ES2671052T3 - Métodos para tratar afecciones asociadas con la activación del complemento dependiente de MASP-2 - Google Patents

Abstract

Un agente inhibidor de MASP-2 que inhibe selectivamente la activación del complemento dependiente de MASP-2 sin inhibir sustancialmente la activación del complemento dependiente de C1q que es un anticuerpo anti-MASP-2 o un fragmento del mismo que se une específicamente a una parte de la secuencia SEQ ID NO: 6, para su uso en la inhibición de la restenosis que sigue a un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en colocación de un stent, aterectomía rotacional y/o angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA).

Description

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DESCRIPCION

Métodos para tratar afecciones asociadas con la activación del complemento dependiente de MASP-2 Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para inhibir los efectos adversos de la activación del complemento dependiente de MASP-2.

Antecedentes de la invención

El sistema del complemento proporciona un mecanismo de acción temprana para iniciar y ampliar la respuesta inflamatoria a la infección microbiana y otros ataques agudos (M.K. Liszewski y J.P. Atkinson, 1993, en Fundamental Immunology, Tercera Edición, editado por W.E. Paul, Raven Press, Ltd., Nueva York). Si bien la activación del complemento proporciona una defensa de primera línea valiosa contra patógenos potenciales, las actividades del complemento que promueven una respuesta inflamatoria protectora pueden también representar una amenaza potencial al hospedante (K.R. Kalli, et al., Springer Semin. Immunopathol. 15:417-431, 1994; B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24:219-228, 1994). Por ejemplo, los productos proteolíticos C3 y C5 atraen y activan neutrófilos. Estas células activadas son indiscriminadas en su liberación de enzimas destructivas y pueden causar daño orgánico. Además, la activación del complemento puede causar la deposición de componentes del complemento líticos en células hospedantes aledañas así como también en dianas microbianas, produciendo la lisis de la célula hospedante.

El sistema del complemento se ha implicado como contribuyente a la patogénesis de diversas enfermedades agudas y crónicas, incluidos infarto de miocardio, revascularización que le sigue a accidente cerebrovascular, síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS), lesión de reperfusión, choque septicémico, fuga capilar que le sigue a quemaduras térmicas, inflamación post-derivación cardiopulmonar, rechazo de trasplante, artritis reumatoidea, esclerosis múltiple, miastenia grave y enfermedad de Alzheimer. Prácticamente en todas estas afecciones, el complemento no es la causa, sino uno de los diversos factores implicados en la patogénesis. No obstante, la activación del complemento puede ser un mecanismo patológico importante y representa un punto para el control clínico en muchos de estos estados de enfermedad. El reconocimiento cada vez mayor de la importancia de la lesión del tejido mediada por el complemento en una diversidad de estados de enfermedad subraya la necesidad de fármacos eficaces inhibidores del complemento. No se ha aprobado ningún fármaco para uso en seres humanos que se dirija específicamente e inhiba la activación del complemento.

Actualmente, está ampliamente aceptado que el sistema del complemento puede activarse a través de tres vías distintas: la vía clásica, la vía de lectinas y la vía alternativa. La vía clásica es usualmente desencadenada por la unión de un anticuerpo a una partícula extraña (es decir, un antígeno) y por lo tanto requiere la exposición previa a ese antígeno para la generación del anticuerpo específico. Dado que la activación de la vía clásica está asociada con el desarrollo de una respuesta inmune, la vía clásica es parte del sistema inmunológico adquirido. En contraste, tanto la ruta de las lectinas como la ruta alternativa son independientes de la inmunidad clonal y forman parte del sistema inmunológico innato.

La primera etapa en la activación de la vía clásica es la unión de una molécula de reconocimiento específica, C1q, a IgG e IgM de unión a antígenos. La activación del sistema del complemento produce la activación secuencial de cimogenos de serina proteasa. La C1q está asociada con las proenzimas de serina proteasa C1r y C1s como un complejo llamado C1 y, tras la unión de C1q a un complejo inmune, a la escisión autoproteolítica del sitio Arg-Ile de C1r le sigue la activación por C1r de C1s, que adquiere así la capacidad de escindir C4 y C2. La escisión de C4 en dos fragmentos, denominados C4a y C4b, permite que los fragmentos C4b formen enlaces covalentes con los grupos hidroxilo o amino adyacentes y la subsiguiente generación de convertasa C3 (C4b2b) a través de la interacción no covalente con el fragmento C2b de C2 activada. La convertasa C3 (C4b2b) activa C3, lo que lleva a la generación de la convertasa C5 (C4b2b3b) y a la formación del complejo de ataque a la membrana (C5b-9) que puede causar lisis microbiana. Las formas activadas de C3 y C4 (C3b y C4b) se depositan covalentemente en las superficies diana exógenas, que son reconocidas por los receptores del complemento en múltiples fagocitos.

Independientemente, el primer paso en la activación del sistema del complemento por la vía de lectinas es también la unión de moléculas de reconocimiento específicas, seguida por la activación de serina proteasas asociadas. No obstante, en lugar de la unión de complejos inmunes por C1q, las moléculas de reconocimiento en la vía de lectinas son proteínas unidas a carbohidratos (lectina de unión a manano (MBL), H-ficolina, M-ficolina y L-ficolina) (J. Lu et al., Biochim. Biophys. Acta 1572:387-400, 2002; Holmskov et al, Annu. Rev. Immunol. 21:547-578 (2003); Teh et al., Immunology 101:225-232 (2000)). Ikeda et al. fueron los primeros en demostrar que, al igual que C1q, la MBL podía activar el sistema del complemento tras la unión a eritrocitos recubiertos con manano en un modo dependiente de C4 (K. Ikeda et al., J. Biol. Chem. 262:7451-7454, 1987). La MBL, un miembro de la familia de la proteína colectina, es una lectina dependiente del calcio que se une a carbohidratos con grupos 3 y 4-hidroxi orientados en el plano ecuatorial del anillo piranosa. Por lo tanto, los ligandos prominentes para MBL son D-manosa y N-acetil-D- glucosamina, mientras que los carbohidratos que no cumplen este requerimiento estérico tienen afinidad indetectable hacia MBL (Weis, W.I., et al., Nature 360:127-134, 1992). La interacción entre MBL y azúcares

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monovalentes es extremadamente débil, con constantes de disociación típicamente en el intervalo 2 mM. La MBL logra unión firme y específica a ligandos de glicano por interacción con múltiples residuos de monosacáridos simultáneamente (Lee, R.T., et al., Archiv. Biochem. Biophys. 299:129-136, 1992). La MBL reconoce los patrones del carbohidrato que comúnmente decoran a microorganismos tales como bacterias, levadura, parásitos y ciertos virus. En contraste, la MBL no reconoce la D-galactosa ni el ácido siálico, los penúltimos y últimos azúcares que usualmente decoran glucoconjugados complejos "maduros" presentes en glucoproteínas de la superficie celular y en el plasma de mamíferos. Se cree que esta especificidad de unión ayuda a proteger contra la autoactivación. No obstante, la MBL se une con gran afinidad a grupos de glicanos “precursores” de gran contenido de manosa en glucoproteínas y glucolípidos unidos por N secuestrados en la retícula endoplasmática y en el Golgi de células mamíferas (Maynard, Y., et al., J. Biol. Chem. 257:3788-3794, 1982). En consecuencia, las células dañadas son dianas potenciales para la activación de la vía de lectinas mediante la unión a la MBL.

Las ficolinas poseen un tipo distinto de dominio de lectina que la MBL, llamado dominio de tipo fibrinógeno. Las ficolinas se unen a residuos de azúcar en un modo independiente del Ca++. En seres humanos, se han identificado tres clases de ficolinas, L-ficolina, M-ficolina y H-ficolina. Ambas ficolinas del suero, L-ficolina y H-ficolina, tienen en común una especificidad hacia N-acetil-D-glucosamina; no obstante, la H-ficolina también se une a N-acetil-D- galactosamina. La diferencia en la especificidad del azúcar de L-ficolina, H-ficolina y MBL significa que las diferentes lectinas pueden ser complementarias y dirigir glucoconjugados diferentes aunque superpuestos. Este concepto es respaldado por el informe reciente que indica que, de las lectinas conocidas en la vía de lectinas, solamente L- ficolina se une específicamente al ácido lipoteicoico, un glucoconjugado de la pared celular que se halla en todas las bacterias grampositivas (Lynch, N.J., et al., J. Immunol. 172:1198-1202, 2004). Las colectinas (es decir, MBL) y las ficolinas no portan similitud importante en la secuencia de aminoácidos. No obstante, los dos grupos de proteínas tienen organizaciones de dominios similares y, al igual que C1q, se agrupan en estructuras oligoméricas, que maximizan la posibilidad de la unión a múltiples sitios. Las concentraciones séricas de MBL son altamente variables en poblaciones sanas, y esto es controlado genéticamente por el polimorfismo/mutaciones tanto en las regiones promotoras con codificantes del gen de MBL. Como proteína de fase aguda, la expresión de MBL además aumenta durante la inflamación. La L-ficolina está presente en el suero a concentraciones similares a la MBL. Por lo tanto, la rama de L-ficolina de la vía de lectinas es potencialmente comparable con la rama de MBL en cuanto a fuerza. La MBL y las ficolinas también pueden funcionar como opsoninas, que requieren la interacción de estas proteínas con receptores de fagocitos (Kuhlman, M., et al., J. Exp. Mecl. 169:1733, 1989; Matsushita, M., et al,. J. Biol. Chem. 271:2448-54, 1996). No obstante, las identidades del receptor o los receptores en las células fagocíticas no han sido establecidas.

La MBL humana forma una interacción específica y de gran afinidad a través de su dominio de tipo colágeno con serina proteasas de tipo C1r/C1s, denominadas serina proteasas asociadas a MBL (MASP). Hasta la fecha, se han descrito tres MASP. Primero, se identificó una "MASP" de una sola enzima y se caracterizó como la enzima responsable del inicio de la cascada del complemento (es decir, escisión de C2 y C4) (Ji, Y.H., et al., J. Immunol. 150:571-578, 1993). Posteriormente, resultó que la MASP es de hecho una mezcla de dos proteasas: MASP-1 y MASP-2 (Thiel, S., et al., Nature 386:506-510, 1997). No obstante se demostró que el complejo MBL-MASP-2 solo es suficiente para la activación del complemento (Vorup-Jensen, T., et al., J. Immunol. 165:2093-2100, 2000). Asimismo, solamente la MASP-2 escindió C2 y C4 en altas tasas (Ambrus, G., et al., J. Immunol. 170:1374-1382, 2003). Por consiguiente, la MASP-2 es la proteasa responsable de activar C4 y C2 para generar la convertasa C3, C4b2b. Esta es una diferencia importante del complejo C1, en donde la acción coordinada de dos serina proteasas específicas (C1r y C1s) conduce a la activación del sistema del complemento. Recientemente, se aisló una tercera proteasa nueva, MASP-3 (Dahl, M.R., et al., Immunity 15:127-35, 2001). MASP-1 y MASP-3 son productos alternativamente empalmados del mismo gen. Las funciones biológicas de MASP-1 y MASP-3 permanecen irresueltas.

Las MASP son organizaciones de dominios idénticos a aquellos de C1r y C1s, los componentes enzimáticos del complejo C1 (Sim, R.B., et al., Biochem. Soc. Trans. 28:545, 2000). Estos dominios incluyen un dominio morfogénico veg/óseo de erizo de mar/C1r/C1s N-terminal (CUB), un dominio de tipo factor de crecimiento epidérmico, un segundo dominio CUB, un tándem de los dominios de la proteína de control del complemento y un dominio de serina proteasa. Como en las C1 proteasas, la activación de MASP-2 ocurre a través de la escisión de un enlace Arg-Ile adyacente al mismo dominio de la serina proteasa, que divide la enzima en cadenas A y B unidas a disulfuro, en donde la última consiste en el dominio de serina proteasa. Recientemente, se describió una deficiencia genéticamente determinada de MASP-2 (Stengaard-Pedersen, K., et al., New Eng. J. Mecl. 349:554-560, 2003). La mutación de nucleótidos sencillos conduce a un intercambio Asp-Gly en el dominio CUBI y torna la MASP-2 incapaz de unirse a MBL.

La MBL está también asociada con una proteína no enzimática denominada proteína asociada a MBL de 19 kDa (MAp19) (Stover, C.M., J. Immunol. 162:3481-90, 1999) o proteína pequeña asociada a MBL (sMAP) (Takahashi, M., et al., Int. Immunol. 11:859-863, 1999). La MAp19 se forma por el empalme alternativo del producto génico de MASP 2 y comprende los primeros dos dominios de MASP-2, seguidos por una secuencia extra de cuatro aminoácidos únicos. Los genes de MASP 1 y MASP 2 están ubicados en los cromosomas 3 y 1, respectivamente (Schwaeble, W., et al., Immunobiology 205:455-466, 2002).

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Varias líneas de evidencia sugieren que hay diferentes complejos de MBL-MASP y una gran fracción de las MASP totales en el suero no forma complejo con MBL (Thiel, S., et al., J. Immunol. 165:878-887, 2000). Tanto la ficolina H como la L están asociadas con MASp y activan la vía del complemento de lectinas, al igual que la MBL (Dahl, M.R., et al., Immunity 15:127-35, 2001; Matsushita, M., et al., J. Immunol. 168:3502-3506, 2002). La vía de lectinas y la vía clásica forman una convertasa C3 (C4b2b) y las dos vías convergen en esta etapa.

Se cree en gran medida que la vía de lectinas tiene una función importante en la defensa del hospedante contra infecciones. Los datos sólidos de la participación de la MBL en la defensa del hospedante provienen del análisis de pacientes con niveles séricos reducidos de MBL funcional (Kilpatrick, D.C., Biochim. Biophys. Acta 1572:401-413, 2002). Dichos pacientes exhiben susceptibilidad a infecciones fúngicas y bacterianas recurrentes. Estos síntomas por lo general son evidentes de manera temprana en la vida, durante una obvia vulnerabilidad a medida que se disipa la titulación de anticuerpos derivados de la madre, pero antes de que se desarrolle un repertorio completo de respuestas de anticuerpos. Este síndrome a menudo proviene de mutaciones en varios sitios en la porción de colágeno de la MBL, que interfieren con la formación correcta de oligómeros de MBL. No obstante, ya que la MBL puede funcionar como una opsonina independiente del complemento, no se sabe hasta qué grado el aumento de susceptibilidad a infecciones se debe a la activación del complemento.

Si bien existen muchos datos que implican tanto a la vía del complemento clásica como a la alternativa en la patogénesis de enfermedades humanas no infecciosas, la función de la vía de lectinas está ahora comenzando a ser evaluada. Estudios recientes aportan datos que indican que la activación de la vía de lectinas puede ser responsable de la activación del complemento y de la inflamación relacionada en lesión de isquemia/ reperfusión. Collard et al. (2000) indicaron que las células endoteliales cultivadas, sometidas a estrés oxidativo se unen a MBL y exhiben deposición de C3 tras la exposición a suero humano (Collard, C.D., et al., Am. J. Pathol. 156:1549-1556, 2000). A su vez, el tratamiento de sueros humanos con anticuerpos monoclonales anti-MBL bloqueantes inhibió la unión a MBL y la activación del complemento. Estos hallazgos se extendieron a un modelo de rata de isquemia de miocardio- reperfusión en el que las ratas tratadas con anticuerpo bloqueante dirigido contra MBL de rata exhibieron significativamente menos daño del miocardio tras la oclusión de una arteria coronaria, que las ratas tratadas con un anticuerpo control (Jordan, J.E., et al., Circulation 104:1413-1418, 2001). El mecanismo molecular de la unión de MBL al endotelio vascular después de estrés oxidativo no está del todo claro; un estudio reciente sugiere que la activación de la vía de lectinas después del estrés oxidativo puede ser mediada por la unión de MBL a citoqueratinas endoteliales vasculares y no a glucoconjugados (Collard, C.D., et al., Am. J. Pathol. 159:1045-1054, 2001). Otros estudios han implicado a la vía clásica y a la vía alternativa en la patogénesis de la lesión de isquemia/reperfusión, y la función de la vía de lectinas en esta enfermedad sigue siendo controvertida (Riedermann, N.C., et al., Am. J. Pathol. 162:363-367, 2003).

En contraste con las vías clásica y de lectinas, no se han hallado iniciadores de la vía alternativa que cumplan las funciones de reconocimiento que efectúan la C1q y las lectinas en las otras dos vías. Actualmente se acepta ampliamente que la vía alternativa es desencadenada espontáneamente por superficies externas y anormales (bacterias, levadura, células infectadas por virus o tejido dañado). Hay cuatro proteínas plasmáticas directamente implicadas en la vía alternativa: C3, factores B y D y properdina. La generación proteolítica de C3b de C3 nativo se requiere para que funcione la vía alternativa. Dado que la convertasa C3 de la vía alternativa (C3bBb) contiene C3b como una subunidad esencial, la cuestión con respecto al origen de la primera C3b mediante la vía alternativa ha presentado un enigma y ha promovido una investigación considerable.

C3 pertenece a la familia de proteínas (junto con C4 y a-2 macroglobulina) que contienen una rara modificación posttraducción conocida como enlace tioéster El grupo tioéster está compuesto por una glutamina cuyo grupo carbonilo terminal está unido al grupo sulfhidrilo de una cisteína a tres aminoácidos de distancia. Este enlace es inestable y el grupo carbonilo electrófilo de la glutamina puede formar un enlace covalente con otras moléculas mediante los grupos hidroxilo o amino. El enlace tioéster es razonablemente estable cuando se secuestra dentro de un bolsillo hidrófilo de C3 intacta. Sin embargo, la escisión proteolítica de C3 a C3a y C3b resulta en la exposición del enlace tioéster altamente reactivo en C3b y mediante este mecanismo, C3b se acopla covalentemente a una diana. Además de su función bien documentada en la unión covalente de C3b a dianas del complemento, también se cree que el tioéster de C3 tiene una función pivotal en desencadenar la vía alternativa. Según la teoría “poco avanzada” y ampliamente aceptada, la vía alternativa es iniciada por la generación de una convertasa de fase fluida, iC3Bb, que se forma a partir de C3 con tioéster hidrolizado (iC3; C3(H2O)) y factor B (Lachmann, P.J., et al., Springer Semin. Immunopathol. 7:143-162, 1984). iC3 de tipo C3b se genera a partir de C3 nativa mediante hidrólisis espontánea lenta del tioéster interno en la proteína (Pangburn, M.K., et al., J. Exp. Med. 154:856-867, 1981). A través de la actividad de la convertasa iC3Bb, las moléculas de C3b se depositan en la superficie diana, iniciando de este modo la vía alternativa.

Se sabe muy poco acerca de los iniciadores de activación de la vía alternativa. Se cree que los activadores incluyen paredes de células de levadura (cimosano), muchos polisacáridos puros, eritrocitos de conejo, ciertas inmunoglobulinas, virus, hongos, bacterias, células tumorales animales, parásitos y células dañadas. La única característica en común con estos activadores es la presencia de carbohidrato, pero la complejidad y variedad de las estructuras de los carbohidratos ha hecho difícil que se puedan establecer los determinantes moleculares compartidos, los cuales se reconocen.

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La vía alternativa puede también proporcionar un potente bucle de ampliación para la convertasa de las vía C3 de lectinas/clásica (C4b2b), ya que cualquier C3b generado puede participar con el factor B en la formación de la convertasa C3 de la vía alternativa (C3bBb) adicional. La convertasa C3 de la vía alternativa se estabiliza mediante la unión de properdina. La properdina extiende seis a diez veces la semivida de la convertasa C3 de la vía alternativa. La adición de C3b a la convertasa C3 conduce a la formación de la convertasa C5 de la vía alternativa.

Se ha pensado que las tres vías (es decir, la clásica, la de lectinas y la alternativa) convergen en C5, que se escinde para formar productos con múltiples efectos proinflamatorios. Se ha hecho referencia a la vía de convergencia como la vía del complemento terminal. C5a es la anafilatoxina más potente, que induce alteraciones en el músculo liso y en el tono vascular, así como también permeabilidad vascular. Es también una poderosa quimiotaxina y un activador de neutrófilos y monocitos. La activación celular mediada por C5a puede ampliar significativamente las respuestas inflamatorias, induciendo la liberación de múltiples mediadores inflamatorios adicionales, incluidas citocinas, enzimas hidrolíticas, metabolitos de ácido araquidónico y especies de oxígeno reactivas. La escisión de C5 conduce a la formación de C5b-9, también conocida como el complejo de ataque a la membrana (MAC). Existe ahora una fuerte evidencia de que la deposición de MAC sublítica puede cumplir una función importante en la inflamación, además de su función como complejo formador de poros líticos.

Rugonfalvi-Kiss Szaboles et al, en Stroke A Journal of Cerebral Circulation Mayo 2005, vol 36, n° 5 (2005) describen la implicación de MASP en enfermedades.

Compendio de la invención

La presente invención se refiere a un agente inhibidor de MASP-2 que inhibe selectivamente la activación del complemento dependiente de MASP-2 sin inhibir sustancialemte la activación del complemento de C1q, el cual es un anticuerpo anti-MASP-2 o un fragmento del mismo que se une específicamente a una porción de la secuencia SEQ ID NO: 6, para su uso en la inhibición de la restenosis que sigue a un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en colocación de un stent, aterectomía rotacional y/o angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA).

También se describe en la presente memoria un método para inhibir los efectos adversos de la activación del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto vivo. El método incluye la etapa de administrar a un sujeto que lo necesita, una cantidad de un agente inhibidor de MASP-2 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2. En este contexto, la frase "activación del complemento dependiente de MASP-2" se refiere a la activación del complemento de la ruta alternativa que ocurre mediante el sistema MASP-2 dependiente de lectina. El agente inhibidor de MASP-2 inhibe la activación del complemento mediante el sistema MASP-2 dependiente de lectina sin inhibir sustancialmente la activación del complemento a través del sistema dependiente de C1q clásico, de modo tal que el sistema dependiente de C1q permanece funcional.

El agente inhibidor de MASP-2 es un anticuerpo anti-MASP-2 o su fragmento. El anticuerpo anti-MASP-2 puede tener la función efectora reducida.

También se describen en esta memoria composiciones para inhibir los efectos adversos de la activación del complemento dependiente de MASP-2, que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de MASP-2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También se describen métodos para elaborar un medicamento para uso en la inhibición de los efectos adversos de la activación del complemento dependiente de MASP-2 en sujetos vivos que lo necesitan, que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de MASP-2 en un vehículo farmacéutico. También se describen métodos para elaborar medicamentos para uso en la inhibición de la activación del complemento dependiente de MASP-2 para el tratamiento de cada una de las afecciones, enfermedades o trastornos que se describen a continuación en este documento.

Los métodos, composiciones y medicamentos descritos en este documento son útiles para inhibir los efectos adversos de la activación del complemento dependiente de MASP-2 in vivo en sujetos mamíferos, incluidos seres humanos que padecen una afección o lesión patológica aguda como se describirá en más detalle en la presente invención. Dichas afecciones o lesiones incluyen, aunque sin limitarse a ello, la activación del complemento mediada por MASP-2 en trastornos autoinmunes asociados y/o en afecciones inflamatorias.

En la presente memoria también se describen métodos para el tratamiento de lesiones de reperfusión por isquemia, tratando a un sujeto que experimenta una reperfusión isquémica, lo que incluye, de manera no taxativa, después de la reparación de un aneurisma aórtico, derivación cardiopulmonar, renastomosis vascular en relación con, por ejemplo, trasplante de órgano (p. ej., de corazón, pulmón, hígado, riñón) y/o reimplante de una extremidad/dígito, accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, reanimación hemodinámica después de procedimientos de choque y/o quirúrgicos, con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de MASP-2 en un vehículo farmacéutico.

En la presente memoria también se describen métodos para inhibir la aterosclerosis, tratando a un sujeto que padece o es propenso a la aterosclerosis, con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de MASP-2 en un vehículo farmacéutico.

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En esta memoria se describen también métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que experimenta una afección vascular que incluye, sin limitación, afecciones cardiovasculares, afecciones cerebrovasculares, afecciones periféricas (p. ej. musculoesqueléticas) afecciones vasculares, afecciones renovasculares, vasculares mesentéricas/entéricas y revascularización a trasplantes y/o reimplantes, tratando a dichos pacientes con una cantidad terapéuticamente eficaz de agente inhibidor de MASP-2. Dichas afecciones incluyen, sin limitación, el tratamiento de: vasculitis, incluida nefritis púrpura de Henoch-Schonlein, vasculitis asociada a lupus eritematoso sistémico, vasculitis asociada a artritis reumatoidea (también llamada artritis reumatoidea maligna), vasculitis del complejo inmunológico y enfermedad de Takayasu; cardiomiopatía dilatada; angiopatía diabética; enfermedad de Kawasaki (arteritis); embolia gaseosa venosa (vGe); y/o restenosis que sigue a la colocación de un stent, aterectomía rotacional y/o angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA).

