ES2666465T3 - Métodos para producir una población de células beta pancreáticas - Google Patents

Abstract

Un método ex vivo para la producción de una población de células beta pancreáticas, que comprende la etapa de: i) proporcionar una población de células alfa pancreáticas; ii) inhibir la expresión o actividad de Arx en dicha población de células alfa pancreáticas; en el que la expresión de Arx se inhibe mediante el uso de un oligonucleótido de siARN, una ribozima, un oligonucleótido inverso, ácido gamma-amino butírico (GABA) o un agonista de receptores de GABA.

Description

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permanente.

La invención describe que la expresión de Arx se puede inhibir mediante ácido gamma-amino butírico (GABA), y/o un análogo de GABA, y/o un agonista (o agonista parcial) de receptores de GABA, y/o un potenciador de GABA, y/o un profármaco de GABA.

La invención describe que el agonista de receptores de GABA actúa sobre los dos receptores GABAA y GABAB. La invención describe que el agonista de receptores de GABA actúa preferentemente, o exclusivamente, sobre el receptor GABAA o GABAB.

Los agonistas de receptores de GABA son muy conocidos para los expertos en la técnica.

Los agonistas de receptores de GABA ilustrativos incluyen, pero sin limitación, ciertos barbituratos (p.ej., tiopental, tiamilal, pentobarbital, secobarbital, hexobarbital, butobarbital, amobarbital, barbital, mefobarbital, fenobarbital, primidona, y similares), ciertas benzodiacepinas (p.ej., midazolam, triazolam, lometazepam, flutazolam, nitrazepam, fluritrazepam, nimetazepam, diazepam, medazepam, oxazolam, prazepam, tofisopam, rilmazafona, lorazepam, temazepam, oxazepam, fluidazepam, clordiazepóxido, cloxazolam, flutoprazepam, alprazolam, estazolam, bromazepam, flurazepam, clorazepato potásico, haloxazolam, loflazepato de etilo, cuazepam, clonazepam, mexazolam, y similares), ciertas tienodiazepinas (p.ej., etizolam, brotizolam, clotiazepam, y similares), ciertos dialquilfenoles (p.ej., propofol, fospropofol, y similares), ciertos análogos de benzodiacepinas (p.ej., Zolpidem, zopiclona, exzopiclona, etc.), y similares.

La invención describe que el agonista de receptores de GABA se selecciona del grupo que consiste en muscimol, THIP/gaboxadol, isoguvacina, amina koji, homotaurina, homohipotaurina, ácido trans-aminociclopentano-3carboxílico, ácido trans-amino-4-crotónico, ácido β-guanidinopropiónico, homo-P-prolina, ácido isonipecótico, ácido 3-((aminoiminometil)tio)-2-propenoico (ZAPA), ácido imidazolacético, y ácido piperidin-4-sulfónico (P4S).

De manera alternativa, se puede usar una glutamato descarboxilasa o ácido glutámico descarboxilasa (GAD), que son enzimas que catalizan la descarboxilación de glutamato a GABA y CO2.

La invención describe que se usan las enzimas que sintetizan GABA GAD65 o GAD67.

Se conocen bien en la técnica los métodos para poner en contacto una población de células, en particular una población de células alfa pancreáticas, con un polipéptido de interés, tal como un polipéptido GAD65 o un polipéptido GAD67, o un vector que codifica el gen de GAD65 o GAD67.

La invención describe que se puede inhibir la expresión de Arx mediante compuestos que actúan sobre la actividad del promotor, el procesamiento del ARN o la estabilidad de la proteína.

La invención describe que se puede conseguir la inhibición de la actividad de Arx mediante el uso de polipéptidos de Arx mutados que compiten con el Arx de tipo natural.

Esta técnica se denomina en general técnica de "mutantes negativos dominantes". Un mutante negativo dominante es un polipéptido o una secuencia de la región codificante de ácido nucleico que se ha cambiado con respecto a al menos una posición en la secuencia, respecto de la versión nativa de tipo natural correspondiente en una posición que cambia una posición de residuo de aminoácido en un sitio activo necesario para la actividad biológica del péptido nativo. Por ejemplo, un mutante negativo dominante puede consistir en una molécula de Arx truncada desprovista de los dominios efectores N-terminales que puede actuar como inhibidor competitivo de Arx por la unión al ADN y la transactivación. La eficacia de la represión de Arx se puede mejorar adicionalmente mediante la fusión a dominios represores que incrementan la función inhibitoria.

Los métodos de la invención se llevan a cabo exponiendo células alfa pancreáticas a un mutante negativo dominante in vitro o ex vivo. La exposición se puede realizar transfectando la célula con un polinucleótido que codifica el polipéptido mutante negativo dominante, y expresando dicho mutante negativo dominante codificado por el polinucleótido, de forma que se inhibe la actividad de Arx. Los métodos para transfectar tales polinucleótidos pueden consistir en los descritos anteriormente.

La exposición también se puede realizar exponiendo directamente las células alfa pancreáticas a un polipéptido mutante negativo dominante, por ejemplo poniendo en contacto la célula con dicho polipéptido, preferiblemente acoplado a un resto de interiorización.

Se conocen en la técnica restos de interiorización adecuados, y, por ejemplo, se pueden seleccionar del grupo que consiste en una secuencia de interiorización de péptidos derivada de proteínas tales como el polipéptido TAT de VIH

o Antennapedia, u otras homeoproteínas. De manera alternativa, la transferencia puede estar mediada por un liposoma, y un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo o ligando que se une a un receptor superficial de la célula objetivo.

Como alternativa, los inhibidores de la actividad pueden consistir en moléculas que son inhibidores de la modificación postraduccional enzimática que regulan una actividad tal como la fosforilación, acetilación, metilación, 7 10

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ribosilación, ubiquitinación, modificación con moléculas pequeñas similares a ubiquitina (SUMOilación, neddylación, etc.), o moléculas que alteran la conformación o interacción con coactivadores o correpresores. Como alternativa adicional, los inhibidores de la actividad pueden consistir en inhibidores de la unión del ADN, la dimerización o la interacción con cofactores.

Los inhibidores de la actividad pueden incluir macromoléculas o moléculas orgánicas pequeñas. La expresión "molécula orgánica pequeña" se refiere a una molécula de un tamaño comparable a las moléculas orgánicas usadas en general en los productos farmacéuticos. La expresión excluye las macromoléculas biológicas (p.ej., proteínas, ácidos nucleicos, etc.). El tamaño de las moléculas orgánicas pequeñas preferidas oscila hasta alrededor de 5000 Da, más preferiblemente hasta 2000 Da, y lo más preferiblemente hasta alrededor de 1000 Da.

La invención describe que el método comprende además una etapa de poner en contacto la población de células alfa pancreáticas con un polipéptido Pax4, un ácido nucleico que codifica un gen Pax4 o un vector que comprende el mismo. Dicha etapa se puede llevar a cabo de manera simultánea o secuencial (es decir, antes o después de) la etapa de inhibir la expresión o la actividad de Arx en una población de células alfa pancreáticas, tal como un oligonucleótido inverso o un siARN hacia Arx, GABA o un agonista de receptores de GABA.

Los métodos para poner en contacto una población de células, en particular una población de células alfa pancreáticas, con un polipéptido Pax-4, un ácido nucleico que codifica un gen Pax-4 o un vector que comprende el mismo se describen en la solicitud de patente internacional WO 2011/012707 y en Collombat et al. 2009.

Células deficientes de Arx

Los métodos de la invención conducen a la generación de células beta pancreáticas de gran interés en el campo terapéutico, así como en el campo del cribado.

