ES2664836T3 - Tratamiento de esclerosis múltiple - Google Patents
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Abstract
Un reactivo de unión capaz de unirse específicamente al receptor de quimioquina CCR2 para su uso en el tratamiento de esclerosis múltiple, en donde el reactivo de unión está inmovilizado en un soporte sólido contenido dentro de una columna de aféresis, a la que se aplica sangre periférica de un paciente separando así las células que expresan CCR2 de la sangre periférica del paciente, en donde el reactivo de unión es la quimioquina MCP-1/CCL2.
Description
FIG. 12 -Secuencia y biotinilación de derivado RANTES.
FIG. 13 – Ejemplo de criterio de selección de poblaciones (gating) para monocitos que expresan CCR2.
5 FIG. 14a – Frecuencia de linfocitos T CCR2 positivos. Las barras presentan la media y SEM de linfocitos T que expresan CCR2 en 2 pacientes y 20 controles sanos.
FIG. 14b – Frecuencia de linfocitos T CCR6 positivos. Las barras representan la media y SEM de linfocitos T que expresan CCR6 en 5 pacientes y 20 controles sanos. Se analizaron la expresión de receptores de quimioquina y marcadores celulares específicos por citometría de flujo. Se caracterizaron los linfocitos T como CD3 positivos.
FIG. 15a – Unión de la quimioquina bMCP-1 a linfocitos T. La barra representa la media y SEM de linfocitos T que se unen a MCP-1 en 5 pacientes con EM.
15 FIG. 15b -Unión de la quimioquina bMIP3a a linfocitos T. La barra representa la frecuencia de unión de linfocitos T a MIP3a en un paciente con EM. Se incubó la sangre con quimioquina biotinilada y se analizó por citometría de flujo. Se caracterizaron los linfocitos T como CD3 positivos.
FIG. 16a – Empobrecimiento de linfocitos T que expresan CCR2 en matriz de Sepharose estreptavidina conjugada con bMCP-1.
FIG. 16b – Empobrecimiento de linfocitos que expresan CCR6 con matriz de Sepharose estreptavidina conjugada con bMIP3a. Se incubaron los glóbulos de la sangre del paciente con EM con matriz de quimioquina biotinlilada -Sepharose estreptavidina. Se retiraron las células sin unir por lavado de la matriz. A continuación, se
25 analizaron las células (tras el empobrecimiento) por citometría de flujo y se compararon con células que no habían sido incubadas con matriz de quimioquina (antes del empobrecimiento).
En EM progresiva secundaria las microglías / MØ presentes en el borde de las placas producen quimioquinas MCP1 y CXCL10 responsables de atraer células que expresan CCR2 y CXCR3 incluyendo macrófagos y astrocitos.
En el presente documento se demuestra que las personas que padecen de EM presentan una mayor frecuencia de células que expresan receptor de quimioquina en la sangre periférica, en particular, linfocitos T que expresan CCR2
35 y CCR6, en comparación con los controles sanos. Se demuestra asimismo en el presente documento que es posible separar las células CCR2 utilizando un reactivo de unión adecuado, en particular MCP-1 (en forma biotinilada) inmovilizado en una matriz adecuada. De manera similar, se demuestra en el presente documento que es posible empobrecer las células que expresan CCR6 (adicionales) utilizando un reactivo adecuado, en particular CCL20 (MIP-31) en forma biotinilada, inmovilizado en una matriz adecuada.
Los niveles de CCL5 son significativamente elevados en el líquido cefalorraquídeo de pacientes EM con enfermedad recidivante, lo que demuestra que CCL5 en circulación está relacionado con el reclutamiento de células de unión CCL5 al cerebro. Estas conclusiones se corroboran por el enriquecimiento de linfocitos T en el líquido cefalorraquídeo que expresan CCR5 y CCR6 lo que indica una activa acumulación como consecuencia de un
45 gradiente de CCL5 de quimioquina. Por lo tanto, la eliminación de células atraídas normalmente al cerebro proporcionando una fuente extracorpórea de CCL5 fijada a una columna será útil para el tratamiento de EM.
