ES2661441T3 - Usos terapéuticos de un extracto de etanol de oleorresina de Boswellia frereana - Google Patents

Abstract

Un extracto en etanol de oleorresina de Boswellia frereana que comprende un inhibidor de la metaloproteinasa 9 de matriz (MMP9); para uso en el tratamiento o prevención de enfermedad inflamatoria intestinal (EII), sepsis, síndrome séptico, lesión isquémica, enfermedad de injerto contra huésped, lesión por reperfusión y cáncer.

Description

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Usos terapéuticos de un extracto de etanol de oleorresina de Boswellia frereana.

La invención definida en las reivindicaciones 1-7 se refiere al uso de Boswellia frereana (comúnmente conocida como incienso) como medicamento; un extracto de Boswellia frereana donde el extracto es soluble en un disolvente orgánico y no comprende ácido boswélico; al menos un agente de dicho extracto; y una composición derivada de Boswellia frereana. La invención se refiere adicionalmente al uso terapéutico de dicho extracto, y/o dicho agente y/o dicha composición y, particularmente, pero no exclusivamente, al uso de dicho extracto, y/o dicho agente y/o composición como inhibidor de una afección inflamatoria tal como, por ejemplo, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), sepsis, síndrome séptico, lesión isquémica, enfermedad de injerto contra huésped, lesión por reperfusión y cáncer.

La Boswellia frereana es un producto natural de Somalia, África. El producto puede obtenerse de numerosos proveedores incluyendo [Resolve (WSS Ltd Va), Unit 12, Southwell Business Centre, Crew Lane Industrial Estate, Southwell, Nottinghamshire, NG25 OTX]; A F Suter & Co. Itd. [Unit 1, Beckingham Business Park, Beckingham Road, Tolleshunt Major, Essex, Reino Unido]; y Joseph Flach & Sons Ltd. [Unit 8, Maxwell Road, Woodston Industrial Estate, Peterborough, Cambridgeshire, PE2 7HU, INGLATERRA].

Introducción

La degradación del cartílago articular es una característica clásica de las artritis tanto degenerativas como inflamatorias, por ejemplo, osteoartritis (OA) y artritis reumatoide (AR). La OA se caracteriza por una pérdida de los proteoglicanos y el colágeno de la matriz extracelular (MEC), y estos eventos catabólicos están mediados principalmente por las metaloproteinasas de la matriz (MMP 1, 3, 9, y 13 (1-6)) y las agrecanasas (ADAMTS-4 y -5 (6-8)). La expresión diferencial de estas enzimas catabólicas está relacionada con el nivel de mediadores inflamatorios y citocinas en la articulación con OA. Las citocinas tales como la interleucina-1 (IL-1) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa), son mediadores clave en el manejo de la destrucción de ECM. Además de inducir la síntesis de las MMP y las agrecanasas, la IL-1 y el TNF-alfa también estimulan la producción de óxido nítrico, a través de la óxido nítrico sintasa inducible, y aumentan la síntesis de prostaglandina E2(PGE2), estimulando la expresión de la PGE2 sintasa y la ciclooxigenasa 2 (COX-2).

La incidencia de OA es prevalente en una población envejecida y obesa; existen estimaciones de 100 millones de personas con OA en la Unión Europea (9), y en los Estados Unidos, la carga de OA clínica ha alcanzado casi los 27 millones de personas en 2007 (10). El alivio del dolor y la rigidez, la mejora de la función física y el retraso del progreso de la enfermedad son importantes objetivos terapéuticos para gestionar la OA. Actualmente se prescriben fármacos analgésicos no opiáceos, antiinflamatorios no esteroideos (AINE), y terapias intra-articulares; el uso continuado de AINE se ha asociado con el sangrado del tracto G.I., y un aumento del riesgo de otros efectos secundarios adversos (11), haciendo que estén lejos del ideal para el tratamiento de una patología crónica. Por lo tanto, la identificación de otros agentes farmacéuticos potenciales que puedan usarse para aliviar los síntomas asociados con la OA, a la que vez que sigan siendo eficaces y no tóxicos, es una búsqueda continua.

Sin embargo, como resultará evidente para los expertos en la técnica, el medicamento descrito en el presente documento tiene aplicación en el tratamiento de cualquier afección inflamatoria en la que MMP9, PGE2 y NO son elevados o que está mediada por lnterleucina-1 tal como artritis reumatoide (AR), enfermedad inflamatoria intestinal (EII), sepsis, síndrome séptico, la osteoporosis, lesión isquémica, enfermedad de injerto contra huésped, lesión por reperfusión, asma, diabetes, cáncer, leucemia mielógena y otras, psoriasis y caquexia, enfermedad de Alzheimer, trastornos neurológicos desmielinizantes incluyendo esclerosis múltiple, trastornos de la retina, trastornos neurológicos, de la retina, y musculares.

En los últimos años, ha habido un interés creciente en el uso de compuestos derivados de hierbas para el alivio de los síntomas de una variedad de enfermedades tales como la OA, el cáncer de mama y próstata, la plasticidad neuronal/pérdida de memoria, la encefalomielitis y la enfermedad inflamatoria intestinal.

Las preparaciones de resina oleosa del género Boswellia (distinta de B. frereana), comúnmente conocida como incienso, se han sido identificado como potentes agentes antiinflamatorios, antiartríticos y antianalgésicos (revisado recientemente en (15, 16)). Tradicionalmente, se ha utilizado la especie Boswellia serrata exhaustivamente en el tratamiento de afecciones que se inician o se mantienen por eventos inflamatorios, incluyendo colitis colagenosa (17), enfermedad de Crohn (18), y tanto artritis reumatoide (19, 20) como osteoartritis (21-23). Los estudios demostraron que B. serrata tenía cierta eficacia en el tratamiento de estas afecciones inflamatorias. En dos modelos

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animales diferentes de artritis (inducida por carragenano e inducida por antígeno), la administración tópica de B. serrata en el sitio de la inflamación redujo el edema de pata de rata en aproximadamente el 50 % (20). Los principales ingredientes farmacológicamente activos de B. serrata son los ácidos alfa y p-Boswélicos (24), y Singh et al. insinuaron que el ácido alfa- o p-boswélico era capaz de actuar en las fases tanto tempranas como tardías de la inflamación (20). Se cree que B. serrata ejerce sus propiedades antiinflamatorias inhibiendo la 5-lipoxigenasa de una manera no competitiva, no redox ligada a enzima selectiva (25), e inhibiendo la actividad COX-1 (26).

Recientemente, la eficacia de 5-Loxin®, un extracto novedoso de B. serrata enriquecido con ácido 3-0-acetil-11-ceto- p-boswélico al 3%, se ha ensayado en ensayos clínicos en seres humanos para el tratamiento de la OA en la rodilla (23). Se observaron mejoras significativas en la puntuación de dolor y de capacidad funcional, y una reducción en la MMP3 del fluido sinovial (23).

Aparte de B. serrata (nativa de India), también se han identificado otros miembros de la familia de Boswellia incluyendo B. sacra (nativa de la península Arábiga) y B. carteri (27) y B.frereana (nativas de África).

Este trabajo ha demostrado que B. frereana no contiene ácido boswélico (alfa o beta), el principal principio farmacológicamente activo de B. Serrata, por lo tanto, resulta sorprendente descubrir que B. frereana es eficaz como antiinflamatorio y resulta interesante descubrir que este efecto antiinflamatorio opera a través de una ruta diferente a la utilizada por otros miembros del género Boswellia. De hecho, se ha descubierto por los autores que el componente o los componentes farmacológicamente activos de B. frereana operan, al menos parcialmente, a través de la supresión, desactivación o inhibición de la metaloproteinasa 9 de la matriz (MMP9). Adicionalmente, los autores de la presente invención también han descubierto que B. frereana inhibe la actividad acetilcolinesterasa y, por lo tanto, esto la hace útil para el tratamiento de trastornos neurológicos en los que la inhibición de la acetilcolinesterasa es beneficiosa, tal como en la enfermedad de Alzheimer. Además, los autores de la presente invención también han demostrado que B. frereana es eficaz en la eliminación de células cancerosas y, por lo tanto, esto la hace útil para el tratamiento del cáncer, en particular del cáncer de mama.

Declaraciones de la invención

De acuerdo con un primer aspecto, la invención se refiere a un extracto en etanol de oleorresina de Boswellia frereana que comprende un inhibidor de la metaloproteinasa 9 de la matriz (MMP9) para su uso en el tratamiento o la prevención de enfermedad inflamatoria intestinal (EII), sepsis, síndrome séptico, osteoporosis, lesión isquémica, enfermedad de injerto contra huésped, lesión por reperfusión, y cáncer.

Se indica en el presente documento que el extracto puede usarse para tratar (EII), osteoporosis, caquexia, trastornos de la acetilcolinesterasa, trastornos neurológicos, y musculares.

Idealmente el individuo que padece el trastorno inflamatorio o la afección mencionada es un mamífero y muy preferiblemente un primate o un animal que come pasto tal como un bóvido, óvido, équido, o suido, como alternativa, el individuo es un félido, cánido o roedor. Mucho más preferiblemente, el individuo es un ser humano.

También se describe el uso de Boswellia frereana en la preparación de un agente para el tratamiento o la prevención de los trastornos o afecciones expuestos anteriormente.

La descripción también indica un método para el tratamiento o la prevención de los trastornos o afecciones expuestos anteriormente, comprendiendo el método administrar a un paciente que necesite tal tratamiento una cantidad eficaz de Boswellia frereana.

Idealmente el paciente es un mamífero y mucho más preferiblemente un primate o animal que come pasto tal como un bóvido, óvido, équido, o suido, como alternativa, el individuo es un félido, cánido o roedor. Mucho más preferiblemente, el individuo es un ser humano. Se indica en el presente documento que un extracto de Boswellia frereana es soluble en una solución orgánica y comprende uno o más de:

a) un inhibidor de la metaloproteinasa 9 de matriz (MMP9),

b) un inhibidor de la síntesis de NO,

c) un inhibidor de la síntesis de PGE2; y

d) dicho extracto no afecta a la ruta de la 5-lipoxigenasa; y

e) dicho extracto no comprende ácido alfa o beta boswélico.

En el contexto de la presente invención, el término "extracto de Boswellia frereana" se refiere a una mezcla de

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componentes que están presentes en la oleo-resina de Boswellia frereana y que son solubles en etanol. El extracto se puede obtener mezclando la resina gomosa con el etanol y dejándolo durante un período de tiempo adecuado, por ejemplo, varios días, en un entorno sin luz de manera que los componentes solubles de la goma se extraigan en el etanol. Se elimina cualquier resina insoluble. El etanol puede eliminarse para dejar el extracto. Para que no haya lugar a dudas, "extracto" no hace referencia a un único componente, sino a la mezcla de componentes.

B. frereana es única ya que, en otras especies de Boswellia el hexano extrae solamente la fracción oleosa esencial (aceite volátil) y, además, en otras especies de Boswellia el etanol aísla solamente la fracción de resina. Sin embargo, con B. frereana tanto el hexano (no polar) como el etanol (polar) aíslan la fracción de resina que contiene epilupeol al 60%.

Se ilustra en el presente documento que, la extracción también se puede llevar a cabo utilizando otros disolventes de extracción tales como acetato de etilo, éter dietílico, cloroformo, cloruro de metileno, éter de petróleo, acetona, pentano, o tolueno. Otros disolventes adecuados serán bien conocidos por los expertos en la técnica de la extracción de componentes de plantas.