En esta memoria se describen también métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que padece trastornos gastrointestinales inflamatorios, incluidos, aunque sin limitarse a ello, pancreatitis, diverticulitis y trastornos intestinales que incluyen enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y síndrome de intestino irritable.

En esta memoria se describen también métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que padece una afección pulmonar, lo que incluye, aunque sin limitación, síndrome de dificultad respiratoria aguda, lesión pulmonar aguda relacionada con una transfusión, lesión pulmonar aguda por isquemia/reperfusión, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma, granulomatosis de Wegener, enfermedad antimembrana basal glomerular (enfermedad de Goodpasture), síndrome de aspiración de meconio, síndrome de bronquiolitis obliterante, fibrosis pulmonar idiopática, lesión pulmonar aguda secundaria a quemadura, edema pulmonar no cardiogénico, depresión respiratoria relacionada con transfusión y enfisema.

En esta memoria se describen también métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que se ha sometido, se está sometiendo o se someterá a un procedimiento de reperfusión extracorpóreo, incluidos, aunque sin limitarse a ello, hemodiálisis, plasmaféresis, leucoféresis, oxigenación por membrana extracorpórea (ECMo), precipitación de LDL por oxigenación por membrana extracorpórea inducida por heparina (HELP) y derivación cardiopulmonar (CPB).

En esta memoria se describen también métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que padece una afección musculoesquelética, lo que incluye, aunque sin limitarse a ello, artrosis, artritis reumatoidea, artritis reumatoidea juvenil, gota, artropatía neuropática, artritis soriásica, espondilitis anquilosante u otras espondiloartropatías y artropatías cristalinas o lupus eritematoso sistémico (SLE).

También se describen métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que padece afecciones renales que incluyen, aunque sin limitarse a ello, glomerulonefritis esangioproliferativa, glomerulonefritis membranosa, glomerulonefritis membranoproliferativa (glomerulonefritis mesangiocapilar), glomerulonefritis post-infecciosa aguda (glomerulonefritis postestreptocócica), glomerulonefritis crioglobulinémica, nefritis por lupus, nefritis por púrpura de Henoch-Schonlein o nefropatía de IgA.

En esta memoria se describen también métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que padece una afección de la piel que incluye, aunque sin limitación, dermatosis bullosa autoinmune, espongiosis eosinofílica, penfigoide bulloso, epidermólisis bullosa adquirida y herpes gestacional, y otros trastornos de la piel, o provenientes de una lesión por quemadura térmica o química que implica fuga capilar.

En esta memoria se describen también métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que ha recibido un trasplante de órgano u otro tejido, lo que incluye, aunque sin limitarse a ello, alotrasplante o xenotrasplante de órganos enteros (p.ej., riñón, corazón, hígado, páncreas, pulmón, córnea, etc.) o injertos (p. ej., válvulas, tendones, médula ósea, etc.).

En esta memoria se describen también métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que padece un trastorno o lesión del sistema nervioso central o un trastorno o lesión del sistema nervioso periférico que incluye, sin limitación, esclerosis múltiple (MS), miastenia grave (MG), enfermedad de Huntington (HD), esclerosis lateral amiotrófica (ALS), síndrome de Guillain Barre, reperfusión que le sigue a accidente cerebrovascular, discos degenerativos, traumatismo cerebral, enfermedad de Parkinson (PD), enfermedad de Alzheimer (AD), síndrome de Miller-Fisher, traumatismo cerebral y/o desmielinación por hemorragia y meningitis.

En esta memoria se describen también métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que padece un trastorno de la sangre que incluye, aunque sin limitarse a ello, septicemia o una afección que resulta de septicemia, incluidos, sin limitación, septicemia severa, choque septicémico, síndrome de dificultad respiratoria aguda resultante de septicemia y síndrome de respuesta inflamatoria sistémica. Se dan a conocer métodos relacionados para el tratamiento de otros trastornos de la sangre, incluido choque hemorrágico, anemia hemolítica, púrpura tromobictopénica trombótica autoinmune (TTP), síndrome urémico hemolítico (HUS) u otras afecciones destructivas de la médula/sangre.

En esta memoria se describen también métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que padece una afección urogenital que incluye, aunque sin limitarse a ello, enfermedad de vejiga

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dolorosa, enfermedad de vejiga sensorial, cistitis abacteriana crónica y cistitis intersticial, esterilidad masculina y femenina, disfunción placentaria y aborto espontáneo y pre-eclampsia.

En esta memoria se describen también métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que padece diabetes no obesa (diabetes de tipo 1 o diabetes mellitus insulinodependiente) o complicaciones de angiopatía, neuropatía o retinopatía por diabetes de tipo 1 o de tipo 2 (del adulto).

En esta memoria se describen también métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que recibe tratamiento de quimioterapia y/o radioterapia, incluido sin limitación el tratamiento de afecciones cancerosas, administrando un inhibidor de MASP-2 a dicho paciente en forma periquimioterapéutica o por perirradioterapia, es decir, antes y/o durante y/o después de la administración de agente(s) quimioterapéutico(s) y/o radioterapia. La administración de la terapia periquimoterapéutica o por perirradioterapia de inhibidores de MASP-2 puede ser útil para reducir los efectos colaterales de la terapia quimoterapéutica o la radioterapia. Aún en un aspecto adicional de la invención, se proporcionan métodos para el tratamiento de malignidades, administrando un agente inhibidor de MASP-2 en un vehículo farmacéuticamente aceptable a un paciente que padece una malignidad.

En esta memoria se describen también métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que padece un trastorno endocrino, administrando a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de MASP-2 en un vehículo farmacéutico. Las afecciones sujetas al tratamiento de acuerdo con la presente invención incluyen, a modo de ejemplo no limitativo, tiroiditis de Hashimoto, estrés, ansiedad y otros trastornos hormonales potenciales que implican la liberación regulada de prolactina, factor de crecimiento o factor de crecimiento de tipo insulina y adrenocorticotropina de la glándula hipófisis.

En esta memoria se describen también métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que padece degeneración macular relacionada con la edad u otra afección oftalmológica mediada por el complemento, administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de MASP-2 en un vehículo farmacéutico a un sujeto que padece dicha afección.

Breve descripción de los dibujos

Los métodos precedentes y muchas de las ventajas concomitantes de la presente invención se apreciarán más fácilmente a medida que los mismos se entiendan mejor por referencia a la siguiente descripción detallada tomada junto con los dibujos adjuntos, en donde:

Los métodos precedentes y muchas de las ventajas concomitantes de la presente invención se apreciarán más fácilmente a medida que los mismos se entiendan mejor por referencia a la siguiente descripción detallada tomada junto con los dibujos adjuntos, en donde:

La Figura 1 es un diagrama de flujo que ilustra el nuevo descubrimiento de que la nueva vía del complemento alternativa requiere la activación de MASP-2 dependiente de la vía de lectinas para la activación del complemento;

La Figura 2 es un diagrama que ilustra la estructura genómica de la MASP-2 humana;

La Figura 3A es un diagrama esquemático que ilustra la estructura de dominio de la proteína MASP-2 humana;

La Figura 3B es un diagrama esquemático que ilustra la estructura de dominio de la proteína MAp19 humana;

La Figura 4 es un diagrama que ilustra la estrategia de inactivación de genes de MASP-2 murinos;

La Figura 5 es un diagrama que ilustra el constructo de minigen de MASP-2;

La Figura 6A presenta resultados que demuestran que la deficiencia de MASP-2 produce la pérdida de la activación de C4 mediada por la vía de lectinas según lo medido por la falta de deposición de C4b en manano;

La Figura 6B presenta resultados que demuestran que la deficiencia de MASP-2 produce la pérdida de la activación de C4 mediada por la vía de lectinas según lo medido por la deposición de C4b en cimosano;

La Figura 6C presenta resultados que demuestran niveles relativos de activación de C4 en muestras de suero obtenidas de MASP-2+/-; MASP-2-/- y de cepas de tipo salvaje según lo medido por deposición de C4b en manano y en cimosano;

La Figura 7A presentas resultados que demuestran que la deficiencia de MASP-2 produce la pérdida de activación de C3 mediada por la vía de lectinas y mediada por la vía alternativa, según lo medido por la falta de deposición de C3b en manano;

La Figura 7B presenta resultados que demuestran que la deficiencia de MASP-2 produce la pérdida de la activación de C3 mediada por la vía de lectinas y por la vía alternativa, según lo medido por la falta de deposición de C3b en cimosano;

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La Figura 8 presenta resultados que demuestran que la adición de MASP-2 recombinante de murino a muestras de suero MASP-2-/- recupera la activación de C4 mediada por la vía de lectinas in un modo dependiente de la concentración de proteínas, según lo medido por la deposición de C4b en manano;

La Figura 9 presenta resultados que demuestran que la vía clásica es funcional en la cepa de MASP-2-/-; y

La Figura 10 presenta resultados que demuestran que el sistema de activación del complemento dependiente de MASP-2 se activa en la fase de isquemia/reperfusión que le sigue a la reparación de un aneurisma aórtico abdominal.

Descripción de la lista de secuencias

SEC ID NO: 1 ADNc de MAp19 humana

SEC ID NO: 2 proteína MAp19 humana (con líder)

SEC ID NO: 3 proteína MAp19 humana (madura)

SEC ID N0: 4 ADNc de MASP-2 humana

SEC ID N0 : 5 proteína MASP-2 humana (con líder)

SEC ID NO: 6 proteína MASP-2 humana (madura)

SEC ID NO: 7 ADNg de MASP-2 humana (exones 1-6)

ANTÍGENOS: (CON REFERENCIA A LA PROTEÍNA MADURA MASP-2)

SEC ID NO: 8 secuencia CUBI (aa 1-121)

SEC ID NO: 9 secuencia CUBEGF (aa 1-166)

SEC ID NO: 10 CUBEGFCUBII (aa 1-293)

SEC ID NO: 11 región EGF (aa 122-166)

SEC ID NO: 12 dominio de serina proteasa (aa 429 - 671)

SEC ID NO: 13 dominio de serina proteasa inactivo (aa 610-625 con Ser618 para la mutación Ala)

SEC ID NO: 14 TPLGPKWPEPVFGRL (péptido CUBI)

SEC ID NO: 15 TAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCEYDFVKLSSGAKVLATLC GQ (péptido CUBI)

SEC ID NO: 16 TFRSDYSN (núcleo de la región de unión a MBL)

SEC ID NO: 17 FYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGF (región de unión a MBL) SEC ID NO: 18 IDECQVAPG (PÉPTIDO EGF)

SEC ID NO: 19 ANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALV (núcleo de la región de unión a serina proteasa) INHIBIDORES DE PÉPTIDOS:

SEC ID N0: 20 ADNc de longitud total MBL SEC ID NO: 21 proteína de longitud total MBL SEC ID NO: 22 OGK-X-GP (unión de consenso)

SEC ID NO: 23 OGKLG SEC ID NO: 24 GLR GLQ GPO GKL GPO G SEC ID NO: 25 GPO GPO GLR GLQ GPO GKL GPO GPO GPO SEC ID NO: 26 GKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPOGKLGPOG SEC ID NO: 27 GAOGSOGEKGAOGPQGPOGPOGKMGPKGEOGDO (h-ficolina humana)

SEC ID NO: 28 GCOGLOGAOGDKGEAGTNGKRGERGPOGPOGKAGPOGPN GAOGEO (ficolina humana p35)

SEC ID NO: 29 LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI (sitio de escisión C4)

INHIBIDORES DE EXPRESIÓN:

SEC ID N0: 30 ADNc del dominio CUBI-EGF (nucleótidos 22-680 de SEC ID NO: 4)

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SEC ID NO: 31

5' CGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGC 3'

Nucleótidos 12-45 de SEC ID NO: 4 incluido el sitio de inicio de la traducción MASP-2 (sentido)

SEC ID NO: 32

5 'G AC ATT ACCTTCCGCTCCG ACTCC A ACG AG A AG3'

Nucleótidos 361-396 de SEC ID NO: 4 que codifican una región que comprende la unión al sitio de MBL,MASP-2 (sentido)

SEC ID NO: 33

5 AGC AGCCCTG A AT ACCC ACGGCCGT ATCCC A A A3'

Nucleótidos 610-642 de SEC ID NO: 4 que codifican una región que comprende el dominio CUBII CEBADORES DE CLONACIÓN:

SEC ID NO: 34 CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC (5' PCR para CUB)

SEC ID NO: 35 GGAATTCCTAGGCTGCATA (3' PCR PARA CUB)

SEC ID NO: 36 GGA ATTCCT AC AGGGCGCT (3' PCR PARA CUBIEGF) SEC ID NO: 37 GGAATTCCTAGTAGTGGAT (3' PCR PARA CUBIEGFCUBII)

SEC ID NOS: 38-47 son cebadores de clonación para el anticuerpo humanizado

SEC ID NO: 48 es un enlace peptídico 9 aa

VECTOR DE EXPRESIÓN:

SEC ID NO: 49 es el inserto del minigen MASP-2

SEC ID NO: 50 es el ADNc de MASP-2 murina

SEC ID NO: 51 es la proteína MASP-2 murina (con líder)

SEC ID NO: 52 es la proteína MASP-2 murina madura

SEC ID NO: 53 ADNc de MASP-2 de rata

SEC ID NO: 54 es la proteína MASP-2 de rata (con líder)

SEC ID NO: 55 es la proteína MASP-2 de rata madura

SEC ID NO: 56-59 son los oligonucleótidos para mutagénesis del sitio dirigido de MASP-2 humana que se usan para generar MASP-2A humana

SEC ID NO: 60-63 son los oligonucleótidos para mutagénesis de sitio dirigido de MASP-2 murina que se usan para generar MASP-2A murina

SEC ID NO: 64-65 son los oligonucleótidos para mutagénesis de sitio dirigido de MASP-2 de rata que se usan para generar MASP-2A de rata

Descripción detallada

La presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento de los presentes inventores de que la MASP-2 es necesaria para iniciar la activación de la vía del complemento alternativa. A través del uso de un modelo de ratón con genes inactivados de MASP-2-/-, los presentes inventores han demostrado que es posible inhibir la activación de la vía del complemento alternativa mediante la vía de MASP-2 mediada por lectinas, dejando la vía clásica intacta, estableciendo así la activación de MASP-2 dependiente de lectinas como un requerimiento para la activación del complemento alternativa en ausencia de la vía clásica. La presente invención describe también el uso de MASP-2 como diana terapéutica para inhibir la lesión celular asociada con la activación de la vía del complemento alternativa mediada por lectinas, dejando intacto el componente de la vía clásica (dependiente de C1q) del sistema inmunológico.

I. Definiciones

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A menos que se defina específicamente en este documento, todos los términos utilizados en la presente memoria tienen el significado que entendería el experto en la técnica de la presente invención. Las siguientes definiciones se proveen con fines de claridad con respecto a los términos que se utilizan en la memoria y en las reivindicaciones para describir la presente invención.

Tal como se emplea en la presente memoria, la expresión "activación del complemento dependiente de MASP-2" se refiere a la activación del complemento de la ruta alternativa que ocurre mediante la activación de MASP-2 dependiente de lectina.

Tal como se emplea en la presente memoria, el término "vía alternativa" se refiere a la activación del complemento que es desencadenada, por ejemplo, por cimosano de paredes de células de hongos y levadura, lipopolisacárido (LPS) de membranas exteriores gramnegativas y eritrocitos de conejo, como también de muchos polisacáridos puros, eritrocitos de conejo, virus, bacterias, células tumorales animales, parásitos y células dañadas, y que tradicionalmente se ha creído que surge de la generación proteolítica espontánea de C3b del factor del complemento C3.

Tal como se emplea en la presente memoria, la expresión "vía de lectinas" se refiere a la activación del complemento que ocurre mediante la unión específica de proteínas de unión a los carbohidratos del suero y no del suero, incluidas lectina de unión a manano (MBL) y ficolinas.

Tal como se emplea en la presente memoria, la expresión "vía clásica" se refiere a la activación del complemento que es desencadenada por el anticuerpo unido a una partícula extraña y que requiere la unión de la molécula de reconocimiento C1q.

Tal como se emplea en la presente memoria, la expresión "agente inhibidor de MASP-2" se refiere a cualquier agente que inhibe o actúa con la MASP-2 e inhibe eficazmente la activación del complemento dependiente de MASP-2, incluidos los anticuerpos anti-MASP-2 y sus fragmentos de unión a MASP-2, péptidos naturales y sintéticos, moléculas pequeñas, receptores de MASP-2 solubles, inhibidores de expresión e inhibidores naturales aislados. Los agentes de inhibición de MASP-2 útiles en el método de la invención pueden reducir la activación del complemento dependiente de MASP-2 por más de 20%, tal como más de 50%, tal como más de 90%. En una realización, el agente inhibidor de MASP-2 reduce la activación del complemento dependiente de MASP-2 por más de 90% (es decir, resultando en la activación del complemento de MASP-2 de solamente 10% o menos).

Tal como se emplea en la presente memoria, el término "anticuerpo" abarca anticuerpos y sus fragmentos de anticuerpos, derivados de cualquier mamífero que produzca anticuerpos (p. ej., ratón, rata, conejo y primate, incluidos seres humanos), que se une específicamente a polipéptidos de MASP-2 o sus porciones. Los anticuerpos ilustrativos incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales y recombinantes; anticuerpos multiespecíficos (p. ej., anticuerpos biespecíficos); anticuerpos humanizados; anticuerpos murinos; anticuerpos quiméricos, anticuerpos monoclonales de ratón-humanos, de ratón-primate, de primate-humano; y anticuerpos anti-idiotipo, y pueden ser cualquier molécula intacta o sus fragmentos.

Tal como se emplea en la presente memoria, la expresión "fragmento de anticuerpo" se refiere a una porción derivada de o relacionada con un anticuerpo anti-MASP-2 de longitud total, que en general incluye la unión al antígeno o su región variable. Los ejemplos ilustrativos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2 y Fv, fragmentos scFv, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

Tal como se emplea en la presente memoria, un fragmento de anticuerpo "Fv" o "scFv monocatenario" comprende los dominios Vh y Vl de un anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena de polipéptidos sencilla. En general, el polipéptido Fv además comprende un enlazador de polipéptidos entre los dominios Vh y Vl, que permite que el scFv forme la estructura deseada para unión del antígeno.

Tal como se emplea en la presente memoria, un "anticuerpo quimérico" es una proteína recombinante que contiene los dominios variables y regiones determinantes de complementaridad derivadas de un anticuerpo de una especie no humana (p. ej., roedor), mientras el resto de la molécula de anticuerpos deriva de un anticuerpo humano.

Tal como se emplea en la presente memoria, un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo quimérico que comprende una secuencia mínima que conforma regiones determinantes de complementaridad específicas de inmunoglobulina humana que es trasplantada en un marco de anticuerpo humano. Los anticuerpos humanizados son proteínas típicamente recombinantes en las que solamente las regiones determinantes de complementaridad del anticuerpo son de origen no humano.

Tal como se emplea en la presente memoria, la expresión "lectina de unión a manano" ("MBL") es equivalente a proteína de unión a manano ("MBP").

Tal como se emplea en la presente memoria, el "complejo de ataque a la membrana" ("MAC") hace referencia a un complejo de los cinco componentes principales terminales del complemento (C5-C9) que se inserta y rompe las membranas. También se denomina C5b-9.

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Tal como se emplea en la presente memoria, "un sujeto" incluye a todos los mamíferos, incluidos sin limitación, seres humanos, primates no humanos, perros, gatos, ovejas, cabras, vacas, conejos, cerdos y roedores.

Tal como se emplean en la presente memoria, los residuos de aminoácidos se abrevian de la siguiente manera: alanina (Ala;A), asparagina (Asn;N), ácido aspártico (Asp;D), arginina (Arg;R), cisteína (Cys;C), ácido glutámico (Glu;E), glutamina (Gln;Q), glicina (Gly;G), histidina (His;H), isoleucina (Ile;I), leucina (Leu;L), lisina (Lys;K), metionina (Met;M), fenilalanina (Phe;F), prolina (Pro;P), serina (Ser;S), treonina (Thr;T), triptófano (Trp;W), tirosina (Tyr;Y) y valina (Val;V).

En el sentido más amplio, los aminoácidos naturales pueden dividirse en grupos en función de la característica química de la cadena lateral de los respectivos aminoácidos. Por aminoácido "hidrófobo" se entiende o bien lie, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val, Ala, Cys o Pro. Por aminoácido "hidrófilo" se entiende o bien Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg o His. Este agrupamiento de aminoácidos puede además dividirse en otra subclase de la siguiente manera. Por aminoácido "hidrófilo no cargado" se entiende o bien Ser, Thr, Asn o Gln. Por aminoácido "ácido" se entiende o bien Glu o Asp. Por aminoácido "básico" se entiende o bien Lys, Arg o His.

Tal como se emplea en la presente memoria, la expresión "sustitución de aminoácidos conservadores" se ilustra con una sustitución entre aminoácidos dentro de cada uno de los siguiente grupos: (1) glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina, (2) fenilalanina, tirosina y triptófano, (3) serina y treonina, (4) aspartato y glutamato, (5) glutamina y asparagina, y (6) lisina, arginina e histidina.

El término "oligonucleótido", tal como se emplea en la presente memoria, se refiere a un oligómero o polímero de ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN) o sus miméticos. Este término también abarca aquellas oligonucleobases compuestas por nucleótidos, azúcares y enlaces internucleosídicos covalentes (esqueleto) naturales, así como también oligonucleótidos que tienen modificaciones no naturales.

II. La vía alternativa, una nueva comprensión

La vía alternativa del complemento fue descrita por primera vez por Louis Pillemer y sus colegas a principios de los años cincuenta en base a estudios en los que se usó cimosano elaborado a partir de las paredes celulares de levadura para activar el complemento (Pillemer, L. et al., J. Exp. Med. 103:1-13, 1956; Lepow, I.H., J. Immunol. 125:471-478, 1980). Desde entonces, el cimosano es considerado el ejemplo canónico de un activador específico de la vía alternativa en suero de seres humanos y de roedores (Lachmann, P.J., et al., Springer Semin. Immunopathol. 7:143-162, 1984; Van Dijk, H., et al., J. Immunol. Methods 85:233-243, 1985; Pangbum, M.K., Methods in Enzymol. 162:639-653, 1988). Un ensayo práctico y muy utilizado para la activación de la vía alternativa consiste en incubar suero en pocillos plásticos recubiertos con cimosano y determinar la cantidad de deposición de C3b en la fase sólida después de la incubación. Como se espera, hay una deposición sustancial de C3b en los pocillos recubiertos con cimosano después de la incubación con suero de ratón normal (Figura 7B). Sin embargo, la incubación de suero de ratones deficientes de MASP-2 homocigotos en pocillos recubiertos con cimosano produce una reducción sustancial en la deposición de C3b en comparación con aquella del suero normal. Asimismo, el uso del suero de ratones heterocigotos para deficiencia del gen MASP 2 en este ensayo produce niveles de deposición de C3b que son intermedios entre aquellos obtenidos con suero de ratones deficientes de MASP-2 homocigotos y suero de ratones normales. Los resultados paralelos también se obtienen usando pocillos recubiertos con manano, otro tipo de polisacárido conocido por activar la vía alternativa (Figura 7A). Dado que los ratones normales y los deficientes de MASP-2 comparten la misma información genética, excepto por el gen MASP 2, estos resultados inesperados demuestran que la MASP-2 cumple una función esencial en la activación de la vía alternativa.

Estos resultados ofrecen una fuerte evidencia de que la vía alternativa no es una vía independiente, autónoma de la activación del complemento como se describe esencialmente en todos los libros de texto médicos y en los artículos de revisión recientes sobre el complemento. La visión actual y ampliamente sostenida es que la vía alternativa se activa en la superficie de ciertas dianas particuladas (microbios, cimosano, eritrocitos de conejo) a través de la ampliación de la activación de C3 espontánea "poco avanzada". Sin embargo, la ausencia de activación importante de la vía alternativa en el suero de ratones con genes inactivados de MASP-2 por dos "activadores" conocidos de la vía alternativa hace que sea improbable que la "teoría poco avanzada" describa un mecanismo fisiológico importante de activación del complemento.

