ES2671644T3 - Antibody Conjugate - Drug - Google Patents
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Abstract
Un conjugado de anticuerpo - fármaco en el que un compuesto antitumoral representado por la siguiente fórmula:**Fórmula** está conjugado con un anticuerpo por medio de un enlazador que tiene una estructura representada por la siguiente fórmula: -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lcen el que el anticuerpo está conectado al extremo terminal de L1, el compuesto antitumoral está conectado al extremo terminal de Lc con el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 como la posición de conexión, en el que n1 representa un número entero de 0 a 6, L1 representa-(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(>=O)-, -CH2-C(>=O)-NH-(CH2)n3-C(>=O)-, -C(>=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-, o -C(>=O)-(CH2)n4-C(>=O)-, en el que n2 representa un número entero de 2 a 8, n3 representa un número entero de 1 a 8, n4 representa un número entero de 1 a 8, L2 representa -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(>=O)-, -S-(CH2)n6-C(>=O)-, o un enlace sencillo, en el que n5 representa un número entero de 1 a 6, n6 representa un número entero de 1 a 6, LP representa un residuo de tetrapéptido de GGFG, La representa -O- o un enlace sencillo, Lb representa -CR2(-R3)- o un enlace sencillo, en el que R2 y R3 representan cada uno independientemente un átomo de hidrógeno, Lc representa -C(>=O)-, -(Succinimid-3-il-N)- tiene una estructura representada por la siguiente fórmula:**Fórmula** que está conectado al anticuerpo en la posición 3 del mismo y está conectado a un grupo metileno en la estructura de enlazador que contiene esta estructura en el átomo de nitrógeno en la posición 1, -(N-li-3-diminiccuS)- tiene una estructura representada por la siguiente fórmula:**Fórmula** que está conectado a L2 en la posición 3 del mismo y está conectado a un grupo metileno en la estructura de enlazador que contiene esta estructura en el átomo de nitrógeno en la posición 1, cic.Hex(1,4) representa un grupo 1,4-ciclohexileno y, cuando L2 es -S-(CH2)n6-C(>=O)-, L1 es -C(>=O)-cic.Hex(1,4)- CH2-(N-li-3-diminiccuS)-.An antibody-drug conjugate in which an antitumor compound represented by the following formula: ** Formula ** is conjugated to an antibody by means of a linker having a structure represented by the following formula: -L1-L2-LP- NH- (CH2) n1-La-Lb-Lcen where the antibody is connected to the terminal end of L1, the antitumor compound is connected to the terminal end of Lc with the nitrogen atom of the amino group at position 1 as the position of connection, in which n1 represents an integer from 0 to 6, L1 represents- (Succinimid-3-yl-N) - (CH2) n2-C (> = O) -, -CH2-C (> = O) -NH- (CH2) n3-C (> = O) -, -C (> = O) -cic.Hex (1,4) -CH2- (N-li-3-diminiccuS) -, or -C ( > = O) - (CH2) n4-C (> = O) -, in which n2 represents an integer from 2 to 8, n3 represents an integer from 1 to 8, n4 represents an integer from 1 to 8 , L2 represents -NH- (CH2-CH2-O) n5-CH2-CH2-C (> = O) -, -S- (CH2) n6-C (> = O) -, or a single bond, in the that n5 represents an integer from 1 to 6, n6 re it has an integer from 1 to 6, LP represents a GGFG tetrapeptide residue, represents -O- or a single bond, Lb represents -CR2 (-R3) - or a single bond, in which R2 and R3 represent each one independently a hydrogen atom, Lc represents -C (> = O) -, - (Succinimid-3-yl-N) - has a structure represented by the following formula: ** Formula ** which is connected to the antibody in the position 3 thereof and is connected to a methylene group in the linker structure containing this structure in the nitrogen atom at position 1, - (N-li-3-diminiccuS) - has a structure represented by the following formula: ** Formula ** which is connected to L2 in position 3 thereof and is connected to a methylene group in the linker structure containing this structure in the nitrogen atom in position 1, cic.Hex (1,4) represents a 1,4-cyclohexylene group and, when L2 is -S- (CH2) n6-C (> = O) -, L1 is -C (> = O) -cyc.Hex (1,4) - CH2- (N-li-3- tiny) -.
Description
DESCRIPCIÓNDESCRIPTION
Conjugado de anticuerpo - fármaco Campo técnicoAntibody conjugate - drug Technical field
La presente invención se refiere a un conjugado de anticuerpo - fármaco que tiene un fármaco antitumoral conjugado 5 con un anticuerpo capaz de seleccionar como diana células tumorales por medio de un resto de estructura de enlazador, siendo útil el conjugado como un fármaco antitumoral.The present invention relates to an antibody-drug conjugate having an antitumor drug conjugated with an antibody capable of targeting tumor cells by means of a linker structure moiety, the conjugate being useful as an antitumor drug.
