en estadio tardío, un cáncer metastásico y un cáncer indiferenciado. En otro ejemplo, el cáncer es cáncer de ovario, carcinoma in situ (CIS), carcinoma de células escamosas (CCE), cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de mama, cáncer de cerebro o cáncer de colon.
También se proporcionan en la presente memoria composiciones que contienen un glucocorticoide para uso en la
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mejora de los efectos adversos asociados con el tratamiento con un agente anti-hialuronano, en donde el agente anti-hialuronano es una enzima que degrada hialuronano conjugada con un polímero. También se describen en la presente memoria métodos de tratamiento y usos de una enzima que degrada hialuronano conjugada con polímero (es decir una enzima que degrada hialuronano modificada por conjugación a un polímero) para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección asociadas a hialuronano. En tales métodos o usos, la enzima que degrada hialuronano se administra en un intervalo de dosificación o una cantidad de entre aproximadamente 0,01 pg/kg (del sujeto) a 15 pg/kg. Por ejemplo, en los métodos descritos en la presente memoria, se administra una enzima que degrada hialuronano en una cantidad de intervalo de dosificación de entre, o de aproximadamente, 0,05 pg/kg a 10 pg/kg, 0,75 pg/kg a 7,5 pg/kg o 1,0 pg/kg a 3,0 pg/kg. La frecuencia de administración es dos veces por semana, una vez a la semana, una vez cada 14 días, una vez cada 21 días o una vez al mes. En ejemplos concretos, la enzima que degrada hialuronano se administra en un régimen de dosificación en el que el ciclo de administración es de una semana, dos semanas, tres semanas o cuatro semanas. El ciclo de administración puede repetirse una pluralidad de veces. Además, en algunos ejemplos, después de un ciclo de administración, la administración se interrumpe durante un período de tiempo predeterminado y a continuación se reanuda en un ciclo de administración posterior. En algunos ejemplos, la frecuencia de administración en el primer ciclo de administración es la misma que la frecuencia de administración en ciclos de administración posteriores. En un ejemplo concreto, la enzima que degrada hialuronano se administra dos veces a la semana en el primer ciclo de administración y una vez a la semana para ciclos posteriores de administración. En tales ejemplos, el ciclo de administración es de 4 semanas.
Por ejemplo, la enzima que degrada hialuronano se utiliza o formula para administración de dosificación única de una cantidad en un intervalo entre o de aproximadamente entre 0,5 pg a 1450 pg o 150 Unidades (U) a 45.000 Unidades para tratar una enfermedad o afección asociadas con el hialuronano. En tales métodos y usos, la enzima que degrada hialuronano puede administrarse como una dosificación unitaria de 0,5 pg a 1450 pg o de 150 Unidades (U) a 45.000 Unidades a una frecuencia de al menos una vez a la semana durante un ciclo de al menos 4 semanas. En ejemplos concretos, la administración de dosificación única o dosis unitaria es de una cantidad en un intervalo entre o de aproximadamente entre 0,75 pg y 1125 pg; 3,75 pg a 750 pg; 56 pg a 565 pg; o 75 pg a 225 pg. En otros ejemplos, la administración de dosificación única o dosis unitaria está en un intervalo entre o de aproximadamente entre 24 unidades (U) a 36.000 U; 120 U a 24.000 U; 1500 U a 18.000 U; o 2400 U a 7200 U.
En cualquiera de los métodos o usos descritos en la presente memoria, en particular para tratar una enfermedad o afección asociadas con el hialuronano, la expresión del hialuronano en una muestra del sujeto se mide antes del tratamiento. La enfermedad o afección asociadas al hialuronano se asocia con una presión alta del líquido intersticial, un cáncer, edema, presión del disco o una enfermedad inflamatoria. Por ejemplo, la enfermedad o afección pueden ser un edema causado por un trasplante de órgano, accidente cerebrovascular o trauma cerebral. En otros ejemplos, la enfermedad o afección es una enfermedad inflamatoria que es artritis reumatoide, esclerodermia, periodontitis, psoriasis, aterosclerosis, heridas crónicas, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa o enfermedad inflamatoria intestinal. En ejemplos concretos, la enfermedad o afección es cáncer y el cáncer es un tumor. Por ejemplo, la enfermedad o afección es un tumor sólido. El tumor puede ser uno que tiene un aumento de expresión celular y/o estromal de un hialuronano, en comparación con un tejido no canceroso del mismo tipo de tejido o en comparación con un tumor no metastásico del mismo tipo tumoral. Cuando la enfermedad o afección es un cáncer, el cáncer es un cáncer en estadio tardío, un cáncer metastásico o un cáncer indiferenciado. Por ejemplo, el cáncer es cáncer de ovario, carcinoma in situ (CIS), carcinoma de células escamosas (CCE), cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de mama, cáncer de cerebro o cáncer de colon.
Cualquiera de las enzimas que degradan hialuronano descritas en la presente memoria o conocidas en la técnica se puede utilizar en los métodos o usos para tratar una enfermedad o afección asociadas con el hialuronano. En algunos ejemplos, se puede administrar adicionalmente un corticosteroide. Por ejemplo, un corticosteroide es un glucocorticoide. Por ejemplo, el corticosteroide es un glucocorticoide que es una cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona o prednisona. En un ejemplo concreto, el glucocorticoide es una dexametasona.
En algunas realizaciones de los métodos descritos en la presente memoria, los métodos implican adicionalmente una etapa de administración de un segundo agente o tratamiento. En algunos aspectos, el segundo agente o tratamiento es un tratamiento contra el cáncer, tal como, por ejemplo, cirugía, radiación, un agente quimioterapéutico, un agente biológico, un polipéptido, un anticuerpo, un péptido, una molécula pequeña, un vector de terapia genética, un virus o ADN. En ejemplos concretos, el segundo agente es un tratamiento contra el cáncer seleccionado entre Acivicinas; Aclarrubicinas; Acodazoles; Acroninas; Adozelesinas; Aldesleuquinas; Alemtuzumabs; Alitretinoinas (Ácidos 9-Cis-Retinoicos); Alopurinoles; Altretaminas; compuestos de Alvocidib; Ambazonas; Ambomininas; Ametantronas; Amifostinas; Aminoglutetimidas; Amsacrinas; Anastrozoles; Anaxironas; Ancitabinas; Antramicinas; Apazicuonas; Argimesnas; Trióxidos de arsénico; Asparraginasas; Asperlinas; Atrimustinas; Azacitidinas; Azetepas; Azotomicinas; Banoxantronas; Batabulinas; Batimastatos; BCG Vivo; Benaxibinas; Bendamustinas; Benzodepas; Bexarotenos; Bevacizumab; Bicalutamidas; Bietaserpinas; Bricodares; Bisantrenos;
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Bisantrenos; Dimesilatos de Bisnafida; Bizelesinas; Bleomicinas; compuestos de Bortezomib; compuestos de Brequinar; Bropiriminas; Budotitanos; Busulfanos; Cactinomicinas; Calusteronas; compuestos de Canertinib; Capecitabinas; Caracemidas; Carbetímeros; Carboplatinos; Carboquonas; Carmofures; Carmustinas con Polifeprosanos; Carmustinas; Carubicinas; Carzelesinas; Cedefingoles; compuestos de Celecoxib; Cemadotinas; Clorambucilos; compuestos de Cioteronel; Cirolemicinas; Cisplatinos; Cladribinas; Clanfenures; Clofarabinas; Crisnatoles; Ciclofosfamidas; compuestos Liposomales de citarabina; Citarabinas; Dacarbazinas; Dactinomicinas; Darbepoetinas Alfa; compuestos Liposomales de Daunorrubicina; Daunorrubicinas/Daunomicinas; Daunorrubicinas; Descitabinas; compuestos de Denileuquin Diftitox; Dexniguldipinas; Dexonaplatinos; Dexrazoxanos; Dezaguaninas; Diaziquonas; compuestos de Dibrospidio; compuestos de Dienogest; Dinalinas; Disermolida; compuestos de Docetaxel; compuestos de Dofequidar; Doxifluridinas; compuestos Liposomales de doxorrubicina; Doxorrubicina HCL; inyección liposomal de Doxorrubicina HCL; Doxorrubicinas; Droloxifenos; Propionatos de Dromostanolona; Duazomicinas; Ecomustinas; Edatrexatos; Edotecarinas; Eflomitinas; compuestos de Elacridar; Elinafidas; Soluciones B de Elliott; Elsamitrucinas; Emitefures; Enloplatinos; Enpromatos; Enzastaurinas; Epipropidinas; Epirrubicinas; Epoetinas alfa; Eptaloprost; Erbulozoles; Esorubicinas; Estramustinas; Etanidazoles; Etoglucidas; fosfatos de Etopósido; Etoposido VP-16s; Etopósidos; Etoprinas; Exemestanos; Exisulindas; Fadrozoles; Fazarabinas; Fenretinidas; compuestos de Filgrastim; Floxuridinas; Fludarabinas; Fluorouracilos; 5-fluorouracilos; Fluoxiimesteronas; Flurocitabinas; Fosquidonas; Fostriecinas; Fostriecinas; Fotretaminas; compuestos de Fulvestrant; Galarrubicinas; Galocitabinas; Gemcitabinas; compuestos de Gemtuzumab/Ozogamicinas; Geroquinoles; Gimatecanos; Gimeracilos; Gloxazonas; Glufosfamidas; Acetatos de goserelina; Hidroxiureas; compuestos de Ibritumomab/Tiuxetanos; Idarrubicinas; Ifosfamidas; Ilmofosinas; compuestos de Ilomastat; Mesilatos de imatinib; Imexonas; Improsulfanos; compuestos de Indisulam; Inproquonas; Interferón alfa-2as; Interferón alfa- 2bs; Interferones Alfa; Interferones Beta; Interferones Gamma; Interferones; Interleucina-2s y otras interleucinas (incluidas las interleucinas recombinantes); Intoplicinas; Iobenguanos [131-I]; Iproplatinos; Irinotecanos; Irsogladinas; Ixabepilonas; Cetotrexatos; L-alanosinas; Lanreotidas; compuestos de Lapatinib; Ledoxantronas; Letrozoles; Leucovorinas; Leuprolidas; Leuprorelinas (Leuprorelidas); Levamisoles; Lexacalcitoles; Liarozoles; Lobaplatinos; Lometrexoles; Lomustinas/CCNU; Lomustinas; compuestos de Lonafarnib; Losoxantronas; Lurtotecanos; Mafosfamidas; Manosulfanos; compuestos de Marimastat; Masoprocoles; Maitansinas; Mecloretaminas; Mecloretaminas/mostazas nitrogenadas; Acetatos de Megestrol; Megestroles; Melengestroles; compuestos de Melfalán; compuestos de MelfalánlL-PAM; Menogarilos; Mepitiostanos; Mercaptopurinas; 6-Mercaptopurina; Mesnas; compuestos de Metesind; Metotrexatos; Metoxsalenos; Metomidatos; Metoprinas; Meturedepas; Miboplatinas; Miproxifeno; Misonidazoles; Mitindomidas; Mitocarcina; Mitocrominas; Mitoflaxonas; Mitogilinas; Mitoguazonas; Mitomalcinas; Mitomicinas C; Mitomicinas; Mitonafidas; Mitoquidonas; compuestos de Mitosper; Mitotanos; Mitoxantronas; Mitozolomidas; Mivobulinas; Mizoribinas; Mofarotenos; Mopidamoles; compuestos de Mubritinib; Ácidos micofenólicos; Fenpropionatos de Nandrolona; Nedaplatinos; Nelzarabinas; Nemorubicinas; Nitracrinas; Nocodazoles; compuestos de Nofetumomab; Nogalamicinas; compuestos de Nolatrexed; Nortopixantronas; Octreótidos; Oprelvequinas; Ormaplatinas; compuestos de Ortataxel; Oteracilos; Oxaliplatinos; Oxisuranos; Oxofenarsinas; compuestos de Paclitaxel; Pamidronatos; Patubilonas; Pegademasas; Pegaspargasas; compuestos de Pegfilgrastim; Peldesinas; Peliomicinas; Pelitrexoles; compuestos de Pemetrexed; Pentamustinas; Pentostatinas; Peplomicinas; Perfosfamidas; Perifosinas; Picoplatinos; Pinafidas; Pipobromanos; Piposulfanos; Pirfenidonas; Piroxantronas; Pixantronas; compuestos de Plevitrexed; Mitramicinas Plicamicidas; Plicamicinas; Plomestanos; Plomestanos; Porfímero sódico; Porfimeros; Porfiromicinas; Prednimustinas; Procarbazinas; Propamidinas; Prospidios; Pumitepas; Puromicinas; Pirazofurinas; Quinacrinas; Ranimustinas; Rasburicasas; Riboprinas; Ritrosulfanos; compuestos de Rituximab; Rogletimidas; compuestos de Roquinimex; Rufocromomicinas; Sabarubicinas; Safingoles; compuestos de Sargramostim; Satraplatinos; Sebriplatinos; Semustinas; Simtrazenos; Sizofiranos; Sobuzoxanos; compuestos de Sorafenib; Esparfosatos; Ácidos esparfosicos; Esparsomicinas; Espirogermanios; Espiromustinas; Espiroplatinos; Espiroplatinos; Escualaminas; Estreptonigrinas; Estreptovaricinas; Estreptozocinas; Sufosfamidas; compuestos de Sulofenur; Malato de Sunitinib; 6-tioguanina (6-TG); Tacedinalinas; Talcos; Talisomicinas; Tallimustinas; Tamoxifenos; compuestos de Tariquidar; Tauromustinas; Tecogalanos; compuestos de Tegafur; Teloxantronas; Temoporfinas; Temozolomidas; Tenipósidos/VM-26s; Teniposidos; Teroxironas; Testolactonas; Tiamiprinas; Tioguaninas; Tiotepas; Tiamiprinas; Tiazofurinas; Tilomisoles; Tiloronas; compuestos de Timcodar; compuestos de Timonacic; Tirapazaminas; Topixantronas; Topotecanos; Toremifenos; compuestos de Tositumomab; Trabectedinas (Ecteinascidina 743); compuestos de Trastuzumab; Trestolonas; Tretinoínas/ATRA; Triciribinas; Trilostanos; Trimetrexatos; Tetranitratos de Triplatino; Triptorelinas; Trofosfamidas; Tubulozoles; compuestos de Ubenimex; Mostaza de Uracilo; Uredepas; Valrrubicinas; compuestos de Valspodar; Vapreotidas; Verteporfinas; Vinblastinas; Vincristinas; Vindesinas; Vinepidinas; Vinfluninas; Vinformidas; Vinglicinatos; Vinleucinoles; Vinleurosinas; Vinorelbinas; Vinrosidinas; Vintriptoles; Vinzolidinas; Vorozoles; Xantomicina As (Guameciclinas); Zeniplatinos; compuestos de Zilascorb [2-H]; Zinostatinas; Zoledronato; Zorrubicinas; y compuestos de Zosuquidar.
Las enzimas que degradan hialuronano ilustrativas proporcionadas en la presente memoria, que incluyen hialuronidasas solubles y las preparaciones de las mismas, se describen, por ejemplo, en las Publicaciones de EE.UU. Núm. US20040268425, US20050260186, US20060104968, US20090123367, US20090181013,
US20090181032, US20090214505, US20090253175 y US20100143457 y en la Patente de Estados Unidos Núm. 7.767.429.
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En los métodos descritos en la presente memoria, el sujeto al que se administró la enzima PEGilada que degrada hialuronano es un sujeto humano. En un aspecto particular de los métodos, el sujeto tiene cáncer y el tratamiento comprende la administración sistémica de una enzima PEGilada que degrada hialuronano.
En cualquiera de los métodos o usos descritos en la presente memoria utilizando una enzima que degrada hialuronano conjugada a un polímero, la actividad específica puede ser de al menos aproximadamente 20.000 U/mg,
25.000 U/mg, 30.000 U/mg, 31.000 U/mg, 32.000 U/mg, 33.000 U/mg, 34.000 U/mg, 35.000 U/mg, 36.000 U/mg,
37.000 U/mg, 38.000 U/mg, 39.000 U/mg, 40.000 U/mg, 45.000 U/mg, 50.000 U/mg, 55.000 U/mg, 60.000 U/mg o más.
Se proporciona adicionalmente en la presente memoria una combinación que contiene una primera composición que contiene una enzima que degrada hialuronano formulada para administración intravenosa, en donde la enzima que degrada hialuronano está conjugada con un polímero, y una segunda composición que comprende un glucocorticoide. En particular, en las combinaciones proporcionadas en la presente memoria, la enzima que degrada hialuronano es una enzima PEGilada que degrada hialuronano, tal como una PH20 PEGilada (por ejemplo, PEGPH20). En otros ejemplos de las combinaciones proporcionadas en la presente memoria, el glucocorticoide es dexametasona.
Descripción detallada
Rasgos generales
A. DEFINICIONES
B. VISIÓN GENERAL
1. Agentes anti-hialuronano y enfermedades, afecciones y/o trastornos asociados con hialuronano
2. Efectos adversos asociados con el tratamiento con agentes anti-hialuronano
3. Uso de corticosteroides para mejorar los efectos adversos de los agentes antihialuronicos
C. AGENTES ANTI-HIALURONANO
1. Agentes que inhiben la síntesis de hialuronano
2. Enzimas que degradan hialuronano
a. Hialuronidasas
i. Hialuronidasas PH20 tipo mamífero
ii. Hialuronidasas bacterianas
iii. Hialuronidasas de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos
b. Otras enzimas que degradan hialuronano
c. Enzimas que degradan hialuronano soluble
i. PH20 humana soluble
ii. rHuPH20
d. Glicosilación de enzimas que degradan hialuronano
e. Enzimas que degradan hialuronano modificadas (conjugadas con polímero) enzimas solubles que degradan hialuronano PEGiladas
D. MÉTODOS DE PRODUCCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Y POLIPEPTIDOS CODIFICADOS DE ENZIMAS QUE DEGRADAN HIALURONANO
1. Vectores y Células
2. Expresión
a. Células procariotas
b. Células de levadura
c. Células de insecto
d. Células de mamífero
e. Plantas
3. Técnicas de purificación
4. PEGilación de polipéptidos enzimáticos que degradan hialuronano
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E. CORTICOSTEROIDES
F. USO DE CORTICOSTEROIDES PARA MEJORAR LOS EFECTOS ADVERSOS DE UN AGENTE ANTIHIALURONANO
1. Composiciones y composiciones farmacéuticas
2. Dosis y administración
a. Corticosteroide
b. Agente Anti-Hialuronano
i. Leflunomida y Derivados
ii. Enzima que degrada Hialuronano
3. Tratamiento combinado
Agentes contra el cáncer y otros tratamientos
4. Embalaje y artículos de manufactura
G. MÉTODOS DE EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD Y EFECTOS DE AGENTES ANTI-HIALURONANO Y CORTICOSTEROIDES
1. Métodos para evaluar los efectos secundarios
2. Actividad Anti-Hialuronano
a. Ensayos para evaluar la actividad de una enzima que degrada hialuronano
b. Ensayos en modelos animales
c. Ensayos en humanos
d. Farmacocinética
H. USO DE AGENTES ANTI-HIALURONANO EN EL TRATAMIENTO DE LAS AFECCIONES, ENFERMEDADES Y TRASTORNOS ASOCIADOS CON EL HIALURONANO
1. Selección de sujetos para el tratamiento y evaluación de los efectos del tratamiento
a. Ensayos para la detección de marcadores de enfermedades asociadas a hialuronano
b. Detección de marcadores asociados a hialuronano en relación con muestras de control
2. Uso en el tratamiento del cáncer
I. EJEMPLOS
A. DEFINICIONES
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece o pertenecen la invención o invenciones. En caso de que haya una pluralidad de definiciones para los términos en la presente memoria, prevalecerán las de esta sección.
Según se utiliza en la presente memoria, "efecto adverso" o "efecto secundario" se refiere a un efecto perjudicial, nocivo y/o no deseado de la administración de un agente anti-hialuronano, tal como una enzima PEGilada que degrada hialuronano, tal como PEGPH20 a un sujeto. Ejemplos de efectos secundarios son los efectos secundarios musculoesqueléticos. Los efectos secundarios o los efectos adversos se clasifican según la toxicidad y existen diversas escalas de toxicidad que proporcionan definiciones para cada grado. Ejemplos de tales escalas son las escalas de toxicidad de los Criterios Comunes de Toxicidad del Instituto Nacional del Cáncer versión 2.0, la Organización Mundial de la Salud o la escala de Criterios de Terminología Común para Eventos Adversos (CTCAE). En general, la escala es la siguiente: Grado 1 = efectos secundarios leves; Grado 2 = efectos secundarios moderados; Grado 3 = efectos secundarios graves; Grado 4 = efectos secundarios que amenazan o incapacitan la vida; Grado 5 = Fatal. La asignación de grados de gravedad está dentro de la experiencia de un médico u otro profesional de la salud.
Según se utiliza en la presente memoria, una toxicidad limitante de la dosis (TLD) se refiere a la dosis de un fármaco que produce efectos secundarios lo suficientemente graves como para evitar que se administren dosis mayores. Está dentro del nivel de conocimiento práctico de un médico experto asignar o determinar una TLD dependiendo del protocolo de tratamiento, la enfermedad que se vaya a tratar, el régimen de dosificación y el paciente concreto que se vaya a tratar. Una definición ilustrativa de TLD para el tratamiento con un agente anti-hialuronano (en ausencia de
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un corticosteroide o en su presencia) es la dosis en la que se observa un evento adverso o efecto secundario relacionado con el tratamiento anti-hialuronano y que se define en una escala de toxicidad de al menos Grado 3 o superior y es una toxicidad no hematológica, o una toxicidad de Grado 2 continua o persistente que no se resuelve en el transcurso del tratamiento y que limita la capacidad del paciente para cumplir con el protocolo terapia, o cualquier toxicidad hematológica de Grado 4 o prolongada de Grado 3. Los TLD no incluyen las náuseas o los vómitos que ocurrieron sin una terapia antiemética profiláctica y que pueden tratarse eficazmente con dicha terapia, o efectos secundarios que se resuelven solos en unas pocas horas a 24 horas.
Según se utiliza en la presente memoria, "efecto musculoesquelético" o "efecto secundario musculoesquelético" se refiere a los efectos sobre el sistema de músculos, tendones, ligamentos, huesos, articulaciones y tejidos asociados. Los efectos secundarios musculoesqueléticos incluyen dolor muscular y articular, rigidez de extremidades superiores e inferiores, calambres, miositis, malestar muscular y sensibilidad en todo el cuerpo, debilidad, fatiga y una disminución en la amplitud de movimiento en las articulaciones de rodilla y codo. Está dentro del nivel de un médico calificado asignar grados de gravedad de los efectos secundarios musculoesqueléticos observados o medidos en función de las escalas de toxicidad. También está dentro del nivel de un médico calificado asignar una TLD a un efecto secundario musculoesquelético observado.
Según se utiliza en la presente memoria, "mejorar" o "reducir" un efecto secundario o evento adverso, o variaciones de los mismos, se refiere a la disminución de los efectos adversos o efectos secundarios, ya sean permanentes o temporales, duraderos o transitorios. Para los fines de la presente memoria, se considera que un efecto secundario de un agente anti-hialuronano administrado, tal como un efecto secundario musculoesquelético, se mejora con un corticosteroide cuando hay una reducción o disminución en el grado de gravedad medido en una escala de toxicidad para el efecto secundario en presencia del corticosteroide en comparación con su ausencia. En un ejemplo, un efecto secundario se mejora cuando la toxicidad observada o medida de un agente anti-hialuronano administrado (observado después de la administración de dosis única, administración de dosificación múltiple o en virtud del régimen de dosificación) de Grado 3 o superior se reduce a un Grado 1 o Grado 2 en presencia de un corticosteroide. En otro ejemplo, se mejora un efecto secundario cuando la TLD de un agente anti-hialuronano administrado se elimina o aumenta después de la administración del corticosteroide. Por ejemplo, se mejora un efecto secundario cuando se elimina o aumenta una TLD de 0,05 mg/mL de un agente anti-hialuronano administrado mediante la administración de un corticosteroide al sujeto, de manera que la misma dosis o una dosis más alta de agente anti-hialuronano puede administrarse con un efecto secundario reducido o cuando la TLD se aumenta a más de 0,05 mg/ml, tal como 0,5 mg/mL.
Según se utiliza en la presente memoria, "prevenir'' un efecto secundario significa reducir o disminuir el riesgo de manifestación de un efecto secundario y es profiláctico. Por lo tanto, para evitar un efecto secundario como se describe en la presente memoria, se administra un tratamiento, por ejemplo, un corticosteroide, antes de que se manifiesten los efectos secundarios, es decir, antes o con la administración de un agente anti-hialuronano.
Según se utiliza en la presente memoria, "administración intravenosa" se refiere a la administración de un agente terapéutico directamente a una vena.
Según se utiliza en la presente memoria, un agente anti-hialuronano se refiere a cualquier agente que modula la síntesis o degradación de hialuronano (HA), alterando de ese modo los niveles de hialuronano en un tejido o célula. Para los fines de la presente memoria, los agentes anti-hialuronano reducen los niveles de hialuronano en un tejido o célula en comparación con la ausencia del agente. Tales agentes incluyen compuestos que modulan la expresión del material genético que codifica la HA sintasa (HAS) y otras enzimas o receptores implicados en el metabolismo del hialuronano, o que modulan las proteínas que sintetizan o degradan el hialuronano, incluida la función o actividad de HAS. Los agentes incluyen moléculas pequeñas, ácidos nucleicos, péptidos, proteínas u otros compuestos. Por ejemplo, los agentes anti-hialuronano incluyen, pero sin limitarse a, moléculas antisentido o efectoras, anticuerpos, enzimas, inhibidores de molécula pequeña y análogos de sustrato HAS.
Según se utiliza en la presente memoria, una enzima que degrada hialuronano se refiere a una enzima que cataliza la escisión de un polímero de hialuronano (también denominado ácido hialurónico o HA) a fragmentos de menor peso molecular. Los ejemplos de enzimas que degradan hialuronano son hialuronidasas, y condroitinasas y liasas concretas que tienen la capacidad de despolimerizar hialuronano. Las condroitinasas ilustrativas que son enzimas que degradan hialuronano incluyen, pero no se limitan a, condroitina ABC liasa (también conocida como condroitinasa ABC), condroitina AC liasa (también conocida como condroitín sulfato liasa o condroitín sulfato eliminasa) y condroitina C liasa. La condroitina ABC liasa comprende dos enzimas, condroitina-sulfato-ABC- endoliasa (Ec 4.2.2.20) y condroitina-sulfato-ABC exoliasa (EC 4.2.2.21). Las condroitin-sulfato-ABC endoliasas y condroitin-sulfato-ABC exoliasas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, las de Proteus vulgaris y Flavobacterium heparinum (la condroitin-sulfato-ABC endoliasa de Proteus vulgaris se expone en SEQ ID NO: 98; Sato et al. (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41(1): 39-46) Las enzimas de condroitinasa AC ilustrativas de bacterias incluyen, pero no se limitan a, las de Flavobacterium heparinum, Victivallis vadensis, expuestas en SEQ ID NO: 99, y Arthrobacter aurescens (Tkalec et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35; Ernst et al. (1995) Critical
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Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444) Las enzimas de condroitinasa C ilustrativas de bacterias incluyen, pero no se limitan a, las de Streptococcus y Flavobacterium (Hibi et al. (1989) FEMS-Microbiol- Lett. 48(2):121-4; Michelacci et al. (1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8; Tsuda et al. (1999) Eur. J. Biochem. 262:127- 133).
Según se utiliza en la presente memoria, hialuronidasa se refiere a una clase de enzimas que degradan hialuronano. Las hialuronidasas incluyen hialuronidasas bacterianas (EC 4.2.2.1 o EC 4.2.99.1), hialuronidasas de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos (EC 3.2.1.36), e hialuronidasas de tipo mamífero (EC 3.2.1.35). Las hialuronidasas incluyen cualquiera de origen no humano que incluye, pero sin limitarse a, murino, canino, felino, leporino, aviar, bovino, ovino, porcino, equino, de peces, de ranas, bacteriano y cualquiera de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos. Las hialuronidasas no humanas ilustrativas incluyen, hialuronidasas de vacas (SEQ ID NO: 10, 11, 64 y BH55 (Patentes de Estados Unidos Núm. 5.747.027 y 5.827.721), avispa chaqueta amarilla (SEQ ID NO: 12 y 13), abeja melífera (SEQ ID NO: 14), avispón de cara blanca (SEQ ID NO: 15), avispa de papel (SEQ ID NO: 16), ratón (SEC. ID NOS: 17-19, 32), cerdo (SEQ ID NO: 20-21), rata (SEQ ID NO: 22-24, 31), conejo (SEQ ID NO: 25), oveja (SEQ ID NO: 26, 27, 63 y 65), chimpancé (SEQ ID NO: 101), mono Rhesus (SEQ ID NO: 102), orangután (SEQ ID NO: 28), mono cynomolgus (SeQ iD NO: 29), cobaya (SEQ ID NO: 30), Arthrobacter sp. (cepa FB24) (SEQ ID NO: 67), Bdellovibrio bacteriovorus (SEQ ID NO: 68), Propionibacterium acnes (SEQ ID NO: 69), Streptococcus agalactiae ((SEQ ID NO: 70); 18RS21 (SEQ ID NO: 71); serotipo la (SEQ ID NO: 72); serotipo III (SEQ ID NO: 73), Staphylococcus aureus (cepa COL (SEQ ID NO: 74); cepa MRSA252 (SEQ ID NO: 75 y 76); cepa MSSA476 (SeQ ID NO: 77); cepa NCTC 8325 (SEQ ID NO: 78); cepa bovina RF122 (SEQ ID NO: 79 y 80); cepa USA300 (SEQ ID NO: 81), Streptococcus pneumoniae ((SEQ ID NO: 82); cepa ATCC BAA-255/R6 (SEQ ID NO: 83); serotipo 2, cepa D39/NCTC 7466 (SEQ ID NO: 84), Streptococcus pyogenes (serotipo M1) (SEQ ID NO: 85); serotipo M2, cepa MGAS10270 (SEQ ID NO: 86); serotipo M4, cepa MGAS10750 (SEQ ID NO: 87); serotipo M6 (SEQ ID NO: 88); serotipo M12, cepa MGAS2096 (SEQ ID NO: 89 y 90); serotipo M12, cepa MGAS9429 (SeQ ID NO: 91); serotipo M28 (SEQ ID NO: 92); Streptococcus suis (SEQ ID NO: 93-95); Vibrio fischeri (cepa ATCC 700601/ES114 (SEQ ID NO: 96)), y la enzima hialuronidasa de Streptomyces hyaluronolyticus, que es específica para el ácido hialurónico y no escinde la condroitina o el condroitin sulfato (Ohya, T. y Kaneko, Y. (1970) Biochim. Biophys. Acta 198:607). Las hialuronidasas también incluyen las de origen humano. Las hialuronidasas humanas ilustrativas incluyen HYAL1 (SEQ ID NO: 36), HYAL2 (SEQ ID NO: 37), HYAL3 (SEQ ID NO: 38), HYAL4 (SEQ ID NO: 39) y PH20 (SEQ ID NO: 1). Entre las hialuronidasas también se incluyen hialuronidasas solubles, que incluyen PH20 ovina y bovina, PH20 humana soluble y rHuPH20 soluble. Los ejemplos de hialuronidasas solubles bovinas u ovinas comercialmente disponibles incluyen Vitrase® (hialuronidasa ovina), Amphadase® (hialuronidasa bovina) e Hydase™ (hialuronidasa bovina).
Según se utiliza en la presente memoria, "hialuronidasa testicular bovina purificada" se refiere a una hialuronidasa bovina purificada a partir de extractos testiculares bovinos (véanse las Patentes de Estados Unidos Núm. 2.488.564, 2.488.565, 2.806.815, 2.808.362, 2.676.139, 2.795.529, 5.747.027 y 5.827.721) Los ejemplos de hialuronidasas testiculares bovinas purificadas comercialmente disponibles incluyen Amphadase® e Hydase™, e hialuronidasas bovinas, que incluyen, pero no se limitan a, las disponibles de Sigma Aldrich, Abnova, EMD Chemicals, GenWay Biotech, Inc., Raybiotech, Inc. y Calzyme. También se incluyen hialuronidasas bovinas producidas recombinantemente, tales como, pero sin limitarse a, aquellas generadas por la expresión de una molécula de ácido nucleico expuesta en cualquiera de los SEQ ID NO: 190-192.
Según se utiliza en la presente memoria, "hialuronidasa testicular ovina purificada" se refiere a una hialuronidasa ovina purificada a partir de extractos testiculares ovinos (véanse las Patentes de Estados Unidos Núm. 2.488.564, 2.488.565 y 2.806.815 y la Solicitud PCT Internacional Núm. WO2005/118799). Los ejemplos de extracto testicular de ovino purificado comercialmente disponible incluyen Vitrase® e hialuronidasas ovinas, que incluyen, pero no se limitan a, las disponibles de Sigma Aldrich, Cell Sciences, EMD Chemicals, GenWay Biotech, Inc., Mybiosource.com y Raybiotech, Inc. También se incluyen hialuronidasas ovinas producidas recombinantemente, tales como, pero sin limitarse a, las generadas por la expresión de una molécula de ácido nucleico expuesta en cualquiera de los SEQ ID NO: 66 y 193-194.
Según se utiliza en la presente memoria, "PH20" se refiere a un tipo de hialuronidasa que se produce en los espermatozoides y es neutra-activa. El PH-20 aparece en la superficie de los espermatozoides y en el acrosoma derivado de los lisosomas, donde se une a la membrana acrosómica interna. PH20 incluye los de cualquier origen incluyendo, pero sin limitarse a, seres humanos, chimpancés, mono Cynomolgus, mono Rhesus, murino, bovino, ovino, de cobaya, conejo y rata. Los polipéptidos PH20 ilustrativos incluyen los de ser humano (SEQ ID NO: 1), chimpancé (SEQ ID NO: 101), mono Rhesus (SEQ ID NO: 102), mono Cynomolgus (SEQ ID NO: 29), vaca (p.ej., SEQ ID NO: 11 y 64), ratón (SEQ ID NO: 32), rata (SEQ ID NO: 31), conejo (SEQ ID NO: 25), oveja (SEQ ID NO: 27, 63 y 65) y cobaya (SEQ ID No: 30).
La referencia a enzimas que degradan hialuronano incluye polipéptidos enzimáticos que degradan hialuronano precursores y polipéptidos enzimáticos que degradan hialuronano maduros (tales como aquellos en los que se ha eliminado una secuencia señal), formas truncadas de los mismos que tienen actividad e incluye variantes alélicas y
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variantes de especie, variantes codificadas por variantes de empalme y otras variantes, incluyendo los polipéptidos que tienen al menos 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con los polipéptidos precursores expuestos en los SEQ ID NO: 1 y 10-48, 63-65, 67-102, o las formas maduras de los mismos. Por ejemplo, la referencia a la enzima que degrada hialuronano también incluye las variantes del polipéptido precursor de pH20 humana expuestas en los SEQ ID NO: 50-51. Las enzimas que degradan hialuronano también incluyen aquellas que contienen modificaciones químicas o postraduccionales y aquellas que no contienen modificaciones químicas o postraduccionales. Tales modificaciones incluyen, pero sin limitarse a, PEGilación, albuminación, glicosilación, farnesilación, carboxilación, hidroxilación, fosforilación y otras modificaciones polipeptídicas conocidas en la técnica. Una hialuronidasa PH20 truncada es cualquier forma abreviada C-terminal de la misma, particularmente formas que son truncadas y neutras activas cuando están N- glicosiladas.
Según se utiliza en la presente memoria, una "PH20 soluble" se refiere a cualquier forma de PH20 que sea soluble en condiciones fisiológicas. Una PH20 soluble se puede identificar, por ejemplo, por su división en la fase acuosa de una solución de Triton® X-114 a 37°C (Bordier et al., (1981) J. Biol. Chem., 256:1604-7). La PH20 anclada a la membrana, como la PH20 anclada a lípidos, incluyendo PH20 anclada a GPI, se dividirá en la fase rica en detergente, pero se dividirá en la fase pobre en detergente o acuosa después del tratamiento con Fosfolipasa-C. Entre las PH20 solubles se incluyen las PH20 ancladas a la membrana en las que una o más regiones asociadas con el anclaje de PH20 a la membrana se han eliminado o modificado, donde la forma soluble conserva la actividad hialuronidasa. La PH20 soluble también incluye PH20 soluble recombinante y las contenidas en o purificadas a partir de fuentes naturales, tales como, por ejemplo, extractos de testículos de ovejas o vacas. Un ejemplo de dicha PH20 soluble es la PH20 humana soluble.
Según se utiliza en la presente memoria, PH20 o sHuPH20 humana soluble incluye polipéptidos de PH20 que carecen de la totalidad o de una porción de la secuencia de anclaje a glicosilfosfatidilinositol (GPI) en el extremo C de manera que tras la expresión, los polipéptidos son solubles bajo condiciones fisiológicas. La solubilidad puede evaluarse mediante cualquier método adecuado que demuestre solubilidad bajo condiciones fisiológicas. Un ejemplo de tales métodos es el ensayo Triton® X-114, que evalúa la división en la fase acuosa y que se ha descrito anteriormente y en los ejemplos. Además, un polipéptido de PH20 humana soluble es, si se produce en células CHO, tales como células CHO-S, un polipéptido que se expresa y se secreta al medio de cultivo celular. Los polipéptidos de PH20 humana solubles, sin embargo, no se limitan a los producidos en células CHO, sino que se pueden producir en cualquier célula o mediante cualquier método, incluida la expresión recombinante y la síntesis de polipéptidos. La referencia a la secreción por células CHO es definitoria. Por lo tanto, si un polipéptido puede ser expresado y secretado por células CHO y es soluble, es decir, divisiones en la fase acuosa cuando se extraen con Triton® X-114, es un polipéptido de PH20 soluble, se produzca de este modo o no. Los polipéptidos precursores para los polipéptidos sHuPH20 pueden incluir una secuencia señal, tal como una secuencia señal heteróloga o no heteróloga (es decir, nativa). Los ejemplos de los precursores son aquellos que incluyen una secuencia señal, tal como la secuencia señal de 35 aminoácidos nativa en las posiciones de aminoácidos 1-35 (véanse, p.ej., los aminoácidos 1-35 de SEQ ID NO: 1).
Según se utiliza en la presente memoria, una "PH20 soluble extendida" o "esPH20" incluye polipéptidos de PH20 soluble que contienen residuos hasta la secuencia de señal de unión de anclaje de GPI y uno o más residuos contiguos de la secuencia de señal de unión del ancla de GPI de manera que esPH20 es soluble bajo condiciones fisiológicas. La solubilidad en condiciones fisiológicas se puede determinar mediante cualquier método conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo, puede evaluarse mediante el ensayo Triton® X-114 descrito anteriormente y en los ejemplos. Además, como se comentó anteriormente, una PH20 soluble es, si se produce en células CHO, tales como células CHO-S, un polipéptido que se expresa y se secreta al medio de cultivo celular. Los polipéptidos de PH20 humana soluble, sin embargo, no se limitan a los producidos en células CHO, sino que se pueden producir en cualquier célula o mediante cualquier método, incluyendo la expresión recombinante y la síntesis de polipéptidos. La referencia a la secreción por células CHO es definitoria. Por lo tanto, si un polipéptido puede ser expresado y secretado por células CHO y es soluble, es decir se divide en la fase acuosa cuando se extrae con Triton® X-114, es un polipéptido de PH20 soluble, se produzca de este modo o no. Los polipéptidos de esPH20 soluble humana incluyen, además de los residuos 36-490, uno o más aminoácidos contiguos de la posición 491 de residuos de aminoácido de SEQ ID NO: 1, inclusive, de manera que el polipéptido resultante es soluble. Los polipéptidos solubles de esPH20 humana ilustrativos son aquellos que tienen residuos de aminoácido correspondientes a los aminoácidos 36-491, 36-492, 36-493, 36-494, 36-495, 36-496 y 36-497 de SEQ ID NO: 1. Son ilustrativos de estos aquellos con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de los SEQ ID NO: 151-154 y 185-187. También se incluyen variantes alélicas y otras variantes, por ejemplo cualquiera con 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con los correspondientes polipéptidos de los SEQ ID NO: 151-154 y 185-187 que conservan actividad neutra y son solubles. La referencia a la identidad de secuencia se refiere a variantes con sustituciones de aminoácidos.
Según se utiliza en la presente memoria, la referencia a "esPH20s" incluye polipéptidos de esPH20 precursores y polipéptidos de esPH20 maduros (tales como aquellos en los que se ha eliminado una secuencia señal), formas
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truncadas de los mismos que tienen actividad enzimática (retención de al menos 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% o más de la forma de longitud completa) y son solubles, e incluye variantes alélicas y variantes de especie, variantes codificadas por variantes de empalme y otras variantes, incluidos polipéptidos que tienen al menos 40%, 45 %, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con los polipéptidos precursores establecidos en los SEQ ID NO: 1 y 3, o las formas maduras de los mismos.
Según se utiliza en la presente memoria, la referencia a las "esPH20" también incluye aquellas que contienen modificaciones químicas o postraduccionales y aquellas que no contienen modificaciones químicas o postraduccionales. Tales modificaciones incluyen, pero sin limitarse a, PEGilación, albuminación, glicosilación, farnesilación, carboxilación, hidroxilación, fosforilación y otras modificaciones polipeptídicas conocidas en la técnica.
Según se utiliza en la presente memoria, "PH20 humana recombinante soluble (rHuPH20)" se refiere a una composición que contiene LA forma soluble de PH20 humana expresada de forma recombinante y secretada en células de ovario de hámster chino (CHO). La rHuPH20 soluble está codificada por una molécula de ácido nucleico que incluye la secuencia señal y se expone en SEQ ID NO: 49. El ácido nucleico que codifica rHuPH20 soluble se expresa en células CHO que secretan el polipéptido maduro. Según se produce en el medio de cultivo, existe heterogeneidad en el extremo C de manera que el producto incluye una mezcla de especies que puede incluir una o más de SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 9 en diversa abundancia.
De forma similar, para otras formas de PH20, tales como las esPH20, los polipéptidos expresados recombinantemente y las composiciones de los mismos pueden incluir una pluralidad de especies cuyo extremo C exhibe heterogeneidad. Por ejemplo, las composiciones de esPH20 expresadas de forma recombinante producidas por la expresión del polipéptido de SEQ ID NO: 107, que codifica una esPH20 que tiene los aminoácidos 36-497, pueden incluir formas con menos aminoácidos, tales como 36-496, 36-495.
Según se utiliza en la presente memoria, un "radical ligado a N" se refiere a un residuo de aminoácido de asparragina (N) de un polipéptido que es susceptible de glicosilarse por modificación postraduccional de un polipéptido. Los radicales ligados a N ilustrativos de PH20 humana incluyen los aminoácidos N82, N166, N235, N254, N368 y N393 de PH20 humana expuestos en SEQ ID NO: 1.
Según se utiliza en la presente memoria, un "polipéptido N-glicosilado" se refiere a un polipéptido PH20 o forma truncada del mismo que contiene un enlace oligosacárido de al menos tres residuos de aminoácido ligados a N, por ejemplo, radicales ligados a N correspondientes a los residuos de aminoácido N235, N368 y N393 de SEQ ID NO: 1. Un polipéptido N-glicosilado puede incluir un polipéptido en el que tres, cuatro, cinco y hasta todos los radicales ligados a N están unidos a un oligosacárido. Los oligosacáridos ligados a N pueden incluir oligosacáridos, oligosacáridos complejos, híbridos o sulfatados u otros oligosacáridos y monosacáridos.
Según se utiliza en la presente memoria, un "polipéptido parcialmente N-glicosilado" se refiere a un polipéptido que contiene mínimamente un N-acetilglucosaminoglicano unido a al menos tres radicales ligados a N. Un polipéptido parcialmente glicosilado puede incluir diversas formas de glicano, que incluyen monosacáridos, oligosacáridos y formas de azúcar ramificadas, incluyendo las formadas por el tratamiento de un polipéptido con EndoH, EndoF1, EndoF2 y/o EndoF3.
Según se utiliza en la presente memoria, un "polipéptido de PH20 desglicosilado" se refiere a un polipéptido de PH20 en el que menos de todos los sitios de glicosilación posibles están glicosilados. La desglicosilación se puede efectuar, por ejemplo, eliminando la glicosilación, previniéndola o modificando el polipéptido para eliminar un sitio de glicosilación. Los sitios concretos de N-glicosilación no son necesarios para la actividad, mientras que otros sí lo son.
Según se utiliza en la presente memoria, "PEGilado" se refiere a la unión covalente u otra unión estable de moléculas poliméricas, tales como polietilenglicol (radical de PEGilación PEG) a enzimas que degradan hialuronano, tales como hialuronidasas, típicamente para aumentar la vida media de la enzima que degrada hialuronano.
Según se utiliza en la presente memoria, un "producto conjugado" se refiere a un polipéptido unido directa o indirectamente a uno o más polipéptidos o radicales químicos diferentes. Dichos productos conjugados incluyen proteínas de fusión, las producidas por productos conjugados químicos y las producidas por cualquier otro método. Por ejemplo, un producto conjugado se refiere a polipéptidos PH20 solubles unidos directamente o indirectamente a uno o más polipéptidos o radicales químicos, por lo que al menos un polipéptido de PH20 soluble está unido, directa o indirectamente a otro polipéptido o radical químico siempre que el producto conjugado conserve la actividad hialuronidasa.
Según se utiliza en la presente memoria, una proteína de fusión se refiere a un polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico que contiene una secuencia codificante de una molécula de ácido nucleico y la secuencia codificante de otra molécula de ácido nucleico en la que las secuencias codificantes están en el mismo
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marco de lectura de manera que cuando la construcción de fusión se transcribe y traduce en una célula anfitriona, la proteína se produce conteniendo las dos proteínas. Las dos moléculas pueden estar adyacentes en la construcción o separadas por un polipéptido enlazador que contiene 1, 2, 3 o más, pero típicamente menos de 10, 9, 8, 7 o 6 aminoácidos. El producto proteico codificado por una construcción de fusión se denomina polipéptido de fusión.
Según se utiliza en la presente memoria, un "polímero" se refiere a cualquier radical natural o sintético de alto peso molecular que está conjugado, es decir, unido de forma estable directa o indirectamente a través de un enlazador, con un polipéptido. Dichos polímeros, típicamente aumentan la semivida en suero, e incluyen, pero sin limitarse a, restos siálicos, radicales de PEGilación, dextrano y azúcar y otros radicales, tales como glicosilación. Por ejemplo, pueden conjugarse con un polímero hialuronidasas tales como una PH20 o rHuPH20 solubles.
Según se utiliza en la presente memoria, un sustrato de hialuronidasa se refiere a un sustrato (p.ej., proteína o polisacárido) que se escinde y/o despolimeriza mediante una enzima hialuronidasa. En general, un sustrato de hialuronidasa es un glicosaminoglicano. Un substrato de hialuronidasa ilustrativo es el hialuronano (HA).
Según se utiliza en la presente memoria, una enfermedad, trastorno o afección asociados con hialuronano se refieren a cualquier enfermedad o afección en la que los niveles de hialuronano están elevados como causa, consecuencia o observados de otro modo en la enfermedad o afección. Las enfermedades y afecciones asociadas a hialuronano se asocian con expresión elevada de hialuronano en un tejido o célula, aumento de la presión del líquido intersticial, disminución del volumen vascular y/o aumento del contenido de agua en un tejido. Las enfermedades, trastornos o afecciones asociados con hialuronano se pueden tratar mediante la administración de una composición que contiene un agente anti-hialuronano, como una enzima que degrada hialuronano, como una hialuronidasa, por ejemplo, una hialuronidasa soluble, sola o combinada con o además de otro tratamiento y/o agente. Las enfermedades y afecciones ilustrativas incluyen, entre otras, enfermedades inflamatorias y cánceres ricos en hialuronano. Los cánceres ricos en hialuronano incluyen, por ejemplo, tumores, incluidos tumores sólidos como cánceres en estadio avanzado, cánceres metastásicos, cánceres indiferenciados, cáncer de ovario, carcinoma in situ (CIS), carcinoma de células escamosas (CCE), cáncer de próstata, cáncer de páncreas, Cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de mama, cáncer de colon y otros cánceres. También son ilustrativas de enfermedades y afecciones asociadas a hialuronano las enfermedades que están asociadas con presión elevada de fluido intersticial, tales como enfermedades asociadas con presión de disco y edema, por ejemplo, edema causado por trasplante de órgano, accidente cerebrovascular, trauma cerebral u otra lesión. Las enfermedades y afecciones asociadas a hialuronano ilustrativas incluyen enfermedades y afecciones asociadas con presión elevada de fluido intersticial, disminución de volumen vascular y/o aumento de contenido de agua en un tejido, incluyendo cánceres, presión de disco y edema. En un ejemplo, el tratamiento de la afección, enfermedad o trastorno asociados a hialuronano incluye mejora, reducción u otro efecto beneficioso sobre uno o más de aumento de la presión de fluido intersticial (PFI), disminución del volumen vascular y aumento del contenido de agua en un tejido.
Según se utiliza en la presente memoria, los niveles elevados de hialuronano se refieren a las cantidades de hialuronano en un tejido, fluido corporal o célula en particular, que dependen de la enfermedad o afección. Por ejemplo, como consecuencia de la presencia de un tumor rico en hialuronano, los niveles de hialuronano (HA) pueden elevarse en fluidos corporales, tales como sangre, orina, saliva y suero, y/o en el tejido o célula tumoral. El nivel se puede comparar con un control convencional u otro adecuado, como una muestra comparable de un sujeto que no tiene la enfermedad asociada a HA.
Según se utiliza en la presente memoria, la actividad específica se refiere a las unidades de actividad por mg de proteína. Los miligramos de hialuronidasa se definen por la absorción de una solución a 280 nm suponiendo un coeficiente de extinción molar de aproximadamente 1,7, en unidades de M"1 cm-1.
Según se utiliza en la presente memoria, los niveles elevados de hialuronano se refieren a las cantidades de hialuronano en un tejido, fluido corporal o célula en particular, que dependen de la enfermedad o afección. Por ejemplo, como consecuencia de la presencia de un tumor rico en hialuronano, los niveles de hialuronano (HA) pueden elevarse en fluidos corporales, tales como sangre, orina, saliva y suero, y/o en el tejido o célula tumoral. El nivel se puede comparar con un control convencional u otro adecuado, tal como una muestra comparable de un sujeto que no tiene la enfermedad asociada a HA.
Según se utiliza en la presente memoria, "actividad" se refiere a una actividad o actividades funcionales de un polipéptido o porción del mismo asociados con una proteína de longitud completa (completa). Por ejemplo, los fragmentos activos de un polipéptido pueden exhibir una actividad de una proteína de longitud completa. Las actividades funcionales incluyen, pero sin limitarse a, actividad biológica, actividad catalítica o enzimática, antigenicidad (capacidad de unirse o competir con un polipéptido por la unión a un anticuerpo anti-polipéptido), inmunogenicidad, capacidad de formar multímeros y la capacidad de unirse específicamente a un receptor o ligando para el polipéptido.
Según se utiliza en la presente memoria, "actividad hialuronidasa" se refiere a la capacidad de catalizar
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enzimáticamente la escisión del ácido hialurónico. El ensayo de la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) XXII de hialuronidasa determina la actividad de hialuronidasa indirectamente al medir la cantidad de ácido hialurónico de mayor peso molecular o sustrato de hialuronano (HA) que queda después de que la enzima reaccione con el HA durante 30 minutos a 37°C (USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention, Inc., Rockville, MD). Se puede utilizar una solución Patrón de Referencia en un ensayo para determinar la actividad relativa, en unidades, de cualquier hialuronidasa. Los ensayos in vitro para determinar la actividad hialuronidasa de las hialuronidasas, tales como PH20, que incluyen PH20 soluble y esPH20, son conocidos en la técnica y se describen en la presente memoria. Los ensayos ilustrativos incluyen el ensayo de microturbidez que mide la escisión del ácido hialurónico por la hialuronidasa indirectamente detectando el precipitado insoluble formado cuando el ácido hialurónico no cortado se une con la albúmina sérica y el ensayo de ácido hialurónico biotinilado que mide la escisión del ácido hialurónico indirectamente al detectar el ácido hialurónico biotinilado restante unido de forma no covalente a los pocillos de placa de microtitulación con un producto conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante y un sustrato cromogénico. Se pueden utilizar patrones de referencia, por ejemplo, para generar una curva patrón para determinar la actividad en unidades de la hialuronidasa que se esté sometiendo a ensayo.
Según se utiliza en la presente memoria, "activa neutra" se refiere a la capacidad de un polipéptido de PH20 para catalizar enzimáticamente la escisión del ácido hialurónico a pH neutro (p.ej., a pH 7,0 o aproximadamente). Generalmente, una PH20 activa neutra y soluble, por ejemplo, una PH20 truncada en el extremo C o parcialmente N-glicosilada, tiene o tiene aproximadamente 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000% o más de actividad en comparación con la actividad hialuronidasa de una PH20 activa neutra correspondiente que no está truncada en el extremo C o N-parcialmente glicosilada.
Según se utiliza en la presente memoria, una "secuencia de señal de unión del ancla de GPI" es una secuencia de aminoácidos C-terminal que dirige la adición de un ancla de GPI preformada al polipéptido dentro del lumen del RE. Las secuencias señal de unión del ancla de GPI están presentes en los polipéptidos precursores de polipéptidos anclados a GPI, tales como polipéptidos PH20 anclados a GPI. La secuencia señal de unión del ancla de GPI C- terminal contiene típicamente una región predominantemente hidrófoba de 8-20 aminoácidos, precedida por una región espaciadora hidrófila de 8-12 aminoácidos, inmediatamente aguas abajo del sitio w, o sitio de unión del ancla de GPI. Las secuencias señal de unión del ancla de GPI se pueden identificar utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Estos incluyen, pero no están limitados a, métodos y algoritmos in silico (véanse, p.ej. Udenfriend et al. (1995) Methods Enzymol. 250:571-582, Eisenhaber et al., (1999) J. Biol. Chem. 292:741-758, Fankhauser et al., (2005) Bioinformatics 21:1846-1852, Omaetxebarria et al., (2007) Proteomics 7:1951-1960, Pierleoni et al., (2008) BMC Bioinformatics 9:392), incluyendo los que están disponibles en sitios web bioinformáticos, como el sitio de herramientas ExPASy Proteomics (p.ej., el sitio WorldWideWeb expasy.ch/tools/).
Según se utiliza en la presente memoria, los "ácidos nucleicos" incluyen ADN, ARN y análogos de los mismos, que incluyen ácidos peptidonucleicos (PNA) y mezclas de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Cuando se hace referencia a sondas o cebadores, que están opcionalmente marcados, tal como con una marca detectable, tal como una marca fluorescente o radiomarca, se contemplan moléculas monocatenarias. Dichas moléculas tienen típicamente de una longitud tal que su diana es estadísticamente única o de bajo número de copias (típicamente menos de 5, generalmente menos de 3) para sondear o cebar una biblioteca. Generalmente, una sonda o cebador contienen al menos 14, 16 o 30 nucleótidos contiguos de secuencia complementaria o idéntica a un gen de interés. Las sondas y los cebadores pueden tener 10, 20, 30, 50, 100 o más ácidos nucleicos de longitud.
Según se utiliza en la presente memoria, un péptido se refiere a un polipéptido que tiene una longitud mayor que o igual a 2 aminoácidos, y una longitud inferior o igual a 40 aminoácidos.
Según se utiliza en la presente memoria, los aminoácidos que aparecen en las diversas secuencias de aminoácidos proporcionadas en la presente memoria se identifican de acuerdo con sus abreviaturas conocidas de tres letras o una letra (Tabla 1). Los nucleótidos que se producen en los diversos fragmentos de ácido nucleico se designan con las designaciones convencionales de una sola letra utilizadas rutinariamente en la técnica.
Según se utiliza en la presente memoria, un "aminoácido" es un compuesto orgánico que contiene un grupo amino y un grupo ácido carboxílico. Un polipéptido contiene dos o más aminoácidos. Para los fines de la presente memoria, los aminoácidos incluyen los veinte aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales y análogos de aminoácidos (es decir, aminoácidos en donde el carbono a tiene una cadena lateral).
Según se utiliza en la presente memoria, "residuo de aminoácido" se refiere a un aminoácido formado tras la digestión química (hidrólisis) de un polipéptido en sus enlaces peptídicos. Se supone que los residuos de aminoácido descritos en la presente memoria están en la forma isomérica "L". Los residuos en la forma isomérica "D", que se designan así, pueden sustituirse por cualquier residuo de L-aminoácido siempre que el polipéptido conserve la propiedad funcional deseada. NH2 se refiere al grupo amino libre presente en el extremo amino de un
polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxi libre presente en el extremo carboxilo de un polipéptido. De acuerdo con la nomenclatura polipeptídica convencional descrita en J. Biol. Chem., 243: 3557-3559 (1968)), y adoptada en 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822, las abreviaturas para los residuos de aminoácido se muestran en la Tabla 1:
Tabla 1- Tabla de correspondencia
SÍMBOLO
1 Letra
3 Letras AMINOÁCIDO
Y
Tyr Tirosina
G
Gly Glicina
F
Phe Fenilalanina
M
Met Metionina
A
Ala Alanina
S
Ser Serina
I
Ile Isoleucina
L
Leu Leucina
T
Thr Treonina
V
Val Valina
P
Pro Prolina
K
Lys Lisina
H
His Histidina
Q
Gln Glutamina
E
Glu Ácido glutámico
Z
Glx Glu y/o Gln
W
Trp Triptófano
R
Arg Arginina
D
Asp Ácido aspártico
N
Asn Asparragina
B
Asx Asn y/o Asp
C
Cys Cisteína
X
Xaa Desconocido u otro
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Todas las secuencias de residuos de aminoácido representadas en la presente memoria por las fórmulas tienen una orientación de izquierda a derecha en la dirección convencional del extremo amino al extremo carboxilo. Además, la frase "residuo de aminoácido" se define para incluir los aminoácidos enumerados en la Tabla de Correspondencia (Tabla 1) y aminoácidos modificados e inusuales, tales como los mencionados en 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822, e 10 incorporados a la presente memoria como referencia. Además, debe observarse que un guión al comienzo o al final de una secuencia de residuos de aminoácido indica un enlace peptídico a una secuencia adicional de uno o más residuos de aminoácido, a un grupo amino-terminal tal como NH2 o a un grupo carboxilo terminal tal como COOH.
Según se utiliza en la presente memoria, los "a-aminoácidos" naturales son los residuos de esos 20 a-aminoácidos 15 encontrados en la naturaleza que se incorporan a la proteína mediante el reconocimiento específico de la molécula de ARNt cargada con su codón de ARNm análogo en seres humanos. Los aminoácidos de origen no natural incluyen así, por ejemplo, aminoácidos o análogos de aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos de origen natural e incluyen, aunque sin limitación, isostereómeros D de los aminoácidos. Los ejemplos de aminoácidos de origen no natural se describen en la presente memoria y son conocidos por los expertos en la técnica.
Según se utiliza en la presente memoria, una construcción de ADN es una molécula de ADN lineal o circular de cadena simple o doble que contiene segmentos de ADN combinados y yuxtapuestos de una manera que no se encuentra en la naturaleza. Las construcciones de ADN existen como resultado de la manipulación humana e
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incluyen clones y otras copias de moléculas manipuladas.
Según se utiliza en la presente memoria, un segmento de ADN es una porción de una molécula de ADN más grande que tiene atributos especificados. Por ejemplo, un segmento de ADN que codifica un polipéptido específico es una porción de una molécula de ADN más larga, tal como un plásmido o fragmento de plásmido, que, cuando se lee desde la dirección 5 'a 3', codifica la secuencia de aminoácidos del polipéptido especificado.
Según se utiliza en la presente memoria, el término polinucleótido significa un polímero monocatenario o bicatenario de desoxirribonucleótidos o bases ribonucleotídicas leídas del extremo 5' al 3'. Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y se pueden aislar a partir de fuentes naturales, sintetizar in vitro, o preparar a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. La longitud de una molécula de polinucleótido se proporciona en la presente memoria en términos de nucleótidos (abreviado "nt") o pares de bases (abreviado "pb"). El término nucleótidos se utiliza para moléculas de cadena simple y doble cuando el contexto lo permite. Cuando el término se aplica a moléculas bicatenarias, se utiliza para denotar la longitud total y se entenderá que es equivalente al término pares de bases. Los expertos en la técnica reconocerán que la longitud de las dos cadenas de un polinucleótido bicatenario pueden diferir ligeramente y que sus extremos pueden escalonarse; por lo tanto, todos los nucleótidos dentro de una molécula de polinucleótido bicatenario pueden no estar emparejados. Dichos extremos desapareados, en general, no superarán los 20 nucleótidos de longitud.
Según se utiliza en la presente memoria, "similitud" entre dos proteínas o ácidos nucleicos se refiere a la relación entre la secuencia de aminoácidos de las proteínas o las secuencias de nucleótidos de los ácidos nucleicos. La similitud puede basarse en el grado de identidad y/u homología de las secuencias de residuos y los residuos contenidos en ellas. Los expertos en la técnica conocen métodos para evaluar el grado de similitud entre proteínas o ácidos nucleicos. Por ejemplo, en un método para evaluar la similitud de secuencia, dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos se alinean de una manera que produce un nivel máximo de identidad entre las secuencias. "Identidad" se refiere al grado en que las secuencias de aminoácidos o nucleótidos son invariables. El alineamiento de las secuencias de aminoácidos, y en cierta medida de las secuencias de nucleótidos, también puede tener en cuenta las diferencias conservativas y/o las sustituciones frecuentes de aminoácidos (o nucleótidos). Las diferencias conservativas son aquellas que conservan las propiedades fisicoquímicas de los residuos involucrados. Los alineamientos pueden ser globales (alineamiento de las secuencias comparadas en toda la longitud de las secuencias e incluyendo todos los residuos) o locales (la alineamiento de una porción de las secuencias que incluye solo la región o regiones más similares).
La "identidad" per se tiene un significado reconocido en la técnica y se puede calcular utilizando mecanismos publicados. (Véanse, p.ej. Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). Aunque existe una serie de métodos para medir la identidad entre dos polinucleótidos o polipéptidos, el término "identidad" es bien conocido por los expertos en la técnica (Carrillo, H. y Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988))).
Según se utiliza en la presente memoria, homólogo (con respecto a secuencias de ácido nucleico y/o aminoácidos) significa aproximadamente una homología de secuencia superior o igual a 25%, típicamente mayor o igual a homología de secuencia de 25%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95%; el porcentaje exacto se puede especificar si es necesario. Para los fines de la presente memoria, los términos "homología" e "identidad" a menudo se utilizan indistintamente, a menos que se indique lo contrario. En general, para la determinación del porcentaje de homología o identidad, las secuencias se alinean de modo que se obtiene el emparejamiento de mayor orden (véase, p.ej.: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Por homología de secuencia, el número de aminoácidos conservados se determina mediante programas de algoritmos de alineación convencionales, y se puede utilizar con penalizaciones por hueco predeterminadas establecidas por cada proveedor. Las moléculas de ácido nucleico sustancialmente homólogas hibridarían típicamente a rigurosidad moderada o a alta rigurosidad a lo largo de toda la longitud del ácido nucleico de interés. También se contemplan las moléculas de ácido nucleico que contienen codones degenerados en lugar de codones en la molécula de ácido nucleico hibridante.
Que dos moléculas tienen secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos que son al menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% "idénticas" u "homólogas" se puede determinar utilizando algoritmos informáticos conocidos tales como el programa "FASTA", utilizando, por ejemplo, los parámetros predeterminados como en Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (otros programas incluyen el paquete del
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programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Altschul,
S.F., et al., J Mol Biol 215:403 (1990)); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994 y Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Por ejemplo, se puede utilizar la función BLAST de la base de datos de información del Centro Nacional de Biotecnología para determinar la identidad. Otros programas comercial o públicamente disponibles incluyen el programa "MegAlign" de DNAStar (Madison, WI) y el programa "Gap" del Genetics Computer Group (UWG) de la Universidad de Wisconsin (Madison WI). El porcentaje de homología o identidad de proteínas y/o moléculas de ácido nucleico se puede determinar, por ejemplo, comparando información de secuencia utilizando un programa informático GAP (p.ej. Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443, revisado por Smith y Waterman ((1981) Adv. Appl. Math. 2:482). Brevemente, el programa GAP define la similitud como el número de símbolos alineados (es decir, nucleótidos o aminoácidos), que son similares, dividido por el número total de símbolos en la más corta de las dos secuencias. Los parámetros por defecto para el programa GAP pueden incluir: (1) una matriz de comparación única (que contiene un valor de 1 para las identidades y 0 para las no identidades) y la matriz de comparación ponderada de Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745, como describen Schwartz y Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, Fundación Nacional de Investigación Biomédica, pág. 353-358 (1979)); (2) una penalización de 3,0 por cada hueco y una penalización adicional de 0,10 por cada símbolo en cada hueco; y (3) no hay penalización por los huecos finales.
Por lo tanto, según se utiliza en la presente memoria, los términos "identidad" u "homología" representan una comparación entre una prueba y un polipéptido o polinucleótido de referencia. Según se utiliza en la presente memoria, el término al menos "idéntico en 90% a" se refiere a porcentajes de identidades de 90 a 99,99 con respecto al ácido nucleico de referencia o la secuencia de aminoácidos del polipéptido. La identidad a un nivel de 90% o más es indicativa del hecho de que, suponiendo fines ilustrativos, se compara una longitud de polipéptido de prueba y de referencia de 100 aminoácidos. No más del 10% (es decir, 10 de cada 100) de los aminoácidos en el polipéptido de prueba difiere del polipéptido de referencia. Se pueden realizar comparaciones similares entre polinucleótidos de prueba y de referencia. Dichas diferencias se pueden representar como mutaciones puntuales distribuidas aleatoriamente en toda la longitud de un polipéptido o pueden agruparse en una o más localizaciones de longitud variable hasta el máximo permisible, p.ej. diferencia de 10/100 aminoácidos (aproximadamente 90% de identidad). Las diferencias se definen como sustituciones, inserciones o deleciones de ácidos nucleicos o aminoácidos. A nivel de homologías o identidades por encima de aproximadamente 85-90%, el resultado debe ser independiente del programa y los parámetros de hueco establecidos; tales altos niveles de identidad se pueden evaluar fácilmente, a menudo mediante alineamiento manual sin depender del soporte lógico.