Ya que se sabe que la proteasa MASP-2 tiene una función específica y bien definida como enzima responsable del inicio de la cascada del complemento de lectina, estos resultados implican la activación de la vía de lectinas por cimosano y manano como un primer paso crítico para la activación subsiguiente de la vía alternativa. C4b es un producto de activación generado por la vía de lectinas, pero no por la vía alternativa. De conformidad con este concepto, la incubación de suero de ratón normal con pocillos recubiertos con cimosano o manano produce la deposición de C4b en los pocillos y esta deposición de C4b se reduce sustancialmente cuando los pocillos recubiertos se incuban con suero de ratones deficientes de MASP-2 (Figuras 6A, 6B y 6C).

La ruta alternativa, además de su función ampliamente aceptada como una vía independiente para la activación del complemento, puede también proporcionar un bucle de ampliación para la activación del complemento inicialmente desencadenada por las vías clásica y de lectinas (Liszewski, M.K. y J.P. Atkinson, 1993, en Fundamental

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Immunology, Tercera Edición, editado por W.E. Paul, Raven Press, Ltd., Nueva York; Schweinie, J.E., et al., J. Clin. Invest. 84:1821-1829, 1989). En este mecanismo de ampliación mediado por la vía alternativa, la convertasa C3 (C4b2b) generada por activación o bien de las cascadas del complemento clásica o de lectinas escinde C3 en C3a y C3b, y proporciona así C3b que puede participar en la formación de C3bBb, la convertasa C3 de la vía alternativa. La explicación probable de la ausencia de activación de la vía alternativa en suero de genes inactivados de MASP-2 es que se requiere la vía de lectinas para la activación del complemento inicial por cimosano, manano y otros "activadores" putativos de la vía alternativa, mientras que la vía alternativa cumple una función crucial en la ampliación de la activación del complemento. En otros términos, la vía alternativa es un bucle de ampliación de proacción dependiente de las vías del complemento de lectinas y clásica para la activación, en lugar de una cascada lineal independiente.

En lugar de que la cascada del complemento se active a través de tres vías distintas (vías clásica, alternativa y de lectinas) como se contempló anteriormente, nuestros resultados indican que es más preciso visualizar el complemento como compuesto por dos sistemas principales, que corresponden, en una primera aproximación, a las ramas innata (lectina) y adquirida (clásica) del sistema de defensas inmunológico del complemento. Las lectinas (MBP, M-ficolina, H-ficolina y L-ficolina) son las moléculas de reconocimiento específicas que desencadenan el sistema del complemento innato, y el sistema incluye el bucle de ampliación de la vía de lectinas y la vía alternativa asociada. C1q es la molécula de reconocimiento específica que desencadena el sistema de complemento adquirido y el sistema incluye el bucle de ampliación de la vía clásica y de la vía alternativa asociada. Hacemos referencia a estos dos sistemas de activación principales del complemento como el sistema del complemento dependiente de lectinas y el sistema del complemento dependiente de C1q, respectivamente.

Además de su función esencial en la defensa inmune, el sistema del complemento contribuye al daño del tejido en muchas afecciones clínicas. Por lo tanto, existe una necesidad imperativa de desarrollar inhibidores del complemento terapéuticamente eficaces para prevenir estos efectos adversos. Al reconocer que el complemento está compuesto por dos sistemas principales de activación del complemento, se llega a la conclusión de que sería muy conveniente inhibir específicamente solamente el sistema de activación del complemento que causa una patología particular sin desactivar por completo las capacidades de defensa inmunes del complemento. Por ejemplo, en los estados de enfermedad en los que la activación del complemento es mediada predominantemente por el sistema del complemento dependiente de lectinas, sería ventajoso inhibir específicamente solamente este sistema. Esto dejaría intacto el sistema de activación del complemento dependiente de C1q para manejar el procesamiento del complejo inmunológico y ayudar en la defensa del hospedante contra las infecciones.

El componente de proteína preferido para dirigir en el desarrollo de agentes terapéuticos a fin de inhibir específicamente el sistema del complemento dependiente de lectinas es MASP-2. De todos los componentes de proteínas del sistema del complemento dependiente de lectinas (MBL, H-ficolina, M-ficolina, L-ficolina, MASP-2, C2- C9, Factor B, Factor D y properdina), solamente la MASP-2 es única para el sistema del complemento dependiente de lectinas y requerida para que el sistema funcione. Las lectinas (MBL, H-ficolina, M-ficolina y L-ficolina) son también componentes únicos en el sistema del complemento dependiente de lectinas. No obstante, la pérdida de uno cualquiera de los componentes de lectina no necesariamente inhibiría la activación del sistema debido a la redundancia de lectinas. Sería necesario inhibir las cuatro lectinas con el fin de garantizar la inhibición del sistema de activación del complemento dependiente de lectinas. Asimismo, ya que también se sabe que la MBL y las ficolinas tienen actividad opsónica independiente del complemento, la inhibición de la función de las lectinas resultaría en la pérdida de este mecanismo beneficioso de defensa del hospedante contra las infecciones. En cambio, esta actividad opsónica de las lectinas independiente del complemento permanecería intacta si la MASP-2 fuese la diana inhibidora. Un beneficio agregado de la MASP-2 como diana terapéutica para inhibir el sistema de activación del complemento dependiente de lectinas es que la concentración en el plasma de MASP-2 está entre las más bajas de cualquier proteína del complemento (~ 500 ng/ml); por lo tanto, correspondientemente a las bajas concentraciones de inhibidores de MASP-2 de gran afinidad, se puede requerir la obtención de una inhibición total (Moller-Kristensen, M., et al., J. Immunol Methods 282:159-167, 2003).

III. Función de la MASP-2 en diversas enfermedades y afecciones y métodos terapéuticos que usan MASP-2 como agentes inhibidores

Ciertas enfermedades y afecciones vasculares

El endotelio está muy expuesto al sistema inmunológico y es particularmente vulnerable a las proteínas del complemento presentes en el plasma. Se ha demostrado que la lesión vascular mediada por el complemento contribuye a la patofisiología de varias enfermedades del sistema cardiovascular, incluida la aterosclerosis (Seifert, P.S., et al., Atherosclerosis 73:91-104, 1988), lesión de isquemia y reperfusión (Weisman, H.F., Science 249:146-51, 1990) e infarto de miocardio (Tada, T., et al., Virchows Arch 430:327-332, 1997). Los datos indican que la activación del complemento puede extenderse a otras afecciones vasculares.

Por ejemplo, hay datos de que la activación del complemento contribuye a la patogénesis de muchas formas de vasculitis, incluyendo: nefritis por púrpura de Henoch-Schonlein, vasculitis asociada a lupus eritematoso sistémico, vasculitis asociada a artritis reumatoidea (también llamada artritis reumatoidea maligna), vasculitis del complejo inmune y enfermedad de Takayasu. La nefritis por púrpura de Henoch-Schonlein es una forma de vasculitis

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sistémica de los vasos pequeños con patogénesis inmune, en donde la activación del complemento a través de la vía de lectinas que produce daño endotelial inducido por C5b-9 es reconocida como un mecanismo importante (Kawana, S., et al., Arch. Dermatol. Res. 282:183-7, 1990; Endo, M., et al., Am J. Kidney Dis. 35:401-7, 2000). El lupus eritematoso sistémico (SLE) es un ejemplo de enfermedades autoinmunes que afecta múltiples órganos, incluida la piel, los riñones, articulaciones, superficies serosas y el sistema nervioso central, y frecuentemente se asocia con vasculitis severa. Los anticuerpos anti-endoteliales IgG y los complejos de IgG capaces de unirse a las células endoteliales están presentes en los sueros de pacientes con SLE activo, y los depósitos de complejos inmunes de IgG y complemento se hallan en las paredes de los vasos sanguíneos de pacientes con vasculitis por SLE (Cines, D.B., et al., J. Clin. Invest. 73:611-25, 1984). La artritis reumatoidea asociada con vasculitis, también llamada artritis reumatoidea maligna (Tomooka, K., Fukuoka Igaku Zasshi 80:456-66, 1989), vasculitis del complejo inmune, vasculitis asociada con hepatitis A, vasculitis leucocitoclástica y la artritis conocida como enfermedad de Takayasu, forman otro grupo pleomórfico de enfermedades humanas en las que la citotoxicidad dependiente del complemento contra células endoteliales y de otros tipos cumple una función documentada (Tripathy, N.K., et al., J. Rheumatol. 28:805-8, 2001).

Las pruebas también indican que la activación del complemento cumple una función en la cardiomiopatía dilatada. La cardiomiopatía dilatada es un síndrome caracterizado por agrandamiento cardiaco y función sistólica deteriorada del corazón. Datos recientes indican que la inflamación constante del miocardio puede contribuir al desarrollo de la enfermedad. Se sabe que C5b-9, el complejo de ataque a la membrana terminal del complemento, se correlaciona en gran medida con la deposición de inmunoglobulina y la expresión de TNF-alfa en el miocardio. En biopsias de miocardio de 28 pacientes con cardiomiopatía dilatada, se demostró la acumulación de C5b-9 en el miocardio, indicando que la activación crónica del complemento mediada por inmunoglobulina en el miocardio puede contribuir, en parte, a la progresión de la cardiomiopatía dilatada (Zwaka, T.P., et al., Am. J. Pathol. 161(2):449-57, 2002).

En esta memoria se describe el tratamiento de una afección vascular, incluidas afecciones cardiovasculares, afecciones cerebrovasculares, afecciones vasculares periféricas (p. ej., musculoesquelética), afecciones renovasculares y afecciones vasculares mesentéricas/entéricas, administrando una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de MASP-2 en un vehículo farmacéutico. Dichas afecciones para las cuales se cree que el tratamiento es adecuado incluyen, aunque sin limitarse a ello: vasculitis, incluida nefritis por púrpura de Henoch-Schonlein, vasculitis asociada a lupus eritematoso sistémico, vasculitis asociada a artritis reumatoidea (también llamada artritis reumatoidea maligna), vasculitis del complejo inmune y enfermedad de Takayasu; cardiomiopatía dilatada, angiopatía diabética; enfermedad de Kawasaki (arteritis); y embolia gaseosa venosa (VGE). Además, dado que la activación del complemento ocurre como consecuencia de traumatismo luminal y de respuesta inflamatoria a cuerpo extraño asociada con procedimientos de intervención cardiovascular, se cree que las composiciones inhibidoras de MASP-2 de la presente invención pueden también utilizarse en la inhibición de restenosis que le sigue a la colocación de un stent, aterectomía rotacional y/o angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA), o bien solas o combinadas con otros agentes inhibidores de restenosis tales como aquellos descritos en la patente de EE. UU. núm. 6.492.332 para Demopulos.

El agente inhibidor de MASP-2 se puede administrar al sujeto por administración intra-arterial, intravenosa, intramuscular, intratecal, intracraneal, subcutánea u otra administración, potencialmente por vía oral para inhibidores no peptidérgicos. La administración se puede repetir periódicamente según lo determinado por el médico para un efecto terapéutico óptimo. Para la inhibición de restenosis, la composición inhibidora de MASP-2 se puede administrar antes y/o durante y/o después de la colocación de un o del procedimiento de aterectomía o angioplastia. Alternativamente, la composición inhibidora de MASP-2 puede revestirse o incorporarse al stent.

IV. Agentes inhibidores de MASP-2

Se han descrito métodos para inhibir los efectos de la activación del complemento dependiente de MASP-2. Los agentes inhibidores de MASP-2 se administran en una cantidad eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto vivo. Los agentes inhibidores de MASP-2 descritos incluyen moléculas que inhiben la actividad biológica de MASP-2 (tal como los inhibidores de moléculas pequeñas, anticuerpos anti-MASP-2 o péptidos bloqueantes que interactúan con MASP-2 o interfieren con una interacción proteína-proteína) y moléculas que reducen la expresión de MASP-2 (tales como las moléculas de ácido nucleico antisentido de MASP-2, moléculas de ARNi específicas de MASP-2 y ribozimas de MASP-2), previniendo así que la MASP-2 active las vías del complemento alternativas. Los agentes inhibidores de MASP-2 se pueden usar solos como terapia primaria o combinados con otros agentes terapéuticos como terapia adyuvante para potenciar los beneficios terapéuticos de otros tratamientos médicos.

La inhibición de la activación del complemento dependiente de MASP-2 se caracteriza por al menos uno de los siguientes cambios en un complemento del sistema del complemento que ocurre como resultado de la administración de un agente inhibidor de MASP-2 de acuerdo con los métodos de la invención: la inhibición de la generación o producción de productos del sistema de activación del complemento dependientes de MASP-2 C4b, C3a, C5a y/o C5b-9 (MAC) (medida, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 2), la reducción de la activación del complemento alternativa evaluada en un ensayo hemolítico que emplea glóbulos rojos de conejo o cobaya insensibilizados, la reducción de escisión de C4 y deposición de C4b (medida, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 2) o la reducción de la escisión de C3 y la deposición de C3b (medida, por ejemplo, como se describe en el

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Ejemplo 2).

Se pueden utilizar agentes inhibidores de MASP-2 que son eficaces para inhibir el sistema de activación del complemento dependiente de MASP-2. Los agentes inhibidores de MASP-2 útiles en la práctica de este aspecto de la presente invención incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-MASP-2 y sus fragmentos. También se describen péptidos inhibidores de MASP-2, moléculas pequeñas, receptores solubles de MASP-2 e inhibidores de expresión. Los agentes inhibidores de MASP-2 pueden inhibir el sistema de activación del complemento dependiente de MASP- 2 bloqueando la función biológica de la MASP-2. Por ejemplo, un agente inhibidor puede bloquear eficazmente las interacciones de una proteína MASP-2 a otra, interferir con la dimerización o el ensamblaje de MASP-2, bloquear la unión a Ca2+, interferir con el sitio activo de serina proteasa MASP-2, o pueden reducir la expresión de la proteína MASP-2.

Los agentes inhibidores de MASP-2 pueden inhibir selectivamente la activación del complemento de MASP-2, dejando funcionalmente intacto el sistema de activación del complemento dependiente de C1q.

El agente inhibidor de MASP-2 útil en los métodos de la invención puede ser un agente inhibidor de MASP-2 específico que se une específicamente a un polipéptido que comprende la SEC ID NO: 6 con una afinidad de por lo menos 10 veces más que otros antígenos del sistema del complemento, por ejemplo, de unión de por lo menos 100 veces más que otros antígenos en el sistema del complemento. La afinidad de unión del agente inhibidor de MASP-2 se puede determinar usando un ensayo de unión adecuado.

El polipéptido de MASP-2 exhibe una estructura molecular similar a MASP-1, MASP-3, y C1r y C1s, las proteasas del sistema del complemento C1. La molécula de ADNc expuesta en la SEC ID NO: 4 codifica un ejemplo representativo de MASP-2 (que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 5) y proporciona el polipéptido de MASP-2 humano con una secuencia líder (aa 1-15) que se escinde después de la segregación, resultando en la forma madura de MASP-2 humana (SEC ID NO: 6). Como se muestra en la FIGURA 2, el gen MASP 2 humano abarca doce exones. El ADNc de MASP-2 humano es codificado por los exones B, C, D, F, G, H, I, J, K y L. Un empalme alternativo produce la proteína de 20 kDa denominada proteína asociada a MBL 19 ("MAp19") (SeC ID NO: 2), codificada por (SEC ID NO: 1) que surge de los exones B, C, D y E, como se muestra en la FIGURA 2. La molécula de ADNc expuesta en la SEC ID NO: 50 codifica la MASP-2 de murino (que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 51) y proporciona el polipéptido de MASP-2 murino con una secuencia líder que se escinde después de la segregación, resultando en la forma madura de MASP-2 murina (SEC ID NO: 52). La molécula de ADNc expuesta en la SEC ID NO: 53 codifica la MASP-2 de rata (que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 54) y proporciona el polipéptido MASP-2 de rata con una secuencia líder que se escinde después de la segregación, resultando en la forma madura de MASP-2 de rata (SEC ID NO: 55).

Los expertos en la técnica reconocerán que las secuencias descrita en las SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 50 y SEC ID NO: 53 representan alelos sencillos de MASP-2 humana, murina y de rata, respectivamente, y que se espera que ocurran la variación alélica y el empalme alternativo. Las variantes alélica de las secuencias de nucleótidos que se muestran en las SEC ID NO: 4, SEC ID N0: 50 y SEC ID NO: 53, incluidas aquellas que contienen mutaciones silenciosas y en las que las mutaciones producen cambios en las secuencias de aminoácidos, se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Las variantes alélicas de la secuencia de MASP-2 se pueden clonar por sonda de ADNc o bibliotecas genómicas de distintos individuos de acuerdo con procedimientos estándar.

Los dominios de la proteína MASP-2 humana (SEC ID NO: 6) se muestran en la FIGURA 3A e incluyen un dominio de la proteína morfogénica C1r/C1s/de erizo de mar Vegf/ósea N-terminal (CUBI) (aa 1-121 de SEC ID NO: 6), un dominio de tipo factor de crecimiento epidérmico (aa 122-166), un segundo dominio CUBI (aa 167-293), además de un tándem de dominios de proteínas de control del complemento y un dominio de serina proteasa. El empalme alternativo del gen MASP 2 resultante en MAp19 que se muestra en la FIGURA 3B. MAp19 es una proteína no enzimática que contiene la región CUBI-EGF N-terminal de MASP-2 con cuatro residuos adicionales (EQSL) derivados del exón E, como se muestra en la FIGURA 2.

Se ha demostrado que varias proteínas se unen a, o interactúan con MASP-2 a través de interacciones de proteína a proteína. Por ejemplo, se sabe que MASP-2 se une y forma complejos dependientes del Ca2+ con proteínas lectina MBL, H-ficolina y L-ficolina. Se ha demostrado que cada complejo MASP-2/lectina activa el complemento a través de la escisión dependiente de MASP-2 de las proteínas C4 y c2 (Ikeda, K., et al., J. Biol. Chem. 262:7451-7454, 1987; Matsushita, M. et al., J. Exp. Med. 176:1497-2284, 2000; Matsushita, M., et al., J. Immunol. 168:3502-3506, 2002). Los estudios han demostrado que los dominios CUBI-EGF de MASP-2 son esenciales para la asociación de MASP-2 con MBL (Thielens, N.M., et al., J. Immunol. 166:5068, 2001). Se ha demostrado también que los dominios CUBIEGFCUBII median la dimerización de MASP-2, que se requiere para la formación de un complejo activo de MBL (Wallis, R., et al., J. Biol. Chem. 275/30962-30969, 2000). En consecuencia, se pueden identificar agentes inhibidores de MASP-2 que se unen a o interfieren con la regiones diana de MASP-2 conocidas por ser importantes para la activación del complemento dependiente de MASP-2.

Anticuerpos anti-MASP-2

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En esta invención, el agente inhibidor de MASP-2 comprende un anticuerpo anti-MASP-2 que inhibe el sistema de activación del complemento dependiente de MASP-2. Los anticuerpos anti-MASP-2 útiles en este aspecto de la invención incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales o recombinantes derivados de cualquier mamífero que produzca anticuerpos y pueden ser fragmentos multiespecíficos, quiméricos, humanizados, anti-idiotipo y de anticuerpos. Los fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, fragmentos de Fv, fragmentos de scFv y anticuerpos monocatenarios como se describe en este documento.

Se han descrito varios anticuerpos anti-MASP-2 en la bibliografía, algunos de los cuales se mencionan a continuación en la TABLA 1. Estos anticuerpos anti-MASP-2 previamente descritos se pueden ensayar por su capacidad de inhibir el sistema de activación del complemento dependiente de MASP-2 usando los ensayos aquí descritos. Una vez que se identifica un anticuerpo anti-MASP-2 que funciona como un agente inhibidor de MASP-2, se puede usar para producir anticuerpos anti-idiotipo y usarse para identificar otras moléculas de unión a MASP-2, como se describirá en más detalladamente a continuación.

Tabla 1: Anticuerpos específicos de MASP-2 de la bibliografía

ANTÍGENO

TIPO DE ANTICUERPO REFERENCIA

MASP-2

Policlonal de rata Peterson, S.V., et al.,

recombinante

Mol. Immunol. 37:803-811,2000

Fragmento CCP1/2-SP (MoAb 8B5) recombinante humano

MoAb de rata (subclase IgG1) Moller-Kristensen, M., et al.,

J. of Immunol. Methods 282:159-167, 2003

MAp19 (MoAb 6G12) recombinante humano (reacción cruzada con MASP-2)

MoAb de rata (subclase IgG1) Moller-Kristensen, M., et al., J. of Immunol. Methods 282:159-167, 2003

MASP-2

MoAb de ratón Peterson, S.V., et al.,

Mol. Immunol. 35:409

Anticuerpos anti-MASP-2 con función efectora reducida

Los anticuerpos anti-MASP-2 para uso pueden tener función efectora reducida para reducir la inflamación que puede surgir de la activación de la vía del complemento clásica. Se ha demostrado que la capacidad de las moléculas de IgG de desencadenar la vía del complemento clásica reside dentro de la porción Fc de la molécula (Duncan, A.R., et al., Nature 332:738-740 1988). Las moléculas IgG en las que la porción Fc de la molécula ha sido extraída por escisión enzimática están desprovistas de esta función efectora (véase Harlow, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1988). Por consiguiente, los anticuerpos con función efectora reducida pueden generarse como consecuencia de la ausencia de la porción Fc de la molécula, teniendo una secuencia Fc genéticamente modificada que minimiza la función efectora, o siendo o bien el isotipo IgG2 o IgG4 humano.

Los anticuerpos con función efectora reducida pueden producirse por manipulación biológica molecular estándar de la porción Fc de las cadenas pesadas de IgG, como se describe en el Ejemplo 9 del presente documento y también en Jolliffe, et al., hit'I Rev. Immunol. 10:241-250, 11993, y en Rodrigues, et al., J. Immunol. 151:6954-6961, 1998. Los anticuerpos con función efectora reducida también incluyen los isotipos IgG2 e IgG4 humanos que tienen la capacidad reducida de activar el complemento y/o interactuar con los receptores de Fc (Ravetch, J.V., et al., Annu. Rev. Immunol. 9:457-492, 1991; Isaacs, J.D., et al., J. Immunol. 148:3062-3071, 1992; van de Winkel, J.G., et al., Immunol. Today 14:215-221, 1993). Los anticuerpos humanizados o completamente humanos específicos de MASP- 2 humana comprendidos por los isotipos IgG2 o IgG4 se pueden producir mediante uno de los diversos métodos conocidos por el experto en la técnica, como se describe en Vaughan, T.J., et al., Nature Biotechnical 16:535-539, 1998.

Producción de anticuerpos anti-MASP-2

Los anticuerpos anti-MASP-2 se pueden producir usando polipéptidos MASP-2 (p. je., MASP-2 de longitud total) o usando péptidos que portan el epítopo de MASP-2 antigénico (p. ej., una porción del polipéptido MASP-2). Los péptidos inmunogénicos pueden ser tan pequeños como de tan solo cinco residuos de aminoácidos. Por ejemplo, el polipéptido MASP-2, incluida la secuencia de aminoácidos completa de SEC ID NO: 6, se pueden usar para inducir anticuerpos anti-MASP-2 útiles en el método de la invención. Dominios de MASP-2 particulares conocidos por estar implicados en las interacciones proteína-proteína, tal como los dominios CUBI y CUBIEGF, así como también la

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región que abarca el sitio activo de serina proteasa, se pueden expresar como polipéptidos recombinantes, como se describe en el Ejemplo 5, y usarse como antígenos. A su vez, los péptidos que comprenden una porción de por lo menos 6 aminoácidos del polipéptido MASP-2 (SEC ID NO: 6) son también útiles para inducir anticuerpos MASP-2. Ejemplos adicionales de antígenos derivados de MASP-2 útiles para inducir los anticuerpos de MASP-2 se dan a conocer en la TABLA 2 a continuación. Los péptidos y polipéptidos MASP-2 utilizados para crear anticuerpos se pueden aislar como polipéptidos naturales o como péptidos recombinantes o sintéticos y como polipéptidos recombinantes catalíticamente inactivos, tal como MASP-2A, como se describe en más detalle en los Ejemplos 5-7. En algunas realizaciones de este aspecto de la invención, los anticuerpos anti-MASP-2 se obtienen usando una cepa de ratón transgénico, como se describe en los Ejemplos 8 y 9 como se describirá en detalle a continuación.

