ES2666206T3 - Genes marcadores novedosos para linfocitos T reguladores de sangre humana - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de identificación o caracterización de linfocitos T humanos supresores y reguladores en una muestra de un paciente, en el que el procedimiento comprende detectar la expresión de una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 1 o 2.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

5

15

25

35

45

55

unión a lípidos. Cualquier especificidad por lo general se determina mediante regiones de bucle o inserciones en el extremo N del dominio, que no están conservados en todos los dominios pH. Los dominios PH se encuentran en proteínas de señalización celular, tales como serina/treonina cinasa, tirosina cinasas, reguladores de proteínas G, GTPasas endocíticas, adaptadores, así como moléculas asociadas al citoesqueleto y en enzimas asociadas a lípidos. Colonia 2, adicionalmente tiene un dominio efector Rho o de homólogos de la región 1 de homología a cinasa relacionada con la proteína cinasa C en la región 19-95, que se describió por primera vez como una región de homología repetida tres veces de la parte no catalítica del extremo N de la proteína cinasa PRK1 (PKN). Más tarde se demostró que las primeras dos de estas repeticiones se unen a la pequeña G proteína rho que se sabe que activa PKN en su forma unida a GTP. También aparecen dominios de unión a rho similares en un número de otras proteínas cinasas y en las proteínas de unión a rho rhofilina y rhotecina. Recientemente, se ha determinado por cristalografía de rayos X la estructura de la repetición REM N terminal que forma complejo con RhoA. Forma un pliegue superenrollado antiparalelo denominado un dedo ACC. La predicción del dominio transmembrana con el servidor de predicción de dominio transmembrana en línea "DAS" ubicado en http://www.sbc.su.se/%7Emiklos/DAS/ identificó 4 regiones transmembrana potenciales (41-44, 197-199, 287-297, 300-301), mientras que la región de 289294 tenía la probabilidad más alta. La proteína supuesta tiene una alta homología (> 73 %) a las secuencias de proteínas supuestas de PLEKHK1 descritas para ratón y rata. Varias variantes de corte y empalme se caracterizan por Collier y col. y, además, muestran una expresión selectiva de este gen en linfocitos T CD4+ en reposo. Esta proteína se encuentra principalmente en el citoplasma. El análisis de la expresión en diferentes tejidos demostró una expresión de nivel medio en el tejido pulmonar, mientras que solo se observó la expresión a niveles bajos o ausentes de Colonia 2 en todos los demás tejidos analizados, incluyendo médula ósea, hígado, corazón, bazo, riñón, timo, músculo esquelético, cerebro, la médula espinal, próstata y páncreas. Se sugiere que Colonia 2 puede ser un marcador de madurez con un papel importante en el desarrollo de linfocitos ((Collier y col., Biochem. Biophys. Res. Commun.; 324: 1360-1369 (2004))) y la regulación de este gen puede asociarse a la proliferación celular y/o la señalización de activación de linfocitos T, la división y la diferenciación de linfocitos.

Se pueden identificar ligandos/fragmentos del CMH de Colonia 2 adecuados mediante el procedimiento descrito en relación con Colonia 1 anterior.

Se muestran fragmentos particulares del CMH de Colonia 2 en la SEQ ID NO: 256-435.

HPGD: HPGD Humano (hidroxiprostaglandina deshidrogenasa 15-(NAD); en lo sucesivo en el presente documento también denominado "Colonia 3" o "Col3"), se ubica en la región genómica 175680186-175647955 en el cromosoma 4 en la región 4q34-35. Consiste en 7 exones resultantes de la transcripción en un ARNm que tiene 2592 pares de bases. La secuencia codificante en sí consiste en 801 pares de bases (véase la SEQ ID NO: 7). La traducción de esta secuencia da como resultado una proteína supuesta con una longitud de 266 aminoácidos (SEQ ID NO: 8).

Las prostaglandinas están implicadas en muchos procesos fisiológicos y celulares, tales como la inflamación (Pichaud y col., Hum Genet.; 99: 279-281 (1997)) y HPGD es la principal enzima de degradación de las prostaglandinas. Mediante la catálisis de la conversión del grupo 15-hidroxilo de las prostaglandinas en un grupo ceto, esta enzima ubicua reduce fuertemente la actividad biológica de estas moléculas.

La proteína se exploró para determinar los dominios funcionales y Colonia 3 tiene un dominio deshidrogenasa de cadena corta en la región 8-250. Esta familia contiene una amplia diversidad de deshidrogenasas. Colonia 3 es un homodímero situado principalmente en el citoplasma con la capacidad de catalizar la reacción de (5Z,13E)-(15S)-11alfa,15-dihidroxi-9-oxoprost-13-enoato + NAD+ a (5Z,13E)-11-alfa-hidroxi-9,15-dioxoprost-13-enoato + NADH y da como resultado la inactivación de las prostaglandinas. La predicción del dominio transmembrana con el servidor de predicción de dominio transmembrana en línea "DAS" ubicado en http://www.sbc.su.se/%7Emiklos/DAS/ identificó 5 regiones transmembrana potenciales (80, 162-170, 188-195, 238-240, 278-286), mientras que la región 164-167 tenían la probabilidad más alta. La proteína supuesta tiene una alta homología (> 88 %) a las secuencias de proteínas supuestas de Colonia 3 descritas para ratón y rata. El análisis de la expresión en diferentes tejidos demostró solamente la expresión a niveles bajos o ausentes de Colonia 3 en todos los tejidos analizados, incluyendo médula ósea, hígado, corazón, bazo, pulmón, riñón, timo, músculo esquelético, cerebro, médula espinal, próstata y páncreas.

Pueden identificarse ligandos/fragmentos adecuados del CMH de Colonia 3 mediante el procedimiento descrito en relación con Colonia 1 anterior.

Se muestran fragmentos particulares del CMH de Colonia 3 en la SEQ ID NO: 436-536.

DNAPTP6: DNAPTP6 humano (proteína 6 transactivada por ADN polimerasa; en lo sucesivo en el presente documento también denominada "Colonia 4" o "Col4"), se ubica en la región genómica 200879041-201051498 en el cromosoma 2 en la región 2q33.1. Consiste en 13 exones resultantes de la transcripción en un ARNm que tiene 2355 pares de bases (véase la SEQ ID NO: 9). La secuencia codificante en sí consiste en 1677 pares de bases. La traducción de esta secuencia da como resultado una proteína supuesta con una longitud de 558 aminoácidos (SEQ ID NO: 10).

La proteína se exploró para determinar los dominios funcionales y Colonia 4 tiene un dominio DUF1387 en la región

9 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

59-368, que representa un dominio de función desconocida. Esta familia representa una región conservada de aproximadamente 300 restos de longitud dentro de un número de proteínas hipotéticas de función desconocida que parecen estar restringidas a mamíferos. La predicción del dominio transmembrana con el servidor de predicción de dominio transmembrana en línea "DAS" ubicado en http://www.sbc.su.se/%7Emiklos/DAS/ identificó 4 regiones transmembrana potenciales (41-44, 72, 88, 409-416, 585-593), mientras que la región 587-591 tenía la probabilidad más alta. La proteína supuesta tiene una alta homología (> 89 %) a las secuencias de proteínas supuestas de DNAPTP6 descritas para ratón y rata. El análisis de la expresión en diferentes tejidos demostró solamente la expresión a niveles bajos o ausentes de Colonia 4 en todos los tejidos analizados, incluyendo médula ósea, hígado, corazón, bazo, pulmón, riñón, timo, músculo esquelético, cerebro, médula espinal, próstata y páncreas.

Pueden identificarse ligandos/fragmentos del CMH adecuados de Colonia 4 mediante el procedimiento descrito en relación con Colonia 1 anterior.

Se muestran fragmentos particulares del CMH de Colonia 4 en la SEQ ID NO: 537-660.

C1orf78: C1orf78 humano (marco de lectura abierto 78 del cromosoma 1; en lo sucesivo en el presente documento también denominado "Colonia 5" o "Col5"), se ubica en la región genómica 36562342-36560219 en el cromosoma 1 en la región 1p34.3. Consiste en 3 exones resultantes de la transcripción en un ARNm que tiene 1054 pares de bases (véase la SEQ ID NO: 11). La secuencia codificante en sí se compone de 495 pares de bases. La traducción de esta secuencia da como resultado una proteína supuesta con una longitud de 164 aminoácidos (SEQ ID NO: 12).