Según se utiliza en la presente memoria, una secuencia alineada se refiere al uso de homología (similitud y/o identidad) para alinear posiciones correspondientes en una secuencia de nucleótidos o aminoácidos. Típicamente, dos o más secuencias que están relacionadas en 50% o más de identidad están alineadas. Un conjunto alineado de secuencias se refiere a 2 o más secuencias que están alineadas en posiciones correspondientes y pueden incluir secuencias alineadas derivadas de ARN, tales como EST y otros ADNc, alineadas con la secuencia de ADN genómico.
Según se utiliza en la presente memoria, "cebador" se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede actuar como punto de iniciación de la síntesis de ADN dirigida al molde en condiciones apropiadas (p.ej., en presencia de cuatro nucleósidos trifosfato diferentes y un agente de polimerización, tal como ADN polimerasa, ARN polimerasa o transcriptasa inversa) en un tampón apropiado y a una temperatura adecuada. Se apreciará que ciertas moléculas de ácido nucleico pueden servir como "sonda" y como "cebador". Sin embargo, un cebador tiene un grupo hidroxilo 3' para la extensión. Se puede utilizar un cebador en una variedad de métodos, que incluyen, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR de transcriptasa inversa (RT), PCR de ARN, LCR, PCR múltiple, PCR angosta "panhandle", PCR de captura, PCR de expresión, RACE 3' y 5', PCR in situ, PCR mediada por ligación y otros protocolos de amplificación.
Según se utiliza en la presente memoria, "par de cebadores" se refiere a un conjunto de cebadores que incluye un cebador 5' (aguas arriba) que hibrida con el extremo 5' de una secuencia que se vaya a amplificar (p.ej., mediante PCR) y un cebador 3' (aguas abajo) que se hibrida con el complemento del extremo 3' de la secuencia que se vaya a amplificar.
Según se utiliza en la presente memoria, "hibrida específicamente" se refiere a reasociación, por medio de apareamiento de bases complementarias, de una molécula de ácido nucleico (p.ej., un oligonucleótido) a una molécula de ácido nucleico diana. Los expertos en la técnica están familiarizados con parámetros in vitro e in vivo que afectan a la hibridación específica, tales como la longitud y la composición de la molécula concreta. Los parámetros particularmente relevantes para la hibridación in vitro incluyen adicionalmente la temperatura de reasociación y lavado, la composición del tampón y la concentración de sal. Los ejemplos de las condiciones de lavado para eliminar moléculas de ácido nucleico unidas no específicamente con alta rigurosidad son 0,1 x SSPE, 0,1% de SDS, 65°C, y a rigurosidad media son 0,2 x SSPE, 0,1% de SDS, 50°C. Se conocen condiciones de rigurosidad equivalentes en la técnica. El experto en la técnica puede ajustar fácilmente estos parámetros para lograr la hibridación específica de una molécula de ácido nucleico con una molécula de ácido nucleico diana
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apropiada para una aplicación concreta. Complementarias, cuando se refiere a dos secuencias de nucleótidos, significa que las dos secuencias de nucleótidos son capaces de hibridarse, típicamente con menos de 25%, 15% o 5% de emparejamientos erróneos entre nucleótidos opuestos. Si fuera necesario, se especificará el porcentaje de complementariedad. Típicamente, las dos moléculas se seleccionan de manera que hibriden en condiciones de alta rigurosidad.
Según se utiliza en la presente memoria, sustancialmente idéntico a un producto significa suficientemente similar para que la propiedad de interés permanezca lo suficientemente inalterada como para que pueda utilizarse el producto sustancialmente idéntico en lugar del producto.
Según se utiliza en la presente memoria, también se entiende que los términos "sustancialmente idéntico" o "similar" varían con el contexto tal como lo entienden los expertos en la técnica relevante.
Según se utiliza en la presente memoria, una variante alélica o variación alélica se refiere a cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica se produce naturalmente a través de la mutación, y puede dar lugar a un polimorfismo fenotípico dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos alterada. El término "variante alélica" también se utiliza en la presente memoria para denotar una proteína codificada por una variante alélica de un gen. Típicamente, la forma de referencia del gen codifica una forma de tipo salvaje y/o una forma predominante de un polipéptido de una población o único miembro de referencia de una especie. Típicamente, las variantes alélicas, que incluyen variantes entre especies, típicamente tienen al menos 80%, 90% o más identidad de aminoácidos con un tipo salvaje y/o una forma predominante de la misma especie; el grado de identidad depende del gen y si la comparación es interespecie o intraespecie. Generalmente, las variantes alélicas intraespecíficas tienen al menos aproximadamente 80%, 85%, 90% o 95% de identidad o mayor con un tipo salvaje y/o forma predominante, incluyendo 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad con una forma de tipo salvaje y/o predominante de un polipéptido. La referencia a una variante alélica en la presente memoria generalmente se refiere a variaciones en las proteínas entre miembros de la misma especie.
Según se utiliza en la presente memoria, "alelo", que se utiliza de forma indistinta en la presente memoria con "variante alélica" se refiere a formas alternativas de un gen o porciones de los mismos. Los alelos ocupan el mismo locus o posición en los cromosomas homólogos. Cuando un sujeto tiene dos alelos idénticos de un gen, se dice que el sujeto es homocigótico para ese gen o alelo. Cuando un sujeto tiene dos alelos diferentes de un gen, se dice que el sujeto es heterocigoto para el gen. Los alelos de un gen específico pueden diferir entre sí en un solo nucleótido o en varios nucleótidos, y pueden incluir modificaciones tales como sustituciones, deleciones e inserciones de nucleótidos. Un alelo de un gen también puede ser una forma de un gen que contiene una mutación.
Según se utiliza en la presente memoria, las variantes de especie se refieren a variantes en polipéptidos entre diferentes especies, que incluyen diferentes especies de mamíferos, tales como ratón y ser humano. Por ejemplo, para PH20, los ejemplos de variantes de especie proporcionadas en la presente invención son PH20 de primate, tales como, pero sin limitarse a, ser humano, chimpancé, macaco y mono cinomolgo. Generalmente, las variantes de especie tienen 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, o 98% de identidad de secuencia. Los residuos correspondientes entre las variantes de especie pueden determinarse comparando y alineando secuencias para maximizar el número de nucleótidos o residuos coincidentes, por ejemplo, de modo que la identidad entre las secuencias sea igual o mayor que 95%, igual o mayor que 96%, igual o mayor que 97%, igual o mayor que 98% o igual a mayor que 99%. A la posición de interés se le asigna el número asignado en la molécula de ácido nucleico de referencia. El alineamiento puede efectuarse manualmente o por observación, en particular, cuando la identidad de secuencia es superior a 80%.
Según se utiliza en la presente memoria, una proteína humana es una codificada por una molécula de ácido nucleico, tal como ADN, presente en el genoma de un ser humano, que incluye todas las variantes alélicas y variaciones conservativas de las mismas. Una variante o modificación de una proteína es una proteína humana si la modificación se basa en el tipo salvaje o secuencia prominente de una proteína humana.
Según se utiliza en la presente memoria, una variante de corte y empalme se refiere a una variante producida por procesamiento diferencial de un transcrito primario de ADN genómico que da como resultado más de un tipo de ARNm.
Según se utiliza en la presente memoria, la modificación se refiere a la modificación de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido o una secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico e incluye deleciones, inserciones y reemplazos (por ejemplo, sustituciones) de aminoácidos y nucleótidos, respectivamente. Las modificaciones ilustrativas son sustituciones de aminoácidos. Un polipéptido con un aminoácido sustituido puede exhibir una identidad de secuencia de 65%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o más con un polipéptido que no contiene las sustituciones de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser conservativas o no conservativas. Generalmente, cualquier modificación de un polipéptido conserva una
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actividad del polipéptido. Los métodos para modificar un polipéptido son rutinarios para los expertos en la técnica; tales como mediante el uso de metodologías de ADN recombinante.
Según se utiliza en la presente memoria, los expertos en la técnica conocen las sustituciones conservativas adecuadas de aminoácidos y pueden realizarse generalmente sin alterar la actividad biológica de la molécula resultante. Los expertos en la técnica reconocen que, en general, las sustituciones de un único aminoácido en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (véase, p.ej. Watson et al. Molecular Biology of the Gen, 4a Edición, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., pág. 224). Tales sustituciones se pueden realizar de acuerdo con las establecidas en la TABLA 2 de la siguiente manera:
Tabla 2
Residuo original
Sustitución conservativa ilustrativa
Ala (A)
Gly; Ser
Arg (R)
Lys
Asn(N)
Gln; Su
Cys(C)
Ser
Gln (Q)
Asn
Glu (E)
Asp
Gly (G)
Ala; Pro
His (H)
Asn; Gln
Ile (I)
Leu; Val
Leu (L)
Ile; Val
Lys (K)
Arg; Gln; Glu
Met (M)
Leu; Tyr; Él
Phe (F)
Met; Leu; Tyr
Ser (S)
Thr
Thr (T)
Ser
Trp (W)
Tyr
Tyr (Y)
Trp; Phe
Val (V)
He; Leu
Otras sustituciones también son permisibles y pueden determinarse empíricamente o de acuerdo con sustituciones conservativas conocidas.
Según se utiliza en la presente memoria, el término promotor significa una porción de un gen que contiene secuencias de ADN que proporcionan la unión de la ARN polimerasa y el inicio de la transcripción. Las secuencias promotoras se encuentran comúnmente, pero no siempre, en la región 5' no codificante de los genes.
Según se utiliza en la presente memoria, el polipéptido o proteína o porción biológicamente activa de los mismos aislados o purificados están sustancialmente libres de material celular u otras proteínas contaminantes de la célula o tejido del que se obtiene la proteína, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Se puede determinar que las preparaciones están sustancialmente libres si aparecen libres de impurezas fácilmente detectables según se determina por métodos de análisis convencionales, tales como cromatografía en capa fina (TLC), electroforesis en gel y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), utilizados por los expertos en la técnica para evaluar tal pureza, o son suficientemente puras como para que una purificación adicional no altere de manera detectable las propiedades físicas y químicas, tales como actividades enzimáticas y biológicas, de la sustancia. Los expertos en la técnica conocen métodos para la purificación de los compuestos para producir compuestos sustancialmente químicamente puros. Sin embargo, un compuesto sustancialmente químicamente puro puede ser una mezcla de estereoisómeros. En tales casos, la purificación adicional podría aumentar la actividad específica del compuesto.
Por lo tanto, la referencia a un polipéptido sustancialmente purificado, tal como una PH20 soluble sustancialmente purificada, se refiere a preparaciones de proteínas que están sustancialmente libres de material celular que incluye
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preparaciones de proteínas en las que la proteína se separa de los componentes celulares de las células de las que se aísla o produce recombinantemente. En una realización, el término sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteínas enzimáticas que tienen menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de proteínas no enzimáticas (también referidas en la presente memoria como proteína contaminante), generalmente menos de aproximadamente 20% de proteínas no enzimáticas o 10% de proteínas no enzimáticas o menos que aproximadamente 5% de proteínas no enzimáticas. Cuando la proteína enzimática se produce recombinantemente, también está sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, 10% o 5% del volumen de la preparación de proteína enzimática.
Según se utiliza en la presente memoria, el término sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos incluye preparaciones de proteínas enzimáticas en las que la proteína se separa de precursores químicos u otros productos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. El término incluye preparaciones de proteínas enzimáticas que tienen menos de aproximadamente 30% (en peso seco), 20%, 10%, 5% o menos de precursores químicos o productos químicos o componentes no enzimáticos.
Según se utiliza en la presente memoria, sintético, con referencia a, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico sintética o un gen sintético o un péptido sintético se refiere a una molécula de ácido nucleico o molécula de polipéptido que se produce por métodos recombinantes y/o por métodos de síntesis química.
Según se utiliza en la presente memoria, la producción por medios recombinantes o el uso de métodos de ADN recombinante significa el uso de los métodos bien conocidos de biología molecular para expresar proteínas codificadas por ADN clonado.
Según se utiliza en la presente memoria, vector (o plásmido) se refiere a elementos discretos que se utilizan para introducir un ácido nucleico heterólogo en las células para expresión o replicación de las mismas. Los vectores típicamente permanecen episomales, pero pueden diseñarse para efectuar la integración de un gen o parte del mismo en un cromosoma del genoma. También se contemplan los vectores que son cromosomas artificiales, tales como los cromosomas artificiales de levadura y los cromosomas artificiales de mamífero. La selección y el uso de tales vehículos son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Según se utiliza en la presente memoria, un vector de expresión incluye vectores capaces de expresar ADN que está conectado operativamente con secuencias reguladoras, tales como regiones promotoras, que son capaces de efectuar la expresión de tales fragmentos de ADN. Dichos segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y terminadoras, y opcionalmente pueden incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un potenciador, una señal de poliadenilación. Los vectores de expresión generalmente se obtienen a partir de ADN plasmídico o viral, o pueden contener elementos de ambos. Por lo tanto, un vector de expresión se refiere a una construcción de ADN o ARN recombinante, tal como un plásmido, un fago, virus recombinante u otro vector que, tras la introducción en una célula anfitriona apropiada, da como resultado la expresión del ADN clonado. Los vectores de expresión apropiados son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen aquellos que son replicables en células eucariotas y/o células procariotas y aquellos que permanecen episomales o aquellos que se integran en el genoma de la célula anfitriona.
Según se utiliza en la presente memoria, el vector también incluye "vectores de virus" o "vectores virales". Los vectores virales son virus modificados genéticamente que están conectados operativamente a genes exógenos para transferir (como vehículos o lanzaderas) los genes exógenos a las células.
Según se utiliza en la presente memoria, "operablemente" o "conectado operativamente" cuando se refiere a segmentos de ADN significa que los segmentos están dispuestos para que funcionen en concierto para sus fines previstos, p.ej., la transcripción se inicia aguas abajo del promotor y aguas arriba de cualquier secuencia transcrita. El promotor es usualmente el dominio al que se une la maquinaria transcripcional para iniciar la transcripción y avanza a través del segmento codificante hacia el terminador.
Según se utiliza en la presente memoria, se pretende que el término "evaluar" incluya una determinación cuantitativa y cualitativa en el sentido de obtener un valor absoluto para la actividad de una proteína, tal como una enzima, o un dominio de la misma, presente en la muestra, y también para obtener un índice, proporción, porcentaje, valor visual u otro indicativo del nivel de la actividad. La evaluación puede ser directa o indirecta. Por ejemplo, no se necesita que la especie química realmente detectada, por supuesto, sea el propio producto escindido enzimáticamente, sino que puede ser, por ejemplo, un derivado del mismo o alguna otra sustancia adicional. Por ejemplo, la detección de un producto de escisión puede ser un radical detectable tal como un radical fluorescente.
Según se utiliza en la presente memoria, la actividad biológica se refiere a las actividades in vivo de un compuesto o las respuestas fisiológicas que resultan de la administración in vivo de un compuesto, composición u otra mezcla. La actividad biológica, por lo tanto, abarca los efectos terapéuticos y la actividad farmacéutica de tales compuestos, composiciones y mezclas. Se pueden observar actividades biológicas en sistemas in vitro diseñados para someter a
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ensayo o utilizar tales actividades. Por lo tanto, para los fines de la presente memoria, una actividad biológica de una enzima hialuronidasa es su degradación de ácido hialurónico.
Según se utiliza en la presente memoria, equivalente, cuando hace referencia a dos secuencias de ácidos nucleicos, significa que las dos secuencias en cuestión codifican la misma secuencia de aminoácidos o proteínas equivalentes. Cuando se utiliza equivalente para referirse a dos proteínas o péptidos, significa que las dos proteínas o péptidos tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos con solo sustituciones de aminoácidos que no alteran sustancialmente la actividad o función de la proteína o el péptido. Cuando equivalente se refiere a una propiedad, la propiedad no necesita estar presente en la misma medida (p.ej., dos péptidos pueden exhibir diferentes velocidades del mismo tipo de actividad enzimática), pero las actividades son generalmente sustancialmente las mismas.
Según se utiliza en la presente memoria, "modular" y "modulación" o "alterar" se refieren a un cambio de una actividad de una molécula, tal como una proteína. Las actividades ilustrativas incluyen, entre otras, actividades biológicas, tales como la transducción de señales. La modulación puede incluir un aumento en la actividad (es decir, regulación positiva o actividad agonística), una disminución en la actividad (es decir, regulación negativa o inhibición) o cualquier otra alteración en una actividad (tal como un cambio en la periodicidad, frecuencia, duración, cinética u otro parámetro). La modulación puede depender del contexto y típicamente la modulación se compara con un estado designado, por ejemplo, la proteína de tipo salvaje, la proteína en un estado constitutivo o la proteína expresada en un tipo o condición celular designados.
Según se utiliza en la presente memoria, una composición se refiere a cualquier mezcla. Puede ser una solución, suspensión, líquido, polvo, pasta, mezcla acuosa, mezcla no acuosa o cualquiera de sus combinaciones.
Según se utiliza en la presente memoria, una combinación se refiere a cualquier asociación entre dos o más artículos. La combinación puede ser dos o más elementos separados, tales como dos composiciones o dos colecciones, puede ser una mezcla de los mismos, tal como una mezcla única de los dos o más artículos, o cualquier variación de los mismos. Los elementos de una combinación generalmente están asociados o relacionados funcionalmente.
Según se utiliza en la presente memoria, "enfermedad o trastorno" se refiere a una afección patológica en un organismo que resulta de una causa o afección que incluye, pero sin limitarse a, infecciones, afecciones adquiridas, afecciones genéticas y que se caracteriza por síntomas identificables. Las enfermedades y trastornos de interés en la presente memoria son enfermedades y trastornos asociados con hialuronano.
Según se utiliza en la presente memoria, "tratar" a un sujeto con una enfermedad o afección significa que los síntomas del sujeto se alivian parcial o totalmente, o permanecen estáticos después del tratamiento. Por lo tanto, el tratamiento abarca profilaxis, terapia y/o cura. La profilaxis se refiere a la prevención de una enfermedad potencial y/o la prevención del empeoramiento de los síntomas o la progresión de una enfermedad.
Según se utiliza en la presente memoria, un agente farmacéuticamente eficaz incluye cualquier agente terapéutico o agentes bioactivos, incluyendo, pero sin limitarse a, por ejemplo, agentes quimioterapéuticos, anestésicos, vasoconstrictores, agentes dispersantes, fármacos terapéuticos convencionales, incluyendo fármacos de molécula pequeña y proteínas terapéuticas.
Según se utiliza en la presente memoria, tratamiento significa cualquier manera en la que los síntomas de una afección, trastorno o enfermedad u otra indicación, se mejoran o se alteran beneficiosamente de otro modo.
Según se utiliza en la presente memoria, efecto terapéutico significa un efecto que resulta del tratamiento de un sujeto que altera, mejora típicamente o mejora los síntomas de una enfermedad o afección o que cura una enfermedad o afección. Una cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de una composición, molécula o compuesto que da como resultado un efecto terapéutico después de la administración a un sujeto.
Según se utiliza en la presente memoria, el término "sujeto" se refiere a un animal, incluyendo un mamífero, tal como un ser humano.
Según se utiliza en la presente memoria, un paciente se refiere a un sujeto humano que presenta síntomas de una enfermedad o trastorno.
Según se utiliza en la presente memoria, aproximadamente la misma significa dentro de una cantidad que un experto en la técnica consideraría como la misma o dentro de un intervalo aceptable de error. Por ejemplo, típicamente, para composiciones farmacéuticas, dentro de al menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5% o 10% se considera aproximadamente la misma. Tal cantidad puede variar dependiendo de la tolerancia a la variación en la composición particular por parte de los sujetos.
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Según se utiliza en la presente memoria, el régimen de dosificación se refiere a la cantidad de agente, por ejemplo, la composición que contiene un agente anti-hialuronano, por ejemplo una hialuronidasa soluble u otro agente, administrada, a y la frecuencia de administración. El régimen de dosificación es una función de la enfermedad o afección que se vaya a tratar, y por lo tanto puede variar.
Según se utiliza en la presente memoria, la frecuencia de administración se refiere al tiempo entre las administraciones de tratamiento sucesivas. Por ejemplo, la frecuencia puede ser de días, semanas o meses. Por ejemplo, la frecuencia puede ser más de una vez por semana, por ejemplo, dos veces por semana, tres veces por semana, cuatro veces por semana, cinco veces por semana, seis veces por semana o diariamente. La frecuencia también puede ser de una, dos, tres o cuatro semanas. La frecuencia concreta es una función de la enfermedad o afección particular tratadas. Generalmente, la frecuencia es más de una vez por semana, y generalmente es dos veces por semana.
Según se utiliza en la presente memoria, un "ciclo de administración" se refiere al programa repetido del régimen de dosificación de administración de la enzima y/o un segundo agente que se repite a lo largo de administraciones sucesivas. Por ejemplo, un ciclo de administración ilustrativo es un ciclo de 28 días con administración dos veces a la semana durante tres semanas, seguido de una semana de dosificación interrumpida.
Según se utiliza en la presente memoria, cuando se hace referencia a la dosificación basándose en los mg/kg del sujeto, se considera que un sujeto humano promedio tiene una masa de aproximadamente 70 kg-75 kg, por ejemplo de 70 kg.
Según se utiliza en la presente memoria, la mejoría de los síntomas de una enfermedad o trastorno concretos mediante un tratamiento, tal como mediante la administración de una composición farmacéutica u otro agente terapéutico, se refiere a cualquier disminución, ya sea permanente o temporal, duradera o transitoria, de los síntomas o, efectos de una afección, tal como, por ejemplo, la reducción de los efectos adversos asociados o que se producen tras la administración de un agente anti-hialuronano, tal como una hialuronidasa PEGilada.
Según se utiliza en la presente memoria, la prevención o profilaxis se refiere a una reducción del riesgo de desarrollar una enfermedad o afección.
Según se utiliza en la presente memoria, una "cantidad terapéuticamente eficaz" o una "dosis terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de un agente, compuesto, material o composición que contiene un compuesto que es al menos suficiente para producir un efecto terapéutico. Por lo tanto, es la cantidad necesaria para prevenir, curar, mejorar, detener o detener parcialmente un síntoma de una enfermedad o trastorno.
Según se utiliza en la presente memoria, la forma de dosis unitaria se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas para sujetos humanos y animales y empaquetadas individualmente como se conoce en la técnica.
Según se utiliza en la presente memoria, una formulación de dosificación única se refiere a una formulación en forma de una dosis única.
Según se utiliza en la presente memoria, la formulación para administración directa significa que la composición no requiere una dilución adicional para su administración.
Según se utiliza en la presente memoria, un "artículo de fabricación" es un producto que se fabrica y se comercializa. Según se utiliza en esta solicitud, se pretende que el término abarque agentes anti-hialuronano, por ejemplo una enzima que degrada hialuronano, tal como hialuronidasa, y composiciones de un segundo agente contenidas en artículos de envasado. Por ejemplo, un segundo agente es un corticosteroide.
Según se utiliza en la presente memoria, fluido se refiere a cualquier composición que pueda fluir. Por lo tanto, los fluidos abarcan composiciones que están en forma de semisólidos, pastas, soluciones, mezclas acuosas, geles, lociones, cremas y otras composiciones similares.
Según se utiliza en la presente memoria, una combinación, tal como una combinación de composiciones proporcionadas en la presente memoria, se refiere a una asociación de elementos de la combinación.
Según se utiliza en la presente memoria, un kit se refiere a una combinación de componentes, tal como una combinación de las composiciones de la presente invención y otro elemento para un fin que incluye, entre otros, reconstitución, activación e instrumentos/dispositivos para el suministro, el diagnóstico y la evaluación de una actividad o propiedad biológica. Los kits incluyen opcionalmente instrucciones de uso.
Según se utiliza en la presente memoria, un extracto o producto lisado celular se refiere a una preparación o fracción que se prepara a partir de una célula lisada o rota.
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Según se utiliza en la presente memoria, el animal incluye cualquier animal, tal como, pero sin limitarse a, primates incluyendo seres humanos, gorilas y monos; roedores, tales como ratones y ratas; aves de corral, tales como pollos; rumiantes, tales como cabras, vacas, ciervos, ovejas; cerdos y otros animales. Los animales no humanos excluyen a los humanos tales como el animal contemplado. Las hialuronidasas proporcionadas en la presente memoria son de cualquier fuente, animal, vegetal, procariótica y fúngica. La mayoría de las hialuronidasas son de origen animal, incluido el origen de los mamíferos. Generalmente las hialuronidasas son de origen humano.
Según se utiliza en la presente memoria, los tratamientos anticancerosos incluyen la administración de fármacos y otros agentes para tratar el cáncer, y también protocolos de tratamiento, tales como cirugía y radiación. Los tratamientos contra el cáncer incluyen la administración de agentes contra el cáncer.
Según se utiliza en la presente memoria, un agente anticanceroso se refiere a cualquier agente o compuesto utilizado en el tratamiento contra el cáncer. Estos incluyen cualquier agente, cuando se utiliza solo o en combinado con otros compuestos, que puede aliviar, reducir, mejorar, prevenir o colocar o mantener en un estado de remisión de síntomas clínicos o marcadores de diagnóstico asociados con tumores y cáncer, y puede utilizarse en combinaciones y composiciones proporcionadas en la presente memoria. Los agentes anticancerosos ilustrativos incluyen, pero sin limitarse a, agentes antihialuronano, tales como las enzimas que degradan hialuronano PEGilado proporcionadas en la presente memoria utilizadas individualmente o combinadas y/o combinadas con otros agentes anticancerosos, tales como agentes quimioterapéuticos, polipéptidos, anticuerpos, péptidos, moléculas pequeñas o vectores de terapia génica, virus o ADN.
Según se utiliza en la presente memoria, un control se refiere a una muestra que es sustancialmente idéntica a la muestra de prueba, excepto que no se trata con un parámetro de prueba, o, si se trata de una muestra de plasma, puede ser de un voluntario normal no afectado con la afección de interés. Un control también puede ser un control interno.
Según se utiliza en la presente memoria, las formas en singular "un", "uno", "una", "el" y "la" incluyen los referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De este modo, por ejemplo, la referencia a un compuesto que comprende o contiene "un dominio extracelular" incluye compuestos con uno o una pluralidad de dominios extracelulares.
Según se utiliza en la presente memoria, los intervalos y las cantidades se pueden expresar como "aproximadamente" un valor o intervalo concretos. Aproximadamente también incluye la cantidad exacta. Por lo tanto, "aproximadamente de 5 bases" significa "aproximadamente 5 bases" y también "5 bases".
Según se utiliza en la presente memoria, "opcional" u "opcionalmente" significa que el evento o circunstancia descrita con posterioridad tiene lugar o no, y que la descripción incluye casos en los que se produce dicho evento o circunstancia y casos en los que no ocurre. Por ejemplo, un grupo opcionalmente sustituido significa que el grupo no está sustituido o está sustituido.
Según se utiliza en la presente memoria, las abreviaturas para cualquier grupo protector, aminoácido y otros compuestos están, a menos que se indique lo contrario, de acuerdo con su uso común, abreviaturas reconocidas, o la Comisión IUPAC-IUB de Nomenclatura Bioquímica (véase, (1972) Biochem. 11:1726).
B. VISIÓN GENERAL
1. Agentes Anti-Hialuronano y enfermedades, afecciones y/o trastornos asociados con el Hialuronano
Ciertas enfermedades se asocian con la expresión y/o producción de hialuronano, incluyendo enfermedades inflamatorias y cánceres. El HA está relacionado con una variedad de procesos biológicos implicados con la progresión de tales enfermedades (véanse, p.ej. Itano et al. (2008) Semin Cancer Biol 18(4):268-274; Tammi et al. (2008) Semin Cancer Biol 18(4):288-295). Por ejemplo, el HA está vinculado a procesos biológicos asociados con la progresión tumoral, incluida la transición epitelio-mesenquimal y la vía supresora de tumores p53. Además, el HA está implicado en un aumento de la captación de agua y de la presión de fluido intersticial (PFI) en los tejidos de la enfermedad, tales como tumores, lo que da como resultado una vasculatura tumoral comprimida. Por ejemplo, en sitios de inflamación o en un foco tumoral, hay una acumulación rápida de hialuronano, otros componentes de la matriz y agua. Debido a esta rápida acumulación, el sitio enfermo no puede llegar a un equilibrio con su entorno y, por lo tanto, tiene una presión de fluido intersticial más alta que los tejidos normales.
Los agentes anti-hialuronano reducen los niveles de ácido hialurónico (HA, también referido en la presente memoria como hialuronano) al interferir con su síntesis o aumentar su degradación. Por ejemplo, las enzimas que degradan hialuronano, tales como la hialuronidasa, interfieren con el ácido hialurónico (HA) y lo degradan. El tratamiento con agentes que degradan o inhiben la síntesis de hialuronano, tales como las enzimas que degradan hialuronano, reduce el hialuronano de manera que el tejido se desinfla, los vasos sanguíneos se expanden y puede circular más
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sangre a través del sitio.
Además, la PFI de la mayoría de los tumores sólidos y otros tejidos enfermos asociados con HA acumulado es elevada, actuando como una barrera para la administración eficaz de fármacos (Heldin et al. (2004) Nat Rev Cancer 4(10):806-813). Por lo tanto, además de disminuir la PFI y el contenido de agua en el sitio tisular y el aumento asociado de la perfusión vascular, los agentes antihialuronano, tales como las enzimas que degradan hialuronano, también pueden potenciar la actividad de las terapias co-administradas. Por ejemplo, los agentes antihialuronano, tales como las enzimas que degradan hialuronano, pueden potenciar la administración de agentes quimioterapéuticos a los tumores.
Por lo tanto, los agentes antihialuronano, tales como las enzimas que degradan hialuronano, exhiben propiedades útiles para una terapia de un agente único o combinada de enfermedades y afecciones que exhiben la acumulación de hialuronano (ácido hialurónico, HA). Las enfermedades, afecciones y/o trastornos asociados con el hialuronano incluyen cánceres y enfermedades inflamatorias. Los cánceres ricos en hialuronano incluyen, entre otros, tumores, incluidos tumores sólidos, por ejemplo, cánceres en estadio tardío, cánceres metastásicos, cánceres indiferenciados, cáncer de ovario, carcinoma in situ (CIS), carcinoma de células escamosas (CCE), cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de mama, cáncer de colon y otros cánceres. Se ha demostrado que la hialuronidasa elimina el HA de los tumores, reduciendo el volumen tumoral, reduciendo la presión intersticial intratumoral, ralentizando la proliferación de células tumorales y aumentando la eficacia de fármacos quimioterapéuticos y agentes biológicos co-administrados al permitir una mayor penetración tumoral (véanse p.ej. la Solicitud de Estados Unidos publicada Núm. 20100003238 y la Solicitud Internacional PCT Núm. WO 2009/128917).
La PEGilación es una tecnología establecida que se utiliza para aumentar la vida media de las proteínas terapéuticas en el organismo, lo que permite su uso en los protocolos de tratamiento sistémico. La PEGilación de agentes anti-hialuronano, tales como las enzimas que degradan hialuronano, tales como hialuronidasa, prolonga su vida media en el organismo desde menos de un minuto hasta aproximadamente 48 a 72 horas y permite el tratamiento sistémico de tumores ricos en HA (véanse, p.ej. la Solicitud de Estados Unidos publicada Núm. 20100003238 y la Solicitud Internacional PCT Núm. WO 2009/128917). El aumento de la vida media relativo a la hialuronidasa no PEGilada permite no solamente la eliminación de HA, sino que también, debido a su presencia continuada en el plasma y su capacidad para degradar HA, reduce o disminuye el grado de regeneración de HA en tejidos enfermos, tales como el tumor. El mantenimiento de los niveles de enzimas plasmáticas puede eliminar el HA, como el HA del tumor, y también contrarrestar la resíntesis de HA.
2. Efectos adversos asociados con el tratamiento con agentes anti-hialuronano
No se ha observado previamente que el uso de agentes antihialuronano, por ejemplo enzimas que degradan hialuronano, tales como la hialuronidasa, esté asociado con efectos secundarios. No obstante, como se describe en la presente memoria, varias especies, incluidos seres humanos, desarrollaron efectos secundarios musculoesqueléticos después de l administración de hialuronidasa PEGilada, como se observó tanto en estudios preclínicos como clínicos (descritos a continuación y en los Ejemplos 6-7). Los efectos secundarios musculoesqueléticos incluyen rigidez, dolor muscular y articular, y una disminución en la amplitud de movimiento en las articulaciones de rodilla y codo.
Los seres humanos que recibieron una sola dosis intravenosa de 0,05 mg/kg de PEGPH20 manifestaron síntomas musculoesqueléticos adversos aproximadamente seis horas después de la administración de la dosis. Los efectos adversos incluyeron uno o más de los siguientes efectos: dolor/rigidez muscular y articular de las extremidades superiores e inferiores, calambres musculares, miositis, dolor y sensibilidad muscular en todo el organismo, debilidad y fatiga. En la escala Criterios de Terminología Común para Eventos Adversos ("CTCAE" en sus siglas inglesas), se observó que los síntomas alcanzaron el Grado 3. Los efectos adversos se resolvieron durante varios días una vez que se interrumpió el tratamiento. El Ejemplo 6 ilustra adicionalmente los eventos adversos que se producen en una muestra de pacientes humanos tratados con PEGPH20 bajo diversos regímenes de dosificación, dosis y frecuencia de dosificación. La gravedad de los eventos musculoesqueléticos parece estar influenciada por la combinación de la dosis de PEGPH20 y la frecuencia de dosificación. Por ejemplo, los síntomas parecen ser más severos con dosis más altas de PEGPH20 y un programa de dosificación más frecuente.
Los monos a los que se administró PEGPH20 exhibieron hipoactividad, letargo, desorientación, postura encorvada y una disminución del ángulo de la articulación de la extremidad. Cuatro semanas de dosificación semanal dos veces con PEGPH20 dieron como resultado una disminución en la amplitud de movimiento en las articulaciones de la rodilla y el codo. Después de suspender la dosificación, se observó recuperación de parcial a completa.
Los perros Beagle que recibieron una dosis única de PEGPH20 de 0,08 mg/kg o PEGPH20 de 0,3 mg/kg exhibieron al día siguiente reducción de la capacidad para caminar, dificultad para mantenerse en pie, disminución de la actividad y rigidez de los músculos del cuello, espalda y extremidades. Los animales se recuperaron completamente el cuatro día después de interrumpir la dosificación.
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3. Uso de corticosteroides para mejorar los efectos adversos de los agentes antihialuronano
En la presente memoria se describen métodos y usos para mejorar o prevenir efectos adversos, tales como los efectos secundarios musculoesqueléticos, asociados con el tratamiento o administración con un agente antihialuronano mediante premedicación o medicación conjunta con un glucocorticoide. Por ejemplo, como se muestra en la presente memoria, los efectos secundarios musculoesqueléticos observados con la administración sistémica de hialuronidasa PEGilada se pueden mejorar, y/o eliminar, mediante premedicación y/o medicación conjunta con un glucocorticoide tal como dexametasona. El resultado es una tolerabilidad mejorada de dosis más altas de PEGPH20 y combinaciones de frecuencias de dosificación. Por lo tanto, como se describe en la presente memoria, los eventos adversos asociados con el tratamiento con PH20 de terapia única o terapia combinada para tratar una enfermedad o afección asociadas a hialuronano se pueden lograr en presencia de un corticosteroide.
Por lo tanto, en la presente memoria se describen métodos para mejorar los efectos adversos asociados con el uso de una enzima PEGilada que degrada hialuronano, para la terapia de agente único o combinada de enfermedades y afecciones que exhiben la acumulación de hialuronano. Los métodos utilizan glucocorticoides para mejorar los efectos secundarios adversos musculoesqueléticos del tratamiento con enzimas que degradan hialuronano PEGilado. En algunos ejemplos, los efectos secundarios adversos se reducen. En otros ejemplos, los efectos secundarios adversos se eliminan. Típicamente, el glucocorticoide se administra por vía oral, aunque se contempla cualquier método de administración del glucocorticoide. Típicamente, el glucocorticoide se administra en una cantidad de, o de aproximadamente, 0,4 a 20 mg, por ejemplo, de, o de aproximadamente, 0,4 mg, 0,5 mg, 0,6 mg, 0,7 mg, 0,75 mg, 0,8 mg, 0,9 mg, 1 mg, 2 mg,, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg, 16 mg, 17 mg, 18 mg, 19 mg o 20 mg por dosis.
El glucocorticoide se puede administrar antes, después o simultáneamente con los agentes antihialuronano, tal como una hialuronidasa PEGilada. En algunos ejemplos, el glucocorticoide se administra antes de la administración de la enzima PEGilada que degrada hialuronano. Por ejemplo, el glucocorticoide se puede administrar hasta, o aproximadamente hasta, 0,5 minutos, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 6 minutos, 7 minutos, 8 minutos, 9 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 25 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas o más antes de la administración de la enzima PEGilada que degrada hialuronano. En otros ejemplos, el glucocorticoide se administra al mismo tiempo que la administración de la enzima PEGilada que degrada hialuronano. En este ejemplo, el glucocorticoide se puede administrar por separado o junto con el agente antihialuronano. Típicamente, el glucocorticoide se administra por separado del agente anti-hialuronano. En otros ejemplos, el corticosteroide se administra después de la administración de la enzima PEGilada que degrada hialuronano. Por ejemplo, el glucocorticoide se puede administrar hasta, o aproximadamente hasta, 0,5 minutos, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 6 minutos, 7 minutos, 8 minutos, 9 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 25 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas o más después de la administración de la enzima PEGilada que degrada hialuronano.
En algunos ejemplos, el glucocorticoide se utiliza en un régimen de dosificación en el que la enzima PEGilada que degrada hialuronano se administra sola para el tratamiento de una enfermedad o afección asociadas a hialuronano. En otros ejemplos, el glucocorticoide se utiliza en un régimen de dosificación donde la enzima PEGilada que degrada hialuronano se administra combinada con uno o más agentes y/o tratamiento adicionales para tratar la enfermedad o trastorno, por ejemplo, un agente anticanceroso, tal como quimioterapia, anticuerpo, vector o ácido nucleico para tratar el cáncer. En este ejemplo, el segundo tratamiento o agente se puede administrar por separado o junto con el agente anti-hialuronano. Por ejemplo, la enzima PEGilada que degrada hialuronano se administra antes, después o con un agente o tratamiento adicional. Por lo tanto, las hialuronidasas solubles pegiladas pueden administrarse como agentes terapéuticos solos o combinados con otros agentes terapéuticos.
C. AGENTES ANTI-HIALURONANO
El HA, también llamado ácido hialurónico, hialuronato o hialuronano, es un glicosaminoglicano lineal de alto peso molecular que contiene unidades repetitivas de disacáridos, N-acetil-D-glucosamina y ácido D-glucurónico unidos por enlaces (31,4 y (31,3. El hialuronano se distribuye ampliamente a través de tejidos conectivos, epiteliales y neuronales. También es un componente principal de la matriz extracelular y un constituyente de la barrera intersticial. Por ejemplo, la matriz extracelular del cartílago contiene una pequeña cantidad de HA. El HA desempeña un papel en la remodelación tisular durante el desarrollo y en la homeostasis tisular normal, y es probable que participe en la adhesión y la migración celular. El HA también funciona como un lubricante biológico en las articulaciones y es importante tanto durante el movimiento como en condiciones estáticas (véanse p.ej. Engstrom- Laurent (1997) J. Intern. Med., 242:57-60; Jiang et al. (2007) Ann. Rev. Cell Dev. Biol., 23:435-61). El Ha se puede utilizar para modular la enfermedad, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades articulares, dispositivos quirúrgicos oftálmicos o en la cicatrización de heridas.
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HA también está implicado en la enfermedad. La acumulación de HA, por ejemplo mediante la alteración del metabolismo, la distribución y la función del hialuronano, se asocia con artritis, trastornos inmunitarios e inflamatorios, enfermedades pulmonares y vasculares, y cáncer (Morohashi et al. (2006) Biochem. Biophys. Res. Comm., 345:1454-1459) Tales enfermedades pueden tratarse inhibiendo la síntesis de HA o degradando HA (véase, p.ej. Morohashi 2006; Solicitud de Estados Unidos publicada Núm. 20100003238 y Solicitud Internacional PCT publicada Núm. WO 2009/128917). Por ejemplo, los agentes antihialuronano, tales como las enzimas que degradan hialuronano, pueden utilizarse para tratar enfermedades o afecciones asociadas con hialuronano, incluidos tumores y cánceres o enfermedades o afecciones inflamatorias. Como se describe en la presente memoria, tales tratamientos que reducen los niveles de hialuronano en células y tejidos pueden asociarse con efectos secundarios adversos, tales como los efectos secundarios musculoesqueléticos. Según se proporciona en la presente memoria, estos efectos adversos pueden aliviarse o mejorarse mediante pretratamiento o co-tratamiento con corticosteroides.
Por lo tanto, los corticosteroides pueden utilizarse en métodos para reducir los efectos secundarios adversos, tales como los efectos secundarios musculoesqueléticos, de cualquier agente que inhiba, degrade o reduzca la acumulación o la elevación de HA en estados de enfermedad. Dichos agentes son conocidos por los expertos en la técnica o pueden identificarse. Por ejemplo, los efectos de los agentes, incluidos los efectos de la dosis y vía de administración, sobre la síntesis o degradación de HA pueden evaluarse en diversos ensayos conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen, pero sin limitarse a, cualquiera de los descritos en la presente memoria o conocidos en la técnica, por ejemplo, ensayos in vitro que miden la degradación de hialuronano (véase, p.ej. Frost y Stern (1997) Anal. Biochem. 251:263-269), tinción de tejido u otras muestras para HA tal como utilizando una proteína de unión a HA u otro reactivo anti-HA (véase, p.ej. Nishida et al. (1999) J. Biol. Chem., 274:21893-21899), ensayo de exclusión de partículas (Nishida) et al. 1999; Morohashi et al. (2006) Biochem Biophys. Res. Comm., 345:1454-1459); medición o evaluación de la expresión de ARNm de HAS para un gene has (Nishida) et al. 1999). Son ilustrativos de tales agentes antihialuronano los agentes que inhiben la síntesis de hialuronano o degradan el hialuronano.
1. Agentes que inhiben la síntesis de hialuronano
El HA puede sintetizarse mediante tres enzimas que son productos de tres genes de mamíferos relacionados identificados como HA sintasas, denominados has-1, has-2 y has-3. Diferentes tipos de células expresan diferentes enzimas HAS y la expresión de los ARNm de HAS se correlaciona con la biosíntesis de HA. Se sabe que el silenciamiento de los genes HAS en las células tumorales inhibe el crecimiento tumoral y la metástasis. Un agente anti-hialuronano incluye cualquier agente que inhibe, reduce o regula negativamente la expresión o el nivel de una HA sintasa. Dichos agentes son conocidos por los expertos en la técnica o pueden identificarse.
Por ejemplo, la regulación negativa de un HAS se puede lograr proporcionando oligonucleótidos que hibriden específicamente o interaccionen de otro modo con una o más moléculas de ácido nucleico que codifican un HAS. Por ejemplo, los agentes anti-hialuronano que inhiben la síntesis de hialuronano incluyen moléculas antisentido o efectoras contra un gen has. Tal inhibición antisentido o efectora se basa típicamente en la hibridación basada en enlaces de hidrógeno de hebras o segmentos de oligonucleótidos de forma que al menos una hebra o segmento se escinda, se degrade o se haga de otro modo inoperable. En otros ejemplos, pueden emplearse silenciamiento génico postranscripcional (PTGS), ARNi, ribozimas y ADNzimas. Está dentro del nivel de un experto en la técnica generar dichas construcciones basándose en la secuencia de HAS1 (expuesta en SEQ ID NO: 195), HAS2 (expuesta en SEQ ID NO: 196) o HAS3 (expuesta en SEQ ID NO: 197 o 198). Se entiende en la técnica que la secuencia de un compuesto antisentido o efector no necesita ser 100% complementaria de la de su ácido nucleico diana para ser específicamente hibridable. Además, un oligonucleótido puede hibridarse sobre uno o más segmentos de manera que los segmentos intermedios o adyacentes no estén implicados en el evento de hibridación (p.ej., una estructura de bucle o estructura en horquilla). Generalmente, los compuestos antisentido o efectores tienen al menos 70% de complementariedad de secuencia con una región diana dentro del ácido nucleico diana, por ejemplo, 75% a 100% de complementariedad, tal como 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% Las moléculas efectoras o antisentido ilustrativas son conocidas en la técnica (véanse p.ej. Chao et al. (2005) J. Biol. Chem., 280:27513- 27522; Simpson et al. (2002) J. Biol. Chem., 277:10050-10057; Simpson et al. (2002) Am. J Path., 161:849; Nishida et at. (1999) J. Biol. Chem., 274: 21893-21899; Edward et al. (2010) British J Dermatology, 162:1224-1232; Udabage et al. (2005) Cancer Res., 65:6139; y la Solicitud de Patente de Estados Unidos publicada Núm. US20070286856).
Otro agente anti-hialuronano ilustrativo que es un inhibidor de la síntesis de HA es 4-metilumbeliferona (4-MU; 7- hidroxi-4-metilcumarina) o un derivado del mismo. La 4-MU actúa reduciendo el grupo de precursores de UDP- GlcUA que se requiere para la síntesis de HA. Por ejemplo, en células de mamífero, el HA se sintetiza mediante HAS utilizando precursores de ácido UDP-glucurónico (uGa) y UDP-N-acetil-D-glucosamina. La 4-MU interfiere con el proceso por el cual se genera UGA, agotando así la reserva intracelular de UGA y dando como resultado la inhibición de la síntesis de HA. Se sabe que 4-MU tiene actividad antitumoral (véanse p.ej. Lokeshwar et al. (2010) Cancer Res., 70:2613-23; Nakazawa et al. (2006) Cancer Chemother. Pharmacol., 57:165-170; Morohashi et al. (2006) Biochem. Biophys. Res. Comm., 345-1454-1459). La administración oral de 4-MU a 600 mg/kg/d) reduce las metástasis en 64% en el modelo de melanoma B16 (Yoshihara et al. (2005) FEBS Lett., 579:2722-6). La estructura
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de 4-MU se establece a continuación. Además, los derivados de 4-MU exhiben actividad anticancerosa, en particular 6,7-dihidroxi-4-metilcumarina y 5,7-dihidroxi-4-metilcumarina (véase p.ej. Morohashi et al. (2006) Biochem. Biophys. Res. Comm., 345-1454-1459).
4-Metilumbeliferona (4-MU; CioHgOs)
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CH3
Los ejemplos de agentes antihialuronano ilustrativos adicionales son inhibidores de tirosina quinasa, tales como Leflunomida (Arava), genisteína o erbstatina. La leflunomida también es un inhibidor de la síntesis de pirimidina. La leflunomida es un fármaco conocido para el tratamiento de la artritis reumatoide (AR) y también es eficaz en el tratamiento del rechazo de aloinjertos y xenoinjertos. Se sabe que HA contribuye directa o indirectamente a HA (véase p.ej. Stuhlmeier (2005) J Immunol., 174:7376-7382). Los inhibidores de la tirosina quinasa inhiben expresión del gen HAS1 (Stuhlmeier 2005).
2. Enzimas que degradan hialuronano
Los agentes anti-hialuronano incluyen enzimas que degradan hialuronano. El hialuronano es un componente esencial de la matriz extracelular y un componente principal de la barrera intersticial. Al catalizar la hidrólisis de hialuronano, las enzimas que degradan hialuronano reducen la viscosidad del hialuronano, aumentando así la permeabilidad del tejido y aumentando la velocidad de absorción de los fluidos administrados por vía parenteral. Como tales, las enzimas que degradan hialuronano, tales como las hialuronidasas, se han utilizado, por ejemplo, como agentes de propagación o dispersión junto con otros agentes, fármacos y proteínas para potenciar su dispersión y suministro.
Las enzimas que degradan hialuronano actúan degradando hialuronano mediante la escisión de polímeros de hialuronano, que se componen de unidades repetitivas de disacáridos, ácido D-glucurónico (GlcA) y N-acetil-D- glucosamina (GlcNAc), conectadas entre sí mediante la alternancia de enlaces glicosídicos £-1^-4 y £-1^-3. Las cadenas de hialuronano pueden alcanzar aproximadamente 25.000 repeticiones de disacáridos o más de longitud y los polímeros de hialuronano pueden variar de tamaño desde aproximadamente 5.000 a 20.000.000 Da. in vivo. Por consiguiente, las enzimas que degradan hialuronano para los usos y métodos proporcionados incluyen cualquier enzima que tenga la capacidad de catalizar la escisión de una cadena o polímero de disacárido de hialuronano. En algunos ejemplos, la enzima que degrada hialuronano escinde el enlace glicosídico £-1^4 en la cadena o polímero hialurónico. En otros ejemplos, la enzima que degrada hialuronano cataliza la escisión del enlace glicosídico £-1^3 en la cadena o polímero de hialuronano.
Por lo tanto, las enzimas que degradan hialuronano, como las hialuronidasas, son una familia de enzimas que degradan el ácido hialurónico, que es un componente esencial de la matriz extracelular y un componente principal de la barrera intersticial. Al catalizar la hidrólisis del ácido hialurónico, un componente principal de la barrera intersticial, las enzimas que degradan hialuronano reducen la viscosidad del ácido hialurónico, aumentando de ese modo la permeabilidad del tejido. Como tales, se han utilizado enzimas que degradan hialuronano, tales como hialuronidasas, por ejemplo, como agente dispersante o dispersante junto con otros agentes, fármacos y proteínas para potenciar su dispersión y suministro. Las enzimas que degradan hialuronano también se utilizan como adyuvante para aumentar la absorción y dispersión de otros fármacos inyectados, para hipodermoclisis (administración subcutánea de fluido) y como un complemento en la urografía subcutánea para mejorar la reabsorción de agentes radiopacos. Las enzimas que degradan hialuronano, por ejemplo la hialuronidasa, pueden utilizarse en aplicaciones de procedimientos oftálmicos, por ejemplo, bloqueo peribulbar y subtenon en anestesia local antes de la cirugía oftálmica. La hialuronidasa también puede utilizarse en otros usos terapéuticos y cosméticos, por ejemplo, promoviendo la acinesia en la cirugía estética, por ejemplo en las blefaroplastias y los estiramientos faciales.
Se han preparado y aprobado varias formas de enzimas que degradan hialuronano, incluyendo hialuronidasas, para uso terapéutico en sujetos, incluyendo seres humanos. Las composiciones y métodos proporcionados pueden utilizarse, a través de estos y otros usos terapéuticos, para tratar enfermedades y afecciones asociadas con el hialuronano. Por ejemplo, las preparaciones de hialuronidasa derivadas de animales incluyen Vitrase® (ISTA Pharmaceuticals), una hialuronidasa testicular ovina purificada, Amphadase® (Amphastar Pharmaceuticals), una
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hialuronidasa testicular bovina e Hydase™ (Prima Pharm Inc.), una hialuronidasa testicular bovina. Se entiende que cualquier preparación de hialuronidasa derivada de un animal se puede utilizar en los métodos y usos proporcionados en la presente memoria (véanse, p.ej. las Patentes de Estados Unidos Núm. 2.488.564, 2.488.565, 2.676.139, 2.795.529, 2.806.815, 2.808.362, 5.747.027 y 5.827.721 y la Solicitud Internacional PCT Núm. WO2005/118799). Hylenex® (Halozyme Therapeutics) es una hialuronidasa recombinante humana producida por células de ovario de hámster chino (CHO) modificadas genéticamente que contienen ácido nucleico que codifica formas solubles de PH20, denominada rHuPH20.
Los ejemplos de enzimas que degradan hialuronano en las composiciones y métodos proporcionados en la presente memoria son hialuronidasas solubles. Otras enzimas que degradan hialuronano ilustrativas incluyen, pero sin limitarse a, condroitinasas y liasas particulares que tienen la capacidad de escindir hialuronano.
Como se describe a continuación, las enzimas que degradan hialuronano existen en formas unidas a la membrana o solubles que se secretan desde las células. Para los fines de la presente invención, se proporcionan enzimas que degradan hialuronano solubles para su uso en los métodos, usos, composiciones o combinaciones de la presente memoria. Así, cuando las enzimas que degradan hialuronano incluyen un anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI) y/o están ancladas a la membrana o son insolubles, tales enzimas que degradan hialuronano se proporcionan en la presente memoria en forma soluble por truncamiento o deleción del anclaje GPI para producir la enzima secretada y soluble. Por lo tanto, las enzimas que degradan hialuronano incluyen variantes truncadas, p.ej. truncadas para eliminar todo o una parte de un ancla de GPI. Las enzimas que degradan hialuronano proporcionadas en la presente memoria también incluyen variantes alélicas o de especie u otras variantes de una enzima que degrada hialuronano soluble. Por ejemplo, las enzimas que degradan hialuronano pueden contener una o más variaciones en su secuencia primaria, tales como sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos. Una variante de una enzima que degrada hialuronano generalmente muestra al menos o aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia en comparación con la enzima que degrada hialuronano que no contiene la variación. Cualquier variación puede incluirse en la enzima que degrada hialuronano para los fines en la presente memoria siempre que la enzima conserve la actividad hialuronidasa, tal como al menos o aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o más de la actividad de una enzima que degrada hialuronano que no contiene la variación (medida mediante ensayos in vitro y/o in vivo bien conocidos en la técnica y descritos en la presente memoria).
Cuando los métodos y usos descritos en la presente memoria describen el uso de una hialuronidasa soluble, de acuerdo con ello se puede utilizar cualquier enzima que degrada hialuronano, generalmente una enzima que degrada hialuronano soluble. Se entiende que cualquier hialuronidasa puede utilizarse en los métodos y usos descritos en la presente memoria (véanse, p.ej., la Patente de Estados Unidos Núm. 7.767.429 y las Publicaciones de los Estados Unidos Núm. US20040268425 y US20100143457).
a. Hialuronidasas
Las hialuronidasas son miembros de una gran familia de enzimas que degradan hialuronano. Hay tres clases generales de hialuronidasas: hialuronidasas de tipo mamífero, hialuronidasas bacterianas e hialuronidasas de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos. Tales enzimas se pueden utilizar en las composiciones, combinaciones y métodos descritos en la presente memoria.
i. Hialuronidasas de tipo mamífero
Las hialuronidasas de tipo mamífero (EC 3.2.1.35) son endo-6-W-acetil-hexosaminidasas que hidrolizan el enlace glicosídico (6-1^4 del hialuronano a varias longitudes de oligosacáridos tales como tetrasacáridos y hexasacáridos. Estas enzimas tienen actividades tanto hidrolíticas como transglicosidasa, y pueden degradar hialuronano y condroitín sulfatos (CS), generalmente C4-S y C6-S. Las hialuronidasas de este tipo incluyen, pero sin limitarse a, hialuronidasas de vacas (bovinas) (SEQ ID nO: 10, 11 y 64 y BH55 (Patentes de Estados Unidos Núm. 5.747.027 y 5.827.721), moléculas de ácido nucleico expuestas en SEQ ID NO: 190-192), oveja (Ovis aries) (SEQ ID NO: 26, 27, 63 y 65, moléculas de ácido nucleico expuestas en SEQ ID NO: 66 y 193-194), avispa chaqueta amarilla (SEQ ID NO: 12 y 13), abeja melífera (SEQ ID nO: 14), avispón de cara blanca (SEQ iD NO: 15), avispa de papel (SEQ ID NO: 16), ratón (SEQ ID NO: 17-19, 32), cerdo (SEQ ID NO: 20-21), rata (SEQ ID NO: 22-24, 31), conejo (SEQ ID NO: 25), orangután (SEQ ID NO: 28), mono cynomolgus (SEQ ID NO: 29), cobaya (SEQ ID nO: 30), chimpancé (SEQ ID NO: 101), mono rhesus (SEQ ID NO: 102 e hialuronidasas humanas (SEQ ID NO: 1-2, 36-39). Las hialuronidasas ilustrativas en las composiciones, combinaciones y métodos descritos en la presente son hialuronidasas solubles.
Las hialuronidasas de mamíferos se pueden subdividir adicionalmente en aquellas que son neutras activas, que se encuentran predominantemente en extractos de testículos y activas ácidas, que se encuentran predominantemente en órganos tales como el hígado. Las hialuronidasas activas neutras ilustrativas incluyen PH20, incluyendo PH20 derivada de diferentes especies tales como ovina (SEQ ID NO: 27, 63 y 65), bovina (SEQ ID NO: 11 y 64) y humana
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(SEQ ID NO: 1). La PH20 humana (también conocida como SPAM1 o proteína de superficie de espermatozoide PH20), generalmente se une a la membrana plasmática a través de un ancla de glicosilfosfatidil inositol (GPI). Está implicada naturalmente en la adhesión del esperma-huevo y ayuda a la penetración de los espermatozoides de la capa de células del cumulus al digerir el ácido hialurónico.
Además de la PH20 humana (también denominada SPAM1), se han identificado cinco genes similares a la hialuronidasa en el genoma humano, HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4 e HYALP1. HYALP1 es un pseudogen y no se ha demostrado que HYAL3 (SEQ ID NO: 38) posea actividad enzimática frente a sustratos conocidos. HYAL4 (polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 39) es una condroitinasa y exhibe poca actividad frente a hialuronano. HYAL1 (polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 36) es la enzima prototípica activa frente a ácido y PH20 (polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 1) es la enzima prototípica neutral-activa. Las hialuronidasas ácidas activas, tales como HYAL1 y HYAL2 (polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 37) generalmente carecen de actividad catalítica a pH neutro (es decir a pH 7). Por ejemplo, HYAL1 tiene poca actividad catalítica in vitro con un pH de 4,5 (Frost et al. (1997) Anal. Biochem. 251:263-269). HYAL2 es una enzima activa frente a ácidos con una actividad específica muy baja in vitro. Las enzimas de tipo hialuronidasa también se pueden caracterizar por las que generalmente están unidas a la membrana plasmática a través de un ancla de glicosilfosfatidil inositol (GPI) tal como HYAL2 humana y PH20 humana (Danilkovitch-Miagkova et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100 (8):4580-5), y aquellos que son generalmente solubles tales como HYAL1 humana (Frost et al. (1997) Biochem Biophys Res Commun. 236(1):10-5).
PH20
La PH20, como otras hialuronidasas de mamíferos, es una endo-S-N-acetil-hexosaminidasa que hidroliza el enlace glicosídico (31 —^4 del ácido hialurónico a diversas longitudes de oligosacáridos tales como tetrasacáridos y hexasacáridos. Tiene actividad hidrolítica y transglicosidasa y puede degradar el ácido hialurónico y los condroitin sulfatos, tales como C4-S y C6-S. La PH20 participa de forma natural en la adhesión de esperma-huevo y ayuda a la penetración de espermatozoides en la capa de células del cumulus al digerir el ácido hialurónico. La PH20 se encuentra en la superficie de los espermatozoides y en el acrosoma derivado de los lisosomas, donde está unido a la membrana acrosómica interna. La PH20 de la membrana plasmática tiene actividad de hialuronidasa solo a pH neutro, mientras que la PH20 de la membrana acrosómica interna tiene actividad a pH neutro y ácido. Además de ser una hialuronidasa, PH20 también parece ser un receptor para la señalización celular inducida por HA y un receptor para la zona pelúcida que rodea al ovocito.
Las proteínas PH20 ilustrativas incluyen polipéptidos PH20 humanos (polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 1, polipéptido maduro expuesto en SEQ ID NO: 2), de chimpancé (SeQ ID NO: 101), de mono Rhesus (SEQ ID NO: 102), bovinos (SEQ ID NO: 11 y 64), de conejo (SEQ ID NO: 25), PH20 ovina (SEQ ID NO: 27, 63 y 65), mono Cynomolgus (SEQ ID NO: 29), cobaya (SEQ ID NO: 30), de rata (SEQ ID NO: 31) y de ratón (SEQ ID NO: 32).
La PH20 bovina es un polipéptido precursor de 553 aminoácidos (SEQ ID NO: 11). El alineamiento de PH20 bovina con la PH20 humana muestra solo una débil homología, con múltiples lagunas existentes desde el aminoácido 470 hasta los respectivos extremos carboxi debido a la ausencia de un ancla de GPI en el polipéptido bovino (véase p.ej., Frost GI (2007) Expert Opin. Drug. Deliv. 4:427-440). De hecho, las anclas de GPI claras no se predicen en muchas otras especies de PH20 además de las humanas. Por lo tanto, los polipéptidos de PH20 producidos a partir de óvidos y bóvidos existen naturalmente como formas solubles. Aunque la PH20 bovina existe unida muy laxamente a la membrana plasmática, ésta no está anclada a través de un ancla sensible a la fosfolipasa (Lalancette et al. (2001) Biol Reprod. 65(2):628-36). Esta característica única de la hialuronidasa bovina ha permitido el uso de la enzima hialuronidasa de los testículos bovinos como un extracto para uso clínico (Wydase®, Hyalase®).
El transcrito de ARNm de PH20 humana se traduce normalmente para generar un polipéptido precursor de 509 aminoácidos (SEQ ID NO: 1) que contiene una secuencia de señal de 35 aminoácidos en el extremo N (posiciones de residuos de aminoácido 1-35) y una secuencia de señal de unión del ancla de glicosilfosfatidilinositol (GPI) de 19 aminoácidos en el extremo C (posiciones de residuos de aminoácido 491-509). La PH20 madura, por lo tanto, es un polipéptido de 474 aminoácidos expuesto en SEQ ID NO: 2. Después del transporte del polipéptido precursor al RE y la eliminación del péptido señal, el péptido señal de unión a GPI C-terminal se escinde para facilitar la unión covalente de un anclaje GPI al aminoácido C-terminal recién formado en la posición de aminoácido correspondiente a la posición 490 del polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 1. De este modo, se produce un polipéptido maduro anclado a GPI de 474 aminoácidos con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2.
La PH20 humana exhibe actividad de hialuronidasa a pH neutro y ácido. En un aspecto, la PH20 humana es la hialuronidasa prototípica neutra activa que generalmente se bloquea en la membrana plasmática a través de un ancla de GPI. En otro aspecto, la PH20 se expresa en la membrana acrosomal interna donde tiene actividad hialuronidasa a pH neutro y ácido. Parece que PH20 contiene dos sitios catalíticos en distintas regiones del polipéptido: las regiones de Péptido 1 y del Péptido 3 (Cherr et al., (2001) Matrix Biology 20:515-525). La evidencia indica que la región del Péptido 1 de PH20, que corresponde a las posiciones de aminoácidos 107-137 del
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polipéptido maduro expuesto en SEQ ID NO: 2 y las posiciones 142-172 del polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 1, es requerida para la actividad de la enzima a pH neutro. Los aminoácidos en las posiciones 111 y 113 (correspondientes al polipéptido PH20 maduro expuesto en SEQ ID NO: 2) dentro de esta región parecen ser importantes para la actividad, ya que la mutagénesis por sustitución de aminoácidos da como resultado polipéptidos PH20 con 3% de actividad hialuronidasa o actividad hialuronidasa indetectable, respectivamente, en comparación con la PH20 de tipo salvaje (Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814).
La región del péptido 3, que corresponde a las posiciones de aminoácidos 242-262 del polipéptido maduro expuesto en SEQ ID NO: 2, y las posiciones 277-297 del polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 1, parece ser importante para actividad enzimática a pH ácido. Dentro de esta región, los aminoácidos en las posiciones 249 y 252 del polipéptido PH20 maduro parecen ser esenciales para la actividad, y la mutagénesis de cualquiera de los dos da como resultado un polipéptido esencialmente desprovisto de actividad (Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814).
Además de los sitios catalíticos, PH20 también contiene un sitio de unión a hialuronano. La evidencia experimental indica que este sitio está ubicado en la región del Péptido 2, que corresponde a las posiciones de aminoácidos 205235 del polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 1 y las posiciones 170-200 del polipéptido maduro expuesto en SEQ ID NO: 2. Esta región está altamente conservada entre las hialuronidasas y es similar al motivo de unión a heparina. La mutación del residuo de arginina en la posición 176 (correspondiente al polipéptido PH20 maduro expuesto en SEQ ID NO: 2) a una glicina da como resultado un polipéptido con solo aproximadamente 1% de la actividad hialuronidasa del polipéptido salvaje (Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814).
Existen siete posibles sitios de glicosilación ligados a N en PH20 humana en N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 del polipéptido ilustrados en SEQ ID NO: 1. Debido a que parecen que los aminoácidos 36 a 464 de SEQ ID NO: 1 contienen el dominio de hialuronidasa de PH20 humana mínimamente activo, el sitio de glicosilación ligado a N N-490 no se requiere para la actividad hialuronidasa apropiada. Existen seis enlaces disulfuro en PH20 humana. Dos enlaces disulfuro entre los residuos de cisteína C60 y C351 y entre C224 y C238 del polipéptido ilustrado en SEQ ID NO: 1 (correspondiente a los residuos C25 y C316, y C189 y C203 del polipéptido maduro expuesto en SEQ ID NO: 2, respectivamente). Se forman otros cuatro enlaces disulfuro entre los residuos de cisteína C376 y C387; entre C381 y C435; entre C437 y C443; y entre C458 y C464 del polipéptido ilustrado en SEQ ID NO: 1 (correspondiente a los residuos C341 y C352; entre C346 y C400; entre C402 y C408; y entre C423 y C429 del polipéptido maduro expuesto en SEQ ID NO: 2, respectivamente).
ii. Hialuronidasas bacterianas
Las hialuronidasas bacterianas (EC 4.2.2.1 o EC 4.2.99.1) degradan el hialuronano y, en diversos grados, los condroitin sulfatos y los dermatán sulfatos. Las hialuronano liasas aisladas de bacterias difieren de las hialuronidasas (de otras fuentes, p.ej., hialuronoglucosaminidasas, EC 3.2.1.35) en su modo de acción. Son endo-S- N-acetilhexosaminidasas que catalizan una reacción de eliminación, en lugar de hidrólisis, del enlace (31 —»4- glucosídico entre N-acetil-beta-D-glucosamina y residuos de ácido D-glucurónico en el hialuronano, produciendo tetra- y hexasacáridos de 3-(4-desoxi)S-D-gluc-4-enuronosil)-N-acetil-D-glucosamina, y productos finales disacáridos. La reacción da como resultado la formación de oligosacáridos con residuos de ácido hexurónico insaturado en sus extremos no reductores.