Los antígenos útiles para producir anticuerpos anti-MASP-2 también incluyen polipéptidos de fusión, tales como fusiones de MASP-2 o su porción con un polipéptido de inmunoglobulina o con proteína unida a maltosa. El inmunógeno del polipéptido puede ser una molécula de longitud total o su porción. Si la porción del polipéptido es de tipo hapteno, dicha porción puede unirse o enlazarse ventajosamente a un vehículo macromolecular (como una hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina de suero bovino (BSA) o toxoide de tétano) para inmunización.

Tabla 2: Antígenos derivados de MASP-2

SEC ID NO:

Secuencia de aminoácidos

SEC ID NO: 6

Proteína MASP-2 humana

SEC ID NO: 51

Proteína MASP-2 murina

SEC ID NO: 8

Dominio CUBI de MASP-2 humana (aa 1-121 de SEC ID NO: 6)

SEC ID NO: 9

Dominios CUBIEGF de MASP-2 humana (aa 1-166 de SEC ID NO: 6)

SEC ID NO: 10

Dominios CUBIEGFCUBII de MASP-2 humana (aa 1-293 de SEC IDNO: 6)

SEC ID NO: 11

Dominio EGF de MASP-2 humana (aa 122-166 de SEC ID NO: 6)

SEC ID NO: 12

Dominio serina proteasa de MASP-2 humana (aa 429-671 de SEC ID NO: 6)

SEC ID NO: 13 GKDSCRGDAGGALVFL

Forma mutante inactivada de serina-proteasa (aa 610-625 de SEC ID NO: 6 con Ser 618 mutado)

SEC ID NO: 14 TPLGPKWPEPVFGRL

Péptido CUBI humano

SEC ID NO: 15: TAPPGYRLRLYFTHFDLEL SHLCEYDFVKLSSGAKVL ATLCGQ

Péptido CUBI humano

SEC ID NO: 16: TFRSDYSN

Región de unión a MBL en el dominio CUBI humano

SEC ID NO: 17: FYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGF

Región de unión a MBL en el dominio CUBI humano

SEC ID NO: 18 IDECQVAPG

Péptido EGF

SEC ID NO: 19 ANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALY

Péptido del sitio activo serina-proteasa

Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos policlonales contra MASP-2 se pueden preparar inmunizando a un animal con el polipéptido MASP- 2 o con su porción inmunogénica, usando métodos conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. Véase, por ejemplo, Green, et al., "Production of Polyclonal Antisera", en Immunochemical Protocols (Manson, ed.), página 105, y como se describe en el Ejemplo 6. La inmunogenicidad de un polipéptido MASP-2 se puede incrementar a través del uso de un adyuvante, incluidos geles minerales, tales como hidróxido de aluminio o adyuvante de Freund (completo o incompleto), sustancias activas superficiales tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, emulsiones oleosas, hemocianina de lapa californiana y dinitrofenol. Los anticuerpos policlonales típicamente se generan en animales tales como caballos, vacas, perros, pollos, ratas, ratones, conejos, cobayas, cabras u ovejas. Alternativamente, un anticuerpo anti-MASP-2 útil en la presente invención puede también derivar de un primate subhumano. Las técnicas generales para generar diagnóstica y terapéuticamente anticuerpos útiles en babuinos se pueden encontrar, por ejemplo, en Goldenberg et al., publicación de patente internacional núm. WO 91/11465, y en Losman, M.J., et al., Int. J. Cáncer 46:310, 1990. Los sueros que contienen anticuerpos inmunológicamente activos

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se producen luego de la sangre de dichos animales inmunizados, usando procedimientos convencionales conocidos en la técnica.

Anticuerpos monoclonales

En algunas realizaciones, el agente inhibidor de MASP-2 es un anticuerpo monoclonal anti-MASP-2. Los anticuerpos monoclonales anti-MASP-2 son altamente específicos, dirigiéndose contra un solo epítopo de MASP-2. Tal como se emplea en la presente invención, el modificador "monoclonal" indica que el carácter del anticuerpo se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se interpretará que requiere la producción del anticuerpo por ningún método particular. Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener usando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpos por líneas celulares continuas en cultivo, tal como el método del hibridoma descrito por Kohler, G., et al., Nature 256:495, 1975, o se pueden elaborar por métodos de ADN recombinante (véase, p. ej., la patente de EE. UU. núm. 4.816.567 para Cabilly). Los anticuerpos monoclonales pueden también aislarse de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las técnicas descritas en Clackson, T., et al., Nature 352:624-628, 1991, y Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991. Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina, incluidas IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquiera de sus subclases.

Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden obtener inyectando a un mamífero adecuado (p. ej., un ratón BALB/c) una composición que comprende un polipéptido de MASP-2 o su porción Después de un periodo de tiempo predeterminado, los esplenocitos se extraen del ratón y se suspenden en un medio de cultivo celular. Los esplenocitos luego se condensan con una línea celular inmortal para formar un hibridoma. Los hibridomas formados se desarrollan en cultivo celular y se estudian por su capacidad de producir anticuerpo monoclonal contra MASP-2. Un ejemplo que describe mejor la producción de anticuerpos monoclonales anti-MASP-2 se provee en el Ejemplo 7. (Véase también Current Protocols in Immunology, Vol. 1., John Wiley & Sons, páginas 2.5.1-2.6.7, 1991).

Los anticuerpos monoclonales humanos se pueden obtener mediante el uso de ratones transgénicos que han sido modificados para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta a una exposición antigénica. En esta técnica, los elementos de locus de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana se introducen en cepas de ratones de líneas de células madre derivadas de embriones que contienen rupturas dirigidas de los locus de cadena pesada y de cadena ligera de la inmunoglobulina endógena. Los ratones transgénicos pueden sintetizar anticuerpos humanos específicos para antígenos humanos, tales como los antígenos de MASP-2 descritos en este documento, y los ratones se pueden usar para producir hibridomas que segregan el anticuerpo de MASP-2 humano, condensando células B de dichos animales a líneas celulares adecuadas de mieloma usando tecnología de Kohler-Milstein convencional, como se describe en el Ejemplo 7. Los ratones transgénicos con un genoma de inmunoglobulina humana se comercializan (p. ej., de Abgenix, Inc., Fremont, CA y Medarex, Inc., Annandale, N.J.). Los métodos para obtener anticuerpos humanos de ratones transgénicos se describen, por ejemplo, en Green, L.L., et al., Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg, N., et al., Nature 368:856, 1994; yTaylor, L.D., etal., Int. Immun. 6:579, 1994.

Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar y purificar de cultivos de hibridoma mediante una diversidad de técnicas bien consolidadas. Dichas técnicas de aislamiento incluyen cromatografía de afinidad con Proteína A Sepharose, cromatografía de exclusión de tamaño y cromatografía de intercambio iónico (véase, por ejemplo, Coligan en las páginas 2.7.1-2.7.12 y en las páginas 2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)", en Methods in Molecular Biology, The Humana Press, Inc., Vol. 10, páginas 79-104, 1992).

Una vez producidos, los anticuerpos policlonales, monoclonales o derivados de fagos se ensayan primero por su unión a MASP-2 específica. Se puede utilizar una diversidad de ensayos conocidos por los expertos en la técnica para detectar anticuerpos que se unen específicamente a MASP-2. Los ensayos ilustrativos incluyen inmunotransferencia Western o análisis de inmunoprecipitación por métodos convencionales (p. ej., como se describe en Ausubel et al.), inmunoelectroforesis, ensayos inmunosorbentes unidos a enzimas, membrana de transferencia puntual, ensayos de inhibición o competición y ensayos sándwich (como se describe en Harlow y Land, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Una vez que se identifican los anticuerpos que se unen específicamente a MASP-2, los anticuerpos anti-MASP-2 se ensayan por su capacidad de funcionar como agentes inhibidores de MASP-2 en uno de varios ensayos tales como, por ejemplo, un ensayo de escisión de C4 específica de lectinas (descrito en el Ejemplo 2), un ensayo de deposición de C3b (descrito en el Ejemplo 2) o un ensayo de deposición de C4b (descrito en el Ejemplo 2).

El experto en la técnica puede determinar fácilmente la afinidad de los anticuerpos monoclonales anti-MASP-2 (véase, p. ej., Scatchard, A., NY Acad. Sci. 51:660-672, 1949). En una realización, los anticuerpos monoclonales anti-MASP-2 útiles para los métodos de la invención se unen a MASP-2 con una afinidad de unión de <100 nM, preferiblemente <10 nM y lo más preferiblemente <2 nM.

Anticuerpos quiméricos/humanizados

Los anticuerpos monoclonales útiles en el método de la invención incluyen anticuerpos quiméricos en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o perteneciente a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la cadena(s) es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de

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otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, así como también fragmentos de dichos anticuerpos (patente estadounidense núm. 4.816.567 para Cabilly, y Morrison, S.L., et al., Proc. Nat'l Acacl. Sci. EE, UU. 81:6851-6855, 1984).

Una forma de anticuerpo quimérico útil en la invención es un anticuerpo anti-MASP-2 monoclonal humanizado. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (p. ej., murinos) son anticuerpos quiméricos, que contienen la secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos monoclonales humanizados se producen transfiriendo las regiones determinantes de complementaridad (CDR) no humanas (p. ej. de ratón), de cadenas variables pesadas y ligeras de la inmunoglobulina del ratón a un dominio variable humano. Típicamente, los residuos de anticuerpos humanos se sustituyen luego en las regiones marco de las contrapartes no humanas. Asimismo, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo del receptor o en el anticuerpo del donante. Estas modificaciones se realizan para refinar más el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá prácticamente todo de por lo menos uno, y habitualmente dos dominios variables, en donde todos o prácticamente todos los bucles corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o prácticamente todas las regiones marco Fv son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente comprenderá también por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente aquella de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véanse Jones, P.T., et al., Nature 321:522-525, 1986; Reichmann, L., et al., Nature 332:323-329, 1988; y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992.

Los anticuerpos humanizados útiles en la invención incluyen anticuerpos monoclonales humanos que incluyen por lo menos una región CDR3 de unión a MASP-2. Además, las porciones de Fc se pueden reemplazar como para producir IgA o IgM, además de anticuerpos de IgG humanos. Dichos anticuerpos humanizados tendrán utilidad clínica particular porque reconocerán específicamente MASP-2 humana, pero no evocarán una respuesta inmune en seres humanos contra el anticuerpo propiamente dicho. En consecuencia, son más adecuados para administraciones in vivo en seres humanos, especialmente cuando es necesaria la administración repetida o a largo plazo.

Un ejemplo de la generación de un anticuerpo anti-MASP-2 humanizado de un anticuerpo monoclonal anti-MASP-2 murino se provee en el Ejemplo 10. Las técnicas para producir anticuerpos monoclonales también se describen, por ejemplo, en Jones, P.T., et al., Nature 321:522, 1986; Carter, P., et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. EE. UU. 89:4285, 1992; Sandhu, J.S., Crit. Rev. Biotech. 12:437, 1992; Singer, I.I., et al., J. Immun. 150:2844, 1993; Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Inc., 1995; Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies," en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), John Wiley & Sons, Inc., páginas 399-434, 1996; y en la patente estadounidense núm. 5.693.762 para Queen, 1997. Además, existen entidades comerciales que sintetizan anticuerpos humanizados de regiones específicas de anticuerpos murinos, como Protein Design Labs (Mountain View, CA).

Anticuerpos recombinantes

Los anticuerpos anti-MASP-2 también se pueden preparar usando métodos recombinantes. Por ejemplo, los anticuerpos humanos se pueden preparar usando bibliotecas de expresión de inmunoglobulina humana (disponibles, por ejemplo, de Stratagene, Corp., La Jolla, CA) para producir fragmentos de anticuerpos humanos (Vjj, Vl, Fv, Fd, Fab o F(ab')2)- Estos fragmentos se usan luego para construir anticuerpos humanos completos similares a aquellos usados para producir anticuerpos quiméricos.

Anticuerpos anti-idiotipo

Una vez que se identifican los anticuerpos anti-MASP-2 con la actividad inhibidora deseada, estos anticuerpos se pueden utilizar para generar anticuerpos anti-idiotipo que se asemejan a una porción de MASP-2 usando técnicas conocidas en el campo. Véase, p. ej., Greenspan, N.S., et al., FASEb J. 7:437, 1993. Por ejemplo, los anticuerpos que se unen a MASP-2 e inhiben competitivamente una interacción de las proteínas MASP-2 requerida para la activación del complemento se pueden utilizar para generar anti-idiotipos que se asemejan al sitio de unión a MBL en la proteína MASP-2 y por ende se unen y neutralizan un ligando de unión de MASP-2, tal como, por ejemplo, MBL.

Fragmentos de inmunoglobulina

Los agentes inhibidores de MASP-2 útiles en el método de la invención abarcan no solamente moléculas de inmunoglobulina intactas, sino también fragmentos conocidos, incluidos fragmentos de Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2 y Fv, scFv, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

Se sabe bien en la técnica que solamente una pequeña porción de una molécula de anticuerpo, el paratopo, está implicada en la unión del anticuerpo a su epítopo (véase, p. ej., Clark, W.R., The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., NY, 1986). Las regiones pFc' y Fc del anticuerpo son efectoras de la vía del complemento clásica, pero no están implicadas en la unión al antígeno. Un anticuerpo del cual la región pFc' ha sido enzimáticamente escindida, o que ha sido producido sin la región pFc', se denomina fragmento F(ab')2 y retiene

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ambos sitios de unión al antígeno de un anticuerpo intacto. Un fragmento de F(ab')2 aislado se denomina fragmento monoclonal bivalente debido a sus dos sitios de unión al antígeno. De modo similar, un anticuerpo del cual la región Fc ha sido enzimáticamente escindida, o que ha sido producido sin la región Fc, se denomina fragmento Fab, y retiene uno de los sitios de unión al antígeno de una molécula de anticuerpo intacta.

Los fragmentos de anticuerpo se pueden obtener por hidrólisis proteolítica, tal como por digestión de pepsina o papaína de anticuerpos enteros por métodos convencionales. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo se pueden producir por escisión enzimática de anticuerpos con pepsina para proveer un fragmento 5S denominado F(ab')2- Este fragmento puede además escindirse empleando un agente reductor de tiol para producir fragmentos monovalentes 3.5S Fab'. Opcionalmente, la reacción de escisión puede realizarse usando un grupo bloqueante para los grupos sulfhidrilo que resultan de la escisión de enlaces disulfuro. Como alternativa, una escisión enzimática que usa pepsina produce dos fragmentos Fab monovalentes y un fragmento Fc directamente. Estos métodos se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. núm. 4.331.647 para Goldenberg; Nisonoff, A., et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, R.R., Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman, et al., en Methods in Enzymology, 1:422, Academic Press, 1967; y en Coligan en las páginas 2.8.1-2.8.10 y 2.10.-2.10.4.

En algunas realizaciones, el uso de los fragmentos de anticuerpo que carecen de la región Fc se prefieren para evitar la activación de la vía del complemento clásica que se inicia tras la unión de Fc al receptor de Fcy. Hay varios métodos mediante los cuales uno puede producir un MoAb que evita las interacciones con el receptor de Fcy. Por ejemplo, la región Fc de un anticuerpo monoclonal puede eliminarse químicamente usando digestión parcial por enzimas proteolíticas (tales como digestión de ficina), generando así, por ejemplo, fragmentos de anticuerpos de unión al antígeno, tales como fragmentos Fab o F(ab)2 (Mariani, M., et al., Mol. Immunol. 28:69-71, 1991).

Alternativamente, el isotipo de IgG humano y4 IgG, que no se une a los receptores de Fcy, se puede usar durante la construcción de un anticuerpo humanizado como se describe en este documento. Los anticuerpos, anticuerpos monocatenarios y dominios de unión al antígeno que carecen del dominio Fc pueden también modificarse usando técnicas recombinantes como se describe en la presente memoria.

Fragmentos de anticuerpos monocatenarios

Alternativamente, uno puede crear moléculas de unión a péptidos sencillos específicas de MASP-2 en donde las regiones Fv de las cadenas pesada y ligera están conectadas. Los fragmentos Fv pueden estar conectados por un enlazador peptídico para formar una proteína de unión al antígeno monocatenaria (scFv). Estas proteínas de unión al antígeno monocatenarias se preparan construyendo un gen estructural que comprende secuencias de ADN que codifican los dominios Vh y Vl que están conectados por un oligonucleótido. El gen estructural se inserta en un vector de expresión, que posteriormente se introduce en una célula hospedante tal como E. coli. Las células hospedantes recombinantes sintetizan una cadena de polipéptido sencilla con un péptido enlazador que une los dos dominios V. Los métodos para producir scFv se describen, por ejemplo, en Whitlow, et al., "Methods: A Companion to Methods in Enzymology" 2:97, 1991; Bird, et al., Science 242:423, 1988; patente estadounidense núm. 4.946.778 para Ladner; Pack, P., et al., Bio/Technology 11:1271, 1993.

Como un ejemplo ilustrativo, un scFv específico de MASP-2 se puede obtener exponiendo los linfocitos al polipéptido de MASP-2 in vitro y seleccionando bibliotecas que exhiben anticuerpos en fago o vectores similares (por ejemplo, a través del uso de proteína o péptido de MASP-2 inmovilizado o marcado). Los genes que codifican los polipéptidos que tienen dominios de unión a polipéptidos de MASP-2 potenciales se pueden obtener ensayando bibliotecas de péptidos aleatorias exhibidas en fago o en bacterias tales como E. coli. Estas bibliotecas que exhiben péptidos aleatorios se pueden usar para detectar péptidos que interactúan con MASP-2. Las técnicas para crear y detectar dichas bibliotecas que exhiben péptidos se conocen en la técnica (patente estadounidense núm. 5.223.409 para Lardner; patente estadounidense núm. 4.946.778 para Ladner; patente estadounidense núm. 5.403.484 para Lardner; patente estadounidense núm. 5.571.698 para Lardner; y Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins Academic Press, Inc., 1996), y las bibliotecas que exhiben péptidos aleatorios y kits para ensayar dichas bibliotecas están comercialmente disponibles, por ejemplo, de CLONTeCh Laboratories, Inc. (Palo Alto, Calif), Invitrogen Inc. (San Diego, Calif.), New England Biolabs, Inc. (Beverly, Mass.) y Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, N.J.).

Otra forma de un fragmento de anticuerpo anti-MASP-2 útil en este aspecto de la invención es un péptido que codifica una región determinante de complementaridad (CDR) que se une a un epítopo en un antígeno de MASP-2 e inhibe la activación del complemento dependiente de MASP-2. Los péptidos CDR ("unidades de reconocimiento mínimo") se pueden obtener construyendo genes que codifican la CDR de un anticuerpo de interés. Dichos genes se preparan, por ejemplo, usando la reacción en cadena de la polimerasa para sintetizar la región variable de ARN de células que producen anticuerpos (véase, por ejemplo, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods en Enzymology 2:106, 1991; Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies" en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), página 166, Cambridge University Press, 1995; y Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al. (eds.), página 137, Wiley-Liss, Inc., 1995).

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Los anticuerpos de MASP-2 descritos en este documento se administran a un sujeto que lo necesita para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2. En algunas realizaciones, el agente inhibidor de MASP-2 es un anticuerpo anti-MASP-2 monoclonal de gran afinidad humano o humanizado con función efectora reducida.

V. Composiciones farmacéuticas y métodos de administración

Dosis

En otro aspecto, la invención da a conocer composiciones para inhibir los efectos adversos de la activación del complemento dependiente de MASP-2, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de MASP-2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El agente inhibidor de MASP-2 se puede administrar a un sujeto que lo necesita en una dosis terapéuticamente eficaz para tratar o aliviar afecciones asociadas con la activación del complemento dependiente de MASP-2. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad del agente inhibidor de MASP-2 suficiente para generar un alivio de los síntomas de la afección.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de los agentes inhibidores de MASP-2 se pueden determinar por procedimientos farmacéuticos convencionales que emplean modelos animales, como el modelo de ratón MASP-2 -/- murino que expresa el transgen de MASP-2 humano descrito en el Ejemplo 3. Con el uso de dichos modelos animales, se pueden determinar el NOAEL (nivel de efecto adverso no observado) y la MED (dosis mínimamente eficaz) empleando métodos convencionales. La relación de dosis entre los efectos NOAEL y MED es la relación terapéutica, que se expresa como la relación NOAEL/MED. Los agentes inhibidores de MASP-2 que exhiben grandes relaciones o índices terapéuticos son los que más se prefieren. Los datos obtenidos de ensayos de cultivos celulares y estudios animales se pueden usar para formular una gama de dosis para uso en seres humanos. La dosis del agente inhibidor de MASP-2 preferiblemente yace dentro del intervalo de concentraciones circulantes que incluyen MED con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo, dependiendo de la forma de dosificación y la ruta de administración que se utilicen.

Para cualquier formulación de compuestos, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar usando modelos animales. Por ejemplo, se puede formular una dosis en un modelo animal para logar un intervalo de concentración en plasma circulante que incluya la MED. Los niveles cuantitativos del agente inhibidor de MASP-2 en el plasma también pueden medirse, por ejemplo, por cromatografía de líquidos de alta resolución.

Además de los estudios de toxicidad, la dosis eficaz puede también estimarse en base a la cantidad de proteína MASP-2 presente en un sujeto vivo y a la afinidad de unión del agente inhibidor de MASP-2. Se ha demostrado que los niveles de MASP-2 en sujetos humanos normales está presente en el suero en niveles bajos en el intervalo de 500 ng/ml, y los niveles de MASP-2 en un sujeto particular, se pueden determinar usando un ensayo cuantitativo para MASP-2 descrito en Moller-Kiistensen M., et al., J. Immunol. Methods 282:159-167, 2003.

En general, la dosis de las composiciones administradas que comprenden agentes inhibidores de MASP-2 varía dependiendo de factores tales como la edad, el peso, la estatura, el sexo y el estado médico general del sujeto, y de los antecedentes médicos previos. A modo ilustrativo, los agentes inhibidores de MASP-2, tales como anticuerpos anti-MASP-2, se pueden administrar en intervalos de dosis de aproximadamente 0,010 a 10,0 mg/kg, preferiblemente de 0,010 a 1,0 mg/kg, más preferiblemente 0,010 a 0,1 mg/kg del peso corporal del sujeto.

La eficacia terapéutica de las composiciones y métodos inhibidores de MASP-2 de la presente invención en un sujeto determinado, y las dosis adecuadas, se pueden determinar de acuerdo con ensayos del complemento conocidos por el experto en la técnica. El complemento genera diversos productos específicos. Durante la última década, se han desarrollado y se encuentran disponibles en el mercado ensayos sensibles y específicos para la mayoría de estos productos de activación, incluidos los pequeños fragmentos de activación C3a, C4a y C5a y los grandes fragmentos de activación iC3b, C4d, Bb y sC5b-9. La mayoría de estos ensayos utilizan anticuerpos monoclonales que reaccionan con antígenos nuevos (neoantígenos) expuestos en el fragmento, pero no en las proteínas naturales de las cuales están formados, lo que hace que estos ensayos sean muy simples y específicos. La mayoría se basan en tecnología ELISA, aunque el radioinmunoensayo es todavía utilizado en ocasiones para C3a y C5a. Estos últimos ensayos miden tanto los fragmentos no procesados como sus fragmentos 'desArg', que son las formas importantes encontradas en la circulación. Los fragmentos no procesados y C5adeSArg son rápidamente aclarados por la unión a los receptores de la superficie celular y en consecuencia están presentes en concentraciones muy reducidas, mientras que C3adeSArg no se une a las células y se acumula en el plasma. La medición de C3a proporciona un indicador sensible de la activación del complemento independiente de la vía. La activación de la vía alternativa se puede evaluar midiendo el fragmento Bb. La detección del producto de fase fluida de activación de la vía de ataque a la membrana, sC5b-9, aporta datos de que el complemento está siendo activado hasta la culminación. Dado que tanto la vía de lectinas como la clásica generan los mismos productos de activación, C4a y C4d, la medición de estos dos fragmentos no provee ninguna información sobre cuál de estas dos vías ha generado los productos de activación.

