ES2667672T3 - Inhibición mediada por interferencia de ARN de expresión génica usando áciddo nucleico de interferencia corto (ANic) - Google Patents

Inhibición mediada por interferencia de ARN de expresión génica usando áciddo nucleico de interferencia corto (ANic) Download PDF

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ES2667672T3
ES2667672T3 ES14195627.6T ES14195627T ES2667672T3 ES 2667672 T3 ES2667672 T3 ES 2667672T3 ES 14195627 T ES14195627 T ES 14195627T ES 2667672 T3 ES2667672 T3 ES 2667672T3
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James Mcswiggen
Leonid Beigelman
Bharat Chowrira
Pamela Pavco
Kathy Fosnaugh
Sharon Jamison
Nassim Usman
James Thompson
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Sirna Therapeutics Inc
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Abstract

Una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) sintética modificada químicamente capaz de regular negativamente la expresión de un gen diana en células por interferencia de ARN (iARN), en la que el ANic comprende: (a) una cadena con sentido y una cadena antisentido; (b) cada cadena de la molécula de ácido nucleico tiene independientemente una longitud de 18 a 24 nucleótidos y el dúplex de ANic tiene de 17 a 23 pares de bases; y (c) un conjugado unido covalentemente a la molécula de ANic; (d) en la que la cadena con sentido tiene 1-10 enlaces internucleósido de fosforotioato y uno o más 2'-desoxi, 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro y/o uno o más nucleótidos modificados de base universal; y la cadena antisentido tiene 1-10 enlaces internucleósido de fosforotioato y uno o más 2'-desoxi, 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'- fluoro y/o uno o más nucleótidos modificados de base universal, en la que el conjugado: se selecciona del grupo que consiste en lípidos, fosfolípidos, anticuerpos, toxinas, polímeros cargados negativamente, proteínas, péptidos, hormonas, carbohidratos, polietilenglicoles y poliaminas; o comprende un ligando para un receptor celular.

Description

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DESCRIPCION
Inhibición mediada por interferencia de ARN de expresión génica usando áciddo nucleico de interferencia corto (ANic)
Campo de la Divulgación
La presente divulgación se refiere a procedimientos y reactivos útiles en la modulación de la expresión génica en una diversidad de aplicaciones, incluyendo su uso en aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico, de validación de dianas y descubrimiento genómico. Específicamente, la divulgación se refiere a moléculas pequeñas de ácido nucleico, tales como moléculas de ácido nucleico de interferencia corto (ANic), ARN de interferencia corto (ARNic), ARN bicatenario (ARNbc), micro-ARN (miARN) y ARN de horquilla corto (ARNhc) capaces de mediar la interferencia de ARN (iARN).
Antecedentes de la invención
Lo siguiente es un análisis de la técnica pertinente que concierne a la iARN. La discusión se proporciona sólo para la comprensión de la siguiente invención. El sumario no es una admisión de que cualquiera de los trabajos descritos más adelante sea de la técnica anterior a la invención reivindicada. En el presente documento el solicitante demuestra que los ácidos nucleicos de interferencia cortos modificados químicamente poseen la misma capacidad para mediar la iARN que las moléculas de ARNic, y se espera que posean una estabilidad y actividad in vivo mejoradas; por lo tanto, esta discusión no tiene por objeto limitarse sólo a ARNic y puede aplicarse a ANic de manera general.
La interferencia de ARN se refiere al procedimiento de silenciamiento génico postranscripcional específico de secuencia en animales mediado por los ARN de interferencia cortos (ARNic) (Fire y col., 1998, Nature, 391, 806). El procedimiento correspondiente en plantas se denomina comúnmente silenciamiento génico postranscripcional o silenciamiento de ARN, y también se denomina supresión en hongos. Se piensa que el procedimiento de silenciamiento génico postranscripcional es un mecanismo de defensa celular conservado de forma evolutiva usado para evitar la expresión de genes extraños, y flora y filos diversos lo comparten comúnmente (Fire y col., 1999, Trends Genet., 15, 358). Dicha protección frente a la expresión de genes extraños puede haber evolucionado como respuesta a la producción de ARN bicatenarios (ARNbc) derivados de una infección viral o de la integración aleatoria de elementos transponibles en un genoma huésped mediante una respuesta celular que destruye específicamente ARN monocatenario homólogo o ARN genómico viral. La presencia de ARNbc en células desencadena la respuesta de iARN a través de un mecanismo que aún tiene que caracterizarse completamente. Este mecanismo parece ser diferente de la respuesta de interferón que se produce como resultado de la activación mediada por ARNbc de la proteína quinasa PKR y 2',5'-oligoadenilato sintetasa, dando como resultado una escisión inespecífica del ARNm por la ribonucleasa L.
La presencia de ARNbc largos en células estimula la actividad de una enzima ribonucleasa III denominada dicer. La dicer está implicada en el procesamiento de los ARNbc en trozos cortos de ARNbc conocidos como ARN de interferencia cortos (ARNic) (Berstein y col., 2001, Nature, 409, 363). Los ARN de interferencia cortos derivados de la actividad de dicer típicamente tienen de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleótidos de longitud y comprenden dúplex de aproximadamente 19 pares de bases (Elbashir y col., 2001, Genes Dev., 15, 188). También se ha implicado a dicer en la escisión de ARN temporales pequeños (ARNtp) de 21 y 22 nucleótidos a partir de ARN precursor de estructura conservada que están implicados en el control traduccional (Hutvagner y col., 2001, Science, 293, 834). La respuesta de iARN también presenta un complejo de endonucleasa, denominado comúnmente complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que media la escisión de ARN monocatenario que tiene una secuencia complementaria a la cadena antisentido del dúplex de ARNic. La escisión del ARN diana tiene lugar en el centro de la región complementaria a la cadena antisentido del dúplex de ARNic (Elbashir y col., 2001, Genes Dev., 15, 188).
La iARN se ha estudiado en una diversidad de sistemas. Fire y col., 1998, Nature, 391, 806, fueron los primeros en observar la iARN en C. elegans. Wianny y Goetz, 1999, Nature Cell Biol., 2, 70, describen la iARN mediada por ARNbc en embriones de ratón. Hammond y col., 2000, Nature, 404, 293, describen la iARN en células de Drosophila transfectadas con ARNbc. Elbashir y col., 2001, Nature, 411, 494, describen la iARN inducida introduciendo dúplex de ARN sintéticos de 21 nucleótidos en células de mamífero cultivadas incluyendo células embrionarias de riñón humano y células HeLa. Trabajos recientes en lisados embrionarios de Drosophila (Elbashir y col., 2001, EMBO J., 20, 6877) han revelado determinados requisitos de longitud, estructura, composición química y secuencia de ARNic que son esenciales para mediar una actividad de iARN eficaz. Estos estudios han demostrado que los dúplex de ARNic de 21 nucleótidos son más activos cuando contienen salientes dinucleotídicos 3'-terminales. Además, la sustitución completa de una o ambas cadenas de ARNic con nucleótidos 2'-desoxi (2'-H) o 2'-O-metilo suprime la actividad de iARN, mientras que se demostró que se toleraba la sustitución de los nucleótidos salientes de ARNic 3'-terminales con nucleótidos 2'-desoxi (2'-H). También se
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demostró que secuencias con un solo emparejamiento erróneo en el centro del dúplex de ARNic suprimía la actividad de iARN. Además, estos estudios también indican que la posición del sitio de escisión en el ARN diana está definida por el extremo 5' de la secuencia guía de ARNic en lugar del extremo 3' de la secuencia guía (Elbashir y col., 2001, EMBO J., 20, 6877). Otros estudios han indicado que es necesario un fosfato 5' en la cadena complementaria diana de un dúplex de ARNic para la actividad del ARNic y que, para mantener el resto fosfato 5' en el ARNic, se utiliza ATP (Nykanen y col., 2001, Cell, 107, 309).
Los estudios han demostrado que la sustitución de los segmentos salientes de nucleótidos 3'-terminales de un dúplex de ARNic de 21 unidades, que tiene salientes 3' de dos nucleótidos, con desoxirribonucleótidos no tiene un efecto adverso sobre la actividad de iARN. Se ha indicado que la sustitución de hasta cuatro nucleótidos en cada extremo del ARNic con desoxirribonucleótidos se tolera bien, mientras que la sustitución completa con desoxirribonucleótidos da como resultado la ausencia de actividad de iARN (Elbashir y col., 2001, EMBO J., 20, 6877). Además, Elbashir y col., anteriormente, también indican que la sustitución de ARNic con nucleótidos 2'-O- metilo suprime completamente la actividad de iARN. Li y col., Publicación Internacional PCT N° WO 00/44914, y Beach y col., Publicación Internacional PCT N° WO 01/68836 sugieren de forma preliminar que el ARNic puede incluir modificaciones en la cadena principal de azúcar-fosfato o en el nucleósido para incluir al menos uno de un heteroátomo de nitrógeno o de azufre, sin embargo, ninguna solicitud postula en qué medida se tolerarían tales modificaciones en moléculas de ARNic, ni proporciona ninguna orientación adicional o ejemplos de dicho ARNic modificado. Kreutzer y col., solicitud de patente canadiense N° 2.359.180, también describen determinadas modificaciones químicas para su uso en construcciones de ARNbc con el fin de contrarrestar la activación de la proteína quinasa PKR dependiente de ARN bicatenario, específicamente nucleótidos 2'-amino o 2'-O-metilo y nucleótidos que contienen un puente de 2'-O- o 4'-C-metileno. Sin embargo, de manera similar, Kreutzer y col. no proporcionan ejemplos u orientaciones con respecto a en qué medida se tolerarían estas modificaciones en moléculas de ARNic.
Parrish y col., 2000, Molecular Cell, 6, 1977-1087, ensayaron determinadas modificaciones químicas dirigidas al gen unc-22 en C. elegans usando transcritos largos de ARNic (> 25 nt). Los autores describen la introducción de restos tiofosfato en estos transcritos de ARNic incorporando análogos de nucleótidos tiofosfato con ARN polimerasa de T7 y T3 y observaron que los ARN con dos bases modificadas con fosforotioato tuvieron también disminuciones sustanciales de su eficacia como iARN. Además, Parrish y col., indicaron que la modificación con fosforotioato de más de dos restos desestabilizaba enormemente los ARN in vitro de forma que las actividades de interferencia no pudieron ensayarse. Ídem en 1081. Los autores también ensayaron determinadas modificaciones en la posición 2' del azúcar nucleotídico en los transcritos largos de ARNic y encontraron que la sustitución de ribonucleótidos por desoxinucleótidos producía una disminución sustancial en la actividad de interferencia, especialmente en el caso de sustituciones de Uridina a Timidina y/o Citidina a desoxi-Citidina. Ídem. Además, los autores ensayaron determinadas modificaciones de bases, incluyendo la sustitución, en cadenas con sentido y antisentido del ARNic, de uracilo por 4-tiouracilo, 5-bromouracilo, 5-yodouracilo y 3-(aminoalil)uracilo y guanosina por inosina. Mientras que la sustitución con 4-tiouracilo y 5-bromouracilo parecía tolerarse, Parrish indicó que la inosina producía una disminución sustancial en la actividad de interferencia cuando se incorporaba en cualquier cadena. Parrish también indicó que la incorporación de 5-yodouracilo y 3-(aminoalil)uracilo en la cadena antisentido daba como resultado también una disminución sustancial en la actividad de iARN.
Se ha descrito el uso de ARNbc más largos. Por ejemplo, Beach y col., Publicación Internacional PCT N° WO 01/68836, describen procedimientos específicos para atenuar la expresión génica usando ARNbc obtenidos endógenamente. Tuschl y col., Publicación Internacional PCT N° WO 01/75164, describen un sistema de iARN in vitro de Drosophila y el uso de moléculas de ARNic específicas para determinadas aplicaciones genómicas funcionales y terapéuticas; aunque Tuschl, 2001, Chem. Biochem., 2, 239-245, duda que pueda usarse la ARNi para curar enfermedades genéticas o infecciones virales debido al peligro de activar la respuesta de interferón. Li y col., Publicación Internacional PCT N° WO 00/44914, describen el uso de ARNbc específicos para atenuar la expresión de determinados genes diana. Zernicka-Goetz y col., Publicación Internacional PCT N° WO 01/36646, describen determinados procedimientos para inhibir la expresión de genes particulares en células de mamífero usando determinadas moléculas de ARNbc. Fire y col., Publicación Internacional PCT N° WO 99/32619, describen procedimientos particulares para introducir determinadas moléculas de ARNbc en células para su uso en la inhibición de la expresión génica. Plaetinck y col., Publicación internacional PCT N° WO 00/01846, describen determinados procedimientos para identificar genes específicos responsables de conferir un fenotipo particular a una célula usando moléculas de ARNbc específicas. Mello y col., Publicación internacional PCT N° WO 01/29058, describen la identificación de genes específicos implicados en la iARN mediada por ARNbc. Deschamps Depaillette y col., Publicación Internacional PCT N° WO 99/07409, describen composiciones específicas que consisten en moléculas de ARNbc particulares combinadas con determinados agentes antivirales. Waterhouse y col., Publicación Internacional PCT N° 99/53050, describen determinados procedimientos para disminuir la expresión fenotípica de un ácido nucleico en células vegetales usando determinados ARNbc. Driscoll y col., Publicación Internacional PCT N° WO 01/49844, describen construcciones de ADN específicas para su uso para facilitar el
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silenciamiento génico en organismos diana.
Otros autores han indicado diversos sistemas de iARN y silenciamiento génico. Por ejemplo, Parrish y col., 2000, Molecular Cell, 6, 1977-1087, describen construcciones específicas de ARNic modificados químicamente que se dirigen al gen unc-22 de C. elegans. Grossniklaus, Publicación Internacional PCT N° WO 01/38551, describe determinados procedimientos para regular la expresión del gen polycomb en plantas usando determinados ARNbc. Churikov y col., Publicación Internacional PCT N° WO 01/42443, describen determinados procedimientos para modificar las características genéticas de un organismo usando determinados ARNbc. Cogoni y col., Publicación Internacional PCT N° WO 01/53475, describen determinados procedimientos para aislar un gen de silenciamiento de Neurospora y usos del mismo. Reed y col., Publicación Internacional PCT N° WO 01/68836, describen determinados procedimientos para el silenciamiento génico en plantas. Honer y col., Publicación Internacional PCT N° WO 01/70944, describen determinados procedimientos de selección de fármacos usando nemátodos transgénicos como modelos de la enfermedad de Parkinson usando determinados ARNbc. Deak y col., Publicación Internacional PCT N° WO 01/72774, describen determinados productos génicos derivados de Drosophila que pueden estar relacionados con iARN en Drosophila. Arndt y col., Publicación Internacional PCT N° WO 01/92513 describen determinados procedimientos para mediar la supresión génica usando factores que potencian la iARN. Tuschl y col., Publicación Internacional PCT N° WO 02/44321, describen determinadas construcciones de ARNic sintético. Pachuk y col., Publicación Internacional PCT N° WO 00/63364 y Satishchandran y col., Publicación Internacional PCT N° WO 01/04313, describen determinados procedimientos y composiciones para inhibir la función de determinadas secuencias polinucleotídicas usando determinados ARNbc. Echeverri y col., Publicación Internacional PCT N° WO 02/38805, describen determinados genes de C. elegans identificados mediante iARN. Kreutzer y col., Publicaciones Internacionales PCT N° WO 02/055692, WO 02/055693 y el documento EP 1144623 B1 describen determinados procedimientos para inhibir la expresión génica usando iARN. Graham y col., Publicaciones Internacionales PCT N° WO 99/49029 y WO 01/70949 y el documento AU 4037501 describen determinadas moléculas de ARNic expresadas en vectores. Fire y col., documento US 6.506.559, describen determinados procedimientos para inhibir la expresión génica in vitro usando determinadas construcciones largas de ARNbc (con más de 25 nucleótidos) que median la iARN.
El documento WO0136646 se refiere a la inhibición específica de la expresión génica en mamíferos poniendo en contacto el gen diana con ARN bicatenario (ARNbc).
El documento CA 2359180 se refiere a un medicamento que contiene al menos un oligorribonucleótido d bicatenario (ARNbc) diseñado para inhibir la expresión de un gen diana.
Elbashir et al 2001 EMBO J 20: 6877-6889 se refiere a la Anatomía funcional de los ARNic para mediar ARNi eficientes en lisados de embrión de Drosophila melanogaster.
Baurer et al 1999 J Virology 73: 5826-5832 se refiere a la discriminación entre Receptores que contienen ácido siálico y los Pseudorreceptores que regulan poliomavirus dispersos en el ratón.
Sumario de la invención
La invención es como se expone en las reivindicaciones y proporciona una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) sintética químicamente modificada capaz de regular negativamente la expresión de un gen diana en células mediante interferencia de ARN (ARNi), en la que el ANic comprende:
(a) cadena con sentido y cadena antisentido;
(b) cada cadena de la molécula de ácido nucleico tiene independientemente 18 a 24 nucleótidos de longitud y el dúplex de ANic tiene de 17 a 23 pares de bases; y
(c) un conjugado unido covalentemente a la molécula de ANic;
(d) en la que la cadena con sentido tiene 1-10 enlaces internucleósido de fosforotioato y uno o más 2'-desoxi, 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro y/o uno o más nucleótidos modificados de base universal; y la cadena antisentido tiene 1-10 enlaces internucleósido de fosforotioato y uno o más 2'-desoxi, 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'- fluoro y/o uno o más nucleótidos modificados de base universal,
en la que el conjugado:
se selecciona del grupo que consiste en lípidos, fosfolípidos, anticuerpos, toxinas, polímeros cargados negativamente, proteínas, péptidos, hormonas, carbohidratos, polietilenglicoles y poliaminas; o
comprende un ligando para un receptor celular, opcionalmente el receptor de asialoglicoproteína (ASGPr).
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La presente invención se refiere a compuestos, composiciones y procedimientos útiles para modular la función del ARN y/o la expresión génica en una célula. Específicamente, la presente invención presenta moléculas sintéticas de ácido nucleico pequeñas como se define en las reivindicaciones, tales como moléculas de ácido nucleico de interferencia corto (ANic), ARN de interferencia corto (ARNic), ARN bicatenario (ARNbc), micro-ARN (miARN) y ARN de horquilla corto (ARNhc) capaces de modular la expresión génica en células mediante inferencia de ARN (iARN). El ARNic de la presente invención puede sintetizarse químicamente, expresarse a partir de un vector o sintetizarse enzimáticamente. El uso de ANic modificado químicamente puede mejorar diversas propiedades de las moléculas de ARNic nativas a través de una resistencia aumentada a la degradación por nucleasa in vivo y/o una captación celular mejorada. Las moléculas ANic modificadas químicamente de la presente invención proporcionan reactivos y procedimientos útiles para una diversidad de aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico, agrícolas, de validación de dianas, de descubrimiento genómico, de ingeniería genética y farmacogenómicas.
En un ejemplo no limitante, la introducción de nucleótidos modificados químicamente en moléculas de ácido nucleico proporciona una herramienta poderosa para superar posibles limitaciones de la estabilidad y biodisponibilidad in vivo intrínsecas a las moléculas de ARN nativas que se administran de forma exógena. Por ejemplo, el uso de moléculas de ácido nucleico modificadas químicamente puede permitir una dosis menor de una molécula de ácido nucleico particular para un efecto terapéutico dado, ya que las moléculas de ácido nucleico modificadas químicamente tienden a tener una semivida en suero más larga. Además, determinadas modificaciones químicas pueden mejorar la biodisponibilidad de moléculas de ácido nucleico dirigiéndose a células o tejidos particulares y/o mejorando la captación celular de la molécula de ácido nucleico. Por lo tanto, incluso si se reduce la actividad de una molécula de ácido nucleico modificada químicamente en comparación con una molécula de ácido nucleico nativa, por ejemplo, cuando se compara con una molécula de ácido nucleico de ARN completa, la actividad global de la molécula de ácido nucleico modificada puede ser mayor que la de la molécula nativa debido a una estabilidad y/o suministro de la molécula mejorados. A diferencia del ARNic nativo no modificado, el ANic modificado químicamente también puede minimizar la posibilidad de activar la actividad de interferón en seres humanos.
Las moléculas de ARNic de la invención pueden diseñarse para inhibir la expresión génica por dirección de iARN de una diversidad de moléculas de ARN. En una realización, las moléculas de ARNic de la invención se usan para dirigir diversos ARN que corresponden a un gen diana. Los ejemplos no limitantes de dichos ARN incluyen ARN mensajero (ARNm), variantes de corte y empalme de ARN alternativas de un gen (o genes) diana, ARN modificado postranscripcionalmente de un gen (o genes) diana, pre-ARNm de un gen (o genes) diana. Si el corte y empalme alternativo produce una familia de transcritos que se distinguen por el uso de exones apropiados, la presente invención puede usarse para inhibir la expresión génica a través de los exones apropiados para inhibir específicamente o para distinguir entre las funciones de los miembros de la familia de genes. Por ejemplo, una proteína que contiene un dominio transmembrana de corte y empalme alternativo puede expresarse en formas tanto unida a membrana como secretada. El uso de la invención para dirigirse al exón que contiene el dominio transmembrana puede usarse para determinar las consecuencias funcionales de la dirección farmacéutica de la forma unida a membrana a diferencia de la forma secretada de la proteína. Los ejemplos no limitantes de aplicaciones de la invención que se refieren a la dirección de estas moléculas de ARN incluyen aplicaciones farmacéuticas terapéuticas, aplicaciones de descubrimiento farmacéutico, aplicaciones de diagnóstico molecular y de función génica y mapeo de genes, por ejemplo, usando el mapeo de polimorfismos de un solo nucleótido con moléculas de ARNic de la invención. Dichas aplicaciones pueden ponerse en práctica usando secuencias génicas conocidas o a partir de secuencias parciales disponibles de una etiqueta de secuencia expresada (EST).
En otra realización, las moléculas de ARNic de la invención se usan para dirigirse a secuencias conservadas que corresponden a una familia de genes o familias de genes. Como tal, puede usarse un ARNic para caracterizar rutas de función génica en una diversidad de aplicaciones. Por ejemplo, la presente invención puede usarse para inhibir la actividad de un gen (o genes) diana en una ruta para determinar la función del gen (o genes) no caracterizado en un análisis de función génica, análisis de función de ARNm o análisis traduccional. La invención puede usarse para determinar posibles rutas de genes diana implicadas en diversas enfermedades y afecciones hacia el desarrollo farmacéutico. La invención puede usarse para entender las rutas de expresión génica implicadas en el desarrollo, tales como en el desarrollo prenatal, desarrollo postnatal y/o envejecimiento.
Una divulgación ofrece una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) que regula negativamente la expresión de una familia de genes por interferencia de ARN. La familia de genes puede comprender más de una variante de corte y empalme de un gen diana, más de un ARN modificado postranscripcionalmente de un gen diana o más de un transcrito de ARN que tiene una homología compartida. En una realización, la familia de genes comprende genes del factor de crecimiento epidérmico (por ejemplo, EGFR, tal como HER1, HER2, HER3 y/o HER4), genes del factor de crecimiento endotelial vascular y del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (por ejemplo, VEGF, VEGFR1, VEGFR2 o VEGFR3) o genes virales que corresponden a diferentes cepas virales (por ejemplo, VIH-1 y VIH-2). Dichas familias de genes pueden establecerse analizando secuencias de ácido nucleico (por ejemplo, las secuencias mostradas por los números de acceso de GenBank de la Tabla V)
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para determinar la homología.
Una divulgación ofrece una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) bicatenario que regula negativamente la expresión de un gen diana de mamífero endógeno (por ejemplo, un gen humano), en el que la molécula de ANic comprende modificaciones químicas y cada cadena del ANic bicatenario tiene aproximadamente 21 nucleótidos de longitud.
En una realización, una molécula de ANic de la invención no comprende ribonucleótidos. En otra realización, una molécula de ANic de la invención comprende ribonucleótidos.
Una divulgación ofrece una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) bicatenario que regula negativamente la expresión de un gen diana de mamífero endógeno (por ejemplo, un gen humano), en la que una de las cadenas de la molécula de ANic bicatenario comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos del gen diana de mamífero endógeno o una parte del mismo, y en la que la segunda cadena de la molécula de ANic bicatenario comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente similar a la secuencia de nucleótidos del gen diana de mamífero endógeno o una parte del mismo.
Una divulgación ofrece una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) bicatenario que regula negativamente la expresión de un gen diana de mamífero endógeno (por ejemplo, un gen humano), en la que cada cadena de la molécula de ANic comprende de aproximadamente 19 a aproximadamente 23 nucleótidos, y en la que cada cadena comprende aproximadamente 19 nucleótidos que son complementarios a los nucleótidos de la otra cadena.
Una divulgación ofrece una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) bicatenario que regula negativamente la expresión de un gen diana de mamífero endógeno (por ejemplo, un gen humano), en la que la molécula de ANic comprende una región antisentido que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos del gen diana de mamífero endógeno o a una parte del mismo, y en la que el ANic comprende adicionalmente una región con sentido, en la que la región con sentido comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente similar a la secuencia de nucleótidos del gen diana de mamífero endógeno o a una parte del mismo.
Una divulgación ofrece una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) bicatenario que regula negativamente la expresión de un gen diana de mamífero endógeno (por ejemplo, un gen humano), en la que cada una de la región antisentido y la región con sentido comprende de aproximadamente 19 a aproximadamente 23 nucleótidos y en la que la región antisentido comprende aproximadamente 19 nucleótidos que son complementarios a nucleótidos de la región con sentido.
Una divulgación ofrece una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) bicatenario que regula negativamente la expresión de un gen diana de mamífero endógeno (por ejemplo, un gen humano), en la que la molécula de ANic comprende una región con sentido y una región antisentido, y en la que la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de ARN codificada por el gen diana de mamífero endógeno o una parte del mismo, y la región con sentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la región antisentido.
Una divulgación ofrece una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) bicatenario que regula negativamente la expresión de un gen diana de mamífero endógeno (por ejemplo, un gen humano), en la que la molécula de ANic se ensambla a partir de dos fragmentos oligonucleotídicos distintos, en la que un fragmento comprende la región con sentido y el segundo fragmento comprende la región antisentido de la molécula de ANic. La región con sentido puede conectarse con la región antisentido mediante una molécula de engarce, tal como un engarce polinucleotídico o un engarce no nucleotídico.
Una divulgación ofrece una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) bicatenario que regula negativamente la expresión de un gen diana de mamífero endógeno (por ejemplo, un gen humano), en la que la molécula de ANic comprende una región con sentido y una región antisentido y en la que la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de ARN codificada por el gen diana de mamífero endógeno o una parte del mismo, y la región con sentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la región antisentido y en la que los nucleótidos de pirimidina en la región con sentido son nucleótidos de 2'-O-metil pirimidina, 2'-desoxi nucleótidos y/o nucleótidos de 2'- desoxi-2'-fluoro pirimidina.
Una divulgación ofrece una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) bicatenario que regula negativamente la expresión de un gen diana de mamífero endógeno (por ejemplo, un gen humano), en la que la molécula de ANic se ensambla a partir de dos fragmentos oligonucleotídicos distintos, en la que un fragmento comprende la región con sentido y el segundo fragmento comprende la región antisentido de la molécula de ANic,
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y en la que el fragmento que comprende la región con sentido incluye un resto protector terminal en el extremo 5', el extremo 3' o tanto en el extremo 5' como en 3' del fragmento que comprende la región con sentido. En otra realización, el resto protector terminal es un resto abásico desoxi invertido o un resto glicerilo. En otra realización, cada uno de los dos fragmentos de la molécula de ANic comprende 21 nucleótidos.
Una divulgación ofrece una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) bicatenario que regula negativamente la expresión de un gen diana de mamífero endógeno (por ejemplo, un gen humano), en la que la molécula de ANic comprende una región con sentido y una región antisentido y en la que la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de ARN codificada por el gen diana de mamífero endógeno o una parte del mismo, y la región con sentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la región antisentido y en la que los nucleótidos de purina presentes en la región antisentido, comprenden nucleótidos de 2'-desoxi purina. En otra realización, la región antisentido comprende un enlace internucleotídico de fosforotioato en el extremo 3' de la región antisentido. En otra realización, la región antisentido comprende una modificación con glicerilo en el extremo 3' de la región antisentido.
Una divulgación ofrece una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) bicatenario que regula negativamente la expresión de un gen diana de mamífero endógeno (por ejemplo, un gen humano), en la que la molécula de ANic se ensambla a partir de dos fragmentos oligonucleotídicos distintos, en la que un fragmento comprende la región con sentido y el segundo fragmento comprende la región antisentido de la molécula de ANic, y en la que aproximadamente 19 nucleótidos de cada fragmento de la molécula de ANic están formando pares de bases con los nucleótidos complementarios del otro fragmento de la molécula de ANic y en la que al menos dos nucleótidos 3'-terminales de cada fragmento de la molécula de ANic no están formando pares de bases con los nucleótidos del otro fragmento de la molécula de ANic. En otra divulgación, cada uno de los nucleótidos 3'- terminales de cada fragmento de la molécula de ANic son 2'-desoxi pirimidinas, tales como 2'-desoxi timidina. En otra divulgación, los 21 nucleótidos de cada fragmento de la molécula de ANic están formando pares de bases con los nucleótidos complementarios del otro fragmento de la molécula de ANic. En otra divulgación, aproximadamente 19 nucleótidos de la región antisentido están formando pares de bases con la secuencia de nucleótidos o una porción de la misma del ARN codificado por el gen diana de mamífero endógeno. En otra divulgación, 21 nucleótidos de la región antisentido están formando pares de bases con la secuencia de nucleótidos o con una parte de la misma, del ARN codificado por el gen diana de mamífero endógeno. En otra divulgación, el extremo 5' del fragmento que comprende dicha región antisentido incluye opcionalmente un grupo fosfato.
Una divulgación ofrece una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) bicatenario que inhibe la expresión de una secuencia de ARN diana de mamífero endógena (por ejemplo, en la que un gen humano codifica dicha secuencia de ARN diana), en la que la molécula de ANic no comprende ribonucleótidos y en la que cada cadena de la molécula de ANic bicatenario comprende aproximadamente 21 nucleótidos.
Una divulgación ofrece una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) bicatenario que inhibe la expresión de un gen diana de mamífero endógeno (por ejemplo, un gen humano tal como el factor de crecimiento endotelial vascular, el receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (tal como, VEGFR1, VEGFR2 o VEGFR3), BCL2, HER2/neu, c-Myc, PCNA, REL-A, PTP1B, BACE, CHK1, PKC-alfa o EGFR), en la que la molécula de ANic no requiere la presencia de un ribonucleótido dentro de la molécula de ANic para dicha inhibición de la expresión de un gen diana de mamífero endógeno y en la que cada cadena de la molécula de ANic bicatenario tiene una longitud de aproximadamente 21 nucleótidos.
En una realización, la invención ofrece un medicamento que comprende una molécula de ANic de la invención.
En una realización, la invención ofrece un principio activo que comprende una molécula de ANic de la invención.
En una realización, la invención ofrece el uso de una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) bicatenario para regular negativamente la expresión de un gen diana de mamífero endógeno, en la que la molécula de ANic comprende una o más modificaciones químicas y cada cadena del ANic bicatenario tiene una longitud de aproximadamente 21 nucleótidos.
En una realización, la molécula (o moléculas) de ARNic y/o los procedimientos de la invención se usan para inhibir la expresión de un gen (o genes) que codifican ARN a los que se hace referencia mediante el número de acceso de GenBank de la Tabla V. En otra realización, la molécula (o moléculas) de ARNic y/o los procedimientos de la invención se usan para dirigir una secuencia (o secuencias) de ARN a las que se hace referencia mediante el número de acceso de GenBank en la Tabla V, o secuencias de ácido nucleico que codifican dichas secuencias a las que se hace referencia mediante el número de acceso de GenBank en la Tabla V. Dichas secuencias se obtienen fácilmente usando los números de acceso de GenBank de la Tabla V.
Una divulgación ofrece una molécula de ANic que tiene actividad de iARN frente a un ARN que codifica una
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proteína, en la que la molécula de ANic comprende una secuencia complementaria al ARN que tiene una secuencia codificante de proteína, tal como las secuencias que tienen los N° de acceso de GenBank mostrados en la Tabla V.
Una divulgación ofrece una molécula de ANic que tiene actividad de iARN frente a un gen, en la que la molécula de ANic comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos del gen, tal como genes que codifican secuencias que tienen los N° de acceso de GenBank mostrados en la Tabla V. En otra realización, una molécula de ANic de la invención incluye una secuencia de nucleótidos que puede interaccionar con una secuencia de nucleótidos de un gen y de ese modo mediar el silenciamiento de la expresión génica, por ejemplo, en la que el ANic media la regulación de la expresión génica mediante procesos celulares que modulan la estructura de la cromatina del gen e impiden la transcripción del gen.
Una divulgación ofrece una molécula de ANic como se define en las reivindicaciones que comprende una secuencia, por ejemplo, la secuencia antisentido de la construcción de ANic, complementaria a una secuencia representada por los N° de acceso de GenBank mostrados en la Tabla V o una parte de dicha secuencia.
En una realización, las moléculas de ácido nucleico de la invención que actúan como mediadores de la respuesta de silenciamiento génico de la interferencia de ARN son moléculas de ácido nucleico bicatenario modificadas químicamente como se expone en las reivindicaciones. Al igual que en sus homólogos de ARN bicatenario nativos, las moléculas de ANic consisten típicamente en dúplex que contienen aproximadamente 19 pares de bases entre oligonucleótidos que comprenden de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos. Se cree que las moléculas de ARNic más activas tienen dichos dúplex con extremos salientes de 1-3 nucleótidos, por ejemplo, dúplex de 21 nucleótidos con 19 de pares de bases y salientes 3' de 2 nucleótidos. Estos segmentos salientes se hidrolizan fácilmente mediante endonucleasas in vivo. Los estudios han demostrado que la sustitución de los segmentos salientes 3' de un dúplex de ARNic de 21 unidades que tiene salientes 3' de 2 nucleótidos, con desoxirribonucleótidos no tiene un efecto adverso sobre la actividad de iARN. Se ha indicado que la sustitución de hasta 4 nucleótidos en cada extremo del ARNic con desoxirribonucleótidos se tolera bien mientras que la sustitución completa con desoxirribonucleótidos da como resultado la ausencia de actividad de iARN (Elbashir y col., 2001, EMBO J., 20, 6877). Además, Elbashir y col., anteriormente, también indican que la sustitución de ARNic con nucleótidos 2'-O-metilo suprime completamente la actividad de iARN. Li y col., Publicación Internacional PCT N° WO 00/44914 y Beach y col., Publicación Internacional PCT N° WO 01/68836 sugieren ambos que el ARNic puede incluir modificaciones en la cadena principal de azúcar-fosfato o en el nucleósido para incluir al menos uno de un heteroátomo de nitrógeno o azufre, sin embargo, ninguna solicitud muestra en qué medida se toleran estas modificaciones en moléculas de ARNic ni proporciona ningún ejemplo de dichos ARNic modificados. Kreutzer y Limmer, solicitud de patente canadiense N° 2.359.180, también describen determinadas modificaciones químicas para su uso en construcciones de ARNbc para contrarrestar la activación de la proteína quinasa dependiente de ARN bicatenario, PKR, específicamente nucleótidos 2'-amino o 2'-O-metilo y nucleótidos que contienen un puente 2'-O- o 4'-C- metileno. Sin embargo, de manera similar, Kreutzer y Limmer no muestran en qué medida se toleran estas modificaciones en moléculas de ARNic ni proporcionan ningún ejemplo de dicho ARNic modificado.
Una divulgación ofrece construcciones de ANic modificados químicamente que tienen especificidad por moléculas de ácido nucleico diana en una célula (es decir, moléculas de ácido nucleico diana que comprenden o codificadas por secuencias a las que se hace referencia en el presente documento mediante los números de acceso de GenBank en la Tabla V). Los ejemplos no limitantes de dichas modificaciones químicas incluyen, sin limitación, enlaces internucleotídicos de fosforotioato, 2'-O-metil ribonucleótidos, 2'-desoxi-2'-fluoro ribonucleótidos, 2'-desoxi ribonucleótidos, nucleótidos de “base universal”, nucleótidos 5-C-metilo e incorporación de restos abásicos desoxi invertidos. Estas modificaciones químicas, cuando se usan en diversas construcciones de ANic, se demuestra que conservan la actividad de iARN en células mientras que, al mismo tiempo, aumentan espectacularmente la estabilidad de estos compuestos en suero. Adicionalmente, al contrario que los datos publicados por Parrish y col., anteriormente, el solicitante demuestra que múltiples (más de una) sustituciones con fosforotioato se toleran bien y confieren aumentos sustanciales de la estabilidad en suero a construcciones de ANic modificadas.
En una realización, una molécula de ANic de la invención comprende nucleótidos modificados al tiempo que mantiene la capacidad de mediar la iARN. Los nucleótidos modificados pueden usarse para mejorar características in vitro o in vivo tales como la estabilidad, actividad y/o biodisponibilidad. Por ejemplo, una molécula de ANic de la invención puede comprender nucleótidos modificados como un porcentaje del número total de nucleótidos presentes en la molécula de ANic. Como tal, una molécula de ANic de la invención puede comprender generalmente nucleótidos modificados de aproximadamente el 5 a aproximadamente el 100% de las posiciones de nucleótidos (por ejemplo, el 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de las posiciones de nucleótidos). El porcentaje real de nucleótidos modificados presentes en una molécula de ANic dada depende del número total de nucleótidos presentes en el ANic. Si la molécula de ANic es monocatenaria, el porcentaje de modificación puede basarse en el número total de
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nucleótidos presentes en las moléculas de ANic monocatenarias. Así mismo, si la molécula de ANic es bicatenaria, el porcentaje de modificación puede basarse en el número total de nucleótidos presentes en la cadena con sentido, en la cadena antisentido o tanto en la cadena con sentido como en la antisentido. Adicionalmente, el porcentaje real de nucleótidos modificados presentes en una molécula de ANic dada, también puede depender del número total de nucleótidos de purina y de pirimidina presentes en el ANic, en el que, por ejemplo, todos los nucleótidos de pirimidina y/o todos los nucleótidos de purina presentes en la molécula de ANic están modificados.
La región antisentido de una molécula de ANic de la invención puede comprender un enlace internucleotídico de fosforotioato en el extremo 3' de dicha región antisentido. La región antisentido puede comprender de aproximadamente uno a aproximadamente cinco enlaces internucleotídicos de fosforotioato en el extremo 5' de dicha región antisentido. Los salientes de nucleótidos 3'-terminales de una molécula de ANic de la invención pueden comprender ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos que están modificados químicamente en un azúcar, base o cadena principal del ácido nucleico. Los salientes de nucleótidos 3'-terminales pueden comprender uno o más ribonucleótidos de bases universales. Los salientes de nucleótidos 3'-terminales pueden comprender uno o más nucleótidos acíclicos.
Una divulgación proporciona un vector de expresión que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica al menos una molécula de ANic de la invención de una manera que permita la expresión de la molécula de ácido nucleico. Otra divulgación proporciona una célula de mamífero que comprende dicho vector de expresión. La célula de mamífero puede ser una célula humana. La molécula de ANic del vector de expresión puede comprender una región sentido y una región antisentido. La región antisentido puede comprender una secuencia complementaria a una secuencia de ADN o de ARN que codifica una proteína y la región sentido puede comprender una secuencia complementaria a la región antisentido. La molécula de ANic puede comprender dos cadenas distintas que tengan regiones sentido y antisentido complementarias.
Una divulgación ofrece una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) modificado químicamente capaz de mediar la interferencia de ARN (iARN) dentro de una célula o de un sistema in vitro reconstituido, en la que la modificación química comprende uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) nucleótidos que comprenden un enlace internucleotídico de esqueleto modificado que tiene la Fórmula I:
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en la que cada R1 y R2 es independientemente cualquier nucleótido, no nucleótido o polinucleótido que puede ser de origen natural o químicamente modificado, cada X e Y es independientemente O, S, N, alquilo o alquilo sustituido, cada Z y W es independientemente O, S, N, alquilo, alquilo sustituido, O-alquilo, S-alquilo, alcarilo o aralquilo y en la que W, X, Y y Z son opcionalmente no todos O.
Los enlaces internucleotídicos modificados químicamente que tienen la Fórmula I, por ejemplo, en los que cualquier Z, W, X y/o Y comprende independientemente un átomo de azufre, pueden estar presentes en una o ambas cadenas oligonucleotídicas del dúplex de ANic, por ejemplo en la cadena con sentido, en la cadena antisentido o en ambas cadenas. Las moléculas de ANic de la divulgación pueden comprender uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) enlaces internucleotídicos químicamente modificados que tienen la Fórmula I en el extremo 3', en el extremo 5' o tanto en el extremo 3' como en el 5' de la cadena con sentido, de la cadena antisentido o de ambas cadenas. Por ejemplo, una molécula de ANic ilustrativa de la invención puede comprender de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o más) enlaces internucleotídicos químicamente modificados que tienen la Fórmula I en el extremo 5' de la cadena con sentido, cadena antisentido o ambas cadenas. En otro ejemplo no limitante, una molécula de ANic ilustrativa de la divulgación puede comprender uno o más (por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) nucleótidos de pirimidina con enlaces internucleotídicos químicamente modificados que tienen la Fórmula I en la cadena con sentido, cadena antisentido o ambas cadenas. En otro ejemplo no limitante más, una molécula de ANic ilustrativa de la invención puede comprender uno o más (por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) nucleótidos de purina con enlaces internucleotídicos químicamente modificados que tienen la Fórmula I en la cadena con sentido, la cadena antisentido o ambas cadenas. En otra realización, una molécula de ANic de la divulgación que tiene enlace o enlaces internucleotídicos de Fórmula I también comprende un nucleótido o no nucleótido químicamente modificado que tenga cualquiera de las Fórmulas I-IV.
Una divulgación ofrece una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) químicamente modificada capaz de mediar la interferencia de ARN (iARN) dentro de una célula o un sistema in vitro reconstituido, en la que
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la modificación química comprende uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) nucleótidos o no nucleótidos que tienen la Fórmula II:
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en la que cada R3, R4, R5, R6, R7, R8, R10, R11 y R12 es independientemente H, OH, alquilo, alquilo sustituido, alcarilo o aralquilo, F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCN, O-alquilo, S-alquilo, N-alquilo, O-alquenilo, S-alquenilo, N- alquenilo, SO-alquilo, alquil-OSH, alquil-OH, O-alquil-OH, O-alquil-SH, S-alquil-OH, S-alquil-SH, alquil-S-alquilo, alquil-O-alquilo, ONO2, NO2, N3, NH2, aminoalquilo, aminoácido, aminoacilo, ONH2, O-aminoalquilo, Oaminoácido, O-aminoacilo, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido o un grupo que tenga la Fórmula I; R9 es O, S, CH2, S=O, CHF o CF2 y B es una base nucleosídica tal como adenina, guanina, uracilo, citosina, timina, 2-aminoadenosina, 5-metilcitosina, 2,6-diaminopurina o cualquier otra base de origen no natural que puede ser complementaria o no complementaria a un ARN diana o una base no nucleosídica tal como fenilo, naftilo, 3-nitropirrol, 5-nitroindol, nebularina, piridona, piridinona o cualquier otra base universal de origen no natural que pueda ser complementaria o no complementaria al ARN diana.