Las hialuronidasas ilustrativas de bacterias para su uso en las composiciones, combinaciones y métodos proporcionados incluyen, pero sin limitarse a, enzimas que degradan hialuronano en microorganismos, incluyendo cepas de Arthrobacter, Bdellovibrio, Clostridium, Micrococcus, Streptococcus, Peptococcus, Propionibacterium, Bacteroides, y Streptomyces. Los ejemplos concretos de tales cepas y enzimas incluyen, pero sin limitarse a Arthrobacter sp. (cepa FB24) (SEQ ID NO: 67), Bdellovibrio bacteriovorus (SEQ ID nO: 68), Propionibacterium acnes (SEQ ID nO: 69), Streptococcus agalactiae ((SEQ ID NO: 70); 18RS21 (SEQ ID NO: 71); serotipo Ia (SEQ ID NO: 72); serotipo III (sEq ID NO: 73), Staphylococcus aureus (cepa COL (SEQ ID NO: 74); cepa MRSA252 (SEQ ID NO: 75 y 76); cepa MSSA476 (SEQ ID NO: 77); cepa NCTC 8325 (SEQ ID NO: 78); cepa bovina RF122 (SEQ ID NO: 79 y 80); cepa USA300 (SeQ ID NO: 81), Streptococcus pneumoniae ((SEQ ID NO: 82); cepa ATCC BAA- 255/R6 (SEQ ID No: 83); serotipo 2, cepa D39/NCTC 7466 (SEQ ID NO: 84), Streptococcus pyogenes (serotipo M1) (SEQ ID NO: 85); serotipo M2, cepa MGAS10270 (SEQ ID NO: 86); serotipo M4, cepa MGAS10750 (SEQ ID NO: 87); serotipo M6 (SEQ ID NO: 88); serotipo M12, cepa MGAS2096 (SeQ ID NO: 89 y 90); serotipo M12, cepa MGAS9429 (SEQ ID NO: 91); serotipo M28 (SEQ ID NO: 92); Streptococcus suis (SEQ ID NO: 93-95); Vibrio fischeri (cepa ATCC 700601/ES114 (SEQ ID NO: 96)), y la enzima hialuronidasa de Streptomyces hyaluronolyticus, que es específica para el ácido hialurónico y no escinde la condroitina o el condroitin sulfato (Ohya, T. y Kaneko, Y. (1970) Biochim. Biophys. Acta 198:607).
iii. Hialuronidasas de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos
Las hialuronidasas de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos (EC 3.2.1.36) son endo-S-glucuronidasas que
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generan productos finales tetra y hexasacáridos. Estas enzimas catalizan la hidrólisis de enlaces 1^3 entre p-D- glucuronato y residuos de N-acetil-D-glucosamina en hialuronato. Las hialuronidasas ilustrativas de sanguijuelas incluyen, pero sin limitarse a, hialuronidasa de Hirudinidae (p.ej., Hirudo medicinalis), Erpobdellidae (p.ej., Nephelopsis obscura y Erpobdella punctata,), Glossiphoniidae (p.ej., Desserobdella picta, Helobdella stagnalis, Glossiphonia complanata, Placobdella ornata y Theromyzon sp.) y Haemopidae (Haemopis marmorata) (Hovingh et al. (1999) Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 124(3):319-26). Una hialuronidasa ilustrativa de bacterias que tiene el mismo mecanismo de acción que la hialuronidasa de sanguijuela es la de cianobacterias, Synechococcus sp. (cepa RCC307, SEQ ID NO: 97).
b. Otras enzimas que degradan hialuronano
Además de la familia de hialuronidasas, se pueden utilizar otras enzimas que degradan hialuronano en las composiciones, combinaciones y métodos descritos. Por ejemplo, se pueden emplear enzimas, que incluyen condroitinasas y liasas particulares, que tienen la capacidad de escindir hialuronano. Las condroitinasas que pueden degradar hialuronano ilustrativas incluyen condroitina ABC liasa (también conocida como condroitinasa ABC), condroitina AC liasa (también conocida como condroitín sulfato liasa o condroitín sulfato eliminasa) y condroitina C liasa. Los métodos para la producción y purificación de tales enzimas para su uso en las composiciones, combinaciones y métodos descritos son conocidos en la técnica (p.ej., Patente de Estados Unidos Núm. 6.054.569; Yamagata, et al. (1968) J. Biol. Chem. 243(7):1523-1535; Yang et al. (1985) J. Biol. Chem. 160(30):1849-1857).
La condroitina ABC liasa contiene dos enzimas, condroitina-sulfato-ABC-endoliasa (EC 4.2.2.20) y condroitina- sulfato-ABC exoliasa (EC 4.2.2.21) (Hamai et al. (1997) J Biol Chem. 272 (14): 9123-30), que degradan una variedad de glicosaminoglicanos del tipo condroitin sulfato y dermatan sulfato. El condroitin sulfato, el proteoglicano condroitín sulfato y el dermatan sulfato son los subestados preferidos para la condroitina-sulfato-ABC-endoliasa, pero la enzima también puede actuar sobre el hialuronano a una velocidad menor. La condroitin-sulfato-ABC endoliasa degrada una variedad de glicosaminoglicanos del tipo condroitin sulfato y dermatan sulfato, produciendo una mezcla de oligosacáridos A4 insaturados de diferentes tamaños que finalmente se degradan a tetra y disacáridos insaturados. La condroitina-sulfato-ABC exoliasa tiene la misma especificidad de sustrato pero elimina los residuos disacáridos de los extremos no reductores de condroitín sulfatos poliméricos y de sus fragmentos oligosacáridos producidos por condroitin-sulfato-ABC endoliasa (Hamai, A. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:9123-9130). Las condroitín sulfato-ABC-endoliasas y condroitin sulfato-ABC-exoliasas ilustrativas incluyen las de Proteus vulgaris y Flavobacterium heparinum (la condroitin-sulfato-ABC endoliasa de Proteus vulgaris se expone en SEQ ID NO: 98 (Sato et al. (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41(1):39-46).
La condroitina AC liasa (EC 4.2.2.5) es activa sobre los condroitinsulfatos A y C, la condroitina y el ácido hialurónico, pero no es activa sobre el dermatan sulfato (condroitin sulfato B). Las enzimas de condroitinasa AC ilustrativas de bacterias incluyen las de Flavobacterium heparinum y Victivallis vadensis, expuestas en SEQ ID NO: 99 y 100, respectivamente, y Arthrobacter aurescens (Tkalec et al. (2000) Applied and Environmentan Microbiology 66(1):29- 35; Ernst et al. (1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444).
La condroitinasa C escinde el condroitin sulfato C produciendo tetrasacárido más un disacárido sulfatado en la posición 6 insaturado (delta Di-6S). También escinde el ácido hialurónico que produce el disacárido no sulfatado insaturado (delta Di-OS). Las enzimas de condroitinasa C ilustrativas de bacterias incluyen las de Streptococcus y Flavobacterium (Hibi et al. (1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4; Michelacci et al. (1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8; Tsuda et al. (1999) Eur. J. Biochem. 262:127-133).
c. Enzimas solubles que degradan hialuronano
En las composiciones, combinaciones, usos y métodos descritos en la presente memoria se proporcionan enzimas que degradan hialuronano solubles, que incluyen hialuronidasas solubles. Las enzimas que degradan hialuronano soluble incluyen cualquier enzima que degrada hialuronano que se secreta a partir de células (p.ej., célula CHO) tras la expresión y existe en forma soluble. Dichas enzimas incluyen hialuronidasas solubles, que incluyen hialuronidasas solubles no humanas, que incluyen hialuronidasas solubles de animales no humanos, hialuronidasas solubles en bacterias e hialuronidasas humanas, Hyal1, PH20 bovina y PH20 ovina, variantes alélicas de las mismas y otras variantes de las mismas. Por ejemplo, entre las enzimas que degradan hialuronano soluble se incluyen enzimas que degradan hialuronano que se han modificado para que sean solubles. Por ejemplo, las enzimas que degradan hialuronano que contienen un ancla de GPI se pueden hacer solubles mediante el truncamiento y la eliminación de la totalidad o una parte del ancla de GPI. En un ejemplo, la hialuronidasa humana PH20, que normalmente está anclada a la membrana a través de un ancla de GPI, puede hacerse soluble mediante el truncamiento y la eliminación de toda o una parte del ancla de GPI en el extremo C-terminal.
Las enzimas que degradan hialuronano soluble también incluyen hialuronidasas activas en condiciones neutras y activas en condiciones ácidas. Dependiendo de factores, tales como, pero sin limitarse a, el nivel deseado de actividad de la enzima después de la administración y/o el sitio de administración, se pueden seleccionar
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hialuronidasas activas en condiciones neutras y activas en condiciones ácidas. En un ejemplo concreto, la enzima que degrada hialuronano para su uso en las composiciones, combinaciones y métodos de la presente invención es una hialuronidasa activa en condiciones neutras soluble.
Una hialuronidasa soluble ilustrativa es PH20 de cualquier especie, tal como cualquiera de las expuestas en SEQ ID NO: 1, 2, 11, 25, 27, 29-32, 63-65 y 101-102, o formas truncadas de las mismas que carecen de toda o una porción del ancla de GPI C-terminal, siempre que la hialuronidasa sea soluble (secretada tras la expresión) y conserve la actividad hialuronidasa. También se incluyen entre las hialuronidasas solubles las variantes alélicas u otras variantes de cualquiera de SEQ ID NO: 1, 2, 11, 25, 27, 29-32, 63-65 y 101-102, o formas truncadas de las mismas. Las variantes alélicas y otras variantes son conocidas por un experto en la técnica, e incluyen polipéptidos que tienen 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%. 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NO: 1,2, 11, 25, 27, 29-32, 63-65 y 101-102, o formas truncadas de los mismos. Las variantes de aminoácidos incluyen mutaciones conservativas y no conservativas. Se entiende que los residuos que son importantes o que se requieren de otro modo para la actividad de una hialuronidasa, tal como cualquiera de los descritos anteriormente o conocidos por los expertos en la técnica, son generalmente invariables y no pueden modificarse. Estos incluyen, por ejemplo, residuos de sitios activos. Por lo tanto, por ejemplo, los residuos de aminoácido 111, 113 y 176 (correspondientes a residuos en el polipéptido PH20 maduro expuesto en SEQ ID NO: 2) de un polipéptido de PH20 humana, o una forma soluble del mismo, son generalmente invariantes y no están alterados. Otros residuos que confieren glicosilación y formación de enlaces disulfuro requeridos para el plegamiento adecuado también pueden ser invariantes.
En algunos casos, la enzima que degrada hialuronano soluble normalmente está anclada a GPI (tal como, por ejemplo, PH20 humana) y se vuelve soluble mediante truncamiento en el extremo C-terminal. Tal truncamiento puede eliminar toda la secuencia señal de unión del ancla de GPI, o puede eliminar solo parte de la secuencia señal de unión del ancla de GPI. El polipéptido resultante, sin embargo, es soluble. En casos donde la enzima que degrada hialuronano soluble conserva una porción de la secuencia señal de unión del ancla de GPI, se pueden conservar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más residuos de aminoácido en la secuencia señal de unión del ancla de GPI, siempre que el polipéptido sea soluble. Los polipéptidos que contienen uno o más aminoácidos del ancla de GPI se denominan enzimas que degradan hialuronano soluble extendidas. Un experto en la técnica puede determinar si un polipéptido está anclado mediante GPI utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Dichos métodos incluyen, pero sin limitarse a, utilizar algoritmos conocidos para predecir la presencia y ubicación de la secuencia de señal de unión del ancla de GPI y el sitio w, y realizar análisis de solubilidad antes y después de la digestión con fosfolipasa C específica de fosfatidilinositol (PI-pLc ) o D (PI-PLD).
Se pueden producir enzimas que degradan hialuronano soluble extendidas realizando truncamientos C-terminales en cualquier enzima que degrada hialuronano anclada naturalmente a GPI de modo que el polipéptido resultante sea soluble y contenga uno o más residuos de aminoácido de la secuencia de señal de unión del ancla de GPI (véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente de Estados Unidos Publicada Núm. US20100143457). Las enzimas que degradan hialuronano soluble extendidas ilustrativas que están truncadas C-terminalmente pero conservan una porción de la secuencia señal de unión del ancla de GPI incluyen polipéptidos de PH20 solubles extendidos (esPH20) de origen de primate, tales como, por ejemplo, polipéptidos esPH20 humanos y de chimpancé. Por ejemplo, los polipéptidos esPH20 pueden prepararse por truncamiento C-terminal de cualquiera de los polipéptidos maduros o precursores expuestos en los SEQ ID NO: 1, 2 o 101, o sus variantes alélica u otras, incluyendo sus fragmentos activos, en el que el resultado el polipéptido es soluble y conserva uno o más residuos de aminoácido de la secuencia de señal de unión de anclaje de GPI. Las variantes alélicas y otras variantes son conocidas por los expertos en la técnica e incluyen polipéptidos que tienen 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% o más identidad de secuencia con cualquiera de sEq ID NO: 1 o 2. Los polipéptidos esPH20 proporcionados en la presente memoria pueden truncarse C-terminalmente con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos en comparación con el tipo polipéptido de tipo salvaje, tal como un polipéptido con una secuencia expuesta en los SEQ ID NO: 1, 2 o 101, con la condición de que el polipéptido esPH20 resultante sea soluble y conserve 1 o más residuos de aminoácido de la secuencia señal de unión del ancla de GPI.
Típicamente, para su uso en las composiciones, combinaciones y métodos descritos en la presente memoria, se utiliza una enzima que degrada hilauronano humana soluble, tal como una PH20 humana soluble. Aunque se pueden utilizar enzimas que degradan hilauronano, tales como PH20, de otros animales, tales preparaciones son potencialmente inmunogénicas, ya que son proteínas animales. Por ejemplo, una proporción significativa de pacientes demuestra una sensibilización previa secundaria a los alimentos ingeridos, y dado que se trata de proteínas animales, todos los pacientes tienen un riesgo de sensibilización posterior. Por lo tanto, las preparaciones no humanas pueden no ser adecuadas para uso crónico. Si se desean preparaciones no humanas, se contempla en la presente memoria que tales polipéptidos puedan prepararse para tener una inmunogenicidad reducida. Tales modificaciones están dentro del nivel de un experto en la técnica y pueden incluir, por ejemplo, la eliminación y/o la sustitución de uno o más epítopos antigénicos en la molécula.
Las enzimas que degradan hialuronano, que incluyen hialuronidasas (p.ej., PH20), utilizadas en los métodos
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descritos en la presente memoria pueden producirse recombinantemente o pueden purificarse o purificarse parcialmente a partir de fuentes naturales, tales como, por ejemplo, extractos de testículos. Los métodos para la producción de proteínas recombinantes, que incluyen enzimas que degradan hialuronano recombinantes, se proporcionan en cualquier parte de la presente memoria y son bien conocidos en la técnica.
i. PH20 humana soluble
Una hialuronidasa soluble ilustrativa es PH20 humana soluble. Se han producido formas solubles de PH20 humana recombinante y se pueden utilizar en las composiciones, combinaciones y métodos descritos en la presente memoria. La producción de tales formas solubles de PH20 se describe en las Solicitudes de Patente Publicadas de Estados Unidos. Núm. US20040268425; US20050260186, US20060104968, US20100143457 y la Solicitud Internacional PCT Núm. WO2009111066. Por ejemplo, los polipéptidos PH20 solubles, incluyen polipéptidos variantes truncados C-terminalmente que incluyen una secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO: 1, o tienen al menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, 98% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos incluidos en SEQ ID NO: 1, conservan la actividad de hialuronidasa y son solubles. Están incluidos entre estos polipéptidos los polipéptidos PH20 solubles que carecen completamente de toda o una porción la secuencia señal de unión del ancla de GPI.
También se incluyen polipéptidos solubles extendidos de PH20 (esPH20) que contienen al menos un aminoácido del ancla de GPI. Por lo tanto, en lugar de tener un ancla de GPI unida covalentemente al extremo C terminal de la proteína en el RE y estar anclado a la capa extracelular de la membrana plasmática, estos polipéptidos se secretan y son solubles. Los polipéptidos PH20 truncados C-terminalmente se pueden truncar C-terminalmente en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 o más aminoácidos en comparación con el polipéptido de tipo salvaje completo, tal como un polipéptido de tipo salvaje completo con una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1 o 2, o sus variantes alélicas o de especie u otras variantes.
Por ejemplo, las formas solubles incluyen, pero sin limitarse a, polipéptidos truncados C-terminales de PH20 humana expuestos en SEQ ID NO: 1 que tienen un residuo de aminoácido C-terminal 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482 y 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 o 500 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, o polipéptidos que exhiben al menos 85% de identidad con la misma. Las formas solubles de PH20 humana generalmente incluyen aquellas que contienen los aminoácidos 36-464 expuestos en SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, cuando se expresa en células de mamífero, la secuencia señal N-terminal de 35 aminoácidos se escinde durante el procesamiento, y la forma madura de la proteína se secreta. Por lo tanto, los polipéptidos solubles maduros contienen los aminoácidos 36 a 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482 y 483 de SEQ ID NO: 1. La Tabla 3 proporciona ejemplos no limitantes de polipéptidos PH20 truncados en el extremo C ilustrativos, que incluyen polipéptidos PH20 solubles truncados en el extremo C-terminal. En la Tabla 3 siguiente, se proporciona la longitud (en aminoácidos) de los polipéptidos precursores y maduros, y el identificador de secuencia (SEC ID NO) en el que se proporcionan secuencias de aminoácidos ilustrativas de los polipéptidos precursores y maduros de las proteínas PH20 truncadas en el extremo C. El polipéptido de PH20 de tipo salvaje también se incluye en la Tabla 3 como comparación. En particular, las hialuronidasas solubles ilustrativas son polipéptidos de PH20 humanas solubles que tienen 442, 443, 444, 445, 446 o 447 aminoácidos de longitud, tal como se expone en cualquiera de SEQ ID NO: 49, o sus variantes alélicas o de especie u otras variantes.
Tabla 3. Polipéptidos de PH20 truncados en el extremo C terminal ilustrativos
Polipéptido
Precursor (aminoácidos) Precursor SEQ ID NO Maduro (aminoácidos) SEQ ID madura NO
tipo salvaje
509 1 474 2
SPAM1-SILF
500 139 465 183
SPAM-VSIL
499 106 464 150
SPAM1-IVSI
498 140 463 184
SPAM1-FIVS
497 107 462 151
SPAM1-MFIV
496 141 461 185
SPAM1-TMFI
495 108 460 152
SPAM1-ATMF
494 142 459 186
SPAM-SATM
493 109 458 153
SPAM1-LSAT
492 143 457 187
Tabla 3. Polipéptidos de PH20 truncados en el extremo C terminal ilustrativos
Polipéptido
Precursor (aminoácidos) Precursor SEQ ID NO Maduro (aminoácidos) SEQ ID madura NO
SPAM1-TLSA
491 110 456 154
SPAM1-PSTL
489 111 454 155
SPAM1-SPST
488 144 453 188
SPAM1-STLS
490 112 455 156
SPAM1-ASPS
487 113 452 157
SPAM1-NASP
486 145 451 189
SPAM1-YNAS
485 114 450 158
SPAM1-FYNA
484 115 449 159
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Las formas generalmente solubles de PH20 se producen utilizando sistemas de expresión de proteínas que facilitan la N-glicosilación correcta para asegurar que el polipéptido conserva la actividad, ya que la glicosilación es importante para la actividad catalítica y la estabilidad de las hialuronidasas. Tales células incluyen, por ejemplo, 5 células de ovario de hámster chino (CHO) (p.ej. Células CHO DG44).
ii. rHuPH20
Se han generado formas solubles recombinantes de PH20 humana y se pueden utilizar en las composiciones, 10 combinaciones y métodos descritos en la presente memoria. La generación de tales formas solubles de PH20 humana recombinante se describe, por ejemplo, en las solicitudes de patente publicadas de los Estados Unidos Núm. US20040268425; US 20050260186; US20060104968; US20100143457; y la Solicitud Internacional PCT Núm. WO2009111066. Los ejemplos de tales polipéptidos son los generados por la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica los aminoácidos 1-482 (expuesta en SEQ ID NO: 3). Tal molécula de ácido nucleico ilustrativa 15 se expone en SEQ ID NO: 49. El procesamiento postraduccional elimina la secuencia señal de 35 aminoácidos, dejando una PH20 humana recombinante soluble en 447 aminoácidos (SEQ ID NO: 4). Según se produce en el medio de cultivo, existe heterogeneidad en el extremo C de manera que el producto, denominado rHuPH20, incluye
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una mezcla de especies que puede incluir uno o más de los SEQ ID NOS. 4-9 en diversa abundancia. Típicamente, rHuPH20 se produce en células que facilitan la N-glicosilación correcta para conservar la actividad, tal como células CHO (p.ej., células CHO DG44).
d. Glicosilación de enzimas que degradan hialuronano
La glicosilación, incluyendo la glicosilación ligada a N y O, de algunas enzimas que degradan hialuronano, incluidas las hialuronidasas, puede ser importante por su actividad catalítica y estabilidad. Aunque la alteración del tipo de glicano que modifica una glicoproteína puede tener efectos drásticos sobre la antigenicidad, el plegamiento estructural, la solubilidad y la estabilidad de una proteína, no se cree que la mayoría de las enzimas requieran la glicosilación para una actividad enzimática óptima. Para algunas hialuronidasas, la eliminación de la glicosilación ligada a N puede dar como resultado una inactivación casi completa de la actividad hialuronidasa. Por lo tanto, para tales hialuronidasas, la presencia de glicanos ligados a N es crítica para generar una enzima activa.
Los oligosacáridos ligados a N pertenecen a varios tipos principales (oligomanosa, complejo, híbrido, sulfatado), todos los cuales tienen núcleos (Man) 3-GlcNAc-GlcNAc unidos mediante el nitrógeno amídico de residuos de Asn que se encuentran dentro de las secuencias -Asn-Xaa-Thr/Ser- (donde Xaa no es Pro). Se ha informado sobre glicosilación en un sitio -Asn-Xaa-Cys para la proteína C de coagulación. En algunos casos, una enzima que degrada hialuronano, tal como una hialuronidasa, puede contener enlaces N-glucosídicos y O-glucosídicos. Por ejemplo, PH20 tiene oligosacáridos ligados a O así como oligosacáridos ligados a N. Hay siete posibles sitios de glicosilación ligados a N en N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 de PH20 humana ilustrados en SEQ ID NO: 1. Los residuos de aminoácido N82, N166 y N254 están ocupados por glicanos de tipo complejo, mientras que los residuos de aminoácido N368 y N393 están ocupados por glicanos de tipo manosa alta. El residuo de aminoácido N235 está ocupado por aproximadamente un 80% de glicanos de tipo de alto contenido de manosa y un 20% de glicanos de tipo complejo. Como se indicó anteriormente, la glicosilación ligada a N en N490 no es necesaria para la actividad de hialuronidasa.
En algunos ejemplos, las enzimas que degradan hialuronano para su uso en las composiciones, combinaciones y/o métodos proporcionados están glicosiladas en uno o en todos los sitios de glicosilación. Por ejemplo, para PH20 humana, o una forma soluble del mismo, 2, 3, 4, 5 o 6 de los sitios de N-glicosilación correspondientes a los aminoácidos N82, N166, N235, N254, N368 y N393 de SEQ ID NO: 1 están glicosilados. En algunos ejemplos, las enzimas que degradan hialuronano están glicosiladas en uno o más sitios de glicosilación nativos. En otros ejemplos, las enzimas que degradan hialuronano se modifican en uno o más sitios de glicosilación no nativos para conferir glicosilación del polipéptido en uno o más sitios adicionales. En dichos ejemplos, la unión de radicales azúcar adicionales puede potenciar las propiedades farmacocinéticas de la molécula, tales como una semivida mejorada y/o una actividad mejorada.
En otros ejemplos, las enzimas que degradan hialuronano para su uso en las composiciones, combinaciones y/o métodos descritos en la presente memoria están parcialmente desglicosiladas (o polipéptidos parcialmente N- glicosilados). Por ejemplo, los polipéptidos PH20 solubles parcialmente desglicosilados que conservan la totalidad o una parte de la actividad hialuronidasa de una hialuronidasa completamente glicosilada se pueden utilizar en las composiciones, combinaciones y/o métodos descritos en la presente memoria. Las hialurodinasas parcialmente desglicosiladas ilustrativas incluyen formas solubles de polipéptidos PH20 parcialmente desglicosilados de cualquier especie, tal como cualquiera de SEQ ID NO: 1, 2, 11, 25, 27, 29-32, 63, 65 y 101-102, o variantes alélicas, variantes truncadas u otras variantes de las mismas. Tales variantes son conocidas por los expertos en la técnica e incluyen polipéptidos que tienen una identidad de secuencia del 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% o más con cualquiera de SEQ ID NOS: 1, 2, 11, 25, 27, 29-32, 63, 65 y 101-102, o formas truncadas de los mismos. Las hialuronidasas parcialmente desglicosiladas proporcionadas en la presente memoria también incluyen hialuronidasas parcialmente desglicosiladas híbridas, de fusión y quiméricas, y productos conjugados de hialuronidasa parcialmente desglicosiladas.
Las glicosidasas, o glucósido hidrolasas, son enzimas que catalizan la hidrólisis del enlace glicosídico para generar dos azúcares más pequeños. Los principales tipos de N-glicanos en vertebrados incluyen manosa, glicanos, glicanos híbridos y glicanos complejos. Existen varias glicosidasas que dan como resultado únicamente una desglicosilación parcial de proteína, incluyendo: EndoF1, que escinde glicanos de tipo manosa y de tipo híbrido; EndoF2, que escinde glicanos de tipo complejo biantenario; EndoF3, que escinde glicanos complejos biantenarios y más ramificados; y EndoH, que escinde glicanos de tipo manosa y tipo híbrido. El tratamiento de una enzima que degrada hialuronano, tal como una hialuronidasa soluble, tal como una PH20 soluble, con una o todas estas glicosidasas puede dar como resultado una desglicosilación solo parcial y, por lo tanto, la retención de la actividad hialuronidasa.
Las enzimas que degradan hialuronano parcialmente desglicosiladas, tales como las hialuronidasas solubles parcialmente desglicosiladas, pueden producirse por digestión con una o más glicosidasas, generalmente una glicosidasa que no elimina todos los N-glicanos, sino que solo desglicosila parcialmente la proteína. Por ejemplo, el
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tratamiento de PH20 (p.ej., una PH20 recombinante denominada rHuPH20) con una o la totalidad de las glicosidasas anteriores (p.ej., EndoF1, EndoF2 y/o EndoF3) da como resultado una desglicosilación parcial. Estos polipéptidos de PH20 parcialmente desglicosilados pueden exhibir actividad enzimática hialuronidasa que es comparable a los polipéptidos completamente glicosilados. Por el contrario, el tratamiento de PH20 con PNGasaF, una glicosidasa que escinde todos los N-glicanos, da como resultado la eliminación completa de todos los N- glicanos y por lo tanto hace que PH20 sea enzimáticamente inactiva. Por lo tanto, aunque todos los sitios de glicosilación ligados a N (tales como, por ejemplo, los de los aminoácidos N82, N166, N235, N254, N368 y N393 de PH20 humana, ilustrados en SEQ ID NO: 1) pueden glicosilarse, el tratamiento con una o más glicosidasas puede reducir el grado de glicosilación en comparación con una hialuronidasa que no se digiere con una o más glicosidasas.
Las enzimas que degradan hialuronano parcialmente desglicosiladas, incluyendo polipéptidos PH20 solubles parcialmente desglicosilados, pueden tener 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% u 80% del nivel de glicosilación de un polipéptido completamente glicosilado. En un ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de los sitios de N-glicosilación correspondientes a los aminoácidos N82, N166, N235, N254, N368 y N393 de SEQ ID NO: 1 están parcialmente desglicosilados, de forma tal que ya no contienen glicanos de alto contenido de manosa o de tipo complejo, sino que contienen al menos un radical de N-acetilglucosamina. En algunos ejemplos, 1, 2 o 3 de los sitios de N-glicosilación que corresponden a los aminoácidos N82, N166 y N254 de SEQ ID NO: 1 están desglicosilados, es decir, no contienen un radical de azúcar. En otros ejemplos, 3, 4, 5 o 6 de los sitios de N-glicosilación que corresponden a los aminoácidos N82, N166, N235, N254, N368 y N393 de SEQ ID NO: 1 están glicosilados. Los residuos de aminoácido glicosilados contienen mínimamente un radical N-acetilglucosamina. Típicamente, las enzimas que degradan hialuronano parcialmente desglicosiladas, que incluyen polipéptidos PH20 solubles parcialmente desglicosilados, exhiben actividad hialuronidasa que es 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000% o más de la actividad hialuronidasa exhibida por el polipéptido completamente glicosilado.
e. Enzimas que degradan hialuronano modificadas (conjugadas con polímeros)
En un ejemplo, las composiciones y combinaciones proporcionadas contienen enzimas que degradan hialuronano, en particular hialuronidasas solubles, que se han modificado por conjugación con una o más moléculas poliméricas (polímero), típicamente para aumentar la vida media de la enzima que degradan hialuronano, por ejemplo, para promover efectos de tratamiento prolongados/sostenidos en un sujeto.
La unión covalente u otra unión estable (conjugación) de moléculas poliméricas, tales como polietilenglicol (radical (PEG) de PEGilación), a las enzimas que degradan hialuronano, tales como hialuronidasas, confieren propiedades beneficiosas a la composición de enzima-polímero que degrada hialuronano resultante. Tales propiedades incluyen biocompatibilidad mejorada, prolongación de la semivida de proteínas (y actividad enzimática) en la sangre, células y/o en otros tejidos dentro de un sujeto, protección eficaz de la proteína de proteasas e hidrólisis, biodistribución mejorada, farmacocinética y/o farmacodinámica mejoradas y una mayor solubilidad en agua.
Los polímeros ilustrativos que pueden conjugarse con la enzima que degrada hialuronano, tales como la hialuronidasa, incluyen homopolímeros naturales y sintéticos, tales como polioles (es decir, poli-OH), poliaminas (es decir, poli-NH2) y poli(ácidos carboxílicos) (es decir, poli-COOH) y otros heteropolímeros, es decir, polímeros que comprenden uno o más grupos de acoplamiento diferentes, p.ej. un grupo hidroxilo y grupos amina. Los ejemplos de moléculas poliméricas adecuadas incluyen moléculas poliméricas seleccionadas entre poli(óxidos de alquileno) (PAO), tales como polialquilenglicoles (PAG), que incluyen polietilenglicoles (PEG), metoxipolietilenglicoles (mPEG) y polipropilenglicoles, PEG-glicidiléteres (Epox-PEG), PEG-oxicarbonilimidazol (CDI-PEG), polietilenglicoles ramificados (PEG), poli(alcohol vinílico) (PVA), policarboxilatos, polivinilpirrolidona, poli-D, L-aminoácidos, polietileno- co-anhídrido de ácido maleico, poliestireno-co-anhídrido de ácido maleico, dextranos que incluyen carboximetil- dextranos, heparina, albúmina homóloga, celulosas, incluyendo metilcelulosa, carboximetilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, carboxietilcelulosa e hidroxipropilcelulosa, productos hidrolizados de quitosano, almidones tales como hidroxietil-almidones e hidroxipropil-almidones, glucógeno, agarosas y sus derivados, goma guar, pululano, inulina, goma de xantano, carragenano, pectina, productos hidrolizados de ácido algínico y biopolímeros.
Típicamente, los polímeros son poli(óxidos de alquileno) (PAO), tales como óxidos de polietileno, tales como PEG, típicamente mPEG, que, en comparación con polisacáridos tales como dextrano y pululano, tienen pocos grupos reactivos capaces de entrecruzarse. Típicamente, los polímeros son moléculas poliméricas no tóxicas tales como (m)polietilenglicol (mPEG) que pueden conjugarse covalentemente con la enzima que degrada hialuronano, tal como la hialuronidasa (p.ej., grupos de unión en la superficie de la proteína) utilizando una química relativamente simple.
Se ha informado de que la PEGilación de agentes terapéuticos aumenta la resistencia a la proteólisis, aumenta la vida media en plasma y disminuye la antigenicidad y la inmunogenicidad. Se conocen en la técnica ejemplos de metodologías de PEGilación (véanse, por ejemplo, Lu y Felix, Int. J. Peptide Protein Res., 43:127-138, 1994; Lu y Felix, Peptide Res., 6:140-6, 1993; Felix et al., Int. J. Peptide Res., 46:253-64, 1995; Benhar et al., J. Biol. Chem.,
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269:13398-404, 1994; Brumeanu et al., J Immunol., 154:3088-95, 1995; véanse también, Caliceti et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55(10):1261-77 y Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8S). La PEGilación también se puede utilizar en la administración de moléculas de ácido nucleico in vivo. Por ejemplo, la PEGilación de adenovirus puede aumentar la estabilidad y la transferencia génica (véase, p.ej. Cheng et al. (2003) Pharm. Res. 20 (9):1444- 51).
Las moléculas poliméricas adecuadas para unirse a las enzimas que degradan hialuronano, que incluyen hialuronidasas, incluyen, aunque sin limitación, polietilenglicol (PEG) y derivados de PEG tales como metoxi- polietilenglicoles (mPEG), PEG-glicidiléteres (Epox-PEG), PEG-oxicarbonilimidazol (CDI-PEG), PEG ramificados y poli(óxido de etileno) (POE) (véanse p.ej. Roberts et al., Advanced Drug Delivery Review (2002) 54:459-476; Harris y Zalipsky, S (eds.) "Poly(ethylene glycol), Chemistry and Biological Applications" ACS Symposium Series 680, 1997; Mehvar et al., J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3(1):125-136, 2000; Harris, (2003) Nature Reviews Drug Discovery 2:214- 221; y Tsubery, (2004) J Biol. Chem 279(37):38118-24). La molécula polimérica puede ser de un peso molecular que típicamente varía de aproximadamente 3 kDa a aproximadamente 60 kDa. En algunas realizaciones, la molécula polimérica que está conjugada con una proteína, tal como rHuPH20, tiene un peso molecular de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 o más de 60 kDa .
Enzimas que degradan hialuronano soluble PEGiladas
La enzima que degrada hialuronano utilizada en los métodos, composiciones y combinaciones de la presente invención puede ser una enzima que degrada hialuronano PEGilada, tal como una enzima que degrada hialuronano soluble PEGilada. En un ejemplo, es una hialuronidasa soluble PEGilada, p.ej. RHuPH20 PEGilada. Se conocen en la técnica diversos métodos para modificar polipéptidos uniendo (conjugando) de manera covalente un PEG o derivado de PEG (es decir, "PEGilación") (véanse, por ejemplo, los documentos U.S. 2006/0104968; U.S. 5.672.662; U.S. 6.737.505; y U.S. 2004/0235734). Las técnicas para la PEGilación incluyen, pero sin limitarse a, ligadores especializados y químicas de acoplamiento (véase p.ej., Roberts et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 54: 459-476, 2002), unión de múltiples radicales de PEG a un único sitio de conjugación (tal como mediante el uso de PEG ramificados; véase p.ej., Guiotto et al., Bioorg. Med Chem. Lett. 12:177-180, 2002), PEGilación y/o mono-PEGilación específicas del sitio (véase p.ej., Chapman et al., Nature Biotech. 17:780-783, 1999), y PEGilación enzimática dirigida al sitio (véase p.ej., Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002). Los métodos y técnicas descritos en la técnica pueden producir proteínas que tienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más 10 derivados de PEG o PEG unidos a una sola molécula de proteína (véase p.ej., el documento U.S. 2006/0104968).
Numerosos reactivos para PEGilación se han descrito en la técnica. Tales reactivos incluyen, pero sin limitarse a, PEG activado con N-hidroxisuccinimidilo (NHS), succinimidil mPEG, mPEG2-N-hidroxisuccinimida, mPEG succinimidil alfa-metilbutanoato, mPEG succinimidil propionato, mPEG succinimidil butanoato, mPEG éster de succinimidilo de ácido carboximetil 3-hidroxibutanoico, PEG-propionato de succinimidilo homobifuncional, PEG propionaldehído homopoxifuncional, PEG butiraldehído homobifuncional, PEG maleimida, PEG hidrazida, carbonato de p-nitrofenilo PEG, mPEG-carbonato de benzotriazol, propionaldehído PEG, mPEG butiraldehído, mPEG2butiraldehído ramificado, mPEG acetilo, mPEG piperidona, mPEG metilcetona, mPEG vinil sulfona, mPEG tiol, mPEG ortopiridiltioéster, mPEG ortopiridil disulfuro, Fmoc-PEG-NHS, Boc-PEG-NHS, vinilsulfona PEG-NHS, acrilato de PEG-NHS, fluoresceína PEG-NHS y biotina PEG-NHS (véanse p.ej., Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995; Veronese et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997; documento U.S. 5.672.662; documento U.S. 5.932.462; documento U.S. 6.495.659; documento U.S. 6.737.505; documento U.S. 4.002.531; documento U.S. 4.179.337; documento U.S. 5.122.614; documento U.S. 5.324. 844; documento U.S. 5.446.090; documento U.S. 5.612.460; documento U.S. 5.643.575; documento U.S. 5.766.581; documento U.S.

5.795. 569; documento U.S. 5.808.096; documento U.S. 5.900.461; documento U.S. 5.919.455; documento U.S.

5.985.263; documento U.S. 5.990. 237; documento U.S. 6.113.906; documento U.S. 6.214.966; documento U.S.

6.258.351; documento U.S. 6.340.742; documento U.S. 6.413.507; documento U.S. 6.420.339; documento U.S.

6.437.025; documento U.S. 6.448.369; documento U.S. 6.461.802; documento U.S. 6.828.401; documento U.S.
6.858.736; documento U.S. 2001/0021763; documento U.S. 2001/0044526; documento U.S. 2001/0046481; documento U.S. 2002/0052430; documento U.S. 2002/0072573; documento U.S. 2002/0156047; documento U.S. 2003/0114647; documento U.S. 2003/0143596; documento U.S. 2003/0158333; documento U.S. 2003/0220447; documento U.S. 2004/0013637; US 2004/0235734; documento WO0500360; documento U.S. 2005/0114037; documento U.S. 2005/0171328; documento U.S. 2005/0209416; documento EP 1064951; documento EP 0822199; documento WO 01076640; documento WO 0002017; documento WO 0249673; documento WO 9428024; y WO 0187925).
D. MÉTODOS DE PRODUCCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Y POLIPEPTIDOS CODIFICADOS DE ENZIMAS QUE DEGRADAN HIALURONANO
Los polipéptidos de una enzima que degrada hialuronano, tal como una hialuronidasa soluble, expuestos en la presente memoria, pueden obtenerse por métodos bien conocidos en la técnica para la purificación de proteínas y la expresión de proteínas recombinantes. Se puede utilizar cualquier método conocido por los expertos en la técnica
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para la identificación de ácidos nucleicos que codifican genes deseados. Se puede utilizar cualquier método disponible en la técnica para obtener un ADNc o clon de ADN genómico de longitud completa (es decir., que abarca toda la región codificante) que codifica una hialuronidasa, tal como de una fuente celular o tisular. Las hialuronidasas solubles modificadas o variantes se pueden diseñar a partir de un polipéptido de tipo salvaje, tal como mediante mutagénesis dirigida al sitio.
Los polipéptidos se pueden clonar o aislar utilizando cualquier método disponible conocido en la técnica para clonar y aislar moléculas de ácido nucleico. Tales métodos incluyen la amplificación mediante PCR de ácidos nucleicos y el escrutinio de bibliotecas, incluyendo el escrutinio de hibridación de ácidos nucleicos, el escrutinio basado en anticuerpos y el escrutinio basado en la actividad.
Los métodos para la amplificación de ácidos nucleicos pueden utilizarse para aislar moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido deseado, que incluyen, por ejemplo, métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se puede utilizar un material que contiene ácido nucleico como material de partida a partir del cual se puede aislar una molécula deseada de ácido nucleico que codifica un polipéptido. Por ejemplo, se pueden utilizar preparaciones de ADN y ARNm, extractos celulares, extractos de tejidos, muestras de fluidos (p.ej. sangre, suero, saliva), muestras de sujetos sanos y/o enfermos en los métodos de amplificación. Las bibliotecas de ácidos nucleicos también pueden utilizarse como fuente de material de partida. Los cebadores pueden diseñarse para amplificar un polipéptido deseado. Por ejemplo, los cebadores pueden diseñarse basándose en secuencias expresadas a partir de las cuales se genera un polipéptido deseado. Los cebadores pueden diseñarse basándose en la retrotraducción de una secuencia de aminoácidos de un polipéptído. Las moléculas de ácido nucleico generadas por amplificación se pueden secuenciar y confirmar que codifican un polipéptido deseado.
Se pueden unir secuencias de nucleótidos adicionales a una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido, incluyendo secuencias conectoras que contienen sitios de endonucleasas de restricción con el fin de clonar el gen sintético en un vector, por ejemplo, un vector de expresión de proteína o un vector diseñado para la amplificación de la secuencias de ADN que codifican la proteína central. Además, las secuencias de nucleótidos adicionales que especifican elementos de ADN funcionales se pueden unir operativamente a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido. Los ejemplos de tales secuencias incluyen, pero sin limitarse a, secuencias promotoras diseñadas para facilitar la expresión de proteínas intracelulares, y secuencias de secreción, por ejemplo secuencias señal heterólogas, diseñadas para facilitar la secreción de proteínas. Tales secuencias son conocidas por los expertos en la técnica. Las secuencias de residuos de nucleótidos adicionales tales como secuencias de bases que especifican regiones de unión a proteínas también se pueden unir a moléculas de ácidos nucleicos que codifican enzimas. Tales regiones incluyen, pero sin limitarse a, secuencias de residuos que facilitan o codifican proteínas que facilitan la absorción de una enzima en células diana específicas, o alteran la farmacocinética de un producto de un gen sintético. Por ejemplo, las enzimas se pueden unir a radicales de PEG.
Además, pueden agregarse etiquetas u otros radicales, por ejemplo, para ayudar en la detección o purificación por afinidad del polipéptido. Por ejemplo, las secuencias de residuos de nucleótidos adicionales tales como las secuencias de bases que especifican una etiqueta epitópica u otro marcador detectable también se pueden unir a moléculas de ácido nucleico que codifican enzimas. Los ejemplos de tales secuencias incluyen secuencias de ácido nucleico que codifican una etiqueta de His (p.ej., 6xHis, HhHHHH, SEQ ID NO: 54) o etiqueta Flag (DYKDDDDK; SEQ ID NO: 55).
Los ácidos nucleicos identificados y aislados pueden insertarse a continuación en un vector de clonación apropiado. Se puede utilizar una gran cantidad de sistemas vector-anfitrión conocidos en la técnica. Los vectores posibles incluyen, pero sin limitarse a, plásmidos o virus modificados, pero el sistema de vectores debe ser compatible con la célula anfitriona utilizada. Tales vectores incluyen, pero sin limitarse a, bacteriófagos tales como derivados de lambda, o plásmidos tales como pCMV4, pBR322 o derivados de plásmido pUC o el vector Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA). Otros vectores de expresión incluyen el vector de expresión HZ24 ilustrado en la presente memoria. La inserción en un vector de clonación puede realizarse, por ejemplo, ligando el fragmento de ADN a un vector de clonación que tiene extremos cohesivos complementarios. La inserción puede efectuarse utilizando vectores de clonación TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA). Si no están presentes los sitios de restricción complementarios utilizados para fragmentar el ADN en el vector de clonación, los extremos de las moléculas de ADN pueden modificarse enzimáticamente. Alternativamente, cualquier sitio deseado puede producirse ligando secuencias de nucleótidos (conectores) en los extremos del ADN; estos conectores ligados pueden contener oligonucleótidos sintetizados químicamente específicos que codifican secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción. En un método alternativo, el vector escindido y el gen de la proteína se pueden modificar mediante colas homopoliméricas. Las moléculas recombinantes se pueden introducir en células anfitrionas mediante, por ejemplo, transformación, transfección, infección, electroporación y sonoporación, de modo que se generen muchas copias de la secuencia del gen.
En realizaciones específicas, la transformación de células anfitrionas con moléculas de ADN recombinante que incorporan el gen de proteína aislado, ADNc o la secuencia de ADN sintetizada permite la generación de copias
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múltiples del gen. Por lo tanto, el gen se puede obtener en grandes cantidades cultivando transformantes, aislando las moléculas de ADN recombinante de los transformantes y, cuando sea necesario, recuperando el gen insertado del ADN recombinante aislado.
1. Vectores y células
Para la expresión recombinante de una o más de las proteínas deseadas, tales como cualquier polipéptido enzimático que degrada hialuronano descrito en la presente memoria, el ácido nucleico que contiene toda o una porción de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína puede insertarse en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante de la proteína insertada. Las señales transcripcionales y traduccionales necesarias también pueden ser suministradas por el promotor nativo para genes de enzimas y/o sus regiones flanqueantes.
También se proporcionan vectores que contienen un ácido nucleico que codifica la enzima. También se proporcionan células que contienen los vectores. Las células incluyen células eucariotas y procariotas, y los vectores son adecuados para su uso en las mismas.
Se proporcionan células procariotas y eucariotas, que incluyen células endoteliales, que contienen los vectores. Tales células incluyen células bacterianas, células de levadura, células fúngicas, Archea, células vegetales, células de insectos y células animales. Las células se utilizan para producir una proteína de las mismas cultivando las células descritas anteriormente en condiciones en las que la proteína codificada es expresada por la célula y recuperando la proteína expresada. Para los fines de la presente memoria, por ejemplo, la enzima puede secretarse al medio.
Siempre que sean vectores que contengan una secuencia de nucleótidos que codifique el polipéptido enzimático que degrada hialuronano, en algunos ejemplos un polipéptido hialuronidasa soluble, acoplado a la secuencia señal nativa o heteróloga, así como a múltiples copias de los mismos. Los vectores se pueden seleccionar para la expresión de la proteína enzimática en la célula o de manera que la proteína enzimática se exprese como una proteína secretada.
Se puede utilizar una variedad de sistemas de anfitrión-vector para expresar la secuencia codificante de la proteína. Estos incluyen, pero sin limitarse a, sistemas celulares de mamíferos infectados con virus (p.ej. virus vaccinia, adenovirus y otros virus); sistemas de células de insectos infectados con virus (p.ej. baculovirus); microorganismos tales como levadura que contiene vectores de levadura; o bacterias transformadas con bacteriófagos, ADN, ADN plasmídico o ADN cosmídico. Las fortalezas y especificidades de los elementos de expresión de los vectores varían. Dependiendo del sistema de anfitrión-vector utilizado, se puede utilizar cualquiera de una serie de elementos de transcripción y traducción adecuados.
Se puede utilizar cualquier método conocido por los expertos en la técnica para la inserción de fragmentos de ADN en un vector para construir vectores de expresión que contienen un gen quimérico que contiene señales de control de transcripción/traducción apropiadas y secuencias codificantes de proteínas. Estos métodos pueden incluir ADN recombinante in vitro y técnicas sintéticas y recombinantes in vivo (recombinación genética). La expresión de secuencias de ácido nucleico que codifican proteína, o dominios, derivados, fragmentos u homólogos de la misma, puede regularse mediante una segunda secuencia de ácido nucleico de modo que los genes o fragmentos de los mismos se expresen en un anfitrión transformado con la molécula o moléculas de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión de las proteínas puede controlarse mediante cualquier promotor/potenciador conocido en la técnica. En una realización específica, el promotor no es nativo de los genes para una proteína deseada. Los promotores que se pueden utilizar incluyen, pero sin limitarse a, el promotor temprano de SV40 (Bernoist y Chambon, Nature 290: 304310 (1981)), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto et al. Cell 22:787-797 (1980)), el promotor de la timidina quinasa del herpes (Wagner et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 78:1441-1445 (1981)), las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneína (Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982)); vectores de expresión procarióticos tales como el promotor de p-lactamasa (Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543) o el promotor tac (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. UsA 80:21-25 (1983)); véase también "Useful Proteins from Recombinant Bacteria": in Scientific American 242:79-94 (1980); vectores de expresión de plantas que contienen el promotor de nopalina sintetasa (Herrara-Estrella et al., Nature 303:209-213 (1984)) o el promotor del ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor (Gardner et al., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)), y el promotor de la enzima fotosintética ribulosa bisfosfato carboxilasa (Herrera-Estrella et al., Nature 310:115-120 (1984)); elementos promotores de levadura y otros hongos tales como el promotor Gal4, el promotor de alcohol deshidrogenasa, el promotor de fosfoglicerol quinasa, el promotor de fosfatasa alcalina y las siguientes regiones de control transcripcional animal que exhiben especificidad tisular y se han utilizado en animales transgénicos: la región de control gen elastasa I que está activa en células acinares pancreáticas (Swift et al., Cell 38:639-646 (1984)); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)); la región de control del gen de insulina que está activa en células beta pancreáticas (Hanahan et al., Nature 315:115-122 (1985)), la región de control del gen de inmunoglobulina que está activa en células linfoides
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(Grosschedl et al., Cell 38:647-658 (1984); Adams et al., Nature 318:533-538 (1985)); Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987)), la región de control del virus del tumor mamario de ratón que está activa en células testiculares, de mama, linfoides y mastocitos (Leder et al., Cell 45:485-495 (1986)), la región de control del gen de la albúmina que está activa en el hígado (Pinkert et al., Genes y Devel. 1:268-276 (1987)), la región de control del gen de la alfafetoproteína que está activa en el hígado (Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammer et al., Science 235:53-58 1987)), la región de control del gen de alfa-1 antitripsina que está activa en el hígado (Kelsey et al., Genes y Devel. 1:161-171 (1987)), la región de control del gen de la beta globina que es activa en células mieloides (Magram et al., Nature 315:338-340 (1985); Kollias et al., Cell 46:89-94 (1986)), la región de control del gen de proteína básica de mielina que está activa en las células oligodendrocíticas del cerebro (Readhead et al., Cell 48:703-712 (1987)), región de control del gen de la cadena ligera 2 de la miosina que está activa en el músculo esquelético (Shani, Nature 314:283-286 (1985)), y la región de control del gen de la hormona liberadora gonadotrófica, que está activa en los gonadótrofos del hipotálamo (Mason et al., Science 234:1372-1378 (1986)).
En una realización específica, se utiliza un vector que contiene un promotor conectado operativamente a ácidos nucleicos que codifican una proteína deseada, o un dominio, fragmento, derivado u homólogo de la misma, uno o más orígenes de replicación, y opcionalmente, uno o más marcadores seleccionables (p.ej., un gen de resistencia a antibióticos). Los vectores plasmídicos ilustrativos para la transformación de células de E. coli incluyen, por ejemplo, los vectores de expresión pQE (disponibles en Qiagen, Valencia, CA, véase también la bibliografía publicada por Qiagen que describe el sistema). Los vectores pQE tienen un promotor T5 de fago (reconocido por ARN polimerasa
E. coli) y un módulo de represión doble de operador lac para proporcionar una expresión altamente regulada y de alto nivel de proteínas recombinantes en E. coli, un sitio de unión ribosómico sintético (RBS II) para la traducción eficaz, una secuencia codificante de etiqueta 6XHis, terminadores de la transcripción tü y T1, origen de replicación ColE1 y un gen de beta-lactamasa para conferir resistencia a la ampicilina. Los vectores pQE permiten la colocación de una etiqueta 6xHis en el extremo N o C terminal de la proteína recombinante. Tales plásmidos incluyen pQE 32, pQE 30 y pQE 31 que proporcionan múltiples sitios de clonación para los tres marcos de lectura y proporcionan la expresión de las proteínas etiquetadas con 6xHis N-terminalmente. Otros vectores plasmídicos ilustrativos para la transformación de células de E. coli, incluyen, por ejemplo, los vectores de expresión pET (véase, la Patente de Estados Unidos 4.952.496; disponible de Novagen, Madison, WI; véase también la bibliografía publicada por Novagen que describe el sistema). Dichos plásmidos incluyen pET 11a, que contiene el promotor T7lac, el terminador T7, el operador lac de E. coli inducible, y el gen represor lac; pET 12a-c, que contiene el promotor T7, el terminador T7 y la señal de secreción ompT de E. coli; y pET15b y pET19b (Novagen, Madison, WI), que contienen una secuencia líder His-Tag™ para utilizar en purificación con una columna de His y un sitio de escisión de trombina que permite la escisión después de la purificación sobre la columna, la región promotora T7-lac y el terminador T7.
Un vector ilustrativo para la expresión en células de mamífero es el vector de expresión HZ24. El vector de expresión HZ24 se obtuvo del esqueleto de vector pCI (Promega). Contiene ADN que codifica el gen de resistencia a betalactamasa (AmpR), un origen de replicación F1, una región del potenciador/promotor inmediato/temprano de Citomegalovirus (CMV), y una señal de poliadenilación tardía de SV40 (SV40). El vector de expresión también tiene un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) del virus ECMV (Clontech) y el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) de ratón.
2. Expresión
Los polipéptidos enzimáticos que degradan hialuronano, que incluyen polipéptidos de hialuronidasa solubles, se pueden producir mediante cualquier método conocido por los expertos en la técnica, incluyendo métodos in vivo e in vitro. Las proteínas deseadas pueden expresarse en cualquier organismo adecuado para producir las cantidades y formas requeridas de las proteínas, tales como, por ejemplo, necesarias para la administración y el tratamiento. Los anfitriones de expresión incluyen organismos procarióticos y eucarióticos tales como E. coli, levadura, plantas, células de insectos, células de mamíferos, incluyendo líneas celulares humanas y animales transgénicos. Los anfitriones de expresión pueden diferir en sus niveles de producción de proteína así como en los tipos de modificaciones postraduccionales que están presentes en las proteínas expresadas. La elección del anfitrión de la expresión se puede hacer en base a estos y otros factores, tales como las consideraciones de regulación y de seguridad, los costes de producción y la necesidad y los métodos para la purificación.
Muchos vectores de expresión están disponibles y son conocidos por los expertos en la técnica y pueden utilizarse para la expresión de proteínas. La elección del vector de expresión estará influenciada por la elección del sistema de expresión del anfitrión. En general, los vectores de expresión pueden incluir promotores de la transcripción y opcionalmente potenciadores, señales de traducción y señales de terminación transcripcional y traduccional. Los vectores de expresión que se utilizan para la transformación estable típicamente tienen un marcador seleccionable que permite la selección y el mantenimiento de las células transformadas. En algunos casos, se puede utilizar un origen de replicación para amplificar el número de copias del vector.
Los polipéptidos enzimáticos que degradan hialuronano, tales como los polipéptidos de hialuronidasa solubles, también se pueden utilizar o expresar como fusiones de proteínas. Por ejemplo, se puede generar una fusión
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enzimática para agregar funcionalidad adicional a una enzima. Los ejemplos de proteínas de fusión enzimática incluyen, pero sin limitarse a, fusiones de una secuencia señal, una etiqueta tal como para localización, p.ej. un su6 etiqueta o una etiqueta myc, o una etiqueta para purificación, por ejemplo, una fusión GST, y una secuencia para dirigir la secreción de proteína y/o la asociación de membrana.
a. Células procariotas
Los procariotas, especialmente E. coli, proporcionan un sistema para producir grandes cantidades de proteínas. La transformación de E. coli es una mecanismo simple y rápido bien conocido por los expertos en la técnica. Los vectores de expresión para E. coli pueden contener promotores inducibles, tales promotores son útiles para inducir altos niveles de expresión de proteínas y para expresar proteínas que exhiben cierta toxicidad para las células anfitrionas. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen el promotor lac, el promotor trp, el promotor tac híbrido, los promotores de aRn T7 y SP6 y el promotor APL regulado por temperatura.
Las proteínas, como las proporcionadas en la presente memoria, pueden expresarse en el entorno citoplásmico de E. coli. El citoplasma es un entorno reductor y para algunas moléculas, esto puede dar como resultado la formación de cuerpos de inclusión insolubles. Se pueden utilizar agentes reductores tales como ditiotreitol y p-mercaptoetanol y desnaturalizantes, tales como guanidina-HCl y urea, para volver a solubilizar las proteínas. Un enfoque alternativo es la expresión de proteínas en el espacio periplásmico de bacterias que proporciona un entorno oxidante e isomerasas de tipo chaperonina y disulfuro y puede conducir a la producción de proteína soluble. Típicamente, una secuencia líder se fusiona con la proteína que se va a expresar que dirige la proteína al periplasma. El líder es eliminado a continuación por peptidasas señal dentro del periplasma. Los ejemplos de secuencias líder de direccionamiento periplásmico incluyen el líder pelB del gen de pectato liasa y el líder derivado del gen de fosfatasa alcalina. En algunos casos, la expresión periplásmica permite la filtración de la proteína expresada al medio de cultivo. La secreción de proteínas permite una purificación rápida y simple del sobrenadante del cultivo. Las proteínas que no se secretan se pueden obtener a partir del periplasma mediante lisis osmótica. Se una manera similar a la expresión citoplásmica, en algunos casos las proteínas pueden volverse insolubles y pueden utilizarse desnaturalizantes y agentes reductores para facilitar la solubilización y el replegamiento. La temperatura de inducción y crecimiento también puede influir en los niveles de expresión y la solubilidad, típicamente se utilizan temperaturas entre 25°C y 37°C. Típicamente, las bacterias producen proteínas aglicosiladas. Por lo tanto, si las proteínas requieren glicosilación para su función, se puede agregar glicosilación in vitro después de la purificación de las células anfitrionas.
b. Células de levadura
Levaduras tales como Saccharomyces cerevisae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces lactis y Pichia pastoris son anfitriones de expresión de levadura bien conocidos que se pueden utilizar para la producción de proteínas, tales como las descritas en la presente memoria. La levadura se puede transformar con vectores replicantes episomales o mediante integración cromosómica estable mediante recombinación homóloga. Típicamente, los promotores inducibles se utilizan para regular la expresión génica. Los ejemplos de tales promotores incluyen GAL1, GAL7 y GAL5 y promotores de metalotioneína, tales como CUP 1, AOX1 u otro promotor de Pichia u otro de levadura. Los vectores de expresión a menudo incluyen un marcador seleccionable tal como LEU2, TRP1, HIS3 y URA3 para la selección y el mantenimiento del ADN transformado. Las proteínas expresadas en levadura a menudo son solubles. La co-expresión con chaperoninas tales como Bip y la proteína disulfuro isomerasa puede mejorar los niveles de expresión y la solubilidad. Además, las proteínas expresadas en levadura pueden dirigirse a la secreción utilizando fusiones de péptidos señal de secreción tales como la señal de secreción de factor alfa de tipo apareamiento de levadura de Saccharomyces cerevisae y fusiones con proteínas de superficie celular de levadura tales como el receptor de adhesión de apareamiento Aga2p o glucoamilasa de Arxula adeninivorans. Se puede diseñar un sitio de escisión de proteasa tal como para la proteasa Kex-2, para eliminar las secuencias fusionadas de los polipéptidos expresados a medida que salen de la ruta de secreción. La levadura también es susceptible de glicosilación en los motivos Asn-X-Ser/Thr.
c. Células de insecto
Las células de insecto, que utilizan particularmente expresión de baculovirus, son útiles para expresar polipéptidos tales como polipéptidos de hialuronidasa. Las células de insecto expresan altos niveles de proteína y son susceptibles de la mayoría de las modificaciones postraduccionales utilizadas por eucariotas superiores. Los baculovirus tienen una gama de anfitrión restrictiva que mejora la seguridad y reduce los problemas reguladores de la expresión eucariota. Los vectores de expresión típicos utilizan un promotor para expresión de alto nivel tal como el promotor de polihedrina de baculovirus. Los sistemas de baculovirus utilizados comúnmente incluyen baculovirus tales como el virus de polihedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV), y el virus de la polihedrosis nuclear de Bombyx mori (BmNPV) y una línea celular de insectos como Sf9 derivada de Spodoptera frugiperda, Pseudaletia unipuncta (A7S) y Danaus plexippus (DpN1). Para la expresión de alto nivel, la secuencia de nucleótidos de la molécula que se va a expresar se fusiona inmediatamente aguas abajo del codón de iniciación de la polihedrina del
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virus. Las señales de secreción de mamíferos se procesan con precisión en células de insectos y se pueden utilizar para secretar la proteína expresada al medio de cultivo. Además, las líneas celulares de Pseudaletia unipuncta (A7S) y Danaus plexippus (DpN1) producen proteínas con patrones de glicosilación similares a los sistemas de células de mamíferos.
Un sistema de expresión alternativo en células de insecto es el uso de células transformadas establemente. Se puede utilizar para la expresión líneas celulares tales como las células de Schneider 2 (S2) y Kc (Drosophila melanogaster) y células C7 (Aedes albopictus). El promotor de metalotioneína de Drosophila puede utilizarse para inducir altos niveles de expresión en presencia de inducción de metales pesados con cadmio o cobre. Los vectores de expresión se mantienen típicamente mediante el uso de marcadores seleccionables tales como neomicina e higromicina.
d. Células de mamífero
Los sistemas de expresión de mamíferos pueden utilizarse para expresar proteínas que incluyen polipéptidos enzimáticos que degradan hialuronano, tales como polipéptidos de hialuronidasa solubles. Las construcciones de expresión pueden transferirse a células de mamífero mediante infección viral tal como adenovirus o mediante transferencia directa de ADN tal como liposomas, fosfato de calcio, DEAE-dextrano y por medios físicos tales como electroporación y microinyección. Los vectores de expresión para células de mamífero incluyen típicamente un sitio cap de ARNm, una caja TATA, una secuencia de iniciación de la traducción (secuencia consenso de Kozak) y elementos de poliadenilación. También se pueden agregar elementos IRES para permitir la expresión bicistrónica con otro gen, como un marcador seleccionable. Tales vectores a menudo incluyen potenciadores del promotor transcripcional para expresión de alto nivel, por ejemplo, el promotor-potenciador de SV40, el promotor de citomegalovirus humano (CMV) y la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous (RSV). Estos promotores-potenciadores están activos en muchos tipos de células. También se pueden utilizar para la expresión regiones promotoras y potenciadoras de tipo tisular y celular. Las regiones promotoras/potenciadoras ilustrativas incluyen, pero sin limitarse a, aquellas de genes tales como elastasa I, insulina, inmunoglobulina, virus de tumor mamario de ratón, albúmina, alfafetoproteína, alfa 1 antitripsina, beta globina, proteína básica de mielina, cadena ligera de miosina 2 y el control del gen de la hormona liberadora gonadotrópica. Los marcadores seleccionables se pueden utilizar para seleccionar y mantener células con la construcción de expresión. Los ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen, entre otros, higromicina B fosfotransferasa, adenosina desaminasa, xantina- guanina fosforribosil transferasa, aminoglucósido fosfotransferasa, dihidrofolato reductasa (DHFR) y timidina quinasa. Por ejemplo, la expresión puede realizarse en presencia de metotrexato para seleccionar únicamente aquellas células que expresan el gen DHFR. La fusión con moléculas de señalización de superficie celular como TCR-Z y Fc£RI-y puede dirigir la expresión de las proteínas en un estado activo en la superficie celular.
Muchas líneas celulares están disponibles para la expresión en mamíferos incluyendo células de ratón, rata humanas, de mono, de pollo y de hámster. Las líneas celulares ilustrativas incluyen, pero sin limitarse a CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, ratón nS0 (no secretoras) y otras líneas de células de mieloma, hibridoma y líneas celulares de heterohibridoma, linfocitos, fibroblastos, células Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8 y HKB. Las líneas celulares también están disponibles adaptadas a medios libres de suero que facilitan la purificación de proteínas secretadas de los medios de cultivo celular. Los ejemplos incluyen células CHO-S (Invitrogen, Carlsbad, Ca, Núm. de cat 11619-012) y la línea celular EBNA-1 libre de suero (Pham et al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-342). Las líneas celulares también están disponibles y están adaptadas para crecer en medios especiales optimizados para una máxima expresión. Por ejemplo, las células DG44 CHO están adaptadas para crecer en cultivo en suspensión en un medio químicamente definido, libre de productos de origen animal.
e. Plantas
Se pueden utilizar células vegetales y plantas transgénicas para expresar proteínas tales como las descritas en la presente memoria. Las construcciones de expresión se transfieren típicamente a plantas utilizando transferencia directa de ADN tal como bombardeo de microproyectiles y transferencia mediada por PEG en protoplastos, y con transformación mediada por agrobacterium. Los vectores de expresión pueden incluir secuencias promotoras y potenciadoras, elementos de terminación de la transcripción y elementos de control de la traducción. Los vectores de expresión y las técnicas de transformación generalmente se dividen entre anfitriones dicotiledóneos, tales como Arabidopsis y tabaco, y anfitriones monocotiledóneos, tales como maíz y arroz. Los ejemplos de promotores vegetales utilizados para la expresión incluyen el promotor del virus del mosaico de la coliflor, el promotor de la nopalina sintetasa, el promotor de la ribosa bisfosfato carboxilasa y los promotores de ubiquitina y UBQ3. A menudo se utilizan marcadores seleccionables tales como higromicina, fosfomanosa isomerasa y neomicina fosfotransferasa para facilitar la selección y el mantenimiento de las células transformadas. Las células vegetales transformadas se pueden mantener en cultivo como células, agregados (tejido calloso) o regenerarse para proporcionar plantas completas. Las células vegetales transgénicas también pueden incluir algas modificadas genéticamente para producir polipéptidos de hialuronidasa. Debido a que las plantas tienen diferentes patrones de glicosilación que las células de mamíferos, esto puede influir en la elección de la proteína producida en estos anfitriones.
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3. Técnicas de purificación
El método para la purificación de polipéptidos, incluyendo polipéptidos enzimáticos que degradan hialuronano (p.ej., polipéptidos de hialuronidasa solubles) u otras proteínas, de células anfitrionas dependerá de las células anfitrionas y de los sistemas de expresión elegidos. Para las moléculas secretadas, las proteínas se purifican generalmente a partir de los medios de cultivo después de retirar las células. Para la expresión intracelular, las células pueden lisarse y las proteínas purificarse a partir del extracto. Cuando se utilizan organismos transgénicos tales como plantas y animales transgénicos para la expresión, se pueden utilizar tejidos u órganos como material de partida para preparar un extracto de células lisadas. Adicionalmente, la producción de animales transgénicos puede incluir la producción de polipéptidos en leche o huevos, que pueden recogerse y, si fuera necesario, las proteínas pueden extraerse y purificarse adicionalmente utilizando métodos convencionales en la técnica.