La proteína se exploró para determinar los dominios funcionales y no pudieron identificarse dominios conocidos anteriormente para Colonia 5. La predicción del dominio transmembrana con el servidor de predicción de dominio transmembrana en línea "DAS" ubicado en http://www.sbc.su.se/%7Emiklos/DAS/ identificó 1 región transmembrana potencial (68-93) en la que la región 69-92 tenía la probabilidad más alta. La proteína supuesta tiene una alta homología (> 89 %) a las secuencias de proteínas supuestas de Colonia 5 descritas para ratón y rata. El análisis de la expresión en diferentes tejidos demostró una expresión de nivel medio en tejidos de pulmón, bazo, timo y cerebro, mientras que solo se observó una expresión a niveles bajos o ausentes de Colonia 5 en todos los demás tejidos analizados, incluyendo médula ósea, hígado, corazón, riñón, músculo esquelético, médula espinal, próstata y páncreas.

Pueden identificarse ligandos/fragmentos adecuados del CMH de Colonia 5 mediante el procedimiento descrito en relación con Colonia 1 anterior. Se muestran fragmentos particulares del CMH de Colonia 5 en la SEQ ID NO: 661

708.

FLJ45983: FLJ45983 humano (proteína FLJ45983; en lo sucesivo en el presente documento también denominada "Colonia 6" o "Col6"), se ubica en la región genómica 8135453-8132419 en el cromosoma 10 en la región 10p14. Consiste en 2 exones resultantes de la transcripción en un ARNm que tiene 2213 pares de bases (véase la SEQ ID NO: 13). La secuencia codificante en sí se compone de 378 pares de bases. La traducción de esta secuencia da como resultado una proteína supuesta con una longitud de 125 aminoácidos (SEQ ID NO: 14).

La proteína se exploró para determinar los dominios funcionales y no pudieron identificarse dominios conocidos anteriormente para Colonia 6. La predicción del dominio transmembrana con el servidor de predicción de dominio transmembrana en línea "DAS" ubicado en http://www.sbc.su.se/%7Emiklos/DAS/ identificó 1 región transmembrana potencial (100-108). El producto de proteína supuesta de Colonia 6 no tiene una homología obvia a las secuencias de proteínas conocidas que se describen para ratón y rata. El análisis de la expresión en diferentes tejidos demostró una expresión de nivel medio en el tejido del riñón mientras que solo se observó una expresión a niveles bajos o ausentes de Colonia 6 en todos los demás tejidos analizados, incluyendo médula ósea, hígado, corazón, bazo, pulmón, timo, músculo esquelético, cerebro, médula espinal, próstata y páncreas.

Pueden identificarse ligandos/fragmentos del CMH adecuados de Colonia 6 mediante el procedimiento descrito en relación con Colonia 1 anterior.

Se muestran fragmentos particulares del CMH de Colonia 6 en la SEQ ID NO: 709-734.

ACTA2: ACTA2 Humano (actina, alfa 2, músculo liso, aorta) se ubica en la región genómica 90702490-90684810 en el cromosoma 10 en la región 10q23.3. Consiste en 9 exones resultantes de la transcripción en un ARNm que tiene 1330 pares de bases (véase la SEQ ID NO: 15). La secuencia codificante en sí consiste en 1134 pares de bases. La traducción de esta secuencia da como resultado una proteína supuesta con una longitud de 377 aminoácidos (SEQ ID NO: 16).

Actina alfa 2, el gen de actina de músculo liso aórtico humano es una de las seis isoformas de actina diferentes que se han identificado. Las actinas son proteínas altamente conservadas que están implicadas en la motilidad, la estructura y la integridad celulares. Las actinas alfa son un constituyente principal del aparato contráctil.

La proteína se exploró para determinar los dominios funcionales y ACTA2 tiene un dominio de actina en la región 1 377, que pertenece a la subfamilia de actina de la superfamilia de actina/MreB/azúcarcinasa/Hsp70. Cualquier especificidad por lo general se determina mediante regiones bucle o inserciones en el extremo N del dominio, que no

10

imagen8

imagen9

imagen10

imagen11

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

gen CD40LG que se asocian al síndrome de inmunodeficiencia hiper-IgM de tipo 1.

Pueden identificarse ligandos/fragmentos adecuados del CMH de CD4OLG humano mediante el procedimiento descrito en relación con la Colonia 1 anterior.

CTLA4: CTLA4 humano (proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos), también conocida como CD152, se ubica en la región genómica 204440753-204446927, en el cromosoma en la región 2q33. La isoforma a consiste en 4 exones resultantes de la transcripción en un ARNm que tiene 1988 pares de bases (véase la SEQ ID NO: 25). La secuencia codificante en sí consiste en 672 pares de bases. La traducción de esta secuencia da como resultado una proteína supuesta con una longitud de 223 aminoácidos (SEQ ID NO: 26). La isoforma B consiste en 3 exones resultantes de la transcripción en un ARNm que tiene 1878 pares de bases (véase la SEQ ID NO: 27). La secuencia codificante en sí consiste en 525 pares de bases. La traducción de esta secuencia da como resultado una proteína supuesta con una longitud de 174 aminoácidos (SEQ ID NO: 28).

Este gen es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas y codifica una proteína que transmite una señal inhibidora a linfocitos T. La proteína contiene un dominio V, un dominio transmembrana y una cola citoplasmática. Se han caracterizado variantes de corte y empalme transcripcionales alternativos, que codifican diferentes isoformas. La isoforma unida a la membrana funciona como un homodímero interconectado mediante un enlace disulfuro, mientras que la isoforma soluble funciona como un monómero. Las mutaciones en este gen se han asociado a la diabetes mellitus dependiente de insulina, la enfermedad de Graves, la tiroiditis de Hashimoto, la enfermedad celíaca, el lupus eritematoso sistémico, la orbitopatía asociada a la tiroides y otras enfermedades autoinmunitarias.

La proteína se exploró para determinar los dominios funcionales y CTLA4 tiene un dominio similar a la inmunoglobulina en la región 53-131. Las moléculas de Ig son proteínas altamente modulares, en las que los dominios variables y constantes tienen patrones de secuencia claras y conservadas. Los dominios en las moléculas Ig y similares a Ig se agrupan en cuatro tipos: conjunto V (variable), conjunto C1 (constante 1), conjunto C2 (constante 2) y conjunto I-set (intermedio). Estudios estructurales han demostrado que estos dominios comparten una estructura sándwich beta de llave griega núcleo común, difiriendo los tipos en el número de cadenas en las láminas beta, así como en sus patrones de secuencia. Pueden encontrarse dominios similares a Ig que se relacionan tanto en secuencia como en estructura en varias familias de proteínas diversas. Los dominios similares a Ig están implicados en una diversidad de funciones, incluyendo el reconocimiento célula-célula, los receptores de superficie celular, la estructura muscular y el sistema inmunitario. Además, CTLA4 tiene un dominio transmembrana en la región 162-184. Los dominios transmembrana se componen de 15-30 restos hidrófobos y se encuentran en proteínas que abarcan una membrana en una célula. Una proteína puede tener un único dominio TM (por ejemplo, receptores transmembrana de Tipo I tales como el receptor de EGF) o múltiples dominios TM (por ejemplo, receptores acoplados a proteína G). Para abarcar el núcleo hidrocarbonado de la membrana de ~ 3 nm requiere una hélice alfa de ~20 restos predominantemente apolares sin carga. La membrana separa dos compartimentos acuosos mediante una fase lipídica bidimensional delgada. Las proteínas de membrana generalmente abarcan esta fase lipídica y, por tanto, necesitan acomodarse al tramo hidrófilo a ambos lados de la membrana, así como al entorno hidrófobo en el núcleo de la bicapa. La estructura de las porciones embebidas en la membrana consiste ya sea en hélices alfa transmembrana montadas con frecuencia en haces de hélices, o en láminas beta antiparalelas que forman poros en forma de barril. La longitud de la hélice transmembrana puede incluso correlacionarse con el espesor de su membrana. Las proteínas que abarcan una sola vez la membrana del retículo endoplasmático (RE) y Golgi tienen generalmente dominios transmembrana más cortos que las proteínas de la membrana plasmática. Puesto que el contenido de colesterol y, por tanto, el espesor de la bicapa lipídica también aumenta junto con la vía secretora, esto podría reflejar un papel de los segmentos y proteínas transmembrana en la clasificación de los lípidos. En proteínas que abarcan la membrana múltiples veces las hélices transmembrana se unen estrechamente a la estructura compacta, globular, de la que se excluyen los lípidos. En proteínas que abarcan la membrana múltiples veces las hélices transmembrana se unen estrechamente a la estructura compacta, globular, de la que se excluyen los lípidos. CTLA4, adicionalmente, tiene un dominio de péptido señal N terminal en la región 1-36. Por lo general se encuentra en el extremo N y normalmente está ausente en la proteína madura. Normalmente se refiere a la secuencia (aproximadamente 20 aminoácidos) que interactúa con la partícula de reconocimiento de señal y dirige el ribosoma al retículo endoplasmático donde tiene lugar la inserción cotraslacional. Los péptidos señal son altamente hidrófobos, pero con algunos restos de carga positiva. La secuencia señal normalmente es retirada de la cadena peptídica en crecimiento por la peptidasa señal, una proteasa específica ubicada en la cara cisternal del retículo endoplasmático. La proteína tiene una alta homología (> 74 %) a las secuencias proteicas de CTLA4 descritas para ratón y rata. Esta proteína se ubica principalmente en la membrana plasmática. El análisis de la expresión en diferentes tejidos demostró una expresión de nivel medio en linfocitos T activos, el bazo, la médula ósea, el timo y el tejido pulmonar, mientras que solo se observaron niveles de expresión bajos o ausentes de CTLA4 en todos los demás tejidos analizados, incluyendo hígado, corazón, riñón, músculo esquelético, cerebro, médula espinal, próstata y páncreas. CTLA4 es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas y es una molécula coestimuladora expresada por linfocitos T activados. CTLA4 es similar al linfocito T coestimulador CD28 y ambas moléculas se unen a B7-1 (CD80) y B7-2 (CD86) sobre las células presentadoras de antígeno. CTLA4 transmite una señal inhibidora a los linfocitos T, mientras que CD28 transmite una señal estimuladora. CTLA4 contiene una secuencia líder, un dominio V, un dominio transmembrana y una cola citoplasmática codificada por 4 exones, respectivamente. La cola citoplasmática contiene 2 sitios de fosforilación potenciales. El análisis por transferencia