Por lo tanto, la presente invención describe así una población de células beta pancreáticas obtenibles mediante el método descrito anteriormente. Preferiblemente, la población de células beta pancreáticas está en una forma purificada.

La invención describe una población de células alfa pancreáticas, que no expresan Arx o en las que la expresión o actividad de Arx está suprimida o inhibida. Preferiblemente, las células alfa pancreáticas carecen del gen Arx. Las células alfa pancreáticas pueden ser de cualquier especie. Preferiblemente son de origen murino o de origen humano.

La invención describe que las células alfa pancreáticas son células alfa pancreáticas de adulto.

Según la presente invención, las células beta pancreáticas se pueden generar fácilmente y de manera eficaz in vitro

o ex vivo. La capacidad de obtener un gran número de células beta pancreáticas in vitro o ex vivo da lugar a nuevas oportunidades para el campo terapéutico.

La presente invención proporciona así una composición farmacéutica que comprende células beta pancreáticas como se definió anteriormente, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Métodos terapéuticos y usos

La presente invención proporciona métodos y composiciones (tales como composiciones farmacéuticas) para la prevención o el tratamiento de la diabetes.

La presente invención describe un inhibidor de la expresión génica de Arx para el uso en la prevención o el tratamiento de la diabetes de un paciente que lo necesita.

Preferiblemente, la invención se refiere a un inhibidor de la expresión génica de Arx para el uso en la prevención o el tratamiento de la diabetes de un paciente que lo necesita, con la condición de que dicho inhibidor de la expresión génica de Arx no sea un polipéptido Pax-4 o un ácido nucleico que codifica el gen Pax-4, o un vector que comprende el mismo.

Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "inhibidor de la expresión génica" se refiere a un compuesto natural o sintético que tiene un efecto biológico que inhibe o reduce significativamente la expresión de un gen. Por lo tanto, un "inhibidor de la expresión génica de Arx" se refiere a un compuesto natural o sintético que tiene un efecto biológico que inhibe o reduce significativamente la expresión del gen que codifica la proteína Arx.

Tal como se usa en la presente memoria, "diabetes" se refiere a la clase amplia de trastornos caracterizados por una producción alterada de insulina y una tolerancia alterada a la glucosa. La diabetes incluye la diabetes tipo 1 y tipo 2, diabetes gestacional, prediabetes, resistencia a la insulina, síndrome metabólico, y tolerancia alterada a la glucosa. La diabetes tipo I también se conoce como diabetes mellitus insulinodependiente (DMID). Las expresiones se usan de manera intercambiable en la presente memoria. La diabetes tipo 2 también se conoce como diabetes mellitus no insulinodependiente (DMNID).

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Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "un paciente que lo necesita" se refiere a un sujeto al que se le ha diagnosticado diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, diabetes gestacional, prediabetes, resistencia a la insulina, síndrome metabólico, o tolerancia alterada a la glucosa, o uno que corre riesgo de desarrollar cualquiera de estos trastornos. Los pacientes que necesitan tratamiento también incluyen aquellos que han padecido una lesión, enfermedad, o procedimiento quirúrgico que afecta al páncreas, o los individuos que de otra manera tienen una alteración de su capacidad de producir insulina. Tales pacientes pueden ser cualquier mamífero, p.ej., ser humano, perro, gato, caballo, cerdo, oveja, ganado bovino, ratón, rata o conejo (preferiblemente un ser humano).

La expresión "prevención de un trastorno", tal como se usa en la presente memoria, no pretende significar una expresión absoluta. En su lugar, la prevención, p.ej., de la diabetes tipo 2, se refiere al retraso del inicio, la frecuencia reducida de los síntomas, o la gravedad reducida de los síntomas asociados al trastorno. La prevención, por lo tanto, se refiere a una amplia diversidad de medidas profilácticas que entenderán los expertos en la técnica. En ciertas circunstancias, se reduce la frecuencia y gravedad de los síntomas a niveles no patológicos, p.ej., de forma que el individuo no necesita una terapia de sustitución de insulina tradicional. En ciertas circunstancias, los síntomas de un paciente que recibe un inhibidor de la expresión génica de Arx según la invención tienen solamente un 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 o 1% de la frecuencia o gravedad de los síntomas experimentados por un individuo con el trastorno sin tratar.

De forma similar, la expresión "tratamiento de un trastorno" no pretende ser una expresión absoluta. En ciertas circunstancias, los inhibidores de la expresión génica de Arx según la invención pretenden reducir la pérdida de células productoras de insulina que conduce a los síntomas diabéticos. En ciertas circunstancias, el tratamiento con los inhibidores de la expresión génica de Arx conduce a un pronóstico mejorado o a una reducción de la frecuencia o gravedad de los síntomas.

La invención describe que el inhibidor de la expresión génica de Arx es un oligonucleótido de siARN, una ribozima, o un oligonucleótido inverso como se describió previamente.

La invención también describe un método para la prevención o el tratamiento (p.ej. tratamiento profiláctico) de la diabetes, que comprende administrar a un paciente que lo necesita un inhibidor de la expresión génica de Arx.

Los inhibidores de la expresión génica de Arx se pueden administrar en forma de una composición farmacéutica, como se define más adelante. Preferiblemente, dicho inhibidor se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad suficiente del inhibidor de la expresión génica de Arx para prevenir o tratar la diabetes con una proporción razonable beneficio/riesgo aplicable a cualquier tratamiento médico.

Se entenderá que el uso diario total de los compuestos de la presente invención lo decidirá el médico que aplica el tratamiento de acuerdo con el buen juicio médico. El nivel de dosis específico terapéuticamente eficaz para cualquier paciente particular dependerá de una diversidad de factores, que incluyen el trastorno a tratar y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada, la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el momento de la administración, la vía de administración, y la velocidad de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; los fármacos usados en combinación o de manera coincidente con el polipéptido específico empleado; y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. Por ejemplo, la experiencia en la técnica permite comenzar con dosis del compuesto a niveles inferiores a los necesarios para conseguir el efecto terapéutico deseado, e incrementar gradualmente la dosis hasta alcanzar el efecto deseado. Sin embargo, la dosis diaria de los productos se puede variar a lo largo de un amplio intervalo de 0,01 a 1.000 mg por adulto al día. Preferiblemente, las composiciones contienen 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100, 250 y 500 mg del ingrediente activo para el ajuste sintomático de la dosis al paciente a tratar. Un medicamento contiene en general de alrededor de 0,01 mg a alrededor de 500 mg del ingrediente activo, preferiblemente de 1 mg a alrededor de 100 mg del ingrediente activo. Se suministra una cantidad eficaz del fármaco generalmente a un nivel de dosis de 0,0002 mg/kg a alrededor de 20 mg/kg de peso corporal al día, especialmente de alrededor de 0,001 mg/kg a 7 mg/kg de peso corporal al día.

Preferiblemente, la presente invención describe un inhibidor de la expresión génica de Arx para el uso en un método para inducir la conversión de células alfa pancreáticas en células beta pancreáticas en un paciente que lo necesita, con la condición de que dicho inhibidor de la expresión génica de Arx no sea un polipéptido Pax-4 o un ácido nucleico que codifica el gen Pax-4, o un vector que comprende el mismo.

La presente invención también describe un método para inducir la conversión de células alfa pancreáticas en células beta pancreáticas en un paciente que lo necesita, que comprende administrar a dicho paciente que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de la expresión génica de Arx.