El nucleótido o no nucleótido químicamente modificado de Fórmula II puede estar presente en una o ambas cadenas oligonucleotídicas del dúplex de ANic, por ejemplo en la cadena con sentido, en la cadena antisentido o en ambas cadenas. Las moléculas de ANic de la divulgación pueden comprender uno o más nucleótidos o no nucleótidos químicamente modificados de Fórmula II en el extremo 3', en el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5' de la cadena con sentido, la cadena antisentido o ambas cadenas. Por ejemplo, una molécula de ANic ilustrativa de la divulgación puede comprender de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o más (por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o más) nucleótidos o no nucleótidos químicamente modificados de Fórmula II en el extremo 5' de la cadena con sentido, la cadena antisentido o ambas cadenas. En otro ejemplo no limitante, una molécula de ANic ilustrativa de la divulgación puede comprender de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o más (por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o más) nucleótidos o no nucleótidos químicamente modificados de Fórmula II en el extremo 3 de la cadena con sentido, la cadena antisentido o ambas cadenas.
Una divulgación ofrece una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) químicamente modificada capaz de mediar la interferencia de ARN (iARN) dentro de una célula o un sistema in vitro reconstituido, en la que la modificación química comprende uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) nucleótidos o no nucleótidos que tienen la Fórmula III:
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en la que cada R3, R4, R5, R6, R7, R8, R10, R11 y R12 es independientemente H, OH, alquilo, alquilo sustituido, alcarilo o aralquilo, F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCN, O-alquilo, S-alquilo, N-alquilo, O-alquenilo, S-alquenilo, N- alquenilo, SO-alquilo, alquil-OSH, alquil-OH, O-alquil-OH, O-alquil-SH, S-alquil-OH, S-alquil-SH, alquil-S-alquilo, alquil-O-alquilo, ONO2, NO2, N3, NH2, aminoalquilo, aminoácido, aminoacilo, ONH2, O-aminoalquilo, Oaminoácido, O-aminoacilo, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido o un grupo que tenga la Fórmula I; R9 es O, S, CH2, S=O, CHF o CF2 y B es una base nucleosídica tal
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como adenina, guanina, uracilo, citosina, timina, 2-aminoadenosina, 5-metilcitosina, 2,6-diaminopurina o cualquier otra base de origen no natural que puede ser complementaria o no complementaria a un ARN diana o una base no nucleosídica tal como fenilo, naftilo, 3-nitropirrol, 5-nitroindol, nebularina, piridona, piridinona o cualquier otra base universal de origen no natural que pueda ser complementaria o no complementaria al ARN diana.
El nucleótido o no nucleótido químicamente modificado de Fórmula III puede estar presente en una o ambas cadenas oligonucleotídicas del dúplex de ANic, por ejemplo en la cadena con sentido, en la cadena antisentido o en ambas cadenas. Las moléculas de ANic de la divulgación pueden comprender uno o más nucleótidos o no nucleótidos químicamente modificados de Fórmula III en el extremo 3’, en el extremo 5’ o en ambos extremos 3’ y 5’ de la cadena con sentido, la cadena antisentido o ambas cadenas. Por ejemplo, una molécula de ANic ilustrativa de la divulgación puede comprender de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o más (por ejemplo aproximadamente 1,2, 3, 4, 5 o más) nucleótidos o no nucleótidos químicamente modificados de Fórmula III en el extremo 5’ de la cadena con sentido, la cadena antisentido o ambas cadenas. En otro ejemplo no limitante, una molécula de ANic ilustrativa de la divulgación puede comprender de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o más (por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o más) nucleótidos o no nucleótidos químicamente modificados de Fórmula III en el extremo 3 de la cadena con sentido, la cadena antisentido o ambas cadenas.
En otra divulgación, una molécula de ANic comprende un nucleótido que tiene la Fórmula II o III, en la que el nucleótido que tiene la Fórmula II o III está en una configuración invertida. Por ejemplo, el nucleótido que tiene la Fórmula II o III está conectado a la construcción de ANic en una configuración 3’-3’, 3’-2’, 2’-3’ o 5’-5’, tal como el extremo 3’, en el extremo 5’ o en ambos extremos 3’ y 5’ una o ambas cadenas de ANic.
Una divulgación ofrece una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) químicamente modificada capaz de mediar la interferencia de ARN (iARN) dentro de una célula o un sistema in vitro reconstituido, en la que la modificación química comprende un grupo fosfato 5’ terminal que tiene la Fórmula IV:
Z
II
X-----P-----Y------
W
en la que cada X e Y es independientemente O, S, N, alquilo, alquilo sustituido o alquilhalo; en la que cada Z y W es independientemente O, S, N, alquilo, alquilo sustituido, O-alquilo, S-alquilo, alcarilo, aralquilo o alquilhalo; y en la que W, X, Y y Z no son todos O.
Una divulgación ofrece una molécula de ANic que tiene un grupo fosfato 5’ terminal que tiene la Fórmula IV en la cadena complementaria diana, por ejemplo, una cadena complementaria a un ARN diana, en la que la molécula de ANic comprende una molécula de ANic toda de ARN. Una divulgación ofrece una molécula de ANic que tiene un grupo fosfato 5’ terminal que tiene la Fórmula IV en la cadena complementaria diana en la que la molécula de ANic también comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, o 3) nucleótidos 3’ terminales teniendo los salientes de nucleótidos de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3 o 4) desoxirribonucleótidos en el extremo 3’ de una o ambas cadenas. En otra realización, un grupo fosfato 5’ terminal que tiene la Fórmula IV está presente en la cadena complementaria diana de una molécula de ANic de la divulgación, por ejemplo una molécula de ANic que tiene modificaciones químicas que tienen cualquiera de las Fórmulas I-VII.
Una divulgación ofrece una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) químicamente modificado capaz de mediar la interferencia de ARN (iARN) dentro de una célula o un sistema in vitro reconstituido, en la que la modificación química comprende uno o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato. Por ejemplo, en un ejemplo no limitante, la divulgación ofrece un ácido nucleico de interferencia corto (ANic) químicamente modificado que tiene aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato en una cadena del ANic. En aún otra realización, la divulgación ofrece un ácido nucleico de interferencia corto (ANic) químicamente modificado que tiene aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato en ambas cadenas. Los enlaces internucleotídicos de fosforotioato pueden estar presentes en una o ambas cadenas oligonucleotídicas del dúplex de ANic, por ejemplo en la cadena con sentido, en la cadena antisentido o en ambas cadenas. Las moléculas de ANic de la divulgación pueden comprender uno o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato en el extremo 3’, en el extremo 5’ o tanto en el extremo 3’ como en el 5’ de la cadena con sentido, de la cadena antisentido o de ambas cadenas. Por ejemplo, una molécula de ANic ilustrativa de la divulgación puede comprender de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o más (por ejemplo, aproximadamente 1,2, 3, 4, 5 o más) enlaces internucleotídicos de fosforotioato en el extremo 5’ de la cadena con sentido, cadena antisentido o ambas cadenas. En otro ejemplo no limitante, una molécula de ANic ilustrativa de la divulgación puede comprender uno o más (por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más)
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enlaces internucleotídicos de fosforotioato de pirimidina en la cadena con sentido, cadena antisentido o ambas cadenas. En otro ejemplo no limitante más, una molécula de ANic ilustrativa de la divulgación puede comprender uno o más (por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) enlaces internucleotídicos de fosforotioato de purina en la cadena con sentido, la cadena antisentido o ambas cadenas.
Una divulgación ofrece una molécula de ANic, en la que la cadena con sentido comprende uno o más de, por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato y uno o más (por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) 2'-desoxi, 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro y/o aproximadamente uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) nucleótidos modificados de base universal y opcionalmente una molécula protectora terminal en el extremo 3', el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5' de la cadena con sentido; y en la que la cadena antisentido comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 o más, específicamente aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato y/o uno o más (por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) 2'-desoxi, 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro y/o aproximadamente uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) nucleótidos modificados de base universal y opcionalmente una molécula protectora terminal en el extremo 3', el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5' de la cadena antisentido. En otra realización, uno o más, por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más nucleótidos de pirimidina de la cadena de ANic con sentido y/o antisentido están modificados químicamente con nucleótidos 2'-desoxi, 2'-O-metilo y/o 2'-desoxi-2'-fluoro, estando o no presentes uno o más, por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más, enlaces internucleotídicos de fosforotioato y/o una molécula protectora terminal en el extremo 3', el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5', en la misma cadena o en cadenas diferentes.
Una divulgación ofrece una molécula de ANic, en la que la cadena con sentido comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, específicamente aproximadamente 1, 2, 3, 4, ó 5 enlaces internucleotídicos de fosforotioato y/o uno o más (por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o más) 2'-desoxi, 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro y/o aproximadamente uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o más) nucleótidos modificados de base universal y opcionalmente, una molécula protectora terminal en el extremo 3', el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5' de la cadena con sentido; y en la que la cadena antisentido comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o más, específicamente aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato y/o uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) 2'-desoxi, 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro y/o aproximadamente uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) nucleótidos modificados de base universal y opcionalmente, una molécula protectora terminal en el extremo 3', el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5' de la cadena antisentido. En otra realización, uno o más, por ejemplo aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más nucleótidos de pirimidina de la cadena de ANic con sentido y/o antisentido están modificados químicamente con nucleótidos 2'-desoxi, 2'-O-metilo y/o 2'-desoxi-2'-fluoro, estando o no presentes de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o más, por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o más, enlaces internucleotídicos de fosforotioato y/o una molécula protectora terminal en el extremo 3', el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5', en la misma cadena o en cadenas diferentes.
Una divulgación ofrece una molécula de ANic en la que la cadena antisentido comprende uno o más, por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato y/o aproximadamente uno o más (por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) 2'-desoxi, 2'-O- metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro y/o aproximadamente uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o más) nucleótidos modificados de base universal y opcionalmente, una molécula protectora terminal en el extremo 3', el extremo 5' o tanto en el extremo 3' como en el extremo 5' de la cadena con sentido; y en la que la cadena antisentido comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 o más, específicamente aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato y/o uno o más (por ejemplo aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) 2'-desoxi, 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro y/o aproximadamente uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o más) nucleótidos modificados de base universal y opcionalmente, una molécula protectora terminal en el extremo 3', el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5' de la cadena antisentido. En otra realización, uno o más, por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más nucleótidos de pirimidina de la cadena de ANic con sentido y/o antisentido están modificados químicamente con nucleótidos 2'-desoxi, 2'-O-metilo y/o 2'-desoxi-2'-fluoro, estando o no presentes uno o más, por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más, enlaces internucleotídicos de fosforotioato y/o una molécula protectora terminal en el extremo 3', el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5' en la misma cadena o en cadenas diferentes.
Una divulgación ofrece una molécula de ANic, en la que la cadena antisentido comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o más, específicamente aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato y/o uno o más (por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) 2'-desoxi, 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro y/o aproximadamente uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o más) nucleótidos modificados de base universal y opcionalmente, una molécula protectora terminal en el extremo 3', el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5' de la cadena con sentido; y en la que la cadena antisentido comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o más, específicamente aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o más enlaces internucleotídicos de
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fosforotioato y/o uno o más (por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) 2'-desoxi, 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro y/o aproximadamente uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o más) nucleótidos modificados de base universal y opcionalmente, una molécula protectora terminal en el extremo 3', el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5' de la cadena antisentido. En otra realización, uno o más, por ejemplo aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más nucleótidos de pirimidina de la cadena de ANic con sentido y/o antisentido están modificados químicamente con nucleótidos 2'-desoxi, 2'-O-metilo y/o 2'-desoxi-2'-fluoro, estando o no presentes de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o más, por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o más, enlaces internucleotídicos de fosforotioato y/o una molécula protectora terminal en el extremo 3', el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5' en la misma cadena o en cadenas diferentes.
Una divulgación ofrece una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) modificado químicamente que tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, específicamente aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato en cada cadena de la molécula de ANic.
Una divulgación ofrece una molécula de ANic que comprende enlaces internucleotídicos 2'-5'. El enlace (o enlaces) internucleotídico 2'-5' puede estar en el extremo 3', el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5' de una o ambas cadenas de la secuencia de ANic. Adicionalmente, el enlace (o enlaces) internucleotídico 2'-5' puede estar presente en diversas posiciones diferentes dentro de una o ambas cadenas de la secuencia de ANic, por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más, incluyendo cada enlace internucleotídico de un nucleótido de pirimidina en una o ambas cadenas de la molécula de ANic, pueden comprender un enlace internucleotídico 2'-5', o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más, incluyendo cada enlace internucleotídico de un nucleótido de purina en una o ambas cadenas de la molécula de ANic, pueden comprender un enlace internucleotídico 2'-5'.
En otra realización, una molécula de ANic químicamente modificada de la divulgación comprende un dúplex que tiene dos cadenas, una o ambas de las cuales puede estar químicamente modificada, en la que cada cadena tiene de aproximadamente 18 a aproximadamente 27 (por ejemplo, aproximadamente 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26 o 27) nucleótidos de longitud, en la que el dúplex tiene de aproximadamente 18 a aproximadamente 23 (por ejemplo, aproximadamente 18, 19, 20, 21, 22 o 23) pares de bases y en la que la modificación química comprende una estructura que tiene cualquiera de las Fórmulas I-VII. Por ejemplo, una molécula de ANic químicamente modificada ilustrativa de la divulgación comprende un dúplex que tiene dos cadenas, una o ambas de las cuales puede estar químicamente modificada con una modificación química que tiene cualquiera de las Fórmulas I-VII o cualquier combinación de las mismas, en la que cada cadena consiste en aproximadamente 21 nucleótidos, teniendo cada uno un saliente de nucleótido 3'-terminal de 2 nucleótidos y en el que el dúplex tiene aproximadamente 19 pares de bases. En otra realización, una molécula de ANic de la divulgación comprende una estructura en horquilla monocatenaria, en la que el ANic tiene de aproximadamente 36 a aproximadamente 70 (por ejemplo, aproximadamente 36, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o 70) nucleótidos de longitud teniendo de aproximadamente 18 a aproximadamente 23 (por ejemplo, aproximadamente 18, 19, 20, 21, 22 o 23) pares de bases y en la que el ANic comprende una estructura que tiene cualquiera de las Fórmulas I-VII o cualquier combinación de las mismas. Por ejemplo, una molécula de ANic químicamente modificada ilustrativa de la divulgación comprende un oligonucleótido lineal que tiene de aproximadamente 42 a aproximadamente 50 (por ejemplo, aproximadamente 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50) nucleótidos que están químicamente modificados con una modificación química que tiene cualquiera de las Fórmulas I-VII o cualquier combinación de las mismas, en la que el oligonucleótido lineal forma una estructura de horquilla que tiene aproximadamente 19 pares de bases y un saliente de nucleótido 3'-terminal de 2 nucleótidos. En otra realización, una molécula de ANic en horquilla lineal de la divulgación contiene un motivo de tallo lazo, en el que la porción de lazo de la molécula de ANic es biodegradable. Por ejemplo, una molécula de ANic en horquilla lineal de la divulgación se diseña de tal manera que la degradación de la porción del lazo de la molécula de ANic in vivo pueda generar una molécula de ANic bicatenaria con salientes 3' terminales, tales como salientes de nucleótido 3' terminales que comprenden aproximadamente 2 nucleótidos.
En otra realización, una molécula de ANic de la divulgación comprende una molécula de ácido nucleico circular, en la que el ANic tiene de aproximadamente 38 a aproximadamente 70 (por ejemplo, aproximadamente 38, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o 70) nucleótidos de longitud teniendo de aproximadamente 18 a aproximadamente 23 (por ejemplo, aproximadamente 18, 19, 20, 21, 22 o 23) pares de bases y en la que el ANic puede incluir una modificación química, que comprende una estructura que tiene cualquiera de las Fórmulas I-VII o cualquier combinación de las mismas. Por ejemplo, una molécula de ANic químicamente modificada ilustrativa de la divulgación comprende un oligonucleótido circular que tiene de aproximadamente 42 a aproximadamente 50 (por ejemplo, aproximadamente 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50) nucleótidos que están químicamente modificados con una modificación química que tiene cualquiera de las Fórmulas I-VII o cualquier combinación de las mismas, en la que el oligonucleótido circular corma una estructura en forma de campana que tiene aproximadamente 19 pares de bases y 2 lazos.
En otra realización, una molécula de ANic circular de la divulgación contiene dos motivos en lazo, en el que una o ambas porciones en lazo de la molécula de ANic es biodegradable. Por ejemplo, una molécula de ANic circular de la divulgación se diseña de manera que la degradación de las porciones en lazo de la molécula de ANic in vivo pueda generar una molécula de ANic bicatenaria con salientes 3’ terminales, tales como salientes de nucleótido 3’ 5 terminales que comprenden aproximadamente 2 nucleótidos.
En una realización, una molécula de ANic de la divulgación comprende al menos un (por ejemplo, aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) resto abásico, por ejemplo un compuesto que tiene la Fórmula V:
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10 en la que cada R3, R4, R5, R6, R7, R8, R10, R11, R12 y R13 es independientemente H, OH, alquilo, alquilo sustituido, alcarilo o aralquilo, F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCN, O-alquilo, S-alquilo, N-alquilo, O-alquenilo, S- alquenilo, N-alquenilo, SO-alquilo, alquil-OSH, alquil-OH, O-alquil-OH, O-alquil-SH, S-alquil-OH, S-alquil-SH, alquil-S-alquilo, alquil-O-alquilo, ONO2, NO2, N3, NH2, aminoalquilo, aminoácido, aminoacilo, ONH2, O- aminoalquilo, O-aminoácido, O-aminoacilo, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, 15 polialquilamino, sililo sustituido o un grupo que tenga la Fórmula I; R9 es O, S, CH2, S=O, CHF o CF2.
En una realización, una molécula de ANic de la divulgación comprende al menos un (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) resto abásico invertido, por ejemplo un compuesto que tiene la Fórmula VI:
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20 en la que cada R3, R4, R5, R6, R7, R8, R10, R11, R12 y R13 es independientemente H, OH, alquilo, alquilo sustituido, alcarilo o aralquilo, F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCN, O-alquilo, S-alquilo, N-alquilo, O-alquenilo, S- alquenilo, N-alquenilo, SO-alquilo, alquil-OSH, alquil-OH, O-alquil-OH, O-alquil-SH, S-alquil-OH, S-alquil-SH, alquil-S-alquilo, alquil-O-alquilo, ONO2, NO2, N3, NH2, aminoalquilo, aminoácido, aminoacilo, ONH2, O- aminoalquilo, O-aminoácido, O-aminoacilo, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, 25 polialquilamino, sililo sustituido o un grupo que tenga la Fórmula I; R9 es O, S, CH2, S=O, CHF o CF2 y cualquiera de R2, R3, R8 o R13 sirve como punto de fijación a la molécula de ANic de la divulgación.
En otra realización, una molécula de ANic de la divulgación comprende al menos un (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) resto de polialquilo sustituido, por ejemplo un compuesto que tiene la Fórmula VII:
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en la que cada n es independientemente un número entero de 1 a 12, cada R1, R2 y R3 es independientemente H,
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OH, alquilo, alquilo sustituido, alcarilo o aralquilo, F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCN, O-alquilo, S-alquilo, N-alquilo, O-alquenilo, S-alquenilo, N-alquenilo, SO-alquilo, alquil-OSH, alquil-OH, O-alquil-OH, O-alquil-SH, S-alquil-OH, S- alquil-SH, alquil-S-alquilo, alquil-O-alquilo, ONO2, NO2, N3, NH2, aminoalquilo, aminoácido, aminoacilo, ONH2, O-aminoalquilo, O-aminoácido, O-aminoacilo, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido o un grupo que tenga la Fórmula I y R1, R2 o R3 sirve como punto de fijación a la molécula de ANic de la divulgación.
Una divulgación ofrece un compuesto que tiene la Fórmula VII, en la que R1 y R2 son grupos hidroxilo (OH), n = 1 y R3 comprende O y es el punto de fijación al extremo 3', al extremo 5' o ambos de los extremos 3' y 5' de una o ambas cadenas de una molécula de ANic bicatenario de la divulgación o a una molécula de ANic monocatenaria de la divulgación. Esta modificación se denomina en el presente documento “glicerilo” (por ejemplo la modificación 6 en la Figura 22).
En otra realización, un resto que tiene cualquiera de las Fórmulas V, VI o VII de la divulgación está en el extremo 3', el extremo 5' o ambos de los extremos 3' y 5' de una molécula de ANic de la divulgación. Por ejemplo, un resto que tiene la Fórmula V, VI o VII puede estar presente en el extremo 3', el extremo 5' o ambos de los extremos 3' y 5' de la cadena antisentido, de la cadena con sentido o tanto de la cadena antisentido como la con sentido de la molécula de ANic. Además, un resto que tiene la Fórmula VII puede estar presente en el extremo 3' o el extremo 5' de la molécula de ANic en horquilla como se describe en el presente documento.
En otra realización, una molécula de ANic de la divulgación comprende un resto abásico que tiene la Fórmula V o VI, en la que el resto abásico que tiene la Fórmula V o VI se conecta a la construcción de ANic en una configuración 3'-3', 3'-2', 2'-3' o 5'-5', tal como en el extremo 3', en el extremo 5' o en ambos de los extremos 3' y 5' de una o ambas cadenas del ANic.
En una realización, una molécula de ANic de la divulgación comprende uno o más (por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA), por ejemplo en el extremo 5', el extremo 3', ambos extremos 5' y 3' o cualquier combinación de los mismos, de la molécula de ANic.
En otra realización, una molécula de ANic de la divulgación, comprende uno o más (por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) nucleótidos acíclicos, por ejemplo, en el extremo 5', el extremo 3', ambos extremos 5' y 3' o cualquier combinación de los mismos, de la molécula de ANic.
En una realización la invención ofrece una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) modificado químicamente de la invención, en la que el ANic modificado químicamente comprende una región con sentido, en la que cualquiera de (por ejemplo, uno o más o todos) los nucleótidos de pirimidina presentes en la región con sentido son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina), y en la que cualquiera de (por ejemplo, uno o más o todos) los nucleótidos de purina presentes en la región con sentido son nucleótidos de 2'-desoxi purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-desoxi purina, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-desoxi purina).
En una realización la invención ofrece una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) modificado químicamente de la invención, en la que el ANic modificado químicamente comprende una región con sentido, en la que cualquiera de (por ejemplo, uno o más o todos) los nucleótidos de pirimidina presentes en la región con sentido son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina) y en la que cualquiera de (por ejemplo, uno o más o todos) los nucleótidos de purina presentes en la región con sentido son nucleótidos de 2'-desoxi purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-desoxi purina, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-desoxi purina), en la que cualquiera de los nucleótidos que comprenden un saliente de nucleótidos 3'-terminal que están presentes en dicha región con sentido son 2'-desoxi nucleótidos.
En una realización, la invención ofrece una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) modificado químicamente de la invención, en la que el ANic modificado químicamente comprende una región antisentido, en la que cualquiera de (por ejemplo, uno o más o todos) los nucleótidos de pirimidina presentes en la región antisentido son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina), y en la que cualquiera de (por ejemplo, uno o más o todos) los nucleótidos de purina presentes en la región antisentido son nucleótidos de 2'-O-metil purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2-'O-metil purina, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-O-metil purina).
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En una realización, la invención ofrece una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) modificado químicamente de la invención, en la que el ANic modificado químicamente comprende una región antisentido, en la que cualquiera de (por ejemplo, uno o más o todos) los nucleótidos de pirimidina presentes en la región antisentido son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina), y en la que cualquiera de (por ejemplo, uno o más o todos) los nucleótidos de purina presentes en la región antisentido son nucleótidos de 2'-O-metil purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-O-metil purina, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-O- metil purina), en la que cualquiera de los nucleótidos que comprenden un saliente de nucleótidos 3'-terminal que están presentes en dicha región antisentido son 2'-desoxi nucleótidos.
En una realización, la invención ofrece una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) modificado químicamente de la invención, en la que el ANic modificado químicamente comprende una región antisentido, en la que cualquiera de (por ejemplo, uno o más o todos) los nucleótidos de pirimidina presentes en la región antisentido son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina), y en la que cualquiera de (por ejemplo, uno o más o todos) los nucleótidos de purina presentes en la región antisentido son nucleótidos de 2'-desoxi purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-desoxi purina, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-desoxi purina).
En una realización, la invención ofrece una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) modificado químicamente de la invención, capaz de mediar la interferencia de ARN (iARN) dentro de una célula o de un sistema in vitro reconstituido, en la que el ANic modificado químicamente comprende una región con sentido y una región antisentido. La región con sentido comprende uno o más nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina) y uno o más nucleótidos de 2'-desoxi purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-desoxi purina, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-desoxi purina). Opcionalmente pueden estar presentes modificaciones abásicas desoxi invertidas en el extremo 3', el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5' de la región con sentido. Opcionalmente, la región con sentido comprende adicionalmente un saliente 3'-terminal que tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, ó 4) 2'-desoxirribonucleótidos. La región antisentido comprende uno o más nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'- desoxi-2'-fluoro pirimidina, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina) y uno o más nucleótidos de 2'-O-metil purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-O-metil purina de manera alternativa una pluralidad de nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-O-metil purina). Opcionalmente, está presente una modificación de protección terminal, tal como cualquier modificación descrita en el presente documento o mostrada en la Figura 22, en el extremo 3', el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5' de la secuencia antisentido. Opcionalmente, la región antisentido comprende adicionalmente un saliente de nucleótidos 3'-terminal que tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3 ó 4) 2'-desoxinucleótidos, en la que los nucleótidos salientes pueden comprender además uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3 ó 4) enlaces internucleotídicos de fosforotioato. Se muestran ejemplos no limitantes de estos ANic modificados químicamente en las Figuras 18 y 19 y la Tabla IV en el presente documento.
En una realización, la invención ofrece una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) modificado químicamente de la invención, capaz de mediar la interferencia de ARN (iARN) dentro de una célula o de un sistema in vitro reconstituido, en la que el ANic comprende una región con sentido y una región antisentido, en la que la región con sentido comprende uno o más nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina) y uno o más ribonucleótidos de purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son ribonucleótidos de purina, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos purina son ribonucleótidos de purina) y en la que la región antisentido comprende uno o más nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina) y uno o más nucleótidos de 2'-O- metil purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-O-,metil-purina, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-O-,metil-purina). Opcionalmente, están presentes modificaciones abásicas desoxi invertidas en el extremo 3', el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5' de la región con sentido. Opcionalmente, la región con sentido comprende adicionalmente un saliente 3'-terminal
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que tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3 ó 4) 2'- desoxirribonucleótidos. Una modificación de protección terminal, tal como cualquier modificación descrita en el presente documento o mostrada en la figura 22, está opcionalmente presente en el extremo 3', el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5' de la secuencia antisentido. Opcionalmente, la región antisentido comprende adicionalmente un saliente de nucleótidos 3'-terminal que tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3 ó 4) 2'-desoxinucleótidos, en la que los nucleótidos salientes pueden comprender además uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3 ó 4) enlaces internucleotídicos de fosforotioato. Se muestran ejemplos no limitantes de estos ANic modificados químicamente en las Figuras 18 y 19 y la Tabla IV en el presente documento.
En una realización, la invención ofrece una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) modificado químicamente de la invención, capaz de mediar la interferencia de ARN (iARN) dentro de una célula o un sistema in vitro reconstituido, en la que el ANic modificado químicamente comprende una región con sentido y una región antisentido, en la que la región con sentido comprende uno o más nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos de pirimidina son nucleótidos 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina) y uno o más nucleótidos de purina seleccionados entre el grupo que consiste en 2'-desoxi nucleótidos, nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA), 2'-metoxietil nucleótidos, 4'-tionucleótidos y 2'-O-metil nucleótidos (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina se seleccionan entre el grupo que consiste en 2'-desoxi nucleótidos, nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA), 2'-metoxietil nucleótidos, 4'-tionucleótidos y 2'-O-metil nucleótidos, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos de purina se seleccionan entre el grupo que consiste en 2'- desoxi nucleótidos, nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA), 2'-metoxietil nucleótidos, 4'-tionucleótidos y 2'- O-metil nucleótidos) y en la que la región antisentido comprende uno o más nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'- fluoro pirimidina) y uno o más nucleótidos de purina seleccionados entre el grupo que consiste en 2'-desoxi nucleótidos, nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA), 2'-metoxietil nucleótidos, 4'-tionucleótidos y 2'-O-metil nucleótidos (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina se seleccionan entre el grupo que consiste en 2'-desoxi nucleótidos, nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA), 2'-metoxietil nucleótidos, 4'-tionucleótidos y 2'-O-metil nucleótidos, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos de purina se seleccionan entre el grupo que consiste en 2'-desoxi nucleótidos, nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA), 2'-metoxietil nucleótidos, 4'-tionucleótidos y 2'-O-metil nucleótidos). Opcionalmente, están presentes modificaciones abásicas desoxi invertidas en el extremo 3', el extremo 5' o ambos extremos 3' y 5' de la región con sentido. Opcionalmente, la región con sentido comprende además un saliente 3'-terminal que tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, ó 4) 2'-desoxirribonucleótidos. Una modificación de protección terminal, tal como cualquier modificación descrita en el presente documento o mostrada en la Figura 22, está presente opcionalmente en el extremo 3', el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5' de la secuencia antisentido. Opcionalmente, la región antisentido comprende además un saliente de nucleótidos 3'-terminal que tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, ó 4) 2'- desoxinucleótidos, en la que los nucleótidos salientes pueden comprender además uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, ó 4) enlaces internucleotídicos de fosforotioato.
En otra realización, cualquier nucleótido modificado presente en las moléculas de ANic de la invención, preferentemente en la cadena antisentido de las moléculas de ANic de la invención, aunque también opcionalmente en las cadenas con sentido y/o tanto antisentido como con sentido, comprenden nucleótidos modificados que tienen propiedades o características similares a los ribonucleótidos de origen natural. Por ejemplo, la divulgación presenta moléculas de ANic que incluyen nucleótidos modificados que tienen una conformación Norte (por ejemplo, ciclo de pseudorrotación Norte, véase por ejemplo Saenger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag ed., 1984). Como tales, los nucleótidos modificados químicamente presentes en las moléculas de ANic de la invención, preferentemente en la cadena antisentido de las moléculas de ANic de la invención, aunque también opcionalmente en las cadenas con sentido y/o tanto antisentido como con sentido, son resistentes a la degradación por nucleasa mientras que al mismo tiempo mantienen la capacidad de mediar la iARN. Los ejemplos no limitantes de nucleótidos que tienen una configuración Norte incluyen nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA) (por ejemplo, 2'-O,4'-C-metilen-(D-ribufuranosi nucleótidos); 2'-metoxietoxi (MOE) nucleótidos; 2'-metil-tio-etil, 2'-desoxi-2'-fluoro nucleótidos, 2'-desoxi-2'-cloro nucleótidos, 2'-azido nucleótidos y 2'- O-metil nucleótidos.
Una divulgación ofrece una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) modificado químicamente capaz de mediar la interferencia de ARN (iARN) dentro de una célula o sistema in vitro reconstituido, en la que la modificación química comprende un conjugado unido covalentemente a la molécula de ANic modificada químicamente. En otra realización, el conjugado está unido covalentemente a la molécula de ANic modificada químicamente, a través de un engarce biodegradable. En una realización, la molécula de conjugado está unida en
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el extremo 3' de la cadena con sentido, la cadena antisentido o ambas cadenas de la molécula de ANic modificada químicamente. En otra realización, la molécula de conjugado se une en el extremo 5' de la cadena con sentido, la cadena antisentido o ambas cadenas de la molécula de ANic modificada químicamente. En otra realización más, la molécula de conjugado se une tanto al extremo 3' como al extremo 5' de cualquiera de la cadena con sentido, la cadena antisentido o ambas cadenas de la molécula de ANic modificada químicamente o cualquier combinación de las mismas. En una realización, una molécula de conjugado de la invención comprende una molécula que facilita el suministro de una molécula de ANic modificada químicamente en un sistema biológico, tal como una célula. En otra realización, la molécula de conjugado unida a la molécula de ANic modificada químicamente es un polietilenglicol, albúmina de suero humano o un ligando para un receptor celular que puede mediar la captación celular. Se describen ejemplos de moléculas de conjugado específicas que contempla la presente divulgación que pueden unirse a moléculas de ANic modificadas químicamente en Vargeese y col., N° de Serie de los Estados Unidos 10/201.394, que se incorpora por referencia en el presente documento. El tipo de conjugado usado y el grado de conjugación de las moléculas de ANic de la invención puede evaluarse para determinar una mejora en los perfiles farmacocinéticos, la biodisponibilidad y/o la estabilidad de las construcciones de ANic mientras que al mismo tiempo se mantiene la capacidad del ANic para mediar la actividad de iARN. Como tal, un experto en la materia puede seleccionar construcciones de ANic que están modificadas con diversos conjugados para determinar si el complejo de ANic-conjugado posee propiedades mejoradas a la vez que mantiene la capacidad de mediar la iARN, por ejemplo, en modelos animales como se conocen generalmente en la técnica.
En una realización, la invención ofrece una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) de la invención, en la que el ANic comprende además un engarce nucleotídico, no nucleotídico o mixto nucleotídico/no nucleotídico que une la región con sentido del ANic con la región antisentido del ANic. En una realización, un engarce nucleotídico de la divulgación puede ser un engarce de > 2 nucleótidos de longitud, por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 nucleótidos de longitud. En otra realización, el engarce nucleotídico puede ser un aptámero de ácido nucleico. “Aptámero” o “aptámero de ácido nucléico”, como se usan en el presente documento, significan una molécula de ácido nucleico que se une específicamente a una molécula diana en la que la molécula de ácido nucleico tiene una secuencia que comprende una secuencia reconocida por la molécula diana en su entorno natural. Como alternativa, un aptámero puede ser una molécula de ácido nucleico que se une a una molécula diana en la que la molécula diana no se une de forma natural a un ácido nucleico. La molécula diana puede ser cualquier molécula de interés. Por ejemplo, el aptámero puede usarse para unirse a un dominio de unión a ligando de una proteína, impidiendo de ese modo la interacción del ligando de origen natural con la proteína. Esto es un ejemplo no limitante y los expertos en la materia reconocerán que pueden generarse fácilmente otras realizaciones usando las técnicas conocidas generalmente en el campo (véase, por ejemplo, Gold y col., 1995, Annu. Rev. Biochem., 64, 763; Brody y Gold, 2000, J. Biotechnol., 74, 5; Sun, 2000, Curr. Opin. Mol. Ther., 2, 100; Kusser, 2000, J. Biotechnol., 74, 27; Hermann y Patel, 2000, Science, 287, 820; y Jayasena, 1999, Clinical Chemistry, 45, 1628.).
En otra realización más, un engarce no nucleotídico de la divulgación comprende un nucleótido abásico, poliéter, poliamina, poliamida, péptido, carbohidrato, lípido, polihidrocarburo u otros compuestos poliméricos (por ejemplo, polietilenglicoles tales como los que tienen entre 2 y 100 unidades de etilenglicol). Los ejemplos específicos incluyen los descritos por Seela y Kaiser, Nucleic Acids Res. 1990, 18: 6353 y Nucleic Acids Res. 1987, 15: 3113; Cload y Schepartz, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113: 6324; Richardson y Schepartz, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113: 5109; Ma y col., Nucleic Acids Res. 1993, 21: 2585 y Biochemistry 1993, 32: 1751; Durand y col., Nucleic Acids Res. 1990, 18: 6353; McCurdy y col., Nucleosides & Nucleotides 1991, 10: 287; Jschke y col., Tetrahedron Lett. 1993, 34: 301; Ono y col., Biochemistry 1991, 30: 9914; Arnold y col., Publicación Internacional N° WO 89/02439; Usman y col., Publicación Internacional N° WO 95/06731; Dudycz y col., Publicación Internacional N° WO 95/11910 y Ferentz y Verdine, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113: 4000. Un “no nucleótido” significa además cualquier grupo o compuesto que se puede incorporar en una cadena de ácido nucleico en el lugar de una o más unidades de nucleótido, incluyendo sustituciones de azúcar y/o fosfato, y permite que las bases restantes muestren su actividad enzimática. El grupo o compuesto puede ser abásico en el sentido de que no contiene una base de nucleótido reconocida comúnmente, tal como adenosina, guanina, citosina, uracilo o timina, por ejemplo, en la posición C1 del azúcar.
Una divulgación ofrece una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) capa de mediar la interferencia de ARN (iARN) dentro de una célula o un sistema in vitro reconstituido, en la que una o ambas cadenas de la molécula de ANic que se ensamblan a partir de dos oligonucleótidos separados no comprenden ningún ribonucleótido. Por ejemplo, una molécula de ANic puede ensamblarse a partir de un único oligonucleótido donde las regiones con sentido y antisentido del ANic comprenden oligonucleótidos separados que no tienen ningún ribonucleótido (por ejemplo, nucleótidos que tienen un grupo 2'-OH) presente en los oligonucleótidos. En otro ejemplo, una molécula de ANic puede ensamblarse a partir de un único oligonucleótido donde las regiones con sentido y antisentido del ANic se unen o circularizan mediante un engarce de nucleótido o de no nucleótido como se describe en el presente documento, en el que el oligonucleótido no tiene ningún ribonucleótido (por ejemplo,
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nucleótidos que tienen un grupo 2'-OH) presente en los oligonucleótidos. El solicitante ha descubierto sorprendentemente que la presencia de ribonucleótidos (por ejemplo, nucleótidos que tienen un grupo 2'-hidroxilo) dentro de la molécula de ANic no se requiere o es esencial para soportar la actividad iARN. Como tal, en una realización, todas las posiciones dentro del ANic pueden incluir nucleótidos químicamente modificados y/o no nucleótidos tales como nucleótidos y/o no nucleótidos que tienen la Fórmula I, II, III, IV, V, VI o VII o cualquier combinación de los mismos hasta el grado de que se mantenga la capacidad de la molécula de ANic para soportar la actividad de iARN en una célula.
En una realización, una molécula de ANic de la invención es una molécula de ANic monocatenario que media la actividad de iARN en una célula o sistema in vitro reconstituido, en la que la molécula de ANic comprende un polinucleótido monocatenario que tiene complementariedad con una secuencia de ácido nucleico diana. En otra realización, la molécula de ANic monocatenario de la invención comprende un grupo fosfato 5'-terminal. En otra realización, la molécula de ANic monocatenario de la invención comprende un grupo fosfato 5'-terminal y un grupo fosfato 3'-terminal (por ejemplo, un fosfato 2',3'-cíclico). En otra realización, la molécula de ANic monocatenario de la invención comprende de aproximadamente 19 a aproximadamente 29 nucleótidos. En aún otra realización, la molécula de ANic monocatenario de la invención comprende uno o más nucleótidos modificados químicamente o no nucleótidos descritos en el presente documento. Por ejemplo, todas las posiciones dentro de la molécula de ANic pueden incluir nucleótidos modificados químicamente tales como nucleótidos que tienen cualquiera de las Fórmulas I-VII o cualquier combinación de las mismas hasta el grado de que se mantenga la capacidad de la molécula de ANic para soportar la actividad de iARN en una célula.
En una realización, una molécula de ANic de la invención es una molécula de ANic monocatenario que media la actividad de iARN en una célula o sistema in vitro reconstituido, en la que la molécula de ANic comprende un polinucleótido monocatenario que tiene complementariedad con una secuencia de ácido nucleico diana, y en la que uno o más nucleótidos de pirimidina presentes en el ANic son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina o, de forma alternativa, una pluralidad de nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina) y en la que cualquiera de los nucleótidos de purina presentes en la región antisentido son nucleótidos de 2'-O-metil purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-O-metil purina o, de forma alternativa, una pluralidad de nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-O-metil purina) y una modificación de protección terminal, tal como cualquier modificación descrita en el presente documento o mostrada en la Figura 22, que está presente opcionalmente en el extremo 3', el extremo 5' o tanto en el extremo 3' como el 5' de la secuencia antisentido, comprendiendo además opcionalmente el ANic de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3 ó 4) 2'-desoxinucleótidos terminales en el extremo 3' de la molécula de ANic, en la que los nucleótidos terminales pueden comprender además uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3 ó 4) enlaces internucleotídicos de fosforotioato, y en la que el ANic comprende además opcionalmente un grupo fosfato terminal, tal como un grupo fosfato 5'- terminal.
En una realización, una molécula de ANic de la invención es una molécula de ANic monocatenario que media la actividad de iARN en una célula o sistema in vitro reconstituido, en la que la molécula de ANic comprende un polinucleótido monocatenario que tiene complementariedad con una secuencia de ácido nucleico diana, y en la que uno o más nucleótidos de pirimidina presentes en el ANic son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina o, de forma alternativa, una pluralidad de nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina) y en la que cualquiera de los nucleótidos de purina presentes en la región antisentido son nucleótidos de 2'-desoxi purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'- desoxi purina o, de forma alternativa, una pluralidad de nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'- desoxi purina) y una modificación de protección terminal, tal como cualquier modificación descrita en el presente documento o mostrada en la Figura 22, que está presente opcionalmente en el extremo 3', el extremo 5' o tanto en el extremo 3' como en el 5' de la secuencia antisentido, comprendiendo además opcionalmente el ANic de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3 ó 4) 2'-desoxinucleótidos terminales en el extremo 3' de la molécula de ANic, en la que los nucleótidos terminales pueden comprender además uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3 ó 4) enlaces internucleotídicos de fosforotioato y en la que el ANic comprende además opcionalmente un grupo fosfato terminal, tal como un grupo fosfato 5'- terminal.
En una realización, una molécula de ANic de la invención es una molécula de ANic monocatenario que media la actividad de iARN en una célula o sistema in vitro reconstituido, en la que la molécula de ANic comprende un polinucleótido monocatenario que tiene complementariedad con una secuencia de ácido nucleico diana y en la que uno o más nucleótidos de pirimidina presentes en el ANic son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina o, de forma alternativa, una pluralidad de nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina), y en la que cualquiera de los nucleótidos de purina presentes en la región antisentido son nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA) (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de LNA o, de forma
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alternativa, una pluralidad de nucleótidos de purina son nucleótidos de LNA) y una modificación de protección terminal, tal como cualquier modificación descrita en el presente documento o mostrada en la Figura 22, que está presente opcionalmente en el extremo 3', el extremo 5' o tanto en el extremo 3' como en el 5' de la secuencia antisentido, comprendiendo además opcionalmente el ANic de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3 ó 4) 2'-desoxinucleótidos terminales en el extremo 3' de la molécula de ANic, en la que los nucleótidos terminales pueden comprender además uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3 ó 4) enlaces internucleotídicos de fosforotioato y en la que el ANic comprende además opcionalmente un grupo fosfato terminal, tal como un grupo fosfato 5'- terminal.
En una realización, una molécula de ANic de la invención es una molécula de ANic monocatenario que media la actividad de iARN en una célula o sistema in vitro reconstituido, en la que la molécula de ANic comprende un polinucleótido monocatenario que tiene complementariedad con una secuencia de ácido nucleico diana y en la que uno o más nucleótidos de pirimidina presentes en el ANic son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina o, de forma alternativa, una pluralidad de nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina) y en la que cualquiera de los nucleótidos de purina presentes en la región antisentido son nucleótidos de 2'-metoxietil purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'- metoxietil purina o, de forma alternativa, una pluralidad de nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'- metoxietil purina) y una modificación de protección terminal, tal como cualquier modificación descrita en el presente documento o mostrada en la Figura 22, que está presente opcionalmente en el extremo 3', el extremo 5' o tanto en el extremo 3' como en el 5' de la secuencia antisentido, comprendiendo además opcionalmente el ANic de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3 ó 4) 2'-desoxinucleótidos terminales en el extremo 3' de la molécula de ANic, en la que los nucleótidos terminales pueden comprender además uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3 ó 4) enlaces internucleotídicos de fosforotioato y en la que el ANic comprende además opcionalmente un grupo fosfato terminal, tal como un grupo fosfato 5'-terminal.
