ES2664809T3 - Anticuerpo anti-TROP-2 humano que tiene actividad antitumoral in vivo - Google Patents

Anticuerpo anti-TROP-2 humano que tiene actividad antitumoral in vivo Download PDF

Info

Publication number
ES2664809T3
ES2664809T3 ES11783675.9T ES11783675T ES2664809T3 ES 2664809 T3 ES2664809 T3 ES 2664809T3 ES 11783675 T ES11783675 T ES 11783675T ES 2664809 T3 ES2664809 T3 ES 2664809T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
antibody
human
amino acid
tumor
htrop
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES11783675.9T
Other languages
English (en)
Inventor
Koji Nakamura
Kentaro Okamura
Maki Tamura
Hiroyuki Yanai
Toru Kanke
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chiome Bioscience Inc
Original Assignee
Chiome Bioscience Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chiome Bioscience Inc filed Critical Chiome Bioscience Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2664809T3 publication Critical patent/ES2664809T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6859—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from liver or pancreas cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57515—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the breast
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57525—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the liver or pancreas
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57535—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the large intestine, e.g. colon, rectum or anus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57555—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Un anticuerpo contra TROP-2 humano, que tiene actividad antitumoral in vivo y en el que: (a) la región V de la cadena H del anticuerpo consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 35 o la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos en las posiciones 20 a 134 en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 35, y la región V de la cadena L de la misma consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 40 o la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos en las posiciones 21 a 127 en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 40; o (b) la región V de la cadena H del anticuerpo consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 65 o la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos en las posiciones 20 a 141 en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 65, y la región V de la cadena L de la misma consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 70 o la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos en las posiciones 20 a 130 en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 70.