La invención describe que el inhibidor de la expresión génica de Arx no es un polipéptido Pax-4 o un ácido nucleico que codifica el gen Pax-4, o un vector que comprende el mismo.

El término "conversión" se usa de manera intercambiable en la presente memoria con la frase "transdiferenciación", y se refiere a la conversión de un tipo de célula somática diferenciada en un tipo de célula somática diferenciada diferente sin someter a reprogramación completa a un intermedio de célula madre pluripotente inducida (iPSC).

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Además de los compuestos de la invención formulados para administración parenteral, tal como inyección intravenosa o intramuscular, otras formas farmacéuticamente aceptables incluyen, p.ej., comprimidos u otros sólidos para administración oral; formulaciones de liposomas; cápsulas de liberación retardada; y cualquier otra forma usada actualmente.

La invención también describe una composición farmacéutica para el uso en un método para inducir la conversión de células alfa pancreáticas en células beta pancreáticas en un paciente que lo necesita, que comprende GABA o un agonista de receptores de GABA como se describió anteriormente.

Terapias de combinación de la invención:

El inhibidor de la expresión génica de Arx de la invención se puede administrar a un paciente con un agente terapéutico adicional adecuado, tal como un agente inmunosupresor útil para mejorar la supervivencia de las células beta pancreáticas recién generadas.

La invención describe una composición farmacéutica o una composición para un kit de componentes que comprende un inhibidor de la expresión génica de Arx y un agente inmunosupresor.

La invención también describe un método para mejorar la supervivencia de células beta pancreáticas regeneradas en un paciente que lo necesita, que comprende una etapa de administrar a dicho paciente que padece diabetes una cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor de la expresión génica de Arx y una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inmunosupresor, en el que el inhibidor de la expresión génica de Arx es GABA o un agonista de receptores de GABA.

Los agentes inmunosupresores son fármacos que inhiben o previenen la actividad del sistema inmunitario, y son muy conocidos para el experto en la técnica.

La invención describe que los agentes inmunosupresores incluyen, pero sin limitación, uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en azatioprina, ácido micofenólico, leflunomida, teriflunomida, metotrexato, FKBP/ciclofilina, tacrólimus, ciclosporina, pimecrólimus, abétimus, guspérimus, sirólimus, deforólimus y everólimus.

La expresión "terapia de combinación" o "en combinación con", tal como se usa en la presente memoria, significa que se administran dos o más sustancias, por ejemplo GABA y Ciclosporina o GABA y Sirólimus, a un sujeto a lo largo de un periodo de tiempo, a la vez o de manera secuencial, p.ej. las sustancias se administran al mismo tiempo

o en momentos diferentes dentro del periodo de tiempo de un régimen que proporcionará los efectos beneficiosos de la combinación de fármacos, a intervalos similares o diferentes. Por ejemplo, la terapia de combinación pretende abarcar la co-administración, de una manera sustancialmente simultánea, tal como en una forma farmacéutica individual, p.ej. una cápsula, que tiene una proporción fija de ingredientes activos, o en múltiples formas farmacéuticas diferentes, p.ej. cápsulas, para cada sustancia. Los compuestos pueden ser o no ser biológicamente activos en el sujeto al mismo tiempo. Como ejemplo, se administra una primera sustancia semanalmente, y se administra una segunda sustancia diariamente. Los detalles exactos de la administración dependerán de la farmacocinética de las dos sustancias. Los diseños de los regímenes de dosificación adecuados son rutinarios para un experto en la técnica.

Por lo tanto, la invención también describe una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de la expresión génica de Arx y un agente inmunosupresor para el uso en la mejora de la supervivencia de células beta pancreáticas regeneradas en un paciente que lo necesita.

La invención describe que el inhibidor de la expresión génica de Arx es GABA o un agonista de receptores de GABA como se definió anteriormente.

La invención también describe una composición de kit de componentes que comprende un inhibidor de la expresión génica de Arx y un agente inmunosupresor para el uso en la mejora de la supervivencia de células beta pancreáticas regeneradas en un paciente que lo necesita.

Las expresiones "kit", "producto" o "preparación combinada", tal como se usan en la presente memoria, definen especialmente un "kit de componentes" en el sentido de que los compuestos de la combinación, como se definieron anteriormente, se pueden administrar independientemente o mediante el uso de diferentes combinaciones fijas con cantidades diferenciadas de los compuestos de la combinación, es decir, de manera simultánea o en momentos diferentes. Los componentes del kit de componentes se pueden administrar después, p.ej., de manera simultánea o espaciada cronológicamente, es decir, en momentos diferentes y con intervalos de tiempo iguales o diferentes para cualquier componente del kit de componentes. Se puede variar la proporción de las cantidades totales de los compuestos de combinación a administrar en la preparación combinada. Los compuestos de combinación se pueden administrar mediante la misma vía o mediante vías diferentes. Cuando la administración es secuencial, el primer compuesto se puede administrar, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 18 o 24 h antes del segundo compuesto.

Métodos de cribado

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Como se mencionó previamente, los métodos de la invención conducen a la generación de células beta pancreáticas de gran interés en el campo del cribado.

Por lo tanto, la presente invención describe un método para el cribado de un compuesto que induce un fenotipo de células beta pancreáticas, que comprende las etapas de a) poner en contacto al menos una célula con un compuesto determinado, y b) ensayar si dicho compuesto es capaz de inhibir la expresión génica de Arx.

La invención describe que dicha célula es una célula alfa pancreática.

De manera alternativa, se pueden usar otras células adultas, especialmente células hepáticas, células ductales o células intestinales como material de partida del método de la presente invención.

Como alternativa adicional, se puede usar cualquier célula precursora capaz de diferenciarse en células beta pancreáticas como la célula de partida del método de la invención. La invención describe que dicha célula precursora se selecciona del grupo que consiste en una célula precursora pancreática, una célula precursora de intestino delgado, una célula precursora hepática, una célula precursora derivada de la población ductal, y una célula madre pancreática.

La invención describe que dicho ensayo incluye determinar si tras poner en contacto la célula también es capaz de producir insulina, en particular tras la incubación de las células con glucosa. Este resultado del cribado de la invención es especialmente adecuado, porque la capacidad de producir insulina es la característica principal de las células beta pancreáticas.

Esto da como resultado que dicho ensayo incluya tanto la capacidad de producir insulina como de determinar la expresión de Arx.

Así, la invención describe que el método para el cribado de un compuesto útil para inducir el fenotipo de célula beta pancreática comprende las etapas de: (a) seleccionar un compuesto de ensayo que inhibe la expresión de Arx llevando a cabo un método como se describió anteriormente, (b) determinar si dicho compuesto induce la producción de insulina en una célula, y (c) seleccionar positivamente el compuesto de ensayo capaz de inducir la producción de insulina en una célula.

Métodos para determinar el nivel de expresión de un gen:

La determinación del nivel de expresión de un gen se puede llevar a cabo mediante una diversidad de métodos muy conocidos en la técnica.