Antecedentes de la técnicaPrior art
Un conjugado de anticuerpo - fármaco (ADC) que tiene un fármaco con citotoxicidad conjugado con un anticuerpo, cuyo antígeno se expresa sobre una superficie de células cancerosas y que también se une a un antígeno capaz de 10 internalización celular y, por lo tanto, puede suministrar el fármaco selectivamente a células las cancerosas y se espera por lo tanto que dé lugar a la acumulación del fármaco dentro de las células cancerosas y que destruya las células cancerosas (véanse las literaturas no de patente 1 a 3). El documento JP2009-538629A desvela unos ADC en los que un fármaco citotóxico está conjugado con un anticuerpo anti-CD22, para seleccionar como diana células tumorales. Como un ADC, Mylotarg (Gemtuzumab ozogamicina), en el que se conjuga caliqueamicina con un 15 anticuerpo anti-CD33, está aprobado como un agente terapéutico para la leucemia mieloide aguda. Además, Adcetris (Brentuximab vedotina), en el que se conjuga auristatina E con un anticuerpo anti-CD30, se ha aprobado recientemente como un agente terapéutico para el linfoma de Hodgkin y el linfoma anaplásico de células grandes (véase la literatura no de patente 4). Los fármacos contenidos en los ADC que se han aprobado hasta la fecha seleccionan como diana ADN o tubulina.An antibody-drug conjugate (ADC) that has a cytotoxicity drug conjugated to an antibody, whose antigen is expressed on a surface of cancer cells and that also binds to an antigen capable of cellular internalization and, therefore, can supplying the drug selectively to the cancer cells and is therefore expected to result in the accumulation of the drug within the cancer cells and destroy the cancer cells (see non-patent literature 1 to 3). JP2009-538629A discloses ADCs in which a cytotoxic drug is conjugated with an anti-CD22 antibody, to select as target tumor cells. As an ADC, Mylotarg (Gemtuzumab ozogamicin), in which calicheamycin is conjugated with an anti-CD33 antibody, is approved as a therapeutic agent for acute myeloid leukemia. In addition, Adcetris (Brentuximab vedotine), in which auristatin E is conjugated with an anti-CD30 antibody, has recently been approved as a therapeutic agent for Hodgkin lymphoma and anaplastic large cell lymphoma (see non-patent literature 4 ). The drugs contained in the ADCs that have been approved to date select DNA or tubulin as the target.
20 Con respecto a un agente antitumoral, se conocen compuestos de bajo peso molecular, derivados de camptotecina, compuestos que inhiben la topoisomerasa I para mostrar un efecto antitumoral. Entre ellos, un compuesto antitumoral representado por la fórmula posteriorWith respect to an antitumor agent, low molecular weight compounds, camptothecin derivatives, compounds that inhibit topoisomerase I to show an antitumor effect are known. Among them, an antitumor compound represented by the subsequent formula
[Fórmula 1][Formula 1]
(exatecán, nombre químico: (1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-dihidro-9-hidroxi-4-metil-1H,12H-(exatecan, chemical name: (1S, 9S) -1-amino-9-ethyl-5-fluoro-2,3-dihydro-9-hydroxy-4-methyl-1H, 12H-
benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-10,13(9H, 15H)-diona) es un derivado soluble en agua de 25 camptotecina (literatura de patente 1 y 2). A diferencia del irinotecán ya usado en escenarios clínicos, no es necesaria una activación mediante una enzima. Además, la actividad inhibitoria sobre la topoisomerasa I es más alta que SN-38, que es una sustancia farmacéuticamente activa principal de irinotecán y topotecán también usada en escenarios clínicos, y se obtiene una actividad citocida in vitro más alta contra diversas células cancerosas. En particular, este muestra el efecto contra células cancerosas que tienen resistencia a SN-38 o similares debido a la 30 expresión de P-glicoproteína. Además, en un modelo de ratón transplantado subcutáneamente con tumor humano, este mostró un efecto antitumoral potente y, por lo tanto, se ha sometido a los estudios clínicos, pero no se ha puesto aún en el mercado (véanse las literaturas no de patente 5 a 10). Sigue sin estar claro si exatecán funciona, o no, eficazmente como un ADC.benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-10,13 (9H, 15H) -dione) is a water soluble derivative of 25 camptothecin (patent literature 1 and 2). Unlike the irinotecan already used in clinical settings, activation by an enzyme is not necessary. In addition, the inhibitory activity on topoisomerase I is higher than SN-38, which is a principal pharmaceutically active substance of irinotecan and topotecan also used in clinical settings, and a higher in vitro cytocidal activity against various cancer cells is obtained. In particular, this shows the effect against cancer cells that have resistance to SN-38 or the like due to the expression of P-glycoprotein. In addition, in a mouse model transplanted subcutaneously with human tumor, it showed a potent antitumor effect and, therefore, has undergone clinical studies, but has not yet been put on the market (see non-patent literature 5 to 10). It remains unclear whether exatecan works, or not, effectively as an ADC.