Description

Anticuerpo anti-TROP-2 humano que tiene actividad antitumoral in vivo
Campo técnico 5
La presente invención se refiere a un anticuerpo anti-TROP-2 humano que tiene actividad antitumoral, y en particular, a un anticuerpo anti-TROP-2 humano que tiene actividad antitumoral in vivo. Además, la presente invención se refiere a un hibridoma, que produce el anticuerpo mencionado anteriormente, y un uso del anticuerpo mencionado anteriormente. 10
Antecedentes de la técnica
El TROP-2 humano (Tacstd2, GA733-1 y EGP-1) (también denominado quot;hTROP-2quot; en lo sucesivo en el presente documento) es una proteína de la membrana celular de tipo 1, transmembrana individual que consiste en 323 restos 15 de aminoácidos (véase SEQ ID NO: 2), y se ha sabido que esta proteína estaba sobreexpresada en diversos tipos de carcinomas de células epidérmicas. Desde hace mucho tiempo se ha sugerido la presencia de una proteína de membrana celular asociada con resistencia inmunológica, que comúnmente se expresa tanto en trofoblastos como en células cancerosas humanos (Documento de No Patente 1). Se identificó una molécula de antígeno reconocida por anticuerpos monoclonales de ratón (162-25.3, 162-46.2) que reacciona con la proteína de membrana celular de 20 una línea BeWo de células de coriocarcinoma humano. Esta molécula de antígeno fue considerada como una de las moléculas expresadas en trofoblastos humanos, y se denominó Trop-2 (Documento de No Patente 2). A partir de ese momento, la misma molécula fue descubierta por otros investigadores. Es decir, un antígeno tumoral reconocido por un anticuerpo monoclonal GA733 de ratón que se obtiene mediante inmunización con células SW948 de cáncer de estómago se denominó GA733-1 (Documento de No Patente 3), y una glicoproteína epitelial reconocida por un 25 anticuerpo monoclonal RS7-3G11 de ratón que se obtiene mediante inmunización con células de cáncer de pulmón de células no microcíticas se denominó antígeno epitelial/carcinoma, EGP-1 (Documento de No Patente 4). En 1995, el gen Trop-2 se clonó, y como resultado, se confirmó que estas son las mismas moléculas (Documento de No Patente 5). Además, se aclaró que la molécula tiene una función para amplificar señales de calcio intracelular en células cancerosas (Documento de No Patente 6), y por lo tanto, también se denomina transductor 2 de señales de 30 calcio asociado a tumor (TACSTD2).
En el cromosoma 1p32h se hacen mapas del gen TROP-2, y éste constituye una familia genética de TACSTD junto con GA733-2 que tiene una homología de aproximadamente un 50 % con ello (que se ha conocido como quot;TACSTD1quot;, quot;glicoproteína epitelial EGP-2quot;, quot;EpCAMquot; o quot;Trop-1quot;) (Documento de No Patente 7). La proteína 35 hTROP-2 (323 restos de aminoácidos; SEQ ID NO: 2) tiene un peso molecular de aproximadamente 36 KDalton, y esta proteína consiste en un péptido señal hidrófilo (1er a 26º aminoácidos), un dominio extracelular (27º a 274º aminoácidos), un dominio transmembrana (275º a 297º aminoácidos) y un dominio intracelular (298º a 323º aminoácidos). El dominio extracelular tiene cuatro sitios de glicosilación unidos a N heterogéneos, y es evidente que su peso molecular aumenta de 11 a 13 KDalton debido a la adición de cadenas de azúcar (Documento de No 40 Patente 5). Se considera que la familia genética TACSTD quien la secuencia de repetición de tiroglobulina (TY) característica en el dominio extracelular y está asociada con la proliferación, invasión y metástasis de células cancerosas.
Hasta la fecha, no se ha identificado un ligando fisiológico de hTROP-2, y la función molecular del mismo no se ha 45 aclarado. Sin embargo, se ha descrito que hTROP-2 transmitió una señal de calcio en células tumorales (Documento de No Patente 6). Además, a partir de los hechos de que la serina intracelular 303 está fosforilada por la proteína quinasa C dependiente de Ca2+ (Documento de No Patente 4) y que hTROP-2 tiene una secuencia de unión a PIP2 en su dominio intracelular, se ha sugerido que hTROP-2 tiene una función de señalización en células tumorales (Documento de No Patente 8). 50
Como resultado de estudios de diagnóstico in vitro tales como inmunohistoquímica (IHC) y análisis de citometría de flujo, se ha informado de la sobreexpresión de hTROP-2 en muchos tipos de carcinomas obtenidos a partir de epitelio tales como cáncer de estómago, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer de hígado y cáncer de esófago. Por el contrario, la expresión de 55 hTROP-2 en tejidos normales está limitada a células en la región epitelial, y el nivel de expresión de hTROP-2 en células normales es inferior al que hay en células cancerosas. Por lo tanto, se sugiere la asociación de TROP-2 con la formación de tumores (Documentos de Patente 1-3 y 9).
Además, en el análisis de un nivel de expresión de hTROP-2 usado como un biomarcador en muestras clínicas, se 60 ha demostrado que, cuando hTROP-2 está altamente expresado, se correlaciona con la malignidad de un cáncer de colon (Documentos de No Patente 10 y 11), cáncer pancreático (Documento de No Patente 12) o cáncer oral (Documento de No Patente 13), la posibilidad de metástasis o recurrencia de un cáncer de este tipo es significativamente elevada. Además, en un análisis de expresión genética a gran escala usando una técnica de micromatriz de ADNc, hTROP-2 se ha identificado como un grupo genético, que está sobre expresado al nivel más 65 elevado en carcinoma papilar severo del ovario, en comparación con el epitelio de ovario normal (Documento de No Patente 14).
Además adicionalmente, en los últimos años, se ha demostrado un papel importante de hTROP-2 en la formación de tumores en los modelos usando células de cáncer de colon (Documento de No Patente 15). Dado que la expresión of hTROP-2 estimula la proliferación celular independiente del anclaje y que se requiere para la formación de tumor y 5 proliferación de células cancerosas trasplantadas por vía subcutánea en ratones inmunodeficientes, aumenta la posibilidad de que hTROP-2 podría actuar como un antígeno tumoral funcional y que se podría usar como una nueva diana terapéutica.
Hasta la fecha, se ha informado de estudios con respecto a los efectos antitumorales de varios anticuerpos anti-10 hTROP-2. Se ha examinado un anticuerpo RS7 (Documento de Patente 1) usando modelos in vivo, en los que se usaron anticuerpos radioetiquetados, y se demostró una actividad antitumoral en modelos de xenoinjerto de ratón atímico. Sin embargo, no se ha informado de los efectos antitumorales solamente con anticuerpo (un anticuerpo desnudo).
15
Además, se ha informado de la citotoxicidad de un anticuerpo monoclonal BR110 anti-hTROP-2 unido a citotoxina (Documento de Patente 2) en las líneas de células H3619, H2987, MCF-7, H3396 y H2981 de cáncer humano en experimentos in vitro. Sin embargo, todavía no se ha desvelado la citotoxicidad de un anticuerpo desnudo o un conjugado inmunológico de Bur110 in vivo.
20
En los últimos años, se ha informado de que un anticuerpo monoclonal aislado, que se produjo a partir de una línea de células de hibridoma AR47A6.4.2 o AR52A301.5 obtenida inmunizando ratones con tejidos de cáncer de ovario humano, unidos a hTROP-2, y que, por primera vez, presentaba, como un anticuerpo desnudo, actividad antitumoral en modelos de xenoinjerto de ratón atímico, así como citotoxicidad in vitro (Documentos de Patente 3 y 4). En estos documentos de patente, el anticuerpo mencionado anteriormente presentaba efectos anti tumorales por tratamiento 25 solamente con anticuerpo en modelos de xenoinjerto de ratón, en los que se habían trasplantado líneas de células de cáncer pancreático, BxPC-3 y PL45, una línea de células de cáncer de próstata, PC-3, una línea de células de cáncer de mama, MCF-7 y una línea de células de cáncer de colon, Colo205. Los efectos terapéuticos del anticuerpo han aparecido los modelos, en los que se habían trasplantado células BxPC-3. Además de esto, la formación y proliferación tumoral solo se suprimían parcialmente (aproximadamente de un 40 % a un 60 %) mediante la 30 administración preventiva del anticuerpo, y era necesaria una cantidad extremadamente grande (aproximadamente 20 mg/kg) del anticuerpo para una supresión de una formación y proliferación tumoral de este tipo.
Basándose en los hallazgos previos mencionados anteriormente, se ha sugerido el uso potencial del anticuerpo anti-hTROP-2 como un anticuerpo antitumoral. Sin embargo, no todos los anticuerpos anti-hTROP-2 presentan efectos 35 antitumorales por tratamiento con anticuerpo solo como anticuerpos desnudos in vivo. Los anticuerpos presentan diferentes funciones para hTROP-2, dependiendo de un sitio de unión, afinidad y el perfil de un anticuerpo monoclonal.
Documento de Patente 1: documento de Patente de Estados Unidos N.º 665.3104 40
Documento de Patente 2: documento de Patente de Estados Unidos N.º 5840854
Documento de Patente 3: documento de Patente de Estados Unidos N.º 7420040
Documento de Patente 4: documento de Patente de Estados Unidos N.º 7420041
Documento de No Patente 1: Faulk WP, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75 (4), pp. 1947-1951 (1978)
Documento de No Patente 2: Lipinski M, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78 (8), pp. 5147-5150 (1981) 45
Documento de No Patente 3: Linnenbach AJ, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86 (1), pp. 27-31 (1989)
Documento de No Patente 4: Basu A, et al., Int. J. Cancer, 62 (4), pp. 472-479 (1995)
Documento de No Patente 5: Fornaro M, et al., Int. J. Cancer, 62 (5), pp. 610-618 (1995)
Documento de No Patente 6: Ripani E, et al., Int. J. Cancer, 76 (5), pp. 671-676 (1998)
Documento de No Patente 7: Calabrese G, et al., Cell Genet., 92 (1-2), pp. 164-165 (2001) 50
Documento de No Patente 8: El Sewedy T et al., Int. J. Cancer, 75 (2), pp. 324-330 (1998)
Documento de No Patente 9: Cubas R, et al., Biochim. Biophys. Acta., 1796 (2), pp. 309-314 (2009)
Documento de No Patente 10: Ohmachi T et al., Clin. Cancer Res., 12 (10), pp. 3057-3063 (2006)
Documento de No Patente 11: Fang YJ, et al., Int. J. Colorectal Dis., 24 (8), pp. 875-884 (2009)
Documento de No Patente 12: Fong D, et al., Br. J. Cancer, 99 (8), pp. 1290-1295 (2008) 55
Documento de No Patente 13: Fong D, et al., Mod. Pathol., 21 (2), pp. 186-191 (2008)
Documento de No Patente 14: Santin AD, et al., Int. J. Cancer, 112 (1), pp. 14-25 (2004)
Documento de No Patente 15: Wang J, et al., Mol. Cancer Ther., 7 (2), pp. 280-285 (2008)
Resumen de la Invención 60
En las circunstancias mencionadas anteriormente, se ha deseado desarrollar un anticuerpo anti-hTROP-2 (un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2) que tenga actividad antitumoral in vivo elevada, y en particular, un anticuerpo anti-hTROP-2 o similares, que tenga un efecto antitumoral como un anticuerpo desnudo solo in vivo y además, que tenga el efecto antitumoral a una dosis baja. 65
La presente invención se ha completado, a la vez que se tenían en cuenta las circunstancias mencionadas anteriormente. La presente invención proporciona un anticuerpo anti-hTROP-2 (un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2), un hibridoma, que produce el anticuerpo, un fragmento del anticuerpo, un complejo (un inmunoconjugado) del anticuerpo y un fármaco, una composición farmacéutica para diagnosticar o tratar un tumor, un método para detectar un tumor, un kit para detectar o diagnosticar un tumor que se describirán a continuación. 5
(1) Un anticuerpo contra TROP-2 humano, que tiene actividad antitumoral in vivo y en el que:
(a) la región V de la cadena H del anticuerpo consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 35 o la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos en las posiciones 20 a 134 en la 10 secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 35, y la región V de la cadena L de la misma consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 40 o la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos en las posiciones 21 a 127 en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 40; o
(b) la región V de la cadena H del anticuerpo consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ 15 ID NO: 65 o la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos en las posiciones 20 a 141 en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 65, y la región V de la cadena L de la misma consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 70 o la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos en las posiciones 20 a 130 en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 70. 20
Los ejemplos del anticuerpo de acuerdo con (1) mencionado anteriormente incluyen un anticuerpo que tiene actividad antitumoral en dos o más tipos de líneas de células tumorales humanas. En el presente documento, el tumor es, por ejemplo, al menos un tipo seleccionado entre el grupo que consiste en cáncer pancreático humano, cáncer de próstata humano, cáncer de colon humano y cáncer de mama humano, y en particular, cáncer 25 pancreático humano. Además, el tumor también incluye un cáncer recurrente y un cáncer metastásico. Además, las líneas de células tumorales son de al menos dos tipos seleccionados entre el grupo que consiste en una línea de células de cáncer pancreático humano PK-59, una línea de células BxPC-3 de cáncer pancreático humano , una línea de células de cáncer pancreático humano KP-3L, una línea de células de cáncer pancreático humano KP-2, una línea de células de cáncer pancreático humano PK-1, una línea de células de cáncer pancreático 30 humano PK-45H, una línea de células de cáncer pancreático humano PK-45P, una línea de células de cáncer pancreático humano TCC-PAN2, una línea de células de cáncer pancreático humano SUIT-2, una línea de células de cáncer de colon humano CACO-2, una línea de células de cáncer de colon humano SW480, una línea de células de cáncer de colon humano DLD-1, una línea de células de cáncer de colon humano HCT 116, una línea de células de cáncer de mama humano JIMT-1, una línea de células de cáncer de mama humano 35 HCC1143, una línea de células de cáncer de mama humano MCF-7, una línea de células de cáncer de próstata humano DU145 y una línea de células de cáncer de próstata humano PC-3; y en particular, una línea de células de cáncer pancreático humano PK-59 y una línea de células BxPC-3 de cáncer pancreático humano .
Un ejemplo del anticuerpo de acuerdo con (1) mencionado anteriormente es un anticuerpo monoclonal.
Un ejemplo del anticuerpo de acuerdo con (1) mencionado anteriormente es un anticuerpo genéticamente 40 recombinante, y los ejemplos más específicos incluyen un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano.
(2) Un anticuerpo monoclonal contra TROP-2 humano, que se produce por un hibridoma que tiene el N.º de registro FERM BP-11251 o FERM BP-11346.
Los ejemplos del anticuerpo de acuerdo con (1) y (2) mencionados anteriormente incluyen: un anticuerpo, que se 45 une a un sitio, al que un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma que tiene el N.º de registro FERM BP-11251 o FERM BP-11346; y un anticuerpo, que se une a una porción que comprende al menos una región (por ejemplo, una región cualquiera) seleccionada entre el grupo que consiste en una región que consiste en los aminoácidos en las posiciones 43 a 65, una región que consiste en los aminoácidos en las posiciones 152 a 165, una región que consiste en los aminoácidos en las posiciones 171 a 183, una región que consiste en los 50 aminoácidos en las posiciones 109 a 120, una región que consiste en los aminoácidos en las posiciones 43 a 56, y una región que consiste en los aminoácidos en las posiciones 193 a 206, en la secuencia de aminoácidos de TROP-2 humano mostrada en la SEQ ID NO: 2.
(3) Un fragmento de anticuerpo obtenido a partir del anticuerpo de acuerdo con (1) o (2) mencionados anteriormente, que comprende: 55
(a) la región V de la cadena H del anticuerpo quimérico consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 35 o la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos en las posiciones 20 a 134 en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 35, y la región V de la cadena L de la misma consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 40 o la secuencia de 60 aminoácidos que consiste en los aminoácidos en las posiciones 21 a 127 en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 40; o
(b) la región V de la cadena H del anticuerpo quimérico consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 65 o la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos en las posiciones 20 a 141 en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 65, y la región V de la cadena L de la 65 misma consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 70 o la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos en las posiciones 20 a 130 en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 70.
(4) Un hibridoma, que produce el anticuerpo de acuerdo con (1) o (2) mencionados anteriormente.
(5) Un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal contra TROP-2 humano, que tiene el N.º de registro FERM BP-11251 o FERM BP-11346. 5
6) Un conjugado de anticuerpo-fármaco, que comprende el anticuerpo de acuerdo con (1) o (2) mencionados anteriormente y una sustancia que tiene actividad antitumoral y/o actividad de eliminación de células.
(7) Un conjugado de anticuerpo-fármaco, que comprende el fragmento de anticuerpo de acuerdo con (3) mencionado anteriormente y una sustancia que tiene actividad antitumoral y/o actividad de eliminación de células. 10
Con respecto al conjugado de acuerdo con (6) y (7) mencionados anteriormente, el tumor es, por ejemplo, al menos un tipo seleccionado entre el grupo que consiste en cáncer pancreático humano, cáncer de próstata humano, cáncer de colon humano y cáncer de mama humano, y en particular, cáncer pancreático humano. Además, el tumor también incluye un cáncer recurrente y un cáncer metastásico.
(8) Una composición farmacéutica, que comprende al menos un tipo seleccionado entre el grupo que consiste en 15 el anticuerpo de acuerdo con (1) y (2) mencionados anteriormente, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con (3) mencionado anteriormente y el conjugado de acuerdo con (6) y (7) mencionados anteriormente.
Un ejemplo de la composición de acuerdo con (8) mencionado anteriormente es una composición usada en el tratamiento de tumores, y en particular, una composición, que no produce una reducción del peso como un efecto secundario. Otro ejemplo de la composición es una composición usada en el diagnóstico de tumores. En 20 el presente documento, el tumor es, por ejemplo, al menos un tipo seleccionado entre el grupo que consiste en cáncer pancreático humano, cáncer de próstata humano, cáncer de colon humano y cáncer de mama humano, Y en particular, cáncer pancreático humano. Además, el tumor también incluye un cáncer recurrente y un cáncer metastásico.
(9) Una composición farmacéutica, que comprende al menos un tipo seleccionado entre el grupo que consiste en 25 el anticuerpo de acuerdo con (1) y (2) mencionados anteriormente, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con (3) mencionado anteriormente y el conjugado de acuerdo con (6) y (7) mencionados anteriormente para uso en un método para tratar un tumor.
Un ejemplo del método para tratar un tumor es un método que no produce una reducción del peso como un efecto secundario. Con respecto a la composición farmacéutica de acuerdo con (9) mencionada anteriormente, el 30 tumor es, por ejemplo, al menos un tipo seleccionado entre el grupo que consiste en cáncer pancreático humano, cáncer de próstata humano, cáncer de colon humano y cáncer de mama humano, and particularmente, cáncer pancreático humano. Además, el tumor también incluye un cáncer recurrente y un cáncer metastásico.
(10) Un método para detectar un tumor, que comprende: permitir que al menos un tipo seleccionado entre el grupo que consiste en el anticuerpo de acuerdo con (1) y (2) mencionados anteriormente, el fragmento de 35 anticuerpo de acuerdo con (3) mencionado anteriormente el conjugado de acuerdo con (6) y (7) mencionados anteriormente, reaccionen con una muestra recogida de un organismo vivo; y a continuación detectar una señal(es) del anticuerpo y/o fragmento de anticuerpo que se ha hecho reaccionar.
Con respecto al método de acuerdo con (10) mencionado anteriormente, el tumor es, por ejemplo, al menos un tipo seleccionado entre el grupo que consiste en cáncer pancreático humano, cáncer de próstata humano, cáncer 40 de colon humano y cáncer de mama humano, y en particular, cáncer pancreático humano. Además, el tumor también incluye un cáncer recurrente y un cáncer metastásico.
(11) Un kit para tratar, diagnosticar o detectar un tumor, que comprende al menos un tipo seleccionado entre el grupo que consiste en el anticuerpo de acuerdo con (1) y (2) mencionados anteriormente, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con (3) mencionado anteriormente el conjugado de acuerdo con (6) y (7) mencionados 45 anteriormente.
Con respecto al kit de acuerdo con (11) mencionado anteriormente, el tumor es, por ejemplo, al menos un tipo seleccionado entre el grupo que consiste en cáncer pancreático humano, cáncer de próstata humano, cáncer de colon humano y cáncer de mama humano, y en particular, cáncer pancreático humano. Además, el tumor también 50 incluye un cáncer recurrente y un cáncer metastásico.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra la medición de la afinidad de unión a antígeno (Kd: constante de disociación) de un 55 anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 (K5-70). Ant: Anticuerpo (total); Antíg: Antígeno (libre).
La Figura 2 muestra la reactividad de un sobrenadante de cultivo de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2, con células HuH-7 (TROP-2-negativo) y células HuH-7-hTROP-2. El histograma relleno indica células HuH-7, y el histograma no relleno indica células HuH-7-hTROP-2.
La Figura 3 muestra la reactividad de un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 con una línea de células de 60 cáncer pancreático humano (células PK-59), que expresa hTROP-2 de manera endógena en la superficie celular. El histograma relleno indica la reacción de la línea celular solamente con un anticuerpo secundario (IgG anti-ratón etiquetado con PE), y el histograma no relleno indica la reacción de la línea celular con cada anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2.
La Figura 4 muestra la reactividad de un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 con una línea de células de 65 cáncer pancreático humano (células BxPC-3), que expresa hTROP-2 de manera endógena en la superficie celular. El histograma relleno indica la reacción de la línea celular solamente con un anticuerpo secundario (IgG anti-ratón etiquetado con PE), y el histograma no relleno indica la reacción de la línea celular con cada anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2.
La Figura 5 muestra la reactividad de un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 (K5-70) con línea de células de cáncer pancreáticos. El histograma relleno indica la reacción de la línea celular solamente con un anticuerpo 5 secundario (IgG anti-ratón etiquetado con PE), y el histograma no relleno indica la reacción de la línea celular con cada anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2.
La Figura 6 muestra la reactividad de un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 (K5-70) con líneas de células de cáncer de colon humano (Colo320, CACO2, SW480, DLD1, CW2 y HCT 116), líneas de células de cáncer de mama humano (JIMT-1 y HCC1143), y líneas de células de cáncer de próstata humano (PC-3 y DU145). El 10 histograma relleno indica la reacción de la línea celular solamente con un anticuerpo secundario (IgG anti-ratón etiquetado con PE), y el histograma no relleno indica la reacción de la línea celular con el anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2.
La Figura 7 muestra la reactividad cruzada de anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 con TROP-2 de ratón. Se usaron células preparadas permitiendo que un gen TROP-2 de ratón se expresara de forma transitoria en células 15 CHO-K1, y se usó un anticuerpo T2-102 (IgG1 de ratón) que presentaba reactividad cruzada con TROP-2 de ratón como un anticuerpo de control positivo. El histograma relleno indica la reacción de las células solo con un anticuerpo secundario (IgG anti-ratón etiquetado con PE), y el histograma no relleno indica la reacción de las células con cada anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2.
La Figura 8 muestra la reactividad cruzada de anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 con EpCAM/TROP-1 20 humano. Se usaron células preparadas permitiendo que un gen EpCAM/TROP-1 humano se expresara de forma transitoria en células CHO-K1, y se usó un anticuerpo monoclonal anti-EpCAM humano etiquetado con PE (Becton, Dickinson and Company) como un anticuerpo de control positivo. El histograma relleno indica la reacción de las células solo con un anticuerpo secundario (IgG anti-ratón etiquetado con PE), y el histograma no relleno indica la reacción de las células con cada anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2. 25
La Figura 9 muestra la actividad inhibitoria del crecimiento celular de anticuerpos anti-hTROP-2 (T6-16, T5-86, K5-70 y K5-107) en una línea de células de cáncer pancreático humano (células PK-59). mIgG indica un anticuerpo de control (IgG de ratón), e YY01 indica un anticuerpo anti-hTROP-2 disponible en el mercado (Santa Cruz). Columna de color blanco: 0 µg/ml; columna de color gris: 0,1 µg/ml; columna de color negro: 1 µg/ml. El nivel de actividad se expresó como una proporción con respecto al valor en el caso de no añadir anticuerpo 30 (0 µg/ml). La barra de error indica una desviación estándar. *P lt; 0,05, **P lt; 0,01 (mediante ensayo t de Student). La Figura 10 muestra un ensayo de raspado de una línea de células de cáncer pancreático humano (células PK-59) en presencia de anticuerpos anti-hTROP-2 (T6-16 y K5-70).
La Figura 10A muestra ejemplos representativos de fotografías de las regiones de raspado de células PK-59. El Día 0 muestra un ejemplo representativo inmediatamente después del raspado. mIgG (Día 1) muestra una 35 fotografía tomada 1 día (24 horas) después del raspado y a continuación añadiendo un anticuerpo de control (IgG de ratón, 1 µg/ml) al medio. K5-70 (Día 1) muestra una fotografía tomada 1 día (24 horas) después del raspado y a continuación añadiendo un anticuerpo K5-70 (1 µg/ml) al medio. T6-16 (Día 1) muestra una fotografía tomada 1 día (24 horas) después del raspado y a continuación añadiendo un anticuerpo T6-16 (1 µg/ml) al medio. Cada flecha en cada fotografía indica el ancho de una región de raspado. 40
Figura 10B. El área de una región de raspado se analizó usando software de análisis de imágenes (Scion Image), y basándose en el valor obtenido, los valores de diversos tipos de otras muestras se calcularon usando el Día 0 del grupo de adición de mIgG de control como un valor patrón de 1. *P lt;0,05, **P lt; 0,01 (mediante ensayo t de Student).
La Figura 11 muestra análisis de FACS usando un marcador de células madre, que se ha realizado en una línea 45 de células de cáncer pancreático humano PK-59. La Figura 11A es una vista que ilustra FACS que muestra la expresión de EpCAM en las células PK-59. El histograma relleno indica la reacción de las células solo con un anticuerpo secundario (IgG anti-ratón etiquetado con PE), y el histograma no relleno indica la reacción de las células con un anticuerpo anti-EpCAM humano (Becton, Dickinson and Company). La Figuras 11B y C son vistas que ilustran FACS que muestra la expresión de P-glicoproteína/MCR1 de las células PK-59 (Figura 11B), o la 50 expresión de ABCG2 en las células PK-59 (Figura 11C). El histograma de color azul indica la reacción de las células solo con un anticuerpo secundario, y el histograma de color rojo indica la reacción de las células con un anticuerpo anti-P-glicoproteína/MDR1 humano (BD Biosciences Pharmingen) (Figura 11B), o con un anticuerpo anti-ABCG2 humano (BD Biosciences Pharmingen) (Figura 11C). La Figura 11D muestra análisis de FACS, en el que las células PK-59 se sometieron a doble tinción con marcadores de células madre de cáncer pancreático, un 55 anticuerpo anti-CD24 humano etiquetado con FITC (BD Biosciences Pharmingen) y un anticuerpo anti-CD44 humano etiquetado con PE (BD Biosciences Pharmingen). Cada número en la Figura 11D indica la proporción existente de las células en cada fracción.
La Figura 12 muestra la evaluación de la actividad antitumoral de un nuevo clon K5-70 de anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 (IgG2a de ratón) en modelos de tratamiento de xenoinjerto usando células PK-59. 60
La Figura 12A muestra el transcurso del tiempo del crecimiento tumoral de un grupo de control (IgG de ratón) y un grupo de administración de K5-70 (un valor medio ± desviación estándar). La flecha indica un periodo de administración de anticuerpo. * P lt; 0,05, ** P lt; 0,01 (mediante ensayo t de Student).
La Figura 12B muestra el peso del tumor representado de cada ratón en el momento del 21er día (Día 21) (el día final del experimento) en el ensayo de la Figura 12A. El valor numérico en cada representación indica un valor 65 medio ± desviación estándar. ** P lt; 0,01 (mediante ensayo t de Student).
La Figura 13 muestra la evaluación de la actividad antitumoral de un clon K5-107 (A), un clon T6-16 (B) y un clon K5-116-2-1 (C) en modelos de tratamiento de xenoinjerto usando células PK-59. El símbolo quot;●quot; indica un grupo de control (IgG de ratón), y el símbolo quot;○quot; indica un grupo de administración de anticuerpo anti-hTROP-2. La flecha en el gráfico indica un periodo de administración de anticuerpo, y el valor numérico en cada representación indica un valor medio ± desviación estándar. * P lt; 0,05 (mediante ensayo t de Student). 5
La Figura 14 muestra la evaluación de la actividad antitumoral de un clon K5-70 (A), un clon T6-16 (B) y un clon K5-116-2-1 (C) en modelos de prevención de xenoinjerto usando células PK-59. El símbolo quot;●quot; indica un grupo de control (IgG de ratón), y el símbolo quot;○quot; indica un grupo de administración de anticuerpo anti-hTROP-2. La flecha en el gráfico indica un periodo de administración de anticuerpo, y el valor numérico en cada representación indica un valor medio ± desviación estándar. ** P lt; 0,01 (mediante ensayo t de Student). 10
La Figura 15 muestra la evaluación de la actividad antitumoral de un clon K5-70 en modelos de prevención y tratamiento de xenoinjerto usando células BxPC-3. La Figura 15A muestra el transcurso del tiempo del crecimiento tumoral de un grupo de control (IgG de ratón) y un grupo de administración de K5-70 en modelos de prevención (un valor medio ± desviación estándar). La flecha indica un periodo de administración de anticuerpo. ** P lt; 0,01 (mediante ensayo t de Student). La Figura 15B muestra el transcurso del tiempo del crecimiento 15 tumoral de un grupo de control (IgG de ratón) y un grupo de administración de K5-70 en modelos de tratamiento (un valor medio ± desviación estándar). La flecha indica un periodo de administración de anticuerpo. * P lt; 0,05 (mediante ensayo t de Student).
La Figura 16 muestra la actividad antitumoral dependiente de la dosis de un clon K5-70 en modelos de prevención de xenoinjerto usando células PK-59. El volumen de un tumor se expresa como un valor 20 medio ± desviación estándar.
La Figura 16A muestra el transcurso del tiempo del crecimiento tumoral de un grupo de control y grupos de administración de K5-70 a diferentes dosis (un valor medio ± desviación estándar). La flecha indica un periodo de administración de anticuerpo. * P lt; 0,05 (mediante ensayo t de Student), ** P lt; 0,01 (mediante ensayo t de Student). 25
La Figura 16B muestra el peso del tumor representado de cada ratón en el momento del 17º día (Día 17) (el día final del experimento) en el ensayo de la Figura 16A. El valor numérico en cada representación indica un valor medio ± desviación estándar. ** P lt; 0,01 (mediante ensayo t de Student).
La Figura 17 es una vista esquemática de una proteína TROP-2 quimérica de ser humano/ratón usada en el experimento. SP: secuencia señal; dominio TY: región de tipo 1 de tiroglobulina; TM: región transmembrana; C: 30 región intracelular, en la que la región rellena es un polipéptido obtenido a partir de hTROP-2, mientras que la región no rellena es un polipéptido obtenido a partir de TROP-2 de ratón. El número en la posición superior de la vista esquemática de la proteína quimérica indica el número de aminoácidos de una proteína TROP-2 de ratón, y el número de la posición inferior de la misma indica el número de aminoácidos de una proteína hTROP-2.
La Figura 18 muestra los resultados obtenidos mediante la identificación de una región de unión a anticuerpo 35 monoclonal anti-hTROP-2, usando TROP-2 quimérica de ser humano/ratón. Usando células HEK293, que expresan constantemente cualquier proteína TROP-2 quimérica de ser humano/ratón-C (hmTROP-2-C) o TROP-2-D quimérica de ratón/ser humano (mhTROP-2-D), se estudió la reactividad con los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 mostrada en la figura. Como control negativo, se usó IgG2b de ratón.
La Figura 19 muestra los resultados obtenidos mediante la identificación de la región de unión a anticuerpo de un 40 anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2.
Un gen hTROP-2 y cada gen de TROP-2 quimérico de ser humano/ratón se introdujeron en células HEK293, y el análisis de FACS se realizó usando las células, en las que los genes se expresaban de forma transitoria. En la Figura 19(A), se estudió la reactividad de los anticuerpos K5-70, K5-107, T5-86 y K5-116-2-1 con hTROP-2 (caja superior), con hmTROP-2-A (caja media) y con hmTROP-2-B (caja inferior). Como control negativo, se usó 45 IgG2b de ratón. En la Figura 19(B), se estudió la reactividad de anticuerpos T6-4 y T6-16 con hTROP-2 (caja superior), con mhTROP-2-E (caja media) y con mhTROP-2-F (caja inferior). Como control negativo, se usó IgG2b de ratón.
La Figura 20 muestra la expresión de hTROP-2 en tejidos normales humanos. Las matrices de tejido normal humano se inmunotiñeron con un clon K5-63-17 de anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2. (A) piel, (B) esófago, 50 (C) riñón (corteza), (D) riñón (médula), (E) páncreas, (F) próstata, (G) vejiga, (H) amígdala, (I) corazón, (J) hígado (aumento: x 200)
La Figura 21 muestra la expresión de hTROP-2 en tejidos cancerosos. Las matrices de tejido de cáncer humano se inmunotiñeron con un clon K5-63-17 de anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2. (A) cáncer de mama, (B) cáncer de pulmón, (C) cáncer de esófago, (D) cáncer de estómago, (E) cáncer pancreático, (F) cáncer de colon, 55 (G) cáncer de vejiga, (H) cáncer de próstata, (I) cáncer de ovario (aumento: x 100)
La Figura 22 muestra la actividad antitumoral de un clon K5-70 mediante una sola administración en modelos de prevención de xenoinjerto usando células PK-59.
La Figura 22A muestra el transcurso del tiempo de la formación del tumor en un grupo de control (IgG de ratón ●) y en un grupo de administración de K5-70 (○) (un valor medio ± desviación estándar). La flecha indica 60 administración de anticuerpo. * P lt; 0,05 (mediante ensayo t de Student), ** P lt; 0,01 (mediante ensayo t de Student).
La Figura 22B muestra el peso del tumor representado de cada ratón en el momento del 28º día (Día 28) (el día final del experimento) en el ensayo de la Figura 22A. ** P lt; 0,01 (mediante ensayo t de Student).
La Figura 22C muestra el transcurso del tiempo de la formación del tumor en cada ratón en un grupo de control 65 (IgG de ratón ●) y en un grupo de administración de K5-70 (○). La flecha indica administración de anticuerpo.
La Figura 23 muestra la actividad antitumoral de un clon K5-70 en modelos de tratamiento de xenoinjerto usando células SW480 de cáncer de colon humano.
La Figura 23A muestra el transcurso del tiempo de la formación del tumor en un grupo de control (IgG de ratón ●) y en un grupo de administración de K5-70 (○) (un valor medio ± desviación estándar). La flecha indica un periodo de administración de anticuerpo. ** P lt; 0,01 (mediante ensayo t de Student). 5
La Figura 23B muestra el peso del tumor representado de cada ratón en el momento del 44º día (Día 44) (el día final del experimento) en el ensayo de la Figura 23A. ** P lt; 0,01 (mediante ensayo t de Student).
La Figura 24 muestra la actividad antitumoral de un clon K5-116-2-1 en modelos de tratamiento de xenoinjerto usando células SW480.
La Figura 24A muestra el transcurso del tiempo de la formación del tumor en un grupo de control (IgG de ratón ●) 10 y en un grupo de administración de T6-16 (○) (un valor medio ± desviación estándar). La flecha indica un periodo de administración de anticuerpo. ** P lt; 0,01 (mediante ensayo t de Student).
La Figura 24B muestra el peso del tumor representado de cada ratón en el momento del 42º día (Día 42) (el día final del experimento) en el ensayo de la Figura 24A. ** P lt; 0,01 (mediante ensayo t de Student).
La Figura 25 muestra la actividad antitumoral de un clon T6-16 en modelos de tratamiento de xenoinjerto usando 15 células SW480.
La Figura 25A muestra el transcurso del tiempo de la formación del tumor en un grupo de control (IgG de ratón ●) y en un grupo de administración de T6-16 (○) (un valor medio ± desviación estándar). La flecha indica un periodo de administración de anticuerpo. * P lt; 0,05 (mediante ensayo t de Student).
La Figura 25B muestra el peso del tumor representado de cada ratón en el momento del 42º día (Día 42) (el día 20 final del experimento) en el ensayo de la Figura 25A. * P lt; 0,05 (mediante ensayo t de Student).
La Figura 26 muestra la actividad antitumoral dependiente de la dosis de un clon K5-70 en modelos de tratamiento de xenoinjerto usando células SW480.
La Figura 26A muestra el transcurso del tiempo de la formación del tumor en un grupo de control (IgG de ratón ●) y en un grupo de administración de K5-70 (○: 1 mg/kg, Δ: 5 mg/kg, □: 10 mg/kg) (un valor medio ± desviación 25 estándar). La flecha indica un periodo de administración de anticuerpo. * P lt; 0,05 (mediante ensayo t de Student).
La Figura 26B muestra el peso del tumor representado de cada ratón en el momento del 42º día (Día 42) (el día final del experimento) en el ensayo de la Figura 26A. * P lt; 0,05 (mediante ensayo t de Student).
La Figura 27 muestra la actividad antitumoral de un clon K5-70 en modelos de tratamiento de xenoinjerto usando 30 células SW480.
La Figura 27A muestra la actividad antitumoral de un anticuerpo K5-70 a intervalos de administración de una vez a la semana. Se muestra el transcurso del tiempo de la formación del tumor en un grupo de control (●: IgG de ratón) y en un grupo de administración de K5-70 (○: 10 mg/kg) (un valor medio ± desviación estándar). Las puntas de flecha (Días 10, 17, 24, 31, and 38) indican administración de un anticuerpo K5-70. * P lt; 0,05 35 mediante ensayo t de Student.
La Figura 27B muestra el transcurso del tiempo de la formación del tumor mediante administración de un anticuerpo K5-70 a intervalos de administración de una vez cada diez días (○: q10d) o una vez cada dos semanas (Δ: q14d). El círculo cerrado (●) indica un grupo de control (IgG de Ratón, 10 mg/kg) (un valor medio ± desviación estándar). Las puntas de flecha rellenas (▼: Días 9, 19, y 29) y las puntas de flecha no 40 rellenas (: Días 9, 23, y 37) indican administración de un anticuerpo K5-70. * P lt; 0,05, ** P lt; 0,01 mediante ensayo t de Student.
La Figura 28 muestra la actividad antitumoral dependiente de la dosis de un clon T6-16 en modelos de tratamiento de xenoinjerto usando células SW480.
La Figura 28A muestra el transcurso del tiempo de la formación del tumor en un grupo de control (●: IgG de 45 ratón) y se muestra en un grupo de administración de T6-16 (○: 1 mg/kg, Δ: 5 mg/kg, □: 10 mg/kg) (un valor medio ± desviación estándar). La flecha indica un periodo de administración de anticuerpo. **P lt; 0,01 (mediante ensayo t de Student).
La Figura 28B muestra el peso del tumor representado de cada ratón en el momento del 43er día (Día 43) (el día final del experimento) en el ensayo de la Figura 28A. ** P lt; 0,01 (mediante ensayo t de Student). 50
La Figura 29 muestra la actividad antitumoral de un clon T6-16 en modelos de tratamiento de xenoinjerto usando células SW480. El transcurso del tiempo de la formación del tumor en un grupo de control (●: IgG de ratón, 10 mg/kg) y se muestra en un grupo de administración de T6-16 (10 mg/kg) (○: q7d, Δ: q10d) (un valor medio ± desviación estándar). Las puntas de flecha (Días 10, 17, 24, 31, y 38) y las flechas (Días 10, 20, 30, y 40) indican la administración de un anticuerpo T6-16. La administración se realizó una vez cada tres días con 55 respecto al grupo de control. * P lt; 0,05, ** P lt; 0,01 mediante ensayo t de Student.
La Figura 30 muestra la actividad antitumoral de un clon K5-70 en modelos de prevención de xenoinjerto usando células DU-145 de próstata humana.
La Figura 30A muestra el transcurso del tiempo de la formación del tumor en un grupo de control (●: IgG de ratón) y en un grupo de administración de K5-70 (○) (un valor medio ± desviación estándar). La flecha indica un 60 periodo de administración de anticuerpo. * P lt; 0,05 (mediante ensayo t de Student).
La Figura 30B muestra el peso del tumor representado de cada ratón en el momento del 40º día (Día 40) (el día final del experimento) en el ensayo de la Figura 30A. * P lt; 0,05 (mediante ensayo t de Student).
La Figura 31 muestra la actividad inhibitoria de metástasis de un clon K5-70 en modelos de metástasis de hígado usando células PK-59. 65
Las Figuras 31A y 31B muestran la imagen de hígado extirpado de un grupo de control (IgG de ratón) (A) y un grupo de administración de K5-70 (B), que se tomaron 6 semanas después del trasplante de células. Las flechas indican focos de metástasis de hígado.
La Figura 32 muestra la actividad antitumoral de K5-70 en modelos de xenoinjerto usando células SW480, que sen modelos de cáncer recurrente después de administración de clorhidrato de irinotecán. Esta figura muestra el transcurso del tiempo de la formación del tumor en un grupo no tratado (♦), en un grupo de administración de 5 clorhidrato de irinotecán (40 mg/kg) + K5-70 (○: 10 mg/kg), y en un grupo de administración de clorhidrato de irinotecán (40 mg/kg) + IgG de ratón (●: 10 mg/kg) (un valor medio ± desviación estándar). Las puntas de flecha (Días 11, 14, y 17) indican administración de clorhidrato de irinotecán. El anticuerpo K-70 o la IgG de ratón se administraron una vez cada tres días desde el Día 20. La flecha indica un periodo de administración de anticuerpo. *P lt; 0,05, **P lt; 0,01 mediante ensayo t de Student. 10
La Figura 33 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc de una región variable de cadena H (VH) del clon K5-70 (SEQ ID NO: 34) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 35). En letra cursiva se muestra un péptido señal. La glutamina (Q) con doble subrayado indica el resto de aminoácido N-terminal de un péptido maduro. Las secuencias de CDR (subrayadas; IYWIN, NIYPSDSYTNYNQKFKD, y TSMADY) se determinaron de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Quinta 15 edición, Publicación del NIH N.º 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Las secuencias de aminoácidos de CDR 1 a 3 de la VH del clon K5-70 se muestran en las SEQ ID NOS: 36 a 38, respectivamente.
La Figura 34 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc de una región variable de cadena L (VL) del clon K5-70 (SEQ ID NO: 39) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 40). En letra cursiva se muestra un 20 péptido señal. El ácido aspártico (D) con doble subrayado indica el resto de aminoácido N-terminal de un péptido maduro. Las secuencias de CDR (subrayadas; RASQSIGTSIH, YASESIS, y QQSNSWPFT) se determinaron de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Quinta edición, Publicación del NIH N.º 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Las secuencias de aminoácidos de CDR 1 a 3 de la VL del clon K5-70 se muestran en las SEQ ID NOS: 41 a 43, respectivamente. 25
La Figura 35 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc de una región variable de cadena H (VH) del clon K5-107 (SEQ ID NO: 44) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 45). En letra cursiva se muestra un péptido señal. La glutamina (Q) con doble subrayado indica el resto de aminoácido N-terminal de un péptido maduro. Las secuencias de CDR (subrayadas; SYWMH, NIYPGGGYTNYDEKFKS, y SSYFDY) se determinaron de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Quinta 30 edición, Publicación del NIH N.º 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Las secuencias de aminoácidos de CDR 1 a 3 de la VH del clon K5-107 se muestran en las SEQ ID NOS: 46 a 48, respectivamente.
La Figura 36 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc de una región variable de cadena L (VL) del clon K5-107 (SEQ ID NO: 49) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 50). En letra cursiva se muestra un 35 péptido señal. El ácido aspártico (D) con doble subrayado indica el resto de aminoácido N-terminal de un péptido maduro. Las secuencias de CDR (subrayadas; RASQNIGTSIH, YASESIS, y QQSNSWPFT) se determinaron de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Quinta edición, Publicación del NIH N.º 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Las secuencias de aminoácidos de CDR 1 a 3 de la VL del clon K5-107 se muestran en las SEQ ID NOS: 51 a 53, respectivamente. 40
La Figura 37 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc de una región variable de cadena H (VH) del clon K5-116-2-1 (SEQ ID NO: 54) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 55). En letra cursiva se muestra un péptido señal. La glutamina (Q) con doble subrayado indica el resto de aminoácido N-terminal de un péptido maduro. Las secuencias de CDR (subrayadas; SYWIT, NIYPSDSYTNYNQKFRD, y LFDY)se determinaron de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, 45 Quinta edición, Publicación del NIH N.º 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Las secuencias de aminoácidos de CDR 1 a 3 de la VH del clon K5-116-2-1 se muestran en las SEQ ID NOS: 56 a 58, respectivamente.
La Figura 38 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc de una región variable de cadena L (VL) del clon K5-116-2-1 (SEQ ID NO: 59) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 60). En letra cursiva se muestra 50 un péptido señal. El ácido aspártico (D) con doble subrayado indica el resto de aminoácido N-terminal de un péptido maduro. Las secuencias de CDR (subrayadas; RASQSIGTSIH, YASESIS, y QQSNSWPFT) se determinaron de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Quinta edición, Publicación del NIH N.º 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Las secuencias de aminoácidos de CDR 1 a 3 de la VL del clon K5-116-2-1 se muestran en las SEQ ID NOS: 61 a 55 63, respectivamente.