15 5

15

25

35

45

55

Northern detectó 2 transcritos de ARNm de CTLA4 1,8 y 0,8 kb en linfocitos T de sangre periférica activados. Linsley y col. (Linsley y col., J. Biol. Chem.; 270: 15417-15424 (1995)) demostraron que la proteína CTLA4 es un homodímero interconectado por un enlace disulfuro en el dominio extracelular en el resto de cisteína 120. Cada polipéptido monomérico contiene un sitio de unión de alta afinidad para las moléculas coestimuladoras B7-1 y B7-2. Usando RT-PCR, Magistrelli y col. (Magistrelli y col., Eur. J. Immunol.; 29: 3596-3602 (1999)) descubrieron que los linfocitos T de sangre periférica humana no activados expresaban una forma cortada y empalmada alternativa de CTLA4. El corte y empalme induce la deleción de la región transmembrana codificada por el exón 2, dando como resultado la producción de una forma soluble de la proteína con una masa molecular de 23 kD; CTLA4 de membrana tiene una masa molecular aparente de 45 kD, lo que sugiere que la forma soluble es una proteína monomérica. Estudios funcionales demostraron que la forma soluble de CTLA4 se regula negativamente mediante la activación de linfocitos T, a diferencia de CTLA4 de membrana, que se regula positivamente mediante la activación de linfocitos T. CTLA4 se une a las isoformas B7 con una afinidad que es de 10 a 100 veces la de CD28. Ostrov y col. (Ostrov y col., Science; 290: 816-819 (2000)) determinaron la estructura cristalina de la porción extracelular de Ctla4 murino a una resolución de 2,0 angstrom. De acuerdo con su pertenencia a la superfamilia de Ig, Ctla4 muestra una topología de cadena similar a los dominios V-alfa. Ctla4 tiene un modo de dimerización inusual que coloca los sitios de unión a B7 distales a la interfaz de dimerización, permitiendo que cada dímero Ctla4 se una a 2 moléculas de B7 divalentes. Los autores sugirieron que la reordenación periódica de estos componentes podría explicar el papel de CTLA4 en la regulación de sensibilidad de los linfocitos T. Oaks y col. (Oaks y col., Cell Immunol.; 201: 144-153 (2000)) descubrieron que la activación de linfocitos humanos dio como resultado la desaparición de sCTLA4 a las 48 horas seguida de su reaparición gradual, mientras que CTLA4-TM aumentó rápidamente y se mantuvo presente al mismo nivel después de la activación. CTLA4Ig es una proteína quimérica soluble que consiste en el dominio extracelular de CTLA4 humano y un fragmento de la porción Fc de la IgG1 humana. Se une a moléculas de B7-1 y B7-2 sobre células presentadoras de antígeno (CPA) y de ese modo bloquea la señal coestimuladora mediada por CD28 para la activación de los linfocitos T. Fallarino y col. (Fallarino y col., Nat. Immunol.; 4: 1206-1212 (2003)) demostraron que las células Tr CD4+/CD25+ de ratón que expresan Ctla4 condicionaron que DC (células dendríticas) que expresan B7 expresen Ido y produzcan IFNg. Las DC (células dendríticas) condicionadas in vitro por los linfocitos Tr mediaron efectos supresores in vivo que fueron dependientes del catabolismo eficaz del triptófano. El requisito para la expresión de Ctla4 se superó en linfocitos Tr estimulados con lipopolisacárido para producir cantidades sustanciales de Ifng e interleucina 10 (IL-10). Fallarino y col. (Fallarino y col., Nat. Immunol.; 4: 1206-1212 (2003)) concluyeron que los linfocitos Tr ceban las DC (células dendríticas) para la inducción de tolerancia a través de la inmunorregulación a base de IDO. Usando ensayos de migración in vitro y microscopía de barrido láser de 2 fotones in vivo, Schneider y col. en. (Schneider y col., Science; 313: 1972-1975 (2006)) demostraron que CTLA4 aumenta la motilidad de los linfocitos T y anula la señal de parada inducida por el receptor de linfocitos T (TCR, por sus siglas en inglés) necesaria para la formación de conjugados estables entre linfocitos T y células presentadoras de antígeno. Este evento condujo a periodos de contacto reducidos entre linfocitos T y células presentadoras de antígeno que, a su vez, disminuyeron la producción y proliferación de citocinas. Schneider y col. (Schneider y col., Science; 313: 1972-1975 (2006)) llegaron a la conclusión de que sus resultados sugieren un modelo fundamentalmente diferente de la señalización de parada inversa, mediante el cual CTLA4 modula el umbral para la activación de linfocitos T y protege frente a la autoinmunidad.

Pueden identificarse ligandos/fragmentos adecuados del CMH de CTLA4 humano mediante el procedimiento descrito en relación con la Colonia 1 anterior.

CTSL1: CTSL1 Humana (catepsina L1) se ubica en la región genómica 89530799-89536127 en el cromosoma 9 en la región 9q21-q22. La isoforma a consiste en 6 exones resultantes de la transcripción en un ARNm que tiene 1731 pares de bases. La isoforma b consiste en 6 exones resultantes de la transcripción en un ARNm que tiene 1587 pares de bases (véase la SEQ ID NO: 29). Ambas isoformas codifican la misma proteína cuya secuencia codificante real consiste en sí en 1002 pares de bases. La traducción de esta secuencia da como resultado una proteína supuesta con una longitud de 333 aminoácidos (SEQ ID NO: 30).