DE-310 es un complejo en el que se conjuga exatecán con un polímero de carboximetildextrano polialcohol 35 biodegradable por medio de un espaciador peptídico de GGFG (literatura de patente 3). Convirtiendo el exatecán en una forma de un profármaco de polímero, de tal modo que puede mantenerse una propiedad de retención sanguínea alta y también se aumenta pasivamente una propiedad de direccionabilidad alta a un área tumoral utilizando la permeabilidad aumentada de los vasos sanguíneos recién formados dentro del tumor y la propiedad de retención en los tejidos tumorales. Con DE-310, a través de una escisión del espaciador peptídico mediante enzima, se liberan 40 continuamente, como una sustancia activa principal, exatecán y exatecán con glicina conectada a un grupo amino. Como resultado, la farmacocinética se mejora y se halló que DE-310 tiene una efectividad más alta que exatecán administrado solo incluso si la dosificación de exatecán es menor que en el caso de la administración de exatecán solo de acuerdo con diversos modelos de evaluación tumoral en estudios no clínicos. Se llevó a cabo un estudio clínico para DE-310, y se confirmaron casos efectivos en seres humanos, en donde estaba presente un informe que 45 sugiere que la sustancia activa principal se acumula en un tumor que en tejidos normales, sin embargo, también existe un informe que indica que la acumulación de DE-310 y la sustancia activa principal en un tumor no es muyDE-310 is a complex in which exatecan is conjugated to a biodegradable carboxymethyldextran polymer by means of a GGFG peptide spacer (patent literature 3). By converting the exatecan into a form of a polymer prodrug, such that a high blood retention property can be maintained and a high addressability property to a tumor area is also passively increased using the increased permeability of the newly formed blood vessels within the tumor and retention property in tumor tissues. With DE-310, through a cleavage of the peptide spacer by enzyme, 40 are continuously released, as a main active substance, exatecan and exatecan with glycine connected to an amino group. As a result, the pharmacokinetics are improved and it was found that DE-310 has a higher effectiveness than exatecan administered only even if the exatecan dosage is lower than in the case of exatecan administration only according to various tumor evaluation models in non-clinical studies A clinical study for DE-310 was carried out, and effective cases were confirmed in humans, where a report was presented that suggests that the main active substance accumulates in a tumor that in normal tissues, however, also exists a report indicating that the accumulation of DE-310 and the main active substance in a tumor is not very
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diferente de la acumulación en tejidos normales en seres humanos y, por lo tanto, no se observa selección como diana pasiva alguna en seres humanos (véanse las literaturas no de patente 11 a 14). Como resultado, tampoco se comercializó DE-310, y sigue sin estar claro si exatecán funciona, o no, eficazmente como un fármaco orientado para tal selección como diana.different from the accumulation in normal tissues in humans and, therefore, no selection is observed as any passive target in humans (see non-patent literature 11 to 14). As a result, DE-310 was also not marketed, and it remains unclear whether exatecan works, or not, effectively as a drug targeted for such selection as a target.
Como un compuesto en relación con DE-310, también se conoce un complejo en el que un resto de estructura representado por -NH(Ch2)4C(=O)- se inserta entre el espaciador de GGFG y exatecán para formar - GGFG- NH(CH2)4C(=O)-, usado como una estructura espaciadora (literatura de patente 4). Sin embargo, el efecto antitumoral del complejo no es en absoluto conocido.As a compound in relation to DE-310, a complex is also known in which a structure residue represented by -NH (Ch2) 4C (= O) - is inserted between the GGFG spacer and exatecan to form - GGFG-NH (CH2) 4C (= O) -, used as a spacer structure (patent literature 4). However, the antitumor effect of the complex is not known at all.
[Lista de citas][List of quotes]
[Literatura de patente][Patent Literature]
[Literatura de patente 1] Patente japonesa abierta a inspección pública n.° 5-59061 [Literatura de patente 2] Patente japonesa abierta a inspección pública n.° 8-337584 [Literatura de patente 3] Publicación internacional n.° WO 1997/46260 [Literatura de patente 4] Publicación internacional n.° WO 2000/25825[Patent literature 1] Japanese patent open for public inspection No. 5-59061 [Patent literature 2] Japanese patent open for public inspection No. 8-337584 [Patent literature 3] International publication No. WO 1997 / 46260 [Patent Literature 4] International Publication No. WO 2000/25825
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[Literatura no de patente 9] Kumazawa, E. y col. Cancer Chemother. Pharmacol. (1998) 42, 210-220.; Potent and broad antitumor effects of DX-8951f, a water-soluble camptothecin derivative, against various human tumors xenografted in nude mice.[Non-patent literature 9] Kumazawa, E. et al. Cancer Chemother Pharmacol (1998) 42, 210-220 .; Potent and broad antitumor effects of DX-8951f, a water-soluble camptothecin derivative, against various human tumors xenografted in nude mice.
[Literatura no de patente 10] De Jager, R., y col. Ann N Y Acad Sci (2000) 922, 260-273.; DX-8951f: summary of phase I clinical trials.[Non-patent literature 10] De Jager, R., et al. Ann N Y Acad Sci (2000) 922, 260-273 .; DX-8951f: summary of phase I clinical trials.
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[Literatura no de patente 12] Kumazawa, E. y col. Cancer Sci (2004) 95, 168-175.; DE-310, a novel macromolecular carrier system for the camptothecin analog DX-8951f: Potent antitumor activities in various murine tumor models.[Non-patent literature 12] Kumazawa, E. et al. Cancer Sci (2004) 95, 168-175 .; DE-310, a novel macromolecular carrier system for the camptothecin analog DX-8951f: Potent antitumor activities in various murine tumor models.
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rResumen de la invención!Summary of the invention!
[Problema técnico][Technical problem]
Con respecto al tratamiento de un tumor mediante un anticuerpo, puede observarse un efecto antitumoral insuficiente incluso cuando el anticuerpo reconoce un antígeno y se une a células tumorales, y hay un caso en el que se necesita un anticuerpo antitumoral más eficaz. Además, muchos compuestos de bajo peso molecular antitumorales presentan un problema en la seguridad como un efecto secundario y la toxicidad y, aunque los compuestos tienen un efecto antitumoral excelente, sigue siendo un objeto lograr un efecto terapéutico superiorWith respect to the treatment of a tumor by an antibody, an insufficient antitumor effect can be observed even when the antibody recognizes an antigen and binds to tumor cells, and there is a case in which a more effective antitumor antibody is needed. In addition, many low molecular weight anti-tumor compounds present a safety problem as a side effect and toxicity and, although the compounds have an excellent anti-tumor effect, it remains an object to achieve a superior therapeutic effect.