En general, el nivel de expresión tal como se determina es un nivel de expresión relativo. Por ejemplo, la determinación comprende poner en contacto la muestra biológica (p.ej. una muestra de células puesta en contacto con un compuesto de ensayo) con reactivos selectivos tales como sondas, cebadores o ligandos, y de ese modo detectar la presencia, o medir la cantidad, de polipéptido o ácidos nucleicos de interés en un principio en dicha muestra biológica. La puesta en contacto se puede llevar a cabo en cualquier dispositivo adecuado, tal como una placa, placa de microtitulación, tubo de ensayo, pocillo, vidrio, columna, etc. La invención describe que la puesta en contacto se lleva a cabo sobre un sustrato revestido con el reactivo, tal como una matriz de ácido nucleico o una matriz de ligando específico. El sustrato puede ser un sustrato sólido o semisólido tal como cualquier soporte adecuado que comprende vidrio, plástico, nailon, papel, metal, polímeros y similares. El sustrato puede ser de diversas formas y tamaños, tal como un portaobjetos, una membrana, una microesfera, una columna, un gel, etc. La puesta en contacto se puede hacer en cualquier condición adecuada para que se forme un complejo detectable, tal como un híbrido de ácido nucleico o un complejo anticuerpo-antígeno, entre el reactivo y los ácidos nucleicos o polipéptidos de la muestra biológica.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "determinar" incluye la detección cualitativa y/o cuantitativa (es decir, detectar y/o medir el nivel de expresión) con o sin referencia a un control o un valor predeterminado. Tal como se usa en la presente memoria, "detectar" significa determinar si Arx está presente o no en una muestra biológica, y "medir" significa determinar la cantidad de Arx en una muestra biológica. En general, se puede determinar el nivel de expresión, por ejemplo, mediante RT-PCR o inmunohistoquímica (IHC) llevadas a cabo con una muestra biológica.

La invención describe que se puede determinar el nivel de expresión determinando la cantidad de mARN.

Los métodos para determinar la cantidad de mARN son muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, el ácido nucleico contenido en las muestras biológicas (p.ej., células o tejidos preparados del paciente) se extrae primero según métodos habituales, por ejemplo mediante el uso de enzimas líticas o disoluciones químicas, o se extrae mediante resinas de unión de ácidos nucleicos siguiendo las instrucciones del fabricante. El mARN extraído se detecta después mediante hibridación (p.ej., análisis de transferencia de Northern) y/o amplificación (p.ej., RT-PCR). Se prefiere la RT-PCR cuantitativa o semicuantitativa. La RT-PCR cuantitativa o semicuantitativa en tiempo real es especialmente ventajosa.

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rápida de glucosa, con un máximo inferior de glucemia, lo que sugiere una masa incrementada de células β funcionales. n ≥3 en todos los experimentos, ** p<0,01, * p<0,05 mediante el uso de ANOVA.

Figura 4: La masa de células similares a β se puede regenerar tras el tratamiento con estreptozotocina en ratones tratados con GABA, y las células insulina+ neo-generadas son funcionales. Los ratones WT se sometieron a tratamiento con estreptozotocina (STZ), y 15 a 20 días después se trataron con GABA o agua. Tras un máximo de glucemia, se observa una recuperación estable para los animales tratados con GABA, mientras los controles mueren de hiperglucemia extrema (A). Tal recuperación está asociada a una regeneración clara de su masa de células β monitorizada 5, 10, 25 y 45 días tras la administración de estreptozotocina mediante inmunoquímica. 85 días tras la inyección de estreptozotocina, los animales WT tratados con GABA y STZ y los controles sin tratar se sometieron a un ensayo de tolerancia a la glucosa (GTT) (B). Los ratones tratados con GABA se comportaron mejor que los controles, con un máximo inferior de glucemia y una vuelta más rápida a la euglucemia, lo que sugiere una masa incrementada de células β.

Figura 5: Expresión relativa de mARN de Arx en células α-TC1-6 tratadas con GABA: Se trataron células α-TC1-6 con concentraciones crecientes de GABA durante diferentes periodos de tiempo. Se midió la expresión relativa de mARN de Arx en las diferentes condiciones. Se observó una disminución de la expresión de Arx en las células tratadas con GABA en comparación con las células no tratadas. * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001; n≥3; datos analizados estadísticamente mediante un ANOVA unidireccional, todos los datos representados como la media ± EEM.

EJEMPLO 1: INHIBICIÓN GENÉTICA DE LA EXPRESIÓN DE ARX

Materiales y Métodos

Manipulaciones de ratones: Para estudiar la invalidación del gen Arx de manera específica en las células α pancreáticas, se usaron dos líneas transgénicas. En primer lugar, se usó una aproximación Cre-LoxP clásica (ArxcKO::GluCre) cruzando la ArxcKO descrita previamente (Fulp et al., 2008), generada mediante recombinación homóloga insertando dos sitios loxP alrededor del segundo exón del gen Arx, y la línea de ratón glucagón-cre clásica, descrita por Herrera et al. (2000). Los experimentos de seguimiento del linaje se realizaron mediante el cruce de animales ArxcKO con una línea de ratones GluCre_ROSA26-β-Gal (Soriano, 1999). En segundo lugar, se generó un sistema inducible aprovechando el sistema TetOn (Clonetech), por lo que se obtuvieron ratones transgénicos dobles cruzando ratones Glu-rtTA y TetOCre (Belteki et al., 2005), se cruzaron adicionalmente con ratones ArxcKO y la línea de ratón GluCre-ROSA26-β-Gal para fines de seguimiento del linaje. En la línea de ratón transgénico triple resultante (ArxcKO::Glu-rtTA-TetOCre), se inactiva condicionalmente Arx de manera específica en las células que expresan glucagón, y solamente tras tratamiento con doxiciclina. Se administró doxiciclina (Sigma) por medio del agua de bebida recién preparada una vez a la semana a una concentración de 2 g/L. Para estudiar la proliferación celular tras la inducción mediada por doxiciclina de Arx, se trataron ratones ArxcKO::Glu-rtTA-TetOCre con doxiciclina y posteriormente con BrdU durante 10 días antes del examen. Se detectaron las células que habían incorporado BrdU durante la replicación del ADN mediante inmunohistoquímica (Invitrogen).

Para analizar la inactivación de Pax4 en mutantes de Arx, se cruzaron ratones con inactivación condicional de Pax4, previamente descritos por Kordowich et al. 2012, con animales Glu-Cre::ArxcKO (Glu-Cre::ArxcKO::Pax4cKO).

Inmunohistoquímica: Los tejidos se fijaron en un 4% de PFA durante 30 min a 4 °C, se incrustaron en parafina y se aplicaron cortes de 8 µm a los portaobjetos. Estos cortes se ensayaron como se describió previamente (Collombat et al., 2003). Los anticuerpos primarios usados fueron los siguientes: anti-insulina policlonal de conejillo de Indias (1/500-Linco), anti-glucagón (1/500-Linco), anti-insulina monoclonal de ratón (1/500-Sigma), anti-glucagón (1/500-Sigma), anti-somatostatina de rata (1/250-Millipore), anti-PP de conejo (1/100), anti-Glut2 (1/5000), anti-PC1/3 (1/500), anti-Nkx6.1 (1/3000), anti-Pdxl (1/1000), anti-NeuroDl (1/200), anti-pax4 (1/4000), anti-Arx (1/500-), anti-BrdU de ratón (1/40). Los anticuerpos secundarios (1/1000-Molecular Probes) usados fueron: 594-alexa anti-ratón; 488-alexa anti-ratón; 594-alexa anti-conejo; 488-alexa anti-conejo; 594-alexa anti-conejillo de Indias; 488-alexa anticonejillo de Indias; 488-alexa anti-rata. Las fotografías se procesaron mediante el uso de ZEISS Axioimager Z1 y LEICA DM 6000 B. Para fines de cuantificación, se contaron manualmente las células teñidas en cada décimo corte.