Las proteínas, como los polipéptidos de hialuronidasa soluble, pueden purificarse utilizando mecanismos de purificación de proteínas conocidos en la técnica que incluyen, pero sin limitarse a, SDS-PAGE, fraccionamiento por tamaño y cromatografía de exclusión por tamaño, precipitación con sulfato de amonio y cromatografía de intercambio iónico, tal como cromatografía de intercambio aniónico. También se pueden utilizar técnicas de purificación por afinidad para mejorar la eficacia y la pureza de las preparaciones. Por ejemplo, los anticuerpos, receptores y otras moléculas que se unen a las enzimas hialuronidasas pueden utilizarse en la purificación por afinidad. Las construcciones de expresión también se pueden diseñar para agregar una etiqueta de afinidad a una proteína tal como un epítopo myc, fusión GST o His6 y purificar por afinidad con anticuerpo myc, resina de glutatión y resina de Ni, respectivamente. La pureza se puede evaluar mediante cualquier método conocido en la técnica que incluya electroforesis en gel y técnicas de tinción y espectrofotométricas. Las composiciones de rHuPH20 purificadas, según se proporcionan en la presente memoria, típicamente tienen una actividad específica de al menos 70.000 a 100.000 Unidades/mg, por ejemplo, aproximadamente 120.000 Unidades/mg. La actividad específica puede variar con la modificación, tal como con un polímero.
4. PEGilación de polipéptidos enzimáticos que degradan hialuronano
El polietilenglicol (PEG) se ha utilizado ampliamente en biomateriales, biotecnología y medicina principalmente porque PEG es un polímero biocompatible, no tóxico, soluble en agua que generalmente no es inmunogénico (Zhao y Harris, ACS Symposium Series 680: 458-72, 1997). En el área del suministro de fármacos, los derivados de PEG se han utilizado ampliamente en la unión covalente (es decir, "PEGilación") a proteínas para reducir la inmunogenicidad, la proteólisis y el aclaramiento renal y para mejorar la solubilidad (Zalipsky, Adv. Drug Del. Rev. 16:157-82, 1995). De forma similar, el PEG se ha unido a fármacos relativamente hidrofóbicos de bajo peso molecular para mejorar la solubilidad, reducir la toxicidad y alterar la biodistribución. Típicamente, los fármacos PEGilados se inyectan en forma de soluciones.
Una aplicación estrechamente relacionada es la síntesis de redes de PEG degradables entrecruzadas o formulaciones para su uso en la administración de fármacos, ya que gran parte de la misma química utilizada en el diseño de portadores de fármacos solubles y degradables también puede utilizarse en el diseño de geles degradables (Sawhney et al., Macromolecules 26: 581-87, 1993). También se sabe que se pueden formar complejos intermacromoleculares mezclando soluciones de dos polímeros complementarios. Tales complejos generalmente se estabilizan mediante interacciones electrostáticas (polianiónicas-policatiónicas) y/o enlaces de hidrógeno (poliacidos- polibásicos) entre los polímeros implicados, y/o mediante interacciones hidrófobas entre los polímeros en un entorno acuoso (Krupers et al., Eur. Polym J. 32:785-790, 1996). Por ejemplo, la mezcla soluciones de poli(ácido acrílico) (PAAc) y poli(óxido de etileno) (POE) en las condiciones adecuadas da como resultado la formación de complejos basados principalmente en enlaces de hidrógeno. La disociación de estos complejos en condiciones fisiológicas se ha utilizado para el suministro de fármacos libres (es decir, no PEGilados). Además, se han formado complejos de polímeros complementarios tanto a partir de homopolímeros como de copolímeros.
Se han descrito en la técnica numerosos reactivos de PEGilación. Dichos reactivos incluyen, pero sin limitarse a, PEG activado con N-hidroxisuccinimidilo (NHS), succinimidil mPEG, mPEG2-N-hidroxisuccinimida, mPEG alfa- metilbutanoato de succinimidilo, mPEG propionato de succinimidil, mPEG butanoato de succinimidilo, mPEG éster de succinimidilo de ácido carboximetil 3-hidroxibutanoico, PEG-propionato de succinimidilo homobifuncional, PEG propionaldehído homobifuncional, PEG butiraldehído homobifuncional, PEG maleimida, PEG hidrazida, carbonato de p-nitrofenilo PEG, mPEG-carbonato de benzotriazol, propionaldehído PEG, mPEG butiraldehído, mPEG2 butiraldehído ramificado, mPEG acetilo, mPEG piperidona, mPEG metilcetona, mPEG vinil sulfona, mPEG tiol, mPEG ortopiridiltioéster, mPEG disulfuro de ortopiridilo, Fmoc-PEG-NHS, Boc-PEG-NHS, vinilsulfona PEG-NHS, acrilato PEG-NHS, fluoresceína PEG-NHS y biotina PEG-NHS (véanse p.ej., Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995; Veronese et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997; documento U.S. 5.672.662;
documento U.S. 5.932.462; documento U.S. 6.495.659; documento U.S. 6.737.505; documento U.S. 4.002.531;
documento U.S. 4.179.337; documento U.S. 5.122.614; documento U.S. 5.324. 844; documento U.S. 5.446.090;
documento U.S. 5.612.460; documento U.S. 5.643.575; documento U.S. 5.766.581; documento U.S. 5.795. 569;
documento U.S. 5.808.096; documento U.S. 5.900.461; documento U.S. 5.919.455; documento U.S. 5.985.263;
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documento U.S. 5.990. 237; documento U.S. 6.113.906; documento U.S. 6.214.966; documento U.S. 6.258.351;
documento U.S. 6.340.742; documento U.S. 6.413.507; documento U.S. 6.420.339; documento U.S. 6.437.025;
documento U.S. 6.448.369; documento U.S. 6.461.802; documento U.S. 6.828.401; documento U.S. 6.858.736;
documento U.S. 2001/0021763; documento U.S. 2001/0044526; documento U.S. 2001/0046481; documento U.S.
2002/0052430; documento U.S. 2002/0072573; documento U.S. 2002/0156047; documento U.S. 2003/0114647; documento U.S. 2003/0143596; documento U.S. 2003/0158333; documento U.S. 2003/0220447; documento U.S. 2004/0013637; US 2004/0235734; documento WO0500360; documento U.S. 2005/0114037; documento U.S. 2005/0171328; documento U.S. 2005/0209416; documento EP 1064951; documento EP 0822199; documento WO 01076640; documento WO 0002017; documento WO 0249673; documento WO 9428024; y WO 0187925).
En un ejemplo, el polietilenglicol tiene un peso molecular que varía de aproximadamente 3 kD a aproximadamente 50 kD, y típicamente de aproximadamente 5 kD a aproximadamente 30 kD. La unión covalente del PEG al fármaco (conocida como "PEGilación") se puede lograr mediante técnicas conocidas de síntesis química. Por ejemplo, la PEGilación de proteína puede realizarse haciendo reaccionar PEG activado con NHS con la proteína en condiciones de reacción adecuadas.
Aunque se han descrito numerosas reacciones para la PEGilación, las que son más aplicables en general confieren direccionalidad, utilizan condiciones de reacción suaves y no requieren un procesamiento posterior exhaustivo para eliminar catalizadores o productos biológicos tóxicos. Por ejemplo, el monometoxi PEG (mPEG) tiene solo un hidroxilo terminal reactivo, y por lo tanto su uso limita parte de la heterogeneidad de la mezcla de productos de PEG- proteína resultante. La activación del grupo hidroxilo en el extremo del polímero opuesto al grupo metoxi terminal es generalmente necesaria para lograr una PEGilación eficaz de la proteína, con el objetivo de hacer que el PEG derivatizado sea más susceptible al ataque nucleofílico. El nucleófilo atacante es usualmente el grupo épsilon-amino de un residuo de lisilo, pero también pueden reaccionar otras aminas (p.ej., la alfa-amina N-terminal o las aminas del anillo de histidina) si las condiciones locales son favorables. Es posible una unión más directa en proteínas que contienen una sola lisina o cisteína. El último residuo puede ser elegido como diana por PEG-maleimida para la modificación específica de tiol. Alternativamente, la hidrazida de PEG puede reaccionar con una enzima que degrada hialuronano oxidado con peryodato y reducirse en presencia de NaCNBH3. Más específicamente, los azúcares CMP PEGilados pueden hacerse reaccionar con una enzima que degrada hialuronano en presencia de glicosiltransferasas apropiadas. Una técnica es la técnica de "PEGilación" en la que varias moléculas poliméricas se acoplan al polipéptido en cuestión. Cuando se utiliza esta técnica, el sistema inmunitario tiene dificultades para reconocer los epítopos en la superficie del polipéptido responsables de la formación de anticuerpos, lo que reduce la respuesta inmunitaria. Para los polipéptidos introducidos directamente en el sistema circulatorio del organismo humano para proporcionar un efecto fisiológico concreto (es decir, productos farmacéuticos) la respuesta inmunitaria potencial típica es una respuesta de IgG y/o IgM, mientras que los polipéptidos que se inhalan a través del sistema respiratorio (es decir, polipéptido industrial) potencialmente puede causar una respuesta de IgE (es decir, respuesta alérgica). Una de las teorías que explican la reducción de la respuesta inmunitaria es que la molécula o moléculas poliméricas protegen el o los epítopos en la superficie del polipéptido responsable de la respuesta inmunitaria que conduce a la formación de anticuerpos. Otra teoría o al menos un factor parcial es que cuanto más pesado es el producto conjugado, se obtiene una respuesta inmunitaria más reducida.
Típicamente, para preparar las enzimas que degradan hialuronano PEGiladas proporcionadas en la presente memoria, que incluyen las hialuronidasas PEGiladas, los radicales de PEG se conjugan, mediante unión covalente, a los polipéptidos. Las técnicas para la PEGilación incluyen, pero sin limitarse a, conectores especializados y químicas de acoplamiento (véase p.ej., Roberts et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 54: 459-476, 2002), unión de múltiples radicales de PEG a un único sitio de conjugación (tal como mediante el uso de PEG ramificados; p.ej., Guiotto et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180, 2002), PEGilación y/o mono-PEGilación específicas de sitio (véase p.ej., Chapman et al., Nature Biotech. 17:780-783, 1999), y PEGilación enzimática dirigida al sitio (véase p.ej., Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002). Los métodos y mecanismos descritos en la técnica pueden producir proteínas que tienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más 10 derivados de PEG o PEG unidos a una sola molécula de proteína (véase p.ej., el documento U.S. 2006/0104968).
Como ejemplo de ilustración de la PEGilación de un método ilustrativo para preparar enzimas que degradan hialuronano PEGilado, tales como hialuronidasas PEGiladas, se han aplicado PEG aldehídos, succinimidas y carbonatos para conjugar radicales de PEG, típicamente succinimidil PEG, a rHuPH20. Por ejemplo, rHuPH20 se ha conjugado con reactivos de succinimidil monoPEG (mPEG) ilustrativos que incluyen mPEG-propionatos de succinimidilo (mPEG-SPA), mPEG-butanoatos de succinimidilo (mPEG-SBA) y (para unir PEG "ramificados") mPEG2-N-hidroxilsuccinimida. Estos ésteres de succinimidilo PEGilados contienen cadenas principales carbonadas de longitud diferente entre el grupo PEG y el entrecruzados activado, y un grupo PEG único o ramificado. Estas diferencias se pueden utilizar, por ejemplo, para proporcionar diferentes cinéticas de reacción y para restringir potencialmente los sitios disponibles para la unión de PEG a rHuPH20 durante el proceso de conjugación.
Los PEG de succinimidilo (como anteriormente) que comprenden PEG lineales o ramificados pueden conjugarse con rHuPH20. Los PEG pueden utilizarse para generar rHuPH20 que contienen de manera reproducible moléculas que
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tienen, de promedio, entre aproximadamente tres y seis o tres y seis moléculas de PEG por hialuronidasa. Dichas composiciones de rHuPH20 PEGiladas se pueden purificar fácilmente para producir composiciones que tienen actividades específicas de aproximadamente 25.000 o 30.000 unidades/mg de proteína de actividad hialuronidasa, y que están sustancialmente libres de rHuPH20 no PEGilada (menos de 5% no PEGilada).
Utilizando diversos reactivos de PEG, pueden prepararse versiones ilustrativas de enzimas que degradan hialuronano, en particular hialuronidasas humanas recombinantes solubles (p.ej., rHuPH20), por ejemplo, utilizando mPEG-SBA (30 kD), mPEG-SMB (30 kD) y versiones ramificadas basadas en mPEG2-NHS (40 kD) y mPEG2-NHS (60 kD). Las versiones PEGiladas de rHuPH20 se han generado utilizando químicas de NHS, así como carbonatos y aldehídos, utilizando cada uno de los siguientes reactivos: mPEG2-NHS-40K ramificado, mPEG-NHS-10K ramificado, mPEG-NHS-20K ramificado, mPEG2-NHS -60K ramificado; mPEG-SBA-5K, mPEG-SBA-20K, mPEG- SBA-30K; mPEG-SMB-20K, mPEG-SMB-30K; mPEG-butiraldehído; mPEG-SPA-20K, mPEG-SPA-30K; y PEG- NHS-5K-biotina. Las hialuronidasas PEGiladas también se prepararon utilizando reactivos de PEG disponibles de Dowpharma, una división de Dow Chemical Corporation; incluyendo hialuronidasas PEGiladas con carbonato de p- nitrofenilo PEG de Dowpharma (30 kDa) y con propionaldehído PEG (30 kDa).
En un ejemplo, la PEGilación incluye la conjugación de mPEG-SBA, por ejemplo, mPEG-SBA-30K (que tiene un peso molecular de aproximadamente 30 kDa) u otros ésteres de succinimidilo de derivado de ácido PEG butanoico, a una hialuronidasa soluble. Los ésteres de succinimidilo de los derivados de ácido PEG butanoico, tales como mPEG-SBA-30K, se acoplan fácilmente a grupos amino de proteínas. Por ejemplo, la conjugación covalente de m- PEG-SBA-30K y rHuPH20 (que tiene un tamaño de aproximadamente 60 KDa) proporciona enlaces amida estables entre rHuPH20 y mPEG, como se muestra en el Esquema 1, a continuación.
Esquema 1
imagen2
Típicamente, se añade mPEG-SBA-30K u otro PEG a la enzima que degrada hialuronano, en algunos casos una hialuronidasa, a una razón molar de PEG:polipéptido de 10:1 en un tampón adecuado, p.ej. NaCl 130 mM/HEPES 10 mM a pH 6,8 o tampón de fosfato 70 mM, pH 7, seguido de esterilización, p.ej. filtración estéril, y conjugación continua, por ejemplo, con agitación, durante la noche a 4°C en una habitación fría. En un ejemplo, la enzima conjugada con PEG que degrada hialuronano se concentra y se somete a intercambio de tampón.
Se conocen en la técnica otros métodos para acoplar ésteres de succinimidilo de derivados de ácido PEG butanoico, tales como mPEG-SBA-30K (véase, por ejemplo, el documento U.S. 5.672.662; el documento U.S. 6.737.505; y el documento U.S. 2004/0235734). Por ejemplo, un polipéptido, tal como una enzima que degrada hialuronano (p.ej., una hialuronidasa), se puede acoplar a un derivado de PEG activado por NHS mediante reacción en un tampón de borato (0,1 M, pH 8,0) durante una hora a 4°C. La proteína PEGilada resultante se puede purificar por ultrafiltración. Alternativamente, la PEGilación de una fosfatasa alcalina bovina puede realizarse mezclando la fosfatasa con mPEG-SBA en un tampón que contiene fosfato sódico 0,2 M y NaCl 0,5 M (pH 7,5) a 4°C durante 30 minutos. El PEG sin reaccionar puede eliminarse por ultrafiltración. En otro método se hace reaccionar el polipéptido con mPEG- SBA en agua desionizada a la que se añade trietilamina para elevar el pH a 7,2-9. La mezcla resultante se agita a temperatura ambiente durante varias horas para completar la PEGilación.
Los expertos en la técnica conocen los métodos para la PEGilación de polipéptidos que degradan hialuronano, incluyendo, por ejemplo, hialuronidasas derivadas de animales y enzimas que degradan hialuronano bacteriano.
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Véase, por ejemplo, la Patente Europea Núm. EP 0400472, que describe la PEGilación hialuronidasa de testículos bovinos y condroitina ABC liasa. Asimismo, la Publicación de Estados Unidos Núm. 2006014968 describe la PEGilación de una hialuronidasa humana derivada de PH20 humana. Por ejemplo, la enzima PEGilada que degrada hialuronano contiene generalmente al menos 3 radicales de PEG por molécula. Por ejemplo, la enzima que degrada hialuronano puede tener una razón molar de PEG a proteína entre 5:1 y 9:1, por ejemplo, 7:1.
E. CORTICOSTEROIDES
Los corticosteroides son una clase de hormonas esteroides que se producen en la corteza suprarrenal. Los corticosteroides están involucrados en una amplia gama de sistemas fisiológicos, como la respuesta al estrés, la respuesta inmunitaria y la regulación de la inflamación, el metabolismo de los carbohidratos, el catabolismo de las proteínas, los niveles sanguíneos de electrolitos y el comportamiento. Estos incluyen glucocorticoides, que son agentes antiinflamatorios con un gran número de otras funciones y mineralocorticoides, que controlan el equilibrio de la sal y el agua principalmente a través de la acción sobre los riñones.
Los glucocorticoides son una clase de hormonas esteroides, por ejemplo, corticosteroides, que se unen al receptor de glucocorticoides. Los glucocorticoides causan sus efectos uniéndose al receptor de glucocorticoides. El complejo glucocorticoide activado a su vez regula la expresión de proteínas antiinflamatorias en el núcleo y reprime la expresión de proteínas proinflamatorias en el citosol al evitar la translocación de otros factores de transcripción del citosol al núcleo.
Generalmente, se puede utilizar cualquier glucocorticoide en los métodos o combinaciones descritos en la presente memoria. Los glucocorticoides incluyen glucocorticoides sintéticos y no sintéticos. Los glucocorticoides ilustrativos incluyen alclometasonas, algestonas, beclometasonas (p.ej., dipropionato de beclometasona), betametasonas (por ejemplo 17-valerato de betametasona, acetato sódico de betametasona, fosfato de sodio de betametasona, valerato de betametasona), budesonidas, clobetasoles (p.ej., propionato de clobetasol), clobetasonas, clocortolonas (p.ej., pivalato de clocortolona), cloprednoles, corticosteroides, cortisonas e hidrocortisonas (p.ej., acetato de hidrocortisona), cortivazoles, compuestos de deflazacort, desonidas, desoximetasonas, dexametasona (p.ej., 21- fosfato de dexametasona, acetato de dexametasona, fosfato sódico de dexametasona), diflorasonas (p.ej., diacetato de diflorasona), diflucortolonas, difluprednatos, enoxolonas, compuestos de fluazacort, flucloronides, fludrocortisonas (p.ej., acetato de fludrocortisona), flumetasonas (p.ej., pivalato de flumetasona), flunisolida, fluocinolonas (p.ej., acetonida de fluocinolona), fluocinonidas, fluocortinas, fluocortolonas, fluorometolonas (p.ej., acetato de fluorometolona), fluperolonas (p.ej., acetato de fluperolona), fluprednidenos, fluprednisolonas, flurandrenolidas, fluticasonas (p.ej. propionato de fluticasona), compuestos de formocortal, halcinonidas, halobetasoles, halometasonas, halopredonas, hidrocortamatos, hidrocortisonas (p.ej. 21-butirato de hidrocortisona, aceponato de hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, buteprato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona, cipionato de hidrocortisona, hemisuccinato de hidrocortisona, probutato de hidrocortisona, fosfato sódico de hidrocortisona, succinato sódico de hidrocortisona, valerato de hidrocortisona, etabonato de loteprednol, mazipredonas, medrisonas, meprednisolonas, metilprednisolonas (aceponato de metilprednisolona, acetato de metilprednisolona, hemisuccinato de metilprednisolona, succinato sódico de metilprednisolona), mometasonas (p.ej., furoato de mometasona), parametasona (p.ej., acetato de parametasona), prednicarbatos, prednisolonas (p.ej., 25-dietilaminoacetato de prednisolona, fosfato sódico de prednisolona, 21-hemisuccinato de prednisolona, acetato de prednisolona; farnesilato de prednisolona, hemisuccinato de prednisolona, prednisolona-21 (beta-D-glucurónido), metasulfobenzoato de prednisolona, esteaglato de prednisolona, tebutato de prednisolona, tetrahidroftalato de prednisolona), prednisonas, compuestos de prednival, predinlidenos, rimexolonas, tixocorticos, triamcinolonas (p. acetónido de triamcinolona, benetónido de triamcinolona, hexacetónido de triamcinolona, 21-palmitato de acetónido de triamcinolona, diacetato de triamcinolona). Estos glucocorticoides y las sales de los mismos se comentan en detalle, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (16a ed. 1980).
En algunos ejemplos, el glucocorticoide se selecciona entre cortisonas, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona y prednisona. En un ejemplo concreto, el glucocorticoide es dexametasona.
F. USO DE CORTICOSTEROIDES PARA MEJORAR LOS EFECTOS ADVERSOS DE UN AGENTE ANTIHIALURONANO
En la presente memoria se describen métodos de tratamiento o usos con glucocorticoides, p.ej., dexametasona, por vía oral o intravenosa, para eliminar o reducir los efectos musculoesqueléticos adversos inducidos por el tratamiento con una enzima PEGilada que degrada hialuronano. En los métodos, el glucocorticoide se utiliza en un régimen de dosificación o cantidad que no afecta al efecto terapéutico de la enzima que degrada hialuronano. Por ejemplo, las enzimas que degradan hialuronano PEGilado conjugadas con polímeros pueden utilizarse para terapia única o terapia combinada de una enfermedad o afección asociadas a hialuronano (véase p.ej Solicitud Publicada de Estados Unidos Núm. US2010003238 y Solicitud Publicada Internacional Núm. WO2009128917). Por ejemplo, puede utilizarse un glucocorticoide para mejorar los efectos secundarios o eventos adversos asociados con el
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tratamiento de una enfermedad o afección asociadas a hialuronano, tales como un cáncer, como se describe en la Sección H, y en particular terapia única o terapia combinada con una enzima que degrada hialuronano PEGilado (p.ej. PEGPH20) de dosis baja que se encuentra en la presente memoria para exhibir eficacia terapéutica. En la presente memoria se proporcionan composiciones farmacéuticas, esquemas de dosificación y medios de administración de corticosteroides para mejorar o reducir los efectos secundarios de los agentes anti-hialuronano administrados. Las composiciones se pueden proporcionar por separado o juntas como parte de un kit.
1. Composiciones y formulaciones farmacéuticas
En la presente memoria se proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen un glucocorticoide, tal como dexametasona,. Los glucocorticoides pueden co-formularse o co-administrarse con composiciones farmacéuticas que contienen un agente anti-hialuronano, tal como enzimas que degradan hialuronano PEGilado, para mejorar los efectos secundarios adversos asociados con el tratamiento de enfermedades o trastornos asociados a hialuronano con el agente anti-hialuronano, p.ej. hialuronidasas PEGiladas.
También se proporcionan en la presente memoria composiciones farmacéuticas de enzimas que degradan hialuronano PEGilado, tales como hialuronidasas PEGiladas. También se proporcionan en la presente memoria composiciones farmacéuticas que contienen un segundo agente que se utiliza para tratar una enfermedad o trastorno asociados con una enfermedad o afección asociadas a hialuronano, tal como cáncer. Los ejemplos de tales agentes incluyen, pero sin limitarse a, agentes anticancerosos que incluyen fármacos, polipéptidos, ácidos nucleicos, anticuerpos, péptidos, moléculas pequeñas, vectores de terapia génica, virus y otros agentes terapéuticos. Los agentes antihialuronano, tales como las enzimas que degradan hialuronano PEGilado, que incluyen hialuronidasas PEGiladas, tales como PEGPH20, pueden co-formularse o co-administrarse con formulaciones farmacéuticas de dichos segundos agentes para mejorar su administración a los sitios o tejidos deseados dentro del organismos asociados con hialuronano en exceso o acumulado.
Se preparan composiciones farmacéuticamente aceptables a la vista de las aprobaciones para una agencia reguladora u otra agencia preparada de acuerdo con la farmacopea generalmente reconocida para uso en animales y en humanos. Los compuestos pueden formularse en cualquier preparación farmacéutica adecuada para cualquiera de administración oral e intravenosa tal como soluciones, suspensiones, polvos o formulaciones de liberación sostenida. Típicamente, los compuestos se formulan en composiciones farmacéuticas utilizando mecanismos y procedimientos bien conocidos en la técnica (véase, p.ej. Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126. La formulación debe adecuarse al modo de administración.
En un ejemplo, la preparación farmacéutica puede estar en forma líquida, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones. Si se proporcionan en forma líquida, las preparaciones farmacéuticas se pueden proporcionar como una preparación concentrada para diluir a una concentración terapéuticamente eficaz antes de su uso. Dichas preparaciones líquidas se pueden preparar por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (p.ej., jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (p.ej., lecitina o acacia); vehículos no acuosos (p.ej., aceite de almendras, ésteres oleosos o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (p.ej., p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). En otro ejemplo, las preparaciones farmacéuticas se pueden presentar en forma liofilizada para su reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir portadores tales como un diluyente, coadyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra la composición (p.ej., corticosteroide o agente anti-hialuronano, tal como enzimas que degradan hialuronano PEGilado). Los ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin. Tales composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto o agente, generalmente en forma purificada o en forma parcialmente purificada, junto con una cantidad adecuada de portador para proporcionar la forma de administración adecuada al paciente. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral y aceite de sésamo. El agua es un portador típico. Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol también se pueden emplear como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Las composiciones pueden contener junto con un ingrediente activo: un diluyente tal como lactosa, sacarosa, fosfato dicálcico o carboximetilcelulosa; un lubricante, tal como estearato de magnesio, estearato de calcio y talco; y un aglutinante tal como almidón, gomas naturales, tales como goma arábiga, gelatina, glucosa, melazas, polivinilpirrolidina, celulosas y derivados de las mismas, povidona, crospovidonas y otros aglutinantes de este tipo conocidos por los expertos en la técnica. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua y etanol. Por ejemplo, los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol o etanol. Una composición, si se desea, también puede contener otras cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores del pH, estabilizantes, potenciadores de la solubilidad y otros
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agentes similares, tales como, por ejemplo, acetato de sodio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina y ciclodextrinas.
Los portadores farmacéuticamente aceptables utilizados en preparaciones parenterales incluyen vehículos acuosos, vehículos no acuosos, agentes antimicrobianos, agentes isotónicos, tampones, antioxidantes, anestésicos locales, agentes de suspensión y dispersión, agentes emulsionantes, agentes secuestrantes o quelantes y otras sustancias farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de vehículos acuosos incluyen inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer, Inyección de Dextrosa Isotónica, Inyección de Agua Estéril, Dextrosa e Inyección de Ringer con Lactato añadido. Los vehículos parenterales no acuosos incluyen aceites fijados de origen vegetal, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz, aceite de sésamo y aceite de cacahuete. Se pueden agregar agentes antimicrobianos a concentraciones bacteriostáticas o fungistáticas a preparaciones parenterales empaquetadas en contenedores de dosis múltiples, incluyendo fenoles o cresoles, mercuriales, alcohol bencílico, clorobutanol, ésteres de ácido metil y propil p-hidroxibenzoico, timerosal, cloruro de benzalconio y cloruro de bencetonio. Los agentes isotónicos incluyen cloruro de sodio y dextrosa. Los tampones incluyen fosfato y citrato. Los antioxidantes incluyen bisulfato de sodio. Los anestésicos locales incluyen hidrocloruro de procaína. Los agentes de suspensión y dispersión incluyen carboximetilcelulosa de sodio, hidroxipropilmetilcelulosa y polivinilpirrolidona. Los agentes emulsionantes incluyen polisorbato 80 (TWEEN 80). Un agente secuestrante o quelante de iones metálicos incluye EDTA. Los vehículos farmacéuticos también incluyen alcohol etílico, polietilenglicol y propilenglicol para vehículos miscibles en agua e hidróxido de sodio, ácido clorhídrico, ácido cítrico o ácido láctico para el ajuste del pH.
Los inyectables se pueden preparar en formas convencionales, tales como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de su inyección, o como emulsiones. Las preparaciones para administración intraprostática incluyen soluciones estériles listas para su inyección, productos estériles solubles en seco, tales como polvos liofilizados, listos para combinarse con un disolvente inmediatamente antes de su uso, incluyendo comprimidos hipodérmicos, suspensiones estériles listas para su inyección, productos insolubles secos estériles listos para ser utilizados combinados con un vehículo inmediatamente antes de su uso, emulsiones estériles. Las soluciones pueden ser acuosas o no acuosas.
2. Dosificaciones y administración
En los métodos y usos descritos en la presente memoria, el glucocorticoide se administra en una cantidad para mejorar, reducir o prevenir un efecto secundario o efecto adverso de un agente anti-hialuronano administrado. En general, se entiende que es la combinación del agente anti-hialuronano particular y la ruta de administración la que causa el efecto secundario particular. Los efectos secundarios ilustrativos observados por el tratamiento con agentes antihialuronano son efectos secundarios musculoesqueléticos. La dosificación o el régimen de dosificación a los que un agente anti-hialuronano provoca un efecto secundario adverso pueden ser determinados empíricamente por un experto en la técnica como se describe en la presente memoria (véase, por ejemplo, la Sección G). Los ejemplos describen métodos para evaluar y verificar eventos adversos en diversos sujetos y modelos como se ejemplifica por la administración de PEGPH20. Típicamente, la cantidad de agente anti-hialuronano también es una cantidad que logra un efecto terapéutico, tal como mediante la inhibición de la síntesis de HA o la degradación de HA. La cantidad de glucocorticoide que mejora, reduce o previene los efectos secundarios observados que resultan del agente anti- hialuronano administrado también puede determinarse empíricamente. La cantidad de glucocorticoide está en función del agente anti-hialuronano, la vía de administración, el efecto secundario observado o medido y el paciente o sujeto particular.
Los agentes anti-hialuronano y los glucocorticoides se pueden administrar mediante cualquier vía de administración adecuada, incluyendo, peso sin limitarse a, vía oral, intravenosa (IV), subcutánea, intramuscular, intratumoral, intradérmica, tópica, transdérmica, rectal o subepidérmica. Como se describe en la presente memoria, también se puede emplear la administración local, en particular para dosis más bajas de un agente anti-hialuronano. La vía de administración del agente anti-hialuronano y el glucocorticoide pueden ser iguales o diferentes. La vía de administración del agente anti-hialuronano está en función del agente anti-hialuronano y de la enfermedad o afección que se vayan a tratar. Del mismo modo, la ruta de administración del glucocorticoide está en función del corticosteroide concreto y el efecto secundario que se esté mejorando. Típicamente, la vía de administración del glucocorticoide y el agente anti-hialuronano es tal que se consigue un efecto sistémico. Por ejemplo, las enzimas que degradan hialuronano PEGilado se administran típicamente por vía intravenosa. En otro ejemplo, los glucocorticoides se administran típicamente por vía oral. Se contemplan otras vías de administración, como cualquier vía conocida por los expertos en la técnica.
El glucocorticoide se puede administrar secuencialmente, intermitentemente, al mismo tiempo o en la misma composición que la enzima PEGilada que degrada hialuronano. Las composiciones también se pueden administrar con otros segundos agentes o tratamientos biológicamente activos, tales como agentes quimioterapéuticos y biológicos, ya sea secuencialmente, intermitentemente, al mismo tiempo o en la misma composición. La administración también puede incluir sistemas de liberación controlada que incluyen formulaciones de liberación controlada y liberación controlada del dispositivo, tal como por medio de una bomba.
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Además, la concentración del agente o agentes farmacéuticamente activos se ajusta de modo que la administración proporcione una cantidad eficaz para producir el efecto farmacológico deseado. La dosis exacta depende de la edad, el peso y las condiciones del paciente o animal como se conoce en la técnica. Las preparaciones parenterales a dosis unitarias se envasan en una ampolla, un vial o una jeringa con una aguja. El volumen de solución líquida o preparación de polvo reconstituido, que contiene el agente o los agentes farmacéuticamente activos, está en función de la gravedad de la enfermedad y del artículo de fabricación concreto elegido para el envase. Todas las preparaciones para administración parenteral deben ser estériles, como se conoce y practica en la técnica.
Las composiciones farmacéuticas pueden formularse en formas de dosificación apropiadas para cada vía de administración. Los agentes farmacéuticamente activos y sus derivados se formulan y administran típicamente en formas de dosificación unitaria o formas de dosificación múltiples. Cada dosis unitaria contiene una cantidad predeterminada de agente terapéuticamente activo suficiente para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con los portadores, diluyentes o vehículos farmacéuticos requeridos. Los ejemplos de formas de dosis unitarias incluyen ampollas y jeringas y comprimidos o cápsulas envasadas individualmente. Las formas de dosis unitaria pueden administrarse en fracciones o múltiplos de las mismas. Una forma de dosis múltiple es una pluralidad de formas de dosificación unitarias idénticas empaquetadas en un único recipiente que se debe administrar en forma de dosis unitaria segregada. Los ejemplos de formas de dosis múltiples incluyen viales, frascos de comprimidos o cápsulas o frascos de 0,47 litros (pintas) o 3,78 litros (galones). Por lo tanto, una forma de dosis múltiple es un múltiplo de dosis unitarias que no están segregadas en el envase. Generalmente, pueden prepararse formas de dosificación o composiciones que contienen ingrediente activo en el intervalo de 0,005% a 100% constituyendo el resto un portador no tóxico. El agente o los agentes terapéuticos se pueden formular como composiciones farmacéuticas para uso de dosificación único o múltiple.
a. Corticosteroide
Se administra un glucocorticoide (en lo sucesivo también denominado corticosteroide) en una cantidad que es terapéuticamente eficaz para mejorar o reducir uno o más efectos adversos de la administración de un agente anti- hialuronano, tal como las enzimas que degradan hialuronano PEGilado, en particular, efectos musculoesqueléticos adversos. Una cantidad terapéuticamente efectiva es la dosis suficiente para mejorar, prevenir, eliminar o reducir uno o más síntomas o efectos adversos. Los indicadores de mejora o pretratamiento satisfactorio incluyen la determinación del fracaso para manifestar una puntuación relevante en la escala CTCAE o un cambio en la clasificación o gravedad en la escala CTCAE.
El corticosteroide se proporciona en una dosis terapéuticamente eficaz. La concentración terapéuticamente eficaz se puede determinar empíricamente mediante ensayos en sistemas in vitro o in vivo (p.ej., modelo animal) conocidos. Por ejemplo, la cantidad de un corticosteroide seleccionado que se va a administrar para mejorar los efectos adversos se puede determinar mediante técnicas clínicas convencionales. Además, se pueden emplear modelos animales para ayudar a identificar intervalos de dosis óptimos. La dosificación precisa, que se puede determinar empíricamente, puede depender de la preparación terapéutica concreta, el régimen y el programa de dosificación, la vía de administración y la gravedad de la enfermedad. Los métodos para evaluar dichos parámetros se describen en la Sección G, y se ilustran en los Ejemplos.
La concentración de un agente terapéutico seleccionado en la composición depende de las velocidades de absorción, inactivación y excreción, las características fisicoquímicas, el programa de dosificación y la cantidad administrada, así como otros factores conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se entiende que la dosificación precisa y la duración del tratamiento está en función de la enfermedad o afección, el tejido que se esté tratando, el paciente o sujeto y el agente anti-hialuronano, incluyendo la cantidad y el régimen de dosificación. La dosis del corticosteroide también puede variar dependiendo de la edad y la salud del paciente, la dosificación del agente anti-hialuronano (p.ej., dosificación de la enzima PEGilada que degrada hialuronano), la potencia del corticosteroide y la vía de administración. Por ejemplo, debe observarse que las concentraciones y los valores de dosificación variarán con la dosis terapéutica y el régimen de dosificación del agente anti-hialuronano, por ejemplo, la enzima PEGilada que degrada hialuronano. Además, el corticosteroide se puede administrar diariamente, semanalmente o mensualmente o durante períodos de tiempo más largos para lograr los resultados deseados. El volumen de dosificación particular puede variar y depende del régimen de dosificación, la frecuencia de administración y la velocidad de administración deseada. Cabe señalar que las concentraciones y los valores de dosificación también pueden variar con la edad del individuo tratado.
La dosificación precisa y la duración del tratamiento pueden determinarse empíricamente utilizando protocolos de ensayo conocidos o mediante extrapolación de ensayo in vivo o in vitro. Debe entenderse adicionalmente que para cualquier sujeto concreto, los regímenes de dosificación específicos deben ajustarse a lo largo del tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las formulaciones, y que los intervalos de concentración establecidos en la presente memoria son solamente ilustrativos y no se pretende que limiten su alcance. En general, los regímenes de dosificación se eligen para limitar la toxicidad, y en la presente memoria se eligen para mejorar los efectos secundarios adversos. Cabe
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señalar que el médico a cargo sabría cómo interrumpir, y cuándo interrumpir o ajustar la terapia a una dosis menor debido a la toxicidad, o disfunción de la médula ósea, el hígado o el riñón u otras disfunciones tisulares. Por el contrario, el médico a cargo también sabría cómo y cuándo ajustar el tratamiento a niveles más altos si la respuesta clínica no fuera la adecuada (lo que excluye los efectos secundarios tóxicos). La administración de un agente terapéutico no debe exceder los niveles de dosificación máximos establecidos por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos o publicados en Physician's Desk Reference.
Generalmente, la dosis de corticosteroide administrada depende del corticosteroide específico, ya que existe una diferencia en la potencia entre diferentes corticosteroides (véase la Tabla 4 a continuación). El corticosteroide, o glucocorticoide, por ejemplo dexametasona, se puede administrar por vía oral (comprimidos, líquido o producto concentrado líquido) PO, por vía intravenosa (IV) o intramuscular. El corticosteroide se administra típicamente en forma de bolo, pero muchos se administran durante un período de tiempo, siempre que la dosis sea eficaz para mejorar uno o más efectos secundarios asociados con la administración del agente anti-hialuronano, por ejemplo, una hialuronidasa PEGilada.
Tabla 4. Administración de glucocorticoides
Glucocorticoide (ruta)
Potencia equivalente (mg)
Hidrocortisona (IV o PO)
20
Prednisona
5
Prednisolona (IV o PO)
5
Succinato sódico de metilprednisolona (IV)
4
Dexametasona (IV o PO)
0,5-0,75
El corticosteroide se puede administrar en cualquier cantidad que sea eficaz para mejorar uno o más efectos secundarios asociados con la administración del agente anti-hialuronano, por ejemplo, una enzima PEGilada que degrada hialuronano. Por lo tanto, el corticosteroide, por ejemplo, glucocorticoide, se puede administrar, por ejemplo, a una cantidad entre, o aproximadamente entre, 0,1 y 100 mg, por dosis, 0,1 a 80 mg, 0,1 a 60 mg, 0,1 a 40 mg, 0,1 a 30 mg, 0,1 a 20 mg, 0,1 a 15 mg, 0,1 a 10 mg, 0,1 a 5 mg, 0,2 a 40 mg, 0,2 a 30 mg, 0,2 a 20 mg, 0,2 a 15 mg, 0,2 a 10 mg, 0,2 a 5 mg, 0,4 a 40 mg, 0,4 a 30 mg, 0,4 a 20 mg, 0,4 a 15 mg, 0,4 a 10 mg, 0,4 a 5 mg, 0,4 a 4 mg, 1 a 20 mg, 1 a 15 mg o 1 a 10 mg, a un sujeto humano adulto de 70 kg. Típicamente, el corticosteroide, tal como un glucocorticoide se administra a una cantidad entre, o aproximadamente entre, 0,4 y 20 mg, por ejemplo, de, o de aproximadamente, 0,4 mg, 0,5 mg, 0,6 mg, 0,7 mg, 0,75 mg, 0,8 mg, 0,9 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg, 16 mg, 17 mg, 18 mg, 19 mg o 20 mg por dosis, a un sujeto humano adulto promedio.
El corticosteroide puede administrarse, por ejemplo, en una dosificación de, o de aproximadamente, 0,001 mg/kg (del sujeto), 0,002 mg/kg, 0,003 mg/kg, 0,004 mg/kg, 0,005 mg/kg, 0,006 mg/kg, 0,007 mg/kg, 0,008 mg/kg, 0,009 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,015 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,025 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,035 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,045 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,055 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,065 mg/kg, 0,07 mg/kg, 0,075 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,085 mg/kg, 0,09 mg/kg, 0,095 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,30 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,40 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,50 mg/kg, 0,55 mg/kg, 0,60 mg/kg, 0,65 mg/kg, 0,70 mg/kg, 0,75 mg/kg, 0,80 mg/kg, 0,85 mg/kg, 0,90 mg/kg, 0,95 mg/kg, 1 mg/kg, 1,05 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,15 mg/kg, 1,20 mg/kg, 1,25 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,35 mg/kg o 1,4 mg/kg, a un sujeto humano adulto promedio, pesando típicamente aproximadamente de 70 kg a 75 kg.
La administración de la dosificación administrada puede variar siempre que la administración del corticosteroide mejore uno o más efectos secundarios adversos asociados con la administración del agente anti-hialuronano, tal como una hialuronidasa PEGilada. En un ejemplo, la dosificación de glucocorticoide, por ejemplo, dexametasona, se administra a dosis sucesivamente más bajas por ciclo de tratamiento. Por lo tanto, en tales regímenes de tratamiento, la dosis de corticosteroide se reduce. Por ejemplo, la dexametasona se administra antes de la administración de un agente anti-hialuronano, por ejemplo una hialuronidasa PEGilada, a una dosis inicial de 4 mg, y después de cada administración sucesiva del agente anti-hialuronano, p.ej. una hialuronidasa PEGilada, la dosis de dexametasona se reduce, de modo que la dosis es de 3 mg para la siguiente administración del agente anti- hialuronano, p.ej. hialuronidasa PEGilada, a continuación 2 mg por administración de agente anti-hialuronano, p.ej. hialuronidasa PEGilada, y a continuación 1 mg por administración de agente anti-hialuronano, p.ej. hialuronidasa pegilada. Se contempla cualquier dosis siempre que la dosis del corticosteroide sea eficaz para reducir uno o más efectos secundarios asociados con la administración del agente anti-hialuronano, p.ej. una hialuronidasa PEGilada.
El tiempo de administración puede variar siempre que la administración del corticosteroide mejore uno o más efectos secundarios adversos asociados con la administración del agente anti-hialuronano, tal como una hialuronidasa PEGilada. El corticosteroide se puede administrar secuencialmente, de forma intermitente, al mismo tiempo o en la
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misma composición que el agente anti-hialuronano, p.ej. enzima que degrada hialuronano PEGilada Por ejemplo, el corticosteroide puede administrarse antes, durante, simultáneamente, o después de la administración del agente anti-hialuronano, p.ej. hialuronidasa pegilada En otro ejemplo, el agente corticosteroide y anti-hialuronano, p.ej. hialuronidasa PEGilada, se administran intermitentemente. En general, el corticosteroide se administra antes de la administración del agente anti-hialuronano, p.ej. hialuronidasa pegilada. Por ejemplo, el corticosteroide, por ejemplo, glucocorticoide, tal como dexametasona, se puede administrar a, o aproximadamente a los 0,5 minutos, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 6 minutos, 7 minutos, 8 minutos, 9 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 25 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas o más antes de la administración del agente anti- hialuronano, por ejemplo, una enzima PEGilada que degrada hialuronano.
En algunos ejemplos, el corticosteroide se administra al mismo tiempo que la administración del agente anti- hialuronano, por ejemplo, una enzima PEGilada que degrada hialuronano. En este ejemplo, el corticosteroide se puede administrar junto con, o separado del, agente anti-hialuronano, p.ej. una hialuronidasa PEGilada. Típicamente, el corticosteroide se administra por separado del agente anti-hialuronano, por ejemplo, una enzima PEGilada que degrada hialuronano. En otros ejemplos, el corticosteroide se administra a, o aproximadamente a los 0,5 minutos, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 6 minutos, 7 minutos, 8 minutos, 9 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 25 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas o más después de la administración del agente anti-hialuronano, por ejemplo, una enzima PEGilada que degrada hialuronano.
En un ejemplo, el corticosteroide se administra antes de la administración del agente anti-hialuronano, por ejemplo, una hialuronidasa PEGilada. Por ejemplo, el corticosteroide, por ejemplo, glucocorticoide, por ejemplo, dexametasona, se administra 1 hora antes de la administración del agente anti-hialuronano, p.ej. una hialuronidasa PEGilada. En otro ejemplo, el corticosteroide se administra 5 minutos antes de la administración del agente anti- hialuronano, p.ej. una enzima PEGilada que degrada hialuronano. En otro ejemplo, el corticosteroide se administra tanto antes como después de la administración del agente anti-hialuronano, p.ej. una hialuronidasa PEGilada. En este ejemplo, el corticosteroide, tal como la dexametasona, se administra de uno a cinco minutos inmediatamente antes de la administración del agente anti-hialuronano, p.ej. una enzima PEGilada que degrada hialuronano y ocho horas después de la administración del agente anti-hialuronano, p.ej. una enzima PEGilada que degrada
hialuronano. En otro ejemplo, se administra un corticosteroide, tal como dexametasona, una hora antes de la administración del agente anti-hialuronano, p.ej. una enzima PEGilada que degrada hialuronano y de ocho a doce horas después de la administración del agente anti-hialuronano, p.ej. una enzima PEGilada que degrada
hialuronano.
Se contempla cualquier régimen de dosificación siempre que el tiempo de dosificación del corticosteroide mejore los uno o más efectos secundarios asociados con la administración del agente anti-hialuronano, por ejemplo, una hialuronidasa PEGilada. Además, la dosis o el régimen de dosificación del corticosteroide es uno que no interfiere ni reduce el efecto terapéutico del agente anti-hialuronano en el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado a hialuronano.
b. Agente Anti-Hialuronano
En el método descrito en la presente memoria, el corticosteroide se administra para mejorar o reducir los eventos adversos asociados con un agente anti-hialuronano. La cantidad de agente anti-hialuronano que se administra está en una cantidad que produce o causa un efecto secundario adverso, tal como un efecto secundario musculoesquelético. Típicamente, la dosis de enzima que degrada hialuronano es aquella que también logra un efecto terapéutico en el tratamiento de una enfermedad o afección asociadas a hialuronano. Por lo tanto, las composiciones de un agente anti-hialuronano se incluyen en una cantidad suficiente para ejercer un efecto terapéuticamente útil. La composición que contiene el agente activo puede incluir un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones de un agente anti-hialuronano también pueden incluir un segundo agente. En general, la dosificación (cantidad y régimen de dosificación) del agente anti-hialuronano, por ejemplo, una enzima PEGilada que degrada hialuronano, determinará la dosificación (cantidad y régimen de dosificación) del corticosteroide, es decir, un glucocorticoide.
La concentración terapéuticamente eficaz de agentes anti-hialuronano se puede determinar empíricamente sometiendo a ensayo los compuestos en sistemas in vitro y in vivo conocidos, tales como los ensayos proporcionados en la presente memoria. Por ejemplo, la concentración de un agente anti-hialuronano, por ejemplo una enzima PEGilada que degrada hialuronano, tal como la hialuronidasa PEGilada depende de las tasas de absorción, inactivación y excreción del complejo, las características fisicoquímicas del complejo, el programa de dosificación y la cantidad administrada así como de otros factores conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se entiende que la dosificación precisa y la duración del tratamiento está en función del tejido que se esté tratando, la enfermedad o afección que se esté tratando, la vía de administración, el paciente o el sujeto y el agente anti-hialuronano concreto y se puede determinar empíricamente utilizando protocolos de ensayo conocidos o por extrapolación de datos de ensayo in vivo o in vitro y/o pueden determinarse a partir de los regímenes de dosificación
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conocidos del agente concreto. La cantidad de un agente anti-hialuronano, por ejemplo, una enzima PEGilada que degrada hialuronano, tal como una hialuronidasa PEGilada, que se administrará para el tratamiento de una enfermedad o afección, por ejemplo, una enfermedad o afección asociadas a hialuronano tal como un tumor rico en HA, puede determinarse mediante técnicas clínicas convencionales. Además, se pueden emplear ensayos in vitro y modelos animales para ayudar a identificar intervalos de dosificación óptimos. La dosificación precisa, que puede determinarse empíricamente, puede depender de la enzima concreta, la vía de administración, el tipo de enfermedad que se vaya a tratar y la gravedad de la enfermedad.
Por ejemplo, los agentes y tratamientos para el tratamiento de enfermedades y afecciones asociadas a hialuronano, tales como agentes anticancerosos, son bien conocidos en la técnica (véase, p.ej. la Solicitud Publicada de Estados Unidos Núm. 20100003238 y la Solicitud Internacional PCT publicada Núm. WO 2009/128917). Por lo tanto, las dosificaciones de un agente anti-hialuronano, tal como una enzima que degrada hialuronano, por ejemplo una hialuronidasa, u otros segundos agentes en una composición se pueden elegir en base a los regímenes de dosificación convencionales para ese agente bajo una ruta de administración dada. Además, como se describe en la Sección H a continuación, en la presente memoria se encuentra que dosis mucho más bajas de una enzima que degrada hialuronano, por ejemplo, exhiben una eficacia terapéutica para el tratamiento de la enfermedad y afección asociada a hialuronano. Por lo tanto, los regímenes de dosificación que utilizan dosis más bajas de una enzima que degrada hialuronano, por ejemplo una enzima que degrada hialuronano modificada con un polímero tal como una PH20 PEGilada, pueden utilizarse para tratar una enfermedad y afección asociada a hialuronano. Como se describe en la presente memoria, cualquiera de tales dosis o régimen de dosificación puede asociarse con eventos adversos, tales como efectos secundarios musculoesqueléticos, que se pueden mejorar mediante premedicación, coadministración y/o post-medicación de un corticosteroide.
Los ejemplos de cantidades eficaces de un agente anti-hialuronano son dosis que varían de 0,01 pg a 100 g por kg de peso corporal. Por ejemplo, una cantidad eficaz de un agente anti-hialuronano es una dosis que varía de 0,01 pg a 100 mg por kg de peso corporal, como 0,01 pg a 1 mg por kg de peso corporal, 1 pg a 100 pg por kg de cuerpo peso, 1 pg a 10 pg por kg de peso corporal o de 0,01 mg a 100 mg por kg de peso corporal. Por ejemplo, las cantidades eficaces incluyen al menos o aproximadamente al menos o aproximadamente 0,01 pg, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 pg/kg de peso corporal . Otros ejemplos de cantidades eficaces incluyen 0,01, 0,02, 0,03, 0,04,
0. 05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 g/kg de peso corporal . Por ejemplo, un agente anti-hialuronano, tal como una enzima que degrada hialuronano, por ejemplo una hialuronidasa (p.ej., una hialuronidasa PEGilada tal como una PEGPH20), se puede administrar de, o aproximadamente de, 0,1 pg/kg a 1 mg/kg, por ejemplo 0,5 pg/kg a 100 pg/kg, 0,75 pg/kg a 15 pg/kg, 0,75 pg/kg a 7,5 pg/kg o 1,0 pg/kg a 3,0 pg/kg. En otros ejemplos, un agente anti-hialuronano tal como una enzima que degrada hialuronano, por ejemplo una hialuronidasa (p.ej., una hialuronidasa PEGilada tal como una PEGPH20), se puede administrar de 1 mg/kg a 500 mg/kg, por ejemplo, de 100 mg/kg a 400 mg/kg, tal como 200 mg/kg. Generalmente, las composiciones contienen de 0,5 mg a 100 gramos de agente anti-hialuronano, por ejemplo, de 20 pg a 1 mg, tal como de 100 pg a 0,5 mg o pueden contener de 1 mg a 1 gramo, tal como de 5 mg a 500 mg.
La dosis o composiciones pueden ser para administración de una sola dosis o para administración de dosificación múltiple. La dosis o composición se pueden administrar en una sola administración una vez, varias veces a la semana, dos veces a la semana, cada 15 días, 16 días, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 días, una vez al mes, varias veces al año o anualmente. En otros ejemplos, la dosis o composición pueden dividirse y administrarse una vez, varias veces a la semana, dos veces a la semana, cada 15 días, 16 días, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26., 27, 28, 29 o 30 días, una vez al mes, varias veces al año o anualmente. Las composiciones antihialuronano se pueden formular como composiciones líquidas o se pueden liofilizar. Las composiciones también se pueden formular como un comprimido o cápsula.
A continuación se proporciona la descripción de dosificaciones y regímenes de dosificación de agentes anti- hialuronano ilustrativos para su uso en los métodos de la presente invención. Los agentes anti-hialuronano pueden utilizarse solos en una terapia de agente único o combinados con otros agentes para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección asociadas a HA. Como se comenta en otra parte de la presente memoria, en ejemplos concretos de los métodos y usos descritos en la presente memoria, dichos agentes se administran combinados con un glucocorticoide para mejorar un efecto secundario asociado con el tratamiento del agente anti-hialuronano.
1. Leflunomida y Derivados
En un ejemplo, la leflunomida, o sus derivados, generalmente están disponibles como comprimidos que contienen 1100 mg de fármaco activo, por ejemplo, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg de fármaco. Para el tratamiento de enfermedades y afecciones asociadas a hialuronano, por ejemplo, artritis reumatoide, se administran 10 a 500 mg por día, típicamente 100 mg por día. La dosificación puede continuarse según sea necesario para el tratamiento de la enfermedad o condiciones, o puede disminuirse o reducirse a dosis sucesivamente más bajas. Por
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ejemplo, para el tratamiento de la Artritis reumatoide, la leflunomida se puede administrar a una dosis de carga inicial de 100 mg por día durante tres días y a continuación se administra a una dosis continua de 20 mg/día.
ii. Enzima que degrada Hialuronano
Por ejemplo, una enzima que degrada hialuronano, tal como una enzima PEGilada que degrada hialuronano (p.ej., una hialuronidasa), se puede administrar sistémicamente, por ejemplo, por vía intravenosa (IV), intramuscularmente, o por cualquier otra ruta sistémica. En ejemplos concretos, se pueden administrar dosis más bajas localmente. Por ejemplo, la administración local de una enzima que degrada hialuronano, tal como una enzima PEGilada que degrada hialuronano, por ejemplo una hialuronidasa PEGilada (p.ej., PH20) incluye administración intratumoral, inyección arterial (p.ej., arteria hepática), administración intraperitoneal, administración intravesical y otras rutas locales utilizadas para la terapia del cáncer que puede aumentar la acción local a una dosis absoluta más baja.
El intervalo de dosificación ilustrativo es de, o de aproximadamente, 0,3 Unidades/kg a 320.000 Unidades/kg, tal como 10 unidades/kg a 320.000 unidades/kg de una hialuronidasa pegilada, o una cantidad funcionalmente equivalente de otra enzima pegilada que degrada hialuronano. En la presente memoria se entiende que una unidad de actividad se normaliza a una actividad convencional, por ejemplo, una actividad medida en un ensayo de microturbidez que analiza la actividad de hialuronidasa. Una hialuronidasa soluble pegilada puede exhibir una menor actividad por mg de proteína total, es decir, exhibe una actividad específica menor, en comparación con una hialuronidasa soluble nativa no tan conjugada. Por ejemplo, una preparación ilustrativa de rHuPH20 exhibe una actividad específica de 120.000 Unidades/mg, mientras que una forma PEGilada de rHuPH20 exhibe una actividad específica de aproximadamente 32.000 Unidades/mg. Típicamente, una forma PEGilada de una enzima que degrada hialuronano, tal como una hialuronidasa, por ejemplo, rHuPH20, exhibe una actividad específica dentro del intervalo de, o de aproximadamente, 18.000 a aproximadamente 45.000 U/mg. En un ejemplo, la enzima PEG que degrada hialuronano puede proporcionarse como una solución de partida, por ejemplo, de 3,5 mg/mL a 112.000 U/mL (~32.000 U/mg), con una razón molar de PEG a proteína entre 5:1 y 9:1, por ejemplo, 7:1, o puede proporcionarse en una forma menos concentrada. Para los fines de la presente memoria, las dosificaciones pueden ser con referencia a las Unidades.
Por ejemplo, la enzima PEGilada que degrada hialuronano, tal como una hialuronidasa, por ejemplo PEGPH20, puede administrarse por vía intravenosa dos veces a la semana, una vez a la semana o una vez cada 21 días. Típicamente, la enzima PEGilada que degrada hialuronano se administra dos veces a la semana. El ciclo de administración puede ser por un período definido, generalmente por 3 semanas o 4 semanas. El ciclo de administración puede repetirse en un régimen de dosificación durante más de un mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 1 año o más. En general, el ciclo de administración se repite a discreción de un médico a cargo, y puede depender de factores tales como la remisión de la enfermedad o afección, la gravedad de la enfermedad o afección, los eventos adversos y otros factores. En otros ejemplos, en ciclos posteriores de administración, la enzima que degrada hialuronano puede administrarse con menos frecuencia. Por ejemplo, en un primer ciclo la enzima que degrada hialuronano se administra dos veces por semana durante cuatro semanas, y en ciclos subsiguientes de administración la enzima que degrada hialuronano se administra una vez a la semana o una vez cada dos semanas, una vez cada 3 semanas (p.ej., una vez cada 21 días) o una vez cada 4 semanas. Como se describe en la presente memoria, la dosis o régimen de dosificación de corticosteroide depende del régimen de dosificación de la enzima que degrada hialuronano.
Si bien las dosis pueden variar dependiendo de la enfermedad y del paciente, la enzima que degrada hialuronano, tal como una hialuronidasa PEGilada, generalmente se administra en una cantidad que es o está aproximadamente en el intervalo de 0,01 pg/kg a 25 mg/kg, tal como de 0.0005 mg/kg (0,5 pg/kg) a 10 mg/kg (320.000 U/kg), por ejemplo, de 0,02 mg/kg a 1,5 mg/kg, por ejemplo, 0,05 mg/kg. La hialuronidasa PEGilada puede administrarse, por ejemplo, a una dosis de, o de aproximadamente, 0.0005 mg/kg (del sujeto), 0.0006 mg/kg, 0.0007 mg/kg, 0.0008 mg/kg, 0.0009 mg/kg, 0,001 mg/kg, 0,0016 mg/kg, 0,002 mg/kg, 0,003 mg/kg, 0,004 mg/kg, 0,005 mg/kg, 0,006 mg/kg, 0,007 mg/kg, 0,008 mg/kg, 0,009 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,016 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,07 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,09 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,30 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,40 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,55 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,7 mg/kg, 0,8 mg/kg, 0,9 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1,7 mg/kg, 1,8 mg/kg, 1,9 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 3,5 mg/kg, 4 mg/kg, 4,5 mg/kg, 5 mg/kg, 5,5 mg/kg, 6 mg/kg, 6,5 mg/kg, 7 mg/kg, 7,5 mg/kg, 8 mg/kg, 8,5 mg/kg, 9 mg/kg, 9,5 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, 21 mg/kg, 22 mg/kg, 23 mg/kg, 24 mg/kg, 25 mg/kg o más a un sujeto humano adulto promedio, que típicamente pesa aproximadamente de 70 kg a 75 kg. En ejemplos concretos, como se describe en la Sección H en la presente memoria, la enzima que degrada hialuronano se administra en cantidades inferiores tales como menos de 20 pg/kg, por ejemplo, de 0,01 pg/kg a 15 pg/kg, 0,05 pg/kg a 10 pg/kg, 0,75 pg/kg a 7,5 pg/kg o 1,0 pg/kg a 3,0 pg/kg.
Una enzima que degrada hialuronano, tal como una hialuronidasa PEGilada (p.ej., PH20), proporcionada en la presente memoria, por ejemplo, PEGPH20, se puede administrar de, o de aproximadamente, 1 Unidad/kg a 800.000
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650.000 Unidades/kg, 10 a 600.000 Unidades/kg, 10 a 550.000 Unidades/kg, 10 a 500.000 Unidades/kg, 10 a
450.000 Unidades/kg, 10 a 400.000 Unidades/kg, 10 a 350.000 Unidades/kg, 10 a 320.000 Unidades/kg, 10 a
300.000 Unidades/kg, 10 a 280.000 Unidades/kg, 10 a 260.000 Unidades/kg, 10 a 240.000 Unidades/kg, 10 a
220.000 Unidades/kg, 10 a 200.000 Unidades/kg, 10 a 180.000 Unidades/kg, 10 a 160.000 Unidades/kg, 10 a
140.000 Unidades/kg, 10 a 120.000 Unidades/kg, 10 a 100.000 Unidades/kg, 10 a 80.000 Unidades/kg, 10 a 70.000 Unidades/kg, 10 a 60.000 Unidades/kg, 10 a 50.000 Unidades/kg, 10 a 40.000 Unidades/kg, 10 a 30.000 Unidades/kg, 10 a 20.000 Unidades/kg, 10 a 15.000 Unidades/kg, 10 a 12.800 Unidades/kg, 10 a 10.000 Unidades/kg, 10 a 9.000 Unidades/kg, 10 a 8.000 Unidades/kg, 10 a 7.000 Unidades/kg, 10 a 6.000 Unidades/kg, 10 a 5.000 Unidades/kg, 10 a 4.000 Unidades/kg, 10 a 3.000 Unidades/kg, 10 a 2.000 Unidades/kg, 10 a 1.000 Unidades/kg, 10 a 900 Unidades/kg, 10 a 800 Unidades/kg, 10 a 700 Unidades/kg, 10 a 500 Unidades/kg, 10 a 400 Unidades/kg, 10 a 300 Unidades/kg, 10 a 200 Unidades/kg, 10 a 100 Unidades/kg, 16 a 600.000 Unidades/kg, 16 a
500.000 Unidades/kg, 16 a 400.000 Unidades/kg, 16 a 350.000 Unidades/kg, 16 a 320.000 Unidades/kg, 16 a
160.000 Unidades/kg, 16 a 80.000 Unidades/kg, 16 a 40.000 Unidades/kg, 16 a 20.000 Unidades/kg, 16 a 16.000 Unidades/kg, 16 a 12.800 Unidades/kg, 16 a 10.000 Unidades/kg, 16 a 5.000 Unidades/kg, 16 a 4.000 Unidades/kg, 16 a 3.000 unidades/kg, 16 a 2.000 unidades/kg, 16 a 1.000 unidades/kg, 16 a 900 unidades/kg, 16 a 800 unidades/kg, 16 a 700 unidades/kg, 16 a 500 unidades/kg, 16 a 400 Unidades/kg, 16 a 300 Unidades/kg, 16 a 200 Unidades/kg, 16 a 100 Unidades/kg, 160 a 12.800 Unidades/kg, 160 a 8.000 Unidades/kg, 160 a 6.000 Unidades/kg, 160 a 4.000 Unidades/kg, 160 a 2.000 Unidades/kg, 160 a 1.000 Unidades/kg, 160 a 500 Unidades/kg, 500 a 5000 Unidades/kg, 1000 a 100.000 Unidades/kg o 1000 a 10.000 Unidades/kg, de la masa del sujeto a quien se le administra. En algunos ejemplos, una enzima que degrada hialuronano, tal como una hialuronidasa PEGilada (p.ej., PH20), proporcionada en la presente memoria, por ejemplo, PEGPH20, se puede administrar de, o de aproximadamente 1 Unidad/kg a 1000 Unidades/kg, 1 Unidad/kg a 500 Unidades/kg o 10 Unidades/kg a 50 Unidades/kg.
En general, cuando la actividad específica de la hialuronidasa PEGilada es o es de aproximadamente 18.000 U/mg a
45.000 U/mg, generalmente se administran, o se administran aproximadamente, 1 Unidad/kg (U/kg), 2 U/kg, 3 U/kg, 4 U/kg, 5 U/kg, 6 U/kg, 7 U/kg, 8 U/kg, 8 U/kg 10 U/kg, 16 U/kg, 32 U/kg, 64 U/kg, 100 U/kg, 200 U/kg, 300 U/kg, 400 U/kg, 500 U/kg, 600 U/kg, 700 U/kg, 800 U/kg, 900 U/kg, 1.000 U/kg, 2.000 U/kg, 3.000 U/kg, 4.000 U/kg, 5.000 U/kg, 6.000 U/kg, 7.000 U/kg, 8.000 U/kg, 9.000 U/kg, 10.000 U/kg, 12.800 U/kg, 20.000 U/kg, 32.000 U/kg, 40.000 U/kg, 50.000 U/kg, 60.000 U/kg, 70.000 U/kg, 80.000 U/kg, 90.000 U/kg, 100.000 U/kg, 120.000 U/kg, 140.000 U/kg,
160.000 U/kg, 180.000 U/kg, 200.000 U/kg, 220.000 U/kg, 240.000 U/kg, 260.000 U/kg, 280.000 U/kg, 300.000 U/kg,
320.000 U/kg, 350.000 U/kg, 400.000 U/kg, 450.000 U/kg, 500.000 U/kg, 550.000 U/kg, 600.000 U/kg, 650.000 U/kg,
700.000 U/kg, 750.000 U/kg, 800.000 U/kg o más, por masa del sujeto.
En algunos aspectos, la enzima PEGilada que degrada hialuronano se formula y se dosifica para mantener al menos 3 U/mL de la hialuronidasa PEGilada en plasma (véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente de Estados Unidos Publicada Núm. US20100003238 y la Solicitud de Patente Internacional Núm. WO2009128917). Por ejemplo, la hialuronidasa soluble pegilada se formula para la administración sistémica en una cantidad suficiente para mantener al menos o aproximadamente 3 U/mL en plasma, generalmente 3 U/mL - 12 U/mL o más, por ejemplo, al menos o aproximadamente un nivel de 4 U/ml, 5 U/ml, 6 U/ml, 7 U/ml, 8 U/ml, 9 U/ml, 10 U/ml, 11 U/ml, 12 U/ml, 13 U/mL, 14 U/mL, 15 U/mL, 16 U/mL, 17 U/mL, 18 U/mL, 19 U/mL, 20 U/mL, 25 U/mL, 30 U/mL, 35 U/ml, 40 U/ml, 45 U/ml, 50 U/mL o más. Generalmente, para los fines de la presente memoria, para mantener al menos 3 U/mL de la hialuronidasa en plasma, se administran, o se administran aproximadamente 0,02 mg/kg (del sujeto), 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0.07 mg/kg, 0.08 mg/kg, 0.09 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.30 mg/kg, 0.35 mg/kg, 0.40 mg/kg kg, 0,45 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,55 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,7 mg/kg, 0,8 mg/kg, 0,9 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg o más. Generalmente, cuando la actividad específica de la hialuronidasa modificada es o es de aproximadamente 20.000 U/mg a 60.000 U/mg, generalmente se administran, o se administran aproximadamente 35.000 U/mg, 60.000 U; 70.000 U; 80.000 U;
90.000 U; 100.000 U; 200.000 U; 300.000 U; 400.000 U; 500.000 U; 600.000 U; 700.000 U; 800.000 U; 900.000 U; 1.000.000 U; 1.500.000 U; 2.000.000 U; 2.500.000 U; 3.000.000 U; 3.500.000 U; 4.000.000 de U o más. Para mantener dichos niveles, la administración puede ser diaria, varias veces a la semana, dos veces a la semana, semanalmente o mensualmente.