En otra realización, cualquier nucleótido modificado presente en las moléculas de ANic monocatenario de la invención puede comprender nucleótidos modificados que tienen propiedades o características similares a los ribonucleótidos de origen natural. Por ejemplo, una divulgación ofrece moléculas de ANic incluyendo nucleótidos modificados que tienen una conformación Norte (por ejemplo, ciclo de pseudorrotación Norte, véase, por ejemplo Saenger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag ed., 1984). Como tal, los nucleótidos modificados químicamente presentes en las moléculas de ANic monocatenario de la invención preferentemente son resistentes a la degradación por nucleasa mientras que al mismo tiempo mantienen la capacidad de mediar la iARN.
Una divulgación ofrece un procedimiento para modular la expresión de un gen dentro una célula que comprende:
(a) sintetizar una molécula de ANic de la invención, que está modificada químicamente, en la que una de las cadenas del ANic comprende una secuencia complementaria al ARN del gen; y (b) introducir la molécula del ANic en una célula en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen en la célula.
Una divulgación ofrece un procedimiento para modular la expresión de un gen dentro de una célula que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANic de la invención, que está modificada químicamente, en la que una de las cadenas del ANic comprende una secuencia complementaria al ARN del gen y en la que la secuencia de la cadena con sentido del ANic comprende una secuencia sustancialmente similar a la secuencia del ARN diana; y
(b) introducir la molécula de ANic en una célula en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen en la célula.
Una divulgación ofrece un procedimiento para modular la expresión de más de un gen dentro de una célula que comprende: (a) sintetizar moléculas de ANic de la invención, que están modificadas químicamente, en las que una de las cadenas de ANic comprende una secuencia complementaria al ARN de los genes; (b) introducir las moléculas de ANic en una célula en condiciones adecuadas para modular la expresión de los genes en la célula.
Una divulgación ofrece un procedimiento para modular la expresión de más de un gen dentro de una célula que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANic de la invención, que está modificada químicamente, en la que una de las cadenas de ANic comprende una secuencia complementaria al ARN del gen y en la que la secuencia de la cadena con sentido del ANic comprende una secuencia identica a la secuencia del ARN diana; y (b) introducir las moléculas de ANic en una célula en condiciones adecuadas para modular la expresión de los genes en la célula.
En una realización, las moléculas de ANic de la invención se usan como reactivos en aplicaciones ex vivo. Por ejemplo, se introducen reactivos de ANic en tejido o células que se trasplantan a un sujeto para un efecto terapéutico. Las células y/o el tejido se pueden obtener a partir de un organismo o sujeto que posteriormente recibe el explante, o se pueden obtener a partir de otro organismo o sujeto antes del trasplante. Las moléculas de ANic se pueden usar para modular la expresión de uno o más genes en las células o tejido, de forma que las células o tejido obtengan un fenotipo deseado o sean capaces de realizar una función cuando se trasplantan in vivo. En una
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realización, se extraen determinadas células diana de un paciente. Estas células extraídas se ponen en contacto con ANic que se dirigen a una secuencia de nucleótidos específica dentro de las células en condiciones adecuadas para la captación de los ANic por estas células (por ejemplo, usando reactivos de suministro tales como lípidos catiónicos, liposomas y similares o usando técnicas tales como electroporación para facilitar el suministro de ANic a las células). Las células después se vuelven a introducir en el mismo paciente o en otros pacientes. Los ejemplos no limitantes de aplicaciones ex vivo incluyen su uso en el trasplante de órganos/tejidos, injerto de tejido o tratamiento de enfermedad pulmonar (por ejemplo, reestenosis) o para prevenir la hiperplasia de la neoíntima y/o aterosclerosis en injertos venosos. Tales aplicaciones ex vivo también se pueden usar para tratar afecciones asociadas con rechazo de injerto de derivación coronaria y periférica, por ejemplo, tales procedimientos se pueden usar junto con cirugía de injerto de derivación vascular periférica y cirugía de injerto de derivación de la arteria coronaria. Las aplicaciones adicionales incluyen trasplantes para tratar lesiones o daños del SNC, incluyendo su uso en el tratamiento de afecciones neurodegenerativas tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, Epilepsia, Demencia, enfermedad de Huntington o esclerosis lateral amiotrófica (ELA).
Una divulgación ofrece un procedimiento para modular la expresión de un gen en un explante de tejido que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANic de la invención, que está modificada químicamente, en la que una de las cadenas del ANic comprende una secuencia complementaria al ARN del gen, y (b) introducir la molécula de ANic en una célula del explante de tejido obtenido a partir de un organismo particular en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen en el explante de tejido. En otra realización, el procedimiento comprende además introducir el explante de tejido de nuevo en el organismo a partir del cual se obtuvo el tejido o en otro organismo en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen en ese organismo.
Una divulgación ofrece un procedimiento para modular la expresión de un gen en un explante de tejido que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANic de la invención, que está modificada químicamente, en la que una de las cadenas del ANic comprende una secuencia complementaria al ARN del gen y en la que la secuencia de la cadena con sentido del ANic comprende una secuencia idéntica a la secuencia del ARN diana; y (b) introducir la molécula de ANic en una célula del explante del tejido obtenido a partir de un organismo particular en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen en el explante de tejido. En otra realización, el procedimiento comprende además introducir el explante de tejido de nuevo en el organismo a partir del cual se obtuvo el tejido o en otro organismo, en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen en ese organismo.
Una divulgación ofrece un procedimiento para modular la expresión de más de un gen en un explante de tejido, que comprende: (a) sintetizar moléculas de ANic de la invención, que están modificadas químicamente, en las que una de las cadenas del ANic comprende una secuencia complementaria al ARN de los genes; (b) introducir las moléculas de ANic en una célula del explante de tejido obtenido a partir de un organismo particular en condiciones adecuadas para modular la expresión de los genes en el explante de tejido. En otra realización, el procedimiento comprende además introducir el explante de tejido de nuevo en el organismo a partir del cual se obtuvo el tejido o en otro organismo en condiciones adecuadas para modular la expresión de los genes en ese organismo.
Una divulgación ofrece un procedimiento para modular la expresión de un gen en un organismo que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANic de la invención, que está modificada químicamente, en la que una de las cadenas del ANic comprende una secuencia complementaria al ARN del gen, y (b) introducir la molécula de ANic en el organismo en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen en el organismo.
Una divulgación ofrece un procedimiento para modular la expresión de más de un gen en un organismo que comprende: (a) sintetizar moléculas de ANic de la invención, que están modificadas químicamente, en las que una de las cadenas del ANic comprende una secuencia complementaria al ARN de los genes; y (b) introducir las moléculas de ANic en el organismo en condiciones adecuadas para modular la expresión de los genes en el organismo.
Una divulgación ofrece un procedimiento para modular la expresión de un gen dentro de una célula que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANic de la divulgación, que está modificada químicamente, en la que el ANic comprende una secuencia monocatenaria que tienen complementariedad con el ARN del gen; y (b) introducir la molécula de ANic en una célula en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen en la célula.
Una divulgación ofrece un procedimiento para modular la expresión de más de un gen dentro de una célula que comprende: (a) sintetizar moléculas de ANic de la invención, que están modificadas químicamente, en las que el ANic comprende una secuencia monocatenaria que tiene complementariedad con el ARN del gen; y (b) poner en contacto la molécula de ANic con una célula in vitro o in vivo en condiciones adecuadas para modular la expresión de los genes en la célula.
Una divulgación ofrece un procedimiento para modular la expresión de un gen en un explante de tejido que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANic de la invención, que está modificada químicamente, en la que el ANic comprende una secuencia monocatenaria que tiene complementariedad con el ARN del gen; y (b) poner en
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contacto la molécula de ANic con una célula del explante de tejido obtenido a partir de un organismo particular en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen en el explante de tejido. En otra realización, el procedimiento comprende además introducir el explante de tejido de nuevo en el organismo a partir del cual se obtuvo el tejido o en otro organismo en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen en ese organismo.
Una divulgación ofrece un procedimiento para modular la expresión de más de un gen en un explante de tejido que comprende: (a) sintetizar moléculas de ANic de la invención, que está modificada químicamente, en las que el ANic comprende una secuencia monocatenaria que tiene complementariedad con el ARN del gen; y (b) introducir las moléculas del ANic en una célula del explante de tejido obtenido a partir de un organismo particular en condiciones adecuadas para modular la expresión de los genes en el explante de tejido. En otra realización, el procedimiento comprende además introducir el explante de tejido de nuevo en el organismo a partir del cual se obtuvo el tejido o en otro organismo en condiciones adecuadas para modular la expresión de los genes en ese organismo.
Una divulgación ofrece un procedimiento para modular la expresión de un gen en un organismo que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANic de la invención, que está modificada químicamente, en la que el ANic comprende una secuencia monocatenaria que tiene complementariedad con el ARN del gen; y (b) introducir la molécula de ANic en el organismo en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen en el organismo.
Una divulgación ofrece un procedimiento para modular la expresión de más de un gen en un organismo que comprende: (a) sintetizar moléculas de ANic de la invención, que están modificadas químicamente, en las que el ANic comprende una secuencia monocatenaria que tiene complementariedad con el ARN del gen; y (b) introducir las moléculas de ANic en el organismo en condiciones adecuadas para modular la expresión de los genes en el organismo.
Una divulgación ofrece un procedimiento para modular la expresión de un gen en un organismo que comprende poner en contacto el organismo con una molécula de ANic de la invención en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen en el organismo.
Una divulgación ofrece un procedimiento para modular la expresión de más de un gen en un organismo que comprende poner en contacto el organismo con una o más moléculas de ANic de la invención en condiciones adecuadas para modular la expresión de los genes en el organismo.
Las moléculas de ANic de la invención se pueden diseñar para inhibir la expresión de un gen diana a través de la dirección de la iARN de una diversidad de moléculas de ARN. En una realización, las moléculas de ANic de la invención se usan para dirigir diversos ARN correspondientes a un gen diana. Los ejemplos no limitantes de tales ARN incluyen ARN mensajero (ARNm), variantes de corte y empalme alternativo del ARN de un gen o genes diana, ARN modificado post-transcripcionalmente de un gen o genes diana, pre-ARNm de un gen o genes diana y/o moldes de ARN. Si el corte y empalme alternativo produce una familia de transcritos que se distinguen por el uso de exones apropiados, la presente invención se puede usar para inhibir la expresión génica a través de los exones apropiados para inhibir específicamente o distinguir entre las funciones de miembros de familias de genes. Por ejemplo, una proteína que contiene un dominio transmembrana sometido a corte y empalme alternativo se puede expresar en formas tanto unida a membrana como secretada. El uso de la invención para dirigirse al exón que contiene el dominio transmembrana se puede usar para determinar las consecuencias funcionales de la dirección farmacéutica de la forma unida a membrana a diferencia de la secretada de la proteína. Los ejemplos no limitantes de aplicaciones de la invención que se refieren a la dirección de estas moléculas de ARN incluyen aplicaciones farmacéuticas terapéuticas, aplicaciones de descubrimiento farmacéutico, aplicaciones de diagnóstico molecular y función génica y mapeo de genes, por ejemplo usando mapeo de polimorfismos de un solo nucleótido con moléculas de ANic de la invención. Tales aplicaciones se pueden poner en práctica usando secuencias génicas conocidas o a partir de secuencias parciales disponibles a partir de una etiqueta de secuencia expresada (EST).
En otra realización, las moléculas de ANic de la invención se usan para dirigir secuencias conservadas correspondientes a una familia de genes o familias de genes. Como tal, las moléculas de ANic que se dirigen a múltiples dianas génicas pueden proporcionar un efecto terapéutico aumentado. Adicionalmente, se puede usar ANic para caracterizar rutas de función génica en una diversidad de aplicaciones. Por ejemplo, la presente invención se puede usar para inhibir la actividad de un gen o genes diana en una ruta para determinar la función de un gen o genes no caracterizados en el análisis de la función génica, análisis de la función del ARNm o análisis traduccional. La invención se puede usar para determinar rutas de genes diana potenciales implicadas en diversas enfermedades y afecciones hacia el desarrollo farmacéutico. La invención se puede usar para comprender rutas de expresión génica implicadas en, por ejemplo, el desarrollo, tal como el desarrollo prenatal y el desarrollo postnatal y/o la progresión y/o el mantenimiento del cáncer, enfermedades infecciosas, autoinmunidad, inflamación,
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trastornos endocrinos, enfermedad renal, enfermedad pulmonar, enfermedad cardiovascular, defectos de nacimiento, envejecimiento y otras enfermedades o afecciones relacionadas con la expresión génica.
Una divulgación ofrece un procedimiento que comprende: (a) generar una biblioteca de construcciones de ANic con una complejidad predeterminada; y (b) ensayar las construcciones de ANic de (a) mencionado anteriormente, en condiciones adecuadas para determinar sitios diana de iARN dentro de la secuencia de ARN diana. En otra realización, las moléculas de ANic de (a) tienen cadenas de una longitud fija, por ejemplo, aproximadamente 23 nucleótidos de longitud. En otra realización más, las moléculas de ANic de (a) son de longitud diferente, por ejemplo, tienen cadenas de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 (por ejemplo, aproximadamente 19, 20, 21,22, 23, 24 ó 25) nucleótidos de longitud. En una realización, el ensayo puede comprender un ensayo de ANic in vitro reconstituido como se describe en el presente documento. En otra realización, el ensayo puede comprender un sistema de cultivo celular en el que se expresa ARN diana. En otra realización, se analizan fragmentos de ARN diana para determinar niveles detectables de escisión, por ejemplo, mediante electroforesis en gel, análisis de transferencia de Northern o ensayos de protección de ARNasa, para determinar el sitio o los sitios diana más adecuados dentro de la secuencia de ARN diana. La secuencia de ARN diana se puede obtener como se conoce en la técnica, por ejemplo, mediante clonación y/o transcripción para sistemas in vitro y mediante expresión celular en sistemas in vivo.
Una divulgación ofrece un procedimiento que comprende: (a) generar una biblioteca aleatorizada de construcciones de ANic que tienen una complejidad predeterminada, tal como de 4N, donde N representa el número de nucleótidos formando pares de bases en cada una de las cadenas de la construcción de ANic (por ejemplo, para una construcción de ANic que tiene cadenas con sentido y antisentido de 21 nucleótidos con 19 pares de bases, la complejidad sería de 419) y (b) ensayar las construcciones de ANic de (a) mencionado anteriormente, en condiciones adecuadas para determinar sitios diana de iARN dentro de la secuencia de ARN diana. En otra realización, las moléculas de ANic de (a) tienen cadenas de una longitud fija, por ejemplo, de aproximadamente 23 nucleótidos de longitud. En otra realización más, las moléculas de ANic de (a) tienen una longitud diferente, por ejemplo, tienen cadenas de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 (por ejemplo, aproximadamente 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25) nucleótidos de longitud. En una realización, el ensayo puede comprender un ensayo de ANic in vitro reconstituido como se ha descrito en el Ejemplo 7 en el presente documento. En otra realización, el ensayo puede comprender un sistema de cultivo celular en el que se expresa ARN diana. En otra realización, se analizan fragmentos de ARN diana para determinar niveles detectables de escisión, por ejemplo mediante electroforesis en gel, análisis de transferencia de Northern o ensayos de protección de ARNasa, para determinar el sitio o los sitios diana más adecuados dentro de la secuencia de ARN diana. En otra realización, la secuencia de ARN diana se puede obtener como se conoce en la técnica, por ejemplo, mediante clonación y/o transcripción para sistemas in vitro y mediante expresión celular en sistemas in vivo.
Una divulgación vención ofrece un procedimiento que comprende: (a) analizar la secuencia de una diana de ARN codificada por un gen diana; (b) sintetizar uno o más conjuntos de moléculas de ANic que tienen una secuencia complementaria a una o más regiones del ARN de (a); y (c) ensayar las moléculas de ANic de (b) en condiciones adecuadas para determinar dianas de iARN dentro de la secuencia de ARN diana. En una realización, las moléculas de ANic de (b) tienen cadenas de una longitud fija, por ejemplo de aproximadamente 23 nucleótidos de longitud. En otra realización, las moléculas de ANic de (b) son de longitud diferente, por ejemplo, tienen cadenas de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 (por ejemplo, aproximadamente 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25) nucleótidos de longitud. En una realización, el ensayo puede comprender un ensayo de ANic in vitro reconstituido como se ha descrito en el presente documento. En otra realización, el ensayo puede comprender un sistema de cultivo celular en el que se expresa ARN diana. Los fragmentos de ARN diana se analizan para determinar niveles detectables de escisión, por ejemplo, mediante electroforesis en gel, análisis de transferencia de Northern o ensayos de protección de ARNasa, para determinar el sitio o los sitios diana más adecuados dentro de la secuencia de ARN diana. La secuencia de ARN diana se puede obtener como se conoce en la técnica, por ejemplo, mediante clonación y/o transcripción para sistemas in vitro y mediante expresión en sistemas in vivo.
Por “sitio diana” se quiere significar una secuencia dentro de un ARN diana a la que se “dirige” la escisión mediada por una construcción de ANic que contiene secuencias dentro de su región antisentido que son complementarias a la secuencia diana.
Por “nivel detectable de escisión” se quiere significar la escisión de ARN diana (y formación de ARN de producto escindidos) en una medida suficiente para diferenciar los productos de escisión por encima del fondo de ARN producidos mediante degradación aleatoria del ARN diana. La producción de productos de escisión del 1-5% del ARN diana es suficiente para detectarse por encima del fondo para la mayoría de los procedimientos de detección.
En una realización, la invención presenta una composición que comprende una molécula de ANic de la invención, que está modificada químicamente, en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En otra realización, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende moléculas de ANic de la invención, que están
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modificadas químicamente, que se dirigen a uno o más genes en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Una divulgación ofrece un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad o afección en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición de la invención en condiciones adecuadas para el tratamiento o prevención de la enfermedad o afección en el sujeto, sólo o junto con uno o más compuestos terapéuticos distintos. En aún otra realización, la divulgación ofrece un procedimiento para reducir o evitar el rechazo de tejido en un sujeto que comprende administrar al sujeto una composición de la invención en condiciones adecuadas para la reducción o prevención del rechazo de tejido en el sujeto.
Una divulgación ofrece un procedimiento para validar una diana génica, que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANic de la invención, que puede estar modificada químicamente en la que una de las cadenas de ANic incluye una secuencia complementaria a ARN de un gen diana; (b) introducir la molécula de ANic en una célula, tejido u organismo en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen diana en la célula, tejido u organismo, y (c) determinar la función del gen ensayando cualquier cambio fenotípico en la célula, tejido u organismo.
Una divulgación ofrece un procedimiento para validar un gen diana que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANic de la invención, que puede estar modificada químicamente, en la que una de las cadenas de ANic incluye una secuencia complementaria al ARN de un gen diana; (b) introducir la molécula de ANic en un sistema biológico en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen diana en el sistema biológico; y (c) determinar la función del gen ensayando cualquier cambio fenotípico en el sistema biológico.
“Sistema biológico” significa un material, en una forma purificada o no purificada, a partir de fuentes biológicas, incluyendo aunque sin limitación fuentes humanas, animales, vegetales, de insecto, bacterianas, virales u otras, en las que el sistema comprende los componentes necesarios para la actividad de iARN. La expresión “sistema biológico” incluye, por ejemplo, una célula, tejido u organismo o extracto de los mismos. La expresión sistema biológico también incluye sistemas de iARN reconstituidos que se pueden usar en un entorno in vitro.
Por “cambio fenotípico” se quiere significar cualquier cambio detectable en una célula que se produce como respuesta al contacto o tratamiento con una molécula de ácido nucleico de la invención (por ejemplo, ANic). Tales cambios detectables incluyen, pero sin limitación, cambios en la forma, tamaño, proliferación, motilidad, expresión de proteína o expresión de ARN u otros cambios físicos o químicos según se pueden ensayar mediante procedimientos conocidos en la técnica. El cambio detectable también puede incluir expresión de genes/moléculas indicadoras tales como Proteína Verde Fluorescente (GFP) o diversas etiquetas que se usan para identificar una proteína expresada o cualquier otro componente celular que se pueda ensayar.
Una divulgación ofrece un kit que contiene una molécula de ANic de la invención, que puede estar modificada químicamente, que se puede usar para modular la expresión de un gen en una célula, tejido u organismo. Una divulgación presenta un kit que contiene más de una molécula de ANic de la invención, que puede estar modificada químicamente, que se puede usar para modular la expresión de más de un gen diana en una célula, tejido u organismo.
Una divulgación ofrece un kit que contiene una molécula de ANic de la invención, que puede estar modificada químicamente, que se puede usar para modular la expresión de un gen diana en un sistema biológico. Una divulgación presenta un kit que contiene más de una molécula de ANic de la invención, que puede estar modificada químicamente, que se puede usar para modular la expresión de más de un gen diana en un sistema biológico.
Una divulgación presenta una célula que contiene una o más moléculas de ANic de la invención, que pueden estar modificadas químicamente. En otra realización, la célula que contiene una molécula de ANic de la invención es una célula de mamífero. En otra realización más, la célula que contiene una molécula de ANic de la invención es una célula humana.
En una realización, la síntesis de una molécula de ANic de la invención, que está modificada químicamente, comprende: (a) síntesis de dos cadenas complementarias de la molécula de ANic; (b) hibridación de dos cadenas complementarias entre sí en condiciones adecuadas para obtener una molécula de ANic bicatenaria. En otra realización, la síntesis de las dos cadenas complementarias de la molécula de ANic es mediante síntesis de oligonucleótidos en fase sólida. En otra realización más, la síntesis de las dos cadenas complementarias de la molécula de ANic es mediante síntesis de oligonucleótidos en tándem en fase sólida.
Una divulgación ofrece un procedimiento para sintetizar una molécula de dúplex de ANic que comprende: (a) sintetizar una primera cadena de secuencia oligonucleotídica de la molécula de ANic, en la que la primera cadena de secuencia oligonucleotídica comprende una molécula de engarce escindible que se puede usar como un armazón para la síntesis de la segunda cadena de secuencia oligonucleotídica del ANic; (b) sintetizar la segunda cadena de secuencia oligonucleotídica de ANic en el armazón de la primera cadena de secuencia oligonucleotídica, en la que la segunda cadena de secuencia oligonucleotídica comprende además un resto
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químico que se puede usar para purificar el dúplex de ANic; (c) escindir la molécula de engarce de (a) en condiciones adecuadas para que las dos cadenas oligonucleotídicas de ANic se hibriden y formen un dúplex estable; y (d) purificar el dúplex de ANic utilizando el resto químico de la segunda cadena de secuencia oligonucleotídica. En una realización, la escisión de la molécula de engarce en (c) mencionada anteriormente tiene lugar durante la desprotección del oligonucleótido, por ejemplo en condiciones de hidrólisis usando una base de alquilamina tal como metilamina. En una realización, el procedimiento de síntesis comprende síntesis en fase sólida sobre un soporte sólido tal como vidrio de tamaño de poro controlado (CPG) o poliestireno, en el que la primera secuencia de (a) se sintetiza en un engarce escindible, tal como un engarce de succinilo, usando el soporte sólido como un armazón. El engarce escindible en (a) usado como un armazón para sintetizar la segunda cadena puede comprender reactividad similar a la del engarce derivatizado de soporte sólido, de forma que la escisión del engarce derivatizado de soporte sólido y el engarce escindible de (a) tiene lugar de forma conjunta. En otra realización, el resto químico de (b) que se puede usar para aislar la secuencia oligonucleotídica unida comprende un grupo tritilo, por ejemplo un grupo dimetoxitritilo, que se puede emplear en una estrategia de síntesis sobre tritilo como se describe en el presente documento. En otra realización más, el resto químico, tal como un grupo dimetoxitritilo, se elimina durante la purificación, por ejemplo, usando condiciones ácidas.
En una realización adicional, el procedimiento para la síntesis de ANic es una síntesis en fase de solución o síntesis en fase híbrida en la que ambas cadenas del dúplex de ANic se sintetizan en tándem usando un engarce escindible unido a la primera secuencia que actúa como un armazón para la síntesis de la segunda secuencia. La escisión del engarce en condiciones adecuadas para la hibridación de las cadenas de la secuencia de ANic separadas da como resultado la formación de la molécula de ANic bicatenaria.
Una divulgación ofrece un procedimiento para sintetizar una molécula de dúplex de ANic que comprende: (a) sintetizar una cadena de secuencia oligonucleotídica de la molécula de ANic, en la que la secuencia comprende una molécula de engarce escindible que se puede usar como un armazón para la síntesis de otra secuencia oligonucleotídica; (b) sintetizar una segunda secuencia oligonucleotídica que tiene complementariedad con la primera cadena de secuencia en el armazón de (a), en la que la segunda secuencia comprende la otra cadena de la molécula de ANic bicatenaria y en la que la segunda secuencia comprende además un resto químico que se puede usar para aislar la secuencia oligonucleotídica unida; (c) purificar el producto de (b) utilizando el resto químico de la segunda cadena de secuencia oligonucleotídica en condiciones adecuadas para aislar la secuencia de longitud completa, que comprende ambas cadenas oligonucleotídicas de ANic conectadas mediante el engarce escindible y en condiciones adecuadas para que las dos cadenas oligonucleotídicas de ANic se hibriden y formen un dúplex estable. En una realización, la escisión de la molécula de engarce en (c) mencionada anteriormente tiene lugar durante la desprotección del oligonucleótido, por ejemplo en condiciones de hidrólisis. En otra realización, la escisión de la molécula de engarce en (c) mencionada anteriormente tiene lugar después de la desprotección del oligonucleótido. En otra realización, el procedimiento de síntesis comprende la síntesis en fase sólida sobre un soporte sólido tal como vidrio de tamaño de poro controlado (CPG) o poliestireno, en la que la primera secuencia de (a) se sintetiza sobre un engarce escindible, tal como un engarce de succinilo, usando el soporte sólido como un armazón. El engarce escindible en (a) usado como un armazón para sintetizar la segunda cadena puede comprender una reactividad similar o una reactividad diferente a la del engarce derivatizado del soporte sólido, de forma que la escisión del engarce derivatizado del soporte sólido y el engarce escindible de (a) tiene lugar de forma conjunta o secuencial. En una realización, el resto químico de (b) que se puede usar para aislar la secuencia oligonucleotídica unida comprende un grupo tritilo, por ejemplo, un grupo dimetoxitritilo.
Una divulgación ofrece un procedimiento para preparar una molécula de ANic bicatenaria en un procedimiento sintético único que comprende: (a) sintetizar un oligonucleótido que tiene una primera y una segunda secuencia, en el que la primera secuencia es complementaria a la segunda secuencia y la primera secuencia oligonucleotídica está unida a la segunda secuencia a través de un engarce escindible y en el que un grupo protector 5'-terminal, por ejemplo, un grupo 5'-O-dimetoxitritilo (5'-O-DMT) permanece en el oligonucleótido que tiene la segunda secuencia; (b) desproteger el oligonucleótido mediante lo cual la desprotección da como resultado la escisión del engarce que une las dos secuencias oligonucleotídicas, y (c) purificar el producto de (b) en condiciones adecuadas para aislar la molécula de ANic bicatenaria, por ejemplo, usando una estrategia de síntesis sobre tritilo, como se describe en el presente documento.
En otra realización, el procedimiento de síntesis de moléculas de ANic de la invención comprende las enseñanzas de Scaringe y col., Patentes de los Estados Unidos N° 5.889.136; 6.008.400; y 6.111.086.
En una realización, la invención ofrece construcciones de ANic que median la iARN en una célula o sistema reconstruido, en las que la construcción de ANic comprende las modificaciones químicas como se definen por las reivindicaciones, y una o más modificaciones químicas adicionales, por ejemplo, una o más modificaciones químicas que tienen cualquiera de las Fórmulas I-VII o cualquier combinación de las mismas que aumente la resistencia a nucleasa de la construcción de ANic.
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Una divulgación ofrece un procedimiento para generar moléculas de ANic con resistencia aumentada a nucleasa que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las Fórmulas I-VII o cualquier combinación de las mismas en una molécula de ANic y (b) ensayar la molécula de ANic de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de ANic que tienen resistencia a nucleasa aumentada.
En una realización, la invención ofrece construcciones de ANic que median la iARN frente a un gen diana, en la que la construcción de ANic comprende las modificaciones químicas como se definen por las reivindicaciones, y una o más modificaciones químicas adicionales descritas en el presente documento que modulan la afinidad de unión entre las cadenas con sentido y antisentido de la construcción de ANic.
Una divulgación ofrece un procedimiento para generar moléculas de ANic con afinidad de unión aumentada entre las cadenas con sentido y antisentido de la molécula de ANic que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las Fórmulas I-VII o cualquier combinación de las mismas en una molécula de ANic y (b) ensayar la molécula de ANic de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de ANic que tienen afinidad de unión aumentada entre las cadenas con sentido y antisentido de la molécula de ANic.
En una realización, la invención ofrece construcciones de ANic que median la iARN en una célula o sistema reconstituido, en las que la construcción de ANic comprende las modificaciones químicas como se definen por las reivindicaciones, y una o más modificaciones químicas adicionales descritas en el presente documento que modulan la afinidad de unión entre la cadena antisentido de la construcción de ANic y una secuencia de ARN diana complementaria dentro de una célula.
En una realización, la invención ofrece construcciones de ANic que median la iARN en una célula o sistema reconstituido, en las que la construcción de ANic comprende las modificaciones químicas como se definen por las reivindicaciones, y una o más modificaciones químicas adicionales descritas en el presente documento que modulan la afinidad de unión entre la cadena antisentido de la construcción de ANic y una secuencia de ADN diana complementaria dentro de una célula.
Una divulgación ofrece un procedimiento para generar moléculas de ANic con afinidad de unión aumentada entre la cadena antisentido de la molécula de ANic y una secuencia diana de ARN complementaria que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las Fórmulas I-VII o cualquier combinación de las mismas en una molécula de ANic y (b) ensayar la molécula de ANic de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de ANic que tienen afinidad de unión aumentada entre la cadena antisentido de la molécula de ANic y una secuencia diana de ARN complementaria.
Una divulgación ofrece un procedimiento para generar moléculas de ANic con afinidad de unión aumentada entre la cadena antisentido de la molécula de ANic y una secuencia diana de ADN complementaria que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las Fórmulas I-VII o cualquier combinación de las mismas en una molécula de ANic y (b) ensayar la molécula de ANic de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de ANic que tienen afinidad de unión aumentada entre la cadena antisentido de la molécula de ANic y una secuencia diana de ADN complementaria.
En una realización, la invención ofrece construcciones de ANic que median la iARN en una célula o sistema reconstituido, en las que la construcción de ANic comprende las modificaciones químicas como se definen por las reivindicaciones, y una o más modificaciones químicas adicionales descritas en el presente documento que modulan la actividad polimerasa de una polimerasa celular capaz de generar moléculas de ANic endógenas adicionales que tienen homología de secuencia con la construcción de ANic modificada químicamente.
Una divulgación ofrece un procedimiento para generar moléculas de ANic capaces de mediar actividad de polimerasa aumentada de una polimerasa celular capaz de generar moléculas de ANic endógenas adicionales que tienen homología de secuencia con una molécula de ANic químicamente modificada que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las Fórmulas I-VII o cualquier combinación de las mismas en una molécula de ANic y (b) ensayar la molécula de ANic de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de ANic capaces de mediar actividad de polimerasa aumentada de una polimerasa celular capaz de generar moléculas de ANic endógenas adicionales que tienen homología de secuencia con una molécula de ANic químicamente modificada.
En una realización, la invención ofrece construcciones de ANic modificadas químicamente que median la iARN en una célula o sistema reconstituido, en las que las modificaciones químicas no afectan de forma significativa a la interacción de ANic con una molécula de ARN, molécula de ADN y/o proteínas u otros factores diana que son esenciales para la iARN de una manera que disminuiría la eficacia de la iARN mediada por tales construcciones de ANic.
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Una divulgación ofrece un procedimiento para generar moléculas de ANic con actividad de iARN mejorada, que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las Fórmulas I-VII o cualquier combinación de las mismas en una molécula de ANic y (b) ensayar la molécula de ANic de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de ANic con actividad de iARN mejorada.
En todavía otra realización, la divulgación ofrece un procedimiento para generar moléculas de ANic con actividad de iARN mejorada contra un ARN diana que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las Fórmulas I-VII o cualquier combinación de las mismas en una molécula de ANic y (b) ensayar la molécula de ANic de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de ANic con actividad de iARN mejorada contra el ARN diana.
En todavía otra realización, la divulgación ofrece un procedimiento para generar moléculas de ANic con actividad de iARN mejorada contra un ADN diana que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las Fórmulas I-VII o cualquier combinación de las mismas en una molécula de ANic y (b) ensayar la molécula de ANic de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de ANic con actividad de iARN mejorada contra el ADN diana, tal como un gen, un cromosoma o una porción del mismo.
En una realización, la invención ofrece construcciones de ANic como se definen en las reivindicaciones, que median la iARN en una célula o sistema reconstituido, en las que la construcción de ANic comprende una o más modificaciones descritas en el presente documento que modulan la captación celular de la construcción de ANic.
Una divulgación ofrece un procedimiento para generar moléculas de ANic contra un gen diana con captación celular mejorada que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las Fórmulas I-VII o cualquier combinación de las mismas en una molécula de ANic y (b) ensayar la molécula de ANic de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de ANic con captación celular mejorada.
En una realización, la invención ofrece construcciones de ANic que median la iARN frente a un gen diana, en las que la construcción de ANic comprende las modificaciones químicas como se definen por las reivindicaciones, y una o más modificaciones químicas adicionales descritas en el presente documento que aumentan la biodisponibilidad de la construcción de ANic, por ejemplo, uniendo conjugados poliméricos tales como polietilenglicol o conjugados equivalentes que mejoran la farmacocinética de la construcción de ANic, o uniendo conjugados que se dirigen a tipos tisulares o tipos celulares específicos in vivo. Se describen ejemplos no limitantes de tales conjugados por Vargeese y col., N° de Serie de los Estados Unidos 10/201.394.
Una divulgación ofrece un procedimiento para generar moléculas de ANic de la invención con una biodisponibilidad mejorada, que comprende (a) introducir un conjugado en la estructura de una molécula de ANic y (b) ensayar la molécula de ANic de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de ANic que tienen una biodisponibilidad mejorada. Tales conjugados pueden incluir ligandos para receptores celulares, tales como péptidos obtenidos a partir de ligandos de proteínas de origen natural; secuencias de localización de proteínas, incluyendo secuencias de código postal celular; anticuerpos, aptámeros de ácido nucleico; vitaminas y otros cofactores, tales como folato y N-acetilgalactosamina; polímeros, tales como polietilenglicol (PEG), fosfolípidos, poliaminas, tales como espermina o espermidina y otros.
Una divulgación ofrece un procedimiento para generar moléculas de ANic de la invención con una biodisponibilidad mejorada que comprende (a) introducir una formulación de excipiente en una molécula de ANic y (b) ensayar la molécula de ANic de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de ANic que tienen una biodisponibilidad mejorada. Tales excipientes incluyen polímeros tales como ciclodextrinas, lípidos, lípidos catiónicos, poliaminas, fosfolípidos y otros.
Una divulgación ofrece un procedimiento para generar moléculas de ANic de la invención con biodisponibilidad mejorada que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las Fórmulas I-VII o cualquier combinación de las mismas en una molécula de ANic y (b) ensayar la molécula de ANic de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de ANic que tienen biodisponibilidad mejorada.
En otra realización, se puede unir covalentemente polietilenglicol (PEG) a compuestos de ANic de la presente invención. El PEG unido puede ser de cualquier peso molecular, preferentemente de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 50.000 daltons (Da).
La presente invención se puede usar sola o como un componente de un kit que tenga al menos uno de los reactivos necesarios para llevar a cabo la introducción in vitro o in vivo de ARN para ensayar muestras y/o sujetos. Por ejemplo, los componentes preferidos del kit incluyen una molécula de ANic de la invención y un vehículo que promueve la introducción del ANic en células de interés como se describe en el presente documento (por ejemplo, usando lípidos y otros procedimientos de transfección conocidos en la técnica, véase por ejemplo Beigelman y col, documento US 6.395.713). El kit se puede usar para validación de diana, tal como para determinar la función y/o
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actividad génica o en la optimización de fármacos y en descubrimiento de fármacos (véase, por ejemplo Usman y col., USSN 60/402.996). Un kit de este tipo también puede incluir instrucciones para permitir a un usuario del kit poner en práctica la divulgación.
Las expresiones “ácido nucleico de interferencia corto”, “ANic”, “ARN de interferencia corto”, “ARNic”, “molécula de ácido nucleico de interferencia corto”, “molécula oligonucleotídica de interferencia corta” o “molécula de ácido nucleico de interferencia corto modificado químicamente”, como se usan en el presente documento, se refieren a cualquier molécula de ácido nucleico capaz de inhibir o regular negativamente la expresión génica o replicación viral, por ejemplo, por mediación de la interferencia de ARN “iARN” o el silenciamiento génico de una manera específica de secuencia; véase, por ejemplo Bass, 2001, Nature, 411, 428-429; Elbashir y col., 2001, Nature, 411, 494-498; y Kreutzer y col., Publicación Internacional PCT N° WO 00/44895; Zernicka-Goetz y col., Publicación Internacional PCT N° WO 01/36646; Fire, Publicación Internacional PCT N° WO 99/32619; Plaetinck y col., Publicación Internacional PCT N° WO 00/01846; Mello y Fire, Publicación Internacional PCT N° WO 01/29058; Deschamps-Depaillette, Publicación Internacional PCT N° WO 99/07409; y Li y col., Publicación Internacional PCT N° WO 00/44914; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe y col., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; y Hall y col., 2002, Science, 297, 2232-2237; Hutvagner y Zamore, 2002, Science, 297, 2056-60; McManus y col., 2002, RNA, 8, 842-850; Reinhart y col., 2002, Gene & Dev., 16, 1616-1626; y Reinhart y Bartel, 2002, Science, 297, 1831). Se muestran ejemplos no limitantes de moléculas de ANic de la invención en las Figuras 4-6, y las Tablas II, III y IV en el presente documento. Por ejemplo, el ANic puede ser una molécula polinucleotídica bicatenaria que comprende regiones con sentido y antisentido autocomplementarias, en la que la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico diana o una parte de la misma, y la región con sentido tiene una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico diana o una parte de la misma. El ANic se puede ensamblar a partir de dos oligonucleótidos separados, donde una cadena es la cadena con sentido y la otra es la cadena antisentido, en el que las cadenas antisentido y con sentido son autocomplementarias (es decir, cada cadena comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de la otra cadena; tal como donde la cadena antisentido y la cadena con sentido forman un dúplex o una estructura bicatenaria, por ejemplo, en la que la región bicatenaria tiene aproximadamente 19 pares de bases); la cadena antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico diana o una parte de la misma, y la cadena con sentido comprende una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico diana o una parte de la misma. Como alternativa, el ANic se ensambla a partir de un solo oligonucleótido, donde las regiones con sentido y antisentido autocomplementarias del ANic se unen por medio de un engarce o engarces basados en ácido nucleico o no basados en ácido nucleico. El ANic puede ser un polinucleótido con una estructura secundaria de horquilla, que tiene regiones con sentido y antisentido autocomplementarias, en el que la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico diana separada o una parte de la misma, y la región con sentido tiene una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de ácido nucleico diana o una parte de la misma. El ANic puede ser un polinucleótido monocatenario circular que tiene dos o más estructuras de bucle y un tallo que comprende regiones con sentido y antisentido autocomplementarias, en el que la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico diana o una parte de la misma, y la región con sentido tiene una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico diana o una parte de la misma, y en la que el polinucleótido circular se puede procesar in vivo o in vitro para generar una molécula de ANic activa capaz de mediar la iARN. El ANic también puede comprender un polinucleótido monocatenario que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico diana o una parte de la misma (por ejemplo, donde tal molécula de ANic no requiere la presencia dentro de la molécula de ANic de una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico diana o una parte de la misma), en el que el polinucleótido monocatenario puede comprender además un grupo fosfato terminal, tal como un 5'-fosfato (véase por ejemplo Martinez y col., 2002, Cell., 110, 563-574 y Schwarz y col., 2002, Molecular Cell, 10, 537-568), o un 5',3'-difosfato. En determinada realización, la molécula de ANic de la invención comprende secuencias o regiones con sentido y antisentido separadas, en la que las regiones con sentido y antisentido están unidas covalentemente por moléculas de engarce nucleotídicas o no nucleotídicas como se conocen en la técnica o están unidas no covalentemente, y de manera alternativa, mediante interacciones iónicas, puentes de hidrógeno, interacciones de van der waals, interacciones hidrófobas y/o interacciones de apilamiento. En determinadas realizaciones, las moléculas de ANic de la invención comprenden una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de un gen diana. En otra realización, la molécula de ANic de la invención interacciona con la secuencia de nucleótidos de un gen diana de una manera que provoca la inhibición de la expresión del gen diana. Como se usan en el presente documento, las moléculas de ANic no tienen que limitarse a aquellas moléculas que contienen sólo ARN, sino que además abarcan nucleótidos modificados químicamente y no nucleótidos. En determinadas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico de interferencia corto de la invención carecen de nucleótidos que contienen 2'-hidroxi (2'-OH). El presente solicitante describe en determinadas realizaciones ácidos nucleicos de interferencia cortos que no requieren la presencia de
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nucleótidos que tengan un grupo 2'-hidroxi para mediar la iARN y como tales, las moléculas de ácido nucleico de interferencia corto de la invención opcionalmente no incluyen ningún ribonucleótido (por ejemplo, nucleótidos que tienen un grupo 2'-OH). Tales moléculas de ANic que no requieren la presencia de ribonucleótidos dentro de la molécula de ANic para apoyar la iARN pueden, sin embargo, tener un engarce o engarces unidos u otros grupos, restos o cadenas unidos o asociados que contengan uno o más nucleótidos con grupos 2'-OH. Opcionalmente, las moléculas de ANic pueden comprender ribonucleótidos en aproximadamente el 5, 10, 20, 30, 40 o 50% de las posiciones de nucleótidos. Las moléculas de ácido nucleico de interferencia corto modificadas de la invención también se pueden denominar oligonucleótidos modificados de interferencia cortos “OMic”. Como se usa en el presente documento, el término ANic tiene por objeto ser equivalente a otros términos usados para describir moléculas de ácido nucleico que son capaces de mediar la iARN específica de secuencia, por ejemplo ARN de interferencia corto (ARNic), ARN bicatenario (ARNbc), micro-ARN (miARN), ARN de horquilla corto (ARNhc), oligonucleótido de interferencia corto, ácido nucleico de interferencia corto, oligonucleótido modificado de interferencia corto, ARNic modificado químicamente, ARN de silenciamiento génico postranscripcional (ARNsgpt) y otros. Adicionalmente, como se usa en el presente documento, el término iARN tiene por objeto ser equivalente a otros términos usados para describir interferencia de ARN específica de secuencia, tales como silenciamiento génico postranscripcional o epigenética. Por ejemplo, las moléculas de ANic de la invención se pueden usar para silenciar epigenéticamente genes a nivel tanto postranscripcional como a nivel pretranscripcional. En un ejemplo no limitante, la regulación epigenética de la expresión génica mediante moléculas de ANic de la invención se puede obtener como resultado a partir de la modificación mediada por ANic de la estructura de cromatina para alterar la expresión génica (véase, por ejemplo, Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe y col., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; y Hall y col., 2002, Science, 297, 2232-2237).