La proteína codificada por este gen es una cisteína proteinasa lisosómica que desempeña un papel fundamental en el catabolismo intracelular de proteínas. Sus sustratos incluyen el colágeno y la elastina, así como el inhibidor de proteasa alfa-1, un elemento de control fundamental de la actividad elastasa de neutrófilos. La proteína codificada se ha implicado en varios procesos patológicos, incluyendo la necrosis de miofibrillas en las miopatías y en la isquemia miocárdica y en la respuesta tubular renal a proteinuria. Esta proteína, que es un miembro de la familia C1 de peptidasas, es un dímero compuesto de cadenas pesadas y ligeras unidas por puentes disulfuro, producidas ambas a partir de un único precursor proteico. Se han descubierto para este gen al menos dos variantes de transcrito que codifican la misma proteína. La proteína se exploró para determinar los dominios funcionales y CTSL1 tiene un dominio cisteína proteasa de la familia de la papaína en la región 114-332. La familia de la papaína tiene una amplia diversidad de actividades, incluyendo endopeptidasas de gama amplia (papaína) y de gama estrecha, aminopeptidasas, dipeptidil peptidasas y enzimas con actividad tanto exo como endopeptidasa. Los miembros de la familia de la papaína están extendidos, se encuentran en baculovirus, eubacterias, levadura y prácticamente todos los protozoos, plantas y mamíferos. Las proteínas son normalmente lisosómicas o secretadas, y se requiere la escisión proteolítica del propéptido para la activación enzimática, aunque la bleomicina hidrolasa es citosólica en hongos y mamíferos. Las cisteína proteinasas similares a papaína se sintetizan esencialmente como proenzimas inactivas (zimógenos) con regiones propeptídicas N terminales. El proceso de activación de estas enzimas incluye la

16

imagen12

5

15

25

35

45

55

diferenciación del mesodermo posterior durante la gastrulación en una forma dependiente de la dosis. Las proteínas caja T tienden a expresarse en órganos específicos o tipos celulares, especialmente durante el desarrollo, y por lo general se requieren para el desarrollo de esos tejidos, por ejemplo, Brachyury se expresa en el mesodermo posterior y en la notocorda en desarrollo, y se requiere para la formación de estas células en ratones. La predicción del dominio transmembrana con el servidor de predicción de dominio transmembrana en línea "DAS" ubicado en http://www.sbc.su.se/%7Emiklos/DAS/ identificó 4 regiones transmembrana potenciales (10-14, 118-130, 250-261, 316-317), mientras que la región 121-127 tenía la probabilidad más alta. La proteína tiene una alta homología (> 86 %) a las secuencias proteicas de EOMES descritas para ratón y rata. El análisis de la expresión en diferentes tejidos demostró una expresión de nivel medio en el tejido del bazo, mientras que solo se observaron niveles de expresión bajos o ausentes de EOMES en todos los demás tejidos analizados, incluyendo médula ósea, hígado, pulmón, corazón, bazo, riñón, timo, músculo esquelético, cerebro, médula espinal, próstata y páncreas. Las mutaciones en el gen T (Brachyury) de ratón provocan defectos en la formación del mesodermo. Varios genes relacionados, miembros de la familia de genes caja T, codifican un dominio de unión a ADN N terminal similar, la caja T, y desempeñan papeles críticos en el desarrollo embrionario humano. Las mutaciones en TBX5 y TBX3 humanos, por ejemplo, provocan los trastornos del desarrollo síndrome de Holt-Oram y síndrome ulnar-mamario, respectivamente. Pearce y col. (Pearce y col., Science; 302: 1041-1043 (2003)) mostraron que eomesodermina, un parálogo de Tbet, se induce en linfocitos T CD8(+) efectores in vitro e in vivo. La expresión ectópica de Eomes era suficiente para recurrir a atributos de efector linfocitos T CD8(+), incluyendo interferón-gamma, perforina y granzima

B. El análisis de pérdida de función sugirió que Eomes también puede ser necesario para la diferenciación efectora completa de los linfocitos T CD8(+). Pearce y col. (Pearce y col., Science; 302: 1041-1043 (2003)) sugirieron que la eomesodermina probablemente complementa las acciones de Tbet y actúa como un gen regulador clave en el desarrollo de la inmunidad mediada por células.

Pueden identificarse ligandos/fragmentos adecuados del CMH de EOMES humanos mediante el procedimiento descrito en relación con la Colonia 1 anterior.

EPB41L3: EPB41L3 Humano (3 similar a banda 4.1 de proteína de membrana de eritrocitos) se ubica en la región genómica 5533985-5382387 en el cromosoma 18 en la región 18p11.32. Consiste en 16 exones resultantes de la transcripción en un ARNm que tiene 4446 pares de bases (véase la SEQ ID NO: 35). La secuencia codificante en sí consiste en 3264 pares de bases. La traducción de esta secuencia da como resultado una proteína supuesta con una longitud de 1087 aminoácidos (SEQ ID NO: 36).

La proteína se exploró para determinar los dominios funcionales y EPB41L3 tiene un dominio banda de homólogos de Banda 4.1 en la región 106-301, que también se conoce como dominio de proteína ezrina/radixina/moesina (ERM) presente en miosinas, ezrina, radixina, moesina, proteína tirosina fosfatasas. Estas proteínas desempeñan papeles estructurales y reguladores en el ensamblaje y la estabilización de dominios plasmamembrana especializados. Algunas proteínas que contienen dominio PDZ se unen una o más de esta familia. Ahora incluye las JAK. Este dominio se encuentra en un número de proteínas asociadas al citoesqueleto que se asocian a diversas proteínas en la interfaz entre la membrana plasmática y el citoesqueleto. Es un dominio N terminal conservado de aproximadamente 150 restos implicado en la unión de proteínas citoplasmáticas a la membrana. EPB41L3, adicionalmente, tiene un dominio superenrollado en la región 708-742. El superenrollamiento es un dominio proteico que forma un haz de dos o tres hélices alfa. Los dominios superenrollados cortos están implicados en las interacciones proteicas pero los dominios superenrollados que forman varillas largas se producen en proteínas estructurales o motoras. La predicción del dominio transmembrana con el servidor de predicción de dominio transmembrana en línea "DAS" ubicado en http://www.sbc.su.se/%7Emiklos/DAS/ identificó 4 regiones transmembrana potenciales (218-231, 311-322, 586-590, 630-667), mientras que las regiones 220-230, 313-320 y 632-664 tenían la probabilidad más alta. La proteína tiene una alta homología (> 88 %) a las secuencias proteicas de EPB41L3 descritas para ratón y rata. Esta proteína se ubica principalmente en la membrana plasmática. El análisis de la expresión en diferentes tejidos demostró una expresión de nivel medio en cerebro, riñón, testículos y tejido intestinal mientras que solo se observaron niveles de expresión bajos o ausentes de EPB41L3 en todos los demás tejidos analizados, incluyendo médula ósea, pulmón, hígado, corazón, bazo, timo, músculo esquelético, médula espinal, próstata y páncreas.

Pueden identificarse ligandos/fragmentos adecuados del CMH de EPB41L3 humano mediante el procedimiento descrito en relación con la Colonia 1 anterior.

FCGBP: FCGBP humano (fragmento Fc de la proteína de unión a IgG) se sitúa en la región genómica 4513237245045810 en el cromosoma 19 en la región 19q13.1. FCGBP consiste en 31 exones resultantes de la transcripción en un ARNm que tiene 9378 pares de bases (véase la SEQ ID NO: 39). La secuencia codificante en sí consiste en 9213 pares de bases. La traducción de esta secuencia da como resultado una proteína con una longitud de 3070 aminoácidos (SEQ ID NO: 40).

En algunos tejidos no linfoides, se expresa el locus (TRGγ) gamma del receptor de linfocitos T no reordenado. El transcrito resultante contiene un subconjunto de los segmentos génicos TRGγ y es más corto que los transcritos TRGγ expresados en tejidos linfoides. Este registro RefSeq representa el transcripto de locus TRGγ reordenado; el locus de TRGγ completo se representa mediante el RefSeq genómico NG_001336. El transcripto representado por este RefSeq tiene dos marcos de lectura abiertos (ORF, por sus siglas en inglés) que codifican diferentes proteínas.

18 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

El ORF corriente abajo está en el mismo marco que TRGγ y su producto proteico es similar a las proteínas TRGγ. El ORF corriente arriba usa un marco de lectura diferente y codifica una proteína nueva.

