ES2669018T3 - Procedimiento para la vacunación por vía oral/mucosa por medio de levaduras recombinantes - Google Patents

Procedimiento para la vacunación por vía oral/mucosa por medio de levaduras recombinantes Download PDF

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Abstract

Procedimiento para la vacunación por vía oral/mucosa que comprende la administración de una cepa de levadura recombinante, generada por ingeniería genética, de la levadura Kluyveromyces lactis, caracterizado por que esta cepa recombinante contiene un casete de expresión integrado genómicamente que se compone del promotor de LAC4 inducible por lactosa, un gen exógeno que codifica para una proteína inmunogénica, un terminador de la transcripción y el gen LAC4 que codifica para la enzima ß-galactosidasa bajo el control del promotor de GAL80 de K. lactis (KIGAL80-P), teniendo lugar la integración dirigida de genes exógenos en el locus de LAC4 del genoma de levadura, sin que se introduzcan secuencias de ADN adicionales, y la expresión de genes exógenos se induce mediante lactosa o galactosa de manera dosificada o se activa constitutivamente después de desactivar el gen regulador KIGAL80.

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento para la vacunación por vía oral/mucosa por medio de levaduras recombinantes
La contención de enfermedades infecciosas sigue siendo uno de los grandes desafíos tanto en la medicina humana como veterinaria. La situación se plantea especialmente compleja en el caso de infecciones víricas que, en contraposición a las infecciones bacterianas, por regla general, no pueden combatirse con principios activos de banda ancha y provocan grandes pérdidas económicas. El desarrollo de nuevas estrategias de vacunación efectivas frente a enfermedades víricas es por lo tanto de suma importancia.
Tradicionalmente, para la vacunación profiláctica y también para la vacunación terapéutica frente a enfermedades por virus se emplean virus "atenuados", es decir, modificados por mutagénesis con virulencia claramente reducida o ausente ("vacunas vivas"), o virus inactivados ("vacunas muertas"). En los últimos tiempos se establecieron cada vez más también las denominadas "vacunas de subunidades" o "vacunas marcadoras de subunidades", empleándose para la vacunación "antígenos principales" producidos por ingeniería genética definidos del patógeno. La expresión "vacuna marcadora" implica que pueden diferenciarse inequívocamente individuos vacunados mediante análisis diagnóstico posterior de individuos infectados naturalmente ("D\VA"-differentiate infected and vaccinated animals (diferenciación de animales infectados y vacunados)). Por antígenos principales se entienden por ejemplo proteínas de la envuelta de virus o de la cápsida de virus que, en ausencia de una partícula de virus completa, pueden inducir una respuesta humoral y/o celular en el huésped, como consecuencia de lo cual puede prevenirse o combatirse una infección por virus de forma preventiva o terapéutica. Una "vacunación de subunidades" requiere que los antígenos principales estén caracterizados. La producción (expresión) y formulación inmunogénica de tales proteínas ("formulación antigénica") para el proceso de vacunación desempeña un papel clave, en particular dado que las proteínas de la envuelta de virus generalmente no son solubles en agua y solo en ocasiones pueden producirse de manera recombinante en sistemas de expresión bacterianos. Correspondientemente costosos son procedimientos para obtener vacunas "de subunidades" en forma generada y garantizar su tiempo de conservación.
Las levaduras como sistemas de expresión para proteínas recombinantes reúnen las ventajas económicas de los sistemas bacterianos con la forma de organización típica para células superiores. Estas están compartimentadas por sistemas de membrana intracelulares, lo que las diferencia fundamentalmente de sistemas de huésped bacterianos y permite la expresión de proteínas de la envuelta víricas ancladas a membrana o incluso la cápsida de virus completa. Además, los beta-glucanos, polímeros de glucosa por los que está formada la pared celular de levadura, tienen un efecto inmunoestimulador conocido desde hace tiempo. Por lo tanto, el objetivo era desarrollar un procedimiento en el que puedan emplearse levaduras completas para la vacunación. El problema se resolvió introduciendo y expresando por medio de métodos de ingeniería genética genes para determinantes inmunogénicos en el genoma de levaduras no patógenas y empleando estas células de levadura recombinantes directamente para la vacunación por vía oral/mucosa.