Está dentro del nivel de un experto en la técnica determinar las cantidades de enzima PEGilada que degrada hialuronano, por ejemplo, PH20 PEGilada, para mantener al menos 3 U/mL de la hialuronidasa en sangre. El nivel de hialuronidasa en sangre puede controlarse a lo largo del tiempo para garantizar que haya una cantidad suficiente de hialuronidasa en la sangre. Se puede realizar cualquier análisis conocido por un experto en la técnica para medir la hialuronidasa en el plasma. Por ejemplo, se puede realizar un ensayo de microturbidez o ensayo enzimático descrito en los ejemplos de la presente memoria sobre proteína en plasma. Cabe esperar que el plasma normalmente contenga enzimas hialuronidasas. Tales enzimas hialuronidasas plasmáticas típicamente tienen actividad a un pH ácido (Patente de Estados Unidos Núm. 7.105.330). Por lo tanto, antes del tratamiento con una enzima modificada, deben determinarse y utilizarse como referencia los niveles en plasma de hialuronidasa. Las mediciones posteriores de los niveles de hialuronidasa en plasma después del tratamiento se pueden comparar con
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los niveles previos a los tratamientos. Alternativamente, el ensayo se puede realizar en condiciones de pH que supriman la actividad de la hialuronidasa lisosómica endógena en plasma, que normalmente exhibe actividad a pH ácido. Por lo tanto, cuando la hialuronidasa soluble modificada es activa a pH neutro (p.ej., PH20 humana), solo se mide el nivel de la hialuronidasa soluble neutra activa modificada.
En otros ejemplos, como se describe en la Sección H en la presente memoria, la enzima PEGilada que degrada hialuronano se formula y se administra a una dosis inferior, que se encuentra en la presente memoria que tiene efectos terapéuticos para tratar una enfermedad o afección asociadas a hialuronano ausentes a un nivel detectable de hialuronidasa mantenido en la sangre. Por ejemplo, la hialuronidasa soluble pegilada se administra a una cantidad que es menor de 20 pg/kg, por ejemplo, de 0,01 pg/kg a 15 pg/kg, de 0,05 pg/kg a 10 pg/kg, de 0,75 pg/kg a 7,5 pg/kg o de 1,0 pg/kg a 3,0 pg/kg, tal como de, o de aproximadamente, 0,01 pg/kg (del sujeto), 0,02 pg/kg, 0,03 pg/kg, 0,04 pg/kg, 0,05 pg/kg, 1,0 pg/kg, 1,5 pg/kg, 2,0 pg/kg, 2,5 pg/kg, 3,0 pg/kg, 3,5 pg/kg, 4,0 pg/kg, 4,5 pg/kg,
5.0 pg/kg, 5,5 pg/kg, 6,0 pg/kg, 7,0 pg/kg, 7,5 pg/kg, 8,0 pg/kg, 9,0 pg/kg, 10,0 pg/kg, 12,5 pg/kg o 15 pg/kg. Generalmente, cuando la actividad específica de la hialuronidasa modificada es o es de aproximadamente 20.000 U/mg a 60.000 U/mg, generalmente de, o de aproximadamente, 35.000 U/mg, se administran de 200 unidades a
50.000 (U), tal como 200 U, 300 U; 400 U; 500 U; 600 U; 700 U; 800 U; 900 U; 1.000 U; 1250 U; 1500 U; 2000 U; 3000 U; 4000 U; 5.000 U; 6.000 U; 7.000 U; 8.000 U; 9.000 U; 10.000 U; 20.000 U; 30.000 U; 40.000 U; o 50.000 U. Para mantener dichos niveles, la administración puede ser diaria, varias veces a la semana, dos veces a la semana, semanalmente o mensualmente.
Típicamente, los volúmenes de inyecciones o infusiones de hialuronidasa PEGilada contemplados en la presente memoria son de, o de aproximadamente, 0,5 ml, 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 15 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 mL o más. La enzima PEGilada que degrada hialuronano, tal como la hialuronidasa PEGilada, puede proporcionarse como una solución de partida a, o aproximadamente a, 50 U/ml, 100 U/ml, 150 U/ml, 200 U/ml, 400 U/mL o 500 U/mL. (o una cantidad funcionalmente equivalente) o puede proporcionarse en una forma más concentrada, por ejemplo a, o a aproximadamente, 1000 U/mL, 2000 Unidades/mL, 3000 U/mL, 4000 U/mL, 5000 U/mL, 6000 U/mL, 7000 U/mL, 8000 U/mL, 9000 U/mL, 10.000 U/mL, 11.000 U/mL, 12.000 U/mL o 12.800 U/mL, para utilizarla directamente o para su dilución a la concentración eficaz antes de utilizar. El volumen de enzima PEGilada que degrada hialuronano, tal como hialuronidasa PEGilada, administrada está en función de la dosificación requerida, pero puede variarse dependiendo de la concentración de una enzima que degrada hialuronano, tal como hialuronidasa soluble, disponible en la formulación de partida. Por ejemplo, se contempla en la presente memoria que la enzima PEGilada que degrada hialuronano, tal como hialuronidasa PEGilada, no se administre a volúmenes superiores a aproximadamente 50 ml, y típicamente se administra a un volumen de 5-30 ml, generalmente a un volumen que no es mayor que aproximadamente 10 mL. La enzima PEGilada que degrada hialuronano, tal como una hialuronidasa PEGilada, se puede proporcionar como una formulación líquida o liofilizada. Las formulaciones liofilizadas son ideales para el almacenamiento de grandes dosis unitarias de enzimas PEGiladas que degradan hialuronano.
3. Tratamiento combinado
Los agentes antihialuronano, tales como las enzimas que degradan hialuronano, por ejemplo una enzima PEGilada que degrada hialuronano (p.ej., hialuronidasa PEGilada tal como PEGPH20) se pueden administrar en un tratamiento combinado, por ejemplo, para el tratamiento de una enfermedad o afección asociadas a hialuronano. Como se describe en la presente memoria, se puede administrar un corticosteroide para mejorar los efectos secundarios o eventos adversos del agente anti-hialuronano en la terapia combinada.
Por ejemplo, las composiciones de un agente anti-hialuronano descrito en la presente memoria pueden coformularse o co-administrarse junto con, antes de, de forma intermitente con, o posteriormente a, otros agentes o tratamientos terapéuticos o farmacológicos, tales como procedimientos, por ejemplo, agentes o tratamientos para tratar una enfermedad o afección asociadas a hialuronano, por ejemplo cánceres asociados a hialuronano. Tales agentes incluyen, entre otros, agentes biológicos, agentes anticancerosos, compuestos de moléculas pequeñas, agentes dispersantes, anestésicos, vasoconstrictores y cirugía, y combinaciones de los mismos. Dichos otros agentes y tratamientos que están disponibles para el tratamiento de una enfermedad o afección, que incluyen todos los ilustrados en la presente memoria, son conocidos por los expertos en la técnica o pueden determinarse empíricamente.
Se puede administrar una preparación de un segundo agente o agentes o tratamiento o tratamientos a la vez, o se puede dividir en varias dosis más pequeñas que se deben administradas a intervalos de tiempo. Las preparaciones de agente/tratamiento seleccionadas pueden administrarse en una o más dosis en el curso de un tiempo de tratamiento, por ejemplo, durante varias horas, días, semanas o meses. En algunos casos, la administración continua es útil. Se entiende que la dosificación precisa y el curso de administración dependen de la indicación y la tolerabilidad del paciente. En general, los expertos en la técnica conocen los regímenes de dosificación para los segundos agentes/tratamientos de la presente invención.
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En un ejemplo, se administra un agente anti-hialuronano, tal como una enzima PEGilada que degrada hialuronano, tal como hialuronidasa PEGilada, como parte de una terapia combinada, mediante la administración del agente anti- hialuronano (p.ej., una enzima PEGilada que degrada hialuronano) y un segundo agente o tratamiento para tratar la enfermedad o afección. En un ejemplo, el agente anti-hialuronano, tal como una enzima PEGilada que degrada hialuronano, y el segundo agente o tratamiento pueden co-formularse y administrarse conjuntamente. En otro ejemplo, el agente anti-hialuronano, tal como una enzima PEGilada que degrada hialuronano, tal como hialuronidasa PEGilada, se administra posteriormente, intermitentemente o simultáneamente con el segundo agente o preparación de tratamiento. Generalmente, el agente anti-hialuronano, por ejemplo una enzima PEGilada que degrada hialuronano, se administra antes de la administración del segundo agente o preparación de tratamiento para permitir que el agente anti-hialuronano, por ejemplo una enzima PEGilada que degrada hialuronano, reduzca o degrade el ácido hialurónico en una célula, tejido o fluido del sujeto, tal como, por ejemplo, el espacio intersticial, la matriz extracelular, el tejido tumoral, la sangre u otro tejido. Por ejemplo, un agente anti-hialuronano, tal como una enzima PEGilada que degrada hialuronano, tal como hialuronidasa soluble, se puede administrar 0,5 minutos, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 6 minutos, 7 minutos, 8 minutos, 9 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 1 hora o más antes de la administración de la segunda preparación del agente. En algunos ejemplos, el agente anti-hialuronano, por ejemplo una enzima PEGilada que degrada hialuronano, se administra junto con la segunda preparación del agente. Como apreciarán los expertos en la técnica, la proximidad deseada de la administración conjunta depende en gran parte del efecto semivida de los agentes en el ajuste del tejido concreto, y la enfermedad concreta que se vaya a tratar, y puede optimizarse fácilmente sometiendo a ensayo los efectos de administrar los agentes en diferentes momentos en modelos adecuados, tal como en modelos animales adecuados. En algunas situaciones, el momento óptimo de administración del agente anti-hialuronano, por ejemplo una enzima PEGilada que degrada hialuronano, tal como una hialuronidasa PEGilada, superará los 60 minutos.
Agentes anticancerosos y otros tratamientos
El agente o los agentes o el tratamiento o los tratamientos anticancerosos pueden ser cirugía, radiación, fármacos, agentes quimioterapéuticos, polipéptidos, anticuerpos, péptidos, moléculas pequeñas o vectores de terapia génica, virus o aDn.
Los ejemplos de agentes anticancerosos que pueden administrarse después, coincidente con o antes de la administración de la enzima PEGilada que degrada hialuronano, tal como una hialuronidasa PEGilada, incluyen, pero sin limitarse a Acivicinas; Avicina; Aclarrubicinas; Acodazoles; Acroninas; Adozelesinas; Aldesleucinas; compuestos de Alemtuzumab; Alitretinoínas (Ácidos 9-Cis-Retinoicos); Alopurinoles; Altretaminas; compuestos de Alvocidib; Ambazonas; Ambomininas; Ametantronas; Amifostinas; Aminoglutetimidas; Amsacrinas; Anastrozoles; Anaxironas; Ancitabinas; Antramicinas; Apazicuonas; Argimesnas; Trióxidos de arsénico; Asparraginasas; Asperlinas; Atrimustinas; Azacitidinas; Azetepas; Azotomicinas; Banoxantronas; Batabulinas; compuestos de Batimastat; BCG Vivo; Benaxibinas; Bendamustinas; Benzodepas; Bexarotenos; Bevacizumab; Bicalutamidas; Bietaserpinas; compuestos de Bricodar; Bisantrenos; Bisantrenos; Dimesilatos de Bisnafida; Bizelesinas; Bleomicinas; compuestos de Bortezomib; compuestos de Brequinar; Bropiriminas; Budotitanos; Busulfanos; Cactinomicinas; Calusteronas; compuestos de Canertinib; Capecitabinas; Caracemidas; Carbetímeros; Carboplatinos; Carbocuonas; compuestos de Carmofur; Carmustinas con Polifeprosanos; Carmustinas; Carrubicinas; Carzelesinas; Cedefingoles; compuestos de Celecoxib; Cemadotinas; Clorambucilos; compuestos de Cioteronel; Cirolemicinas; Cisplatinos; Cladribinas; compuestos de Clanfenur; Clofarabinas; Crisnatoles; Ciclofosfamidas; Liposomales de citarabina; Citarabinas; Dacarbazinas; Dactinomicinas; Darbepoetinas Alfa; Liposomales de Daunorrubicina; Daunorrubicinas/Daunomicinas; Daunorrubicinas; Decitabinas; compuestos de Denileucina Diftitox; Dexniguldipinas; Dexonaplatinos; Dexrazoxanos; Dezaguaninas; Diaziquonas; Dibrospidios; compuestos de Dienogest; Dinalinas; Disermolida; compuestos de Docetaxel; compuestos de Dofequidar; Doxifluridinas; Liposomales de doxorrubicina; Doxorrubicina HCL; inyección de liposomas de Doxorrubicina HCL; Doxorrubicinas; Droloxifenos; Propionatos de Dromostanolona; Duazomicinas; Ecomustinas; Edatrexatos; Edotecarinas; Eflornitinas; compuestos de Elacridar; Elinafidas; Soluciones B de Elliott; Elsamitrucinas; compuestos de Emitefur; Enloplatinos; Enpromatos; Enzastaurinas; Epipropidinas; Epirrubicinas; Epoetinas alfa; compuestos de Eptaloprost; Erbulozoles; Esorrubicinas; Estramustinas; Etanidazoles; Etoglucidas; fosfatos de Etopósido; Etopósido VP-16s; Etopósidos; Etoprinas; Exemestanos; compuestos de Exisulind; Fadrozoles; Fazarabinas; Fenretinidas; compuestos de Filgrastim; Floxuridinas; Fludarabinas; Fluorouracilos; 5-fluorouracilos; Fluoximesteronas; Flurocitabinas; Fosquidonas; Fostriecinas; Fostriecinas; Fotretaminas; compuestos de Fulvestrant; Galarrubicinas; Galocitabinas; Gemcitabinas; compuestos de Gemtuzumab/Ozogamicinas; Geroquinoles; Gimatecanos;
Gimeracilos; Gloxazonas; Glufosfamidas; Acetatos de goserelina; Hidroxiureas; compuestos de
Ibritumomab/Tiuxetanos; Idarrubicinas; Ifosfamidas; Ilmofosinas; compuestos de Ilomastat; Mesilatos de imatinib; Imexonas; Improsulfanos; compuestos de Indisulam; Inprocuonas; Interferones alfa-2a; Interferones alfa-2b; Interferones Alfa; Interferones Beta; Interferones Gamma; Interferones; Interleucina-2s y otras interleucinas (incluidas las interleucinas recombinantes); Intoplicinas; Iobenguanos [131-I]; Iproplatinos; Irinotecanos; Irsogladinas; Ixabepilonas; Cetotrexatos; L-alanosinas; Lanreotidas; compuestos de Lapatinib; Ledoxantronas; Letrozoles; Leucovorinas; Leuprolidas; Leuprorelinas (Leuprorelidas); Levamisoles; Lexacalcitoles; Liarozoles; Lobaplatinos; Lometrexoles; Lomustinas/CCNU; Lomustinas; Lonafarnib; Losoxantronas; Lurtotecanos; Mafosfamidas;
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Manosulfanos; compuestos de Marimastat; Masoprocoles; Maitansinas; Mecloretaminas; Mecloretaminas/mostazas nitrogenadas; Acetatos de Megestrol; Megestroles; Melengestroles; compuestos de Melfalán; MelfalanlL-PAM; Menogarilos; Mepitiostanos; Mercaptopurinas; 6-Mercaptopurina; Mesnas; compuestos de Metesind; Metotrexatos; Metoxsalenos; Metomidatos; Metoprinas; Meturedepas; Miboplatinos; Miproxifenos; Misonidazoles; Mitindomidas; Mitocarcinas; Mitocrominas; Mitoflaxonas; Mitogilinas; Mitoguazonas; Mitomalcinas; Mitomicinas C; Mitomicinas; Mitonafidas; Mitoquidonas; compuestos de Mitosper; Mitotanos; Mitoxantronas; Mitozolomidas; Mivobulinas; Mizoribinas; Mofarotenos; Mopidamoles; compuestos de Mubritinib; Ácidos micofenólicos; Fenpropionatos de Nandrolona; Nedaplatinos; Nelzarabinas; Nemorrubicinas; Nitracrinas; Nocodazoles; compuestos de Nofetumomab; Nogalamicinas; compuestos de Nolatrexed; Nortopixantronas; Octreótidos; Oprelvecinas; Ormaplatinos; compuestos de Ortataxel; Oteracilos; Oxaliplatinos; Oxisuranos; Oxofenarsinas; compuestos de Paclitaxel; Pamidronatos; Patubilonas; Pegademasas; Pegaspargasas; compuestos de Pegfilgrastim; Peldesinas; Peliomicinas; Pelitrexoles; compuestos de Pemetrexed; Pentamustinas; Pentostatinas; Peplomicinas; Perfosfamidas; Perifosinas; Picoplatinos; Pinafidas; Pipobromanos; Piposulfanos; Pirfenidonas; Piroxantronas; Pixantronas; compuestos de Plevitrexed; Plicamicida Mitramicinas; Plicamicinas; Plomestanos; Plomestanos; Porfimeros sódicos; Porfímeros; Porfiromicinas; Prednimustinas; Procarbazinas; Propamidinas; Prospidios; Pumitepas; Puromicinas; Pirazofurinas; Quinacrinas; Ranimustinas; Rasburicasas; Riboprinas; Ritrosulfanos; compuestos de Rituximab; Rogletimidas; compuestos de Roquinimex; Rufocromomicinas; Sabarubicinas; Safingoles; compuestos de Sargramostim; Satraplatinos; Sebriplatinos; Semustinas; Simtrazenos; Sizofiranos; Sobuzoxanos; compuestos de Sorafenib; Esparfosatos; Ácidos esparfosicos; Esparsomicinas; Espirogermanios; Espiromustinas; Espiroplatinos; Espiroplatinos; Escualaminas; Estreptonigrinas; Estreptovaricinas; Estreptozocinas; Sufosfamidas; compuestos de Sulofenur; Malato de Sunitinib; 6-tioguanina (6-TG); Tacedinalinas; Talcos; Talisomicinas; Talimustinas; Tamoxifenos; compuestos de Tariquidar; Tauromustinas; Tecogalanos; compuestos de Tegafur; Teloxantronas; Temoporfinas; Temozolomidas; Tenipósidos/VM-26; Tenipósidos; Teroxironas; Testolactonas; Tiamiprinas; Tioguaninas; Tiotepas; Tiamiprinas; Tiazofurinas; Tilomisoles; Tiloronas; compuestos de Timcodar; compuestos de Timonacic; Tirapazaminas; Topixantronas; Topotecanos; Toremifenos; compuestos de Tositumomab; Trabectedinas (Ecteinascidina 743); compuestos de Trastuzumab; Trestolonas; Tretinoínas/ATRA; Triciribinas; Trilostanos; Trimetrexatos; Tetranitratos de Triplatino; Triptorelinas; Trofosfamidas; Tubulozoles; compuestos de Ubenimex; Mostaza de Uracilo; Uredepas; Valrubicinas; compuestos de Valspodar; Vapreotidas; Verteporfinas; Vinblastinas; Vincristinas; Vindesinas; Vinepidinas; Vinfluninas; Vinformidas; Vinglicinatos; Vinleucinoles; Vinleurosinas; Vinorelbinas; Vinrosidinas; Vintriptoles; Vinzolidinas; Vorozoles; Xantomicinas A (Guameciclinas); Zeniplatinos; compuestos de Zilascorb [2-H]; Zinostatinas; Zoledronato; Zorrubicinas; y compuestos de Zosuquidar, por ejemplo:
Aldesleucinas (p.ej., PROLEUKIN®); compuestos de Alemtuzumab (p.ej., CAMPATH®); Alitretinoínas (p.ej., PANRETIN®); Alopurinoles (p.ej., ZYLOPRIM®); Altretaminas (por ejemplo HEXALEN®); Amifostinas (p.ej., ETHYOL®); Anastrozoles (p.ej., ARIMIDEX®); Trióxidos de arsénico (p.ej., TRISENOX®); Asparraginasas (p.ej., ELSPAR®); BCG Vivo (p.ej., TICE® BCG); Bexarotenos (p.ej., TARGRETIN®); Bevacizumab (AVASTIN®); Bleomicinas (p.ej., BLENOXANE®); Busulfan intravenoso (p.ej., BUSULFEX®); Busulfanos orales (p.ej., MYLERAN®); Calusteronas (p.ej., METHOSARB®); Capecitabinas (p.ej., XElOdA®); Carboplatinos (p.ej., PARAPLATIN®); Carmustinas (p.ej., BCNU®, BiCNU®); Carmustinas con Polifeprosanos (p.ej., Oblea GLIAdEl®); compuestos de Celecoxib (p.ej., CELEBREX®); Clorambucilos (p.ej., LEUKERAN®); Cisplatinos (p.ej., PLATINOL®); Cladribinas (p.ej., LEUSTATIN®, 2-CdA®); Ciclofosfamidas (p.ej., CYTOXAN®, NEOSAR®); Citarabinas (p.ej., CYTOSAR-U®); Liposomas de citarabina (p.ej., DepoCyt®); Dacarbazinas (p.ej., DTIC-Dome): dactinomicinas (p.ej., COSMEGEN®); Darbepoetinas Alfa (p.ej., ARANESP®); Liposomales de daunorrubicina (p.ej., DANUOXOME®); Daunorrubicinas/daunomicinas (p.ej., cErUbIDINE®); compuestos de Denileucina Diftitox (p.ej., ONTAK®); Dexrazoxanos (p.ej., ZINECARD®); compuestos de Docetaxel (p.ej., TAXOTERE®); Doxorrubicinas (p.ej., ADRIAMYCIN®, RUBEX®); Liposomales de doxorrubicina, incluyendo inyecciones de liposomas con Doxorrubicina HCL (p.ej., DOXIL®); Propionatos de dromostanolona (p.ej., DROMOSTANOLONE® e inyección de MASTERONE®); Soluciones B de Elliott (p.ej., Elliott's B Solution®); Epirrubicinas (p.ej., ELLENCE®); Epoetinas alfa (p.ej., EPOGEN®); Estramustinas (p.ej., EmCYT®); fosfatos de Etopósido (p.ej., EtOPOPHOS®); Etopósido VP-16 (p.ej., VEPESID®); Exemetanos (p.ej., AROMASIN®); compuestos de Filgrastim (p.ej., NEUPOGEN®); Floxuridinas (p.ej., FUDR®); Fludarabinas (p.ej., FLUDARA®); Fluorouracilo incl. 5-FU (p.ej., ADRUCIL®); compuestos de Fulvestrant (p.ej., FASLODEX®); Gemcitabinas (p.ej., GEMZAR®); Gemtuzumabs/Ozogamicinas (p.ej., MYLOTARG®); Acetatos de goserelina (p.ej., ZOLADEX®); Hidroxiureas (p.ej., HYDREA®); compuestos de Ibritumomab/Tiuxetano (p.ej., ZEVALIN®); Idarrubicinas (p.ej., IDAMYCIN®); Ifosfamidas (p.ej., IFEX®); Mesilatos de imatinib (p.ej., GLEeVeC®); Interferones alfa-2a (p.ej., rOfERON-A®); Interferones alfa-2b (p.ej., INTRON A®); Irinotecanos (p.ej., CAMPtOsAR®); Letrozoles (p.ej., FEMARA®); Leucovorinas (p.ej., wElLCOVORIN®, LEUCOVORIN®); Levamisoles (p.ej., ERGAMISOL®); Lomustinas/CCNU (p.ej., CeeBU®); Mecloretaminas/mostazas nitrogenadas (p.ej., MUSTARGEN®); Acetatos de Megestrol (p.ej., MEGACE®); compuestos de Melfalán/L-PAM (p.ej., ALKERAN®); Mercaptopurina, incluyendo 6-mercaptopurinas (6-MP, por ejemplo, PURINETHOL®); Mesnas (p.ej., MESNEX®); Metotrexatos; Metoxsalenos (p.ej., UVADEX®); Mitomicina C (p.ej., MUTAMYCIN®, MITOZYTREX®); Mitotanos (p.ej., LYSODREN®); Mitoxantronas (p.ej., NOVANTRONE®); Fenpropionatos de nandrolona (p.ej., DURABOLIN-50®); compuestos de Nofetumomab (p.ej., VERLUMA®); Oprelvecinas (p.ej., NEUMEGA®); Oxaliplatinos (p.ej., ELOXATiN®); compuestos de Paclitaxel (p.ej., PAXENE®, tAxOL®); Pamidronatos (p.ej., aReDIA®); Pegademasas (p.ej., AdAgEN®); Pegaspargasas (p.ej., ONCASPAR®);
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compuestos de Pegfilgrastim (p.ej., NEULASTA®); Pentostatinas (p.ej., NIPENT®); Pipobromanos (p.ej., VERCYTE®); Plicamicina/mitramicinas (p.ej., MiThRACIN®); Porfímero sódico (p.ej., PHOTOFRIN®); Procarbazinas (p.ej., MATULANE®); Quinacrinas (p.ej., ATABRINE®); Rasburicasas (p.ej., ELITEK®); Rituximab (p.ej., RITUXAN®); compuestos de Sargramostim (p.ej., PROKINE®); Estreptozocinas (p.ej., ZANOSAR®); Malatos de Sunitinib (p.ej., SUTENT®); Talcos (p.ej., SClErOsOL®); Tamoxifenos (p.ej., NoLvAdEX®); Temozolomidas (p.ej., TEMODAR®); Tenipósidos/VM-26 (p.ej., VUMON®); Testolactonas (p.ej., TESLAC®); Tioguaninas que incluyen, 6-tioguanina (6-TG); Tiotepas (p.ej., THIOPLEX®); Topotecanos (p.ej., HYCAMTIN®); Toremifeno (p.ej., FARESTON®); compuestos de Tositumomab (p.ej., BEXXAR®); Trastuzumab (p.ej., HERCEPTIN®); Tretinoínas/ATRA (p.ej., VESANOID®); Mostaza de Uracilo; Valrubicinas (p.ej., VALSTaR®); Vinblastinas (p.ej., VELBAN®); Vincristinas (p.ej., ONCOVIN®); Vinorelbinas (p.ej., NAVELBINE®); y Zoledronatos (p.ej., ZOMETA®).
4. Envasado y artículos de manufactura
También se proporcionan artículos de fabricación que contienen materiales de envasado, cualquier composición farmacéutica o combinación proporcionada en la presente memoria, y una etiqueta que indica que las composiciones y combinaciones se van a utilizar para el tratamiento de efectos secundarios asociados con la administración de un agente anti-hialuronano, por ejemplo una enzima PEGilada que degrada hialuronano, y/o para tratar una enfermedad o afección asociadas a hialuronano. Los artículos de fabricación ilustrativos son recipientes que incluyen recipientes de cámara única y de cámara doble. Los contenedores incluyen, pero no están limitados a, tubos, botellas y jeringas. Los contenedores pueden incluir además una aguja para administración subcutánea.
En un ejemplo, la composición farmacéutica contiene el corticosteroide y ningún segundo agente o tratamiento. En otro ejemplo, el artículo de fabricación contiene composiciones farmacéuticas que contienen el corticosteroide y el agente anti-hialuronano, por ejemplo, una enzima PEGilada que degrada hialuronano. En este ejemplo, el corticosteroide y el agente anti-hialuronano, por ejemplo una enzima PEGilada que degrada hialuronano, se pueden proporcionar juntos o por separado, para el envasado como artículos de fabricación. En otro ejemplo, el artículo de fabricación contiene el agente corticosteroide, anti-hialuronano (p.ej., una enzima PEGilada que degrada hialuronano) y un segundo agente o agentes o tratamiento o tratamientos. En este ejemplo, el agente corticosteroide, anti-hialuronano (p.ej., una enzima PEGilada que degrada hialuronano) y un segundo agente o agentes o tratamiento o tratamientos, se pueden proporcionar juntos o por separado, para el envasado como artículos de fabricación.
En un ejemplo, la composición farmacéutica contiene el agente anti-hialuronano (p.ej., una enzima PEGilada que degrada hialuronano), y ningún segundo agente o tratamiento. En otro ejemplo, el artículo de fabricación contiene el agente anti-hialuronano (p.ej., una enzima PEGilada que degrada hialuronano) y un segundo agente o agentes o tratamiento o tratamientos. En este ejemplo, las composiciones farmacéuticas de un segundo agente y un agente anti-hialuronano, por ejemplo una enzima PEGilada que degrada hialuronano, tal como una hialuronidasa PEGilada, se pueden proporcionar juntas o por separado, para envasar como artículos de fabricación.
Los artículos de fabricación proporcionados en la presente memoria contienen materiales de envasado. Los materiales de envasado para uso en el envasado de productos farmacéuticos son bien conocidos por los expertos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Núm. 5.323.907, 5.052.558 y 5.033.252, cada una de los cuales se incorpora a la presente memoria en su totalidad. Los ejemplos de materiales de envasado farmacéuticos incluyen, pero sin limitarse a, envases de tipo burbuja, frascos, tubos, inhaladores, bombas, bolsas, viales, contenedores, jeringas, botellas y cualquier material de envasado adecuado para una formulación seleccionada y modo de administración y tratamiento previstos .
La elección del envase depende del corticosteroide, tal como un glucocorticoide y otros agentes, y de si dichas composiciones se empaquetarán juntas o por separado. En general, el envase no es reactivo con las composiciones contenidas en el mismo. En otros ejemplos, algunos de los componentes se pueden envasar como una mezcla. En otros ejemplos, todos los componentes se empaquetan por separado. Por lo tanto, por ejemplo, los componentes se pueden envasar como composiciones separadas que, al mezclarse inmediatamente antes de la administración, pueden administrarse directamente juntas. Alternativamente, los componentes pueden envasarse como composiciones separadas para su administración por separado.
Los componentes se pueden envasar en un contenedor. Los componentes se envasan por separado en el mismo contenedor. Generalmente, los ejemplos de tales contenedores incluyen aquellos que tienen un espacio cerrado, definido que contiene glucocorticoides, y un espacio cerrado, definido y separado que contiene los otros componentes o componentes tales que las zonas subsiguientes están separadas por una membrana fácilmente retirable que, después de ser retirada, permite que los componentes se mezclen. Se contempla cualquier recipiente u otro artículo de fabricación, siempre que el glucocorticoide esté separado de los otros componentes antes de la administración. Para realizaciones adecuadas, véanse, por ejemplo, los contenedores descritos en Patentes de Estados Unidos Núm. 3.539.794 y 5.171.081.
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Las composiciones seleccionadas que incluyen artículos de fabricación de las mismas también se pueden proporcionar como kits. Los kits pueden incluir una composición farmacéutica descrita en la presente memoria y un artículo para su administración proporcionado como artículo de fabricación. El kit puede, opcionalmente, incluir instrucciones para la aplicación incluyendo dosificación, regímenes de dosificación e instrucciones para los modos de administración. Los kits también pueden incluir una composición farmacéutica descrita en la presente memoria y un artículo para diagnóstico.
G. MÉTODOS DE EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD Y EFECTOS DE AGENTES ANTI-HIALURONANO Y CORTICOSTEROIDES
En la presente memoria se describen métodos para tratar un sujeto con un glucocorticoide tal como dexametasona, para mejorar y/o eliminar los efectos adversos que resultan de un agente anti-hialuronano administrado. Por ejemplo, la administración sistémica de hialuronidasa PEGilada se asocia con efectos secundarios musculoesqueléticos que incluyen, por ejemplo, dolor muscular y articular, rigidez de extremidades superiores e inferiores, calambres, miositis, malestar muscular y sensibilidad en todo el cuerpo, debilidad, fatiga y/o una disminución en la amplitud de movimiento en las articulaciones de la rodilla y el codo. En dichos métodos, el corticosteroide generalmente se administra para mejorar los efectos secundarios sin eliminar las actividades del agente anti-hialuronano para reducir el hialuronano al inhibir su síntesis o degradar el hialuronano. Está dentro del nivel de un experto en la técnica evaluar si los corticosteroides mejoran tales efectos secundarios, incluso sin interferir con la actividad de un agente anti-hialuronano, tal como una hialuronidasa PEGilada. Por ejemplo, se pueden realizar varios modelos animales y estudios clínicos en seres humanos. Además de evaluar la mejora de los efectos secundarios, la eficacia, la tolerabilidad y los estudios farmacocinéticos de un agente anti-hialuronano se pueden realizar en presencia o ausencia de dosis variables de glucocorticoides. En particular, el hialuronano PEGilado es un agente terapéutico solo o combinado con agentes secundarios tales como fármacos quimioterapéuticos, para el tratamiento de enfermedades y afecciones asociadas a hialuronano, en particular cánceres (véanse, por ejemplo, los documentos US 2010/0003238 y WO09/128917) Por lo tanto, la mejora de los efectos secundarios de la hialuronidasa PEGilada con corticosteroides permite el uso de hialuronidasa PEGilada en dichos tratamientos a la vez que se minimizan los efectos secundarios sistémicos, por ejemplo musculoesqueléticos, de la hialuronidasa PEGilada. Se pueden realizar estudios, incluso en modelos animales de una enfermedad asociada a hialuronano, tal como el cáncer, para evaluar la eficacia de la hialuronidasa PEGilada, sola o combinada con agentes quimioterapéuticos, y en presencia o ausencia de tratamiento con corticosteroides.
1. Métodos para evaluar los efectos secundarios
Se pueden utilizar ensayos in vivo para evaluar la eficacia de los glucocorticoides en la mejora o eliminación de los efectos secundarios musculoesqueléticos. Los efectos secundarios que pueden evaluarse incluyen, por ejemplo, dolor muscular y articular, rigidez de las extremidades superiores e inferiores, calambres, miositis, malestar muscular y sensibilidad en todo el cuerpo, debilidad, fatiga y/o disminución de la amplitud de movimiento en la rodilla y articulaciones de los codos. Los ensayos para evaluar los efectos secundarios pueden incluir modelos animales en los que se pueden observar movimientos reducidos, cambios de comportamiento o postura, hallazgos radiográficos, cambios histopatológicos en el animal y otras observaciones clínicas notables. Otros ensayos pueden incluir ensayos clínicos en sujetos humanos en los que los pacientes pueden ser interrogados sobre los síntomas, evaluados mediante examen físico, imágenes (p.ej., mediante resonancia magnética o PET) o mediante evaluación radiológica. Se observa una mejoría de un efecto secundario causado por la administración de un agente anti- hialuronano cuando el efecto secundario se mejora, se elimina, se disminuye o se reduce en presencia del corticosteroide cuando se compara con su ausencia.
En dichos ejemplos, la dosis de agente anti-hialuronano y/o corticosteroide puede variarse para identificar la dosis óptima o mínima requerida para lograr actividad a la vez que se mejoran los efectos secundarios. Tales estudios están dentro del nivel de un experto en la técnica. Además, el régimen de dosificación puede variarse. Por ejemplo, los estudios se pueden realizar utilizando un programa de dosificación de agente anti-hialuronano mensualmente, cada dos semanas, una vez a la semana, dos veces a la semana, tres veces a la semana, cuatro veces a la semana o más. Además, el corticosteroide se puede administrar antes, a la vez y/o después de la administración del agente anti-hialuronano. Los ejemplos ilustran tales estudios en modelos animales y pacientes humanos.
Por ejemplo, se pueden utilizar modelos animales in vivo para evaluar la capacidad de corticosteroides, tales como la dexametasona, para mejorar o eliminar los efectos secundarios asociados con la administración del agente anti- hialuronano. Los modelos animales pueden incluir primates no humanos tales como monos cynomolgus o macacos rhesus, perros, por ejemplo perros beagle, o cualquier otro animal que muestre efectos secundarios adversos en respuesta al tratamiento con hialuronidasa PEGilada. Los modelos animales pueden dosificarse con un agente anti- hialuronano en presencia o ausencia de corticosteroides y se pueden observar o medir los efectos musculoesqueléticos.
Por ejemplo, se pueden tratar animales tales como monos cynomolgus, perros beagle u otro modelo animal similar
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susceptible de eventos musculoesqueléticos observables o medibles con un agente anti-hialuronano en presencia o ausencia de corticosteroides. En un ejemplo, a un grupo de animales, por ejemplo monos cynomolgus o perros beagle, se les administra un agente anti-hialuronano solo, por ejemplo una hialuronidasa PEGilada, tal como mediante administración intravenosa. Por ejemplo, la administración puede ser dos veces por semana. El tratamiento puede continuar hasta que se observen cambios en la amplitud de movimiento de la articulación de la extremidad en las articulaciones de la rodilla y el codo, o se observe rigidez o movilidad reducida. A continuación, se puede tratar otro grupo de animales con el agente anti-hialuronano y administrar corticosteroides, en forma de dosis orales de dexametasona u otros corticosteroides, administrados el mismo día que la administración del agente anti- hialuronano. Los grupos de animales se pueden comparar, por ejemplo, mediante el examen físico de la amplitud de movimiento de la articulación u otra movilidad reducida, la histopatología de las articulaciones, la palpación de la rigidez o la formación de imágenes conocidas por los expertos en la técnica, para evaluar la capacidad del corticosteroide, tal como la dexametasona, para mejorar los efectos secundarios musculoesqueléticos mediados por el agente anti-hialuronano. La dosis, la frecuencia de dosificación, la vía de administración y el momento de la dosificación del corticosteroide, tal como la dexametasona, pueden variarse para optimizar la eficacia del corticosteroide.
En otro ejemplo, se puede evaluar la eficacia de los corticosteroides tales como la dexametasona en la mejora o eliminación de los efectos secundarios adversos asociados con la administración del agente anti-hialuronano en pacientes humanos con tumores sólidos. Por ejemplo, se puede diseñar un ensayo clínico para examinar la capacidad del corticosteroide para mejorar y/o eliminar los efectos adversos mediados por el agente anti- hialuronano, incluyendo, entre otros, uno o más de los siguientes: dolor/rigidez muscular y articular de las extremidades superiores e inferiores, calambres, miositis muscular, dolores musculares y sensibilidad en todo el cuerpo, debilidad y fatiga. Los pacientes pueden tratarse con un agente anti-hialuronano con o sin un tratamiento conjunto con un corticosteroide tal como la dexametasona. Durante y después de la administración del agente anti- hialuronano, se pueden evaluar los efectos secundarios de ambos grupos de tratamiento. Un médico puede determinar la gravedad de los síntomas mediante el examen físico del sujeto, por ejemplo, quejas del paciente, signos vitales, cambios en el peso corporal, ECG de 12 derivaciones, ecocardiograma, química clínica, o diagnóstico por imágenes (MRI, PET o evaluación radiológica). La gravedad de los síntomas se puede cuantificar mediante el sistema de clasificación de Criterios de Terminología Común del NCI para Eventos Adversos ("CTCAE en sus siglas inglesas"). El CTCAE es una terminología descriptiva utilizada para el informe de eventos adversos ("AE en sus siglas inglesas"). Se proporciona una escala de calificación (severidad) para cada término de AE. El CTCAE muestra los grados 1 a 5, con descripciones clínicas de la gravedad de cada evento adverso según las siguientes pautas generales: Grado 1 (AE leve); Grado 2 (AE moderado); Grado 3 (AE severo); Grado 4 (AE que amenaza la vida o incapacitante); y Grado 5 (Muerte relacionada con AE). La capacidad de un corticosteroide para mejorar los efectos secundarios adversos asociados con la administración de un agente anti-hialuronano se puede medir mediante la observación de una reducción en la clasificación o la gravedad en la escala CTCAE en uno o más efectos secundarios adversos en sujetos tratados con el agente anti-hialuronano y el corticosteroide en comparación con los sujetos tratados con el antihialuronano solo, es decir, la gravedad de los efectos secundarios, se reduce del Grado 3 al Grado 1 o Grado 2. Esto se ilustra en los Ejemplos de la presente memoria.
En otro ejemplo, los ensayos clínicos pueden diseñarse para evaluar la tolerabilidad aumentando la dosis del agente anti-hialuronano y evaluando la toxicidad limitante de la dosis. En dicho ejemplo, se puede determinar una dosis tolerada máxima de agente anti-hialuronano que puede tolerarse en presencia de un agente de mejora tal como un corticosteroide. Los regímenes de tratamiento pueden incluir un aumento de dosis en donde cada paciente inscrito recibe una dosis más alta de agente anti-hialuronano a la misma dosis de corticosteroide. Se puede realizar un seguimiento de los pacientes en busca de eventos adversos para determinar la dosis más alta de agente anti- hialuronano que se puede administrar con un corticosteroide antes de que ya no se toleren los efectos secundarios. La tolerabilidad puede medirse en función de la gravedad de los síntomas que surgen durante y después del tratamiento. Las dosis de agente anti-hialuronano se pueden aumentar hasta que los efectos adversos alcancen un nivel predeterminado, por ejemplo, Grado 3. Los regímenes de dosificación también pueden incluir una disminución de la cantidad de corticosteroides administrados para examinar la necesidad continua de corticosteroides y la posibilidad de aclimatación al agente anti-hialuronano con respecto a los efectos secundarios resultantes.
2. Actividad Anti-Hialuronano
Además de los ensayos para evaluar el efecto de los corticosteroides en la mejora de los efectos secundarios de un agente anti-hialuronano, se pueden realizar otros ensayos por separado o junto con los mencionados anteriormente para evaluar los efectos de los corticosteroides sobre la inhibición o actividad de degradación de hialuronano. Tales ensayos pueden incluir, entre otros, medir cantidades de hialuronano en biopsias de tejido o de tumor o hialuronano soluble en plasma, mediciones de catabolitos de hialuronano en sangre u orina, mediciones de actividad hialuronidasa en plasma o mediciones de presión de fluido intersticial. volumen vascular o contenido de agua en tumores. Se pueden utilizar otros ensayos tales como mediciones de farmacocinética, cuyos métodos son conocidos por los expertos en la técnica, para evaluar los efectos de los corticosteroides sobre los parámetros farmacocinéticos del agente anti-hialuronano.
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a. Ensayos para evaluar la actividad de una enzima que degrada hialuronano
La actividad de una enzima que degrada hialuronano puede evaluarse utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el ensayo USP XXII para hialuronidasa determina la actividad indirectamente midiendo la cantidad de ácido hialurónico no degradado, o sustrato de hialuronano (HA) que queda después de que la enzima se deja reaccionar con el HA durante 30 minutos a 37°C (USP xXiI-Nf XVII (1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD). Se puede utilizar un Patrón de Referencia de Hialuronidasa (USP) o una solución Patrón de Hialuronidasa del Formulario Nacional (NF) en un ensayo para determinar la actividad, en unidades, de cualquier hialuronidasa. En un ejemplo, la actividad se mide utilizando un ensayo de microturbidez. Éste se basa en la formación de un precipitado insoluble cuando el ácido hialurónico se une con la albúmina sérica. La actividad se mide incubando hialuronidasa o una muestra que contiene hialuronidasa, por ejemplo sangre o plasma, con hialuronato sódico (ácido hialurónico) durante un período de tiempo determinado (p.ej., 10 minutos) y a continuación precipitando el hialuronato sódico no digerido con la adición de albúmina sérica acidulada. La turbidez de la muestra resultante se mide a 640 nm después de un período de desarrollo adicional. La disminución de la turbidez resultante de la actividad de la hialuronidasa en el sustrato de hialuronato de sodio es una medida de la actividad enzimática de la hialuronidasa.
En otro ejemplo, la actividad de hialuronidasa se mide utilizando un ensayo de microtitulación en el que se mide el ácido hialurónico biotinilado residual después de la incubación con hialuronidasa o una muestra que contiene hialuronidasa, por ejemplo, sangre o plasma (véase, p.ej. Frost y Stern (1997) Anal. Biochem. 251:263-269, Publicación de Patente de Estados Unidos Núm. 20050260186). Los grupos carboxilo libres en los residuos de ácido glucurónico del ácido hialurónico se biotinilan, y el sustrato de ácido hialurónico biotinilado se acopla covalentemente a una placa de microtitulación. Después de la incubación con hialuronidasa, se detecta el sustrato de ácido hialurónico biotinilado residual utilizando una reacción de avidina-peroxidasa, y se compara con la reacción siguiente obtenida con patrones de hialuronidasa de actividad conocida. También se conocen en la técnica otros ensayos para medir la actividad de la hialuronidasa y se pueden utilizar en los métodos de la presente memoria (véanse p.ej. Delpech et al., (1995) Anal. Biochem. 229:35-41; Takahashi et al., (2003) Anal. Biochem. 322:257-263).
También se puede evaluar la capacidad de una enzima que degrada hialuronano activo, tal como una hialuronidasa soluble modificada (p.ej., rHuPH20 PEGilada) para actuar como un agente de propagación o difusión. Por ejemplo, se puede inyectar colorante azul tripán, por ejemplo subcutáneamente o intradérmicamente, con o sin una enzima que degrada hialuronano en la piel lateral a cada lado de ratones atímicos. A continuación se mide la zona del colorante, por ejemplo con un microcalibrador, para determinar la capacidad de la enzima que degrada hialuronano para actuar como un agente de propagación (véase, p.ej. la Patente de Estados Unidos Publicada Núm. 20060104968).
Los ensayos anteriores pueden realizarse utilizando una enzima que degrada hialuronano en presencia o ausencia de un corticosteroide o utilizando la sangre o plasma de un paciente o animal tratado con hialuronidasa con o sin un corticosteroide.
b. Ensayos en modelos animales
Se pueden utilizar modelos animales de enfermedades, trastornos o afecciones asociados a hialuronanos para evaluar el efecto in vivo de la administración de un agente anti-hialuronano, como una hialuronidasa modificada o hialuronidasa PEGilada, con o sin la administración conjunta de un corticosteroide. También se puede incluir otro agente, tal como un agente quimioterapéutico, en la evaluación de la actividad. Las enfermedades asociadas a hialuronano ilustrativas para las que se puede utilizar un modelo animal apropiado incluyen tumores sólidos, por ejemplo, cánceres en estadio tardío, cánceres metastásicos, cánceres indiferenciados, cáncer de ovario, carcinoma in situ (CIS), carcinoma de células escamosas (CCE), próstata cáncer, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de mama, cáncer de colon y otros cánceres. También son ilustrativas de enfermedades y trastornos asociados a hialuronano enfermedades inflamatorias, presión de disco, cáncer y edema, por ejemplo, edema causado por trasplante de órgano, accidente cerebrovascular, trauma cerebral u otra lesión.
Los modelos animales pueden incluir, pero sin limitarse a, ratones, ratas, conejos, perros, cobayas y modelos de primates no humanos, tales como monos cynomolgus o macacos rhesus. En algunos ejemplos, a los ratones inmunodeficientes, tales como ratones desnudos o ratones SCID, se les trasplanta una línea celular tumoral de un cáncer asociado a hialuronano para establecer un modelo animal de ese cáncer. Las líneas celulares ilustrativas de cánceres asociados a hialuronano incluyen, pero sin limitarse a, células de carcinoma de próstata PC3, células de adenocarcinoma de páncreas BxPC-3, células de carcinoma de mama MDA-MB-231, células de tumor de mama MCF-7, células de tumor de mama BT474, células de tumor de próstata Tramp C2 y células de cáncer de próstata Mat-LyLu, y otras líneas celulares descritas en la presente memoria que están asociadas con hialuronano, p.ej. contienen niveles elevados de hialuronano. Los agentes anti-hialuronano pueden administrarse a continuación al animal con o sin un corticosteroide tal como dexametasona, para evaluar los efectos del corticosteroide sobre la actividad anti-hialuronano midiendo, por ejemplo, los niveles o contenido de hialuronano. El contenido de
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hialuronano se puede medir mediante la tinción de muestras de tejido tumoral para hialuronano o midiendo los niveles de hialuronano soluble en plasma. Otras mediciones de la actividad antihialuronano incluyen la evaluación del volumen del tumor, la formación o el tamaño de los halos, la presión del líquido intersticial, el contenido de agua y/o el volumen vascular. En el Ejemplo 9 se demuestran ensayos tales como los mencionados anteriormente.
En otros ejemplos, perros tales como los perros beagle se pueden tratar con un agente anti-hialuronano en presencia o ausencia de un corticosteroide, tal como la dexametasona. Se toman biopsias de tejidos tales como la piel o el tejido muscular esquelético y se tiñen para determinar el hialuronano y se evalúan visualmente. Los tejidos de los animales tratados con un agente anti-hialuronano solo se comparan a continuación con los tejidos de los anales tratados con el agente anti-hialuronano y el corticosteroide para medir el efecto del corticosteroide sobre la actividad anti-hialuronano. Estos ensayos se demuestran en el Ejemplo 8.
c. Ensayos en seres humanos
Se pueden utilizar al mismo tiempo pruebas clínicas tales como las descritas en la Sección G1 anterior, realizadas para evaluar la capacidad de los corticosteroides para mejorar los efectos adversos mediados por hialuronano, para evaluar la actividad del agente anti-hialuronano en presencia de un corticosteroide. Se pueden realizar ensayos para medir la actividad anti-hialuronano en pacientes con tumores sólidos, tratados, por ejemplo, con un agente anti- hialuronano con o sin corticosteroides, con dosis crecientes de agente anti-hialuronano y una cantidad fija de corticosteroides, o con una cantidad fija de agente anti-hialuronano y dosis decrecientes de corticosteroides. Estos ensayos pueden incluir ensayos de biopsia de tejido tumoral en los que se toman biopsias de tumores antes del tratamiento, durante el tratamiento y después del tratamiento. Los tejidos se tiñen para medir los niveles de hialuronano en el tumor para evaluar la actividad del agente anti-hialuronano administrado. Los tejidos tumorales teñidos de los que se han tomado biopsias antes, durante y después del tratamiento se pueden comparar para evaluar la actividad anti-hialuronano en presencia de corticosteroides.
En otro ejemplo, la sangre y la orina se pueden recoger en diferentes puntos temporales a lo largo del tratamiento del paciente y se pueden analizar catabolitos de hialuronano. La presencia de catabolitos es indicativa de degradación de hialuronano y, por lo tanto, es una medida de la actividad de la hialuronidasa. La enzima plasmática también puede evaluarse y medirse a lo largo del tiempo después de la administración. Los ejemplos ilustran estos ensayos.
Los métodos adicionales para evaluar la actividad anti-hialuronano incluyen ensayos que evalúan la difusión de agua en los tejidos. Como se comenta en otra parte de la presente memoria, los tejidos que acumulan hialuronano generalmente tienen una presión de fluido intersticial más alta que el tejido normal debido a la acumulación concomitante de agua. Por lo tanto, los tejidos que acumulan HA, tales como los tumores, tienen alta presión de fluido intersticial, que puede medirse mediante diversos métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar MRI de difusión, como ADC MRI o DCE MRI. La difusión de agua puede evaluarse mediante estos procedimientos, y se correlaciona directamente con la presencia de tejidos ricos en hialuronano, tales como tumores sólidos (véase, p.ej. Chenevert et al. (1997) Clinical Cancer Research, 3:1457-1466). Por ejemplo, los tumores que acumulan hialuronano tienen un aumento distinguible de MRI ADC o MRI DCE debido a una mayor perfusión. Dichos ensayos se pueden realizar en presencia y en ausencia de un agente anti-hialuronano con o sin corticosteroide, y se comparan los resultados. Los métodos para medir la difusión son una medida útil para evaluar los cambios celulares que siguen a tales terapias.
d. Farmacocinética
Se pueden realizar estudios farmacocinéticos con modelos animales o se pueden realizar durante estudios clínicos con pacientes para evaluar el efecto de la co-administración de un corticosteroide sobre las propiedades farmacocinéticas de una enzima que degrada hialuronano modificada, tal como una hialuronidasa modificada. Los modelos animales incluyen, pero sin limitarse a, ratones, ratas, conejos, perros, cobayas y modelos de primates no humanos, tales como monos cynomolgus o macacos rhesus. En algunos casos, los estudios farmacocinéticos se realizan con animales sanos. En otros ejemplos, los estudios se realizan utilizando modelos animales de una enfermedad para la cual se considera el tratamiento con hialuronano, tales como modelos animales de cualquier enfermedad o trastorno asociado a hialuronano.
Las propiedades farmacocinéticas de un agente anti-hialuronano, tal como una hialuronidasa modificada, en presencia de un corticosteroide, pueden evaluarse midiendo parámetros tales como la concentración máxima (pico) (Cmáx), el tiempo pico (es decir, cuando se produce la concentración máxima; Tmáx), la concentración mínima (es decir, la concentración mínima entre dosis; Cmin), la vida media de eliminación (T1/2) y el área bajo la curva (es decir, el área bajo la curva generada al representar el tiempo frente a la concentración; AUC), después de la administración. En los casos en que la hialuronidasa modificada se pueda administrar por vía subcutánea, la biodisponibilidad absoluta de la hialuronidasa se determina comparando el área bajo la curva de hialuronidasa después de la administración subcutánea (AUCsc) con el AUC de hialuronidasa después de la administración
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intravenosa (AUC¡v). La biodisponibilidad absoluta (F), se puede calcular con la fórmula: F = ([AUC]sc x dosiSsc)/([AUC]¡v x dosisiv).
Pueden administrarse un intervalo de dosis y una frecuencia de dosificación diferentes en los estudios farmacocinéticos para evaluar el efecto del aumento o la disminución de las concentraciones del corticosteroide, tal como la dexametasona y/o el agente anti-hialuronano (p.ej., rHuPH20 PEGilada) en la dosis. Las propiedades farmacocinéticas de los agentes anti-hialuronano, tales como la biodisponibilidad, también pueden evaluarse con o sin la co-administración de corticosteroides. Por ejemplo, a perros, tales como perros beagle, se les puede administrar un agente anti-hialuronano, tal como una hialuronidasa PEGilada, sola, o junto con un corticosteroide, utilizando una o más vías de administración. Dichos estudios pueden realizarse para evaluar el efecto de la coadministración de corticosteroides con agente anti-hialuronano sobre las propiedades farmacocinéticas. Además, el efecto de la co-administración de un agente anti-hialuronano, tal como una hialuronidasa, con otro agente, tal como un agente quimioterapéutico, en presencia o ausencia de un corticosteroide, sobre las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de ese agente también se puede evaluar in vivo utilizando modelos animales y/o sujetos humanos, tal como en el contexto de una prueba clínica, como se comentó anteriormente.
H. USO DE AGENTES ANTIHIALURONANO EN EL TRATAMIENTO DE LAS AFECCIONES, ENFERMEDADES Y TRASTORNOS ASOCIADOS CON HIALURONANO
Los agentes anti-hialuronano, tales como una enzima PEGilada que degrada hialuronano, pueden utilizarse para tratar enfermedades o afecciones asociadas a hialuronano, solos o combinados con agentes terapéuticos. En particular, las enzimas modificadas que degradan hialuronano, tales como PEGPH20, tienen actividad antitumoral solas o combinadas con agentes quimioterapéuticos (véase p.ej. Solicitud publicada de los Estados Unidos Núm. US20100003238 y Solicitud Publicada Internacional Núm. WO2009128917).
Como se encuentra en la presente memoria, se observa actividad antitumoral a dosis mucho más bajas que las contempladas previamente que no alcanzan o mantienen un nivel detectable de enzima hialuronidasa en plasma. Por lo tanto, la magnitud de los efectos secundarios adversos, tales como los efectos secundarios musculoesqueléticos, no es tan grave como las dosis más altas de la enzima. A estas dosis más bajas, la enzima presenta propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas que se correlacionan con una reducción de hialuronano (HA) asociado a tumor, elevación de hialuronano en plasma y cambios favorables en los volúmenes e incidencia tumorales.
Por lo tanto, se describe en la presente memoria un método o uso para tratar una enfermedad o afección asociadas a hialuronano, tal como un cáncer, administrando una enzima que degrada hialuronano modificada con polímero, tal como una hialuronidasa modificada con polímero, por ejemplo, una PH20 (p.ej., PEGPH20) a un paciente en una cantidad inferior a 20 pg/kg, por ejemplo, de 0,01 pg/kg a 15 pg/kg, de 0,05 pg/kg a 10 pg/kg, de 0,75 pg/kg a 7,5 pg/kg o de 1,0 pg/kg a 3,0 pg/kg, tal como a aproximadamente 0,01 pg/kg (del sujeto), 0,02 pg/kg, 0,03 pg/kg, 0,04 pg/kg, 0,05 pg/kg, 1,0 pg/kg, 1,5 pg/kg, 2,0 pg/kg, 2,5 pg/kg, 3,0 pg/kg, 3,5 pg/kg, 4,0 pg/kg, 4,5 pg/kg, 5,0 pg/kg, 5,5 pg/kg, 6,0 pg/kg, 7,0 pg/kg, 7,5 pg/kg, 8,0 pg/kg, 9,0 pg/kg, 10,0 pg/kg, 12,5 pg/kg o 15 pg/kg. Por ejemplo, una enzima que degrada hialuronano modificada con polímero, tal como una hialuronidasa PEGilada (p.ej., PH20), proporcionada en la presente memoria, por ejemplo, PEGPH20, se puede administrar de, o aproximadamente de, 1 Unidad/kg a 1000 Unidades/kg, 1 Unidad/kg a 500 Unidades/kg o 10 Unidades/kg a 50 Unidades/kg. Generalmente, cuando la actividad específica de la hialuronidasa modificada es, o es de aproximadamente, 20.000 U/mg a 60.000 U/mg, generalmente de, o de aproximadamente 35.000 U/mg, se administran de 200 unidades a 50.000 (U), se administran por ejemplo 200 U, 300 U ; 400 U; 500 U; 600 U; 700 U; 800 U; 900 U; 1.000 U; 1.250 U; 1.500 U; 2.000 U; 3.000 U; 4.000 U; 5.000 U; 6.000 U; 7.000 U; 8.000 U; 9.000 U; 10.000 U; 20.000 U; 30.000 U; 40.000 U; o 50.000 U. Por lo general, los volúmenes para inyección o infusión son menores a 50 ml, tal como de, o aproximadamente de, 0,5 ml, 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL o 50 mL.
Para el tratamiento de una enfermedad o afección asociadas a hialuronano, tal como un cáncer, la enzima que degrada hialuronano modificada con polímero puede administrarse sistémicamente, por ejemplo, por vía intravenosa (IV), intramuscular, o por cualquier otra vía sistémica. En ejemplos concretos, las dosis más bajas se pueden administrar localmente. Por ejemplo, la administración local de una enzima que degrada hialuronano, tal como una enzima PEGilada que degrada hialuronano, por ejemplo una hialuronidasa PEGilada (p.ej., PH20) incluye administración intratumoral, inyección arterial (p.ej., arteria hepática), administración intraperitoneal, administración intravesical y otras rutas locales utilizadas para la terapia del cáncer que puede aumentar la acción local a una dosis absoluta más baja. En los métodos en la presente memoria para tratar una enfermedad o afección asociadas a hialuronano, tal como un cáncer, la enzima se puede administrar sola o combinada con agentes terapéuticos. Además, según se proporciona en otros métodos en la presente memoria, los corticosteroides se pueden administrar para mejorar cualquier efecto secundario o evento adverso asociado con la enzima que degrada hialuronano.
En los métodos descritos en la presente memoria para tratar una enfermedad o afección asociadas a hialuronano,
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las cantidades de una enzima que degrada hialuronano modificada con polímero como se establece anteriormente se administran periódicamente durante un ciclo de administración. Por ejemplo, la administración periódica de una enzima que degrada hialuronano modificada con polímero puede ser dos veces por semana, una vez por semana o una vez cada 21 días. La duración del ciclo de administración se puede determinar empíricamente, y depende de la enfermedad que se vaya a tratar, la gravedad de la enfermedad, el paciente concreto y otras consideraciones dentro del nivel de conocimiento práctico del médico a cargo. El tiempo de tratamiento con una enzima hialuronidasa modificada puede ser de una semana, dos semanas, un mes, varios meses, un año, varios años o más. Por ejemplo, una enzima hialuronidasa modificada se puede administrar dos veces a la semana durante un período de un año o más. En algunos ejemplos, se puede reducir la frecuencia periódica de la administración en ciclos posteriores de administración. Por ejemplo, una enzima hialuronidasa modificada puede administrarse dos veces por semana durante 4 semanas, y a continuación administrarse una vez a la semana durante un período de un año o más. Si los síntomas de la enfermedad persisten en ausencia de tratamiento interrumpido, el tratamiento puede continuarse por un período de tiempo adicional y/o puede aumentarse el período de frecuencia de administración. Durante el transcurso del tratamiento, se pueden controlar las pruebas de toxicidad relacionada con la enfermedad y/o el tratamiento o los efectos secundarios. Si se observan efectos secundarios, se puede incluir un agente corticosteroide en el régimen de dosificación como se describe en la presente memoria.
Además, el ciclo de administración se puede adaptar para agregar períodos de tratamiento interrumpido con el fin de proporcionar un período de descanso de la exposición a la enzima. El tiempo de interrupción del tratamiento puede ser por un tiempo predeterminado o puede determinarse empíricamente dependiendo de cómo responda el paciente o dependiendo de los efectos secundarios observados. Por ejemplo, el tratamiento puede interrumpirse durante una semana, dos semanas, un mes o varios meses. En general, el período de tratamiento interrumpido se integra en un ciclo de régimen de dosificación para un paciente. Por ejemplo, un régimen de dosificación ilustrativo es un ciclo de tratamiento de 28 días, administrando la enzima modificada durante las primeras 3 semanas, dos veces a la semana, seguido de una semana sin dosificación. Así, por ejemplo, a un paciente se le pueden administrar dosis de la enzima modificada los días 1, 4, 8, 11, 15 y 18, seguido de una semana de tratamiento interrumpido, en el transcurso del ciclo de 28 días. Como se indicó anteriormente, el ciclo de administración puede ser durante cualquier período de tiempo deseado. Por lo tanto, el ciclo de administración de 28 días se puede repetir durante cualquier período de tiempo. Está dentro del nivel de conocimiento práctico del médico a cargo adoptar un ciclo de administración y régimen de dosificación que satisfaga las necesidades del paciente dependiendo de las consideraciones personales específicas del paciente y la enfermedad que se vaya a tratar.
En ejemplos concretos, una administración de dosificación única de una enzima que degrada hialuronano modificada con polímero, tal como una hialuronidasa PEGilada (p.ej., PH20), proporcionada en la presente memoria, por ejemplo, PEGPH20, es una cantidad en un intervalo de entre, o aproximadamente entre, 0,5 pg y 1450 pg o de 150 Unidades (U) a 45.000 Unidades. Por ejemplo, una administración de dosificación única es de una cantidad en un intervalo entre, o aproximadamente entre, 0,75 pg y 1125 pg; 3,75 pg y 750 pg; 56 pg y 565 pg; o 75 pg y 225 pg. En otros ejemplos, una administración de dosificación única es de una cantidad en un intervalo entre, o aproximadamente entre, 24 unidades (U) y 36.000 U; 120 U y 24.000 U; 1500 U y 18.000 U; o 2400 U y 7200 U. Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan los usos de una enzima que degrada hialuronano que se administra a un sujeto como una dosis unitaria de una cantidad en un intervalo entre, o aproximadamente entre, 0,5 pg y 1450 pg o 150 Unidades (U) y 45.000 unidades a una frecuencia de al menos una vez por semana durante un ciclo de al menos 4 semanas. La frecuencia puede ser al menos dos veces a la semana o una vez a la semana. Se entiende que el ciclo de administración para tratar una enfermedad o afección asociadas a hialuronano se puede repetir una pluralidad de veces dependiendo de las necesidades concretas del paciente.
En algunos ejemplos proporcionados en la presente memoria, utilizando los métodos de la presente memoria, los corticosteroides pueden administrarse combinados con un agente anti-hialuronano para el tratamiento o uso en el tratamiento de una enfermedad o afección asociadas a hialuronano, tal como en el tratamiento de pacientes con tumores sólidos avanzados. En algunos ejemplos, también se pueden utilizar en la terapia agentes quimioterapéuticos u otros agentes anticancerosos. Los usos terapéuticos descritos a continuación son ilustrativos y no limitan las aplicaciones de los métodos descritos en la presente memoria. Se entiende que en la siguiente descripción, se puede utilizar un corticosteroide, tal como un glucocorticoide, por ejemplo dexametasona, combinado con un agente anti-hialuronano en los métodos para reducir o mejorar los efectos secundarios musculoesqueléticos u otros efectos secundarios. Las dosis y la vía de administración se describen anteriormente en la Sección F.
Los métodos descritos incluyen métodos para el uso de las enzimas que degradan hialuronano para tratar cualquier enfermedad o afección asociadas a hialuronano, que incluyen, pero sin limitarse a, uno que está asociado con alta presión de fluido intersticial, un cáncer y en particular un cáncer rico en hialuronano, edema, presión del disco, una enfermedad inflamatoria y otras enfermedades asociadas con hialuronano. Las afecciones y enfermedades asociadas con hialuronano son enfermedades y afecciones en las cuales los niveles de hialuronano son elevados como causa, consecuencia u observados de otra forma en la enfermedad o afección. En algunos casos, las enfermedades y afecciones asociadas a hialuronano se asocian con un aumento de la presión del líquido intersticial, disminución del volumen vascular y/o aumento del contenido de agua en un tejido, tal como un tumor. Las
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enfermedades y afecciones asociadas a hialuronano ilustrativas que pueden tratarse utilizando las enzimas, composiciones y métodos proporcionados incluyen, entre otros, cánceres ricos en hialuronano, por ejemplo, tumores, incluidos tumores sólidos tales como cánceres de estadio tardío, cánceres metastásicos, cánceres indiferenciados, cáncer de ovario, carcinoma in situ (CIS), carcinoma de células escamosas (CCE), cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de mama, cáncer de colon y otros cánceres.
Los niveles elevados de hialuronano están asociados con numerosas enfermedades inflamatorias, que incluyen prácticamente todos los procesos de enfermedad que implican inflamación. Dichas enfermedades y afecciones incluyen, pero sin limitarse a, artritis reumatoide, periodontitis, esclerodermia, psoriasis, aterosclerosis, heridas crónicas, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y enfermedad inflamatoria intestinal. Un mecanismo para estos niveles elevados se debe a la regulación de genes de HA sintasa por mediadores inflamatorios, tales como IL-1p (Ducale et al. (2005) Am. J. Physiol. Gatrointest. Liver Physiol., 289:G462-G470). Además, el hialuronano por sí mismo es capaz de interactuar y activar diversos leucocitos, lo que agrava la inflamación (véase, por ejemplo, Ducale et al. 2005; Jiang et al. (2007) Annu. Rev. Cell. Dev. Biol., 23:435-61). Por lo tanto, otras enfermedades y afecciones asociadas a hialuronano que pueden tratarse con agentes anti-hialuronano incluyen enfermedades y afecciones inflamatorias, que incluyen, entre otras, artritis reumatoide, esclerodermia, periodontitis, psoriasis, aterosclerosis, heridas crónicas, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y enfermedad inflamatoria intestinal.