La proteína se exploró para determinar los dominios funcionales y FCGBP tiene 13 dominios D de tipo factor de von Willebrand (vWF) en la región 463-627, 862-1019, 1249-1406, 1662-1831, 2064-2222, 2450-2607, 2863-3032, 32653423, 3651-3808, 4064-4233, 4463-4624, 4848-5002 y 5228-5382. El factor de Von Willebrand contiene varios dominios de tipo D: D1 y D2 están presentes dentro del propéptido N terminal, mientras que los dominios D restantes se requieren para la multimerización. Una familia de reguladores de crecimiento (denominados originalmente cef10, factor de crecimiento de tejido conjuntivo, fisp-12, cyr61, o, como alternativa, IG-M1 beta y IG-M2 beta), pertenecen todos a genes tempranos inmediatos expresados después de la inducción por factores de crecimiento o ciertos oncogenes. El análisis de secuencia de esta familia reveló la presencia de cuatro módulos distintos. Cada módulo tiene homólogos en otras proteínas de mosaico extracelulares tales como factor de Von Willebrand, rendija, tromboespondinas, colágenos fibrilares, proteínas de unión a IGF y mucinas. La clasificación y el análisis de estos módulos sugieren la ubicación de regiones de unión y, por analogía a módulos mejor caracterizados en otras proteínas, arroja algo de luz sobre la estructura de esta nueva familia. El dominio de vWF se encuentra en diversas proteínas plasmáticas: factores del complemento B, C2, CR3 y CR4; las integrinas (dominios I); tipos de colágeno VI, VII, XII y XIV; y otras proteínas extracelulares. Aunque la mayoría de las proteínas que contienen VWA son extracelulares, las más antiguas presentes en todos los eucariotas son todas proteínas intracelulares implicadas en funciones tales como la transcripción, la reparación del ADN, el transporte ribosómico y de membrana y el proteosoma. Una característica común parece ser la implicación en complejos multiproteicos. Las proteínas que incorporan dominios de vWF participan en numerosos eventos biológicos (por ejemplo, adhesión celular, la migración, retorno, formación de patrones y transducción de señales), implicando la interacción con una gran diversidad de ligandos. Un número de enfermedades humanas surgen de mutaciones en los dominios VWA. La predicción de estructura secundaria de 75 secuencias de vWF alineadas ha revelado una secuencia en gran parte alternante de hélices alfa y cadenas beta. Una de las funciones del factor de von Willebrand (vWF) es servir como un transportador del factor de coagulación VIII (FVIII). La conformación nativa del dominio D' de vWF no solo se requiere para la unión al factor VIII (FVIII), sino también para la multimerización normal y la secreción óptima. La predicción del dominio transmembrana con el servidor de predicción de dominio transmembrana en línea "DAS" ubicado en http://www.sbc.su.se/%7Emiklos/DAS/ identificó para 8 regiones transmembrana potenciales FCGBP (11-15, 312-318, 580-586, 416-419, 1801-1807, 1827-1830, 2578-2581, 2901-2904). No se ha notificado ninguna homología a secuencias proteicas conocidas de ratón o rata para la secuencia de la proteína humana de FCGBP. Esta proteína se ubica principalmente extracelularmente. El análisis de la expresión en diferentes tejidos demostró una expresión de nivel medio en intestino, bazo, riñón, pulmón, timo, próstata y tejido páncreas mientras que solo se observaron niveles de expresión bajos o ausentes de FCGBP en todos los demás tejidos analizados, incluyendo médula ósea, hígado, corazón, cerebro, músculo esquelético y médula espinal.

Pueden identificarse ligandos/fragmentos adecuados del CMH de FCGBP humano mediante el procedimiento descrito en relación con la Colonia 1 anterior.

FHIT: FHIT Humano (gen de la tríada de histidina frágil), también conocido como FRA3B o AP3Aasa, se ubica en la región genómica 59.712.992-60.497.735 en el cromosoma 3 en la región 3p14.2. Consiste en 5 exones resultantes de la transcripción en un ARNm que tiene 1095 pares de bases (véase la SEQ ID NO: 41). La secuencia codificante en sí consiste en 444 pares de bases. La traducción de esta secuencia da como resultado una proteína con una longitud de 147 aminoácidos (SEQ ID NO: 42).

Este gen, un miembro de la familia de genes de la tríada de histidina, codifica una diadenosina 5',5"'-P1,P3-trifosfato hidrolasa implicada en el metabolismo de purinas. El gen abarca el sitio frágil común FRA3B en el cromosoma 3, donde el daño inducido por carcinógenos puede conducir a translocaciones y transcritos aberrantes de este gen. De hecho, se han descubierto transcritos aberrantes de este gen en aproximadamente la mitad de todos los carcinomas de esófago, de estómago y de colon.

La proteína se exploró para determinar los dominios funcionales, FHIT tiene un motivo tríada de histidina (HIT, por sus siglas en inglés) que abarca toda la proteína. El motivo tríada de histidina (HIT), His-phi-His-phi-His-phi-phi (phi, un aminoácido hidrófobo) se identificó como que está altamente conservado en una diversidad de organismos. La estructura cristalina de Hint de conejo, purificado como una proteína de unión a adenosina y AMP, mostró que las proteínas en la superfamilia HIT se conservan como proteínas de unión a nucleótidos y que los homólogos de Hint, que se encuentran en todas las formas de vida, se relacionan estructuralmente con homólogos de Fhit y enzimas relacionadas con GalT, que tienen perfiles filogénicos más restringidos. Los homólogos de Hint incluyendo Hint de conejo y Hnt1 de levadura hidrolizan sustratos de adenosina 5' monofosforamida tales como AMP-NH2 y AMP-lisina a AMP más el producto de amina y funcionan como reguladores positivos de Cdk7/Kin28 in vivo. Los homólogos de Fhit son diadenosina polifosfato hidrolasas y funcionan como supresores tumorales en ser humano y ratón, aunque la función de supresión tumoral de Fhit no depende de la hidrólisis de ApppA. La tercera rama de la superfamilia HIT, que incluye homólogos de GALT, contiene un motivo His-X-His-X-Gln relacionado y transfiere restos de monofosfatos de nucleósidos a segundos sustratos fosforilados en lugar de hidrolizarlos.

La predicción del dominio transmembrana con el servidor de predicción de dominio transmembrana en línea "DAS" ubicado en http://www.sbc.su.se/%7Emiklos/DAS/ no identificó regiones transmembrana. FHIT tiene una alta

19 5

15

25

35

45

55

homología (> 88 %) a las secuencias proteicas de FHIT para ratón y rata. Huebner y Croce ((Huebner y Croce, Br. J. Cancer; 88: 1501-1506)) revisaron las mutaciones en FHIT en tumores primarios y las características clínicas asociadas. Señalaron que, desde que el gen FHIT se encontró en 1996 se habían publicado más de 350 informes de estudios. Los datos que resumieron indicaron que FHIT está alterado en muchos tumores humanos, en particular en los provocados por agentes carcinógenos ambientales, tales como los presentes en el humo del tabaco. En muchos de estos tumores, en particular en los inducidos por el tabaco u otros carcinógenos ambientales, las alteraciones de FHIT se producen muy pronto durante el proceso de múltiples etapas de la carcinogénesis. Huebner y Croce (Huebner y Croce, Nat. Rev. Cancer; 1: 214-221 (2001)) demostraron que las células cancerosas negativas para FHIT son muy sensibles a la expresión de FHIT; por ejemplo, la infección con virus recombinantes de FHIT puede provocar la regresión y la prevención de tumores en animales de experimentación. Por tanto, es lógico predecir el desarrollo de un enfoque de terapia génica para el tratamiento y la prevención de cánceres humanos negativos para FHIT.

Pueden identificarse ligandos/fragmentos adecuados del CMH de FHIT humano mediante el procedimiento descrito en relación con la Colonia 1 anterior.

FLOT1: FLOT1 Humana (flotillina 1), también conocida como componente de membrana integral de caveolas, se ubica en la región genómica 30803465-30818443 en el cromosoma 6 en la región 6p21.3. Consiste en 10 exones resultantes de la transcripción en un ARNm que tiene 1462 pares de bases (véase la SEQ ID NO: 43). La secuencia codificante en sí consiste en 1284 pares de bases. La traducción de esta secuencia da como resultado una proteína con una longitud de 305 aminoácidos (SEQ ID NO: 44).

Las caveolas son dominios pequeños en la membrana celular interna implicada en el tráfico vesicular y la transducción de señales. FLOT1 codifica una proteína integral de membrana asociada a caveolas.

