ES2662020T3

ES2662020T3 - Anticuerpos contra la interleucina-6 y sus usos

Info

Publication number: ES2662020T3
Application number: ES13189422.2T
Authority: ES
Inventors: Willie Lin; Tong-Young Lee; Han-Chung Wu; Tanny Chen Tsao
Original assignee: Fountain Biopharma Inc
Current assignee: Fountain Biopharma Inc
Priority date: 2012-10-22
Filing date: 2013-10-18
Publication date: 2018-04-05
Anticipated expiration: 2033-10-18
Also published as: IL238366B; AU2013335004A1; US20140112935A1; JP6469012B2; AU2013335004B2; EP2722341B1; RU2656162C2; KR20150085816A; EP2722341A1; CN103772503A; JP2016501837A; WO2014066167A1; US9758580B2; CA2889181A1; TWI500629B; RU2015119159A; DK2722341T3; US10370443B2; TW201429988A; CN103772503B

Abstract

Un anticuerpo aislado que se une a interleucina 6 humana (IL6), que comprende: (a) una región variable de la cadena pesada (VH), que comprende una región determinante de complementariedad 1 de la cadena pesada (HC CDR1) de SEQ ID NO: 2, una región determinante de complementariedad 2 de la cadena pesada (HC CDR2) de SEQ ID NO: 4 y una región determinante de complementariedad 3 de la cadena pesada (HC CDR3) de SEQ ID NO: 6; y una región variable de la cadena ligera (VL), que comprende una región determinante de complementariedad 1 de la cadena ligera (LC CDR1) de SEQ ID NO: 9, una región determinante de complementariedad 2 de la cadena ligera (LC CDR2) de SEQ ID NO: 11 y una región determinante de complementariedad 3 de la cadena ligera (LC CDR3) de SEQ ID NO: 13; (b) una región variable de la cadena pesada (VH), que comprende una región determinante de complementariedad 1 de la cadena pesada (HC CDR1) de SEQ ID NO: 2, una región determinante de complementariedad 2 de la cadena pesada (HC CDR2) de SEQ ID NO: 4 y una región determinante de complementariedad 3 de la cadena pesada (HC CDR3) de SEQ ID NO: 6; y una región variable de la cadena ligera (VL), que comprende una región determinante de complementariedad 1 de la cadena ligera (LC CDR1) de SEQ ID NO: 9, una región determinante de complementariedad 2 de la cadena ligera (LC CDR2) de SEQ ID NO: 11 y una región determinante de complementariedad 3 de la cadena ligera (LC CDR3) de SEQ ID NO: 15; o (c) una región variable de la cadena pesada (VH), que comprende una región determinante de complementariedad 1 de la cadena pesada (HC CDR1) de SEQ ID NO: 2, una región determinante de complementariedad 2 de la cadena pesada (HC CDR2) de SEQ ID NO: 4 y una región determinante de complementariedad 3 de la cadena pesada (HC CDR3) de SEQ ID NO: 16; y una región variable de la cadena ligera (VL), que comprende una región determinante de complementariedad 1 de la cadena ligera (LC CDR1) de SEQ ID NO: 9, una región determinante de complementariedad 2 de la cadena ligera (LC CDR2) de SEQ ID NO: 11 y una región determinante de complementariedad 3 de la cadena ligera (LC CDR3) de SEQ ID NO: 15.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

imagen8

(iii) un anticuerpo que comprende una VL que comprende una LC CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 9, una LC CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 11 y una LC CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 13;

(iv) un anticuerpo que comprende (a) una VH que comprende una HC CDR1 que comprende SEQ ID NO: 2,

5 una HC CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 4 y una HC CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 6 y (b) una VL que comprende una LC CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 9, una LC CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 11 y una LC CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 13;

10 (v) un anticuerpo que comprende una VL que comprende una LC CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 9, una LC CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 11 y una LC CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 15;

(vi) un anticuerpo que comprende (a) una VH que comprende una HC CDR1 que comprende la secuencia de

aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2, una HC CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos indicada 15 en SEQ ID NO: 4 y una HC CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 6 y

(b) una VL que comprende una LC CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 9, una LC CDR2 que comprende el secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 11 y una LC CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 15;

(vii) un anticuerpo que comprende una VH que comprende una HC CDR1 que comprende la secuencia de ami

20 noácidos indicada en SEQ ID NO: 2, una HC CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 4 y una HC CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 16;

(viii) un anticuerpo que comprende una VH que comprende (a) una HC CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2, una HC CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 4 y una HC CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 16 y

25 (b) una VL que comprende una LC CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 9, una LC CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 11 y una LC CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 15.