También son ilustrativas de enfermedades y afecciones asociadas a hialuronano enfermedades que están asociadas con presión de fluido intersticial elevada, tales como enfermedades asociadas con presión de disco y edema, por ejemplo, edema causado por trasplante de órgano, accidente cerebrovascular, trauma cerebral u otra lesión. Las enfermedades y afecciones asociadas a hialuronano ilustrativas incluyen enfermedades y afecciones asociadas con presión de fluido intersticial elevada, disminución del volumen vascular y/o aumento del contenido de agua en un tejido, incluyendo cánceres, presión de disco y edema. En un ejemplo, el tratamiento de la afección, enfermedad o trastorno asociados a hialuronano incluye mejora, reducción u otro efecto beneficioso sobre uno o más de aumento de la presión de fluido intersticial (PFI), disminución del volumen vascular y aumento del contenido de agua en un tejido.
Típicamente, las enfermedades y afecciones asociadas a hialuronano están asociadas con expresión de hialuronano elevada en un tejido, célula o fluido corporal (p.ej., tejido tumoral o tejido, sangre o espacio intersticial asociado a tumor) en comparación con un control, p.ej. otro tejido, célula o fluido corporal. La expresión elevada de hialuronano puede ser elevada en comparación con un tejido, célula o fluido corporal normal, por ejemplo, un tejido, célula o fluido corporal que son análogos a la muestra que se está sometiendo a ensayo, pero aisladas de un sujeto
diferente, como un sujeto que es normal (es decir, no tiene una enfermedad o afección, o no tiene el tipo de
enfermedad o afección que tiene el sujeto que se está evaluando), por ejemplo, un sujeto que no tiene una
enfermedad o afección asociadas a hialuronano. La expresión elevada de hialuronano puede ser elevada en
comparación con un tejido análogo de otro sujeto que tiene una enfermedad o afección similar, pero cuya enfermedad no es tan grave y/o no está asociada a hialuronano o expresa menos hialuronano y, por lo tanto, está asociada a hialuronano. un grado menor. Por ejemplo, el sujeto que se está sometiendo a ensayo puede ser un sujeto con cáncer asociado a hialuronano, donde las cantidades de HA en el tejido, la célula o el líquido son relativamente elevadas en comparación con un sujeto que tiene un cáncer menos grave, como una etapa temprana, diferenciada o otro tipo de cáncer. En otro ejemplo, la célula, tejido o fluido contiene niveles elevados de hialuronano en comparación con una muestra de control, tal como un fluido, tejido, extracto (p.ej., extracto celular o nuclear), ácido nucleico o preparación de péptidos, línea celular, biopsia, patrón u otra muestra, con una cantidad conocida o cantidad relativa de HA, tal como una muestra, por ejemplo una línea celular tumoral, que se sabe que expresa niveles relativamente bajos de HA, tales como líneas de células de tumor ilustrativas descritas en la presente memoria que expresan bajos niveles de HA, para ejemplo, la línea celular HCT 116, la línea celular HT29, la línea celular NCI H460, la línea celular DU145, la línea celular Capan-1 y los tumores de modelos tumorales generados utilizando tales líneas celulares (véase, por ejemplo, el Ejemplo 17A).
Típicamente, la enfermedad o afección asociadas a hialuronano se asocia con un aumento de expresión de HA, por ejemplo, en un tejido enfermo, por ejemplo, un tumor. En un ejemplo, las HALO (regiones de la matriz pericelular que son ricas en proteoglicanos, que incluyen hialuronano) se forman en un tejido del sujeto, por ejemplo, en un tejido enfermo. En otro ejemplo, la presencia de las HALO se detecta en un cultivo in vitro de células de un tejido del sujeto, por ejemplo, un tejido enfermo.
En un ejemplo, la afección, enfermedad o trastorno asociados a hialuronano se asocian con un aumento de la presión de fluido intersticial, disminución del volumen vascular o aumento del contenido de agua en un tejido. En un ejemplo, el tratamiento de la afección, enfermedad o trastorno asociados a hialuronano incluye mejora, reducción u otro efecto beneficioso sobre uno o más de aumento de la presión de fluido intersticial (PFI), disminución del volumen vascular y aumento del contenido de agua en un tejido. Los usos terapéuticos incluyen el tratamiento de una enfermedad o afección asociadas al hialuronano, incluyendo el tratamiento del cáncer, reducción del volumen tumoral, incremento de la sensibilidad a la quimioterapia u otro tratamiento contra el cáncer, mejora de la
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biodisponibilidad o suministro de un tratamiento para el cáncer u otro agente de tratamiento, disminución de la presión del líquido intersticial, aumento del volumen vascular, disminución del contenido de agua en un tejido en el sujeto y otros tratamientos.
1. Selección de sujetos para el tratamiento y evaluación de los efectos del tratamiento
Los métodos incluyen etapas para seleccionar sujetos para el tratamiento con agentes anti-hialuronano y para evaluar los efectos del tratamiento, tal como la eficacia del tratamiento. Tales métodos incluyen métodos para detectar marcadores de enfermedad asociados a hialuronano, que incluyen cualquier indicación de que un sujeto tiene una enfermedad asociada a hialuronano, que es probable que el sujeto responda al tratamiento por el agente anti-hialuronano, y/o que una muestra del sujeto, tal como un tejido, célula o fluido, contenga una expresión elevada de hialuronano. Los ensayos ilustrativos para detectar marcadores se describen a continuación e incluyen ensayos para medir la expresión de HA y/o la expresión de HA relativa en una muestra de un sujeto, ensayos para analizar efectos de agentes anti-hialuronano en una muestra del sujeto y ensayos para medir lecturas típicamente asociadas con ciertas enfermedades/afecciones asociadas a hialuronano, tales como baja expresión o actividad de hialuronidasa, alta presión de fluido intersticial, volumen vascular y contenido de agua. En general, puede utilizarse cualquier ensayo conocido para la detección de proteínas o ácidos nucleicos en muestras de sujetos, o para evaluar los efectos del tratamiento sobre células/tejidos in vitro.
Los sujetos seleccionados para el tratamiento en los métodos proporcionados en la presente memoria incluyen sujetos que tienen expresión elevada, aberrante o acumulada de hialuronano en comparación con sujetos que no tienen la enfermedad o afección o en comparación con tejidos normales o muestras que no tienen expresión elevada, aberrante o acumulada de HA. Cualquier muestra o tejido de un sujeto puede analizarse y compararse con una muestra o tejido normal. Los niveles de hialuronano se pueden medir a partir de cualquier fuente tal como a partir de un tejido (p.ej., mediante biopsia), tumor, células, o a partir de sangre, suero, orina u otros fluidos corporales. Por ejemplo, como se describe en otra parte en la presente memoria, los perfiles de depósito de HA en tumores sólidos generalmente se han categorizado como pericelulares o estromales. Se han observado niveles elevados de HA en plasma, sobre todo en pacientes con tumor de Wilms, mesotelioma y metástasis hepáticas. Por lo tanto, dependiendo de la enfermedad o afección, se puede medir una muestra diferente para los niveles de hialuronano. La elección de la muestra está dentro del nivel de un experto en la técnica.
El ensayo utilizado para medir los niveles de hialuronano está en función de la enfermedad o afección y se puede elegir según la enfermedad o afección particular. Un experto en la técnica está familiarizado con los métodos de detección de hialuronano, que incluyen, pero sin limitarse a, métodos de inmunohistoquímica, métodos de ELISA, como se describe en la sección (i) a continuación.
En un ejemplo, la etapa para detectar marcadores se realiza antes de tratar a un sujeto, por ejemplo, para determinar si el sujeto tiene una afección o enfermedad asociada a hialuronano que será susceptible de tratamiento con un agente anti-hialuronano. En este ejemplo, si se detecta el marcador (p.ej., si se determina que una célula, tejido o fluido del paciente contienen expresión elevada de hialuronano o responden a la enzima que degrada hialuronano), se lleva a cabo una etapa de tratamiento, en la que se administra al sujeto una enzima que degrada hialuronano. En un ejemplo, cuando no se detecta el marcador (p.ej., si se determina que una célula, tejido o fluido del paciente contienen una expresión de hialuronano normal o no elevada o no responde a un agente anti- hialuronano), se puede seleccionar otra opción de tratamiento.
En otro ejemplo, el paso para detectar marcadores se realiza después de tratar a un sujeto, o durante el curso del tratamiento del sujeto (p.ej., tratamiento con el agente anti-hialuronano (p.ej., hialuronidasa modificada soluble) (con o sin co-administración de un agente), por ejemplo, para determinar si el tratamiento con el agente anti-hialuronano está teniendo un efecto en el tratamiento de la enfermedad o afección. En un ejemplo de este tipo, el marcador no se detecta o se detecta con una disminución de la cantidad o nivel relativo en comparación con la cantidad/nivel antes del tratamiento, o en comparación con otra muestra, el tratamiento continúa, se realiza otra ronda de tratamiento o se inicia otro tratamiento, tal como una terapia combinada. En otro ejemplo, si el marcador se detecta al mismo nivel que antes del tratamiento o que otra muestra, se puede seleccionar otra opción de tratamiento.
a. Ensayos para la detección de marcadores de enfermedades asociadas a hialuronano
Los ensayos para detectar marcadores de enfermedades y afecciones asociadas a hialuronano incluyen ensayos para medir la cantidad (p.ej., la cantidad relativa) de hialuronano, la expresión de HA sintasa y/o hialuronidasa en un tejido, célula y/o fluido corporal de un sujeto, por ejemplo, un tumor. Entre estos ensayos están incluidos los que pueden detectar la expresión de HA, la expresión de Hialuronano sintasa 2 (HAS2), la presencia de las HALO (regiones de la matriz pericelular que son ricas en proteoglicanos, incluyendo hialuronano) y la presencia de enzimas que degradan hialuronano, tales como hialuronidasas, por ejemplo, en muestras del sujeto.
Los ensayos para detectar niveles de proteína y ácido nucleico son bien conocidos en la técnica y se pueden utilizar
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en los métodos de la presente memoria para medir hialuronano, hialuronano sintasa u otra expresión de proteína y/o ácido nucleico. Tales ensayos incluyen, pero sin limitarse a, ELISA, SDS-PAGE, transferencia Western, PCR, RT- PCR, inmunohistoquímica, histología y citometría de flujo. Por ejemplo, una muestra de un sujeto, tal como una muestra de tejido (p.ej., una biopsia de un tumor de un paciente o modelo animal, una muestra de estroma), un fluido (p.ej., sangre, orina, plasma, saliva u otra muestra), una célula o muestra celular, o extracto, u otra muestra, puede teñirse con anticuerpos anti-HA, por ejemplo, utilizando tinción histológica, tal como inmunohistoquímica (IHC) de secciones de tejido fijas o congeladas, para determinar la presencia y extensión de hialuronano en el tejido o la muestra, o tinción celular inmunofluorescente, ensayos de precipitación "pull-down" y citometría de flujo. En otro ejemplo, la muestra, p.ej. biopsia, puede analizarse mediante RT-PCR para evaluar la cantidad de ARNm de HA.
Los métodos conocidos para la detección de la expresión de hialuronano en el cáncer incluyen, pero sin limitarse a, el ensayo de tipo ELISA descrito por Lokeshwar et al., en Cancer Res. 57:773 - 777 (1997), para medir niveles de HA en orina o extractos de tejido de vejiga de sujetos que tienen cáncer de vejiga. Para el ensayo, la orina o los extractos se aplican como recubrimiento en placas de micropocillos (también se aplica como recubrimiento la HA de cordón umbilical), seguido de incubación (p.ej., 16 horas, temperatura ambiente) con una proteína de unión a HA marcada (p.ej. Biotinilada), como descrito en la presente memoria, se lavan y la proteína de unión a HA unida a los pocillos se cuantifica utilizando un sustrato de agente de detección de avidina-biotina. Tales métodos son bien conocidos en la técnica. En un ejemplo, la orina de un sujeto con un cáncer de vejiga asociado a HA contenía niveles de HA que se elevaron 2-9 veces en comparación con la orina/extractos de pacientes normales (sujetos sanos o sujetos con otras enfermedades o afecciones gastrourinarias); por lo tanto, el marcador se detectaría si los niveles de HA en la orina fueran elevados en comparación con los sujetos normales, p.ej. elevados entre aproximadamente 2 veces y aproximadamente 9 veces, p.ej. elevados, o elevados aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 veces en comparación con el sujeto normal.
En un ejemplo adicional, la expresión y producción de hialuronano en células de tumor in vitro pueden evaluarse utilizando cualquiera de los métodos descritos anteriormente. Del mismo modo, la producción y/o expresión de Hialuronano sintasa 2 (HAS2) por células in vitro, ex vivo o in vivo también se puede someter a ensayo mediante, por ejemplo, ELISA, SDS-PAGE, transferencia Western, PCR, RT-PCR, inmunohistoquímica, histología o citometría de flujo.
En otro ejemplo, se determina la cantidad de actividad de hialuronidasa en una muestra del sujeto, tal como en la sangre o plasma, por ejemplo, tal como con un ensayo de turbidez.
En otro ejemplo, se aísla una célula u otro tejido de un paciente, p.ej. una célula tumoral, y se utiliza en un estudio para determinar si la célula o el tejido responden al tratamiento con la enzima que degrada hialuronano in vitro, por ejemplo, utilizando un ensayo clonogénico o cualquier otro ensayo para medir el crecimiento, la proliferación y/o la supervivencia de células o tejidos, tales como células de tumor, en respuesta al tratamiento. En un ejemplo, las células cancerosas de un sujeto se siembran sobre una superficie, tal como una matriz extracelular o una mezcla de proteínas, tal como la mezcla comercializada con el nombre de fábrica Matrigel® (BD Biosciences). En este ejemplo, el marcador asociado a hialuronano es la sensibilidad de la célula o tejido a la administración de la enzima que degrada hialuronano. En este ejemplo, si se inhibe o bloquea cualquier propiedad, tal como proliferación, crecimiento o supervivencia de las células mediante la adición de enzima que degrada hialuronano, se determina que el sujeto puede ser susceptible de tratamiento con composiciones que contienen enzimas que degradan hialuronano.
Además de los ensayos para determinar los niveles de expresión de hialuronano, se pueden utilizar otros ensayos para seleccionar un sujeto para el tratamiento, y/o para evaluar la eficacia y/o duración del tratamiento. La presión del líquido intersticial (PFI) puede medirse utilizando una sonda o instrumento apropiado. Por ejemplo, se puede utilizar un catéter con punta de transductor para medir la PFI en tejidos cancerosos u otros tejidos de interés. El catéter pasa a través del orificio interno de una aguja quirúrgica, que a continuación se inserta en el centro del tumor. La aguja se retira mientras el catéter se mantiene en posición. La PFI (mmHg) puede medirse después utilizando una unidad de adquisición de datos apropiada (véase, p.ej. Ozerdem et al. (2005) Microvasc. Res. 70:116- 120). Otros métodos para medir PFI incluyen el método del catéter de mecha (Fadnes et al. (1977) Microvasc. Res. 14: 27-36).
El volumen vascular se puede medir, por ejemplo, mediante imágenes de ultrasonido. Este método emplea microburbujas hiper-ecoicas para proporcionar las fuertes reflexiones de ondas de ultrasonido que son detectadas. Las microburbujas, cuando se inyectan, por ejemplo intravenosamente, a un sujeto o modelo animal, quedan atrapadas en el espacio vascular debido a su tamaño. Los ensayos para evaluar el contenido de agua en el tejido, tal como el contenido de agua del tejido tumoral, también son conocidos en la técnica. Por ejemplo, las muestras de un tumor pueden cosecharse, transferirse, pesarse y congelarse rápidamente antes de ser liofilizadas. A continuación se informa sobre el peso de agua como la razón en peso de tejido húmedo a seco (es decir, liofilizado) en peso.
La capacidad de una célula tumoral para formar matrices pericelulares (halos) in vitro puede evaluarse utilizando un
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ensayo de exclusión de partículas. Pueden añadirse pequeñas partículas (glóbulos rojos fijados con formalina) a cultivos de células tumorales de baja densidad en presencia, por ejemplo, de agrecano, que es un gran proteoglicano de agregación de condroitín sulfato. Después de que las partículas se sedimentan, los cultivos se pueden observar a 400 aumentos para determinar si los halos fueron formados por las células de tumor. Esto se puede visualizar como zonas alrededor de las células de las cuales se excluyen las partículas.
b. Detección de marcadores asociados a hialuronano en relación con muestras de control
Para cualquiera de los métodos de detección, el marcador (p.ej., expresión de HA, capacidad de respuesta a la enzima que degrada hialuronano, expresión de HA-sintasa o actividad de hialuronidasa) se compara típicamente con una muestra de control, de modo que la detección del marcador generalmente incluye determinar que la lectura es elevada o reducida en comparación con la muestra de control.
Por ejemplo, la muestra de control puede ser otro tejido, célula o fluido corporal, tal como un tejido normal, una célula o un fluido corporal. Por ejemplo, se pueden evaluar un tejido, célula o fluido corporal análogos a la muestra que se somete a ensayo, pero aislado de un sujeto diferente, tal como un sujeto que es normal (es decir, no tiene una enfermedad o afección, o no tiene el tipo de enfermedad o afección que tiene el sujeto que se está evaluando). En otro ejemplo, se puede someter a ensayo un tejido análogo de otro sujeto que tiene una enfermedad o afección similar, pero cuya enfermedad no es tan grave y/o no está asociada con hialuronano o expresa relativamente menos hialuronano. Por ejemplo, cuando la célula, tejido o fluido que se están evaluando son de un sujeto que tiene cáncer, pueden compararse con un tejido, célula o fluido de un sujeto que tiene un cáncer menos grave, tal como un estadio temprano, diferenciado u otro tipo de cáncer. En otro ejemplo, una muestra de control es un fluido, tejido, extracto (p.ej., extracto celular o nuclear), ácido nucleico o preparación de péptido, línea celular, biopsia, patrón u otra muestra, con una cantidad conocida o cantidad relativa de HA. Por ejemplo, una muestra de este tipo puede incluir una línea celular tumoral que se sabe que expresa niveles relativamente bajos de HA. Ejemplos de tales líneas celulares tumorales descritas en la presente memoria que expresan bajos niveles de HA, por ejemplo, la línea celular HCT 116, la línea celular HT29, la línea celular NCI H460, la línea celular DU145, la línea celular Capan-1 y los tumores de modelos tumorales generados utilizando tales líneas celulares.
Se entiende que el cambio concreto, p.ej. el aumento o disminución de HA, depende del ensayo utilizado y de la fuente de muestra que se mide. Por ejemplo, en un ELISA, el aumento o disminución de la absorbancia a una longitud de onda particular o en cantidad de proteína (p.ej., como se determina mediante el uso de una curva patrón) se puede expresar con respecto a un control. En un ensayo de PCR, tal como RT-PCR, los niveles de expresión de la muestra pueden compararse con los niveles de expresión de control (p.ej., expresarse como un cambio doble) utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica, tales como el uso de patrones.
Por ejemplo, cuando se está sometiendo a ensayo la cantidad de hialuronano en una muestra de un sujeto, la detección del marcador puede determinar que la cantidad de HA en la muestra (p.ej., células cancerosas, tejido o fluido) del sujeto es elevada en comparación con un muestra de control, tal como una muestra de control descrita en el párrafo anterior. En un ejemplo, se determina que el cáncer es un cáncer rico en hialuronano si la cantidad de HA en el tejido, la célula o el líquido está elevada, o elevada aproximadamente, 0,5 veces, 1, vez, 2, veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 11 veces, 12 veces, 13 veces, 14 veces, 15 veces, 20 veces, o más, en comparación con la muestra de control.
En algunos ejemplos, se pueden realizar biopsias de un tumor y teñir directamente para determinar la expresión de HA. En otros ejemplos, se puede someter a ensayo una muestra, tal como una muestra de sangre u orina u otra muestra de fluido corporal asociadas con el tumor particular, para determinar el HA. El tipo de ensayo variará dependiendo del tipo de tumor, aunque se contempla que se puede utilizar más de un ensayo para detectar HA. Las referencias en la presente memoria a tales ensayos para tumores particulares son solo a título ilustrativo. Por ejemplo, para cánceres de vejiga, las muestras de orina pueden analizarse para detectar hialuronano mediante procedimientos de ELISA convencionales. Para los fines de la presente memoria, se pueden seleccionar sujetos que exhiben HA 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces o más HA en comparación con la orina de los controles normales del paciente (véase, por ejemplo, Lokeshwar et al. (2000) J. Urol., 163:348-56). En otro ejemplo, se pueden realizar biopsias y teñir las células tumorales para determinar el HA, tal como mediante inmunohistoquímica (véase, p.ej. Anttila et al. (2000) Cancer Research, 60:150-156; Karvinen et al. (2003) British J of Dermatology, 148:86-94; Lipponen et al. (2001) Euro J Can. 37:849-856); Auvinen et al. (2000) American J of Pathology, 156:529). Generalmente, en dichos ejemplos, una muestra de tumor o célula tumoral se considera positiva para HA si se observa cualquier señal de HA asociada a células cancerosas. Como control negativo para la tinción de fondo, las células pueden predigerirse con una hialuronidasa para escindir todos los HA asociados a las células. Las muestras también se pueden comparar con una célula o tejido normal del mismo sujeto. Además, en dichos métodos, el nivel de hialuronano asociado a células puede calificarse como bajo, moderado o alto. Por ejemplo, la expresión de HA se considera alta o moderada si 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o más del área tumoral mostraron señal de HA persistente. Típicamente, en la presente memoria se contempla el tratamiento de sujetos con HA de moderado a alto.
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2. Uso en el tratamiento de cánceres
Como se señaló anteriormente, el hialuronano desempeña un papel en los procesos asociados con el cáncer y los niveles de hialuronano se correlacionan con la agresividad tumoral y diversos marcadores de agresividad tumoral y mal pronóstico. Por lo tanto, se describen métodos para tratar cánceres asociados a hialuronano con agentes anti- hialuronano combinados con un glucocorticoide para mejorar, reducir o disminuir los efectos secundarios muscoesqueléticos inducidos por la enzima. Los cánceres incluyen cánceres y cánceres ricos en hialuronano que están asociados con la presión elevada del líquido intersticial.
El hialuronano desempeña un papel en los procesos asociados con la motilidad celular, que incluyen el desarrollo, la regeneración, la reparación, la embriogénesis, el desarrollo embriológico, la curación de heridas, la angiogénesis y la tumorigénesis (Toole 1991 Cell Biol. Extracell. Matrix, Hay (ed.), Plenum Press, Nueva York, 1384-1386; Bertrand et al. 1992 Int. J. Cancer 52:1-6; Knudson et al., 1993 FAsEb J. 7:1233-1241). Además, los niveles de hialuronano se correlacionan con la agresividad tumoral (Ozello et al. 1960 Cancer Res. 20: 600-604; Takeuchi et al. 1976, Cancer Res. 36: 2133-2139; Kimata et al. 1983 Cancer Res. 43: 1347-1354); el hialuronano promueve diversos procesos cancerosos, que incluyen, entre otros, crecimiento tumoral, supervivencia, metástasis y presión del líquido intersticial.
La hialuronidasa tiene efectos anticancerosos directos cuando se inyecta en los tumores. La hialuronidasa previene el crecimiento de tumores trasplantados en ratones (De Maeyer et al., (1992) Int. J. Cancer 51:657-660) e inhibe la formación de tumores tras la exposición a carcinógenos (Pawlowski et al. (1979) Int. J. Cancer 23:105-109) La hialuronidasa es eficaz como único agente terapéutico en el tratamiento del cáncer de cerebro (gliomas) (documento WO 198802261). Como se comentó anteriormente, otros agentes anti-hialuronano también tienen actividad antitumoral conocida.
Los cánceres asociados a hialuronano son cánceres asociados con la expresión de hialuronano, típicamente a expresión de hialuronano elevada, que se puede determinar, por ejemplo, antes del tratamiento, como se describió anteriormente. Las enfermedades y afecciones asociadas a hialuronano ilustrativas que pueden tratarse utilizando las composiciones proporcionadas que contienen agentes y procedimientos antihialuronano son cánceres, particularmente cánceres ricos en hialuronano, por ejemplo, cánceres ricos en hialuronano que están asociados con presión de fluido intersticial elevada.
Por ejemplo, el cáncer rico en hialuronano puede ser un cáncer en el que las células cancerosas producen HALO en un ensayo de exclusión de partículas in vitro; cánceres que tienen expresión elevada de hialuronano (según se determina por inmunotinción, p.ej., tinción histológica de secciones del tumor); cánceres que tienen HAS2 elevada (Hialuronano sintasa 2); y cánceres que no producen hialuronidasa (HYAL1) in vitro. Los cánceres ricos en hialuronano pueden identificarse mediante cualquier método para evaluar la expresión de hialuronano como se describe en la presente memoria, y otros métodos conocidos para analizar la expresión de proteína/ARNm.
Se han identificado diversos cánceres ricos en hialuronano. En algunos casos, la expresión de hialuronano se correlaciona con un mal pronóstico, por ejemplo, disminución de la tasa de supervivencia y/o tasa de supervivencia libre de recurrencia, metástasis, angiogénesis, invasión de células cancerosas en otros tejidos/zonas, y otros indicadores de mal pronóstico. Tal correlación ha sido observada, por ejemplo, en tumores ricos en hialuronano incluyendo cáncer de ovario, CCE, CIS, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, incluyendo cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), cáncer de mama, cáncer de colon y cáncer de páncreas (véanse, por ejemplo, Maarit et al., Cancer Research, 60:150-155 (2000); Karvinen et al., British Journal of Dermatology, 148:86-94 (2003)); Lipponen et al., Eur. Journal of Cancer, 849-856 (2001)); Pirinen et al., Int. J. Cancer: 95:12-17 (2001); Auvinen et al., American Journal of Pathology, 156 (2): 529-536 (2000)); Ropponen et al., Cancer Research, 58: 342347 (1998))). Por lo tanto, los cánceres ricos en hialuronano pueden tratarse mediante la administración de un agente anti-hialuronano, tal como una hialuronidasa, para tratar uno o más síntomas del cáncer. Los tumores ricos en hialuronano incluyen, entre otros, cáncer de próstata, mama, colon, ovario, estómago, cabeza y cuello y otros tumores y cánceres.
Los agentes anti-hialuronano, tales como las enzimas que degradan el hialuronano, incluidas las hialuronidasas, también se pueden utilizar para aumentar la sensibilidad de los tumores que son resistentes a la quimioterapia convencional. Por ejemplo, los agentes anti-hialuronano, por ejemplo, enzimas que degradan hialuronano, incluyendo hialuronidasas, tales como rHuPH20, pueden administrarse a un paciente que tiene un tumor asociado con un defecto de HYAL1 en una cantidad eficaz para aumentar la difusión alrededor del sitio del tumor (p.ej., para facilitar la circulación y/o concentraciones de agentes quimioterapéuticos en y alrededor del sitio del tumor), inhibir la motilidad de la célula tumoral, tal como por degradación del ácido hialurónico, y/o disminuir el umbral de apoptosis de la célula tumoral. Esto puede llevar a la célula o células tumorales a un estado de anoiquis, lo que hace que la célula tumoral sea más susceptible a la acción de agentes quimioterapéuticos. La administración de un agente anti- hialuronano, tal como una hialuronidasa, puede inducir la capacidad de respuesta de tumores de páncreas, estómago, colon, ovarios y mama que anteriormente eran resistentes a la quimioterapia (Baumgartner et al. (1988)
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Reg. Cáncer Treat. 1: 55-58; Zanker et al. (1986) Proc. Amer. Assoc. Cáncer Res. 27:390).
En un ejemplo, se utilizan agentes anti-hialuronano, tales como las enzimas que degradan hialuronano, en particular, las hialuronidasas, en el tratamiento de cánceres metastásicos y no metastásicos, que incluyen aquellos que tienen una disminución de actividad hialuronidasa endógena con respecto a las células no cancerosas. Los agentes anti- hialuronano, por ejemplo enzimas que degradan hialuronano tales como hialuronidasas, pueden utilizarse como agente quimioterapéutico solo o combinado con otros productos quimioterapéuticos. Los cánceres ilustrativos incluyen, pero sin limitarse a, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de pulmón de células escamosas y cánceres de mama, ovarios, cabeza y cuello, o cualquier otro cáncer asociado con niveles deprimidos de actividad de hialuronidasa o disminución del catabolismo de ácido hialurónico.
Además del tratamiento de la enfermedad con el agente anti-hialuronano solo (y también combinado con un corticosteroide), las composiciones y métodos descritos en la presente memoria también se pueden utilizar para tratar cánceres asociados a hialuronano mediante la administración del agente anti-hialuronano combinado, por ejemplo, simultáneamente o antes de, con un agente o tratamiento quimioterapéutico u otro agente anticanceroso. En este ejemplo, el agente anti-hialuronano, por ejemplo una enzima que degrada hialuronano, tal como una hialuronidasa, típicamente mejora la penetración de agentes quimioterapéuticos u otros agentes anticancerosos en tumores sólidos, tratando así la enfermedad. El agente anti-hialuronano, por ejemplo una enzima que degrada hialuronano, tal como una hialuronidasa, puede inyectarse intratumoralmente con agentes anticancerosos o por vía intravenosa para cánceres diseminados o tumores difíciles de alcanzar.
El agente anticanceroso puede ser un agente quimioterapéutico, un anticuerpo, un péptido o un vector de terapia génica, virus o ADN. Además, se puede utilizar un agente anti-hialuronano, por ejemplo, enzimas que degradan hialuronano, como hialuronidasa, para reclutar células tumorales a la reserva de ciclo para la sensibilización en tumores previamente quimiorrefractarios que han adquirido resistencia a múltiples fármacos (St Croix et al., (1998) Cancer Lett September 131(1): 35-44) Los agentes anti-hialuronano, tales como las enzimas que degradan hialuronano, que incluyen hialuronidasas, tales como, por ejemplo, rHuPH20, también pueden potenciar la administración de compuestos biológicos tales como anticuerpos monoclonales, citocinas y otros fármacos a tumores que acumulan glicosaminoglicanos.
Los agentes anticancerosos ilustrativos que pueden administrarse después, coincidentes con o antes de la administración de un agente anti-hialuronano, por ejemplo, una enzima que degrada hialuronano, tal como una hialuronidasa, incluyen, pero sin limitarse a, Acivicinas; Aclarrubicinas; Acodazoles; Acroninas; Adozelesinas; Aldesleucinas; compuestos de Alemtuzumab; Alitretinoínas (Ácidos 9-Cis-Retinoicos); Alopurinoles; Altretaminas; compuestos de Alvocidib; Ambazonas; Ambomininas; Ametantronas; Amifostinas; Aminoglutetimidas; Amsacrinas; Anastrozoles; Anaxironas; Ancitabinas; Antramicinas; Apazicuonas; Argimesnas; Trióxidos de arsénico; Asparaginasas; Asperlinas; Atrimustinas; Azacitidinas; Azetepas; Azotomicinas; Banoxantronas; Batabulinas; compuestos de Batimastat; BCG Vivo; Benaxibinas; Bendamustinas; Benzodepas; Bexarotenos; Bevacizumab; Bicalutamidas; Bietaserpinas; compuestos de Biricodar; Bisantrenos; Bisantrenos; Dimesilatos de Bisnafida; Bizelesinas; Bleomicinas; compuestos de Bortezomib; compuestos de Brequinar; Bropiriminas; Budotitanos; Busulfanos; Cactinomicinas; Calusteronas; compuestos de Canertinib; Capecitabinas; Caracemidas; Carbetímeros; Carboplatinos; Carbocuonas; compuestos de Carmofur; Carmustinas con Polifeprosanos; Carmustinas; Carrubicinas; Carzelesinas; Cedefingoles; compuestos de Celecoxib; Cemadotinas; Clorambucilos; compuestos de Cioteronel; Cirolemicinas; Cisplatinos; Cladribinas; compuestos de Clanfenur; Clofarabinas; Crisnatoles; Ciclofosfamidas; Liposomales de citarabina; Citarabinas; Dacarbazinas; Dactinomicinas; Darbepoetinas Alfa; Liposomales de Daunorrubicina; Daunorrubicinas/Daunomicinas; Daunorrubicinas; Decitabinas; compuestos de Denileucina Diftitox; Dexniguldipinas; Dexonaplatinos; Dexrazoxanos; Dezaguaninas; Diaziquonas; Dibrospidios; compuestos de Dienogest; Dinalinas; Disermolidas; compuestos de Docetaxel; compuestos de Dofequidar; Doxifluridinas; Liposomales de doxorrubicina; Doxorrubicina HCL; inyección de liposomas de Doxorrubicina HCL; Doxorrubicinas; Droloxifenos; Propionatos de Dromostanolona; Duazomicinas; Ecomustinas; Edatrexatos; Edotecarinas; Eflornitinas; compuestos de Elacridar; Elinafidas; Soluciones B de Elliott; Elsamitrucinas; compuestos de Emitefur; Enloplatinos; Enpromatos; Enzastaurinas; Epipropidinas; Epirrubicinas; Epoetinas alfa; compuestos de Eptaloprost; Erbulozoles; Esorrubicinas; Estramustinas; Etanidazoles; Etoglucidas; fosfatos de Etopósido; Etopósido VP-16s; Etopósidos; Etoprinas; Exemestanos; compuestos de Exisulind; Fadrozoles; Fazarabinas; Fenretinidas; compuestos de Filgrastim; Floxuridinas; Fludarabinas; Fluorouracilos; 5-fluorouracilos; Fluoximesteronas; Flurocitabinas; Fosquidonas; Fostriecinas; Fostriecinas; Fotretaminas; compuestos de Fulvestrant; Galarrubicinas; Galocitabinas; Gemcitabinas; compuestos de Gemtuzumab/Ozogamicinas; Geroquinoles; Gimatecanos; Gimeracilos; Gloxazonas; Glufosfamidas; Acetatos de goserelina; Hidroxiureas; compuestos de
Ibritumomab/Tiuxetanos; Idarrubicinas; Ifosfamidas; Ilmofosinas; compuestos de Ilomastat; Mesilatos de imatinib; Imexonas; Improsulfanos; compuestos de Indisulam; Inprocuonas; Interferones alfa-2a; Interferones alfa-2b; Interferones Alfa; Interferones Beta; Interferones Gamma; Interferones; Interleucina-2s y otras interleucinas (incluidas las interleucinas recombinantes); Intoplicinas; Iobenguanos [131-I]; Iproplatinos; Irinotecanos; Irsogladinas; Ixabepilonas; Cetotrexatos; L-alanosinas; Lanreotidas; compuestos de Lapatinib; Ledoxantronas; Letrozoles; Leucovorinas; Leuprolidas; Leuprorelinas (Leuprorelidas); Levamisoles; Lexacalcitoles; Liarozoles; Lobaplatinos;
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Lometrexoles; Lomustinas/CCNU; Lomustinas; Lonafarnib; Losoxantronas; Lurtotecanos; Mafosfamidas; Manosulfanos; compuestos de Marimastat; Masoprocoles; Maitansinas; Mecloretaminas; Mecloretaminas/mostazas nitrogenadas; Acetatos de Megestrol; Megestroles; Melengestroles; compuestos de Melfalán; MelfalanlL-PAM; Menogarilos; Mepitiostanos; Mercaptopurinas; 6-Mercaptopurina; Mesnas; compuestos de Metesind; Metotrexatos; Metoxsalenos; Metomidatos; Metoprinas; Meturedepas; Miboplatinos; Miproxifenos; Misonidazoles; Mitindomidas; Mitocarcinas; Mitocrominas; Mitoflaxonas; Mitogilinas; Mitoguazonas; Mitomalcinas; Mitomicinas C; Mitomicinas; Mitonafidas; Mitoquidonas; compuestos de Mitosper; Mitotanos; Mitoxantronas; Mitozolomidas; Mivobulinas; Mizoribinas; Mofarotenos; Mopidamoles; compuestos de Mubritinib; Ácidos micofenólicos; Fenpropionatos de Nandrolona; Nedaplatinos; Nelzarabinas; Nemorrubicinas; Nitracrinas; Nocodazoles; compuestos de Nofetumomab; Nogalamicinas; compuestos de Nolatrexed; Nortopixantronas; Octreótidos; Oprelvecinas; Ormaplatinos; compuestos de Ortataxel; Oteracilos; Oxaliplatinos; Oxisuranos; Oxofenarsinas; compuestos de Paclitaxel; Pamidronatos; Patubilonas; Pegademasas; Pegaspargasas; compuestos de Pegfilgrastim; Peldesinas; Peliomicinas; Pelitrexoles; compuestos de Pemetrexed; Pentamustinas; Pentostatinas; Peplomicinas; Perfosfamidas; Perifosinas; Picoplatinos; Pinafidas; Pipobromanos; Piposulfanos; Pirfenidonas; Piroxantronas; Pixantronas; compuestos de Plevitrexed; Plicamicida Mitramicinas; Plicamicinas; Plomestanos; Plomestanos; Porfimeros sódicos; Porfímeros; Porfiromicinas; Prednimustinas; Procarbazinas; Propamidinas; Prospidios; Pumitepas; Puromicinas; Pirazofurinas; Quinacrinas; Ranimustinas; Rasburicasas; Riboprinas; Ritrosulfanos; compuestos de Rituximab; Rogletimidas; compuestos de Roquinimex; Rufocromomicinas; Sabarubicinas; Safingoles; compuestos de Sargramostim; Satraplatinos; Sebriplatinos; Semustinas; Simtrazenos; Sizofiranos; Sobuzoxanos; compuestos de Sorafenib; Esparfosatos; Ácidos esparfosicos; Esparsomicinas; Espirogermanios; Espiromustinas; Espiroplatinos; Espiroplatinos; Escualaminas; Estreptonigrinas; Estreptovaricinas; Estreptozocinas; Sufosfamidas; compuestos de Sulofenur; Malato de Sunitinib; 6-tioguanina (6-TG); Tacedinalinas; Talcos; Talisomicinas; Talimustinas; Tamoxifenos; compuestos de Tariquidar; Tauromustinas; Tecogalanos; compuestos de Tegafur; Teloxantronas; Temoporfinas; Temozolomidas; Tenipósidos/VM-26; Tenipósidos; Teroxironas; Testolactonas; Tiamiprinas; Tioguaninas; Tiotepas; Tiamiprinas; Tiazofurinas; Tilomisoles; Tiloronas; compuestos de Timcodar; compuestos de Timonacic; Tirapazaminas; Topixantronas; Topotecanos; Toremifenos; compuestos de Tositumomab; Trabectedinas (Ecteinascidina 743); compuestos de Trastuzumab; Trestolonas; Tretinoínas/ATRA; Triciribinas; Trilostanos; Trimetrexatos; Tetranitratos de Triplatino; Triptorelinas; Trofosfamidas; Tubulozoles; compuestos de Ubenimex; Mostaza de Uracilo; Uredepas; Valrubicinas; compuestos de Valspodar; Vapreotidas; Verteporfinas; Vinblastinas; Vincristinas; Vindesinas; Vinepidinas; Vinfluninas; Vinformidas; Vinglicinatos; Vinleucinoles; Vinleurosinas; Vinorelbinas; Vinrosidinas; Vintriptoles; Vinzolidinas; Vorozoles; Xantomicinas A (Guameciclinas); Zeniplatinos; compuestos de Zilascorb [2-H]; Zinostatinas; Zoledronato; Zorrubicinas; y compuestos de Zosuquidar, por ejemplo:
Aldesleucinas (p.ej., PROLEUKIN®); compuestos de Alemtuzumab (p.ej., CAMPATH®); Alitretinoínas (p.ej., PANRETIN®); Alopurinoles (p.ej., ZYLOPRIM®); Altretaminas (por ejemplo HEXALEN®); Amifostinas (p.ej., ETHYOL®); Anastrozoles (p.ej., ARIMIDEX®); Trióxidos de arsénico (p.ej., TRISENOX®); Asparraginasas (p.ej., FELSPAR®); BCG Vivo (p.ej., TICE® BCG); Bexarotenos (p.ej., TARGRETIN®); Bevacizumab (AVASTIN®); Bleomicinas (p.ej., BLENOXANE®); Busulfan intravenoso (p.ej., BUSULFEX®); Busulfanos orales (p.ej., MYLERAN®); Calusteronas (p.ej., METHOSARB®); Capecitabinas (p.ej., XElOdA®); Carboplatinos (p.ej., PARAPLATIN®); Carmustinas (p.ej., BCNU®, BiCNU®); Carmustinas con Polifeprosanos (p.ej., Oblea GLIAdEl®); compuestos de Celecoxib (p.ej., CELEBREX®); Clorambucilos (p.ej., LEUKERAN®); Cisplatinos (p.ej., PLATINOL®); Cladribinas (p.ej., LEUSTATIN®, 2-CdA®); Ciclofosfamidas (p.ej., CYTOXAN®, NEOSAR®); Citarabinas (p.ej., CYTOSAR-U®); Liposomas de citarabina (p.ej., DepoCyt®); Dacarbazinas (p.ej., DTIC-Dome): dactinomicinas (p.ej., COSMEGEN®); Darbepoetinas Alfa (p.ej., ARANESP®); Liposomales de daunorrubicina (p.ej., DANUOXOME®); Daunorrubicinas/daunomicinas (p.ej., cErUbIDINE®); compuestos de Denileucina Diftitox (p.ej., ONTAK®); Dexrazoxanos (p.ej., ZINECARD®); compuestos de Docetaxel (p.ej., TAXOTERE®); Doxorrubicinas (p.ej., ADRIAMYCIN®, RUBEX®); Liposomales de doxorrubicina, incluyendo inyecciones de liposomas con Doxorrubicina HCL (p.ej., DOXIL®); Propionatos de dromostanolona (p.ej., DROMOSTANOLONE® e inyección de MASTERONE®); Soluciones B de Elliott (p.ej., Elliott's B Solution®); Epirrubicinas (p.ej., ELLENCE®); Epoetinas alfa (p.ej., EPOGEN®); Estramustinas (p.ej., EmCYT®); fosfatos de Etopósido (p.ej., EtOPOPHOS®); Etopósido VP-16 (p.ej., VEPESID®); Exemetanos (p.ej., AROMASIN®); compuestos de Filgrastim (p.ej., NEUPOGEN®); Floxuridinas (p.ej., FUDR®); Fludarabinas (p.ej., FLUDARA®); Fluorouracilo incl. 5-FU (p.ej., ADRUCIL®); compuestos de Fulvestrant (p.ej., FASLODEX®); Gemcitabinas (p.ej., GEMZAR®); Gemtuzumabs/Ozogamicinas (p.ej., MYLOTARG®); Acetatos de goserelina (p.ej., ZOLADEX®); Hidroxiureas (p.ej., HYDREA®); compuestos de Ibritumomab/Tiuxetano (p.ej., ZEVALIN®); Idarrubicinas (p.ej., IDAMYCIN®); Ifosfamidas (p.ej., IFEX®); Mesilatos de imatinib (p.ej., GLEeVeC®); Interferones alfa-2a (p.ej., rOfERON-A®); Interferones alfa-2b (p.ej., INTRON A®); Irinotecanos (p.ej., CAMPtOsAR®); Letrozoles (p.ej., FEMARA®); Leucovorinas (p.ej., wElLCOVORIN®, LEUCOVORIN®); Levamisoles (p.ej., ERGAMISOL®); Lomustinas/CCNU (p.ej., CeeBU®); Mecloretaminas/mostazas nitrogenadas (p.ej., MUSTARGEN®); Acetatos de Megestrol (p.ej., MEGACE®); compuestos de Melfalán/L-PAM (p.ej., ALKERAN®); Mercaptopurina, incluyendo 6-mercaptopurinas (6-MP, por ejemplo, PURINETHOL®); Mesnas (p.ej., MESNEX®); Metotrexatos; Metoxsalenos (p.ej., UVADEX®); Mitomicina C (p.ej., MUTAMYCIN®, MITOZYTREX®); Mitotanos (p.ej., LYSODREN®); Mitoxantronas (p.ej., NOVANTRONE®); Fenpropionatos de nandrolona (p.ej., DURABOLIN-50®); compuestos de Nofetumomab (p.ej., VERLUMA®); Oprelvecinas (p.ej., NEUMEGA®); Oxaliplatinos (p.ej., ELOXATiN®); compuestos de Paclitaxel (p.ej., PAXENE®,
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TAXOL®); Pamidronatos (p.ej., AREDIA®); Pegademasas (p.ej., ADAGEN®); Pegaspargasas (p.ej., ONCASPAR®); compuestos de Pegfilgrastim (p.ej., NEULASTA®); Pentostatinas (p.ej., NIPENT®); Pipobromanos (p.ej., VERCYTE®); Plicamicina/mitramicinas (p.ej., MiThRACIN®); Porfímero sódico (p.ej., PHOTOFRIN®); Procarbazinas (p.ej., MATULANE®); Quinacrinas (p.ej., ATABRINE®); Rasburicasas (p.ej., ELITEK®); Rituximab (p.ej., RITUXAN®); compuestos de Sargramostim (p.ej., PROKINE®); Estreptozocinas (p.ej., ZANOSAR®); Malatos de Sunitinib (p.ej., SUTENT®); Talcos (p.ej., SClErOsOL®); Tamoxifenos (p.ej., NoLvAdEX®); Temozolomidas (p.ej., TEMODAR®); Tenipósidos/VM-26 (p.ej., VUMON®); Testolactonas (p.ej., TESLAC®); Tioguaninas que incluyen, 6-tioguanina (6-TG); Tiotepas (p.ej., THIOPLEX®); Topotecanos (p.ej., HYCAMTIN®); Toremifeno (p.ej., FARESTON®); compuestos de Tositumomab (p.ej., BEXXAR®); Trastuzumab (p.ej., HERCEPTIN®); Tretinoínas/ATRA (p.ej., VESANOID®); Mostaza de Uracilo; Valrubicinas (p.ej., VALSTaR®); Vinblastinas (p.ej., VELBAN®); Vincristinas (p.ej., ONCOVIN®); Vinorelbinas (p.ej., NAVELBINE®); y Zoledronatos (p.ej., ZOMETA®).
En un ejemplo, un agente anti-hialuronano, por ejemplo una enzima que degrada hialuronano, tal como una hialuronidasa modificada, por ejemplo, rHuPH20 PEGilada, se administra a un sujeto después, coincidente con o antes de la administración de uno o más de docetaxel (p.ej., TAXOTERE). ®), doxorrubicina liposomal (p.ej., DOXIL®), Malato de Sunitinib (p.ej., SUTENT®) o Bevacizumab (AVASTIN®). En los métodos descritos en la presente memoria, un glucocorticoide también se administra para mejorar o prevenir efectos secundarios, tales como los efectos secundarios musculoesqueléticos que resultan de o están asociados con la administración del agente anti-hialuronano.
I. EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se incluyen con fines ilustrativos. Los ejemplos 1-7 son Ejemplos de referencia; Los Ejemplos 8-15 son ejemplos de acuerdo con la invención.
Ejemplo 1
Líneas celulares que expresan rHuPH20
A. Generación de una línea celular soluble inicial que expresa rHuPH20
Se transfectaron células de ovario de hámster chino (CHO) con el plásmido HZ24 (expuesto en SEQ ID NO: 52). El vector plásmido HZ24 para la expresión de rHuPH20 soluble contiene un esqueleto de vector pCI (Promega), ADN que codifica los aminoácidos 1-482 de hialuronidasa PH20 humana (SEQ ID NO: 49), un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) del virus ECMV (Clontech) y el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) de ratón. El esqueleto del vector pCI también incluye ADN que codifica el gen de resistencia a betalactamasa (AmpR), un origen de replicación, una región del potenciador/promotor inmediato temprano de citomegalovirus (CMV), un intrón quimérico y una señal de poliadenilación tardía de SV40 (SV40). El ADN que codifica la construcción rHuPH20 soluble contiene un sitio NheI y una secuencia consenso de Kozak antes del ADN que codifica la metionina en la posición 1 de aminoácido de la secuencia señal de 35 aminoácidos nativa de PH20 humana, y un codón de parada después del ADN que codifica la tirosina que corresponde a la posición de aminoácido 482 de la hialuronidasa PH20 humana expuesta en SEQ ID NO: 1), seguido de un sitio de restricción BamHI. La construcción pCI-PH20-IRES-DHFR- SV40pa (HZ24), por lo tanto, da como resultado una única especie de ARNm impulsada por el promotor de CMV que codifica los aminoácidos 1-482 de PH20 humana (expuesto en SEQ ID NO: 3) y los amino ácidos 1-186 de la dihidrofolato reductasa de ratón (expuesta en SEQ ID NO: 53), separados por el sitio interno de entrada al ribosoma (IRES).
Se sembraron células CHO no transfectadas que crecían en medio CD-CHO modificado de GIBCO para células DHFR(-), con un suplemento de Glutamina 4 mM y 18 pL/L de Plurionic F68/L (Gibco), a 0,5 x 106 células/mL en un matraz agitador en preparación para la transfección. Las células se cultivaron a 37°C en 5% de CO2 en una incubadora humidificada, con movimiento oscilante a 120 rpm. Las células CHO no transfectadas en crecimiento exponencial se sometieron a ensayo para determinar su viabilidad antes de la transfección.
Se sedimentaron sesenta millones de células viables del cultivo de células CHO no transfectadas y se
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resuspendieron a una densidad de 2 x 10 células en 0,7 mL de tampón de transfección 2x (2x HeBS: Hepes 40 mM, pH 7,0, NaCl 274 mM, KCl 10 mM, Na2HPO4 1,4 mM, dextrosa 12 mM). A cada alícuota de células resuspendidas, se le añadieron 0,09 mL (250 pg) del plásmido HZ24 lineal (linealizado mediante digestión durante la noche con Cla I (New England Biolabs), y las soluciones de células/ADN se transfirieron a cubetas de electroporación BTX con hueco de 0,4 cm (Gentronics) a temperatura ambiente. Se realizó una electroporación de control negativo sin mezclar ADN plasmídico con las células. Las mezclas de células/plásmidos se sometieron a electroporación con una descarga de condensador de 330 V y 960 pF o a 350 V y 960 pF.
Las células se retiraron de las cubetas después de la electroporación y se transfirieron a 5 mL de medio CD-CHO modificado para células DHFR(-), con un suplemento de Glutamina 4 mM y 18 mL/L de Plurionic F68/L (Gibco), y se
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dejaron crecer en un pocilio de una placa de cultivo de tejido de 6 pocilios sin selección durante 2 días a 37°C en 5% de CO2 en una incubadora humidificada.
Dos días después de la electroporación, se retiraron 0,5 mL de medio de cultivo de tejido de cada pocillo y se analizó la presencia de actividad hialuronidasa utilizando el ensayo de microturbidez descrito en el Ejemplo 4. Las células que expresaban los niveles más altos de actividad hialuronidasa se recogieron del pocillo de cultivo de tejido, se contaron y se diluyeron de 1 x 104 a 2 x 104 células viables por mL. Se transfirió una alícuota de 0,1 mL de la suspensión celular a cada pocillo de cinco placas de cultivo de tejido de fondo redondo de 96 pocillos. Se añadieron cien microlitros de medio Cd-CHO (GIBcO) que contenía suplemento GlutaMAX™-1 4 mM (GIBCO™, Invitrogen Corporation) y sin suplementos de hipoxantina y timidina a los pocillos que contenían células (volumen final 0,2 mL).
Se identificaron diez clones de las 5 placas cultivadas sin metotrexato. Seis de estos clones HZ24 se expandieron en cultivo y se transfirieron a matraces de agitación como suspensiones de células individuales. Los clones 3D3, 3E5, 2G8, 2D9, 1E11 y 4D10 se cultivaron en placa en placas de cultivo de tejido de fondo redondo de 96 pocillos utilizando una estrategia de dilución infinita bidimensional en la que las células se diluyeron 1:2 en la placa y 1:3 en el placa, comenzando en 5000 células en la parte superior izquierda. Los clones diluidos se hicieron crecer en un fondo de 500 células DG44 CHO no transfectadas por pocillo, para proporcionar los factores de crecimiento necesarios para los días iniciales en cultivo. Se prepararon diez placas por subclón, con 5 placas que contenían metotrexato 50 nM y 5 placas sin metotrexato.
El clon 3D3 produjo 24 subclones visuales (13 del tratamiento sin metotrexato y 11 del tratamiento con metotrexato 50 nM). Se midió la actividad de hialuronidasa significativa en los sobrenadantes de 8 de los 24 subclones (> 50 unidades/ml), y estos 8 subclones se expandieron en matraces de cultivo de tejidos T-25. Los clones aislados del protocolo de tratamiento con metotrexato se expandieron en presencia de metotrexato 50 nM. El clon 3D35M se expandió adicionalmente en metotrexato 500 nM en matraces de agitación y dio lugar a clones que producían más de 1.000 Unidades/mL de actividad hialuronidasa (clon 3D35M; o Gen1 3D35M). A continuación se preparó un banco de células maestro (MCB) de las células 3D35M
B. Generación de una línea celular de segunda generación que expresa rHuPH20 soluble
La línea celular Gen1 3D35M descrita en el Ejemplo 1A se adaptó a niveles más altos de metotrexato para producir clones de generación 2 (Gen2). Se sembraron células 3D35M a partir de cultivos establecidos que contenían metotrexato en medio CD CHO que contenía 4 mM de GlutaMAX-1™ y metotrexato 1,0 pM. Las células se adaptaron a un nivel más alto de metotrexato, cultivándolas y pasándolas 9 veces durante un período de 46 días a 37°C, incubadora humidificada con 7% de CO2. La población amplificada de células se clonó mediante dilución limitante en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos que contenían medio con metotrexato 2,0 pM. Después de aproximadamente 4 semanas, se identificaron los clones y se seleccionó el clon 3E10B para la expansión. Se hicieron crecer células 3E10B en medio CD CHO que contenía 4 mM de GlutaMAX-1™ y metotrexato 2,0 pM durante 20 pases. Se creó y congeló un banco de células maestro (MCB) de la línea celular 3E10B y se usó para estudios posteriores.
La amplificación de la línea celular continuó cultivando células 3E10B en medio CD CHO que contenía de GlutaMAX-1™ 4 mM y metotrexato 4,0 pM. Después de los 12° pase, las células se congelaron en viales como banco de células de investigación (RcB). Un vial del RCB se descongeló y cultivó en un medio que contenía metotrexato 8,0 pM. Después de 5 días, la concentración de metotrexato en el medio se aumentó a 16,0 pM, a continuación a 20,0 pM 18 días después. Las células del 8° pase en un medio que contenía 20,0 pM de metotrexato se clonaron mediante dilución limitante en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos que contenían medio CD CHO que contenía GlutaMAX-1™ 4 mM de y metotrexato 20,0 pM. Los clones se identificaron 5-6 semanas después y el clon 2B2 se seleccionó para la expansión en medio que contenía 20,0 pM de metotrexato. Después del pase 11, las células 2B2 se congelaron en viales como un banco de células de investigación (RCB).
Las células 2B2 resultantes son células CHO DG44 deficientes en dihidrofolato reductasa (dhfr-) que expresan PH20 humana recombinante soluble (rHuPH20). La PH20 soluble está presente en células 2B2 con un número de copias de aproximadamente 206 copias/célula. El análisis de transferencia Southern de ADN genómico de células 2B2 digeridas con Spe I, Xba I y BamH l/Hind III utilizando una sonda específica de rHuPH20 reveló el siguiente perfil de restricción de digestión: una banda de hibridación principal de ~7,7 kb y cuatro bandas de hibridación menores (~13,9, ~6,6, ~5,7 y ~4,6 kb) con ADN digerido con Spe l; una banda principal de hibridación de ~5,0 kb y dos bandas de hibridación menores (~13,9 y ~6,5 kb) con ADN digerido con Xba l; y se observó una única banda de hibridación de ~1,4 kb utilizando ADN 2B2 digerido con BamH l/Hind lll. El análisis de secuencia del transcrito de mRNA indicó que el cDNA derivado (SEQ ID NO: 56) era idéntico a la secuencia de referencia (SEQ ID NO: 49) excepto por una diferencia de pares de bases en la posición 1131, que se observó que era una timidina (T) en lugar de la citosina esperada (C). Esta es una mutación silenciosa, sin efecto en la secuencia de aminoácidos.
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Ejemplo 2
Producción y purificación de rHuPH20
A. Producción de rHuPH20 soluble en Gen2 en cultivo celular de biorreactor de 300 L
Un vial de células HZ24-2B2 (Ejemplo 1B) se descongeló y se expandió a partir de matraces de agitación a través de matraces con agitador de 36L en medio CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) con un suplemento de metotrexato 20 pM y GlutaMAX-1™ (Invitrogen). Brevemente, se descongeló un vial de células en un baño de agua a 37°C, se añadieron los medios y las células se centrifugaron. Las células se resuspendieron en un matraz de agitación de 125 mL con 20 mL de medio de nueva aportación y se colocaron a 37°C, incubadora con 7% de CO2. Las células se expandieron hasta 40 mL en el matraz de agitación de 125 mL. Cuando la densidad celular alcanzó más de 1,5 x 106 células/mL, el cultivo se expandió en un matraz giratorio de 125 mL en un volumen de cultivo de 100 mL. El matraz se incubó a 37°C, 7% de CO2. Cuando la densidad celular alcanzó más de 1,5 x 106células/mL, el cultivo se expandió en un matraz giratorio de 250 mL en un volumen de cultivo de 200 mL, y el matraz se incubó a 37°C, 7% de CO2. Cuando la densidad celular alcanzó más de 1,5 x 106 células/mL, el cultivo se expandió en un matraz giratorio de 1 L en un volumen de cultivo de 800 mL y se incubó a 37°C, 7% de CO2. Cuando la densidad celular alcanzó más de 1,5 x 106 células/mL el cultivo se expandió en un matraz giratorio de 6 L en 5000 mL de volumen de cultivo y se incubó a 37°C, 7% de CO2. Cuando la densidad celular alcanzó más de 1,5 x 106 células/mL, el cultivo se expandió en un matraz giratorio de 36 L en un volumen de cultivo de 32 L y se incubó a 37°C, 7% de CO2.
Se esterilizó un reactor de 400 L y se añadieron 230 mL de medio CD-CHO. Antes del uso, se verificó la contaminación del reactor. Se transfirieron aproximadamente 30 células L desde los matraces giratorios de 36 L al biorreactor de 400 L (Braun) a una densidad de inoculación de 4,0 x 105 células viables por mL y un volumen total de 260L. Los parámetros fueron punto de ajuste de la temperatura, 37°C; Velocidad del Impulsor 40-55 RPM; Presión del Vaso: 0,069 bar; Inyección de Aire 0,5-1,5 L/Min.; Capa superior de aire: 3 L/min. Se tomaron muestras del reactor diariamente para recuentos de células, verificación de pH, análisis de medios, producción y retención de proteínas. Asimismo, durante el ciclo se añadieron alimentaciones de nutrientes. A las 120 h (día 5), se añadieron 10,4 L de Medio de Alimentación Núm. 1 (4 x CD-CHO + 33 g/l de glucosa + 160 mL/l de Glutamax-1™ + 83 mL/l de yeastolato + 33 mg/l de rHuinsulina). A las 168 horas (día 7), se añadieron 10,8 L de la Alimentación Núm. 2 (2 x CD-CHO + 33 g/L de glucosa + 80 mL/L de Glutamax-1™ + 167 mL/L de Yeastolato + 0,92 g/L de butirato de sodio), y la temperatura de cultivo se cambió a 36,5°C. A las 216 horas (día 9), se añadieron 10,8 L de la Alimentación Núm. 3 (1 x CD-CHO + 50 g/L de Glucosa + 50 mL/L de Glutamax-1™ + 250 mL/L de Yeastolato + 1,80 g/L de Butirato de Sodio), y la temperatura de cultivo se cambió a 36°C. A las 264 horas (día 11), se añadieron 10,8 L de la Alimentación Núm. 4 (1 x CD-CHO + 33 g/L de glucosa + 33 mL/L Glutamax-1™ + 250 mL/L de Yeastolato + 0,92 g/l de butirato de sodio) y la temperatura de cultivo se cambió a 35,5°C. Se observó que la adición del medio de alimentación mejoraba drásticamente la producción de rHuPH20 soluble en las etapas finales de producción. El reactor se cosechó a los 14 o 15 días o cuando la viabilidad de las células cayó por debajo del 40%. El procedimiento dio como resultado una productividad final de 17.000 Unidades por mL con una densidad celular máxima de 12 millones de células/mL. En la cosecha, se tomaron muestras del cultivo para determinar micoplasma, carga biológica, endotoxinas y virus in vitro e in vivo, Microscopía electrónica de transmisión (TEM) y actividad enzimática.
El cultivo se bombeó con una bomba peristáltica a través de cuatro módulos del sistema de filtración Millistak (Millipore) en paralelo, cada uno con una capa de tierra de diatomeas graduada a 4-8 pm y una capa de tierra de diatomeas graduada a 1,4-1, 1 pm, seguido por una membrana de celulosa, luego a través de un segundo sistema de filtración Millistak (Millipore) que contenía una capa de tierra de diatomeas graduada a 0,4-0,11 pm y una capa de tierra de diatomeas graduada a <0,1 pm, seguido por una membrana de celulosa, y a continuación a través de un filtro final de 0,22 pm en una bolsa flexible estéril de un solo uso con una capacidad de 350 L. Al fluido de cultivo celular cosechado se le añadió un suplemento de EDTA 10 mM y Tris 10 mM a un pH de 7,5. El cultivo se concentró 10 veces con un aparato de filtración de flujo tangencial (TFF) utilizando cuatro filtros de poliéter sulfona (PES) de corte de peso molecular (MWCO) de 30 kDa Sartoslice TFF (Sartorius), seguido de un intercambio de tampón 10X con Tris 10 mM, Na2SO4 20 mM, pH 7,5 en un filtro final de 0,22 pm en una bolsa de almacenamiento estéril de 50 L.
Se inactivaron los virus de la cosecha concentrada y sometida a diafiltración. Antes de la inactivación viral, se preparó una solución de Triton X-100 al 10%, fosfato de tri(n-butilo) (TNBP) al 3%. La cosecha concentrada, sometida a diafiltración se expuso a Triton X-100 al 1%, TNBP al 0,3% durante 1 hora en un recipiente de reacción de vidrio de 36 L inmediatamente antes de la purificación en la columna Q.
B. Purificación de rhuPH20 soluble en Gen2
Se preparó una columna de intercambio iónico Q Sepharose (Pharmacia) (9 L de resina, H = 29 cm, D = 20 cm). Se tomaron muestras de lavado para la determinación del pH, la conductividad y el ensayo de endotoxina (LAL). La columna se equilibró con 5 volúmenes de columna de Tris 10 mM, Na2SO4 20 mM, pH 7,5. Después de la
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inactivación viral, la cosecha concentrada, sometida a diafiltración (Ejemplo 2A) se cargó en la columna Q a una velocidad de flujo de 100 cm/h. La columna se lavó con 5 volúmenes de columna de Tris 10 mM, Na2SO4 20 mM, pH 7,5 y Hepes 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7,0. La proteína se eluyó con Hepes 10 mM, NaCl 400 mM, pH 7,0 en un filtro final de 0,22 pm en una bolsa estéril. La muestra de eluato se sometió a ensayo para determinar la carga biológica, la concentración de proteína y la actividad hialuronidasa. Se tomaron lecturas de absorbancia A280 al comienzo y al final del intercambio.
A continuación se realizó la cromatografía de interacción hidrófoba en Fenil-Sefarosa (Pharmacia). Se preparó una columna de fenil-Sefarosa (PS) (19-21 L de resina, H = 29 cm, D = 30 cm). El lavado se recogió y se tomaron muestras para determinar el pH, la conductividad y las endotoxinas (ensayo LAL). La columna se equilibró con 5 volúmenes de columna de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M, CaCl2 0,1 mM, pH 7,0. Al producto eluido de proteína de la columna de Q sepharose se le añadió un suplemento de soluciones de partida de sulfato de amonio 2 M, fosfato de potasio 1 M y CaCh 1 M para producir concentraciones finales de 5 mM, 0,5 M y 0,1 mM, respectivamente. La proteína se cargó en la columna PS a una velocidad de flujo de 100 cm/h y se recogió el flujo continuo de la columna. La columna se lavó con fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M y CaCl2 0,1 mM, pH 7,0 a 100 cm/h, y el lavado se añadió al flujo continuo recogido. Combinado con el lavado de la columna, el flujo continuo se pasó a través de un filtro final de 0,22 pm a una bolsa estéril. Se tomaron muestras del flujo para determinar carga biológica, la concentración de proteína y la actividad enzimática.
Se preparó una columna de aminofenilboronato (ProMedics). El lavado se recogió y se tomaron muestras para determinar el pH, la conductividad y las endotoxina (ensayo LAL). La columna se equilibró con 5 volúmenes de columna de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M. El flujo continuo de Ps que contenía la proteína purificada se cargó en la columna de aminofenilboronato a una velocidad de flujo de 100 cm/h. La columna se lavó con fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 7,0. La columna se lavó con 20 mM de bicina, 0,5 M de sulfato de amonio, pH 9,0. La columna se lavó con 20 mM de bicina, 100 mM de cloruro de sodio, pH 9,0. La proteína se eluyó con Hepes 50 mM, NaCl 100 mM, pH 6,9 y se pasó a través de un filtro estéril a una bolsa estéril. La muestra eluida se analizó para determinar la carga biológica, la concentración de proteína y la actividad enzimática.
Se preparó la columna de hidroxiapatita (HAP) (Biorad). El lavado se recolectó y se sometió a ensayo para determinar el pH, la conductividad y la endotoxina (ensayo LAL). La columna se equilibró con fosfato de potasio 5 mM, NaCl 100 mM, CaCh 0,1 mM, pH 7.0. A la proteína purificada con aminofenil-boronato se le añadió un suplemento de concentraciones finales de fosfato de potasio 5 mM y CaCh 0,1 mM y se cargó en la columna HAP a una velocidad de flujo de 100 cm/h. La columna se lavó con fosfato de potasio 5 mM, pH 7, NaCl 100 mM, CaCl2 0,1 mM. La columna se lavó seguidamente con fosfato de potasio 10 mM, pH 7, NaCl 100 mM, CaCh 0,1 mM. La proteína se eluyó con fosfato de potasio 70 mM, pH 7,0 y se pasó a través de un filtro estéril de 0,22 pm a una bolsa estéril. La muestra eluida se analizó para determinar la carga biológica, la concentración de proteína y la actividad de la enzima.