FLOT1 se exploró para determinar los dominios funcionales y tiene un dominio Band 7 en la región 1-185 y un dominio flotilina en la región 190-363. Las flotillinas son proteínas integrales de membrana que se ha demostrado que están presentes en varios componentes subcelulares, incluyendo caveolas (microdominios de membrana plasmática invaginados), balsas de lípidos (microdominios de membrana plasmática resistentes a detergente y ricos en esfingolípidos y colesterol) y el aparato de Golgi. La función molecular de las flotillinas sigue siendo desconocida. Probablemente están implicadas en la organización de la estructura de caveolas y balsas de lípidos, y otros dominios de membrana resistentes a detergente. También pueden estar implicadas en la transducción de señales. Se ha demostrado que las flotillinas se acumulan en células cerebrales con el desarrollo de la patología de Alzheimer. También se incluyen en esta familia las proteínas Reggie, que se expresan en dominios de la membrana plasmática neuronal no caveolar. La predicción del dominio transmembrana con el servidor de predicción de dominio transmembrana en línea "DAS" ubicado en http://www.sbc.su.se/%7Emiklos/DAS/ no identificó regiones transmembrana potenciales. FLOT1 tiene una homología muy alta (> 98 %) a las secuencias proteicas de FLOT1 descritas para ratón y rata. Zhang y col. (Zhang y col., Genome Res.; 10: 1546-1560 (2000)) purificaron FLOT1 humana mediante RT-PCR a partir de sangre de cordón y médula ósea de adultos CD34+. Mediante el análisis de micromatrices, encontraron una expresión débil de FLOT1 en 4 de 5 estirpes celulares hematopoyéticas y ninguna expresión en una estirpe celular promielocítica. El análisis de la transferencia Northern de tejidos de ratón reveló la expresión en tejido adiposo, corazón, músculo esquelético y pulmón. Mediante análisis de transferencia Western, también se encontró Flot1 como una proteína de 47 kD en los dominios de membrana ricos en caveolina aislados de pulmón humano y de adipocitos de ratón cultivados.

Pueden identificarse ligandos/fragmentos adecuados del CMH de FLOT1 humano mediante el procedimiento descrito en relación con la Colonia 1 anterior.

FOXP3: FOXP3 humana (caja forkhead P3), también conocida como IPEX o escurfina, se ubica en la región genómica 48993841-49008232 en el cromosoma X en la región Xp11.23. El transcrito de longitud completa consiste en 12 exones resultantes de la transcripción en un ARNm que tiene 6659 pares de bases. La secuencia codificante en sí consiste en 1830 pares de bases. La traducción de esta secuencia da como resultado una proteína supuesta con una longitud de 609 aminoácidos.

Chatila y col. (Chatila y col., J. Clin. Invest.; 106: R75-81 (2000)) indicaron que el marco de lectura abierto de FOXP3 humana de 1146 pb codifica una proteína de 381 aminoácidos deducida. Mediante PCR de una biblioteca de ADNc de células mononucleares de sangre periférica humana, Smith y col. (Smith y col., Immunology; 119: 203-211 (2006)) clonaron FOXP3 de longitud completa y variantes de corte y empalme que carecen del exón 2 y ambos exones 2 y 7. La proteína de longitud completa contiene 431 aminoácidos. La variante que carece del exón 2 codifica una proteína de 396 aminoácidos que carece de parte del dominio rico en prolina y la variante que carece de los exones 2 y 7 codifica una proteína de 369 aminoácidos que también carece de una gran parte de la supuesta cremallera de leucina. Smith y col. (Smith y col., Immunology; 119: 203-211 (2006)) observaron que los ratones parecen carecer de variantes de Foxp3. FOXP3 se exploró para determinar los dominios funcionales y tiene un dominio Forkhead (FH) en la región 295-391. Forkhead (FH), también conocido como "hélice alada" se denomina así por la proteína forkhead de Drosophila, un factor de transcripción que promueve el desarrollo terminal más que segmentario. Esta familia de los dominios de factor de transcripción, que se unen a B-ADN como monómeros, también se encuentran en proteínas de factor nuclear de hepatocitos (HNF, por sus siglas en inglés), que

20 5

15

25

35

45

55

proporcionan regulación génica específica de tejido. La estructura contiene de 2 bucles flexibles o "alas" en la región C terminal, por tanto, de ahí el término hélice alada. La predicción del dominio transmembrana con el servidor de predicción de dominio transmembrana en línea "DAS" ubicado en http://www.sbc.su.se/%7Emiklos/DAS/ no identificó regiones transmembrana potenciales. FOXP3 tiene una alta homología (> 86 %) a las secuencias de proteínas de FOXP3 descritas para ratón y rata. Stock y col. (Stock y col., Nat. Immunol.; 5: 1149-1156 (2004)) describieron un tipo de linfocito Tr específico de antígeno que se desarrolló in vivo a partir de linfocitos T vírgenes CD4positivos/CD25-negativos durante una respuesta inmunitaria polarizada Th1. Estos linfocitos Tr fueron inducidos por células dendríticas CD8A-positivas, produjeron tanto IFNG como IL10 y expresaron el 'factor de transcripción principal' de Th1, TBET (TBX21), así como ICOS y FOXP3. Las células inhibieron la hiperreactividad de las vías respiratorias inducida por alérgenos de una manera dependiente de IL10 en ratones. Stock y col. (Stock y col., Nat. Immunol.; 5: 1149-1156 (2004)) llegaron a la conclusión de que estos linfocitos Tr adaptativos están relacionados con, pero son distintos de, los linfocitos Th1. Propusieron que existe un espectro de tipos de linfocitos Tr adaptativos, que comprende linfocitos similares a Th1 y los linfocitos Th2 notificados anteriormente que son inducidos por células dendríticas CD8A-negativas y expresan el 'factor de transcripción principal' de Th2, GATA3 y FOXP3. Pueden identificarse ligandos/fragmentos adecuados del CMH de FOXP3 humano mediante el procedimiento descrito en relación con la Colonia 1 anterior.

GNLY: GNLY Humana (granulisina), también conocida como LAG2, se ubica en la región genómica 8577492585779380 en el cromosoma 2 en la región 2p11.2. La granulisina se corta y empalma de forma alternativa, dando como resultado los transcritos NKG5 y 519. El transcrito NKG5 consiste en 5 exones resultantes de la transcripción en un ARNm que tiene 738 pares de bases (véase la SEQ ID NO: 47). La secuencia codificante en sí consiste en 438 pares de bases. La traducción de esta secuencia da como resultado una proteína supuesta con una longitud de 145 aminoácidos (SEQ ID NO: 48). El transcrito 519 consiste en 5 exones resultantes de la transcripción en un ARNm que tiene 853 pares de bases (véase la SEQ ID NO: 49). La secuencia codificante en sí consiste en 390 pares de bases. La traducción de esta secuencia da como resultado una proteína supuesta con una longitud de 129 aminoácidos (SEQ ID NO: 50). La granulisina es una proteína presente en gránulos citotóxicos de linfocitos T citotóxicos y linfocitos citolíticos naturales. La granulisina es un miembro de la familia de proteínas similares a saposina (SAPLIP) y se ubica en los gránulos citotóxicos de los linfocitos T, que se liberan tras la estimulación por el antígeno. La granulisina tiene actividad antimicrobiana frente a M. tuberculosis y otros organismos.

GNLY se exploró para determinar los dominios funcionales y tiene un dominio Saposina B (SapB) en la región 46

126. Las saposinas son proteínas lisosómicas pequeñas que sirven como activadores de diversas enzimas lisosómicas de degradación de lípidos. Probablemente actúan aislando el sustrato lipídico de los alrededores de la membrana, haciéndolo de este modo más accesible a las enzimas de degradación solubles. Todas las saposinas de mamíferos se sintetizan como una sola molécula precursora (prosaposina) que contiene cuatro dominios Saposina B, produciendo las saposinas activas después de la escisión proteolítica, y dos dominios Saposina-A que se retiran en la reacción de activación. Los dominios Saposina B también aparecen en otras proteínas, muchas de ellas activas en la lisis de las membranas. La predicción del dominio transmembrana con el servidor de predicción de dominio transmembrana en línea "DAS" ubicado en http://www.sbc.su.se/%7Emiklos/DAS/ identificó 1 región transmembrana potencial (5-19) para el transcrito NKG5, mientras que para el transcrito 519 no pudo identificarse ninguna región transmembrana. La proteína GNLY no tiene homología descrita a las secuencias proteicas GNLY descritas para ratón y rata.