La Figura 39 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc de una región variable de cadena H (VH) del clon T6-16 (SEQ ID NO: 64) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 65). En letra cursiva se muestra un péptido señal. El ácido glutámico (E) con doble subrayado indica el resto de aminoácido N-terminal de un péptido maduro. Las secuencias de CDR (subrayadas; DYNMH, YIYPYNGGTGYNQRFKS, y 60 EDYGSSPSYAMDY) se determinaron de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Quinta edición, Publicación del NIH N.º 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Las secuencias de aminoácidos de CDR 1 a 3 de la VH del clon T6-16 se muestran en las SEQ ID NOS: 66 a 68, respectivamente.
La Figura 40 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc de una región variable de cadena L (VL) del clon T6-65 16 (SEQ ID NO: 69) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 70). En letra cursiva se muestra un péptido señal. El ácido aspártico (D) con doble subrayado indica el resto de aminoácido N-terminal de un péptido maduro. Las secuencias de CDR (subrayadas; RSSQSLVHGNGNTYLH, KhSNRFS, y SQTTHVPT) se determinaron de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Quinta edición, Publicación del NIH N.º 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Las secuencias de aminoácidos de CDR 1 a 3 de la VL del clon T6-16 se muestran en las SEQ ID NOS: 71 a 73, 5 respectivamente.
Modo para realizar la invención
En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá con detalle. Las siguientes 10 descripciones no pretenden limitar el alcance de la presente invención. Además de los siguientes ejemplos, la presente invención se puede modificar y se puede realizar, si fuera apropiado, dentro del intervalo que no altere la intervención de la presente invención
1. Resumen de la presente invención 15
Como se ha mencionado anteriormente, la TROP-2 humana (hTROP-2) es una sola proteína transmembrana, de membrana de tipo 1 que tiene una longitud completa de 323 restos de aminoácidos. Se ha sabido que un gen de hTROP-2 y un producto genético de la misma se expresan en diversos tipos de células cancerosas.
20
Como se ha mencionado anteriormente, se ha deseado desarrollar un anticuerpo anti-hTROP-2 humano (un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 humano) o similares con una actividad antitumoral in vivo elevada. Bajo tales circunstancias, el presente inventor realizó una identificación sistemática a través de un número de clones extremadamente grande, y como resultado, el inventor tuvo éxito en la obtención de un clon que tenía una actividad antitumoral in vivo elevada. de forma específica, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal, que 25 reconoce de forma específica la región extracelular de hTROP-2 in vivo, y en particular, un anticuerpo monoclonal que presenta una afinidad elevada en un orden de picomoles (pM). El anticuerpo de la presente invención es extremadamente útil porque es un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2, que presenta una actividad inhibitoria del crecimiento tumoral significativa a una dosis más baja que la del anticuerpo anti-hTROP-2 existente (por ejemplo, a una dosificación de 1/20) cuando se administra de manera individual como un anticuerpo desnudo, y que también 30 presentaba una actividad inhibitoria del crecimiento tumoral significativa en modelos de tratamiento de ratón portador de tumor, en el que se usa en múltiples tipos de células de cáncer humano.
2. Producción del anticuerpo anti-hTROP-2
35
(1) Preparación del antígeno
La información con respecto a la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de hTROP-2 se desvela con el quot;Número de registro NP_002344quot; en la página web de, por ejemplo, NCBI (GenBank) (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ). La información con respecto a una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1) que codifica la secuencia de aminoácidos 40 de hTROP-2 se desvela con el quot;Número de registro NM_002353quot; en la misma página web como se ha descrito anteriormente.
Como un antígeno, se puede usar un polipéptido o péptido (que también se denomina simplemente péptido) que comprende al menos una porción (toda o una parte) de la secuencia de aminoácidos de hTROP-2, y 45 preferentemente, se puede usar un péptido que comprende al menos una porción (toda o una parte) de la secuencia de aminoácidos de la región extracelular de hTROP-2. La región extracelular (incluyendo un péptido señal) de hTROP-2 indica una región que comprende los aminoácidos en las posiciones 1 a 274 de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 2 (el péptido señal: los aminoácidos en las posiciones 1 a 26). En el presente documento, con respecto a un péptido usado como un antígeno, la descripción quot;al menos una porción de la 50 secuencia de aminoácidosquot; mencionada anteriormente no está limitada en particular en términos de longitud. Por ejemplo, son preferentes una región que comprende los aminoácidos en las posiciones 1 a 145 de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 2, una región que comprende los aminoácidos en las posiciones 146 a 274 de la misma secuencia de aminoácidos como se ha descrito anteriormente, y similares.
55
Un péptido usado como un antígeno se puede producir ya sea mediante síntesis química, o mediante síntesis de acuerdo con un método de ingeniería genética usando Escherichia coli o similares. se puede aplicar un método bien conocido por las personas con experiencia en la materia.
Cuando un péptido se produce mediante síntesis química, éste se puede sintetizar con un método de síntesis de 60 péptidos bien conocido. Además, a la síntesis de péptidos se puede aplicar a un método de síntesis en fase sólida o un método de síntesis en fase líquida. También se puede usar un sintetizador de péptidos disponible en el mercado (por ejemplo, PSSM-8 fabricado por Shimadzu Corporation, etc.).
Cuando un péptido se sintetiza mediante un método de ingeniería genética, en primer lugar, se diseña y se sintetiza 65 el ADN que codifica el péptido. El diseño y la síntesis de un ADN de este tipo se puede realizar de acuerdo con un método de PCR, usando un vector que comprende un gen de hTROP-2 de longitud completa, o similares como un molde, y también usando cebadores diseñados para ser capaces de sintetizar una región de ADN deseada. A partir de ese momento, el ADN se une a un vector adecuado para obtener un vector recombinante usado para expresión de proteínas, y a continuación este vector recombinante se introduce en un hospedador de modo que un gen de interés se puede expresar en el mismo, obteniendo de ese modo un transformante (Sambrook J. et al., Molecular 5 Cloning, A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001).
Como un vector, se usa un fago o un plásmido capaz de replicarse de forma autónoma en un microorganismo hospedador. Además, también se puede usar un virus de animal o un virus de insecto. Para producir un vector recombinante, un ADN purificado se puede escindir con enzimas de restricción adecuadas, y la porción de ADN 10 escindida de ese modo se puede insertar a continuación en el sitio de la enzima de restricción o similares de un ADN vector adecuado, con el fin de unirla al vector. El tipo de hospedador usado en la transformación no está limitado en particular, siempre y cuando sea capaz de expresar un gen de interés. Los ejemplos de un hospedador de este tipo incluyen bacterias (Escherichia coli, Bacillus subtilis, etc.), levaduras, células de animal (células COS, células CHO, etc.), células de insecto, e insectos. Como un hospedador de este tipo también se puede usar un mamífero tal como 15 una cabra. Un método para introducir un vector recombinante en un hospedador se conoce públicamente.
El transformante descrito anteriormente se cultiva, y a continuación un péptido usado como antígenos se recoge del cultivo. El término quot;cultivoquot; se usa en el presente documento para hacer referencia tanto a (a) un sobrenadante de cultivo, como a (b) células cultivadas, una masa celular cultivada o un producto disgregado de las mismas. 20
Después de finalizar el cultivo, cuando un péptido de interés se produce en una masa celular o en células, el péptido se extrae disgregando la masa celular o las células. Por otro lado, cuando un péptido de interés se produce fuera de una masa celular o fuera de las células, se usa directamente una solución de cultivo, o la masa celular o las células se retiran de la solución de cultivo mediante centrifugación o similares. A partir de ese momento, el péptido de 25 interés se puede aislar y purificar con un solo uso de métodos bioquímicos usados comúnmente en el aislamiento y purificación de péptidos, tales como precipitación con sulfato de amonio, filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía por afinidad, o mediante combinación de manera apropiada de los métodos bioquímicos mencionados anteriormente.
30
En la presente invención, un péptido usado como un antígeno también se puede obtener mediante traducción in vitro usando un sistema de síntesis sin células. En este caso, se pueden aplicar los métodos, es decir, un método que usa ARN como un molde y un método que usa ADN como un molde (transcripción/traducción). Como tal, se puede usar un sistema de síntesis sin células, un sistema disponible en el mercado, tal como el sistema Expressway™ (Invitrogen), PURESYSTEM (marca comercial registrada; Post Genome Institute) o el sistema TNT (Marca comercial 35 registrada; Promega).
El péptido obtenido de este modo se puede unir a una proteína vehículo adecuada tal como albúmina de suero bovino (BSA), hemocianina de lapa californiana (KLH), tiroglobulina humana o γ-globulina de pollo.
40
Además, el antígeno puede ser un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que comprende una deleción, sustitución o adición de uno o más aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de hTROP-2 (SEQ ID NO: 2) o una secuencia parcial de la misma como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, se puede usar un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos, en la que uno o más (preferentemente uno o varios (por ejemplo, 1 a 10, y más preferentemente 1 a 5)) aminoácidos han sufrido deleción, o uno o más (preferentemente uno 45 o varios (por ejemplo, 1 a 10, y que más preferentemente 1 a 5)) aminoácidos están sustituidos con otros aminoácidos, o uno o más (preferentemente uno o varios (por ejemplo, 1 a 10, y más preferentemente 1 a 5)) otros aminoácidos se añaden, con respecto a la secuencia de aminoácidos de hTROP-2 o una secuencia parcial de la misma.
50
En la presente invención, un gen a introducir en una célula o similar es un gen que codifica una proteína hTROP-2 o un fragmento parcial de la misma, o una proteína mutante de la misma o un fragmento de la misma. Como un gen de este tipo, se puede usar, por ejemplo, un gen que tenga la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 1 o una secuencia parcial de la misma.
55
Además, como un gen a introducir en una célula o similar, también se puede usar una secuencia de nucleótidos que hibride en condiciones astringentes con una secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 1 y que codifica una proteína que tiene actividad de hTROP-2, o una secuencia parcial de la misma.
60
La descripción quot;condiciones astringentesquot; se usa en el presente documento para hacer referencia a condiciones de lavado después de finalizar la hibridación. Como condiciones astringentes de este tipo, una concentración de sal (sodio) en tampón es de 10 a 500 mM y una temperatura es de 42 ºC a 72 ºC, y preferentemente, la condición salina mencionada anteriormente es de 50 a 300 mM y una temperatura es de 55 ºC a 68 ºC.
65
En un gen se puede introducir una mutación de acuerdo con un método conocido tal como un método de Kunlcel o un método de dúplex con huecos, usando, por ejemplo, un kit de introducción de mutación que utiliza mutagénesis dirigida al sitio, tal como el Sistema de Mutagénesis Dirigida al Sitio Gene-Tailor™ (fabricado por Invitrogen) o el Sistema de Mutagénesis Dirigida al Sitio TaKaRa (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc.; fabricado por Takara Bio Inc.).
5
(2) Producción del anticuerpo policlonal
El antígeno preparado se administra a un mamífero para inmunización. El tipo de mamífero de este tipo no está limitado en particular. Por ejemplo, se puede usar una rata, un ratón y un conejo, y entre ellos, es preferente un ratón. 10
La dosificación del antígeno por animal se puede determinar, si fuera apropiado, dependiendo de la presencia o ausencia de un adyuvante. Los ejemplos de un adyuvante de este tipo incluyen un adyuvante completo de Freund (FCA), un adyuvante incompleto de Freund (FIA) y un adyuvante de hidróxido de aluminio. La inmunización se puede realizar principalmente mediante inyección del antígeno en la vena, almohadilla de la pata, hipodermis o 15 cavidad abdominal de un animal. Además, el intervalo de inmunización está limitado en particular, y la inmunización se realiza a intervalos de varios días a varias semanas, preferentemente a intervalos de 1 semana, de 1 a 10 veces, y preferentemente 2 o 3 veces. De tres a siete días después del día de la inmunización final, un título de anticuerpo se mide mediante inmunoensayo enzimático (ELISA o EIA), radioinmunoensayo (RIA) u otros métodos. En la fecha en la que se obtiene un título de anticuerpo deseado, la sangre se puede extraer para obtener antisuero. En el 20 método descrito anteriormente para recoger un anticuerpo, si fuera necesario purificar el anticuerpo, el anticuerpo se puede purificar seleccionando un método adecuado a partir de los métodos conocidos tales como precipitación con sulfato de amonio precipitation, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel y cromatografía por afinidad, o combinando los métodos mencionados anteriormente, si fuera apropiado. A partir de ese momento, la reactividad de un anticuerpo policlonal en el antisuero se mide mediante el método de ELISA o 25 similar.
(3) Producción del anticuerpo monoclonal
(3-1) Recogida de células productoras de anticuerpo 30
El anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención no está limitado, pero es preferentemente un anticuerpo monoclonal.
El antígeno preparado se administra a un mamífero, tal como una rata, un ratón o un conejo, para inmunización. La 35 dosificación del antígeno por animal se puede determinar, si fuera apropiado, dependiendo de la presencia o ausencia de un adyuvante. En el presente documento se pueden usar los mismos adyuvantes como se ha descrito anteriormente. Además, en el presente documento se pueden aplicar los mismos métodos de inmunización como se ha descrito anteriormente. De uno a sesenta días, y preferentemente, de uno a catorce días después del día de la inmunización final, se recogen las células productoras de anticuerpo. Los ejemplos de células productoras de 40 anticuerpo de este tipo incluyen células esplénicas, células de ganglios linfáticos y células de sangre periférica. Entre estas, son preferentes las células de ganglios linfáticos y células esplénicas.
(3-2) Fusión celular
45
Para obtener hibridomas (una línea celular productora de anticuerpo), se realiza la fusión celular de células productoras de anticuerpo con células de mieloma. Como células de mieloma a fusionar con células productoras de anticuerpo, se pueden usar células establecidas comúnmente disponibles de animales tales como ratones. La línea celular usada en el presente documento es preferentemente una línea celular, que tiene selectividad de fármaco, que no puede sobrevivir en un estado sin fusionar en un medio selectivo de HAT (que contiene hipoxantina, 50 aminopterina y timidina), y que puede sobrevivir solamente en un estado fusionado con células productoras de anticuerpo.
Los ejemplos de células de mieloma incluyen líneas de células de mieloma de ratón tales como P3-X63-Ag8.653, P3-X63-Ag8 (X63), P3-X63-Ag8.U1 (P3U1), P3/NS 1/1-Ag4-1 (NS1) y Sp2/0-Ag14 (Sp2/0). Las células de mieloma 55 se pueden seleccionar, si fuera apropiado, a la vez que se tiene en consideración la compatibilidad con células productoras de anticuerpo.
Posteriormente, las células de mieloma se fusionan con células productoras de anticuerpo. Para una fusión celular de este tipo, las células productoras de anticuerpo (1 x 106 a 1 x 107 células/ml) se mezclan con células de mieloma 60 (2 x 105 a 2 x 106 células/ml) en un medio para células animales, tal como DMEM o un medio RPMI-1640 que no contiene suero. La proporción celular entre las células productoras de anticuerpo y las células de mieloma (células productoras de anticuerpo : células de mieloma) no está limitada. En general, la proporción celular es preferentemente 1 : 1 a 10 : 1, y más preferentemente 3 : 1. A partir de ese momento, una reacción de fusión se realiza en presencia de un promotor de fusión celular. Como promotor de fusión celular de este tipo, se puede usar 65 polietilenglicol que tiene un peso molecular promedio de 1.000 a 6.000 Dalton (D) o similar. Además, también es posible fusionar células productoras de anticuerpo con células de mieloma, usando un aparato de fusión celular disponible en el mercado que utiliza estimulación eléctrica (por ejemplo, electroporación).
(3-3) Selección y clonación de hibridomas
5
Los hibridomas de interés se seleccionan entre las células después del tratamiento de fusión celular. Como un método para seleccionar hibridomas, la suspensión celular se diluye de forma apropiada, por ejemplo, con un medio RPMI-1640 que contiene suero bovino fetal, y la solución diluida se dispersa a continuación en una placa de microtitulación. A partir de ese momento, a cada pocillo se le añade un medio selectivo. Aunque el medio selectivo se intercambia de forma apropiada por uno recién preparado, se realiza el cultivo. Como resultado, 10 aproximadamente 14 días después del inicio del cultivo en el medio selectivo, las células que crecen a partir del medio selectivo se pueden obtener como hibridomas.
Posteriormente, se realiza identificación sistemática para examinar si un anticuerpo que reacciona o no con hTROP-2 está presente en un sobrenadante de cultivo de los hibridomas en crecimiento. La identificación sistemática de 15 hibridomas se puede realizar de acuerdo con un método habitual, y por lo tanto, el método de identificación sistemática no está limitado en particular. Por ejemplo, se recoge una alícuota del sobrenadante de cultivo de los hibridomas en crecimiento contenidos en el pocillo, y de identificación sistemática se realiza a continuación mediante ELISA, EIA, RIA o similares.
20
La clonación de las células fusionadas puede realizar mediante un método de dilución limitante o similar. Un anticuerpo que muestra una reactividad elevada con hTROP-2 se determina mediante citometría de flujo o similar, y a continuación se selecciona un hibridoma que produce este anticuerpo. El hibridoma seleccionados se establece como un clon.
25
(3-4) Recogida del anticuerpo monoclonal
Como un método para cultivar el hibridoma establecido y a continuación recoger un anticuerpo monoclonal A partir del cultivo obtenido, se puede adoptar un método de cultivo celular común, un método de formación de ascitis o similar. El término quot;cultivoquot; se usa en el presente documento para hacer referencia a que se permite que los 30 hibridomas crezcan en una placa de cultivo o un frasco de cultivo, o que se permite que los hibridomas crezcan en la cavidad abdominal de un animal, como se describe a continuación.
En el caso del método de cultivo celular, los hibridomas se cultivan en un medio para células animales, tal como un medio RPMI-1640 que contiene suero bovino fetal al 10 %, un medio MEM o un medio sin suero, en condiciones de 35 cultivo comunes (por ejemplo, 37 ºC, concentración de CO2 al 5 %) de 7 a 14 días, y a partir de ese momento, un anticuerpo se puede obtener a partir del sobrenadante del cultivo.
En el caso del método de formación de ascitis, se administran aproximadamente 1 x 107 hibridomas en la cavidad abdominal de un animal de la misma especie que el mamífero a partir de que se obtienen células de mieloma, de 40 modo que se permite que proliferen grandes cantidades de hibridomas. A partir de ese momento, de 2 a 3 semanas más tarde, la ascitis preferentemente se recoge.
Los métodos de recogida de anticuerpo descritos anteriormente, si fuera necesario purificar el anticuerpo, el anticuerpo se puede purificar seleccionando de forma apropiada un método adecuado a partir de métodos conocidos 45 tales como precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico, filtración en gel y cromatografía por afinidad, o combinando los métodos mencionados anteriormente.
(3-5) Selección del clon que tiene actividad antitumoral
50
El anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención es un anticuerpo que tiene actividad antitumoral in vivo.
La expresión quot;actividad antitumoralquot; se usa en el presente documento para hacer referencia a actividad de eliminación de células tumorales (células cancerosas) o actividad de inhibición de crecimiento tumoral. Los ejemplos precedentes de una actividad tumoral de este tipo incluyen actividad de inhibición del crecimiento de células 55 cancerosas y actividad de inhibición de la angiogénesis tumoral. El tipo de tumor humano (células tumorales), sobre las que el anticuerpo de la presente invención es capaz de presentar actividad antitumoral, incluye diversos tipos de tumores humanos conocidos, en los que se ha confirmado la expresión de hTROP-2. El tipo de un tumor humano de este tipo no está limitado en particular. Por ejemplo, son preferentes uno o dos o más de cáncer pancreático humano, cáncer de próstata humano, cáncer de colon humano y cáncer de mama humano, y es más preferente el 60 cáncer pancreático humano.
Además, el tumor descrito anteriormente puede ser un cáncer recurrente o un cáncer metastásico. El anticuerpo de la presente invención también es capaz de presentar una actividad antitumoral excelente en estos tipos de tumores.
65
La presencia de actividad antitumoral in vivo se puede confirmar, por ejemplo, usando un ratón portador de tumor (un modelo de xenoinjerto de ratón), en la hipodermis de la que se han trasplantado las células tumorales deseadas, y a continuación administrando al ratón el anticuerpo como se ha obtenido anteriormente. En este caso, el anticuerpo se puede administrar inmediatamente después del trasplante de células tumorales (Modelos de prevención). Como alternativa, se puede administrar después de confirmar que el tumor trasplantado ha alcanzado un volumen determinado previamente (Modelos de tratamiento). El método de administración está limitado. Por 5 ejemplo, el anticuerpo se puede administrar una vez cada tres días, cada semana, cada diez días, o cada dos semanas, o mediante una sola administración (solo una vez), a una dosificación de 5 a 20 mg/kg de peso corporal, mediante administración intraperitoneal o similar. En el caso de modelos de prevención, la presencia o ausencia de actividad antitumoral y el nivel de la misma se pueden evaluar basándose en la frecuencia de la formación del tumor y el volumen tumoral. En el caso de modelos de tratamiento, la presencia o ausencia de actividad antitumoral y el 10 nivel de la misma se pueden evaluar basándose en el volumen tumoral.
Un ejemplo del anticuerpo anti-hTROP-2 que tiene actividad antitumoral in vivo es un anticuerpo en el que las secuencias de aminoácidos de CDR 1 a 3 de la región V de la cadena H de la misma se muestran en las SEQ ID NOS: 36 a 38, respectivamente, y/o las secuencias de aminoácidos de CDR 1 a 3 de la región V de la cadena L de 15 la misma se muestran en las SEQ ID NOS: 41 a 43, respectivamente. En la presente invención, un ejemplo preferente de la región V de la cadena H es una región V de la cadena H que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 35. Un ejemplo preferente de la región V de la cadena L del anticuerpo anti-hTROP de la presente invención es una región V de la cadena L que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 40. 20
Otro ejemplo del anticuerpo anti-hTROP-2 es un anticuerpo en el que las secuencias de aminoácidos de CDR 1 a 3 de la región V de la cadena H de la misma se muestran en las SEQ ID NOS: 46 a 48, respectivamente, y/o las secuencias de aminoácidos de CDR 1 a 3 de la región V de la cadena L de la misma se muestran en las SEQ ID NOS: 51 a 53, respectivamente. Un ejemplo de la región V de la cadena H es una región V de la cadena H que 25 consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 45. Un ejemplo de la región V de la cadena L es una región V de la cadena L que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 50.
De forma análoga, un ejemplo adicional del anticuerpo anti-hTROP-2 es un anticuerpo en el que las secuencias de aminoácidos de CDR 1 a 3 de la región V de la cadena H de la misma se muestran en las SEQ ID NOS: 56 a 58, 30 respectivamente, y/o las secuencias de aminoácidos de CDR 1 a 3 de la región V de la cadena L de la misma se muestran en las SEQ ID NOS: 61 a 63, respectivamente. Un ejemplo de la región V de la cadena H es una región V de la cadena H que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 55. Un ejemplo de la región V de la cadena L es una región V de la cadena L que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 60. 35
De forma análoga, un ejemplo adicional del anticuerpo anti-hTROP-2 es un anticuerpo en el que las secuencias de aminoácidos de CDR 1 a 3 de la región V de la cadena H de la misma se muestran en las SEQ ID NOS: 66 a 68, respectivamente, y/o las secuencias de aminoácidos de CDR 1 a 3 de la región V de la cadena L de la misma se muestran en las SEQ ID NOS: 71 a 73, respectivamente. Un ejemplo preferente de la región V de la cadena H del 40 anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención es una región V de la cadena H que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 65. Un ejemplo preferente de la región V de la cadena L del anticuerpo anti-hTROP de la presente invención es una región V de la cadena L que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 70.
45
En la presente invención, de forma más específica, los ejemplos preferentes de un anticuerpo anti-hTROP-2 que tiene actividad antitumoral in vivo incluyen: un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 (nombre del clon: K5-70) producido por un hibridoma con Número de registro FERM BP-11251; y un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 (nombre del clon: T6-16) producido por un hibridoma con Número de registro FERM BP-11346. También se desvelan: un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 (nombre del clon: K5-107) producido por un hibridoma con 50 Número de registro FERM BP-11252; un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 (nombre del clon: K5-116-2-1) producido por un hibridoma con Número de registro FERM BP-11253; y un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 (nombre del clon: T5-86) producido por un hibridoma con Número de registro FERM BP-11254.
En el presente documento, el hibridoma con Número de registro FERM BP-11251 se denominó quot;Hibridoma de 55 Ratón-Ratón K5-70quot; y se depositó el 12 de mayo de 2010; el hibridoma con Número de registro FERM BP-11252 se denominó quot;Hibridoma de Ratón-Ratón K5-107quot; y se depositó el 12 de mayo de 2010; el hibridoma con Número de registro FERM BP-11253 se denominó quot;Hibridoma de Ratón-Ratón K5-116-2-1quot; y se depositó el 12 de mayo de 2010; el hibridoma con Número de registro FERM BP-11346 se denominó quot;Hibridoma de Ratón-Ratón T6-16quot; y se depositó el 1 de marzo de 2011; y el hibridoma con Número de registro FERM BP-11254 se denominó quot;Hibridoma de 60 Ratón-Ratón T5-86quot; y se depositó el 12 de mayo de 2010. Todos estos hibridoma se depositaron en el International Patent Organism Depositary (IPOD), el National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, una Institución Administrativa Independente relacionada con el Ministerio de Economía, Comercio e Industria (el AIST, Tsukuba Central 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba, Ibaraki, Japón, código postal: 305-8566).
65
Además adicionalmente, otro ejemplo preferente del anticuerpo anti-hTROP-2 es un anticuerpo anti-hTROP-2 que se une a un sitio (por ejemplo, un epítopo), al que se une (reconoce) un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el N.º de registro FERM BP-11251, FERM BP-11252, FERM BP-11253, FERM BP-11346 o FERM BP-11254.
Los ejemplos preferentes de un epítopo de este tipo se proporcionarán a continuación en (3-6). 5
(3-6) Epítopo del anticuerpo anti-hTROP-2
El tipo de un epítopo (un determinante antigénico) del anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención no está limitado, siempre y cuando tenga al menos una porción de hTROP-2 como un antígeno. Por ejemplo, un epítopo de 10 este tipo tiene preferentemente al menos una porción de una región formada retirando una región que consiste en los aminoácidos en las posiciones 252 a 260 de la secuencia de aminoácidos de hTROP-2 mostrada en la SEQ ID NO: 2, más preferentemente al menos una porción de una región que consiste en los aminoácidos en las posiciones 1 a 69 o al menos una porción de una región que consiste en los aminoácidos en las posiciones 100 a 274 (excepto para una región que consiste en aminoácidos en la posición 252 a 260), y adicionalmente preferentemente al menos 15 una porción de una región que consiste en los aminoácidos en las posiciones 27 a 69 o una región que consiste en los aminoácidos en las posiciones 109 a 206. Los ejemplos particularmente preferentes del epítopo descrito anteriormente incluyen una región que consiste en los aminoácidos en las posiciones 43 a 65, una región que consiste en los aminoácidos en las posiciones 152 a 165, una región que consiste en los aminoácidos en las posiciones 171 a 183, una región que consiste en los aminoácidos en las posiciones 109 a 120, una región que 20 consiste en los aminoácidos en las posiciones 193 a 206, una región que consiste en los aminoácidos en las posiciones 43 a 56, y una porción que comprende una región de este tipo, en la secuencia de aminoácidos de hTROP-2 mostrada en la SEQ ID NO: 2. Los ejemplos particularmente preferentes adicionales incluyen una región que consiste en los aminoácidos en las posiciones 43 a 65, una región que consiste en los aminoácidos en las posiciones 152 a 165, una región que consiste en los aminoácidos en las posiciones 171 a 183, una región que 25 consiste en los aminoácidos en las posiciones 109 a 120, y una porción que comprende una región de este tipo. Un anticuerpo anti-hTROP-2, que reconoce las regiones descritas anteriormente (se une a las regiones o porciones descritas anteriormente que comprenden regiones de ese tipo), tiene una actividad de internalización elevada en células tumorales, por ejemplo, y por lo tanto es extremadamente útil como un inmunoconjugado como se describe a continuación. 30
(3-7) Características del anticuerpo anti-hTROP-2
Como se ha descrito anteriormente, el anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención es un anticuerpo que tiene una actividad antitumoral in vivo elevada a una dosis baja. De forma específica, es preferente que el presente 35 anticuerpo anti-hTROP-2 presente una actividad inhibitoria del crecimiento tumoral de un 50 % o superior (preferentemente un 80 % o superior, más preferentemente un 90 % o superior, además preferentemente un 95 % o superior, y de forma particularmente preferente casi un 100 % (por ejemplo, un 98 % o superior, o un 99 % o superior)) a una dosis (como un anticuerpo desnudo) de 20 mg/kg de peso corporal o inferior (preferentemente 10 mg/kg de peso corporal o inferior, más preferentemente 5 mg/kg de peso corporal o inferior, y además 40 preferentemente 1 mg/kg de peso corporal o inferior) con respecto a un modelo animal portador de tumor.
En el presente documento, la actividad inhibitoria del crecimiento tumoral (%) se puede calcular, por ejemplo, con la siguiente fórmula:
45
Además, el anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención tiene preferentemente actividad antitumoral en dos o más tipos de líneas de células tumorales humanas. El tipo de una línea de células tumorales humanas de este tipo no está limitado. Por ejemplo, las líneas de células tumorales humanas de este tipo son al menos dos tipos 50 seleccionados entre el grupo que consiste en diversos tipos de líneas de células de cáncer pancreático humano, líneas de células de cáncer de próstata humano, líneas de células de cáncer de colon humano y líneas de células de cáncer de mama humano. De forma específica, los ejemplos preferentes de las líneas de células tumorales humanas de este tipo incluyen al menos dos tipos seleccionados entre el grupo que consiste en una línea de células de cáncer pancreático humano PK-59, una línea de células BxPC-3 de cáncer pancreático humano , una línea de células de 55 cáncer pancreático humano KP-3L, una línea de células de cáncer pancreático humano KP-2, una línea de células de cáncer pancreático humano PK-1, una línea de células de cáncer pancreático humano PK-45H, una línea de células de cáncer pancreático humano PK-45P, una línea de células de cáncer pancreático humano TCC-PAN2, una línea de células de cáncer pancreático humano SUIT-2, una línea de células de cáncer de colon humano CACO-2, una línea de células de cáncer de colon humano SW480, una línea de células de cáncer de colon humano DLD-1, 60 una línea de células de cáncer de colon humano HCT 116, una línea de células de cáncer de mama humano JIMT-1, una línea de células de cáncer de mama humano HCC1143, una línea de células de cáncer de mama humano MCF-7, una línea de células de cáncer de próstata humano DU145 y una línea de células de cáncer de próstata humano PC-3. De estos, como los dos o más tipos de líneas de células tumorales humanas descritos anteriormente, son más preferentes la línea de células de cáncer pancreático humano PK-59 y la línea de células BxPC-3 de cáncer pancreático humano. 5
Además, el anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención tiene una constante de disociación (valor de Kd) preferentemente de 1,0 x 10-10 M o inferior, más preferentemente 1,0 x 10-11 M o inferior, y además preferentemente 1,0 x 10-12 M o inferior. En el presente documento, la capacidad de unión (afinidad) del anticuerpo se puede medir en forma de una constante de disociación (valor de Kd), una constante de tasa de disociación (Kdis [1/s]) o una 10 constante de tasa de asociación (Kas [1/M.s]), por ejemplo, mediante análisis de Scatchard o sensor de resonancia de plasmones superficiales denominado Biacore. Como aparatos de Biacore de este tipo, se pueden usar Biacore 3000, Biacore 2000, Biacore X, Biacore J y Biacore Q (todos los cuales poros fabricados por Biacore), por ejemplo. Es preferente que el anticuerpo tenga una constante de disociación (valor de Kd) que sea tan pequeño como sea posible porque podría tener una capacidad de unión elevada (afinidad). El valor de Kd se determina basándose en 15 los dos parámetros de Kdis y Kas, y se puede expresar en la fórmula: Kd[M] = Kdis/Kas. Como un método para calcular el valor de Kd, se puede adoptar preferentemente el método que se describe en los Ejemplos como se describe a continuación (de forma específica, Ejemplo 10).
(4) Anticuerpo y fragmento de anticuerpo genéticamente recombinantes 20
(4-1) Anticuerpo genéticamente recombinante
En una realización preferente del anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención, se proporciona un anticuerpo genéticamente recombinante. El tipo de un anticuerpo genéticamente recombinante de este tipo no está limitado. 25 Los ejemplos incluyen un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, y un anticuerpo humano.
Un anticuerpo quimérico (es decir, un anticuerpo quimérico humanizado) es un anticuerpo formado al unir (conjugar) la región variable de un anticuerpo obtenido a partir de ratón a la región constante de un anticuerpo obtenido a partir de ser humano (por favor hágase referencia a Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851-6855, (1984), etc.). Cuando se 30 produce un anticuerpo quimérico de este tipo, era anticuerpo unido de ese modo se puede construir fácilmente mediante una técnica de recombinación genética.
Cuando se produce un anticuerpo humanizado, una región determinante de la complementariedad (CDR) se trasplanta desde la región variable de un anticuerpo de ratón en la región variable de un anticuerpo humano, con el 35 fin de producir una región variable reconstruida, en la que una región marco conservada (FR) se obtiene a partir del ser humano y CDR se obtiene a partir del ratón (lo que se denomina injerto de CDR (trasplante de CDR)). Posteriormente, la región variable humana reconstruida, humanizada de este modo se une a una región constante humana. Un método de este tipo para producir un anticuerpo humanizado se conoce bien en el presente campo técnico (por favor hágase referencia o véase Nature, 321, 522-525 (1986); J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987); Queen 40 C et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033 (1989); Publicación de Patente de JP (Kohyo) N.º 4-502408 A (1992) (documento de Patente Japonesa N.º 2828340; Queen et al.), etc.).
En general, en el caso de un anticuerpo humano (un anticuerpo humano completo), su estructura que comprende una región Hiper Variable que es el sitio de unión al antígeno de una región V, otras partes de la región V, y una 45 región constante es la misma que la estructura del anticuerpo de un ser humano. Sin embargo, un sitio Hiper Variable de este tipo también se puede obtener a partir de otros animales. Una técnica para producir un anticuerpo humano se conoce públicamente, y se ha establecido un método para producir secuencias genéticas que son comunes en seres humanos mediante ingeniería genética. Un anticuerpo humano se puede obtener, por ejemplo, mediante un método que usa un ratón que produce anticuerpo humano que tiene fragmentos de cromosomas 50 humanos que comprenden los genes de la cadena H y de la cadena L del anticuerpo humano (por favor hágase referencia a Tomizuka, K. et al., Nature Genetics, (1977) 16, 133-143; Kuroiwa, Y. et al., Nuc. Acids Res., (1998) 26, 3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects, (1999) 10, 69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. e Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2000) 97, 722-727, etc.), o con un método para obtener un anticuerpo humano obtenido a partir de presentación de fago 55 seleccionado entre una biblioteca de anticuerpos humanos (por favor hágase referencia a Wormstone, I. M. et al., Investigative Oftalmology & Visual Science., (2002) 43 (7), 2301-8; Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics,(2002) 1 (2), 189-203; Siriwardena, D. et al., Opthalmology, (2002) 109 (3), 427-431, etc.).
En el caso del anticuerpo quimérico, el anticuerpo humanizado y el anticuerpo humano mencionados anteriormente, 60 la cadena de azúcar unida a N-glucósido en la región Fc del anticuerpo es preferentemente una cadena de azúcar, en la que la fucosa no se une a N-acetilglucosamina en el extremo terminal reductor de la misma. Un ejemplo específico es un anticuerpo que consiste en moléculas de anticuerpo genéticamente recombinante, que tiene, en la región Fc de las moléculas de anticuerpo, una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa No se une a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo terminal reductor de la cadena de azúcar unida a N-glucósido a 65 través de un enlace. Un anticuerpo de este tipo es capaz de mejorar de manera significativa la actividad de ADCC. Este punto (las características de la cadena de azúcar unida a N-glucósido en la región Fc del anticuerpo) también es preferente para el anticuerpo policlonal y el anticuerpo monoclonal mencionados anteriormente.
(4-2) Fragmento de anticuerpo
5
El fragmento de anticuerpo anti-hTROP-2 (fragmento parcial) de la presente invención está incluido en el anticuerpo de la presente invención. En el presente documento, el fragmento de anticuerpo de la presente invención tiene actividad de unión a hTROP-2 (es decir, es capaz de unirse a hTROP-2) y también tiene actividad antitumoral in vivo, como en el caso del anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención.
10
El fragmento del anticuerpo se refiere a una región de una porción de un anticuerpo policlonal anti-hTROP-2 o anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 (es decir, un fragmento de anticuerpo obtenido a partir del anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención). Los anticuerpos de un fragmento de anticuerpo de este tipo incluyen péptidos que comprenden, como al menos una porción del mismo, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv (fragmento variable de anticuerpo), un anticuerpo de una sola hebra (una cadena H, una cadena L, una región V de cadena H, y una región V de cadena 15 L, etc.), scFv, diacuerpo (dímero de scFv), dsFv (una región V estabilizada con disulfuro), y una región determinante de la complementariedad (CDR).
El Fab es un fragmento de anticuerpo con un peso molecular de aproximadamente 50.000 que tiene actividad de unión a antígeno, que se forma mediante la unión de aproximadamente una mitad del lado N-terminal de la cadena 20 H a toda la cadena L a través de un enlace disulfuro, entre fragmentos obtenidos mediante tratamiento de moléculas de anticuerpo con una proteasa, papaína. Además, también es posible producir un Fab de este tipo mediante inserción de ADN que codifica el Fab de un anticuerpo en un vector de expresión procariota o un vector de expresión eucariota, y a continuación introduciendo al vector en un procariota o en un eucariota con el fin de permitir que el ADN se exprese en el mismo. 25
El F(ab’)2 es un fragmento de anticuerpo con un peso molecular de aproximadamente 100.000 que tiene actividad de unión a antígeno, cuyo tamaño es ligeramente superior al de Fab que se une a Fab a través de enlace disulfuro en la región bisagra, entre fragmentos obtenidos mediante tratamiento de moléculas de anticuerpo con una proteasa, pepsina. Además, también es posible producir un F(ab’)2 de este tipo mediante el enlace tioéter o enlace disulfuro de 30 Fab, como se describe posteriormente.
El Fab’ es un fragmento de anticuerpo con un peso molecular de aproximadamente 50.000 que tiene actividad de unión a antígeno, que se forma mediante escisión del enlace disulfuro en la región bisagra del F(ab’)2 mencionado anteriormente. Además, también es posible producir un Fab’ de este tipo mediante inserción de ADN que codifica el 35 fragmento de Fab’ de un anticuerpo en un vector de expresión procariota o un vector de expresión eucariota, y a continuación introduciendo al vector en un procariota o en un eucariota con el fin de permitir que el ADN se exprese en el mismo.
El scFv es un fragmento de anticuerpo que tiene actividad de unión a antígeno, que es un polipéptido VH-P-VL o VL-40 P-VH formado mediante unión de una región V de una sola cadena H (VH) a una región V de una sola cadena L (VL) usando un conector peptídico adecuado (P). Un scFv de este tipo se puede producir obteniendo ADNc que codifica VH y VL de un anticuerpo, construyendo ADN que codifica scFv, insertando el ADN en un vector de expresión procariota o un vector de expresión eucariota, y a continuación introduciendo al vector en un procariota o en un eucariota con el fin de permitir que el ADN se exprese en el mismo. 45
El diacuerpo es un fragmento de anticuerpo formado por dimerización de scFv, que tiene actividades de unión a antígeno divalentes. Las actividades de unión a antígeno divalentes de este tipo pueden ser idénticas entre sí, o también pueden ser diferentes entre sí. Un diacuerpo de este tipo se puede producir obteniendo ADNc que codifica la VH y VL de un anticuerpo, construyendo ADN que codifica scFv de modo que la longitud de la secuencia de 50 aminoácidos de P tiene 8 restos o menos, insertando el ADN en un vector de expresión procariota o un vector de expresión eucariota, y a continuación introduciendo al vector en un procariota o en un eucariota con el fin de permitir que el ADN se exprese en el mismo.
El dsFv es un fragmento de anticuerpo formado mediante unión de polipéptidos, en el que un resto de aminoácido en 55 cada una de VH y VL se ha sustituido con un resto de cisteína, entre sí a través de un enlace disulfuro entre los restos de cisteína. El resto de aminoácido a sustituir con restos de cisteína se puede seleccionar basándose en el cálculo de la estructura tridimensional del anticuerpo de acuerdo con el método de Reiter et al., (Protein Engineering, 7, 697-704, 1994). Un dsFv de este tipo se puede producir obteniendo ADNc que codifica la VH y VL de un anticuerpo, construyendo ADN que codifica dsFv, insertando el ADN en un vector de expresión procariota o un 60 vector de expresión eucariota, y a continuación introduciendo al vector en un procariota o en un eucariota con el fin de permitir que el ADN se exprese en el mismo.
Un péptido que comprende una CDR comprende al menos una región de las CDR de VH (CDR 1 a 3) y las CDR de VL (CDR 1 a 3). Los ejemplos más preferentes de un péptido de este tipo incluyen un péptido que comprende todas 65 las CDR de VH y un péptido que comprende todas las CDR de VL. Un ejemplo particularmente preferente del péptido es un péptido que comprende todas las CDR de VH y VL (6 regiones en total). Los ejemplos preferentes de la secuencia de aminoácidos de una CDR de este tipo incluyen las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NOS: 36 a 38, 41 a 43, 46 a 48, 51 a 53, 56 a 58, 61 a 63, 66 a 68, y 71 a 73, como se ha descrito anteriormente. Un péptido que comprende múltiples CDR se pueden unir entre sí, directamente o a través de un conector peptídico adecuado. Un péptido de este tipo que comprende CDR se puede producir mediante construcción de ADN que 5 codifica la VH y VL de un anticuerpo, insertando el ADN en un vector de expresión procariota o un vector de expresión eucariota, y a continuación introduciendo al vector de expresión en un procariota o un eucariota con el fin de permitir que el ADN se exprese en el mismo. Además, un péptido de este tipo que comprende CDR también se puede producir mediante métodos de síntesis química tal como un método de Fmoc (un método de fluorenilmetiloxi-carbonilo) y un método de tBoc (un método de t-butiloxicarbonilo). 10
El fragmento de anticuerpo de la presente invención, como tal, puede ser un fragmento de anticuerpo, que comprende una parte o toda la región Fc del anticuerpo en la que la fucosa no se une a la N-acetilglucosamina en el extremo terminal reductor de una cadena de azúcar unida a N-glucósido. De otro modo, el fragmento de anticuerpo de la presente invención también puede ser una proteína de fusión, momento en el que el fragmento de anticuerpo 15 mencionado anteriormente se fusiona con una parte o toda la región Fc del anticuerpo en la que la fucosa no se une a la N-acetilglucosamina en el extremo terminal reductor de una cadena de azúcar unida a N-glucósido. Un fragmento de anticuerpo de este tipo es capaz de mejorar la actividad de ADCC de forma significativa, y por lo tanto es preferente.
20
En lo sucesivo en el presente documento, en las descripciones de la presente memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos mencionados anteriormente también están incluidos en el anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención.