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potenciando adicionalmente la seguridad. De ese modo, un objeto de la presente invención es obtener proporcionar un fármaco antitumoral que tenga un efecto terapéutico excelente, que sea excelente en términos del efecto antitumoral y la seguridad.further enhancing security. Thus, an object of the present invention is to obtain to provide an antitumor drug having an excellent therapeutic effect, which is excellent in terms of the antitumor effect and safety.
Los inventores de la presente invención pensaron que, cuando un compuesto antitumoral exatecán se convierte en un conjugado de anticuerpo - fármaco, por medio de un resto de estructura de enlazador, mediante conjugación con el anticuerpo, que es capaz de seleccionar como diana células tumorales, es decir, que tiene una propiedad de reconocer células tumorales, una propiedad de unirse a células tumorales, una propiedad de internalización dentro de células tumorales, una actividad citocida contra células tumorales, o similares, el compuesto antitumoral puede suministrarse más seguramente a las células tumorales para mostrar específicamente el efecto antitumoral del compuesto en células tumorales y, por lo tanto, el efecto antitumoral puede seguramente mostrarse y también se espera un efecto citocida potenciado del anticuerpo, y puede reducirse una dosis del compuesto antitumoral en comparación con un caso de administración del compuesto solo y, por lo tanto, puede aliviarse una influencia del compuesto antitumoral sobre las células normales de tal modo que puede lograrse una seguridad más alta.The inventors of the present invention thought that, when an exatecan antitumor compound is converted into an antibody-drug conjugate, by means of a linker structure moiety, by conjugation with the antibody, which is capable of targeting tumor cells, that is, that it has a property of recognizing tumor cells, a property of binding to tumor cells, a property of internalization within tumor cells, a cytocidal activity against tumor cells, or the like, the antitumor compound can be more safely delivered to tumor cells to specifically show the antitumor effect of the compound in tumor cells and, therefore, the antitumor effect can surely be shown and an enhanced cytocidal effect of the antibody is also expected, and a dose of the antitumor compound can be reduced compared to a case of administration of the compound alone and therefore can relieve an influence of the antitumor compound on normal cells can be achieved so that higher safety can be achieved.
A este respecto, los inventores de la presente invención crearon un enlazador con una estructura específica y tuvieron éxito en la obtención de un conjugado de anticuerpo - fármaco en el que el anticuerpo y exatecán se conjugan entre sí por medio del enlazador, y confirmaron un efecto antitumoral excelente mostrado por el conjugado para completar de ese modo la presente invención.In this regard, the inventors of the present invention created a linker with a specific structure and were successful in obtaining an antibody-drug conjugate in which the antibody and exatecan are conjugated to each other by means of the linker, and confirmed an effect excellent antitumor shown by the conjugate to thereby complete the present invention.
Específicamente, la presente invención se refiere a lo siguiente.Specifically, the present invention relates to the following.
[1] Un conjugado de anticuerpo - fármaco en el que un compuesto antitumoral representado por la siguiente fórmula:[1] An antibody-drug conjugate in which an antitumor compound represented by the following formula:
está conjugado con un anticuerpo por medio de un enlazador que tiene una estructura representada por la siguiente fórmula:It is conjugated to an antibody by means of a linker having a structure represented by the following formula:
-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-.-L1-L2-LP-NH- (CH2) n1-La-Lb-Lc-.
En este caso, el anticuerpo está conectado al extremo terminal de L1, el compuesto antitumoral está conectado al extremo terminal de Lc con el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 como posición de conexión, en el queIn this case, the antibody is connected to the terminal end of L1, the antitumor compound is connected to the terminal end of Lc with the nitrogen atom of the amino group at position 1 as the connection position, in which
n1 representa un número entero de 0 a 6,n1 represents an integer from 0 to 6,
L1 representa -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-, -CH2-C(=O)-NH-(CH2)n3-C(=O)-, -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N- li-3-diminiccuS)- o -C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-,L1 represents - (Succinimid-3-yl-N) - (CH2) n2-C (= O) -, -CH2-C (= O) -NH- (CH2) n3-C (= O) -, -C (= O) -cic.Hex (1,4) -CH2- (N- li-3-diminiccuS) - or -C (= O) - (CH2) n4-C (= O) -,
en el que n2 representa un número entero de 2 a 8, n3 representa un número entero de 1 a 8, n4 representa un número entero de 1 a 8,where n2 represents an integer from 2 to 8, n3 represents an integer from 1 to 8, n4 represents an integer from 1 to 8,
L2 representa -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)-, -S-(CH2)n6-C(=O)-, o un enlace sencillo, en el que n5 representa un número entero de 1 a 6, n6 representa un número entero de 1 a 6,L2 represents -NH- (CH2-CH2-O) n5-CH2-CH2-C (= O) -, -S- (CH2) n6-C (= O) -, or a single bond, in which n5 represents an integer from 1 to 6, n6 represents an integer from 1 to 6,
LP representa un residuo de tetrapéptido de GGFG,LP represents a GGFG tetrapeptide residue,
La representa -O- o un enlace sencillo,It represents -O- or a simple link,
Lb representa -CR2(-R3)- o un enlace sencillo,Lb represents -CR2 (-R3) - or a single link,
en el que R2 y R3 representan cada uno independientemente un átomo de hidrógeno,in which R2 and R3 each independently represent a hydrogen atom,
Lc representa -C(=O)-,Lc represents -C (= O) -,
-(Succinimid-3-il-N)- tiene una estructura representada por la siguiente fórmula:- (Succinimid-3-il-N) - has a structure represented by the following formula:
OOR
N—N—
OOR
que está conectado al anticuerpo en la posición 3 del mismo y está conectado a un grupo metileno en la estructura de enlazador que contiene esta estructura en el átomo de nitrógeno en la posición 1, -(N-li-3-diminiccuS)- tiene una estructura representada por la siguiente fórmula:which is connected to the antibody at position 3 thereof and is connected to a methylene group in the linker structure containing this structure at the nitrogen atom at position 1, - (N-li-3-diminiccuS) - has a structure represented by the following formula:
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que está conectado a L2 en la posición 3 del mismo y está conectado a un grupo metileno en la estructura de enlazador que contiene esta estructura en el átomo de nitrógeno en la posición 1,which is connected to L2 in position 3 thereof and is connected to a methylene group in the linker structure containing this structure in the nitrogen atom in position 1,
cic.Hex(1,4) representa un grupo 1,4-ciclohexileno y, cuando L2 es -S-(CH2)n6-C(=O)-, L1 es -C(=O)-cic.Hex(1,4)- CH2-(N-li-3-diminiccuS)-.cic.Hex (1,4) represents a 1,4-cyclohexylene group and, when L2 is -S- (CH2) n6-C (= O) -, L1 is -C (= O) -cyc.Hex (1 , 4) - CH2- (N-li-3-diminiccuS) -.