Preferiblemente, dicho extracto comprende el triterpeno pentacíclico epi-lupeol o un derivado del mismo o una sal de uno cualquiera de estos.

El epi-lupeol es un diastereoisómero del triterpeno pentacíclico lupeol. Los diastereómeros se definen como estereoisómeros que no son enantiómeros (es decir, imágenes especulares no superponibles entre sí). Los diastereómeros, a veces denominados diastereoisómeros generalmente tienen diferentes propiedades físicas y diferente reactividad que sus isómeros.

Otros componentes del extracto comprenden p-amirina, a-amirina, dímeros de a-felandreno, a-tuyeno y a-felandreno y sus isómeros y, cuando sea apropiado, sales. Se ilustra en el presente documento que el extracto tiene un cromatograma de GC-MS como el que se muestra en la Figura 6. Más preferiblemente, los principales componentes son epi-lupeol, p-amirina y dímero de alfa-felandreno.

Adicionalmente se ilustra que el extracto o un agente seleccionado entre epi-lupeol, p-amirina, a-amirina, dímeros de a-felandreno, a-tuyeno y a-felandreno; los isómeros de estos agentes distintos de lupeol; cuando sea apropiado, sales aceptables desde el punto de vista farmacéutico o veterinario; y mezclas de los mismos, para su uso en medicina, particularmente en el tratamiento o la prevención de las enfermedades y afecciones inflamatorias expuestas anteriormente.

Las sales farmacéutica o veterinariamente aceptables apropiadas incluyen sales de adición básicas tales como sales de sodio, potasio, calcio, aluminio, cinc, magnesio y otras sales de metales, así como colina, dietanolamina, etanolamina, etildiamina, megulmina y otras sales de adición básicas bien conocidas como se resume en Paulekuhn et al., (2007) J. Med. Chem. 50: 6665-6672y/o como se conoce por los expertos en la técnica.

La invención también proporciona o la descripción ilustra el uso del extracto de etanol en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de los trastornos o afecciones como se reivindica o como se describe en el presente documento, respectivamente.

En otro aspecto más de la invención, se proporciona una composición que comprende el extracto de la invención junto con un vehículo.

Generalmente, la composición será una composición farmacéutica o veterinaria y el vehículo será un vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable.

También se ilustra en el presente documento una composición que comprende un agente seleccionado de epi- lupeol, p-amirina, a-amirina, dímeros de a-felandreno, a-tuyeno y a-felandreno; los isómeros de estos agentes distintos de lupeol; cuando sea apropiado, sales farmacéutica o veterinariamente aceptables; y mezclas de los mismos; junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

También pueden estar presentes otros materiales activos, según se pueda considerar apropiado o aconsejable para la enfermedad o afección que se trata o se previene. Por ejemplo, la composición también puede contener un agente antibiótico o antibacteriano.

El vehículo, o, si están presentes más de uno, cada uno de los vehículos, deben ser aceptables en el sentido de ser

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compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no perjudiciales para el receptor.

Las formulaciones incluyen aquellas adecuadas para la administración nasal, bronquial (inhalada), tópica (incluyendo gotas oculares, bucal y sublingual), parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, intraarticular e intradérmica) y se pueden preparar mediante cualquier método bien conocido en la técnica farmacéutica.

Las composiciones preferidas se formulan para la administración intraarticular, intravenosa, parenteral, oral, nasal, bronquial o tópica.

La composición puede prepararse poniendo en asociación el extracto de la invención y el vehículo. En general, las formulaciones se preparan poniendo en asociación uniforme e íntimamente el agente activo con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos, o ambos, y luego, si fuera necesario, moldeando el producto. La descripción se extiende a los métodos para preparar una composición farmacéutica que comprende poner un extracto de la invención en conjunto o asociación con un vehículo o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable.

Las formulaciones para la administración oral de la presente invención se pueden presentar como: unidades discretas tales como cápsulas, sobres o comprimidos que contienen cada uno una cantidad predeterminada del agente activo; como polvo o gránulos; como una solución o suspensión del agente activo en un líquido acuoso o un líquido no acuoso; o como una emulsión líquida de aceite en agua o una emulsión líquida de agua en aceite; o como un bolo, etc.

Para las composiciones para administración oral (por ejemplo, comprimidos y cápsulas), el término "vehículo aceptable" incluye vehículos tales como excipientes comunes por ejemplo, agentes aglutinantes, por ejemplo jarabe, acacia, gelatina, sorbitol, tragacanto, polivinilpirrolidona (Povidona), metilcelulosa, etilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, hidroxipropilmetilcelulosa, sacarosa y almidón; cargas y vehículos, por ejemplo almidón de maíz, gelatina, lactosa, sacarosa, celulosa microcristalina, caolín, manitol, fosfato dicálcico, cloruro de sodio y ácido algínico; y lubricantes tales como estearato de magnesio, estearato de sodio y otros estearatos metálicos, estearato de glicerol, ácido esteárico, silicona líquida, talco, ceras, aceites y sílice coloidal. También se pueden utilizar agentes saporíferos tales como menta, aceite de gaulteria, aroma de cereza y similares. Puede ser deseable añadir un agente colorante para hacer que la forma de dosificación sea fácilmente identificable. Los comprimidos también se pueden recubrir mediante métodos bien conocidos en la técnica.

Se puede elaborar un comprimido por medio de compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Se pueden preparar comprimidos por medio de compresión en una máquina adecuada del agente activo en una forma de flujo libre tal como polvo o gránulos, opcionalmente mezclado con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, conservante, agente tensioactivo o dispersante. Los comprimidos moldeados se pueden elaborar mediante moldeo en una máquina adecuada de una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos se pueden recubrir o marcar opcionalmente y se pueden formular de manera que proporcionen una liberación lenta o controlada del agente activo.

Otras formulaciones adecuadas para la administración oral incluyen grageas que comprende el agente activo en una base aromatizada, normalmente sacarosa y acacia o tragacanto; pastillas que comprenden el agente activo en una base inerte tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia; y enjuagues bucales que comprenden el agente activo en un vehículo líquido adecuado.

Para la aplicación tópica a la piel, los compuestos se pueden elaborar en crema, pomada, gelatina, solución o suspensión, etc. Las formulaciones en crema o pomada que se pueden utilizar para el fármaco son formulaciones convencionales bien conocidas en la técnica, por ejemplo, como se describe en los libros de texto convencionales de fármacos tales como la British Pharmacopoeia.

Los extractos descritos en el presente documento pueden usarse para el tratamiento del tracto respiratorio por medio de administración nasal, bronquial o bucal, por ejemplo, de aerosoles o pulverizaciones que pueden dispersar el principio farmacológicamente activo en forma de un polvo o en forma de gotas de una solución o suspensión. Las composiciones farmacéuticas con propiedades de dispersión de polvo contienen normalmente, además del principio activo, un propulsor líquido con un punto de ebullición por debajo de la temperatura ambiente y, si se desea, coadyuvantes, tales como tensioactivos y/o diluyentes no iónicos o aniónicos sólidos o líquidos. Las composiciones farmacéuticas en las que el principio farmacológico activo está en solución, contienen, además de esto, un propulsor adecuado, y además, si fuera necesario, un disolvente adicional y/o un estabilizador. En lugar del propulsor, también se puede utilizar aire comprimido, siendo posible producir esto según se requiera por medio de un dispositivo de

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compresión y expansión adecuado.

Las formulaciones parenterales serán generalmente estériles.

La cantidad precisa de un extracto de la presente invención que es terapéuticamente eficaz, y la ruta por medio de la cual semejante compuesto se puede administrar mejor, pueden determinarse fácilmente por un experto en la técnica comparando el nivel del agente en sangre con la concentración requerida para tener un efecto terapéutico.

Adicionalmente se ilustra en el presente documento un método para el tratamiento o la prevención de un trastorno o afección como los expuestos anteriormente, que comprende administrar a un paciente que necesite semejante tratamiento una cantidad eficaz de:

a. un extracto de la invención; o

b. un agente seleccionado de epi-lupeol, p-amirina, a-amirina, dímeros de a-felandreno, a-tuyeno y a-felandreno; los isómeros de estos agentes distintos de lupeol; cuando sea apropiado sus sales; y mezclas de los mismos; o

c. una composición de acuerdo con la invención.

Adicionalmente se ilustra en el presente documento un método para obtener un extracto de Boswellia frereana que comprende:

a) obtener oleo-resina de Boswellia frereana;

b) exponer dicha resina a un líquido orgánico en un entorno impermeable a la luz;

c) eliminar cualquier resina insoluble; y

d) eliminar el disolvente para producir extracto de Boswellia frereana.

La eliminación del disolvente de la etapa (d) se puede lograr mediante evaporación.

Como alternativa, la precipitación de una fracción sólida de triterpeno se puede obtener mediante la adición de agua a la mezcla de extracción orgánica, idealmente, esta etapa tiene lugar después de eliminar la resina insoluble.

Idealmente la resina se expone a etanol, preferiblemente etanol, e idealmente etanol del 100%. Sin embargo, se ilustra en el presente documento que, también se pueden utilizar otros disolventes orgánicos tales como acetato de etilo, éter dietílico, cloroformo, cloruro de metileno, éter de petróleo, acetona, pentano, o tolueno.

Los componentes del extracto se identificaron usando cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) usando un cromatógrafo de gases Agilent Technologies 6890N equipado con un detector selectivo de masa Agilent 5973 Network y un automuestreador de la serie Agilent 7683.

El extracto comprendía el triterpeno pentacíclico epi-lupeol. Otros componentes del extracto fueron p-amirina, a- amirina, dímeros de a-felandreno, a-tuyeno y a-felandreno. El extracto tiene un cromatograma de GC-MS como el que se muestra en la Figura 6 a partir de la cual se puede observar que los componentes principales son epi-lupeol, p-amirina y dímeros de a-felandreno.

Opcionalmente, una vez que se ha obtenido el extracto, este se disuelve en un disolvente orgánico, típicamente un disolvente alcohólico tal como metanol o etanol, más usualmente etanol e, idealmente etanol al 100% a una concentración de aproximadamente 10 mg/ml.

Adicionalmente se ilustra en el presente documento un extracto que puede obtenerse mediante el método mencionado anteriormente de la invención.

Adicionalmente se ilustra en el presente documento una fuente novedosa de un triterpeno pentacíclico tal como epi- lupeol, donde dicha fuente es Boswellia frereana. Además, la fuente anteriormente mencionada es también una fuente de p-amirina, a-amirina, dímeros de a-felandreno, a-tuyeno y a-felandreno. Adicionalmente, el método anterior proporciona un modo en el que dichos triterpeno pentacíclico y p-amirina, a-amirina, dímeros de a- felandreno, a-tuyeno y a-felandreno pueden ser extraídos de la fuente.