Vehículos farmacéuticos y vehículos de administración

En general, las composiciones del agente inhibidor de MASP-2 de la presente invención, combinadas con cualquier otro agente terapéutico seleccionado, están adecuadamente contenidas en un vehículo farmacéuticamente

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aceptable. El vehículo es no tóxico y biocompatible y se selecciona como para no afectar perjudicialmente la actividad biológica del agente inhibidor de MASP-2 (y cualquier otro agente combinado con estos). Los vehículos farmacéuticamente aceptables ilustrativos para péptidos se describen en la patente estadounidense núm. 5.211.657 para Yamada. Los anticuerpos anti-MASP-2 y los péptidos inhibidores útiles en la invención se pueden formular en preparaciones en formas sólida, semisólida, en gel, líquida o gaseosa, tal como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, ungüentos, disoluciones, supositorios, inhalantes e inyecciones que permiten la administración oral, parenteral o quirúrgica. La invención también contempla la administración local de las composiciones recubriendo los dispositivos médicos y similares.

Los vehículos adecuados para administración parenteral por inyección, infusión o irrigación, o tópica incluyen agua destilada, disolución salina fisiológica tamponada con fosfato, disoluciones de Ringer normales o lactadas, disolución de dextrosa, disolución de Hank o propanodiol. Además, los aceites estériles, fijos pueden emplearse como disolvente o medio de suspensión. Para este propósito, puede emplearse cualquier aceite biocompatible incluidos mono o diglicéridos. Además, los ácidos grasos tales como ácido oleico encuentran uso en la preparación de inyectables. El vehículo y el agente se pueden combinar como un líquido, suspensión, gel polimerizable o no polimerizable, pasta o bálsamo.

El vehículo puede comprender también un vehículo de administración para sostener (es decir, extender, demorar o regular) la administración del agente(s) o para potenciar la administración, absorción, estabilidad o farmacocinética del agente(s) terapéutico. Dicho vehículo de administración puede incluir, a modo de ejemplo no limitativo, micropartículas, microesferas, nanoesferas o nanopartículas compuestas por proteínas, liposomas, carbohidratos, compuestos orgánicos sintéticos, compuestos inorgánicos, hidrogeles poliméricos o copoliméricos y micelas poliméricas. Los sistemas de administración adecuados de hidrogel y micelas incluyen los copolímeros de PEO:PHB:PEO y los complejos de copolímero/ciclodextrina descritos en el documento WO 2004/009664 A2 y PEO y los complejos de PEO/ciclodextrina descritos en el documento US 2002/0019369 A1. Dichos hidrogeles se pueden inyectar localmente en el sitio de acción destinado o por vía subcutánea o intramuscular para formar una formulación de liberación sostenida.

Para administración intra-articular, el agente inhibidor de MASP-2 se puede transportar en los vehículos líquidos o geles anteriormente descritos que son inyectables, en los vehículos de administración sostenida anteriormente descritos que son inyectables o en ácido hialurónico o un derivado de ácido hialurónico.

Para administración oral de agentes no peptidérgicos, el agente inhibidor de MASP-2 se puede transportar en una carga o diluyente inerte tal como sacarosa, almidón de maíz o celulosa.

Para administración tópica, el agente inhibidor de MASP-2 se puede transportar en un ungüento, loción, crema, gel, gota, supositorio, aerosol, líquido o polvo, o en gel o sistemas de administración microcapsular mediante un parche transdérmico.

Diversos sistemas de administración nasal y pulmonar, incluidos aerosoles, inhaladores dosificadores, inhaladores en polvo seco y nebulizadores están siendo desarrollados y pueden adaptarse adecuadamente para administración de la presente invención en un vehículo de administración en aerosol, inhalante o nebulizador, respectivamente.

Para administración intratecal (IT) o intracerebroventricular (ICV), se pueden usar los sistemas de administración apropiadamente estériles (p. ej., líquidos, geles, suspensiones, etc.) para administrar la presente invención.

Las composiciones de la presente invención pueden también incluir excipientes biocompatibles, tales como agentes de dispersión o humectantes, agentes de suspensión, diluyentes, tampones, potenciadores de penetración, emulsionantes, aglutinantes, espesantes, saporíferos (para administración oral).

Vehículos farmacéuticos para anticuerpos y péptidos

Más específicamente con respecto a anticuerpos anti-MASP-2 (y también adecuadas para péptidos inhibidores) las formulaciones ilustrativas pueden administrarse por vía parenteral como formulaciones inyectables de una disolución o suspensión del compuesto en un diluyente fisiológicamente aceptable con un vehículo farmacéutico que puede ser un líquido estéril tal como agua, aceites, disolución salina, glicerol o etanol. Adicionalmente, las sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, tensioactivos, sustancias tamponantes de pH y similares pueden estar presentes en composiciones que comprenden anticuerpos anti-MASP-2 y péptidos inhibidores. Los componentes adicionales de las composiciones farmacéuticas incluyen petróleo (tal como de origen animal, vegetal o sintético), por ejemplo, aceite de soja y aceite mineral. En general, los glicoles tales como propilenglicol o polietilenglicol son vehículos líquidos preferidos para disoluciones inyectables.

Los anticuerpos anti-MASP-2 y los péptidos inhibidores pueden también administrarse en la forma de una inyección de liberación lenta o preparación de implante que se puede formular en un modo tal como para permitir una liberación sostenida o pulsátil de los agentes activos.

Modos de administración

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Las composiciones farmacéuticas que comprenden agentes inhibidores de MASP-2 se pueden administrar en una diversidad de formas dependiendo de si lo más adecuado es un modo local o sistémico de administración para la afección que se esté tratando. Además, como se describió anteriormente en la presente invención con respecto a los procedimientos de reperfusión extracorpórea, los agentes inhibidores de MASP-2 se pueden administrar a través de la introducción de las composiciones de la presente invención a la sangre o el plasma recirculante. A su vez, las composiciones de la presente invención se pueden administrar recubriendo o incorporando las composiciones en un dispositivo médico.

Administración sistémica

Tal como se emplea en la presente memoria, la expresión "administración sistémica" tiene como fin incluir, aunque sin limitarse a ello, las rutas orales y parenterales, incluida la ruta intramuscular (IM), subcutánea, intravenosa (IV), intra-arterial, de inhalación, sublingual, bucal, tópica, transdérmica, nasal, rectal, vaginal y otras rutas de administración, que resulta eficazmente en la dispersión del agente administrado a uno o múltiples sitios de acción terapéutica prevista. Las rutas preferidas de administración sistémica para las presentes composiciones incluyen la ruta intravenosa, intramuscular, subcutánea y de inhalación. Se ha de apreciar que la ruta de administración sistémica exacta para los agentes seleccionados utilizados en las composiciones particulares de la presente invención se determinará en parte en función de la susceptibilidad del agente a las vías de transformación metabólica asociadas con una ruta de administración determinada. Por ejemplo, los agentes peptidérgicos pueden administrarse de la forma más adecuadas por rutas que no sean la ruta oral.

Los anticuerpos y polipéptidos inhibidores de MASP-2 se pueden administrar a un sujeto que lo necesita por cualquier medio adecuado. Los métodos de administración de anticuerpos y polipéptidos de MASP-2 incluyen la administración por las rutas de administración oral, pulmonar, parenteral (p. ej., inyección intramuscular, intraperitoneal, intravenosa (IV) o subcutánea), inhalación (como mediante la formulación de un polvo fino), transdérmica, nasal, vaginal, rectal o sublingual, y se pueden formular en formas de dosificación adecuadas para cada ruta de administración.

A modo de ejemplo representativo, los anticuerpos y péptidos inhibidores de MASP-2 se pueden introducir a un cuerpo vivo por aplicación a una membrana corporal capaz de absorber los polipéptidos, por ejemplo, las membranas nasales, gastrointestinales y rectales. Los polipéptidos típicamente se aplican a la membrana absorbente junto con un potenciador de penetración. (véanse, p. ej., Lee, V.H.L., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys. 5:69, 1988; Lee, V.H.L., J. Controlled Release 13:213, 1990; Lee, V.H.L., Ed., Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, Nueva York (1991); DeBoer, A.G., et al., J. Controlled Release, 13:241, 1990). Por ejemplo, STDHF es un derivado sintético de ácido fusídico, un tensioactivo esteroideo que es similar en estructura a las sales biliares, y se ha utilizado como potenciador de penetración para administración nasal. (Lee, W.A., Biopharm. 22, Nov./Dic. 1990.)

Los anticuerpos y polipéptidos inhibidores de MASP-2 se pueden introducir en asociación con otra molécula, tal como un lípido, para proteger a los polipéptidos de la degradación enzimática. Por ejemplo, la unión covalente de los polímeros, especialmente polietilenglicol (PEG), se ha utilizado para proteger a ciertas proteínas de la hidrólisis enzimática en el cuerpo y prolongar así la semivida (Fuertges, F., et al., J. Controlled Release 11:139, 1990). Se han descrito muchos sistemas poliméricos para la administración de proteínas (Bae, Y.H., et al., J. Controlled Release 9:271, 1989; Hori, R., et al., Pharm. Res. 6:813, 1989; Yamakawa, I., et al., J. Pharm. Sci. 79:505, 1990; Yoshihiro, I., et al., J. Controlled Release 10:195, 1989; Asano, M., et al., J. Controlled Release 9:111, 1989; Rosenblatt, J., et al., J. Controlled Release 9:195, 1989; Makino, K., J. Controlled Release 12:235, 1990; Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci. 78:117, 1989; Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci. 78:219, 1989).

Recientemente, se han desarrollado liposomas con mejor estabilidad y semivida en la circulación en suero (véase, p. ej., la patente estadounidense núm. 5.741.516 para Webb). Asimismo, se han revisado diversos métodos de preparaciones de liposomas y de tipo liposomas como vehículos de fármacos potenciales (véanse, p. ej., la patente estadounidense núm. 5.567.434 para Szoka; patente estadounidense núm. 5.552.157 para Yagi; patente estadounidense núm. 5.565.213 para Nakamori; patente estadounidense num. 5.738.868 para Shinkarenko; y patente estadounidense núm. 5.795.587 para Gao).

Para aplicaciones transdérmicas, los anticuerpos y polipéptidos inhibidores de MASP-2 se pueden combinar con otros ingredientes adecuados, tales como vehículos y/o adyuvantes. No hay limitaciones con respecto a la naturaleza de dichos otros ingredientes, excepto que deben ser farmacéuticamente aceptables para la administración prevista, y no pueden degradar la actividad de los ingredientes activos de la composición. Los ejemplos de vehículos adecuados incluyen ungüentos, cremas, geles o suspensiones, con o sin colágeno purificado. Los anticuerpos y polipéptidos inhibidores de MASP-2 pueden también impregnarse en parches transdérmicos, yesos y vendas, preferiblemente en forma líquida o semilíquida.

Las composiciones de la presente invención se pueden administrar sistémicamente en forma periódica en intervalos determinados para mantener un nivel deseado de efecto terapéutico. Por ejemplo, las composiciones se pueden administrar por inyección subcutánea, cada dos a cuatro semanas o en intervalos menos frecuentes. El esquema de dosificación será determinado por el médico, teniendo en cuenta diversos factores que pueden influir en la acción de

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la combinación de agentes. Estos factores incluirán el grado de progreso de la afección que se esté tratando, la edad, el sexo y el peso del paciente, y otros factores clínicos. La dosis para cada agente individual variará como una función del agente inhibidor de MASP-2 que se incluya en la composición, además de la presencia y naturaleza de cualquier vehículo de administración de fármacos (p. ej., un vehículo de liberación sostenida). A su vez, la cantidad de la dosis se podrá ajustar para que represente una variación en la frecuencia de la administración y en la conducta farmacocinética del agente(s) administrado.

Administración local

Tal como se emplea en la presente memoria, el término "local" abarca la aplicación de un fármaco en o alrededor de un sitio de acción localizada prevista, y puede incluir, por ejemplo, la administración tópica a la piel u otros tejidos afectados, administración oftálmica, intratecal (IT), intracerebroventricular (ICV), intra-articular, intracavitaria, intracraneal o intravesicular, colocación o irrigación. Se puede preferir la administración local para posibilitar la administración de una dosis inferior, a fin de evitar efectos colaterales sistémicos, y para un control más preciso del tiempo de administración y concentración de los agentes activos en el sitio de administración local. La administración local proporciona una concentración conocida en el sitio diana, independientemente de la variabilidad entre pacientes en el metabolismo, el torrente circulatorio, etc. El control de la dosis mejorado también se provee mediante el modo directo de administración.

La administración local de un agente inhibidor de MASP-2 se puede lograr en el contexto de métodos quirúrgicos para tratar una enfermedad o afección, tal como por ejemplo durante procedimientos de cirugía de derivación arterial, aterectomía, procedimientos con láser, procedimientos ultrasónicos, angioplastía con globo y colocación de stent. Por ejemplo, un inhibidor de MASP-2 se puede administrar a un sujeto junto con un procedimiento de angioplastia con globo. Un procedimiento de angioplastia con globo implica insertar un catéter que tiene un globo desinflado en una arteria. El globo desinflado se posiciona próximo a la placa aterosclerótica y se infla de manera tal que la placa queda comprimida contra la pared vascular. En consecuencia, la superficie del globo está en contacto con la capa de las células endoteliales vasculares en la superficie del vaso sanguíneo. El agente inhibidor de MASP- 2 puede unirse al catéter de angioplastia con globo en un modo que permita la liberación del agente en el sitio de la placa aterosclerótica. El agente se puede unir al catéter con globo de acuerdo con procedimientos estándar conocidos en la técnica. Por ejemplo, el agente se puede conservar en un compartimiento del catéter con globo hasta que el globo se infle, momento en el cual se libera al entorno local. Alternativamente, el agente se puede impregnar en la superficie del globo, de modo tal de entrar en contacto con las células de la pared arterial a medida que el globo se infla. El agente puede también administrarse en un catéter con globo perforado tal como aquellos descritos en Flugelman, M.Y., et al., Circulation 85: 1110-1117, 1992. Véase también la solicitud PCT WO 95/23161 publicada para un procedimiento ilustrativo de como acoplar una proteína terapéutica a un catéter de angioplastia con globo. Asimismo, el agente inhibidor de MASP-2 puede incluirse en un gel o recubrimiento polimérico aplicado a un stent, o puede incorporarse al material del stent, de manera tal que el stent eluya el agente inhibidor de MASP-2 después de la colocación vascular.

Las composiciones inhibidoras de MASP-2 utilizadas en el tratamiento de artritis y otros trastornos musculoesqueléticos se pueden administrar localmente por inyección intra-articular. Dichas composiciones pueden adecuadamente incluir un vehículo de liberación sostenida. Como otro ejemplo de casos en los que puede ser conveniente la administración local, las composiciones inhibidoras de MASP-2 utilizadas en el tratamiento de afecciones urogenitales puede instilarse adecuadamente en forma intravesical o dentro de otra estructura urogenital.

Recubrimientos en un dispositivo médico

Los agentes inhibidores de MASP-2 tales como anticuerpos y péptidos inhibidores se pueden inmovilizar en (o dentro) de una superficie de un dispositivo médico implantable o acoplable. La superficie modificada típicamente estará en contacto con el tejido vivo después del implante al cuerpo de un animal. Por "dispositivo médico implantable o acoplable" se entiende cualquier dispositivo que se implante o acople al tejido del cuerpo de un animal, durante la operación normal del dispositivo (p. ej., stents y dispositivos de administración de fármacos implantables). Dichos dispositivos médicos implantables o acoplables pueden estar hechos de, por ejemplo, nitrocelulosa, diazocelulosa, vidrio, poliestireno, polivinilcloruro, polipropileno, polietileno, dextrano, Sepharose, agar, almidón, nylon, acero inoxidable, titanio y polímeros biodegradables y/o biocompatibles. La unión de la proteína a un dispositivo se puede lograr con cualquier técnica que no destruya la actividad biológica de la proteína enlazada, por ejemplo acoplando uno o ambos residuos N-C-terminales de la proteína al dispositivo. El acoplamiento también se puede realizar en uno o más sitios internos en la proteína. Se pueden usar también múltiples acoplamientos (tanto internos como en los extremos de la proteína). Una superficie de un dispositivo médico implantable o acoplable se puede modificar para incluir grupos funcionales (p. ej., carboxilo, amida, amino, éter, hidroxilo, ciano, nitrido, sulfanamido, acetilínicotínico, epóxido, silánico, anhídrico, succinímico, azido) para inmovilizar allí las proteínas. Las químicas de acoplamiento incluyen, aunque sin limitarse a ello, la formación de ésteres, éteres, amidas, azido y derivados de sulfanamido, cianato y otros enlaces a los grupos funcionales disponibles en los anticuerpos de MASP- 2 o péptidos inhibidores. Los anticuerpos o fragmentos inhibidores de MASP-2 también se pueden acoplar en forma no covalente por adición de un marcador de afinidad a la proteína, tal como GST (D.B. Smith y K.S. Johnson, Gene 67:31, 1988), polihistidinas (E. Hochuli et al., J. Chromatog. 411:77, 1987) o biotina. Dichos marcadores de afinidad se pueden usar para el acoplamiento reversible de la proteína a un dispositivo.

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Las proteínas también se pueden unir en forma covalente a la superficie del cuerpo de un dispositivo, por ejemplo, por activación covalente de la superficie del dispositivo médico. A modo de ejemplo representativo, la proteína(s) matricelular se puede acoplar al cuerpo del dispositivo mediante cualquiera de los siguientes pares de grupos reactivos (en donde un miembro del par está presente en la superficie del cuerpo del dispositivo y el otro miembro del par está presente en la proteína(s) matricelular): ácido hidroxílico/carboxílico para producir un enlace éster; hidroxilo/anhídrido para producir un enlace éster; hidroxilo/isocianato para producir un enlace uretano. Una superficie del cuerpo de un dispositivo que no posee grupos reactivos útiles se puede tratar con grabado de plasma por descarga de radiofrecuencia (RFGD) para generar grupos reactivos con el fin de permitir la deposición de proteína(s) matricelular (p. ej., tratamiento de plasma con oxígeno para introducir grupos que contienen oxígeno; tratamiento de plasma con propilamino para introducir grupos amino).

Los agentes inhibidores de MASP-2 que comprenden moléculas de ácido nucleico tales como inhibidores de péptidos que codifican ARNi o ADN antisentido se pueden embeber en matrices porosas acopladas al cuerpo de un dispositivo. Las matrices porosas representativas útiles para preparar la capa superficial son aquellas preparadas a partir de tendón o colágeno dérmico, que se pueden obtener de una diversidad de fuentes comerciales (p. ej., Sigma y Collagen Corporation), o matrices de colágeno preparadas como se describe en las patentes estadounidenses núm. 4.394.370 para Jefferies y 4.975.527 para Koezuka. Un material de colágeno se denomina UltraFiber™ y se obtiene de Norian Corp. (Mountain View, California).

Ciertas matrices poliméricas pueden también emplearse, si se desea, e incluyen polímeros de éster acrílico y polímeros de ácido láctico, como se describe, por ejemplo, en las patentes estadounidenses núm. 4.526.909 para Urist y 4.563.489 para Urist. Los ejemplos particulares de polímeros útiles son aquellos de ortoésteres, anhídridos, propileno-cofumaratos, o un polímero de uno o más monómeros de ácido a-hidroxicarboxílico, (p. ej., un ácido a- hidroxiacético (ácido glicólico) y/o un ácido a-hidroxipropiónico (ácido lactico)).

Esquemas de tratamiento

En aplicaciones profilácticas, las composiciones farmacéuticas se administran a un sujeto susceptible a, o que conlleva riesgo de, una afección asociada con la activación del complemento dependiente de MASP-2 en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riego de desarrollar síntomas de la afección. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones farmacéuticas se administran a un sujeto del que se sospecha que padece, o que ya padece, una afección asociada con la activación del complemento dependiente de MASP-2 en una cantidad terapéuticamente eficaz suficiente para aliviar, o por lo menos reducir parcialmente, los síntomas de la afección. En ambos esquemas profilácticos y terapéuticos, las composiciones que comprenden agentes inhibidores de MASP-2 se pueden administrar en varias dosis hasta lograr un resultado terapéutico suficiente en el sujeto. La aplicación de las composiciones inhibidoras de MASP-2 de la presente invención se puede llevar a cabo por administración única de la composición, o en una secuencia limitada de administraciones, para el tratamiento de una afección aguda, p. ej., lesión por reperfusión u otra lesión traumática. Alternativamente, la composición se puede administrar en intervalos periódicos durante un periodo de tiempo extendido para el tratamiento de afecciones crónicas, p. ej., artritis o psoriasis.

Los métodos y composiciones de la presente invención se pueden usar para inhibir la inflamación y procesos relacionados que típicamente resultan de procedimientos médicos y quirúrgicos diagnósticos y terapéuticos. Para inhibir dichos procedimientos, la composición inhibidora de MASP-2 de la presente invención se puede aplicar en un peri-procedimiento. Tal como se emplea en la presente memoria "peri-procedimiento" se refiere a la administración de la composición inhibidora pre-procedimiento y/o intra-procedimiento y/o post-procedimiento, es decir, antes del procedimiento, antes y durante el procedimiento, antes y después del procedimiento, antes, durante y después del procedimiento, durante el procedimiento, durante y después del procedimiento, o después del procedimiento. La aplicación peri-procedimiento se puede llevar a cabo por administración local de la composición al sitio quirúrgico o del procedimiento, como por inyección o irrigación continua o intermitente del sitio o por administración sistémica. Los métodos adecuados para la administración peri-operatoria local de disoluciones del agente inhibidor de MASP-2 se describen en las patentes estadounidenses núm. 6.420.432 para Demopulos y 6.645.168 para Demopulos. Los métodos adecuados para administración local de composiciones condroprotectoras incluido el agente(s) inhibidor de MASP-2 se describen en la solicitud de patente internacional PCT WO 01/07067 A2. Los métodos y composiciones adecuados para administración sistémica dirigida de composiciones condroprotectoras, incluido el agente(s) inhibidor de MASP-2, se describen en la solicitud de patente internacional PCT WO 03/063799 A2.

VI. Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran simplemente el mejor modo contemplado ahora para practicar la invención, pero no deben interpretarse como limitativos de la invención.

Ejemplo 1

Este ejemplo describe la generación de una cepa de ratón deficiente de MASP-2 (MASP-2-/-) pero suficiente de MAp19 (MAp19+/+).

Materiales y métodos: Se diseñó el vector de direccionamiento pKO-NTKV 1901 para alterar los tres exones que

codifican el extremo C-terminal de MASP-2 murina, incluido el exón que codifica el dominio de serina proteasa, como se muestra en la FIGURA 4. Se usó PKO-NTKV 1901 para transfectar la línea celular ES, E14.1a (SV129 Ola). Se seleccionaron clones resistentes a neomicina y sensibles a timidina cinasa. Se seleccionaron 600 clones ES y, de estos, se identificaron cuatro clones diferentes y se verificó por análisis que contenían el evento de direccionamiento 5 selectivo y la recombinación esperada, como se muestra en la FIGURA 4. Las quimeras se generaron a partir de estos cuatros clones positivos por transferencia de embriones. Las quimeras luego se retrocruzaron en el fondo de genes C57/BL6 para crear machos transgénicos. Los machos transgénicos se cruzaron con hembras para generar F1 en donde 50% de la descendencia mostró heterocigosidad para el gen MASP-2 alterado. Los ratones heterocigotos se entrecruzaron para generar descendencia deficiente de MASP-2 de homocigotos, resultando en 10 ratones heterocigotos y de tipo salvaje en la proporción de 1:2:1, respectivamente.

Resultados y fenotipo: Los ratones deficientes de MASP-2-/- homocigotos resultantes se hallaron viables y fértiles, y se verificó que eran deficientes de MASP-2 por análisis Southern para confirmar el correcto evento de direccionamiento, por análisis Northern para confirmar la ausencia de ARNm de MASP-2 y por análisis Western para confirmar la ausencia de la proteína MASP-2 (no se muestran los datos). La presencia de ARNm de MAp19 y la 15 ausencia de ARNm de MASP-2 se confirmaron además usando RT-PCR resuelta en tiempo en una máquina LightCycler. Los ratones MASP-2-/- continúan expresando MAp19, MASP-1 y ARNm y proteína MASP-3 como se espera (no se muestran los datos). La presencia y abundancia de ARNm en los ratones MASP-2-/- para Properdina, Factor B, Factor D, C4, C2 y C3 se evaluó por análisis LightCycler y se halló idéntico a aquel de los controles de la camada de tipo salvaje (no se muestran los datos). El plasma de los ratones MASP-2-/- homocigotos es totalmente 20 deficiente de la activación del complemento mediada por la vía de lectinas y la activación del complemento mediada por la vía alternativa, como se describe en más detalle en el Ejemplo 2.