Kluyveromyces lactis.
Kluyveromyces lactis pertenece a las denominadas levaduras de calidad alimentaria (food grade) con el estado GRAS (generally regarded as safe (generalmente considerado como seguro)). Tal como la levadura de panadería, que se ha probado y acreditado para la industria alimentaria como aditivo alimentario a lo largo de siglos, también ha resultado inocua la levadura K. lactis presente con frecuencia en los productos lácteos.
Vacunación por vía oral/mucosa
Vacunas/antígenos pueden administrarse por vía parenteral u oral/mucosa. Mientras que en el primer caso los antígenos llegan al sistema circulatorio, generalmente por inyección, evitando el tubo digestivo, en la vacunación por vía oral/mucosa la absorción transcurre a través del epitelio intestinal mucoso tras pasar por el estómago. Las mucosas intestinales están permanentemente expuestas a patógenos y representan en sí mismas una barrera de absorción importante para agentes infecciosos. Además existe un sistema inmunitario mucoso que se diferencia en los denominados sitios inductivos y efectores. La absorción de antígeno tiene lugar en los sitios inductivos a través de células M en los "parches de Peyer". Las células inmunitarias asociadas a los parches de Peyer del MALT (mucosa-associated lymphoid tissue (tejido linfoide asociado a la mucosa)) inducen la respuesta inmunitaria. Después de bajar la respuesta inmunitaria se generan en todo el organismo, como también en los sitios efectores de las mucosas, células inmunitarias de memoria específicas, que por regla general proporcionan una protección de larga duración frente al antígeno/patógeno original.
Ventajas de los procedimientos de vacunación por vía oral/mucosa. En comparación con una inmunización parenteral, la inmunización por vía oral/mucosa requiere el uso de cantidades de antígeno considerablemente mayores. Mediante la vacunación por vía oral/mucosa es sin embargo posible, en contraposición a la vacunación parenteral, inducir además de la respuesta inmunitaria sistémica también una respuesta inmunitaria local en los sitios efectores de las mucosas. En especial en el caso de los patógenos (tales como por ejemplo el virus de la diarrea viral bovina, BVDV y el virus de la peste porcina clásica, CSFV; véase también más adelante), que (también) se transmiten a través de las membranas mucosas, una vacunación por vía oral/mucosa tiene el potencial de
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generar una inmunidad activa y de larga duración. Otras ventajas importantes de la vacunación oral son una buena aceptación y economía. En el caso más favorable, las vacunas pueden producirse con bajos costes y administrarse con la alimentación de forma nada complicada.
La administración oral de cepas de levadura que expresan antígenos de virus, por lo tanto, no solo es inocua, sino que podría tener efectos adyuvantes y beneficiosos para la salud adicionales.
Era ahora el objetivo desarrollar un sistema de expresión que permita la integración dirigida de genes exógenos en el genoma de Kluyveromyces lactis y permita correspondientemente la síntesis intracelular de antígenos. Otro objetivo era emplear una cepa de K.lactis recombinante de este tipo, que contiene un antígeno de virus específico, para una vacunación por vía oral/mucosa.
De acuerdo con la invención se desarrolló un sistema de huésped/vector que permite integrar, a través de procedimientos de ingeniería genética, genes exógenos de manera dirigida en el locus de LAC4 del genoma de K. lactis, sin que deban introducirse secuencias de ADN adicionales (marcadores de selección o similares). La expresión de gen exógeno se encuentra bajo el control del promotor de LAC4 y puede inducirse mediante lactosa o galactosa en el medio de crecimiento de forma dosificada o, activarse constitutivamente después de desactivar el gen regulador, KIGAL80. Las cepas de levadura recombinantes son estables sin presión de selección y pueden cultivarse en condiciones de fermentación en altas densidades. La expresión de proteína exógena puede cuantificarse indirectamente a través de la expresión de un gen indicador endógeno.