La invención se ilustrará a continuación a modo de ejemplo solamente con referencia a las siguientes figuras, donde el trabajo sobre el cartílago no pertenece a la presente invención:

La Figura 1 muestra que Boswellia frereana no inhibe la liberación de sGAG inducida por IL-1a/OSM de

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explantes de cartílago. B. frereana(100 pg/ml) no afectó a los niveles de sGAG en A. tejido, y B. liberación acumulativa al medio de explantes de cartílago tratados con 5 ng/ml de IL-1a y 10 ng/ml de OSM, a lo largo de un período de 28 días (ensayo DMMB). Los datos se expresan como la sGAG media por peso seco de tejido (pg/mg) ± SEM (n = 4) (* * p <0,01, ♦ ♦ ♦ p <0,001 para la comparación entre explantes tratados con IL-1a/OSM o sin tratar;

la Figura 2 muestra que la Boswellia frereana previene la liberación de colágeno inducida por IL-1a/OSM de explantes de cartílago. B. frereana (100 pg/ml) no tuvo efecto sobre los niveles de colágeno en A. explantes de cartílago tratados con 5 ng/ml de IL-1 a y 10 ng/ml de OSM, sin embargo B. B. frereana inhibió la liberación de colágeno al medio, es decir, la degradación de colágeno después de 28 días de tratamiento con citocina (ensayo de hidroxiprolina). Los datos se expresan como el colágeno medio por peso seco de tejido (pg/mg) ± SEM (n = 4) (♦ ♦

♦ p <0,001 para la comparación entre los explantes tratados con IL-1a/OSM o sin tratar, ***p = 0,001 para la comparación entre los explantes tratados con IL-1a/OSM +/- 100 pg/ml de B. frereana);

la Figura 3 muestra que la expresión/activación de MMP9 inducida por IL-1a/OSM se inhibe por Boswellia frereana, como se manifiesta por la reducción de la transcripción de MMP 9. B. frereana (100 pg/ml) inhibió la expresión de pro-MMP 9 y MMP 9 activa, y redujo la activación de MMP 2 de explantes de cartílago tratados con 5 ng/ml de IL-1 a y 10 ng/ml de OSM. Los zimogramas de gelatina representativos de A. día 7 y B. día 28 solamente se analizan en esta Figura para mantener la brevedad, pero las tendencias son representativas de las observadas en los días 3, 14 y 21. Los datos se expresan como la media de pro-MMP o MMP activa (unidades densitométricas) liberadas por peso seco de tejido (unidades densitométricas/mg de peso seco de tejido) ± SEM (n = 4) (* * * p <0,001 para ^comparación entre la pro-MMP 9 liberada de explantes no tratados frente a tratados con IL-1a/OSM; p <0,05,***p <0,001 para la comparación entre la MMP 2 activa y la pro-MMP 9, respectivamente, liberadas de explantes tratados con IL-1a/oSM +/-100 pg/ml de B. frereana). C. B. frereana suprimió parcialmente el ARNm de MMP 9 inducido por citocina en explantes tratados durante 3 días (qPCR). Los datos se presentan como la media de la expresión de MmP 9 (unidades arbitrarias) ± SEM (n = 4) (p = 0,079);

la Figura 4 muestra que la producción de nitrito inducida por IL-1a/OSM y la expresión de ARNm de iNOS se suprimen por Boswellia frereana. A. B. frereana(100 pg/ml) inhibió significativamente el nitrito liberado de explantes de cartílago tratados con 5 ng/ml de IL-1 a y 10 ng/ml de OSM durante un período de 28 días (ensayo de Griess). Los datos se expresan como la media de nitrito liberado por peso seco de tejido (pM/mg de peso seco de tejido) ± SEM (n = 4). B. Los niveles de ARNm de iNOS se inhibieron por B. frereana en explantes estimulados con citocina tratados durante 3 días (qPCR). Los datos se presentan como la media de la expresión de iNOS (unidades

arbitrarias) ± SEM (n = 4) (* * p <0,01,* * * p <0,001 para la comparación entre explantes tratados con IL-1a/OSM o

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sin tratar, y p <0,05, p <0,01, p <0,001 para la comparación entre explantes tratados con IL-1a/OSM +/- 100 pg/ml de B. frereana);

la Figura 5 muestra que Boswellia frereana suprime la producción de PGE2 inducida por IL-1a/OSM, PGE2 sintasa y la expresión de ARNm COX-2. A. La PGE2 liberada de explantes de cartílago tratados con 5 ng/ml de IL- 1a y 10 ng/ml de OSM se inhibió significativamente en presencia de 100 pg/ml de B. frereana durante un periodo de 28 días (ELISA de PGE2). Los datos se expresan como la media de PGE2 liberada por peso seco de tejido (pg/mg de peso seco de tejido) ± SEM (n = 4). B. Los niveles de PGE2 sintasa y ARNm COX-2 inducidos por citocinas también se suprimieron por B. frereana en explantes tratados durante 3 días (qPCR). Los datos se presentan como

la media de la expresión del gen (unidades arbitrarias) ± SEM (n = 4) (* p <0,05,* * p <0,01,* * * p <0,001 para la

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comparación entre explantes tratados con IL-1a/OSM o sin tratar, y p <0,05, p <0,01, p <0,001 para la comparación entre explantes tratados con IL-1a/OSM +/- 100 pg/ml de B. frereana);

la Figura 6 muestra que Epi-lupeol es el constituyente predominante de Boswellia frereana. Identificación de los principales constituyentes químicos de los extractos etanólicos de B. frereana usando cromatografía de gases con espectrometría de masas. A. La corriente de iones totales generó cromatogramas de gases, donde los números corresponden a los constituyentes identificados. El eje y del cromatograma superior se ha ampliado para mostrar los constituyentes volátiles obtenidos a lo largo de los 50 minutos iniciales, B. El cromatograma inferior representa compuestos identificados durante el análisis de 90 minutos completo. El pico más grande (n.° 18), y que representa el constituyente principal, se identificó como epi-lupeol, que representa casi el 60% del extracto de B. frereana. También se identificaron cantidades traza de otros compuestos, incluyendo derivados de lupeol;

la Figura 7 muestra la corriente de iones total (TIC) que generó cromatogramas para la identificación de: A) Extracto de aceite esencial de B. frereana. El mayor pico identificado para el aceite esencial fue dímero de a-felandreno

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(11%) B) Extracto en hexano de B. frereana usando cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS). El pico principal identificado es epi-Lupeol (60%);

la Figura 8 muestra el espectro de masas (El+ve) de epi-Lupeol obtenido en el tiempo de retención de 79,99 minutos;

la Figura 9 muestra estructuras químicas de terpenos que están comúnmente presentes en B. frereana;

la Figura 10 muestra extractos en etanol de árboles de especies de Boswellia que ilustran diferentes contenidos de goma. Vaso de precipitados 1) B. papyrifera,Vasos de precipitados 2-5) B. frereana,Vasos de precipitados 6-7) B. carteri.

B. frereana es la única especie con apenas alguna cantidad de goma de polisacárido presente;

la Figura 11 muestra la actividad anti-acetilcolinesterasa de extracto de B. frereana A) placa de TLC de control sin aplicar ninguna muestra para investigar falsos positivos. B) Se aplicaron a la placa de TLC 20 pl de extractos de B. frereana a diferentes concentraciones y 20 pl de bromhidrato de galantamina. Se aplicaron las siguientes muestras: 1) 101,6, 2) 50,8, 3) 25,4, 4) 12,7, 5) 6,35, 6) 3,17 mg/ml, 7) bromhidrato de galantamina (1 mM). Ambas placas se desarrollaron con una fase móvil de tolueno: acetato de etilo (90:10) y se pulverizaron con DTNB 2,5 mM/ATCL 2,5 mM en tampón Tris-HCI 50 mM (pH 8,0) seguido de pulverización con solución de enzima aceticolinesterasa (4 U/ml). Se observó actividad AChE en forma de manchas de color blanco brillante sobre un fondo de dolor amarillo. C) Detección de compuestos presentes en los extractos en etanol de B. frereana. A la placa de TLC se le aplicaron 20 pl de extractos de B. frereana a diferentes concentraciones: 1) 101,6, 2) 50,8, 3) 25,4, 4) 12,7, 5) 6,35, 6) 3,17 mg/ml. La placa se desarrolló con una fase móvil de tolueno:acetato de etilo (90:10) y se pulverizó con reactivo de detección de anisaldehído.

La Figura 12 muestra las propiedades anti-tumorales de extractos de B. frereana sobre células de cáncer humano, particularmente células de cáncer de mama de la línea celular de cáncer de mama MCF-7, los dos gráficos muestran el efecto de extracto etanólico de B. frereana sobre células MCF-7 en un intervalo de 0-2000 pg/ml. La respuesta se midió después de 24, 48 y 72 horas por medio de la absorbancia de producto de formazán utilizando el ensayo MTS. Los valores se expresan como la absorbancia corregida media de 8 pocillos. Las células se sembraron a 5 x 104 células/cm2 con 0,1 ml de medio de crecimiento por pocillo. El extracto de B. frereana se añadió 24 horas después de la siembra. La concentración de etanol se ajustó en todos los pocillos para que contuvieran el 0,77%. Después de 24, 48 y 72 horas más, un ensayo MTS. La absorbancia se leyó usando el FLUOstar OPTIMA.

La Tabla 1 muestra los Cebadores utilizados en los ensayos de PCR cuantitativa usando la detección SYBR Green®. Se diseñaron cebadores para secuencias de GenBank utilizando el software de diseño de cebadores Primer 3 (
http://www.frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3 www.cgi);

Tabla 2. Contenido de resina de oleorresina de B. frereana después de la extracción con hexano (disolvente no polar) y etanol (disolvente polar);

la Tabla 3 muestra una comparación del contenido de goma de Boswellia frereana con una especie relacionada; la Tabla 4 muestra un resumen de los componentes de la oleorresina de B. frereana;

la Tabla 5 muestra el contenido de aceite esencial de la oleorresina de B. frereana extraída por medio de hidro- destilación; y

la Tabla 6 muestra los componentes químicos identificados en diferentes extractos de oleorresina de B. frereana (aceite esencial, hexano y etanol); y

La Tabla 7 muestra los valores de DL50 de células MCF-7 a las 24, 48 y 72 h de incubación.

Materiales y métodos

Todos los reactivos se adquirieron Sigma (Poole, Reino Unido) a menos que se especifique otra cosa. El medio de cultivo consistió en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (medio DMEM glutamax l™/HAMS F12 (1:1), Invitrogen, Reino Unido) complementado con 100 Unidades/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, 50 pg/ml de L- ascorbato-2-fosfato y 1X Insulina-Transferrina-Selenito de sodio (ITS).

Las oleorresinas de incienso somalí, Boswellia frereana (nombre Somalí Maidi) y Boswellia carteri (nombre Somali Beyo) se obtuvieron en Hargeysa en Somalilandia (norte de Somalia). El incienso etíope (Boswellia papyrifera) fue amablemente suministrado por Mr Abdi Farah (Somaliland Frankincense Company, Cardiff). Los disolventes etanol absoluto y hexano (calidad analar) se adquirieron en Fischer Scientific (Loughborough).

Extracción de Boswellia frereana (para bio-ensayo)

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Se recogió resina gomosa de Boswellia frereana y los componentes activos se prepararon extrayendo la resina gomosa (20 g) sucesivamente con etanol (100%) durante 7 días en un recipiente impermeable a la luz. La resina gomosa insoluble se retiró por filtración y el disolvente se evaporó a 60 °C. Más específicamente, se pesó con precisión una cantidad conocida de oleorresina de B. frereana (20 g), se colocó en un vaso de precipitados de vidrio de 500 ml y se añadieron 100 ml de etanol. La mezcla se agitó con una espátula, se cubrió con papel aluminio y Para-film y después se dejó reposar durante siete días. El extracto en etanol se filtró utilizando un filtro Express™ Millipore de 150 ml. El disolvente se evaporó en una corriente suave de nitrógeno a una temperatura de 60 °C. El extracto de B. frereana resultante se disolvió en etanol a una concentración de 10 mg/ml para dar la reserva de trabajo y se almacenó a -20 °C.

