ES2665258T3 - Producción de metabolitos - Google Patents

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ES2665258T3
ES2665258T3 ES11720810.8T ES11720810T ES2665258T3 ES 2665258 T3 ES2665258 T3 ES 2665258T3 ES 11720810 T ES11720810 T ES 11720810T ES 2665258 T3 ES2665258 T3 ES 2665258T3
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ES
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microorganism
tdh3
seq
vector
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Michael Katz
Thomas Durhuus
Hans Peter Smits
Jochen FÖRSTER
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Evolva Holding SA
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Evolva AG
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
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Abstract

Un microorganismo recombinante que produce y excreta al medio de cultivo un estilbenoide como producto metabolito cuando se cultiva en condiciones de producción de estilbenoide, cuyo microorganismo tiene genes que codifican enzimas que constituyen una ruta metabólica para la producción de dicho estilbenoide y un transportador ABC que transporta dicho estilbenoide fuera de dicho microorganismo a dicho medio de cultivo, en donde dicho transportador es exógeno a dicho microorganismo o dicho gen que codifica dicho transportador es endógeno y está presente en un número de copias mayor que en el microorganismo nativo y/o está bajo el control de un promotor más fuerte de modo que dicho gen endógeno se exprese a un nivel más alto que el nivel de expresión nativo, en donde dicho microorganismo tiene genes que codifican las enzimas: - fenilalanina amoniaco liasa, 4-cumarato-CoA ligasa y estilbeno sintasa; y/o - fenilalanina amoniaco liasa, cinamato 4-hidroxilasa, 4-cumarato-CoA ligasa y estilbeno sintasa; y/o - tirosina amoniaco liasa, 4-cumarato-CoA ligasa y estilbeno sintasa; y/o - tirosina amoniaco liasa, cinamato 4-hidroxilasa, 4-cumarato-CoA ligasa y estilbeno sintasa.

Description

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levadura. Se aplicarían Principios similares a otros estilbenoides. Se realizaron búsquedas in silico utilizando la herramienta BLAST en una base de datos del genoma de S. cerevisiae y sometiendo a búsqueda blast transportadores ABC de otras levaduras y hongos y de la propia S. cerevisiae. Los candidatos resultantes se muestran en la Tabla 1. Se encontraron algunos candidatos más que los 16 transportadores ABC anteriormente descritos (Rogers et al., 2001; Jungwirth y Kuchler 2006) en estas búsquedas de homología.
Tabla 1. Transportadores ABC en S. cerevisiae (Nomenclatura de acuerdo con la base de datos del genoma de Saccharomyces).
YOR153W -PDR5
YCR011C -ADP1
YDR406W -PDR15
YPL270W -MDL2
YOR328W -PDR10
YLR188W -MDL1
YNR070W -PDR18
YDR135C -YCF1
YPL058C -PDR12
YLL048C -YBT1
YDR011W -SNQ2
YHL035C -VMR1
YOR011W -AUS1
YKL209C -STE6
YIL013C -PDR11
YMR301C -ATM1
YOL075C
YLL015W -BPT1
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YGR281W -YOR1
Se han descrito supuestos genes de resveratrol sintasa en el hongo de la raíz blanca Botrytis Cinerea (Número de acceso del gen BcatrB: AJ006217) (Schoonbeek et al., 2001) y el hongo Aspergillus nidulans (Número de acceso del gen ATRB: Z68905) (del Sorbo et al., 1997, Andrade et al., 2000). Los mutantes de deleción de Botrytis cinerea (delta-BcatrB) y Aspergillus Nidulans (delta-ATRB) mostraron una mayor sensibilidad hacia el resveratrol (Schoonbeek et al., 2001, Andrade et al., 2000). Estas dos proteínas, ATRBp y BcatrBp, tienen la homología más alta (30-39%) para los genes transportadores de S. cerevisiae codificados por los genes PDR18, SNQ2, PDR10, PDR12, PDR5 y PDR15. Los autores de la presente invención consideran que al menos uno de los genes homólogos en S. cerevisiae debe ser un transportador de resveratrol. Como se muestra en los ejemplos a continuación, tanto SNQ2 como BcatrBp son eficaces para aumentar la producción de resveratrol en S. cerevisiae.