Se generó una serie de cepas de vacuna de K. lactis recombinante. En general, estas cepas expresan de manera inducible cantidades significativas de una proteína, o dominios de esta proteína, o dominios de esta proteína fusionados con dominios de proteína de otras especies. Los dominios de proteína de otras especies relacionados a este respecto sirven para fines adyuvantes o para la compartimentación dirigida de la proteína exógena expresada en la célula de levadura. Además de los efectos adyuvantes, la compartimentación de la proteína exógena expresada es importante para la optimización de la expresión o la formulación del producto de expresión. Una cepa de K.lactis recombinante (véase los ejemplos de realización) se empleó con éxito para la vacunación por vía oral/mucosa.
El objetivo de la invención se consiguió proporcionando una cepa recombinante de la levadura Kluyveromyces lactis de acuerdo con la reivindicación 20 y de un procedimiento para la vacunación por vía oral/mucosa de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo este procedimiento la cepa recombinante de acuerdo con la invención de la levadura Kluyveromyces lactis. La invención se refiere además al uso de la cepa recombinante de la levadura Kluyveromyces lactis para la expresión de proteínas exógenas así como en la vacunación, en particular frente al virus BVD o el virus CSF, de acuerdo con las reivindicaciones 21 a 23.
Ejemplos de realización:
1. Generación de la cepa de K. lactis VAK367-D4 (Met- ura3 Iac4::ScURA3).
La cepa de partida VAK367 para la expresión heteróloga de proteínas exógenas tiene las siguientes propiedades: permite el cultivo a altas densidades celulares, sin que a este respecto se liberen de manera detectable proteínas intracelulares. A este respecto, esta cepa se diferencia de muchas cepas de K. lactis estrechamente relacionadas. La cepa VAK367 se derivó mediante dos rondas de mutagénesis de la cepa CBS 2359 (Centraalbureau voor Schimmelcultures
http://www.fungalbiodiversitycentre.com) y es auxotrófica para el aminoácido metionina y la nucleobase uracilo. De la cepa VAK367 se derivó con métodos de ingeniería genética la cepa VAK367-D4 (depositada en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH (DSMZ) en Braunschweig), en la que con ayuda del plásmido pD4-2 se sustituyó la secuencia de +358 a +1181 del gen LAC4 por el gen ScURA3. La cepa VAK367-D4 permite ahora la integración de genes exógenos en el locus de LAC4 sin marcadores adicionales, seleccionándose en crecimiento sobre lactosa. A este respecto, el uso de un vector de integración adecuado, tal como por ejemplo Klp3 (véase a continuación) sustituye por recombinación homóloga el casete de disrupción de modo que con la pérdida del marcador de ScURA3 se reconstituye un gen LAC4 intacto. (Figura 1).
2. Generación de un vector de integración que permite la expresión inducible de genes exógenos.
Vector: Klp3 (Figura 2)
En el caso del vector Klp3 se trata de un vector de E.coli, a base de YRp7, que no puede replicarse de manera autónoma en levaduras, dado que se delecionó la secuencia de ARS1. Klp3 contiene secuencias de K.lactis que permite la integración en el locus de LAC4 mediante recombinación homóloga (región en sentido de 5' de LAC4 y extremo 5' del marco de lectura de LAC4). Entre el promotor de LAC4 y el inicio de la transcripción se insertó una sección de ADN, que contiene el terminador de tEF1 y el promotor de KIGAL80. De esta manera el marco de lectura de LAC4 se encuentra bajo el control del promotor de KIGAL80, que se regula conjuntamente a través del factor de transcripción KlGal4 con el promotor de LAC4 (Zenke et al. 1993, Molecular and Cellular Biology, 13:7566- 7576). Esta construcción permite, a través de la medición de la p-galactosidasa codificada por LAC4, seguir la
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inducción de la expresión de gen exógeno. Klp3 permite la integración del gen exógeno entre el promotor de LAC4 y terminador de TEF1 a través del sitio de corte Sa/I único. Para la integración del casete de expresión se digiere Kl p3 con HpaI o EcoRI y se transforma en VAK367-D4 de K. lactis. A este respecto, el casete de expresión se separa de la parte de vector de E.coli, de modo que las cepas resultantes no contienen ninguna secuencia bacteriana.