Experimentos de seguimiento del linaje basados en β-galactosidasa: Los tejidos pancreáticos se aislaron y se fijaron durante 30 min a 4 °C en una disolución que contenía un 1% de formaldehído, 0,2% de glutaraldehído, 0,02% de NP40. Los tejidos se deshidrataron en un 25% de sacarosa durante la noche a 4 °C. Antes de cortarlos, los tejidos se incrustaron en un medio de congelación. Para la determinación de la actividad de β-galactosidasa, los tejidos se lavaron en PBS y después se incubaron durante la noche en una disolución de tinción (K3Fe(CN)6 500 mM, K4Fe(CN)6 250 mM, MgCl2 0,5 M, 40 mg/ml de X-gal en DMF).

Exposición y medida de los niveles de glucosa en sangre: Para fines de exposición, los animales se sometieron a ayuno durante 16 h y se les inyectó de manera intraperitoneal glucosa (2 g/kg de peso corporal) o insulina (0,75 U/kg). Se midieron los niveles de glucosa en sangre en los momentos indicados tras la inyección con un glucómetro ONETOUCH Vita (Life Scan, Inc., CA).

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podría estimular tales procesos mediante la estimulación de Pax4. Para distinguir entre estas dos posibilidades, se generaron animales mutantes dobles que permitieron la deleción condicional de Arx y Pax4 de manera específica en las células α. Para conseguir este fin, se cruzaron animales ArxcKO con animales Pax4cKO (generados mediante introducción de dos sitios LoxP en el locus de Pax4 [Kordowitch et al., 2012]). Los animales transgénicos dobles resultantes se cruzaron posteriormente con ratones Glu-Cre para generar animales Glu-cre::ArxcKO::Pax4cKO (denominados Glu-ArxKO/Pax4KO). Mediante el uso de inmunohistoquímica en páncreas transgénicos triples de 3 meses de edad, se descubrió que las células productoras de glucagón fueron negativas para Arx y Pax4. De manera importante, también se descubrió que varias células productoras de insulina carecieron de Pax4, y tales células correspondieron muy probablemente a células α convertidas en células similares a β ArxY/-Pax4-/-. El examen adicional de estos páncreas transgénicos triples mediante inmunohistoquímica proporcionó, de nuevo, un incremento sustancial del número de islotes y una hipertrofia clara de islotes provocada por una hiperplasia de las células insulina+, que se descubrió que fue similar a la observada en los animales con deleción de Arx. Los análisis cuantitativos confirmaron este aumento del número de células insulina+ (Figura 3A-E), pero también del contenido de células somatostatina+, y las células distintas de β se hallaron de nuevo localizadas preferentemente cerca de los conductos en los islotes. Fue digno de mención que la observación de que, a pesar de la carencia de Pax4 en la mayoría de células β, no se pudo detectar una alteración de la glucemia basal de mutantes dobles de 6 meses de edad en comparación con los controles (127±7 mg/dl y 121±4 mg/dl, respectivamente). De manera interesante, tras la exposición a glucosa, los animales Glu-ArxKO/Pax4KO mostraron una respuesta significativamente mejorada como se observó previamente en los ratones Glu-ArxKO (Figura 3F), lo que sugiere una masa incrementada de células similares a β funcionales. En conjunto, el análisis sugiere que la pérdida combinada de Arx y Pax4 en las células productoras de glucagón da como resultado un fenotipo similar al de los mutantes de Arx, lo que sugiere que Arx representa la pieza principal implicada en los procesos de neogénesis de células similares a β mediados por células α.

DISCUSIÓN:

En este estudio, se informa que la inactivación del gen Arx en las células α pancreáticas a diferentes edades da como resultado islotes hipertróficos compuestos principalmente de células que expresan un fenotipo de células β. Los datos apoyan la noción de una conversión de células α en células similares a β tras la simple inactivación de Arx. Estos procesos desencadenan mecanismos compensatorios, asociados a la reexpresión de Ngn3 y Rfx6, que dan como resultado la neogénesis de células similares a α, y tales células se convierten posteriormente en células similares a β tras la expresión de glucagón, y de ese modo la inactivación de Arx. De manera importante, las células similares a β recién formadas son funcionales y pueden invertir la diabetes inducida químicamente. Igual de interesante fue el hallazgo de que la pérdida adicional de Pax4 no afecta a estos mecanismos, lo que sugiere que Arx representa el inductor principal de la neogénesis de las células similares a β mediada por células α.

La inactivación de Arx induce que las células α adquieran una identidad de células similares a β: Se analizaron dos modelos de ratones transgénicos que permitieron (1) la inactivación constitutiva de Arx en todas las células productoras de glucagón tan pronto como inician la expresión de hormonas (es decir, durante la embriogénesis), o

(2) la pérdida inducible de Arx en las células α a cualquier edad. En ambos casos, se descubrió que la inactivación de Arx fue bastante eficaz, y un 70-90% de las células glucagón+ parecieron deficientes de Arx. De manera interesante, se descubrió que varias células ArxY/-glucagón+ expresaron de manera ectópica el gen específico de células β Pax4. Debido a que se descubrió previamente que Pax4 y Arx inhiben mutuamente la transcripción del otro durante el transcurso de la morfogénesis del páncreas [Collombat et al., 2005], es concebible que la pérdida de Arx pueda dar como resultado la reactivación de Pax4 en las células α. Esta noción estuvo apoyada por las alteraciones fenotípicas observadas en ambos modelos, reminiscentes de las halladas en animales con expresión ectópica constitutiva de Pax4 en las células productoras de glucagón [Collombat et al., 2009]. De hecho, se observó una progresiva hiperplasia de células insulina+/hipertrofia de islotes y un incremento sustancial del número de islotes. Sin embargo, a diferencia de los animales que expresaron anormalmente Pax4 en las células glucagón+, los ratones Glu-ArxKO y Dox+ IndGlu-ArxKO mostraron una esperanza de vida normal, una glucemia basal normal, y un incremento limitado de islotes totales/población de células insulina+. Estas discrepancias se pueden atribuir muy probablemente a diferencias en la eficacia de la expresión de los transgenes, pero también, en el caso de Dox+ IndGlu-ArxKO, al hecho de que la deficiencia de Arx se desencadena en las células α a edades más tardías.

Mediante el uso del seguimiento del linaje, se demuestra que la pérdida de Arx en las células α induce su conversión en células que expresan la mayoría de características de las células β verdaderas, tal como se proporciona por medio del análisis de genes marcadores, el examen de microscopía electrónica, y los ensayos funcionales. Es interesante observar la similitud de las alteraciones fenotípicas en los animales Glu-ArxKO e IndGlu-ArxKO tratados con Dox a diferentes edades. De hecho, esto sugiere que el envejecimiento no es un factor limitante para este proceso de conversión, ni para la neogénesis resultante de células insulina+. En otras palabras, los datos indican que las células α adultas que se han sometido a envejecimiento y señales ambientales conservan su capacidad de conversión en células similares a β.