Cualquiera de los anticuerpos anti-IL6 descritos en este documento se pueden examinar para determinar sus propiedades, como la actividad de unión al antígeno, la especificidad de la unión al antígeno y las funciones biológicas,

30 siguiendo métodos de rutina, por ejemplo, los descritos en los ejemplos a continuación.

Cualquiera de los anticuerpos anti-IL6 descritos en este documento se pueden modificar para que contengan restos adicionales no proteínicos que son conocidos en la técnica y están fácilmente a disposición, por ejemplo, mediante PEGilación, hiperglicosilación y similares. Las modificaciones que pueden mejorar la semivida en suero son de interés.

35 También se describen en este documento ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los anticuerpos anti-IL6 descritos en este documento, vectores tales como vectores de expresión que comprenden estos ácidos nucleicos y células hospedadoras que comprenden los vectores. En un ejemplo, tanto las secuencias que codifican la cadena pesada como la ligera (por ejemplo, secuencias que codifican una VH y una VL, una VH-CH1 y una VL-CL, o una cadena pesada de longitud completa y una cadena ligera de longitud completa) se incluyen en un vector de expresión.

40 En otro ejemplo, cada una de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo se clona en un vector individual. En el último caso, los vectores de expresión que codifican las cadenas pesadas y ligeras se pueden cotransfectar en una célula hospedadora para expresar ambas cadenas, las cuales se pueden ensamblar para formar anticuerpos intactos, ya sea in vivo o in vitro. Alternativamente, el vector de expresión que codifica la cadena pesada y que codifica la cadena ligera se puede introducir en diferentes células hospedadoras para expresar cada una de las cadenas pesa

45 da y ligera, las cuales se pueden purificar y ensamblar a continuación para formar anticuerpos intactos in vitro.

Numerosos métodos conocidos por los expertos en la técnica están disponibles para la obtención de anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen a antígeno. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden producir usando métodos de ADN recombinante. Los anticuerpos monoclonales también se pueden producir mediante la generación de hibridomas. Los hibridomas formados de esta manera se escrutan después utilizando métodos convencionales, tales

50 como ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) para identificar uno o varios hibridomas que producen un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno especificado. Además, los sistemas de presentación en fagos se pueden utilizar para la detección de anticuerpos de cadena sencilla.

Alternativamente, cualquiera de los anticuerpos anti-IL6 se puede preparar a través de una metodología convencional, por ejemplo, tecnología de recombinación. Por ejemplo, las secuencias de polipéptidos proporcionadas en este 55 documento (véase, por ejemplo, la Tabla 1) para los anticuerpos ejemplares descritos en este documento, se pueden utilizar para obtener secuencias de ácido nucleico adecuadas que los codifican y las secuencias de ácido nucleico se pueden clonar en vectores de expresión adecuados mediante tecnología recombinante convencional, para

imagen9

imagen10

imagen11

imagen12

imagen13

anti-humana marcada con HRP (KPL) diluida 1:10.000 en 1% de BSA-PBS durante 40 min a TA. Las placas se lavaron de nuevo y se añadió una solución de sustrato 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) para que se desarrolle color. A continuación se añadió la solución de parada (H2SO4 1 M) y se cuantificó la absorción a 450 nm usando un fotómetro de placas automático (Bio-Rad).

5 Después de cuatro rondas de bioselección, se identificaron más de ocho cientos clones de fagos que eran capaces de unirse a la rhIL6 mediante el ensayo ELISA descrito anteriormente. Se seleccionaron 29 clones de fagos para analizar la secuencia para determinar las secuencias de VH VL que codificaban anticuerpos anti-IL6. Se identificó una serie de clones únicos; cuya actividad de unión y especificidad se determinaron mediante un ensayo ELISA comparativo.

10 Un clon del fago parental identificado a partir de los procedimientos de bioselección descritos anteriormente, el clon 1-4-62, se seleccionó para una maduración por afinidad para producir anticuerpos anti-IL6 de alta afinidad a través de la construcción mediante una mutagénesis dirigida al sitio, de bancos aleatorizados de anticuerpos en fagos de CDRs de VL/VH, conteniendo cada uno más de 0,9 x 109 variantes de anticuerpos. Los bancos se construyeron utilizando cebadores directos de VL y VH que contenían secuencias al azar en las regiones de CDRs basadas en las

15 secuencias de VL y VH del clon 1-4-62, siguiendo los protocolos convencionales a continuación. Los bancos aleatorizados de CDRs se sometieron a los procedimientos de bioselección, en condiciones muy rigurosas, como se describe en este documento, y al menos dos clones de alta afinidad, Ag1-4-6 (FB704) y Hag1T-3-10 fueron identificados por tener actividades de unión más elevadas en relación con el clon parental.