Plásmido KIp3-E2-1 (9437 pb)
El segmento génico de BVDV, que contenía, entre otros, la región que codifica para E2 de BVDV (ORF de E2 de BVDV), se insertó como fragmento de SalI-XhoI en el sitio de corte SalI entre el promotor de LAC4 y terminador de TEF1. En sentido 3' se encuentra el promotor de KIGAL80, que se fusionó con el extremo 5' del ORF de LAC4. Mediante restricción del plásmido con HpaI se obtienen dos fragmentos de los cuales el de mayor tamaño porta el casete de expresión con el ORF de E2 de BVDV.
3. Formulación del antígeno principal E2 de BVDV y CSFV. De BVDV (virus de la diarrea viral bovina), el agente patógeno de las diarreas virales bovinas y la enfermedad de la mucosa (BVD/MD) como también de CSFV (virus de la fiebre porcina clásica), el agente patógeno de la peste porcina clásica (CSF), está caracterizado un antígeno principal. A este respecto se trata de la proteína E2 de la "envuelta" (integrada en la envuelta del virus). E2 induce también en ausencia de una partícula de virus una respuesta inmunitaria humoral masiva, es decir, la formación de anticuerpos que neutralizan virus de forma efectiva. Mediante la formulación por ingeniería genética de E2 pudo reforzarse adicionalmente el potencial inmunogénico de la proteína y también generarse una respuesta inmunitaria celular (Bruschke et al., 1999; Nobiron et al., 2003). La respuesta inmunitaria específica y exclusiva frente a dominios de proteína de E2 individuales, en determinadas circunstancias, formulados por ingeniería genética, permite la discriminación de animales vacunados de animales infectados con virus de campo, por ejemplo por medio de procedimientos de ELISA.
4. Construcción de una cepa de K. lactis que expresa la proteína E2 de BVDV
Por medio de la tecnología de acuerdo con la invención se produjo la cepa de K. lactis, VAK367-E2-1. Para ello se cortó el plásmido Klp3-E2-1 con HpaI y el fragmento de mayor tamaño HpaI, que codifica el ORF de E2 de BVDV, se integró a través de recombinación homóloga cromosómicamente en la cepa de partida VAK367-D4 (DSM 23097). En VAK367-D4 (DSM 23097) el gen LAC4 está destruido mediante inserción del gen URA3 (lac4::URA3). Mediante la integración cromosómica del fragmento mencionado se sustituyó el sitio génico lac4::URA3 y se reconstituyó el gen LAC4 intacto (Figura 1). La selección de células de K. lactis, que contenían la secuencia génica de BVDV, tuvo lugar mediante crecimiento sobre medio de lactosa. La pérdida del gen URA3 se confirmó mediante el fenotipo Ura-. La secuencia del sitio génico correspondiente se confirmó mediante secuenciación de ADN. (Protocolo de secuencias 1).
En la cepa VAK367-E2-1 resultante está integrado un segmento del genoma de BVDV de la cepa CP7 de BVDV en el genoma de levadura. El segmento génico de BVDV correspondiente contenía la región que codifica para la proteína E2 así como partes de las regiones E1 y p7 adyacentes. Las regiones E1 y p7 contienen las secuencias señal necesarias para el procesamiento correcto de la proteína E2 (protocolo de secuencias 2). El procesamiento correcto (maduración) de las proteínas E2 de BVDV tiene lugar a través de signalasas, que se codifican por la célula de levadura.
Por medio de un procedimiento de detección de inmunofluorescencia desarrollado específicamente puede establecerse la expresión de E2 de BVDV en células de la cepa de K. lactis VAK367-E2-1. Un procedimiento de ELISA desarrollado especialmente para la detección de E2 de BVDV permite la detección y cuantificación de antígeno expresado de manera heteróloga. El procedimiento de ELISA análogo pudo emplearse para la cuantificación exacta del título de anticuerpos de animales inmunizados. Procedimientos de neutralización de virus y procedimientos para la caracterización de anticuerpos y células T se emplearon como procedimientos de rutina.
Un procedimiento de qRT-PCR novedoso permite detectar y cuantificar el genoma de ARN de BVDV a partir de suero y sobrenadantes de cultivo celular.
5. Detección de la eficacia de la cepa de K.lactis VAK367-E2-1 en estudios de inmunización por vía oral/mucosa
Estudio 1.