Pueden identificarse ligandos/fragmentos adecuados del CMH de GNLY humano mediante el procedimiento descrito en relación con la Colonia 1 anterior.

ICA1: ICA1 humano (autoantígeno 1 de las células de los islotes), también conocido como ICA69, se ubica en la región genómica 8119940-8268710 en el cromosoma 7 en la región 7p22. Se han descrito variantes cortadas y empalmadas de forma alternativa que codifican diferentes isoformas de la proteína; sin embargo, no todas las variantes se han caracterizado completamente. Hasta la fecha, se han descrito 2 transcritos para ICA1. El primer transcrito consiste en 14 exones resultantes de la transcripción en un ARNm que tiene 2396 pares de bases (véase la SEQ ID NO: 51). El segundo transcrito consiste en 14 exones resultantes de la transcripción en un ARNm que tiene 2268 pares de bases (véase la SEQ ID NO: 53). La secuencia codificante en sí de ambas transcripciones consiste en 1452 pares de bases. La traducción de esta secuencia da como resultado una proteína supuesta con una longitud de 483 aminoácidos (SEQ ID NO: 54).

ICA1 se encuentra en el citosol y como forma unida a la membrana en el complejo de Golgi y gránulos secretores inmaduros. Se cree que esta proteína es un autoantígeno en la diabetes mellitus dependiente de insulina y en el síndrome de Sjögren primario.

ICA1 se exploró para determinar los dominios funcionales y tiene un dominio Arfaptina en la región 22 a 249. Arfaptina es una proteína expresada de forma ubicua implicada en mediar la interacción entre Rac, un miembro de la familia Rho y GTPasas pequeñas Arf; la Arfaptina se une a Arf6 y Arf1 unidos a GTP, pero se une Rac.GTP y Rac.GDP con afinidades similares. Las estructuras de Arfaptina con Rac unido ya sea a GDP o al análogo lentamente hidrolizable GMPPNP, muestran que las regiones de cambio adoptan conformaciones similares en ambos complejos. Se cree que Arf1 y Arf6 se unen a la misma superficie que Rac. ICA1, adicionalmente, tiene un dominio ICA69 (ICA69) autoantigénico de células de los islotes en la región 261-483. Esta familia incluye una

21

imagen13

imagen14

imagen15

imagen16

imagen17

imagen18

imagen19

imagen20

imagen21

imagen22

imagen23

imagen24

imagen25

imagen26

imagen27

imagen28

imagen29

imagen30

imagen31

imagen32

imagen33

imagen34

imagen35

imagen36

imagen37

imagen38

imagen39

imagen40

imagen41

Después de la descongelación, los linfocitos T CD4+ se purificaron usando el sistema de separación de células BD IMag™ (BD Biosciences) con partículas de CD4 de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Después de la tinción con CD127-Alexa 647, CD25-PE y CD4-PerCP-Cy5.5 (ambos de BD) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, los linfocitos Treg CD4+ CD127bajo CD25+, los linfocitos T CD4+ CD127+ CD25bajo convencionales y los 5 linfocitos T CD4+ CD127+ CD25int activados se purificaron usando un clasificador de células FACSDiVa™ (BD Biosciences). La pureza de la población de linfocitos Treg CD4+ CD127bajo CD25+ FOXP3+ medida por tinción FOXP3 Alexa 488 se comprobó como habitualmente y dio como resultado > 95 % de linfocitos Treg CD4+CD25alto después de la purificación. El aislamiento y la cuantificación de ARN, la preparación de ARNc marcado con biotina, la hibridación, la exploración y el análisis estadístico se realizaron como se ha descrito anteriormente. Los criterios

10 utilizados para la selección de genes expresados diferencialmente se definieron como ya se ha mencionado.

Ejemplo 1: Identificación de genes núcleo Treg.

El objetivo de este estudio era identificar los genes que muestran una expresión única en linfocitos T reguladores (Treg) en comparación con otros linfocitos T CD4+ convencionales que se identificaron como se indica a continuación y se designaron el "transcriptoma núcleo" de los Treg. Se realizó un total de 192 experimentos individuales que 15 interrogaban los linfocitos T convencionales y Treg en diferentes estados de activación. Los linfocitos T CD4+ se aislaron de sangre periférica y se separaron posteriormente en linfocitos CD25+ y CD25. Los linfocitos CD25-se dejaron sin estimular (en reposo) o se expusieron a diferentes estímulos. Esto incluía la activación a través de anticuerpos αCD3 y αCD28 con o sin adición de señales inhibidoras (TGFβ, CTLA4, PGE2, IL10 y PD1). Las células CD25+ se dejaron sin estimular, se expusieron a la activación por IL2 o se expandieron usando rapamicina. La figura

20 1 muestra el flujo de trabajo completo de todos los experimentos realizados. Todas las muestras están presentes en repeticiones con al menos n = 3.

Para la exploración de genes candidatos potenciales se usó un enfoque de reconocimiento de patrones. En primer lugar, se generó un gráfico de contorno virtual para cada gen sobre todo el conjunto de datos. Después, se determinó la correlación del perfil de expresión de cada gen y el perfil de expresión del control positivo FOXP3

25 (Figura 2). Los genes con correlación alta positiva con respecto a la correlación negativa para FOXP3 se seleccionaron como genes asociados al transcriptoma núcleo. 43 genes cumplieron con los criterios de reconocimiento de patrones y se identificaron como el transcriptoma núcleo de los linfocitos Treg (Tabla 1). La Figura 3 visualiza estos 43 genes usando una representación de contorno tridimensional.

Tabla 1: 43 genes núcleo de Treg.

Símbolo (SEQ ID NO) of ARNm

Treg Linfocitos T en reposo Linfocitos T CD25- Linfocitos T activados

ACTA2 (15)

740+/-75 414 +/-96 333 +/-106 528 +/-155

BFSP2 (17)

335 +/-125 155 +/-15 150 +/-31 143 +/-16

C1orf78 (11)

644 +/-108 327 +/-66 289 +/-68 295 +/-94

CCL5 (19)

678 +/-433 4998 +/-772 3404 +/-2178 3274 +/-1774

CCR7 (21)

1491 +/-561 4226 +/-1310 3059 +/-1012 3809 +/-1320

CD40LG (23)

197 +/-62 568 +/-90 577 +/-96 616 +/-296

CTLA4 (25, 27)

1061 +/-313 316 +/-165 306 +/-84 452 +/-440

CTSL (29, 31)

100 +/-8 422 +/-259 202 +/-61 273 +/-121

EOMES (33)

117 +/-25 352 +/-84 424 +/-335 337 +/-197

EPB41L3 (35)

89 +/-7 212 +/-67 133 +/-32 121 +/-13

FAM129A (37)

1294 +/-154 719 +/-204 555 +/-180 735 +/-357

FANK1 (1)

562 +/-118 116 +/-21 93 +/-2 98 +/-15

FCGBP (39)

222 +/-33 519 +/-192 392 +/-73 604 +/-350

FHIT (41)

196 +/-40 324 +/-46 361 +/-91 294 +/-96

FLOT1 (43)

543 +/-57 1170 +/-213 1169 +/-156 994 +/-222

FOXP3 (45)

260 +/-113 103 +/-6 88 +/-5 104 +/-19

GNLY (47, 49)

189 +/-45 3218 +/-902 671 +/-694 978 +/-616

HPGD (7)

265 +/-76 133 +/-17 109 +/-14 106 +/-17

ICA1 (51, 53)

378 +/-143 140 +/-11 191 +/-32 117 +/-10

51

(continuación)

Símbolo (SEQ ID NO) of ARNm

Treg Linfocitos T en reposo Linfocitos T CD25- Linfocitos T activados

IL10RA (57)

1068 +/-282 533 +/-53 605 +/-140 432 +/-115

IL7R (55)

966 +/-424 1852 +/-762 2497 +/-811 1766 +/-1188

LASS6 (61)

145 +/-54 396 +/-39 373 +/-91 363 +/-94

MGST2 (65)

251 +/-47 163 +/-26 140 +/-33 121 +/-25

PTTG3 (77)

229 +/-35 128 +/-16 143 +/-23 134 +/-36

KIAA1600 (59)

782 +/-148 544 +/-70 452 +/-56 445 +/-67

C6orf190 (735)

186 +/-57 425 +/-90 514 +/-66 416 +/-162

LOC339541 (63)