Las regiones determinantes de complementariedad 1-3 (CDR 1-3) y las regiones estructurales 1-4 (FW1-4) para

20 ambos dominios VH y VL para los tres anticuerpos anti-IL6, 1-4-62, Ag1-4-6 y Hag1T-3-10, se proporcionan en la Tabla 1 a continuación:

Tabla 1. Secuencias de aminoácidos de los dominios VH y VL para los anticuerpos anti-IL6

Dominio VH: imagen14 imagen15 imagen16 imagen17

imagen18: FW1 CDR1 FW2 CDR2

1-4-62: imagen19 TGGMSVS (SEQ ID NO: 2) imagen20 imagen21

Ag1-4-6: imagen22 TGGMSVS (SEQ ID NO: 2) imagen23 imagen24

HAg1T-310: imagen25 TGGMSVS (SEQ ID NO: 2) imagen26 imagen27

imagen28: FW3 CDR3 FW4 imagen29

1-4-62: imagen30 imagen31 WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 7) imagen32

Ag1-4-6: imagen33 imagen34 WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 7) imagen35

HAg1T-310: imagen36 imagen37 WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 7) imagen38

Dominio VL: imagen39 imagen40 imagen41 imagen42

imagen43: FW1 CDR1 FW2 CDR2

1-4-62: imagen44 RDSQSVSSTSLA (SEQ ID NO: 9) imagen45 DTSNRAT (SEQ ID NO: 11)

Ag1-4-6: imagen46 RDSQSVSSTSLA (SEQ ID NO: 9) imagen47 DTSNRAT (SEQ ID NO: 11)

5

10

15

20

25

30

Dominio VL: imagen48 imagen49 imagen50 imagen51

imagen52: FW1 CDR1 FW2 CDR2

HAg1T-3-10: imagen53 RDSQSVSSTSLA (SEQ ID NO: 9) imagen54 DTSNRAT (SEQ ID NO: 11)

imagen55: FW3 CDR3 FW4 imagen56

1-4-62: imagen57 LVRNNWPPRFT (SEQ ID NO: 13) FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 14) imagen58

Ag1-4-6: imagen59 SFVSRPYPRFT (SEQ ID NO: 15) FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 14) imagen60

HAg1T-3-10: imagen61 SFVSRPYPRFT (SEQ ID NO: 15) FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 14) imagen62

Ejemplo 2: Caracterización de los anticuerpos de alta afinidad que se unen a IL6 humana

Materiales y métodos

(i) Líneas celulares y anticuerpos

Las células de mieloma humano, la línea celular U266 (BCRC 60437), se obtuvieron a partir de “Bioresource Collection and Research Center” (BCRC) en Taiwán y se cultivaron en medio RPMI 1640 (Biowet) complementado con 10% de suero bovino fetal.

El hibridoma de linfocitos B dependiente de IL6, B9, se cultivó en RPMI 1640 complementado con 5% de suero bovino fetal, más 50 pg/ml de IL6 humana recombinante.

Las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs) fueron adquiridas en Lonza y se cultivaron en placa de Petri recubierta con gelatina en medio EGMTM-2 singleQuots® (Lonza).

Las células productoras de IgG, la línea celular FreeStyle® CHO (Invitrogen), se cultivaron en medio de expresión de FreeStyle® CHO (Invitrogen) con L-glutamina 8 mM.

La línea celular Flp-in CHO (Invitrogen) se cultivó en F12 de Ham (Invitrogen) con 10% de suero bovino fetal.

Un anticuerpo anti-IL6 de control, BE8, se adquirió en Diaclone. Actemra, un fármaco a base de anticuerpos (anticuerpos anti-IL6), aprobado por la “Food and Drug Administration” de Estados Unidos (FDA) para el tratamiento de la artritis reumatoide, se adquirió en la Universitätsklinikum de Heidelberg, Alemania. El nucleótido de IgG1 humana se adquirió en Sigma.

(ii) Producción de anticuerpos de IgG1 anti-IL6 totalmente humanos

Cuatro vectores expresados (pA01-kappa, pA02-gamma, p2CMV intermedio y pcDNAFRT modificado) se construyeron para la producción de IgG humana en células de mamífero. El gen completo de la cadena ligera (que contenía una región constante Kappa) y el gen completo de la cadena pesada (que contenía una región constante gamma) que codificaban anticuerpos candidatos anti-IL6, se clonaron desde pcANTAB5E en pA01-Kappa y pA02-Gamma por separado, para la expresión transitoria del anticuerpo. Estos vectores de expresión se introdujeron en células FreeStyle® CHO-S mediante el reactivo GenJet® Plus (SignalGen).