Muchos transportadores ABC de otros organismos se han expresado en S .cerevisiae (Connolly et al., 2005; Del Sorbo et al., 2008; Nimii et al., 2005; Zwiers et al., 2002). Sin embargo, también se han expresado transportadores ABC de S. cerevisiae en otros organismos. Esto ha sido ilustrado por la expresión funcional del transportador YCF1 en la planta Arabidopsis thaliana (Song et al., 2003) y PDR5, un pariente cercano de SNQ2, en la planta de tabaco (Muhitch et al., 2000). En general, parece que la expresión funcional de cualquier transportador ABC es posible a través de las barreras de especie, como se ha ilustrado por la expresión de 25 transportadores ABC humanos en Pichia pastoris (Chloupkova et al., 2007). Incluso los transportadores unidos a la membrana eucarióticos se han expresado en organismos procarioticós tales como Lactococcus lactis (Kunji et al., 2003). Por lo tanto, es probable que otros organismos puedan volverse tolerantes a altos niveles de resveratrol por la expresión heteróloga de SNQ2
o BcatrB de S. cerevisiae o Botrytis cinerea.
El segundo aspecto se refiere al uso de etiquetas de ubiquitinación y es útil ya sea de forma aislada o combinadas con el primer aspecto.
Dicha secuencia de etiqueta de ubiquitinación es preferiblemente una prolongación C-terminal de dicho producto de expresión.
Preferiblemente, dicha prolongación C-terminal de dicho producto de expresión satisface los siguientes criterios:
1. Es una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido conectado en marco al extremo N o C terminal de un marco de lectura abierto de un gen.
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Nombre
Region Tipo
Tag 2
Promotor 6169..6216
4CL2
ORF complemento (507..2177)
VST1
ORF 3547..4725
URA3 con TAG2
ORF 5365..6219 /nota=Longitud: 807
PAL2 Codón opt.
ORF complemento (7199..9352)
Bla
ORF complemento (15751..16623)
C4H-CYB5-ATR2
ORF 10722..14540
Plásmido RHO0032b véase también la Figura 5 Características Rho0032b
Nombre
Tipo Región
CYC1
Terminador 8094..8214
ADH1
Terminador complemento (157..321)
pUC
Origen de replicación 14999..15666
2 mu
Origen de replicación 16808..17963
Origen F1
Origen de replicación 9613..9919
TEF1
Promotor 12996..13396
TDH3
Promotor complemento (12052..12706)
TDH3
Promotor complemento (2673..3327)
TEF1
Promotor 3617..4017
VST1
ORF 13409..14587
4CL2
ORF complemento (10369..12039)
HIS3
ORF 8562..9221
Bla
ORF complemento (15814..16674)
PAL2
ORF complemento (507..2660)
C4H-CYB5-ATR2
ORF 4030..7848
Plásmido RHO0044 -véase también la Figura 6 Características Rho0044
10
Nombre
Tipo Región
LEU2_terminador
Terminador 9721..10171
CYC1
Terminador 7985..8105
CYC1
Terminador 15627..15747
ADH1
Terminador complemento (48..212)
ADH1
Terminador complemento (10797..10961)
2 mu
Origen de replicación 17586..18741
Origen PUC
Origen de replicación 15777..16444
TDH3
Promotor 13514..14180
TEF
Promotor complemento (12824..13236)
LEU2_promotor
Promotor 8234..8613
TEF
Promotor 3502..3914
TDH3
Promotor complemento (2558..3223)
VST1
ORF 14187..15368
4CL2
ORF complemento (11147..12817)
LEU2
ORF 8614..9720
C4H::Cyb5::AR2codopt
ORF 3957..8105
PAL2codopt
ORF complemento (398..2551)
BLA
ORF complemento (16592..17464)
Plásmido RHO0051 -véase también la Figura 7 Características Rho0051
Nombre
Tipo Región
PTRP1
Promotor 187..468
TDH3
Promotor 2865..3514
TEF
Promotor complemento (2164..2564)
SNQ2
ORF 3521..8026
TRP1
ORF 469..1140
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amplificado se digirió con BamH1/Xho1 y se ligó en pESC-HIS-4CL2 digerido con BamH1/Xho1. El plásmido resultante, pESC-HIS-4CL2-VST1 (Rh0043), contenía los genes que codificaban 4CL2 y VST1 bajo el control de los promotores <= GAL1/GAL10 => inducidos por galactosa divergentes. La secuencia del gen que codificaba VST1 se verificó por secuenciación de dos clones diferentes de pESC-HIS-4CL2-VST1.