Por “modular" se quiere significar que la expresión del gen o el nivel de moléculas de ARN o moléculas de ARN equivalentes que codifican una o más proteínas o subunidades de proteína, o la actividad de una o más proteínas o subunidades de proteínas se regula positivamente o negativamente, de forma que la expresión, el nivel o la actividad es mayor que o menor que el observado en ausencia del modulador. Por ejemplo, el término “modular” puede significar “inhibir”, pero el uso de la palabra “modular” no está limitado a esta definición.
Por “inhibir" se quiere significar que la actividad de un producto de expresión génica o nivel de ARN o ARN equivalentes que codifican uno o más productos génicos se reduce por debajo del observado en ausencia de la molécula de ácido nucleico de la invención. En una realización, la inhibición con una molécula de ANic preferentemente está por debajo de ese nivel observado en presencia de una molécula inactiva o atenuada que no es capaz de mediar una respuesta de iARN. En otra realización, la inhibición de expresión génica con la molécula de ANic de la presente invención es mayor en presencia de la molécula de ANic que en su ausencia.
Por “inhibir”, “regular negativamente” o “reducir”, quieren significar que la expresión del gen o el nivel de moléculas de ARN o moléculas de ARN equivalentes que codifican una o más proteínas o subunidades de proteína, o la actividad de una o más proteínas o subunidades de proteínas, está reducida por debajo de la observada en ausencia de las moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, ANic) de la invención. En una realización, la inhibición, regulación negativa o reducción con una molécula de ANic es inferior a ese nivel observado en presencia de una molécula inactiva o atenuada. En otra realización, la inhibición, regulación negativa o reducción con moléculas de ANic es inferior a ese nivel observado en presencia de, por ejemplo, una molécula de ANic con secuencia desorganizada o con emparejamientos erróneos. En otra realización, la inhibición, regulación negativa o reducción de la expresión génica con una molécula de ácido nucleico de la presente invención es mayor en presencia de la molécula de ácido nucleico que en su ausencia.
Por “gen” o “gen diana” quieren significar un ácido nucleico que codifica un ARN, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico que incluyen, pero sin limitación, genes estructurales que codifican un polipéptido. El gen diana puede ser un gen obtenido a partir de una célula, un gen endógeno, un transgén o genes exógenos tales como genes de un patógeno, por ejemplo, un virus, que está presente en la célula después de la infección de la misma. La célula que contiene el gen diana se puede obtener a partir de o estar contenida en cualquier organismo, por ejemplo una planta, animal, protozoo, virus, bacteria u hongo. Los ejemplos no limitantes de plantas incluyen monocotiledóneas, dicotiledóneas o gimnospermas. Los ejemplos no limitantes de animales incluyen vertebrados o invertebrados. Los ejemplos no limitantes de hongos incluyen mohos o levaduras.
Por gen “endógeno” o “celular” quieren significar un gen que se encuentra normalmente en una célula en su localización natural en el genoma. Por ejemplo, HER-2, VEGF, VEGF-R, EGFR, BCL-2, c-MYC, RAS y similares se considerarían un gen endógeno. Los genes expresados en una célula a partir de un plásmido, vector viral u otros vectores o a partir de virus, bacterias, hongos se considerarían genes “extraños” o “heterólogos”; tales genes no se encuentran normalmente en la célula huésped, sino que se introducen mediante técnicas de transferencia génica convencionales o como resultado de una infección por un virus, bacteria u otro agente infeccioso.
Por “familia de genes" se quiere significar un grupo de más de una molécula de ácido nucleico que comparte al
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menos una característica común, tal como homología de secuencia, especificidad de diana, modo de acción, estructura secundaria o la capacidad de modular un proceso o más de un proceso en un sistema biológico. La familia de genes puede ser de origen viral o celular. La familia de genes puede codificar, por ejemplo, grupos de citocinas, receptores, factores de crecimiento, proteínas adaptadoras, proteínas estructurales y otros epítopos de proteína.
Por "familia de proteína" se quiere significar un grupo de más de una proteína, péptido o polipéptido que comparten al menos una característica común, tal como homología de secuencia, especificidad de diana, modo de acción, estructura secundaria o la capacidad de modular un proceso o más de un proceso en un sistema biológico. La familia de proteínas puede ser de origen viral o celular. La familia de proteínas puede codificar, por ejemplo, grupos de citocinas, receptores, factores de crecimiento, proteínas adaptadoras, proteínas estructurales y otros epítopos de proteínas.
Por “región de secuencia altamente conservada" se quiere significar una secuencia de nucleótidos de una o más regiones en un gen diana que no varía significativamente de una generación a la otra o de un sistema biológico al otro.
Por “cáncer" se quiere significar un grupo de enfermedades caracterizadas por un crecimiento y propagación descontrolada de células anormales.
“Región con sentido” significa una secuencia de nucleótidos de una molécula de ANic que tiene complementariedad con una región antisentido de la molécula de ANic. Adicionalmente, la región con sentido de una molécula de ANic puede comprender una secuencia de ácido nucleico que tiene homología con una secuencia de ácido nucleico diana.
Por “región antisentido" se quiere significar una secuencia de nucleótidos de una molécula de ANic que tiene complementariedad con una secuencia de ácido nucleico diana. Adicionalmente, la región antisentido de una molécula de ANic puede opcionalmente comprender una secuencia de ácido nucleico que tiene complementariedad con una región con sentido de la molécula de ANic.
Por “ácido nucleico diana" se quiere significar cualquier secuencia de ácido nucleico cuya expresión o actividad se tiene que modular. El ácido nucleico diana puede ser ADN o ARN.
Por “complementariedad" se quiere significar que un ácido nucleico puede formar un enlace o enlaces de hidrógeno con otra secuencia de ácido nucleico mediante Watson-Crick tradicional u otros tipos no tradicionales. En referencia a las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, la energía libre de unión para una molécula de ácido nucleico con su secuencia complementaria es suficiente para permitir que se desarrolle la función pertinente del ácido nucleico, por ejemplo, la actividad de iARN. La determinación de las energías libres de unión de moléculas de ácido nucleico se conoce bien en la técnica (véase, por ejemplo, Turner y col., 1987, CSH Symp. Quant. Biol. LII págs. 123-133; Frier y col., 1986, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83: 9373-9377; Turner y col., 1987, J. Am. Chem. Soc. 109: 3783-3785). Un porcentaje de complementariedad indica el porcentaje de restos contiguos en una molécula de ácido nucleico que pueden formar enlaces de hidrógeno (por ejemplo, emparejamiento de bases de Watson-Crick) con una segunda secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10 de 10 teniendo una complementariedad del 50%, 60%, 70%, 80%, 90% y 100%). “Perfectamente complementario” significa que todos los restos contiguos de una secuencia de ácido nucleico se unirán mediante enlaces de hidrógeno con el mismo número de restos contiguos en una segunda secuencia de ácido nucleico.
Las moléculas de ANic de la invención reofrecen un enfoque terapéutico novedoso para una amplia variedad de enfermedades y afecciones, incluyendo cáncer o enfermedad cancerosa, enfermedad infecciosa, enfermedad cardiovascular, enfermedad neurológica, enfermedad priónica, enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmune, enfermedad pulmonar, enfermedad renal, enfermedad hepática, enfermedad mitocondrial, enfermedad endocrina, enfermedades y afecciones relacionadas con la reproducción y cualquier otro indicio que pueda responder al nivel de un producto génico expresado en una célula u organismo.
En la presente invención, cada secuencia de una molécula de ANic de la invención tiene independientemente de aproximadamente 18 a aproximadamente 24 nucleótidos de longitud, en realizaciones específicas aproximadamente 18, 19, 20, 21, 22, 23 ó 24 nucleótidos de longitud. En otra realización, los dúplex de ANic de la invención comprenden independientemente de aproximadamente 17 a aproximadamente 23 pares de bases (por ejemplo, aproximadamente 17, 18, 19, 20, 21, 22 ó 23). En otra realización más, las moléculas de ANic de la invención que comprenden estructuras de horquilla o circulares tienen de aproximadamente 35 a aproximadamente 55 (por ejemplo, aproximadamente 35, 40, 45, 50 ó 55) nucleótidos de longitud o de aproximadamente 38 a aproximadamente 44 (por ejemplo, 38, 39, 40, 41, 42, 43 ó 44) nucleótidos de longitud y comprenden de aproximadamente 16 a aproximadamente 22 (por ejemplo, aproximadamente 16, 17, 18, 19, 20, 21 ó 22) pares de bases. Se muestran moléculas de ANic ilustrativas de la invención en la Tabla II. Se muestran moléculas de ANic
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sintéticas ilustrativas de la invención en la Tabla I y/o en las Figuras 18-19.
Como se usa en el presente documento, “célula” se usa en su sentido biológico habitual y no se refiere a un organismo multicelular completo, por ejemplo, no se refiere específicamente a un ser humano. La célula puede estar presente como un organismo, por ejemplo, aves, plantas y mamíferos tales como seres humanos, vacas, ovejas, simios, monos, cerdos, perros y gatos. La célula puede ser procariota o eucariota (por ejemplo, célula de mamífero o vegetal). La célula puede ser de origen somático o de línea germinal, totipotente o pluripotente, con capacidad de división o sin capacidad de división. La célula también se puede obtener a partir de o puede comprender un gameto o un embrión, una célula madre, o una célula completamente diferenciada.
Las moléculas de ANic de la invención se añaden directamente, o pueden formar complejos con lípidos catiónicos, empaquetarse dentro de liposomas o suministrarse de otra manera a células o tejidos diana. El ácido nucleico o los complejos de ácido nucleico se pueden administrar localmente a los tejidos pertinentes ex vivo o in vivo a través de inyección, bomba de infusión o endoprótesis vascular, estando o no presentes su incorporación en biopolímeros. En realizaciones particulares, las moléculas de ácido nucleico de la invención comprenden secuencias mostradas en las Tablas I-II y/o en las Figuras 18-19. Los ejemplos de tales moléculas de ácido nucleico consisten básicamente en secuencias definidas en estas tablas y figuras. Adicionalmente, las construcciones modificadas químicamente descritas en la Tabla IV se pueden aplicar a cualquier secuencia de ANic de la invención.
La divulgación también proporciona células de mamífero que contienen una o más moléculas de ANic de la presente invención. La una o más moléculas de ANic pueden dirigirse independientemente al mismo sitio o a sitios diferentes.
Por “ARN" se quiere significar una molécula que comprende al menos un resto de ribonucleótido. “Ribonucleótido” significa un nucleótido con un grupo hidroxilo en la posición 2' de un resto de p-D-ribofuranosa. Los términos incluyen ARN bicatenario, ARN monocatenario, ARN aislado tal como ARN purificado parcialmente, ARN esencialmente puro, ARN sintético, ARN producido de forma recombinante, así como ARN alterado que difiere del ARN de origen natural por la adición, deleción, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Tales alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como al extremo o extremos del ANic o internamente, por ejemplo en uno o más nucleótidos del ARN. Los nucleótidos en las moléculas de ARN de la presente invención también pueden comprender nucleótidos no convencionales, tales como nucleótidos de origen no natural o nucleótidos o desoxinucleótidos sintetizados químicamente. Estos ARN alterados se pueden denominar análogos o análogos de ARN de origen natural.
Por “sujeto" se quiere significar un organismo, que es un donante o receptor de células explantadas o las propias células. “Sujeto” también se refiere a un organismo al que se pueden administrar las moléculas de ácido nucleico de la invención. En una realización, un sujeto es un mamífero o células de mamífero. En otra realización, un sujeto es un ser humano o células humanas.
El término “fosforotioato”, como se usa en el presente documento, se refiere a un enlace internucleotídico que tiene la Fórmula I, en el que Z y/o W comprenden un átomo de azufre. De esta manera, el término fosforotioato se refiere a enlaces internucleotídicos tanto de fosforotioato como de fosforoditioato.
La expresión “base universal”, como se usa en el presente documento, se refiere a análogos de bases de nucleótidos que forman pares de bases con cada una de las bases de ADN/ARN naturales con escasa discriminación entre las mismas. Los ejemplos no limitantes de bases universales incluyen C-fenilo, C-naftilo y otros derivados aromáticos, inosina, azol carboxamidas y derivados de nitroazol tales como 3-nitropirrol, 4- nitroindol, 5-nitroindol y 6-nitroindol como se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Loakes, 2001, Nucleic Acids Research, 29, 2437-2447).
La expresión “nucleótido acíclico” como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier nucleótido que tiene un azúcar de ribosa acíclica, por ejemplo, donde cualquiera de los carbonos de ribosa (C1, C2, C3, C4 o C5) están ausentes del nucleótido independientemente o en combinación.
Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, individualmente, o en combinación o junto con otros fármacos, se pueden usar para tratar enfermedades o afecciones analizadas en el presente documento. Por ejemplo, para tratar una enfermedad o afección particular, las moléculas de ANic se pueden administrar a un sujeto o se pueden administrar a otras células apropiadas evidentes para los expertos en la materia, individualmente o en combinación con uno o más fármacos en condiciones adecuadas para el tratamiento.
En una realización adicional, las moléculas de ANic se pueden usar en combinación con otros tratamientos conocidos para tratar afecciones o enfermedades analizadas anteriormente. Por ejemplo, las moléculas descritas se podrían usar en combinación con uno o más agentes terapéuticos para tratar una enfermedad o afección. Los
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ejemplos no limitantes de otros agentes terapéuticos que se pueden combinar fácilmente con una molécula de ANic de la invención son moléculas de ácido nucleico enzimáticas, moléculas de ácido nucleico alostéricas, moléculas de ácido nucleico antisentido, señuelo o aptámero, anticuerpos tales como anticuerpos monoclonales, moléculas pequeñas y otros compuestos orgánicos y/o inorgánicos incluyendo metales, sales e iones.
Una divulgación ofrece un vector de expresión que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica al menos una molécula de ANic de la invención, de una manera que permite la expresión de la molécula de ANic. Por ejemplo, el vector puede contener secuencia o secuencias que codifican ambas cadenas de una molécula de ANic que comprenden un dúplex. El vector también puede contener secuencia o secuencias que codifican una molécula de ácido nucleico sencilla que es autocomplementaria y de esta manera forma una molécula de ANic. Los ejemplos no limitantes de dichos vectores de expresión se describen en Paul y col., 2002, Nature Biotechnology, 19, 500; y Novina y col., 2002, Nature Medicine, avance de publicación en línea doi:10,1038/nm725.
Una divulgación presenta una célula de mamífero, por ejemplo, una célula humana, que incluye un vector de expresión de la invención.
En todavía otra realización, el vector de expresión de la divulgación comprende una secuencia para una molécula de ARNic que tiene complementariedad a una molécula de ARN denominada con un número de Acceso de Genbank en la Tabla III.
En todavía otra realización, el vector de expresión de la divulgación comprende una secuencia para una molécula de ARNic que tiene complementariedad a una molécula de ARN denominada con un número de Acceso de Genbank, por ejemplo los Números de Acceso de Genbank mostrados en la Tabla I.
En una realización, un vector de expresión de la divulgación comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica dos o más moléculas de ANic, que pueden ser la misma o diferentes.
En otro aspecto de la divulgación, las moléculas de ARNic que interaccionan con moléculas de ARN diana y regulan negativamente moléculas de ARN diana que codifican genes (por ejemplo, moléculas de ARN diana a las que se hace referencia mediante el número de Acceso de Genbank en la Tabla III) se expresan a partir de unidades de transcripción insertadas en vectores de ADN o ARN. Los vectores recombinantes pueden ser vectores de ADN plasmídicos o virales. Los vectores virales que expresan ANic se pueden construir en base a, pero sin limitación, virus adenoasociados, retrovirus, adenovirus o alfavirus. Los vectores recombinantes capaces de expresar las moléculas de ANic se pueden suministrar como se ha descrito en el presente documento y persistir en células diana. Como alternativa, se pueden usar vectores virales que proporcionan la expresión transitoria de moléculas de ANic. Tales vectores se pueden administrar repetidamente según sea necesario. Una vez expresadas, las moléculas de ANic se unen y regulan negativamente la función génica o la expresión a través de interferencia de ARN (iARN). El suministro de vectores de expresión de ANic puede ser sistémico, tal como mediante administración intravenosa o intramuscular, mediante administración a células diana sometidas a explante a partir de un sujeto, seguida de la reintroducción en el sujeto, o mediante cualquier otro medio que permitiera la introducción en la célula diana deseada.
Por “vectores” quiere significar cualquier técnica basada en ácido nucleico y/o en virus para suministrar un ácido nucleico deseado.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción de las realizaciones preferidas de la misma, y a partir de las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra un ejemplo no limitante de un esquema para la síntesis de moléculas de ANic. Las cadenas de secuencia de ANic complementarias, cadena 1 y cadena 2, se sintetizan en tándem y están conectadas por un enlace escindible, tal como un succinato de nucleótido o un succinato abásico, que puede ser el mismo o diferente del engarce escindible usado para la síntesis en fase sólida sobre un soporte sólido. La síntesis puede ser en fase sólida o en fase de solución, en el ejemplo mostrado, la síntesis es una síntesis en fase sólida. La síntesis se realiza de manera que un grupo protector, tal como un grupo dimetoxitritilo, permanece intacto sobre el nucleótido terminal del oligonucleótido en tándem. Después de la escisión y desprotección del oligonucleótido, las dos cadenas de ANic hibridan espontáneamente para formar un dúplex de ANic, que permite la purificación del dúplex utilizando las propiedades del grupo protector terminal, por ejemplo aplicando un procedimiento de purificación sobre tritilo en el que solamente se aíslan los dúplex/oligonucleótidos con el grupo protector terminal.
La Figura 2 muestra un espectro de masas MALDI-TOV de un dúplex de ANic purificado sintetizado por un procedimiento de la divulgación. Los dos picos mostrados corresponden a la masa esperada de las cadenas de
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secuencia de ANic separadas. Este resultado demuestra que el dúplex de ANic generado a partir de la síntesis en tándem puede purificarse como una sola entidad usando una metodología de purificación sobre tritilo simple.
La Figura 3 muestra los resultados de un ensayo de estabilidad usado para determinar la estabilidad en suero de las construcciones de ANic químicamente modificadas en comparación con un control de ANic que consiste en todo el ARN con terminaciones 3'-TT. Se muestran los valores de T A para la estabilidad del dúplex.
La Figura 4 muestra los resultados de una exploración de la actividad de iARN de construcciones de ANic modificadas con fosforotioato usando un sistema indicador de luciferasa.
La Figura 5 muestra los resultados de una exploración de la actividad de iARN de construcciones de ANic modificadas con fosforotioato y una base universal usando un sistema indicador de luciferasa.
La Figura 6 muestra los resultados de una exploración de la actividad de iARN de construcciones de ANic modificadas con 2'-O-metilo usando un sistema indicador de luciferasa.
La Figura 7 muestra los resultados de una exploración de la actividad de iARN de construcciones de ANic modificadas con 2'-O-metilo y 2'-desoxi-2'-fluoro usando un sistema indicador de luciferasa.
La Figura 8 muestra los resultados de una exploración de la actividad de iARN de una construcción de ANic modificada con fosforotioato usando un sistema indicador de luciferasa.
La Figura 9 muestra los resultados de una exploración de la actividad de iARN de una construcción de ANic con modificaciones abásicas desoxi invertidas generada mediante síntesis en tándem usando un sistema indicador de luciferasa.
La Figura 10 muestra el resultado de una exploración de la actividad de iARN de construcciones de ANic químicamente modificadas que incluyen construcciones de ANic modificadas con 3'-glicerilo en comparación con una construcción de ANic de control todo de ARN usando un sistema indicador de luciferasa. Estos ANic químicamente modificados se compararon en el ensayo de luciferasa descrito en el presente documento a una concentración 1 nM y 10 nM usando un control de ANic todo de ARN (siGL2) que tiene ditimidina (TT) 3'- terminal y su correspondiente control invertido (Inv siGL2). El nivel de fondo de la expresión de luciferasa en células HeLa se indica por la columna “células”. Las cadenas con sentido y antisentido de construcciones de ANic químicamente modificadas se muestran mediante el número RPI (cadena con sentido/cadena antisentido). Las secuencias correspondientes a estos números RPI se muestran en la Tabla I.
La Figura 11 muestra los resultados de una exploración de la actividad de iARN de construcciones de ANic químicamente modificadas. La exploración comparó diversas combinaciones de modificaciones químicas de cadenas con sentido y modificaciones químicas de cadenas antisentido. Estos ANic químicamente modificados se compararon en el ensayo de luciferasa descrito en el presente documento a una concentración de 1 nM y 10 nM usando un control de ANic todo de ARN (siGL2) que tiene ditimidina (TT) 3'-terminal y su correspondiente control invertido (Inv siGL2). El nivel de fondo de la expresión de luciferasa en las células HeLa se indica
mediante la columna “células”. Las cadenas con sentido y antisentido de las construcciones de ANic
químicamente modificadas se muestran por el número RPI (cadena con sentido/cadena antisentido). Las secuencias correspondientes a estos números RPI se muestran en la Tabla I.
La Figura 12 muestra los resultados de una exploración de la actividad de iARN de construcciones de ANic químicamente modificadas. La exploración comparó diversas combinaciones de modificaciones químicas de cadenas con sentido y modificaciones químicas de cadenas antisentido. Estos ANic químicamente modificados se compararon en el ensayo de luciferasa descrito en el presente documento a una concentración de 1 nM y 10 nM usando un control de ANic todo de ARN (siGL2) que tiene ditimidina (TT) 3'-terminal y su correspondiente control invertido (Inv siGL2). El nivel de fondo de la expresión de luciferasa en las células HeLa se indica
mediante la columna “células”. Las cadenas con sentido y antisentido de las construcciones de ANic
químicamente modificadas se muestran por el número RPI (cadena con sentido/cadena antisentido). Las secuencias correspondientes a estos números RPI se muestran en la Tabla I. Además, la cadena antisentido en solitario (RPI 30430) y un control invertido (RPI 30227/30229, que tiene la misma química que RPI 30063/30224) se comparó con los dúplex de ANic descritos anteriormente.
La Figura 13 muestra los resultados de una exploración de la actividad de iARN de construcciones de ANic químicamente modificadas. La exploración comparó diversas combinaciones de modificaciones químicas de cadenas con sentido y modificaciones químicas de cadenas antisentido. Estos ANic químicamente modificados se compararon en el ensayo de luciferasa descrito en el presente documento a una concentración de 1 nM y 10 nM usando un control de ANic todo de ARN (siGL2) que tiene ditimidina (TT) 3'-terminal y su correspondiente
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control invertido (Inv siGL2). El nivel de fondo de la expresión de luciferasa en las células HeLa se indica por la columna “células”. Las cadenas con sentido y antisentido de las construcciones de ANic químicamente modificadas se muestran por el número RPI (cadena con sentido/cadena antisentido). Las secuencias correspondientes a estos números RPI se muestran en la Tabla I. Además, un control invertido (RPI 30226/30229, que tiene la misma química que RPI 30222/30224) se comparó con los dúplex de ANic descritos anteriormente.
La Figura 14 muestra los resultados de una exploración de la actividad de iARN de construcciones de ANic químicamente modificadas que incluyen diversas construcciones de ANic modificadas en posición 3'-terminal en comparación con una construcción de ANic de control toda de ARN usando un sistema indicador de luciferasa. Estos ANic químicamente modificados se compararon en el ensayo de luciferasa descrito en el presente documento a una concentración de 1 nM y 10 nM usando un control de ANic todo de ARN (siGL2) que tiene ditimidina (TT) 3'-terminal y su correspondiente control invertido (Inv siGL2). El nivel de fondo de la expresión de luciferasa en las células HeLa se indica mediante la columna “células”. Las cadenas con sentido y antisentido de las construcciones de ANic químicamente modificadas se muestran por el número RPI (cadena con sentido/cadena antisentido). Las secuencias correspondientes a estos números RPI se muestran en la Tabla I.
La Figura 15 muestra los resultados de una exploración de la actividad de iARN de construcciones de ANic químicamente modificadas. La exploración comparó diversas combinaciones de química de cadena con sentido en comparación con una química de cadena antisentido fija. Estos ANic químicamente modificados se compararon en el ensayo de luciferasa descrito en el presente documento a una concentración de 1 nM y 10 nM usando un control de ANic todo de ARN (siGL2) que tiene ditimidina (TT) 3'-terminal y su correspondiente control invertido (Inv siGL2). El nivel de fondo de la expresión de luciferasa en las células HeLa se indica mediante la columna “células”. Las cadenas con sentido y antisentido de las construcciones de ANic químicamente modificadas se muestran por el número RPI (cadena con sentido/cadena antisentido). Las secuencias correspondientes a estos números RPI se muestran en la Tabla I.
La Figura 16 muestra los resultados de un estudio de titulación de ANic, en el que la actividad de iARN de una construcción de ANic modificada con fosforotioato se compara con la de una construcción de ANic que consiste en todo ribonucleótidos excepto por dos restos timidina terminales usando un sistema indicador de luciferasa.
La Figura 17 muestra una representación mecanística propuesta no limitante de la degradación del ARN diana implicado en la iARN. El ARN bicatenario (ARNbc), que se genera por la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP) a partir de ARN monocatenario extraño, por ejemplo ARN viral, transponible u otro ARN exógeno, activa la enzima DICER que a su vez genera dúplex de ANic. De manera alternativa, el ANic sintético o expresado puede introducirse directamente en una célula por medios apropiados. Se forma un complejo de ANic activo que reconoce un ARN diana, dando como resultado la degradación del ARN diana por el complejo de endonucleasa RISC o en la síntesis de ARN adicional mediante la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP), que puede activar DICER y dar como resultado moléculas de ANic adicionales, amplificando por lo tanto la respuesta de iARN.
La Figura 18A-F muestra ejemplos no limitantes de construcciones de ANic químicamente modificadas de la presente invención. En la Figura, N representa cualquier nucleótido (adenosina, guanosina, citosina, uridina u opcionalmente timidina, por ejemplo la timidina puede sustituirse en las regiones salientes indicadas entre paréntesis (N N). Se muestran diversas modificaciones para las cadenas con sentido y antisentido de las construcciones de ANic.
Figura 18A: La cadena con sentido comprende 21 nucleótidos que tienen cuatro enlaces internucleotídicos fosforotioato 5'- y 3'-terminales, en la que los dos nucleótidos 3'-terminales están opcionalmente formando pares de bases y en la que todos los nucleótidos de pirimidina que puedan estar presentes son nucleótidos modificados con 2'-O-metilo o 2'-desoxi-2'-fluoro excepto por los (N N) nucleótidos, que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales u otras modificaciones químicas descritas en el presente documento. La cadena antisentido comprende 21 nucleótidos, que opcionalmente tienen un resto glicerilo 3'- terminal y en la que los dos nucleótidos 3'-terminales son opcionalmente complementarios a la secuencia de ARN diana, y que tienen un enlace internucleotídico de fosforotioato 3'-terminal y cuatro enlaces internucleotídicos de fosforotioato 5'-terminales, y en la que todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados con 2'-desoxi-2'-fluoro excepto por los (N N) nucleótidos, que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales u otras modificaciones descritas en el presente documento.
Figura 18B: La cadena con sentido comprende 21 nucleótidos en los que los dos nucleótidos 3'-terminales están opcionalmente formando pares de bases y en la que todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar
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presentes son nucleótidos modificados con 2'-O-metilo o 2'-desoxi-2'-fluoro excepto por los (N N) nucleótidos, que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales u otras modificaciones químicas descritas en el presente documento. La cadena antisentido comprende 21 nucleótidos, que opcionalmente tienen un resto glicerilo 3-terminal y en la que los dos nucleótidos 3-terminales son opcionalmente complementarios a la secuencia de ARN diana, y en la que todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados con 2'-desoxi-2'-fluoro excepto por los (N N) nucleótidos, que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales u otras modificaciones químicas descritas en el presente documento.
Figura 18C: La cadena con sentido comprende 21 nucleótidos que tienen restos protectores 5'- y 3'-terminales, en la que los dos nucleótidos 3'-terminales están opcionalmente formando pares de bases y en la que todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados con 2'-O-metilo o 2'-desoxi- 2'-fluoro excepto por los (N N) nucleótidos, que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales u otras modificaciones químicas descritas en el presente documento. La cadena antisentido comprende 21 nucleótidos, que tiene opcionalmente un resto glicerilo 3'-terminal y, en la que los dos nucleótidos 3'-terminales son opcionalmente complementarios con la secuencia de ARN diana, y que tiene un enlace internucleotídico de fosforotioato 3'-terminal, y en la que todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados con 2'-desoxi-2'-fluoro excepto por los (N N) nucleótidos, que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales u otras modificaciones químicas descritas en el presente documento.
Figura 18D: La cadena con sentido comprende 21 nucleótidos que tienen restos protectores 5'- y 3'-terminales, en la que los dos nucleótidos 3'-terminales están opcionalmente formando pares de bases y en la que todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados con 2'-desoxi-2'-fluoro excepto por los (N N) nucleótidos, que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales u otras modificaciones químicas descritas en el presente documento, y en la que todos los nucleótidos de purina que pueden estar presentes son 2'-desoxi nucleótidos. La cadena antisentido comprende 21 nucleótidos, que opcionalmente tiene un resto glicerilo 3'-terminal, y en la que los dos nucleótidos 3'- terminales son opcionalmente complementarios a la secuencia de ARN diana, y que tienen un enlace internucleotídico de fosforotioato 3'-terminal, y en la que todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados con 2'-desoxi-2'-fluoro y todos los nucleótidos de purina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados con 2'-O-metilo excepto por los (N N) nucleótidos, que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales u otras modificaciones químicas descritas en el presente documento.
Figura 18E: La cadena con sentido comprende 21 nucleótidos que tienen restos protectores 5'- y 3'-terminales en la que los dos nucleótidos 3'-terminales están opcionalmente formando pares de bases y en la que todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados con 2'-desoxi-2'-fluoro excepto por los (N N) nucleótidos, que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases
universales u otras modificaciones químicas descritas en el presente documento. La cadena antisentido comprende 21 nucleótidos, que opcionalmente tienen un resto glicerilo 3'-terminal y en la que los dos nucleótidos 3'-terminales son opcionalmente complementarios a la secuencia de ARN diana, y en la que todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados con 2'-desoxi-2'-fluoro y todos los nucleótidos de purina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados con 2'-O-metilo, excepto por los (N N) nucleótidos, que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases
universales u otras modificaciones químicas descritas en el presente documento.
Figura 18F: La cadena con sentido comprende 21 nucleótidos que tienen restos protectores 5'- y 3'-terminales en la que los dos nucleótidos 3'-terminales están opcionalmente formando pares de bases y en la que todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presente son nucleótidos modificados con 2'-desoxi-2'-fluoro excepto por los (N N) nucleótidos, que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases
universales u otras modificaciones químicas descritas en el presente documento. La cadena antisentido comprende 21 nucleótidos, que opcionalmente tienen un resto glicerilo 3'-terminal, y en la que los dos nucleótidos 3'-terminales son opcionalmente complementarios a la secuencia de ARN diana, y que tienen un enlace internucleotídico de fosforotioato 3'-terminal y en la que todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados con 2'-desoxi-2'-fluoro y todos los nucleótidos de purina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados con 2'-desoxi excepto por los (N N) nucleótidos, que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales u otras modificaciones químicas descritas en el presente documento. La cadena antisentido de las construcciones A-F comprende
complementariedad de secuencia con la secuencia de ARN diana de la presente invención.
La Figura 19 muestra ejemplos no limitantes de secuencias de ANic específicas químicamente modificadas de la presente invención. A-F aplica las modificaciones químicas descritas en las Figuras 18A-F a una secuencia
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de ANic representativa que se dirige a EGFR (HERI).
La Figura 20 muestra ejemplos no limitantes de diferentes construcciones de ANic de la presente invención. Los ejemplos mostrados (construcciones 1, 2 y 3) tienen 19 pares de bases representativas, sin embargo, las diferentes realizaciones de la invención incluyen cualquier número de pares de bases descrito en las reivindicaciones. Las regiones entre paréntesis representan salientes de nucleótidos, que comprenden por ejemplo entre aproximadamente 1, 2, 3 ó 4 nucleótidos de longitud, preferentemente aproximadamente 2 nucleótidos. Las construcciones 1 y 2 pueden usarse independiente para la actividad de iARN. La construcción 2 puede comprender un engarce polinucleotídico o no nucleotídico, que opcionalmente puede diseñarse como un engarce biodegradable. En una realización, la estructura en bucle mostrada en la construcción 2 puede comprender un engarce biodegradable que da como resultado la formación de la construcción 1 in vivo y/o in vitro. En otro ejemplo, la construcción 3 puede usarse para generar la construcción 2 de acuerdo con el mismo principio en el que se usa un engarce para generar la construcción 2 de ANic activo in vivo y/o in vitro, que opcionalmente puede utilizar otro engarce biodegradable para generar la construcción 1 de ANic activo in vivo y/o in vitro. Como tal, la estabilidad y/o actividad de las construcciones de ANic puede modularse en base al diseño de la construcción de ANic para su uso in vivo o in vitro y/o in vitro.
La Figura 21 es una representación esquemática de un procedimiento usado para determinar sitios diana para la iARN mediada por ANic dentro de una secuencia de ácido nucleico diana particular, tal como ARN mensajero. (A) Se sintetizan un conjunto de oligonucleótidos de ANic en los que la región antisentido de las construcciones de ANic tiene complementariedad con sitios diana en la secuencia de ácido nucleico diana, y en los que la región con sentido comprende una secuencia complementaria a la región antisentido del ANic. (B) Las secuencias se usan para transfectar células. (C) Las células se seleccionan en base a cambios fenotípicos que están asociados con la modulación de la secuencia de ácido nucleico diana. (D) El ANic se aísla a partir de las células seleccionadas y se secuencia para identificar sitios diana eficaces dentro de la secuencia de ácido nucleico diana.
Figura 22 muestra ejemplos no limitantes de diferentes químicas de estabilización (1-10) que pueden usarse, por ejemplo, para estabilizar el extremo 3' de secuencias de ANic de la presente invención, incluyendo (1) desoxirribosa [3-3']-invertida; (2) desoxirribonucleótido; (3) [5'-3']-3'-desoxirribonucleótido; (4) [5'-3']- ribonucleótido; (5) [5' -3']-3'-O-metil ribonucleótido; (6) 3'-glicerilo; (7) [3'-5']-3'-desoxirribonucleótido; (8) [3'-3']- desoxirribonucleótido; (9) [5'-2']-desoxirribonucleótido; y (10) [5-3]-desoxirribonucleótido. Además de las químicas de cadena principal modificadas y no modificadas indicadas en la Figura, estas químicas pueden combinarse con diferentes modificaciones de cadena principal como se describe en el presente documento, por ejemplo, modificaciones de cadena principal que tienen la Fórmula I. Además, el 2'-desoxi nucleótido que se muestra 5' a las modificaciones terminales puede ser otro nucleótido o no nucleótido modificado o no modificado descrito en el presente documento, por ejemplo, modificaciones que tienen cualquiera de las Fórmulas I-VII o cualquier combinación de las mismas.
La Figura 23 muestra un ejemplo no limitante de la inhibición mediada por ANic de la angiogénesis inducida por VEGF usando el modelo de angiogénesis corneal de rata. El sitio de dirección de ANic 2340 del ARN de VEGFR1 (mostrado como N° RPI de cadena con sentido/cadena antisentido) se comparó con controles invertidos (mostrados como N° RPI de cadena con sentido/cadena antisentido) a tres concentraciones diferentes y se comparó con un control de VEGF en el que no se administró ANic.
La Figura 24 muestra un ejemplo no limitante de una estrategia usada para identificar construcciones de ANic químicamente modificadas de la presente invención que sean resistentes a nucleasa, conservando al mismo tiempo la capacidad para mediar la actividad de iARN. Se introducen modificaciones químicas en la construcción de ANic en base a parámetros de diseño fundamentados (por ejemplo, introducción de modificaciones 2', modificaciones de bases, modificaciones de cadena principal, modificaciones de protección terminal, etc.). La construcción modificada se ensaya en un sistema apropiado (por ejemplo, suero humano para resistencia a nucleasa, mostrado, o un modelo animal para parámetros de PK/suministro). En paralelo, la construcción de ANic se ensaya para determinar la actividad de iARN, por ejemplo en un sistema de cultivo celular tal como un ensayo de indicador de luciferasa). Después se identifican las construcciones de ANic candidatas que poseen una característica particular manteniendo al mismo tiempo la actividad de iARN, y pueden modificarse adicionalmente y ensayarse una vez más. Puede usarse este mismo enfoque para identificar moléculas conjugadas con ANic con perfiles farmacocinéticos, suministro y actividad de iARN mejorados.
La Figura 25 muestra un ejemplo no limitante de la reducción del ARNm de HER2 en células A549 mediada por ANic modificados químicamente y basados en ARN que se dirigen a los sitios 2344 y 3706 del ARNm de HER2. Se transfectaron células A549 con 4 ug/ml de lípidos en complejo con ANic no modificados 25 nM con una protección de ditimidina 3'-terminal (RPI n° 28266/28267) o un control invertido correspondiente (RPI n°
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La Figura 26 muestra un ejemplo no limitante de la reducción del ARNm de PKC-alfa en células A549 mediada por ANic químicamente modificados que se dirigen al ARNm de PKC-alfa. Se transfectaron células A549 con 0,25 ug/pocillo de lípido en complejo con ANic 25 nM. Se comparó una exploración de construcciones de ANic que comprendían ribonucleótidos y protecciones de ditimidina 3'-terminales con células no tratadas, construcciones de control de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg. 2) y células transfectadas sólo con lípido (control de transfección). Como se muestra en la Figura, todas las construcciones de ANic mostraron una reducción significativa de la expresión de ARN de PKC-alfa.
La Figura 27 muestra un ejemplo no limitante de la reducción del ARNm de Myc (c-Myc) en células 293T mediada por los ANic químicamente modificados que se dirigen al ARNm de c-Myc. Se transfectaron células 293T con 0,25 ug/pocillo de lípido en complejo con ANic 25 nM. Se comparó una exploración de construcciones de ANic que comprendían ribonucleótidos y protecciones de ditimidina 3'-terminales con células no tratadas, construcciones de control de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg. 2) y células transfectadas sólo con lípido (control de transfección). Como se muestra en la Figura, tres de las construcciones de ANic (RPI 30993/31069; RPI 30995/31071 y RPI 30996/31072) mostraron una reducción significativa de la expresión del ARN de c-Myc.
La Figura 28 muestra un ejemplo no limitante de reducción del ARNm de BCL2 en células A549 mediada por ANic químicamente modificados que se dirigen al ARNm de BCL2. Se transfectaron células A549 con 0,25 ug/pocillo de lípido en complejo con ANic 25 nM. Se ensayó una construcción de ANic que comprendía ribonucleótidos y protecciones de ditimidina 3'-terminales (RPI n° 30998/3031074) junto con una construcción de ANic químicamente modificado que comprendía nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina y ribonucleótidos de purina, y en la que la cadena con sentido del ANic se modifica adicionalmente con protecciones abásicas desoxi invertidas 5'- y 3'-terminales y la cadena antisentido comprende un enlace internucleotídico de fosforotioato 3'-terminal (RPI n° 31368/31369) que también se comparó con un control invertido de la misma química (RPI n° 31370/31371) y una construcción de ANic químicamente modificada que comprende nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina y 2'-desoxi-2'-fluoro purina, en la que la cadena con sentido del ANic se modifica adicionalmente con protecciones abásicas desoxi invertidas 5'- y 3'-terminales y la cadena antisentido comprende un enlace internucleotídico de fosforotioato 3'-terminal (RPI n° 31372/31373) que también se comparó con un control invertido de la misma química (RPI n° 31374/31375). Además, las construcciones de ANic también se compararon con células no tratadas, células transfectadas con lípido y construcciones de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg. 2) y células transfectadas sólo con lípido (control de transfección). Como se muestra en la Figura, las construcciones de ANic muestran reducción significativa de la expresión del ARN de BCL2 en comparación con controles desorganizados, no tratados y de transfección.
La Figura 29 muestra un ejemplo no limitante de la reducción del ARNm de CHK-1 en células A549 mediada por ANic químicamente modificados que se dirigen al ARNm de CHK-1. Se transfectaron células A549 con 0,25 ug/pocillo de lípido en complejo con ANic 25 nM. Se comparó una construcción de ANic que comprendía ribonucleótidos y protecciones de ditimidina 3'-terminales (RPI n° 31003/31079) y una construcción de ANic químicamente modificada que comprendía nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina y ribonucleótidos de purina, en la que la cadena con sentido del ANic se modificó adicionalmente con protecciones abásicas desoxi invertidas 5'- y 3'-terminales y en el que la cadena antisentido comprendía un enlace internucleotídico de fosforotioato 3'-terminal (RPI n° 31302/31303), con un control invertido de la misma química (RPI n° 31314/31325). Además, las construcciones de ANic también se compararon con células no tratadas, células transfectadas con lípido y construcciones de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg. 2) y células transfectadas sólo con lípido (control de transfección). Como se muestra en la Figura, ambas construcciones de ANic mostraron una reducción significativa de la expresión del ARN de CHK-1 en comparación con controles apropiados.
La Figura 30 muestra un ejemplo no limitante de la reducción del ARNm de BACE en células A549 mediada por ANic que se dirigen al ARNm de BACE. Se transfectaron células A549 con 0,25 ug/pocillo de lípido en complejo con ANic 25 nM. Se comparó una exploración de construcciones de ANic que comprendían ribonucleótidos y protecciones de ditimidina 3'-terminales con células no tratadas, construcciones de control de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg. 2) y células transfectadas sólo con lípido (control de transfección). Como se muestra en la Figura, todas las construcciones de ANic muestran una reducción significativa de la expresión del ARN de BACE.
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La Figura 31 muestra un ejemplo no limitante de reducción del ARNm de ciclina D1 en células A549 mediada por ANic químicamente modificados que se dirigen al ARNm de la ciclina D1. Se transfectaron células A549 con 0,25 ug/pocillo de lípido en complejo con ANic 25 nM. Se comparó una construcción de ANic que comprendía ribonucleótidos y protecciones de ditimidina 3'-terminales (RPI n° 31009/31085) con una construcción de ANic químicamente modificada que comprendía nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina y ribonucleótidos de purina en los que la cadena con sentido del ANic se modificó adicionalmente con protecciones abásicas desoxi invertidas 5'- y 3'-terminales y la cadena antisentido comprendía un enlace internucleotídico de fosforotioato 3'-terminal (RPI n° 31304/31305) que también se comparó con un control invertido de la misma química (RPI n° 31316/31317). Además, las construcciones de ANic también se compararon con células no tratadas, células transfectadas con lípido y construcciones de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg. 2) y células transfectadas sólo con lípido (control de transfección). Como se muestra en la Figura, ambas construcciones de ANic muestran una reducción significativa de la expresión del ARN de ciclina D1.