3. Preparación del conjugado de anticuerpo-fármaco 25
Como un inmunoconjugado preparado usando en anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención mencionado anteriormente, se puede proporcionar un conjugado de anticuerpo-fármaco, que comprende el anticuerpo mencionado anteriormente y una sustancia (un compuesto, etc.) que tiene actividad antitumoral y/o actividad de eliminación de células. Se debe indicar que un conjugado formado preparando previamente cada una de las 30 moléculas de anticuerpo mencionado anteriormente y la sustancia mencionada anteriormente que tiene actividad antitumoral y/o actividad de eliminación de células, por separado, y a continuación combinándolos, se denomina generalmente inmunoconjugado. Por otro lado, un conjugado obtenido mediante unión de una toxina de proteína usada como una sustancia de este tipo que tiene actividad antitumoral y/o actividad de eliminación de células a un gen de anticuerpo o un gen de acuerdo con una técnica de recombinación genética, con el fin de permitirle que 35 exprese una sola proteína (una proteína de fusión), generalmente se denomina inmunotoxina.
Los ejemplos de una sustancia que tiene actividad antitumoral incluyen doxorrubicina, caliqueamicina, mitomicina C, Auristatina E e isótopo radiactivo (RI). Los ejemplos de una sustancia que tiene actividad de eliminación de células incluyen saporina, lisina, exotoxina de pseudomonas, toxina de difteria el isótopo radiactivo (RI). De estos, saporina 40 y exotoxina de pseudomonas se usan preferentemente. El tipo de RI que tiene actividad antitumoral y/o actividad de eliminación de células no está limitado en particular, y los ejemplos de los RI de este tipo incluyen 90Y, 111In, 125I, 3H, 35S, 14C, 186Re, 188Re, 189Re, 177Lu,, 67Cu, 212Bi, 213Bi, 211At,, 198Au, 224Ac, 126I, 133I, 77Br, 113mIn, 95Ru, 97Ru, 103Ru, 105Ru, 107Hg, 203Hg, 94mTc, 121mTe, 122mTe, 125mTe, 165Tm, 167Tm, 168Tm, 111Ag, 197Pt, 109Pd, 32P, 33P, 47Sc, 153Sm, 177Lu, 105Rh, 142Pr, 143Pr, 161Tb, 166Ho, 199Au, 57Co, 58Co, 51Cr, 59Fe, 18F, 75Se, 201Tl, 225Ac, 76Br, 86Y, 169Yb, 166Dy, 212Pb y 45 223Ra.
Un método para producir un conjugado de anticuerpo-fármaco no está limitado. Por ejemplo, se aplica un método para acoplar un anticuerpo con un fármaco a través de un enlace disulfuro o un enlace de hidrazona.
50
El anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención mencionado anteriormente es excelente en términos de actividad de internalización en células tumorales diana que expresan hTROP-2. Por lo tanto, combinando previamente una sustancia que tiene actividad antitumoral y actividad de eliminación de células con el anticuerpo anti-hTROP-2, llega a ser posible permitir que una sustancia actúe de forma directa y altamente selectiva en las células tumorales. El conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención es extremadamente excelente en 55 términos de capacidad de suministrar el agente a las células tumorales diana.
La actividad de internalización en células se puede evaluar mediante etiquetado con fluorescencia de un anticuerpo con rodamina o similares a continuación observando el comportamiento migratorio y localización del anticuerpo usando un microscopio de fluorescencia o similares. 60
Además, en la presente invención, además del conjugado de anticuerpo-fármaco mencionado anteriormente, También se puede proporcionar un fragmento de conjugado de anticuerpo-fármaco, en el que se usa el fragmento de anticuerpo mencionado anteriormente en lugar de un anticuerpo. Con respecto a los detalles de un fragmento de conjugado de anticuerpo-fármaco de este tipo, se pueden aplicar las descripciones del conjugado de anticuerpo-65 fármaco mencionado anteriormente, si fuera apropiado.
En lo sucesivo en el presente documento, en las descripciones de la presente memoria descriptiva, un fragmento de conjugado de anticuerpo-fármaco de este tipo también está incluido en el conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención.
4. Composición farmacéutica 5
El anticuerpo anti-hTROP-2 y el conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención son útiles como principios activos contenidos en una composición farmacéutica.
La composición farmacéutica es útil como una composición farmacéutica para tratar y/o diagnosticar un tumor. En 10 particular, dado que el anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención y un conjugado de anticuerpo-fármaco que comprende el anticuerpo mencionado anteriormente tienen actividad inhibitoria del crecimiento tumoral excelente como tal actividad antitumoral, se usan preferentemente en el tratamiento de tumor. Es decir, el anticuerpo anti-hTROP-2 y el conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención son útiles como príncipes activos contenidos en un agente terapéutico tumoral y en un agente de diagnóstico tumoral. Se debe indicar que el 15 tratamiento del tumor descrito anteriormente incluye inhibición del crecimiento tumoral y supresión del crecimiento tumoral. De forma específica, si se trata de un agente terapéutico tumoral, los ejemplos del agente terapéutico tumoral incluyen un inhibidor del crecimiento tumoral y un supresor del crecimiento tumoral.
Es preferente proporcionar la composición farmacéutica de la presente invención en forma de una composición 20 farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-hTROP-2 y/o conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención como principio o principios activos, y que comprende adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable. Además, la composición farmacéutica de la presente invención se puede usar en combinación con agentes antitumorales conocidos. Mediante un uso combinado de este tipo, se puede obtener un efecto antitumoral más elevado. 25
Las enfermedades diana (tumores), a las que se aplica la composición farmacéutica de la presente invención, incluyen: los diversos tipos mencionados anteriormente de tumores humanos conocidos, en los que se ha confirmado previamente la expresión de hTROP-2. Entre otros, son particularmente preferentes uno o dos o más tipos seleccionados entre cáncer pancreático humano, cáncer de próstata humano, cáncer de colon humano y 30 cáncer de mama humano. La enfermedad llana de este tipo puede ser una sola enfermedad, o dos o más enfermedades que se pueden desarrollar en combinación. Además, el tumor diana puede ser un cáncer recurrente o un cáncer metastásico. La composición farmacéutica de la presente invención (adicionalmente, el anticuerpo anti-hTROP-2 y/o conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención) se puede usar de manera eficaz como un agente terapéutico y un agente de diagnóstico para un cáncer recurrente o un cáncer metastásico. 35
Los ejemplos del quot;vehículo farmacológicamente aceptablequot; incluyen un excipiente, un diluyente, un prolongador de cadena, un agente disgregante, un estabilizante, un conservantes, un tampón, un emulsionante, un agente aromático, un agente colorante, un edulcorante, un espesante, un agente corrector, un agente solubilizante y otros aditivos. Usando uno o más tipos de tales vehículos, se puede preparar una composición farmacéutica en forma de 40 una inyección, un agente líquido, una cápsula, una suspensión, una emulsión, un jarabe, etc. Estas composiciones farmacéuticas se pueden administrar por vía oral o por vía parenteral. Otra forma de administración parenteral es, por ejemplo, una inyección que comprende uno con más principios activos, que se prepara mediante un método habitual. Una inyección de este tipo se puede producir disolviendo o suspendiendo el anticuerpo presente en un vehículo farmacológicamente aceptable tal como una solución salina normal o un agua destilada disponible en el 45 mercado usada para inyección.
En particular, cuando un fragmento de anticuerpo obtenido a partir del anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención (en particular, un fragmento de anticuerpo con un peso molecular bajo) se administra en un organismo vivo, se puede usar un sistema de dispersión coloidal además de los componentes mencionados anteriormente. se 50 anticipa que un sistema de dispersión coloidal de este tipo tiene un efecto de aumento de la estabilidad de un compuesto (un fragmento de anticuerpo) en un organismo vivo o un efecto de transporte de un compuesto de este tipo de manera eficaz a un órgano, tejido, o célula específicos. El tipo de uno de tales sistemas de dispersión coloidal no está limitado, siempre y cuando se usa comúnmente. Los ejemplos de un sistema de dispersión coloidal de este tipo incluyen sistemas de dispersión que comprenden, como bases, polietilenglicol, un conjugado macromolecular, 55 un agregado macromolecular, una nanocápsula, microesfera, perlas, y lípidos que incluyen un agente emulsionante de aceite en agua, micela, micela mixta y liposoma. Los ejemplos preferentes de un sistema de dispersión coloidal de este tipo incluyen múltiples liposomas y las vesículas de membrana artificial, que tienen un efecto de transporte de manera eficaz de un compuesto de este tipo a un órgano, tejido o célula específicos (Mannino et al., Biotechniques, 1988, 6, 682; Blume y Cevc, Biochem. et Biophys. Acta, 1990, 1029, 91; Lappalainen et al., Antiviral 60 Res., 1994, 23, 119; Chonn y Cullis, Current Op. Biotech., 1995, 6, 698).
La dosificación de la composición farmacéutica de la presente invención difiere dependiendo de la edad, sexo, peso corporal y síntomas de un paciente, efectos terapéuticos, un método de administración, un tiempo de tratamiento, los tipos del anticuerpo anti-hTROP-2 y conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención contenidos en la 65 composición farmacéutica, etc. En general, la presente composición farmacéutica se puede administrar dentro del intervalo entre 600 µg y 6.000 mg por adulto por administración. Sin embargo, la dosis no se limita al intervalo mencionado anteriormente.
En un caso en el que la composición farmacéutica se administra en forma de una inyección, por ejemplo, se puede administrar a una dosificación de 100 µg a 100 mg, por administración, por peso corporal de un paciente humano, de 5 una vez o divididas en varias administraciones, como una dosis diaria promedio. Preferentemente, la composición farmacéutica se puede administrar una vez cada tres días, una vez a la semana, una vez cada diez días, o una vez cada dos semanas, o mediante una sola administración (momento en el que el número total de administraciones es 1). Los ejemplos de la forma de clasificación incluyen inyección intravenosa, inyección subcutánea, inyección intradérmica, inyección intramuscular e inyección intraperitoneal. Entre estas, es precedente la inyección 10 intravenosa. Además, una inyección de este tipo se puede preparar en forma de un diluyente no acuoso (por ejemplo, polietilenglicol, aceite vegetal tal como aceite de oliva, alcoholes tales como etanol, etc.), una suspensión, o una emulsión. Una inyección de este tipo se puede esterilizar mediante esterilización mecánica usando un filtro, la mezcla de un microbicida, etc. La inyección se puede producir en forma de una inyección a preparar antes de su uso. Es decir, una composición sólida esterilizada se prepara mediante un método de liofilización o similar, y la 15 composición a continuación se disuelve en agua destilada esterilizada usada para inyección u otros disolventes antes de su uso, de modo que se pueda usar a continuación.
La presente invención proporciona un uso del anticuerpo anti-hTROP-2 y/o conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención, mencionados anteriormente en la producción de un agente farmacéutico (un fármaco) para tratar 20 y/o diagnosticar un tumor. Además, la presente invención proporciona el anticuerpo anti-hTROP-2 y/o conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención, mencionados anteriormente, que se usan para tratar y/o diagnosticar un tumor.
Además, la presente invención proporciona un método para tratar y/o diagnosticar un tumor, que se caracteriza por 25 que comprende el uso (en particular, la administración a pacientes) del anticuerpo anti-hTROP-2 y/o conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención mencionados anteriormente. Además, la presente invención también proporciona el uso del anticuerpo anti-hTROP-2 y/o conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención, mencionados anteriormente en el tratamiento de tumor.
30
5. Método para detectar tumores
El método para detectar un tumor de la presente invención se caracteriza por que comprende permitir que el anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención mencionado anteriormente reaccione con una muestra recogida de un organismo vivo (denominada en lo sucesivo en el presente en un documento muestra biológica), y detecta una 35 señal(es) del anticuerpo que reacciona.
Como se ha descrito anteriormente, se ha confirmado que hTROP-2 se expresa de forma específica en diversos tipos de células tumorales. Por lo tanto, hTROP-2, y en particular, se puede usar hTROP-2 libre (una porción de la región extracelular de hTROP-2) como un marcador para diversos tipos de tumores. En particular, tal hTROP-2 se 40 puede usar preferentemente como un marcador para cáncer pancreático humano, cáncer de próstata humano, cáncer de colon humano y cáncer de mama humano.
Por lo tanto, se permite que el anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención reaccione con una muestra biológica, y a continuación se detecta una señal del anticuerpo que reacciona, con el fin de detectar un tumor. La 45 señal de anticuerpo obtenida se puede usar como un indicador de la cantidad de un antígeno en la muestra biológica (es decir, una cantidad de hTROP-2 o una cantidad de hTROP-2 libre). En la detección de un tumor usando el anticuerpo de la presente invención, en primer lugar, se permite que una muestra biológica recogida como un analito de un sujeto, tal como una sección de tejido o sangre usada como una diana de ensayo, se una al anticuerpo de la presente invención mediante una reacción de antígeno-anticuerpo. Posteriormente, basándose en los resultados de 50 la medición de la cantidad del anticuerpo unido, se mide la cantidad de un antígeno de interés contenido en la muestra biológica. Esta medición se puede realizar de acuerdo con métodos de inmunoensayo conocidos. Por ejemplo, se puede usar un método de inmunoprecipitación, un método de inmunoaglutinación, radioinmunoensayo, Inmunofelometría, un método de transferencia de Western, citometría de flujo y similares. En radioinmunoensayo, se usa un anticuerpo etiquetado, y por lo tanto una señal de anticuerpo se expresa como la cantidad del anticuerpo 55 etiquetado y se detecta directamente. De otro modo, un anticuerpo cuya concentración o título de anticuerpo se ha conocido se puede usar como una solución patrón, y por lo tanto una señal del anticuerpo diana se puede expresar como un valor relativo. Es decir, tanto la solución patrón como el analitos se pueden medir usando un dispositivo de medición, y una señal de anticuerpo en una muestra biológica se puede expresar como un valor relativo al valor de la solución patrón usada como un criterio. Los ejemplos de un radioinmunoensayo de este tipo incluyen el método de 60 ELISA, el método de EI, el método de RIA, inmunoensayo de fluorescencia (FIA), e inmunoensayo de luminiscencia. Entre estos, el método de ELISA es particularmente preferente porque es sencillo y altamente sensible.
En la presente invención, el estado de un tumor se puede evaluar o diagnosticar, usando el resultado de detección obtenido con el método de detección mencionado anteriormente como un indicador. Por ejemplo, cuando el 65 resultado de detección supera un valor patrón determinado previamente, el estado de un tumor se define como positivo para tumor, y cuando el resultado de detección es menor que el valor patrón determinado previamente, se define como negativo para tumor. En el caso del positivo para tumor, se determina que se podría haber desarrollado un cierto tipo de tumor, y por lo tanto el estado tumoral se puede evaluar. La expresión quot;el estado de un tumorquot; se usa en el presente documento para hacer referencia a la presencia o ausencia del desarrollo de un tumor, o el grado de progresión del mismo. Por lo tanto, los ejemplos específicos del estado de un tumor incluyen presencia o 5 ausencia del desarrollo de un tumor, el grado de progresión del mismo, el grado de malignidad, la presencia o ausencia de metástasis, y la presencia o ausencia de recurrencia.
En la evaluación mencionada anteriormente, como un estado de un tumor a evaluar, solamente un estado se puede seleccionar entre los ejemplos mencionados anteriormente, o múltiples ejemplos se pueden combinar y seleccionar. 10 La presencia o ausencia de un tumor se puede evaluar mediante la determinación de si el tumor se ha desarrollado o no, con referencia al valor patrón determinado previamente usado como un límite, basándose en el resultado de detección obtenido. El grado de malignidad se usa como un indicador que indica el grado de progresión de un cáncer. Basándose en el resultado de detección, el tumor diana se puede clasificar en un cierto estadio de enfermedad y se puede evaluar. De otro modo, un cáncer inicial y un cáncer avanzado se pueden distinguir entre sí, 15 Y a continuación se pueden evaluar. Por ejemplo, también es posible determinar el tumor diana como un cáncer inicial o un cáncer avanzado, usando el resultado de detección como un indicador. La metástasis del tumor se puede evaluar determinando si ha aparecido o no una neoplasia en un sitio alejado de la posición de la lesión inicial, usando el resultado de detección como un indicador. La recurrencia se puede evaluar determinando si el resultado de detección ha superado o no el valor patrón determinado previamente de nuevo después del estadio de intervalo o 20 remisión.
6. Kit para detectar o diagnosticar tumores
El anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención se puede proporcionar en forma de un kit para detectar o 25 diagnosticar un tumor. El kit de la presente invención comprende una sustancia de etiquetado, un reactivo en fase sólida sobre el que se ha inmovilizado el anticuerpo o el anticuerpo etiquetado, etc., así como el anticuerpo mencionado anteriormente. Una sustancia de etiquetado que etiqueta el anticuerpo se refiere a una sustancia etiquetada con una enzima, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto quimioluminiscente, etc. El kit de la presente invención también puede comprender otros reactivos usados para realizar la detección de la 30 presente invención, además de los elementos componentes mencionados anteriormente. Por ejemplo, cuando una sustancia de etiquetado de este tipo es una sustancia de etiquetado enzimática, el kit de la presente invención puede comprender un sustrato enzimático (un sustrato cromogénico, etc.), una solución de disolución de sustrato enzimático, una solución de parada de reacción enzimática, un diluyente usado para analitos, etc. Además, el presente kit puede comprender adicionalmente diversos tipos de tampones, agua esterilizada, diversos tipos de 35 recipientes de cultivo celular, diversos tipos de reactores (un tubo Eppendorf, etc.), un agente del bloqueo (un componente de suero tal como albúmina de suero bovino (BSA), leche desnatada, o suero de cabra), un agente de lavado, un agente tensioactivo, diversos tipos de placas, un agente antiséptico tal como azida sódica, un manual de operación experimental (instrucciones), etc.
40
El kit de la presente invención se puede usar de manera eficaz para realizar el método de detección de la presente invención mencionado anteriormente, y por lo tanto es extremadamente útil.
En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá de forma más específica en los siguientes ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos no pretenden limitar el alcance de la presente invención. 45
[Ejemplo 1]
[Clonación del gen hTROP-2]
50
Un gen hTROP-2 de longitud completa se aisló de hígado fetal humano (embrión de 10 semanas de edad) de acuerdo con un método de RT-PCR. En primer lugar, los siguientes cebadores de PCR se diseñaron basándose en la secuencia de un gen hTROP-2 (N.º de registro en Genbank NM_002353).
Cebador directo: 5’-ttcctccgccccaccatggc-3’ (SEQ ID NO: 3) 55
Cebador inverso: 5’-ctcgagcaagctcggttcctttctc-3’ (SEQ ID NO: 4)
Cuando se diseñaron estos cebadores, una secuencia digerida con enzima de restricción XhoI excepto para un codón de finalización se añadió al cebador inverso. El ADNc se sintetizó a partir de ARN total (TAKARA) preparado a partir de hígado fetal humano (embrión de 10 semanas de edad). Usando este ADNc como un molde, una reacción 60 de PCR se realizó con los cebadores mencionados anteriormente. A partir de ese momento, se realizaron desarrollo mediante electroforesis en gel de agarosa y extracción de una banda de interés, y a continuación se clonó en un vector pCRII (Invitrogen) (pCRII-hTROP-2). El ADNc de hTROP-2 clonado se confirmó por secuenciación.
Un vector de expresión se construyó escindiendo un fragmento de EcoRI/XhoI que comprendía un gen hTROP-2 de 65 pCRII-hTROP-2, y a continuación insertando el fragmento en el sitio EcoRI/XhoI de un vector pcDNA4/myc-His© A (Invitrogen) (pcDNA4-hTROP-2-myc/His). Además, un fragmento de HindIII/PmeI que comprendía un gen hTROP-2 se recortó de pcDNA4-hTROP-2-myc/His (en el que la porción de escisión de HindIII tenía extremos romos), y a continuación el fragmento se insertó en un sitio PmeI de un vector pcDNA3.1 (+) (Invitrogen), con el fin de construir un vector de expresión que comprendía un gen de resistencia a neomicina (pcDNA3.1-hTROP-2-myc/His).
5
[Ejemplo 2]
[Construcción de una línea celular capaz de expresar el gen hTROP-2 de forma estable]
El vector de expresión (pcDNA3.1-hTROP-2-myc/His) que codifica el ADNc de longitud completa de hTROP-2, que 10 se había producido con el método descrito anteriormente, se introdujo en células HEK293 (RIKEN), células HuH-7 (HSRRB), células 7E2-C (descritas en el documento WO 2005/052156) y células CHO-K1 (HSRRB), usando un reactivo de lipofectamina 2000 (Invitrogen), y a continuación la selección se realizó usando un antibiótico G418 (geneticina; GIBCO BRL). A partir de ese momento, se estableció y se obtuvo una línea celular, que expresaba hTROP-2 de forma estable. 15
[Ejemplo 3]
[Producción de proteína recombinante de región extracelular de hTROP-2]
20
Un fragmento genético que codifica una porción de la región extracelular de hTROP-2 (de forma específica, una región que consiste en los aminoácidos en las posiciones 1 a 263 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2) se amplificó con un método de PCR. En la amplificación se usaron los siguientes cebadores.
Cebador directo: 5’-ttcctccgccccaccatggc-3’ (SEQ ID NO: 3) 25
Cebador inverso: 5’-ctcgagctcgtccaggtaatagatgagcg-3’ (SEQ ID NO: 5)
En esta operación, una secuencia digerida con enzima de restricción XhoI se añadió al cebador inverso. El fragmento de ADN amplificado con el método de PCR se desarrolló mediante electroforesis en gel de agarosa, y a continuación se purificó usando el Kit de Extracción en Gel (QIAGEN) QIAquick (marca comercial registrada). El 30 fragmento de ADN purificado se subclonó en un vector pCR Blunt (Invitrogen) (pCRB-hTROP-2 EC), y la secuencia genética se confirmó. Posteriormente, un fragmento de EcoRI/XhoI que comprendía el fragmento genético codificante de la región extracelular de hTROP-2 se recortó del pCRB-hTROP-2 EC, y a continuación se insertó en el sitio EcoRI/XhoI de un vector pcDNA4/myc-His© A (Invitrogen) (pcDNA4mH-hTROP-2 EC). Además, para producir un sitio de restricción enzimática de NruI, los siguientes oligonucleótidos se asociaron y se insertaron en el sitio 35 BamHI/EcoRI del pcDNA4mH-hTROP-2 EC.
Oligonucleótido 1: 5’-gatccactagtcgcgagtggtgg-3’ (SEQ ID NO: 6)
Oligonucleótido 2: 5’-aattccaccactcgcgactagtg-3’ (SEQ ID NO: 7)
40
De forma análoga, un conector pBgl II (TAKARA) se insertó en el sitio PmeI del pcDNA4mH-hTROP-2 EC (pcDNA4mH-NB-hTROP-2 EC). Para producir una proteína recombinante usando baculovirus, un fragmento de NruI/BglII que comprendía el fragmento genético codificante de la región extracelular de hTROP-2 se recortó del pcDNA4mH-NB-hTROP-2 EC, y a continuación se insertó en el sitio NruI/BglII de un vector pPSC8 (Nosan Corporation) (pPSC8-hTROP-2 EC). La producción de la proteína recombinante de la región extracelular de hTROP-45 2 usando baculovirus se delegó a Nosan Corporation.
La proteína recombinante de la región extracelular de hTROP-2 se purificó como sigue a continuación. Se añadió Ni Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare Biosciences) a un sobrenadante de cultivo que comprendía la proteína recombinante, de modo que se permitió que se unieran entre sí a 4 ºC durante 2 horas. A partir de ese momento, el 50 producto resultante se lavó con un tampón de fosfato que contenía imidazol 20 mM, usando EconoColumn (BIO RAD), y a continuación se eluyó con un tampón de fosfato que contenía imidazol 300 mM, de modo que se purificó.
[Ejemplo 4]
55
[Aislamiento de ADNc de EpCAM humana y construcción del vector de expresión]
Un gen EpCAM humano de longitud completa se aisló a partir de hígado fetal humano (embrión de 10 semanas de edad) de acuerdo con un método de RT-PCR. En primer lugar, los siguientes cebadores de PCR se diseñaron basándose en la secuencia de un gen EpCAM humano (N.º de registro en Genbank NM_002354). 60
Cebador directo: 5’-tcctcgtgtcccactcccgg-3’ (SEQ ID NO: 8)
Cebador inverso: 5’-ctcgagtgcattgagttccctatgc-3’ (SEQ ID NO: 9)
Cuando se diseñaron estos cebadores, una secuencia digerida con enzima de restricción XhoI excepto para un 65 codón de finalización se añadió al cebador inverso. El ADNc se sintetizó a partir de ARN total (TAKARA) preparado a partir de hígado fetal humano (embrión de 10 semanas de edad). Usando este ADNc como un molde, una reacción de PCR se realizó con los cebadores mencionados anteriormente. A partir de ese momento, se realizaron desarrollo mediante electroforesis en gel de agarosa y extracción de una banda de interés, y a continuación se clonó en un vector pCRII (Invitrogen) (pCRII-hEpCAM). El ADNc de EpCAM humano clonado se confirmó por secuenciación.
5
Un vector de expresión se construyó escindiendo un fragmento de EcoRI/XhoI que comprendía un gen EpCAM humano de pCRII-hEpCAM, y a continuación insertando el fragmento en el sitio EcoRI/XhoI de un vector pcDNA4/myc-His© A (Invitrogen) (pcDNA4-hEpCAM-myc/His). Además, un fragmento de HindIII/PmeI que comprendía un gen EpCAM humano se recortó de pcDNA4-hEpCAM-myc/His (en el que la porción de escisión de HindIII tenía extremos romos), y a continuación el fragmento se insertó en un sitio PmeI de un vector pcDNA3.1 (+) 10 (Invitrogen), con el fin de construir un vector de expresión que comprendía un gen de resistencia a neomicina (pcDNA3.1-hEpCAM-myc/His).
[Ejemplo 5]
15
[Producción del anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2]
Como agentes inmunógenos, se usaron líneas celulares capaces de expresar hTROP-2 de forma estable (células HEK293-hTROP-2, células CHO-K1-hTROP-2 y células 7E2-C-hTROP-2); línea de células de cáncer pancreático expresan de forma endógena una proteína hTROP-2 en la superficie celular (PK-59, RCB1901; adquirida en el 20 banco de células RIKEN); y la proteína recombinante de la región extracelular de hTROP-2 producida con el método descrito anteriormente.
En el caso de las líneas celulares capaces de expresar hTROP-2 de forma estable, se usaron 1 x 107 células, y en el caso de la proteína hTROP-2 recombinante, se usaron 20 µg de la proteína. Las líneas celulares por la proteína 25 recombinante se mezclaron con un adyuvante TiterMax Gold (Funakoshi Corporation) a una proporción de mezcla de 1 : 1, con el fin de preparar una emulsión. A continuación la emulsión se inyectó en las dos almohadillas de las patas o cavidad abdominal de un ratón (C57/BL6, Balb/c) (inmunización inicial). Cuando la inmunización se realizaba por inyección en las dos almohadillas de las patas durante un breve periodo de tiempo, se realizó una estimulación de tres a diez días después de la inmunización inicial. El día después de la inmunización final, los ganglios linfáticos 30 se recogieron de ambas rodillas, y a continuación se prepararon linfocitos. Cuando la inmunización se realizaba mediante inyección en la cavidad abdominal durante un periodo de tiempo largo, las estimulaciones se realizaban a intervalos de una vez a la semana después de la inmunización final (en la que las estimulaciones se realizaron de 1 a 2 meses). A partir de ese momento, los linfocitos B se aislaron del bazo de acuerdo con un método habitual. En el caso de inmunización usando células como agentes inmunógenos, para las estimulaciones se usó una suspensión 35 celular de PBS que contenía 5 x 106 células. En el caso del uso de una proteína como un agente inmunógeno, se usaron 5 µg de una solución de PBS.
Los linfocitos preparados se mezclaron con una línea de células de mieloma de ratón (P3-X63-Ag8.653) a una proporción de mezcla de 3 : 1, y a continuación la fusión celular se llevó a cabo de acuerdo con un método con 40 polietilenglicol. A partir de ese momento, las células fusionadas se cultivaron de 7 a 28 días en un medio de metil celulosa (nombre comercial: Medio D de Clonación ClonaCell-HY; Células Madre), que contenía HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina). Cada una de las colonias individuales de hibridomas en crecimiento se seleccionaron y se colocaron en una placa de fondo plano de 96 pocillos, y usando un medio selectivo líquido que contenía HAT, los hibridoma se cultivaron en una incubadora de CO2 al 5 %. Un sobrenadante de cultivo de hibridomas en crecimiento 45 De colonias individuales se sometió a una identificación sistemática primaria a través de ELISA Celular (que se describe posteriormente) y a continuación a una identificación sistemática secundaria a través de análisis de FACS usando células HuH-7-hTROP-2, PK-59, estableciendo de ese modo 300 tipos de hibridomas, que producen anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 que reconocen proteínas hTROP-2 expresadas en la superficie celular de células vivas. 50
[Ejemplo 6]
[Identificación sistemática primaria usando ELISA Celular]
55
Las células CHO-K1 (control negativo para hTROP-2; adquiridas en Japan Health Sciences Foundation) y las células CHO-K1-hTROP-2 (o células HUH-7 (control negativo para hTROP-2; adquiridas en Japan Health Sciences Foundation) y células HuH-7-hTROP-2) se inocularon de forma alternativa en una placa de cultivo de 96 pocillos (BD Falcon) a una densidad celular de 3 x 104 células/pocillo, y a continuación las células se cultivaron en una atmósfera de CO2 al 5 % a 37 ºC de 1 a 2 días. El medio de cultivo celular se retiró por decantación. A partir de ese momento, 60 las células se lavaron con PBS enfriado con hielo, y a continuación se trataron con paraformaldehído al 4 %-PBS durante 5 minutos, de modo que las células se inmovilizaron. Las células se lavaron con PBS que se había enfriado el hielo, y a continuación se preparó una placa de ELISA. A partir de ese momento, el ELISA se realizó de acuerdo con un método habitual. A continuación se describirán los procedimientos específicos.
65
En primer lugar, el bloqueo con una solución de leche desnatada al 2 %-PBS se realizó a temperatura ambiente de 30 minutos a 1 hora. Posteriormente, el sobrenadante del cultivo de hibridoma se añadió a la misma, y a continuación se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. A partir de ese momento, el producto resultante se lavó con una solución de Tween 20 al 0,1 %-PBS tres veces. Como un anticuerpo secundario, anti-IgG de ratón etiquetado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (GE Healthcare Biosciences), que se había diluido 1000 veces con una solución de bloqueo, se añadió al producto resultante, y a continuación se hicieron reaccionar a 5 temperatura ambiente durante 1 hora. A partir de ese momento, el producto resultante se lavó con una solución de Tween 20 al 0,1 %-PBS tres veces. . Una solución de sustrato de TMB (3,3’,5,5’-tetrametilbencidina: SIGMA) se añadió a la solución de reacción para llevar a cabo una reacción de color, y a continuación la reacción se terminó añadiendo ácido sulfúrico 1 M. A partir de ese momento, la absorbancia (405 nm) se midió usando el Modelo 550 de un lector de microplacas (BIO RAD). Los hibridomas correspondientes a un sobrenadante de cultivo de hibridoma 10 que presentaban un valor de absorbancia elevado con respecto al control negativo se sometieron a un cultivo a gran escala en una placa de fondo plano de 24 pocillos, y a continuación se sometieron a una identificación sistemática secundaria usando análisis de FACS.
[Ejemplo 7] 15
[Identificación sistemática secundaria usando análisis de FACS]
Los hibridomas, que se encontró que eran positivos en la identificación sistemática primaria descrita anteriormente usando ELISA Celular, se sometieron a una identificación sistemática secundaria usando análisis de FACS. En la 20 evaluación de las células de hibridoma, las células HuH-7, que eran células de cáncer de hígado humano que no expresaban hTROP-2, se usaron como células de control negativo y como un indicador se usó la reactividad con células HuH-7-hTROP-2, que expresaban hTROP-2 de forma estable. A continuación, la evaluación se realizó basándose en la reactividad con células PK-59 (RCB1901; adquiridas en el banco celular de RIKEN), que eran células de cáncer pancreático humano que expresaban de forma endógena una proteína hTROP-2 En la superficie 25 celular.
Las células se retiraron de la placa de cultivo mediante un tratamiento con tripsina, y a continuación se preparó una suspensión celular (densidad celular: 2 x 106 células/ml). El sobrenadante del cultivo de hibridoma, que se presentaba como positivo en la identificación sistemática primaria usando ELISA Celular, se hizo reaccionar con 100 30 µl de la suspensión celular a 4 ºC durante 20 minutos. La mezcla de reacción se lavó con PBS, y a continuación se hizo reaccionar con IgG de ratón etiquetado con PE (BD Pharmingen) (0,1 µg) (4 ºC, 30 minutos). A partir de ese momento, la mezcla de reacción se analizó usando FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company).
Por último, se establecieron aproximadamente 300 tipos de hibridomas, que producen un anticuerpo monoclonal 35 anti-hTROP-2 que reconoce una proteína hTROP-2 expresada en la superficie celular de células vivas.
[Ejemplo 8]
[Identificación de isotipo] 40
El isótopo del anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 producido se identificó usando el KIT DE ENSAYO DE FORMACIÓN DE ISOTIPOS DE ANTICUERPO MONOCLONAL DE RATÓN (Serotec) de acuerdo con un método incluido en el kit mencionado anteriormente.
45
[Ejemplo 9]
[Formación de ascitis y purificación del anticuerpo TROP-2]
Los clones de hibridoma producidos con el método descrito anteriormente se administraron a una densidad de 50 3 x 106 clones en la calidad abdominal de un ratón atímico BALB/c, al que previamente (siete días antes) se le había administrado 2,6,10,14-tetrametilpentadecano (pristano). Dos semanas más tarde, la ascitis se recogió. Además, está ascitis se sometió a precipitación con ácido caprílico, y a continuación a purificación por afinidad usando una columna de proteína G (proteína G HiTrap; GE Healthcare Biosciences) o una columna de proteína A (proteína A HiTrap; GE Healthcare Biosciences), con el fin de obtener anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 de clones de 55 hibridoma individuales.
[Ejemplo 10]
[Medición de afinidad de unión a antígeno (medición del valor de Kd)] 60
La afinidad de unión a antígeno (valor de Kd) del anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 generado se calculó con un método que usa ELISA (Djavadi-Ohaniance L. et al (1996), En Antibody Engineering, Capítulo 4, pp. 77-97. IRL Press, Oxford).
65
De forma específica, la proteína hTROP-2 recombinante purificada (0,1 µg/ml) se añadió a una placa de cultivo de 96 pocillos (Corning) de modo que el antígeno se preparaba en fase sólida (a temperatura ambiente durante 1 hora, o a 4 ºC durante una noche). Posteriormente, el producto resultante se lavó con PBS tres veces, y a continuación se añadió leche desnatada al 2 % (solución de PBS) al mismo para bloquearlo (a temperatura ambiente durante 1 hora). El producto resultante se lavó con PBS dos veces. A partir de ese momento, un complejo de antígeno-anticuerpo que se había formado previamente mezclando una solución de antígeno (una proteína hTROP-2 5 purificada; 50, 25, 12,5, 6,25, o 3,125 nM) con cada clon (0,5 nM) del anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 y a continuación equilibrando la mezcla, se añadió a la placa de ELISA descrita anteriormente, y a continuación se hicieron reaccionar (a temperatura ambiente durante 1 hora). El producto de reacción se lavó con PBS tres veces, y a continuación se hizo reaccionar con anti-IgG de ratón etiquetado con HRP (concentración final: 1 µg/ml) (GE Healthcare Biosciences) diluido con una solución de bloqueo (a temperatura ambiente durante 1 hora). 10 Posteriormente, el producto de reacción se lavó con una solución de Tween 20 al 0,1 %-PBS tres veces, y a continuación se añadió una solución de sustrato TMB (3,3’,5,5’-tetrametilbencidina: SIGMA) para llevar a cabo una reacción de color. A continuación, se añadió ácido sulfúrico 1 M al producto de reacción para terminar la reacción. La absorbancia se midió usando el Modelo 550 de un lector de microplacas (BIO RAD).
15
Para medir la constante de disociación (Kd) se usaron las siguientes expresiones de cálculo.
De acuerdo con la ley de acción de masas, una reacción de antígeno-anticuerpo se representa con las siguientes expresiones.
20
En la expresión (2), Antíg libre representa la concentración de un antígeno libre, Antic libre representa la concentración de un anticuerpo libre, y Ag-Ab representa la concentración de un complejo de antígeno-anticuerpo. Si Ag-Ab = x, la concentración de anticuerpo libre se representa con la siguiente expresión. 25
Por lo tanto, la expresión (2) mencionada anteriormente puede ser
30
Si ambos términos de la expresión (4) se multiplican por x / Kd x Antic total,
35
Si X = x/Antic total e Y = x/Antic total x Antíg libre en la expresión (5),
40
Basándose en la expresión (6), el valor de Kd se calculó.
Los valores de Kd de los 300 clones de anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 generados se midieron con el método descrito anteriormente. Como resultado, había 133 clones que presentaban un valor de Kd de 1 x 10-10 (M) o inferior, 59 clones que presentaban un valor de Kd de 1 x 10-11 (M) o inferior, y 2 clones que presentaban un valor de Kd de 45 1 x 10-12 (M) o inferior.
Entre los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2, que presentaban actividad inhibitoria del crecimiento tumoral in vivo, se encontró que los valores de Kd de 5-70 (IgG2a de ratón), T6-16 (IgG2a de ratón), K5-107 (IgG1 de ratón) K5-116-2-1 (IgG1 de ratón) y T5-86 (IgG1 de ratón) eran 6,8 x 10-12 (M), 4,3 x 10-12 (M), 4,7 x 10-12 (M), 2,69 x 10-11 50 (M) y 8,49 x 10
Tabla 1
Valores de Kd de anticuerpos monoclonales anti-hTROP -2
Clon N.º Kd (x 10-12 M)
K5-70 6,8 T6-16 4,3 K5-107 4,7 K5-116-2-1 26,9 T5-86 84,9
[Ejemplo 11] 5
[Reactividad de anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 con líneas de células de cáncer humano]
Las líneas de células de cáncer humano (líneas de células tumorales humanas) usadas en estos estudios se adquirieron en Health Science Research Resources Bank (HSRRB), banco de células RIKEN (RIKEN), ATCC 10 (Colección Americana de Cultivos Tipo), ECACC (Colección Europea de Cultivos Celulares) y DSMZ (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares). De forma específica, se usaron las siguientes líneas de células cancerosas.
huH-1 (HSRRB), HUH-6 (HSRRB), HuH-7 (HSRRB), JHH-5 (HSRRB), JHH-6 (HSRRB), JHH-7 (HSRRB), HLE 15 (HSRRB), HLF (HSRRB), HepG2 (HSRRB), Alexander (HSRRB), KP-1N (HSRRB), KP-1NL (HSRRB), KP-2 (HSRRB), KP-3 (HSRRB), KP-3L (HSRRB), PK-1 (RIKEN), PANC-1 (RIKEN), MIA PaCa-2 (HSRRB), PK-59 (RIKEN), PK-45H (RIKEN), PK-45P (RIKEN), BxPC-3 (ATCC), SUIT-2 (HSRRB), TCC-PAN2 (HSRRB), SW480 (ATCC), DLD-1 (HSRRB), LoVo (HSRRB), COLO-320 (RIKEN), CACO-2 (RIKEN), CW-2 (RIKEN), HCT 116 (ATCC), HCC-56 (HSRRB), MCF-7 (HSRRB), JIMT-1 (DSMZ), HCC1143 (ATCC), A549 (HSRRB), DU145 (RIKEN) y PC-3 20 (HSRRB).
Las células cancerosas se retiraron de una placa de cultivo mediante un tratamiento con tripsina, y a continuación se preparó una suspensión celular (densidad celular: 2 x 106 células/ml). Un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 (0,1 µg) se añadió a 100 µl de la suspensión celular, y a continuación se hicieron reaccionar a 4 ºC durante 20 minutos. 25 La solución de reacción se lavó con PBS, y a continuación se hizo reaccionar con IgG anti-ratón etiquetado con PE (BD Biosciences Pharmingen) (0,1 µg) (a 4 ºC durante 30 minutos). A partir de ese momento, el producto resultante se analizó por FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company).
Todos los anticuerpos anti-hTROP-2 generados no se unían a una línea HuH-7 de células de cáncer de hígado 30 humano, que no expresaban hTROP-2 de forma endógena. Por otro lado, los anticuerpos anti-hTROP-2 se unían a células HuH-7-hTROP-2, en las que un gen hTROP-2 se expresaba de forma estable (Figura 2). Posteriormente, la reactividad de los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 generados con líneas de células de cáncer humano (en las que una proteína hTROP-2 se expresaba de forma endógena en la superficie celular) se examinó mediante análisis de FACS. Como resultado, los 300 tipos de anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 generados se unían a 35 líneas de células de cáncer pancreático humano (PK-59 y BxPC-3). En particular, todos los anticuerpos K5-70, T6-16, K5-107, K5-116-2-1 y T5-86, que presentaban actividad inhibitoria del crecimiento tumoral in vivo, se unían a líneas de células de cáncer humano a niveles elevados. Por ejemplo, cuando se comparaba con un caso en el que las líneas de células cancerosas reaccionaban solamente con IgG anti-ratón etiquetado con PE (BD Biosciences Pharmingen), los anticuerpos mencionados anteriormente presentaban la siguiente capacidad de unión a células PK-40 59 y a células BxPC-3 a una intensidad de fluorescencia media: K5-70 (44 veces), T6-16 (59 veces), K5-107 (89 veces), K5-116-2-1 (122 veces) and T5-86 (15 veces) (a células PK-59; Figura 3); y K5-70 (45 veces), T6-16 (25 veces), K5-107 (90 veces), K5-116-2-1 (121 veces) y T5-86 (10 veces) (a células BxPC-3; Figura 4).
Con respecto a líneas de células de cáncer humano distintas a PK-59 y BxPC-3, entre 12 tipos de líneas de células 45 de cáncer pancreático, los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 se unían a KP-2, KP-3L, PK-1, PK-45H, SUIT-2 y TCC-PAN2, y no se unían a KP-1N, KP-1NL, KP-3, PANC-1 y MIA-PaCa2 (Figura 5). Entre las líneas de células de cáncer de colon humano, los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 se unían a CACO-2, SW480, DLD-1 y HCT 116, y no se unían a COLO-320 y CW-2 (Figura 6). Además, los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 se unían a JIMT-1 y HCC1143 (que eran ambas líneas de células de cáncer de mama humano) y a PC-3 y DU145 (que eran 50 ambas líneas de células de cáncer de próstata humano). Por lo tanto, reconocían proteínas hTROP-2 que se expresaban de forma endógena en la superficie celular de muchos tipos de líneas de células de cáncer humano (Figura 6).
[Ejemplo 12] 55
[Reactividad cruzada con proteína TROP-2 de ratón y proteína TROP-1/EpCAM humana]
Con el fin de examinar la especificidad de los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 generados, la reactividad de los anticuerpos con una proteína TROP-2 de ratón que muestra una homología de un 80 % al nivel de la secuencia 60 de aminoácidos con la proteína hTROP-2, y con una proteína TROP-1/EpCAM humana que muestra una homología de un 50 % al nivel de la secuencia de aminoácidos con la proteína hTROP-2, se examina mediante análisis de FACS.
De forma específica, cada uno de un vector de expresión (TROP-2-pcDNA3.1 de ratón (+), proporcionado por el Instituto de Biociencias Moleculares y Celulares, Universidad de Tokio) que comprendía un ADNc de longitud 5 completa de un gen TROP-2 de ratón (N.º de registro en GenBank NM_020047, Y08830), y un vector de expresión (pcDNA3.1-hEpCAM-myc/His) que comprendía el ADNc de longitud completa de un gen TROP-1/EpCAM humano (N.º de registro en GenBank NM_002354), se introdujo de forma transitoria en células CHO-K1, usando el reactivo Lipofectamina 2000 reagent (Invitrogen). A partir de ese momento, de 24 a 48 horas más tarde, las células se retiraron de una placa de cultivo tratándolas con tripsina, y a continuación se preparó una suspensión celular. La 10 suspensión celular preparada de este modo se hizo reaccionar de forma sucesiva con el anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 (0,1 µg) producido y con IgG anti-ratón etiquetado con PE, y a continuación se analizó con FACSCalibur.
Un anticuerpo T2-102 (IgG1 de ratón) usado como un control positivo, que presentaba reactividad cruzada con TROP-2 de ratón, presenta una capacidad de unión elevada a las células CHO-K1 en las que el gen TROP-2 de 15 ratón se expresaba de forma transitoria. Por otro lado, los anticuerpos K5-70, T6-16, K5-107, K5-116-2-1 y T5-86 no presentaban una reactividad cruzada de este tipo con TROP-2 de ratón (Figura 7).
De forma análoga, un anticuerpo monoclonal EpCAM anti-humano (BD Biosciences Pharmingen) usado como un control positivo presentaba una capacidad de unión elevada a las células CHO-K1 en las que el EpCAM/TROP-1 20 humano se expresaba de forma transitoria. Por otro lado, los anticuerpos K5-70, T6-16, K5-107, K5-116-2-1 y T5-86 no presentaban una reactividad cruzada de este tipo con EpCAM/TROP-1 humano (Figura 8).
Los resultados mencionados anteriormente demostraban que los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 generados, y en particular, los anticuerpos K5-70, T6-16, K5-107, K5-116-2-1 y T5-86, que presentaban actividad 25 antitumoral in vivo, se unían de forma específica a hTROP-2.
[Ejemplo 13]
[Medición de la actividad inhibitoria del crecimiento celular] 30
Como un método para examinar la actividad del anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 para inhibir la función de hTROP-2, la influencia del anticuerpo en el recinto celular de células cancerosas humanas, que expresan hTROP-2 de forma endógena en la superficie celular, se evaluó midiendo el número de células vivas usando TetraColor ONE (Seikagaku Corporation). De forma específica, las células PK-59 se suspendieron en un medio RPMI1640 que 35 contenía suero bovino fetal al 0,5 % (preparado por BioWest) a una concentración celular de 2 x 105 células/ml, y a continuación se añadieron 100 µl de la suspensión celular preparada a cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos. Posteriormente, la IgG de ratón (control negativo) y anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 (concentraciones finales: 0,1 y 1 µg/ml) se añadieron a los pocillos, y a continuación las mezclas se cultivaron a 37 ºC en una incubadora con CO2 al 5 % durante 72 horas. Como control, se usó un anticuerpo monoclonal anti-40 hTROP-2 (clon YY01, Santa Cruz) disponible en el mercado. Se añadió TetraColor ONE (Seikagaku Corporation) a los pocillos, y a continuación se hicieron reaccionar en una incubadora con CO2 al 5 % de 1 a 2 horas. Después de finalizar la reacción, la placa de cultivo de 96 pocillos se sometió directamente a la medición de absorbancia a una longitud de onda de 490 nm (longitud de onda de control: 655 nm), usando un Lector de Microplacas. El experimento se realizó usando 3 pocillos para cada grupo. Un ensayo de diferencia significativa se realizó de acuerdo con el 45 ensayo t de Student, y se determinó que P lt; 0,05 era estadísticamente significativo.