Los genes completos de la cadena ligera y la cadena pesada se clonaron primero en el vector p2CMV intermedio y después se clonaron en un vector de expresión único pcDNAFRT modificado para la expresión estable del anticuerpo. El vector pcDNAFRT se transfectó en células CHO mediante el reactivo GenJet® Plus y los clones positivos se seleccionaron con higromicina B (Invitrogen) para una expresión durante un período de tiempo más largo. El material sobrenadante del cultivo se recogió y se purificó con MabSelect SuRe y columnas de proteína A (GE Healthcare).

(iii) Análisis de la unión y la competencia

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Se realizaron un ELISA y una transferencia Western para examinar la actividad de la unión de los anticuerpos IgG humanos anti-IL6. Brevemente, las placas se recubrieron con IL6 recombinante humana (R&D Systems) a 2 µg/ml. Después de lavar con PBS, los pocillos se bloquearon con 1% (p/v) de BSA en PBS durante 1 h a TA. Los anticuerpos anti-IL6 purificados en diluciones en serie (partiendo de una concentración de 2 µg/ml) se colocaron en los pocillos y se incubaron a TA durante 1 h. La placa se lavó con PBS que contenía 0,1% (p/v) de Tween 20 y después se aplicó una sonda de IgG de cabra anti-humana marcada con HRP (KPL), que se diluyó 1:10.000 en 1% de BSA-PBS, durante 40 min a TA. La placa se lavó de nuevo y se añadió una solución de sustrato TMB para que se desarrolle color. Después, se añadió una solución de parada (H2SO4 1 M) y se cuantificó la absorción a 450 nm usando un fotómetro de placas automático (Bio-Rad).

La proteína IL6 recombinante se hirvió en 5X tampón de muestra reductor (Tris-HCl 0,15 M, pH 6,8, 50% de glicerol, 10% de SDS, 2-mercaptoetanol 0,71 M, 0,095% de azul de bromofenol) durante 10 min y se sometió a SDS-PAGE (Bio-Rad). Las proteínas se transfirieron después a una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad) y se sometieron a inmunotransferencia con los anticuerpos anti-IL6 completamente humanos descritos en este documento. Después de incubar con anticuerpo de cabra anti-conejo marcado con HRP (Thermo) o anticuerpo de cabra anti-ratón marcado con HRP (KPL), las membranas se revelaron mediante un aumento de la quimioluminiscencia (GE Healthcare).

Las placas se recubrieron con receptor-α de IL6 humana recombinante (R&D Systems) a 2 µg/ml en tampón NaHCO3 0,1 M a 4°C durante la noche. Después de lavar con PBS, los pocillos se bloquearon con 1% (p/v) de BSA en PBS durante 1 h a TA. Los anticuerpos anti-IL6 purificados en diluciones dobles seriadas con una concentración inicial de 2 µg/ml, se preincubaron con rhIL6 (0,5 µg/ml) a TA durante 1 h. Las mezclas se la colocaron después en la placa y se incubaron a TA durante 1 h. La placa se lavó con PBS que contenía 0,1% (v/v) de Tween 20 y después se aplicó una sonda de IgG2a de ratón anti-IL6 humana (Abcam) diluida 1:2000 en 1% de BSA-PBS durante 1 h a TA. La placa se lavó y luego se aplicó una sonda de IgG de cabra anti-ratón marcada con HRP (Thermo) diluida

1:10.000 en 1% de BSA-PBS durante 40 min a TA. La placa se lavó de nuevo y se añadió una solución de sustrato TMB para que se desarrollara el color. La solución de parada (H2SO4 1 M) se añadió a continuación y se cuantificó la absorción a 450 nm usando un fotómetro de placas automático.

(iv): Ensayo de la transducción de la señalización celular

Las células U266 (1 x 106/ml) se lavaron dos veces con RPMI 1640 exento de suero y se cultivaron durante 2 h en ausencia de suero bovino fetal y factores de crecimiento. Las células se estimularon con rhIL6 (5 ng/ml) durante 30 min a 37°C y a continuación se trataron con o sin anticuerpos anti-IL6. Las células se lavaron con PBS enfriado con hielo y después se lisaron en tampón RIPA (Thermo) complementado con inhibidor de proteasa y fosfatasa (Roche). El análisis por transferencia Western se realizó usando anticuerpos anti-pSTAT3 y anti-STAT3 (Cell Signaling Technology). Después de incubar con anticuerpo de cabra anti-conejo marcado con HRP (Thermo) o de cabra anti-ratón marcado con HRP (Thermo), las membranas se revelaron mediante un aumento de la quimioluminiscencia (GE Healthcare).

(v): Ensayo de la proliferación celular

Las células B9 murinas (5 x 104/ml) se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron con rhIL6 (10 pg/ml). El receptor de IL6 de células B9 murinas se podía estimular con IL6 humana. Los anticuerpos anti-IL6 con varias concentraciones o anticuerpos de IgG de control, se colocaron en los pocillos. Las células se cultivaron a 37°C durante 72 h. La viabilidad celular se detectó mediante un ensayo de tetrazolio soluble en agua (WST-1) (Roche) según las instrucciones del fabricante. Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado.