La presente invención también se refiere a cada uno de lo siguiente.The present invention also relates to each of the following.
[2] El conjugado de anticuerpo - fármaco de acuerdo con [1], en el que la estructura del enlazador es una estructura seleccionada de entre el siguiente grupo:[2] The antibody-drug conjugate according to [1], wherein the linker structure is a structure selected from the following group:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)- (Succinimid-3-yl-N) -CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)- (Succinimid-3-yl-N) -CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)- (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=O) -(NH-DX)- (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)- (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)- (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)- (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-- (Succinimid-3-yl-N) -CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH- CH2CH2CH2-C (= O) -
(NH-DX)(NH-DX)
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-C(=O)-(NH- DX)- (Succinimid-3-yl-N) -CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH- CH2CH2-C (= O) - (NH- DX)
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-- (Succinimid-3-yl-N) -CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-
CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-- (Succinimid-3-yl-N) -CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-
CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O) (NH-DX)-CH2-C (= O) -NH-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX) -C (= O) -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) (NH-DX)
-C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) en el que -(NH-DX) representa un grupo representado por la siguiente fórmula:-C (= O) -cic.Hex (1,4) -CH2- (N-li-3-diminiccuS) -S-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX) in which - (NH-DX) represents a group represented by the following formula:
en la que el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 es la posición de conexión, y -GGFG- representa un residuo de péptido de -Gly-Gly-Phe-Gly-.wherein the nitrogen atom of the amino group at position 1 is the connection position, and -GGFG- represents a peptide residue of -Gly-Gly-Phe-Gly-.
[3] El conjugado de anticuerpo - fármaco de acuerdo con [1] en el que un compuesto antitumoral representado por la siguiente fórmula:[3] The antibody-drug conjugate according to [1] in which an antitumor compound represented by the following formula:
está conjugado con un anticuerpo por medio de un enlazador que tiene una estructura representada por la siguiente fórmula:It is conjugated to an antibody by means of a linker having a structure represented by the following formula:
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-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc--L1-L2-LP-NH- (CH2) n1-La-Lb-Lc-
en el que el anticuerpo está conectado al extremo terminal de L1, el compuesto antitumoral está conectado al extremo terminal de Lc con el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 como la posición de conexión, en el quewherein the antibody is connected to the terminal end of L1, the antitumor compound is connected to the terminal end of Lc with the nitrogen atom of the amino group in position 1 as the connection position, in which
n1 representa un número entero de 0 a 6,n1 represents an integer from 0 to 6,
L1 representa -(Succinimid-3-il-NMCH2)n2-C(=O)-, en el que n2 representa un número entero de 2 a 5,L1 represents - (Succinimid-3-yl-NMCH2) n2-C (= O) -, in which n2 represents an integer from 2 to 5,
L2 representa -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O) o un enlace sencillo, en el que n5 representa un número entero de 2 o 4,L2 represents -NH- (CH2-CH2-O) n5-CH2-CH2-C (= O) or a single bond, in which n5 represents an integer of 2 or 4,
LP representa un residuo de tetrapéptido de GGFG,LP represents a GGFG tetrapeptide residue,
La representa -O- o un enlace sencillo,It represents -O- or a simple link,
Lb representa -CR2(-R3)- o un enlace sencillo, en el que R2 y R3 representan cada uno un átomo de hidrógeno,Lb represents -CR2 (-R3) - or a single bond, in which R2 and R3 each represent a hydrogen atom,
Lc representa -C(=O)-, yLc represents -C (= O) -, and
-(Succinimid-3-il-N)- tiene una estructura representada por la siguiente fórmula:- (Succinimid-3-il-N) - has a structure represented by the following formula:
OOR
OOR
que está conectado al anticuerpo en la posición 3 del mismo y está conectado a un grupo metileno en la estructura de enlazador que contiene esta estructura en el átomo de nitrógeno en la posición 1.which is connected to the antibody in position 3 thereof and is connected to a methylene group in the linker structure containing this structure in the nitrogen atom in position 1.