Entre los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2, que hasta el momento se habían generado en la propia compañía de los inventores, se examinaron aproximadamente 160 clones con el método descrito anteriormente, en términos de su efecto sobre el crecimiento celular de células PK-59. Como resultado, se confirmó que T6-16, T5-86, 50 K5-70 y K5-107, que habían presentado actividad inhibitoria del crecimiento tumoral in vivo, tenían actividad inhibitoria del crecimiento celular de un 20 % a un 40 %, no se comparan con IgG de ratón (control negativo). Llegó a ser evidente que estos anticuerpos anti-hTROP-2 tienen actividad para unirse a proteínas hTROP-2, que se expresaban en la superficie de células cancerosas humanas, para neutralizar las proteínas hTROP-2, y para inhibir el crecimiento de las células cancerosas (Figura 9). 55
[Ejemplo 14]
[Ensayo de raspado]
60
El efecto de un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 en la capacidad migratoria de células cancerosas humanas se evaluó mediante un ensayo de raspado. Las células PK-59 se suspendieron en un medio RPMI1640 que contenía suero bovino fetal al 10 % a una concentración de 3 x 105 células/ml, y a continuación 100 µl de la suspensión celular preparada se añadieron a cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos. Cuando las células llegaron a ser confluentes, una porción de las células cultivadas en monocapa se desprendió, de modo que la placa se raspo 65 en una dirección longitudinal con el extremo de una punta. Un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 e IgG de ratón usada como un control negativo se añadieron al medio hasta concentraciones finales de 0,1 y 1 µg/ml, respectivamente, y a continuación el cultivo se llevó a cabo durante 24 horas. Antes de añadir el anticuerpo (Día 0) y 24 horas después del cultivo (Día 1), la región desprendida de la célula se fotografió, y a continuación se midió la distancia entre las células. Además, el área de una región desprendida de este tipo se cuantificó usando el software Scion Image. El experimento se realizó usando 8 pocillos para cada grupo. Un ensayo de diferencia significativa se 5 realizó de acuerdo con el ensayo t de Student, y se determinó que P lt; 0,05 era estadísticamente significativo.
El efecto de un anticuerpo hTROP-2 en la capacidad migratoria de las células que invaden la región de raspado se examinó. Al igual que con el ensayo de inhibición del crecimiento celular, se evaluaron anticuerpos que tenían efectos beneficiosos. Como un método de evaluación, las células se fotografiaron el Día 0 (cuando se añadía el 10 anticuerpo) y el Día 1 (24 horas después de añadir el anticuerpo), y la distancia migratoria (µm) y el área de una región de raspado se determinaron mediante análisis de imágenes. Como resultado, como se muestra en la Figura 10, se observaron diferencias evidentes en términos de la capacidad migratoria de las células. Los anticuerpos T6-16 y K5-70, que se usaron en el presente ensayo, presentaban una actividad inhibitoria del crecimiento celular significativa, cuando se comparaban con el control. Incluso en un ensayo de reproducibilidad, se observaba la misma 15 tendencia. En particular, T6-16 presentaba un resultado de P lt; 0,01 (mediante ensayo t de Student), y se encontró correlación con el ensayo in vivo.
[Ejemplo 15]
20
[Evaluación de efectos beneficiosos del anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 en ratones portadores de tumor]
Modelo de prevención
Las líneas de células de cáncer pancreático (PK-59 y BxPC-3), que expresaban hTROP-2, se retiraron tratando las 25 células con tripsina, y PBS se añadió a las mismas para preparar una suspensión celular que tenía una concentración de 1 x 108 células/ml. La suspensión celular preparada de este modo se mezcló con una cantidad igual de Matrigel (BD Biosciences Pharmingen) en hielo. Usando una jeringa de calibre 26 G, se inyectaron 100 µl de la mezcla obtenida (5 x 106 células) en la hipodermis del costado derecho de cada ratón atímico hembra de 6 semanas de edad (Balb/c, nu/nu). El día del trasplante de las células cancerosas (Día 1), los ratones se dividieron en 30 grupos, y comenzó la administración del anticuerpo (1, 5 o 10 mg/kg de peso corporal, administración intraperitoneal). A partir de ese momento, la administración del anticuerpo continuó a intervalos de una vez cada tres días. La actividad anti tumoral se evaluó basándose en la frecuencia de formación de tumor y el volumen tumoral. El volumen tumoral se calculó con la siguiente fórmula.
35
Modelo de tratamiento
Las líneas de células de cáncer pancreático (PK-59 y BxPC-3), que expresaban hTROP-2, se retiraron tratando las 40 células con tripsina, y PBS se añadió a las mismas para preparar una suspensión celular que tenía una concentración de 1 x 108 células/ml. La suspensión celular preparada de este modo se mezcló con una cantidad igual de Matrigel (BD Biosciences Pharmingen) en hielo. Usando una jeringa de calibre 26 G, se inyectaron 100 µl de la mezcla obtenida (Balb/c, nu/nu). De cinco a seis días después del trasplante de las células cancerosas, los ratones cuyo volumen tumoral había aumentado de 50 a 150 mm3 (valor medio: aproximadamente 100 mm3) se 45 dividieron en grupos. El día en el que los ratones se dividieron en grupos se definió como un primer día (Día 1), y comenzó la administración del anticuerpo. El anticuerpo se administró por vía intraperitoneal a intervalos de una vez cada tres días (10 mg/kg de peso corporal). La actividad tumoral se evaluó midiendo el volumen tumoral. Un ensayo de diferencia significativa se realizó de acuerdo con el ensayo t de Student, y se determinó que P lt; 0,05 era estadísticamente significativo. 50
[Ejemplo 16]
[Análisis de actividad antitumoral in vivo del anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 en modelo de xenoinjerto de células de cáncer pancreático humano] 55
Es esencial que un anticuerpo usado para el tratamiento de cáncer, que tiene como diana a hTROP-2, tenga la actividad de eliminar de forma específica tejidos tumorales que expresan hTROP-2 o que inhiben el crecimiento del tumor.
60
Los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 (aproximadamente 160 clones), recién producidos en la presente invención, se evaluaron usando los modelos de tratamiento de xenoinjerto de una línea PK-59 de células de cáncer pancreático. Las células PK-59 expresan, en la superficie de las mismas, EpCAM (Figura 11A) que actúa como un marcador de células madre de cáncer pancreático (Chenwei Li, et al. Cancer Res 2007; 67: (3). 1030-1037), y que también expresan P-glicoproteína/MDR1 (Figura 11B) y ABCG2/CDw338 (Figura 11C) (Chen, C. J. et al. Cell 47 (3), 381-389 (1986), Allikmets, R., et al. Hum. Mol. Genet. 5 (10), 1649-1655 (1996)), que son transportadores de ABC asociados a resistencia a fármacos. Además, las células PK-59 contienen una fracción celular (8,93 %) (Figura 11D) positiva tanto para CD24 como para CD44, que es característico para las células madre de cáncer pancreático, y se supone que son una línea de células de cáncer pancreático humano altamente maligna (Chenwei Li, et al. Cancer 5 Res 2007; 67: (3). 1030-1037, Jane E. Visvader y Geoffrey J. Lindeman. Nat Rev Cancer. Vol. 8 (10): 755-68, 2008).
La mayoría de los aproximadamente 160 clones recién generados no presentaban efectos beneficiosos en los modelos de tratamiento de xenoinjerto de células PK-59. Entre los clones de este tipo, se pudieron obtener clones que presentan una actividad inhibitoria del crecimiento tumoral, significativa, en particular los clones K5-70, T6-16, 10 K5-107, T5-86 y K5-116-2-1.
En un grupo de administración del clon K5-70 (IgG2a de ratón), la tasa de crecimiento tumoral se inhibe de forma estadísticamente significativa. El 21er día después del inicio de la administración (día 21), el volumen tumoral de un grupo de control (N = 14) era 1200,8 ± 377,3 mm3, mientras que el volumen tumoral del grupo de administración del 15 clon K5-70 era 748,7 ± 162,9 mm3 (P lt; 0,01 mediante ensayo t de Student) (Figura 12A). Cuando el volumen tumoral en el momento del inicio de la administración del anticuerpo se definía como 1,0, el volumen tumoral en el 21er día (Día 21) era 7,8 en el grupo de administración del clon K5-70, mientras que el volumen tumoral Del grupo de control era 12,5 (Figura 12A). El peso del tumor extirpado era 0,43 ± 0,14 g (P lt; 0,01 mediante ensayo t de Student) en el grupo de administración del clon K5-70, mientras que el del grupo de control era 0,73 ± 0,26 g. Por lo tanto, el 20 clon K5-70 presentaba una actividad inhibitoria de aproximadamente un 60 % (Figura 12B).
De forma análoga, la tasa de crecimiento tumoral se inhibía de forma significativa incluso en un grupo (N = 8) de administración del clon K5-107 (IgG1 de ratón), un grupo (N = 8) de administración del clon T6-16 (IgG2a de ratón), un grupo de administración del clon T5-86 (IgG1 de ratón) y un grupo (N = 8) de administración del clon K5-116-2-1 25 (IgG2a de ratón). En el 17º día después del inicio de la administración (Día 17), los volúmenes tumorales del grupo (N = 8) de administración del clon K5-107 y el grupo (N = 8) de administración del clon T6-16 eran 698,2 ± 175,9 mm3 (P lt; 0,05 mediante ensayo t de Student) y 707,2 ± 254,5 mm3 (P lt; 0,05 mediante ensayo t de Student), respectivamente, mientras que el volumen tumoral del grupo de control era 1039,3 ± 271,6 mm3. De forma análoga, en el 16º día después del inicio de la administración (Día 16), el volumen tumoral del grupo (N = 8) de 30 administración del clon K5-116-2-1 era 508,5 ± 225,2 mm3 (P lt; 0,05 mediante ensayo t de Student), mientras que el volumen tumoral del grupo de control (N = 8) era 797,0 ± 172,9 mm3 (Figura 13).
Por otro lado, en el caso del clon T5-86, en el 15º día después del inicio de la administración (Día 15), el tumor del grupo (N = 8) de administración del clon T5-86 era 744,1 ± 289,1 mm3, mientras que el volumen tumoral del grupo de 35 control (N = 8) era 1033,2 ± 319,4 mm3. Por lo tanto, no se encontró diferencia significativa en términos de volumen tumoral. Sin embargo, en la comparación del peso del tumor, que se realizó el mismo día, el peso del tumor del grupo de administración del clon T5-86 era 0,44 ± 0,13 g (P lt; 0,05 mediante ensayo t de Student), mientras que el peso del tumor del grupo de control era 0,62 ± 0,14 g. Por lo tanto, el clon T5-86 presentaba una actividad inhibitoria significativa. 40
Además, en términos tanto de volumen tumoral como de peso del tumor, la proporción (T/C) de cada grupo de administración del clon con respecto al grupo de control el día final del experimento se muestra en la Tabla 2 que sigue a continuación. Como se muestra en la Tabla 2, cada anticuerpo del clon presentaba una actividad inhibitoria significativa (T/C = 62 % a un 72 %) en cada grupo de administración de anticuerpo del clon. 45
Tabla 2
Grupo
N (número de ratones) T/C de volumen tumoral (%) T/C de peso tumoral (%)
K5-70
14 62,3** 58,8**
K5-107
8 67,2* 65,0*
T6-16
8 68,0* 64,7*
T5-86
8 72,0 70,5*
K5-116-2-1
8 63,8* 60,5*
* P lt; 0,05, ** P lt; 0,01 (mediante ensayo t de Student)
Además, se analizó la actividad antitumoral de cada uno de los clones K5-70, T6-16 y K5-116-2-1 en los modelos de prevención de xenoinjerto de la línea PK-59 de células de cáncer pancreático. Después de finalizar la administración 50 de cada clon de anticuerpo, el crecimiento tumoral se inhibió en todos los individuos (N = 8). En el 18º día después del inicio de la administración (Día 18), el volumen tumoral del grupo de administración del clon K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) era 62,4 ± 80,4 mm3 (P lt; 0,01 mediante ensayo t de Student), mientras que el volumen tumoral del grupo de control (N = 8) era 880,8 ± 206,4 mm3. Por lo tanto, el clon K5-70 presentaba una actividad inhibitoria del crecimiento tumoral de un 92,9 %. En el 28º día después del inicio de la administración (Día 28), el volumen tumoral 55 del grupo de administración del clon T6-16 (10 mg/kg de peso corporal) era 152,4 ± 122,3 mm
10
En términos tanto de volumen tumoral como de peso del tumor, la proporción (T/C) de cada grupo de administración del clon con respecto al grupo de control el día final del experimento se muestra en la Tabla 3 que sigue a continuación. Como se muestra en la Tabla 3, una inhibición del crecimiento tumoral significativa se observaba en cada grupo de administración de anticuerpos del clon, y en particular, un efecto significativo tal como T/C = 10 % o inferior se confirmó en el grupo de administración del clon K5-70. 15
Tabla 3
Grupo
N (número de ratones) T/C de volumen tumoral (%) T/C de peso tumoral (%)
K5-70
8 7,1** 5,8**
T6-16
8 15,3** 10,5**
K5-116-2-1
8 23,2** 21,5**
** P lt; 0,01 (mediante ensayo t de Student)
El anticuerpo AR47A6.4.2 anti-TROP-2 conocido (documento de Patente de Estados Unidos N.º 7420041) ha presentado el efecto de inhibición del crecimiento tumoral, a una dosificación de 20 mg/kg, en modelos de 20 prevención de xenoinjerto usando diversas líneas de células de cáncer humano. Este anticuerpo AR47A6.4.2 anti-TROP-2 ha inhibido el crecimiento tumoral de una línea de células PL45 de cáncer pancreático en un porcentaje de casi un 100 %. Sin embargo, este anticuerpo ha presentado el efecto de inhibición tumoral en una línea de células BxPC-3 de cáncer pancreático en un porcentaje de aproximadamente un 50 %, en una línea de células PC-3 de cáncer de próstata en un porcentaje de aproximadamente un 40 %, en una línea de células MCF-7 de cáncer de 25 mama en un porcentaje de aproximadamente un 60 %, y en una línea de células Colo205 de cáncer de colon en un porcentaje de aproximadamente un 40 %. Por el contrario, el anticuerpo anti-hTROP-2 de la invención de la presente solicitud ha presentado un efecto inhibitorio del crecimiento tumoral más elevado a una dosificación de la mitad de la dosis mencionada anteriormente (10 mg/kg).
30
[Ejemplo 17]
[Análisis de actividad antitumoral en modelos de xenoinjerto (modelos de prevención y modelos de tratamiento) de la línea de células BxPC-3 de cáncer pancreático humano]
35
Al igual que en el caso del uso de los modelos de tratamiento de xenoinjerto descritos anteriormente de la línea de células de cáncer pancreático humano PK-59, se analizó la actividad antitumoral del clon K5-70 en modelos de prevención de xenoinjerto modelos de tratamiento de xenoinjerto de una línea de células BxPC-3 de cáncer pancreático humano.
40
Cuando se comparaba con un grupo de control (N = 8), el crecimiento tumoral del grupo de administración del clon K-70 se inhibía de forma significativa. En el 52º día (Día 52), el volumen tumoral del grupo de administración del clon K5-70 (N = 8) era 236,0 ± 136,4 mm3, mientras que el volumen tumoral del grupo de control (N = 8) era 616,3 ± 266,8 mm3. Por lo tanto, el clon K-70 presentaba un efecto inhibitorio del crecimiento tumoral de un 61,7 % (P lt; 0,01 mediante ensayo t de Student) (Figura 15). 45
A partir de los resultados mencionados anteriormente, llegó a ser evidente que el anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 presenta una actividad inhibitoria del crecimiento tumoral in vivo significativa en al menos dos especies de células de cáncer.
50
[Ejemplo 18]
[Actividad antitumoral dependiente de la dosis del anticuerpo anti-hTROP-2 (clon K5-70) en modelos de prevención de xenoinjerto de línea de células de cáncer pancreático que expresan hTROP-2 (células PK-59)]
55
Con el fin de analizar con más detalle la actividad inhibitoria del crecimiento tumoral in vivo del anticuerpo anti-hTROP-2, se realizó un ensayo dependiente de la dosis. Como se muestra en la Figura 16, el crecimiento tumoral de las células PK-59 se inhibía de forma dependiente de la dosis con la administración de K5-70. En el 21er día después de la administración del anticuerpo (Día 21), el volumen tumoral del grupo de control (N = 7) era 937,8 ± 295,3 mm
10
[Ejemplo 19]
[Ensayo de epítopo]
Preparación de proteína TROP-2 quimérica de ser humano/ratón 15
Un gen TROP-2 de ser humano/ratón se preparó de acuerdo con un método de PCR. Los cebadores de PCR, como se muestra a continuación, se diseñaron basándose en una secuencia genética de TROP-2 de ser humano y en una secuencia genética de TROP-2 de ratón (N.º de registro en Genbank NM_020047).
20
Cebadores TROP-2-C de ser humano/ratón
Y606 (lado directo): 5’-cctgagcctacgctgcgacgaagtggtgcg-3’ (SEQ ID NO: 10)
Y607 (lado inverso): 5’-cgcaccacttcgtcgcagcgtaggctcagg-3’ (SEQ ID NO: 11)
25
Cebadores TROP-2-A de ser humano/ratón
Y612 (lado directo): 5’-gactgctccacgctgacttccaagtgcctg-3’ (SEQ ID NO: 12)
Y613 (lado inverso): 5’-caggcacttggaagtcagcgtggagcagtc-3’ SEQ ID NO: 13)
30
Cebadores TROP-2-B de ser humano/ratón
Y614 (lado directo): 5’-ctcgtggacaacgatggcctctacgacccg-3’ (SEQ ID NO: 14)
Y615 (lado inverso): 5’-cgggtcgtagaggccatcgttgtccacgag-3’ (SEQ ID NO: 15)
35
Cebadores TROP-2-D de ser humano/ratón
Y608 (lado directo): 5’-ccaaagcctgcgctgcgatgagctggtgcgc-3’ (SEQ ID NO: 16)
Y609 (lado inverso): 5’-gcgcaccagctcatcgcagcgcaggctttgg-3’ (SEQ ID NO: 17)
40
Cebadores TROP-2-E de ser humano/ratón
Y616 (lado directo): 5’-agcttcctatccgcggtgcactacgagcag-3’ (SEQ ID NO: 18)
Y617 (lado inverso): 5’-ctgctcgtagtgcaccgcggataggaagct-3’ (SEQ ID NO: 19)
45
Cebadores TROP-2-F de ser humano/ratón
Y618 (lado directo): 5’-gacattaaaggcgagtctctattccagggc-3’ (SEQ ID NO: 20)
Y619 (lado inverso): 5’-gccctggaatagagactcgcctttaatgtc-3’ (SEQ ID NO: 21)
50
Cebadores TROP-2 de ratón
Cebador directo: 5-ctactccaccccaccctggcg-3’ (SEQ ID NO: 22)
Cebador inverso: 5’-ctcgagcaagctaggttcgcttctc-3’ (SEQ ID NO: 23)
55
Al cebador inverso TROP-2 de ratón, se añadió una secuencia digerida con enzima de restricción XhoI excepto para un codón de finalización. En la Figura 17A se muestra una vista esquemática de proteínas TROP-2 quiméricas de ser humano/ratón preparadas.
La proteína quimérica hmTROP-2-A es una proteína quimérica, que consiste en un polipéptido que varía desde el 60 extremo en la posición N-terminal con respecto al aminoácido en la posición 69 de la proteína hTROP-2 y un polipéptido que varía desde el aminoácido en la posición 64 con respecto al extremo C-terminal de la proteína TROP-2 de ratón. La proteína quimérica hmTROP-2-B es una proteína quimérica, que consiste en un polipéptido que varía desde el extremo en la posición N-terminal con respecto al aminoácido en la posición 101 de la proteína hTROP-2 y un polipéptido que varía desde el aminoácido en la posición 96 con respecto al extremo C-terminal de la 65 proteína TROP-2 de ratón. La proteína quimérica hmTROP-2-C es una proteína quimérica, que consiste en un polipéptido que varía desde el extremo en la posición N-terminal con respecto al aminoácido en la posición 145 de la proteína hTROP-2 y un polipéptido que varía desde el aminoácido en la posición 140 con respecto al extremo C-terminal de la proteína TROP-2 de ratón. La proteína quimérica mhTROP-2-D es una proteína quimérica, que consiste en un polipéptido que varía desde el extremo en la posición N-terminal con respecto al aminoácido en la posición 139 de la proteína TROP-2 de ratón y un polipéptido que varía desde el aminoácido en la posición 146 con 5 respecto al extremo C-terminal de la proteína TROP-2. La proteína quimérica mhTROP-2-E es una proteína quimérica, que consiste en un polipéptido que varía desde el extremo en la posición N-terminal con respecto al aminoácido en la posición 187 de la proteína TROP-2 de ratón y un polipéptido que varía desde el aminoácido en la posición 194 con respecto al extremo C-terminal de la proteína TROP-2. La proteína quimérica mhTROP-2-F es una proteína quimérica, que consiste en un polipéptido que varía desde el extremo en la posición N-terminal con 10 respecto al aminoácido en la posición 227 de la proteína TROP-2 de ratón y un polipéptido que varía desde el aminoácido en la posición 234 con respecto al extremo C-terminal de la proteína TROP-2.
Los vectores de expresión usados en la preparación de las proteínas quiméricas descritas anteriormente se construyeron de forma específica con los siguientes métodos. Para preparar un gen quimérico hmTROP-2-A, el gen 15 hTROP-2 se usó como un molde, y se realizó PCR usando el cebador directo hTROP-2 y el cebador Y613 TROP-2-A de ser humano/ratón. De forma análoga, el gen TROP-2 de ratón se usó como un molde, y se realizó PCR usando el cebador Y612 TROP-2-A de ser humano/ratón y el cebador inverso TROP-2 de ratón. Un fragmento de ADN amplificado con la PCR se desarrolló usando gel de acrilamida, y a continuación se recuperó una banda de interés mediante extracción. Posteriormente, los dos tipos de fragmentos de ADN extraídos se mezclaron para preparar un 20 molde, y a continuación la PCR se llevó a cabo usando el cebador directo hTROP-2 y el cebador inverso TROP-2 de ratón. Un producto de PCR se desarrolló mediante electroforesis en gel de agarosa, y a continuación se extrajo un fragmento de ADN de interés. El fragmento de ADN extraído se clonó en un vector Blunt para pCR (marca comercial registrada) (Invitrogen) (pCRB-hmTROP-2-A), y a continuación se confirmó una secuencia genética. Un vector de expresión para células animales se produjo retirando el gen hTROP-2 de pcDNA3.1-hTROP-2-myc/His mediante 25 digestión con EcoRI/XhoI, y a continuación insertando en el mismo un fragmento de EcoRI/XhoI que contenía un gen quimérico hmTROP-2-A preparado a partir de pCRB-hmTROP-2-A (pcDNA3.1-hmTROP-2-A-myc/His). Además, los siguientes genes quiméricos se prepararon con el mismo método como se ha descrito anteriormente, y se construyeron vectores de expresión: hmTROP-2-B (usando un cebador directo de TROP-2 humano, un cebador Y615 de TROP-2-B de ser humano/ratón, un cebador Y614 de TROP-2-B de ser humano/ratón y un cebador inverso 30 TROP-2 de ratón), hmTROP-2-C (usando un cebador directo de TROP-2 humano, un cebador Y607 de TROP-2-C de ser humano/ratón, un cebador Y606 de TROP-2-C de ser humano/ratón y un cebador inverso TROP-2 de ratón), mhTROP-2-D (usando un cebador inverso TROP-2 de ratón, un cebador Y609 de TROP-2-D de ser humano/ratón, un cebador Y608 de TROP-2-D de ser humano/ratón y un cebador inverso de TROP-2 humano), mhTROP-2-E (usando un cebador directo TROP-2 de ratón, un cebador Y617 de TROP-2-E de ratón/ser humano, un cebador 35 Y616 de TROP-2-E de ratón/ser humano y un cebador inverso de TROP-2 humano), mhTROP-2-F (usando un cebador directo TROP-2 de ratón, un cebador Y619 de TROP-2-F de ratón/ser humano, un cebador Y618 de TROP-2-F de ratón/ser humano y un cebador inverso TROP-2 humano) (pcDNA3.1-hmTROP-2-B-myc/His, pcDNA3.1-hmTROP-2-C-myc/His, pcDNA3.1-mhTROP-2-D-myc/His, pcDNA3.1-mhTROP-2-E-myc/His, y pcDNA3.1-mhTROP-2-F-myc/His). 40
Establecimiento de líneas de células HEK293, que expresan, de manera constitutiva, hTROP-2, proteínas quiméricas TROP-2-C de ser humano/ratón y TROP-2-D de ratón/ser humano
Cada uno de los vectores de expresión, descritos anteriormente, pcDNA3.1-hTROP-2-myc/His, pcDNA3.1-hmTROP-45 2-C-myc/His and pcDNA3.1-mhTROP-2-D-myc/His, se introdujeron en células HEK293. La selección se realizó usando un antibiótico G418 (Calbiochem), y se establecieron líneas de células HEK293 que expresan de forma constitutiva la proteína hTROP-2, la proteína quimérica hmTROP-2-C y la proteína quimérica mhTROP-2-D.
Se identificaron las regiones de unión de los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 K5-70, T5-86, K5-107, T6-4, 50 T6-16 y K5-116-2-1, que presentaban efectos beneficiosos en los modelos de tratamiento de xenoinjerto de la línea PK-59 de células de cáncer pancreático. En primer lugar, la reactividad de los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 que presentaban efectos beneficiosos con células HEK293, que expresan constantemente las proteínas quiméricas hmTROP-2-C y mhTROP-2-D, se examinó mediante análisis de FACS (Figura 18). Como resultado, se encontró que K5-70, K5-107, T5-86 y K5-116-2-1 reaccionaban con hmTROP-2-C, pero que estos anticuerpos no 55 reaccionaban con mhTROP-2-D. Por otro lado, T6-4 y T6-16 reaccionaban con mhTROP-2-D, pero no reaccionaban con hmTROP-2-C. A partir de estos resultados, la región de unión de cada uno de K5-70, K5-107, T5-84 y K5-116-2-1 se limitó a una región que variaba desde el extremo N-terminal con respecto al aminoácido en la posición 145 de hTROP-2, y la región de unión de cada uno de T6-4 y T6-16 se limitó a una región que variaba desde el aminoácido en la posición 146 con respecto al aminoácido en la posición 274 de hTROP-2 (Figura 18). 60
Para analizar las regiones de unión con más detalle, se prepararon vectores usados en la expresión de proteínas quiméricas hmTROP-2-A, hmTROP-2-B, mhTROP-2-E y mhTROP-2-F, y se analizó la reactividad de las proteínas quiméricas con los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 que presentaban efectos beneficiosos (Figura 19). Cada uno de los vectores de expresión recién preparados, que se iban a usar en la expresión de las proteínas quiméricas, 65 se introdujo en células HEK293, y a continuación se llevó a cabo un análisis de FACS, usando las células que expresaban de forma transitoria las proteínas quiméricas. K5-70, K5-107, T5-86 y K5-116-2-1 reaccionaban con hmTROP-2-A, pero no reaccionaban con mhTROP-2-B. Los 6 tipos examinados de anticuerpos monoclonales reaccionaban con hTROP-2. Estos resultados mostraban claramente que la región de unión de K5-70, K5-107, T5-86 y K5-116-2-1 está presente en una región que varía desde el extremo N-terminal con respecto al aminoácido en la posición 69 de hTROP-2. Además, no T6-4 y T6-16 reaccionaban con ninguno de mhTROP-2-E ni mhTROP-2-F. 5 Esto sugería que estos anticuerpos reconocen una región que varía desde el aminoácido en la posición 146 con respecto al aminoácido en la posición 193 de hTROP-2.
[Ejemplo 20]
10
[Inmunohistoquímica]
lt;Materiales/Métodogt;
En la inmunohistotinción se usaron las siguientes matrices de tejido normal y de cáncer. 15
Matrices de tejido normal humano:
Órganos normales, humanos por duplicado (N.º de Catálogo: AB1, Super Bio Chips)
Tejidos normales más que aplicaciones puntuales individuales (N.º de Catálogo: A103 (VI), ISU ABXIS) 20 Matrices de tejido de cáncer de pulmón:
Metástasis-normal de cáncer de pulmón humano (N.º de Catálogo: CCA3, Super Bio Chips)
Tejido de carcinoma de pulmón humano con tejido en el borde, 2 núcleos de ubicación (N.º de Catálogo: OD-CT-RsLug03-002, Shanghai Outdo Biotech) 25
Matriz de tejido de cáncer pancreático:
Tejido de carcinoma de páncreas humano con tipo monopatológico en 60 casos, 2 núcleos de ubicación (N.º de Catálogo: OD-CT-DgPan03-001, Shanghai Outdo Biotech) 30
Matrices de tejido de cáncer de hígado:
Carcinoma hepatocelular, grados I a III con controles de tejido normal, 63 casos en matrices tisulares (N.º de Catálogo: CS03-01-002U, Cybrdi) 35
Tejido de carcinoma de hígado humano con tipo monopatológico en 30 casos, 2 núcleos de ubicación (N.º de Catálogo: OD-CT-DgLiv02-002, Shanghai Outdo Biotech)
Matrices de tejido de cáncer de colon:
40
Cáncer colorrectal, humano (N.º de Catálogo: CD3, Super Bio Chips)
Carcinoma de colon humano con tejido en el borde, 2 núcleos de ubicación (N.º de Catálogo: OD-CT-DgCo103-002, Shanghai Outdo Biotech)
Matrices de tejido con metástasis de ganglios linfáticos de cáncer de colon y metástasis de hígado: 45
Cáncer colorrectal (colon y recto) con matriz de tejido de metástasis de ganglios linfáticos con emparejada, 44 casos/99 núcleos, portaobjetos de ensayo (N.º de Catálogo: CO991t, Biomax us)
Cáncer colorrectal (colon y recto) con matriz de tejido de adyacente de metástasis de ganglios linfáticos y normal emparejada, 43 casos/99 núcleos (N.º de Catálogo: CO992, Biomax us) 50
Metástasis en tejidos de cáncer de colon_hígado (N.º de Catálogo: A203 (IV), ISU ABXIS)
Matrices de tejido de cáncer de mama:
Cáncer de mama, humano-metástasis-normal (N.º de Catálogo: CBA3, Super Bio Chips) 55
Carcinoma de mama humano con tejido en el borde, 2 núcleos de ubicación (N.º de Catálogo: OD-CT-RpBre03-002, Shanghai Outdo Biotech)
Matrices de tejido de cáncer de estómago:
60
Cáncer de estómago, humano (N.º de Catálogo: CQ1, Super Bio Chips)
Carcinoma gástrico humano con tejido en el borde, 2 núcleos de ubicación (N.º de Catálogo: OD-CT-DgStm03-002, Shanghai Outdo Biotech)
Matriz de tejido de cáncer de esófago: 65
Cáncer de esófago, humano (N.º de Catálogo: CR1, Super Bio Chips)
Carcinoma de esófago humano con tejido en el borde, 2 núcleos de ubicación (N.º de Catálogo: OD-CT-DgEso03-002, Shanghai Outdo Biotech)
Matriz de tejido de cáncer de ovario: 5
Cáncer de ovario, humano (N.º de Catálogo: CJ1, Super Bio Chips)
Matriz de tejido de cáncer de próstata:
10
Cáncer de próstata, humano-normal (N.º de Catálogo: CA3, Super Bio Chips)
Matriz de tejido de cáncer de vejiga:
Carcinoma de vejiga / carcinoma de células transicionales, grados I a III con matrices de tejido normal (N.º de 15 Catálogo: CC12-01-001U, Cybrdi)
La información del paciente y la información clínica con respecto a los matrices de tejido descritas anteriormente se obtuvieron a partir de fichas de datos unidas a las mismas y en las páginas de inicio de compañías individuales.
20
Método de inmunohistotinción
Después de finalizar un tratamiento de desparafinación, los portaobjetos de matriz de tejido de tejidos normales y de tejidos de cáncer humanos se sometieron a un tratamiento de proteasa con pepsina a 37 ºC durante 5 minutos. A partir de ese momento, las secciones se usaron en inmunotinción usando un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2. 25 Una reacción de color se realizó usando DAB(3,3’-diaminobencidina) como sustrato, y como una contra tinción, a continuación se realizó tinción nuclear usando hematoxilina.
De forma más específica, estas operaciones se realizaron como sigue a continuación. Una sección embebida en parafina se sometió a un tratamiento de desparafinación, y a continuación se sometió a un tratamiento de proteasa 30 con pepsina (DAKO) a 37 ºC durante 5 minutos. Después de activar el antígeno, la sección se trató a temperatura ambiente durante 20 minutos usando una solución preparada añadiendo una solución de peróxido de hidrógeno a metanol hasta una concentración final de un 0,3 %, de modo que la actividad de peroxidasa endógena se eliminó. El producto resultante se lavó con PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos dos veces, y a continuación se bloqueó a temperatura ambiente durante 30 minutos usando una solución de PBS que contenía suero de caballo 35 normal al 1,5 % (DAKO), con el fin de realizar una operación para bloquear la unión no específica en los tejidos. Posteriormente, el producto resultante se hizo reaccionar con el clon del K5-63-17 anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 (concentración final: 10 µg/ml), que se había diluido con una solución de PBS que contenía suero de caballo normal al 1,5 %, a temperatura ambiente durante 1 hora, y a continuación se lavó con PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos tres veces. A partir de ese momento, un anticuerpo de IgG anti-ratón (Vector), que se 40 había diluido 200 veces con una solución de PBS que contenía suero de caballo normal al 1,5 %, se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos. El producto de reacción se lavó con PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos tres veces, y con reactivo del kit Vectastain ABC (Vector) se mezcló de acuerdo con el manual de instrucciones incluido en el mismo, con el fin de preparar un complejo de ABC. Este complejo de ABC se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos. El producto de reacción se lavó con PBS a temperatura 45 ambiente durante 5 minutos tres veces, y a continuación se realizó un desarrollo de color usando una solución de DAB de Tinción Simple de Sustrato de Histofina Peroxidasa (Nichirei Biosciences). Después de finalizar el desarrollo de color, el producto de reacción se lavó con agua desionizada durante 5 minutos, y el núcleo se tiño con una solución de hematoxilina de Mayer (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). A partir de ese momento, la deshidratación se realizó con alcohol, seguido de penetración con xileno y montaje en Entellan New (Merck Japón). 50
lt;Resultadosgt;
Expresión de hTROP-2 en tejidos normales humanos
55
El patrón de expresión de hTROP-2 en tejidos normales humanos se analizó usando el clon K5-63-17 del anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2. Una matriz de tejido normal humano (N.º de Catálogo: AB1, Super Bio Chips) se desparafinizó, y a continuación se sometió a tratamiento hidrófilo. A partir de ese momento, el antígeno se activó con una proteasa, pepsina, y a continuación la inmunotinción se realizó usando el clon K5-63-17 del anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 (Figura 20). Como resultado, se observó tinción en la piel, esófago, riñón (corteza y 60 médula), páncreas, próstata, vejiga y amígdalas. Una mayoría de imágenes teñidas se localizaban en la membrana celular (Figura 20A, B, C, D, F, G y H), pero la expresión de hTROP-2 se observaba parcialmente incluso en el citoplasma (Figura 20E y H). Por otro lado, una tinción de este tipo no se observaba en el corazón, hígado, estómago, intestino delgado, intestino grueso, músculo esquelético, pulmón, bazo, glándula del timo y similares (Figura 20I y J). 65
Expresión de hTROP-2 en tejidos de cáncer humano
Para examinar la expresión de hTROP-2 (tasa positiva para hTROP-2) en tejidos de cáncer humano, las matrices de tejido de cáncer de diversas especies de cáncer humano se inmunotiñeron usando el clon K5-63-17 del anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2. Una sección de tejido, en la que un 10 % o más de células cancerosas estaban teñidas, 5 se definió como positivo para hTROP-2. Los resultados de la tinción se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4
Tejidos de cáncer
Número de casos positivos para TROP-2 / número total de casos Tasa positiva para TROP-2 (%)
Cáncer de mama
32/80 40
Cáncer de pulmón
53/81 65,4
Cáncer de esófago
69/90 76,7
Cáncer de estómago
25/90 27,8
Cáncer de colon
29/178 16,3
Cáncer pancreático
26/62 41,9
Cáncer de hígado
7/92 7,61
Cáncer de vejiga
42/59 71,2
Cáncer de próstata
35/38 92,1
Cáncer de ovario
14/58 24,1
Las imágenes teñidas representativas se muestran en la Figura 21. Entre las especies de cáncer, con respecto a las 10 que se había analizado la expresión de hTROP-2, el cáncer de próstata tenía la tasa positiva más elevada (92,1 %), y también con el cáncer de pulmón (65,4 %), cáncer de esófago (76,7 %), cáncer de vejiga (71,2 %) y similares presentaban tasas positivas elevadas. El cáncer de hígado tenía la tasa positiva más baja (7,61 %). A partir de imágenes teñidas se observó que, al igual que en las células normales, hTROP-2 estaba altamente localizado en la membrana celular incluso en el caso de células cancerosas (Figura 21A a F, H e I). Además, en algunos casos 15 hTROP-2 también se localizaba en el citoplasma (Figura 21A, B, E y G).
La tasa positiva para hTROP-2 en cáncer pancreático era de un 41,9 %. La relación entre esta tasa positiva para hTROP-2 y el grado (grado de diferenciación) de cáncer pancreático se analizó. Como resultado, hTROP-2 se expresaba a frecuencia elevada en cáncer pancreático con un alto grado, en particular, con un bajo grado de 20 diferenciación (Tabla 5).
Tabla 5
26/62 aplicaciones puntuales positivas para hTROP-2 de cáncer pancreático (41,94 %)
Grado
- + Tasa positiva
I
8 0 0 %
I - II
5 0 0 %
II
19 21 52,5 %
I - III
4 5 55,6 % p lt; 0,01
total
36 26
[Ejemplo 21] 25
[Actividad antitumoral de anticuerpo K5-70 con una sola administración en modelos de prevención de xenoinjerto de la línea de células de cáncer pancreático humano PK-59]
Se presentaba una fuerte actividad antitumoral in vivo de un clon K5-70 (IgG2a de ratón) incluso con una sola 30 administración de K5-70 a una dosificación de 10 mg/kg de peso corporal con respecto a modelos de prevención de xenoinjerto usando una línea de células de cáncer pancreático humano PK-59. En un grupo de control (IgG de ratón, 10 mg/kg de peso corporal, N = 3), se observó formación de tumor en todos los individuos, y el volumen tumoral en el día 28º día después del trasplante celular (Día 28) era 781,7 ± 74,5 mm3. Por otro lado, en un grupo en el que se administró K5-70 solo una vez el día de trasplante de las células cancerosas (Día 1) (10 mg/kg de peso corporal, 35 N = 3), el volumen tumoral el Día 28 era 144,4 ± 176,9 mm
[Ejemplo 22]
10
[Actividad antitumoral de anti-TROP-2 humano anticuerpo monoclonal en modelos de tratamiento de xenoinjerto de la línea de células de cáncer de colon humano SW480]
La actividad antitumoral de cada uno de los anticuerpos monoclonales anti-TROP-2 humano (clones K5-70, K5-116-2-1, y T6-16) se examinó con modelos de tratamiento de xenoinjerto usando una línea de células de cáncer de colon 15 humano SW480. Las células SW480 (5 x 106 células) se trasplantaron por vía subcutánea en el costado derecho de cada ratón NOD-scid hembra de 6 semanas de edad (Día 1). Cuando el volumen tumoral promedio alcanzó 100 mm3, se realizó formación de grupos (Día 7 o Día 10). A partir del Día 7 o Día 10, la administración intraperitoneal del anticuerpo se realizó a intervalos de administración de una vez cada tres días. La actividad antitumoral del clon K5-70 y las actividades antitumorales de los clones K5-116-2-1 y T6-16 se evaluaron mediante 20 estudios independientes, por separado. El estudio de evaluación de la actividad antitumoral de K5-70, el volumen tumoral de un grupo de control (IgG de ratón (10 mg/kg de peso corporal), N = 8) el 44º día después del trasplante de células cancerosas (Día 44) era 365,4 ± 214,6 mm3. Por otro lado, el volumen tumoral de un grupo de administración de K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) era 27,4 ± 29,4 mm3 (P lt; 0,01 mediante ensayo t de Student), y por lo tanto, la formación del tumor se veía inhibida de forma significativa en el grupo de administración de K5-70 25 (tasa de inhibición: 92,5 %) (Figura 23A). Con respecto al peso tumoral, el peso tumoral del grupo de control era 0,11 ± 0,07 g, mientras que el peso tumoral del grupo de administración de K5-70 era 0,005 ± 0,007 (g) (P lt; 0,01 mediante ensayo t de Student), lo que muestra una tasa inhibitoria de un 95,5 % (Figura 23B). En particular, en dos de los ocho ratones individuales en el grupo de administración de K5-70, la formación de tumor estaba completamente inhibida, y la presencia de tumor no se pudo confirmar. 30
En el estudio de evaluación de las actividades antitumorales de K5-116-2-1 y T6-16, que se realizó por separado, el volumen tumoral del grupo de control el Día 42 era 713,8 ± 354,5 mm3 (N = 8). Por el contrario, el volumen tumoral del grupo de administración de K5-116-2-1 (10 mg/kg de peso corporal) era 188,9 ± 97,4 mm3 (N = 8, P lt; 0,01 mediante ensayo t de Student) (Figura 24A), y el volumen tumoral del grupo de administración de T6-16 (10 mg/kg 35 de peso corporal) era 292,8 ± 199,7 mm3 (N = 8, P lt; 0,05 mediante ensayo t de Student) (Figura 25A). Por lo tanto, los dos grupos de administración mencionados anteriormente mostraban tasas de inhibición de un 73,5 % y un 59,0 %, respectivamente. Con respecto al peso tumoral también, el peso tumoral del grupo de control era 0,39 ± 0,19 g. Por el contrario, el peso tumoral del grupo de administración de K5-116-2-1 era 0,10 ± 0,07 g (P lt; 0,01 mediante ensayo t de Student), y el peso tumoral del grupo de administración de T6-16 era 0,17 ± 0,14 g 40 (P lt; 0,05 mediante ensayo t de Student). Por lo tanto, los dos grupos de administración mencionados anteriormente presentaban tasas de inhibición de un 72,2 % y un 56,4 %, respectivamente (Figura 24B y Figura 25B).
[Ejemplo 23]
45
[Actividad antitumoral dependiente de la dosis del clon K5-70 en modelos de tratamiento de xenoinjerto usando la línea de células de cáncer de colon humano SW480]
Posteriormente, la actividad antitumoral dependiente de la dosis del clon K5-70 (IgG2a de ratón) se examinó con modelos de tratamiento de xenoinjerto usando una línea de células de cáncer de colon humano SW480. Las células 50 SW480 (5 x 106 células) se trasplantaron por vía subcutánea en el costado derecho de cada ratón NOD-scid hembra de 6 semanas de edad. Diez días después del trasplante (Día 10) momento en el que el volumen tumoral promedio alcanzó 100 mm3, los ratones se dividieron en un grupo de control (IgG de ratón, grupo de administración de 10 mg/kg de peso corporal, N = 8, 104,4 ± 17,6 mm3), un grupo de administración de K5-70 (1 mg/kg de peso corporal) (N = 8, 104,3 ± 16,1 mm3), un grupo de administración de K5-70 (5 mg/kg de peso corporal) (N = 8, 55 104.6 ± 15.9 mm3), y un grupo de administración de K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) (N = 8, 104,8 ± 14,9 mm3). A continuación, la administración intraperitoneal se realizó a intervalos de administración de una vez cada tres días. El Día 42, el volumen tumoral del grupo de control era 713,8 ± 354,5 mm3. Por otro lado, en los grupos de administración de K5-70, se observó actividad inhibitoria de la formación de tumor dependiente de la dosis. Es decir, el volumen tumoral del grupo de administración de 1 mg/kg de peso corporal era 485,0 ± 207,3 mm3 (tasa de 60 inhibición: 32,1 %), el volumen tumoral del grupo de administración de 5 mg/kg de peso corporal era 339,5 ± 253,2 mm3 (tasa de inhibición: 52,4 %), y el volumen tumoral del grupo de administración de 10 mg/kg de peso corporal era 355,4 ± 202,8 mm3 (tasa de inhibición: 50.2 %, P lt; 0,05 mediante ensayo t de Student) (Figura 26A). De forma análoga, con respecto al peso tumoral el Día 42, el peso tumoral del grupo de control era 0,39 ± 0,19 g. Por otro lado, el peso tumoral del grupo de administración de K5-70 (1 mg/kg de peso corporal) era 65 0,24 ± 0,11 g (tasa de inhibición: 37.8 %), el peso tumoral del grupo de administración de 5 mg/kg de peso corporal era 0,17 ± 0,14 g (tasa de inhibición: 55,8 %, P lt; 0,05 mediante ensayo t de Student), y el peso tumoral del grupo de administración de 10 mg/kg de peso corporal era 0,20 ± 0,13 g (tasa de inhibición: 47,1 %). Por lo tanto, se confirmó una actividad antitumoral dependiente de la dosis (Figura 26B).
[Ejemplo 24] 5
[Análisis de intervalos de administración del clon K5-70 con respecto a modelos de tratamiento xenoinjerto usando la línea de células de cáncer de colon humano SW480]
Posteriormente, para analizar los intervalos de administración óptima del clon K5-70 (IgG2a de ratón), la actividad 10 antitumoral del clon K5-70 cuando se administraba una vez a la semana (una vez cada 7 días) se examinó con modelos de tratamiento de xenoinjerto usando una línea de células de cáncer de colon humano SW480. Las células SW480 (5 x 106 células) se trasplantaron por vía subcutánea en el costado derecho de cada ratón NOD-scid hembra de 6 semanas de edad. Diez días después del trasplante (Día 10) momento en el que el volumen tumoral promedio alcanzó 100 mm3, los ratones se dividieron en un grupo de control (IgG de ratón, grupo de administración de 10 15 mg/kg de peso corporal, N = 8, 104,4 ± 17,6 mm3) y un grupo de administración de K5-70 (10 mg/kg de peso corporal, una vez a la semana) (N = 8, 104,3 ± 16,1 mm3). A continuación, la administración intraperitoneal se realizó una vez cada 7 días. El Día 42, el volumen tumoral del grupo de control era 713,8 ± 354,5 mm3, mientras que el volumen tumoral del grupo de administración de K5-70 (una vez a la semana) era 323,3 ± 239,9 mm3 (tasa de inhibición: 55 %, P lt; 0,05 mediante ensayo t de Student) (Figura 27A). Además, cuando el intervalo de 20 administración se aumentaba a una vez cada 10 días y a una vez cada dos semanas, el volumen tumoral del grupo de control el Día 39 era 956,9 ± 367,8 mm3. Por otro lado, el volumen tumoral del grupo de administración de K5-70 (Administrado una vez cada 10 días) el Día 39 era 525,4 ± 180,6 mm3 (tasa de inhibición: 45,1 %, P lt; 0,01 mediante ensayo t de Student), y el volumen tumoral del grupo de administración de K5-70 (administrado una vez cada 14 días) era 459,4 ± 217,6 mm3 (tasa de inhibición: 52,0 %, P lt; 0,01 mediante ensayo t de Student) (Figura 27B). En 25 las técnicas anteriores (documentos de patente US 7420040 y US 7420041), cuando los anticuerpos se administraban a modelos de tratamiento de xenoinjerto usando una línea de células de cáncer pancreático (BxPC-3) a una dosificación de 20 mg/kg de peso corporal, tres veces a la semana (a intervalos de administración de 2 días), los anticuerpos presentaban actividad antitumoral a una tasa de inhibición de un 50 % a un 60 %. Por el contrario, el anticuerpo K-70 presentaba una actividad antitumoral equivalente a las de las técnicas anteriores, a una dosificación 30 de la mitad de las de las técnicas anteriores (10 mg/kg de peso corporal), una vez cada 2 semanas (a intervalos de administración de 12 días). Si se tienen en cuenta una dosificación individual e intervalos de administración, llega a ser evidente que el anticuerpo K5-70 presentaba una actividad antitumoral significativa a una dosificación total de al menos una doceava parte de las de las técnicas anteriores.
35
[Ejemplo 25]
[Actividad antitumoral dependiente de la dosis del clon T6-16 en modelos de tratamiento de xenoinjerto usando la línea de células de cáncer de colon humano SW480]
40
Posteriormente, la actividad antitumoral dependiente de la dosis del clon T6-16 (IgG2a de ratón) se examinó con modelos de tratamiento de xenoinjerto usando una línea de células de cáncer de colon humano SW480. Las células SW480 (5 x 106 células) se trasplantaron por vía subcutánea en el costado derecho de cada ratón NOD-scid hembra de 6 semanas de edad. Diez días después del trasplante (Día 10) momento en el que el volumen tumoral promedio alcanzó 100 mm3, los ratones se dividieron en un grupo de control (IgG de ratón, grupo de administración de 10 45 mg/kg de peso corporal, N = 8, 105,8 ± 9,9 mm3), un grupo de administración de T6-16 (1 mg/kg de peso corporal) (N = 8, 104,4 ± 13,3 mm3), un grupo de administración de T6-16 (5 mg/kg de peso corporal) (N = 8, 104,7 ± 13,0 mm3), y un grupo de administración de T6-16 (10 mg/kg de peso corporal) (N = 8, 104,8 ± 12,4 mm3). A continuación, la administración intraperitoneal se realizó a intervalos de administración de una vez cada tres días. El Día 43, el volumen tumoral del grupo de control era 473,5 ± 137,0 mm3. Por otro lado, en los grupos de 50 administración de T6-16, se observó actividad inhibitoria de la formación de tumor dependiente de la dosis. Es decir, el volumen tumoral del grupo de administración de 1 mg/kg de peso corporal era 397,9 ± 97,5 mm3 (tasa de inhibición: 16,0 %), el volumen tumoral del grupo de administración de 5 mg/kg de peso corporal era 195,9 ± 89,7 mm3 (tasa de inhibición: 58,7 %, P lt; 0,01 mediante ensayo t de Student), y el volumen tumoral del grupo de administración de 10 mg/kg de peso corporal era 190,2 ± 56,5 mm3 (tasa de inhibición: 59,8 %, P lt; 0,01 55 mediante ensayo t de Student) (Figura 28A). De forma análoga, con respecto al peso tumoral el Día 43, el peso tumoral del grupo de control era 0,19 ± 0,07 g. Por otro lado, el peso tumoral del grupo de administración de T6-16 (1 mg/kg de peso corporal) era 0,20 ± 0,08 g, el peso tumoral del grupo de administración de 5 mg/kg de peso corporal era 0,08 ± 0,04 g (tasa de inhibición: 57,9 %, P lt; 0,01 mediante ensayo t de Student), y el peso tumoral del grupo de administración de 10 mg/kg de peso corporal era 0,09 ± 0,04 g (tasa de inhibición: 52,6 %, P lt; 0,01 mediante 60 ensayo t de Student). Por lo tanto, se confirmó una actividad antitumoral dependiente de la dosis (Figura 28B).