Origen de las células similares a β neo-generadas: Aunque se demostró una conversión de células productoras de glucagón en células similares a β, también se observó sistemáticamente la presencia continuada de células α en ambos modelos animales, y los análisis de cuantificación no mostraron variaciones significativas en su contenido en comparación con los controles. Esto sugiere que se activan procesos de neogénesis para compensar la pérdida de

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las células α convertidas. Es probable que la falta de glucagón provocada por esta conversión corresponda a la señal desencadenante de tal neogénesis, como se observa en los animales que expresaban anormalmente Pax4 en células glucagón+ [Collombat et al., 2009]. Sin embargo, la confirmación de esta hipótesis requeriría un trabajo adicional. De manera interesante, se observaron numerosas células en proliferación en los páncreas mutantes para Arx. Estas se detectaron en su mayoría en el tapiz ductal, en vez de dentro del islote. Además, también se detectaron células que reactivaron la expresión del gen del desarrollo y pro-endocrino Ngn3 en la misma localización que se observó en los animales que se sometieron a ligadura de los conductos pancreáticos [Xu et al. 2008] o con la expresión anormal forzada de Pax4 en las células α [Collombat et al., 2009]. Del mismo modo, también se descubrió que se expresaba de manera ectópica en la misma localización un objetivo de Ngn3, Rfx6, lo que sugiere una recapitulación de, al menos, una parte del programa de diferenciación endocrina. Además, se observó un número incrementado de células somatostatina+ en el polo del islote muy cerca de estos conductos. En conjunto, estos resultados apoyan la noción de que, tras la conversión de las células α en células similares a β, se activan mecanismos compensatorios y dan como resultado la proliferación de células del tapiz ductal, la reexpresión de Ngn3, así como la expresión ectópica de Rfx6, y la adquisición de una identidad de células endocrinas. La validación de tal concepto requeriría el seguimiento inducible del linaje de las células que expresan Ngn3/Rfx6. Sin embargo, debido al uso del sistema Cre/Lox para inactivar Arx en estos modelos animales, no se pudo usar para seguir la progenie de estas células.

Aunque los experimentos de seguimiento del linaje permitieron concluir que las células α neogeneradas continuamente se pueden convertir en células similares a β tras la inactivación de Arx, sigue sin estar claro el destino/origen de las células somatostatina+ supernumerarias. Se pudieron concebir tres alternativas probables: (1) las células que reexpresan Ngn3 podrían pasar a través de una fase de transición de expresión de glucagón antes de adoptar una de las diferentes identidades de las células endocrinas, (2) las células que reexpresan Ngn3 podrían adoptar preferentemente un destino de célula α para sustituir las convertidas y posteriormente adoptar un fenotipo de células similares a β tras la deficiencia de Arx, y las células extra somatostatina+ detectadas corresponderían a células que han escapado a este favorecimiento del linaje, (3) las células que reexpresan Ngn3 podrían dar lugar a los diferentes subtipos de células endocrinas, como se observa durante el transcurso del desarrollo, y varias de las células somatostatina+ neo-generadas se convertirían posteriormente en células similares a α para compensar su pérdida (antes de la adquisición de una identidad de células similares a β tras la inactivación de Arx). Aunque la primera alternativa se podría descartar basándose en la ausencia de marcaje con β-gal de las células somatostatina+ en el seguimiento del linaje de las células glucagón+, la discriminación entre las últimas hipótesis esperará la generación de herramientas genéticas adecuadas para seguir la progenie de las células somatostatina+ o PP+. De forma similar, será necesario un trabajo adicional para proporcionar pruebas concluyentes del destino/papel de las células que reexpresan Ngn3.

La inactivación de Arx en las células α puede invertir las consecuencias de la diabetes inducida por toxinas: En un esfuerzo continuo para asegurar la identidad de las células similares a β suplementarias observadas en los ratones Glu-ArxKO y Dox+ IndGlu-ArxKO, se monitorizaron sus parámetros fisiológicos y se llevaron a cabo ensayos funcionales, que incluyen medidas de los niveles de glucosa y/o insulina tras exposiciones a glucosa o insulina. En todos los casos, los resultados apoyan la noción de una masa incrementada de células similares a β capaces de responder a diferentes exposiciones. Es digno de mención que, a pesar de una hiperplasia de células similares a β, se descubrió que estos animales exhibieron una glucemia basal normal y no exhibieron resistencia a insulina, lo que sugiere un mecanismo de retroalimentación que permite una regulación óptima a pesar de un número incrementado de células similares a β. De manera importante, los análisis demostraron que tales células similares a β pueden sustituir funcionalmente a sus homólogos endógenos tras la inactivación de las células β inducida por estreptozotocina, y de ese modo previenen la muerte del animal o la hiperglucemia crónica. De manera interesante, los datos sugieren que tales procesos regenerativos pueden conducir a una reposición de la masa de células β, y de ese modo permitir la supervivencia del animal, incluso cuando se desencadena de manera concomitante con una hiperglucemia mediada por toxinas. Esto sugiere una neogénesis relativamente eficaz y rápida de células similares a β. Así, los hallazgos sugieren que la simple pérdida del gen Arx en las células α es suficiente para iniciar un ciclo continuo de neo-formación de células α y su conversión en células similares a β, y de ese modo conduce a la regeneración de una masa de células similares a β funcionales, un concepto importante en el contexto de la investigación de la diabetes.

Arx como pieza principal en la neogénesis de células similares a β: Como se mencionó previamente, en varias células productoras de glucagón Glu-ArxKO y Dox+ IndGlu-ArxKO, se observó una expresión ectópica de Pax4. Aunque la conversión aparentemente rápida de células α en células similares a β no permitió observar esta expresión anormal en todas las células ArxY/-glucagón+, se podría plantear la hipótesis de que la reexpresión de Pax4 en las células α podría contribuir, al menos en parte, a su conversión en células similares a β como se informó previamente [Collombat et al., 2009]. Así, para determinar de manera concluyente si la expresión forzada de Pax4 o la inactivación de Arx está en el origen de la conversión de las células glucagón+ en células similares a β, se generó un modelo animal que permitió la inactivación de ambos genes en las células glucagón+. De manera interesante, se observaron alteraciones fenotípicas similares a las de los animales deficientes de Arx o que expresaban anormalmente Pax4 [Collombat et al., 2009], lo que incluye una hiperplasia de células insulina+, un aumento del número de islotes, y una localización preferente de células distintas de β cercanas a los conductos. Vale la pena indicar que se observaron varias células insulina+ Pax4-en estos páncreas mutantes dobles, lo que proporciona

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información sobre su origen, y por tanto indica que derivaron de células productoras de glucagón. Así, estos resultados demuestran que Pax4 es prescindible en estos procesos de regeneración, y permiten concluir que Arx representa el factor principal que permite la conversión de las células α en células similares a β y su regeneración posterior. Por lo tanto, se propone que el desarrollo de terapias dirigidas a inactivar/inhibir Arx en las células α potencialmente podría abrir nuevas posibilidades en la investigación de la diabetes y/o ayudar en el diseño de protocolos de diferenciación de células β eficaces en el contexto de la investigación de células madre.

EJEMPLO 2: INHIBICIÓN FARMACOLÓGICA DE LA EXPRESIÓN DE ARX

Materiales y Métodos

Manipulaciones de ratones: Se realizaron experimentos de seguimiento de linaje cruzando animales Glucagón-Cre [Gu et al., 2002; Ashery-Padan et al., 2006; Herrera 2000], Ngn3-CreER [Gu et al., 2002] y HNF-CreER [Gu et al., 2002] con la línea de ratones ROSA26-β-Gal [Soriano 1999]. Se administró GABA (Sigma) mediante inyecciones intraperitoneales de una disolución 50 µM recién preparada una vez por semana. Se disolvió tamoxifeno (TAM, Sigma) en aceite de maíz a una concentración de 20 mg/ml y se administró mediante una sonda. Para evaluar la proliferación celular tras la adición de GABA, se trató a ratones WT con GABA y posteriormente con BrdU durante 10 días antes del examen. Se detectaron las células que habían incorporado BrdU durante la replicación del ADN mediante inmunohistoquímica (Invitrogen).