Los constituyentes químicos de los extractos de B. frereana se analizaron por cromatografía de gases- espectrometría de masas (GC-MS) usando un cromatógrafo de gases Agilent Technologies 6890N equipado con un detector selectivo de masa Agilent 5973 Network y un automuestreador de la serie Agilent 7683. (Véase la figura 6). Se utilizó un intervalo de barrido de 35 a 450 unidades de masa para adquirir los datos del espectro de masas con un tiempo de muestreo de 2 que corresponde a 3,5 barridos por segundo. La adquisición de datos se realizó usando el soporte lógico informático MSD Chemstation™. La identificación de los picos individuales se realizó comparando los espectros de masas de las muestras con los almacenados en la base de datos de la biblioteca del National Institute of Standards and Technology (NIST) que contiene más de 54.000 espectros y mediante comparación de los espectros de masas de las muestras con los valores publicados en la bibliografía.

El National Institute of Standards and Technology es un laboratorio de investigación de ciencias físicas y una agencia del U.S. Department of Commerce. (sitio web -
www.nist.gov). Se encuentra disponible en el mercado una biblioteca de espec. de masas alternativa en Wiley (sitio web -www.siswe b.co m/softwa re/ms/wi lev.htm#wilev8).

Caracterización química: Comparación del Contenido de Resina y goma de oleorresinas de B. frereana B. carteri y B. Papyrifera

Se trituraron por separado gránulos de oleorresina de Boswellia de B. carteri, B. frereana y B. papyrifera, hasta un polvo con un mortero. Se colocaron 40 g del polvo de cada oleorresina en vasos de precipitados de vidrio de 500 ml separados y se añadieron 100 ml de etanol absoluto a cada vaso de precipitados. Las mezclas se agitaron con una espátula, se cubrieron con papel aluminio y Para-film y después se dejaron reposar durante tres días. Después de este período de tiempo los extractos en etanol se agitaron y después se filtraron a vacío, utilizando un filtro Express™ Millipore de 150 ml. El peso de la goma insoluble en etanol (polisacárido) que quedó en cada filtro se registró y los extractos en etanol filtrados se almacenaron a -20 °C.

Caracterización química: Extracción de hexano de B. frereana

Se extrajo resina gomosa de Boswellia frereana (20 g) utilizando hexano como disolvente durante 3 días en un recipiente impermeable a la luz. La resina gomosa insoluble se eliminó centrifugando a 2000 rpm durante 30 minutos y la capa clara de sobrenadante se retiró. El hexano disolvente se evaporó en una corriente suave de nitrógeno a una temperatura de 40 °C y se almacenó a -20 °C.

Caracterización química: Extracción de aceite esencial de oleorresinas de B. frereana

Se puso agua desionizada (1 litro) en un aparato de destilación de vapor de agua, a través de la parte inferior del recipiente de vidrio, y se colocaron 50,6 g de oleorresina de B. frereana en la parte superior del recipiente de vidrio. Los dos recipientes de vidrio estaban separados físicamente solo por una malla de metal perforado. El manto térmico se ajustó a una potencia máxima y el agua se calentó hasta ebullición. El producto destilado (300 ml) se recogió en un contenedor de vidrio de 500 ml, se añadieron 100 ml de hexano y la mezcla se sacudió. La capa de hexano (capa superior) se eliminó, se transfirió a un contender limpio y el disolvente se eliminó por evaporación en una corriente suave de nitrógeno para proporcionar un aceite aromático de color amarillo (0,44 g).

Modelo in vitro de degeneración de cartílago

Se recogió cartílago articular profundo (explantes de 6 mm de diámetro) de la articulación metacarpo-falángica de terneras bovinas de 7 días de edad utilizando un troquel para biopsia. Los explantes de cartílago se estabilizaron durante 3 días en medio de cultivo antes del tratamiento. Se estableció un modelo de degradación de cartílago in vitro, caracterizado por la pérdida de agrecano y la proteolisis de colágeno de tipo II (29, 30), tratando explantes de cartílago con 5 ng/ml de IL-1a recombinante (Peprotech, Reino Unido) y 10 ng/ml de oncostatina M recombinante

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humana (OSM; Peprotech, Reino Unido), en presencia o ausencia de 100 |jg/ml de extracto de B. frereana; los explantes no tratados sirvieron como control. Los cultivos se mantuvieron a lo largo de un período de 28 días, con reposición de medio y/o tratamientos cada 3 días. El tejido y el medio se recogieron después de 3, 7, 14, 21 y 28 días de cultivo. Los explantes de cartílago se liofilizaron a lo largo de un período de 48 horas y todos los datos bioquímicos se normalizaron al peso seco de tejido (mg). Para el análisis de ARNm, los explantes se cultivaron con los tratamientos indicados anteriormente durante 3 días para permitir la investigación de los cambios en los genes tempranos. Los explantes se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido antes de la extracción del ARN.

Ensayo de citotoxicidad: Cytotox 96®

Se evaluó la viabilidad celular utilizando el ensayo de citotoxicidad no radiactiva CytoTox 96® (Promega) (31). El ensayo enzimático mide cuantitativamente los niveles de lactato deshidrogenasa en el medio de cultivo como consecuencia de la lisis celular es decir, a través de la muerte celular. El medio de cultivo (50 jl) se pipeteó a una placa de 96 pocillos y se mezcló con 50 jl de mezcla de sustrato reconstituido (componente del kit). Después de 30 minutos de incubación a la temperatura ambiente evitando la luz, se determinaron los valores de absorbancia a 492 nm utilizando un lector de placa.

Análisis de glucosaminoglicanos sulfatados: Ensayo de Azul de Dimetilmetileno (DMMB)

Se determinaron los niveles de glucosaminoglicanos sulfatados (sGAG) en los explantes de tejido y liberados al medio utilizando el ensayo DMMB (32). Los explantes de tejido (50 mg de tejido: 1 ml de tampón) se pusieron en tampón de digestión (fosfato de sodio 20 mM (pH 6,8), EDTA 1 mM, DTT 2 mM) que contenía 300 pg de papaína (proteinasa no específica de la matriz). Las muestras se incubaron a 60 °C durante 1 hora, o hasta que el tejido se hubo disuelto completamente. Se añadió yodoacetamida 10 mM a las muestras para alquilar los grupos sulfhidrilo reactivos (generados por tratamiento con DTT) y las muestras se llevaron a un volumen final de 5 ml (Tris 50 mM (pH 8,0). Se preparó una dilución seriada utilizando condroitina-4-sulfato de ballena (sulfato C) con patrones que variaban de 0 - 50 jg/ml. Los patrones se prepararon en el mismo tampón que las muestras bajo análisis, es decir, para medio - DMEM-glutamax I™, y para extractos de tejidos - tampón de extracción (Tris 50 mM (pH 8,0)). Se pipetearon 40 jl de patrones y muestras por triplicado en una placa de 96 pocillos seguido de la adición de 200 jl de reactivo DMMB (1,6% (p/v) de azul de 1,9-dimetilmetileno, hidróxido de sodio al 3% (v/v), etanol al 1% (v/v), ácido fórmico al 0,35% (v/v)). La placa se leyó inmediatamente a una longitud de onda de 525 nm, y se determinaron las concentraciones de sGAG a partir de la lectura directamente de la curva patrón. Cualquiera de las muestras con una lectura fuera de los límites de la curva patrón se diluyó en su respectivo tampón, los patrones se pipetearon a pocillos nuevos y las muestras se volvieron a ensayar.

Análisis de colágeno: Ensayo de hidroxiprolina

Se determinó la cantidad de colágeno dentro y liberado del cartílago utilizando el ensayo de hidroxiprolina utilizando una adaptación del método de Woessner (31). Brevemente, se hidrolizaron explantes de tejido y muestras de medio en HCI 12 N o 6 N, respectivamente, a 110 °C durante 24 horas y las muestras se liofilizaron. Se preparó una curva patrón disolviendo 4-hidroxiprolina en DMEM-glutamax I™ para dar un intervalo de 1 - 10 jg/ml. Los productos hidrolizados (30 jl) y los patrones se añadieron por triplicado a una placa de 96 pocillos seguido de 70 jl de diluyente (isopropanol del 66% (v/v)) y 50 jl de oxidante (cloramina T 18 mM, 50% (v/v) de tampón de reserva) antes de la incubación a la temperatura ambiente durante 5 minutos. Se añadió reactivo de color (dimetilamino benzaldehído 3,7 mM, ácido perclórico al 15% (v/v), isopropanol del 85% (v/v)) (125 jl) y se incubó a 70 °C durante 40 minutos. Se detectó la absorbancia (540 nm) y se calculó el contenido de hidroxiprolina a partir de la curva patrón. Cualquiera de las muestras con una lectura fuera de los límites de la curva patrón se diluyó en su respectivo tampón, los patrones se pipetearon a pocillos nuevos y las muestras se volvieron a ensayar. Se calculó el colágeno total multiplicando los valores de hidroxiprolina por un factor de 7,14 (33).

Zimografía en gelatina: Análisis de expresión/activación de las MMP 2 y 9

Se evaluaron la expresión y la activación de las MMP 2 y 9 en muestras de medio experimental por medio de zimografía en gelatina (34). Las muestras de medio se desnaturalizaron en un tampón de muestra de doble dilución (Tris 60 mM (pH 6,8), SdS al 2% (p/v), glicerol al 10% (p/v), Azul de Bromofenol al 0,01% (p/v)) a 60 °C durante 30 minutos. Brevemente, las muestras se cargaron sobre un gel de poliacrilamida SDS al 7,5% (p/v) que contenía 0,5 mg/ml de gelatina porcina (BDH, Poole, Reino Unido), y se hicieron circular en 1X tampón de Laemmli (Tris 25 mM, glicina 0,192 M, SDS al 0,1%) a 150 V durante aproximadamente 60 minutos o hasta que el frente de colorante estuvo cerca del final del gel. Las muestras se cargaron en un valor de peso seco equivalente teniendo en cuenta las diferencias en el volumen de medio acumulado a lo largo del cultivo de 28 días. Los geles se lavaron 3 veces en

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Tritón X-100 al 2,5% para eliminar el SDS y permitir la renaturalización de la enzima. Los geles se incubaron durante la noche en tampón de proteolisis de MMP (Tris 50 mM (pH 7,8), CaCl2 50 mM, NaCI 0,5 M) a 37 °C para activar las enzimas latentes. Los geles se tiñeron con posterioridad (azul brillante de Coomassie R-250 al 0,25% (p/v), ácido acético glacial al 10% (v/v), metanol del 45% (v/v)) durante 1 hora. Se observaron zonas aclaradas de actividad gelatinolítica después de la decoloración (ácido acético glacial al 7,5% (v/v), metanol del 10% (v/v)) durante al menos una hora o hasta que fueron evidentes zonas de gelatinolisis. Se analizaron sus cantidades relativas mediante densitometría de barrido (UMAX MagicScan) y software de imágenes NIH (NIH, Bethesda, MD).