[Ejemplo 26]
[Análisis de intervalos de administración del clon T6-16 con respecto a modelos de tratamiento de xenoinjerto 65 usando la línea de células de cáncer de colon humano SW480]
Posteriormente, para analizar los intervalos de administración óptima del clon T6-16 (IgG2a de ratón), la actividad antitumoral del clon T6-16 cuando se administraba a intervalos de administración de una vez a la semana (una vez cada 7 días) y una vez cada 10 días se examinó con modelos de tratamiento de xenoinjerto usando una línea de células de cáncer de colon humano SW480. Las células SW480 (5 x 106 células) se trasplantaron por vía subcutánea en el costado derecho de cada uno de los ratones NOD-scid hembra de 6 semanas de edad. Diez días 5 después del trasplante (Día 10) momento en el que el volumen tumoral promedio alcanzó 100 mm3, los ratones se dividieron en un grupo de control (IgG de ratón, grupo de administración de 10 mg/kg de peso corporal, N = 8, 105,8 ± 9,9 mm3), un grupo de administración de T6-16 (10 mg/kg de peso corporal, una vez a la semana) (N = 8, 105,0 ± 11,6 mm3), un grupo de administración de T6-16 (10 mg/kg de peso corporal, una vez cada 10 días) (N = 5, 130,8 ± 2,4 mm3). A continuación, la administración comenzó. El Día 43, el volumen tumoral del grupo de control era 10 473,5 ± 137,0 mm3. Por otro lado, el volumen tumoral del grupo de administración de T6-16 (una vez a la semana) era 243,7 ± 65,3 mm3 (tasa de inhibición: 48,5 %, P lt; 0,01 mediante ensayo t de Student), y el volumen tumoral del grupo de administración de T6-16 (una vez cada 10 días) era 297,8 ± 54,4 mm3 (tasa de inhibición: 37,1 %, P lt; 0,05 mediante ensayo t de Student) (Figura 29). En las técnicas anteriores (documentos de patente US 7420040 y US 7420041), cuando los anticuerpos se administraban a modelos de tratamiento de xenoinjerto usando una línea de 15 células de cáncer pancreático (BxPC-3) a una dosificación de 20 mg/kg de peso corporal, tres veces a la semana (a intervalos de administración de 2 días), los anticuerpos presentaban actividad antitumoral a una tasa de inhibición de un 50 % a un 60 %. Por el contrario, se encontró que el anticuerpo T6-16 presentaba una actividad antitumoral significativa, cuando se administraba a una dosificación de la mitad de las de las técnicas anteriores una vez cada 10 días (a intervalos de administración de 8 días). Si se tienen en cuenta una dosificación individual e intervalos de 20 administración, llega a ser evidente que el anticuerpo T6-16 presentaba una actividad antitumoral significativa a una dosificación total de al menos una octava parte de las de las técnicas anteriores.
[Ejemplo 27]
25
[Análisis de actividad antitumoral del clon K5-70 en modelos de prevención de xenoinjerto usando la línea de células de cáncer de próstata humano DU-145]
La actividad antitumoral del clon K5-70 en el cáncer de próstata humanos se evaluó con modelos de prevención de xenoinjerto usando células DU-145 (Banco de Células RIKEN, RCB2143). Las células DU-145 (5 x 106 células) se 30 trasplantaron por vía subcutánea en cada uno de los ratones atímicos hembra de 6 semanas de edad (Balb/c, nu/nu). El día en el que se realizó el trasplante se definió como Día 1. Los ratones se dividieron en un grupo de control (N = 8) y un grupo de administración de K5-70 (N = 8). A partir del Día 1, K-70 se administró por vía intraperitoneal a los ratones a una frecuencia de una vez cada 3 días a una dosificación de 10 mg/kg de peso corporal. El Día 40, el volumen tumoral del grupo de control era 368,2 ± 307,8 mm3. Por otro lado, el volumen 35 tumoral del grupo de administración de K5-70 era 30,6 ± 29,6 mm3 (P lt; 0,05 mediante ensayo t de Student), lo que muestra una actividad inhibitoria de la formación del tumor de aproximadamente un 90 % (Figura 30A). Con respecto al peso tumoral, además se observó una actividad antitumoral significativa. El peso tumoral del grupo de control el Día 40 era 0,18 ± 0,18 g. Por el contrario, en el grupo de administración de K5-70, los tumores desaparecieron de los 8 Ratones individuales, y por lo tanto, la formación de tumor estaba completamente inhibida (Figura 30B). A partir de 40 los resultados mencionados anteriormente, llegó a ser evidente que el clon K5-70 del anticuerpo monoclonal anti-TROP-2 humano muestra una fuerte actividad antitumoral incluso en el cáncer de próstata humano.
[Ejemplo 28]
45
[Actividad inhibitoria de la metástasis del clon K5-70 en modelos de metástasis de hígado usando la línea de células de cáncer pancreático humano PK-59]
La metástasis del cáncer es un factor importante que influye en el pronóstico clínico en el tratamiento del cáncer gastrointestinal. El control de la metástasis es, de forma terapéutica, significativamente importante. Si se pudiera 50 suprimirlo solamente la formación de tumores sino también la metástasis del cáncer a otros órganos mediante la administración de un anticuerpo para uso en terapia para el cáncer que se dirigiera a TROP-2, se podría anticipar una utilidad clínica. Por lo tanto, esta es una propiedad deseada como un anticuerpo terapéutico para el cáncer.
La expresión de TROP-2 se confirmó en muchos tipos de carcinomas. Se informó que TROP-2 se expresaba a un 55 nivel particularmente elevado en focos de metástasis (Br. J. Cancer (2008); 99: 1290-1295, Clin. Cancer Res. (2006); 12: 3057-3063, Mod. Pathol. (2008); 21: 186-191). Además, también se informó que, cuando las células cancerosas introducidas en el gen Trop-2 se trasplantaba en ratones atímicos a través de administración transesplénica o transpancreática, la incidencia de metástasis en hígado aumentaba (documento WO 2010/089782, Molecular Cancer (2010); 9: 253), y por lo tanto, el informe sugería la importancia de TROP-2 en el proceso de metástasis del cáncer. 60 Sin embargo, hasta la fecha, no ha habido informes que describan de forma específica que un anticuerpo que se dirija a TROP-2 tenga acción inhibitoria de la metástasis in vivo.
El clon K5-70 del anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2, que se descubrió con la presente invención, presenta efectos terapéuticos elevados en modelos de xenoinjerto, en la hipodermis de la que se habían trasplantado células 65 de cáncer pancreático. Mediante un ensayo de raspado realizado in vitro se demostró que el anticuerpo K5-70 era capaz de suprimir la capacidad de migración de las células de cáncer pancreático PK-59, además de realizar una supresión del crecimiento de las células cancerosas. Por lo tanto, se consideró que el anticuerpo K5-70 podía inhibir la metástasis del cáncer in vivo. por lo tanto, se examinó el efecto de inhibición de la metástasis de un anticuerpo monoclonal de ratón anti-hTROP-2, usando modelos en los que las células de cáncer pancreático PK-59 se inyectaban en el bazo de ratones atímicos de modo que se desarrolló metástasis de hígado. 5
Una línea de células de cáncer pancreático (PK-59) que expresan hTROP-2 de forma endógena se recogió mediante tratamiento con tripsina, y a continuación se preparó una suspensión de 2 x 107 células/ml con PBS. La suspensión celular se conservó en hielo hasta el trasplante. Cada ratón atímico hembra de 6 o 7 semanas de edad (Balb/c, nu/nu) se anestesia mediante administración intraperitoneal de pentobarbital, y de 10 a 15 mm del costal izquierdo 10 de los mismos se extirpó con anestesia. El bazo se retiró de la cavidad abdominal, y a continuación se inyectaron 50 µl de la suspensión celular (1 x 106 células) en el bazo usando una jeringa de calibre 26G. Cuatro minutos después de la inyección de las células, el hilio del bazo se suturó con suturas de seda de 5-0, y a continuación el bazo se extirpó. El peritoneo cortado se cerró con suturas de seda de 5-0, y el sitio quirúrgico se cerró a continuación con Clips para Heridas (AUTOCLIP 9 mm, Becton Dickinson). El día antes del trasplante de células cancerosas, los 15 ratones se dividieron en grupos. Un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 (K5-70) o un anticuerpo de control (IgG de ratón purificada) se administró por vía intraperitoneal a ratones a una dosificación de 10 mg/kg de peso corporal. Además, siete días después del trasplante de células cancerosas, un anticuerpo de este tipo se administró de la misma manera como se ha descrito anteriormente. De cuatro a seis semanas después del trasplante de células cancerosas, los ratones se sometieron a eutanasia mediante dislocación cervical. A continuación, el hígado se 20 extirpó de cada ratón, y se confirmó la presencia o ausencia de focos metastásicos.
En el grupo de control en el que la IgG de ratón se administraba a los ratones, en 4 de los 6 ratones en los que se habían trasplantado células PK-59, se observaron focos metastásicos aparentes (de 2 a 7 focos) alrededor del lóbulo del hígado de cuatro a seis semanas después del trasplante (Figura 31A, incidencia de metástasis: 67 %, Tabla 6). 25 Por el contrario, en cuatro ratones en el grupo de administración de K5-70, en los que también se habían trasplantado células PK-59, los focos metastásicos de este tipo no se observaban en el hígado de ninguno de los ratones, y por lo tanto, una incidencia de metástasis era de un 0 % (Figura 31B, Tabla 6).
Tabla 6 30
Efecto de supresión de metástasis del clon K5-70 en modelos de metástasis de hígado producido por trasplante transesplénico de células PK-59 en ratones atímicos
Grupo de administración
Semanas después del trasplante N.º del individuo Número de focos metastásicos Determinación de metástasis
Grupo de control
4W C-1 0 -
Grupo de control
4W C-2 5 ++
6W C-3 7 ++
6W C-4 7 ++
6W C-5 2 +
6W C-6 0 -
Número promedio de focos metastásicos 3,5 Incidencia de metástasis 67 %
Grupo de
4W K-1 0
administración de
6W K-2 0
K5-70
6W K-3 0
6W K-4 0
Número promedio de focos metastásicos 0 Incidencia de metástasis 0 %
A partir de estos resultados, llegó a ser evidente que el anticuerpo K5-70 anti-hTROP-2 tiene una acción inhibitoria extremadamente fuerte en la metástasis de hígado en las células de cáncer pancreático PK-59.
[Ejemplo 29]
[Actividad antitumoral del anticuerpo K5-70 en modelos de xenoinjerto usando la línea de células de cáncer de colon SW480, que son modelos de cáncer recurrente después de administración de clorhidrato de irinotecán]
5
En los últimos años, muchos fármacos quimioterapéuticos para suprimir el crecimiento de células cancerosas se han desarrollado como fármacos terapéuticos. Estos fármacos han conseguido ciertos resultados en el tratamiento. Sin embargo, estos fármacos quimioterapéuticos han sido problemáticos en términos de efectos secundarios asociados con la acción sucesora del crecimiento de las mismas en células normales en vez de en células cancerosas y la recurrencia del cáncer después de suspensión del tratamiento. Por consiguiente, si se pudiera suprimir la recurrencia 10 tumoral después de finalizar el tratamiento con fármacos quimioterapéuticos Mediante administración de un anticuerpo terapéutico para el cáncer dirigido contra TROP-2, se podrían anticipar utilidades clínicas elevadas. Por lo tanto, se trata de una propiedad deseada como un anticuerpo terapéutico para el cáncer.
Como agentes terapéuticos para el cáncer de colon, además de fármacos que contienen 5-FU y platino, 15 recientemente se ha aplicado clorhidrato de irinotecán (Topotecin, Daiichi Sankyo Co., Ltd.) a sitios clínicos, que tiene un efecto inhibitorio de topoisomerasa. Con respecto a modelos animales también, también se informado del efecto antitumoral del clorhidrato de irinotecán en modelos de ratón, en los se habían trasplantado diversos tipos de células de tumorales humanas incluyendo cáncer de colon como un ejemplo habitual (Cancer Chemother Pharmacol. (1991); 28 (3): 192-8). Por lo tanto, el efecto de prevención de la recurrencia del clon K5-70 del 20 anticuerpo anti-hTROP-2 (IgG2a de ratón) en rumor recurrente después de administración de clorhidrato de irinotecán se ha examinado con modelos de xenoinjerto usando una línea de células de cáncer de colon humano SW480. Las células SW480 (5 x 106 células) se trasplantaron por vía subcutánea en el costado derecho de ratones NOD-scid hembra de 8 semanas de edad. Once días después del trasplante (Día 11) momento en el que el volumen tumoral promedio alcanzó 100 mm3, los ratones se dividieron en un grupo sin tratamiento (grupo de administración 25 de solución salina normal, N = 8, 130,7 ± 16,2 mm3) y un grupo de administración de clorhidrato de irinotecán (CPT-11, Topotecin, Daiichi Sankyo Co., Ltd.) (N = 16, 123,0 ± 21,4 mm3). A partir de ese momento, el clorhidrato de irinotecán se administró por vía intraperitoneal a los ratones a una dosificación de 40 mg/kg de peso corporal, una vez cada 3 días, 3 veces en total (Días 11, 14, y 17). El tercer día después de la administración final de clorhidrato de irinotecán (Día 20), el volumen tumoral del grupo sin tratamiento alcanzó 232,1 ± 21,1 mm3. Por otro lado, el 30 volumen tumoral del grupo de administración de clorhidrato de irinotecán era 126,6 ± 26,6 mm3 (P lt; 0,01 con el ensayo t de Student), y por lo tanto, se observó un efecto de supresión tumoral aparente. En esta etapa, el grupo de administración de clorhidrato de irinotecán se dividió en dos grupos basándose en el tamaño del tumor. Un grupo se definió como un grupo de administración de K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) (N = 8, volumen tumoral el Día 20: 126,0 ± 28,0 mm3), y el otro grupo se definió como un grupo de administración de IgG de ratón (10 mg/kg de peso 35 corporal) (N = 8, tamaño del tumor el Día 20: 127,2 ± 27,0 mm3). La administración intraperitoneal y la medición del volumen tumoral se realizaron en cada grupo una vez cada 3 días, de modo que se evaluó la recurrencia del tumor (Figura 32). En el grupo de administración de IgG de ratón desde el 18º día después de la administración final de clorhidrato de irinotecán (Día 35), se observaron varios ratones que tenían un tumor recurrente aparente con volumen tumoral superior a 300 mm3. En el 30º día después de la administración final de clorhidrato de irinotecán 40 (Día 47), se observó un tumor con un volumen tumoral superior a 300 mm3 en 5 de los 8 ratones (volumen tumoral promedio: 401,7 ± 172,7 mm3). Por el contrario, en el grupo de administración de K5-70, la recurrencia del tumor se suprimía de forma significativa, y el volumen tumoral promedio era 180,5 ± 142,1 mm3 (P lt; 0,05 mediante ensayo t de Student) (Figura 32). En particular, en el grupo de administración de K5-70, el volumen tumoral el Día 47 llevó a ser más pequeño que el volumen tumoral cuando los ratones se dividieron en grupos (126,0 ± 28,0 mm3). El 45 volumen tumoral llegó a ser inferior a 100 mm3 en 4 de los 8 ratones. A partir de estos resultados, llegó a ser evidente que el anticuerpo K5-70 anti-hTROP-2 tenía una acción supresora extremadamente fuerte incluso en el tumor recurrente después de la administración de clorhidrato de irinotecán.
[Ejemplo 30] 50
[Formación de mapas de epítopos usando tecnología CLIPS]
lt;Materiales y métodos gt;
55
Síntesis de péptidos
Los péptidos lineales 15-mer y 30-mer obtenidos a partir de dominios extracelulares de TROP-2, que se usaron en el presente experimento, se obtuvieron mediante síntesis en fase sólida de acuerdo con un método de Fmoc (9-Fluorenilmetoxicarbonilo). Además, para análisis de epítopo discontinuo, se sintetizó un péptido 17-mer obtenido a 60 partir de un dominio extracelular de TROP-2, a cuyos extremos se habían añadido restos de cisteína, y una conformación con una o dos estructuras de lazo se reconstruyó mediante tecnología CLIPS (Tecnología de Péptidos Químicamente unidos en Armazones). Cuando otro resto de cisteína estaba presente cerca del resto de cisteína añadido, éste se sustituía con alanina.
65
5034 tipos de los péptidos sintetizados estaban unidos covalentemente a tarjetas PEPSCAN (455 péptidos/tarjeta), y la unión de los péptidos sintetizados a anticuerpos se analizó a continuación con el método de ELISA. Se permitió que las tarjetas PEPSCAN reaccionaran con anticuerpos monoclonales anti-TROP-2 humano (K5-70, K5-107, K5-5 116-2-1, T5-86, y T6-16) que se habían diluido hasta una concentración de 1 µg/ml con un tampón de bloqueo (un tampón fosfato que contenía suero de caballo al 4 %, ovoalbúmina al 5 %, Tween al 1 %). Después de del lavado, se permitió que el producto reaccionara con un complejo de peroxidasa-anticuerpo secundario diluido 1000 veces a 25 ºC durante 1 hora. Después del lavado, a la solución de reacción se le añadió una solución de sustrato (una solución que contenía sulfonato de 2,2’-azino-di-3-etilbenzotiazolina (ABTS) y 2 µl de solución de peróxido de 10 hidrógeno al 3 %), seguido de una reacción cromogénica durante 1 hora. La actividad de unión de los anticuerpos se cuantificó mediante fotografía con una cámara CCD y a continuación realizando un análisis de imágenes.
lt;Resultadosgt;
15
Los anticuerpos monoclonales anti-TROP-2 humano, K5-70, K5-107, K5-116-2-1, T5-86 y T6-16, que presentaban efectos beneficiosos, se sometieron a análisis de epítopos usando tecnología CLIPS (Péptidos Químicamente Unidos en Armazones). Se debe indicar que la expresión quot;número del aminoácidoquot; se usa en los presentes ejemplos para hacer referencia al número del aminoácido en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 (proteína hTROP-2 (323 restos de aminoácido)). 20
El resultado del análisis para el anticuerpo K5-70 se muestra en la Tabla 7 que sigue a continuación. Como resultado, se encontró que 33 péptidos presentaban una fuerte actividad de unión con respecto al anticuerpo K5-70. En estos 33 péptidos, una secuencia que comprendía VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD (números de aminoácidos 43-65) ((péptidos N.os 1-7 y 9 en la Tabla 7), una secuencia que comprendía HHILIDLRHRPTAG 25 (números de aminoácidos 152-165) ((péptidos N.os 14, 22-25, 28, 29, 31 y 33 en la Tabla 7), una secuencia que comprendía VHYEQPTIQIELRQ (números de aminoácidos 193-206) ((péptidos N.os 8, 10, 12, 13, 15, 18, 20, 21, 23, 26, 28, 30 y 32 en la Tabla 7), y una secuencia que comprendía DLDAELRRLFRER (números de aminoácidos 171-183) ((péptidos N.os 11, 12, 14, 16, 18, 19, 21, 22, 25, 29 y 31 en la Tabla 7) aparecieron repetidamente. El anticuerpo K5-70 se unía de forma particularmente fuerte a la secuencia que comprende 30 VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD. A partir de estos resultados, se sugirió que, en la proteína hTROP-2, es probable que los 4 tipos mencionados anteriormente de regiones de secuencias específicas sea epítopos del anticuerpo K5-70.
Tabla 7 35
Unión del anticuerpo K5-70 a péptidos CLIPS obtenidos a partir de dominios extracelulares de TROP-2 humano
número
péptido unión de K5-70
1
NKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCST 2742
2
TVCSPDGPGSRCQCRALSSGMAVDCSTLTS 2604
3
TNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCS 2562
4
MTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLT 2402
5
KMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTL 1770
6
PTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDC 1391
7
VCSFDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLTSK 932
8
CAAVHYEQPTIQIELRCAAVHYEQPTIQIELRC 876
9
CPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD 839
10
CVHYEQPTIQIELRQNCVHYEQPTIQIELRQNC 825
11
HSDLDAELRRLFRERCHSDLDAELRRLFRERC 725
12
RLFRERYRLHPKFVAAVHYEQPTIQIELRQ 687
13
AVHYEQPTIQIELRQ 642
14
CAGAFNHSDLDAELRRCHHILIDLRHRPTAGAC 624
15
CPKFVAAVHYEQPTIQCGLDLRVRGEPLQVERC 579
16
CHSDLDAELRRLFRERCGLD 538
17
FQGRGGLDLRVRGEP 538
Unión del anticuerpo K5-70 a péptidos CLIPS obtenidos a partir de dominios extracelulares de TROP-2 humano
número
péptido unión de K5-70
18
CVHYEQPTIQIELRQNCDLDAELRRLFRERYRC 524
19
CHSDLDAELRRLFRERCRGE 519
20
CTIQIELRQNTSQKAACVHYEQPTIQIELRQNC 513
21
CVHYEQPTIQIELRQNCHSDLDAELRRLFRERC 511
22
CHHILIDLRHRPTAGACHSDLDAELRRLFRERC 489
23
CHHILIDLRHRPTAGACVHYEQPTIQIELRQNC 489
24
CHHILIDLRHRPTAGACGLDLRVRGEPLQVERC 488
25
CDAELRRLFRERYRLHCDELVRTHHILIDLRHC 483
26
CVHYEQPTIQIELRQNC 483
27
CAFNHSDLDAELRRLFCVHYEQPTIQIELRQNC 478
28
CVHYEQPTIQIELRQNCHHILIDLRHRPTAGAC 473
29
CDLDAELRRLFRERYRCDELVRTHHILIDLRHC 472
30
VHYEQPTIQIELRQNCGLDLRVRGEPLQVERC 470
31
CDELVRTHHILIDLRHCDLDAELRRLFRERYRC 469
32
AVHYEQPTIQIELRQCAVHYEQPTIQIELRQC 468
33
CHSDLDAELRRLFRERCDELVRTHHILIDLRHC 466
El resultado del análisis para el anticuerpo K5-107 se muestra en la Tabla 8 que sigue a continuación. Como resultado, se encontró que una secuencia que comprende VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD (números de aminoácidos 43-65) estaba contenida en 10 de los 20 péptidos (péptidos N.os 1-6, 8, 13,14 y 17 en la Tabla 8) (Tabla 8). 5
Por consiguiente, se sugirió que, en la proteína hTROP-2, la región de la secuencia peptídica mencionada anteriormente que consiste en VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD puede ser un epítopo del anticuerpo K5-107.
Tabla 8 10
Unión del anticuerpo K5-107 a péptidos CLIPS obtenidos a partir de dominios extracelulares de TROP-2 humano
número
péptido unión de K5-107
1
TNKMTVCSPDGPGG RCQCRALGSG MAVDCS 2763
2
NKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCST 2761
3
KMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTL 2752
4
MTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLT 2726
5
CPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD 2723
6
TVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLTS 2720
7
TCPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAV 2716
8
VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLTSK 2689
9
CSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLTSKC 2655
10
CTCPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMA 2655
11
NCTCPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGM 2207
12
DNCTCPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSG 1816
13
TNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCS 1525
14
CTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDASTLTSKC 1118
Unión del anticuerpo K5-107 a péptidos CLIPS obtenidos a partir de dominios extracelulares de TROP-2 humano
número
péptido unión de K5-107
15
QDNCTCPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGS 874
16
SPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLTSKCL 561
17
CTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDASTC 380
18
TVCSPDGPGGRCQCR 312
19
CAPKNARTLVRPSEHACARTLVRPSEHALVDNC 284
20
HSDLDAELRRLFRERCHSDLDAELRRLFRERC 272
El resultado del análisis para el anticuerpo K5-116-2-1 se muestra en la Tabla 9 que sigue a continuación. En este análisis, tres tipos de secuencias específicas, en particular, una secuencia que comprendía VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD (números de aminoácidos 43-65) ((péptidos N.os 1-7, 15 y 25 en la Tabla 9), una secuencia que comprendía HHILIDLRHRPTAG (números de aminoácidos 152-165) ((péptidos N.os 8-11, 16, 17, 5 19, 20, 22-24, y 27-29 en la Tabla 9), y una secuencia que comprendía DLDAELRRLFRER (números de aminoácidos 171-183) ((péptidos N.os 11-14, 17, 19, 21, 23 y 29 en la Tabla 9) aparecían varias veces (Tabla 9). Por consiguiente, se sugirió que, en la proteína hTROP-2, estos tres tipos de relaciones de secuencia peptídica puedan ser epítopos del anticuerpo K5-116-2-1.
10
Tabla 9
Unión del anticuerpo K5-116-2-1 a péptidos CLIPS obtenidos a partir de dominios extracelulares de TROP-2 humano
número
péptido unión de K5-116-2-1
1
TVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLTS 2672
2
NKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCST 2613
3
TNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCS 2482
4
MTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLT 2440
5
KMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTL 2423
6
CPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD 2136
7
PTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAV DC 1723
8
CAGAFNHSDLDAELRRCHHILIDLRHRPTAGAC 1643
9
CTHHILIDLRHRPTAGC 1586
10
CVHYEQPTIQIELRQNCHHILIDLRHRPTAGAC 1504
11
CHHILIDLRHRPTAGCHSDLDAELRRLFRERC 1475
12
HSDLDAELRRLFRERCHSDLDAELRRLFRERC 1467
13
CDAELRRLFRERYRLHCHSDLDAELRRLFRERC 1462
14
CDAELRRLFRERYRLHCPK 1442
15
VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLTSK 1432
16
DLSLRCDELVRTHHILIDLRHRPTAGAFNH 1421
17
CDELVRTHHILIDLRHCDLDAELRRLFRERYRC 1392
18
CFQGRGGLDLRVRGEPC 1376
19
CDAELRRLFRERYRLHCDELVRTHHILIDLRHC 1366
20
CGLDLRVRGEPLQVERCHHILIDLRHRPTAGAC 1342
21
CHSDLDAELRRLFRERCHSDLDAELRRLFRERC 1331
22
CDELVRTHHILIDLRHCHHILIDLRHRPTAGAC 1323
23
CDAELRRLFRERYRLHCDELVRTHHILIDLRHC 1266
Unión del anticuerpo K5-116-2-1 a péptidos CLIPS obtenidos a partir de dominios extracelulares de TROP-2 humano
número
péptido unión de K5-116-2-1
24
CHHILIDLRHRPTAGACRGEPLQVERTLIYYLC 1229
25
CSPDGPGGRCQCRAL 1227
26
CTVASPDGPGGRAQARACVHYEQPTIQIELRQNC 1223
27
CHHILIDLRHRPTAGACVHYEQPTIQIELRQNC 1222
28
LSLRCDELVRTHHILIDLRHRPTAGAFNHS 1220
29
CDELVRTHHILIDLRHCHSDLDAELRRLFRERC 1205
Los resultados de los análisis de los anticuerpos T5-86 y T6-16 se muestran en la Tabla 10 y en la Tabla 11 que siguen a continuación, respectivamente. En estos análisis, los anticuerpos se unían fuertemente a un péptido que comprendía una secuencia que consiste en DPEGRFKAR-QCN (números de aminoácidos 109-120). La secuencia peptídica mencionada anteriormente estaba comprendida en 22 de los 26 péptidos que se unen al anticuerpo T5-86 5 ((péptidos N.os 1-3, 5-8, 10-13, 15-19, y 21-26 en la Tabla 10), y estaba comprendida en 4 de los 26 péptidos que se unen al anticuerpo T6-16 (péptidos N.os 1, 2, 9 y 13 en la Tabla 11) (Tabla 10 y Tabla 11). Además, en el análisis con respecto al anticuerpo T5-86, una secuencia distinta a la que comprendía DPEGRFKARQCN (números de aminoácidos 109-120), una secuencia que comprendía VCSPDGPGGRCQCR (números de aminoácidos 43-56) ((péptidos N.os 4, 14 and 20 en la Tabla 10) aparecía varias veces. Además, también en el análisis con respecto al 10 anticuerpo T6-16, otra secuencia que comprendía HHILIDLRHRPTAG (números de aminoácidos 152-165) ((péptidos N.os N.º 4-8, 10-12, 19, 21, 23, 25 y 26 en la Tabla 11) se encontró varias veces. Por consiguiente, se sugirió que, en la proteína hTROP-2, dos tipos de regiones de secuencia peptídica, en particular, DPEGRFKARQCN (números de aminoácidos 109-120) y VCSPDGPGGRCQCR (números de aminoácidos 43-56), pueden ser epítopo del anticuerpo K5-86. También se sugirió que, en la proteína hTROP-2, dos tipos de reacciones de secuencia peptídica, en 15 particular, DPEGRFKARQCN (números de aminoácidos 109-120) y HHILIDLRHRPTAG (números de aminoácidos 152-165), pueden ser epítopos del anticuerpo T6-16.
Tabla 10
Unión del anticuerpo T5-86 a péptidos CLIPS obtenidos a partir de dominios extracelulares de TROP-2 humano
número
péptido unión de T5-86
1
CYDPDADPEGRFKARQCADPEGRFKARQANQTC 2306
2
PDCDPEGRFKARQCN 2292
3
CADPEGRFKARQANCPDADPEGRFKARQANC 2287
4
VCSPDGPGGRCQCRA 2263
5
CYDPDADPEGRFKARQCPDADPEGRFKARQANC 2260
6
CADPEGRFKARQANQTCTDPDADPEGRFKARQC 2240
7
CADPEGRFKARQANQTCYDPDADPEGRFKARQC 2208
8
DCDPEGRFKARQCNQ 2150
9
CTVASPDGPGGRAQARCHSDLDAELRRLFRERC 2086
10
CDADPEGRFKARQANQCDADPEGRFKARQANQC 2035
11
DGRFKARQANQTSVAWCARTLVRPSEHALVDNC 2019
12
DADPEGRFKARQANQTCPDADPEGRFKARQANC 1980
13
CPDADPEGRFKARQANCPDADPEGRFKARQANC 1950
14
CSPDGPGGRCQCRAL 1946
15
CEGRFKARQANQTSVACEGRFKARQANQTSVAC 1895
16
CTVASPDGPGGRAQARCPDADPEGRFKARQANC 1890
17
CGLYDPDADPEGRFKACPDADPEGRFKARQANC 1857
18
DPDCDPEGRFKARQCNCQTSVCWCVNSVGVR 1850
19
CPEGRFKARQANQTSVCDELVRHHILIDLRHC 1841
Unión del anticuerpo T5-86 a péptidos CLIPS obtenidos a partir de dominios extracelulares de TROP-2 humano
número
péptido unión de T5-86
20
CPDGPGGRAQARALGSCHSDLDAELRRLFRERC 1830
21
CTLVRPSEHALVDNDGCGRFKARCANQTSVAWC 1820
22
CPDADPEGRFKARQANCYDPDADPEGRFKARQC 1795
23
CGLYDPDADPEGRFKACPEGRFKARQANQTSVC 1793
24
YDPDCDPEGRFKARQ 1775
25
CPDADPEGRFKARQANCADPEGRFKARQANQTC 1773
26
CDPEGRFKARQCNQT 1772
Tabla 11
Unión del anticuerpo T6-16 a péptidos CLIPS obtenidos a partir de dominios extracelulares de TROP-2 humano
número
péptido unión de T6-16
1
CVNSVGVRRTDKGDLSCPDCYDPDADPEGRFKARQC 1072
2
CSVGVRRTDKGDLSLRCYDPDADPEGRFKARQC 786
3
HSDLDAELRRLFRERCHSDLDAELRRLFRERC 714
4
CDELVRTHHILIDLRHCDLDAELRRLFRERYRC 713
5
CVNSVGVRRTDKGDLSLRCDELVRTHHILI 688
6
VRRTDKGDLSLRCDELVRTHHILIDLRHRP 670
7
CVERTLIYYLDEIPPKCHHILIDLRHRPTAGAC 626
8
CHHILIDLRHRPTAGACHSDLDAELRRLFRERC 620
9
CVNSVGVRRTDKGDLSCPDADPEGRFKARQANC 611
10
CVHYEQPTIQIELRQNCHHILIDLRHRPTAGAC 602
11
VGVRRTDKGDLSLRCDELVRTHHILIDLRH 601
12
CAGAFNHSDLDAELRRCHHILIDLRHRPTAGAC 592
13
CSVGVRRTDKGDLSLRCPDADPEGRFKARQANC 585
14
CVRPSEHALVDNDGLYCSVGVRRTDKGDLSLRC 573
15
CDAELRRLFRERYRLHCHSDLDAELRRLFRERC 566
16
CSVGVRRTDKGDLSLRCNDGLYDPDADPEGRFC 559
17
CVNSVGVRRTDKGDLSCGLYDPDADPEGRFKAC 553
18
CDLDAELRRLFRERYRCHSDLDAELRRLFRERC 534
19
CDELVRTHHILIDLRHCHHILIDLRHRPTAGAC 534
20
CAGAFNHSDLDAELRRCDLDAELRRLFRERYRC 529
21
CDAELRRLFRERYRLHCDELVRTHHILIDLRHC 527
22
CVHYEQPTIQIELRQNCDLDAELRRLFRERYRC 526
23
CHHILIDLRHRPTAGACVHYEQPTIQIELRQNC 524
24
CGVRRTDKGDLSLRADCGVRRTDKGDLSLRADC 524
25
CGLDLRVRGEPLQVERCHHILIDLRHRPTAGAC 521
26
CDLDAELRRLFRERYRCDELVRTHHILIDLRHC 516
[Ejemplo 31]
5
[Secuenciación de regiones variables de genes de anticuerpo de anticuerpos anti-TROP-2 humano de ratón (clones K5-70, K5-107, K5-116-2-1, y T6-16)]
El ARN total se extrajo de 3 x 106 hibridomas productores de anticuerpo monoclonal anti-TROP-2 de ratón, usando el reactivo TRIzol (Invitrogen). Con respecto al clon K5-70, el clon K5-107, y el clon K5-116-2-1, el ADNc se sintetizó usando el kit de Amplificación de ADNc de RACE SMARTer™ (Clontech) de acuerdo con el método incluido con el kit, usando un cebador específico de la cadena H de IgG de ratón (5’-TCCAKAGTT-3’ (SEQ ID NO: 24)) y un 5 cebador específico de la cadena L de IgG de ratón (5’-GCTGTCCTGATC-3’ (SEQ ID NO: 25)). Con respecto al clon T6-16, el ADNc se sintetizó usando el kit GeneRacer (Invitrogen) de acuerdo con el método incluido con el kit, usando un cebador oligo dT. Cada uno de los genes que codifican las regiones variables (VH, VL) de las cadenas H y L del clon K5-70 (IgG2a de ratón), el clon K5-107 (IgG1 de ratón) y el clon K5-116-2-1 (IgG2a de ratón) se clonaron con un método de PCR usando el ADNc sintetizado anteriormente como un molde. En esta operación, como 10 cebador en la posición 5’ se usó la Mezcla de Cebador A Universal 10 X (UPM) incluida con el kit de Amplificación de ADNc de RACE SMARTer™. Por otro lado, como cebador en la posición 3’ para la amplificación de VH, se usó un cebador que tenía una secuencia específica para la cadena H de IgG de ratón, y como cebador en la posición 3’ para la amplificación de VL, se usó un cebador que tenía una secuencia específica para la cadena L de IgG de ratón. Cebador en la posición 5’ (Mezcla de Cebador A Universal 10 X (UPM)): 15
Largo (0,4 µM)
20
Corto (2 µM)
5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (SEQ ID NO: 27)
Cebador en la posición 3’ (cebador R): 25
VH: 5’-GGGAARTARCCCTTGACCAGGCA-3’ (SEQ ID NO: 28)
5’-GGGAARTAGCCTTTGACAAGGCA-3’ (SEQ ID NO: 29)
VL: 5’-CACTGCCATCAATVTTCCACTTGACA-3’ (SEQ ID NO: 30)
30
Usando cada uno de los cebadores descritos anteriormente, la PCR se realizó con la composición de solución de reacción y condiciones de reacción que siguen a continuación. Además, un cebador R para amplificación del ADNc de VH se preparó mezclando las dos secuencias mencionadas anteriormente entre sí a una proporción equimolar y se usó a continuación.
35
lt;Composición de solución de reaccióngt;
ADNc molde:
2,5 µl
Tampón PrimeSTAR 5 X (Mg2+ plus):
10 µl
dNTP 2,5 mM:
4 µl
ADN polimerasa PrimeSTAR HS (2,5 U/µl):
0,5 µl
Mezcla de Cebador A Universal 10 X (UPM):
5 µl
Cebador R (10 µM):
1 µl
Agua esterilizada:
27 µl
Total:
50 µl
lt;Condiciones de reaccióngt;
Una reacción se realizó a 94 ºC (10 s), y a partir de ese momento, se realizó un ciclo que consistía en quot;desnaturalización/disociación con calor a 98 ºC (10 s) → hibridación a 60 ºC (5 s) → síntesis/elongación a 72 ºC 40 (60 s)quot; 30 veces en total. Por último, una reacción se realizó a 72 ºC (3 min).
Los ADNc de VH y VL sintetizados se subclonaron en un vector pMD20-T (Takara Bio Inc.), y se determinaron las secuencias de nucleótidos de los mismos. Las secuencias de nucleótidos de una pluralidad de clones de VH y de clones de VL se descodificaron, y se identificaron secuencias de nucleótidos específicas para las regiones variables 45 de la cadena H y de la cadena L de ratón. La Figura 33 y la Figura 34 muestran las secuencias de nucleótidos de ADNc consenso de la VH y VL de K5-70, y secuencias de aminoácidos supuestas. La Figura 35 y la Figura 36 muestran las secuencias de nucleótidos de ADNc consenso de la VH y VL de K5-107, y secuencias de aminoácidos supuestas. La Figura 37 and La Figura 38 muestran las secuencias de nucleótidos de ADNc consenso de la VH y VL de K5-116-2-1, y secuencias de aminoácidos supuestas. 50
Se clonaron genes que codifican las regiones variables (VH, VL) de las cadenas H y L del clon T6-16 con un método de PCR usando el ADNc sintetizado anteriormente como un molde. En esta operación, como cebador en la posición 5’ se usó un cebador incluido con el kit GeneRacer. Por otro lado, como cebador en la posición 3’ para la amplificación de VH, se usó un cebador que tenía una secuencia específica para la cadena H de IgG de ratón, y como cebador en la posición 3’ para la amplificación de VL, se usó un cebador que tenía una secuencia específica para la cadena L de IgG de ratón.
5
Cebador en la posición 5’ (cebador F):
5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’ (SEQ ID NO: 31)
Cebador en la posición 3’ (cebador R): 10
VH: 5’- GCCAGTGGATAGACAGATGG-3’ (SEQ ID NO: 32)
VL: 5’- GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3’ (SEQ ID NO: 33)
15
Usando cada uno de los cebadores descritos anteriormente, la PCR se realizó con la composición de solución de reacción y condiciones de reacción que siguen a continuación.
lt;Composición de solución de reaccióngt;
ADNc molde:
1,0 µl
Tampón PrimeSTAR 5 X (Mg2+ plus):
10 µl
dNTP 2,5 mM:
4 µl
ADN polimerasa PrimeSTAR HS (2,5 U/µl):
0,5 µl
Cebador F (10 µM):
3 µl
Cebador R (10 µM):
1,0 µl
Agua esterilizada:
30,5 µl
Total:
50 µl
lt;Condiciones de reaccióngt; 20
Una reacción realizó a 94 ºC (10 s), y a partir de ese momento, Un ciclo que consistía en quot;desnaturalización/disociación con calor a 98 ºC (10 s) → hibridación a 57 ºC (10 s) → síntesis/elongación a 72 ºC (60 s)quot; se realizó 35 veces en total.
25
Los ADNc de VH y VL sintetizados se subclonaron en un vector pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen), y se determinaron las secuencias de nucleótidos de los mismos. Las secuencias de nucleótidos de una pluralidad de clones de VH y de clones de VL se descodificaron, y se identificaron secuencias de nucleótidos específicas para las regiones variables de la cadena H y de la cadena L de ratón. La Figura 39 y la Figura 40 s muestran las secuencias de nucleótidos de ADNc consenso de la VH y VL de T6-16, y secuencias de aminoácidos supuestas. 30
Aplicabilidad industrial
La presente invención es capaz de proporcionar un anticuerpo, que reacciona de forma específica con hTROP-2 y que tiene actividad antitumoral in vivo elevada, y en particular, un anticuerpo monoclonal que tiene actividad 35 antitumoral in vivo elevada a una dosis baja. Además, la presente invención es capaz de proporcionar un hibridoma, que produce el anticuerpo, un fragmento del anticuerpo, un complejo del anticuerpo o similares y diversos tipos de fármacos, una composición farmacéutica para diagnosticar o tratar un tumor, un método para detectar un tumor, y un kit para detectar o diagnosticar un tumor.
40
[Listado de Secuencias Sin Texto]
SEQ ID NO: 3
ADN Sintético
SEQ ID NO: 4
ADN Sintético
SEQ ID NO: 5
ADN Sintético
SEQ ID NO: 6
ADN Sintético
SEQ ID NO: 7
ADN Sintético
SEQ ID NO: 8
ADN Sintético
SEQ ID NO: 9
ADN Sintético
SEQ ID NO: 10
ADN Sintético
SEQ ID NO: 11
ADN Sintético
SEQ ID NO: 12
ADN Sintético
SEQ ID NO: 13
ADN Sintético
SEQ ID NO: 14
ADN Sintético
[Listado de Secuencias Sin Texto]
SEQ ID NO: 15
ADN Sintético
SEQ ID NO: 16
ADN Sintético
SEQ ID NO: 17
ADN Sintético
SEQ ID NO: 18
ADN Sintético
SEQ ID NO: 19
ADN Sintético
SEQ ID NO: 20
ADN Sintético
SEQ ID NO: 21
ADN Sintético
SEQ ID NO: 22
ADN Sintético
SEQ ID NO: 23
ADN Sintético
SEQ ID NO: 24
ADN Sintético
SEQ ID NO: 25
ADN Sintético
SEQ ID NO: 26
ADN Sintético
SEQ ID NO: 27
ADN Sintético
SEQ ID NO: 28
ADN Sintético
SEQ ID NO: 29
ADN Sintético
SEQ ID NO: 30
ADN Sintético
SEQ ID NO: 31
ADN Sintético
SEQ ID NO: 32
ADN Sintético
SEQ ID NO: 33
ADN Sintético
Listado de secuencias
lt;110gt; LivTech, Inc.
lt;120gt; anticuerpo anti-hTROP-2 5
lt;130gt; PCT11-0004
lt;150gt; JP 2010-113302
lt;151gt; 2010-05-17 10
lt;160gt; 73
lt;170gt; PatentIn versión 3.4
15
lt;210gt; 1
lt;211gt; 2080
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Homo sapiens
20
lt;220gt;
lt;221gt; CDS
lt;222gt; (339)..(1310)
lt;400gt; 1 25
lt;210gt; 2
lt;211gt; 323
lt;212gt; PRT 5
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 2
lt;210gt; 3
lt;211gt; 20
lt;212gt; ADN 5
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; ADN sintético
10
lt;400gt; 3
ttcctccgcc ccaccatggc 20
lt;210gt; 4
lt;211gt; 25 15
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; ADN sintético 20
lt;400gt; 4
ctcgagcaag ctcggttcct ttctc 25
lt;210gt; 5 25
lt;211gt; 29
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Artificial
lt;220gt; 5
lt;223gt; ADN sintético
lt;400gt; 5
ctcgagctcg tccaggtaat agatgagcg 29
10
lt;210gt; 6
lt;211gt; 23
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Artificial
15
lt;220gt;
lt;223gt; ADN sintético
lt;400gt; 6
gatccactag tcgcgagtgg tgg 23 20
lt;210gt; 7
lt;211gt; 23
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Artificial 25
lt;220gt;
lt;223gt; ADN sintético
lt;400gt; 7 30
aattccacca ctcgcgacta gtg 23
lt;210gt; 8
lt;211gt; 20
lt;212gt; ADN 35
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; ADN sintético
40
lt;400gt; 8
tcctcgtgtc ccactcccgg 20
lt;210gt; 9
lt;211gt; 25 45
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; ADN sintético 50
lt;400gt; 9
ctcgagtgca ttgagttccc tatgc 25
lt;210gt; 10 55
lt;211gt; 30
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; ADN sintético
lt;400gt; 10
cctgagccta cgctgcgacg aagtggtgcg 30 5
lt;210gt; 11
lt;211gt; 30
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Artificial 10
lt;220gt;
lt;223gt; ADN sintético
lt;400gt; 11 15
cgcaccactt cgtcgcagcg taggctcagg 30
lt;210gt; 12
lt;211gt; 30
lt;212gt; ADN 20
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; ADN sintético
25
lt;400gt; 12
gactgctcca cgctgacttc caagtgcctg 30
lt;210gt; 13
lt;211gt; 30 30
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; ADN sintético 35
lt;400gt; 13
caggcacttg gaagtcagcg tggagcagtc 30
lt;210gt; 14 40
lt;211gt; 30
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Artificial
lt;220gt; 45
lt;223gt; ADN sintético
lt;400gt; 14
ctcgtggaca acgatggcct ctacgacccg 30
50
lt;210gt; 15
lt;211gt; 30
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Artificial
55
lt;220gt;
lt;223gt; ADN sintético
lt;400gt; 15
cgggtcgtag aggccatcgt tgtccacgag 30
lt;210gt; 16
lt;211gt; 31
lt;212gt; ADN 5
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; ADN sintético
10
lt;400gt; 16
ccaaagcctg cgctgcgatg agctggtgcg c 31
lt;210gt; 17
lt;211gt; 31 15
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; ADN sintético 20
lt;400gt; 17
gcgcaccagc tcatcgcagc gcaggctttg g 31
lt;210gt; 18 25
lt;211gt; 30
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Artificial
lt;220gt; 30
lt;223gt; ADN sintético
lt;400gt; 18
agcttcctat ccgcggtgca ctacgagcag 30
35
lt;210gt; 19
lt;211gt; 30
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Artificial
40
lt;220gt;
lt;223gt; ADN sintético
lt;400gt; 19
ctgctcgtag tgcaccgcgg ataggaagct 30 45
lt;210gt; 20
lt;211gt; 30
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Artificial 50
lt;220gt;
lt;223gt; ADN sintético
lt;400gt; 20 55
gacattaaag gcgagtctct attccagggc 30
lt;210gt; 21
lt;211gt; 30
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; ADN sintético 5
lt;400gt; 21
gccctggaat agagactcgc ctttaatgtc 30
lt;210gt; 22 10
lt;211gt; 21
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Artificial
lt;220gt; 15
lt;223gt; ADN sintético
lt;400gt; 22
ctactccacc ccaccctggc g 21
20
lt;210gt; 23
lt;211gt; 25
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Artificial
25
lt;220gt;
lt;223gt; ADN sintético
lt;400gt; 23
ctcgagcaag ctaggttcgc ttctc 25 30
lt;210gt; 24
lt;211gt; 9
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Artificial 35
lt;220gt;
lt;223gt; ADN sintético
lt;400gt; 24 40
tccakagtt 9
lt;210gt; 25
lt;211gt; 12
lt;212gt; ADN 45
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; ADN sintético
50
lt;400gt; 25
gctgtcctga tc 12
lt;210gt; 26
lt;211gt; 45 55
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; ADN sintético
lt;400gt; 26
ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45
5
lt;210gt; 27
lt;211gt; 22
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Artificial
10
lt;220gt;
lt;223gt; ADN sintético
lt;400gt; 27
ctaatacgac tcactatagg gc 22 15
lt;210gt; 28
lt;211gt; 23
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Artificial 20
lt;220gt;
lt;223gt; ADN sintético
lt;400gt; 28 25
gggaartarc ccttgaccag gca 23
lt;210gt; 29
lt;211gt; 23
lt;212gt; ADN 30
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; ADN sintético
35
lt;400gt; 29
gggaartagc ctttgacaag gca 23
lt;210gt; 30
lt;211gt; 26 40
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; ADN sintético 45
lt;400gt; 30
cactgccatc aatvttccac ttgaca 26
lt;210gt; 31 50
lt;211gt; 23
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Artificial
lt;220gt; 55
lt;223gt; ADN sintético
lt;400gt; 31
cgactggagc acgaggacac tga 23
lt;210gt; 32
lt;211gt; 20
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Artificial 5
lt;220gt;
lt;223gt; ADN sintético
lt;400gt; 32 10
gccagtggat agacagatgg 20
lt;210gt; 33
lt;211gt; 21
lt;212gt; ADN 15
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; ADN sintético
20
lt;400gt; 33
gatggataca gttggtgcag c 21
lt;210gt; 34
lt;211gt; 402 25
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Homo sapiens
lt;220gt;
lt;221gt; CDS 30
lt;222gt; (1)..(402)
lt;400gt; 34
lt;210gt; 35
lt;211gt; 134
lt;212gt; PRT 5
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 35
lt;210gt; 36
lt;211gt; 5
lt;212gt; PRT 5
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 36
10
lt;210gt; 37
lt;211gt; 17
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Homo sapiens 15
lt;400gt; 37
lt;210gt; 38
lt;211gt; 6
5
lt;210gt; PRT
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 38
10
lt;210gt; 39
lt;211gt; 381
15
lt;210gt; ADN
lt;213gt; Homo sapiens
lt;220gt;
lt;221gt; CDS 20
lt;222gt; (1)..(381)
lt;400gt; 39
25
lt;210gt; 40
lt;211gt; 127
5
lt;210gt; PRT
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 40
10
lt;210gt; 41
lt;211gt; 11
lt;212gt; PRT 5
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 41
10
lt;210gt; 42
lt;211gt; 7
lt;210gt; PRT 15
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 42
20
lt;210gt; 43
lt;211gt; 9
lt;210gt; PRT 25
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 43
30
lt;210gt; 44
lt;211gt; 402
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Homo sapiens 35
lt;220gt;
lt;221gt; CDS
lt;222gt; (1).. (402)
40
lt;400gt; 44
lt;210gt; 45
lt;211gt; 134
lt;212gt; PRT 5
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 45
10
lt;210gt; 46
lt;211gt; 5
5
lt;210gt; PRT
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 46
10
lt;210gt; 47
lt;211gt; 17
15
lt;210gt; PRT
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 47
20
lt;210gt; 48
lt;211gt; 6
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 48
5
lt;210gt; 49
lt;210gt; 381 10
lt;212gt; ADN
lt;210gt; Homo sapiens
lt;220gt; 15
lt;221gt; CDS
lt;222gt; (1)..(381)
lt;400gt; 49
20
lt;210gt; 50
lt;211gt; 127
lt;210gt; PRT 5
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 50
10
lt;210gt; 51
lt;211gt; 11
lt;210gt; PRT 15
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 51
20
lt;210gt; 52
lt;210gt; 7
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Homo sapiens
5
lt;400gt; 52
lt;210gt; 53 10
lt;210gt; 9
lt;210gt; PRT
lt;213gt; Homo sapiens 15
lt;400gt; 53
20
lt;210gt; 54
lt;211gt; 396
lt;210gt; ADN
lt;213gt; Homo sapiens 25
lt;220gt;
lt;221gt; CDS
lt;222gt; (1).. (396)
30
lt;400gt; 54
lt;210gt; 55
lt;211gt; 132
5
lt;210gt; PRT
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 55
10
lt;210gt; 56
lt;211gt; 5
5
lt;210gt; PRT
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 56
10
lt;210gt; 57
lt;211gt; 17
15
lt;210gt; PRT
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 57
20
lt;210gt; 58
lt;210gt; 4 25
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 58
30
lt;210gt; 59
lt;211gt; 381
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Homo sapiens
lt;220gt;
lt;221gt; CDS 5
lt;222gt; (1)..(381)
lt;400gt; 59
10
lt;210gt; 60
lt;211gt; 127
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Homo sapiens 15
lt;400gt; 60
lt;210gt; 61
lt;211gt; 11
lt;212gt; PRT 5
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 61
10
lt;210gt; 62
lt;211gt; 7
lt;210gt; PRT 15
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 62
20
lt;210gt; 63
lt;211gt; 9
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Homo sapiens
5
lt;400gt; 63
lt;210gt; 64 10
lt;211gt; 423
lt;212gt; ADN
lt;210gt; Homo sapiens
15
lt;220gt;
lt;221gt; CDS
lt;222gt; (1)..(423)
lt;400gt; 64 20
lt;210gt; 65
lt;211gt; 141
5
lt;210gt; PRT
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 65
10
lt;210gt; 66
lt;211gt; 5
lt;212gt; PRT 5
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 66
10
lt;210gt; 67
lt;211gt; 17
lt;210gt; PRT 15
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 67
20
lt;210gt; 68
lt;211gt; 13
lt;210gt; PRT 25
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 68
30
lt;210gt; 69
lt;211gt; 390
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Homo sapiens 35
lt;220gt;
lt;221gt; CDS
lt;222gt; (1)..(390)
40
lt;400gt; 69
lt;210gt; 70
lt;211gt; 130
5
lt;210gt; PRT
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 70
10
lt;210gt; 71
lt;210gt; 16 5
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 71
10
lt;210gt; 72
lt;211gt; 7
15
lt;210gt; PRT
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 72
20
lt;210gt; 73
lt;211gt; 8
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Homo sapiens 5
lt;400gt; 73