205 +/-55 422 +/-66 508 +/-133 398 +/-110

TARP (103, 105)

191 +/-54 640 +/-94 638 +/-393 450 +/-225

RBMS1 (81, 83, 85)

354 +/-34 723 +/-225 744 +/-77 545 +/-65

NCF4 (67, 69)

1184 +/-285 640 +/-110 433 +/-135 344 +/-1067

NELL2 (71)

251 +/-148 1707 +/-560 877 +/-152 1164 +/-565

PLEKHK1 (3, 5)

653 +/-109 166 +/-31 142 +/-19 151 +/-18

PTPLA (73)

317 +/-64 136 +/-17 123 +/-6 115 +/-25

PTTG1 (75)

299 +/-89 172 +/-29 173 +/-25 147 +/-39

RAB6IP1 (79)

127 +/-21 280 +/-46 306 +/-63 238.83 +/-54

RHOU (87)

107 +/-6 178 +/-28 217 +/-61 146 +/-28

SATB1 (89)

787 +/-112 1988 +/-262 1739 +/-439 2028 +/-687

SELP (91)

461 +/-169 146 +/-9 144 +/-24 149 +/-21

SEMA3G (93)

194 +/-64 105 +/-6 109 +/-10 105 +/-3

SHMT2 (95)

1741 +/-310 797 +/-126 724 +/-187 1275 +/-812

STAM (97)

637 +/-194 264 +/-25 207 +/-35 217 +/-30

STOM (99, 101)

345 +/-54 783 +/-60 920 +/-278 692 +/-258

TCF7 (107, 109, 111, 113)

8270 +/-3071 16713 +/-1197 17162 +/-3138 11895 +/-5380

TNFRSF1B (115)

1950 +/-360 861 +/-145 832 +/-216 826 +/-265

TRIM16 (117)

433 +/-125 253 +/-18 286 +/-32 247 +/-24

UTS2 (119, 121)

263 +/-84 162 +/-28 149 +/-21 130 +/-4

Se muestran valores de expresión medios +/-desviación típica para los grupos de muestras distintas

Ejemplo 2: Análisis de 6 genes marcadores de Treg potenciales

A. FANK1: FANK1 humano (dominios de repetición 1 de fibronectina tipo III y anquirina; Colonia 1) se ubica en

5 la región genómica 127575098-127688151 en el cromosoma 10 en la región 10q26.2. Consiste en 11 exones resultantes de la transcripción en un ARNm que tiene 1395 pares de bases (véase la SEQ ID NO: 1). La secuencia codificante en sí consiste en 1038 pares de bases. La traducción de esta secuencia da como resultado una proteína supuesta con una longitud de 346 aminoácidos (SEQ ID NO: 2).

B. PLEKHK1: PLEKHK1 humana (que contiene dominio de homología a pleckstrina, familia K miembro 1,

10 también conocida como rhotecina2; Colonia 2) se ubica en la región genómica 63698472-63622959 en el cromosoma 10 en la región 10q21.2. Consiste en 12 exones resultantes de la transcripción en un ARNm que tiene 6659 pares de bases (véase la SEQ ID NO: 3, mostrándose una variante adicional de la misma que tiene 2123 pares de bases en la SEQ ID NO: 5). La secuencia codificante en sí consiste en 1830 pares de bases. La traducción de esta secuencia da como resultado una proteína supuesta con una longitud de 609 aminoácidos

15 (SEQ ID NO: 4).

C. HPGD: HPGD humana (hidroxiprostaglandina deshidrogenasa 15-(NAD); Colonia 3) se ubica en la región

52

genómica 175680186-175647955 en el cromosoma 4 en la región 4q34-35. Consiste en 7 exones resultantes de la transcripción en un ARNm que tiene 2592 pares de bases. La secuencia codificante en sí consiste en 801 pares de bases (véase la SEQ ID NO: 7). La traducción de esta secuencia da como resultado una proteína supuesta con una longitud de 266 aminoácidos (véase la SEQ ID NO: 8).

5 D. DNAPTP6: DNAPTP6 humana (proteína 6 transactivada por ADN polimerasa; Colonia 4) se ubica en la región genómica 200879041-201051498 en el cromosoma 2 en la región 2q33.1. Consiste en 13 exones resultantes de la transcripción en un ARNm que tiene 2355 pares de bases (véase la SEQ ID NO: 9). La secuencia codificante en sí consiste en 1677 pares de bases. La traducción de esta secuencia da como resultado una proteína supuesta con una longitud de 558 aminoácidos.

10 E. C1orf78: C1orf78 humano (marco de lectura abierto 78 del cromosoma 1; Colonia 5) se ubica en la región genómica 36562342-36560219 en el cromosoma 1 en la región 1p34.3. Consiste en 3 exones resultantes de la transcripción en un ARNm que tiene 1054 pares de bases. La secuencia codificante en sí consiste en 495 pares de bases (véase la SEQ ID NO: 11). La traducción de esta secuencia da como resultado una proteína supuesta con una longitud de 164 aminoácidos (SEQ ID NO: 12).

15 F. FLJ45983: FLJ45983 humana (proteína FLJ45983; Colonia 6) se ubica en la región genómica 81354538132419 en el cromosoma 10 en la región 10p14. Consiste en 2 exones resultantes de la transcripción en un ARNm que tiene 2213 pares de bases. La secuencia codificante en sí consiste en 378 pares de bases (véase la SEQ ID NO: 13). La traducción de esta secuencia da como resultado una proteína supuesta con una longitud de 125 aminoácidos (SEQ ID NO: 14).

20 Ejemplo 3: Clonación de los 6 genes candidatos en vectores de expresión bacterianos y de mamíferos

A. Amplificación de ADNc: Se pidieron clones de ADNc de longitud completa para los 6 genes candidatos de RZPD (Deutsches Ressourcenzentrum fur Genomforschung GmbH, Heubnerweg 6, D-14059 Berlin, Alemania). En primer lugar, todos los clones se sembraron en placas de agar para seleccionar un solo clon, que después se hizo crecer en cultivos durante la noche para amplificar el vector. Se aisló el ADN usando el kit de extracción de gel QIAquick de

25 Qiagen. Usando cebadores específicos el ADNc se amplificó para la clonación adicional.

Tabla 2: Cebadores para la clonación de Col1-6

Gen

Cebador SEQ ID NO Secuencia Tamaño del producto (pb)

Col1

FANK1 PCR dir 123 ATGGAGCCCCAGAGAATCAT

FANK1 PCR inv

124 GCAGACACAAGACTTCTTTGG 1035

FANK1 PCR inv parada

125 TCAGCAGACACAAGACTTCTT 1038

Col2

PLEKHK1 PCR dir 126 ATGGAGGGGCCGAGCCT

PLEKHK1 PCR inv

127 TACTTGTGCCTGCAGCCAT 1827

PLEKHK1 PCR inv parada

128 CTATACTTGTGCCTGCAGCC 1830

Col3

HPGD PCR dir 129 ATGCACGTGAACGGCAAAGT

HPGD PCR inv

130 TTGGGTTTTTGCTTGAAATGGA 798

HPGD PCR inv parada

131 TCATTGGGTTTTTGCTTGAAATG 801

Col4

DNAPTP6 PCR dir 132 ATGGCTGAACTCAATACTCATG

DNAPTP6 PCR inv

133 GGCCACCAACGTCACAGCCG 1674

DNAPTP6 PCR inv parada

134 TCAGGCCACCAACGTCACAG 1677

Col5

Col5 PCR dir 135 ATGGATGCCCCGCGAAGGGA

Col5 PCR inv

136 GTAATAGTGCATGCGGCCCAGG 495

Col5 PCR inv parada

137 TCAGTAATAGTGCATGCGGC 498

Col6

Col6 PCR dir 138 ATGGAGCCGGACTTTCTCC

Col6 PCR inv

139 GGACTTCGACCCCGGGGCTC 375

Col6 PCR inv parada

140 TCAGGACTTCGACCCCGGG 378

Para la clonación en el vector de expresión bacteriano pTr Chis-TOPO (Invitrogen) se amplificó ADNc con codón de parada mientras que el ADNc se amplificó sin codón de parada para la clonación en el vector de expresión Lentivírico pLenti6/V5-DEST (Invitrogen).

53

imagen42

Claims (1)

1. imagen1