Análisis de Griess: medición de niveles de nitrito

Se determinaron las concentraciones absolutas de nitrito, un producto final estable de NO, en el medio de cultivo utilizando el ensayo de Griess (Promega). Se generó una curva patrón de nitrito utilizando solución madre de nitrito de sodio 0,1 M (componente del kit). La solución se diluyó hasta una concentración 100 pM (utilizando dH2O), y se realizó una dilución seriada a la mitad (variando los patrones de 1,56 pM a 100 pM). Las muestras de medio (50 pl) se pipetearon por triplicado en una placa de 96 pocillos, se añadieron 5o pl de solución de sulfanilamida y la placa se incubó a la temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadió una solución NED (50 pl) a cada pocillo y se detectó la absorbancia a una longitud de onda de 540 nm. Se determinó el nitrito (pM) mediante comparación con la curva patrón de nitrito. Cualquiera de las muestras con una lectura fuera de los límites de la curva patrón se diluyó en su respectivo tampón, los patrones se pipetearon a pocillos nuevos y las muestras se volvieron a ensayar.

ELISA de PGE2: medición de los niveles de prostaglandina E2

Se midió la producción de PGE2 en el medio de cultivo usando un ELISA de alta sensibilidad (PGE2HS-EIA; Cambridge Biosciences). Los patrones de PGE2 se prepararon a partir de una solución madre de 50 ng/ml (componente del kit) para proporcionar una curva patrón que oscilaba de 20 pg/ml a 640 pg/ml. Los patrones, los controles negativos y las muestras de medio (100 pl) se pipetearon por triplicado en una placa de 96 pocillos seguido de la adición de 50 pl de producto conjugado de PGE2 HS-EIA peroxidasa. Se añadió anticuerpo para PGE2 HS-EIA (50 pl) a cada pocillo y la placa se incubó durante la noche a 4°C. El contenido de la placa se eliminó y los pocillos se lavaron tres veces con 400 pl de tampón de lavado (componente del kit). Tras la eliminación del tampón de lavado, se añadieron 200 pl de sustrato pNpp a cada pocillo y se midió la absorbancia a una longitud de onda de 450 nm utilizando un lector de placa. Las absorbancias se normalizaron restando la absorbancia del control negativo. Se realizó un gráfico logarítmico de patrones de PGE2 frente a la absorbancia, y se calculó la concentración de PGE2 en las muestras. Cualquiera de las muestras con una lectura fuera de los límites de la curva patrón se diluyó en su respectivo tampón, los patrones se pipetearon a pocillos nuevos y las muestras se volvieron a ensayar.

Extracción de ARN, síntesis de ADNc y análisis de PCR cuantitativa

Se homogeneizaron explantes de cartílago en 1 ml de Reactivo Trizol™ (Invitrogen) en N2 líquido (2000 rpm, 1,5 minutos) usando un desmembrador (B. Braun Biotech Int., Alemania), se extrajo el ARN total y se generó ADNc como se ha descrito previamente (35, 36). Brevemente, se añadieron 175 pl de cloroformo al Trizol™ que contenía el cartílago homogeneizado, se mezclaron mediante inversión varias veces y se incubaron a la temperatura ambiente durante 5 minutos. La fase que contenía ARN se recogió por centrifugación de las muestras (14.000 rpm, 15 minutos, 4 °C) y eliminación del componente acuoso superior a un tubo eppendorf estéril. Se añadió un volumen igual de isopropanol a la fase acuosa que contenía ARN, el tubo se invirtió varias veces para mezclar y el ARN precipitó durante la noche a -20 °C. El ARN se sedimentó centrifugando las muestras (14.000 rpm, 15 minutos, 4 °C); el sobrenadante se eliminó y el sedimento se lavó con 1 ml de etanol del 75%. El ARN se sedimentó mediante centrifugación (14.000 rpm, 5 minutos, 4 °C), el sobrenadante se descartó y el sedimento que contenía ARN se secó al aire a la temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos o hasta que el etanol se hubo evaporado completamente. Las muestras se trataron con ADNasa (1U de ADNasa, tampón de ADNasa al 10% (v/v)) a 37 °C durante 30 minutos.

Los componentes de ADNasa residuales se eliminaron mediante la adición de DNA-later al 10% (v/v) (Ambion) seguido de centrifugación (10.000 rpm, 2 minutos) para sedimentar los contaminantes; el ARN permanece en el sobrenadante. La primera hebra de ADNc se sintetizó (20 pl de volumen de reacción) utilizando transcriptasa inversa Superscript™ III (Invitrogen). Brevemente, se añadieron 1 pg de cebadores al azar y dNTP 500 pM a 10 pl de ARN y se incubaron a 65 °C durante 5 minutos. Después de añadir 5x tampón de la primera hebra, DTT 200 mM y 10 U de Inhibidor de ARNasa recombinante (Promega), la muestra se incubó a 42 °C durante 2 minutos. Se añadieron 200 U de transcriptasa inversa Superscript™ III (Invitrogen) a la muestra y se incubaron durante 50 minutos a 42 °C; la reacción se terminó calentando la muestra a 70 °C durante 15 minutos. Se realizó la PCR en tiempo real usando un Sistema de QPCR Mx3000® (Stratagene). Se diseñó un ensayo de qPCR en tiempo real, basándose en la detección

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de SYBR Green®, para el perfilado transcripcional de ¡NOS, PGE2 sintasa, COX-2 (37) y MMP 9 en las muestras de ADNc, después de la normalización al gen constitutivo 18S (38). Se diseñaron cebadores para el marco de lectura abierto de iNOS, PGE2 sintasa y MMP 9 utilizando el software de diseño de cebadores Primer 3 (
http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3 www.cgi) (Tabla 1). Brevemente, se añadieron 12,5 pl de tampón Sybr® Green Jumpstart™ Taq ReadyMix a 100 nM de cada cebador y 1 pl de ADNc y la reacción se llevó a un volumen final de 25 pl con dH2O. Las muestras y los controles negativos (omitiendo el molde de ADNc) se cargaron en una microplaca de 96 pocillos (Stratagene) y la reacción de PCR se controló por medio del soporte lógico de qPCR MxPro™. Todas las reacciones se llevaron a cabo a una temperatura de hibridación de 60 °C. La cuantificación relativa se calculó usando el método 2"ññCj como se ha descrito previamente (39, 40), utilizando los controles no tratados como grupo de referencia para cuantificar los cambios relativos en la expresión del gen diana. Los datos se presentan como la multiplicidad de cambio en la expresión génica normalizada a un gen de referencia endógeno 18S con respecto a las muestras de ADNc de control no tratadas. Cuando no hubo amplificación de un producto génico en las muestras de ADNc de cartílago no tratado, la multiplicidad de cambio en la expresión del gen fue con respecto a las muestras de ADNc tratadas con IL-1a/OSM.

Análisis estadístico

Los datos se normalizaron hasta el peso seco de los explantes de cartílago y se presentaron como la media ± error típico de la media (n = 4 explantes por tratamiento). Cada experimento se repitió tres veces y se muestran los datos representativos. Los datos se sometieron a ensayo para determinar la normalidad (Anderson-Darling) y las varianzas iguales antes de los análisis paramétricos (Minitab). Se realizó el análisis estadístico utilizando un modelo ANOVA lineal generalizado de 2-factores y una prueba post hoc de Tuckey, o cuando se indica en el texto, utilizando una prueba t de 2 muestras (análisis qPCR). Las diferencias se consideraron significativas a valores de P menores de 0,05.

Extractos de Boswellia Frereana: Ensayo de inhibición de acetilcolinesterasa (AChE)

Este método de TLC para el escrutinio de la actividad AChE se basa en el referido por Rhee et al. (56) y es una versión modificada del método UV original de Ellman para determinar la actividad AChE (Ellmanet al., 57).

Productos químicos y reactivos

La acetilcolinesterasa (AChE, 1000 U) de anguila eléctrica, la Trizma Base, el Yoduro de acetiltiocolina (ATCI), el Ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico) (DTNB, reactivo de Ellman) y el bromhidrato de Galantamina se adquirieron en Sigma-Aldrich (Poole, Dorset). El tolueno y el acetato de etilo se adquirieron en Fisher Scientific (Loughborough, Leicestershire)

Preparación de solución tampón (Tris-HCI 50 mM a pH 8)

Se pesaron con precisión 6,057 g of Tris Base (peso molecular 121,14 g) en un matraz volumétrico de 1 litro. Se añadieron 800 ml de agua desionizada, su pH se ajustó a pH 8 con HCI concentrado y a continuación se diluyó en volumen con agua desionizada. El tampón se almacenó a 4 °C.

Preparación de mezcla de pulverización de yoduro de acetiltiocolina (2,5 mM)/Ácido 5,5'-ditiobis-(2- nitrobenzoico) (DTNB) (2,5 mM)

Se pesaron con precisión 72,2 mg de ATCI y 100,8 mg de DTNB en el mismo matraz volumétrico de 100 ml y se diluyeron en volumen con tampón y se almacenaron a 4 °C.

Preparación de solución de enzima acetilcolinesterasa (4 U/ml)

Se transfirió el contenido del vial de AChE (1000 U) a un matraz volumétrico de 250 ml y se diluyó en volumen con tampón. La solución se almacenó a -20 °C hasta que fue necesaria.

Preparación de la muestra

Se diluyó una solución de partida de extracto en etanol de Boswellia frereana (101,6 mg/ml) en etanol proporcionando concentraciones finales de B. frereana de 101,6, 50,8, 25,4, 12,7, 6,35 y 3,17 mg/ml.

Preparación de patrón de referencia (1 mM)

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Placa de TLC

Un gel de sílice 60 F254 con las dimensiones 200 mm x 200 mm y un grosor de 0,2 mm se adquirió de VWR International (West Sussex).

Disolvente de desarrollo de TLC

Se añadieron 90 ml de tolueno y 10 ml de acetato de etilo y se mezclaron entre sí.

Reactivo de detección

Se transfirieron 0,5 ml de anisaldehído a un matraz volumétrico de 100 ml y se añadieron 10 ml de ácido acético glacial. A esto se le añadieron 85 ml de metanol seguido de 5 ml de ácido sulfúrico concentrado y a continuación se sacudió para mezclar.

Procedimiento

Se aplicaron 100 ul de los extractos de Boswellia a las placas de TLC así como 100 ul de bromhidrato de galantamina (1 mM) como solución de referencia. La placa de TLC se desarrolló utilizando tolueno y acetato de etilo (90:10) como disolvente. Después de secar durante 30 minutos la placa se pulverizó con 20 ml de la mezcla de sustrato/colorante (ATCI/DTNB) hasta la saturación. Se dejó secar la placa durante 5 minutos antes de pulverizar con 20 ml de la solución de enzima y a continuación se dejó secar. La placa se fotografió en el plazo de 10-20 minutos aunque las manchas blancas permanecieron durante 1 hora. Se obtenía una mancha positiva si se observaba una mancha blanca sobre un fondo de color amarillo. Se desarrolló una placa de TLC de control (sin muestras), para investigar los falsos positivos, y se trató como se describe para las placas de TLC tratadas. Los componentes de TLC también se detectaron pulverizando las placas de TLC desarrolladas con solución de anisaldehído.

Propiedades anti-tumorales de extractos de Boswellia frereana sobre líneas celulares de cáncer de mama humano (MCF-7)

La investigación se realizó usando la línea celular de cáncer de mama humano MCF-7 (donada por el Dr Richard Clarkson, Cardiff University, originalmente de ECACC). La línea celular de cáncer de mama humano MCF-7 se estableció en 1970 a partir de efusión pleural de una mujer Caucásica de 69 años de edad que padecía adenocarcinoma de mama (58). Esta línea celular ha sido ampliamente utilizada como modelo de tumor experimental.