Inmunohistoquímica: Los tejidos se fijaron en un 4% de PFA durante 30 min a 4 °C, se incrustaron en parafina y se aplicaron cortes de 8 µm a los portaobjetos. Estos cortes se ensayaron como se describió previamente [Collombat et al., 2003]. Los anticuerpos primarios usados fueron los siguientes: anti-insulina policlonal de conejillo de Indias (1/500-Linco), anti-glucagón (1/500-Millipore), anti-glucagón monoclonal de ratón (1/500-Sigma), anti-BrdU (1/40-Roche), anti-E-cadherina (1/200-BD Transduction Lab), anti-somatostatina de rata (1/250-Millipore), anti-Glut2 de conejo (1/5000), anti-PC1/3 (1/500-Millipore), anti-Nkx6.1 (1/3000-Novonordisk), anti-Pdxl (1/1000), anti-NeuroD1 (1/200-Millipore), anti-Ngn3 (1/500-Abgent), anti-β-galactosidasa (1/10000-Millipore), anti-vimentina de pollo (1/5000-Millipore), anti-osteopontina de cabra (1/200-R&D Systems). Los anticuerpos secundarios (1/1000 -Molecular Probes) usados fueron: 594-y 488-alexa anti-ratón; 594-y 488-alexa anti-conejo; 594-y 488-alexa anti-conejillo de Indias; 488-alexa anti-rata; 594-y 488-alexa anti-cabra; 594-y 488-alexa anti-pollo. Las fotografías se procesaron mediante el uso de ZEISS Axioimager Z1 y LEICA DM 6000 B. Para fines de cuantificación, se contaron manualmente las células teñidas en cada décimo corte.

Experimentos de seguimiento del linaje basados en β-galactosidasa: Los tejidos pancreáticos se aislaron y se fijaron durante 30 min a 4 °C en una disolución que contenía un 1% de formaldehído, 0,2% de glutaraldehído, 0,02% de NP40. Los tejidos se deshidrataron en un 25% de sacarosa durante la noche a 4 °C. Antes de cortarlos, los tejidos se incrustaron en un medio de congelación. Para la determinación de la actividad de β-galactosidasa, los tejidos se lavaron en PBS y después se incubaron durante la noche en una disolución de tinción (K3Fe(CN)6 500 mM, K4Fe(CN)6 250 mM, MgCl2 0,5 M, 40 mg/ml de X-gal en DMF).

Recuentos de células: Se llevaron a cabo análisis cuantitativos contando los píxeles coloreados en cortes (inmuno-) teñidos de páncreas mediante el uso del programa informático Photoshop. De manera específica, cada 10º corte se procesó mediante el uso de los mismos ajustes para todos los animales y genotipos.

Exposición y medida de los niveles de glucosa en sangre: Para fines de exposición, los animales se sometieron a ayuno durante 16 h y se les inyectó de manera intraperitoneal glucosa (2 g/kg de peso corporal). Se midieron los niveles de glucosa en sangre en los momentos indicados tras la inyección con un glucómetro ONETOUCH Vita (Life Scan, Inc., CA).

Inducción de la diabetes mediada por estreptozotocina: Para inducir la hiperglucemia, se disolvió STZ (Sigma) en tampón de citrato sódico 0,1 M (pH 4,5), y se administró una única dosis de manera intraperitoneal (100 mg/kg) en 10 min desde la disolución. La progresión de la diabetes se evaluó mediante la monitorización de los niveles de glucosa en sangre de los ratones.

Análisis de datos: Todos los valores se representan como la media ± EEM, y se consideran significativos si P < 0,05. Los datos se analizaron estadísticamente mediante ANOVA.

Resultados

El tratamiento de ratones WT con GABA induce una hiperplasia de células productoras de insulina, y tales células expresan un fenotipo de células β: Para determinar las consecuencias de la administración de GABA, se llevaron a cabo análisis inmunohistoquímicos. Los ratones WT tratados con GABA mostraron una hipertrofia de islotes en comparación con los ratones de control, que fue el resultado de un aumento del número de células insulina+ (Tabla 2). Este incremento del tamaño de los islotes pareció depender de la duración del tratamiento con GABA (Tabla 1). También se observó un incremento del número de islotes en los ratones tratados con GABA en comparación con los controles, y este incremento pareció ser independiente de la duración del tratamiento con GABA (Tabla 1). Además del número incrementado de islotes y células insulina+, los ratones WT tratados con GABA mostraron contenidos incrementados de células glucagón+ y somatostatina+ (Tabla 2) en comparación con sus homólogos sin tratar. Por

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último, se descubrió que los animales tratados con GABA fueron viables, sanos y fértiles, su esperanza de vida y glucemia basal permanecieron dentro de los intervalos normales, independientemente de la administración de GABA (Tabla 1).

Tabla 1: Comparación cuantitativa del número de islotes entre los animales tratados con GABA y los controles de igual edad (n = 3 para cada grupo).

Duración del tratamiento con GABA

Edad de tratamiento con GABA Esperanza de vida Glucemia basal Recuento de islotes Tamaño de islotes

1 mes

2,6 m normal 126 x 2,19 ± 0,04 *** x 1,04 ± 0,15

2 meses

2,6 m normal 134 x 1,86 ± 0,05 *** x 2,15 ± 0,22 **

3 meses

2,6 m normal 142 x 1,80 ± 0,03 *** x 3,49 ± 0,11 **

*** p<0,001, ** p<0,01; datos analizados estadísticamente mediante un ANOVA unidireccional; todos los datos representados como la media ± EEM. El examen de los ratones WT tratados con GABA durante 2 o 3 meses reveló un incremento del número de células que expresaban hormonas y del número de islotes. Se descubrió que la esperanza de vida y la glucemia basal (monitorizadas semanalmente) estuvieron dentro de los intervalos normales, en comparación con los controles, en todas las condiciones analizadas.

Tabla 2: Comparación cuantitativa del número de células que expresaban glucagón, insulina o somatostatina mediante recuento de píxeles entre animales tratados con GABA y controles de igual edad (n = 3 para cada grupo).

Duración del tratamiento con GABA

Recuento de células insulina+ Recuento de células glucagón+ Recuento de células somatostatina+

1 mes

x 1,04 ± 0,15 x 0,97 x 1,43

2 meses

x 2,15 ± 0,22 ** x 1,91 x 2,39

3 meses

x 3,49 ± 0,11 ** x 3,02 x 2,84

*** p<0,001, ** p<0,01; datos analizados estadísticamente mediante un ANOVA unidireccional; todos los datos representados como la media ± EEM. El examen de los ratones WT tratados con GABA durante 2 o 3 meses reveló un incremento del número de células que expresaban hormonas y del número de islotes. Se descubrió que la esperanza de vida y la glucemia basal (monitorizadas semanalmente) estuvieron dentro de los intervalos normales, en comparación con los controles, en todas las condiciones analizadas.

Para confirmar la identidad de las células insulina+ en los páncreas tratados con GABA, se ensayó la expresión de varios genes marcadores de células endocrinas mediante inmunoquímica en comparación con los controles sin tratar. Estos análisis revelaron que las células que expresaban insulina en los islotes tratados con GABA mostraron la mayoría de características de las células β verdaderas. De hecho, estas células expresaron uniformemente marcadores fiables de células β, tales como los factores de transcripción Pdx1, Nkx6.1 y NeuroD1, el transportador de glucosa específico de células β Glut 2, la prohormona convertasa 1/3 (PC1/3), así como el marcador panendocrino Pax6. También se descubrió que estas células carecieron de los determinantes de las células distintas de β, tales como glucagón y somatostatina.