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo contra TROP-2 humano, que tiene actividad antitumoral in vivo y en el que:
    (a) la región V de la cadena H del anticuerpo consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID 5 NO: 35 o la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos en las posiciones 20 a 134 en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 35, y la región V de la cadena L de la misma consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 40 o la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos en las posiciones 21 a 127 en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 40; o 10
    (b) la región V de la cadena H del anticuerpo consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 65 o la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos en las posiciones 20 a 141 en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 65, y la región V de la cadena L de la misma consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 70 o la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos en las posiciones 20 a 130 en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la 15 SEQ ID NO: 70.
  2. 2. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, donde:
    (a) el anticuerpo tiene actividad antitumoral en dos o más tipos de líneas de células tumorales humanas, 20
    donde las líneas de células tumorales son de al menos dos tipos seleccionados del grupo que consiste en una línea de células de cáncer pancreático humano PK-59, una línea de células de cáncer pancreático humano BxPC-3, una línea de células de cáncer pancreático humano KP-3L, una línea de células de cáncer pancreático humano KP-2, una línea de células de cáncer pancreático humano PK-1, una línea de células de cáncer pancreático humano PK-45H, una línea de células de cáncer pancreático humano PK-45P, una línea de células 25 de cáncer pancreático humano TCC-PAN2, una línea de células de cáncer pancreático humano SUIT-2, una línea de células de cáncer de colon humano CACO-2, una línea de células de cáncer de colon humano SW480, una línea de células de cáncer de colon humano DLD-1, una línea de células de cáncer de colon humano HCT 116, una línea de células de cáncer de mama humano JIMT-1, una línea de células de cáncer de mama humano HCC1143, una línea de células de cáncer de mama humano MCF-7, una línea de células de cáncer de próstata 30 humano DU145 y una línea de células de cáncer de próstata humano PC-3; y preferentemente son la línea de células de cáncer pancreático humano PK-59 y la línea de células de cáncer pancreático humano BxPC-3; y/o
    (c) el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal; y/o
    (d) el tumor es al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en cáncer pancreático humano, cáncer de próstata humano, cáncer de colon humano y cáncer de mama humano; y preferentemente es cáncer pancreático 35 humano; y/o
    (e) el tumor es un cáncer recurrente o un cáncer metastásico.
  3. 3. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde el anticuerpo es un anticuerpo genéticamente recombinante, que es preferentemente un anticuerpo quimérico. 40
  4. 4. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se une:
    (a) a un sitio al que se une el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el N.º de registro FERM BP-11251 o FERM BP-11346; o 45
    (b) a una porción que comprende al menos una región seleccionada del grupo que consiste en una región que consiste en los aminoácidos en las posiciones 43 a 65, una región que consiste en los aminoácidos en las posiciones 152 a 165, una región que consiste en los aminoácidos en las posiciones 171 a 183, una región que consiste en los aminoácidos en las posiciones 109 a 120, una región que consiste en los aminoácidos en las posiciones 43 a 56, y una región que consiste en los aminoácidos en las posiciones 193 a 206, en la secuencia 50 de aminoácidos de TROP-2 humano mostrada en la SEQ ID NO: 2.
  5. 5. Un anticuerpo monoclonal contra TROP-2 humano, que se produce por un hibridoma que tiene el N.º de registro FERM BP-11251, o FERM BP-11346.
    55
  6. 6. Un fragmento de anticuerpo obtenido a partir de un anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende:
    (a) la secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena H mostrada en la SEQ ID NO: 35 o la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos en las posiciones 20 a 134 en la secuencia de aminoácidos que se 60 muestra en la SEQ ID NO: 35, y la secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena L mostrada en la SEQ ID NO: 40 o la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos en las posiciones 21 a 127 en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 40; o
    (b) la secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena H mostrada en la SEQ ID NO: 65 o la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos en las posiciones 20 a 141 en la secuencia de aminoácidos que se 65 muestra en la SEQ ID NO: 65, y la secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena L mostrada en la SEQ ID NO: 70 o la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos en las posiciones 20 a 130 en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 70.
  7. 7. Un hibridoma que produce un anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o que tiene el N.º de registro FERM BP-11251 o FERM BP-11346. 5
  8. 8. Un conjugado de anticuerpo-fármaco que comprende un anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o un fragmento de anticuerpo como se define en la reivindicación 6, y una sustancia que tiene actividad antitumoral y/o actividad de eliminación de células.
    10
  9. 9. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 8, donde:
    (a) el tumor es al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en cáncer pancreático humano, cáncer de próstata humano, cáncer de colon humano y cáncer de mama humano; o
    (b) el tumor es cáncer pancreático humano; y/o 15
    (c) el tumor es un cáncer recurrente o un cáncer metastásico.
  10. 10. Una composición farmacéutica que comprende al menos uno seleccionado de entre el grupo que consiste en un anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, un fragmento de anticuerpo como se define en la reivindicación 6 o un conjugado como se define en la reivindicación 8 o 9. 20
  11. 11. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10 para uso en un método para tratar un tumor, opcionalmente donde el método para tratar un tumor no produce una reducción del peso como efecto secundario.
  12. 12. La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 11, donde: 25
    (a) el tumor es al menos un tipo seleccionado de entre el grupo que consiste en cáncer pancreático humano, cáncer de próstata humano, cáncer de colon humano y cáncer de mama humano; y/o
    (b) el tumor es un cáncer recurrente o un cáncer metastásico.
    30
  13. 13. Un método para detectar un tumor, que comprende:
    - permitir que al menos uno seleccionado de entre el grupo que consiste en un anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, un fragmento de anticuerpo como se define en la reivindicación 7 u 8 y un conjugado como se define en la reivindicación 10, reaccione con una muestra que se ha recogido de un 35 organismo vivo; y
    - a continuación detectar una señal(s) del anticuerpo y/o fragmento de anticuerpo que se ha hecho reaccionar.
  14. 14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, donde el tumor es al menos un tipo seleccionado de entre el grupo que consiste en cáncer pancreático humano, cáncer de próstata humano, cáncer de colon humano y cáncer 40 de mama humano.
  15. 15. Un kit para tratar, diagnosticar o detectar un tumor, que comprende al menos uno seleccionado de entre el grupo que consiste en un anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, un fragmento de anticuerpo como se define en la reivindicación 6 y un conjugado de acuerdo con la reivindicación 7 u 8; 45
    opcionalmente donde el tumor es al menos un tipo seleccionado de entre el grupo que consiste en cáncer pancreático humano, cáncer de próstata humano, cáncer de colon humano y cáncer de mama humano.
ES11783675.9T 2010-05-17 2011-05-17 Anticuerpo anti-TROP-2 humano que tiene actividad antitumoral in vivo Active ES2664809T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010113302 2010-05-17
JP2010113302 2010-05-17
PCT/JP2011/061709 WO2011145744A1 (ja) 2010-05-17 2011-05-17 in vivoで抗腫瘍活性を有する抗ヒトTROP-2抗体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2664809T3 true ES2664809T3 (es) 2018-04-23