(vi): Análisis Biacore

La afinidad de la unión de IgG se midió utilizando un kit de captura de anticuerpos humanos (GE Healthcare) en un sistema BIAcore T200 (GE Healthcare). La IgG de ratón anti-humana se inmovilizó sobre un chip sensor CM5 a través de acoplamiento con amina. Aproximadamente 700 UR de IgG anti-IL6 purificada en tampón HBS-EP+ se capturaron sobre la superficie inmovilizada. Se inyectó la IL6 humana recombinante (R&D Systems) con concentraciones que oscilaban desde 25,6 nM a 0,4 nM en tampón HBS-EP+ durante 2 minutos, usando un caudal de 30 µl/min. La disociación del antígeno unido en el flujo del tampón HBS-EP+ siguió durante 7 minutos. Las superficies con IgG se regeneraron después de cada ciclo empleando una solución de regeneración (MgCl2 3 M). La constante de disociación (KD) se calculó como kd/ka.

(vii) Análisis de la especificidad

Las placas se recubrieron con IL-3 humana recombinante, IL4, IL5, IL6, IL11, IL17A, CNTF, OSM, IGF-1 (R&D Systems), IL2, FGF (Prospec), VEGF, TNF-α, EGF (Peprotech) a 2 µg/ml en tampón NaHCO3 0,1 M a 4°C durante la noche. Después de lavar con PBS, los pocillos se bloquearon con 1% (p/v) de BSA en PBS a TA durante 1 h. Los anticuerpos anti-IL6 purificados diluidos cuatro veces en serie, con una concentración inicial de 2 µg/ml, se colocaron en los pocillos y se incubaron a TA durante 1 h. La placa se lavó en PBS que contenía 0,1% (p/v) de Tween 20 y después se aplicó una sonda de IgG de cabra anti-humana marcada con HRP (KPL) diluida 1:10.000 en 1% de BSA-PBS durante 40 min a TA. La placa se lavó de nuevo y se añadió una solución de sustrato TMB para que se

5

10

15

20

25

30

35

desarrolara el color. La solución de parada (H2SO4 1 M) se añadió entonces y se cuantificó la absorción a 450 nm usando VERSA max (Molecular Devices).

Resultados

(a) Actividad de la unión de anticuerpos IgG anti-IL6

Para explorar la especificidad de la unión de los anticuerpos anti-IL6, los genes de VH y VL que codificaban los clones de scFv seleccionados, se fusionaron con genes de la región constante kappa y gamma para producir anticuerpos IgG1 humanos completos, como se ha descrito en este documento. Ensayos ELISA y de transferencia Western mostraron que los anticuerpos anti-IL6 podían unirse a la proteína IL6 humana recombinante y mostraban una actividad neutralizante de una manera dependiente de la dosis.

El análisis BIAcore mostraba que el promedio de las constantes de la tasa de asociación (ka) de los clones Ag1-4-6 y Hag1T-3-10 mejoraba de 4,38 x 10-5 a 2,24 x 10-6 M-1 s-1, en comparación con el clon parental 1-4-62. Las constantes de la tasa de disociación (kd) mejoraron desde 1,66 x 10-3 a 6 x 10-4 s-1. Las constantes de equilibrio de la disociación (KD) mejoraron desde 3,85 hasta 0,27 nM. Véase la Tabla 2 a continuación.

Tabla 2. Constantes de la tasa de asociación (ka) y constantes de disociación (kd) de los anticuerpos anti-IL6

Anticuerpo: Ka (1/Ms) Kd (1/s) KD (nM)

1-4-62: 4,38E+05 1,66E-03 3,85

Ag1-4-6: 1,61E+06 1,21E-03 0,75

HAg1T-3-10: 2,24E+06 6,00E-04 0,27

(b): Especificidad de la unión de los anticuerpos anti-IL6

Un ensayo ELISA como se ha descrito en este documento, se realizó para confirmar la especificidad de la unión de los anticuerpos anti-IL6 de alta afinidad descritos en este documento. Brevemente, las placas se recubrieron con diferentes citocinas como se indica en la Figura 3A (citocinas de la familia de IL6) y la Figura 3B (citocinas que no son de la familia de IL6) y se examinaron las actividades de unión del clon del anticuerpo FB704 (es decir, Ag1-4-6) con esas citocinas. FB704 mostraba una actividad de unión elevada con la proteína IL6 humana pero no con otras citocinas (Figuras 3A y 3B), lo que indica la especificidad de su unión a IL6 humana.