[4] El conjugado de anticuerpo - fármaco de acuerdo con [3], en el que -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- es -NH-(CH2)3-C(=O)-,[4] The antibody-drug conjugate according to [3], wherein -NH- (CH2) n1-La-Lb-Lc- is -NH- (CH2) 3-C (= O) -,
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, o -NH-(CH2)2-O-CH2-C(=O)-.-NH-CH2-O-CH2-C (= O) -, or -NH- (CH2) 2-O-CH2-C (= O) -.
[5] El conjugado de anticuerpo - fármaco de acuerdo con [4], en el que -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- es -NH-CH2-O-CH2-C(=O)-.[5] The antibody-drug conjugate according to [4], wherein -NH- (CH2) n1-La-Lb-Lc- is -NH-CH2-O-CH2-C (= O) -.
[6] El conjugado de anticuerpo - fármaco de acuerdo con una cualquiera de [3] a [5], en el que la estructura del enlazador es una estructura seleccionada de entre el siguiente grupo:[6] The antibody-drug conjugate according to any one of [3] to [5], wherein the linker structure is a structure selected from the following group:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (=O) -(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX)- (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX) - (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX) - (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2-C (= O) -NH -CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH- CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
en el que -(NH-DX) representa un grupo representado por la siguiente fórmula:in which - (NH-DX) represents a group represented by the following formula:
en la que el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 es una posición de conexión.wherein the nitrogen atom of the amino group in position 1 is a connecting position.
[7] El conjugado de anticuerpo - fármaco de acuerdo con [6], en el que la estructura del enlazador es:[7] The antibody-drug conjugate according to [6], in which the structure of the linker is:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).- (Succinimid-3-yl-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX).
[8] El conjugado de anticuerpo - fármaco de acuerdo con cualquiera de [1] a [4], en el que un número promedio de unidades de la estructura de fármaco - enlazador seleccionada conjugada por anticuerpo está en un intervalo de 2 a 8.[8] The antibody-drug conjugate according to any of [1] to [4], in which an average number of units of the selected drug-linker structure conjugated by antibody is in a range of 2 to 8.
[9] El conjugado de anticuerpo - fármaco de acuerdo con cualquiera de [1] a [4], en el que un número promedio de unidades de la estructura de fármaco - enlazador seleccionada conjugada por anticuerpo está en un intervalo de 3 a 8.[9] The antibody-drug conjugate according to any of [1] to [4], in which an average number of units of the selected drug-linker structure conjugated by antibody is in a range of 3 to 8.
[10] El conjugado de anticuerpo - fármaco de acuerdo con cualquiera de [1] a [4], en el que una célula que es seleccionada como diana por el conjugado de anticuerpo - fármaco es una célula tumoral.[10] The antibody-drug conjugate according to any of [1] to [4], in which a cell that is selected as the target by the antibody-drug conjugate is a tumor cell.
[11] El conjugado de anticuerpo - fármaco de acuerdo con cualquiera de [1] a [4], en el que el anticuerpo es un anticuerpo anti-A33, un anticuerpo anti-B7-H3, un anticuerpo anti-CanAg, un anticuerpo anti-CD20, un anticuerpo anti-CD22, un anticuerpo anti-CD30, un anticuerpo anti-CD33, un anticuerpo anti-CD56, un anticuerpo anti-CD70,[11] The antibody-drug conjugate according to any of [1] to [4], wherein the antibody is an anti-A33 antibody, an anti-B7-H3 antibody, an anti-CanAg antibody, an antibody anti-CD20, an anti-CD22 antibody, an anti-CD30 antibody, an anti-CD33 antibody, an anti-CD56 antibody, an anti-CD70 antibody,
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un anticuerpo anti-CEA, un anticuerpo anti-Cripto, un anticuerpo anti-EphA2, un anticuerpo anti-G250, un anticuerpo anti-MUC1, un anticuerpo anti-GPNMB, un anticuerpo anti-integrina, un anticuerpo anti-PSMA, un anticuerpo anti-tenascin-C, un anticuerpo anti-SLC44A4 o un anticuerpo anti-mesotelina.an anti-CEA antibody, an anti-Crypto antibody, an anti-EphA2 antibody, an anti-G250 antibody, an anti-MUC1 antibody, an anti-GPNMB antibody, an anti-integrin antibody, an anti-PSMA antibody, an antibody anti-tenascin-C, an anti-SLC44A4 antibody or an anti-mesothelin antibody.
[12] El conjugado de anticuerpo - fármaco de acuerdo con cualquiera de [1] a [4], en el que el anticuerpo es un anticuerpo anti-B7-H3, un anticuerpo anti-CD30, un anticuerpo anti-CD33 o un anticuerpo anti-CD70.[12] The antibody-drug conjugate according to any of [1] to [4], wherein the antibody is an anti-B7-H3 antibody, an anti-CD30 antibody, an anti-CD33 antibody or an antibody anti-CD70.
[13] El conjugado de anticuerpo - fármaco de acuerdo con cualquiera de [1] a [4], en el que el anticuerpo es un anticuerpo anti-B7-H3.[13] The antibody-drug conjugate according to any of [1] to [4], wherein the antibody is an anti-B7-H3 antibody.
[14] Un fármaco que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco de acuerdo con cualquiera de [1] a [4], o una sal del mismo.[14] A drug containing the antibody-drug conjugate according to any of [1] to [4], or a salt thereof.
[15] Un fármaco antitumoral y/o fármaco anticancerígeno que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco de acuerdo con cualquiera de [1] a [4], o una sal del mismo.[15] An antitumor drug and / or anticancer drug containing the antibody-drug conjugate according to any of [1] to [4], or a salt thereof.