Generación de una cepa de MASP-2-/- en un fondo C57BL6 puro: Los ratones MASP-2-/- se retrocruzan con una línea C57BL6 pura por nueve generaciones antes del uso de la cepa MASP-2-/- como modelo animal experimental.

Ejemplo 2

25 Este ejemplo demuestra que se requiere MASP-2 para la activación del complemento mediante la vía alternativa y la vía de lectinas.

Métodos y materiales:

Ensayo de escisión de C4 específica de la vía de lectinas: Se ha descrito un ensayo de escisión de C4 por Petersen, et al., J. Immunol. Methods 257:107 (2001) que mide la activación de la vía de lectinas resultante de ácido 30 lipoteicoico (LTA) de S. aureus, que se une a L-ficolina. El ensayo descrito en el Ejemplo 11 se adaptó para medir la activación de la vía de lectinas mediante MBL recubriendo la placa con LPS y manano o cimosano antes de añadir suero de ratones MASP-2 -/- como se describe a continuación. El ensayo también se modificó para eliminar la posibilidad de la escisión de C4 debido a la vía clásica. Esto se logró utilizando un tampón de dilución de muestras que contenía NaCl 1 M, lo cual permite la unión de gran afinidad de los componentes de reconocimiento de la vía de 35 lectinas a sus ligandos, pero evita la activación de C4 endógena, excluyendo así la participación de la vía clásica al disociar el complejo C1. En síntesis, en las muestras de suero de ensayo modificadas (diluidas en gran cantidad de sal (tampón de NaCl 1 M) se añaden placas recubiertas con ligando, seguidas de la adición de una cantidad constante de C4 purificada en un tampón con una concentración fisiológica de sal. Los complejos de reconocimiento unidos que contienen MASP-2 escinden C4, generando la deposición de C4b.

40 Métodos de ensayo:

1) Placas de microtitulación Nunc Maxisorb (Maxisorb, Nunc, Cat. No. 442404, Fisher Scientific) se recubrieron con 1 |j/ml de manano (M7504 Sigma) o cualquier otro ligando (p. ej., los mencionados a continuación) diluido en tampón de recubrimiento (Na2CO315 mM, NaHCO3 35 mM, pH 9,6).

Se emplearon los siguientes reactivos en el ensayo:

45 a. manano (1 jg/pocillo manano (M7504 Sigma) en 100 jl tampón de recubrimiento):

b. cimosano (1 jg/pocillo cimosano (Sigma) en 100 jl tampón de recubrimiento);

c. LTA (1 jg/pocillo en 100 jl tampón de recubrimiento o 2 jg/pocillo en 20 jl metanol)

d. 1 jg de Mab 4H5 específico de H-ficolina en tampón de recubrimiento

e. PSA de Aerococcus viridans (2 jg/pocillo en 100 jl tampón de recubrimiento)

50 f. 100 jl/pocillo de S. aureus DSM20233 fijada a formalina (OD550=0,5) en tampón de recubrimiento.

2) Las placas se incubaron durante toda la noche a 4°C.

3) Después de incubar durante toda la noche, los sitios de unión a la proteína residual se saturaron incubando las

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placas con tampón bloqueador HSA-TBS al 0,1% (0,1% (p/v) HSA en Tris-CL 10 mM, NaCI 140 mM, NaN3 1,5 mM, pH 7,4) durante 1-3 horas; luego lavando las placas 3X con TBS/tween/Ca2+ (TBS con 0,05% Tween 20 y CaCl2 5 mM, MgCl21 mM, pH 7,4).

4) Las muestras de suero a ensayar se diluyeron en tampón de unión a MBL (NaCl 1 M) y las muestras diluidas se añadieron a las placas y se incubaron durante la noche a 4°C. Los pocillos que recibieron solamente tampón se usaron como controles negativos.

5) Después de la incubación durante la noche a 4°C, las placas se lavaron 3X con TBS/tween/Ca2+. C4 humano (100 jl/pocillo de 1 |jg/ml diluido en BBS (barbital 4 mM, NaCl 145 mM, CaCl2 2 mM, MgCh 1 mM, pH 7,4)) se añadió luego a las placas y se incubó durante 90 minutos a 37°C. Las placas se lavaron nuevamente 3X con TBS/tween/Ca2+.

6) Se detectó la deposición de C4b con un C4c antihumano de pollo conjugado a fosfatasa alcalina (diluido 1:1000 en TBS/tween/Ca2+, que se añadió a las placas y se incubó durante 90 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron luego nuevamente 3X con TBS/tween/Ca2+.

7) Se detectó fosfatasa alcalina añadiendo 100 jl de disolución de sustrato de p-nitrofenil fosfato, incubando a temperatura ambiente durante 20 minutos y leyendo la OD405 en una lectora de placas de microtitulación.

Resultados: Las FIGURAS 6A-B muestran la cantidad de deposición de C4b en manano (FIGURA 6A) y cimosano (FIGURA 6B) en diluciones en suero de MASP-2+/+ (cruces), MASP-2+/- (círculos cerrados) y MASP-2-/- (triángulos cerrados). La FIGURA 6C muestra la actividad relativa de la convertasa C4 en las placas recubiertas con cimosano (barras blancas) o manano (barras sombreadas) de ratones MASP-2-/+ (n=5) y ratones MASP-2-/- (n=4) en relación con ratones de tipo salvaje (n=5) en base a la medición de la cantidad de deposición de C4b normalizado al suero de tipo salvaje. Las barras de error representan la desviación estándar. Como se muestra en las FIGURAS 6A-C, el plasma de ratones MASP-2-/- es totalmente deficiente de la activación del complemento mediada por la vía de lectinas en placas recubiertas con manano y cimosano. Estos resultados demuestran claramente que MASP-2, pero no MASP-1 ni MASP-3, es el componente efector de la vía de lectinas.

Ensayo de deposición de C3b:

1) Se recubren placas de microtitulación Nunc Maxisorb (Maxisorb, Nunc, cat. No. 442404, Fisher Scientific) con 1 jg/pocillo manano (M7504 Sigma) o cualquier otro ligando diluido en tampón de recubrimiento (Na2CO3 15 mM, NaHCO3 35 mM, pH 9,6) y se incuba durante toda la noche a 4°C.

2) Se saturan sitios de unión a proteína residual incubando la placa con tampón de bloqueo HSA-TBS al 0,1% (0,1% (p/v) HSA en Tris-CL 10 mM, NaCl 140 mM, NaN 1,5 mM, pH 7,4) durante 1-3 horas.

3) Las placas se lavan en TBS/tw/Ca++ (TBS con 0,05% Tween 20 y CaCl2 5 mM) y se añade BBS diluido a las muestras de suero (barbital 4 mM, NaCl 145 mM, CaCl2 2 mM, MgCh 1 mM, pH 7,4). Los pocillos que reciben solamente tampón se usan como controles negativos. Un conjunto control de muestras de suero obtenidas de ratones MASP-2-/- de tipo salvaje se despojan de C1q antes del uso en el ensayo. El suero de los ratones despojados de C1q se preparó usando Dynabeads acoplados a la proteína A (Dynal Biotech, Oslo, Noruega) recubiertas con C1q IgG antihumano de conejo (Dako, Glostmp, Dinamarca), de acuerdo con las instrucciones del proveedor.

4) Después de incubar durante toda la noche a 4°C y de otro lavado con TBS/tw/Ca++, se detecta C3 convertida y unida con anticuerpo C3c antihumano policlonal (Dako A 062) diluido en TBS/tw/Ca++ a 1:1000). El anticuerpo secundario es IgG anticonejo de cabra (molécula entera) conjugado a fosfatasa alcalina (Sigma Immunochemicals A- 3812) diluido 1:10.000 en TBS/tw/Ca++. La presencia de la vía del complemento alternativa (AP) se determina por adición de 100 jl disolución de sustrato (conjuntos de comprimidos de nitrofenilfosfato Sigma Fast, Sigma) y se incuba a temperatura ambiente. La hidrólisis se supervisa cuantitativamente midiendo la absorción a 405 nm en una lectora de placas de microtitulación. Se prepara una curva estándar para cada análisis, usando diluciones en serie de muestras de plasma/suero.

Resultados: Los resultados que se muestran en las FIGURAS 7A y 7B son de sueros mezclados de varios ratones. Las cruces representan suero de MASP-2+/+, los círculos rellenos representan suero de MASP-2+/+ desprovistos de C1q, los cuadrados abiertos representan suero de MASP-2-/- y los triángulos abiertos representan suero de MASP- 2-/- desprovistos de C1q. Como se muestra en las FIGURAS 7A-B, el suero de los ratones MASP-2-/- ensayados en un ensayo de deposición de C3b produce niveles muy bajos de activación de C3 en placas recubiertas de manano (FIGURA 7A) y cimosano (FIGURA 7B). Este resultado demuestra claramente que se requiere MASP-2 para contribuir a la generación inicial de C3b proveniente de C3 para iniciar la vía del complemento alternativa. Este es un resultado sorprendente en función de la visión ampliamente aceptada de que los factores del complemento C3, el factor B, el factor D y properdina forman una vía alternativa funcional independiente en la que C3 puede someterse a un cambio de configuración conformacional espontáneo a una forma de "tipo C3b" que luego genera convertasa de fase fluida iC3Bb y deposita moléculas C3b en las superficies de activación tales como cimosano.

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MASP-2 recombinante reconstituye la activación de C4 dependiente de la vías de lectinas en suero de ratones MASP-2-/-

Con el fin de establecer que la ausencia de MASP-2 fue la causa directa de la pérdida de la activación de C4 dependiente de lectinas en los ratones MASP-2-/-, se examinó el efecto de añadir proteína MASP-2 recombinante a muestras de suero en el ensayo de escisión de C4 anteriormente descrito. Se produjeron proteínas recombinantes de MASP-2 murina funcionalmente activa y MASP-2A murina catalíticamente inactiva (en donde el residuo serina del sitio activo en el dominio de serina proteasa se sustituyó con el residuo alanina), y se purificaron como se describe a continuación en el Ejemplo 5. El suero agrupado de ratones 4 MASP-2 -/- se pre-incubó con concentraciones de proteína en aumento de MASP-2 murina recombinante o MASP-2A murina recombinante inactiva y se ensayó la actividad de la convertasa C4 como se describió anteriormente.

Resultados: Como se muestra en la FIGURA 8, la adición de la proteína MASP-2 recombinante murina funcionalmente activa (se muestra como triángulos abiertos) al suero obtenido de los ratones MASP-2 -/- restauró la activación de C4 dependiente de la vía de lectinas en un modo dependiente de la concentración de la proteína, mientras que la proteína MASP-2A murina catalíticamente inactiva (se muestra como asteriscos) no restauró la activación de C4. Los resultados que se muestran en la FIGURA 8 se normalizan a la activación de C4 observada con el suero de ratón de tipo salvaje mezclado (se muestra como una línea de puntos).

Ejemplo 3

Este ejemplo describe la generación de una cepa de ratón transgénico que es MASP-2-/- murina, MAp19+/+ y que expresa un transgen de MASP-2 humano (gen inactivado de MASP-2 murina (knock-out) y gen modificado de MASP-2 humana (knock-in).

Materiales y métodos: Se construyó un minigen que codifica MASP-2 humana llamado "mini hMASP-2" (SEC ID NO: 49) como se muestra en la FIGURA 5, que incluye una región promotora del gen MASP 2 humano, incluidos los primeros 3 exones (exón 1 a exón 3) seguido de secuencia de ADNc que representa la secuencia codificadora de los siguiente 8 exones, codificando así la proteína MASP-2 de longitud total promovida por su promotor endógeno. El constructo de mini hMASP-2 se inyectó en huevos fertilizados de MASP-2-/- con el fin de reemplazar el gen MASP 2 murino deficiente por el de MASP-2 humana expresada en forma transgénica.

Ejemplo 4

Este ejemplo describe el aislamiento de la proteína MASP-2 humana en la forma de proenzima de suero humano.

Método de aislamiento de MASP-2 humana: Se ha descrito un método para aislar MASP-2 de suero humano en Matsushita et al., J. Immunol. 165:2637-2642, 2000. En síntesis, se pasa el suero humano por una columna de manano de levadura-Sepharose usando tampón de imidazol 10 mM (pH 6,0) que contiene NaCl 0,2 M, CaCh 20 mM, NPGB 0,2 mM, p-APMSFy 20 |jM y 2% mannitol. Las proenzimas MaSP-1 y MASP-2 forman complejo con MBL y se eluye con el tampón anteriormente mencionado que contiene manosa 0,3 M. Para separar las proenzimas MASP-1 y MASP-2 de MBL, se aplican preparaciones que contienen el complejo a anti-MBL-Sepharose y luego se eluyen las MASP con tampón de imidazol que contiene EDTA 20 mM y NaCl 1 M. Finalmente, las proenzimas MASP-1 y MASP-2 se separan unas de otras pasando por anti-MASP-1-Sepharose en el mismo tampón que se usó para anti-MBL-Sepharose. Se recupera la MASP-2 en los efluentes, mientras que MASP-1 se eluye con tampón de glicina 0,1 M (pH 2,2).

Ejemplo 5

Este ejemplo describe la expresión recombinante y la producción de proteínas de MASP-2 humana, de rata y murina recombinante de longitud total, polipéptidos derivados de MASP-2 y formas mutantes catalíticamente activadas de MASP-2

Expresión de MASP-2 humana, murina y de rata de longitud total:

La secuencia de ADNc de longitud total de MASP-2 humana (SEC ID NO: 4) también se subclonó en el vector de expresión mamífero pCI-Neo (Promega), que promueve la expresión eucariota bajo el control de la región del potenciador/promotor de CMV (se describe en Kaufman R.J. et al., Nucleic Acids Research 19:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-66 (1991)). El ADNc de ratón de longitud total (SEC ID N0: 50) el ADNC de MASP-2 de rata (SEC ID NO: 53) se subclonaron cada uno en el vector de expresión pED. Los vectores de expresión de MASP-2 se transfectaron luego a la línea celular de ovario de hámster chino adherente DXB1 usando el procedimiento de transfección de fosfato de calcio estándar descrito en Maniatis et al., 1989. Las células transfectadas con estos constructos se desarrollaron muy lentamente, implicando que la proteasa codificada es citotóxica.

En otro planteamiento, el constructo del minigen (SEC ID NO: 49) que contiene ADNc humano de MASP-2 promovido por su promotor endógeno se transfecta transitoriamente a células de ovario de hámster chino (CHO). La proteína MASP-2 humana se segrega en el medio de cultivo y se aísla como se describe a continuación.

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Expresión de MASP-2 catalíticamente inactiva de longitud total:

Fundamentos: La MASP-2 es activada por la escisión autocatalítica después de que los subcomponentes de reconocimiento MBL o ficolinas (o bien L-ficolina, H-ficolina o M-ficolina) se unen a su respectivo patrón de carbohidrato. La escisión autocatalítica que resulta en la activación de MASP-2 a menudo sucede durante el procedimiento de aislamiento de MASP-2 de suero, o durante la purificación que le sigue a la expresión recombinante. Con el fin de obtener una preparación de proteínas más estable para uso como antígeno, se creó una forma catalíticamente inactiva de MASP-2, diseñada como MASP-2A,que reemplaza el residuo serina que está presente en la tríada catalítica del dominio de proteasa con un residuo alanina en rata (SEC ID NO: 55 Ser617 a Ala617); en ratón (SEC ID NO: 52 Ser617 a Ala617); o en ser humano (SEC ID NO: 3 Ser618 a Ala618).

Con el fin de generar proteínas MASP-2A humanas y murinas catalíticamente inactivas, se llevó a cabo mutagénesis dirigida al sitio usando los oligonucleótidos que se exponen en la TABLA 5. Los oligonucleótidos de la TABLA 5 se diseñaron para renaturalizar a la región del ADNc humano y murino que codifica la serina enzimáticamente activa y el oligonucleótido que contienen una incompatibilidad con el fin de cambiar el codón de serina al codón de alanina. Por ejemplo, se usaron oligonucleótidos PCR de SEC ID NOS: 56-59 en combinación con ADNc de MASP-2 humana (SEC ID NO: 4) para ampliar la región desde el codón de partida hasta la serina enzimáticamente activa y desde la serina hasta el codón finalizador para generar la lectura abierta completa de la MASP-2A mutada que contiene la mutación Ser618 a Ala618. Los productos de PCR se purificaron después de la electroforesis en gel de agarosa, y se generaron superposiciones de adenosina sencillas usando un procedimiento de factor de cola estándar. La MASP-2A con cola de adenosina se clonó luego al vector pGEM-T easy, transformada en E. coli.

Se generó una proteína MASP-2A de rata catalíticamente inactiva convirtiendo a cinasa y renaturalizando la SEC ID NO: 64 y la SEC ID NO: 65 combinando estos dos oligonucleótidos en cantidades molares equivalentes, calentando a 100°C durante 2 minutos y enfriando lentamente hasta temperatura ambiente. El fragmento renaturalizado resultante tiene extremos compatibles con Pst1 y Xba1 y se insertó en lugar del fragmento Pst1-Xba1 de ADNc de MASP-2 de rata de tipo salvaje (SEC ID NO: 53) para generar MASP-2A de rata.

5 'GAGGTGACGCAGGAGGGGCATTAGTGTTT 3' (SEC ID NO: 64)

5' CTAGAAACACTAATGCCCCTCCTGCGTCACCTCTGCA 3' (SEC ID NO: 65)

Se subclonó MASP-2A humana, murina y de rata o bien en uno de los vectores de expresión de mamífero pED o pCI-Neo y se transfectó en la línea celular de ovario de hámster chino DXB1 como se describe a continuación.

En otro planteamiento, la forma catalíticamente inactiva de MASP-2 se construye usando el método descrito en Chen et al., J. Biol. Chem., 276(28):25894-25902, 2001. En síntesis, el plásmido que contiene el ADNc de MASP-2 humano de longitud total (descrito en Thiel et al., Nature 386:506, 1997) se digiere con Xho1 y EcoRI y el ADNC de MASP-2 (descrito en la presente como SEC ID NO: 4) se clona en los correspondientes sitios de restricción del vector de transferencia del baculovirus pFastBacl (Life Technologies, NY). El sitio activo de serina proteasa de MASP-2 en Ser618 se altera luego a Ala618 sustituyendo los oligonucleótidos bicatenarios que codifican el aminoácido de la región peptídica 610-625 (SEC ID NO: 13) con los aminoácidos de la región nativa 610 a 625 para crear un polipéptido de longitud total de MASP-2 con un dominio de proteasa inactiva. Construcción de plásmidos de expresión que contienen regiones de polipéptidos derivados de Masp-2 humana.

Los siguientes constructos se producen usando el péptido de señales de MASP-2 (residuos 1-15 de SEC ID NO: 5) para segregar diversos dominios de MASP-2. Se prepara un constructo que expresa el dominio humano CUBI de MASP-2 (SEC ID NO: 8) por PCR ampliando la región que codifica los residuos 1-121 de MASP-2 (SEC ID NO: 6) (correspondientes al dominio N-terminal de CUBI). Se prepara un constructo que expresa el dominio humano CUBIEGF de MASP-2 (SEC ID NO: 9) por PCR ampliando la región que codifica los residuos 1-166 de MASP-2 (SEC ID NO: 6) (correspondientes al dominio N-terminal de CUBIEGF). Se prepara un constructo que expresa el dominio humano CUBiEgFCUBII de MASP-2 (SEC ID NO: 10) por PCR ampliando la región que codifica los residuos 1-293 de MASP-2 (SEC ID NO: 6) (correspondientes al dominio N-terminal de CUBIEGFCUBII). Los dominios precedentemente mencionados se amplían por PCR usando VentR polimerasa y pBS-MASP-2 como molde, de acuerdo con métodos de PCR establecidos. La secuencia del cebador 5' del cebador sentido (5'- CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3' SEC ID NO: 34) introduce un sitio de restricción BamHI (subrayado) en el extremo 5' de los productos de PCR. Los cebadores antisentido para cada uno de los dominios de MASP-2, que se exponen a continuación en la TABLA 5 están diseñados para introducir un codón finalizador (negrita) seguido por un sitio EcoRI (subrayado) al final de cada producto de PCR. Una vez ampliados los fragmentos de ADN se digieren con BamHI y EcoRI y se clonan en los sitios correspondientes del vector pFastBacl. Los constructos resultantes se caracterizan por mapeo de restricción y se confirman por secuenciación de ADNds.

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TABLA 5: Cebadores de PCR para MASP-2

Dominio de MASP-2

Cebador PCR en 5' Cebador PCR en 3'

SEC ID NO: 8 CUBI (aa 1-121 de SEC ID NO: 6)

5 'CGGGATCCATGA GGCTGCTGACCCTC-3' (SEC ID NO: 34) 5'GGAATTCCTAGGCTGCATA (SEC ID NO: 35)

SEC ID NO: 9 CUBIEGF (aa 1-166 de SEC ID NO: 6)

5 'CGGGATCCATGA GGCTGCTGACCCTC-3' (SEC ID NO: 34) 5 'GGAATTCCTAC AGGGCGCT-3' (SEC ID NO: 36)

SEC ID NO: 10 CUBIEGFCUBII (aa 1-293 de SEC ID NO:6)

5 'CGGGATCCATGA GGCTGCTGACCCTC-3' (SEC ID NO: 34) 5 'GG AATTCCTAGTAGTGGAT 3' (SEC ID NO: 37)

SEC ID NO: 4 MASP-2 humana

5'ATGAGGCTGCTG ACCCTCCTGGGCCTTC 3' (SEC ID NO: 56) hMASP- 2 directo 5 'TT AAAATCACTAATTATG TTCTCGATC 3' (SEC ID NO: 59) hMASP-2_inverso

SEC ID NO: 4 ADNc de MASP-2 humana

5 CAGAGGTGACGC AGGAGGGGCAC 3' (SEC ID NO: 58) hMASP-2_ala_directo 5'GTGCCCCTCCTGCGTCAC CTCTG 3' (SEC ID NO: 57) hMASP- 2_ala_inverso

SEC ID N0: 50 ADNc de MASP-2 murina

5'ATGAGGCTACTC ATCTTCCTGG3' (SEC ID NO: 60) mMASP-2_directo 5 'TTAGAAATTACTTATTAT GTTCTCAATCC3' (SEC ID NO: 63) mMASP-2_inverso

SEC ID N0: 50 ADNc de MASP-2 murina

5 CCCCCCCTGCGT CACCTCTGCAG3' (SEC ID NO: 62) mMASP-2_ala_directo 5 CTGCAGAGGTGACGCAG GGGGGG 3' (SEC ID NO: 61) mMASP-2_ala_inverso

Expresión eucariota recombinante de MASP-2 y producción de proteína MASP-2A de ratón, rata y ser humano enzimáticamente inactiva

Los constructos de expresión de MASP-2 y MASP-2A anteriormente descritos se transfectaron en células DXB1 usando el procedimiento de transfección de fosfato de calcio estándar (Maniatis et al., 1989). MASP-2A se produjo en medio libre de suero para garantizar que las preparaciones no estuviesen contaminadas con otras proteínas del suero. Se cosechó el medio de células confluentes todos los segundos días (cuatro veces en total). El nivel de MASP-2A recombinante promedió en aproximadamente 1,5 mg/litro de medio de cultivo para cada una de las tres especies.

Purificación de la proteína MASP-2A: Se purificó MASP-2A (mutante Ser-Ala anteriormente descrito) por cromatografía de afinidad en columnas MBP-A-agarosa. Esta estrategia permitió la rápida purificación sin el uso de marcas externas. MASP-2A (100-200 ml de medio diluido con un volumen equivalente de tampón de carga (Tris-Cl 50 mM, pH 7,5, que contenía NaCl 150 mM y CaCl2 25 mM) se cargó a una columna de afinidad de MBP-agarosa (4 ml) pre-equilibrada con 10 ml de tampón de carga. Después de lavar con otros 10 ml de tampón de carga, la proteína se eluyó en fracciones de 1 ml con Tris-Cl 50 mM, pH 7,5, que contenía NaCl 1,25 M y EDTA 10 mM. Las fracciones que contenían MASP-2A se identificaron por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. En caso de ser necesario, se purificó MASP-2A adicionalmente por cromatografía de intercambio iónico en una columna MonoQ (HR 5/5). Se dializó la proteína con Tris-Cl 50 mM a pH 7,5, que contenía NaCl 50 mM y se cargó a una columna equilibrada en el mismo tampón. Después del lavado, se eluyó MASP-2A con un gradiente de NaCl de 0,05-1 M en 10 ml.