En conjunto, los datos demuestran que la administración de GABA a ratones WT conduce a una hipertrofia progresiva de islotes y a la neogénesis de islotes. Estos islotes hipertróficos son principalmente la consecuencia de una hiperplasia de células insulina+ (dichas células expresan muchas características de las células β verdaderas), así como de un incremento del contenido de células glucagón+ y células somatostatina+.

El tratamiento con GABA puede inducir la conversión de células que expresan glucagón en células productoras de insulina: Para determinar el origen de la hipertrofia de los islotes en los ratones tratados con GABA, se llevaron a cabo análisis inmunohistoquímicos adicionales. Se observaron varios ejemplos, de islotes no relacionados, de células que co-expresaban insulina con glucagón. Esto sugiere que los procesos subyacentes en la neogénesis de células similares a β podrían requerir una fase de transición de expresión de glucagón. Para validar esta hipótesis, se usaron ratones Glu-Cre::Rosa26-lox-β-gal. Estos ratones, en los que las células que expresan glucagón están marcadas de manera irreversible, se trataron con una dosis elevada de estreptozotocina para inducir químicamente la diabetes, y después se les inyectó diariamente (o no) GABA una vez que fueron hiperglucémicos (glucemia de alrededor de 300 mg/dl). En los controles Glu-Cre::Rosa26-lox-β-gal (no tratados con GABA o estreptozotocina), mediante el uso de tinción de X-gal, se halló actividad de β-gal únicamente en las células de la zona del manto de los islotes, en la que se detectan clásicamente células que expresan glucagón. En los animales tratados con GABA (aislados 40 días tras la inyección de estreptozotocina), los islotes parecieron regenerados, y se observó un gran

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regeneraron progresivamente células insulina+ tras la pérdida de las células β en animales WT tratados con GABA, mediante análisis inmunohistoquímicos en diferentes momentos.

Los datos proporcionan pruebas de que las células similares a β neo-generadas son funcionales y pueden contrarrestar la diabetes inducida químicamente.

DISCUSIÓN:

Los informes previos han demostrado un efecto regenerativo de GABA en los modelos de ratón TD1. Sin embargo, que se sepa, no se ha establecido una conexión entre GABA y la regeneración de células β mediada por células α. En este estudio, se intentó investigar si GABA puede ser un inductor químico potencial de este proceso. Mediante el uso del tratamiento con GABA en ratones WT y varias líneas de ratón que permiten el seguimiento del linaje, se informa de que el tratamiento de ratones WT con GABA da como resultado islotes hipertróficos debido a la hiperplasia de células β, células α y células δ. Se demuestra que estas alteraciones fenotípicas implican la proliferación de células en el epitelio/tapiz ductal acompañada de la reexpresión del factor pro-endocrino Ngn3. Aprovechando las herramientas de seguimiento del linaje, también se demuestra que una mayoría de las células adicionales observadas tras el tratamiento con GABA han pasado a través de una etapa de expresión de glucagón, Ngn3 y Hnf1β, lo que confirma adicionalmente los hallazgos. Además, las células recién formadas son funcionales y pueden invertir la diabetes inducida químicamente tras el tratamiento con GABA. En conjunto, estos hallazgos apoyan la noción de que GABA puede inducir la regeneración de células β a través de un proceso de conversión de células α en células β.

El tratamiento con GABA induce a las células α a convertirse en células β: Las alteraciones fenotípicas observadas en los ratones WT tratados con GABA durante 1 a 3 meses son reminiscentes de las halladas en los animales con expresión ectópica de Pax4 en las células que expresan glucagón. De hecho, el tratamiento de ratones WT con GABA induce una hipertrofia de islotes acompañada de un aumento del contenido de células productoras de hormonas, y un incremento del número de islotes. Una posibilidad para el origen de los islotes sobredimensionados podría ser la proliferación de las células β endógenas, y esta hipótesis está apoyada por los informes de que GABA incrementa la replicación de células β [Soltani et al., 2011; Ligon et al., 2007]. Sin embargo, la ausencia de un incremento significativo de la proliferación de células β en los ratones tratados con GABA respecto del tamaño de los islotes (datos no mostrados) sugiere que el incremento de la población de células β puede surgir de otra fuente. Teniendo en cuenta el hecho de que GABA puede convertir las células α en células similares a β in vitro, se usó la línea de ratones Glu-Cre::Rosa26-lox-β-gal para determinar el destino de las células productoras de glucagón tras la adición de GABA. Los experimentos de seguimiento del linaje proporcionaron pruebas de la conversión de células α en células β mediada por GABA in vivo, lo que dio como resultado islotes hipertróficos. Además, la detección continuada de células glucagón+ a pesar de su conversión sugiere que se desencadenan mecanismos compensatorios para regenerar estas células. De hecho, se observó una renovación de células α como resultado de las alteraciones en la señalización de glucagón o la escasez de glucagón en los estudios previos. Si, en este caso, la hipertrofia de los islotes es la consecuencia de la reducción del glucagón y la neogénesis de células α posterior, la suplementación con glucagón debería dificultar este proceso. Para verificar esta teoría, se podría administrar glucagón a animales WT tratados con GABA para observar si esto podría disminuir el número incrementado de células que expresan hormonas.

Origen de la hipertrofia de islotes: Por lo que se refiere al origen de las células similares a α neo-generadas, la observación de una localización preferente de esas células en un polo del islote, adyacente a los conductos, la reexpresión de Ngn3 y la proliferación incrementada de células en el medio ductal apunta a una supuesta fuente de células que expresan glucagón. Además, se observó que pocas células de los islotes co-expresaron Ngn3 y glucagón/insulina (datos no mostrados), lo que sugiere además que esas células pasaron a través de una fase de reexpresión potencial de Ngn3. El seguimiento de las células HNF1β+ y Ngn3+ en los animales tratados con GABA apoyó esta hipótesis. De hecho, se detectó actividad de β-galactosidasa en los islotes en ratones Ngn3CreER::Rosa26-lox-β-gal y HNF1β-CreER::Rosa26-lox-β-gal tratados con GABA, a diferencia de los animales de control. Sin embargo, los análisis inmunohistoquímicos adicionales mediante el uso de anticuerpos generados hacia las hormonas endocrinas y β-galactosidasa deberían confirmar el concepto de que las células que expresan glucagón (y posteriormente las células productoras de insulina) pasaron a través de una fase de transición HNF1β+ y Ngn3+. Los experimentos adicionales mediante el uso de una línea de ratones con inactivación condicional de Ngn3 deberían determinar la contribución de las células que reexpresan Ngn3 a la regeneración de las células glucagón+. Además de la reexpresión de Ngn3, se observó la expresión de un marcador mesenquimatoso, vimentina, en el mismo medio ductal, y unas cuantas células vimentina+ glucagón+/insulina+ en los islotes. En conjunto, los resultados sugieren que la generación de nuevas células epiteliales/endocrinas puede requerir la conversión de células similares al mesénquima. Sin embargo, sigue sin determinarse si la neogénesis de las células de los islotes pasa a través de la activación de una ruta mesenquimatosa. Además, se observó un número incrementado de células somatostatina+ en estrecha proximidad a los conductos. Por lo tanto, se podría plantear la hipótesis de que estas células se regeneraron tras el tratamiento con GABA antes de su conversión en células productoras de insulina. El seguimiento de las células somatostatina+ debería proporcionar respuestas, sin embargo, que se sepa, todavía se tiene que generar una línea de ratones Somatostatina-Cre que funcione.

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Claims (1)

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