Mantenimiento de cultivos celulares de MCF-7

Se hicieron crecer células MCF-7 en Medio Esencial Mínimo de Eagle (EMEM) con solución salina equilibrada de Earle sin L-glutamina (Lonza) que tenía un suplemento de glutamina al 1% (Invitrogen), insulina al 0,1% (Sigma), Penicilina y estreptomicina al 1% (Invitrogen), suero fetal bovino al 10% (Sigma), aminoácidos no esenciales al 1% (Lonza) y piruvato de sodio al 1% (Ambrex). Se hicieron crecer en cultivo adherente utilizando matraces de 75 cm2 (Costar) a 37 °C y en una atmósfera de CO2 al 5% en aire.

Las células se subcultivaron cada 7 días y se sembraron a 2 x 104 células por cm2. Para cosechar las células, primero se eliminó el medio de cultivo. A continuación la capa celular se enjuagó suavemente con aproximadamente 7 ml de tripsina al 0,25% con EDTA (Gibco) para eliminar cualquier medio de crecimiento restante. Después se añadieron 5 ml más de tripsina/EDTA y el matraz se incubó durante 3 minutos para separar las células y despegarlas de la superficie del matraz. Se utilizó un microscopio invertido (Nikon Diaphot) para verificar que las células se habían despegado. A continuación se añadieron 10 ml de medio al matraz y se pipetearon suavemente arriba y abajo para separar las agrupaciones de células. Las células se contaron utilizando una cámara de recuento celular hemocitométrico Bright Line y se sembraron en matraces que contenían un total de 20 ml de medio cada uno. Después los matraces se colocaron en la incubadora para permitir que las células se pegaran. El medio se cambió una vez por semana.

Medición de la respuesta celular utilizando el ensayo MTS

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Se utilizó el kit de Ensayo de Proliferación Celular No Radiactivo Acuoso CelITiter 96 (Promega) para realizar los ensayos MTS. El kit contiene 20 ml de solución MTS y 1 ml de solución PMS.

Todos los ensayos MTS se realizaron en placas de 96 pocillos (Costar). Las células se sembraron a 1,2 x 10 - 1,5 x 105 células/cm2 con 0,1 - 0,2ml de medio de crecimiento apropiado. Los pocillos de control en todos los casos contenían el mismo volumen de medio, el mismo volumen de reactivo de ensayo y el mismo volumen de solución MTS pero no contenían células. Después, las placas se incubaron. Se añadieron suspensión celular y solución MTS a los pocillos utilizando una pipeta repetitiva (HandyStep) o una pipeta multicanal y artesa (Transferpette). La suspensión celular de la artesa se agitó regularmente con una espátula estéril para evitar que las células se asienten en la superficie. A las 24 - 48 horas de la siembra, se añadieron 50 pl del reactivo de ensayo según fuera apropiado. A las 24 - 168 horas de la siembra se añadió la solución MTS a 20 pl de solución MTS por 100 pl de medio a los pocillos con y sin células. Las placas se devolvieron a continuación a la incubadora durante dos horas. A continuación las placas se retiraron de la incubadora y se sacudieron utilizando un agitador de placa orbital (MS1 Minishaker IKA) durante diez segundos para garantizar que el producto de reacción estaba homogéneamente distribuido en el pocillo. Después se leyó la absorbancia a 492 nm utilizando un lector de placa Anthos Reader 2001 (Labtech) o un lector de placa FLUOstar OPTIMA (Labtech). En el caso de las curvas de crecimiento, el medio se cambió a las 72 horas y cada 24 horas después de eso de modo que el agotamiento del medio no actúe como variable de confusión. Para eliminar el medio de los pocillos se colocó un hisopo estéril sobre la parte superior de la placa que a continuación se invirtió. El medio fue absorbido por el hisopo estéril y cualquier medio restante se eliminó dando golpecitos con otro hisopo estéril. Luego se pipeteó medio de nueva aportación (0,2 ml) a todos los pocillos de ensayo y de control.

Preparación de extracto en etanol de B. frereana (Boswellia frereana)

Se disolvió un extracto en etanol de B. frereana (3,01778 g) en 10 ml de etanol absoluto (Fisher Scientific) para dar una solución de partida de 266,7 mg/ml. Esto se filtró a continuación utilizando una membrana PTFE Sartorius (Fisher Scientific Reino Unido) para garantizar la esterilidad. La solución de partida se diluyó en medio para proporcionar 3 veces la concentración final necesaria y se añadieron 50 pl de este producto concent rado a los pocillos que contenían 0,1 ml de medio para proporcionar una concentración final de 88 - 2000 pg/ml en el pocillo. Las muestras se sometieron después a vórtice para dispersar el extracto en el medio. La concentración de etanol se ajustó para que fuera constante en todos los pocillos. La concentración se ajustó para que contuviera la misma concentración que el pocillo que contenía la concentración más alta de extracto de B. frereana. Esta varió del 0,17 al 0,77%.

Se puede producir absorbancia de fondo no específica en el medio de cultivo incubado con solución MTS. Esta se corrigió para utilizar pocillos de control que fueran idénticos a los pocillos de ensayo pero sin contener células. La absorbancia promedio de estos pocillos de control se restó de todos los demás valores de absorbancia de los pocillos de ensayo para proporcionar la absorbancia corregida. Estos valores de absorbancia corregida se utilizaron para trazar la absorbancia de formazán en los gráficos. Las barras de error expresan el error típico de la diferencia (se(d)) entre los pocillos de control y los pocillos de ensayo y se calcularon utilizando la siguiente ecuación:

imagen1

se(d) = error estándar de la diferencia; sqrt = raíz cuadrada;

set = error estándar de los pocillos de ensayo; set = error estándar de los pocillos de control.

Cálculo de los valores de DL5o

Los valores de DL50 se calcularon como la concentración del extracto de B. frereana a la cual había una reducción de 50% en la absorbancia de formazán. Los gráficos se trazaron utilizando la absorbancia media de formazán y se presentaron como el porcentaje de la absorbancia a 0 pg/ml. La DL5o se tomó al 50% de absorbancia de formazán en cada momento de muestreo (24, 48 y 72 horas después de la incubación con extracto de B. frereana) en las curvas. Esto se realizó para cada experimento y la media en cada momento de incubación se registró en los resultados.

Análisis estadístico

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El análisis estadístico se realizó en Minitab 15.

Se realizaron ANOVA de dos vías y ANOVA de tres vías por medio del modelo lineal general. Se utilizó la comparación pareada simultánea de Tukey para comparar las medias. Si las varianzas no eran homogéneas (como se verifica utilizando el ensayo de Bartlett), se utilizaba una regresión ponderada. Los pesos utilizados fueron los recíprocos de la varianza (59).

Resultados

Sorprendentemente se encontró que la oleorresina de B. frereana era casi completamente soluble tanto en hexano como en etanol dando como resultado rendimientos de extracción muy elevados para la resina (99%), como se indica en la tabla 2.

Las Tablas 2 y 3 indican que las oleorresinas de B. frereana contienen muy poca goma insoluble en etanol (polisacárido). Esto contrasta con otras especies de Boswellia tales como B. carterii y B. papyrifera, en las que la fracción de goma insoluble en etanol comprendía 48% y 51% respectivamente como se muestra en la tabla 2. También se ha informado de que las oleorresinas de Boswellia de India (6. serrata) contienen una cantidad sustancial de fracción de goma insoluble en alcohol, en la región de 24% (55).

A diferencia de las oleorresinas de B.carteri, B. serrata y B. papyrifera se encontró que esta especie concreta de Boswellia (B. frereana) no era susceptible de destilación con vapor de agua debido a su bajo contenido de goma. Al contacto con el vapor de agua la resina se ablandó y pasó completamente a través de la malla perforada y al agua caliente. El método de aislamiento del aceite esencial fue por lo tanto en la realidad uno de hidro-destilación en lugar de destilación con vapor de agua.

El contenido de aceite esencial de B. frereana, utilizando hidro-destilación fue bastante bajo (0,87%) como se indica en la tabla 5.

Los disolventes no polares tales como hexano se utilizan comúnmente, en fitoquímica, para extraer el componente de aceite volátil de las oleorresinas mientras el etanol se utiliza comúnmente para extraer la fracción de resina más polar de las oleorresinas. Se han utilizado previamente hexano para aislar el componente de aceite volátil de oleorresinas aromáticas relacionadas tales como incienso (B.carterii, B. papyrifera),Opoponax (Commiphora guidotti) y mirra (Commiphora molmol) a la vez que deja la resina y el contenido de goma de las oleorresinas intactos. Inesperadamente, en este caso, el hexano no es adecuado para la extracción del componente de aceite volátil de B. frereana ya que el disolvente también extraía el componente de resina. Véase la Figura 7.

En el siguiente trabajo se realiza sobre el cartílago, aunque el tratamiento con cartílago no forma parte de la presente invención.

B. frereana no afecta a la viabilidad de condrocitos de cartílago.

El tratamiento de explantes de cartílago con 5 ng/ml de IL-1a y 10 ng/ml de OSM o 100 pg/ml de B. frereana, por separado o combinados no afectó significativamente a la viabilidad celular a lo largo del período de cultivo de 28 días (datos no mostrados).

B. frereana no afecta a los niveles de sGAG en un modelo in vitro de degradación de cartílago.

El tratamiento de explantes con 5 ng/ml de IL-1 a y 10 ng/ml de OSM, por separado o combinado con 100 pg/ml de B. frereana no tuvo efecto sobre los niveles de sGAG en el tejido (Figura 1A). En contraste hubo un aumento significativo en la cantidad de los sGAG detectados en el medio de explantes tratados con IL-1a/OSM con respecto a los que se dejaron sin tratar o se trataron con B. frereana solo (p <0,01; la transformación log requirió análisis de los datos de los días 3 y 7). B. frereana no rescató la pérdida de sGAG inducida por citocina de explantes de cartílago a lo largo del período de cultivo (Figura 1B).

B. frereana reduce la liberación de colágeno en un modelo in vitro de degradación de cartílago.

No hubo diferencias apreciables en la cantidad de colágeno medida en los explantes a través de los tratamientos (Figura 2A). Se liberó significativamente más colágeno al medio desde los explantes de cartílago tratados con IL- 1a/OSM después de 28 días en cultivo en comparación con los explantes no tratados o tratados con B. frereana (p = 0,001; transformación log). No obstante, hubo un reducción significativa en el colágeno liberado desde explantes de

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cartílago tratados con IL-1a/OSM combinado con B. frereana (p = 0,012; transformación log) volviendo los niveles a cantidades iniciales (Figura 2B).

B. frereana inhibe la expresión y activación de MMP 9 inducidas por citocina, debido a la reducción de la transcripción de MMP 9, en un modelo in vitro de degradación de cartílago.