Ejemplo 5. Construcción de un vector de levadura para expresión inducida por galactosa de 4CL1 y VST1
El gen que codificaba 4CL1 se aisló mediante PCR a partir del vector puc57-4CL1 utilizando el cebador directo 5'-TTGAAAATTCGAATTC ATGGCCCCCCAAGAA-3' (SEQ ID NO: 42) que contiene el sitio de restricción EcoRI subrayado y el cebador inverso 5'-GCGAAGAATTGTTAATTAA TTAAAGACCGTTTGCTAGTTT-3' (SEQ ID NO: 43) que contiene el sitio de restricción para PACI subrayado. El producto de PCR 4CL1 amplificado se digirió con EcoR1/PAC1 y se ligó en el vector pESC-HIS digerido con EcoR1/PAC1 (Stratagene), dando como resultado el vector pESC-HIS-4CL1. Se secuenciaron dos clones diferentes de pESC-HIS-4CL1 para verificar la secuencia del gen clonado.
El gen que codificaba VST1 se amplificó a partir del vector Genscript puc57-VST1 mediante PCR utilizando el cebador directo 5'-CC GGATCC ATG GCA TCC GTA GAG GAG TTC AGA A-3' (SEQ ID NO: 40) que contiene el sitio de restricción BamHI subrayado y el cebador inverso 5'-CG CTCGAG TCA TTA GTT AGT GAC AGT TGG AAC AGA GT-3' (SEQ ID NO: 45) que contiene el sitio de restricción para XHOI subrayado. El gen VST1 sintético amplificado se digirió con BamH1/Xho1 y se ligó en pESC-HIS-4CL1 digerido con BamH1/Xho1. El plásmido resultante, pESC-HIS-4CL1-VST1 (RhO001), contenía los genes que codificaban 4CL1 y VST1 bajo el control de los promotores <= GAL1/GAL10 => inducidos por galactosa divergentes. La secuencia del gen que codificaba VST1 se verificó por secuenciación de dos clones diferentes de pESC-HIS-4CL1-VST1 (RHO001).
Ejemplo 6. Construcción de un fragmento promotor constitutivo fuerte TDH3
El promotor TDH3 (GPD) de 600 pares de bases se amplificó a partir de ADN genómico de S. cerevisiae utilizando el cebador directo 5'-GC GAGCTC AGT TTA TCA TTA TCA ATA CTC GCC ATT TCA AAG-3' (SEQ ID NO: 46) que contiene un sitio de restricción Sac1 y el cebador inverso 5'-CG TCTAGA ATC CGT CGA AAC TAA GTT CTG GTG TTT TAA AAC TAA AA-3' (SEQ ID NO: 47) que contiene un sitio de restricción Xba1. El fragmento de TDH3 amplificado se digirió con Sac1/Xba1 y se ligó en el plásmido pRS416 digerido con Sac1/Xba1 (Sikorski y Hieter, 1989) como se describió previamente (Mumberg et al., 1995) dando como resultado el plásmido pRS416-TDH3.