EJEMPLOS 1 y 2
Materiales y métodos
Aislamiento de leucocitos de sangre periférica. Se fijó sangre periférica heparinizada de donantes de sangre sanos o de pacientes con enfermedad intestinal inflamatoria (EII) en paraformaldehído al 4 % durante 4 minutos, se hemolizó durante 15 minutos con una solución de cloruro de amonio al 0,83 % y se lavó dos veces en tampón FACS para
55 obtener una suspensión de leucocitos de la sangre.
Quimioquinas. Se incubaron leucocitos durante 30 minutos en la oscuridad a 4 ºC con MCP-1 biotinilado y marcado con Alexa647 Fluor® (en concentraciones de 10 ng/µl y 50 ng/µl). Se lavaron las células con tampón FACS y se analizaron por citometría de flujo. Todas las quimioquinas utilizadas en los ejemplos fueron facilitadas por Almac Sciences Scotland Ltd., Edimburgo, Escocia.
Ensayo de citometría de flujo. Se llevó a cabo el ensayo de citometría de flujo en un citómetro FACS Calibur de dos láseres (BD Immunocytometry Systems, San José, Ca, Estados Unidos). Se hizo el recuento de diez mil células y se analizaron en cada ejemplo. Para el análisis de los datos, se utilizó el software Cell Quest Pro de Becton Dickinson.
65 EJEMPLO 1-Unión de monocitos a MCP-1. En este experimento con MCP-1 biotinilado, se observó que
13
Modificaciones: RANTES humana que corresponde a los restos 1-68, se expresa inicialmente como 91 aminoácidos que comprenden el pliegue de quimioquina y un péptido de señal de 23 aminoácidos que se escinde. Se mutó la única metionina (Met67) dentro de la secuencia a lisina para mitigar la oxidación de este resto durante el ensamblaje de cadena, observada durante la síntesis del derivado de la secuencia natural. Esta sustitución de Met por Lys proporcionó una lisina en la posición 67 que fue modificada por biotinilación sobre la resina.
Se muestra la secuencia de aminoácidos lineal (SEQ ID NO: 17) antes de la fijación de la molécula de biotina en el aminoácido 67 (K):
Se ensambló la secuencia de RANTES obtenida por ingeniería genética sobre un soporte sólido (resina Wang), aplicando protocolos Fmoc para síntesis de péptidos en fase sólida, tal como se ha descrito en la sección de protocolos general:
X es K(ivDde)
20 Se incorporó FmocLys(ivDde)-OH como el resto 67 para facilitar el marcado específico de sitio en esta posición de la proteína (SEQ ID NO: 18). Tras la separación del grupo protector ivDde, se llevó a cabo el acoplamiento de la biotina, tal como se describe en la sección del protocolo general. Se llevaron a cabo la escisión, la purificación y los protocolos de plegado tal como se ha descrito para abastecer la quimioquina activa deseada (SEQ ID NO: 19).
X es un resto de aminoácido que puede ser biotinilado, como lisina, ornitina o ácido diaminopropiónico y opcionalmente está biotinilado, opcionalmente, a través de una molécula espaciadora como PEG (p.ej. K(Biotina))
30 Datos de Ionización por electrospray con espectrometría de masas en tándem (ESI-TOF-MS) de biotinaRANTES purificada plegada: obtenido = 8068,9 Da; esperado 8070,2 Da.
Datos de ensayo funcional:
35 Se analizó BiotinRANTES en cuanto a la actividad agonista en un ensayo con aequarina contra hCCR5, (Euroscreen) y se registró un valor EC50 de 0,5 nM.
40 Molécula diana: MIP-3α derivatizada en la funcionalidad de cadena lateral ε-amino Lys(68) con PEG-Biotina (Sal TFA)
Modificaciones: MIP-3α humana que corresponde a los restos 1-70, se expresa inicialmente como 96 aminoácidos que comprenden el pliegue de quimioquina y un péptido de señal de 26 aminoácidos que se escinde. Se modificó la 45 lisina de origen natural en la posición 68 por biotinilación sobre la resina. Se incorporó un espaciador PEG entre la funcionalidad ε-amino y la biotina.