La Figura 32 muestra un ejemplo no limitante de la reducción del ARNm de PTP-1B en células A549 mediada por ANic químicamente modificados que se dirigen al ARNm de PTP-1B. Se transfectaron células A549 con 0,25 ug/pocillo de lípido en complejo con ANic 25 nM. Se comparó una construcción de ANic que comprendía ribonucleótidos y protecciones de ditimidina 3'-terminales (RPI n° 31018/31307) con una construcción de ANic químicamente modificada que comprendía nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina y ribonucleótidos de purina en los que la cadena con sentido del ANic se modificó adicionalmente con protecciones abásicas desoxi invertidas 5'- y 3'-terminales y la cadena antisentido comprendía un enlace internucleotídico de fosforotioato 3'- terminal (RPI n° 31306/31307), que también se comparó con un control invertido de la misma química (RPI n° 31318/31319). Además, las construcciones de ANic también se compararon con células no tratadas, células transfectadas con lípido y construcciones de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg. 2) y células transfectadas sólo con lípido (control de transfección). Como se muestra en la Figura, ambas construcciones de ANic muestran una reducción significativa de la expresión del ARN de PTP-1B.
La Figura 33 muestra un ejemplo no limitante de la reducción del ARNm de ERG2 en células DLD1 mediada
por ANic que se dirigen al ARNm de ERG2. Se transfectaron células DLD1 con 0,25 ug/pocillo de lípido en
complejo con ANic 25 nM. Se comparó una exploración de construcciones de ANic que comprendían ribonucleótidos y protecciones de ditimidina 3'-terminales con células no tratadas, construcciones de control de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg. 2) y células transfectadas sólo con lípido (control de transfección). Como se muestra en la Figura, todas las construcciones de ANic muestran una reducción significativa de la expresión del ARN de ERG2.
La Figura 34 muestra un ejemplo no limitante de la reducción del ARNm de PCNA en células A549 mediada
por ANic químicamente modificados que se dirigen al ARNm de PCNA. Se transfectaron células A549 con 0,25
ug/pocillo de lípido en complejo con ANic 25 nM. Se comparó una construcción de ANic que comprendía ribonucleótidos y protecciones de ditimidina 3'-terminales (RPI n° 31035/31111) con una construcción de ANic químicamente modificada que comprendía nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina y ribonucleótidos de purina en los que la cadena con sentido del ANic se modificó adicionalmente con protecciones abásicas desoxi invertidas 5'- y 3'-terminales y la cadena antisentido comprendía un enlace internucleotídico de fosforotioato 3'- terminal (RPI n° 31310/31311), que también se comparó con un control invertido de la misma química (RPI n° 31322/31323). Además, también se compararon las construcciones de ANic con células no tratadas, células transfectadas con lípido y construcciones de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg. 2) y células transfectadas sólo con lípido (control de transfección). Como se muestra en la Figura, ambas construcciones de ANic mostraron una reducción significativa de la expresión del ARN de PCNA.
Descripción detallada de la presente invención
Mecanismo de Acción de las Moléculas de Ácido Nucleico de la Invención
La siguiente discusión analiza el mecanismo propuesto de interferencia de ARN mediada por ARN de interferencia corto como se conoce actualmente, y no tiene por objeto ser limitante ni es una admisión de técnica anterior. El solicitante demuestra en el presente documento que los ácidos nucleicos de interferencia cortos modificados químicamente poseen una capacidad similar o mejorada para mediar la iARN que las moléculas de ARNic, y se espera que posean una estabilidad y actividad mejoradas in vivo; por lo tanto, esta discusión no tiene por objeto limitarse únicamente al ARNic y se puede aplicar a los ANic en su totalidad. “Capacidad mejorada para mediar la iARN” o “actividad de iARN mejorada” tienen por objeto incluir la actividad de iARN medida in vitro y/o in vivo, donde la actividad de iARN es un reflejo tanto de la capacidad del ANic para mediar la iARN como de la estabilidad de los ANic de la invención. En la presente invención, el producto de estas actividades puede estar aumentado in vitro y/o in vivo en comparación con un ARNic todo de ARN o un ANic que contiene una pluralidad de ribonucleótidos. En algunos casos, la actividad o estabilidad de la molécula de ANic puede estar disminuida (es
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decir, menos de diez veces), pero la actividad global de la molécula de ANic está aumentada in vitro y/o in vivo.
La interferencia de ARN se refiere al procedimiento de silenciamiento génico postranscripcional específico de secuencia en animales mediado por ARN de interferencia cortos (ARNic) (Fire y col., 1998, Nature, 391, 806). El procedimiento correspondiente en plantas se denomina comúnmente silenciamiento génico postranscripcional o silenciamiento de ARN y también se hace referencia al mismo como supresión en hongos. El procedimiento de silenciamiento génico postranscripcional se cree que es un mecanismo de defensa celular conservado de manera evolutiva usado para evitar la expresión de genes extraños que comparten comúnmente flora y filos diversos (Fire y col., 1999, Trends Genet., 15, 358). Dicha protección frente a la expresión de genes extraños puede haber evolucionado como respuesta a la producción de ARN bicatenarios (ARNbc) derivados de una infección viral o de la integración aleatoria de elementos transponibles en un genoma huésped mediante una respuesta celular que destruye específicamente ARN monocatenario homólogo o ARN genómico viral. La presencia de ARNbc en células desencadena la respuesta de iARN a través de un mecanismo que aún tiene que caracterizarse completamente. Este mecanismo parece ser diferente de la respuesta de interferón que se produce como resultado de la activación mediada por ARNbc de la proteína quinasa PKR y 2',5'-oligoadenilato sintetasa, dando como resultado una escisión inespecífica del ARNm por la ribonucleasa L.
La presencia de ARNbc largos en células estimula la actividad de una enzima ribonucleasa III denominada Dicer. La Dicer está implicada en el procesamiento de los ARNbc en trozos cortos de ARNbc conocidos como ARN de interferencia cortos (ARNic) (Berstein y col., 2001, Nature, 409, 363). Los ARN de interferencia cortos derivados de la actividad de Dicer típicamente tienen de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleótidos de longitud y comprenden dúplex de aproximadamente 19 pares de bases. También se ha implicado a Dicer en la escisión de ARN temporales pequeños (ARNtp) de 21 y 22 nucleótidos a partir de ARN precursor de estructura conservada que están implicados en el control traduccional (Hutvagner y col., 2001, Science, 293, 834). La respuesta de iARN también presenta un complejo de endonucleasa, denominado comúnmente complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que media la escisión de ARN monocatenario que tiene una secuencia homóloga a la del ARNic. La escisión del ARN diana tiene lugar en el centro de la región complementaria a la secuencia de guía del dúplex de ARNic (Elbashir y col., 2001, Genes Dev., 15, 188). Además, la interferencia de ARN también puede implicar silenciamiento génico mediado por ARN pequeño (por ejemplo, micro-ARN o miARN), presumiblemente a través de mecanismos celulares que regulan la estructura de cromatina y de ese modo evitan la transcripción de secuencias génicas diana (véase, por ejemplo, Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe y col., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; y Hall y col., 2002, Science, 297, 2232-2237). Como tal, las moléculas de ANic de la presente invención se pueden usar para mediar el silenciamiento génico a través de la interacción con transcritos de ARN o, como alternativa, mediante la interacción con secuencias génicas particulares, en las que tal interacción da como resultado el silenciamiento génico a nivel transcripcional o a nivel postranscripcional.
La iARN se ha estudiado en una diversidad de sistemas. Fire y col., 1998, Nature, 391, 806, fueron los primeros en observar la iARN en C. elegans. Wianny y Goetz, 1999, Nature Cell Biol., 2, 70, describen la iARN mediada por ARNbc en embriones de ratón. Hammond y col., 2000, Nature, 404, 293, describen la iARN en células de Drosophila transfectadas con ARNbc. Elbashir y col., 2001, Nature, 411, 494, describen la iARN inducida introduciendo dúplex de ARN sintéticos de 21 nucleótidos en células de mamífero cultivadas incluyendo células embrionarias de riñón humano y células HeLa. Trabajos recientes en lisados embrionarios de Drosophila han revelado determinados requisitos de longitud, estructura, composición química y secuencia de ARNic que son esenciales para mediar una actividad de iARN eficaz. Estos estudios han demostrado que los dúplex de ARNic de 21 nucleótidos son más activos cuando contienen dos salientes dinucleotídicos 3'-terminales. Además, la sustitución completa de una o ambas cadenas de ARNic con nucleótidos 2'-desoxi o 2'-O-metilo suprime la actividad de iARN, mientras que se demostró que se toleraba la sustitución de los nucleótidos de ARNic 3'- terminales con nucleótidos desoxi. También se demostró que secuencias con un emparejamiento erróneo en el centro del dúplex de ARNic suprimían la actividad de iARN. Además, estos estudios también indican que la posición del sitio de escisión en el ARN diana está definida por el extremo 5' de la secuencia guía de ARNic en lugar del extremo 3' de la secuencia guía (Elbashir y col., 2001, EMBO J., 20, 6877). Otros estudios han indicado que es necesario un fosfato 5' en la cadena complementaria diana de un dúplex de ARNic para la actividad del ARNic y que, para mantener el resto fosfato 5' en el ARNic, se utiliza ATP (Nykanen y col., 2001, Cell, 107, 309).); sin embargo, las moléculas de ARNic que carecen de un fosfato 5' son activas cuando se introducen de forma exógena, sugiriendo que la fosforilación 5' de construcciones de ARNic puede ocurrir in vivo.
Síntesis de Moléculas de Ácido Nucleico
La síntesis de ácidos nucleicos de una longitud superior a 100 nucleótidos es difícil usando procedimientos automáticos y el coste terapéutico de dichas moléculas es prohibitivo. En la presente divulgación, en motivos de ácidos nucleicos pequeños, “pequeños” se refiere a motivos de ácido nucleico no superiores a 100 nucleótidos de longitud, preferentemente no superiores a 80 nucleótidos de longitud y, más preferentemente, no superiores a 50
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nucleótidos de longitud; por ejemplo, se usan preferentemente para suministro exógeno secuencias oligonucleotídicas de ANic individuales o secuencias de ANic sintetizados en tándem. La estructura simple de estas moléculas aumenta la capacidad del ácido nucleico para invadir regiones diana de estructura de ARN y/o proteína. Las moléculas ejemplares de la presente invención se sintetizan químicamente y otras pueden sintetizarse de manera similar.
Los oligonucleótidos (por ejemplo, determinados oligonucleótidos modificados o partes de oligonucleótidos que carecen de ribonucleótidos) se sintetizan usando protocolos conocidos en la técnica, por ejemplo como describen Caruthers y col., 1992, en Methods in Enzymology 211, 3-19, Thompson y col., en la Publicación Internacional PCT N° WO 99/54459, Wincott y col., 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684, Wincott y col., 1997, Methods Mol. Bio., 74, 59, Brennan y col., 1998, Biotechnol Bioeng., 61, 33-45, y Brennan, Patente de Estados Unidos N° 6.001.311. Todas estas referencias se incorporan en el presente documento por referencia. La síntesis de oligonucleótidos hace uso de grupos de protección y acoplamiento de ácidos nucleicos comunes, tales como dimetoxitritilo en el extremo 5' y fosforamiditas en el extremo 3'. En un ejemplo no limitante, se realizan síntesis a pequeña escala en un sintetizador 394 Applied Biosystems, Inc. usando un protocolo a escala 0,2 |imol con una etapa de acoplamiento de 2,5 min para nucleótidos 2'-O-metilados y una etapa de acoplamiento de 45 segundos para 2'-desoxi nucleótidos o 2'-desoxi-2'-fluoro nucleótidos. La Tabla II resume las cantidades y los tiempos de contacto de los reactivos usados en el ciclo de síntesis. De manera alternativa, pueden realizarse síntesis a escala 0,2 |imol en un sintetizador de placa de 96 pocillos, tal como el instrumento producido por Protogene (Palo Alto, CA) con una modificación mínima para el ciclo. Puede usarse un exceso de 33 veces (60 |il de 0,11 M = 6,6 |imol) de 2'-O-metil fosforamidita y un exceso de 105 veces de S-etil tetrazol (60 |il de 0,25 M = 15 |imol) en cada ciclo de acoplamiento de restos 2'-O-metilo con respecto al 5'-hidroxilo unido a polímero. Puede usarse un exceso de 22 veces (40 |il de 0,11 M = 4,4 |imol) de desoxi fosforamidita y un exceso de 70 veces de S-etil tetrazol (40 |il de 0,25 M = 10 |imol) en cada ciclo de acoplamiento de restos desoxi con respecto al 5' hidroxilo unido a polímero. Los rendimientos de acoplamiento promedio en el sintetizador 394 Applied Biosystems, Inc., determinados por cuantificación colorimétrica de las fracciones de tritilo, son típicamente del 97,5-99%. Otros reactivos de síntesis de oligonucleótidos para el sintetizador 394 Applied Biosystems, Inc. incluyen lo que se indica a continuación: la solución de destritilación es TCA al 3% en cloruro de metileno (ABI); la protección terminal se realiza con W-metil imidazol al 16% en THF (ABI) y anhídrido acético al 10%/2,6-lutidina al 10% en THF (ABI); y la solución de oxidación es I2 16,9 mM, piridina 49 mM, agua al 9% en THF (PERSEPTIVE™). Se usa acetonitrilo de Calidad de Síntesis de Burdick & Jackson directamente del frasco de reactivo. La solución de S-Etiltetrazol (0,25 M en acetonitrilo) se prepara a partir del sólido obtenido de American International Chemical, Inc. De manera alternativa, para la introducción de enlaces fosforotioato, se usa reactivo de Beaucage (1,1 -dióxido de 3H-1,2-Benzoditiol-3- ona, 0,05 M en acetonitrilo).
La desprotección de los oligonucleótidos basados en ADN se realiza de la siguiente manera: el oligorribonucleótido sobre tritilo unido a polímero se transfiere a un vial de vidrio con tapa de rosca de 4 ml y se suspende en una solución de metilamina acuosa al 40% (1 ml) a 65°C durante 10 minutos. Después de enfriar a -20°C, el sobrenadante se retira del soporte polimérico. El soporte se lava tres veces con 1,0 ml de EtOH:MeCN:H2O/3:1:1, se somete a agitación vorticial y después el sobrenadante se añade al primer sobrenadante. Los sobrenadantes combinados, que contienen el oligorribonucleótido, se secan para proporcionar un polvo blanco.
El procedimiento de síntesis usado para el ARN, incluyendo determinadas moléculas de ANic de la invención, sigue el procedimiento que se describe en Usman y col., 1987, J. Am. Chem. Soc, 109, 7845; Scaringe y col., 1990, Nucleic Acids Res., 18, 5433; y Wincott y col., 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684 Wincott y col., 1997, Methods Mol. Bio., 74, 59, y hace uso de grupos de protección y acoplamiento de ácidos nucleicos comunes tales como dimetoxitritilo en el extremo 5' y fosforamiditas en el extremo 3'. En un ejemplo no limitante, se realizan síntesis a pequeña escala en un sintetizador 394 Applied Biosystems, Inc. usando un protocolo a escala 0,2 |imol con una etapa de acoplamiento de 7,5 min para nucleótidos protegidos con alquilsililo y una etapa de acoplamiento de 2,5 minutos para nucleótidos 2'-O-metilados. La Tabla II resume las cantidades y los tiempos de contacto de los reactivos usados en el ciclo de síntesis. Como alternativa, la síntesis a escala 0,2 |imol puede realizarse en un sintetizador de placa de 96 pocillos, tal como el instrumento producido por Protogene (Palo Alto, CA) con una modificación mínima del ciclo. Puede usarse un exceso de 33 veces (60 |il de 0,11 M = 6,6 |imol) de 2'-O-metil fosforamidita y un exceso de 75 veces de S-etil tetrazol (60 |il de 0,25 M = 15 |imol) en cada ciclo de acoplamiento de restos 2'-O-metilo con respecto al 5'-hidroxilo unido a polímero. Puede usarse un exceso de 66 veces (120 |il de 0,11 M = 13,2 |imol) de fosforamidita (ribo) protegida con alquilisilo y un exceso de 150 veces de S-etil tetrazol (120 |il de 0,25 M = 30 |imol) en cada ciclo de acoplamiento de ribo-restos con respecto al 5'-hidroxilo unido a polímero. Los rendimientos de acoplamiento promedio en el sintetizador 394 Applied Biosystems, Inc., determinados por cuantificación colorimétrica de las fracciones de tritilo, son típicamente del 97,5-99%. Otros reactivos de síntesis de oligonucleótidos para el sintetizador 394 Applied Biosystems, Inc. incluyen lo que se indica a continuación: la solución de destritilación es TCA al 3% en cloruro de metileno (ABI); la protección terminal se realiza con W-metil imidazol al 16% en THF (ABI) y anhídrido acético al 10%/2,6-lutidina al 10% en THF (ABI); y la
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solución de oxidación es I2 16,9 mM, piridina 49 mM, agua al 9% en THE (PERSEPTIVE™). Se usa acetonitrilo de Calidad de Síntesis de Burdick & Jackson directamente del frasco de reactivo. La solución de S-Etiltetrazol (0,25 M en acetonitrilo) se prepara a partir del sólido obtenido de American International Chemical, Inc. De manera alternativa, para la introducción de enlaces fosforotioato, se usa reactivo de Beaucage (1,1 -dióxido de 3H-1,2- Benzoditiol-3-ona, 0,05 M en acetonitrilo).
La desprotección del ARN se realiza usando un protocolo de dos recipientes o de un recipiente. Para el protocolo de dos recipientes, el oligorribonucleótido sobre tritilo unido a polímero se transfiere a un vial de vidrio con tapa de rosca de 4 ml y se suspende en una solución de metilamina acuosa al 40% (1 ml) a 65°C durante 10 minutos. Después de enfriar a -20°C, el sobrenadante se retira del soporte polimérico. El soporte se lava tres veces con 1,0 ml de EtOH:MeCN:H2O/3:1:1, se somete a agitación vorticial y después el sobrenadante se añade al primer sobrenadante. Los sobrenadantes combinados, que contienen el oligorribonucleótido, se secan para proporcionar un polvo blanco. El oligorribonucleótido de base desprotegida se resuspende en solución de TEA/HF/NMP anhidra (300 |il de una solución de 1,5 ml de N-metilpirrolidinona, 750 |il de TEA y 1 ml de TEA^3HF para proporcionar una concentración de HF 1,4 M) y se calienta a 65°C. Después de 1,5 h, el oligómero se inactiva con NH4HCO31,5 M.
De manera alternativa, para el protocolo de un recipiente, el oligorribonucleótido sobre tritilo unido a polímero se transfiere a un vial de vidrio con tapa de rosca de 4 ml y se suspende en una solución de metilamina etanólica al 33%/DMSO: 1/1 (0,8 ml) a 65°C durante 15 min. El vial se lleva a temperatura ambiente (ta). Se añade TEA^3HF (0,1 ml) y el vial se calienta a 65°C durante 15 minutos. La muestra se enfría a -20°C y después se inactiva con NH4HCO31,5 M.
Para la purificación de los oligómeros sobre tritilo, la solución de NH4HCO3 inactivada se carga sobre un cartucho que contiene C-18 que se ha lavado previamente con acetonitrilo, seguido de TEAA 50 mM. Después de lavar con agua el cartucho cargado, el ARN se destritila con TFA al 0,5% durante 13 minutos. Después, se lava de nuevo el cartucho con agua, se realiza el intercambio salino con NaCl 1 M y se lava de nuevo con agua. Después, el oligonucleótido se eluye con acetonitrilo al 30%.
Los rendimientos promedio de acoplamiento por etapas son típicamente >98% (Wincott y col., 1995 Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684). Los expertos en la materia reconocerán que la escala de síntesis puede adaptarse para ser mayor o menor que el ejemplo descrito anteriormente incluyendo, pero sin limitación, un formato de 96 pocillos.
Como alternativa, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden sintetizarse por separado y unirse entre sí después de la síntesis, por ejemplo, por ligación (Moore y col., 1992, Science 256, 9923; Draper y col., Publicación Internacional PCT N° WO 93/23569; Shabarova y col., 1991, Nucleic Acids Research 19, 4247; Bellon y col., 1997, Nucleosides & Nucleotides, 16, 951; Bellon y col., 1997, Bioconjugate Chem. 8, 204), o por hibridación después de la síntesis y/o desprotección.
Las moléculas de ANic de la invención también pueden sintetizarse mediante una metodología de síntesis en tándem como se describe en el Ejemplo 1 en el presente documento, en la que las dos cadenas de ANic se sintetizan como una cadena o fragmento oligonucleotídico contiguo sencillo separado mediante un engarce escindible que se escinde posteriormente para proporcionar fragmentos o cadenas de ANic distintos que hibridan y permiten la purificación del dúplex de ANic. El engarce puede ser un engarce polinucleotídico o un engarce no nucleotídico. Como se describe en el presente documento, la síntesis en tándem del ANic, puede adaptarse fácilmente a plataformas de síntesis multipocillo/multiplaca, tales como plataformas de 96 pocillos o multipocillo de mayor tamaño, de manera similar. La síntesis en tándem de ANic, que se describe en el presente documento, también puede adaptarse fácilmente a plataformas de síntesis a gran escala, empleando reactores discontinuos, columnas de síntesis y similares.
También puede ensamblarse una molécula de ANic a partir de dos cadenas o fragmentos de ácido nucleico distintos, en los que un fragmento incluye la región con sentido y el segundo fragmento incluye la región antisentido de la molécula de ARN.
Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden modificarse ampliamente para aumentar la estabilidad por modificación con grupos resistentes a nucleasa, por ejemplo, 2'-amino, 2'-C-alilo, 2'-fluoro, 2’-0- metilo, 2’-H (para una revisión véase Usman y Cedergren, 1992, TIBS 17, 34; Usman y col., 1994, Nucleic Acids Symp. Ser. 31, 163). Las construcciones de ANic pueden purificarse por electroforesis en gel usando procedimientos generales o pueden purificarse por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC; véase Wincott y col., anteriormente, cuya totalidad se incorpora en el presente documento por referencia) y resuspenderse en agua.
En otro aspecto de la invención, las moléculas de ANic de la invención se expresan a partir de unidades de transcripción insertadas en vectores de ADN o ARN. Los vectores recombinantes pueden ser plásmidos de ADN o vectores virales. Los vectores virales que expresan ANic pueden construirse basándose, pero sin limitación, en
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virus adenoasociados, retrovirus, adenovirus o alfavirus. Los vectores recombinantes capaces de expresar las moléculas de ANic pueden suministrarse como se describe en el presente documento y persistir en células diana. De manera alternativa, pueden usarse vectores virales que proporcionan una expresión transitoria de moléculas de ANic.
Optimización de la actividad de la molécula de ácido nucleico de la invención
La síntesis química de moléculas de ácido nucleico con modificaciones (base, azúcar y/o fosfato) puede impedir su degradación por ribonucleasas séricas, que puede aumentar su potencia (véase por ejemplo Eckstein y col., Publicación Internacional N° WO 92/07065; Perrault y col., 1990 Nature 344, 565; Pieken y col., 1991, Science 253, 314; Usman y Cedergren, 1992, Trends in Biochem. Sci. 17, 334; Usman y col., Publicación Internacional N° WO 93/15187; y Rossi y col., Publicación Internacional N° WO 91/03162; Sproat, Patente de Estados Unidos N° 5.334.711; Gold y col., Patente de Estados Unidos N° 6.300.074; y Burgin y col., anteriormente). Todas las referencias anteriores describen diversas modificaciones químicas que pueden realizarse en los restos de base, fosfato y/o azúcar de las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento. Se desean modificaciones que aumenten su eficacia en células y la eliminación de bases de las moléculas de ácido nucleico para acortar los tiempos de síntesis de oligonucleótidos y reducir los requisitos químicos.
En la técnica existen diversos ejemplos que describen modificaciones de azúcares, bases y fosfatos que pueden introducirse en moléculas de ácidos nucleicos con un aumento significativo de su eficacia y estabilidad a nucleasa. Por ejemplo, los oligonucleótidos se modifican para aumentar la estabilidad y/o aumentar la actividad biológica, por modificación con grupos resistentes a nucleasa, por ejemplo, 2'-amino, 2'-C-alilo, 2'-fluoro, 2'-0-metilo, 2'-O- alilo, 2'-H, modificaciones de las bases de nucleótidos (para una revisión véase Usman y Cedergren, 1992, TIBS. 17, 34; Usman y col., 1994, Nucleic Acids Symp. Ser. 31, 163; Burgin y col., 1996, Biochemistry, 35, 14090). La modificación de los azúcares de las moléculas de ácido nucleico se ha descrito ampliamente en la técnica (véase Eckstein y col., Publicación Internacional PCT N° WO 92/07065; Perrault y col. Nature, 1990, 344, 565-568; Pieken y col. Science, 1991, 253, 314-317; Usman y Cedergren, Trends in Biochem. Sci. , 1992, 17, 334-339; Usman y col. Publicación Internacional PCT N° WO 93/15187; Sproat, Patente de Estados Unidos N° 5.334.711 y Beigelman y col., 1995, J. Biol. Chem., 270, 25702; Beigelman y col., Publicación Internacional PCT N° WO 97/26270; Beigelman y col., Patente de Estados Unidos N° 5.716.824; Usman y col., Patente de Estados Unidos N° 5.627.053; Woolf y col., Publicación Internacional PCT N° WO 98/13526; Thompson y col., USSN 60/082,404 que se presentó el 20 de abril de 1998; Karpeisky y col., 1998, Tetrahedron Lett., 39, 1131; Earnshaw y Gait, 1998, Biopolymers (Nucleic Acid Sciences), 48, 39-55; Verma y Eckstein, 1998, Annu. Rev. Biochem., 67, 99-134; y Burlina y col., 1997, Bioorg. Med. Chem., 5, 1999-2010; todas las referencias se incorporan de esta manera en su totalidad por referencia en el presente documento). Dichas publicaciones describen procedimientos y estrategias generales para determinar la localización de incorporación de las modificaciones de los azúcares, bases y/o fosfatos y similares en las moléculas de ácido nucleico sin modular la catálisis. A la vista de dichos contenidos, pueden usarse modificaciones similares, como se describe en el presente documento, para modificar las moléculas de ácido nucleico ANic de la presente invención siempre que no se inhiba de manera significativa la capacidad del ANic para promover la iARN en las células.
Aunque la modificación química de enlaces internucleotídicos de oligonucleótidos con enlaces fosforotioato, fosforoditioato y/o 5'-metilfosfonato mejora la estabilidad, excesivas modificaciones pueden causar cierta toxicidad o disminuir la actividad. Por lo tanto, cuando se diseñan moléculas de ácido nucleico, debería minimizarse la cantidad de estos enlaces internucleotídicos. La reducción de la concentración de estos enlaces debería disminuir la toxicidad, dando como resultado una eficacia aumentada y una mayor especificidad de estas moléculas.
Se proporcionan moléculas de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) que tienen modificaciones químicas que mantienen o aumentan la actividad. Generalmente, dicho ácido nucleico también es más resistente a nucleasas que un ácido nucleico no modificado. Por consiguiente, la actividad in vitro y/o in vivo no debería disminuirse significativamente. En los casos en los que el objetivo sea la modulación, las moléculas de ácido nucleico terapéuticas suministradas de manera exógena deberían ser óptimamente estables dentro de las células hasta que la traducción del ARN diana se haya modulado suficiente tiempo para reducir los niveles de la proteína no deseable. Este periodo de tiempo varía de horas a días dependiendo de la patología. Las mejoras en la síntesis química del ARN y del ADN (Wincott y col., 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677; Caruthers y col., 1992, Methods in Enzymology 211,3-19) han ampliado la capacidad para modificar moléculas de ácido nucleico introduciendo modificaciones de nucleótidos para aumentar su estabilidad frente a nucleasa, como se ha descrito anteriormente.
En una realización, las moléculas de ácido nucleico de la invención incluyen uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) nucleótidos de fijación a G. Un nucleótido de fijación de G es un análogo de citosina modificado en el que las modificaciones confieren la capacidad de unir mediante enlaces de hidrógeno ambas caras de Watson-Crick y Hoogsteen de una guanina complementaria dentro de un dúplex, véase por ejemplo Lin y Matteucci, 1998, J. Am Chem. Soc., 120, 8531-8532. Una sola sustitución de análogo de fijación
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de G dentro de un oligonucleótido puede dar como resultado una estabilidad térmica helicoidal sustancialmente aumentada y una discriminación de emparejamientos erróneos cuando híbrida con oligonucleótidos complementarios. La inclusión de dichos nucleótidos en las moléculas de ácido nucleico de la invención da como resultado tanto una afinidad como una especificidad aumentadas hacia dianas de ácido nucleico, secuencias complementarias o cadenas de molde. En otra realización, las moléculas de ácido nucleico de la invención incluyen uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, o más) nucleótidos de “ácido nucleico bloqueado” LNA tales como un 2',4'-C-metileno biciclo nucleótido (véase por ejemplo Wengel y col., Publicación Internacional PCT N° WO 00/66604 y WO 99/14226).
Una divulgación presenta conjugados y/o complejos de moléculas de ANic de la divulgación. Dichos conjugados y/o complejos pueden usarse para facilitar el suministro de moléculas de ANic en un sistema biológico, tal como una célula. Los conjugados y complejos que proporciona la presente divulgación pueden conferir actividad terapéutica transfiriendo compuestos terapéuticos a través de membranas celulares, modificando la farmacocinética y/o modulando la localización de las moléculas de ácido nucleico de la divulgación. La presente divulgación incluye el diseño y síntesis de nuevos conjugados y complejos para el suministro de moléculas, incluyendo, pero sin limitación, pequeñas moléculas, lípidos, fosfolípidos, nucleósidos, nucleótidos, ácidos nucleicos, anticuerpos, toxinas, polímeros cargados negativamente y otros polímeros, por ejemplo, proteínas, péptidos, hormonas, carbohidratos, polietilenglicoles o poliaminas, a través de membranas celulares. En general, los transportadores descritos se diseñan para su uso de manera individual o como parte de un sistema multicomponente, estando o no presentes engarces degradables. Se espera que estos compuestos mejoren el suministro y/o la localización de las moléculas de ácido nucleico de la divulgación en diversos tipos de células obtenidas a partir de tejidos diferentes, en presencia o en ausencia de suero (véase Sullenger y Cech, Patente de Estados Unidos N° 5.854.038). Los conjugados de las moléculas descritos en el presente documento pueden unirse a moléculas biológicamente activas mediante engarces que son biodegradables, tales como moléculas de engarce de ácidos nucleicos biodegradables.
El ANic de la invención comprende un conjugado covalentemente unido a la molécula de ANic, en el que el conjugado se selecciona del grupo que consiste en lípidos, fosfolípidos, anticuerpos, toxinas, polímeros cargados negativamente, proteínas, péptidos, hormonas, carbohidratos, polietilenglicoles y poliaminas; o comprende un ligando para un receptor celular, opcionalmente el receptor de asialoglicoproteína (ASGPr).
La expresión “engarce biodegradable”, como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de engarce de ácido nucleico o que no es de ácido nucleico diseñada como un engarce biodegradable para unir una molécula a otra molécula, por ejemplo, una molécula biológicamente activa a una molécula de ANic de la invención o las cadenas con sentido y antisentido de una molécula de ANic de la invención. El engarce biodegradable se diseña de manera que su estabilidad pueda modularse para un fin particular, tal como el suministro a un tipo de tejido o célula particular. La estabilidad de una molécula de engarce biodegradable basada en ácido nucleico puede modularse usando diversas químicas, por ejemplo combinaciones de ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos y nucleótidos químicamente modificados, tales como 2'-O-metilo, 2'-fluoro, 2'-amino, 2'-O- amino, 2'-C-alilo, 2'-O-alilo y otros nucleótidos con bases modificadas o modificaciones en la posición 2'. La molécula de engarce de ácido nucleico biodegradable puede ser un dímero, trímero, tetrámero o una molécula de ácido nucleico de mayor tamaño, por ejemplo, un oligonucleótido de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 nucleótidos de longitud, o puede comprender un solo nucleótido con un enlace basado en fósforo, por ejemplo, un enlace fosforamidato o fosfodiéster. La molécula de engarce de ácido nucleico biodegradable también puede comprender modificaciones de la cadena principal del azúcar del ácido nucleico o de la base del ácido nucleico.
El término “biodegradable”, como se usa en el presente documento, se refiere a la degradación en un sistema biológico, por ejemplo degradación enzimática o degradación química.
La expresión “molécula biológicamente activa”, como se usa en el presente documento, se refiere a compuestos o moléculas que son capaces de generar o modificar una respuesta biológica en un sistema. Los ejemplos no limitantes de moléculas de ANic biológicamente activas en solitario o en combinación con otras moléculas que contempla la presente divulgación incluyen moléculas terapéuticamente activas tales como anticuerpos, hormonas, antivirales, péptidos, proteínas, quimioterápicos, moléculas pequeñas, vitaminas, cofactores, nucleósidos, nucleótidos, oligonucleótidos, ácidos nucleicos enzimáticos, ácidos nucleicos antisentido, oligonucleótidos que forman tríplex, quimeras 2,5-A, ANic, ARNbc, alozimas, aptámeros, señuelos y análogos de los mismos. Las moléculas biológicamente activas de la divulgación también incluyen moléculas capaces de modular la farmacocinética y/o farmacodinámica de otras moléculas biológicamente activas, por ejemplo, lípidos y polímeros tales como poliaminas, poliamidas, polietilenglicol y otros poliéteres.
El término “fosfolípido”, como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula hidrófoba que comprende al menos un grupo de fósforo. Por ejemplo, un fosfolípido puede comprender un grupo que contiene
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fósforo y un grupo alquilo saturado o insaturado, opcionalmente sustituido con grupos OH, COOH, oxo, amina, o grupos arilo sustituidos o no sustituidos.
Las moléculas de ácido nucleico terapéuticas (por ejemplo moléculas de ANic) suministradas de manera exógena son óptimamente estables dentro de las células hasta que la transcripción inversa del ARN se haya modulado suficiente tiempo para reducir los niveles del transcrito de ARN. Las moléculas de ácido nucleico son resistentes a nucleasas para funcionar como agentes terapéuticos intracelulares eficaces. Las mejoras en la síntesis química de las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente invención y en la técnica han ampliado la capacidad de modificar las moléculas de ácido nucleico introduciendo modificaciones de nucleótidos para aumentar su estabilidad frente a nucleasa como se ha descrito anteriormente.
En otra realización más, se proporcionan moléculas de ANic que tienen modificaciones químicas que mantienen o aumentan la actividad enzimática de las proteínas implicadas en la iARN. Generalmente, dichos ácidos nucleicos también son más resistentes a nucleasas que los ácidos nucleicos no modificados. Por lo tanto, la actividad in vitro y/o in vivo no debería disminuirse significativamente.
El uso de las moléculas basadas en ácido nucleico de la invención conducirá a un mejor tratamiento del avance de la enfermedad ofreciendo la posibilidad de terapias de combinación (por ejemplo moléculas de ANic múltiples dirigidas a genes diferentes; moléculas de ácido nucleico acopladas a moduladores conocidos de moléculas pequeñas; o tratamiento intermitente con combinaciones de moléculas, incluyendo diferentes motivos y/u otras moléculas químicas o biológicas). El tratamiento de sujetos con moléculas de ANic también puede incluir combinaciones de diferentes tipos de moléculas de ácido nucleico, tales como moléculas de ácido nucleico enzimáticas (ribozimas), alozimas, antisentido, 2,5-A oligoadenilato, señuelos y aptámeros.
En otro aspecto, una molécula de ANic de la invención comprende una o más estructuras de protección 5' y/o 3', por ejemplo sólo en la cadena de ANic con sentido, en la cadena de ANic antisentido o en ambas cadenas de ANic.
Por “estructura de protección" se quiere significar modificaciones químicas, que se han incorporado en cualquiera de los extremos terminales del oligonucleótido (véase, por ejemplo, Adamic y col., Patente de Estados Unidos N° 5.998.203). Estas modificaciones terminales protegen a la molécula de ácido nucleico de la degradación por exonucleasa y pueden ayudar al suministro y/o localización dentro de una célula. La protección puede estar presente en el extremo 5' (protección 5') o en el extremo 3' (protección 3') o puede estar presente en ambos extremos terminales. En ejemplos no limitantes, la protección 5' se selecciona del grupo que consiste en glicerilo, resto (residuo) abásico desoxi invertido; 4',5'-metileno nucleótido; l-(beta-D-eritrofuranosil) nucleótido; 4'-tio nucleótido; nucleótido carbocíclico; 1,5-anhidrohexitol nucleótido; L-nucleótidos; alfa-nucleótidos, nucleótidos con base modificada; enlace fosforoditioato; treo-pentofuranosil nucleótido; 3',4'-seco nucleótido acíclico; 3,4- dihidroxibutil nucleótido acíclico; 3,5-dihidroxipentil nucleótido acíclico, resto nucleotídico 3'-3' invertido; resto abásico 3'-3' invertido; resto nucleotídico 3'-2' invertido; resto abásico 3'-2' invertido; 1,4-butanodiol fosfato; 3'- fosforamidato; hexilfosfato; aminohexil fosfato; 3'-fosfato; 3'-fosforotioato; fosforoditioato o resto metilfosfonato formador o no formador de puentes.
En ejemplos no limitantes, la protección 3' se selecciona del grupo que consiste en, glicerilo, resto (residuo) abásico desoxi invertido, 4',5'-metileno nucleótido; l-(beta-D-eritrofuranosil) nucleótido; 4'-tio nucleótido; nucleótido carbocíclico; 5'-amino-alquil fosfato; 1,3-diamino-2-propil fosfato; 3-aminopropil fosfato; 6-aminohexil fosfato; 1,2- aminododecil fosfato; hidroxipropil fosfato; 1,5-anhidrohexitol nucleótido; L-nucleótido; alfa-nucleótido; nucleótido con base modificada; fosforoditioato; treo-pentofuranosil nucleótido; 3',4'-seco nucleótido acíclico; 3,4-dihidroxibutil nucleótido; 3,5-dihidroxipentil nucleótido; resto nucleotídico 5'-5'-invertido; resto abásico 5'-5';invertido; 5'- fosforamidato; 5'-fosforotioato; 1,4-butanodiol fosfato; 5'-amino; 5'-fosforamidato, fosforotioato y/o fosforoditioato formador y/o no formador de puentes, restos metilfosfonato y 5'-mercapto formadores y/o no formadores de puentes (para más detalles véase Beaucage y lyer, 1993, Tetrahedron 49, 1925; incorporado por referencia en el presente documento).
La expresión “no nucleotídico” significa cualquier grupo o compuesto que puede incorporarse en una cadena de ácido nucleico en el lugar de una o más unidades de nucleótidos, incluyendo sustituciones de azúcares y/o fosfato, y permite que el resto de bases muestren su actividad enzimática. El grupo o compuesto es abásico ya que no contiene una base nucleotídica comúnmente reconocida, tal como adenosina, guanina, citosina, uracilo o timina y por lo tanto carece de una base en la posición 1'.
Un grupo “alquilo” se refiere a un hidrocarburo alifático saturado, incluyendo grupos alquilo de cadena lineal, cadena ramificada y cíclicos. Preferentemente, el grupo alquilo tiene de 1 a 12 carbonos. Más preferentemente, es un alquilo inferior de 1 a 7 carbonos, más preferentemente de 1 a 4 carbonos. El grupo alquilo puede estar sustituido o no sustituido. Cuando está sustituido el grupo (o grupos) sustituido es preferentemente hidroxilo, ciano, alcoxi, =O, =S, NO2 o N(CH3)2, amino o SH. El término también incluye grupos alquenilo que son grupos hidrocarburo insaturados que contienen al menos un doble enlace carbono-carbono, incluyendo grupos de cadena
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lineal, cadena ramificada o cíclicos. Preferentemente, el grupo alquenilo tiene de 1 a 12 carbonos. Más preferentemente, es un alquenilo inferior de 1 a 7 carbonos, más preferentemente de 1 a 4 carbonos. El grupo alquenilo puede estar sustituido o no sustituido. Cuando está sustituido, el grupo (o grupos) sustituido es preferentemente hidroxilo, ciano, alcoxi, =O, =S, NO2, halógeno, N(CH3)2, amino o SH. El término “alquilo” también incluye grupos alquinilo que tienen un grupo hidrocarburo insaturado que contiene al menos un triple enlace carbono-carbono, incluyendo grupos de cadena lineal, cadena ramificada o cíclicos. Preferentemente, el grupo alquinilo tiene de 1 a 12 átomos de carbono. Más preferentemente, es un alquinilo inferior de 1 a 7 carbonos, más preferentemente de 1 a 4 carbonos. El grupo alquinilo puede estar sustituido o no sustituido. Cuando está sustituido el grupo (o grupos) es preferentemente hidroxilo, ciano, alcoxi, =O, =S, NO2 o N(CH3)2, amino o SH.
Dichos grupos alquilo también pueden incluir grupos arillo, alquilarilo, arilo carbocíclico, arilo heterocíclico, amida y éster. Un grupo “arilo” se refiere a un grupo aromático que tiene al menos un anillo que tiene un sistema de electrones pi conjugados e incluye grupos arilo carbocíclico, arilo heterocíclico y biarilo, pudiendo todos estar opcionalmente sustituidos. El sustituyente (o sustituyentes) preferido de grupos arilo son grupos halógeno, trihalometilo, hidroxilo, SH, OH, ciano, alcoxi, alquilo, alquenilo, alquinilo y amino. Un grupo “alquilarilo” se refiere a un grupo alquilo (como se ha descrito anteriormente) unido covalentemente a un grupo arilo (como se ha descrito anteriormente). Los grupos arilo carbocíclicos son grupos en los que los átomos del anillo en el anillo aromático son todos átomos de carbono. Los átomos de carbono están opcionalmente sustituidos. Los grupos arilo heterocíclicos son grupos que tienen de 1 a 3 heteroátomos como átomos del anillo en el anillo aromático y el resto de los átomos del anillo son átomos de carbono. Los heteroátomos adecuados incluyen oxígeno, azufre y nitrógeno, e incluyen furanilo, tienilo, piridilo, pirrolilo, N-alquil inferior pirrolo, pirimidilo, pirazinilo, imidazolilo y similares, opcionalmente todos sustituidos. Una “amida” se refiere a un -C(O)-NH-R, en el que R es alquilo, arilo, alquilarilo o hidrógeno. Un “éster” se refiere a un -C(O)-OR', en el que R es alquilo, arilo, alquilarilo o hidrógeno.