(c): Inhibición de la vía de señalización dependiente de IL6 y la proliferación celular mediante anticuerpos anti-IL6

Se utilizaron células U266 de mieloma múltiple humano para examinar el efecto de los anticuerpos anti-IL6 sobre la cascada de señalización inducida con IL6. Las células U266 se cultivaron en presencia o ausencia de anticuerpos, junto con rhIL6. Después de 30 minutos, se recogieron los lisados de células completas y se realizó un análisis de transferencia Western para examinar la proteína STAT3 fosforilada (P-STAT3), que es un importante factor de transcripción implicado en la vía de señalización de IL6. La expresión de la proteína P-STAT3 se inhibía con los anticuerpos anti-IL6 de alta afinidad, Ag1-4-6 y HAg1T-3-10, a un nivel superior al de Actemra, un anticuerpo humanizado anti-receptor de IL6 se utilizó como control. (Figuras 1A y 1B). Los niveles de inhibición de la fosforilación de STAT3 a través de los anticuerpos, se muestran en la Tabla 3 a continuación:

Tabla 3. Niveles de inhibición de la fosforilación de STAT3 mediante anticuerpos anti-IL6

Porcentaje de inhibición de control con diferentes concentraciones de Ac: 0,05 μg/ml 0,5 μg/ml

1-4-62: 0 8

Ag1-4-6: 0 60

HAg1T-3-10: 49 93

Actemra: 0 17

Además, para examinar la actividad de los anticuerpos sobre la proliferación celular, se cultivaron células de hibridoma murino B9 dependientes de IL6 en presencia de anticuerpos anti-IL6 o anti-IL6R, así como un anticuerpo de control del isotipo a diversas concentraciones. El impacto sobre la proliferación celular se evaluó mediante un ensayo WST-1 (Roche) después de 72 horas. Como se muestra en la Figura 1C, los anticuerpos anti-IL6 totalmente humanos 1-4-62, Ag1-4-6 y HAg1T-3-10 inhibían la proliferación de las células B9 de una manera dependiente de la dosis y los valores de CI50 de 1-4 -62, Ag1-4-6 y HAg1T-3-10 eran 0,618, 0,0468 y 0,00456 µg/ml, respectivamente.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Ejemplo 3: Eficacia de los anticuerpos anti-IL6 de alta afinidad en el tratamiento del cáncer

Materiales y métodos

(i): Animales

Ratones NOD/SCID machos (7-8 semanas de edad) fueron adquiridos en BioLASCO Taiwan Co., Ltd (Taipéi, Taiwán) para todos los experimentos. Los ratones se mantuvieron en jaulas estériles ventiladas individualmente (IVC) a 20°C y se aclimataron a las instalaciones de alojamiento al menos 7 días antes de que se iniciaran los experimentos.

(ii): Ensayo con Matrigel de la angiogénesis

El Matrigel líquido (BD Biosciences) se mantuvo a 4°C. La proteína recombinante hIL6 (R&D Systems) se añadió al Matrigel hasta una concentración final de 100 ng/0,5 ml. Los ratones fueron anestesiados con Avertin (0,2 ml/10 g, inyección i.p.) y se inyectó en dos sitios del lado dorsal con 0,5 ml de Matrigel. A continuación, se trató a los ratones con anticuerpos de IgG anti-IL6 o un anticuerpo de IgG de control a través de una inyección intravenosa. El día 6, los ratones fueron sacrificados mediante asfixia con CO2. Se retiraron los implantes de Matrigel, se pesaron y se fotografiaron. Para medir los niveles de hemoglobina, el implante de Matrigel se lisó con un tampón de lisis (1% de SDS, 0,5% de Triton en PBS) durante la noche a 4°C. El contenido en hemoglobina de los implantes se cuantificó usando el reactivo de Drabkin (Sigma). Las concentraciones de hemoglobina en los implantes se determinaron usando una curva estándar de hemoglobina bovina (Sigma). Los contenidos en hemoglobina se indicaron como microgramos de hemoglobina por gramo de Matrigel. Las medias + SD se calcularon utilizando la prueba t de Student no pareada; p <0,05 se consideró como estadísticamente significativo.

(iii) Ensayo de metástasis tumoral PC3 en la próstata utilizando un modelo de implantación intraesplénica

Los ratones se anestesiaron con Avertin (0,2 ml/10 g) y se les afeitó el flanco izquierdo. A continuación se colocaron en posición decúbito lateral derecho y se frotaron con alcohol al 75% en el flanco izquierdo. En la piel de la pared abdominal se realizó una incisión longitudinal (paralela a la columna vertebral) de 1 cm. El bazo se exteriorizó y se estabilizó con suavidad. Una aguja de calibre 30 en una jeringa de insulina se insertó 3-4 mm en el parénquima del bazo. Se inyectaron lentamente 50 µl de una suspensión de células PC-3. Una roncha pálida visible indicaba una inyección exitosa. A continuación, la aguja se retiró y se colocó una pequeña bola de algodón para cubrir el sitio de la inyección durante 30 segundos para evitar el sangrado y el derrame de la suspensión celular. El bazo se colocó de nuevo en el peritoneo. La pared abdominal se cerró con una sutura con nailon 6-0, y la piel se cerró con una sutura con nailon 4-0.