[16] Un fármaco antitumoral y/o fármaco anticancerígeno como se define en cualquiera de [1] a [4], para su uso contra cáncer de pulmón, cáncer de riñón, cáncer urotelial, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, glioblastoma multiforme, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de mama, melanoma, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de estómago o cáncer de esófago.[16] An antitumor drug and / or anticancer drug as defined in any of [1] to [4], for use against lung cancer, kidney cancer, urothelial cancer, colorectal cancer, prostate cancer, glioblastoma multiforme, ovarian cancer, pancreatic cancer, breast cancer, melanoma, liver cancer, bladder cancer, stomach cancer or esophageal cancer.
[17] Una composición farmacéutica que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco de acuerdo con cualquiera de [1] a [4], o una sal del mismo como un componente activo, y un componente de formulación farmacéuticamente aceptable.[17] A pharmaceutical composition containing the antibody-drug conjugate according to any of [1] to [4], or a salt thereof as an active component, and a pharmaceutically acceptable formulation component.
[18] Un compuesto intermedio de fármaco - enlazador representado por la siguiente fórmula:[18] An intermediate drug-linker compound represented by the following formula:
Q-(CH2)nQ-C(=O)-L2a-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX)Q- (CH2) nQ-C (= O) -L2a-LP-NH- (CH2) n1-La-Lb-Lc- (NH-DX)
en el que Q representa (maleimid-N-il)- nQ representa un número entero de 2 a 8,in which Q represents (maleimid-N-il) - nQ represents an integer from 2 to 8,
L2a representa -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)- o un enlace sencillo, en el que n5 representa un número entero de 1 a 6,L2a represents -NH- (CH2-CH2-O) n5-CH2-CH2-C (= O) - or a single bond, in which n5 represents an integer from 1 to 6,
LP representa un residuo de tetrapéptido de GGFG n1 representa un número entero de 0 a 6,LP represents a tetrapeptide residue of GGFG n1 represents an integer from 0 to 6,
La representa -O- o un enlace sencillo,It represents -O- or a simple link,
Lb representa -CR2(-R3)- o un enlace sencillo,Lb represents -CR2 (-R3) - or a single link,
en el que R2 y R3 representan cada uno independientemente un átomo de hidrógeno, Lc representa -C(=O)-,in which R2 and R3 each independently represent a hydrogen atom, Lc represents -C (= O) -,
(maleimid-N-il)- es un grupo representado por la siguiente fórmula:(maleimid-N-il) - is a group represented by the following formula:
OOR
OOR
en la que el átomo de nitrógeno es una posición de conexión, y -(NH-DX) es un grupo representado por la siguiente fórmula:wherein the nitrogen atom is a connecting position, and - (NH-DX) is a group represented by the following formula:
en la que el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 es una posición de conexión.wherein the nitrogen atom of the amino group in position 1 is a connecting position.
[19] El compuesto intermedio de fármaco - enlazador de acuerdo con [18], en el que n5 es un número entero de 2 o 4,[19] The intermediate drug-linker compound according to [18], wherein n5 is an integer of 2 or 4,
-NH-(CH2)n1-La-Lb- es -NH-CH2CH2CH2-,-NH- (CH2) n1-La-Lb- is -NH-CH2CH2CH2-,
-NH-CH2-O-CH2-, o -NH-CH2CH2-O-CH2-.-NH-CH2-O-CH2-, or -NH-CH2CH2-O-CH2-.
[20] Un compuesto de los siguientes:[20] A compound of the following:
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(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-(maleimid-N-il) -CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-
DX),DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=0)-(NH-DX) o (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), en el que (maleimid-N-il)- es un grupo representado por la siguiente fórmula:(maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (= 0) - (NH-DX) or (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C ( = O) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX), in which (maleimid-N-il) - is a group represented by the following formula:
OOR
OOR
en la que el átomo de nitrógeno es una posición de conexión, y -(NH-DX) es un grupo representado por la siguiente fórmula:wherein the nitrogen atom is a connecting position, and - (NH-DX) is a group represented by the following formula:
en la que el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 es una posición de conexión.wherein the nitrogen atom of the amino group in position 1 is a connecting position.
[21] El compuesto de acuerdo con [20] que es: (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).[21] The compound according to [20] which is: (maleimid-N-yl) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX ).
[22] Un enlazador representado por la siguiente fórmula:[22] A linker represented by the following formula:
-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc--L1-L2-LP-NH- (CH2) n1-La-Lb-Lc-
para obtener un conjugado de anticuerpo - fármaco en el que un fármaco está conjugado con un anticuerpo por medio del enlazador, en el que L1 es una posición de conexión para el anticuerpo, Lc es una posición de conexión para un compuesto antitumoral, en el queto obtain an antibody-drug conjugate in which a drug is conjugated to an antibody by means of the linker, in which L1 is a connection position for the antibody, Lc is a connection position for an antitumor compound, in which
n1 representa un número entero de 0 a 6,n1 represents an integer from 0 to 6,
L1 representa -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-, en el que n2 representa un número entero de 2 a 8,L1 represents - (Succinimid-3-yl-N) - (CH2) n2-C (= O) -, in which n2 represents an integer from 2 to 8,
L2 representa -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O) - o un enlace sencillo, en el que n5 representa un número entero de 1 a 6,L2 represents -NH- (CH2-CH2-O) n5-CH2-CH2-C (= O) - or a single bond, in which n5 represents an integer from 1 to 6,
LP representa un residuo de tetrapéptido de GGFG,LP represents a GGFG tetrapeptide residue,
La representa -O- o un enlace sencillo,It represents -O- or a simple link,
Lb representa -CR2(-R3)-, o un enlace sencillo,Lb represents -CR2 (-R3) -, or a single link,
en el que R2 y R3 representan cada uno independientemente un átomo de hidrógeno,in which R2 and R3 each independently represent a hydrogen atom,
Lc representa -C(=O)-,Lc represents -C (= O) -,
-(Succinimid-3-il-N)- tiene una estructura representada por la siguiente fórmula:- (Succinimid-3-il-N) - has a structure represented by the following formula:
que está conectado al anticuerpo en la posición 3 del mismo y está conectado a un grupo metileno en la estructura de enlazador que contiene esta estructura en el átomo de nitrógeno en la posición 1.which is connected to the antibody in position 3 thereof and is connected to a methylene group in the linker structure containing this structure in the nitrogen atom in position 1.