“Nucleótido”, como se usa en el presente documento, debe incluir, como se reconoce en la técnica, bases naturales (convencionales) y bases modificadas bien conocidas en la técnica. Dichas bases se localizan generalmente en la posición 1' de un resto de azúcar de nucleótido. Los nucleótidos generalmente comprenden una base, un azúcar y un grupo fosfato. Los nucleótidos pueden tener el resto de azúcar, fosfato y/o base modificado o no modificado (denominados también indistintamente análogos de nucleótidos, nucleótidos modificados, nucleótidos no naturales, nucleótidos no convencionales y otros; véase, por ejemplo, Usman y McSwiggen, anteriormente; Eckstein y col., Publicación Internacional PCT N° WO 92/07065; Usman y col., Publicación Internacional PCT N° WO 93/15187; Uhlman y Peyman, anteriormente). Existen diversos ejemplos de bases de ácidos nucleicos modificadas conocidos en la técnica, como se resumen por Limbach y col., 1994, Nucleic Acids Res. 22, 2183. Algunos de los ejemplos no limitantes de modificaciones de bases que pueden introducirse en las moléculas de ácido nucleico incluyen inosina, purina, piridin-4-ona, piridin-2-ona, fenilo, pseudouracilo, 2,4,6- trimetoxi benceno, 3-metil uracilo, dihidrouridina, naftilo, aminofenilo, 5-alquilcitidinas (por ejemplo, 5-metilcitidina), 5-alquiluridinas (por ejemplo, ribotimidina), 5-halouridina (por ejemplo, 5-bromouridina) o 6-azapirimidinas o 6- alquilpirimidinas (por ejemplo 6-metiluridina), propina y otras (Burgin y col., 1996, Biochemistry, 35, 14090; Uhlman y Peyman, anteriormente). Por “bases modificadas” en este aspecto se entienden bases de nucleótidos distintas de adenina, guanina, citosina y uracilo en la posición 1' o sus equivalentes.
En una realización, la invención ofrece moléculas de ANic modificadas, con modificaciones de la cadena principal de fosfato que comprenden una o más sustituciones de fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, fosfotriéster, morfolino, amidato carbamato, carboximetilo, acetamidato, poliamida, sulfonato, sulfonamida, sulfamato, formacetal, tioformacetal, y/o alquilsililo. Para una revisión de las modificaciones de la cadena principal de oligonucleótidos, véase Hunziker y Leumann, 1995, Nucleic Acid Analogues: Synthesis and Properties, in Modern Synthetic Methods, VCH, 331-417, y Mesmaeker y col., 1994, Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides, in Carbohydrate Modifications in Antisense Research, ACS, 24-39.
Por “abásico" se quiere significar restos de azúcares que carecen de una base o que tienen otros grupos químicos en lugar de una base en la posición 1', véase por ejemplo Adamic y col., Patente de Estados Unidos N° 5.998.203.
Por “nucleósido no modificado" se quiere significar una de las bases de adenina, citosina, guanina, timina o uracilo unidas al carbono 1' de la p-D-ribo-furanosa.
Por “nucleósido modificado" se quiere significar cualquier base nucleotídica que contiene una modificación en la estructura química de una base, azúcar y/o fosfato de nucleótido no modificado. Las fórmulas I-VII muestran ejemplos no limitantes de nucleótidos modificados y/u otras modificaciones descritas en el presente documento.
Con referencia a los nucleótidos modificados en posición 2', como se describe para la presente invención, por “amino” se entiende 2'-NH2 o 2'-0-NH2, que pueden estar modificados o no modificados. Dichos grupos modificados se describen, por ejemplo, por Eckstein y col., Patente de Estados Unidos N° 5.672.695 y Matulic- Adamic y col., Patente de Estados Unidos N° 6.248.878.
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Para aumentar la utilidad de estas moléculas, pueden realizarse diversas modificaciones en la estructura de ácido nucleico del ANic. Dichas modificaciones aumentarán la vida útil, semivida in vitro, estabilidad y facilitará la introducción de dichos oligonucleótidos en el sitio diana, por ejemplo, para aumentar la penetración de membranas celulares y conferir la capacidad de reconocer y unirse a células diana.
Administración de Moléculas de Ácido Nucleico
Una molécula de ANic de la invención puede adaptarse para su uso para tratar cualquier enfermedad, infección o afección asociada con la expresión génica y otras indicaciones que pueden responder a nivel de producto génico en un tejido o célula, en solitario o en combinación con otras terapias. Por ejemplo, una molécula de ANic puede comprender un vehículo de suministro, incluyendo liposomas, para su administración a un sujeto, vehículos y diluyentes y sus sales y/o puede estar presente en formulaciones farmacéuticamente aceptables. Se describen procedimientos para el suministro de moléculas de ácido nucleico en Akhtar y col., 1992, Trends Cell Bio., 2, 139; Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995, Maurer y col., 1999, Mol. Membr. Biol., 16, 129-140; Hofland y Huang, 1999, Handb. Exp. Pharmacol., 137, 165-192; y Lee y col., 2000, ACS Symp. Ser., 752, 184-192, incorporándose todas en el presente documento por referencia. Beigelman y col., Patente de Estados Unidos N° 6.395.713 y Sullivan y col., documento PCT WO 94/02595 describen adicionalmente los procedimientos generales para el suministro de moléculas de ácido nucleico. Estos protocolos pueden utilizarse para el suministro de prácticamente cualquier molécula de ácido nucleico. Las moléculas de ácido nucleico pueden administrarse a células mediante una diversidad de procedimientos conocidos por los expertos en la materia, incluyendo, pero sin limitación, la encapsulación en liposomas, por iontoforesis, o por incorporación en otros vehículos, tales como hidrogeles, ciclodextrinas (véase, por ejemplo González y col., 1999, Bioconjugate Chem., 10, 1068-1074), nanocápsulas biodegradables y microesferas bioadhesivas, o por vectores proteicos (O'Hare y Normand, Publicación Internacional PCT N° WO 00/53722). Como alternativa, la combinación de ácido nucleico/vehículo se suministra localmente por inyección directa o usando una bomba de infusión. La inyección directa de las moléculas de ácido nucleico de la invención, por vía subcutánea, intramuscular o intradérmica, puede realizarse usando metodologías con aguja y jeringa convencionales o tecnologías sin aguja tales como las descritas en Conry y col., 1999, Clin. Cancer Res., 5, 2330-2337 y Barry y col., Publicación Internacional PCT N° WO 99/31262. Muchos ejemplos en la técnica describen procedimientos de suministro de oligonucleótidos en el SNC por bomba osmótica (véase, Chun y col., 1998, Neuroscience Letters, 257, 135-138, D'Aldin y col., 1998, Mol. Brain Research, 55, 151-164, Dryden y col., 1998, J. Endocrinol., 157, 169-175, Ghirnikar y col., 1998, Neuroscience Letters, 247, 21-24) o infusión directa (Broaddus y col., 1997, Neurosurg. Focus, 3, artículo 4). Otras vías de suministro incluyen, pero sin limitación, suministro oral (en forma de comprimido o píldora) y/o suministro intratecal (Gold, 1997, Neuroscience, 76, 1153-1158). Se proporcionan descripciones más detalladas del suministro y administración de ácidos nucleicos por Sullivan y col., anteriormente, Draper y col., PCT WO93/23569, Beigelman y col., PCT WO99/05094 y Klimuk y col., PCT WO99/04819. Las moléculas de la presente divulgación pueden usarse como agentes farmacéuticos. Los agentes farmacéuticos previenen, modulan la aparición o tratan (alivio de un síntoma en cierta medida, preferentemente todos los síntomas) de una patología en un sujeto.
Además, la divulgación quiere presentar el uso de procedimientos para suministrar las moléculas de ácido nucleico de la presente invención a células hematopoyéticas, incluyendo monocitos y linfocitos. Estos procedimientos se describen con detalle por Hartmann y col., 1998, J. Phamacol. Exp. Ther., 285(2), 920-928; Kronenwett y col., 1998, Blood, 91(3), 852-862; Filion y Phillips, 1997, Biochim. Biophys. Acta., 1329(2), 345-356; Ma y Wei, 1996, Leuk Res., 20(11/12), 925-930; y Bongartz y col., 1994, Nucleic Acids Research, 22(22), 4681-8. Dichos procedimientos, como se ha descrito anteriormente, incluyen el uso de oligonucleótidos libres, formulaciones de lípidos catiónicos, formulaciones liposomales incluyendo liposomas e inmunoliposomas sensibles al pH y bioconjugados incluyendo oligonucleótidos conjugados con péptidos fusogénicos, para la transfección de células hematopoyéticas con oligonucleótidos.
Por lo tanto, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende uno o más ácidos nucleicos de la invención en un vehículo aceptable, tal como un estabilizante, tampón y similar. Los polinucleótidos de la invención pueden administrarse (por ejemplo, ARN, ADN o proteína) e introducirse en un sujeto por cualquier medio convencional, estando o no presentes estabilizantes, tampones y similares, para formar una composición farmacéutica. Cuando se desea usar un mecanismo de suministro liposomal, pueden seguirse protocolos convencionales para la formación de liposomas. Las composiciones de la presente invención también pueden formularse y usarse como comprimidos, cápsulas o elixires para administración oral, supositorios para administración rectal, soluciones y suspensiones estériles para la administración inyectable y las otras composiciones conocidas en la técnica.
La presente invención también incluye formulaciones farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos. Estas formulaciones incluyen sales de los compuestos anteriores, por ejemplo, sales de adición de ácidos, por ejemplo, sales de ácido clorhídrico, bromhídrico, acético y ácido benceno sulfónico.
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Una composición o formulación farmacológica se refiere a una composición o formulación en una forma adecuada para la administración, por ejemplo, administración sistémica, en una célula o sujeto, incluyendo por ejemplo un ser humano. Las formas adecuadas dependen, en parte, del uso o la vía de entrada, por ejemplo, oral, transdérmica o por inyección. Dichas formas no deberían impedir que la composición o formulación alcance una célula diana (es decir, una célula en la que sea deseable el suministro del ácido nucleico cargado negativamente). Por ejemplo, las composiciones farmacológicas inyectadas en el torrente sanguíneo deberían ser solubles. En la técnica se conocen otros factores e incluyen consideraciones tales como la toxicidad y formas que impiden que la composición o formulación ejerza su efecto.
Por “administración sistémica" se quiere significar la absorción o acumulación sistémica in vivo de fármacos en el torrente sanguíneo, seguida de la distribución por todo el cuerpo. Las vías de administración que conducen a la absorción sistémica incluyen, sin limitación: intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, por inhalación, oral, intrapulmonar e intramuscular. Cada una de estas vías de administración expone las moléculas de ANic de la invención a un tejido enfermo accesible. Se ha demostrado que la velocidad de entrada de un fármaco en la circulación está en función del peso o tamaño molecular. El uso de un liposoma u otro vehículo farmacológico que comprende los compuestos de la presente invención posiblemente puede localizar el fármaco, por ejemplo, en determinados tipos de tejidos, tales como los tejidos del sistema reticuloendotelial (SRE). También es útil una formulación liposomal que pueda facilitar la asociación del fármaco con la superficie de las células, tales como linfocitos y macrófagos. Esta estrategia puede proporcionar un suministro aumentado del fármaco a células diana aprovechando la especificidad del reconocimiento inmune por macrófagos y linfocitos de células anómalas, tales como células que producen MDR en exceso
Por “formulación farmacéuticamente aceptable" se quiere significar una composición o formulación que permite distribuir eficazmente las moléculas de ácido nucleico de la presente invención en la localización física más adecuada para su actividad deseada. Los ejemplos no limitantes de agentes adecuados para la formulación con las moléculas de ácido nucleico de la presente invención incluyen: inhibidores de glicoproteína P (tales como Pluronic P85), que pueden aumentar la entrada de fármacos en el SNC (Jolliet-Riant y Tillement, 1999, Fundam. Clin. Pharmacol., 13, 16-26); polímeros biodegradables, tales como microesferas de poli (DL-lactida-coglicolida) para el suministro de liberación sostenida después de su implantación intracerebral (Emerich, DF y col, 1999, Cell Transplant, 8, 47-58) (Alkermes, Inc. Cambridge, MA); y nanopartículas cargadas, tales como las compuestas por polibutilcianoacrilato, que pueden suministrar fármacos a través de la barrera hematoencefálica y pueden modificar los mecanismos de captación neuronal (Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 23, 941-949, 1999). Otros ejemplos no limitantes de estrategias de suministro para las moléculas de ácido nucleico de la presente invención incluyen material descrito por Boado y col., 1998, J. Pharm. Sci., 87, 1308-1315; Tyler y col., 1999, FEBS Lett., 421, 280-284; Pardridge y col., 1995, PNAS USA., 92, 5592-5596; Boado, 1995, Adv. Drug Delivery Rev., 15, 73107; Aldrian-Herrada y col., 1998, Nucleic Acids Res., 26, 4910-4916; y Tyler y col., 1999, PNAS USA., 96, 70537058.
La divulgación también ofrece el uso de la composición que comprende liposomas de superficie modificada que contienen lípidos de poli(etilenglicol) (liposomas modificados con PEG o de circulación prolongada o liposomas sigilosos (Stealth)). Estas formulaciones ofrecen un procedimiento para aumentar la acumulación de fármacos en tejidos diana. Esta clase de vehículos farmacológicos son resistentes a la opsonización y eliminación por el sistema mononuclear fagocítico (SMF o SRE), permitiendo de esta manera tiempos de circulación en sangre más prolongados y una exposición tisular aumentada para el fármaco encapsulado (Lasic y col. Chem. Rev. 1995, 95, 2601-2627; Ishiwata y col., Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 1005-1011). Se ha demostrado que dichos liposomas se acumulan selectivamente en tumores, supuestamente por extravasación y captura en los tejidos diana neovascularizados (Lasic y col., Science 1995, 267, 1275-1276; Oku y col., 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1238, 86-90). Los liposomas de circulación prolongada mejoran la farmacocinética y farmacodinámica del ADN y ARN, particularmente en comparación con liposomas catiónicos convencionales que se sabe que se acumulan en tejidos del SMF (Liu y col., J. Biol. Chem. 1995, 42, 24864-24870; Choi y col., Publicación Internacional PCT N° WO 96/10391; Ansell y col., Publicación Internacional PCT N° WO 96/10390; Holland y col., Publicación Internacional PCT N° WO 96/10392). También es probable que los liposomas de circulación prolongada protejan a los fármacos de la degradación por nucleasa en mayor medida en comparación con los liposomas catiónicos, basándose en su capacidad para evitar su acumulación en tejidos del SMF metabólicamente agresivos tales como el hígado y el bazo.
La presente invención también incluye composiciones preparadas para el almacenamiento o administración que incluyen una cantidad farmacéuticamente eficaz de los compuestos deseados en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los vehículos o diluyentes aceptables para su uso terapéutico se conocen bien en la técnica farmacéutica, y se describen, por ejemplo, en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985). Por ejemplo, pueden proporcionarse agentes conservantes, estabilizantes, colorantes y saporíferos. Éstos incluyen benzoato sódico, ácido sórbico y ésteres del ácido p-hidroxibenzoico. Además, pueden usarse agentes antioxidantes y de suspensión.
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Una dosis farmacéuticamente eficaz es esa dosis necesaria para prevenir, inhibir la aparición o tratar (aliviar un síntoma en cierta medida, preferentemente todos los síntomas) de una patología. La dosis farmacéuticamente eficaz depende del tipo de enfermedad, de la composición usada, de la vía de administración, del tipo de mamífero a tratar, de las características físicas del mamífero específico en cuestión, de la medicación simultánea y otros factores que reconocerán los expertos en la técnica médica. Generalmente, dependiendo de la potencia del polímero cargado negativamente, se administra una cantidad de entre 0,1 mg/kg y 100 mg/kg de peso corporal/día de los principios activos.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención y las formulaciones de las mismas pueden administrarse por vía oral, por vía tópica, por vía parenteral, por inhalación o pulverización o por vía rectal en formulaciones unitarias de dosificación que contienen vehículos, adyuvantes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos convencionales. El término parenteral, como se usa en el presente documento, incluye técnicas de inyección o infusión percutánea, subcutánea, intravascular (por ejemplo, intravenosa), intramuscular o intratecal y similares. Además, se proporciona una formulación farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico de la divulgación y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una o más moléculas de ácido nucleico de la presente divulgación pueden estar presentes en asociación con uno o más vehículos y/o diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables no tóxicos y, si se desea, con otros principios activos. Las composiciones farmacéuticas que contienen moléculas de ácido nucleico de la invención pueden estar en una forma adecuada para su uso oral, por ejemplo, como comprimidos, trociscos, pastillas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsión, cápsulas duras o blandas, o jarabes o elixires.
Las composiciones destinadas a uso oral pueden prepararse de acuerdo con cualquier procedimiento conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas y dichas composiciones pueden contener uno o más de dichos agentes edulcorantes, agentes saporíferos, agentes colorantes o agentes conservantes para proporcionar preparaciones farmacéuticamente elegantes y apetecibles. Los comprimidos contienen el principio activo mezclado con excipientes no tóxicos farmacéuticamente aceptables que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio; agentes disgregantes y de granulación, por ejemplo, almidón de maíz o ácido algínico; agentes aglutinantes, por ejemplo almidón, gelatina o goma arábiga; y agentes lubricantes, por ejemplo, estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Los comprimidos pueden no estar revestidos o pueden revestirse mediante técnicas conocidas. En algunos casos dichos revestimientos pueden prepararse por técnicas conocidas para retrasar la disgregación y absorción en el tracto gastrointestinal y proporcionar por lo tanto una acción sostenida durante un periodo más prolongado. Por ejemplo, puede emplearse un material retardante tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.
Las formulaciones para uso oral también pueden presentarse como cápsulas de gelatina dura en las que el principio activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín, o como cápsulas de gelatina blandas en las que el principio activo se mezcla con agua o con un medio oleoso, por ejemplo aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva.
Las suspensiones acuosas contienen los materiales activos en una mezcla con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Dichos excipientes son agentes de suspensión, por ejemplo carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma arábiga; agentes dispersantes o humectantes que pueden ser una fosfatida de origen natural, por ejemplo, lecitina o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo estearato de polioxietileno o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo heptadecaetilenoxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tal como monooleato de polioxietilen sorbitán o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo monooleato de polietilen sorbitán. Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservantes, por ejemplo, etilo o p-hidroxibenzoato de n-propilo, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes saporíferos y uno o más agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina.
Las suspensiones oleosas pueden formularse suspendiendo los principios activos en un aceite vegetal, por ejemplo aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco, o en un aceite mineral tal como parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo, cera de abeja, parafina dura o alcohol cetílico. Pueden añadirse agentes edulcorantes y agentes saporíferos para proporcionar preparaciones orales apetecibles. Estas composiciones pueden conservarse añadiendo un antioxidante tal como ácido ascórbico.
Los polvos y gránulos dispersables adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua proporcionan el principio activo mezclado con un agente dispersante o humectante, agente de suspensión y uno o más conservantes. Los agentes dispersantes o humectantes o agentes de suspensión adecuados se ilustran por los ya mencionados anteriormente. También pueden estar presentes excipientes adicionales, por
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ejemplo, agentes edulcorantes, saporíferos y colorantes.
Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal o un aceite mineral o mezclas de los mismos. Los agentes emulsionantes adecuados pueden ser gomas de origen natural, por ejemplo, goma arábiga o goma de tragacanto, fosfatidas de origen natural, por ejemplo, semilla de soja, lecitina y ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos y hexitol, anhídridos, por ejemplo, monooleato de sorbitán, y productos de condensación de dichos ésteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo, monooleato de polioxietilen sorbitán. Las emulsiones también pueden contener agentes edulcorantes y saporíferos.
Pueden formularse jarabes y elixires con agentes edulcorantes, por ejemplo, glicerol, propilenglicol, sorbitol, glucosa o sacarosa. Dichas formulaciones también pueden contener un emoliente, un conservante y agentes saporíferos y colorantes. Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una suspensión acuosa u oleosa inyectable estéril. Esta suspensión puede formularse de acuerdo con la técnica conocida usando los agentes de dispersión o humectantes y agentes de suspensión adecuados que se han mencionado anteriormente. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están agua, solución de Ringer y solución de cloruro de sodio isotónica. Adicionalmente, como un disolvente o medio de suspensión se emplean de manera convencional aceites no volátiles estériles. Con este fin, puede emplearse cualquier aceite no volátil suave incluyendo mono- o diglicéridos sintéticos. Adicionalmente, se usan ácidos grasos tales como ácido oleico en la preparación de inyectables.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención también pueden administrarse en forma de supositorios, por ejemplo, para la administración rectal del fármaco. Estas composiciones pueden prepararse mezclando el fármaco con un excipiente no irritante adecuado que sea sólido a las temperaturas habituales pero líquido a la temperatura rectal y, por lo tanto, se fundirá en el recto para liberar el fármaco. Dichos materiales incluyen manteca de cacao y polietilenglicoles.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden administrarse parenteralmente en un medio estéril. Dependiendo del vehículo y de la concentración usada, el fármaco puede suspenderse o disolverse en el vehículo. De manera ventajosa, en el vehículo pueden disolverse adyuvantes tales como anestésicos locales, conservantes y agentes de tamponantes.
Niveles de dosificación del orden de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 140 mg por kilogramo de peso corporal por día son útiles en el tratamiento de las afecciones indicadas anteriormente (de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 7 g por sujeto por día). La cantidad de principio activo que puede combinarse con los materiales de vehículo para producir una sola forma de dosificación varía dependiendo del huésped tratado y del modo de administración particular. Las formas unitarias de dosificación generalmente contienen entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 500 mg de un principio activo.
Se entiende que el nivel de dosis específico para cualquier sujeto particular depende de una diversidad de factores incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, salud general, sexo, dieta, momento de administración, vía de administración y velocidad de excreción, combinación de fármaco y gravedad de la enfermedad particular que se esté sometiendo a terapia.
Para la administración a animales no humanos, la composición también puede añadirse al pienso o agua de bebida del animal. Puede ser conveniente formular las composiciones de pienso y agua de bebida del animal de forma que el animal ingiera una cantidad terapéuticamente apropiada de la composición junto con su dieta. También puede ser conveniente presentar la composición como una premezcla para adición al pienso o agua de bebida.
Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención también pueden administrarse a un sujeto en combinación con otros compuestos terapéuticos para aumentar el efecto terapéutico global. El uso de múltiples compuestos para tratar una indicación puede aumentar los efectos beneficiosos a la vez que reduce la presencia de efectos secundarios.
Una divulgación comprende composiciones adecuadas para administrar moléculas de ácido nucleico de la invención a tipos celulares específicos. Por ejemplo, el receptor de asialoglicoproteína (ASGPr) (Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432) es único para los hepatocitos y se une a glicoproteínas con galactosa terminal ramificadas, tales como asialoorosomucoide (ASOR). En otro ejemplo, el receptor de folato se sobreexpresa en muchas células cancerosas. La unión de tales glicoproteínas, glicoconjugados sintéticos o folatos al receptor tiene lugar con una afinidad que depende claramente del grado de ramificación de la cadena oligosacárida, por ejemplo, se unen con mayor afinidad estructuras triantenarias que las cadenas biantenarias o monoantenarias (Baenziger y
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Fiete, 1980, Cell, 22, 611-620; Connolly y col., 1982, J. Biol. Chem., 257, 939-945). Lee y Lee, 1987, Glycoconjugate J., 4, 317-328, obtuvieron esta elevada especificidad a través del uso de N-acetil-D-galactosamina como el resto carbohidrato, que tiene una afinidad mayor por el receptor, en comparación con la galactosa. Este “efecto de agrupamiento” también se ha descrito para la unión y captación de glicoproteínas o glicoconjugados que terminan en manosilo (Ponpipom y col., 1981, J. Med. Chem., 24, 1388-1395). El uso de conjugados basados en galactosa, galactosamina o folato para transportar compuestos exógenos a través de membranas celulares puede proporcionar una estrategia de suministro dirigido para, por ejemplo, el tratamiento de enfermedad hepática, cánceres hepáticos u otros cánceres. El uso de bioconjugados también puede proporcionar una reducción en la dosis necesaria de los compuestos terapéuticos necesarios para el tratamiento. Además, puede modularse la biodisponibilidad terapéutica, los parámetros farmacodinámicos y farmacocinéticos a través del uso de bioconjugados de ácido nucleico de la invención. Los ejemplos no limitantes de tales bioconjugados se describen por Vargeese y col., documento USSN 10/201.394, presentado el 13 de agosto de 2001; y Matulic-Adamic y col., documento USSN 60/362.016, presentado el 6 marzo de 2002.
Como alternativa, determinadas moléculas de ANic de la presente invención pueden expresarse dentro de células a partir de promotores eucariotas (por ejemplo, Izant y Weintraub, 1985, Science, 229, 345; McGarry y Lindquist, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 399; Scanlon y col., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 10591-5; Kashani- Sabet y col., 1992, Antisense Res. Dev., 2, 3-15; Dropulic y col., 1992, J. Virol., 66, 1432-41; Weerasinghe y col., 1991, J. Virol., 65, 5531-4; Ojwang y col., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10802-6; Chen y col., 1992, Nucleic Acids Res., 20, 4581-9; Sarver y col., 1990 Science, 247, 1222-1225; Thompson y col., 1995, Nucleic Acids Res., 23, 2259; Good y col., 1997, Gene Therapy, 4, 45. Los expertos en la materia comprenden que cualquier ácido nucleico puede expresarse en células eucariotas a partir del vector de ADN/ARN apropiado. La actividad de tales ácidos nucleicos puede aumentarse mediante su liberación a partir del transcrito primario mediante un ácido nucleico enzimático (Draper y col., PCT WO 93/23569, y Sullivan y col., PCT WO 94/02595; Ohkawa y col., 1992, Nucleic Acids Symp. Ser., 27, 15-6; Taira y col., 1991, Nucleic Acids Res., 19, 5125-30; Ventura y col., 1993, Nucleic Acids Res., 21, 3249-55; Chowrira y col., 1994, J. Biol. Chem., 269, 25856.
En otro aspecto de la divulgación, pueden expresarse moléculas de ARN de la presente invención a partir de unidades de transcripción (véase, por ejemplo Couture y col., 1996, TIG., 12, 510) insertadas en vectores de ADN o ARN. Los vectores recombinantes pueden ser plásmidos de ADN o vectores virales. Pueden construirse vectores virales de expresión del ANic basándose en, pero sin limitación, virus adenoasociados, retrovirus, adenovirus o alfavirus. En otra realización, se usan construcciones basadas en pol III para expresar moléculas de ácido nucleico de la invención (véase, por ejemplo Thompson, Patentes de Estados Unidos N° 5.902.880 y 6.146.886). Los vectores recombinantes capaces de expresar las moléculas de ANic pueden suministrarse como se ha descrito anteriormente y persistir en células diana. Como alternativa, pueden usarse vectores virales que proporcionen la expresión transitoria de moléculas de ácido nucleico. Tales vectores pueden administrarse repetidamente según sea necesario. Una vez expresada, la molécula de ANic interacciona con el ARNm diana y genera una respuesta de iARN. El suministro de vectores de expresión de la molécula de ANic puede ser sistémico, tal como mediante administración intravenosa o intramuscular, mediante administración a células diana explantadas de un sujeto seguida de la reintroducción en el sujeto, o mediante cualquier otro medio que permitiría la introducción en la célula diana deseada (para una revisión véase Couture y col., 1996, TIG., 12.510).
La divulgación también ofrece un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una molécula de ANic de la presente invención. El vector de expresión puede codificar una o ambas cadenas de un dúplex de ANic o una sola cadena autocomplementaria que hibrida consigo misma en un dúplex de ANic. Las secuencias de ácido nucleico que codifican las moléculas de ANic de la presente invención pueden unirse operativamente de una manera que permita la expresión de la molécula de ANic (véase, por ejemplo Paul y col., 2002, Nature Biotechnology, 19, 505; Miyagishi y Taira, 2002, Nature Biotechnology, 19, 497; Lee y col., 2002, Nature Biotechnology, 19, 500; y Novina y col., 2002, Nature Medicine, avance de publicación en línea doi: 10.1038/nm725).
En otro aspecto, la divulgación presenta un vector de expresión que comprende: a) una región de inicio de la transcripción (por ejemplo, región de inicio eucariota pol I, II o III); b) una región de terminación de la transcripción (por ejemplo, región de terminación eucariota pol I, II o III) y c) una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una de las moléculas de ANic de la presente invención; en el que dicha secuencia está unida operativamente a dicha región de inicio y dicha región de terminación, de una manera que permite la expresión y/o el suministro de la molécula de ANic. El vector puede incluir opcionalmente una fase de lectura abierta (ORF) para una proteína unida operativamente en el lado 5' o en el lado 3' de la secuencia que codifica el ANic de la invención; y/o un intrón (secuencias intermedias).
La transcripción de las secuencias de moléculas de ANic puede dirigirse por un promotor para ARN polimerasa I (pol I), ARN polimerasa II (pol II) o ARN polimerasa III (pol III) eucariota. Los transcritos de los promotores pol II o pol III se expresan a niveles elevados en todas las células; los niveles de un promotor pol II dado en un tipo de
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célula dado dependen de la naturaleza de las secuencias reguladoras de genes (potenciadores, silenciadores, etc.) presentes en las proximidades. También se usan promotores de ARN polimerasa procariota, con la condición de que la enzima ARN polimerasa procariota se exprese en las células apropiadas (Elroy-Stein y Moss, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA-, 87, 6743-7; Gao y Huang 1993, Nucleic Acids Res., 21, 2867-72; Lieber y col., 1993, Methods Enzymol., 217, 47-66; Zhou y col., 1990, Mol. Cell. Biol., 10, 4529-37). Varios investigadores han demostrado que las moléculas de ácido nucleico expresadas a partir de tales promotores pueden funcionar en células de mamífero (por ejemplo, Kashani-Sabet y col., 1992, Antisense Res. Dev., 2,3-15; Ojwang y col., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 89, 10802-6; Chen y col., 1992, Nucleic Acids Res., 20, 4581-9; Yu y col., 1993, Pro. Natl. Acad. Sci. USA., 90, 6340-4; L'Huillier y col., 1992, EMBO J., 11, 4411-8; Lisziewicz y col., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 90, 8000-4; Thompson y col., 1995, Nucleic Acids Res., 23, 2259; Sullenger y Cech, 1993, Science, 262, 1566). Más específicamente, las unidades de transcripción tales como las derivadas de genes que codifican ARN nuclear pequeño U6 (ARNnp), ARN de transferencia (ARNt) y ARN VA de adenovirus son útiles para generar concentraciones elevadas de moléculas de ARN deseadas tales como ANic en células (Thompson y col., anteriormente; Couture y Stinchcomb, 1996, anteriormente; Noonberg y col., 1994, Nucleic Acid Res., 22, 2830; Noonberg y col., Patente de Estados Unidos N° 5.624.803; Good y col., 1997, Gene Ther., 4, 45; Beigelman y col., Publicación Internacional PCT N° WO 96/18736. Las unidades de transcripción de ANic anteriores pueden incorporarse en una diversidad de vectores para su introducción en células de mamífero, incluyendo, pero sin limitación, vectores de ADN plasmídico, vectores de ADN viral (tales como vectores de adenovirus o de virus adenoasociados) o vectores de ARN viral (tales como vectores retrovirales o de alfavirus) (para una revisión véase Couture y Stinchcomb, 1996, anteriormente).
La divulgación presenta un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una de las moléculas de ANic de la invención de una manera que permite la expresión de esa molécula de ANic. El vector de expresión comprende en una realización; a) una región de inicio de la transcripción; b) una región de terminación de la transcripción; y c) una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una cadena de la molécula de ANic, en la que la secuencia está unida operativamente a la región de inicio y la región de de terminación de una manera que permite la expresión y/o el suministro de la molécula de ANic.
En otra realización el vector de expresión comprende: a) una región de inicio de la transcripción; b) una región de terminación de la transcripción; c) una fase de lectura abierta; y d) una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una cadena de una molécula de ANic, en la que la secuencia está unida operativamente al extremo 3' de la fase de lectura abierta y en la que la secuencia está unida operativamente a la región de inicio, la fase de lectura abierta y la región de terminación de una manera que permite la expresión y/o el suministro de la molécula de ANic. En otra realización más, el vector de expresión comprende: a) una región de inicio de la transcripción; b) una región de terminación de la transcripción; c) un intrón; y d) una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una molécula de ANic, en la que la secuencia está unida operativamente a la región de inicio, el intrón y la región de terminación de una manera que permite la expresión y/o el suministro de la molécula de ácido nucleico.
En otra realización, el vector de expresión comprende: a) una región de inicio de la transcripción; b) una región de terminación de la transcripción; c) un intrón; d) una fase de lectura abierta; y e) una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una cadena de una molécula de ANic, en la que la secuencia está unida operativamente al extremo 3' de la fase de lectura abierta y en la que la secuencia está unida operativamente a la región de inicio, el intrón, la fase de lectura abierta y la región de terminación de una manera que permite la expresión y/o el suministro de la molécula de ANic.
Ejemplos:
En la medida en que los siguientes ejemplos caen fuera del ámbito de las reivindicaciones, se incluyen solamente para fines ilustrativos.
Ejemplo 1: Síntesis en tándem de construcciones de ANic
Las moléculas de ANic ilustrativas de la invención se sintetizan en tándem usando un engarce escindible, por ejemplo, un engarce basado en succinilo. La síntesis en tándem como se ha descrito en el presente documento viene seguida de un proceso de purificación de una etapa que proporciona moléculas de iARN en alto rendimiento. Esta estrategia es muy asequible para la síntesis de ANic para respaldar la exploración de iARN de alto rendimiento y puede adaptarse fácilmente a plataformas de síntesis multicolumna o multipocillo.
Después de completar una síntesis en tándem de un oligo de ANic y su complementario, en el que el grupo dimetoxitrilo 5'-terminal (5'-O-DMT) permanece intacto (síntesis sobre tritilo), los oligonucleótidos se desprotegen como se ha descrito anteriormente. Después de la desprotección, se permite que las cadenas de secuencia de ANic hibriden espontáneamente. Esta hibridación produce un dúplex en el que una cadena ha conservado el grupo 5'-O-DMT mientras que la cadena complementaria comprende un 5'-hidroxilo terminal. El dúplex recién formado se
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comporta como una molécula única durante la purificación por extracción en fase sólida de rutina (purificación sobre Tritilo) aunque sólo una molécula tiene un grupo dimetoxitritilo. Debido a que las cadenas forman un dúplex estable, este grupo dimetoxitritilo (o un grupo equivalente, tal como otros grupos tritilo u otros restos hidrófobos) es todo lo que se necesita para purificar el par de oligos, por ejemplo, usando un cartucho C18.
Se usa química de síntesis de fosforamidita convencional hasta el punto de introducir un engarce en tándem, tal como un engarce de succinato abásico desoxi invertido o succinato de glicerilo (véase la Figura 1) o un engarce escindible equivalente. Un ejemplo no limitante de condiciones de acoplamiento de engarce que pueden usarse incluye una base impedida estéricamente, tal como diisopropiletilamina (DIPA) y/o DMPA en presencia de un reactivo activador tal como Bromotripirrolidinofosfoniohexafluorurofosfato (PyBrOP). Después de que se acople el engarce, se utiliza química de síntesis convencional para completar la síntesis de la segunda secuencia dejando el 5'-O-DMT terminal intacto. Después de la síntesis, el oligonucleótido resultante se desprotege de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento y se inactiva con un tampón adecuado, por ejemplo con NaOAc 50 mM o NH4H2CO3 1,5 M.
La purificación del dúplex de ANic puede conseguirse fácilmente usando extracción en fase sólida, por ejemplo usando un cartucho de 1 g Waters C18 SepPak acondicionado con 1 volumen de columna (VC) de acetonitrilo, 2 VC de H2O y 2 VC de NaOAc 50mM. La muestra se carga y después se lava con 1 VC de H2O o NaOAc 50mM. Las secuencias fallidas se eluyen con 1 VC de ACN al 14% (solución acuosa con NaOAc 50 mM y NaCl 50 mM). Después, la columna se lava, por ejemplo con 1 VC de H2O, seguido por detritilación en columna, por ejemplo pasando 1 VC de ácido trifluoroacético acuoso (TFA) al 1% sobre la columna, añadiendo después un segundo VC de TFA acuoso al 1% a la columna y dejándolo en reposo durante aproximadamente 10 minutos. La solución de TFA restante se retira y la columna se lava con H2O seguido por 1 VC de NaCl 1 M y H2O adicional. Después, el producto de dúplex de ANic se eluye, por ejemplo, usando 1 VC de CAN acuoso al 20%.
La Figura 2 proporciona un ejemplo de análisis de espectrometría de masas de MALDI-TOV de una construcción de ANic purificada en la que cada pico corresponde a la masa calculada de una cadena de ANic individual del dúplex de ANic. El mismo ANic purificado proporciona tres picos cuando se analiza mediante electroforesis capilar en gel (CGE), correspondiendo supuestamente un pico al ANic de dúplex, y correspondiendo supuestamente dos picos a las cadenas de secuencia de ANic separadas. El análisis de HPLC de intercambio iónico de la misma construcción de ANic muestra únicamente un solo pico. El ensayo de la construcción de ANic purificada usando un ensayo indicador de luciferasa descrito más adelante demostró la misma actividad de iARN en comparación con construcciones de ANic generadas a partir de cadenas de secuencia de oligonucleótidos sintetizados por separado.
Ejemplo 2: Estabilidad en suero de construcciones de ANic modificadas químicamente
En construcciones de ANic se introdujeron modificaciones químicas para determinar la estabilidad de estas construcciones en comparación con oligonucleótidos de ANic nativos (que contienen dos salientes de nucleótidos de timidina) en suero humano. Una investigación de la estabilidad en suero de los dúplex de ARN reveló que las construcciones de ANic consistentes en todos los nucleótidos de ARN, que contienen dos salientes de nucleótidos de timidina, tienen una semivida en suero de 15 segundos, mientras que las construcciones de ANic modificadas químicamente permanecen estables en suero durante 1 a 3 días dependiendo del grado de modificación. Se realizaron ensayos de estabilidad de la iARN marcando internamente una cadena (cadena 1) de ANic y formando dúplex con 1,5 X la concentración de la cadena de ANic complementaria (cadena 2) (para asegurar que todo el material marcado estaba en forma de dúplex). Las construcciones de ANic en forma de dúplex se ensayaron después para determinar la estabilidad incubando a una concentración final de 2 |iM de ANic (concentración de las 2 cadenas) en suero de ratón o humano al 90% durante los puntos temporales de 30 s, 1 min, 5 min, 30 min, 90 min, 4 h 10 min, 16 h 24 min y 49 h. Los puntos temporales se procesaron en geles de poliacrilamida desnaturalizantes al 15% y se analizaron en un Phosphorimager.
El marcaje interno se realizó mediante reacciones quinasa con polinucleótido quinasa (PNK) y 32P-y-ATP, con adición de fosfato radiomarcado en el nucleótido 13 de la cadena 2, contando desde el lado 3'. El ligamiento de los fragmentos de 8 unidades restantes con ARN ligasa de T4 dio como resultado la cadena 2 de longitud completa de 21 unidades. La formación de dúplex de iARN se realizó añadiendo concentraciones apropiadas de los oligonucleótidos de ANic y calentando a 95°C durante 5 min seguido de un lento enfriamiento a temperatura ambiente. Las reacciones se realizaron añadiendo suero al 100% a los dúplex de ANic e incubando a 37°C, y después retirando alícuotas a los puntos temporales deseados. Los resultados de este estudio se resumen en la Figura 3. Como se muestra en la Figura 3, las moléculas de ANic modificadas químicamente (por ejemplo, las SEC ID N°: 925/927, 925/928, 925/929, 925/930 y 925/931) tienen una estabilidad en suero significativamente aumentada en comparación con una construcción de ANic que tiene todo ribonucleótidos excepto una modificación ditimidina (TT) 3'-terminal (por ejemplo, SEC ID N°: 925/926).
Ejemplo 3: Identificación de posibles sitios diana del ANic en cualquier secuencia de ARN
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Se exploró la secuencia de una diana de ARN de interés, tal como un transcrito de ARNm viral o humano, para detectar sitios diana, por ejemplo usando un algoritmo de plegamiento informatizado. En un ejemplo no limitante, se usa la secuencia de un gen o un transcrito de un gen de ARN derivado de una base de datos, tal como Genbank, para generar dianas de ANic que tienen complementariedad con la diana. Dichas secuencias pueden obtenerse a partir de una base de datos o pueden determinarse experimentalmente como se conoce en la técnica. Los sitios diana que se conocen, por ejemplo, los sitios diana que se ha determinado que son eficaces basándose en estudios con otras moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, ribozimas o antisentido, o las dianas que se sabe que están asociadas con una enfermedad o afección tal como los sitios que contienen mutaciones o deleciones, pueden usarse para diseñar moléculas de ANic que se dirijan a esos sitios. Pueden usarse varios parámetros para determinar qué sitios son los sitios diana más adecuados dentro de la secuencia de ARN diana. Esos parámetros incluyen, pero sin limitación, la estructura secundaria o terciaria del ARN, la composición de las bases de nucleótidos de la secuencia diana, el grado de homología entre diversas regiones de la secuencia diana o la posición relativa de la secuencia diana dentro del transcrito de ARN. Basándose en estas determinaciones, puede seleccionarse cualquier número de sitios diana dentro del transcrito de ARN para explorar moléculas de ANic para determinar su eficacia, por ejemplo, usando ensayos de escisión de ARN in vitro, cultivos de células o modelos animales. En un ejemplo no limitante, dentro del transcrito se seleccionan cualquiera de 1 a 1000 sitios diana basándose en el tamaño de la construcción de ANic a usar. Usando procedimientos conocidos en la técnica, pueden desarrollarse ensayos de exploración de alto rendimiento para explorar moléculas de ANic, tales como ensayos multipocillo o multiplaca o ensayos de exploración de bibliotecas combinatorias/ANic para determinar la reducción eficaz en la expresión del gen diana.
Ejemplo 4: Selección de sitios diana para la molécula de ANic en un ARN
Para realizar la selección de ANic que se dirigen a una secuencia génica o transcrito dado pueden usarse las siguientes etapas no limitantes.
La secuencia diana se descompone mediante simulación por ordenador en una lista de todos los fragmentos o subsecuencias de una longitud particular, por ejemplo, fragmentos de 23 nucleótidos, incluidos en la secuencia diana. Esta etapa se realiza típicamente usando un lenguaje de programación Perl habitual, aunque también pueden emplearse programas de análisis de secuencia comerciales tales como Oligo, MacVector o el Paquete Informático GCG de Wisconsin.
En algunos casos, los ANic corresponden a más de una secuencia diana; como sería el caso, por ejemplo, de la dirección a diferentes transcritos del mismo gen, la dirección a diferentes transcritos de más de un gen o la dirección tanto a los genes humanos como a un homólogo animal. En este caso, se genera una lista de subsecuencias de una longitud particular para cada una de las dianas y después las listas se comparan para encontrar las secuencias coincidentes en cada lista. Después, las subsecuencias se clasifican de acuerdo con el número de secuencias diana que contienen la subsecuencia determinada; el objetivo es encontrar subsecuencias que estén presentes en la mayoría o en todas las secuencias diana. Como alternativa, la clasificación puede identificar subsecuencias que sean únicas para una secuencia diana, tal como una secuencia diana mutante. Dicho enfoque permitiría el uso de un ANic para dirigirse específicamente a la secuencia mutante y no efectuar la expresión de la secuencia normal.
En algunos casos, las subsecuencias de ANic están ausentes en una o más secuencias aunque están presentes en la secuencia diana deseada; éste sería el caso cuando el ANic se dirige a un gen con un miembro de la familia parálogo que no debe ser diana. Como en el caso 2 anterior, se genera una lista de subsecuencias de una longitud particular para cada una de las dianas, y después las listas se comparan para encontrar secuencias que están presentes en el gen diana pero ausentes en el parálogo no diana.