Family

ID=44991828

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES11783675.9T Active ES2664809T3 (es) 2010-05-17 2011-05-17 Anticuerpo anti-TROP-2 humano que tiene actividad antitumoral in vivo

Country Status (16)

Country Link
US (2) US9062100B2 (es)
EP (1) EP2573120B1 (es)
JP (2) JP5859434B2 (es)
KR (1) KR101624381B1 (es)
CN (1) CN103228673A (es)
AU (1) AU2011255870B2 (es)
BR (1) BR112012029281B1 (es)
CA (1) CA2798778C (es)
EA (3) EA035852B1 (es)
ES (1) ES2664809T3 (es)
IL (1) IL222812B (es)
MX (2) MX369106B (es)
NZ (2) NZ603455A (es)
PH (1) PH12012502231A1 (es)
SG (2) SG185583A1 (es)
WO (1) WO2011145744A1 (es)

Families Citing this family (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8435529B2 (en) 2002-06-14 2013-05-07 Immunomedics, Inc. Combining radioimmunotherapy and antibody-drug conjugates for improved cancer therapy
US9745380B2 (en) 2002-03-01 2017-08-29 Immunomedics, Inc. RS7 antibodies
US9770517B2 (en) 2002-03-01 2017-09-26 Immunomedics, Inc. Anti-Trop-2 antibody-drug conjugates and uses thereof
DE60325184D1 (de) 2002-03-01 2009-01-22 Immunomedics Inc Rs7 antikörper
EP1572242B1 (en) 2002-12-13 2014-04-16 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates with an intracellularly-cleavable linkage
US10058621B2 (en) 2015-06-25 2018-08-28 Immunomedics, Inc. Combination therapy with anti-HLA-DR antibodies and kinase inhibitors in hematopoietic cancers
US9707302B2 (en) 2013-07-23 2017-07-18 Immunomedics, Inc. Combining anti-HLA-DR or anti-Trop-2 antibodies with microtubule inhibitors, PARP inhibitors, bruton kinase inhibitors or phosphoinositide 3-kinase inhibitors significantly improves therapeutic outcome in cancer
KR101624381B1 (ko) 2010-05-17 2016-05-25 가부시키가이샤 리부텍쿠 in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항인간 TROP-2 항체
US9427464B2 (en) * 2011-11-22 2016-08-30 Chiome Bioscience Inc. Anti-human TROP-2 antibody having an antitumor activity in vivo
ITCH20120008A1 (it) * 2012-05-16 2013-11-17 Saverio Alberti Uso di trop-2 come marcatore predittivo di risposta a terapia anti-tumorale basata su inibitori di cd9, akt e vie di segnale collegate
CN102827282B (zh) * 2012-09-04 2015-02-11 林红 人源抗Trop-2基因工程抗体IgG及其应用
US12310958B2 (en) 2012-12-13 2025-05-27 Immunomedics, Inc. Antibody-drug conjugates and uses thereof
US10137196B2 (en) 2012-12-13 2018-11-27 Immunomedics, Inc. Dosages of immunoconjugates of antibodies and SN-38 for improved efficacy and decreased toxicity
CA3177936A1 (en) 2012-12-13 2014-06-19 Immunomedics, Inc. Dosages of immunoconjugates of antibodies and sn-38 for improved efficacy and decreased toxicity
US10206918B2 (en) 2012-12-13 2019-02-19 Immunomedics, Inc. Efficacy of anti-HLA-DR antiboddy drug conjugate IMMU-140 (hL243-CL2A-SN-38) in HLA-DR positive cancers
US9492566B2 (en) 2012-12-13 2016-11-15 Immunomedics, Inc. Antibody-drug conjugates and uses thereof
US20240139324A1 (en) 2012-12-13 2024-05-02 Immunomedics, Inc. Dosages of immunoconjugates of antibodies and sn-38 for improved efficacy and decreased toxicity
US9931417B2 (en) 2012-12-13 2018-04-03 Immunomedics, Inc. Antibody-SN-38 immunoconjugates with a CL2A linker
US11253606B2 (en) 2013-07-23 2022-02-22 Immunomedics, Inc. Combining anti-HLA-DR or anti-Trop-2 antibodies with microtubule inhibitors, PARP inhibitors, Bruton kinase inhibitors or phosphoinositide 3-kinase inhibitors significantly improves therapeutic outcome in cancer
IL320195A (en) 2013-09-13 2025-06-01 Genentech Inc Methods and compositions containing purified recombinant polypeptides
RU2016107435A (ru) * 2013-09-13 2017-10-18 Дженентек, Инк. Композиции и способы обнаружения и количественного определения белка клеток-хозяев в клеточных линиях и рекомбинантные полипептидные продукты
SMT202500227T1 (it) 2013-12-25 2025-09-12 Daiichi Sankyo Co Ltd Metodo per produrre un coniugato anticorpo anti-trop2-farmaco
HRP20241783T1 (hr) 2014-01-31 2025-02-28 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-her2 antitijelo-lijek konjugat
WO2015126548A1 (en) 2014-02-21 2015-08-27 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Disease therapy by inducing immune response to trop-2 expressing cells
JP2018500930A (ja) 2014-12-04 2018-01-18 アブルッツォ・セラノスティックス・エッセ・エッレ・エッレ ヒト化抗ｔｒｏｐ−２モノクローナル抗体及びその使用
WO2016172427A1 (en) 2015-04-22 2016-10-27 Immunomedics, Inc. Isolation, detection, diagnosis and/or characterization of circulating trop-2-positive cancer cells
US10195175B2 (en) 2015-06-25 2019-02-05 Immunomedics, Inc. Synergistic effect of anti-Trop-2 antibody-drug conjugate in combination therapy for triple-negative breast cancer when used with microtubule inhibitors or PARP inhibitors
JP6787890B2 (ja) 2015-06-29 2020-11-18 第一三共株式会社 抗体−薬物コンジュゲートの選択的製造方法
ES3054991T3 (en) * 2015-10-30 2026-02-09 Medimmune Ltd Prevention of n-terminal truncation in igg light chains
US20170224837A1 (en) 2016-02-10 2017-08-10 Immunomedics, Inc. Combination of abcg2 inhibitors with sacituzumab govitecan (immu-132) overcomes resistance to sn-38 in trop-2 expressing cancers
US12128102B2 (en) 2016-03-08 2024-10-29 Takeda Pharmaceutical Company Limited Constrained conditionally activated binding proteins
TWI862473B (zh) 2016-12-12 2024-11-21 日商第一三共股份有限公司 抗體-藥物結合物與免疫檢查點抑制劑之組合、以及醫藥組成物之用途
TWI780104B (zh) 2017-01-17 2022-10-11 日商第一三共股份有限公司 抗ｇｐｒ２０抗體及抗ｇｐｒ２０抗體-藥物結合物、以及其製造方法及用途
RU2758234C2 (ru) 2017-03-27 2021-10-26 Иммьюномедикс, Инк. ЛЕЧЕНИЕ ТРИЖДЫ НЕГАТИВНОГО РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩЕГОСЯ ЭКСПРЕССИЕЙ Trop-2, С ПОМОЩЬЮ САЦИТУЗУМАБА ГОВИТЕКАНА И ИНГИБИТОРА Rad51
CN110352201A (zh) 2017-04-03 2019-10-18 免疫医疗公司 用于癌症疗法的抗体药物缀合物的皮下施用
TWI855528B (zh) 2017-05-15 2024-09-11 日商第一三共股份有限公司 抗體-藥物結合物之製造方法
AU2018327171B2 (en) 2017-08-31 2023-03-09 Daiichi Sankyo Company, Limited Improved method for producing antibody-drug conjugate
US11318212B2 (en) 2017-08-31 2022-05-03 Daiichi Sankyo Company, Limited Method for producing antibody-drug conjugate
EP3679067A2 (en) 2017-09-08 2020-07-15 Maverick Therapeutics, Inc. Constrained conditionally activated binding proteins
CN108680750A (zh) * 2017-12-29 2018-10-19 广西壮族自治区人民医院 Trop2蛋白表达量的elisa检测方法及试剂盒
SMT202300227T1 (it) 2018-05-18 2023-09-06 Glycotope Gmbh Anticorpo anti-muc1
IL280296B2 (en) 2018-07-27 2025-03-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Drug recognition protein of an antibody-drug conjugate
AU2019315177A1 (en) 2018-07-31 2021-02-25 Daiichi Sankyo Company, Limited Treatment of metastatic brain tumor by administration of antibody-drug conjugate
CN112739826A (zh) 2018-08-23 2021-04-30 第一三共株式会社 抗体-药物缀合物的敏感性标志物
US20220089768A1 (en) * 2019-01-04 2022-03-24 Trio Pharmaceuticals, Inc. Multi-specific protein molecules and uses thereof
CN114390938B (zh) * 2019-03-05 2025-03-21 武田药品工业有限公司 受约束的条件性活化的结合蛋白
CN112243443B (zh) * 2019-05-10 2023-03-17 江苏豪森药业集团有限公司 抗trop-2抗体、其抗原结合片段及其医药用途
BR112021023901A2 (pt) 2019-05-29 2022-01-18 Daiichi Sankyo Co Ltd Conjugado anticorpo-fármaco anti-trop2, composição farmacêutica, método para tratar ou prevenir câncer, e, uso de um conjugado anticorpo-fármaco anti-trop2 na fabricação de um fármaco para o tratamento ou prevenção do câncer
CN112646038B (zh) * 2019-10-11 2025-06-03 迈威(上海)生物科技股份有限公司 抗人Trop-2抗体及其应用
JP7525633B2 (ja) 2020-03-20 2024-07-30 イミュノメディックス， インコーポレイテッド サシツズマブゴビテカン療法用のバイオマーカー
JP2023524271A (ja) 2020-05-08 2023-06-09 ボルト バイオセラピューティクス、インコーポレーテッド エラスターゼ－基質ペプチドリンカーイムノコンジュゲート、及びそれらの使用
AU2021296205B2 (en) * 2020-06-22 2024-12-12 Systimmune, Inc. Anti-TROP2 antibody
KR20230051189A (ko) 2020-08-13 2023-04-17 볼트 바이오테라퓨틱스 인코퍼레이티드 피라졸로아제핀 면역접합체, 및 그의 용도
IT202000031838A1 (it) * 2020-12-22 2022-06-22 Saverio Alberti Piattaforma per ottenere anticorpi monoclonali diretti contro antigeni processati tumore-specifici
CN114685669A (zh) * 2020-12-30 2022-07-01 和铂医药(苏州)有限公司 结合trop2的抗体及其用途
KR20230163450A (ko) 2021-03-26 2023-11-30 볼트 바이오테라퓨틱스 인코퍼레이티드 2-아미노-4-카복사마이드-벤즈아제핀 면역접합체 및 이의 용도
CN117769439A (zh) 2021-03-26 2024-03-26 博尔特生物治疗药物有限公司 2-氨基-4-甲酰胺-苯并氮杂卓免疫缀合物及其用途
JP2024520674A (ja) 2021-06-02 2024-05-24 バイオ－テラ ソリュ－ションズ，エルティーディー． 薬物コンジュゲート及びその使用
AU2022290855A1 (en) 2021-06-11 2023-12-07 Gilead Sciences, Inc. Combination mcl-1 inhibitors with anti-body drug conjugates
TWI883332B (zh) 2021-06-11 2025-05-11 美商基利科學股份有限公司 Mcl-1抑制劑與抗癌劑之組合
EP4355785A1 (en) 2021-06-17 2024-04-24 Amberstone Biosciences, Inc. Anti-cd3 constructs and uses thereof
MX2024003779A (es) 2021-09-29 2024-04-19 Kisoji Biotechnology Inc Agentes de union dirigidos a celulas tumorales que expresan trop2.
EP4422697A1 (en) 2021-10-29 2024-09-04 Bolt Biotherapeutics, Inc. Tlr agonist immunoconjugates with cysteine-mutant antibodies, and uses thereof
CA3241006A1 (en) 2021-11-30 2023-06-08 Daiichi Sankyo Company Limited Protease-cleavable masked antibodies
CN114195888B (zh) * 2021-12-07 2023-06-09 江苏中新医药有限公司 一种抗新冠抗体药物的核心序列
EP4477674A4 (en) 2022-02-09 2026-04-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Masked antibody sensitive to the environment and its use
EP4545099A1 (en) 2022-06-27 2025-04-30 Bio-Thera Solutions, Ltd. Method for treating solid tumor
CN120417934A (zh) 2022-12-23 2025-08-01 基因泰克公司 Cereblon降解剂缀合物及其用途
EP4647440A1 (en) * 2023-01-04 2025-11-12 Aston Science Inc. Trop2 immunogenic peptide
CN118873678A (zh) 2023-01-18 2024-11-01 泰励生物科技（上海）有限公司 抗体偶联药物及其用途
WO2024173384A1 (en) 2023-02-14 2024-08-22 Bolt Biotherapeutics, Inc. Aza-benzazepine immunoconjugates, and uses thereof
WO2024186626A1 (en) 2023-03-03 2024-09-12 Bolt Biotherapeutics, Inc. Aza-bicyclic sting agonist immunoconjugates, and uses thereof
WO2025111445A1 (en) * 2023-11-21 2025-05-30 Convergent Therapeutics, Inc. Trop-2 radiopharmaceutical conjugate and uses thereof
WO2025207033A1 (en) * 2024-03-27 2025-10-02 Agency For Science, Technology And Research Anti-trop2 antigen-binding molecules
WO2026055185A1 (en) 2024-09-04 2026-03-12 Bolt Biotherapeutics, Inc. Sting agonist immunoconjugates and uses thereof

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
DE69632333T2 (de) 1995-10-19 2004-12-30 Bristol-Myers Squibb Co. Monoklonaler antikörper br110 und dessen anwendung
US6653104B2 (en) 1996-10-17 2003-11-25 Immunomedics, Inc. Immunotoxins, comprising an internalizing antibody, directed against malignant and normal cells
DE60325184D1 (de) 2002-03-01 2009-01-22 Immunomedics Inc Rs7 antikörper
EP1702982B1 (en) 2003-11-28 2010-05-05 Kanagawa Academy Of Science And Technology Method of detecting liver cancer, diagnostic for liver cancer and remedy for cancer
US7420040B2 (en) 2006-02-24 2008-09-02 Arius Research Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of TROP-2
US20080131428A1 (en) * 2006-02-24 2008-06-05 Arius Research, Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of TROP-2
WO2010089782A1 (en) 2009-02-05 2010-08-12 Saverio Alberti Anti-trop-2 monoclonal antibodies and uses thereof in the treatment and diagnosis of tumors
KR101624381B1 (ko) 2010-05-17 2016-05-25 가부시키가이샤 리부텍쿠 in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항인간 TROP-2 항체
JP2015095020A (ja) * 2013-11-11 2015-05-18 株式会社デンソーアイティーラボラトリ 画像付二次元コード生成装置、画像付二次元コード生成方法、及び画像付二次元コード生成プログラム

Also Published As

Publication number Publication date
CA2798778C (en) 2016-01-05
JP2015221793A (ja) 2015-12-10
IL222812A0 (en) 2012-12-31
EA201500219A1 (ru) 2015-10-30
BR112012029281A2 (pt) 2016-11-29
AU2011255870B2 (en) 2015-05-28
JPWO2011145744A1 (ja) 2013-07-22
CA2798778A1 (en) 2011-11-24
EA201291260A1 (ru) 2013-05-30
MX2012013327A (es) 2012-12-05
CN103228673A (zh) 2013-07-31
AU2011255870A1 (en) 2013-01-17
EP2573120B1 (en) 2018-01-17
JP5859434B2 (ja) 2016-02-10
US20130089872A1 (en) 2013-04-11
EA031043B1 (ru) 2018-11-30
EA035852B1 (ru) 2020-08-20
US20160053018A1 (en) 2016-02-25
WO2011145744A1 (ja) 2011-11-24
IL222812B (en) 2018-06-28
US9670287B2 (en) 2017-06-06
MX369106B (es) 2019-10-29
KR101624381B1 (ko) 2016-05-25
NZ702053A (en) 2016-01-29
NZ603455A (en) 2015-01-30
US9062100B2 (en) 2015-06-23
EA201500220A1 (ru) 2015-10-30
AU2011255870A8 (en) 2013-01-24
PH12012502231A1 (en) 2013-02-04
EP2573120A4 (en) 2013-10-16
EP2573120A1 (en) 2013-03-27
SG185583A1 (en) 2012-12-28
KR20130038278A (ko) 2013-04-17
MX350781B (es) 2017-09-18
SG10201503904XA (en) 2015-06-29
BR112012029281B1 (pt) 2020-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2664809T3 (es) Anticuerpo anti-TROP-2 humano que tiene actividad antitumoral in vivo
ES2750358T3 (es) Anticuerpo anti-TROP-2 humano que muestra actividad antitumoral in vivo
ES2484842T3 (es) Anticuerpo anti-DLK-1 humana que muestra la actividad antitumoral in vivo
ES2527521T3 (es) Anticuerpos antihumanos frente a Dlk-1 que tienen actividad antitumoral
ES2665341T3 (es) Anticuerpo anti-DLK-1 humana con actividad antitumoral in vivo
NZ716839A (en) Anti-human trop-2 antibody having an antitumor activity in vivo
NZ716839B2 (en) Anti-human trop-2 antibody having an antitumor activity in vivo
NZ623464B2 (en) Anti-human trop-2 antibody having an antitumor activity in vivo
HK1198042A (en) Anti-human trop-2 antibody exhibiting antitumor activity in vivo
HK1198042B (en) Anti-human trop-2 antibody exhibiting antitumor activity in vivo