Ejemplo 7. Construcción del fragmento promotor fuerte constitutivo TEF2
Se amplificó el promotor TEF2 de 400 pares de bases a partir de ADN genómico de S. cerevisiae utilizando el cebador directo 5'-GC GAGCTC ATA GCT TCA AAA TGT TTC TAC TCC TTT TTT ACT CTT-3' (SEQ ID NO: 48) que contiene un sitio de restricción Sac1 y el cebador inverso 5'-CG TCTAGA AAA CTT AGA TTA GAT TGC TAT GCT TTC TTT CTA ATG A-3' (SEQ ID NO: 49) que contiene un sitio de restricción Xba1. El fragmento de TEF2 amplificado se digirió con Sac1/Xba1 y se ligó en el plásmido pRS416 digerido con Sac1/Xba1 (Sikorski y Hieter, 1989) como se describió previamente (Mumberg et al., 1995) dando como resultado el plásmido pRS416-TEF2.
Ejemplo 8. Construcción del fragmento del promotor TEF y TDH3 constitutivo divergente fusionado
Se construyó un fragmento de fusión divergente entre el promotor TEF2 y el promotor TDH3 comenzando a partir de PRS416-TEF y PRS416-TDH3.
El fragmento de TDH3 de 600 pares de bases se amplificó de nuevo a partir de PRS416-TDH3 utilizando el cebador directo 5' TTGCGTATT GGGCGCTCTTCC GAG CTC AGT TTA TTA TTA TCA ATA CTC GC-3' (SEQ ID NO: 50) que contiene el saliente subrayado para la fusión de PCR al fragmento de TEF2 y el cebador inverso 5' AT GGATCC TCT AGA ATC CGT CGA AAC TAA GTT CTG-3' (SEQ ID NO: 51) que contiene el sitio de restricción BamH1 subrayado. Esto dio como resultado un fragmento listo para la fusión al fragmento de TEF2 a continuación.
Se amplificó de nuevo el fragmento de TEF2 de 400 pares de bases que incluía un espaciador de 277 pares de bases aguas arriba del sitio de restricción Sac1 a partir de PRS416-TEF2 utilizando el cebador directo 5' AT GAATTC TCT AGA AAA CTT AGA TTA GAT TGC TAT GCT TTC-3' (SEQ ID NO: 52) que contiene el sitio de restricción EcoR1 subrayado y el cebador inverso 5' TGA TAA TGA TAA ACT GAG CTC GGA AGA GCG CCC AAT ACG CAA AC-3' (SEQ ID NO: 53) que contiene el saliente subrayado para la fusión al fragmento de TDH3. Esto dio como resultado un fragmento de 680 pares de bases listo para la fusión al fragmento de TDH3.
El fragmento de TEF2 de 680 pares de bases y los fragmentos de TDH3 de 600 pares de bases se unieron entre sí (fusionaron) utilizando PCR de fusión con el cebador directo 5' AT GAATTC TCT AGA AAA CTT AGA TTA GAT TGC TAT GCT TTC-3' (SEC ID NO 54) y el cebador inverso 5' AT GGATCC TCT AGA ATC CGT CGA AAC TAA GTT CTG-3' (SEQ ID NO: 55), dando como resultado el fragmento de promotor divergente <= TEF2/TDH3 => (SEQ ID NO: 56).
Ejemplo 9. Construcción de un vector de levadura para la expresión constitutiva de PAL2 y el gen de fusión C4H:ATR2
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El vector pESC-URA-PAL2-C4H:ATR2 con promotores inducibles por galactosa GAL1/GAL10 divergentes se digirió secuencialmente con NotI y BsiWI para eliminar los promotores GAL1/GAL10.
El fragmento del promotor <= TEF2/TDH3 => constitutivo divergente (Ejemplo 8) se volvió a amplificar con el cebador directo 5-GC GCGGCCGC TCT AGA AAA CTT AGA TTA GAT TGC TAT GCT TTC-3 (SEQ ID NO: 57) y cebador inverso 5-ATT CGTACG TCT AGA ATC CGT CGA AAC TAA GTT CTG-3 (SEQ ID NO: 58). El producto de PCR resultante se digirió secuencialmente con NotI y BsiWI y se ligó en el vector anterior sin el fragmento GAL1/Gal10. Esto dio como resultado un vector pESC-URA-TDH3-PAL2-TEF1-C4H: ATR2 (RHO0019) con promotores reemplazados, de GAL1/Gal10 a TEF2/TDH3.