En explantes no tratados, hubo una expresión mínima de pro-MMP 9 después de 7 días, pero se observaron pro- MMP 2 y MMP 2 activa en explantes de cartílago tanto no tratados como tratados con B. frereana (Figura 3A). El cartílago estimulado con IL-1a/OSM sintetizó niveles significativamente más altos de pro-MMP 9 después de 7 días (p < 0,0001; transformación log). La MMP 9 activa no se observó en este momento puntual. Los niveles de pro-MMP 2 y MMP 2 activa no se alteraron apreciablemente después de la estimulación con IL-1a/OSM. De forma interesante, B.frereana inhibió la síntesis de pro-MMP 9 inducida por citocina (p <0,0001; transformación log), pero no tuvo efecto sobre la expresión o activación de pro-MMP 2. Después de 28 días en cultivo, ya no se observó pro-MMP 9 en los explantes de cartílago no tratados, pero estuvieron presentes tanto pro-MMP 2 como MMP 2 activa (Figura 3B). Estas observaciones también fueron evidentes en cartílago tratado con B. frereana. En general, B. frereana abolió la expresión y la activación de MMP 9 inducida por citocinas. Hubo una reducción drástica en la cantidad de pro-MMP 9 expresada por los explantes tratados con IL-1a/OSM combinado con B. frereana que fue altamente significativa desde el día 7 en adelante. Como consecuencia de la reducción de la síntesis de MMP 9, se abolieron los niveles de MMP 9 activa volviendo a llevar los niveles de expresión a los de los explantes no tratados. También pareció reducir la expresión de pro-MMP 2 mediada por IL-1a/OSM pero esta no alcanzó significación (p = 0,06; transformación log). No obstante, B. frereana contrarrestó significativamente la activación de pro-MMP 2 por IL-1a/OSM (p = 0,04; transformación log categorizada). Solamente se han incluido los medios retirados de los explantes después de 7 y 28 días en el manuscrito para mantener la brevedad pero son representativos de las tendencias observadas a lo largo de todos los momentos puntuales. Como la expresión de la proteína MMP 9 era sensible al tratamiento, se cuantificaron los niveles de ARNm de MMP 9 en tejido que había sido tratado durante 3 días (Figura 3C). El ARNm de MMP 9 estuvo por debajo del límite de detección en explantes de cartílago tanto no tratados como tratados con B. frereana. Sin embargo, B. frereana redujo la transcripción de MMP 9 inducida por IL-1a/OSM casi al 50%, aunque esta no alcanzara bastante significación (p = 0,079; prueba t de 2 muestras).

B. frereana reduce la producción de nitrito inducida por citocina y suprime la expresión de ARNm de iNOS en un modelo in vitro de degradación de cartílago.

La cantidad de nitrito producida por los explantes no tratados, y los explantes tratados con B. frereana fue baja (< 5 pM/mg de peso seco de tejido) y no cambió apreciablemente a lo largo del período de cultivo de 28 días (Figura 4A). Como se esperaba, el tratamiento con citocina aumentó significativamente la producción de nitrito después de 3 (p <0,0033), 7 (p = 0,0009), 14 (p <0,0029), 21 (p <0,0001) y 28 días (p <0,0001) con respecto a los explantes no tratados (transformación log de los datos), pero B. frereana, inhibió significativamente la producción de nitrito inducida por IL-1a/OSM después de 14 (p = 0,003), 21 (p = 0,0007) y 28 días (p = 0,001) (transformación log de los datos). Los niveles de expresión de ARNm de iNOS se cuantificaron para determinar si la reducción de nitrito en los últimos momentos puntuales podía ser atribuida a la inhibición transcripcional temprana en el período de cultivo (Figura 4B). Hubo cantidades variables pero mínimas de ARNm de iNOS en los explantes de cartílago no tratados después de 3 días en cultivo. No se detectó ARNm de iNOS en el cartílago tratado con B. frereana. Como se esperaba, hubo un aumento de aproximado de 50 veces en los niveles de ARNm de iNOS en los explantes estimulados con IL-1a/OSM con respecto a los controles no tratados (p <0,0001; transformación log), que se redujo aproximadamente 75% en presencia de B. frereana (p = 0,02; transformación log), en concordancia con los niveles de nitrito observados en los medios de cultivo.

B. frereana reduce la producción de PGE2 inducida por citocina y suprime la expresión de ARNm tanto de PGE2 sintasa como de COX-2 en un modelo in vitro de degradación de cartílago.

La cantidad de PGE2 producida por los explantes no tratados y los explantes tratados con B. frereana no cambió apreciablemente a lo largo del período de cultivo de 28 días (<25 pg/mg de peso seco de tejido) (Figura 5A). Como se esperaba, el tratamiento con citocina aumentó significativamente la producción de PGE2 después de 3 (p = 0,012; transformación log), 7 (p = 0,0002), 14 (p = 0,006; transformación log), 21 (p <0,0001; transformación log) y 28 días (p <0,0001; transformación log) con respecto a los explantes no tratados, variando de 100 - 1000 pg/mg peso seco de tejido. En presencia de B. frereana, hubo una inhibición significativa de la producción de PGE2 inducida por IL- 1a/OSM en explantes después de 7 (p = 0,03), 21 (p = 0,005; transformación log) y 28 días de tratamiento (p = 0,0005; transformación log); sin embargo no volvió a los niveles iniciales. Los niveles de expresión de ARNm de PGE2 sintasa también se cuantificaron para determinar si la reducción de PGE2 observada a lo largo del período de cultivo se podría atribuirá la inhibición de la transcripción de PGE2 sintasa (Figura 5B). El ARNm de PGE2 sintasa no

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fue detectable ni en el cartílago no tratado ni en el tejido tratado con B. frereana después de 3 días de cultivo. IL- 1a/OSM estimuló la expresión del ARNm de PGE2 en el cartílago, y esta se redujo casi 60% cuando los explantes estimulados con citocina se trataron simultáneamente con B. frereana (p = 0,007; prueba t de 2 muestras). En conjunto, también se cuantificaron los niveles de ARNm de COX-2 - la enzima limitante de la velocidad en la síntesis de PGE2. Se observaron cantidades mínimas de ARNm de COX-2 en cartílago no tratado, y los niveles fueron indetectables en cartílago tratado con B. frereana (Figura 5B). Hubo un aumento significativo de 12 veces en los niveles de ARNm de COX-2 en explantes estimulados con IL-1a/OSM con respecto a cartílago no tratado (p < 0,0001), que se redujo aproximadamente 75% cuando se trató simultáneamente con B. frereana (p = 0,0001).

£p/-lupeol es el principal constituyente de B. frereana.

Aproximadamente el 81% de los componentes presentes en el extracto en etanol de B. frereana se identificaron utilizando GC-MS como se ha indicado (Figura 6). El principal componente identificado, y que representa el 59,3% del extracto de B. frereana fue ep/-lupeol (Figura 6B). Otros componentes secundarios identificados en el extracto etanólico de B. frereana fueron p-amirina (6,35%), acetato de Lupeol (3,10%), a-amirina (2,38%), dímero 3 de a- felandreno (1,10%), dímero 5 de a-felandreno (0,24%), a-tuyeno (0,34%) y a-felandreno (0,24%).

B. frereana inhibe la acetilcolinesterasa

Se encontró que los extractos de B. frereana, después de ser pulverizados con la enzima, el sustrato y el reactivo de detección producían manchas de color blanco brillante sobre las placas de TLC sobre un fondo de color amarillo. Estos fueron capaces de inhibir la actividad de la acetilcolinesterasa a todas las concentraciones sometidas a ensayo (101,6 - 3,17 mg/ml). El patrón de referencia bromhidrato de galantemina (1 mM), un conocido inhibidor de AChE, también proporcionó una mancha de color blanco brillante sobre la referencia de la placa de TLC. No se observaron manchas de color blanco, correspondientes a falsos positivos, para la placa de TLC de control.

B. frereana elimina células cancerosas

Concentraciones del extracto de B. frereana a 800 pg/ml o mayores dieron como resultado una disminución de la absorbancia deformazán, indicando una reducción en la actividad mitocondrial y una reducción en el número de células. Esta disminución en el número de células se podía haber producido si los componentes activos del extracto de Boswellia causaran la detención del ciclo celular (citostasis). Una detención del ciclo celular prolongada en una fase distinta de GO es intolerable para la célula y dará como resultado por último daño celular indirecto y muerte celular. Los componentes citotóxicos del extracto de B. frereana pueden, por lo tanto, comportarse como inductor apoptótico y potenciador de la muerte celular para las células cancerosas humanas MCF-7.

Análisis

En el presente estudio, los autores de la presente invención utilizaron un modelo in vitro de degeneración de cartílago (29, 30) para determinar si la especie de Boswellia poco conocida - B. frereana tenía eficacia antiinflamatoria, y por lo tanto se podía explotar como terapia alternativa para el tratamiento de una diversidad de trastornos inflamatorios. Se trataron explantes de cartílago con 5 ng/ml de IL-1 a y 10 ng/ml de OSM a lo largo de un período de 28 días, en presencia o ausencia de 100 pg/ml de B. frereana. No hubo evidencia de citotoxicidad inducida por IL-1/OSM o B. frereana a lo largo del período de cultivo de 28 días. En este modelo in vitro, ni las citocinas ni B. frereana tuvieron un efecto discernible sobre la cantidad de sGAG o colágeno retenida en los explantes. No obstante, hubo un aumento significativo en la cantidad de sGAG y colágeno liberada de los explantes después de la estimulación con IL-1a/OSM durante 3 y 21-28 días, respectivamente, que concuerda con los informes anteriores (41, 42). En presencia de IL-1a/OSM aproximadamente 50% del contenido de sGAG se liberó al medio a lo largo del período de 28 días, por lo tanto es ligeramente sorprendente que la cantidad de sGAG en el tejido no refleje esto. Se deduce que en presencia de citocinas, el tejido está sintetizando continuamente nuevo sGAG para remplazar el que se ha perdido (43). La detección de sGAG y colágeno en el medio representa principalmente la degradación y liberación de componentes de la MEC desde el tejido. Curiosamente, B. frereana solo fue capaz de rescatar la degradación de colágeno mediada por IL-1/OSM. Durante el período de 28 días, B. frereana no tuvo efecto sobre la cantidad de sGAG liberado al medio después de la estimulación con citocinas; esto sugeriría que debe existir un mecanismo diferente de acción entre el colágeno y sGAG para explicar la inhibición diferencial observada.

Los mediadores clave de la degradación del colágeno incluyen las MMP 9 y 13 (44). Se han observado mayores niveles de MMP 9 activa en cartílago articular patológico (1, 3-6). Para averiguar si el aumento observado en la liberación de colágeno por IL-1a/OSM y la posterior modulación por B. frereana, representaban un fenotipo

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catabólico, se analizó el estado de expresión y activación de la pro-MMP 9. Durante los 28 días, se aumentaron sustancialmente tanto la síntesis de pro-MMP 9 como su activación en explantes estimulados por citocina, lo que puede haber contribuido a la liberación significativa de colágeno los días 21-28, como se ha informado previamente (44). B. frereana inhibió la síntesis mediada por IL-1a/OSM y la activación de pro-MMP 9 haciendo volver la expresión a los niveles iniciales. [IL-1a/OSM no tuvo un efecto significativo sobre la expresión de pro-MMP 2, aunque los niveles de MMP 2 activa parecían aumentar. Después de 28 días, B. frereana también inhibió la activación de pro-MMP 2]. Estos datos sugieren que la reducción de la expresión de pro-MMP 9 inducida por IL- 1a/OSM en explantes tratados con B. frereana puede surgir de la inhibición transcripcional de MMP 9 que se observó.