En ensayos con animales se administró a un número significativo de ratones de ensayo una emulsión de K. lactis no tratada previamente en condiciones normalizadas. A este respecto se usaron diferentes esquemas de inmunización. Los criterios principales fueron a este respecto diferentes cantidades de levadura añadida (3 - como máximo un 8 % del porcentaje de la alimentación tomada diariamente) y diferentes "intervalos de refuerzo".
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(i) Se demostró una compatibilidad general de K.lactis: la administración oral de la emulsión de levadura no provocó ningún cambio visible en el estado de los animales.
(ii) La administración oral de K.lactis llevó a una respuesta inmunitaria humoral detectable de manera inequívoca frente a proteínas de levadura determinadas. Mediante procedimientos de inmunotransferencia de tipo Western pudo establecerse en los animales alimentados con K.lactis, en comparación con los animales control, una respuesta de anticuerpo significativa y específica frente a proteínas de levadura. Las proteínas de levadura tienen por lo tanto, por sí mismas, un efecto inmunogénico. Además de la prueba de principio, de que con la administración oral de K.lactis puede generarse una respuesta inmunitaria, se indicó que mediante la administración oral de levadura en combinación con un antígeno recombinante puede conseguirse un efecto adyuvante adicional.
Estudio 2
En ensayos con animales con un número significativo de ratones se vacunó por vía oral con un esquema de inmunización optimizado (véase el estudio 1) y con K. lactis recombinante de la cepa 367-E2-1.
Resultados:
(i) A través del procedimiento de ELISA especial pudo detectarse la formación de anticuerpos anti-E2 de BVDV en los ratones vacunados con la cepa de K.lactis 367-E2-1 en comparación con los ratones control (inmunizados con K.lactis no tratada previamente)
ii) En una prueba de neutralización con BVDV en cultivos celulares bovinos pudo establecerse un efecto neutralizante de antisueros de ratones que se inmunizaron con K. lactis de la cepa 367-E2-1, a su vez en comparación con sueros de ratones control.
iii) Mediante el uso de adyuvantes tales como CpG-ODN y QuilA se consiguió un refuerzo de la respuesta inmunitaria.
iv) Mediante inmunización por vía mucosa/oral con la cepa de K.lactis recombinante VAK367-E2-1 pudo conseguirse una protección eficaz. Esto pudo mostrarse en experimentos de exposición con vaccinia virus recombinantes, que expresan la proteína e2 de BVDV.
Los resultados de los estudios prueban que de acuerdo con la invención, por medio de
la generación de una cepa de K.lactis y variantes de esta cepa, pueden integrarse de manera dirigida en las mismas genes exógenos sin marcadores de selección adicionales. Los derivados recombinantes resultantes de la cepa de K lactis en cuestión pueden usarse para fines de expresión para la posterior preparación bioquímica de una proteína heteróloga. Las células de las cepas de K.lactis recombinantes correspondientes pueden emplearse directamente para la inmunización por vía mucosa/oral o parenteral.
Datos de secuencias
Molécula: KIp3, 8117 pb ADN circular Descripción: Ligación de lac4 en i-amp
Nombre del archivo: KIp3.cm5, fecha 12 de noviembre de 2009 Impresión: 1-8117 pb (completa), formato monocatenario

Claims (21)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento para la vacunación por vía oral/mucosa que comprende la administración de una cepa de levadura recombinante, generada por ingeniería genética, de la levadura Kluyveromyces lactis, caracterizado por que esta cepa recombinante contiene un casete de expresión integrado genómicamente que se compone del promotor de LAC4 inducible por lactosa, un gen exógeno que codifica para una proteína inmunogénica, un terminador de la transcripción y el gen LAC4 que codifica para la enzima p-galactosidasa bajo el control del promotor de GAL80 de K. lactis (KIGAL80-P), teniendo lugar la integración dirigida de genes exógenos en el locus de LAC4 del genoma de levadura, sin que se introduzcan secuencias de ADN adicionales, y la expresión de genes exógenos se induce mediante lactosa o galactosa de manera dosificada o se activa constitutivamente después de desactivar el gen regulador KIGAL80.
  2. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que las cepas de K. lactis recombinantes son genéticamente estables durante el crecimiento en condiciones no selectivas.