La proteína HAP purificada se pasó a continuación a través de un filtro de eliminación viral. El filtro de Viosart esterilizado (Sartorius) se preparó primero lavando con 2 L de fosfato de potasio 70 mM, pH 7,0. Antes del uso, se tomaron muestras del tampón filtrado para determinar el pH y la conductividad. La proteína purificada HAP se bombeó por medio de una bomba peristáltica a través del filtro de eliminación viral 20 nM. La proteína filtrada en fosfato de potasio 70 mM, pH 7,0 se pasó a través de un filtro final de 0,22 pm a una bolsa estéril. La muestra filtrada viral se sometió a ensayo para determinar el perfil de concentración de proteína, actividad enzimática, oligosacáridos, monosacáridos y ácido siálico. La muestra también se sometió a ensayo para determinar las impurezas relacionadas con el procedimiento.
Ejemplo 3
Preparación de rHuPH20 PEGilada
En este ejemplo, la rHuPH20 se PEGiló mediante reacción de la enzima con éster de N-hidroxisuccinimidilo lineal de ácido metoxipoli(etilenglicol) butanoico (mPEG-SBA-30K).
A. Preparación de mPEG-SBA-30K
Para generar PEGPH20, se conjugó covalentemente rHuPH20 (que tiene un tamaño de aproximadamente 60 KDa) con un éster de N-hidroxisuccinimidilo lineal de ácido metoxipoli(etilenglicol)butanoico (mPEG-SBA-30K), que tiene un peso molecular aproximado de 30 kDa. La estructura de mPEG-SBA se muestra a continuación, donde n “ 681.
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Los métodos utilizados para preparar el mPEG-SBA-30K que se utilizó para PEGilar la rHuPH20 se describen, por ejemplo, en Patente de Estados Unidos Núm. 5.672.662. En resumen, el mPEG-SBA-30K se prepara de acuerdo con el siguiente procedimiento:
Se añade gota a gota una solución de malonato de etilo (2 equivalentes) disuelto en dioxano a hidruro de sodio (2 equivalentes) y tolueno bajo una atmósfera de nitrógeno. El mPEG metanosulfonato (1 equivalente, PM 30 kDa, Shearwater) se disuelve en tolueno y se añade a la mezcla anterior. La mezcla resultante se pone a reflujo durante aproximadamente 18 horas. La mezcla de reacción se concentra a la mitad de su volumen original, se extrae con una solución acuosa de NaCl al 10%, se extrae con ácido clorhídrico acuoso al 1% y los extractos acuosos se combinan. Las capas acuosas recogidas se extraen con diclorometano (3x) y la capa orgánica se seca con sulfato de magnesio, se filtra y se evapora a sequedad. El residuo resultante se disuelve en hidróxido de sodio 1N que contiene cloruro de sodio y la mezcla se agita durante 1 hora. El pH de la mezcla se ajusta a aproximadamente 3 mediante adición de ácido clorhídrico 6N. La mezcla se extrae con diclorometano (2x).
La capa orgánica se seca sobre sulfato de magnesio, se filtra, se concentra y se vierte en éter dietílico frío. El precipitado se recoge mediante filtración y se seca al vacío. El compuesto resultante se disuelve en dioxano y se somete a reflujo durante 8 horas y a continuación se concentra hasta sequedad. El residuo resultante se disuelve en agua y se extrae con diclorometano (2x), se seca sobre sulfato de magnesio y la solución se concentra por evaporación rotativa y a continuación se vierte en éter dietílico frío. El precipitado se recoge mediante filtración y se seca al vacío. El compuesto resultante (1 equivalente) se disuelve en diclorometano y se añade N-hidroxisuccinimida (2,1 equivalentes). La solución se enfría a 0°C y se añade gota a gota una solución de diciclohexilcarbodiimida (2,1 equivalentes) en diclorometano. La solución se agita a temperatura ambiente durante aproximadamente 18 horas. La mezcla de reacción se filtra, concentra y precipita en éter dietílico. El precipitado se recoge mediante filtración y se seca a vacío para proporcionar el polvo mPEG-SBA-30K que a continuación se congela a < -15°C.
B. Conjugación de mPEG-SBA-30K a rHuPH20
Para preparar la PEGPH20, el mPEG-SBA-30K se acopló al grupo o grupos amino de rHuPH20 por conjugación covalente, proporcionando enlaces amida estables entre rHuPH20 y mPEG, como se muestra a continuación, donde n =681.
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+ H2N—rHuPH20
O
H
H3CO—^CH2CH20j-CH2CH2CH2C—N—rHuPH20
n
rHuPH2 PEGilada
Antes de la conjugación, la proteína en masa purificada rHuPH20 preparada en el Ejemplo 2B se concentró a 10 mg/mL, utilizando casetes de filtración de flujo tangencial (TFF) de polietersulfona (PES) de 10 kDa (Sartorius) con un área de filtración de 0,2 m2, y tampón se cambió frente fosfato de potasio 70 mM a pH 7,2. La proteína
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concentrada se almacenó a continuación a 2-8°C hasta su uso.
Para conjugar la rHuPH20, el mPEG-SBA-30K (Nektar) se descongeló a temperatura ambiente en la oscuridad durante no más de 2 horas. Dependiendo del tamaño del lote, se colocó una barra de agitación estéril de 7,62 cm en un matraz Erlenmeyer de 1 o 3 litros y se añadió proteína rHuPH20 con intercambio de tampón. Se añadieron 5 gramos de polvo de mPEG-SBA-30K seco por gramo de rHuPH20 (razón molar 10:1 de mPEG-SBA-30K:rHuPH20) en el matraz bajo una campana de vacío y la mezcla se mezcló durante 10 minutos o hasta que se disolvió por completo el mPEG-SBA-30K. La velocidad de agitación se ajustó de manera que se produjera agitación vorticial sin formación de espuma.
La solución se filtró bajo una campana de clase 100 bombeando la solución, a través de una bomba peristáltica, a través de una cápsula de filtro de poliestireno y acetato de celulosa de 0,22 pm (filtro Tubetop de 50 mL Corning) en un nuevo matraz Erlenmeyer de 1 o 3 litros que contenía una barra de agitación estéril de 7,62 cm. El volumen de la mezcla de reacción de PEGPH20 se determinó en masa (densidad de 1 g/ml) y el filtro de 0,22 pm utilizado para la filtración se examinó en una prueba de integridad posterior al uso.
La mezcla se colocó en una placa de agitación a 2-8°C y se mezcló durante 20 ± 1 horas en la oscuridad. La velocidad de agitación se ajustó de nuevo de manera que se produjera agitación vorticial sin formación de espuma. Todo el contenedor de Erlenmeyer se envolvió en papel de aluminio para proteger la solución de la luz. Después de mezclar, la reacción se inactivó mediante la adición de glicina 1 M a una concentración final de 25 mM. Las muestras se eliminaron del recipiente para someter a ensayo el pH y la conductividad. El pH y la conductividad se ajustaron a continuación mediante la adición a una solución de Tris Base 5 mM (5,65 L/L) y Tris 5 mM, NaCl 10 mM, pH 8,0 (13,35 L/L) para proceder a la purificación con Q Sepharose.
Se preparó una columna de intercambio iónico QFF Sepharose (GE Healthcare) (Altura = 21,5-24,0 cm, Diámetro = 20 cm) equilibrando con 5 volúmenes de columna (36 L) de Tris 5 mM, NaCl 10 mM, pH 8,0. El producto congugado se cargó en la columna QFF a una velocidad de flujo de 95 cm/h. La columna se lavó a continuación con 11 L de tampón de equilibrado (Tris 5 mM, NaCl 10 mM, pH 8,0) a una velocidad de flujo de 95 cm/h seguido de un lavado con 25 L de tampón de equilibrado a una velocidad de flujo de 268 cm/hora. El producto proteico se eluyó a continuación con Tris 5 mM, NaCl 130 mM, pH 8,0 a una velocidad de flujo de 268 cm/h. El PEGPH20 purificado resultante se concentró a 3,5 mg/mL, utilizando casetes de filtración de flujo tangencial (TFF) de polietersulfona (PES) de 30 kDa (Sartorius) con un área de filtración de 0,2 m2, y el tampón se intercambió por Histidina 10 mM, NaCl 130 mM a pH 6,5. El material resultante se sometió a ensayo para determinar la actividad enzimática como se describe en el Ejemplo 4 a continuación. El material rHuPH20 PEGilado a una concentración de 3,5 mg/mL (actividad enzimática final 140.000 U/ml) se cargó, en volúmenes de 3 mL, en viales de vidrio de 5 mL con un tapón de caucho de bromobutilo siliconado y sello de aluminio desprendible, y se congeló (congelado durante la noche en un congelador a -20°C, a continuación se colocó en un congelador a -80°C para un almacenamiento más prolongado). La rHuHP20 PEGilada contenía aproximadamente 4,5 moles de PEG por mol de rHuPH20.
Ejemplo 4
Determinación de la actividad hialuronidasa de rHuPH20 soluble
La actividad hialuronidasa de rHuPH20 soluble en muestras tales como cultivos celulares, plasma, fracciones de purificación y soluciones purificadas se determinó utilizando un ensayo turbidimétrico, que se basa en la formación de un precipitado insoluble cuando el ácido hialurónico se une con albúmina sérica, o un sustrato de ensayo de ácido hialurónico biotinilado, que mide la cantidad de rHuPH20 o PEGPH20 enzimáticamente activa mediante la digestión del sustrato de ácido hialurónico biotinilado (b-HA) unido no covalentemente a placas de microtitulación de plástico de múltiples pocillos.
A. Ensayo de microturbidez
La actividad de hialuronidasa de rHuPH20 soluble se mide incubando rHuPH20 soluble con hialuronato de sodio (ácido hialurónico) durante un período de tiempo determinado (10 minutos) y a continuación precipitando el hialuronato de sodio no digerido con la adición de albúmina de suero acidulada. La turbidez de la muestra resultante se mide a 640 nm después de un período de desarrollo de 30 minutos. La disminución de la turbidez resultante de la actividad enzimática en el sustrato de hialuronato de sodio es una medida de la actividad hialuronidasa de rHuPH20 soluble. El método se realiza utilizando una curva de calibración generada con diluciones de un patrón de referencia de trabajo de ensayo de rHuPH20 soluble, y las mediciones de la actividad de la muestra se realizan en relación con esta curva de calibración.
Las diluciones de la muestra se prepararon en Soluciones Diluyentes Enzimáticas. La Solución Diluyente Enzimática se preparó disolviendo 33,0 ± 0,05 mg de gelatina hidrolizada en 25,0 mL del tampón de reacción PIPES 50 mM (NaCl 140 mM, PIPES 50 mM, pH 5,5) y 25,0 mL de agua estéril para inyectables (SWFI), y diluyendo 0,2 mL de
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solución de Buminate al 25% en la mezcla y agitando a vórtice durante 30 segundos. Esto se realizó en el plazo de las 2 horas posteriores al uso y se almacenó en hielo hasta que fue necesario. Las muestras se diluyeron a un 1-2 U/mL estimadas. Generalmente, la dilución máxima por etapa no excedió de 1:100 y el tamaño de muestra inicial para la primera dilución no fue inferior a 20 pL. Los volúmenes mínimos de muestra necesarios para realizar el ensayo fueron los siguientes: Muestras en proceso, Fracciones de FPLC: 80 pL; Sobrenadantes de cultivo de tejido: 1 ml; Material concentrado: 80 pL; Material Purificado o Etapa Final: 80 pL. Las diluciones se realizaron por triplicado en una placa de 96 pocillos de baja unión a proteína, y 30 pl de cada dilución se transfirieron a placas de fondo negro/transparente Optilux (BD BioSciences).
Se prepararon diluciones de rHuPH20 soluble conocida con una concentración de 2,5 U/mL en Solución Diluyente Enzimática para generar una curva patrón y se añadieron a la placa Optilux por triplicado. Las diluciones incluyeron 0 U/mL, 0,25 U/mL, 0,5 U/mL, 1,0 U/mL, 1,5 U/mL, 2,0 U/mL y 2,5 U/mL. Los pocillos de "blanco reactivo" que contenían 60 pl de solución de diluyente enzimático se incluyeron en la placa como control negativo. La placa se cubrió y se calentó en un bloque de calor durante 5 minutos a 37°C. La cubierta se retiró y la placa se sacudió durante 10 segundos. Después de sacudir, la placa se devolvió al bloque de calor y se preparó el Dispositivo de Manejo de Líquidos MULTIDROP 384 con la solución de hialuronato sódico tibio de 0,25 mg/mL (preparada disolviendo 100 mg de hialuronato sódico (LifeCore Biomedical) en 20,0 mL de SWFI. Se mezcló girando y/o balanceando suavemente a 2-8°C durante 2-4 horas, o hasta que se disolvió por completo). La placa de reacción se transfirió a MULTIDROP 384 y la reacción se inició presionando la tecla de inicio para dispensar 30 pL de hialuronato sódico en cada pocillo. A continuación se retiró la placa del MULTIDROP 384 y se sacudión durante 10 segundos antes de ser transferida a un bloque de calor con la cubierta de la placa reemplazada. La placa se incubó a 37°C durante 10 minutos.
El MULTIDROP 384 se preparó para detener la reacción cebando la máquina con la Solución de trabajo en suero y cambiando la configuración del volumen a 240 pL. (25 mL de Solución de Partida de Suero [1 volumen de Suero de Caballo (Sigma) se diluyó con 9 volúmenes de solución de tampón de acetato 500 mM y el pH se ajustó a 3,1 con ácido clorhídrico] en 75 mL de solución de tampón de acetato 500 mM) . La placa se retiró del bloque de calor y se colocó en el MULTIDROP 384, y se dispensaron 240 pL de Soluciones de Trabajo de suero a los pocillos. La placa se retiró y se agitó en un lector de placas durante 10 segundos. Después de otros 15 minutos, se midió la turbidez de las muestras a 640 nm y se determinó la actividad de hialuronidasa (en U/ml) de cada muestra mediante el ajuste a la curva patrón.
La actividad específica (unidades/mg) se calculó dividiendo la actividad hialuronidasa (U/ml) por la concentración de proteína (mg/ml).
B. Ensayo de hialuronano biotinilado
El ensayo de ácido hialurónico biotinilado mide la cantidad de rHuPH20 o PEGPH20 enzimáticamente activas en muestras biológicas mediante la digestión de un sustrato de ácido hialurónico biotinilado (b-HA) de gran peso molecular (~1,2 megadaltons) unido no covalentemente a placas de microtitulación de múltiples pocillos de plástico. La rHuPH20 o PEGPH20 en los patrones y las muestras se dejan incubando en una placa recubierta con b-HA a 37°C. Después de una serie de lavados, el b-HA no escindido/unido se trata con producto conjugado de estreptavidina con peroxidasa de rábano picante (SA-HRP). La reacción entre SA-HRP inmovilizada y el sustrato cromogénico, 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB), produce una solución de color azul. Después de detener la reacción con ácido, la formación del producto de reacción soluble de color amarillo se determina leyendo la absorbancia a 450 nm utilizando un espectrofotómetro de placa de microtitulación. La disminución de la absorbancia a 450 nm resultante de la actividad enzimática en el sustrato de ácido hialurónico biotinilado (b-HA) es una medida de la actividad de hialuronidasa de rHuPH20 soluble. El método se realiza utilizando una curva de calibración generada con diluciones de un patrón de referencia de rHuPH20 o PEGPH20 solubles, y las mediciones de la actividad de la muestra se realizan en relación con esta curva de calibración.
Se prepararon diluciones de la muestra y el calibrador en Diluyente de Ensayo. El Diluyente de Ensayo se preparó añadiendo plasma reunido al 1% v/v (de la especie apropiada) a BSA al 0,1% (p/v) en HEPES, pH 7,4. Esto se preparó diariamente y se almacenó a 2-8°C. Dependiendo del tipo de especie y del nivel de hialuronidasa previsto, se prepararon diluciones únicas o múltiples para asegurar que al menos una dilución de muestra cayera dentro del intervalo de la curva de calibración. Para guiar la selección de la dilución o diluciones de la muestra de prueba, se utilizó información conocida sobre la dosis de hialuronidasa administrada, la vía de administración, el volumen plasmático aproximado de la especie y el punto temporal para estimar los niveles de actividad de hialuronidasa. Cada dilución de muestra se mezcló ya que se preparó mediante agitación vorticial de pulso breve y las puntas de pipeta se cambiaron entre cada dilución. En general, las diluciones comenzaron con una dilución inicial de 50 o 100 veces seguida de diluciones seriadas adicionales. Se preparó una curva de calibración de siete puntos de rHuPH20 o PEGPH20 (dependiendo del tratamiento administrado) que variaba en una concentración de 0,004 a 3,0 U/mL para rHuPH20 y de 0,037 a 27 U/mL para PEGPH20. Se aplicaron cien microlitros (100 pL) de cada dilución de muestra de prueba y punto de la curva de calibración a pocillos por triplicado de una placa de microtitulación de 96
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pocilios (Immulon 4HBX, Thermo) que se había recubierto previamente con 100 pL por pocilio de b-HA a 0,1 mg/mL y bloqueado con 250 pL de albúmina de suero bovino al 1,0% (p/v) en PBS. La placa o placas se cubrieron con un precinto de sello adhesivo y se incubaron a 37°C durante aproximadamente 90 minutos. Al final del período de incubación, el sello adhesivo se retiró de la placa, las muestras se aspiraron y la placa se lavó cinco (5) veces con 300 pL por pocillo de Tampón de lavado (Tampón de fosfato 10 mM, Cloruro de potasio 2,7 mM, Cloruro de Sodio 137 mM, pH 7,4, con Tween 20 al 0,05% (v/v), PBST) utilizando un lavador de placas automatizado (BioTek ELx405 Select CW, Programa '4HBX1'). Se añadieron por pocillo 100 microlitros de solución de trabajo de producto conjugado de estreptavidina-HRP [producto conjugado de estreptavidina-HRP (1:5.000 v/v) en Tris-HCl 20 mM, cloruro sódico137 mM, Tween 20 al 0,025% (v/v), albúmina de suero bovino al 0,1% (p/v). La placa se selló y se dejó incubando a temperatura ambiente durante aproximadamente 60 minutos sin sacudirla y protegida de la luz. Al final del período de incubación, el sello adhesivo se retiró de la placa, las muestras se aspiraron y la placa se lavó cinco (5) veces con 300 pL por pocillo de Tampón de Lavado como se describió anteriormente. Se añadió solución de TMB (a temperatura ambiente) a cada pocillo y se dejó incubando protegida de la luz durante aproximadamente cinco (5) minutos a temperatura ambiente. Se añadió después solución de parada de TMB (KPL, Núm. de Catálogo 50-85-06) como 100 pL por pocillo. La absorbancia de cada pocillo a 450 nm se determinó utilizando un espectrofotómetro de placa de microtitulación. La respuesta de la Curva de Calibración en cada placa se modeló utilizando un ajuste de curva logístico de 4 parámetros. La actividad de hialuronidasa de cada muestra desconocida se calculó mediante la interpolación de la curva de calibración, se corrigió el factor de dilución de la muestra y se informó en U/mL.
Ejemplo 5
Inmunoensayo electroquimioluminiscente para la detección de anticuerpos anti-rHuPH20 en plasma
En este ejemplo, se midió la presencia de anticuerpos en plasma o suero producidos contra la porción de aminoácidos de PEGPH20 utilizando un ensayo de formación de puentes electroquimioluminiscentes (ECL) (véase Mire-Sluis et al., Journal of Immunological Methods 289: 1-16, 2004).
A. Descripción del ensayo
El método se realizó típicamente en tres Niveles. En el Nivel 1, se realizó un escrutinio inicial en las muestras que se iban a someter a ensayo. Las muestras que arrojaron valores de ECL por encima de un punto de corte determinado matemáticamente se analizaron en el Nivel 2, mientras que se informó que las muestras que no arrojaron valores de ECL por encima del punto de corte eran negativas para los anticuerpos anti-rHuPH20. Los ensayos de Nivel 2 confirmaron los resultados positivos del Nivel 1 utilizando una rHuPH20 no incluida como inhibidor competitivo y los ensayos de Nivel 3 se utilizaron para confirmar a qué dilución de la muestra la respuesta permanece por encima del punto de corte. Las evaluaciones de nivel 1 y nivel 2 se pueden realizar al mismo tiempo.
B. Preparación de controles
Se generó una provisión de partida de anticuerpo policlonal de conejo anti-rHuPH20 de 1 mg/mL diluyendo 100 pl de un anticuerpo policlonal de conejo anti-rHuPH20 de 2,45 mg/mL en 145 pl de Tampón de Bloqueo StartingBlock T20 (TBS) (Thermo, Núm. de catálogo 37543). Esta provisión de partida se mezcló completamente y posteriormente se utilizó para generar una segunda provisión de partida (100 pg/ml) diluyendo 100 pl del anticuerpo policlonal de conejo anti-rHuPH20 de 1 mg/mL en 900 pl de tampón de bloqueo StartingBlock T20 (TBS) (Thermo, Núm. de catálogo 37543). A continuación, se usó la provisión de partida de trabajo de 100 pg/mL para generar controles positivos bajos, medios y altos como se describe en la Tabla 5 a continuación. La Reserva de Base negativa utilizada fue plasma K3-EDTA humano (Bioreclamation, Núm. de catálogo HMPLEDTA). El diluyente fue Tampón StartingBlock. El control negativo es el plasma humano de la Reserva de Base negativa solo (sin adición). Se utilizaron las muestras iniciales de cada perro como control para las muestras post-exposición a PEGPH20.
Tabla 5. Controles positivos y negativos para el ensayo anti-rHuPH20
Concentración Nominal (ng/mL)
Concentración de la Provisión de Partida de Trabajo (ng/mL) Volumen de la Provisión de Partida (HL) Volumen de Plasma (mL) Volumen Total (mL)
1.000 (Alto)
100.000 200 19,8 20
500 (Medio)
100.000 100 19,9 20
250 (Bajo)
100.000 50 19,95 20
0 (Negativo)
0 0 20 20
Se pipetearon los controles Alto, Medio, Bajo y Negativo en alícuotas de 100 pl y se almacenaron a -70°C hasta su
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uso (durante hasta 1 año a partir de la fecha de preparación).
C. Ensayo de Nivel 1
Se recogieron muestras de suero sanguíneo para determinar la presencia de anticuerpos anti-rHuPH20 y se almacenaron congeladas a -70°C hasta su uso. El día de la prueba de la muestra, las muestras de control alto, medio, bajo y negativo (Ejemplo 5B) se retiraron del almacenamiento y se descongelaron junto con las muestras de ensayo a temperatura ambiente, en hielo o a 2-8°C hasta que se descongelaron. Las muestras de prueba y las muestras de control se mezclaron suavemente y cada una se diluyó 1:100 en tampón de bloqueo StartingBlock T20 (TBS) (Thermo, Núm. de catálogo 37543) para un total de 200 pl por muestra.
Se preparó una solución separada 10 mL que contenía 250 ng/mL de rHuPH20-Bt (Hialuronidasa Humana Recombinante-Biotinilada, Millipore, solicitud especial) y 250 ng/mL de rHuPH20-Rt (Hialuronidasa Humana Recombinante-Rutenio, Millipore, solicitud especial) en Tampón de Bloqueo StartingBlock T20 (TBS). La solución se mezcló suavemente y se añadieron 200 pl a cada uno de los tubos de muestra y muestra de control de 200 pl. Los tubos se sometieron a agitación vorticial suavemente (Vortex Genie, Scientific Industries, Núm. de catálogo 14-96126), se sellaron y se incubaron durante la noche durante 16-24 horas a 2-8°C con balanceo suave (Heidolph Rocking Platform Shaker, Núm. de Modelo Polymax 2040), protegido de la luz.
Durante la incubación, se bloqueó una Placa con Recubrimiento de Estreptavidina Convencional MA2400 96 (Meso Scale Discovery, Núm. de catálogo L15SA) con 300 pl/pocillo de Tampón de Bloqueo StartingBlock (TBS) (Thermo, Núm. de catálogo 37542) durante 1-4 horas a temperatura ambiente con sacudimiento suave. Después de completar el bloqueo, el Tampón de Bloqueo StartingBlock (TBS) se eliminó mediante aspiración y la placa se lavó 3 veces con 300 pl/pocillo de tampón de lavado TBS-T (Tris 25 mM, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Tween al 0,05%, pH 7,4 ± 0,1 a temperatura ambiente) en una Lavadora de Placas Automática Bio-Tek (Núm. de Modelo ELx405).
Después de aspirar el tampón de lavado, se añadieron 100 pl/pocillo de cada muestra y la muestra de control (cada muestra por duplicado) a un pocillo de la placa recubierta con estreptavidina y se selló con un sellador de placa opaco (VWR International, Núm. de catálogo 14230-062). Se dejó que avanzara la unión durante 30 ± 3 minutos a temperatura ambiente con sacudimiento suave, protegida de la luz.
Durante la incubación de 30 minutos, se preparó una solución 1X de 20 mL de Tampón de Lectura T con Tensioactivo (4X Tampón de Lectura, Meso Scale Discovery, Núm. de catálogo R92TC) con agua ultrapura. Cuando se completó el período de incubación de la muestra, la solución de muestra se aspiró de la placa (Lavadora de Placas Automática Bio-Tek, altura del Producto Aspirado 3,048 mm, Posición horizontal del Producto Aspirado 1,372 mm, Velocidad de Flujo del Producto Aspirado 3,0 mm/seg) y la placa se lavó 3 veces en una Lavadora de Placas Automática Bio-Tek con 300 pl/pocillo de tampón de lavado TBS-T (Velocidad de Flujo de Dispensación caudal de distribución 5, Altura de Dispensación 15,24 mm). A continuación, se añadió Tampón de Lectura T con tensioactivo (1X) a cada pocillo de la placa (150 pl/pocillo). A los 30 minutos de agregar el Tampón de lectura T, la placa se leyó en un Meso Scale Discovery Sector Imager 2400. Se recogieron datos (unidades de electroquimioluminiscencia) del Sector Imager 2400 utilizando el soporte lógico Meso Scale Discovery (Gaithersburg, MD).
(i) Validación de datos
Un ensayo se definió como muestras analizadas juntas en una placa. Se realizaron un mínimo de 3 controles negativos (distribuidos uno cerca de la parte anterior de la placa, uno cerca del centro de la placa y uno cerca de la parte posterior de la placa, o dos cerca de la parte anterior de la placa y dos cerca de la parte posterior la placa) y se realizaron 2 controles positivos para cada concentración (alta, media, baja, uno cerca de la parte anterior de la placa y uno cerca de la parte posterior de la placa).
Las especificaciones de idoneidad del sistema para cada ensayo se establecieron y documentaron en una "Hoja de Resumen del Método de Prueba". Un ensayo fue aceptable en los ensayos de Nivel 1 si 1) El coeficiente de variación (% CV) de la respuesta (unidades ECL) de las réplicas para los controles fue < 20,0% (solo si el valor de respuesta fue > 50 unidades ECL); 2) Los valores de respuesta de ECL para > 66,0% de los controles positivos estuvieron dentro de ± 50% del valor de respuesta de ECL esperado o el intervalo de aceptación asignado como se especifica en la Hoja de Resumen del Método de Prueba; 3) El valor medio de respuesta ECL para al menos un control positivo estaba dentro de ± 50% del valor esperado de respuesta ECL o el intervalo de aceptación asignado como se especifica en la Hoja Resumen del Método de Prueba en cada nivel de concentración (es decir, controles bajo, medio, alto) ; 4) El valor medio de respuesta ECL para al menos un control positivo estaba dentro de ± 50% del valor esperado de respuesta ECL o el intervalo de aceptación asignado como se especifica en la Hoja Resumen de Método de Prueba en cada conjunto (parte anterior o posterior de la placa) de los controles; 5) El valor medio de respuesta de ECL para los controles negativos estuvo dentro del intervalo de aceptación asignado como se especifica en la Hoja de resumen del método de prueba; y 6) Los valores de respuesta de ECL para > 66,0% de los controles negativos estuvieron dentro del intervalo de aceptación asignado como se especifica en la Hoja de
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Resumen del Método de Prueba.
Un ensayo fue aceptable en los ensayos de Nivel 2 si además de los criterios anteriores para los ensayos de Nivel 1, el ensayo también cumplía los siguientes criterios: 1) El porcentaje de inhibición para los controles positivos era > 50,0% para al menos 50,0% de los controles positivos en cada concentración; 2) El porcentaje de inhibición para los controles positivos fue > 50,0% para al menos 50,0% de los controles positivos en cada conjunto (parte anterior frente a parte posterior de la placa); y 3) El porcentaje de inhibición fue > 50,0% para > 75,0% de todos los controles positivos.
Una muestra del estudio se volvió a analizar por cualquiera de las siguientes razones: 1) Un mal funcionamiento del equipo; 2) La muestra de prueba se perdió durante el procesamiento analítico; 3) El % CV entre los valores replicados de ECL fue > 20,0% (Este criterio no se aplicaba si las respuestas ECL de ambas repeticiones de la muestra estaban por debajo del punto de corte del ensayo o si las respuestas ECL de ambas repeticiones de la muestra estaban por encima del punto de corte del ensayo. Además, este criterio no se aplicó si la diferencia entre las respuestas eCl replicadas era < 50 unidades ECL); 4) El valor promedio de ECL de una muestra fue > el punto de corte del ensayo en la prueba de Nivel 1. La muestra se consideraría como supuesta positiva y se enviaría para pruebas de Nivel 2, a menos que se realizaran pruebas de Nivel 2 al mismo tiempo; y 5) Se descubrió un problema documentado asociado con el manejo de la muestra del estudio.
(ii) Análisis de datos
Se ejecutó un mínimo de 3 controles negativos en cada nivel. Los valores individuales para el control negativo se utilizaron para calcular el "punto de corte flotante". El "punto de corte flotante" se calculó a partir de cada placa multiplicando el valor medio geométrico de los 3 controles negativos por un factor de normalización constante de 1,14 (derivado de un análisis paramétrico de los datos de validación). Este punto de corte flotante tenía un valor máximo según lo determinado por la "Hoja de Información del Ensayo del Método de Prueba". Si el punto de corte calculado fue mayor que el punto de corte máximo indicado en la "Hoja de información del Ensayo del Método de Prueba", se utilizaron las unidades ECL máximas como punto de corte (se evalúa el valor máximo de ECL para cada lote de Reserva de Base negativa).
Basándose en el punto de corte, se evaluó cada muestra. Se informó de que las muestras con un valor medio de ECL menor que el punto de corte eran negativas para los anticuerpos contra rHuPH20. Las muestras con un valor medio de ECL mayor o igual que el punto de corte se clasificaron como "Supuestas Positivas" y se sometieron a la prueba de Nivel 2 (que se puede realizar al mismo tiempo). Se informó de que las muestras con un valor de ECL medio mayor o igual al punto de corte pero con un volumen de muestra insuficiente para permitir la prueba de Nivel 2 eran "Supuestas Positivas" y no se volvieron a someter a ensayo.
D. Ensayo de Nivel 2
Cada muestra que se identificó como supuesta positiva en el Nivel 1, se sometió a ensayo de Nivel 2. La prueba de Nivel 2 examinó la capacidad de un exceso no marcado de rHuPH20 para inhibir la supuesta unión del anticuerpo a la rHuPH20 marcada.
La prueba de Nivel 2 se llevó a cabo esencialmente como para la prueba de Nivel 1 (Ejemplo 5C) excepto para la dilución de muestra inicial de 1:100 en el Tampón de Bloqueo StartingBlock T20 (TBS). En el Nivel 2, cada muestra y muestra de control se diluyeron 1:100 en Tampón de Bloqueo StartingBlock T20 (TBS) (Thermo, catálogo Núm. 37543) para un total de 200 pL y también se diluyó 1:100 en Tampón de Bloqueo StartingBlock T20 (TBS) que contenía 10 pg/mL de rHuPH20 (creada como una mezcla maestra de 8 mL de tampón de bloqueo StartingBlock T20 (TBS) con rHuPH20 a una concentración 10 pg/ml) para un total de 200 pL.
Después de leer la placa como en el Ejemplo 5C, el porcentaje de inhibición se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación: Inhibición Porcentual = (Valor ECL medio de la muestra no inhibida) menos (valor ECL medio de la muestra inhibida) dividido por (valor ECL medio de la muestra no inhibida) multiplicado por 100. Cualquier muestra que se confirme que tiene una inhibición de 50% o superior se consideró "Positiva para el Anticuerpo" y se sometió a la prueba de Nivel 3. Se informó de que las muestras con menos de 50% de inhibición eran "Negativas para el Anticuerpo". Se informó de que las muestras con 50% o más de inhibición pero con una muestra insuficiente para continuar al Nivel 3 eran "Positivas para el Anticuerpo" pero no se sometieron a ensayo en el Nivel 3.
E. Ensayo de nivel 3
Cada muestra que se identificó como "Anticuerpo Positivo" en el Nivel 2, se envió para titulación en el Nivel 3. La valoración del Nivel 3 y las pruebas se llevaron a cabo esencialmente como para el Nivel 1 (Ejemplo 5C) excepto que las muestras se diluyeron en StartingBlock T20 (TBS) inicialmente 1:100 y a continuación se diluyeron seriadamente en plasma normal (como se utiliza para el control negativo; Reserva de Base Negativa).
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Después de las etapas de dilución, cada una de las diluciones se diluyó adicionalmente 1:100 en Tampón de Bloqueo StartingBlock T20 (TBS) (como en el ejemplo 5C) para generar la dilución de ensayo final. El ensayo se llevó a cabo a continuación como para el Nivel 1.
Después de leer la placa, se determinó el título (la dilución de muestra más alta) que arrojó un valor medio de ECL por encima del punto de corte del ensayo. Se informó de que las valoraciones que tenían al menos una dilución con un valor medio de ECL > el punto de corte y un valor < el punto de corte eran "Positivas para el Anticuerpo" y se informó de que el título era la dilución final donde el valor de ECL estaba por encima del punto de corte. Se informó de que las valoraciones con todas las diluciones con un valor de ECL medio > el punto de corte eran "Positivas para el Anticuerpo" y se sometieron e ensayo diluciones adicionales. Se informó de que las valoraciones en las que solo la dilución original 1:100 (como en el Nivel 1) tenían un valor ECL medio > el punto de corte eran "Positivas para el Anticuerpo -1:5".
Ejemplo 6
Efecto de PH20 en los Efectos Musculoesqueléticos
A. Mono Cynomolgus
Este ejemplo describe las observaciones musculoesqueléticas que se observaron en un estudio de toxicidad de dosis repetidas de 4 semanas realizado en monos cynomolgus después de la administración IV de PEGPH20. Cuatro grupos de monos (6 animales por género, con la excepción del grupo que recibió 0,2 mg/kg/dosis de PEGPH20, que fue de 4 animales por género) recibieron dosis IV dos veces por semana del vehículo, 0,2, 2,0 o 10,5 mg/kg/dosis de PEGPH20, respectivamente, durante 4 semanas consecutivas. La administración IV dos veces por semana fue bien tolerada en monos, sin embargo, se observaron cambios en las articulaciones de las extremidades. Los monos exhibieron una disminución relacionada con la dosis de la amplitud de movimiento en la rodilla y el codo, que mostró una recuperación parcial o total después del cese de la dosificación. Además, hubo una disminución moderada en la masa de los tejidos blandos (músculo esquelético) en un solo animal a dosis altas observada mediante examen radiológico. Esto es compatible con el efecto farmacológico de PEGPH20 para eliminar el hialuronano (HA) y su agua extracelular asociada de los tejidos. No hubo cambios histopatológicos asociados (cartílagos, tendones, ligamentos) de la articulación de la rodilla o del músculo esquelético, ni hallazgos radiográficos anormales de la articulación de la rodilla, aunque la amplitud de movimiento fue limitado. Estas observaciones indican que la administración de PEGPH20 puede inducir o producir efectos musculoesqueléticos transitorios.
B. Seres Humanos
Este Ejemplo describe los resultados de un estudio clínico (Fase 1-101), que evalúa la dosificación creciente de PEGPH20 en pacientes para mantener los niveles elevados de enzimas en plasma y limitar el retorno del sustrato de HA. La mediana de edad de los pacientes fue de 61 años (intervalo 56-86) con tipos de tumores que incluyen histiocitoma, colorrectal, pancreático, de vejiga, carcinoide y ovárico. En todos los casos, los pacientes ingresaron al programa bajo medicación para el dolor relacionada con su afección de presentación, pero no para el dolor relacionado con el fármaco del estudio.
1. Dosis Intravenosa (IV) Única de 0,05 mg/kg de PEGPH20
Inicialmente, a dos pacientes se les administró una sola dosis intravenosa (IV) de 0,05 mg/kg de PEGPH20. Este ejemplo describe que ambos pacientes experimentaron rigidez y dolor muscular y articular severo con un inicio de aproximadamente 6-10 horas después de la dosificación. El dolor duró más de 9 días y los pacientes experimentaron rigidez, dolor muscular y articular y debilidad que interferían con las actividades de la vida diaria.
El primer paciente recibió una dosis intravenosa (IV) de 4,6 mg (0,05 mg/kg) de PEGPH20 (masa del paciente de 92 kg). Aproximadamente 10 horas después de la dosis, el paciente informó de dolor bilateral de cadera, dificultad para caminar y dolor de garganta moderadamente grave. El paciente discontinuó el estudio después de la dosis única. El día 2, el paciente informó de que no podía levantarse de la cama debido a dolor muscular y articular y rigidez en las extremidades superiores e inferiores. Las extremidades superiores se podían mover, con las articulaciones del codo y la muñeca capaces de flexionarse y extenderse, sin embargo, las rodillas estaban rígidas y no podían extenderse por completo. La gravedad del dolor muscular/articular fue de Grado 3. En el transcurso de 3 semanas, el paciente mostró una mejora lenta pero constante de los efectos musculoesqueléticos.
El segundo paciente recibió una dosis IV de 4,9 mg (0,05 mg/kg) de PEGPH20 IV (masa del paciente de 98 kg). Entre 4 y 8 horas después de la dosis, el paciente informó de dolor musculoesquelético. El paciente discontinuó el estudio después de la dosis única. El día 2, la paciente informó de un dolor profundo, inicialmente en las rodillas, pero también en todos los músculos y huesos y dolor de garganta. La gravedad del dolor muscular/articular fue de Grado 3. Para el día 5, el paciente informó que se sentía mejor y, para el día 9, el paciente informó de que el dolor
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musculoesquelético había mejorado sustancialmente.
Las muestras de plasma del paciente también se analizaron utilizando un perfil de analito múltiple (MAP) de inflamación humana de 46 diferentes citocinas, quimiocinas, reactivos de fase aguda y otros biomarcadores inflamatorios de plasma humanos. No se observaron hallazgos notables en las dos primeras muestras de pacientes, descartando inflamación general o daño muscular.
2. Dosis Intravenosa (IV) dos Veces por Semana de PEGPH20 a 0,5 pg/kg
Dada la gravedad de los síntomas de los dos primeros pacientes, a un tercer paciente se le administró una dosis de 0,0005 mg/kg (0,5 pg/kg) dos veces a la semana. El día 1, este paciente recibió una dosis IV de 0,06155 mg de PEGPH20. El día 3, el paciente experimentó durante uno a dos minutos, un calambre de resolución espontánea en la pantorrilla derecha. El paciente recibió la segunda dosis IV de 0,06155 mg de PEGPH20 el día 4. El día 5, el paciente informó de calambres musculares repetidos en sus pies, pantorrillas y muslos, que duraron aproximadamente de tres a cuatro minutos y ocurrieron aproximadamente de seis a ocho veces a lo largo del día. Los calambres fueron acompañados por malestar muscular y sensibilidad en todo el cuerpo, pero sin participación articular. El paciente era ambulatorio pero rígido. La gravedad del dolor muscular/articular fue de Grado 3. Debido a estos efectos musculoesqueléticos, el paciente alcanzó la toxicidad limitante de la dosis y no recibió más dosis de PEGPH20. La sensibilidad muscular se resolvió el día 21 y los calambres musculares el día 43.
También se midieron los niveles de la enzima hialuronidasa y los niveles de catabolito de HA como se indicó anteriormente en el Ejemplo 6B.1. Un resumen de los niveles enzimáticos medios y los catabolitos de HA después de la administración de 0,5 pg/kg de PEGPH20 también se expone en el Ejemplo 12.
3. Dosis Intravenosa (IV) Única de 0,5 pg/kg de PEGPH20 Cada 21 días
Tres pacientes adicionales también fueron tratados con una dosis IV de 0,5 pg/kg de PEGPH20 cada 21 días. Dos de los pacientes recibieron una segunda dosis de 0,5 pg/kg de PEGPH20, 21 días después de la primera dosis. Solo se observan efectos secundarios musculoesqueléticos intermitentes de Grado 1 o transitorio de Grado 2 en todos los pacientes. No se produjeron toxicidades limitantes de dosis (TLD) en esta cohorte de dosis. Sin embargo, todos los pacientes abandonaron debido a la progresión de la enfermedad.
También se midieron los niveles de la enzima hialuronidasa y los niveles de catabolito HA como se indicó anteriormente en el Ejemplo 6B.1. Un resumen de los niveles enzimáticos medios y los catabolitos HA después de la dosificación con 0,5 pg/kg de PEGPH20 también se expone en el Ejemplo 12.
4. Dosis intravenosa (IV) única de 0,75 pg/kg de PEGPH20 cada 21 días
Dada la atenuación de los efectos musculoesqueléticos a la dosis IV de 0,5 pg/kg de PEGPH20 cada 21 días, la dosis de PEGPH20 aumentó. Posteriormente, a cuatro pacientes se les administró una dosis IV de 0,75 pg/kg de PEGPH20 cada 21 días, y el régimen de dosificación en esta cohorte incluyó hasta tres dosis a este nivel de dosis. En general, solo se observan efectos secundarios musculoesqueléticos intermitentes de Grado 1 o transitorio de Grado 2. Todos los pacientes abandonaron debido a la progresión de la enfermedad. Un resumen de los resultados de cada uno de los pacientes es el siguiente:
El primero de los pacientes tenía adenocarcinoma de páncreas moderadamente diferenciado y sufrió un dolor musculoesquelético de Grado 1 dos días después del primer ciclo 2 dosis. La gravedad del evento aumentó a Grado 3 después 10 días. Esto no se consideró una toxicidad limitante de la dosis, ya que se produjo después del primer ciclo. El evento duró un total de 14 días (10 días en el Grado 1 y cuatro días en el Grado 3) y se resolvió. Este paciente fue retirado después de dos ciclos debido a la progresión de la enfermedad.
El segundo paciente de la cohorte tenía un tumor carcinoide mesentérico del intestino delgado y sufrió calambres en la mano del Grado 1 siete días después de la dosis del Ciclo 1. El paciente discontinuó debido a la progresión de la enfermedad.
El tercer paciente tenía adenocarcinoma de ovario y experimentó un evento adverso Grado 2 de dolor óseo (sacro, esternón y rodillas) y dolores musculares el mismo día que la dosis del ciclo 1. Los dolores musculares se resolvieron después 10 días, y el dolor óseo disminuyó de gravedad a Grado 1 después 10 días adicionales y se resolvió después de un total de 49 días. Ese paciente discontinuó debido a la progresión de la enfermedad después de tres ciclos. En este paciente, se midió el antígeno-125 de cáncer (CA-125), que es una proteína que se encuentra en células de cáncer de ovario a niveles que son elevados en comparación con las células normales. En particular, CA-125 disminuyó de 103 U/mL (ciclo 1 día 1) a 64 U/mL (ciclo 1 día 15). En el ciclo 3, día 1, que fue el último valor registrado, CA125 fue de 116,4 U/mL.
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El cuarto paciente tenía adenocarcinoma de colon y recibió un total de dos ciclos. Los espasmos musculares de grado 1 se produjeron en la parte superior de la espalda dos días después de la primera dosis y duraron un día. La rigidez bilateral de manos, rodillas y hombros de Grado 1 se produjo nueve días después de la segunda dosis.
Los niveles de enzima hialuronidasa y los niveles de catabolito de HA también se midieron como se indicó anteriormente en el Ejemplo 6B.1. Un resumen de los niveles enzimáticos medios y los catabolitos de HA después de la administración de dosis de 0,75 pg/kg de PEGPH20 también se expone en el Ejemplo 12.
5. Dosis Intravenosa (IV) Única de 1,0 pg/kg de PEGPH20 cada 21 días
La dosis de PEGPH20 aumentó 33% y a tres pacientes se les administró una dosis IV de 1,0 pg/kg de PEGPH20
cada 21 días. Dos de los pacientes tenían adenocarcinoma de próstata y un paciente tenía cáncer de pulmón de células no pequeñas [CPCNP]. No se informó sobre toxicidades limitantes de dosis (TLD). Solo uno de los pacientes informó sobre síntomas musculoesqueléticos, que se clasificaron como espasmos musculares intermitentes de Grado 1 (costillas, pies, pantorrillas), dolor articular intermitente y dolor costal. Todos los síntomas comenzaron uno o tres días después de la dosis del ciclo 1. El dolor de costillas se resolvió después de nueve días, el espasmo muscular se resolvió después de 43 a 44 días y el dolor de cadera se resolvió después de 45 días.
6. Dosis intravenosa (IV) única de 1,5 pg/kg de PEGPH20 cada 21 días
Un paciente con adenocarcinoma de próstata recibió una dosis IV de 1,5 pg/kg de PEGPH20 cada 21 días. No se informó sobre toxicidades limitantes de dosis (TLD).
7. Compendio
De los 14 pacientes tratados, 3 abandonaron debido a eventos adversos: uno recibió 50,0 pg/kg dos veces por semana debido a un dolor musculoesquelético de grado 4, uno recibió 50,0 pg/kg dos veces por semana debido al dolor musculoesquelético de grado 3 y uno recibió 0,5 pg/kg en un ciclo de 21 días debido al dolor musculoesquelético de Grado 3. Un paciente, que recibió 0,5 pg/kg en un ciclo de 21 días, completó dos ciclos de terapia y a continuación se suspendió debido a la progresión de la enfermedad. Todos los demás pacientes abandonaron debido a la progresión de la enfermedad.
Ejemplo 7
Efecto de PEGPH20 sobre los Efectos Musculoesqueléticos en Perros Beagle
A. Estudio de Tolerabilidad e Intervalo de Dosis Farmacocinética en Perros Beagle
A la luz de las observaciones musculoesqueléticas en monos y seres humanos en respuesta a PEGPH20 IV, se buscó un modelo no clínico para estos efectos musculoesqueléticos. Debido a su temperamento dócil y facilidad de manejo para procedimientos y evaluaciones, se evaluaron perros Beagle (BioTox Sciences Contract Research Organization, San Diego, CA utilizando perros de colonia BioTox Sciences que se originaron en Marshall Farms USA, Inc., North Rose, NY) por su capacidad de modelar síntomas musculoesqueléticos similares a los observados en seres humanos, en respuesta a la administración de PEGPH20. Se evaluó un estudio de tolerabilidad y farmacocinética de dosis únicas intravenosas de PEGPH20 en perros Beagle. Se realizó un estudio de búsqueda de intervalo de dosis para evaluar las dosis intravenosas (IV) de PEGPH20 de 3040 a 47500 Unidades/kg (0,08 a 1,25 mg/kg).
El día 1, se administró a un perro beagle macho una inyección en embolada de 5 mL mediante punción con aguja percutánea de la vena cefálica con PEGPH20 a la dosis inicial de 3040 Unidades/kg (0,08 mg/kg). El perro parecía normal hasta el día 2 cuando se observó una reducción de la movilidad (reducción de la capacidad para caminar o pararse) y rigidez de los músculos del cuello, la espalda y las extremidades a la palpación. A las 48 horas de la dosis, la movilidad del animal había mejorado y en el día 3, el animal exhibió una recuperación casi completa. En base a estas observaciones de respuestas musculoesqueléticas severas a PEGPH20, se detuvo el estudio de aumento de la dosis.
B. Respuesta Musculoesquelética a PEGPH20 IV en Perros Beagle
Para confirmar y evaluar mejor la respuesta musculoesquelética a PEGPH20, se administró a dos perros Beagle macho 80 pg/kg (3040 U/kg) de PEGPH20, dos por vía intravenosa (IV) y uno por vía subcutánea (SC) y se observaron visualmente las respuestas musculoesqueléticas (Tabla 6). Se administró PEGPH20 como una inyección en embolada de 5 mL/animal IV o SC. La administración intravenosa se realizó mediante punción percutánea con aguja de la vena cefálica, mientras que la administración SC se realizó mediante punción percutánea con aguja en la región dorsal posterior, cerca de los hombros. A las 23 horas de la dosis (día 2), los tres perros exhibieron reducción
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de la movilidad (reducción de la capacidad para caminar o pararse), disminución de la actividad general y rigidez muscular en el cuello, la espalda y las extremidades a la palpación. Para el día 4, cada una de las respuestas musculoesqueléticas se había resuelto.
Tabla 6. Programa de Administración IV de Dosis Única de PEGPH20
Día de estudio
Dosis [Unidades/kg (mg/kg)]
PERRO 989
PERRO 153 PERRO 288
(Dosis IV)
(Dosis de SC)
(Dosis IV)
1
3040 U/kg 3040 U/kg 3040 U/kg
(0,08 mg/kg) (0,08 mg/kg) (0,08 mg/kg)
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3
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Este estudio confirmó los hallazgos musculoesqueléticos del estudio descrito en el Ejemplo 7A y estableció el perro Beagle como un modelo no clínico para los efectos musculoesqueléticos mediados por PEGPH20 similares a los observados en seres humanos.
C. Administración Repetida de PEGPH20 en perros Beagle
Para investigar la viabilidad de la administración repetida de PEGPH20 para acondicionar perros para tolerar dosis posteriores de PEGPH20, a los tres perros a los que se administraron las dosis en el Ejemplo 7B se les volvieron a administrar las dosis por vía IV, a través de la vena cefálica o por vía subcutánea (SC) mediante punción percutánea con aguja en la región posterior dorsal cerca del hombros con dosis diarias crecientes de PEGPH20 de 1520 a 60800 Unidades/kg (0,04 a 1,6 mg/kg) de acuerdo con el programa mostrado en la Tabla 7.
Tabla 7. Programa de Administración Repetida de PEGPH20 con Dosis Crecientes de PEGPH20
Día de estudio
Dosis [Unidades/kg (mg/kg)]
PERRO 989
PERRO 153 PERRO 288
(Dosis IV)
(Dosis de SC)
(Dosis IV)
4
1520 (0,04) 1520 (0,04) 1520 (0,04)
5
2280 (0,06) 2280 (0,06) 2280 (0,06)
6
3040 (0,08) 3040 (0,08) 3040 (0,08)
7
3800 (0,1) 3800 (0,1) 3800 (0,1)
8
7600 (0,2) 7600 (0,2) 7600 (0,2)
9
15200 (0,4) 15200 (0,4) 15200 (0,4)
10
22800 (0,6) 22800 (0,6) 22800 (0,6)
11
30400 (0,8) 30400 (0,8) 30400 (0,8)
12
60800 (1,6) 60800 (1,6) 60800 (1,6)
Los días 4 a 6, los tres perros exhibieron respuestas musculoesqueléticas a PEGPH20, incluyendo reducción de la movilidad (reducción de la capacidad para caminar o pararse), disminución general de la actividad y rigidez muscular en el cuello, la espalda y las extremidades a la palpación. Si bien el inicio de las respuestas musculoesqueléticas los días 4 a 6 fue más rápido (unas pocas horas) que las respuestas musculoesqueléticas observadas el día 1 (23 horas), la gravedad de las respuestas disminuyó del día 4 al día 6. Además, la recuperación de las respuestas también fue más rápida los días 4 a 6 (hasta 12 horas) que la observada el día 1 (2 días). No se observaron respuestas musculoesqueléticas en los tres perros del día 7 al día 9. El día 12, un perro que había recibido dosis IV (perro 288), exhibió movilidad reducida 2 horas después de la dosis de 60800 unidades/kg (1,6 mg/kg) con recuperación completa en el plazo de las 10 horas posteriores a la dosis. Este mismo perro también exhibió arcadas después de la dosis en el día 10 y arcadas y vómitos el día 11 y el día 12.
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D. Efecto de la Inmunogenicidad de PEGPH20 en Perros Beagle
Se examinó la dosificación repetida múltiple después de una interrupción en la dosificación en los tres perros Beagle macho del Ejemplo 7C anterior. El día 17, 26 o 33, un perro recibió 3040 unidades/kg (0,08 mg/kg) de PEGPH20 por vía intravenosa con una inyección en embolada de 5 mL mediante punción con aguja percutánea de la vena cefálica de acuerdo con el programa de la Tabla 8.
Tabla 8. Programa de Dosificación de PEGPH20
Día de estudio
Dosis [Unidades/kg (mg/kg)]
PERRO 989
PERRO 153 PERRO 288
17
3040 (0,08)
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3040 (0,08)
33
3040 (0,08)
Inmediatamente después de la dosis, se observó que cada uno de los tres perros experimentaba una reacción sistémica de tipo anafilactoide. Las reacciones incluyeron micción, defecación, disminución de la actividad física, dificultad para caminar, arcadas y/o vómitos, y aumento de la frecuencia y profundidad respiratoria. La recuperación marcada ocurrió en el plazo de 10 a 25 minutos con recuperación completa en el plazo de las 24 horas posteriores a la dosis. No se observaron cambios adicionales en la movilidad, actividad o tono muscular de los animales en ningún punto temporal posterior a la dosis (los animales se observaron dos veces al día hasta el siguiente evento de dosificación).
Debido a la posibilidad de que las reacciones indicadas anteriormente fueran causadas por una respuesta inmunológica a PEGPH20 (una proteína humana) administrada, se sometieron a ensayo los sueros de los sangrados previos a las dosis el Día 17, 26 o 33, y de los sangrados de los tres perros el día 51, para determinar la reactividad a la hialuronidasa humana recombinante (rHuPH20) para establecer si los perros habían armado una respuesta inmunitaria humoral a PEGPH20.
Los días 17, 26 o 33, se extrajo sangre antes de la administración de la dosis (pero después de los 12 días de la exposición creciente a PEGPH20 del Día 1 al Día 12), del perro que se debía tratar ese día. También se extrajo sangre de los tres perros el día 51. Se analizó el suero aislado de la sangre para determinar la presencia de anticuerpos anti-rHuPH20 como se describe en el Ejemplo 5 anterior. Los resultados del ensayo se muestran en la Tabla 9. Estos resultados confirman que los tres perros armaron una fuerte respuesta de anticuerpos frente al componente de proteína, rHuPH20, de PEGPH20, lo que indica que PEGPH20 es inmunogénica en perros Beagle. Este hallazgo no es inesperado ya que el componente de proteína de PEGPH20 es una proteína humana.
Tabla 9. Anticuerpos séricos anti-rHuPH20 después de repetir la dosificación en perros Beagle
Núm. ID de animal
Valor de Referencia (Día 1 predosis) Post-Exposición a PEGPH20 (Días Variables) Post-Exposición a PEGPH20 (Día 51)
989
No detectado Día 17: 1:25.000 1:125.000
153
No detectado Día 26: 1:625.000 1:125.000
288
No detectado Día 33: 1:1.953.125.000 1:78,125.000
Para examinar si la respuesta de anticuerpos en perros Beagle conduce a un aclaramiento o neutralización potencial de la PEGPH20 administrada, se examinó la capacidad de la re-dosificación de PEGPH20 para reducir el hialuronano del músculo esquelético.
Los mismos tres perros (989, 153 y 288) se trataron con una dosis IV de 3040 unidades/kg (0,08 mg/kg) de PEGPH20 el Día 59. Inmediatamente después de la dosis, un animal (perro núm. 288) exhibió arcadas con un recuperación por 5 minutos. No se observaron efectos musculoesqueléticos en ningún punto temporal posterior.
Veinticuatro horas después de la dosis (Día 60), se tomaron biopsias de músculo esquelético de cada uno de los tres perros tratados y también de un perro Beagle de control no tratado. Los músculos semitendinoso medial/membranoso medial fueron seleccionados para las biopsias. El área de la biopsia se rasuró con tijeras eléctricas y se frotó con soluciones de Clorhexidina o Povidona-Yodo. Se inyectó bupivacaína o lidocaína (2 - 3 mg/kg) por vía subcutánea (SC) en el área de la biopsia para la analgesia local. La biopsia muscular se recolectó utilizando una aguja de biopsia de 2 mm de diámetro. Se aplicó una esponja de gasa con ligera presión para detener
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cualquier sangrado. Se inyectaron SC 0,2 mg/kg de Metacam (meloxicam) para controlar el dolor. Las muestras de biopsia se colocaron en tubos Eppendorf o equivalentes con aproximadamente 200 pL de formalina tamponada neutra (NBF) al 10%.
Las muestras de tejidos obtenidas de las biopsias se tiñeron para determinar el HA tisular utilizando un método de tinción histoquímica altamente específico. Utilizando este método, las biopsias de tejidos fijadas en NBF al 10% durante 48 horas, se incluyeron en parafina, se seccionaron y se sondearon para determinar HA utilizando una proteína de unión a HA biotinilada (HABP; Seikagaku, Japón), a continuación se sondearon con estreptavidina marcada con FITC (Vector Labs, Canadá) para la detección. Los núcleos celulares se contratiñeron con reactivo DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol). A continuación se tomaron micrografías utilizando un microscopio Zeiss (Thornwood, NY) junto con el programa de imágenes Spot (Diagnostic Instruments, Inc).
La expresión de hialuronano en las secciones se evaluó visualmente mediante el nivel de intensidad de fluorescencia verde presente. La tinción con hialuronano de la matriz pericelular de muestras de músculo esquelético tomadas de los tres animales tratados con PEGPH20 fue virtualmente la misma tinción de alta intensidad que la tinción con hialuronano en muestras de tejido de animales de control no tratados que revelan que el tratamiento con PEGPH20 en estos animales no eliminó hialuronano extracelular en muestras de músculo esquelético. Esto indica que los anticuerpos anti-rHuPH20 en suero generados en los perros Beagle en respuesta a la administración repetida de PEGPH20, probablemente poseían actividad de neutralización de PH20.
Ejemplo 8
Efecto de la Dexametasona sobre PEGPH20 en Perros Beagle
El perro Beagle fue identificado como una especie que exhibe observaciones musculoesqueléticas similares, en términos de su presentación y el momento de inicio y resolución, a los referidos en seres humanos, en respuesta a la administración de PEGPH20. Por lo tanto, el perro Beagle fue explorado adicionalmente como un modelo de las respuestas musculoesqueléticas humanas a PEGPH20 y como un modelo para examinar el tratamiento de los síntomas.
A. Régimen de Premedicación para la Dexametasona
Se llevaron a cabo estudios para optimizar el régimen de premedicación para la dexametasona.
En un estudio, cuatro perros Beagle macho no sometidos a tratamiento previo recibieron dosis oral de 4 mg/dosis de dexametasona dos veces al día el día de la administración de PEGPH20. La primera dosis de dexametasona se administró por vía oral (PO) inmediatamente antes de la administración intravenosa (IV) de PEGPH20. La segunda dosis de dexametasona se administró por vía oral aproximadamente 8 horas después. El día 1, se administraron a un perro 3040 U/kg (0,08 mg/kg) de PEGPH20 después de la Dexametasona. Veinticuatro horas más tarde (día 2), se administraron a un segundo perro 5700 U/kg (0,15 mg/kg) de PEGPH20 después de la Dexametasona. Veinticuatro horas más tarde (día 3), se administraron a un tercer perro 11400 U/kg (0,3 mg/kg) de PEGPH20 después de la Dexametasona. Veinticuatro horas más tarde (día 4), se administraron a un cuarto perro 38000 U/kg (1,0 mg/kg) de PEGPH20 después de la Dexametasona. La sangre se recogió antes de la administración de PEGPH20, y 0,5 h, 4 h y 24 h después de la administración de PEGPH20. Se observaron los efectos musculoesqueléticos en los animales antes de la dosis y 0,5, 4, 8 y 24 horas después de la dosis. Ninguno de los 4 perros desarrolló respuestas musculoesqueléticas a PEGPH20 a ningún nivel de dosis en ninguno de los puntos temporales evaluados, lo que indica que la premedicación con dexametasona bloqueó el desarrollo de los efectos musculoesqueléticos de PEGPH20.
B. Efecto de la Dexametasona en las Observaciones Musculoesqueléticas Inducidas por PEGPH20
La capacidad de la dexametasona para mejorar los efectos musculoesqueléticos de PEGPH20 se confirmó en un estudio farmacológico adicional. Los cuatro grupos de tratamiento (cada uno con 3 perros Beagle) y los días de tratamiento se muestran en la Tabla 10 a continuación. La PEGPH20 se administró por vía intravenosa con una inyección en embolada de 5 mL mediante punción con aguja percutánea de la vena cefálica los días 1, 2 y/o 5. La dexametasona se administró por vía oral inmediatamente antes de la inyección de PEGPH20 y aproximadamente 8 horas después de la inyección. A todos los animales se les volvió a administrar la dosis 3 días después de la primera inyección excepto aquellos del grupo de tratamiento con PEGPH20 sola, a los que no se les volvió a admistrar la dosis.
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Tabla 10. Diseño del Estudio del Régimen de Premedicación con Dexametasona
Grupo de tratamiento
Núm. de perros Medicamento Recibido el Día de Estudio Indicado
1
2 4 5
Control de Vehículo
3 Control de vehículo (Tampón API) Control de vehículo (Tampón API)
PEGPH20 solo
3 PEGPH20 (0,3 mg/kg)
PEGPH20 (baja) + Dexametasona
3 PEGPH20 (0,3 mg/kg) + Dexametasona (4 mg antes de PEGPH20 y 4 mg, 8 horas después de PEGPH20) PEGPH20 (0,3 mg/kg) + Dexametasona (4 mg antes de PEGPH20 y 4 mg, 8 horas después de PEGPH20)
PEGPH20 (alta) + Dexametasona
3 PEGPH20 (1,0 mg/kg) + Dexametasona (4 mg antes de PEGPH20 y 4 mg, 8 horas después de PEGPH20) PEGPH20 (1,0 mg/kg) + Dexametasona (4 mg antes de PEGPH20 y 4 mg, 8 horas después de PEGPH20)
Los perros fueron observados para determinar la respuesta musculoesquelética a PEGPH20 inmediatamente después del tratamiento con la primera dosis de PEGPH20 y también a las 0,5, 2, 4, 7, 10, 12, 16, 20, 24, 48 y 72 horas después de la dosis. Después de la segunda dosis, los animales se observaron a las 0,5, 2, 4, 7, 10, 12, 16, 20, 24, 48, 72, 96 y 120 horas después de la segunda dosis. Los animales tratados con una sola dosis de PEGPH20 se evaluaron a las 96 horas, 120 horas, 6, 7, 8 y 9 días después de la dosis.
Los perros Beagle a los que se les administró PEGPH20 (11400 Unidades/kg; 0,3 mg/kg) mostraron observaciones musculoesqueléticas de moderadas a severas caracterizadas por reducción de la movilidad (reducción de la capacidad para caminar o pararse), disminución general de la actividad y rigidez muscular del cuello, espalda y extremidades a la palpación. En general, la aparición de estas observaciones musculoesqueléticas se observó por primera vez aproximadamente 10 horas después de la dosis de PEGPH20, aumentó gradualmente de gravedad entre 12-20 horas después de la dosis de PEGPH20 y posteriormente se resolvió completamente aproximadamente 72 horas después de la dosis de PEGPH20. El pretratamiento con dexametasona mejoró estos síntomas musculoesqueléticos en perros a los que se administraron dosis de PEGPH20 a 0,3 mg/kg o 1,0 mg/kg en todos los puntos temporales examinados.
C. Efecto de la Dexametasona sobre la Eliminación de Hialuronano con PEGPH20
Dado que el pretratamiento con dexametasona mejoró las respuestas musculoesqueléticas inducidas por PEGPH20, se examinaron los efectos de la dexametasona sobre la eliminación de hialuronano con PEGPH20 en el músculo esquelético y en los tejidos cutáneos.
Se tomaron biopsias de tejidos del músculo esquelético y de la piel de cada uno de los tres perros en cada grupo de tratamiento descrito en la Tabla 11, 24 horas antes y 24 horas después de la primera administración IV de PEGPH20. Los músculos semitendinoso medial/membranoso medial fueron seleccionados para la biopsias. El área de la biopsia se rasuró con tijeras eléctricas y se frotó con soluciones de Clorhexidina o Povidona-Yodo. Se inyectó bupivacaína o lidocaína (2-3 mg/kg) por vía subcutánea (SC) en el área de la biopsia para la analgesia local. La biopsia muscular se recolectó utilizando una aguja de biopsia de 2 mm de diámetro. Se aplicó una esponja de gasa con ligera presión para detener cualquier sangrado. Se inyectaron SC 0,2 mg/kg de Metacam (meloxicam) para controlar el dolor. Las muestras de biopsia se colocaron en tubos Eppendorf o equivalentes con aproximadamente 200 pL de formalina tamponada neutra (NBF) al 10%.
Las muestras de tejidos de los que se tomaron biopsias se tiñeron para determinar el HA tisular. Brevemente, las biopsias de tejidos fijadas en NBF al 10% durante 48 horas, se incluyeron en parafina, se seccionaron y se sondearon para determinar el HA utilizando una proteína de unión a HA biotinilada (HABP; Seikagaku, Japón), a continuación se sondearon con estreptavidina marcada con FITC (Vector Labs, Canadá) para la detección. Los núcleos celulares se contratiñeron con reactivo DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol). A continuación se tomaron
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micrografías utilizando un microscopio Zeiss (Thornwood, NY) junto con el programa de imágenes Spot (Diagnostic Instruments, Inc).