Se muestra la secuencia de aminoácidos lineal (SEQ ID NO: 20) antes de la fijación del espaciador PEG y biotina moléculas en el aminoácido 68 (K): 50
Se ensambló la secuencia de MIP-3α obtenida por ingeniería genética en un soporte sólido (resina Wang), aplicando protocolos Fmoc para síntesis de péptidos en fase sólida, tal como se ha descrito en la sección de protocolos 55 general:
22
X= K(ivDde)
Se incorporó FmocLys(ivDde)-OH como el resto 68 para facilitar el marcado específico de sitio en esta posición de la proteína (SEQ ID NO: 21). Tras la separación del grupo protector ivDde se llevó a cabo el acoplamiento del espaciador PEG y biotina, tal como se describe en la sección del protocolo general. Se llevaron a cabo la escisión, purificación y los protocolos de plegado, tal como se ha descrito para abastecer la quimioquina activa deseada (SEQ ID NO: 22).
10 X es un resto de aminoácido que puede ser biotinilado, como lisina, ornitina o ácido diaminopropiónico y opcionalmente, está biotinilado, opcionalmente, a través de una molécula espaciadora como PEG, en particular K(PEG-Biotina)
15 Datos de Ionización por electrospray con espectrometría de masas en tándem (ESI-TOF-MS) biotinaMip-3α purificada plegada: obtenido = 8396,4 Da; esperado 8397,0 Da.
Datos de ensayo funcional:
20 Se analizó BiotinMIP-3α en cuanto a la actividad agonista en un ensayo con aequarina contra hCCR6, (Euroscreen) y se registró un valor EC50 de 1,6 nM en comparación con EC50 para MIP-3α nativa recombinante de 1,0 nM.
25 Molécula diana: TECK (Met para sustitución Nleu) derivatizada en la funcionalidad de cadena lateral ε-amino Lys72 con PEG-Biotina (Sal TFA)
Modificaciones: Forma truncada de TECK humana que corresponde a los restos 1-74 de la proteína madura, que abarca la secuencia que corresponde al pliegue de quimioquina. La longitud completa de la proteína es de 127 30 aminoácidos (el péptido de señal es de 23 aminoácidos en una proteína inmadura de 150 aminoácidos). Se alteró la única metionina dentro de la secuencia en Norleucina para mitigar la oxidación de este resto durante el ensamblaje de cadena, observada durante la síntesis del derivado de la secuencia natural. Se sometió Gln en el extremo N de la proteína a formación de pyroGlu en condiciones fisiológicas. Así, se sustituyó Gln1 de la secuencia por piroglutamina para evitar especies mixtas de Gln N-terminal y generándose pyroGlu. Esto mejora el rendimiento de la síntesis y
35 asegura una preparación de quimioquina homogénea a lo largo de la fabricación y el uso de la columna. Se modificó la lisina de origen natural en la posición 72 por biotinilación sobre la resina. Se incorporó un espaciador PEG entre la funcionalidad ε-amino y la biotina.
Se muestra La secuencia de aminoácidos lineal (SEQ ID NO: 23) antes de la fijación del espaciador PEG y biotina 40 moléculas en el aminoácido 72 (K):
X1 = pyroGlu o Gln 45 X64 = Norleucina
Se ensambló la secuencia TECK obtenida por ingeniería genética sobre un soporte sólido (Resina Wang), aplicando protocolos Fmoc para síntesis de péptidos en fase sólida, tal como se ha descrito en la sección de protocolos general:
X1 = pyroGlu o Gln X64 = Norleucina X72 = K(Dde)
55 NPKSREVQRANleKLLDARNK(ivDde)VF-RESIN
Se incorporó FmocLys(ivDde)-OH como el resto 72 para facilitar el marcado específico de sitio en esta posición de la proteína (SEQ ID NO: 24). Tras la separación de the ivDde grupo protector, se llevó a cabo el acoplamiento del espaciador PEG y biotina, tal como se describe en la sección del protocolo general. Se llevaron a cabo la escisión, la
23
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