Resultados: Se obtuvieron rendimientos de 0,25-0,5 mg de la proteína MASP-2A a partir de 200 ml de medio. La masa molecular de 77,5 kDa determinada por MALDI-MS es mayor que el valor calculado del polipéptido no modificado (73,5 kDa) debido a la glucosilación. La unión de glicanos en cada uno de los sitios de W-glucosilación representa la masa observada. MASP-2A migra como una sola banda en los geles de SDS-poliacrilamida, demostrando que no se procesa de manera proteolítica durante la biosíntesis. La masa molecular promedio en peso determinada por ultracentrifugación de equilibrio concuerda con el valor calculado para los homodímeros del polipéptido glucosilado.

Producción de polipéptidos de MASP-2 recombinantes humanos

Otro método para producir polipéptidos recombinantes derivados de MASP-2 y MASP2A se describe en Thielens, N.M., et al., J. Immunol. 166:5068-5077, 2001. En síntesis, células de insecto Spodoptera frugiperda (células Sf9 Ready-Plaque de Novagen, Madison, WI) se desarrollan y mantienen en medio libre de suero Sf900II (Life

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Technologies) enriquecido con 50 lU/ml de penicilina y 50 mg/ml de estreptomicina (Life Technologies). Las células de insecto Trichoplusia ni (High Five) (provistas por Jadwiga Chroboczek, Institut de Biologie Structurale, Grenoble, Francia) se mantienen en medio TC100 (Life Technologies) que contiene FCS al 10% (Dominique Dutscher, Brumath, Francia) enriquecido con 50 IU/ml de penicilina y 50 mg/ml de estreptomicina. Se generan baculovirus recombinantes usando el sistema Bac-to-Bac (Life Technologies). El ADN de bácmido se purifica usando el sistema de purificación Qiagen midiprep (Qiagen) y se usa para transfectar las células de insecto Sf9 usando Cellfectin en medio SFM Sf900 II (Life Technologies) como se describe en el protocolo del fabricante. Se recogen partículas recombinantes del virus 4 días después, se titulan por ensayo de placas del virus y se amplían como lo describen King y Possee, en The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Chapman and Hall Ltd., Londres, pág. 111-114, 1992.

Las células High Five (1,75 x 107 células/175-cm2 matraz de cultivo de tejido) se infectan con los virus recombinantes que contienen los polipéptidos de MASP-2 a una multiplicidad de la infección de 2 en medio SFM Sf900 II a 28° C durante 96 h. Los sobrenadantes se recogen por centrifugación y se añade diisopropil fosforofluoridato a una concentración final de 1 mM.

Los polipéptidos de MASP-2 se segregan en el medio de cultivo. Los sobrenadantes de cultivo se dializan contra NaCl 50 mM, CaCh 1 mM, hidrocloruro de trietanolamina 50 mM, pH 8,1, y se cargan a 1,5 ml/min a una columna Q- Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech) (2,8 x 12 cm) equilibrada en el mismo tampón. La elución se realiza aplicando un gradiente lineal de 1,2 litros a NaCl 350 mM en el mismo tampón. Las fracciones que contienen los polipéptidos de MASP-2 recombinantes se identifican por análisis Western blot, se precipitan por adición de (NH4)2SO4 a 60% (p/v) y se dejan durante la noche a 4°C. Los sedimentos se resuspenden en NaCl 145 mM, CaCl2 1 mM, hidrocloruro de trietanolamina 50 mM, pH 7,4 y se aplican a una columna tSk G3000 SWG (7,5 x 600 mm) (Tosohaas, Montgomeryville, PA) equilibrada en el mismo tampón. Los polipéptidos purificados luego se concentran hasta 0,3 mg/ml por ultrafiltración en microconcentradores Microsep (p.m. límite de corte = 10.000) (Filtron, Karistein, Alemania).

Ejemplo 6

Este ejemplo describe un método para producir anticuerpos monoclonales contra polipéptidos de MASP-2.

Materiales y métodos:

Antígenos de MASP-2: Se produce antisuero de MASP-2 antihumano policlonal inmunizando a conejos con los siguientes polipéptidos de MASP-2 aislados: MASP-2 humana (SEC ID NO: 6) aislada de suero como se describe en el Ejemplo 4; MASP-2 humana recombinante (SEC ID NO: 6), MASP-2A que contiene el dominio de proteasa inactivo (SEC ID NO: 13), como se describe en los Ejemplos 4-5; y CUBI recombinante (SEC ID NO: 8), CUBEGFI (SEC ID NO: 9) y CUBeGfCUBII (SEC ID NO: 10) expresados como se describió anteriormente en el Ejemplo 5.

Anticuerpos policlonales: Conejos de seis semanas de vida, imprimados con BCG (vacuna bacillus Calmette-Guerin) se inmunizan por inyección de 100 |jg de polipéptido MASP-2 a 100 jg/ml en disolución salina estéril. Las inyecciones se aplican cada 4 semanas con titulación de anticuerpo monitoreada por ensayo ELISA como se describe en el Ejemplo 7. Se recogen sobrenadantes de cultivo para purificación de anticuerpos por cromatografía de afinidad de la proteína A.

Ejemplo 7

Este ejemplo describe un método para producir anticuerpos monoclonales murinos contra polipéptidos de MASP-2 de rata o humanos.

Materiales y métodos:

Ratones macho A/J (Harlan, Houston, Tex.), 8-12 semanas de vida, reciben inyecciones subcutáneas de 100 jg de polipéptidos rMASP-2 o rMASP-2A humanos o de rata (preparados como se describe en el Ejemplo 4 o en el Ejemplo 5) en adyuvante de Freund completo (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) en 200 jl de disolución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4. En intervalos de dos semanas, los ratones reciben dos veces inyecciones subcutáneas de 50 jg de polipéptido rMASP-2 o rMASP-2A humano o de rata en adyuvante de Freund incompleto. En la cuarta semana, los ratones reciben una inyección de 50 jg de polipéptido rMASP-2 o rMASP-2A de rata o humano en PBS y se fusionan 4 días después.

Para cada fusión, se preparan suspensiones unicelulares del bazo de un ratón inmunizado y se usan para la fusión con células de mieloma Sp2/0. Se fusionan 5x108 de las células Sp2/0, y 5x108 de las células de bazo se fusionan en medio que contiene 50% polietilenglicol (P.M. 1450) (Kodak, Rochester, N.Y.) y dimetilsulfóxido al 5% (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.). Las células luego se ajustan hasta una concentración de 1,5x105 células de bazo por 200 jl de la suspensión en medio Iscove (Gibco, Grand Island, N.Y.), enriquecido con suero bovino fetal al 10%, 100 unidades/ml de penicilina, 100 jg/ml de estreptomicina, hipoxantina 0,1 mM, aminopterina 0,4 jM y timidina 16 jM. Se añaden 200 jl de la suspensión celular a cada pocillo de aproximadamente veinte placas de microcultivo de 96 pocillos. Después de aproximadamente diez días, los sobrenadantes de cultivo se extraen para estudio de

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reactividad con el factor de MASP-2 purificado en un ensayo ELISA.

Ensayo de ELISA: Pocillos de placas de microensayo Immulon 2 (Dynatech Laboratories, Chantilly, Va.) se recubren añadiendo 50 jl de hMASP-2 purificada a 50 ng/ml de rMASP-2 rata (o rMASP-2A) durante la noche a temperatura ambiente. La baja concentración de MASP-2 para el recubrimiento permite la selección de anticuerpos de gran afinidad. Después de extraer la disolución de recubrimiento agitando la placa, se añaden 200 jl de BLOTTO (leche en polvo desnatada) en PBS a cada pocillo durante una hora para bloquear los sitios no específicos. Una hora después, los pocillos se lavan con un tampón PBST (PBS que contiene 0,05% Tween 20). Se recogen 50 jl de sobrenadantes de cultivo de cada pocillo de fusión y se mezclan con 50 jl de BLOTTO y luego se añaden a los pocillos individuales de las placas de microensayo. Después de una hora de incubación, los pocillos se lavan con PBST. Los anticuerpos murinos unidos se detectan luego por reacción con IgG antirratón de cabra conjugados con peroxidasa de rábano (HRP) (específico de Fc) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa.) y se diluyen a 1:2.000 en BLOTTO. La disolución de sustrato de peroxidasa que contiene 0,1% 3,3,5,5 tetrametil benzidina (Sigma, St. Louis, Mo.) y 0,0003% peróxido de hidrógeno (Sigma) se añade a los pocillos para desarrollo de color durante 30 minutos. La reacción finaliza por adición de 50 jl de H2SO4 2M por pocillo. Se lee la densidad óptica a 450 nm de la mezcla de reacción con una lectora de ELISA BioTek (BioTek Instruments, Winooski, Vt.).

Ensayo de unión a MASP-2:

Los sobrenadantes de cultivo con un resultado positivo en el ensayo ELISA de MASP-2 descrito anteriormente se pueden ensayar en un ensayo de unión para determinar la afinidad de unión que tienen los agentes inhibidores de MASP-2 para MASP-2. También se puede usar un ensayo similar para determinar si los agentes inhibidores se unen a otros antígenos en el sistema del complemento.

Se recubren pocillos de placas de microtitulación de poliestireno (placas de unión medianas de 96 pocillos, Coming Costar, Cambridge, MA) con MASP-2 (20 ng/100 jl/pocillo, Advanced Research Technology, San Diego, CA) en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4 durante la noche a 4°C. Después de aspirar la disolución de MASP-2, los pocillos se bloquean con PBS que contiene 1% de albúmina de suero bovino (BSA; Sigma Chemical) durante 2 h a temperatura ambiente. Los pocillos sin recubrimiento de MASP-2 sirven como controles de fondo. Alícuotas de sobrenadantes de hibridoma o MoAbs anti-MASP-2 purificados, en concentraciones variables en disolución de bloqueo, se añaden a los pocillos. Después de una incubación de 2 h a temperatura ambiente, los pocillos se enjuagan abundantemente con PBS. Se detecta MoAb anti-MASP-2 unido a MASP-2 por adición de IgG anti-ratón de cabra conjugada a peroxidasa (Sigma Chemical) en disolución de bloqueo, que se deja incubar durante

1 hora a temperatura ambiente. La placa se enjuaga nuevamente en forma abundante con PBS, y se añaden 100 jl de sustrato de 3,3',5,5'-tetrametil benzidina (TMB) (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). La reacción de TMB se inactiva por adición de 100 jl de ácido fosfórico 1M, y la placa se lee a 450 nm en una lectora de microplacas (SPECTRA MAX 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Los sobrenadantes de cultivo de las células positivas se ensayan luego por su capacidad de inhibir la activación del complemento en un ensayo funcional tal como el ensayo de escisión de C4 descrito en el Ejemplo 2. Las células en pocillos positivos se clonan luego por dilución limitativa. Se ensayan los MoAb nuevamente para reactividad con hMASP-2 en un ensayo ELISA como se describió previamente. Los hibridomas seleccionados se desarrollan en matraces giratorios y el sobrenadante de cultivo se recoge para purificación de anticuerpos por cromatografía de afinidad de la proteína A.

Ejemplo 8

Este ejemplo describe la generación de un ratón con genes inactivados MASP-2-/- que expresa MASP-2 humana para uso como modelo en el que seleccionar los agentes inhibidores de MASP-2.

Materiales y métodos: Se cruzan un ratón MASP-2-/- descrito en el Ejemplo 1 y un ratón MASP-2-/- que expresa un constructo del transgen de MASP-2 humano (genes modificados de MASP-2) descrito en el Ejemplo 3, y la progenie, que consiste en MASP-2-/- murino, MAp19+ murino, MASP-2+ murino, se usa para identificar agentes inhibidores de MaSP-2 humana.

Dichos modelos animales se pueden usar como sustratos de prueba para la identificación y eficacia de agentes inhibidores de MASP-2 tales como anticuerpos anti-MASP-2 humanos, péptidos y no péptidos inhibidores de MASP-

2 y composiciones que comprenden agentes inhibidores de MASP-2. Por ejemplo, el modelo animal se expone a un compuesto o agente que se sabe desencadena la activación del complemento dependiente de MASP-2 y un agente inhibidor de MASP-2 se administra al modelo animal en un tiempo y concentración suficientes para producir una reducción de los síntomas de la enfermedad en el animal expuesto.

Además, los ratones MASP-2-/- murino, MAp19+, MASP-2+ humano se pueden usar para generar líneas celulares que contienen uno o más tipos de células implicadas en una enfermedad asociada a MASP-2 que se pueden usar como modelo de cultivo celular para ese trastorno. La generación de líneas celulares continuas de animales transgénicos se conoce en la técnica, véase, por ejemplo Small, J.A., et al., Mol. Cell Biol., 5:642-48, 1985.

Ejemplo 9

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Este ejemplo describe un método para producir anticuerpos humanos contra MASP-2 humana en un ratón con genes inactivados de MASP-2 que expresa MASP-2 humana e inmunoglobulinas humanas.

Materiales y métodos:

Se generó un ratón MASP-2-/- como se describe en el Ejemplo 1. Se construyó luego un ratón que expresa MASP-2 humana como se describe en el Ejemplo 3. Un ratón MASP-2-/- homocigoto y un ratón MASP-2-/- que expresa MASP-2 humana se cruzan cada uno con un ratón derivado de una línea de células madre embrionaria modificada para contener alteraciones dirigidas de locus de la cadena ligera y la cadena pesada de inmunoglobulina endógena y expresión de por lo menos un segmento del locus de inmunoglobulina humana. Preferiblemente, el segmento del locus de inmunoglobulina humana incluye secuencias no reordenadas de los componentes de las cadenas pesada y ligera. Tanto la inactivación de los genes de inmunoglobulina endógena como la introducción de genes de

inmunoglobulina exógena se pueden lograr por recombinación homóloga dirigida. Los mamíferos transgénicos

resultantes de este proceso son capaces de reordenar funcionalmente las secuencias del componente de

inmunoglobulina y expresar un repertorio de anticuerpos de diversos isotipos codificados por genes de

inmunoglobulina humana, sin expresar genes de inmunoglobulina endógena.

La producción y propiedades de los mamíferos que tienen estas propiedades se describe, por ejemplo, en Thomson, A.D., Nature 148:1547-1553, 1994, y en Sloane, B.F., Nature Biotechnology 14:826, 1996. Las cepas genéticamente modificadas de ratones en los que los genes de anticuerpo de ratón son inactivados y funcionalmente reemplazados con genes de anticuerpo humano se comercializa (p. ej., XenoMousi®, disponible de Abgenix, Fremont CA). Los ratones de la descendencia resultante son capaces de producir MoAb humano contra MASP-2 humana que son adecuados para uso en terapia humana.

Ejemplo 10

Este ejemplo describe la generación y producción de anticuerpos anti-MASP-2 murinos humanizados y fragmentos de anticuerpos.

Se genera un anticuerpo monoclonal murino anti-MASP-2 en ratones macho A/J, como se describe en el Ejemplo 7. El anticuerpo murino luego se humaniza como se describe a continuación para reducir su inmunogenicidad reemplazando las regiones constantes murinas con sus contrapartes humanas para genera un fragmento de IgG y Fab quimérico del anticuerpo, que es útil para inhibir los efectos adversos de la activación del complemento dependiente de MASP-2 en sujetos humanos de acuerdo con la presente invención.

1. Clonación de genes de regiones variables anti-MASP-2 de células de hibridoma murino. Se aísla ARN total de las células de hibridoma que segregan MoAb anti-MASP-2 (obtenido como se describe en el Ejemplo 7) usando RNAzol según el protocolo del fabricante (Biotech, Houston, Tex.). El ADNc de la primera cadena se sintetiza de ARN total usando oligo dT como el cebador. Se efectúa análisis PCR usando los cebadores 3' derivados de la región C constante de inmunoglobulina, y conjuntos de cebadores degenerados derivados del péptido líder o de la primera región marco de genes Vh o Vk murinos como los cebadores 5'.

El análisis de PCR anclado se lleva a cabo como lo describen Chen y Platsucas (Chen, P.F., Scancl. J. Immunol. 35:539-549, 1992). Para la clonación del gen Vk, se prepara ADNc bicatenario usando un cebador Not1-MAK1 (5 '- TGCGGCCGCTGTAGGTGCTGTCTTT-3' SEC ID NO: 38). Los adaptadores renaturalizados ADI (5'- GGAATTCACTCGTTATTCTCGGA-3' SEC ID NO: 39) y AD2 (5'-TCCGAGAATAACGAGTG-3' SEC ID N0: 40) se ligan a ambos términos 5' y 3' del ADNc bicatenario. Los adaptadores en los extremos 3' se extraen por digestión de Not1. El producto digerido luego se usa como molde en PCR con el oligonucleótido AD1 como el cebador 5' y MAK2 (5'-CATTGAAAGCTTTGGGGTAGAAGTTGTTC-3' SEC ID NO: 41) como el cebador 3'. Los fragmentos de ADN de aproximadamente 500 bp se clonan en pUC19. Se seleccionan varios clones para análisis de secuencias a fin de verificar que la secuencia clonada abarque la región constante de inmunoglobulina murina esperada. Los

oligonucleótidos Not1-MAK1 y MAK2 derivan de la región Vk y tienen 182 y 84 bp, respectivamente, en dirección 3'

del primer par de bases del gen C kappa. Se eligen clones que incluyen Vk completo y el péptido líder.

Para la clonación del gen Vh, se prepara ADNc usando el cebador Not1 MAG1 (5'-

CGCGGCCGCAGCTGCTCAGAGTGTAGA-3' SeC iD NO: 42). Los adaptadores renaturalizados ADI y AD2 se ligan a ambos términos 5' y 3' del ADNc bicatenario. Los adaptadores en los extremos 3' se extraen por digestión de Not1. El producto digerido se usa como molde en PCR con el oligonucleótido AD1 y MAG2 (5'-

CGGTAAGCTTCACTGGCTCAGGGAAATA-3' SEC ID NO: 43) como cebadores. Los fragmentos de ADN de 500 a 600 bp de longitud se clonan en pUC19. Los oligonucleótidos Not1-MAG1 y MAG2 derivan de la región Cy.7.1 murina y tienen 180 y 93 bp, respectivamente, en dirección 3' desde el primer bp del gen Cy.7.1 murino. Se eligen clones que incluyen el Vh completo y el péptido líder.

2. Construcción de vectores de expresión para IgG y Fab de MASP-2 quiméricos. Se usaron los genes Vh y Vk clonados anteriormente descritos como moldes en una reacción PCR para añadir el consenso Kozak al extremo 5' y el donante de empalme al extremo 3' de la secuencia de nucleótidos. Después de analizar las secuencias para confirmar la ausencia de errores de la reacción PCR, los genes Vh y Vk se insertan en cassettes de vectores de expresión que contienen C.y1 y C. kappa humanos, respectivamente, para dar pSV2neoVH-huCY1 y pSV2neoV-

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huCY. Los ADN de plásmido purificados en gradientes de CsCI de los vectores de cadena pesada y ligera se usan para transfectar células COS por electroporación. Después de 48 horas, el sobrenadante de cultivo se ensaya por ELISA para confirmar la presencia de aproximadamente 200 ng/ml de IgG quimérica. Las células se cosechan y se prepara ARN total. El ADNc de la primera cadena se sintetiza a partir del ARN total usando oligo dT como el cebador. Este ADNc se usa como molde en la reacción PCR para generar los fragmentos de ADN, Fd y kappa. Para el gen Fd, se lleva a cabo una reacción PCR usando 5'-AAGAAGCTTGCCGCCACCATGGATTGGCTGTGGAACT-3' (SEC ID NO: 44) como el cebador 5' y un cebador 3' derivado de CH1 (5'-

CGGGATCCTCAAACTTTCTTGTCCACCTTGG-3' SEC ID NO: 45). Se confirma que la secuencia de ADN contiene Vh y Vk y el dominio CH1 de IgG1 humana. Después de la digestión con las enzimas correctas, los fragmentos de ADN Fd se insertan en los sitios de restricción Hindlll y BamHI del cassette del vector de expresión pSV2dhfr-TUS para dar pSV2dhfrFd. El plásmido pSV2 se comercializa y consiste en segmentos de ADN de diversas fuentes: ADN pBR322 (línea delgada) contiene el origen pBR322 de replicación de ADN (pBR ori) y el gen de resistencia a lactamasa ampicilina (Amp); ADN SV40, representado por sombreado y marcado más gruesos, contiene el origen SV40 de replicación de aDn (SV40 ori), promotor temprano (5' a los genes dhfr y neo), y la señal de poliadenilación (3' a los genes dhfr y neo). La señal de poliadenilación derivada de SV40 (pA) también está dispuesta en el extremo 3' del gen Fd.

Para el gen kappa, se lleva a cabo reacción PCR usando 5'-A AG A A AGCTTGCCGCC ACC ATGTTCTC ACT AGCTCT - 3' (SEC ID NO: 46) como el cebador 5' y un cebador 3' derivado de Ck (5'-

CGGGATCCTTCTCCCTCTAACACTCT-3' SEC ID NO: 47). Se confirma que la secuencia de ADN contiene las regiones Vh completa y Vk humana. Después de la digestión con enzimas de restricción correctas, los fragmentos de ADN kappa se insertan en los sitios de restricción Hindlll y BamHI del cassette del vector de expresión pSV2neo- TUS para dar pSV2neoK. La expresión de ambos genes Fd y .kappa es promovida por elementos potenciadores y promotores derivados de HCMV. Ya que el gen Fd no incluye el residuo de aminoácidos cisteína implicado en el enlace disulfuro intercadenas, este Fab quimérico recombinante contiene cadenas pesada y ligera no covalentemente unidas. Este Fab quimérico está diseñado como cFab.

Para obtener Fab recombinante con un enlace disulfuro inter-cadena pesada y ligera, el gen Fd anteriormente mencionado se puede extender para incluir la secuencia codificadora de 9 aminoácidos adicionales (EPKSCDKTH SEC ID NO: 48) de la región bisagra de IgG1 humana. El segmento de ADN BstEII-BamHI que codifica 30 aminoácidos en el extremo 3' del gen Fd se puede reemplazar con los segmentos de ADN que codifican el Fd extendido, resultando en pSV2dhfrFd/9aa.

3. Expresión y purificación de IgG anti-MASP-2 quimérica

Para generar líneas celulares que segregan IgG anti-MASP-2 quimérica, se transfectan células NSO con ADN de plásmido purificado de pSV2neoVH-huC.Yl y pSV2neoV-huC kappa por electroporación. Las células transfectadas se seleccionan en presencia de 0,7 mg/ml G4l8. Las células se desarrollan en un matraz giratorio de 250 ml usando medio que contiene suero.

El sobrenadante de cultivo de un matraz de cultivo centrífugo de 100 ml se carga en una columna de 10 ml PROSEP-A (Bioprocessing, Inc., Princeton, N.J.). La columna se lava con 10 volúmenes de lecho de PBS. El anticuerpo unido se eluye con tampón de citrato 50 mM, pH 3,0. Se añade un volumen equivalente de Hepes 1 M, pH 8,0 a la fracción que contiene el anticuerpo purificado para ajustar el pH a 7,0. Se extraen las sales residuales por intercambio de tampones con PBS por ultrafiltración de la membrana Millipore (P.M. valor de corte: 3.000). La concentración de proteína del anticuerpo purificado se determina por el método BCA (Pierce).

4. Expresión y purificación de Fab anti-MASP-2 quimérico

Para generar líneas celulares que segregan Fab anti-MASP-2 quimérico, se transfectan células CHO con ADN de plásmido purificado de pSV2dhfrFd (o pSV2dhfrFd/9aa) y pSV2neokappa, por electroporación. Las células transfectadas se seleccionan en presencia de G418 y metotrexato. Las líneas celulares seleccionadas se amplían en concentraciones en aumento de metotrexato. Las células se subclonan en forma unicelular por dilución limitativa. Las líneas celulares subclonadas unicelulares de gran producción se desarrollan luego en un cultivo giratorio de 100 ml que usa medio libre de suero.

Se purifica Fab anti-MASP-2 quimérico por cromatografía de afinidad, usando un MoAb anti-idiopático de ratón a MoAb de MASP-2. Un MoAB de MASP-2 anti-idiopático se puede preparar inmunizando a ratones con MoAb anti- MASP-2 murino conjugado con hemocianina de lapa californiana (KLH) y seleccionando la unión de MoAb específica que se puede completar con MASP-2 humana. Para la purificación, 100 ml de sobrenadante de cultivos giratorios de células CHO que producen cFab o cFab/9aa se cargan a una columna de afinidad acoplada con un MoAb de MASP- 2 anti-idiotipo. La columna luego se lava a fondo con PBS antes de eluir el Fab unido con dietilamina 50 mM, pH 11,5. Se extraen las sales residuales por intercambio de tampones como se describió precedentemente. La concentración de proteína del Fab purificado se determina por el método BCA (Pierce).