Las subsecuencias de ANic clasificadas pueden analizarse y clasificarse adicionalmente de acuerdo con el contenido en GC. Puede proporcionarse una preferencia para sitios que contienen el 30-70% de GC, con una preferencia adicional para sitios que contienen el 40-60% de GC.
Las subsecuencias de ANic clasificadas pueden analizarse y clasificarse adicionalmente de acuerdo con el autoplegamiento y horquillas internas. Se prefieren los plegamientos internos más débiles; deben evitarse estructuras en horquilla fuertes.
Las subsecuencias de ANic clasificadas pueden analizarse y clasificarse adicionalmente según tengan series de GGG o CCC en la secuencia. GGG (o incluso más G) en cualquier cadena puede hacer problemática la síntesis de oligonucleótidos y potencialmente puede interferir con la actividad de la iARN, de manera que se evita siempre que se disponga de otras secuencias apropiadamente adecuadas. En la cadena diana se busca CCC porque esto situará a GGG en la cadena antisentido.
Las subsecuencias de ANic clasificadas pueden analizarse y clasificarse adicionalmente de acuerdo con si tienen el dinucleótido UU (dinucleótido de uridina) en el extremo 3' de la secuencia y/o AA en el extremo 5' de la secuencia (para proporcionar UU en 3' en la secuencia antisentido). Estas secuencias permiten el diseño de moléculas de ANic con
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dinucleótidos de timidina TT terminales.
De la lista de subsecuencias clasificada, como se ha descrito anteriormente, se seleccionan cuatro o cinco sitios diana. Por ejemplo, en subsecuencias que tienen 23 nucleótidos, los 21 nucleótidos a la derecha de cada subsecuencia de 23 unidades seleccionada se diseñan y sintetizan para la cadena superior (con sentido) del dúplex de ANic, mientras que el complementario inverso de los 21 nucleótidos a la izquierda de cada subsecuencia de 23 unidades seleccionada se diseña y se sintetiza para la cadena inferior (antisentido) del dúplex de ANic (véase la Tabla I). Si para la secuencia se desean restos TT terminales (como se describe en el párrafo 7), entonces los dos nucleótidos 3'-terminales de las cadenas con sentido y antisentido se sustituyen por TT antes de realizar la síntesis de los oligonucleótidos.
Las moléculas de ANic se exploran en un cultivo celular in vitro o en un sistema de modelo animal para identificar la molécula de ANic más activa o el sitio diana más preferido dentro de la secuencia de ARN diana.
En un enfoque alternativo, se usa un conjunto de construcciones de ANic específico para una secuencia diana para explorar sitios diana en células que expresan ARN diana, tales como células HeLa humanas. En la Figura 21 se muestra la estrategia general usada en este enfoque. Un ejemplo no limitante de dicho conjunto es un conjunto que comprende secuencias que tienen secuencias antisentido complementarias a la secuencia de ARN diana y secuencias con sentido complementarias a las secuencias antisentido. Las células (por ejemplo, células HeLa) que expresan el gen diana se transfectan con el conjunto de construcciones de ANic y se clasifican las células que demuestran un fenotipo asociado con silenciamiento génico. El conjunto de construcciones de ANic puede modificarse químicamente como se ha descrito en el presente documento y sintetizarse, por ejemplo, en un modo de alto rendimiento. Se identifica el ANic de células que demuestran un cambio fenotípico positivo (por ejemplo, niveles de ARNm diana o expresión de la proteína diana reducidos), por ejemplo por análisis posicional dentro del ensayo, y se usa para determinar el sitio (o los sitios) diana más adecuado dentro de la secuencia de ARN diana basándose en la secuencia complementaria a la cadena antisentido de ANic correspondiente identificada en el ensayo.
Ejemplo 5: Actividad de la iARN de construcciones de ANic modificadas químicamente
El ácido nucleico de interferencia corto (ANic) está surgiendo como una poderosa herramienta para la regulación génica. Los dúplex de ANic constituidos totalmente por ribosa activan la ruta de la iARN pero tienen utilidad limitada como compuestos terapéuticos debido a su sensibilidad a nucleasa y a la corta semivida en suero, como se muestra en el Ejemplo 2 anterior. Para desarrollar construcciones de ANic resistentes a nucleasa para aplicaciones in vivo, se ensayaron los ANic que se dirigen al ARNm de luciferasa y que contienen modificaciones químicas estabilizantes para determinar la actividad en células HeLa. En la Tabla I se muestran las secuencias para las secuencias de oligonucleótidos de ANic usadas en este estudio. Las modificaciones incluían enlaces fosforotioato (P=S), 2'O-metil nucleótidos o 2'-fluoro (F) nucleótidos en una o en las dos cadenas de ANic y diversas químicas de estabilización en el extremo 3', que incluyen 3'- glicerilo, abásico 3'-invertido, Timidina 3'-invertida y/o Timidina. El ANic activo que contiene modificaciones estabilizantes tales como las descritas en el presente documento debe resultar útil para aplicaciones in vivo.
Se utilizó un sistema indicador de luciferasa para ensayar la actividad de la iARN de las construcciones de ANic modificadas químicamente en comparación con construcciones de ANic constituidas por nucleótidos totalmente de ARN que contienen dos salientes de nucleótidos de timidina. Las cadenas con sentido y antisentido del ANic (20 uM de cada una) se hibridaron por incubación en tampón (acetato de potasio 100 mM, HEPES-KOH 30 mM, pH 7,4, acetato de magnesio 2 mM) durante 1 min a 90°C seguido de 1 hora a 37°C. Los plásmidos que codifican la luciferasa de luciérnaga (pGL2) y la luciferasa de renilla (pRLSV40) se adquirieron en Promega Biotech.
Se cultivaron células S3 HeLa a 37°C en DMEM con FBS al 5% y 24 horas antes de la transfección se sembraron 15.300 células en 100 ul de medio por pocillo de una placa de 96 pocillos. Para la transfección, se añadieron 4 ul de Lipofectamina 2000 (Life Technologies) a 96 ul de OPTI-MEM, se sometió a agitación vorticial y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después, se añadieron 100 ul de lípido diluido a un tubo de microtitulación que contenía 5 ul de pGL2 (200 ng/ul), 5 ul de pRLSV40 (8 ng/ul), 6 ul de ANic (25 nM o 10 nM final) y 84 ul de OPTI-MEM, la mezcla se sometió brevemente a agitación vorticial y se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. La mezcla de transfección se mezcló después brevemente y se añadieron 50 ul a cada uno de tres pocillos que contenían células S3 HeLa en 100 ul de medio. Las células se incubaron durante 20 horas después de la transfección y se analizaron para determinar la expresión de luciferasa usando el ensayo de luciferasa Doble de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega Biotech). Los resultados de este estudio se resumen en las Figuras 4-16. Las secuencias de las cadenas de ANic usadas en este estudio se muestran en la Tabla I y en las figuras se indican por N° RPI. La actividad luciferasa normalizada se indica como la proporción de la actividad luciferasa de luciérnaga con respecto a la actividad de luciferasa de renilla en la misma muestra. Las barras de error representan desviaciones típicas de transfecciones por triplicado. Como se muestra en las Figuras 4-16, la actividad de la iARN de las construcciones modificadas químicamente es comparable con la de las construcciones de ANic de control, que consisten por completo en ribonucleótidos en cada posición excepto el extremo 3' que comprende dos salientes de nucleótidos de timidina. En algunos casos, la actividad de la iARN de las construcciones modificadas químicamente es superior a la construcción de ANic que consiste por completo
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en ribonucleótidos en cada posición excepto el extremo 3' que comprende dos salientes de nucleótidos de timidina. Por ejemplo, la Figura 4 muestra los resultados obtenidos de una exploración usando construcciones de ANic modificadas con fosforotioato; la construcción RPI 27654/27659 contiene sustituciones de fosforotioato para cada nucleótido de pirimidina en ambas secuencias, la construcción RPI 27657/27662 contiene sustituciones de 3'-fosforotioato 5-terminales en cada cadena, la construcción RPI 27649/27658 contiene todas las sustituciones de fosforotioato solamente en la cadena antisentido, mientras que las construcciones RPI 27649/27660 y RPI 27649/27661 tienen cadenas con sentido no modificadas y grados de sustituciones de fosforotioato variables en la cadena antisentido. Todas estas construcciones muestran una actividad de iARN significativa cuando se comparan con un ANic desorganizado.
La Figura 5 muestra los resultados obtenidos de una exploración usando sustituciones con fosforotioato (RPI 28253/28255 y RPI 28254/28256) y sustituciones de bases universales (RPI 28257/28259 y RPI 28258/28260) en comparación con los mismos controles descritos anteriormente. Como se muestra, estas combinaciones muestran una actividad de iARN equivalente o mejorada cuando se compara con la construcción de ANic de control.
La Figura 6 muestra los resultados obtenidos de una exploración usando construcciones de ANic modificadas con 2'-O- metilo en las que la cadena con sentido contiene 10 (RPI 28244/27650) o 5 (RPI 28245/27650) sustituciones 2'-O-metilo, ambas con actividad comparable con la construcción de ANic de control.
La Figura 7 muestra los resultados obtenidos de una exploración usando construcciones de ANic modificadas con 2'-O- metilo o 2'-desoxi-2'-fluoro en comparación con una construcción de control que consiste completamente en ribonucleótidos en cada posición excepto en el extremo 3' que comprende dos salientes de nucleótidos de timidina.
La Figura 8 compara una construcción de ANic que contiene seis sustituciones de fosforotioato en cada cadena (RPI 28460/28461), en la que 5 fosforotioatos están presentes en el extremo 3' y un solo fosforotioato está presente en el extremo 5' de cada cadena. Este motivo muestra una actividad muy similar con respecto a la construcción de ANic de control que consiste completamente en ribonucleótidos en cada posición excepto en el extremo 3', que comprende dos salientes de nucleótidos de timidina.
La Figura 9 compara una construcción de ANic sintetizada por el procedimiento de la divulgación descrito en el Ejemplo 1, en el que se usó un engarce de succinato abásico desoxi invertido para generar un ANic que tiene una protección abásica desoxi invertida 3' en la cadena antisentido del ANic. Esta construcción muestra actividad mejorada en comparación con la construcción de ANic de control (siGL2) que consiste totalmente en ribonucleótidos en cada posición excepto en el extremo 3' que comprende dos salientes de nucleótidos de timidina.
La Figura 10 muestra los resultados de una exploración de la actividad de la iARN de construcciones de ANic modificadas químicamente que incluyen construcciones de ANic modificadas con 3'-glicerilo en comparación con una construcción de ANic de control toda de ARN usando un sistema indicador de luciferasa. Estos ANic modificados químicamente se compararon en el ensayo de luciferasa descrito en el presente documento a una concentración de 1 nM y 10 nM usando un control de ANic todo de ARN (siGL2) que tenía ditimidina (TT) 3'-terminal y su correspondiente control invertido (Inv siGL2). La columna “células” indica el nivel de fondo de la expresión de luciferasa en las células HeLa. Las cadenas con sentido y antisentido de las construcciones de ANic modificadas químicamente se muestran mediante el número RPI (cadena con sentido/cadena antisentido). Las secuencias correspondientes a estos números RPI se muestran en la Tabla I. Como se muestra en la Figura, las construcciones de ANic modificadas en posición 3'-terminal conservan una actividad de iARN significativa en comparación con la construcción de ANic de control (siGL2).
La Figura 11 muestra los resultados de una exploración de la actividad de iARN de construcciones de ANic modificadas químicamente. La exploración comparaba diversas combinaciones de modificaciones químicas de la cadena con sentido y modificaciones químicas de la cadena antisentido. Estos ANic modificados químicamente se compararon en el ensayo de luciferasa descrito en el presente documento a una concentración de 1 nM y 10 nM usando un control de ANic todo de ARN (siGL2) que tiene ditimidina (TT) 3'-terminal (TT) y su correspondiente control invertido (Inv siGL2). La columna “células” indica el nivel de fondo de la expresión de luciferasa en las células HeLa. Las cadenas con sentido y antisentido de las construcciones de ANic modificadas químicamente se muestran mediante el número RPI (cadena con sentido/cadena antisentido). Las secuencias correspondientes a estos números RPI se muestran en la Tabla I. Como se muestra en la figura, las construcciones RPI 30063/30430, RPI 30433/30430 y RPI 30063/30224 modificadas químicamente conservan una actividad de iARN significativa en comparación con la construcción de ANic de control. Debe observarse que la RPI 30433/30430 es una construcción de ANic que no tiene ribonucleótidos que conserva una actividad de iARN significativa en comparación con la construcción siGL2 de control in vitro, por lo tanto, se espera que esta construcción tenga una actividad de iARN similar y una estabilidad mejorada en comparación con las construcciones de ANic que tienen ribonucleótidos in vivo.
La Figura 12 muestra los resultados de una exploración de la actividad de iARN de construcciones de ANic modificadas químicamente. La exploración compara diversas combinaciones de modificaciones químicas de la cadena con sentido y modificaciones químicas de la cadena antisentido. Estos ANic modificados químicamente se compararon en el ensayo de luciferasa descrito en el presente documento a una concentración de 1 nM y 10 nM usando un control de ANic todo de
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ARN (siGL2) que tiene ditimidina (TT) 3'-terminal y su correspondiente control invertido (Inv siGL2). La columna “células” indica el nivel de fondo de la expresión de luciferasa en las células HeLa”. Las cadenas con sentido y antisentido de las construcciones de ANic modificadas químicamente se muestran mediante el número RPI (cadena con sentido/cadena antisentido). Las secuencias correspondientes a estos números RPI se muestran en la Tabla I. Como se muestra en la figura, las construcciones RPI 30063/30224 y RPI 30063/30430 modificadas químicamente conservan una actividad de iARN significativa en comparación con la construcción de ANic de control (siGL2). Además, se compararon la cadena antisentido en solitario (RPI 30430) y un control invertido (RPI 30227/30229, que tiene la misma química que el RPI 30063/30224) con los dúplex de ANic descritos anteriormente. La cadena antisentido (RPI 30430) en solitario proporciona mucha menos inhibición en comparación con los dúplex de ANic usando esta secuencia.
La Figura 13 muestra los resultados de una exploración de la actividad de iARN de construcciones de ANic modificadas químicamente. La exploración comparó diversas combinaciones de modificaciones químicas de la cadena con sentido y modificaciones químicas de la cadena antisentido. Estos ANic modificados químicamente se compararon en el ensayo de luciferasa descrito en el presente documento a una concentración de 1 nM y 10 nM usando un control de ANic todo de ARN (siGL2) que tiene ditimidina (TT) 3'-terminal y su correspondiente control invertido (Inv siGL2). La columna “células” indica el nivel de fondo de la expresión de luciferasa en las células HeLa. Las cadenas con sentido y antisentido de las construcciones de ANic modificadas químicamente se muestran mediante el número RPI (cadena con sentido/cadena antisentido). Las secuencias correspondientes a estos números RPI se muestran en la Tabla I. Además, se comparó un control invertido (RPI 30226/30229, que tenía la misma química que el RPI 30222/30224) con los dúplex de ANic descritos anteriormente. Como se muestra en la figura, las construcciones RPI 28251/30430, RPI 28251/30224 y RPI 30222/30224 modificadas químicamente conservan una actividad de iARN significativa en comparación con las construcciones de ANic de control, y la construcción RPI 28251/30430 modificada químicamente demuestra una actividad mejorada en comparación con la construcción de ANic de control (siGL2).
La Figura 14 muestra los resultados de una exploración de la actividad de la iARN de construcciones de ANic modificadas químicamente que incluyen diversas construcciones de ANic modificadas en posición 3'- terminal en comparación con una construcción de ANic de control toda de ARN usando un sistema indicador de luciferasa. Estos ANic modificados químicamente se compararon en el ensayo de luciferasa descrito en el presente documento a una concentración de 1 nM y 10 nM usando un control de ANic todo de ARN (siGL2) que tiene ditimidina (TT) 3'-terminal y su correspondiente control invertido (Inv siGL2). La columna “células” indica el nivel de fondo de la expresión de luciferasa en las células HeLa. Las cadenas con sentido y antisentido de las construcciones de ANic modificadas químicamente se muestran mediante el número RPI (cadena con sentido/cadena antisentido). Las secuencias correspondientes a estos números RPI se muestran en la Tabla I. Como se muestra en la figura, las construcciones RPI 30222/30546, 30222/30224, 30222/30551, 30222/30557 y 30222/30558 modificadas químicamente conservan una actividad de iARN significativa en comparación con la construcción de ANic de control.
La Figura 15 muestra los resultados de una exploración de la actividad de iARN de construcciones de ANic modificadas químicamente. La exploración comparó diversas combinaciones de químicas de cadena con sentido en comparación con una química de cadena antisentido fijada. Estos ANic modificados químicamente se compararon en el ensayo de luciferasa descrito en el presente documento a una concentración de 1 nM y 10 nM usando un control de ANic todo de ARN (siGL2) que tiene ditimidina (TT) 3'-terminal y su correspondiente control invertido (Inv siGL2). La columna “células” indica el nivel de fondo de la expresión de luciferasa en las células HeLa. Las cadenas con sentido y antisentido de las construcciones de ANic modificadas químicamente se muestran por el número RPI (cadena con sentido/cadena antisentido). Las secuencias correspondientes a estos números RPI se muestran en la Tabla I. Como se muestra en la figura, todas las construcciones RPI 30063/30430, 30434/30430 y 30435/30430 modificadas químicamente demuestran una mayor actividad en comparación con la construcción de ANic de control (siGL2).
Ejemplo 6: Titulación de la actividad de iARN
Se realizó un ensayo de titulación para determinar el intervalo inferior de la concentración de ANic necesaria para la actividad de iARN en una construcción de ANic de control que consiste en nucleótidos de ARN por completo que contiene dos salientes del nucleótido timidina y una construcción de ANic modificada químicamente que comprende 5 enlaces fosforotioato internucleotídicos tanto en la cadena con sentido como en la antisentido. El ensayo se realizó como se ha descrito anteriormente, sin embargo, las construcciones de ANic se diluyeron a concentraciones finales de entre 2,5 nM y 0,025 nM. Los resultados se muestran en la Figura 16. Como se muestra en la Figura 16, la construcción de ANic modificada químicamente muestra un perfil de la actividad de iARN dependiente de la concentración muy similar al de la construcción de ANic de control cuando se comparó con un control de secuencia de ANic invertida.
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Ejemplo 7: Diseño del ANic
Se seleccionaron sitios diana del ANic analizando secuencias del ARN diana y priorizando opcionalmente los sitios diana basándose en el plegamiento (estructura de cualquier secuencia determinada analizada para determinar la accesibilidad del ANic a la diana), usando una biblioteca de moléculas de ANic como se describe en el Ejemplo 4 o, de manera alternativa, usando un sistema de ANic in vitro como se describe en el Ejemplo 9 en el presente documento. Se diseñaron moléculas de ANic que pudieran unirse a cada diana y se analizaron de manera opcional individualmente por plegamiento informatizado para evaluar si la molécula de ANic podía interaccionar con la secuencia diana. Para optimizar la actividad, puede seleccionarse la variación de la longitud de las moléculas de ANic. Generalmente, se selecciona una cantidad suficiente de bases de nucleótidos complementarias para unirse a, o interaccionar de otra manera con, el ARN diana, pero el grado de complementariedad puede modularse para acomodar dúplex de ANic o longitudes o composiciones de bases variables. Usando dichas metodologías, pueden diseñarse moléculas de ANic para sitios diana dentro de cualquier secuencia de ARN conocida, por ejemplo las secuencias de ARN correspondientes a cualquier trascripto génico.
Se diseñan construcciones de ANic modificadas químicamente para proporcionar estabilidad frente a nucleasas para la administración sistémica in vivo y/o propiedades farmacocinéticas, de localización y suministro mejoradas conservando al mismo tiempo la capacidad de mediar la actividad de iARN. Las modificaciones químicas como se describe en el presente documento se introducen sintéticamente usando procedimientos sintéticos descritos en el presente documento y los conocidos generalmente en la técnica. Después, las construcciones de ANic sintéticas se ensayan para determinar la estabilidad frente a nucleasas en suero y/o en extractos celulares/tisulares (por ejemplo, extractos de hígado). Las construcciones de ANic sintéticas también se ensayan en paralelo para determinar la actividad de iARN usando un ensayo apropiado, tal como un ensayo indicador de luciferasa como se describe en el presente documento u otro ensayo adecuado que pueda cuantificar la actividad de iARN. Las construcciones de ANic sintéticas que poseen estabilidad a nucleasa y actividad de iARN pueden modificarse adicionalmente y volverse a evaluar en ensayos de estabilidad y actividad. Después, las modificaciones químicas de las construcciones de ANic activas estabilizadas pueden aplicarse a cualquier secuencia de ANic que se dirija a cualquier ARN seleccionado y usarse, por ejemplo, en ensayos de exploración de dianas para escoger compuestos de ANic líderes para el desarrollo terapéutico (véase, por ejemplo, la Figura 24).
Ejemplo 8: Síntesis Química y Purificación de ANic
Pueden diseñarse moléculas de ANic para interaccionar con diversos sitios en el ARN mensajero, por ejemplo, secuencias diana dentro de las secuencias de ARN descritas en el presente documento. La secuencia de una cadena de la molécula (o moléculas) de ANic es complementaria a las secuencias del sitio diana descritas anteriormente. Las moléculas de ANic pueden sintetizarse químicamente usando procedimientos descritos en el presente documento. Pueden sintetizarse moléculas de ANic inactivas que se usan como secuencias de control desorganizando la secuencia de las moléculas de ANic de tal manera que no sea complementaria a la secuencia diana. Generalmente, pueden sintetizarse construcciones de ANic usando procedimientos de síntesis de oligonucleótidos en fase sólida como se describe en el presente documento (véase por ejemplo Usman y col., Patentes de Estados Unidos N° 5.804.683; 5.831.071; 5.998.203; 6.117.657; 6.353.098; 6.362.323; 6.437.117; 6.469.158; Scaringe y col., Patentes de Estados Unidos N° 6.111.086; 6.008.400; 6.111.086).
En un ejemplo no limitante, los oligonucleótidos de ARN se sintetizan por etapas usando la química de fosforamidita como se conoce en la técnica. La química convencional de fosforamidita implica el uso de nucleósidos que comprenden cualquiera de los grupos 5'-O-dimetoxitritilo, 2'-O-terc-butildimetilsililo, 3'-O-2- cianoetil N,N-diisopropilfosforamidita y grupos de protección de amina exocíclicos (por ejemplo N6-benzoil adenosina, N4 acetil citidina y N2-isobutiril guanosina). De manera alternativa, pueden usarse éteres de 2'-O-sililo junto con grupos de protección 2'-O-ortoéster lábil a ácidos en la síntesis del ARN como describe Scaringe, citado anteriormente. Diferentes químicas 2' pueden requerir diferentes grupos de protección, por ejemplo los nucleósidos 2'-desoxi-2'amino pueden utilizar la protección con N-ftaloílo como describen Usman y col., en la Patente de Estados Unidos 5.631.360).
Durante la síntesis en fase sólida, cada nucleótido se añade secuencialmente (en dirección 3' a 5') al oligonucleótido unido al soporte sólido. El primer nucleósido en el extremo 3' de la cadena se une covalentemente a un soporte sólido (por ejemplo, vidrio o poliestireno de tamaño de poro controlado) usando diversos engarces. Se combinan el precursor del nucleótido, una fosforamidita de ribonucleósido y un activador dando como resultado el acoplamiento de la segunda fosforamidita de nucleósido sobre el extremo 5' del primer nucleósido. Después, el soporte se lava y todos los grupos 5'-hidroxilo que no han reaccionado se protegen con un reactivo de protección tal como anhídrido acético para proporcionar restos 5'-acetilo inactivos. Después, el enlace fosforoso trivalente se oxida para proporcionar un enlace fosfato más estable. Al final del ciclo de adición de nucleótidos, el grupo de protección 5'-O se escinde en condiciones adecuadas (por ejemplo, condiciones ácidas para grupos basados en tritilo y fluoruro para grupos basados en sililo). El ciclo se repite para cada nucleótido posterior.
La modificación de las condiciones de síntesis puede usarse para optimizar la eficacia de acoplamiento usando,
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por ejemplo, diferentes tiempos de acoplamiento, diferentes concentraciones de reactivo/fosforamidita, diferentes tiempos de contacto, diferentes soportes sólidos y químicas de engarces de soporte sólido dependiendo de la composición química particular del ANic a sintetizar. La desprotección y purificación del ANic puede realizarse como describen generalmente Usman y col., en los documentos US 5.831.071, US 6.353.098, US 6.437.117, y Bellon y col., en los documentos US 6.054.576, US 6.162.909, US 6.303.773, incorporados por referencia en el presente documento en su totalidad o Scaringe citado anteriormente. Adicionalmente, las condiciones de desprotección pueden modificarse para proporcionar el mejor rendimiento y pureza posibles de las construcciones de ANic. Por ejemplo, el solicitante ha observado que los oligonucleótidos que comprenden 2'-desoxi-2'-fluoro nucleótidos pueden degradarse en condiciones de desprotección inadecuadas. Dichos oligonucleótidos se desprotegen usando metilamina acuosa a aproximadamente 35°C durante 30 minutos. Si el oligonucleótido que contiene 2'-desoxi-2'-fluoro también comprende ribonucleótidos, después de la desprotección con metilamina acuosa a aproximadamente 35°C durante 30 minutos, se añade TEA-HF y la reacción se mantiene a aproximadamente 65°C durante 15 minutos adicionales.
Ejemplo 9: Ensayo in vitro de la iARN para evaluar la actividad del ANic
Se usó un ensayo in vitro que resume la iARN en un sistema acelular para evaluar las construcciones de ANic específicas para el ARN diana. El ensayo comprende el sistema descrito por Tuschl y col., 1999, Genes and Development, 13, 3191-3197 y Zamore y col., 2000, Cell, 101, 25-33 adaptado para su uso con ARN diana. Se usó un extracto de Drosophila derivado de blastodermo sincitial para reconstituir la actividad de la iARN in vitro. El ARN diana se generó mediante transcripción in vitro a partir de un plásmido apropiado usando ARN polimerasa de T7 o mediante síntesis química como se describe en el presente documento. Las cadenas de ANic con sentido y antisentido (cada una, por ejemplo, a 20 uM) se hibridaron por incubación en tampón (tal como acetato de potasio 100 mM, HEPES-KOH 30 mM, pH 7,4, acetato de magnesio 2 mM) durante 1 minuto a 90°C seguido de 1 hora a 37°C, y después se diluyeron en tampón de lisis (por ejemplo acetato de potasio 100 mM, HEPES-KOH 30 mM a pH 7,4, acetato de magnesio 2 mM). La hibridación puede controlarse por electroforesis en gel sobre un gel de agarosa en tampón de TBE y teñirse con bromuro de etidio. El lisado de Drosophila se preparó usando embriones de cero a dos horas de edad de moscas Oregon R recogidos sobre agar de melaza fermentado que están desprovistos de corion y lisados. El lisado se centrifugó y el sobrenadante se aisló. El ensayo comprendía una mezcla de reacción que contenía lisado al 50% [vol/vol], ARN (concentración final de 10-50 pM) y tampón de lisis al 10% [vol/vol] que contenía ANic (concentración final de 10 nM). La mezcla de reacción también contenía fosfato de creatina 10 nM, creatina fosfoquinasa a 10 ug.ml, GTP 100 uM, UTP 100 uM, CTP 100 uM, ATP 500 uM, DTT 5 mM, RNasin 0,1 U/ul (Promega), y 100 uM de cada aminoácido. La concentración final de acetato potásico se ajustó a 100 mM. Las reacciones se pre-ensamblaron en hielo y se preincubaron a 25°C durante 10 minutos antes de añadir ARN, después se incubaron a 25°C durante 60 minutos adicionales. Las reacciones se inactivaron con 4 volúmenes de 1,25 x de Tampón de Lisis Pasivo (Promega). La escisión del ARN diana se ensayó mediante análisis RT-PCR u otros procedimientos conocidos en la técnica y se comparó con las reacciones de control en las que se excluyó el ANic de la reacción.
Como alternativa, para el ensayo se preparó ARN diana marcado internamente mediante transcripción in vitro en presencia de [alfa-32P]CTP, pasado sobre una columna G50 Sephadex por cromatografía tipo spin y se usó como ARN diana sin purificación adicional. Opcionalmente, el ARN diana se marcó en el extremo 5' con 32P usando la enzima polinucleótido quinasa de T4. Los ensayos se realizaron como se ha descrito anteriormente y el ARN diana y los productos de escisión del ARN específicos generados por la iARN se visualizaron sobre una autorradiografía de un gel. El porcentaje de escisión se determinó por cuantificación mediante Phosphor Imager® de bandas que representan ARN de control intacto o ARN de reacciones de control sin ANic y los productos de escisión generados por el ensayo.
En una realización, este ensayo se usó para determinar sitios diana del ARN diana para la escisión de iARN mediada por ANic, en el que se exploró una pluralidad de construcciones de ANic para la escisión del ARN diana mediada por iARN, por ejemplo, analizando la reacción de ensayo por electroforesis del ARN diana marcado o por transferencia de Northern, así como por otra metodología bien conocida en la técnica.
Ejemplo 10: Inhibición por ácido nucleico de ARN diana in vivo
Se diseñaron moléculas de ANic dirigidas al ARN diana y se sintetizaron como se ha descrito anteriormente. Estas moléculas de ácido nucleico pueden ensayarse para determinar la actividad de escisión in vivo, usando, por ejemplo, el siguiente procedimiento.
Se usaron dos formatos para ensayar la eficacia de los ANic que se dirigen a un transcrito génico particular. En primer lugar, se ensayaron los reactivos en células de expresión diana (por ejemplo, HeLa), para determinar el grado de inhibición del ARN y de la proteína. Se seleccionaron reactivos del ANic frente a la diana de ARN. La inhibición del ARN se midió después de administrar estos reactivos mediante un agente de transfección adecuado
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a células. Las cantidades relativas del ARN diana se midieron frente a actina usando PCR a tiempo real controlando la amplificación (por ejemplo, ABI 7700 Taqman®). Se realizó una comparación con una mezcla de secuencias de oligonucleótidos fabricada para dianas no relacionadas o para un control de ANic aleatorizado con la misma longitud y química global, pero sustituidas aleatoriamente en cada posición. Se seleccionaron reactivos primarios y secundarios líder para la diana y se realizó la optimización. Después de seleccionar una concentración de agente de transfección óptima, se realizó un transcurso de tiempo de inhibición de ARN con la molécula de ANic líder. Además, para determinar la inhibición del ARN, puede usarse un formato de siembra de células en placa.
Suministro del ANic a células
El día anterior a la transfección, se sembraron células (por ejemplo HeLa), por ejemplo, a 1 x 105 células por pocillo de una placa de seis pocillos, en EGM-2 (BioWhittaker). Se formó un complejo de ANic (concentración final, por ejemplo, 20 nM) y lípido catiónico (por ejemplo, concentración final 2 |ig/ml) en medio basal EGM (BioWhittaker) a 37°C durante 30 minutos en tubos de poliestireno. Después de someter a agitación vorticial, el ANic que formaba complejos se añadió a cada pocillo y se incubó durante los tiempos indicados. Para los experimentos de optimización iniciales, las células se sembraron, por ejemplo, a 1 x 103 en placas de 96 pocillos y se añadieron los complejos de ANic como se describe. La eficacia del suministro de ANic a las células se determinó usando un ANic fluorescente que formaba complejos con lípido. Las células en placas de 6 pocillos se incubaron con ANic durante 24 horas, se aclararon con PBS y se fijaron en paraformaldehído al 2% durante 15 minutos a temperatura ambiente. La captación de ANic se visualizó usando un microscopio fluorescente.
Cuantificación del ARNm por Taqman y Lightcycler
Se preparó ARN total a partir de células después de suministro del ANic, por ejemplo, usando kits de purificación de ARN Qiagen para ensayos de 6 pocillos o kits de extracción Rneasy para ensayos de 96 pocillos. Para el análisis Taqman, se sintetizaron sondas doblemente marcadas con el colorante indicador, FAM o JOE, unido covalentemente al extremo 5' y el colorante de inactivación TAMRA conjugado al extremo 3'. Se realizaron amplificaciones por RT-PCR de una etapa en, por ejemplo, el Detector de Secuencia ABI PRISM 7700 usando reacciones de 50 |il que consistían en 10 |il de ARN total, cebador directo 100 nM, cebador inverso 900 nM, sonda 100 nM, tampón de reacción de PCR TaqMan 1X (PE-Applied Biosystems), MgCh 5,5 nM, 300 |iM de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP, inhibidor de RNasa 10U (Promega), 1,25 U de AmpliTaq Gold (PE-Applied Biosystems) y 10 U de Transcriptasa Inversa M-MLV (Promega). Las condiciones de ciclado térmico pueden consistir en 30 min a 48°C, 10 min a 95°C, seguido por 40 ciclos de 15 s a 95°C y 1 min a 60°C. La cuantificación de los niveles del ARNm se determina con respecto a los patrones generados a partir de ARN celular total diluido en serie (300, 100, 33, 11 ng/rxn) y normalizados con respecto al ARNm de p-actina o GAPDH en reacciones TaqMan en paralelo. Para cada gen de interés se diseñó un cebador superior e inferior y una sonda marcada con fluorescencia. La incorporación a tiempo real del colorante SYBR Green I en un producto de PCR específico puede medirse en tubos capilares de vidrio usando un lightcyler. Se generó una curva patrón para cada par de cebadores usando ARNc de control. Los valores se representaron como expresión relativa con respecto a GAPDH en cada muestra.
Transferencia de Western
Se pueden preparar extractos nucleares usando una técnica de micropreparación convencional (véase, por ejemplo, Andrews y Faller, 1991, Nucleic Acids Research, 19, 2499). Se prepararon extractos de proteínas a partir de sobrenadante usando, por ejemplo, precipitación con TCA. Se añadió un volumen igual de TCA al 20% al sobrenadante celular, se incubó sobre hielo durante 1 hora y se sedimentó por centrifugación durante 5 min. Los sedimentos se lavaron en acetona, se secaron y se resuspendieron en agua. Los extractos de proteína celular se procesaron sobre un gel de poliacrilamida Bis-Tris NuPage al 10% (extractos nucleares) o Tris-Glicina al 4-12% (extractos de sobrenadante) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. La unión inespecífica se puede bloquear mediante incubación, por ejemplo, con leche desnatada al 5% durante 1 hora seguido por anticuerpo primario durante 16 horas a 4°C. Después de los lavados, se aplicó el anticuerpo secundario, por ejemplo (dilución 1:10.000) durante 1 hora a temperatura ambiente y se detectó la señal con el reactivo SuperSignal (Pierce).
Ejemplo 11: Modelos Animales
Pueden usarse diversos modelos animales para explorar construcciones de ANic in vivo como se conoce en la técnica, por ejemplo, los modelos animales que se usan para evaluar otras tecnologías de ácido nucleico tales como moléculas de ácido nucleico enzimáticas (ribozimas) y/o antisentido. Dichos modelos animales se usan para ensayar la eficacia de las moléculas de ANic descritas en este documento. En un ejemplo no limitante, las moléculas de ANic que se diseñan como agentes antiangiogénicos pueden explorarse en modelos animales. Existen varios modelos animales en los que el efecto antiangiogénesis de los ácidos nucleicos de la presente invención, tales como el ANic, se dirigía contra genes asociados con la angiogénesis y/o metástasis, tales como
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genes VEGFR (por ejemplo, VEGFR1, VEGFR2 y VEGFR3). Típicamente se ha usado un modelo de córnea para estudiar la angiogénesis en rata y conejo, ya que en este tejido normalmente avascular se puede seguir fácilmente el reclutamiento de vasos sanguíneos (Pandey y col., 1995 Science 268: 567-569). En estos modelos, un pequeño disco de Teflón o Hydron previamente tratado con un factor de angiogénesis (por ejemplo bFGF o VEGF) se inserta dentro de un bolsillo creado quirúrgicamente en la córnea. La angiogénesis se controla de 3 a 5 días después. También se suministran en el disco moléculas de ANic dirigidas contra los ARNm de VEGFR o se administran gota a gota en el ojo durante el transcurso del experimento. En otro modelo ocular, se ha demostrado que la hipoxia produce tanto una expresión aumentada de VEGF como neovascularización en la retina (Pierce y col., 1995 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92: 905-909; Shweiki y col., 1992 J. Clin. Invest. 91: 2235-2243).
Existen varios modelos animales para explorar agentes antiangiogénicos. Éstos incluyen la formación de vasos en la córnea después de una lesión de la córnea (Burger y col., 1985 Cornea 4: 35-41; Lepri, y col., 1994 J. Ocular Pharmacol. 10: 273-280; Ormerod y col., 1990 Am. J. Pathol. 137: 1243-1252) o el implante del factor de crecimiento intracorneal (Grant y col., 1993 Diabetologia 36: 282-291; Pandey y col. 1995, mencionado anteriormente; Zieche y col., 1992 Lab. Invest. 67: 711-715), o el crecimiento de vasos en la matriz de Matrigel que contenía factores de crecimiento (Passaniti y col., 1992 mencionado anteriormente), neovascularización de los órganos reproductores femeninos después de manipulación hormonal (Shweiki y col., 1993 Clin. Invest. 91: 22352243), implicando varios modelos la inhibición del crecimiento tumoral en tumores sólidos muy vascularizados (O'Reilly y col., 1994 Cell 79: 315-328; Senger y col., 1993 Cancer and Metas. Rev. 12: 303-324; Takahasi y col., 1994 Cancer Res. 54: 4233-4237; Kim y col., 1993, mencionados anteriormente) y neovascularización inducida por hipoxia transitoria en la retina de ratón (Pierce y col., 1995 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92: 905-909).
El modelo de córnea, descrito en Pandey y col., mencionado anteriormente, es el modelo de exploración de la eficacia de agentes anti-angiogénicos más habitual y está bien caracterizado. Este modelo implica un tejido avascular en el que se reclutan vasos mediante un agente de estimulación (factor de crecimiento, quemadura térmica o alcalina, endotoxina). El modelo de córnea utilizaría el implante de córnea intraestromático de un microgránulo de Teflón empapado en una solución de VEGF-Hydron para reclutar vasos sanguíneos hacia el microgránulo, lo cual puede cuantificarse usando técnicas microscópicas convencionales y de análisis por imagen. Para evaluar su eficacia anti-angiogénica, se aplican ribozimas tópicamente en el ojo o unidas con Hydron en el propio microgránulo de Teflón. Esta córnea avascular, así como el modelo Matrigel proporcionan ensayos de bajo efecto de fondo. Aunque el modelo de córnea se ha realizado ampliamente en el conejo, también se han realizado estudios en rata.
El modelo de ratón (Passaniti y col., mencionado anteriormente) es un modelo no tisular que utiliza Matrigel, un extracto de membrana basal (Kleinman y col., 1986) o discos de filtro Millipore®, que pueden impregnarse con factores de crecimiento y agentes anti-angiogénicos en una forma líquida antes de la inyección. Después de la administración subcutánea a temperatura corporal, el Matrigel o los discos de filtro Millipore® forman un implante sólido. El VEGF impregnado en el Matrigel o disco de filtro Millipore® se usa para reclutar vasos dentro de la matriz de Matrigel o disco de filtro Millipore®, que puede procesarse histológicamente para inmunohistoquímica vWF (antígeno del factor VIII) específica de células endoteliales, tinción Trichrome-Masson o contenido de hemoglobina. Del mismo modo que la córnea, el Matrigel o el disco de filtro Millipore® son avasculares; sin embargo, no son tejidos. En el modelo Matrigel o de disco de filtro Millipore®, las moléculas de ANic se administran dentro de la matriz de Matrigel o del disco de filtro Millipore® para ensayar su eficacia anti-angiogénica. Por lo tanto, las cuestiones de suministro en este modelo, así como con el suministro de moléculas de ANic mediante microgránulos de Teflón revestidos con Hydron en el modelo de córnea de rata, pueden ser menos problemáticas debido a la presencia homogénea del ANic dentro de la matriz respectiva.
Los modelos de carcinoma pulmonar de Lewis y de melanoma murino B-16 son modelos bien aceptados de cáncer primario y metastásico y se usan para la exploración inicial de agentes anticancerosos. Estos modelos murinos no dependen del uso de ratones inmunodeficientes, son relativamente económicos y minimizan las preocupaciones de alojamiento. Los modelos tanto pulmonar de Lewis como de melanoma B-16 implican el implante subcutáneo de aproximadamente 106 células tumorales de líneas de células tumorales agresivas desde el punto de vista metastásico (líneas pulmonares de Lewis 3LL o D122, LLc-LN7; melanoma B-16-BL6) en ratones C57BL/6J. Como alternativa, el modelo pulmonar de Lewis puede producirse por implante quirúrgico de esferas tumorales (aproximadamente 0,8 mm de diámetro). La metástasis también puede configurarse inyectando directamente las células tumorales i.v. En el modelo pulmonar de Lewis, pueden observarse metástasis microscópicas aproximadamente 14 días después del implante con tumores metastásicos macroscópicos cuantificables desarrollados a los 21-25 días. El melanoma B-16 muestra una evolución temporal similar con neovascularización tumoral comenzando 4 días después del implante. Ya que en estos modelos existen tumores tanto primarios como metastásicos después de 21-25 días en el mismo animal, pueden tomarse múltiples mediciones como índices de eficacia. Puede cuantificarse el volumen y la latencia de crecimiento del tumor primario así como el número de focos pulmonares metastásicos micro- y macroscópicos o número de animales que muestran metástasis. También
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puede medirse el porcentaje de aumento de duración de la vida. Por lo tanto, estos modelos proporcionan ensayos primarios de eficacia adecuados para explorar sistémicamente las moléculas de ANic y formulaciones de ANic administradas.
En los modelos pulmonar de Lewis y de melanoma B-16, normalmente la farmacoterapia sistémica con una amplia diversidad de agentes comienza 1-7 días después del implante/inoculación tumoral con regímenes de administración continuos o múltiples. Pueden realizarse estudios farmacocinéticos simultáneos para determinar si pueden conseguirse niveles suficientes de ANic en tejido para esperar el efecto farmacodinámico. Adicionalmente, pueden retirarse tumores primarios y metástasis pulmonares secundarias y someterse a una diversidad de estudios in vitro (es decir, reducción del ARN diana).
Utilizando estos modelos para evaluar la actividad de ANic, pueden medirse niveles de proteína VEGFR1, VEGFR2 y/o VEGFR3 clínica o experimentalmente mediante análisis FACS. Los niveles de ARNm que codifican VEGFR1, VEGFR2 y/o VEGFR3 se evaluarán mediante análisis de Northern, protección frente a RNasa, análisis de extensión cebador y/o RT-PCR cuantitativa. De esta manera, pueden identificarse moléculas de ANic que bloquean los ARNm que codifican las proteínas VEGFR1, VEGFR2 y/o VEGFR3 y, por lo tanto, dan como resultado niveles disminuidos de actividad VEGFR1, VEGFR2 y/o VEGFR3 en más del 20% in vitro.
Ejemplo 12: Inhibición de la angiogénesis in vivo mediada por ANic
El fin de este estudio era evaluar la actividad antiangiogénica de ANic dirigida contra VEGFR1 en el modelo de córnea de rata de angiogénesis inducida por VEGF (véase anteriormente). Estas moléculas de ANic tienen controles invertidos correspondientes que son inactivos ya que no son capaces de interaccionar con la diana de ARN. Las moléculas de ANic y VEGF se suministraron conjuntamente usando el procedimiento del disco de filtro: discos de filtro de Nitrocelulosa (Millipore®) de 0,057 de diámetro se sumergieron en soluciones apropiadas y se implantaron quirúrgicamente en córneas de rata como describen Pandey y col., mencionado anteriormente.