Ejemplo 10. Construcción de un vector de levadura para la expresión constitutiva de PAL2 y el gen de fusión C4H:CYB5:ATR2
El vector pESC-URA-PAL2-C4H:CYB5:ATR2 con promotores inducibles por galactosa GAL1/GAL10 divergentes se digirió secuencialmente con NotI y BsiWI para eliminar los promotores GAL1/GAL10.
El fragmento del promotor <= TEF2/TDH3 => constitutivo divergente (Ejemplo 8) se volvió a amplificar con el cebador directo 5-GC GCGGCCGC TCT AGA AAA CTT AGA TTA GAT TGC TAT GCT TTC-3 (SEQ ID NO: 57) y el cebador inverso 5-ATT CGTACG TCT AGA ATC CGT CGA AAC TAA GTT CTG-3 (SEQ ID NO: 58). El producto de PCR resultante se digirió secuencialmente con NotI y BsiWI y se ligó en el vector anterior sin el fragmento GAL1/Gal10. Esto dio como resultado un vector pESC-URA-TDH3-PAL2-TEF1-C4H:CYB5:ATR2 (RHO0025) con promotores reemplazados, de GAL1/GA110 a TEF2/TDH3.
Ejemplo 11. Construcción de un vector de levadura para la expresión constitutiva inducida de 4CL2 y VST1
El vector pESC-HIS-4CL2-VST1 con promotores inducibles por galactosa GAL1/GAL10 divergentes se digirió secuencialmente con EcoR1 y BamH1 para eliminar los promotores GAL1/GAL10.
El fragmento del promotor <= TEF2/TDH3 => constitutivo divergente (Ejemplo 8) se digirió secuencialmente con EcoR1 y BamH1 y se ligó en el vector linealizado anterior sin el fragmento GAL1/GAL10. Esto dio como resultado un vector pesc-HIS3-TEF2-4CL2-TDH3-VST1 (RHO0011) con promotores reemplazados, de GAL1/GA110 a TEF2/TDH3.
Ejemplo 12. Generación de vectores de control RHO0020 y RHO0022
Los vectores pESC-URA3 y pESC-HIS3 (Stratagene) se digirieron con BamHI y EcoRI para eliminar los promotores de galactosa GAL1/Gal10 divergentes. Los promotores TEF/TDH3 divergentes se cortaron del vector RHO009 y se ligaron en dos cadenas principales de vectores de Stratagene abiertas para generar los vectores de control vacíos pESC-URA3-TEF/TDH3 (RHO0020) y pESC-HIS3-TEF/TDH3 (RHO0022).
Ejemplo 13: Generación del vector RHO0028 a partir de RHO0025 (intercambio de marcadores)
El marcador URA3 en el vector RHO0025 se intercambió por el marcador HIS3 utilizando la tecnología Infusion. La cadena principal del vector RHO0025 a excepción del casete del marcador URA3 se linealizó con PCR utilizando la polimerasa Herculasa II con el cebador directo 5'-ATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGG-3' (SEQ ID NO: 59) y el cebador inverso 5'-CTC TCA GTA CAA TCT GCT CTG ATG CCG-3' (SEQ ID NO: 60). El casete del marcador HIS3 se amplificó de nuevo a partir de pESC-HIS (Stratagene) utilizando el cebador directo 5' CAGAGCA GATTGTACTG AGAG GAG CTT GGT GAG CGC TAG GAG TCA y el cebador inverso 5'-CGG TAT TTT CTC CTT ACG CAT GGA AAG CGC GCC TCG TTC AGA ATG-3' (SEQ ID NO: 62) con los salientes homólogos subrayados para el vector RHO0025 linealizado. Los dos fragmentos se recombinaron utilizando el kit de Clonación Infusion. El vector resultante pESC-HIS3-TDH3-PAL2-TEF1-C4H:CYB5:ATR2 (RHO0028).