Después de la implantación, los ratones fueron asignados aleatoriamente a diferentes grupos de tratamiento (grupo de Docetaxel, grupo de Docetaxel más anticuerpos anti-IL6 y grupo de control con PBS) y se trataron con dosis múltiples de anticuerpo anti-IL6 (20 mg/kg cada vez, dos veces a la semana), Docetaxel (3 mg/kg cada vez, una vez a la semana) a través de la vena de la cola o mediante inyección i.p. Los pesos corporales de los ratones se midieron dos veces a la semana.

Todos los ratones fueron sacrificados mediante asfixia con CO2 y se determinaron los pesos corporales. Los tumores primarios en el bazo y el hígado se extirparon, se fotografiaron y se pesaron. El índice de órganos se expresó como miligramo de órgano por gramo de ratón. Las medias + SD se calcularon utilizando la prueba t de Student. Como ensayo de supervivencia se utilizó el análisis de Kaplan-Meier. Se preparó una sección embebida en parafina o congelada de las masas tumorales y se tiñó con anti-CD31 y Ki-67 más una tinción con hematoxilina para el análisis.

(iv) Modelo con xenoinjerto de tumor pancreático humano

Células tumorales pancreáticas humanas BxPC-3 y MiaPaCa se resuspendieron en PBS y se inyectaron por vía subcutánea (s.c.) (5 x 106 células, volumen total 0,15 ml) en el flanco derecho de los ratones. Después de 10 días, los ratones fueron asignados aleatoriamente a diferentes grupos de tratamiento (grupos de anticuerpo FB704, oxaliplatino, FB704 más oxaliplatino, gemcitabina y control con PBS) y se trataron con dosis múltiples de FB704 (20 mg/kg cada vez, dos veces a la semana) u oxaliplatino (3 mg/kg cada vez, una vez a la semana) o gemcitabina (80 mg/kg cada vez, dos veces a la semana) a través de la vena de la cola o mediante inyección i.p. Los pesos corporales de los ratones y los tamaños de los tumores se midieron dos veces a la semana. Los tamaños de los tumores se midieron usando un calibrador y el volumen del tumor se calculó por la longitud x anchura2 x 0,52. Después del experimento, todos los ratones se sacrificaron, se recogieron muestras de sangre de los ratones y las masas tumorales se retiraron y ponderaron. Las diferencias en los valores medios de volumen del tumor y peso del tumor se evaluaron mediante la prueba t de Student. Secciones embebidas en parafina o congeladas de masas tumorales se prepararon y se tiñeron mediante anti-CD31, Ki67 o TUNEL más tinción con H&E para el análisis.

Resultados

(i) FB704 inhibe la angiogénesis in vivo en un ensayo con Matrigel

La capacidad anti-angiogénica de FB704 se examinó en un modelo de Matrigel in vivo como se ha descrito en este

imagen63

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Las células HUVEC se sembraron en una placa de 48 pocillos con una densidad de 2 x 105 células/ml. Las células se trataron con una combinación de IL6 humana recombinante, receptor α de IL6 (R&D Systems) con o sin anticuerpos anti-IL6, a diversas concentraciones o el anticuerpo IgG de control a 37°C durante 24 h. Se recogió el material sobrenadantes de cultivos exentos de células y se analizó la presencia de MCP-1 y sICAM-1 mediante ELISA (Ray-Biotech)

Este ensayo in vitro indicaba que IL6 más sIL6Rα inducían la expresión de MCP-1 y sICAM-1 en las HUVECs. Los anticuerpos Ag1-4-6 y HAg1T-3-10 inhibían MCP-1 (Figura 2A) y sICAM-1 (Figura 2B) inducidas con IL6 más sIL6Rα, de una manera dependiente de la dosis. La eficacia de la inhibición era mayor que la de Actemra.

(ii) Los anticuerpos anti-IL6 inhibían la producción de MCP-1 en células U937 y células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC)

MCP-1 es una pequeña citocina que pertenece a la familia de las quimiocinas CC, que reclutan monocitos, linfocitos T de memoria y células dendríticas a los sitios de una inflamación. Entre las células inmunes, se sabe que las células monocíticas son las principales productoras de MCP-1. MCP-1 tiene un papel importante en la inflamación y la artritis. Además, se observó que IL6 induce MCP-1 en monocitos humanos. Por lo tanto, los anticuerpos anti-IL6 descritos en este documento se sometieron a ensayo para determinar su eficacia para inhibir la expresión de MCP-1 en las células U937 de la línea celular promonocítica, estimuladas con IL6.