El estímulo para la angiogénesis en este estudio fue el tratamiento del disco de filtro con VEGF 30 |iM que se implantó dentro del estroma de la córnea. Esta dosis produce neovascularización reproducible que parte del plexo vascular pericorneal que crece hacia el disco en un estudio de respuesta a la dosis 5 días después del implante. Los discos de filtro tratados solamente con el vehículo para VEGF no muestran respuesta angiogénica. El ANic se administró conjuntamente con VEGF en un disco en dos concentraciones de ANic diferentes. Una preocupación con la administración simultánea es que el ANic no sería capaz de inhibir la angiogénesis, ya que los receptores del VEGF pueden estimularse. Sin embargo, el Solicitante ha observado que a dosis bajas de VEGF, la respuesta neovascular se vuelve normal, lo que sugiere que el estímulo de VEGF es esencial para mantener la respuesta angiogénica. El bloqueo de la producción de los receptores de VEGF usando la administración simultánea de ANic de ARNm anti-VEGFR atenuaría la neovascularización normal inducida por el disco de filtro tratado con VEGF.
Materiales y Procedimientos:
Compuestos de Ensayo y Controles
VEGF de Systems R&D, sin vehículo a 75 |iM en Tris-Cl 82 mM, pH 6,9
ANic, 1,67 |ig/|il, SITIO 2340 (SEC ID N°: 2; SEC ID N°: 6) con sentido/antisentido
ANic, 1,67 |ig/|il, CONTROL INVERTIDO PARA EL SITIO 2340 (SEC ID N°: 19; SEC ID N°: 20) con sentido/antisentido
ANic 1,67 |ig/|il, Sitio 2340 (SEC ID N°: 419; SEC ID N°: 420) con sentido/antisentido Animales
Ratas Harlan Sprague-Dawley, Aproximadamente 225-250 g 45 machos, 5 animales por grupo.
Cría
Los animales se alojan en grupos de dos. El alimento, el agua, la temperatura y la humedad se determinan de acuerdo con las normas de funcionamiento de Instalaciones de Ensayo de Farmacología (SOP), que están de acuerdo con la Guía de 1996 para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (NRC). Los animales se aclimatan a la instalación durante al menos 7 días antes de la experimentación. Durante este tiempo, los animales se observan para determinar la salud global y se toman muestras de sangre de centinelas para determinar la serología basal.
Grupos Experimentales
Cada solución (VEGF y ANic) se preparó como una solución 1X para las concentraciones finales mostradas en los
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grupos experimentales descritos en la Tabla III. Condiciones de Hibridación de ANic
Las cadenas sentido y antisentido de ANic se hibridan durante 1 minuto en H2O a 1,67 mg/ml/cadena seguido por 1 hora de incubación a 37°C, produciendo 3,34 mg/ml de ANic en dúplex. Para el tratamiento de 20 |ig/ojo, se inyectan 6 |il de los 3,34 mg/ml de dúplex en el ojo (véase mas adelante). Los 3,34 mg/ml de ANic dúplex después se pueden diluir en serie para ensayos de dosis respuesta.
Preparación de Disco de Filtro de VEGF
Para el implante corneal, discos de nitrocelulosa de 0,57 mm de diámetro, preparados a partir de membranas de filtro de nitrocelulosa con un diámetro de poro de 0,45 |im (Millipore Corporation), se empaparon durante 30 min en 1 |il de VEGF 75 |iM en Tris HCl 82 mM (pH 6,9) en placas de petri revestidas en hielo. Los discos de filtro empapados sólo con el vehículo para VEGF (Tris-Cl 83 mM pH 6,9) no provocan respuesta angiogénica.
Cirugía corneal
El modelo de córnea de rata usado en este estudio fue uno modificado a partir de Koch y col., mencionado anteriormente, y Pandey y col., mencionado anteriormente. En resumen, las córneas se irrigaron con solución de povidona y yodo al 0,5% seguido por solución salina normal y dos gotas de lidocaína al 2%. Bajo un microscopio de disección (Leica MZ-6), se creó un bolsillo estromático y se insertó un disco de filtro empapado previamente (véase anteriormente) en el bolsillo de forma que su borde estuviera a 1 mm del limbo corneal.
Inyección intraconjuntival de soluciones de ensayo
Inmediatamente después de la inserción del disco, se insertó la punta de un inyector OD de 40-50 |im (construido en el laboratorio de los presentes inventores) dentro del tejido conjuntival a 1 mm del borde del limbo corneal que era directamente adyacente al disco de filtro empapado en VEGF. Se dosificaron seiscientos nanolitros de solución de ensayo (ANic, control invertido o vehículo de agua estéril) a una velocidad de 1,2 |il/min usando una bomba de jeringa (Kd Scientific). Después se retiró el inyector, se enjuagó en serie en etanol al 70% y agua estéril y se sumergió en agua estéril entre cada inyección. Una vez inyectada la solución de ensayo, se mantuvo el párpado cerrado usando clips de microaneurisma hasta que el animal comenzó a recuperar la actividad motora general. Después del tratamiento, los animales se calentaron en una almohadilla calefactora a 37°C.
Cuantificación de la respuesta angiogénica
Cinco días después del implante del disco, los animales se sometieron a eutanasia después de la administración im de 0,4 mg/kg de atropina y se obtuvieron imágenes digitales de las córneas. El área de superficie neovascular (ASN, expresada en píxeles) se midió post mórtem a partir de los vasos corneales cargados de sangre usando morfometría computarizada (Image Pro Plus, Media Cybernetics, v2.0). El ASN media individual se determinó por triplicado a partir de tres regiones de tamaño idéntico en el área de neovascularización máxima entre el disco de filtro y el limbo. Se sumó el número de píxeles correspondiente a los vasos corneales cargados de sangre en estas regiones para producir un índice de ASN. Después se calculó un ASN media de grupo. Los datos de cada grupo de tratamiento de normalizaron para ASN de control tratado con vehículo de VEGF/ANic y finalmente se expresaron como un porcentaje de inhibición de la angiogénesis inducida por VEGF.
Estadística
Después de determinar la normalidad de las medias de grupo de tratamiento, el porcentaje de inhibición medio de grupo de angiogénesis inducida por VEGF se sometió a un análisis de varianza de una vía. Esto se siguió por dos ensayos post-hoc para determinar el significado, incluyendo el procedimiento de Dunnett (comparación con el control de VEGF) y Tukey-Kramer (todas las comparaciones de medias de grupo restantes) a alfa = 0,05. Se realizaron análisis estadísticos usando JMP v.3.1.6 (SAS Institute).
Los resultados se representan gráficamente en la Figura 23. Como se muestra en la Figura 23, ANic activos en el sitio 4229 de VEGFR1 a tres concentraciones fueron eficaces para inhibir la angiogénesis en comparación con el control de ANic invertido y el control de VEGF. Una versión modificada químicamente del ANic activo en el sitio 4229 de VEGFR1 que comprende una cadena con sentido que tiene 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidinas y ribo purinas con restos abásicos desoxi invertidos 5'- y 3'-terminales (SEC ID N°: 419) y una cadena antisentido que tiene 2'- desoxi-2'-fluoro pirimidinas y ribo purinas con un enlace internucleotídico de 3'-fosforotioato terminal (SEC ID N°: 420), mostraron una inhibición similar. Este resultado muestra que las moléculas de ANic de composición modificada químicamente diferentes de la divulgación son capaces de inhibir significativamente la angiogénesis in vivo.
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Se ensayaron construcciones de ANic (Tabla I) para determinar su eficacia para reducir la expresión de ARN de EGFR (HER1) en células A549. Las células A549 se sembraron aproximadamente 24 h antes de la transfección en placas de 96 pocillos a 5.000-7.500 células/pocillo, 100 |il/pocillo, de forma que en el momento de la transfección las células tuvieran una confluencia del 70-90%. Para la transfección, se mezclaron ANic hibridados con el reactivo de transfección (Lipofectamine 2000, Invitrogen) en un volumen de 50 |il/pocillo y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente. Las mezclas de transfección de ANic se añadieron a células para dar una concentración de ANic final de 25 nM en un volumen de 150 |il. Cada mezcla de transfección de ANic se añadió a 3 pocillos para tratamientos de ANic por triplicado. Las células se incubaron a 37°C durante 24 h en presencia continua de la mezcla de transfección de ANic. A las 24 h, se preparó ARN a partir de cada pocillo de células tratadas. Primero se retiraron y se desecharon los sobrenadantes con las mezclas de transfección, después las células se lisaron y se preparó el ARN a partir de cada pocillo. La expresión de genes diana después del tratamiento se evaluó mediante RT-PCR para el gen diana y para un gen de control (36B4, una subunidad de ARN polimerasa) para su normalización. Se calculó el promedio de los datos por triplicado y se determinaron las desviaciones típicas para cada tratamiento. Los datos normalizados se representaron gráficamente y se determinó el porcentaje de reducción de ARNm diana mediante ANic activos en comparación con sus ANic de control invertidos respectivos.
Los resultados de este estudio se muestran en la Figura 25. Una construcción de ANic que comprende ribonucleótidos y protecciones de ditimidina 3'-terminales (RPI n° 30988/31064) se comparó con una construcción de ANic modificada químicamente que comprendía nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina y ribonucleótidos de purina en los que la cadena con sentido del ANic estaba modificada adicionalmente con protecciones abásicas desoxi invertidas 5'- y 3'-terminales y la cadena antisentido comprendía un enlace internucleotídico de fosforotioato 3'-terminal (RPI n° 31300/31301), que también se comparó con un control invertido de la misma química (RPI n° 31314/31325). Adicionalmente, las construcciones de ANic también se compararon con células no tratadas, células transfectadas con lípido y construcciones de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg. 2), y células transfectadas únicamente con lípido (control de transfección). Como se muestra en la figura, las dos construcciones de ANic reducen significativamente la expresión del ARN de EGFR. Otras químicas de estabilización adicionales como se describen en la Tabla IV se ensayaron de forma similar para determinar su actividad.
Ejemplo 14: Inhibición mediada por iARN de la expresión de ARN de PKC-alfa
Se ensayaron construcciones de ANic (Tabla I) para determinar su eficacia para reducir la expresión de ARN de PKC-alfa en, por ejemplo, células A549. Se sembraron células aproximadamente 24 h antes de la transfección en placas de 96 pocillos a 5.000-7.500 células/pocillo, 100 |il/pocillo, de forma que en el momento de la transfección las células tenían una confluencia del 70-90%. Para la transfección, ANic hibridados se mezclaron con el reactivo de transfección (Lipofectamine 2000, Invitrogen) en un volumen de 50 |il/pocillo y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente. Las mezclas de transfección de ANic se añadieron a las células para dar una concentración de ANic final de 25 nM en un volumen de 150 |il. Cada mezcla de transfección de ANic se añadió a 3 pocillos para tratamientos de ANic por triplicado. Las células se incubaron a 37°C durante 24 h en presencia continuada de la mezcla de transfección de ANic. A las 24 h, se preparó ARN a partir de cada pocillo de células tratadas. Los sobrenadantes con las mezclas de transfección se retiraron y desecharon primero, después las células se lisaron y se preparó ARN a partir de cada pocillo. La expresión del gen diana después del tratamiento se evaluó mediante RT-PCR para el gen diana y para un gen de control (36B4, una subunidad de ARN polimerasa) para su normalización. Se calculó el promedio de los datos por triplicado y se determinaron las desviaciones típicas para cada tratamiento. Los datos normalizados se representaron gráficamente y se determinó el porcentaje de reducción de ARNm diana mediante ANic activos en comparación con sus ANic de control invertidos respectivos.
En un ejemplo no limitante, construcciones de ANic se exploraron para determinar su actividad (véase la Figura 26) y se compararon con células no tratadas, construcciones de control de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg. 2) y células transfectadas únicamente con lípido (control de transfección). Como se muestra en la Figura 26, las construcciones de ANic reducen significativamente la expresión de ARN de PKC-alfa. Los candidatos generados a partir de una selección de este tipo se ensayaron después adicionalmente. En un ejemplo no limitante, se ensayaron construcciones de ANic que comprendían ribonucleótidos y protecciones de ditimidina 3'-terminales junto con una construcción de ANic modificada químicamente que comprendía nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina y ribonucleótidos de purina, en los que la cadena con sentido de ANic estaba modificada adicionalmente con protecciones abásicas desoxi invertidas 5'- y 3'-terminales y la cadena antisentido comprendía un enlace internucleotídico de fosforotioato 3'-terminal. Otras químicas de estabilización adicionales como se describen en la Tabla IV se ensayaron de forma similar para determinar su actividad. Estas construcciones de ANic se compararon con controles invertidos de la misma química apropiados. Adicionalmente, las construcciones de ANic también se compararon con células no tratadas, células transfectadas con lípido y construcciones de ANic
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Ejemplo 15: Inhibición de la expresión de ARN de Myc mediada por iARN
Se ensayaron las construcciones de ANic (Tabla I) para determinar su eficacia para reducir la expresión de ARN de Myc (c-Myc) en células 293T. Se sembraron células 293T aproximadamente 24 h antes de la transfección en placas de 96 pocillos a 5.000-7.500 células/pocillo, 10 |il/pocillo, de manera que en el momento de la transfección las células tenían una confluencia del 70-90%. Para la transfección, los ANic hibridados se mezclaron con el reactivo de transfección (Lipofectamine 2000, Invitrogen) en un volumen de 50 |il/pocillo y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente. Las mezclas de transfección de ANic se añadieron a células para dar una concentración final de ANic de 25 nM en un volumen de 150 |il. Cada mezcla de transfección de ANic se añadió a 3 pocillos para tratamientos de ANic por triplicado. Las células se incubaron a 37°C durante 24 h en presencia continua de la mezcla de transfección de ANic. A las 24 h, se preparó ARN a partir de cada pocillo de células tratadas. Los sobrenadantes con las mezclas de transfección se retiraron y desecharon primero, después las células se lisaron y se preparó ARN a partir de cada pocillo. Se evaluó la expresión del gen diana después del tratamiento mediante RT-PCR para el gen diana y para un gen de control (36B4, una subunidad de ARN polimerasa) para su normalización. Se calculó el promedio de los datos por triplicado y se determinaron las desviaciones típicas para cada tratamiento. Los datos normalizados se representaron gráficamente y se determinó el porcentaje de reducción del ARNm diana mediante los ANic activos en comparación con sus ANic de control invertidos respectivos.
Los resultados de este estudio se muestran en la Figura 27. Se comparó una exploración de construcciones de ANic con células no tratadas, construcciones de control de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg. 2) y células transfectadas sólo con lípido (control de transfección). Como se muestra en la Figura, tres de las construcciones de ANic (RPI 30993/31069; RPI 30995/31071; y RPI 30996/31072) redujeron significativamente la expresión del ARN de c-Myc. Otras químicas de estabilización adicionales como se describen en la Tabla IV se ensayaron de forma similar para determinar su actividad.
Ejemplo 16: Inhibición de la expresión de ARN de BCL2 mediada por iARN
Se ensayaron construcciones de ANic (Tabla I) para determinar su eficacia para reducir la expresión de ARN de BCL2 en, por ejemplo, células A549. Las células se sembraron aproximadamente 24 h antes de la transfección en placas de 96 pocillos a 5.000-7.500 células/pocillo, 100 |il/pocillo, de tal manera que en el momento de la transfección las células tenían una confluencia del 70-90%. Para la transfección, los ANic hibridados se mezclaron con el reactivo de transfección (Lipofectamine 2000, Invitrogen) en un volumen de 50 |il/pocillo y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente. Las mezclas de transfección de ANic se añadieron a las células para dar una concentración de ANic final de 25 nM en un volumen de 150 |il. Cada mezcla de transfección de ANic se añadió a 3 pocillos para tratamientos de ANic por triplicado. Las células se incubaron a 37°C durante 24 h en presencia continua de la mezcla de transfección de ANic. A las 24 h, se preparó ARN a partir de cada pocillo de células tratadas. Los sobrenadantes con las mezclas de transfección se retiraron y desecharon primero, después las células se lisaron y se preparó el ARN a partir de cada pocillo. Se evaluó la expresión del gen diana después del tratamiento por RT-PCR para el gen diana y un gen de control (36B4, una subunidad de ARN polimerasa) para su normalización. Se calculó el promedio de los datos por triplicado y se determinaron las desviaciones típicas para cada tratamiento. Los datos normalizados se representaron gráficamente y se determinó el porcentaje de reducción del ARNm diana por ANic activos en comparación con sus ANic de control invertidos respectivos.
En un ejemplo no limitante, se transfectaron células A549 con 0,25 ug/pocillo de lípido formando complejo con ANic 25 nM. Se ensayó una construcción de ANic que comprendía ribonucleótidos y protecciones de ditimidina 3'- terminales (RPI n° 30998/31074) junto con una construcción de ANic químicamente modificada que comprendía nucleótidos 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina y ribonucleótidos de purina en la que la cadena con sentido del ANic se modificó adicionalmente con protecciones abásicas desoxi invertidas 5'- y 3'-terminales y la cadena antisentido comprendía un enlace internucleotídico de fosforotioato 3' terminal (RPI n° 31368/31369), que también se comparó con un control invertido de la misma química (RPI n° 31370/31371) y una construcción de ANic químicamente modificada que comprendía nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina y 2'-desoxi-2'-fluoro purina en el que la cadena con sentido del ANic estaba modificada adicionalmente con protecciones abásicas desoxi invertidas 5'- y 3'-terminales y la cadena antisentido comprendía un enlace internucleotídico fosforotioato 3'-terminal (RPI n° 31372/31373) que también se comparó con un control invertido de la misma química (RPI n° 31374/31375). Además, las construcciones de ANic también se compararon con células no tratadas, células transfectadas con lípido y construcciones de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg. 2) y células transfectadas sólo con lípido (control de transfección). Como se muestra en la Figura 28, las construcciones de ANic reducen significativamente la expresión del ARN de BCL2 en comparación con los controles desorganizados, no tratados y de transfección. Otras químicas de estabilización adicionales como se describen en la Tabla IV se ensayaron de forma similar para determinar su actividad.
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Se ensayaron construcciones de ANic (Tabla I) para determinar su eficacia para reducir la expresión del ARN de CHK-1 en células A549. Se sembraron células A549 aproximadamente 24 h antes de la transfección en placas de 96 pocillos a 5.000-7.500 células/pocillo, 100 |il/pocillo, de tal manera que en el momento de la transfección las células tenían una confluencia del 70-90%. Para la transfección, los ANic hibridados se mezclaron con el reactivo de transfección (Lipofectamine 2000, Invitrogen) en un volumen de 50 |il/pocillo y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente. Las mezclas de transfección de ANic se añadieron a las células para dar una concentración de ANic final de 25 nM en un volumen de 150 |il. Cada mezcla de transfección de ANic se añadió a 3 pocillos para tratamientos de ANic por triplicado. Las células se incubaron a 37°C durante 24 h en presencia continua de la mezcla de transfección de ANic. A las 24 h, se preparó el ARN a partir de cada pocillo de células tratadas. Los sobrenadantes con las mezclas de transfección se retiraron y desecharon primero, después las células se lisaron y se preparó el ARN a partir de cada pocillo. Se evaluó la expresión del gen diana después del tratamiento por RT- PCR para el gen diana y para un gen de control (36B4, una subunidad de ARN polimerasa) para su normalización. Se calculó el promedio de los datos por triplicado y se determinaron las desviaciones típicas para cada tratamiento. Los datos normalizados se representaron gráficamente y se determinó el porcentaje de reducción del ARNm diana por los ANic activos en comparación con sus ANic de control invertidos respectivos.
Los resultados de este estudio se muestran en la Figura 29. Una construcción de ANic que comprendía ribonucleótidos y protecciones de ditimidina 3'-terminales (RPI n° 31003/31079) y una construcción de ANic químicamente modificada que comprendía nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina y ribonucleótidos de purina en la que la cadena con sentido del ANic estaba modificada adicionalmente con protecciones abásicas desoxi invertidas 5'- y 3'-terminales y en la que la cadena antisentido comprendía un enlace internucleotídico de fosforotioato 3'-terminal (RPI n° 31302/31303), se compararon con un control invertido de la misma química (RPI n° 31314/31325). Además, las construcciones de ANic también se compararon con células no tratadas, células transfectadas con lípido y construcciones de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg. 2) y células transfectadas sólo con lípido (control de transfección). Como se muestra en la Figura, ambas construcciones de ANic redujeron significativamente la expresión del ARN de CHK-1 en comparación con controles apropiados. Otras químicas de estabilización adicionales como se describen en la Tabla IV se ensayaron de forma similar para determinar su actividad.
Ejemplo 18: Inhibición de la expresión de ARN de BACE mediada por iARN
Se ensayaron construcciones de ANic (Tabla I) para determinar su eficacia para reducir la expresión de ARN de BACE en, por ejemplo células A549. Las células se sembraron aproximadamente 24 h antes de la transfección en placas de 96 pocillos a 5.000-7.500 células/pocillo, 100 |il/pocillo, de tal manera que en el momento de la transfección las células tenían una confluencia del 70-90%. Para la transfección, los ANic hibridados se mezclaron con el reactivo de transfección (Lipofectamine 2000, Invitrogen) en un volumen de 50 |il/pocillo y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente. Las mezclas de transfección de ANic se añadieron a las células para dar una concentración de ANic final de 25 nM en un volumen de 150 |il. Cada mezcla de transfección de ANic se añadió a 3 pocillos para tratamientos de ANic por triplicado. Las células se incubaron a 37°C durante 24 h en presencia continua de la mezcla de transfección de ANic. A las 24 h, se preparó el ARN a partir de cada pocillo de células tratadas. Los sobrenadantes con las mezclas de transfección se retiraron y desecharon primero, después las células se lisaron y se preparó el ARN a partir de cada pocillo. Se evaluó la expresión del gen diana después del tratamiento mediante RT-PCR para el gen diana y para un gen de control (36B4, una subunidad de ARN polimerasa) para su normalización. Se calculó el promedio de los datos por triplicado y se determinaron las desviaciones típicas para cada tratamiento. Los datos normalizados se representaron gráficamente y se determinó el porcentaje de reducción del ARNm diana por los ANic activos en comparación con sus ANic de control invertidos respectivos.
En un ejemplo no limitante, se exploraron construcciones de ANic para determinar su actividad (véase Figura 30) y se compararon con células no tratadas, construcciones de control de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg. 2) y células transfectadas sólo con lípido (control de transfección). Como se muestra en la Figura 30, las construcciones de ANic redujeron significativamente la expresión del ARN de BACE. Después se ensayaron adicionalmente los candidatos generados a partir de dicha exploración. En un ejemplo no limitante, las construcciones de ANic que comprendían ribonucleótidos y protecciones de ditimidina 3'-terminales se ensayaron junto con una construcción de ANic químicamente modificada que comprendía nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina y ribonucleótidos de purina, en la que la cadena con sentido del ANic estaba modificada adicionalmente con protecciones abásicas desoxi invertidas 5'- y 3'-terminales y la cadena antisentido comprendía un enlace internucleotídico de fosforotioato 3'-terminal. Otras químicas de estabilización adicionales como se describen en la Tabla IV se ensayaron de forma similar para determinar su actividad. Estas construcciones de ANic se compararon con controles invertidos de la misma química apropiados. Además, las construcciones de ANic también se compararon con células no tratadas, células transfectadas con lípido y construcciones de ANic
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Ejemplo 19: Inhibición de la expresión de ARN de ciclina D1 mediada por iARN
Se ensayaron construcciones de ANic (Tabla I) para determinar su eficacia para reducir la expresión de ARN de ciclina D1 en células A549. Células A549 se sembraron aproximadamente 24 h antes de la transfección en placas de 96 pocillos a 5.000-7.500 células/pocillo, 100 |il/pocillo, de tal manera que en el momento de la transfección las células tenían una confluencia del 70-90%. Para la transfección, los ANic hibridados se mezclaron con el reactivo de transfección (Lipofectamine 2000, Invitrogen) en un volumen de 50 |il/pocillo y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente. Las mezclas de transfección de ANic se añadieron a las células para dar una concentración final de ANic de 25 nM en un volumen de 150 |il. Cada mezcla de transfección de ANic se añadió a 3 pocillos para tratamientos de ANic por triplicado. Las células se incubaron a 37°C durante 24 h en presencia continua de la mezcla de transfección de ANic. A las 24 h, se preparó el ARN a partir de cada pocillo de células tratadas. Los sobrenadantes con las mezclas de transfección se retiraron y desecharon primero, después las células se lisaron y se preparó el ARN a partir de cada pocillo. Se evaluó la expresión del gen diana después del tratamiento por RT- PCR para el gen diana y para un gen de control (36B4, una subunidad de ARN polimerasa) para su normalización. Se calculó el promedio de los datos por triplicado y las desviaciones típicas se determinaron para cada tratamiento. Los datos normalizados se representaron en una gráfica y se determinó el porcentaje de reducción del ARNm diana por los ANic activos en comparación con sus ANic de control invertidos respectivos.
Los resultados de este estudio se muestran en la Figura 31. Se ensayó una construcción de ANic que comprendía ribonucleótidos y protecciones de ditimidina 3'-terminales (RPI n° 30988/31064) junto con una construcción de ANic químicamente modificada que comprendía nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina y ribonucleótidos de purina en la que la cadena con sentido del ANic estaba modificada adicionalmente con protecciones abásicas desoxi invertidas 5'- y 3'-terminales y la cadena antisentido comprendía un enlace internucleotídico de fosforotioato 3'-terminal (RPI n° 31300/3130), que también se comparó con un control invertido de la misma química (RPI n° 31312/31313). Además, las construcciones de ANic también se compararon con células no tratadas, células transfectadas con lípido y construcciones de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg. 2) y células transfectadas sólo con lípido (control de transfección). Como se muestra en la Figura, las dos construcciones de ANic redujeron significativamente la expresión del ARN de ciclina D1. Otras químicas de estabilización adicionales como se describen en la Tabla IV se ensayaron de forma similar para determinar su actividad.
Ejemplo 20: Inhibición de la expresión de ARN de PTP-1B mediada por iARN
Se ensayaron construcciones de ANic (Tabla I) para determinar su eficacia para reducir la expresión del ARN de PTP-1B en células A549. Células A549 se sembraron aproximadamente 24 h antes de la transfección en placas de 96 pocillos a 5.000-7.500 células/pocillo, 100 |il/pocillo, de tal manera que en el momento de la transfección las células tenían una confluencia del 70-90%. Para la transfección, los ANic hibridados se mezclaron con el reactivo de transfección (Lipofectamine 2000, Invitrogen) en un volumen de 50 |il/pocillo y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente. Las mezclas de transfección de ANic se añadieron a células para dar una concentración de ANic final de 25 nM en un volumen de 150 |il. Cada mezcla de transfección de ANic se añadió a 3 pocillos para tratamientos de ANic por triplicado. Las células se incubaron a 37°C durante 24 h en presencia continua de la mezcla de transfección de ANic. A las 24 h, se preparó el ARN a partir de cada pocillo de células tratadas. Los sobrenadantes con las mezclas de transfección se retiraron y desecharon primero, después las células se lisaron y se preparó el ARN a partir de cada pocillo. Se evaluó la expresión del gen diana después del tratamiento por RT- PCR para el gen diana y para un gen de control (36B4, una subunidad de ARN polimerasa) para su normalización. Se calculó el promedio de los datos por triplicado y se determinaron las desviaciones típicas para cada tratamiento. Los datos normalizados se representaron en una gráfica y se determinó el porcentaje de reducción del ARNm diana por los ANic activos en comparación con sus ANic de control invertidos respectivos.
Los resultados de este estudio se muestran en la Figura 32. Se ensayó una construcción de ANic que comprendía ribonucleótidos y protecciones de ditimidina 3'-terminales (RPI n° 31018/31094) junto con una construcción de ANic químicamente modificada que comprendía nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina y ribonucleótidos de purina, en la que la cadena con sentido del ANic estaba modificada adicionalmente con protecciones abásicas desoxi invertidas 5'- y 3'-terminales y la cadena antisentido comprendía un enlace internucleotídico de fosforotioato 3'-terminal (RPI n° 31306/31307), que también se comparó con un control invertido de la misma química (RPI n° 31318/31319). Además, también se compararon las construcciones de ANic con células no tratadas, células transfectadas con lípido y construcciones de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg. 2) y células transfectadas sólo con lípido (control de transfección). Como se muestra en la Figura, ambas construcciones de ANic redujeron significativamente la expresión del ARN de PTP-1B. Otras químicas de estabilización adicionales como se describen en la Tabla IV se ensayaron de forma similar para determinar su actividad.
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Se ensayaron construcciones de ANic (Tabla I) para determinar su eficacia para reducir la expresión de ARN de ERG2 en, por ejemplo células DLD1. Las células se sembraron aproximadamente 24 h antes de la transfección en placas de 96 pocillos a 5.000-7.500 células/pocillo, 100 |il/pocillo, de tal manera que en el momento de la transfección las células tenían una confluencia del 70-90%. Para la transfección, los ANic hibridados se mezclaron con el reactivo de transfección (Lipofectamine 2000, Invitrogen) en un volumen de 50 |il/pocillo y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente. Las mezclas de transfección de ANic se añadieron a las células para dar una concentración de ANic final de 25 nM en un volumen de 150 |il. Cada mezcla de transfección de ANic se añadió a 3 pocillos para tratamientos de ANic por triplicado. Las células se incubaron a 37°C durante 24 h en presencia continua de la mezcla de transfección de ANic. A las 24 h, se preparó el ARN a partir de cada pocillo de células tratadas. Los sobrenadantes con las mezclas de transfección se retiraron y desecharon primero, después las células se lisaron y se preparó el ARN a partir de cada pocillo. Se evaluó la expresión del gen diana después del tratamiento mediante RT-PCR para el gen diana y para un gen de control (36B4, una subunidad de ARN polimerasa) para su normalización. Se calculó el promedio de los datos por triplicado y se determinaron las desviaciones típicas para cada tratamiento. Los datos normalizados se representaron en una gráfica y se determinó el porcentaje de reducción del ARNm diana por los ANic activos en comparación con sus ANic de control invertidos respectivos.
En un ejemplo no limitante, se exploraron construcciones de ANic para determinar su actividad (véase la Figura 33) y se compararon con células no tratadas, construcciones de control de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg. 2) y células transfectadas sólo con lípido (control de transfección). Como se muestra en la Figura 33, las construcciones de ANic redujeron significativamente la expresión del ARN de ERG2. Después, se ensayaron adicionalmente los candidatos generados a partir una exploración de este tipo. En un ejemplo no limitante, las construcciones de ANic que comprendían ribonucleótidos y protecciones de ditimidina 3'-terminales se ensayaron junto con una construcción de ANic químicamente modificada que comprendía nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina y ribonucleótidos de purina, en la que la cadena con sentido del ANic estaba modificada adicionalmente con protecciones abásicas desoxi invertidas 5'- y 3'-terminales y la cadena antisentido comprendía un enlace internucleotídico de fosforotioato 3'-terminal. Otras químicas de estabilización adicionales como se describen en la Tabla IV se ensayaron de forma similar para determinar su actividad. Estas construcciones de ANic se compararon con controles invertidos de la misma química. Además, las construcciones de ANic también se compararon con células no tratadas, células transfectadas con lípido y construcciones de ANic desorganizado y células transfectadas sólo con lípido (control de transfección). Otras químicas de estabilización adicionales como se describen en la Tabla IV se ensayaron de forma similar para determinar su actividad.
Ejemplo 22: Inhibición de la expresión de ARN de PCNA mediada por iARN
Se ensayaron construcciones de ANic (Tabla I) para determinar su eficacia para reducir la expresión de ARN de PCNA en células A549. Células A549 se sembraron aproximadamente 24 h antes de la transfección en placas de 96 pocillos a 5.000-7.500 células/pocillo, 100 |il/pocillo, de manera que en el momento de la transfección las células tenían una confluencia del 70-90%. Para la transfección, los ANic hibridados se mezclaron con el reactivo de transfección (Lipofectamine 2000, Invitrogen) en un volumen de 50 |il/pocillo y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente. Las mezclas de transfección de ANic se añadieron a las células para dar una concentración de ANic final de 25 nM en un volumen de 150 |il. Cada mezcla de transfección de ANic se añadió a 3 pocillos para tratamientos de ANic por triplicado. Las células se incubaron a 37°C durante 24 h en presencia continua de la mezcla de transfección de ANic. A las 24 h, se preparó el ARN a partir de cada pocillo de células tratadas. Los sobrenadantes con las mezclas de transfección se retiraron y desecharon primero, después las células se lisaron y se preparó el ARN a partir de cada pocillo. Se evaluó la expresión del gen diana después del tratamiento mediante RT-PCR para el gen diana y para un gen de control (36B4, una subunidad de ARN polimerasa) para su normalización. Se calculó el promedio de los datos por triplicado y se determinaron las desviaciones típicas para cada tratamiento. Los datos normalizados se representaron en una gráfica y se determinó el porcentaje de reducción del ARNm diana por los ANic activos en comparación con sus ANic de control invertidos respectivos.
Los resultados de este estudio se muestran en la Figura 34. Se ensayó una construcción de ANic que comprendía ribonucleótidos y protecciones de ditimidina 3'-terminales (RPI n° 31035/31111) junto con una construcción de ANic químicamente modificada que comprendía nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina y ribonucleótidos de purina en la que la cadena con sentido del ANic estaba modificada adicionalmente con protecciones abásicas desoxi invertidas 5'- y 3'-terminales y la cadena antisentido comprendía un enlace internucleotídico de fosforotioato 3'-terminal (RPI n° 31310/31311), que también se comparó con un control invertido de la misma química (RPI n° 31322/31323). Además, las construcciones de ANic también se compararon con células no tratadas, células transfectadas con lípido y construcciones de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg. 2) y células transfectadas sólo con lípido (control de transfección). Como se muestra en la Figura, ambas construcciones de ANic redujeron significativamente la expresión del ARN de PCNA. Otras químicas de estabilización adicionales como se describen
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en la Tabla IV se ensayaron de forma similar para determinar su actividad.
Ejemplo 23: Indicaciones
Las moléculas de ANic de la invención pueden usarse para tratar una diversidad de enfermedades y afecciones a través de la modulación de la expresión génica. Usando los procedimientos descritos en el presente documento, pueden diseñarse moléculas de ANic modificadas químicamente para modular la expresión de cualquier número de genes diana, incluyendo, pero sin limitación, genes asociados con el cáncer, enfermedades metabólicas, enfermedades infecciosas tales como infecciones virales, bacterianas o fúngicas, enfermedades neurológicas, enfermedades musculoesqueléticas, enfermedades del sistema inmune, enfermedades asociadas con las rutas de señalización y mensajeros celulares, y enfermedades asociadas con sistemas de transporte que incluyen bombas y canales moleculares.
Los ejemplos no limitantes de diversos genes virales que pueden dirigirse usando moléculas de ARNic de la invención incluyen Virus de la Hepatitis C (VHC, por ejemplo, N° de Acceso de Genbank: D11168, D50483.1, L38318 y S82227), Virus de la Hepatitis B (VHB, por ejemplo N° de Acceso de Genbank AF100308.1), Virus de la Inmunodeficiencia Humana de tipo 1 (VIH-1, por ejemplo N° de Acceso de Genbank U51188), Virus de la Inmunodeficiencia Humana de tipo 2 (VIH-2, por ejemplo N° de Acceso de Genbank X60667), Virus del Nilo Occidental (VNO, por ejemplo N° de Acceso de Genbank NC_001563), citomegalovirus (CMV por ejemplo N° de Acceso de Genbank NC_001347), virus respiratorio sincitial (VRS por ejemplo N° de Acceso de Genbank NC_001781), virus de la gripe (por ejemplo, N° de Acceso de Genbank AF037412), rinovirus (por ejemplo, números de acceso de Genbank: D00239, X02316, X01087, L24917, M16248, K02121, X01087), papilomavirus (por ejemplo N° de Acceso de Genbank NC_001353), Virus del Herpes Simple (VHS por ejemplo N° de Acceso de Genbank NC_ 001345), y otros virus tales como VLTH (por ejemplo N° de Acceso de Genbank AJ430458). Debido a la elevada variabilidad de secuencia de muchos genomas virales, la selección de moléculas de ARNic para amplias aplicaciones terapéuticas probablemente implicaría las regiones conservadas del genoma viral. Los ejemplos no limitantes de regiones conservadas de los genomas virales incluyen, pero sin limitación, Regiones No Codificantes (NCR) 5', Regiones No Codificantes (NCR) 3' y/o sitios internos de entrada al ribosoma (IRES). Las moléculas de ARNic diseñadas frente a regiones conservadas de diversos genomas virales permitirán la inhibición eficaz de la replicación viral en diversas poblaciones de pacientes y pueden garantizar la eficacia de las moléculas de ARNic frente a cuasiespecies virales que evolucionan debido a mutaciones en las regiones no conservadas del genoma viral.
Los ejemplos no limitantes de genes humanos que pueden dirigirse usando moléculas de ARNic de la invención usando los procedimientos descritos en el presente documento incluyen cualquier secuencia de ARN humana, por ejemplo las comúnmente indicadas por el Número de Acceso de Genbank. Estas secuencias de ARN pueden usarse para diseñar moléculas de ARNic que inhiban la expresión génica y de este modo anulan enfermedades, afecciones o infecciones asociadas con la expresión de esos genes. Dichos ejemplos no limitantes de genes humanos que pueden dirigirse usando moléculas de ARNic de la invención incluyen VEGFr (VEGFr-1 por ejemplo, N° de Acceso de Genbank XM_067723, VEGFr-2, por ejemplo, N° de Acceso de Genbank AF063658), HERI, HER2, HER3 y HER4 (por ejemplo, N° de Acceso de Genbank: NM_005228, NM_004448, NM_001982 y NM_005235, respectivamente), telomerasa (TERT, por ejemplo, N° de Acceso de Genbank NM_003219), ARN de telomerasa (por ejemplo, N° de Acceso de Genbank U86046), NFkappaB, Rel-A (por ejemplo, N° de Acceso de Genbank NM_005228), NOGO (por ejemplo, N° de Acceso de Genbank AB020693), NOGOr (por ejemplo, N° de Acceso de Genbank XM_015620), RAS (por ejemplo, N° de Acceso de Genbank NM_004283), RAF (por ejemplo, N° de Acceso de Genbank XM_033884), CD20 (por ejemplo, N° de Acceso de Genbank X07203), METAP2 (por ejemplo, N° de Acceso de Genbank NM_003219), CLCA1 (por ejemplo, N° de Acceso de Genbank NM_001285), fosfolambán (por ejemplo, N° de Acceso de Genbank NM_002667), PTP1B (por ejemplo, N° de Acceso de Genbank M31724) y otros, por ejemplo, los mostrados en la Tabla III.
La molécula de ANic de la invención también puede usarse en una diversidad de aplicaciones agrícolas que implican la modulación de la expresión de genes endógenos o exógenos en plantas usando ANic, que incluye su uso como agente insecticida, antiviral y antifúngico o la modulación de rasgos en plantas tales como perfiles de aceite y almidón y resistencia a agresiones.
Ejemplo 24: Usos de diagnóstico
Las moléculas de ANic de la invención pueden usarse en una diversidad de aplicaciones de diagnóstico tales como en la identificación de dianas moleculares (por ejemplo, ARN) en una diversidad de aplicaciones, por ejemplo, en entornos clínicos, industriales, ambientales, agrícolas y/o de investigación. Dicho uso de diagnóstico de moléculas de ANic implica la utilización de sistemas de iARN reconstituidos, usando, por ejemplo, lisados celulares o lisados celulares parcialmente purificados. Las moléculas de ANic de la presente invención pueden usarse como herramientas de diagnóstico para examinar las mutaciones y la deriva genética dentro de células enfermas, o para
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detectar la presencia de ARN endógeno o exógeno, por ejemplo viral, en una célula. La estrecha relación entre la actividad de ANic y la estructura del ARN diana permite la detección de mutaciones en cualquier región de la molécula, que modifica el emparejamiento de bases y la estructura tridimensional del ARN diana. Usando múltiples moléculas de ANic descritas en la presente invención, pueden mapearse cambios de nucleótidos que son importantes para la estructura y función del ARN in vitro, así como en células y tejidos. La escisión de los ARN diana con moléculas de ANic puede usarse para inhibir la expresión génica y definir el papel de los productos génicos especificados en la progresión de la enfermedad o infección. De este modo, pueden definirse otras dianas genéticas como mediadores importantes de la enfermedad. Estos experimentos conducirán a un mejor tratamiento de la progresión de la enfermedad permitiendo la posibilidad de terapias de combinación (por ejemplo, múltiples moléculas de ANic dirigidas a genes diferentes, moléculas de ANic acopladas con inhibidores de bajo peso molecular conocidos o tratamiento intermitente con combinaciones de moléculas de ANic y/u otras moléculas químicas o biológicas). Otros usos in vitro de las moléculas de ANic de la presente invención se conocen bien en la técnica e incluyen la detección de la presencia de los ARNm asociados con una enfermedad, infección o afección relacionada. Dicho ARN se detecta determinando la presencia de un producto de escisión después del tratamiento con un ANic usando metodologías convencionales, por ejemplo, transferencia por resonancia de emisión de fluorescencia (FRET).
En un ejemplo específico, se usan para el ensayo moléculas de ANic que escinden solamente formas de tipo silvestre o mutantes del ARN diana. Las primeras moléculas de ANic (es decir, las que solo escinden formas de tipo silvestre del ARN diana) se usan para identificar el ARN de tipo silvestre presente en la muestra y las segundas moléculas de ANic (es decir, las que solo escinden formas mutantes del ARN diana) se usan para identificar el ARN mutante en la muestra. Como controles de reacción, sustratos sintéticos de ARN tanto de tipo silvestre como mutante se escinden por ambas moléculas de ANic para demostrar las eficacias relativas de los ANic en las reacciones y la ausencia de escisión de las especies de ARN “no diana”. Los productos de escisión de los sustratos sintéticos también sirven para generar marcadores de tamaño para el análisis de los ARN de tipo silvestre y mutante en la población de muestra. Por lo tanto, cada análisis requiere dos moléculas de ANic, dos sustratos y una muestra desconocida, que se combinan en seis reacciones. La presencia de productos de escisión se determina usando un ensayo de protección RNasa de manera que los fragmentos de longitud completa y de escisión de cada ARN pueden analizarse en un carril de un gel de poliacrilamida. No se requiere en absoluto cuantificar los resultados para hacerse una idea de la expresión de los ARN mutantes y del supuesto riesgo de los cambios fenotípicos deseados en las células diana. La expresión del ARNm cuyo producto proteico está implicado en el desarrollo del fenotipo (es decir relacionado con enfermedad o relacionado con infección) es adecuada para establecer el riesgo. Si se usan sondas de actividad específica comparable para ambos transcritos, entonces una comparación cualitativa de los niveles de ARN es adecuada y disminuye el coste del diagnóstico inicial. Proporciones más elevadas de la forma mutante con respecto a la de tipo silvestre se correlacionan con un mayor riesgo independientemente de que los niveles de ARN se comparen cualitativa o cuantitativamente.

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