La síntesis de MMP 9 está modulada por una variedad de moléculas pro-inflamatorias incluyendo NO y COX-2 (45), y está bien establecido que tanto NO como COX-2 están implicados en la degradación del cartílago (43, 46). El nitrito, el producto final estable de NO, estaba significativamente elevado en explantes de cartílago estimulados con IL-1a/OSM a lo largo de todo el período de cultivo, mientras en presencia de B. frereana, la producción de NO inducida por citocina estaba significativamente inhibida. Se supuso que el amplio aumento en la síntesis y activación de pro-MMP 9 se puede atribuir, en parte, a los niveles de NO, y que la acción de B. frereana en la inhibición de la producción de NO evita la síntesis y/o activación de MMP 9 aguas abajo. La inflamación de las articulaciones en la OA también aumenta los niveles circulantes de COX-2 - la enzima limitante de la velocidad en la síntesis de PGE2, lo que ocasiona un aumento de la síntesis de PGE2. Un estudio previo indicó una conexión entre NO y la expresión de COX-2 es un modelo canino de OA experimental (45). La combinación de IL-1 a con OSM elevó significativamente la síntesis de PGE2 hasta aproximadamente 80 veces la observada en los explantes de cartílago no tratados, de acuerdo con los estudios anteriores (37, 47). Utilizando la combinación de IL-1a/OSM, B. frereana redujo los niveles de PGE2 aunque estos no volvieron a los niveles iniciales.

Para comprender mejor el mecanismo de acción de B. frereana en este modelo inflamatorio in vitro de degradación de cartílago, se cuantificó la cantidad de transcritos génicos para iNOS, PGE2 sintasa y COX-2 utilizando qPCR. Se observó que todos aumentaban significativamente en los explantes tratados con IL-1a/OSM, y en presencia combinada con B. frereana, los niveles de transcripción génica se redujeron significativamente; sin embargo, no volvieron a los niveles iniciales observados en los explantes no tratados. Los datos de los autores de la presente invención sugerirían que la acción inhibidora de B. frereana sobre la síntesis de NO y PGE2 está controlada a nivel transcripcional.

Aunque se han realizado diversos estudios sobre B. serrata, y sus componentes farmacológicamente activos han sido identificados como ácidos a y p-boswélicos predominantemente (24), se sabe poco acerca de los ingredientes bioactivos de B. frereana exceptuando que se ha referido que difiere de las otras especies (48). Utilizando la cromatografía de gases junto con la espectrometría de masas, los autores de la presente invención identificaron los constituyentes primarios de B. frereana, de los cuales el epi-lupeol representa casi el 60% del extracto. Aunque B. frereana tiene la genealogía de las especies de Boswellia, carece de los componentes activos tales como el ácido boswélico, que son característicos de los otros miembros de la familia, como se ha aludido previamente (48). El epi- lupeol es un triterpeno pentacíclico; su isómero lupeol es un triterpeno de origen natural encontrado en diversas frutas y hortalizas incluyendo aceitunas, fresas e higos (49). Resulta interesante señalar, y tienen una importancia potencial en la comprensión de los mecanismos de acción de B. frereana en el estudio de los autores de la presente invención, las propiedades bioquímicas del lupeol. Se ha demostrado que el lupeol tiene propiedades farmacológicas que varían ampliamente incluyendo actividad anti-inflamatoria y anti-artrítica in vitro e in vivo (50, 51). La administración oral de lupeol a un modelo de rata de artritis inducida por antígeno condujo a una reducción del 39% en la hinchazón de la pata, y una reducción de la cantidad de hidroxiprolina y sGAG en la orina indicando que el lupeol podría aliviar los síntomas de inflamación (51). El lupeol administrado tópicamente a un modelo murino de inflamación inducida por éster de 12-O-tetradecanoil-forbol suprimió el edema en la oreja, debido a una reducción significativa de la PGE2 y una inhibición más débil de la liberación de nitrito (50). Las observaciones de los autores de la presente invención apoyan estos datos in vivo aunque los autores de la presente invención observaron mayor eficacia frente a la producción de nitrito con respecto a los niveles de PGE2, sin embargo, esto puede reflejar el hecho de que el componente activo de B. frereana es el ep/-lupeol y no el lupeol. La administración tópica de lupeol a un modelo de tumorigénesis en piel de ratón inhibió significativamente el edema y la hiperplasia de la piel junto con una disminución de la expresión de COX-2 y NO sintasa (52), coincidiendo con la eficacia del epi-lupeol en el estudio in vitro de los autores de la presente invención. La reducción de COX-2 y NO sintasa se atribuyó a una inhibición de la activación de NF-kB. El factor de transcripción nuclear NF-kB es una pieza clave en el desarrollo y el progreso de enfermedades inflamatorias crónicas incluyendo la artritis reumatoide (53). Las propiedades antiinflamatorias de B. serrata implican la regulación de la activación de NF-kB, como se demuestra en un estudio reciente utilizando un modelo de aterosclerosis en ratón (54). Sin embargo, aunque se sabe que B. serrata inhibe la función de la 5- lipoxigenasa (25), se demostró que el lupeol no tenía efecto sobre los productos de la lipoxigenasa (50), por lo tanto

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no es probable que el lupeol afecte a la ruta de la 5-lipoxigenasa.

Adicionalmente el extracto de B. frereana, fue capaz de inhibir la actividad acetilcolinesterasa y eliminar un modelo bien conocido de cáncer, esto es, la línea celular de cáncer de mama MCF-7.

Para concluir, este es el primer informe que detalla la eficacia anti-inflamatoria, anti-acetilcolinesterasa y citotóxica de B. frereana. Los datos novedosos de los autores de la presente invención demuestran que el tratamiento de explantes de cartílago estimulados con IL-1a/OSM con B. frereana confiere cierta protección frente a la degeneración del tejido al inhibir la degradación de la matriz colagenosa, a través de la inhibición de la expresión y activación de MMP 9, y una reducción significativa de la expresión de mediadores inflamatorios incluyendo NO, PGE2 y COX-2. De ello se desprende que B. frereana puede, por lo tanto, ser explotada como medicamento para tratar los trastornos o afecciones mediados por MMP 9 en los que existe la necesidad de una reducción significativa en la expresión de mediadores inflamatorios incluyendo NO, PGE2 y COX-2. B. frereana, que no es tóxica y es particularmente eficaz para la regulación de PGE2 puede ofrecer una perspectiva adicional para la acción terapéutica de este compuesto de origen natural. Además, B. frereana puede conferir cierta protección frente a trastornos neurológicos caracterizados por un aumento de la actividad acetilcolinesterasa o en los que es deseable bloquear su actividad. Adicionalmente, B. frereana tiene aplicación en la destrucción de células cancerosas.

Bibliografía

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Tabla 1

Gen de interés

Secuencia de cebador Tamaño del producto (pb)

iNOS

F 5' - TGTTCAGCTGTGCCTTCAAC - 3' 232

R 5' - AAAGCGCAGAACTGAGGGTA - 3'

PGE2 sintasa

F 5' - GGACGCTCAGAGACATGGAG - 3' 206

R 5' - TATGCCACGGTGTGTACCATA - 3'

MMP9

F 5' - TAGCACGCACGACATCTTTC - 3' 121

R 5' - GAAGGTCACGTAGCCCACAT - 3'

Tabla 2. Contenido de resina de oleorresina de B. frereana después de la extracción con hexano (disolvente no _________________________polar) y ^ etanol (disolvente polar).__________ _____________

Disolvente de extracción

Peso de oleorresina original (g) Peso de resina extraída (g) % de resina1 (fracción soluble en etanol) % de residuo gomoso2

Hexano

20,0 19,8 98,8 1,3

Etanol

20,0 19,9 99,3 0,7

'La resina también contiene una pequeña cantida2d de aceite esencial - véase la tabla 4 para el contenido de aceite esencial de B. frereana. Calculado restando el % de contenido de resina de 100.

Tabla 3. Comparación del contenido de goma de Boswellia frereana con una especie relacionada.

Boswellia spp.

País de origen Peso de oleorresina original (g) Peso de la goma (g) (fracción insoluble en etanol) % de goma (fracción insoluble en etanol) % de resina (fracción soluble en etanol)

B. serrataa

India 10,0 2,4 24,0 -

B. serratab

India - - - 25 ± 40

B. papyriferac

Etiopía 40,2 20,7 51,4 48,6

B. carteriic

Somalilandia 40,1 22,1 55,0 45,0

B. carteriic

Somalilandia 40,2 19,3 48,0 51,9

B. frereanac

Somalilandia 40,1 0,7 1,7 98,3

B. frereanac

Somalilandia 40,3 0,6 1,4 98,6

B. frereanac

Somalilandia 40,0 0,7 1,7 98,3

B. frereanac

Somalilandia 40,0 0,5 1,2 98,8

a% de goma informado por Sen et al., 1992. b% de resina informado por Natural Remedies PVT Limited c% de resina calculado restando el % de contenido de goma de 100.

Tabla 4. Resumen de los componentes de la oleorresina de B. frereana

Constituyentes químicos de la oleorresina de B. frereana

% p/p

Fracción volátil (Aceite esencial)

0,9

Fracción soluble en alcohol (Resina)

98,3 ± 99,3

Fracción insoluble en alcohol (goma de polisacárido)

0,6-1,6

5

Tabla 5. Contenido de aceite esencial de la oleorresina ^ de B. frereana extraída por medio de hidro-destilación

Disolvente de extracción

Peso de oleorresina original (g) Peso del aceite esencial extraído (g) % de aceite esencial

Vapor

50,4 0,4 0,9

Tabla 6. Componentes químicos identificados en diversos extractos de oleorresina de B. frereana (aceite esencial, ____________________________________hexano y etanol);____________________________________

Componentes químicos

Fracción aislada (Método de extracción)

Aceite esencial (Destilación por vapor)

Resina (Hexano) Resina (Etanol)

% de área pico

% de área pico

% de área pico

a-Tuyeno

9,85 0,76 0,34

a-Pineno

0,011 N.D

Sabineno

2,62 N.D N.D

P-Pineno

N.D N.D

a-Felandreno

Traza 0,118 0,074

m-Cimeno

1,62 N.D Traza

P-Cimeno

5,49 0,21 0,136

Tuyol

5,22 0,18 0,135

Eucaliptol

0,91 0,065 0,058

Tuyol

2,87 0,047 0,042

trans-2-Caren-4-ol

1,92 N.D N.D

Desconocido

3,89 N.D N.D

trans-Pinocarveol

2,51 N.D N.D

(S)-cis-Verbenol

0,62 N.D N.D

Tuyen-2-eno/T uyona

3,19 0,056 0,050

Sabinol

3,62 0,047 Traza

Terpinen-4-ol

6,59 N.D N.D

Claims (7)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   REIVINDICACIONES

   1. Un extracto en etanol de oleorresina de Boswellia frereana que comprende un inhibidor de la metaloproteinasa 9 de matriz (MMP9);

   para uso en el tratamiento o prevención de enfermedad inflamatoria intestinal (EII), sepsis, síndrome séptico, lesión isquémica, enfermedad de injerto contra huésped, lesión por reperfusión y cáncer.
2. 2. El extracto para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende uno cualquiera o más de los siguientes epi-lupeol, p-amirina, a-amirina, dímeros de a-felandreno, a-tuyeno y a-felandreno y sus isómeros, distintos de lupeol, o sales.
3. 3. El extracto para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende epi-lupeol, p-amirina y dímero de alfa-felandreno y sus isómeros, distintos de lupeol, o sales.
4. 4. El extracto para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, donde dicho extracto comprende un vehículo.
5. 5. El extracto para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, donde el vehículo es un vehículo farmacéutico o veterinario.
6. 6. El extracto para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1-5, junto con un producto terapéutico adicional.
7. 7. El extracto para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, donde dicho agente terapéutico es un agente antibiótico o antibacteriano.