Ejemplo 14. Generación del vector RHO009 a partir de RHO0011 (intercambio de marcadores)
El marcador HIS3 en el vector RHO0011 se intercambió por el marcador URA3 utilizando la tecnología Infusion. La cadena principal del vector RHO0011 a excepción del casete marcador HIS3 se linealizó con PCR utilizando la polimerasa Herculasa II con el cebador directo 5'-TCG ACG GAT CTA TGC GGT GTG AAA TAC C-3' (SEQ ID NO: 63) y el cebador inverso 5' -ACT CTC AGT ACA ATC TGC TCT GAT GCC G-3' (SEQ ID NO: 64). El casete del marcador URA3 se volvió a amplificar a partir de pESC-URA (Stratagene) utilizando el cebador directo 5'-AGA GCAGATTGTA CTGAGAGT CAT CAG AGC AGA TTG TAC TGA GAG TGC-3' (SEQ ID NO: 65) y el cebador inverso 5'-CAC ACC GCA TAG ATC CGT CGA GGA TTT TGC CGA TTT CGG CCT ATT GG-3' (SEQ ID NO: 66) con los salientes homólogos subrayados para el vector RHO0011 linealizado. Los dos fragmentos se recombinaron utilizando el kit de Clonación Infusion. El vector resultante pESC-URA3-TEF2-4CL2-TDH3-VST1 se denominó RHO009.
Ejemplo 15. Construcción de un vector de levadura para la expresión constitutiva de PAL2, C4H:ATR2, 4CL2 y VST1 que contienen el marcador ura3 RHO0029
Se utilizó RHO0019 como molde para la amplificación por PCR (Herculasa II) utilizando el cebador directo 5-CAG
18
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67). Se utilizó RHO0011 como molde para la amplificación por PCR de los casetes de expresión 4CL2 y VST1 (Herculasa II) utilizando el cebador directo 5-TGG CTT AAC TAT GCG GCA TGA GCG ACC TCA TGC TAT ACC T3 (SEQ ID NO: 68) y el cebador inverso 5 -CT CAG TAC AAT CTGC TCT GCT GTG GAT AAC CGT ATT ACC G-3 (SEQ ID NO: 69). Los dos fragmentos obtenidos por PCR se fusionaron utilizando la Tecnología de clonación 5 InFusion dando como resultado el plásmido pESC-URA3:TAG-TDH3-PAL2-TEF1-C4H:CYB5:ATR2-TDH3-4CL2-TEF-VST1. La secuencia de la etiqueta añadida al extremo C-terminal del producto del gen URA3 fue ACKNWFSSLSHFVIHL (SEQ ID NO: 1). El plásmido se denominó RHO0053. En la Figura 4 aparece un diagrama de este sistema de expresión que contiene el gen de fusión de fenilalanina amoniaco liasa y cinamato-4-hidroxilasa, 4-cumarato-CoA ligasa y resveratrol sintasa. El sistema de expresión tiene una etiqueta adicional
10 ACKNWFSSLSHFVIHL (SEQ ID NO: 1) situada en el extremo C-terminal del gen marcador, en este caso ura3. Una etiqueta alternativa para utilizar aquí sería FYYPIWFARVLLVHYQ (SEQ ID NO: 3).
Ejemplo 20. Transformación de mutantes por deleción de Euroscarf con el supuesto resveratrol suprimido para escrutar supuestos transportadores de resveratrol.
Se escrutó la colección de cepas mutantes por deleción del archivo Europeo de S. cerevisiae para determinar el
15 análisis funcional (Euroscarf). Esta colección consiste en diferentes mutantes en los cuales se ha suprimido un gen conocido (Giaever, et al 2002). De esta biblioteca, los autores de la presente invención seleccionaron mutantes con los transportadores eliminados, identificados en la Tabla 2, que se eligieron como se ha descrito anteriormente.