Células U937 (2 x 106 células/pocillo) se cultivaron con IL6 (100 ng/ml) durante 24 h en placas de cultivo de fondo plano de 48 pocillos (Corning, Corning, NY) que contenían RPMI 1640 en presencia de los anticuerpos anti-IL6 a diferentes concentraciones. Los niveles de MCP-1 en el material sobrenadante se midieron con los kits de ELISA para MCP-1 (e Bioscience). Todos los experimentos in vitro se realizaron por triplicado.

La producción de MCP-1 a partir de células U937 se observó después de una estimulación con IL6 y de una manera dependiente de la dosis y los anticuerpos anti-IL6 inhibían la producción de MCP-1 en las células U937 inducidas con IL6 (Figura 7A).

Además, las PBMCs se aislaron a partir de cinco donantes sanos. Las células (5 X 105 células/250 μl/pocillo) se cultivaron con IL6 (100 ng/ml) durante 24 h en placas de cultivo de 96 pocillos con fondo en U (Corning, Corning, NY) que contenían RPMI1640 en presencia de anticuerpos anti-IL6 a diferentes concentraciones. Los niveles de MCP-1 en el material sobrenadante se midieron mediante kits de ELISA para MCP-1 (e Bioscience).

Se observó una producción de MCP-1 en las células PBMCs después de la estimulación con IL6. La presencia de los anticuerpos Ag1-4-6 y HAg1T-3-10 inhibía la producción de MCP-1 de una manera dependiente de la dosis, mientras que una IgG1 de control del isotipo no mostraba ese efecto inhibidor (Figura 7B).

(iii) Los anticuerpos anti-IL6 inhibían la producción de MCP-1 y VEGF en fibroblastos sinoviales procedentes de pacientes con artritis reumatoide

Los tejidos sinoviales frescos se desmenuzaron y se digirieron en una solución de colagenasa y ADNasa. Los fibroblastos aislados se filtraron a través de filtros de nailon de 70 mm. Las células se cultivaron en placas de cultivo celular de plástico en 95% de aire/5% de CO2 en medio RPMI 1640 (Life Technologies) que estaba complementado con HEPES 20 mM y 10% de FBS termoinactivado, glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina (pH ajustado a 7,6). Más del 95% de las células eran fibroblastos, tal como se caracterizó mediante una tinción inmunofluorescente utilizando un anticuerpo específico para el marcador proteico de fibroblastos, vimentina. Los fibroblastos procedentes de los pases cuatro a nueve se utilizaron para los experimentos.

Unos sinoviocitos similares a fibroblastos obtenidos a partir de pacientes humanos con AR, como se han descrito anteriormente (células RA-FLS) se cultivaron en placas de cultivo de fondo plano de 6 pocillos (Corning, Corning, NY; 2 X 105 células/2 ml/pocillo) durante 2 días y se estimularon tanto con IL6 como con sIL6R. Los anticuerpos se añadieron a los pocillos a diversas concentraciones y se incubaron con las células durante 24 h. Los niveles de MCP-1 se midieron después mediante kits de ELISA para MCP-1 (e Bioscience).

Las células RA-FLS expresan MCP-1 de forma natural a niveles bajos y el pretratamiento con IL6 y sIL6R podía estimular un alto nivel de producción de MCP-1. Los anticuerpos anti-IL6 descritos en este documento mostraban una inhibición significativa de la producción de MCP-1 en células RA-FLS disponibles comercialmente (Figura 8A) y células RA-FLS obtenidas a partir de pacientes con AR como se ha descrito anteriormente (Figura 8B).

El factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) tiene un papel importante en la patogénesis de la AR. Los niveles de VEGF son significativamente más altos en los fluidos sinoviales de pacientes con AR. También induce una permeabilidad vascular y media en la inflamación. Para examinar el efecto de los anticuerpos anti-IL6 sobre la producción de VEGF en las células RA-FLS, esas células se trataron con los anticuerpos anti-IL6 descritos en este documento en presencia de IL6 (100 ng/ml), sIL6R (100 ng/ml) e IL1β (5 ng/ml) del modo siguiente.

Las células RA-FLS (2 X 104 células/500 µl/pocillo) se cultivaron en placas de cultivo con 48 pocillos de fondo plano (Corning, Corning, NY) durante 24 horas y después se estimularon tanto con IL6 como sIL6R e IL-1β. Los anticuer

Claims

imagen1

imagen2