La expresión de hialuronano en las secciones se evaluó visualmente mediante el nivel de intensidad de fluorescencia verde presente. El músculo esquelético y los tejidos cutáneos de los animales tratados con Control de Vehículo (tampón API) mostraron un patrón similar de hialuronano pericelular teñido con brillo tanto en muestras de pretratamiento como de post-tratamiento. Mientras que el músculo esquelético y los tejidos cutáneos de animales tratados con PEGPH20 (0,3 mg/kg) sola, PEGPH20 (0,3 mg/kg) + dexametasona (4 mg/dosis BID, dos veces al día) y PEGPH20 (1,0 mg/kg) + dexametasona (4 mg/dosis BID, dos veces al día) mostraron hialuronano pericelular brillantemente teñido en las muestras de pretratamiento, las muestras posteriores al tratamiento de cada uno de estos grupos de tratamiento no revelaron prácticamente tinción con hialuronano. Estos hallazgos indicaron que la dexametasona no inhibía la actividad de degradación de hialuronano de PEGPH20.
D. Efecto de la Dexametasona sobre la Farmacocinética de PEGPH20
Para examinar los efectos de la dexametasona sobre la farmacocinética de PEGPH20, se recogieron muestras de sangre de cada perro del Ejemplo 8B, de la Tabla 10 anterior. Se extrajo sangre después de la administración de PEGPH20 o Control de Vehículo de acuerdo con la Tabla 11 siguiente.
Tabla 11. Puntos Temporales de las Extracciones de Sangre para las Mediciones Farmacocinéticas
Punto de tiempo de extracción de sangre por grupo de tratamiento
Control de vehículo (Tampón API) PEGPH20 (0,3 mg/kg) PEGPH20 (0,3 mg/kg) + Dexametasona (4 mg; BID) PEGPH20 (1,0 mg/kg) + Dexametasona (4 mg; BID)
Post Primera Dosis
5 min, 10 min, 30 min, 2 h, 4 h, 7 h, 10 h, 24 h, 48 h, 72 h 5 min, 10 min, 30 min, 2 h, 4 h, 7 h, 10 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días 5 min, 10 min, 30 min, 2 h, 4 h, 7 h, 10 h, 24 h, 48 h, 72 h 5 min, 10 principales, 30 min, 2 h, 4 h, 7 h, 10 h, 24 h, 48 h, 72 h
Post - Segunda Dosis
10 min, 30 min, 2 h, 4 h, 7 h, 10 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h N/A 10 min, 30 min, 2 h, 4 h, 7 h, 10 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h 10 min, 30 min, 2 h, 4 h, 7 h, 10 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h
Se midió la actividad hialuronidasa en plasma en cada punto temporal utilizando el ensayo de ácido hialurónico biotinilado descrito en el Ejemplo 4B. El plasma se preparó a partir de muestras de sangre recogidas y se almacenó congelado a -70°C hasta su análisis. El límite inferior de cuantificación para el ensayo fue de 2,90 U/mL. Los datos de la concentración plasmática frente al tiempo se analizaron mediante métodos no compartimentales y compartimentales utilizando WinNonlin Pro versión 5.1 (Pharsight Corp., Mountain View, CA). Los parámetros PK derivados incluyen AUC, Cmax y Tmax. La exposición sistémica definida por AUC y Cmax fue similar entre PEGPH20 sola y PEGPH20 + dexametasona cuando se administró por vía intravenosa a perros y los perfiles PK generales de los tres grupos de tratamiento con PEGPH20 fueron similares, lo que indica que la dexametasona no afecta la farmacocinética de PEGPH20.
También se midieron los catabolitos de HA como se describe en el Ejemplo 6. Los resultados muestran la aparición de catabolitos de HA después de la administración por PEGPH20, que no se vio afectada por la presencia de dexametasona.
Ejemplo 9
Efecto de la Dexametasona Sobre las Actividades Antitumorales o de Degradación de Hialuronano de PEGPH20 en Modelos de Xenoinjerto de Tumor de Próstata Humano o de Páncreas Humano
Para examinar si la dexametasona interfería con las actividades antitumorales o que degradan hialuronano de PEGPH20, se evaluaron los modelos de xenoinjerto de cáncer de próstata humano o cáncer de páncreas humano.
A. Modelos de Xenoinjerto de Cáncer de Próstata PC3
1. Actividad Antitumoral en Modelos de Xenoinjerto de Cáncer de Próstata PC3
Las células tumorales de la línea celular de carcinoma de próstata PC3 se cultivaron hasta aproximadamente 80%
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de confluencia y a continuación se tripsinizaron, recogieron, lavaron una vez en HBSS (solución salina equilibrada de Hank, Mediatech Inc.), a continuación se resuspendieron en Matrigel® al 50% en hBsS a 2x107 células/mL en hielo antes de su inoculación en animales. A ratones atímicos macho carentes de sistema inmunitario (Nu/Nu (Ncr); Taconic Farms, peso promedio ~ 20 g) se les inocularon por vía intramuscular (IM) 0,05 mL de esta suspensión celular, peritibialmente, en la pata posterior izquierda (adyacente al periostio de la tibia). Los implantes en los animales se evaluaron dos veces por semana y se dejaron crecer hasta un volumen tumoral medio de aproximadamente 500 mm3 (Día -2, Tabla 12). Los volúmenes tumorales reales se determinaron utilizando ultrasonido de alta resolución VisualSonics Vevo 770, utilizando dos dimensiones axiales perpendiculares.
Los animales se clasificaron aleatoriamente y se agruparon en 6 grupos de 8 ratones por grupo (6 + 2 ratones satélite). Los grupos de tratamiento fueron vehículo (tampón API), PEGPH20 (157.500 Unidades/kg, 4.5 mg/kg), dosis bajas de dexametasona (1.25 mg/kg), dosis altas de dexametasona (5 mg/kg), PEGPH20 (4,5 mg/kg) + dosis bajas de dexametasona (1,25 mg/kg) y PEGPH20 (4,5 mg/kg) + dosis altas de dexametasona (5 mg/kg). La dosis y la frecuencia de las inyecciones intravenosas de PEGPH20 (o vehículo) fueron de 157.500 Unidades/kg o aproximadamente 4,5 mg/kg, cada 3rd día comenzando el Día 0 (días 0, 3, 6, 9, 12) con un total de 5 inyecciones (Q3Dx5) con un volumen de dosis de 0,1 mL. Se demostró previamente que esta dosificación y régimen de frecuencia inhibía el crecimiento del tumor de xenoinjerto en 34-70%. Las dosis y la frecuencia de las inyecciones intraperitoneales de dexametasona fueron de 1,25 mg/kg a la dosis baja y de 5 mg/kg a la dosis alta, una vez al día hasta el día 13 (QDx13) con un volumen de dosis de 0,1 mL.
Los volúmenes tumorales de todos los ratones se midieron antes del tratamiento el día -2 (volumen tumoral medio de ~500 mm3) y los días 1, 6, 9, 13, 16 y 20 mediante la captura de imágenes utilizando el sistema de ultrasonido VisualSonic y el uso de un programa de soporte lógico de adquisición de imágenes mediante ultrasonido para calcular el volumen del tumor (Tabla 12). El porcentaje de inhibición del crecimiento tumoral (% TGI) se calculó mediante la siguiente ecuación:
[l-(Tn-T0)/(Cn-C0)]xlOO%
En la ecuación anterior, Tn es el volumen tumoral promedio en el grupo de tratamiento el día "n" respectivo en el punto temporal indicado después del tratamiento; A es el volumen tumoral promedio en el grupo de tratamiento el día 0 antes del tratamiento; Cn es el volumen tumoral promedio en el grupo de control el día "n" respectivo en el punto temporal indicado después del tratamiento con el vehículo; y C0 es el volumen tumoral promedio en el grupo de control el día 0 antes del tratamiento.
Los datos en la Tabla 12 muestran que la dexametasona sola no tuvo efecto sobre la inhibición del crecimiento tumoral, con la dosis baja o alta. Los resultados también muestran que los efectos sobre el crecimiento tumoral fueron similares en los grupos tratados con PEGPH20 sola versus PEGPH20 y dexametasona. Por lo tanto, los datos de los modelos de xenoinjerto de cáncer de próstata PC3 revelaron que la dexametasona no interfería con los efectos de la PEGPH20 sobre la inhibición del crecimiento tumoral.
Tabla 12. Volúmenes de Tumores y Análisis Estadístico de la Actividad Antitumoral de PEGPH20, Dexametasona como Agentes Únicos y Combinados en el Modelo de Cáncer de Próstata PC3
Grupo/Día
Día 2 Día 1 Día 6 Día 9 Día 13 Día 16 Día 20
Tampón API
487,3 653,1 861,5 994,5 1252,7 1528,8 1870,5
ET
51,57 70,03 56,14 71,78 91,28 95,31 144,22
PEGPH20 4,5 mg/kg
491,10 394,38 598,39 674,83 827,53 1046,73 1310,85
ET
49,26 47,61 69,29 76,03 102,22 119,17 177,85
valor p
0,004 0,005 0,004 0,004 0,01 0,02
% TGI
TR 71 64 56 47 41
Dexametasona 1,25 mg/kg
486,88 636,98 727,80 964,35 1202,35 1401,91 1792,92
ET
48,16 66,17 96,52 85,93 119,73 130,68 166,24
Dexametasona 5 mg/kg
516,25 633,84 854,90 995,47 1211,50 1455,27 1840,11
ET
51,14 56,61 69,60 91,98 125,39 207,27 257,18
Dexametasona 1,25 mg/kg + PEGPH20 4,5 mg/kg
489,69 491,36 673,05 766,85 914,62 1067,69 1498,98
5
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Tabla 12. Volúmenes de Tumores y Análisis Estadístico de la Actividad Antitumoral de PEGPH20, Dexametasona como Agentes Únicos y Combinados en el Modelo de Cáncer de Próstata PC3
Grupo/Día
Día 2 Día 1 Día 6 Día 9 Día 13 Día 16 Día 20
ET
45,71 62,92 78,57 83,52 98,62 148,24 223,68
valor p
0,05 0,04 0,029 0,012 0,01
% TGI
99 51 45 44 45
Dexametasona 5 mg/kg + PEGPH20 4,5 mg/kg
493,92 471,88 661,93 693,24 839,57 995,19 1343,58
ET
44,40 54,47 58,26 60,04 71,02 63,90 76,21
valor p
0,03 0,01 0,003 0,002 0,0005 0,005
% TGI
TR 55 61 55 52 39
ET = Error típico; % TGI = % Inhibición del crecimiento tumoral; TR = Regresión Tumoral; valor-p = Prueba-T de Student de Varianzas Iguales Pareadas de Una Cola
2. Efecto de la Dexametasona Sobre la enzima plasmática PEGPH20
También se recogieron muestras de plasma de los ratones satélite portadores de tumores PC3 individuales de ratones del grupo de control y tratamiento 24 horas después de la dosis final de PEGPH20 y dexametasona el día 13. Se evaluó la hialuronidasa PEGPH20 en plasma utilizando el ensayo de ácido hialurónico biotinilado descrito en el Ejemplo 4B. Los animales tratados con PEGPH20, PEGPH20 + dosis bajas de dexametasona y PEGPH20 + dosis altas de dexametasona tuvieron niveles similares de actividad hialuronidasa plasmática lo que indica que la dexametasona no interfirió con el nivel de actividad de PEGPH20 en el plasma de los ratones.
Se utilizaron adicionalmente muestras de plasma para medir el hialuronano plasmático soluble en el grupo de control y en cada uno de los grupos de tratamiento (Catálogo R & D Systems DY3614; ensayo ELISA). En el grupo de control de vehículo, los niveles de hialuronano en plasma oscilaron entre 800.000 y 900.000 ng/mL. El grupo con dosis bajas de dexametasona tuvo un alto intervalo de variabilidad en las concentraciones plasmáticas de hialuronano (una concentración alta y una concentración baja, pero ambas medibles) pero el grupo con dosis altas de dexametasona tenía niveles de hialuronano en plasma que oscilaban entre 23.000 y 42.000 ng/mL. Los ratones tratados con PEGPH20 sola o con PEGPH20 + dexametasona (dosis alta o baja) no tenían hialuronano detectable (por debajo del límite de cuantificación) lo que demuestra que la dexametasona no alteró la actividad en plasma de PEGPH20 en ratones.
Por lo tanto, los resultados muestran que la dexametasona no tuvo ningún efecto sobre la actividad de PEGPH20 en el plasma.
3. Efecto de la Dexametasona Sobre la Actividad de Degradación de Hialuronano de PEGPH20 en Modelos de Xenoinjerto de Cáncer de Próstata PC3
Los tejidos tumorales de los dos ratones satélite de los 6 grupos de tratamiento del Ejemplo 9A.1 anterior se recogieron mediante biopsia de tejido el Día 14 y se tiñeron para detectar la presencia de hialuronano. Las biopsias tumorales se fijaron en NBF al 10% durante 48 horas, se incluyeron en parafina y se seccionaron. Las muestras se sometieron a ensayo para determinar el hialuronano utilizando una proteína de unión a HA biotinilada (HABP), a continuación se sondearon con estreptavidina marcada con FITC para su detección. Los núcleos celulares se contratiñeron con reactivo DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol). A continuación se tomaron micrografías utilizando un microscopio Zeiss (Thornwood, NY) junto con el programa de imágenes Spot (Diagnostic Instruments, Inc).
La expresión de hialuronano en las secciones se evaluó mediante el nivel de intensidad de fluorescencia verde en las secciones. Mientras que la tinción de hialuronano pericelular significativa estaba presente en secciones tumorales tomadas de animales tratados con vehículo, dosis altas de dexametasona o dosis bajas de dexametasona, la tinción de hialuronano pericelular estaba casi completamente ausente en secciones de tumores tomadas de animales tratados con PEGPH20 sola, PEGPH20 + dosis baja de dexametasona o PEGPH20 + dosis altas de dexametasona. La tinción con hialuronano en muestras de tejidos de animales tratados con PEGPH20 sola fue prácticamente la misma que la tinción con hialuronano en muestras de tejido de animales tratados con PEGPH20 combinada con dosis bajas o altas de dexametasona, lo que indica que la dexametasona no alteró la actividad de PEGPH20 en la eliminación de hialuronano pericelular.
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B. Modelos de Xenoinjerto de Cáncer de Páncreas BxPC3
Para examinar adicionalmente si la dexametasona afectó las actividades antitumorales o de degración de hialuronano de PEGPH20, se evaluaron los modelos de xenoinjerto de cáncer de páncreas humano.
1. Actividad Antitumoral en Modelos de Xenoinjerto de Cáncer de Páncreas BxPC3
Las células tumorales de la línea celular de cáncer de páncreas BxPC3 se cultivaron hasta aproximadamente 80% de confluencia, se les añadió tripsina, se recogieron, se lavaron una vez en HBSS (solución salina equilibrada de Hank, Mediatech Inc.) y se resuspendieron en Matrigel al 50% en HBSS a 2x107 células/mL en hielo antes de la inoculación en animales. A ratones atímicos hembra carentes de sistema inmunitario (peso medio ~ 20 g) se les inocularon por vía intramuscular (IM) 0,05 mL de suspensión celular, peritibialmente, en la pata posterior izquierda (adyacente al periostio de la tibia). Los tumores en los animales se evaluaron dos veces por semana y se dejaron crecer a un volumen tumoral medio de aproximadamente 250 mm3 (Día -1, Tabla 13). Los volúmenes tumorales reales se determinaron con ultrasonido de alta resolución VisualSonics Vevo 770.
Los animales fueron agrupados aleatoriamente en 6 grupos de 8 animales por grupo (6 +2 ratones satélite) y tratados con vehículo (tampón API), PEGPH20 (157.500 Unidades/kg, 4,5 mg/kg), dosis bajas de dexametasona (1,25 mg/kg ), dosis altas de dexametasona (5 mg/kg), PEGPH20 (4,5 mg/kg) + dosis bajas de dexametasona (1,25 mg/kg) y PEGPH20 (4,5 mg/kg) + dosis alta de dexametasona (5 mg/kg). La dosis y la frecuencia de las inyecciones intravenosas de PEGPH20 (o vehículo) fueron de 157.500 Unidades/kg o aproximadamente 4,5 mg/kg, los Días 0, 3, 7, 10, 13 y 17 para un total de 6 inyecciones a partir del Día 0 (dosis volumen de 0,1 mL). Las dosis y la frecuencia de las inyecciones intraperitonales de dexametasona fueron de 1,25 mg/kg a la dosis baja y de 5 mg/kg a la dosis alta, una vez al día hasta el día 17 (QDx17) con un volumen de dosis de 0,1 mL.
Los volúmenes tumorales de todos los ratones se midieron antes del tratamiento los días -4 y -1 (volumen tumoral medio de ~ 250 mm3) y los días 4, 7, 11, 14 y 17 mediante la captura de imágenes utilizando el sistema de ultrasonido VisualSonic y el uso de un programa de soporte lógico de obtención de imágenes de ultrasonido para calcular el volumen del tumor (Tabla 13). El porcentaje de inhibición del crecimiento tumoral (% TGI) se calculó como se describió anteriormente en el Ejemplo 9A.
Los datos en la Tabla 13 siguiente resumen los resultados. Los resultados muestran que los efectos sobre el volumen del tumor con la administración simultánea de dexametasona, ya sea a dosis altas o bajas, con PEGPH20 fueron similares a los resultados cuando se administró PEGPH20 sola. Los datos de los modelos de xenoinjerto de cáncer de páncreas BxPC3 muestran que la dexametasona no interfirió en la inhibición del crecimiento tumoral mediada por PEGPH20.
Tabla 13. Volumen Tumoral y Análisis Estadístico de la Actividad Antitumoral de PEGPH20 y Dexametasona como Agentes Únicos y Combinados.
Grupo/Día
Día 4 Día 1 Día 4 Día 7 Día 11 Día 14 Día 17
Tampón API
201,7 281,0 517,4 598,4 772,2 974,1 1266,2
ET
33,30 36,74 70,35 60,11 81,22 114,56 172,61
PEGPH20 4,5 mg/kg
196,87 275,75 350,44 394,40 473,50 596,96 790,16
ET
34,06 47,53 65,68 73,09 92,44 112,96 160,10
valor p
0,05 0,03 1 0,02 0,02 0,03
% TGI
68 63 60 54 48
Dexametasona 5 mg/kg
197,29 231,18 396,26 379,39 481,54 603,82 720,95
ET
34,61 44,61 82,79 62,01 66,94 95,93 115,49
valor p
0,01 0,01 0,01 0,02
% TGI
53 49 46 50
Dexametasona 1,25 mg/kg
202,85 312,65 463,51 609,40 732,92 796,84 933,86
ET
38,24 48,31 55,42 104,30 95,85 100,99 120,33
Dexametasona 5 mg/kg + PEGPH20 4,5 mg/kg
205,98 317,51 394,98 414,21 516,62 674,16 794,21
ET
40,68 41,62 45,53 63,27 75,87 87,85 114,50
5
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40
45
Tabla 13. Volumen Tumoral y Análisis Estadístico de la Actividad Antitumoral de PEGPH20 y Dexametasona como Agentes Únicos y Combinados.
Grupo/Día
Día 4 Día 1 Día 4 Día 7 Día 11 Día 14 Día 17
valor p
0,03 0,02 0,03 0,02
% TGI
70 59 49 52
Dexametasona 1,25 mg/kg + PEGPH20 4,5 mg/kg
207,68 265,19 325,49 341,39 424,14 527,05 610,31
ET
41,97 56,80 60,12 73,10 63,41 75,65 81,90
valor p
0,03 0,01 0,003 0,003 0,003
% TGI
74 76 68 62 65
ET = Error Típico; % TGI =% Inhibición del crecimiento tumoral; TR = Regresión Tumoral; valor-p = Prueba-T de Student de Varianzas Iguales Pareadas de Una Cola
2. Efecto de la Dexametasona Sobre la Enzima Plasmática PEGPH20
También se recogieron muestras de plasma de ratones satélite portadores de tumores PC3 individuales de ratones del grupo de control y tratamiento 24 horas después de la dosis final de PEGPH20 y dexametasona el día 17. Se evaluó la actividad hialuronidasa de PEGPH20 en plasma utilizando el método descrito en el Ejemplo 4. Los animales tratados con PEGPH20, PEGPH20 + dosis bajas de dexametasona y PEGPH20 + dosis altas de dexametasona tuvieron niveles similares de actividad de hialuronidasa plasmática, lo que indica que la dexametasona no interfirió en el nivel de actividad de PEGPH20 en el plasma de estos ratones.
Las muestras de plasma se utilizaron adicionalmente para medir el hialuronano plasmático soluble en el grupo control y en cada uno de los grupos de tratamiento (R & D Systems Núm. de Cátalogo DY3614; ensayo ELISA). En el grupo de control de vehículo, los niveles de hialuronano en plasma oscilaron entre 2.000 y 4.000 ng/mL. El grupo con dosis altas de dexametasona tuvo un alto intervalo de variabilidad en las concentraciones plasmáticas de hialuronano (una concentración alta y una concentración baja pero ambas medibles) pero el grupo con dosis bajas de dexametasona tuvo niveles plasmáticos de hialuronano entre 2.000 y 4.000 ng/mL, similar a los animales de control. Los ratones tratados con PEGPH20 solo o con PEGPH20 + dexametasona (dosis alta o baja) no tenían hialuronano detectable (por debajo del límite de cuantificación) lo que demuestra que la dexametasona no alteró la actividad en plasma de PEGPH20 en estos ratones.
Los datos de los modelos de xenoinjerto de cáncer de páncreas BxPC3 muestran que la dexametasona tampoco tuvo ningún efecto sobre la actividad de PEGPH20 en el plasma en este modelo.
3. Efecto de la Dexametasona Sobre la Actividad de Degradación de Hialuronano de PEGPH20 en Modelos de Xenoinjerto de Cáncer de Páncreas BxPC3
Los tejidos tumorales de los dos ratones satélite de los 6 grupos de tratamiento en el Ejemplo 9B.1 anterior, se recogieron mediante biopsia de tejido el Día 18 y se tiñeron para detectar la presencia de hialuronano. Las biopsias tumorales se fijaron en NBF al 10% durante 48 horas, se incluyeron en parafina y se seccionaron. Las muestras se sondearon para determinar el hialuronano utilizando una proteína de unión a HA biotinilada (HABP), a continuación se sondearon con estreptavidina marcada con FITC para su detección. Los núcleos celulares se contratiñeron con reactivo DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol). A continuación se tomaron micrografías utilizando un microscopio Zeiss (Thornwood, NY) junto con el programa de imágenes Spot (Diagnostic Instruments, Inc).
La expresión de hialuronano en las secciones se evaluó por el nivel de intensidad de fluorescencia verde en las secciones. Mientras que la tinción de hialuronano pericelular significativa estaba presente en secciones tumorales tomadas de animales tratados con control de vehículo, dosis altas de dexametasona o dosis bajas de dexametasona, la tinción de hialuronano estuvo casi completamente ausente de las secciones tumorales tomadas de animales tratados con PEGPH20 sola, PEGPH20 + dosis bajas de dexametasona, o PEGPH20 + dosis altas de dexametasona. La tinción con hialuronano en muestras de tejido de animales tratados con PEGPH20 solo fue prácticamente la misma que la tinción en muestras de tejido de animales tratados con PEGPH20 y dosis bajas o altas de dexametasona, lo que indica que de manera similar a los resultados en el modelo de xenoinjerto PC3, la dexametasona no alteró la actividad de PEGPH20 en la eliminación de hialuronano, en el modelo de xenoinjerto BxPC3.
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Ejemplo 10
Efecto de la Dexametasona Sobre los Efectos Musculoesqueléticos en Seres Humanos
Este ejemplo describe un estudio que evalúa el efecto de la dexametasona en la mejora o reducción de los eventos musculoesqueléticos adversos que resultaron de la administración de PEGPH20 en seres humanos. Se añadió dexametasona a un régimen de dosificación como premedicación para eliminar o mejorar los efectos musculoesqueléticos de la administración de PEGPH20. El ciclo de tratamiento se definió como un período de 28 días, con PEGPH20 administrada por vía intravenosa (IV) y dexametasona administrada por vía oral. La dosificación de PEGPH20 y dexametasona tuvo lugar los días 1, 4, 8, 11, 15, 18, 22 y 25 del ciclo de 28 días. En cada día de dosificación, se administró un régimen de premedicación de 4 mg de dexametasona por vía oral una hora antes de PEGPH20, seguido por una segunda dosis de 4 mg de dexametasona 8-12 horas después de la dosificación de PEGPH20.
A. Criterios de Inclusión y Exclusión
Los pacientes se inscribieron en el estudio después de firmar el formulario de consentimiento informado. Los pacientes tenían al menos un tumor sólido confirmado, avanzado; eran refractarios al tratamiento convencional; tenían al menos un tumor que era medible de acuerdo con los criterios RECIST; tenían un estado de rendimiento de Karnofsky >70%; tenían una fracción de eyección de >50%, según lo determinado por el ecocardiograma al inicio del estudio; tenían una esperanza de vida de al menos 3 meses; no presentaban embarazo y aceptaron utilizar anticonceptivos; y tenía una función de órganos aceptable como se muestra mediante análisis de laboratorio hematológicos, hepáticos, renales y de coagulación.
Los pacientes tampoco presentaban ninguno de los siguientes criterios de exclusión: metástasis cerebral conocida; Enfermedad cardíaca de Clase III o IV de acuerdo con Asociación Cardíaca de Nueva York, infarto de miocardio o arritmia cardíaca que requiriera terapia médica; infección activa que requiriera terapia sistémica; diabetes no controlada que requiriera terapia con insulina; afecciones médicas que requirieran terapia con heparina; infección conocida por VIH, hepatitis B o hepatitis C; alergia conocida a la hialuronidasa; enfermedad grave no maligna; o intolerancia a la dexametasona. Los pacientes también acordaron cumplir con el protocolo y no participar en ningún otro estudio terapéutico intervencionista concurrente. En todos los casos, los pacientes ingresaron al programa bajo medicación para el dolor. Por ejemplo, el primer paciente en este estudio estaba tomando oxicodona-acetaminofeno & oxicontina para el dolor relacionado con su afección de presentación pero no para el dolor relacionado con el fármaco del estudio.
B. Dosificación y evaluación 1. Primer paciente
Inicialmente, a un paciente con tumores sólidos avanzados que cumplía los criterios de inclusión/exclusión se le administró PEGPH20 + dexametasona dos veces a la semana durante 28 días con una dosis inicial baja de 0,5 pg/kg. El primer paciente era una mujer de 55 años, 68,6 kg, con cáncer de ovario.
Aproximadamente una hora antes de la administración de PEGPH20, se administró dexametasona (4 mg) por vía oral. A continuación, se colocó una aguja/catéter del calibre apropiado por vía intravenosa y se administró PEGPH20 durante 5 minutos como un impulso IV lento. Para la PEGPH20, la dosificación se prescribió en una base de pg/kg, en base al peso real del paciente el día 1. Se suministró PEGPH20 en forma de una solución acuosa que contenía 3,5 mg/mL de PEGPH20 con histidina 10 mM y NaCl 130 mM a un pH de 6,5. La dosis se diluyó con solución salina normal hasta un volumen final 10 mL. La dosis inicial fue de 0,5 pg/kg, administrada dos veces a la semana durante 28 días, de acuerdo con lo especificado por el régimen de dosificación. La segunda dosis de dexametasona se administró 8-12 horas más tarde. Se utilizaron AINE (ibuprofeno) o ciclobenzaprina para tratar el dolor musculoesquelético si se producía.
Durante el ciclo de 28 días, el paciente se sometió a una serie de evaluaciones médicas y de laboratorio. En la Tabla 14 se muestra un programa de estas evaluaciones y sus puntos temporales. Todos los datos recopilados en cada punto temporal se registraron en un Formulario de Informe de Caso.
Tabla 14. Calendario de evaluaciones
Actividad
Escrutinio Ciclo de Tratamiento 1
Día de estudio (día del ciclo)
-10 a -1 1 2/3 4 8 11 15 18 22 25
Consentimiento Informado Firmado
X
Tabla 14. Calendario de evaluaciones
Actividad
Escrutinio Ciclo de Tratamiento 1
Criterios de Inclusión/Exclusión
X
Historial médico
X
Historial médico - 28 días
X
Examen físico
X
Estado de rendimiento de Karnofsky
X
Signos vitales (PA, FC, RR, Temperatura)
X Xde X X X X X X X
Peso corporal
Xd
PE Diana
Xd Xd
Muestra de tejido de biopsia tumoral para tinción con HA
X Xb
ECG de 12 derivaciones
Xd
Ecocardiograma
X Xd
Parámetros de química clínica, CBC y coagulación
X Xd Xd Xd Xd
Marcadores inflamatorios: ESR y CRP
X o Q. X
Análisis de orina
X X o Q. Xd
Prueba de embarazo
X
Marcadores tumorales según corresponda
X Xd
Catabolitos HA
X o Q. X X o Q. Xcd X o Q. Xcd Xcd X o Q. X o Q.
Muestra de plasma de inmunogenicidad PEGPH20
Xd X
Colección de muestras de sangre PK
X o Q. X X X X X X X X
Eficacia de la evaluación mediante imágenes/ radiológica
X
Día de estudio (día del ciclo)
-10 a -1 1 2/3 4 8 11 15 18 22 25
ADC-MRI, DCE-MRI, y/o FDG-PET
X Xa Xa
Infusión de PEGPH20
Xe Xe Xe Xe Xe Xe Xe Xe
Medicaciones concomitantes
X X X X X X X X
Eventos adversos
X X X X X X X X X
a - A realizar el día 3 (de manera óptima) o el día 4 antes de la infusión y al final del ciclo 1 (después del día 25). b - Biopsia tumoral posterior a la dosis para la tinción de HA si fuera posible, en cualquier momento el día 2 o más. c - Después de la administración d - Antes de la administración e - Durante la administración F/U - Seguimiento
Se evaluaron los eventos adversos o los efectos secundarios, incluyendo los eventos musculoesqueléticos y otros eventos adversos. Cualquier evento médico no deseable se consideró un evento adverso (EA) si su aparición se 5 produjo durante o después de la primera exposición del paciente a PEGPH20 combinada con dexametasona pero a más tardar 30 días después de la última dosis (independientemente de si se consideraba relacionado con PEGPH20 + dexametasona).
Los EA se categorizaron por gravedad (la medida de intensidad en oposición a la medida de gravedad) por parte del 10 Investigador utilizando la Versión 4.0 del NCI CTCAE y las pautas presentadas en la Tabla 15 a continuación. Todos los EA fueron clasificados además por el investigador dependiendo de si el EA estaba Relacionado, Probablemente Relacionado, Posiblemente Relacionado, Poco Probablemente Relacionado o No Relacionado específicamente con la administración de PEGPH20 y/o dexametasona.
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Tabla 15. Clasificación de Eventos Adversos por Gravedad
Gravedad
Definición
Leve (Grado 1)
Los síntomas o signos pueden existir, pero son transitorios y fácilmente tolerados. La intervención no está indicada.
Moderada (Grado 2)
Los síntomas limitan algunas actividades de la vida diaria. La intervención mínima, local o no invasiva está indicada para evitar la incomodidad del paciente.
Grave (Grado 3 o superior)
Los síntomas son incapacitantes. La hospitalización u otra intervención urgente pueden estar indicadas.
También se realizó un seguimiento del paciente para determinar la toxicidad limitante de la dosis (TLD). Para calificarla como una TLD, el evento adverso tuvo que haber sido considerado relacionado con el tratamiento con PEGPH20 + dexametasona y debe haber surgido durante los primeros 28 días de tratamiento. La TLD se definió como cualquier toxicidad no hematológica según el Criterio de Terminología Común para Eventos Adversos (CTCAE) del Instituto Nacional del Cáncer (NCI) de Grado 3 o superior (véase la Tabla 15). Las excepciones a esto incluyeron náuseas y vómitos que ocurrieron sin terapia antiemética profiláctica pero que fueron tratados eficazmente con dicha terapia, y toxicidades musculoesqueléticas de Grado 3 que se trataron fácilmente de tal manera que se degradaron a Grado 2 o menos, o se resolvieron en 24 horas. La TLD también se definió como cualquier toxicidad en curso y persistente de Grado 2 que no se resolvió durante 21 días y que limitaba la capacidad del paciente para cumplir con la terapia de protocolo. Una definición final de TLD incluía cualquier toxicidad hematológica de Grado 4 o prolongada de Grado 3.
Después de administrar PEGPH20 combinada con dexametasona el día 1 y el día 4, el paciente experimentó un dolor bilateral de rodilla de grado 1. La 3a dosis el día 8 se administró sin complicaciones. El dolor bilateral de rodilla continuó siendo de Grado 1, fue intermitente y no requirió terapia ni limitó la ambulación. Un examen físico de la rodilla indicó que no hubo cambios físicos o limitaciones en el movimiento de la articulación. El evento adverso no se consideró una TLD.
El paciente completó el régimen (4 semanas, dos veces por semana los días 1, 4, 8, 11, 15, 18, 22 y 25) sin complicaciones adicionales relacionadas. Además, el paciente también tuvo diarrea, distensión abdominal (Grado 3, no relacionada) y erupción actínica (Grado 2) en los brazos superiores e inferiores bilaterales (Grado 2, no relacionada). El paciente descontinuó y discontinuó el estudio debido a progresión clínica de la enfermedad (cáncer de ovario).
2. Segundo paciente
Puesto que el régimen de dosificación de PEGPH20 combinada con dexametasona fue bien tolerado en el primer paciente, la dosis de PEGPH20 se intensificó en un segundo paciente con cáncer de esófago. El paciente, varón y de 71 años de edad, recibió dosis de 1,6 pg/kg de PEGPH20 + dexametasona dos veces a la semana durante 28 días. Excepto por la dosis más alta, el régimen de dosificación fue el mismo que en el primer paciente. Las evaluaciones médicas y de laboratorio, incluidos los eventos adversos y la TLD se llevaron a cabo como se ha descrito anteriormente para el primer paciente.
Se observaron efectos secundarios musculoesqueléticos de grado 1. Los efectos adversos, todos de Grado 1, incluyeron malestar leve en la parte inferior de la espalda, fatiga, dolor y malestar en la cadera izquierda, calambres musculares en las manos y los pies. No se informó sobre TLD. El paciente tuvo eventos adversos que incluyeron fatiga (Grado 1, relacionada), dolor de cadera izquierda (Grado 1, no relacionado con el fármaco del estudio); calambres musculares y dolor dorsolumbar (Grado 1, posiblemente relacionado con el fármaco del estudio).
El paciente continuó el ciclo 2, donde el paciente recibió dosis semanales. El paciente discontinuó debido a la progresión de la enfermedad el día 15 del ciclo 2.
3. Tercer paciente
A un tercer paciente se le administraron 5,0 pg/kg de PEGPH20 + dexametasona dos veces a la semana durante 28 días. La primera dosis se recibió sin complicaciones. El día de la segunda dosis, el paciente tuvo calambres musculares de Grado 1 en las manos, que progresaron a calambres musculares de Grado 3 en las manos, las piernas, los pies y los dedos de los pies después de la tercera dosis. El paciente no recibió infusiones adicionales y discontinuó el estudio.
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15
20
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60
4. Cuarto y Quinto Pacientes
Debido a los calambres musculares de Grado 3 experimentados después de una tercera dosis de 5,0 pg/kg de PEGPH20, la dosis se redujo a 1,6 pg/kg en dos pacientes, cada uno recibió 1,6 pg/kg de PEGPH20 + dexametasona dos veces a la semana durante 28 días.
El cuarto paciente, que tenía un adenocarcinoma de colon moderadamente diferenciado, experimentó cólicos bilaterales de grado 1 en los dedos, manos, pies y pantorrillas. Notablemente, una biopsia posterior a la dosis de una lesión metastásica del hígado demostró una reducción en HA pericelular cuando se comparó con una biopsia tumoral archivada (véase el Ejemplo 12). El paciente completó el ciclo 2, pero se retiró del estudio antes del ciclo de inicio 3 debido a la progresión de la enfermedad.
El quinto paciente, que tenía un adenocarcinoma colorrectal moderadamente diferenciado, informó de cólicos bilaterales intermitentes de Grado 1 en los muslos comenzando el mismo día que la segunda dosis de PEGPH20, que estaba en curso. También se produjo dolor intermitente de rodilla izquierda de Grado 1 en un solo día, que fue un día después de la segunda dosis de PEGPH20 y volvió a ocurrir como Grado 1 el día en que se administró la sexta dosis de PEGPH20. Este paciente también informó de cólicos bilaterales intermitentes de Grado 2 en las manos y los músculos de las extremidades inferiores, que comenzaron el mismo día que la cuarta dosis de PEGPH20.
C. Compendio de Resultados
Para el estudio de pacientes con menos de 5,0 pg/kg de PEGPH20 combinada con dexametasona, los efectos adversos fueron en su mayoría de naturaleza musculoesquelética, incluyendo dolor bilateral de rodilla, calambres musculares en el pie derecho, calambres musculares en la mano izquierda y derecha, que fueron todos fármacos de estudio relacionados y fueron todos de Grado 1. Los cinco pacientes discontinuaron debido a la progresión de la enfermedad. Un paciente, que recibió 1,6 pg/kg dos veces por semana, completó dos ciclos de terapia y a continuación se suspendió debido a la progresión de la enfermedad.
En resumen, los resultados muestran que el uso de premedicación con dexametasona, 4 mg administrados antes y después de la dosificación de PEGPH20 el día de la dosificación (una hora antes y ocho a 12 horas después de la administración de PEGPH20), ha atenuado la gravedad de los eventos musculoesqueléticos. Por lo tanto, el uso de dexametasona permite la administración tolerable de PEGPH20 a una dosificación y frecuencia de dosificación más altas que las logradas por PEGPH20 en ausencia de dexametasona.
Ejemplo 11
Detección Histoquímica de HA
Se obtuvieron muestras para la detección histoquímica de HA a partir de una muestra tumoral previa a la biopsia y una muestra de biopsia hepática metastásica posterior al ciclo 1 de un paciente al que se administraron dosis durante 4 semanas con 1,6 pg/kg de PEGPH20 + dexametasona como se describe en el Ejemplo 10. Una biopsia predosificación (prebiopsia) archivada obtenidas en 2007 (3,5 años antes del estudio PEGPH20) y una biopsia postCiclo 1 (Post-biopsia) de PEGPH20 (3 días después de la última dosis) se obtuvieron de una paciente de cáncer de colon con metástasis hepáticas. La biopsia posterior al tratamiento del paciente se obtuvo después de un ciclo de tratamiento con PEGPH20 a 1,6 pg/kg en un programa de dos veces por semana con co-tratamiento con dexametasona.
Brevemente, las biopsias tumorales se fijaron en formalina tamponada normal (NBF) y se cortaron y tiñeron secciones de 5 pm utilizando una proteína de unión a hialuronano marcada con biotina (HABP-bio) (Seikagaku, Japón). Después del lavado para eliminar el reactivo primario, se usó un reactivo secundario marcado. Los núcleos se contratiñeron utilizando un reactivo DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol). Las micrografías se capturaron a través de un microscopio fluorescente invertido Nikon Eclipse TE2000U acoplado a una cámara digital Insight FireWire (Diagnostic Instruments, Michigan) o un objetivo suspendido ZEISS (Carl Zeiss, Inc) que tiene el mismo sistema de imágenes.
La tinción histoquímica de las muestras con proteína de unión a HA biotinilada demostró una disminución de los niveles de HA pericelular y estromal después de un ciclo de tratamiento con PEGPH20. Los resultados se resumen en la Tabla 16. La puntuación H representa la intensidad relativa de HA pericelular y estromal. Los datos demuestran la capacidad de PEGPH20 para degradar el HA asociado al tumor.
TABLA 16: Detección histoquímica de HA
Células tumorales pericelulares (% de células teñidas) Estroma (% área teñida) % área total
Espécimen
3+ 2+ 1 + 0 H 3+ 2+ 1 + 0 H Tumor Estroma**
prebiopsia
10 30 25 35 115 30 50 15 5 205 40 50
postbiopsia
0 0 25 75 25 30 30 23 17 173 20 5
** estroma asociado al tumor
Ejemplo 12
5 Método de HPLC para la estimación del nivel de hialuronano (HA) en plasma
Este ejemplo describe un método para la determinación del contenido de HA-disacárido en plasma. El método emplea la hidrólisis de HA con condroitinasa ABC para liberar los HA-disacáridos, derivatizarlos con 2-amino acridona (AMAC) y analizarlos en una HPLC de fase inversa acoplada a detección de fluorescencia. La 10 cuantificación de los HA-disacáridos se lleva a cabo por comparación con los patrones de HA-disacárido.
1. Patrones de trabajo
En el método, se generó una solución patrón de trabajo. En primer lugar, se generó una solución de partida diluida 15 (SPD) a partir de una Solución de Partida de HA-disacárido (SP). La SP de disacárido HA se generó añadiendo 1 mL de agua a un vial de HA-Disac (V-labs, Núm. de Cat. C3209) que contenía 2 mg de polvo liofilizado para formar una suspensión uniforme. Para generar soluciones de partida diluidas, se diluyeron 5 pl de la solución SP con 125 pl de agua para generar una solución SPD1 (que contenía 200 pmoles/pl de HA-Disac, 200 nmoles/mL de HA-Disac). Se realizaron diluciones seriadas 1:5 en agua para generar SPD2 (que contenía 40 pmoles/pl de HA-Disac, 40 20 nmoles/mL de HA-Disac) y a continuación SPD3 (que contenía 8 pmoles/pl de HA-Disac; 8 nmoles/mL de HA- Disac). A continuación, se generaron soluciones patrón de trabajo como se expone en albúmina de suero humana (HAS) al 25% (ABO Pharmaceuticals, Núm. de Cat. 1500233) o plasma de ratón normal (Bioreclamation, Núm. de Cat. MSEPLEDTA2-BALB-M) como se expone en las Tablas 17 y 18.
TABLA 17: Solución Patrón de Trabajo en HSA
Núm. SPT
SPD3 SPD2 SPD1 Agua (pl) HSA al 25% (pl) HA0Disac (pmoles en 150 pl)
SPT0
0,00 130,00 20,00 0
SPT1
1,25 128,70 20,00 10
SPT2
3,13 126,87 20,00 25
SPT3
6,25 123,75 20,00 50
SPT4
12,50 117,50 20,00 100
SPT5
6,25 123,75 20,00 250
SPT6
12,50 117,50 20,00 500
SPT7
6,25 123,75 20,00 1250
SPT8
12,50 117,50 20,00 2500
SPT9
25,00 105,00 20,00 5000
SPT10
50,00 80,00 20,00 10000
TABLA 18: Solución Patrón de Trabajo en Plasma de Ratón Normal
SPT#
SPD3 SPD2 SPD1 Agua (pl) Plasma de Ratón Normal (pl) HA0Disac (pmoles en 150 pl)
SPT0
0,00 50,00 100,00 0
SPT1
1,25 48,70 100,00 10
5
10
15
20
25
TABLA 18: Solución Patrón de Trabajo en Plasma de Ratón Normal
SPT#
SPD3 SPD2 SPD1 Agua (pl) Plasma de Ratón Normal (pl) HA0Disac (pmoles en 150 pl)
SPT2
3,13 46,87 100,00 25
SPT3
6,25 43,75 100,00 50
SPT4
12,50 37,50 100,00 100
SPT5
6,25 43,75 100,00 250
SPT6
12,50 37,50 100,00 500
SPT7
6,25 43,75 100,00 1250
SPT8
12,50 37,50 100,00 2500
SPT9
25,00 25,00 100,00 5000
SPT10
50,00 00,00 100,00 10000
2. Hidrólisis y Obtención de Muestras
A continuación, la muestra se hidrolizó. La muestra (p.ej., plasma) se preparó tomando aproximadamente 100 pg de proteína en un tubo de polipropileno y ajustando el volumen a 340 pl con agua. También se preparó un blanco de matriz tomando tampón de dilución (1,59 g de HEPES, 5,07 g de NaCl, 1800 mL de agua, pH 7,0) igual al volumen
de la muestra y ajustando el volumen a 340 pl. La hidrólisis de las muestras y el blanco de matriz se efectuaron
mediante la adición de 60 pl de TFA al tubo de muestra y al tubo del blanco de matriz, y el contenido se mezcló e incubó a 100°C durante 4 horas. Los viales se dejaron enfriar a temperatura ambiente. Los viales se evaporaron a sequedad utilizando un SpeedVac. A continuación, se añadieron 300 pl de agua a cada tubo y se sometieron a agitación vorticial para resuspender las muestras.
Para la derivación de muestras hidrolizadas, blancos y muestras de trabajo, se evaporaron hasta sequedad 45 pl de cada muestra (muestra, blanco o muestra de trabajo) en un SpeedVac. A continuación, se añadieron 10 pl de SAS a la muestra seca, el blanco y los patrones de trabajo. A continuación, se añadieron 50 pl de solución de marcaje ABA/NaCNBH3. Los tubos se sometieron a agitación vorticial y se centrifugaron brevemente. A continuación, se añadieron 440 pl de fase móvil A y los tubos se mezclaron bien. La Fase Móvil A se preparó de la siguiente manera: se añadieron 132 mL de tampón de acetato de amonio 1 M (Sigma, Núm. de Cat. A7330) a un matraz volumétrico de 1 L y se añadió agua para llenar el matraz. Después de la derivación, las cargas nominales en la columna por 20
pl de inyección para los patrones de trabajo se muestran en la Tabla 19.
TABLA 19
Núm. SPT
Fuc (pmoles) GalN (pmoles) GlcN (pmoles) Gal (pmoles) Man (pmoles)
SPT1
25 3,0 105 42 175
SPT2
30 3,7 127 51 211
SPT3
35 4,3 150 60 250
SPT4
41 5,0 173 69 287
SPT5
46 5,6 195 78 325
3. HPLC
La columna de HPLC se equilibró a una velocidad de flujo de 1,0 mL/min con los ajustes iniciales de la fase móvil como se describe en la Tabla 20. Se permitió que el sistema se equilibrara hasta que el valor de referencia fuera estable. El análisis de HPLC se realizó con los parámetros del aparato indicados en la Tabla 20.
TABLA 20: Parámetros del Aparato de HPLC
Parámetro
Valores
Columna
Columna de fase inversa Bakerbond C18, 4.6 x 250 mm, 5 um
5
10
15
20
25
30
35
TABLA 20: Parámetros del Aparato de HPLC
Parámetro
Valores
Temperatura de la Columna
Temperatura ambiente
Fase Móvil A
n-butilamina al 0,2%, ácido fosfórico al 0,5%, tetrahidrofurano al 1% en agua
Fase Móvil B
Fase móvil A al 50%, acetonitrilo al 50%
Velocidad de flujo
1,0 mL/min
Volumen de inyección
20 pl
Detector
Fluorescencia; Excitación 360 nm, emisión 425 nm
Condiciones de la muestra
4-6°C
Gradiente
Tiempo (min) %A %B
0.0
95 5
25,0
95 5
50,0
85 15
50,1
0 100
60,0
0 100
60,1
95 5
70,0
95 5
La secuencia para el análisis de la muestra fue la siguiente: SPT5 (1 inyección) para el acondicionamiento/equilibrado de la columna/ganancia del detector; inyección de agua (1 inyección); SPT3 (3 inyecciones); SPT1 (1 inyección); SPT2 (1 inyección); SPT4 (1 inyección); SPT5 (1 inyección); Agua (1 inyección); Blanco de Matriz (1 inyección); Muestra 1 (1 inyección); Muestra 2 (1 inyección); SPT3 (3 inyecciones); Agua (1 inyección). El sistema se consideró adecuado cuando había una calidad de separación aceptable; la razón de señal a ruido para el pico de monosacárido más corto en la muestra de SPT1 era igual a, o mayor que, 10; la desviación típica relativa (RSD) de las áreas de los picos para cada patrón de monosacárido para las 6 inyecciones de SPT3 fue igual o inferior a 4%; el coeficiente de correlación (r) fue de 0,99 (r se midió utilizando soporte lógico para trazar el área del pico de cada patrón de trabajo frente a la carga de la columna (expresada como pmoles) utilizando las primeras tres inyecciones del patrón SPT3 y calculando la pendiente, la intersección y el coeficiente de correlación para los patrones de trabajo utilizando un modelo de regresión lineal de mínimos cuadrados); las áreas de los picos correspondientes a los monosacáridos no eran más del 2% del área del pico medida para SPT5; y las áreas de los picos correspondientes a los monosacáridos en la inyección de agua no fueron más del 0,5% de las áreas de los picos medidas para SPT5.
4. Análisis de la Muestra
Se determinó el área del pico promedio corregida para cada monosacárido en cada preparación de muestra. Se utilizó la integración de valle a valle para el pico GalN. Para determinar esto, las curvas lineales generadas a partir de los patrones de trabajo se utilizaron para calcular la cantidad de cada monosacárido cargado para cada preparación de muestra. Para cada tipo de monosacárido, se calculó la razón molar promedio de monosacáridos por molécula de proteína para cada muestra. A continuación, para cada muestra, se determinó la suma global de las razones molares promedio para los cinco monosacáridos. Los cálculos se realizaron en base a lo siguiente: El peso molecular (PM) de la proteína hialuronidasa no glicosilada es 51106 g/mol; el volumen total de cada muestra es de 500 pl; el factor de dilución de la muestra es 0,15; el volumen de cada inyección es de 20 pl; y el factor de conversión de mg a pg es 109. Los cálculos se realizaron de la siguiente manera para cada monosacárido:
La cantidad de monosacáridos para cada preparación se calculó utilizando la siguiente ecuación:
Monosacárido (pmoles) = Área del Pico - Interceptación
Pendiente
El número de monosacáridos por molécula de proteína se calculó utilizando la siguiente fórmula:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Monosacáridos por razón de proteína = Monosacárido (pimoles) x PM x 500 ul
0,1 mg x 109 x 20 ' ul x 0,15
Para cada muestra, se informó sobre los resultados para cada muestra como la razón de monosacáridos por proteína para cada monosacárido junto con la suma de las cinco razones de monosacáridos.
Ejemplo 13
Farmacocinética de PEGPH20 Con o Sin Dexametasona
En los estudios en seres humanos descritos en el Ejemplo 6 (PEGPH20) y el Ejemplo 10 (PEGPH20 + dexametasona), se recogieron muestras de sangre a tiempos programados de los pacientes. Las muestras de plasma se almacenaron congeladas y las concentraciones de PEGPH20 se determinaron midiendo la actividad hialuronidasa utilizando un ensayo turbidimétrico modificado como se describe en el Ejemplo 4. El método turbidimétrico de USP utilizado para la determinación de la actividad hialuronidasa se basó en la formación de un precipitado insoluble que se produce cuando HA se une a suero acidulado. Las concentraciones de PEGPH20 se expresaron como unidades de actividad hialuronidasa (U/ml) interpoladas a partir de una curva de calibración. La actividad fue referida al 1 U/mL más cercana, y los métodos analíticos fueron aplicables para medir concentraciones de hialuronidasa en plasma tan bajas como 0,3125 U/mL.
1. PEGPH20
Se analizaron muestras de sangre de pacientes en el Ejemplo 6 que recibieron de una a tres dosis IV de PEGPH20 a dosis que variaban de 0,5 ug/kg a 50 ug/kg para determinar la farmacocinética de PH20.
Para los dos pacientes que inicialmente recibieron una dosis única de 50 ug/kg (Ejemplo 6B.1), la concentración plasmática a lo largo del tiempo fue similar. Las concentraciones máximas de PEGPH20 en plasma se midieron poco después de la infusión y desaparecieron constantemente de la circulación a lo largo del tiempo. El análisis farmacocinético indicó un pequeño volumen de distribución, un aclaramiento plasmático lento y una semivida terminal de aproximadamente 2 días. Los resultados muestran que inicialmente después de la administración, se midieron aproximadamente 30 U/mL de enzima en el plasma. El nivel de enzima plasmática disminuyó constantemente con el tiempo, pero fue detectable 24 y 48 horas después de la administración con menos de aproximadamente 2 U/mL presentes a las 72 horas después de la administración. Los parámetros PK revelaron una vida media plasmática de 28-48 horas en los pacientes. La Tabla 21 presenta un resumen de los parámetros PK que incluyen la concentración plasmática máxima observada (Cmáx; U/ml), el aclaramiento absoluto/sistémico (CL; mL/h/kg), la semivida de distribución (Loa), la semivida de eliminación (L/2p), y el volumen del compartimento central (V1; mL/kg).
Tabla 21: Parámetros PK después de dosis únicas de 50 pg/kg Dosis de PEGPH20
Paciente
Cmax (U/mL) CL (mL/hr/kg) ti/2a (hr) ti/2p (hr) V1 (mL/kg)
1
30,5 2,44 4,77 49,4 57,96
2
31,3 3,29 2,47 25,9 55,93
Para los doce pacientes restantes en el estudio tratados con dosis únicas o múltiples de PEGPH20 que oscilaron entre 0,5 ug/kg y 1,5 ug/kg, las concentraciones plasmáticas se midieron después de la administración (pero menos de o aproximadamente 1,5 U/ml), pero las concentraciones disminuyeron. por debajo del límite de cuantificación (BQL) durante el primer día. Debido a que las concentraciones plasmáticas generalmente estaban cerca o por debajo del límite de cuantificación, no se disponía de suficiente información sobre el curso temporal de las concentraciones plasmáticas. En general, hubo un aumento dependiente de la dosis en la exposición sistémica durante el primer día después de la administración IV de PEGPH20 a bajas dosis que variaron de 0,5 ug/kg a 1,5 ug/kg.
Para los ocho pacientes que recibieron dosis múltiples en el estudio en el Ejemplo 6, se detectaron concentraciones plasmáticas medibles después de la administración repetida en cuatro de estos ocho pacientes. Estas concentraciones plasmáticas fueron bajas, oscilando de 0,34 a 0,83 U/mL y fueron similares a las detectadas después de la administración inicial.
2. PEGPH20 + Dexametasona
Se analizaron muestras de sangre de pacientes en el Ejemplo 10 que recibieron múltiples administraciones de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
PEGPH20 a dosis que variaron de 0,5 pg/kg a 5,0 pg/kg para la farmacocinética de PH20.
Para facilitar la comparación con la farmacocinética de PEGPH20 sin dexametasona descrita anteriormente, se recogieron datos de concentración en plasma frente a tiempo antes de la administración repetida de PEGPH20. Para pacientes tratados con 0,5 pg/kg o 1,6 pg/kg, las concentraciones plasmáticas máximas fueron compatibles con las observadas en el estudio sin dexametasona. Las concentraciones cayeron al límite de la cuantificación durante el primer día. La concentración máxima medida de un solo paciente tratado con 5,0 pg/kg de PEGPH20 fue aproximadamente 1/10 de los valores de Cmax detectados para los pacientes tratados con 50 pg/kg de PEGPH20 en el estudio sin dexametasona. Estos resultados muestran que la farmacocinética plasmática de PEGPH20 es similar en presencia o ausencia de dexametasona.
Ejemplo 14
Farmacodinámica de PEGPH20 Con o Sin Dexametasona
La actividad enzimática de PEGPH20 se midió mediante el control de las concentraciones de hialuronano presentes en la circulación. Se utilizó un ensayo de disacárido descrito en el Ejemplo 12 para medir las concentraciones de HA y sus catabolitos en muestras seriadas de plasma que se recogieron a tiempos programados de pacientes en los estudios en seres humanos descritos en el Ejemplo 6 (PEGPH20) y el Ejemplo 10 (PEGPH20 + dexametasona) .
1. PEGPH20
Las muestras de sangre de pacientes en el Ejemplo 6 que recibieron de una a tres dosis IV de PEGPH20 a dosis que variaban de 0,5 pg/kg a 50 pg/kg se analizaron para determinar los catabolitos de HA. Las concentraciones plasmáticas de HA antes de la dosificación de PEGPH20 eran típicamente menores de 1 pg/mL para todos los pacientes en el estudio.
Para los pacientes que recibieron una sola dosis de 50 pg/kg de PEGPH20, las concentraciones plasmáticas de hialuronano aumentaron significativamente. A pesar de la desaparición relativamente más rápida de PEGPH20 del plasma (Ejemplo 12.1), las concentraciones elevadas de HA parecían acumularse más lentamente y persistir durante un período superior a 2 semanas (más de 400 horas). El efecto prolongado sobre el catabolismo de Ha, es decir, las concentraciones sostenidas de HA en la circulación, es compatible con la actividad enzimática de PEGPH20 en un compartimiento periférico o tejido extravascular.
Para los 12 pacientes restantes que se trataron con dosis únicas o múltiples de PEGPH20 que oscilaron entre 0,5 pg/kg y 1,5 pg/kg, los niveles de catabolitos de HA aumentaron de una manera dependiente de la dosis en el transcurso de una semana. También se determinaron las concentraciones máximas de HA (Cmáx) y estimaciones de área bajo la curva de una semana (AUCü-168h) para cada paciente para cuantificar la respuesta farmacodinámica. Los resultados mostraron que la exposición sistémica a los catabolitos de HA, medida por la concentración plasmática máxima o área bajo la curva, parecía aumentar con el aumento de la dosis de PEGPH20.
2. PEGPH20 + Dexametasona
Las muestras de sangre de los pacientes en el Ejemplo 10 que recibieron múltiples administraciones de PEGPH20 a dosis que variaron de 0,5 pg/kg a 5,0 pg/kg se analizaron para determinar las concentraciones de HA. De acuerdo con las observaciones en las muestras de pacientes que reciben solo PH20 descritas anteriormente, la concentración de HA en plasma frente a los datos de tiempo aumentó después de la administración de PEGPH20. Las concentraciones de HA plasmática medidas durante la primera semana de administración aumentaron con el aumento de la dosis de PEGPH20. En los tres pacientes que completaron un ciclo completo de tratamiento y recibieron 8 dosis de PEGPH20, los resultados mostraron un aumento sostenido de las concentraciones plasmáticas de HA en muestras de los tres pacientes medidas durante el período de dosificación.
Ejemplo 15
Adquisición de Imágenes de Resonancia Magnética
La MRI ponderada por difusión se realizó utilizando una secuencia de ecos con giro rápido de un solo disparo para estimar los valores píxel a píxel para el coeficiente de difusión aparente. La adquisición de imágenes de resonancia magnética mejorada con contraste dinámico (DCE-MRI) incluyó la adquisición de imágenes durante la infusión con un agente de contraste. La calibración se realizó utilizando un fantasma de dos partes que contenía un tubo interior y una mezcla de hielo/agua. Se realizaron barridos antes del tratamiento y después del tratamiento.
5
10
15
20
25
1. Adquisición de Imágenes de Resonancia Magnética por Coeficiente de Difusión Aparente (ADC-MRI)
La adquisición de imágenes de resonancia magnética por coeficiente de difusión aparente (ADC-MRI) mide el volumen de agua que se ha movido a través de la membrana celular en base a un cálculo derivado de las exploraciones previas y posteriores al tratamiento. Las exploraciones ADC-MRI se completaron para un total 10 de los 14 pacientes en el estudio descrito en el Ejemplo 6 y 4 de los 5 pacientes en el estudio descrito en el Ejemplo 10. El análisis de las imágenes adquiridas de cada paciente fue realizado por un radiólogo en Imaging Endpoints (Scottsdale, AZ), y las estimaciones cuantitativas de ADC se calcularon para los tejidos en cada paciente. En la Tabla 22 se muestra un resumen de los hallazgos de ADC-MRI asociados con las regiones tumorales. Como se muestra en la Tabla, se observaron aumentos en ADC-MRI en 7 de 14 (50%) de los pacientes después de la dosificación de PEGPH20. El aumento de los valores de ADC es compatible con el mecanismo de acción de PEGPH20. Los valores de ADC, sin embargo, no cambiaron en 5 de 14 pacientes, y los valores disminuyeron en 2 de 14 pacientes.
Tabla 22: Compendio de ADC-MRI
Dosis y frecuencia
Días de barrido posdosis Cambio en Tumor ADC-MRI desde el momento inicial
Ejemplo 6
50 pg/kg
D4 ningún cambio
0,5 pg/kg; 2 veces por semana
D3 ningún cambio
0,5 pg/kg; Ciclo de 21 días
D3 incremento
0,5 pg/kg; Ciclo de 21 días
D4 disminución en los ganglios linfáticos
0,5 pg/kg; Ciclo de 21 días
D3 incremento
0,75 pg/kg; Ciclo de 21 días
D3 incremento
0,75 pg/kg; Ciclo de 21 días
D3 ningún cambio
0,75 pg/kg; Ciclo de 21 días
D3, D30 incremento
1,0 pg/kg; Ciclo de 21 días
D5 incremento
1,5 pg/kg; Ciclo de 21 días
D3 ningún cambio
Ejemplo 10
1,6 pg/kg + dexametasona; 2 veces por semana
D3, D29 incremento
5,0 pg/kg + dexametasona; 2 veces por semana
D1, D4 aumento D 1
1,6 pg/kg + dexametasona; 2 veces por semana
D2, D25 disminución D25
1,6 pg/kg + dexametasona; 2 veces por semana
D1, D2 ningún cambio
. 2. Adquisición de Imágenes de Resonancia Magnética Mejorada con Contraste Dinámico (DCE-MRI)
La resonancia magnética mejorada con contraste dinámico (DCE-MRI) mide el flujo sanguíneo que indica un cambio en la vascularización del tumor. Las exploraciones se completaron en 4 de 5 pacientes en el estudio descrito en el Ejemplo 10. El análisis de las imágenes adquiridas de cada paciente fue realizado por un radiólogo en Imaging Endpoints (Scottsdale, AZ), y las estimaciones cuantitativas del coeficiente de transferencia de volumen (Ktrans), volumen de sangre (Vp) y fracción de volumen extracelular (Ve) se calcularon para los tejidos en cada paciente. Un resumen de los hallazgos de DCE-MRI asociados con regiones tumorales se expone en la Tabla 23. Se observaron aumentos significativos en el parámetro Ktrans en los dos pacientes que se examinaron el día de la administración de PEGPH20. El aumento de Ktrans a las pocas horas de la administración es compatible con los datos preclínicos que muestran que el PEGPH20 causa descompresión vascular y aumento del flujo sanguíneo (Thompson et al. (2010) Mol. Cancer Ther., 9:3052-64).
Tabla 23: Compendio DCE-MRI
Dosis y frecuencia
Días de Barrido Pos-Dosis Cambio en DCE-MRI del Tumor desde el momento inicial
1,6 pg/kg + dexametasona;
D3, D29 disminución en ktrans en D29

Claims (20)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    1. El uso de un glucocorticoide para la formulación de un medicamento para mejorar un efecto secundario adverso asociado con el tratamiento con una enzima que degrada hialuronano, en donde la enzima que degrada hialuronano está conjugada con un polímero.
  2. 2. Una composición farmacéutica, que comprende un glucocorticoide para uso en la mejora de un efecto secundario adverso asociado con el tratamiento con una enzima que degrada hialuronano, en donde la enzima que degrada hialuronano está conjugada con un polímero.
  3. 3. El uso de la reivindicación 1 o la composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 2, en donde el efecto adverso es un efecto secundario musculoesquelético.
  4. 4. El uso o composición farmacéutica para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el efecto adverso es musculoesquelético y se selecciona entre dolor muscular y articular, rigidez de las extremidades superiores e inferiores, calambres, miositis, malestar muscular y sensibilidad en todo el cuerpo, debilidad, fatiga y/o disminución de la amplitud de movimiento en la rodilla y articulaciones de los codos.
  5. 5. El uso o la composición farmacéutica para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el glucocorticoide se selecciona entre cortisonas, dexametasonas, hidrocortisonas, metilprednisolonas, prednisolonas y prednisonas.
  6. 6. El uso o la composición farmacéutica para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el glucocorticoide se formula para administración oral.
  7. 7. El uso o composición farmacéutica para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el glucocorticoide se formula para la administración de dosis única de una cantidad en un intervalo entre o aproximadamente entre 0,1 y 20 mg.
  8. 8. El uso o la composición farmacéutica para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el polímero es PEG y la enzima que degrada hialuronano está PEGilada.
  9. 9. El uso o composición farmacéutica para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la enzima que degrada hialuronano es una hialuronidasa.
  10. 10. El uso o la composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 9, en donde la hialuronidasa es una PH20 o una PH20 soluble.
  11. 11. El uso o composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 10, en donde la hialuronidasa es una PH20 soluble que ha sido truncada para eliminar un sitio de unión de glicosilfosfatilinositol (GPI) C-terminal o una porción del sitio de unión de GPI.
  12. 12. El uso o la composición farmacéutica para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en donde la hialuronidasa es neutra activa y N-glicosilada y se selecciona entre:
    (a) un polipéptido de hialuronidasa que es una PH20 completa o es una forma truncada en el extremo C de la PH20, en donde la PH20 completa comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2; o
    (b) un polipéptido de hialuronidasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con el polipéptido o la forma truncada de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2; o
    (c) un polipéptido de hialuronidasa de (a) o (b) que comprende sustituciones de aminoácidos, con lo cual el polipéptido hialuronidasa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con el polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 2 o con la correspondiente forma truncada del mismo.
  13. 13. El uso o composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 12, en donde la forma truncada contiene los aminoácidos 36 a 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482 o 483 de SEQ ID NO:1
  14. 14. Una combinación, que comprende:
    una primera composición que comprende una enzima que degrada hialuronano formulada para administración intravenosa, en donde la enzima que degrada hialuronano está conjugada con un polímero;
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    y
    una segunda composición que comprende un glucocorticoide.
  15. 15. La combinación de la reivindicación 14, en donde el glucocorticoide se selecciona entre cortisonas, dexametasonas, hidrocortisonas, metilprednisolonas, prednisolonas y prednisonas.
  16. 16. La combinación de la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en donde la enzima que degrada hialuronano es una hialuronidasa.
  17. 17. La combinación de la reivindicación 16, en donde la hialuronidasa es una PH20 o una PH20 soluble.
  18. 18. La combinación de la reivindicación 17, en donde la hialuronidasa es una PH20 soluble que ha sido truncada para eliminar un sitio de unión de glicosilfosfatilinositol (GPI) C-terminal o una porción del sitio de unión de GPI.
  19. 19. La combinación de cualquiera de las reivindicaciones 16-18, en donde la hialuronidasa es neutra activa y N- glicosilada y se selecciona entre:
    (a) un polipéptido de hialuronidasa que es una PH20 completa o es una forma truncada en el extremo C de la PH20, en donde la PH20 completa comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2; o
    (b) un polipéptido hialuronidasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con el polipéptido o la forma truncada de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2; o
    (c) un polipéptido hialuronidasa de (a) o (b) que comprende sustituciones de aminoácidos, con lo cual el polipéptido hialuronidasa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con el polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 2 o con las correspondientes formas truncadas de los mismos.
  20. 20. La combinación de la reivindicación 19, en donde la forma truncada contiene los aminoácidos 36 a 467, 468, 469, 470, 471,472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482 o 483 de SEQ. ID NO: 1.
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