Tabla 2 Transportadores ABC seleccionados candidatos para el escrutinio
ORF suprimido de la cepa Euroscarf
Nombre del gen para ORF suprimido
YOOOO *1)
Cepa de control, Sin deleción
ΔYGR281w
YOR1
ΔYDR406w
PDR15
ΔYDR011w
SNQ2
ΔYOR328w
PDR10
ΔYOR153w
PDR5
ΔYPL058c
PDR12
ΔYNR070w
PDR18
ΔYIL013c
PDR11
*1) El fondo de cepa (genotipo) para la levadura de control YOOOO es [BY4741 MATA his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0] y para cepas con deleciones génicas es [BY4741 MATA his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0 Gene: delta: KanMx] donde Genne:delta:KanMX significa que cada gen ha sido suprimido por la incorporación homóloga del casete de kanamicina (KANMM), resistencia a la geneticina G418.
20 Los mutantes por deleción de Euroscarf y el control en la Tabla 2 se transformaron con dos vectores RHO009 y RHO0028, que juntos albergaban la ruta completa heteróloga del resveratrol dividida en las dos copias múltiples de 2 micras diferentes. El vector RHO009 contenía los genes que codificaban las enzimas que convierten la fenilalanina en ácido cumarico, es decir, fenilalanina amoniaco liasa (PAL2) de Arabidopsis thaliana y Cinnamato-4-hidroxilasa (C4H) de Arabidopsis thaliana fusionadas en marco a su citocromop-450-reductasa (AR2) de Arabidopsis thaliana.
25 RHO0028 contiene los genes que convierten el ácido cumarico en resveratrol, es decir 4-cumarato:CoA-ligasa (4CL2) de A. thaliana y resveratrol sintasa (VST1) de Vitis vinifera. En detalle, las células de levadura Euroscarf se extrajeron del agar inclinado suministrado de Euroscarf y se inocularon en 5 ml de YPD en tubos de escrutinio estériles durante la noche a 30°C. Las células se transformaron de acuerdo con el método convencional de acetato de litio (Gitez y Schiestl, 1989) con el vector RHO009 y RHO028. Los transformantes en forma de colonias
30 individuales se seleccionaron sobre placas de agar SC-URA-HIS.
20
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Concentración [g/L]
FeSO4·7H2O
3,0
H3BO3
1,0
KI
0,1
Condiciones de funcionamiento de la fermentacion de alimentación por lotes
Las condiciones de funcionamiento utilizadas en la fase de lote inicial y la fase de alimentación de las fermentaciones de alimentación por lotes se muestran en la Tabla 15. Tabla 15 Condiciones de funcionamiento para la fase inicial del lote en las fermentaciones de alimentación por lotes
Parámetro
Punto de ajuste
Volumen de líquido (1)
0,5
Temperatura (°C)
30,0
pH
5,5
Velocidad de agitación (rpm)1
1200-1800
Velocidad de flujo de gas (vvm)2, 3
1,5
Velocidad de flujo de gas (l/min)
0,75
1 ajustado automáticamente de manera que el oxígeno disuelto está por encima de 60% (ajuste 100 % para 0,75 l/min y 1200 rpm, sin células) 2 vvm = l de gas/(l de líquido x min) 3 1 vvm para la fermentación utilizando la cepa FS09263-29-44-51
Preparación de soluciones de partida de glicerol
Las soluciones de partida de glicerol se prepararon utilizando cultivos en matraces oscilantes con pantallas laterales de 250 ml durante una noche (se llevaron a cabo a 30°C y se agitaron a 250 rpm). Tales cultivos se inocularon con
10 un asa llena de células de una placa de agar. Las células se cosecharon durante la fase logarítmica tardía (DO600 ~7-9) mientras había glucosa residual. El caldo se transfirió a tubos de centrífuga Falcon estériles de 50 ml y las células se centrifugaron durante 5 min. a aproximadamente 4.000 rpm a 4°C. Las células se volvieron a suspender en ~15 ml de solución de glicerol estéril al 15% (p/v). Se transfirió una alícuota de 1 ml de células suspendidas a crioviales y se almacenaron a -80 °C.