  3. 3. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que las cepas recombinantes de la levadura Kluyveromyces lactis se emplean como sistema de expresión y para la vacunación.
  4. 4. Procedimiento según las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que las cepas recombinantes de Kluyveromyces lactis permiten la expresión inducible por lactosa de genes exógenos.
  5. 5. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones anteriores 1 a 3, caracterizado por que el gen exógeno se integra en el locus de LAC4 de la cepa de Kluyveromyces lactis recombinante.
  6. 6. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la cepa de Kluyveromyces lactis recombinante, aparte del gel exógeno, no contiene secuencias de vector adicionales ni marcadores de selección.
  7. 7. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la expresión de gen exógeno tiene lugar constitutivamente después de desactivarse el gen KIGAL80.
  8. 8. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la expresión de gen exógeno puede cuantificarse indirectamente a través de la expresión de un gen indicador endógeno.
  9. 9. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el gen exógeno permite la expresión de proteínas víricas con propiedades antigénicas.
  10. 10. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el gen exógeno permite la expresión de proteínas estructurales víricas.
  11. 11. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el gen exógeno permite la expresión de proteínas estructurales víricas de las familias Flaviviridae, Birnaviridae y Orthomyxoviridae.
  12. 12. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el gen exógeno permite la expresión de proteínas estructurales del virus de la diarrea viral bovina (BVDV).
  13. 13. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que las cepas recombinantes de la levadura Kluyveromyces lactis expresan de manera inducible o constitutiva cantidades significativas de una proteína o de dominios de esta proteína o de dominios de esta proteína fusionados con dominios de proteína de otras especies.
  14. 14. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que se permite la preparación bioquímica de proteínas exógenas.
  15. 15. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que en el caso de una vacunación por medio de la administración de células de levadura completas de una cepa recombinante de la levadura Kluyveromyces lactis se genera una inmunización específica frente a proteína exógena expresada.
  16. 16. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado por que en el caso de una vacunación por medio de administración por inhalación, bronquial, oral, nasal de células de levadura completas de una cepa recombinante de la levadura Kluyveromyces lactis, se genera una inmunización específica frente a proteína exógena expresada.
  17. 17. Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado por que proteínas exógenas preparadas bioquímicamente permiten una inmunización específica.
  18. 18. Cepa recombinante de la levadura Kluyveromyces lactis, caracterizada por que esta cepa recombinante
    contiene un casete de expresión integrado genómicamente que se compone del promotor de LAC4 inducible por lactosa, un gen exógeno que codifica para una proteína inmunogénica, un terminador de la transcripción y el gen LAC4 que codifica para la enzima p-galactosidasa bajo el control del promotor de GAL80 de K. lactis (KIGAL80-P), teniendo lugar la integración dirigida de genes exógenos en el locus de LAC4 del genoma de levadura, sin que se 5 introduzcan secuencias de ADN adicionales, y la expresión de genes exógenos se induce mediante lactosa o galactosa de manera dosificada o se activa constitutivamente después de desactivar el gen regulador KIGAL80.
  19. 19. Uso de la cepa recombinante de la levadura Kluyveromyces lactis según la reivindicación 18 para la expresión de proteínas exógenas.
    10
  20. 20. Cepa recombinante de la levadura Kluyveromyces lactis según la reivindicación 18 para su uso en la vacunación.
  21. 21. Cepa recombinante de la levadura Kluyveromyces lactis según la reivindicación 18 para su uso en la vacunación por vía oral/mucosa frente al virus BVD o el virus CSF.
    15
    lac4-p ♦ - . L Gen exógeno -n*
    i
    '/Gen exógeno
    imagen1
    VAK367-D4 (Lac Ura+)
    Derivado de Klp3
    Recombinación homologa y selección en crecimiento sobre lactosa
    VAK367-YFG (Lac+ Ura')
    imagen2
    BsaHI
    Ampicilina
    BstAPI
    - Apal PspOMI
    Hpal
    Terminador de TEF
    Fragmento de LAC41
    CJal
    SanOI
    PpuMI
    Psi
    Sacll.
    Salí
    Blnl
    BspMI
    Xcml
    Pstl
    Acclll
    ■ BamHI
    Pací
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