La capacidad de la IgG de MASP-2 quimérica, cFab y cFAb/9aa para inhibir las vías del complemento dependientes de MASP-2 se puede determinar usando los ensayos que se describen en el Ejemplo 2.

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Ejemplo 11

Este ejemplo describe un ensayo de escisión de C4 in vitro que se utiliza como estudio funcional para identificar agentes inhibidores de MASP-2 capaces de bloquear la activación del complemento dependiente de MASP-2-vía L- ficolina/P35, H-ficolina, M-ficolina o manano.

Ensayo de escisión de C4: Un ensayo de escisión de C4 ha sido descrito por Petersen, S.V., et al., J. Immunol. Methods 257:107, 2001, el cual mide la activación de la vía de lectinas resultante de ácido lipoteicoico (LTA) de S. aureus que se une a L-ficolina.

Reactivos: Se prepara S. aureous (DSM20233) fijada a formalina de la siguiente manera:

se desarrollan bacterias durante toda la noche a 37°C en medio de sangre y soja tríptico, se lava tres veces con PBS, luego se fija durante 1 h a temperatura ambiente en PBS/0,5% formalina y se lava otras tres veces con PBS, antes de resuspenderse en tampón de recubrimiento (Na2CO315 mM, NaHCO3 35 mM, pH 9,6).

Ensayo: Los pocillos de una placa de microtitulación Nunc MaxiSorb (Nalgene Nunc International, Rochester, NY) se recubren con: 100 jl de S. aureus DSM20233 fijada a formalina (OD550 = 0,5) en tampón de recubrimiento con 1 |jg de L-ficolina en tampón de recubrimiento.

Después de incubar durante toda la noche, los pocillos se bloquean con albúmina de suero humano al 0,1% (HSA) en TBS (Tris-HCl 10 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4), luego se lavan con TBS que contiene 0,05% Tween 20 y CaCl2 5 mM (tampón de lavado). Las muestras de suero humano se diluyen en Tris-HCl 20 mM, NaCl 1 M, CaCl210 mM, 0,05% Triton X-100, 0,1% HSA, pH 7,4, lo que previene la activación de C4 endógena y disocia el complejo C1 (compuesto por C1q, C1r y C1s). Los agentes inhibidores de MASP-2, incluidos MoAb anti-MASP-2 y péptidos inhibidores se añaden a las muestras de suero en concentraciones variables. Las muestras diluidas se añaden a la placa y se incuban durante la noche a 4° C. Después de 24 horas, las placas se lavan a fondo con tampón de lavado, luego se añaden a cada pocillo 0,1 jg de C4 humana purificada (obtenida como se describe en Dodds, A.W., Methods Enzymol. 223:46, 1993) en 100 (jl de barbital 4 mM, NaCl 145 mM, CaCh 2 mM, MgCh 1 mM, pH 7,4. Después de 1,5 h a 37°C, las placas se lavan nuevamente y se detecta la deposición de C4b usando C4c antihumano de pollo conjugado a fosfatasa alcalina (se obtiene de Immunsystem, Uppsala, Suecia) y se mide usando el sustrato colorimétrico fosfato de p-nitrofenilo.

Ensayo de C4 en manano: El ensayo anteriormente descrito se adapta para medir la activación de la vía de lectinas mediante MBL recubriendo la placa con LSP y manano antes de añadir suero mezclado con diversos agentes inhibidores de MASP-2.

Ensayo de C4 en H-ficolina (Hakata Ag): El ensayo anteriormente descrito se adapta para medir la activación de la vía de lectinas mediante H-ficolina recubriendo la placa con LPS y H-ficolina antes de añadir suero mezclado con diversos agentes inhibidores de MASP-2.

Ejemplo 12

El siguiente ensayo demuestra la presencia de activación de la vía clásica en ratones de tipo salvaje y MASP-2-/-.

Métodos: Se generaron complejos inmunes in situ recubriendo placas de microtitulación (Maxisorb, Nunc, cat. No. 442404, Fisher Scientific) con 0,1% de albúmina de suero humana en Tris 10 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4 durante 1 hora a temperatura ambiente seguido de incubación durante la noche a 4°C con antisuero de suero completo anti oveja (Scottish Antibody Production Unit, Carluke, Escocia) diluido 1:1000 en TBS/tween/Ca2+. Las muestras de suero se obtuvieron de ratones de tipo salvaje y MASP-2-/- y se añadieron a las placas recubiertas. Se prepararon muestras control en las que C1q se despojó de las muestras de suero de tipo salvaje y MASP-2-/-. El suero de ratón despojado de C1q se preparó usando Dynabeads acoplada a proteína A (Dynal Biotech, Oslo, Noruega) recubierta con C1q IgG antihumana de conejo (Dako, Glostrap, Dinamarca), según las instrucciones del proveedor. Las placas se incubaron durante 90 minutos a 37°C. El C3b unido se detectó con un anticuerpo policlonal anti-C3c humano (Dako A 062) diluido en TBS/tw/ Ca++ a 1:1000. El anticuerpo secundario es IgG anti-conejo de cabra.

Resultados: La FIGURA 9 expone los niveles relativos de deposición de C3b en placas recubiertas con IgG en suero de tipo salvaje, suero de MASP-2-/-, suero de MASP-2-/- despojado de C1q de tipo salvaje y suero de MASP-2-/- despojado de C1q. Estos resultados demuestran que la vía clásica está intacta en la cepa de ratón MASP-2-/-.

Ejemplo 13

El siguiente ensayo se usa para estudiar si un agente inhibidor de MASP-2 bloquea la vía clásica, analizando el efecto de un agente inhibidor de MASP-2 bajo condiciones en las que la vía clásica es iniciada por complejos inmunes.

Métodos: Para ensayar el efecto de un agente inhibidor de MASP-2 en condiciones de activación del complemento en las que la vía clásica es iniciada por complejos inmunes, muestras de 50 jl por triplicado que contienen 90% NHS se incuban a 37°C en presencia de 10 jg/ml de complejo inmune (IC) o PBS, y también se incluyen muestras por

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triplicado paralelas (+/-IC) que contienen anticuerpo monoclonal anti-properdina 200 nM durante la incubación a 37°C. Después de una incubación de dos horas a 37°C, se añade EDTA 13 mM a todas las muestras para detener la activación adicional del complemento, y las muestras se enfrían inmediatamente a 5°C. Las muestras luego se conservan a -70°C antes de ensayarse para productos de activación del complemento (C3a y sC5b-9) usando kits ELISA (Quidel, Catálogos núm. A015 y A009) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 14

Este ejemplo demuestra que el sistema de activación del complemento de MASP-2 dependiente de lectinas se activa en la fase de isquemia/reperfusión que le sigue a una reparación de aneurisma aórtico abdominal.

Fundamento y diseño experimental: Los pacientes que se someten a una reparación de aneurisma aórtico abdominal (aAa) están sujetos a una lesión de isquemia-reperfusión, que es mediada en gran medida por la activación del complemento. Investigamos la función de la vía de activación del complemento de lectinas dependiente de MASP-2 en lesión de isquemia y reperfusión en pacientes que se someten a una reparación de AAA. El consumo de lectina de unión a manano (MBL) en suero se usó para medir la cantidad de activación de la vía de lectinas dependiente de MASP-2 que ocurrió durante la reperfusión.

Aislamiento de muestras del suero de pacientes: Se incluyó en este estudio un total de 23 pacientes que se sometieron a reparación de AAA infrarrenal electiva y 8 pacientes control que se sometieron a cirugía abdominal mayor.

Para los pacientes que se sometieron a reparación de AAA, se tomaron muestras de sangre sistémicas de la arteria radial de cada paciente (con una vía arterial) en cuatro puntos de tiempo definidos durante el procedimiento: punto de tiempo 1: inducción de anestesia; punto de tiempo 2: justo antes del pinzamiento arterial; punto de tiempo 3: justo antes de la extracción de la pinza aórtica; y punto de tiempo 4: durante la reperfusión.

Para los pacientes control que se sometieron a cirugía abdominal mayor, se tomaron muestras de sangre sistémicas en la inducción de la anestesia y dos horas después del comienzo del procedimiento.

Ensayo de los niveles de MBL: Se ensayó la muestra de plasma de cada paciente para niveles de lectina unida a manano (MBL) usando técnicas de ELISA.

Resultados: Los resultados de este estudio se exponen en la FIGURA 10, que presenta un gráfico que muestra el cambio medio en porcentaje en los niveles de MBL (eje y) en cada uno de los diversos puntos de tiempo (eje x). Los valores de partida para MBL son 100%, en donde se muestran reducciones relativas en lo sucesivo. Como se muestra en la FIGURA 10, los pacientes con AAA (n=23) exhiben una reducción significativa en los niveles de MBL en plasma, promediando aproximadamente 41% de reducción al momento de la isquemia/reperfusión que le sigue a AAA. En contraste, en pacientes control (n=8) sometidos a cirugía abdominal mayor, se observó solamente un consumo leve de MBL en las muestras de plasma.

Los datos presentados proveen una fuerte indicación de que la vía de lectinas dependiente de MASP-2 del sistema del complemento se activa en la fase de isquemia/reperfusión que le sigue a la reparación de AAA. La reducción de los niveles de MBL parece estar asociada a la lesión de isquemia-reperfusión porque los niveles de MBL caen significativa y rápidamente cuando el vaso mayor pinzado se reperfunde después del final de la operación. En contraste, los sueros control de pacientes que se someten a cirugía abdominal mayor sin un ataque de isquemia- reperfusión importante solamente exhiben una ligera disminución de los niveles de MBL en plasma. En vista de la contribución bien establecida de la activación del complemento en la lesión de reperfusión, concluimos que la activación de la vía de lectinas dependiente de MASP-2 en células endoteliales isquémicas es un factor importante en la patología de la lesión de isquemia/reperfusión. Por consiguiente, se esperaría que un bloqueo o una reducción transitoria en la vía de lectinas dependiente de MASP-2 de la activación del complemento tuviese un impacto terapéutico beneficioso significativo para mejorar el resultado de los procedimientos clínicos y de las enfermedades que implican ataque isquémico transitorio, p. ej., infarto de miocardio, infarto de intestino, quemaduras, trasplantes y accidentes cerebrovasculares.

Ejemplo 15

Este ejemplo describe un ensayo que mide la activación de neutrófilos que es útil como indicador de una dosis eficaz de un agente inhibidor de MASP-2 para el tratamiento de afecciones asociadas con la vía dependiente de lectinas de acuerdo con los métodos de la invención.

Métodos: Un método para medir la elastasa de los neutrófilos ha sido descrito en Gupta-Bansal, R., et al., Molecular Immunol. 37:191-201, 2000. En resumen, el complejo de elastasa y a1-antitripsina del suero se mide con un ensayo sándwich de dos sitios que utiliza anticuerpos contra elastasa y a-i-antitripsina. Se recubren placas de microtitulación de poliestireno con una dilución 1:500 de anticuerpo de elastasa antihumano (The Binding Site, Birmingham, Reino Unido) en PBS durante la noche a 4°C. Después de aspirar la disolución de anticuerpos, los pocillos se bloquean con PBS que contiene 0,4% HAS durante 2 h a temperatura ambiente. Se añaden a los pocillos alícuotas (100 jl) de muestras de plasma que son tratadas con o sin un agente inhibidor de MASP-2. Después de una incubación de a 2 h

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a temperatura ambiente, los pocilios se enjuagan abundantemente con PBS. El complejo de elastasa-ai-antitrisina ligado se detecta por adición de una dilución 1:500 de anticuerpo a1-antitripsina conjugado a peroxidasa en disolución de bloqueo que se deja incubar por 1 h a temperatura ambiente. Después de lavar la placa con PBS, se añaden alícuotas de 100 pl de sustrato TMB. La reacción de TMB se inactiva por adición de 100 pl de ácido fosfórico, y la placa se lee a 450 nm en una lectora de microplacas.

Ejemplo 16

Este ejemplo describe un modelo animal para ensayar agentes inhibidores de MASP-2 útiles para tratar la isquemia de miocardio/reperfusión.

Métodos: Un modelo de isquemia de miocardio-reperfusión ha sido descrito por Vakevaetal., Circulation 97:2259- 2267, 1998, y Jordan et al., Circulation 104(12): 1413-1418, 2001. El modelo descrito se puede modificar para uso en ratones MASP-2-/- y MASP-2+/+ de la siguiente manera. En resumen, se anestesian ratones macho adultos. Se canulan la vena yugular y la tráquea, y se mantiene la ventilación con 100% oxígeno con un ventilador para roedores ajustado para mantener el CO2 exhalado entre 3,5% y 5%. Se realiza una toracotomía izquierda y se coloca una sutura a 3 o 4 mm del origen de la arteria coronaria izquierda. Cinco minutos antes de la isquemia, los animales reciben el agente inhibidor de MASP-2, tal como anticuerpos anti-MASP-2 (p. ej., en un intervalo de dosis entre 0,01 y 10 mg/kg). Se inicia entonces la isquemia ajustando la sutura alrededor de la arteria coronaria y se mantiene durante 30 minutos, seguida por cuatro horas de reperfusión. Los animales con operación simulada se preparan de manera idéntica sin ajuste de la sutura.

Análisis de deposición de C3 del complemento: Después de la reperfusión, las muestras para inmunohistoquímica se obtienen de la región central del ventrículo izquierdo, se fijan y se congelan a -80°C hasta procesarse. Los cortes de tejido se incuban con anticuerpo de C3 antirrata de cabra conjugado a HRP. Los cortes de tejido se analizan para presencia de tinción de C3 en presencia de agentes inhibidores anti-MASP-2 según lo comparado con los animales control con operación simulada y los animales MASP-2-/- para identificar los agentes inhibidores de MASP-2 que reducen la deposición de C3 in vivo.

Ejemplo 17

Este ejemplo describe el uso de la cepa de MASP-2-/- como un modelo animal para ensayar los agentes inhibidores de MASP-2 por su capacidad de proteger el tejido trasplantado contra lesión de isquemia/reperfusión.

Antecedentes/Fundamentos: Se sabe que la lesión de isquemia/reperfusión ocurre en el órgano de un donante durante el trasplante. El grado de daño al tejido se relaciona con la longitud de la isquemia y es mediado por el complemento, como lo demuestran diversos modelos y el uso de los agentes inhibidores del complemento como el receptor soluble de tipo 1 (CR1) (Weisman et al., Science 249:146-151, 1990; Mulligan et al., J. Immunol. 148:1479- 1486, 1992; Pratt et al., Am. J. Path. 163(4):1457-1465, 2003). Se ha descrito un modelo animal para trasplante por Pratt et al., Am. J. Path. 163(4): 1457-1465, que se puede modificar para uso con el modelo de ratón MaSp-2-/- y/o para uso como sistema del modelo a MASP-2+/+ en el que seleccionar agente inhibidores de MASP-2 por su capacidad de proteger el tejido trasplantado de lesión de isquemia/reperfusión. La purga del riñón del donante con el fluido de perfusión antes del trasplante proporciona una oportunidad de introducir agentes inhibidores anti-MASP-2 en el riñón del donante.

Métodos: Se anestesian ratones MASP-2-/- y/o MASP-2+/+. El riñón izquierdo del donante se diseca y la aorta se liga en sentido cefálico y caudal hacia la arteria renal. Un catéter Portex (Portex Ltd, Hythe, Reino Unido) se inserta entre las ligaduras y el riñón se perfunde con 5 ml de disolución de perfusión renal Soltran (Baxter Health Care, Reino Unido) que contiene agentes inhibidores de MASP-2 tales como anticuerpos monoclonales anti-MASP-2 (en un intervalo de dosis de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg) por un periodo de por lo menos 5 minutos. El trasplante renal se realiza luego y los ratones se controlan con el transcurso del tiempo.

Análisis de receptores de trasplantes: Se cosechan trasplantes renales en distintos intervalos de tiempo y se analizan los cortes de tejido usando anti-C3 para determinar el grado de deposición de C3.

Ejemplo 18

Este ejemplo describe el uso de un anillo tubular como modelo para ensayar agentes inhibidores de MASP-2 útiles para prevenir el daño al tejido resultante de la circulación extracorpórea (ECC) como un circuito de derivación a cardiopulmonar (CPB).

Antecedentes y fundamentos: Como se describió anteriormente, los pacientes que se someten a ECC durante un CPB sufren una reacción inflamatoria sistémica, que es en parte causada por la exposición de la sangre a las superficies artificiales del circuito extracorpóreo, pero además por factores independientes de la superficie como traumatismo quirúrgico y lesión de isquemia-reperfusión (Butler, J., et al., Ann. Thorac. Surg. 55:552-9, 1993; Edmunds, L.H., Ann. Thorac. Surg. 66 (Supl):S12-6, 1998; Asimakopoulos, G., Perfusión 14:269-77, 1999). También se ha demostrado que la vía del complemento alternativa cumple una función predominante en la activación del complemento en circuitos de CPB, resultante de la interacción de la sangre con las superficies artificiales de los

circuitos de CPB (véase Kirklin et al., 1983, 1986, anteriormente analizado). En consecuencia, en base a las observaciones descritas en este documento de que la MASP-2 cumple una función esencial en la inhibición de las vías de lectinas y alternativa, el anillo tubular es útil para seleccionar agentes inhibidores de MASP-2 eficaces para uso como agentes terapéuticos con el fin de prevenir o tratar una reacción inflamatoria desencadenada por 5 exposición extracorpórea.

Métodos: Se utiliza una modificación de un anillo tubular previamente descrito para circuitos de derivación cardiopulmonar (véase Gong et al., .J. Clinical Immunol. 16(4):222-229 (1996)) como se describe en Gupta-Bansal et al., Molecular Immunol. 37:191-201 (2000). En síntesis, se extrae sangre de un sujeto sano en un tubo Vacutanier de 7 ml (que contiene 7 unidades de heparina por ml de sangre completa). Un tubo de polietileno similar al que se usa 10 en los procedimientos de CPB (p. ej., I.D. 2,92 mm; O.D. 3,73 mm, longitud: 45 cm) se rellena con 1 ml de sangre y se cierra en un bucle con una pieza corta de un tubo de silicona. Un tubo control que contiene sangre heparinizada con EDTA 10 mM se incluyó en el estudio como control de fondo. La muestra y los tubos control se giraron verticalmente en un baño de agua durante 1 hora a 37° C. Después de la incubación, las muestras de sangre se transfirieron a tubos micrófugos de 1,7 ml que contenían EDTA, resultando en una concentración final de EDTA 20 15 mM. Las muestras se centrifugaron y se recogió el plasma. Se añaden agentes inhibidores de MASP-2, tales como anticuerpos anti-MASP-2 a la sangre heparinizada inmediatamente antes de la rotación. Las muestras de plasma se someten luego a ensayos para medir la concentración de C3a y C5b-9 soluble como se describe en Gupta-Bansal et al., 2000, supra.

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   1. Un agente inhibidor de MASP-2 que inhibe selectivamente la activación del complemento dependiente de MASP-2 sin inhibir sustancialmente la activación del complemento dependiente de C1q que es un anticuerpo anti-MASP-2 o un fragmento del mismo que se une específicamente a una parte de la secuencia SEQ ID NO: 6, para su uso en la inhibición de la restenosis que sigue a un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en colocación de un stent, aterectomía rotacional y/o angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA).
2. 2. Un agente inhibidor de MASP-2 para el uso según la reivindicación 1, donde el agente inhibidor de MASP-2 se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 6.
3. 3. Un agente inhibidor de MASP-2 para el uso según la reivindicación 2, donde el agente inhibidor de MASP-2 se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 6 con una afinidad al menos 10 veces mayor que la afinidad con la que se une a un antígeno diferente en el sistema complementario.
4. 4. Un agente inhibidor de MASP-2 para el uso según cualquier reivindicación precedente, donde el agente inhibidor de MASP-2 se une a un polipéptido que se encuentra en una posición entre los restos aminoácidos 1-176 de la secuencia SEQ ID NO: 6.
5. 5. Un agente inhibidor de MASP-2 para el uso según cualquier reivindicación precedente, donde el anticuerpo anti- MASP-2 es monoclonal.
6. 6. Un agente inhibidor de MASP-2 para el uso según cualquier reivindicación precedente, donde el anticuerpo anti- MASP-2 es recombinante.
7. 7. Un agente inhibidor de MASP-2 para el uso según cualquier reivindicación precedente, donde el anticuerpo anti- MASP-2 tiene una función efectora reducida.
8. 8. Un agente inhibidor de MASP-2 para el uso según cualquier reivindicación precedente, donde el anticuerpo anti- MASP-2 del mismo es quimérico humanizado o humano.
9. 9. Un agente inhibidor de MASP-2 para el uso según cualquier reivindicación precedente, donde el anticuerpo anti- MASP-2 se produce en un animal transgénico deficiente en MASP-2.
10. 10. Un agente inhibidor de MASP-2 para el uso según cualquier reivindicación precedente, donde el agente es para el uso en administración intra-arterial, intravenosa, intratecal, intracraneal o intramuscular.
11. 11. Un agente inhibidor de MASP-2 para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde el agente inhibidor de MASP-2 es para el uso enr administración subcutánea.
12. 12. Un agente inhibidor de MASP-2 para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde el agente inhibidor de MASP-2 se reviste sobre o se incorpora sobre o dentro de una superficie de un dispositivo implantable.
13. 13. Un agente inhibidor de MASP-2 para el uso según la reivindicación 12, donde el agente inhibidor de MASP-2 se reviste sobre o se incorpora sobre o dentro de una superficie de un stent de manera que el stent eluya el agente inhibidor de MASP-2 después de la colocación vascular.
14. 14. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-MASP-2 inhibidor de MASP-2 o un fragmento del mismo que se une específicamente a una pate de la secuencia SEQ ID NO: 6 e inhibe selectivamente la activación del complemento dependiente de MASP-2 sin inhibir sustancialmente la activación del complemento dependiente de C1q y un vehículo farmacéuticamente aceptable para el mismo para el uso en la inhibición de la restenosis que sigue a un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en colocación de un stent, aterectomía rotacional y/o angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA).
15. 15. Una composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 10, en donde el agente inhibidor de MASP-2 es como se ha descrito en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9.

    imagen1

    Vía clásica

    Vía de lectinas

    MBL o Ficolinas

    Vía alternativa1

    Convertasa C3

    Convertasa C5

    imagen2

    imagen3

    imagen4

    imagen5

    j:- .io'< i.: ''L; dominios >

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    S

    J

    dominio sema proteasa

    imagen6

    imagen7

    positivo

    mi m

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    Estructura

    gemca dei

    » me

    m m tur m mc

    gen MASP2

    de ratón

    fflf

    Tipo salvaje

    Cromosoma

    4 ratón)

    Ta: gen timidmacmasa

    pKO-NTKV 1901

    NEO: gen de resistencia

    Constructo

    MI

    del gen mactivado

    MIASP-2 clonado

    marcador de

    (para Unearizar)

    marcador de

    selección

    s elección

    HliM

    negativo

    MI

    Mí

    después de

    recombmacion

    homologa

    Resultado de análisis

    sonda NEO

    Southern para ES

    diana de 5,6 kb

    sonda cassette B sonda externa

    [ tipo salvaje 3,3 kb

    I diana 3 kb MI

    diana 10 kb

    sitios de restricción externos

    al evento propuesto

    tipo salvaje 12 kb

    Exones fl ¡} £ d +ADNc

    mdominio (M CWÍtipoM CCPl m dominio serina proteasa

    imagen8

    Intrones IJ ¡W Ill(¡ región 3'UT de

    ARNm MASP-2

    imagen9

    imagen10

    imagen11

    imagen12

    ^3

    imagen13

    imagen14

    i+m

    Activación de C4 relativa

    imagen15

    imagen16

    imagen17

    imagen18

    imagen19

    imagen20

    mitrar </<}

    imagen21

    i,5 1,7 1,9 2,1 2,1 7,) 2,1 2,9 1,1 1,1 5,5

    dilución logarítmica en plasma

    imagen22

    imagen23

    AAA (n=23)

    Controles (n=8)

    Inducción Pre-pmzamiento Isquemia

    Reperfusion