15 Cultivos de siembra e inóculo
Los cultivos de siembra se prepararon llevando a cabo cultivos secuenciales de matraces oscilantes, de manera que las células experimentaron un cierto número de generaciones antes de ser inoculadas en el biorreactor. El cultivo del matraz oscilante se llevó a cabo en un matraz oscilante de 500 ml utilizando un volumen de trabajo de 100 ml. El medio utilizado en los cultivos se describe más arriba. El matraz oscilante inicial se inoculó con un cultivo de solución 20 de partida de glicerol hasta una DO600 final de 0,01 o 0,001. Las células se incubaron a 30°C y 150 rpm y se recogieron cuando la DO600 alcanzó aproximadamente 1 (que corresponde a aproximadamente 10 generaciones) y se transfirieron al siguiente matraz oscilante. El procedimiento se repitió, de modo que se llevaron a cabo un total de 4 cultivos en matraz oscilante (o aproximadamente 40 generaciones) antes de la inoculación. El cultivo en el cuarto matraz se utilizó para inocular el reactor. La DO inicial de toda la fermentación fue de aproximadamente 0,001.
25 Cuando se utilizaron las cepas FS09258-53-32B-44-51 o FS09258-29-30-44-67, la DO inicial en la fermentación fue de aproximadamente 0,05 32
imagen27
Cepa
Inicio de Tiempo (h) µ (l/h) o velocidad de flujo (ml/h) DO600 Et (g/L)
FS09258-51-53-32B44
Fase de alimentación exponencial 25 0,08 1/h 30 40
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Fase 1 de alimentación constante 50 20 ml/h 110 0,15
imagen29
Fase 2 de alimentación constante 73 7,7 ml / h 190 0
FS09240-29-30-44
Fase de alimentación exponencial 43 0,1 1/h 15 12
imagen30
Fase 1 de alimentación constante 61 18 ml/h 40 0
imagen31
Fase 2 de alimentación constante 74 8,8 ml/h 110 0
FS09258-
Fase de alimentación exponencial 43 0,1 1/h 22 4
imagen32
Fase 1 de alimentación constante 63 20 ml/h 186 0
imagen33
Fase 2 de alimentación constante Ninguno Ninguno Ninguno Ninguno
FS09263-29-44-51
Fase de alimentación exponencial 42 0,1 1/h 20 20
imagen34
Fase 1 de alimentación constante 64 21 ml/h 160 0
imagen35
Fase 2 de alimentación constante 73 10,4 ml/h 184 0
FS09263-29-44-67
Fase de alimentación exponencial 24 0,1 1/h 18 22,7
imagen36
Fase 1 de alimentación constante 75 20 ml/h 108 0
imagen37
Fase 2 de alimentación constante Ninguno Ninguno Ninguno Ninguno
FS09263-29-44pSF057
Fase de alimentación exponencial 42 0,1 1/h 21.5 18
imagen38
Fase 1 de alimentación constante 63 21,3 ml/h 174 0
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Fase 2 de alimentación constante Ninguno Ninguno Ninguno Ninguno
34
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  1. imagen1
    imagen2
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Ito et al. Precise mapping and molecular characterization of the MFT1 gene involved in import of a fusion protein into mitochondria in Saccharomyces cerevisiae
Gola et al. An expression system for the functional analysis of pheromone genes in the tetrapolar basidiomycete Schizophyllum commune
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Přibylová et al. Expression of the Saccharomyces cerevisiae MPR1 gene encoding N-acetyltransferase in Zygosaccharomyces rouxii confers resistance tol-azetidine-2-carboxylate
Martini et al. is the fact that yeast species display a large genetic variability, often includ-ing phenotypically and genotypically highly diverging strains. Models including various taxonomically certified strains, more representative of the genetic variability within species, may be the ideal tool to conjugate bio-diversity and genetics.
Bao et al. Isolation of a gene greatly expressed in Kluyveromyces marxianus at high temperature