[23] El enlazador de acuerdo con [22], que se selecciona de entre el siguiente grupo, con la condición de que el extremo terminal izquierdo sea una posición de conexión con el anticuerpo y el extremo terminal derecho sea una posición de conexión con el compuesto antitumoral:[23] The linker according to [22], which is selected from the following group, with the proviso that the left terminal end is a connection position with the antibody and the right terminal end is a connection position with the anti-tumor compound:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-- (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (= O) -
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-- (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (= O) -
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-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.- (Succinimid-3-yl-N) -CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) -.
[24] El enlazador de acuerdo con [23], que, con la condición de que el extremo terminal izquierdo sea una posición de conexión con el anticuerpo y el extremo terminal derecho sea una posición de conexión con el compuesto antitumoral, es:[24] The linker according to [23], which, provided that the left terminal end is a connection position with the antibody and the right terminal end is a connection position with the antitumor compound, is:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-.- (Succinimid-3-yl-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (= O) -.
[25] Un procedimiento para preparar un conjugado de anticuerpo - fármaco, en el que el anticuerpo se trata en una condición reductora y a continuación se hace reaccionar con un compuesto[25] A procedure for preparing an antibody-drug conjugate, in which the antibody is treated in a reducing condition and then reacted with a compound
seleccionado de entre el grupo de compuestos mostrado posteriormente:selected from the group of compounds shown below:
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NHCH2CH2CH2-C(=O)-(NH-(maleimid-N-il) -CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2-O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NHCH2CH2CH2-C (= O) - (NH-
DX),DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), o (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), en lo anterior, (maleimid-N-il)- es un grupo representado por la siguiente fórmula:(maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX), or (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX), in the above, (maleimid-N-il) - is a group represented by the following formula:
OOR
OOR
en la que el átomo de nitrógeno es una posición de conexión, y -(NH-DX) es un grupo representado por la siguiente fórmula:wherein the nitrogen atom is a connecting position, and - (NH-DX) is a group represented by the following formula:
en la que el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 es una posición de conexión.wherein the nitrogen atom of the amino group in position 1 is a connecting position.
[26] El procedimiento de acuerdo con [25], en el que el anticuerpo se trata en una condición reductora y a continuación se hace reaccionar con el compuesto mostrado posteriormente:[26] The procedure according to [25], wherein the antibody is treated in a reducing condition and then reacted with the compound shown below:
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).(maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX).
[27] Un compuesto seleccionado de entre un grupo de NH2-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),[27] A compound selected from a group of NH2-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX),
NH2-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), o HO-CH2-C(=O)-(NH-DX),NH2-CH2CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX), or HO-CH2-C (= O) - (NH-DX),
en el que -(NH-DX) es un grupo representado por la siguiente fórmula:in which - (NH-DX) is a group represented by the following formula:
en la que el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 es una posición de conexión.wherein the nitrogen atom of the amino group in position 1 is a connecting position.
[28] El compuesto de acuerdo con [27], que es[28] The compound according to [27], which is
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HO-CH2-C(=O)-(NH-DX).HO-CH2-C (= O) - (NH-DX).
Efectos ventajosos de la invenciónAdvantageous effects of the invention
Con un conjugado de anticuerpo - fármaco que tiene un compuesto antitumoral exatecán conjugado por medio de un enlazador con una estructura específica, pueden lograrse un efecto antitumoral y una seguridad excelentes.With an antibody-drug conjugate having a conjugated exatecan antitumor compound by means of a linker with a specific structure, excellent antitumor effect and safety can be achieved.
Breve descripción de los dibujosBrief description of the drawings
[Figura 1] La figura 1 muestra una secuencia de aminoácidos de la variante 1 de B7-H3 (SEQ ID NO: 1).[Figure 1] Figure 1 shows an amino acid sequence of variant 1 of B7-H3 (SEQ ID NO: 1).
[Figura 2] La figura 2 muestra una secuencia de aminoácidos de la variante 2 de B7-H3 (SEQ ID NO: 2).[Figure 2] Figure 2 shows an amino acid sequence of variant 2 of B7-H3 (SEQ ID NO: 2).
[Figura 3] La figura 3 muestra una secuencia de aminoácidos de una cadena pesada de tipo M30-H1 (SEQ ID NO: 9).[Figure 3] Figure 3 shows an amino acid sequence of a heavy chain of type M30-H1 (SEQ ID NO: 9).
[Figura 4] La figura 4 muestra una secuencia de aminoácidos de una cadena pesada de tipo M30-H2 (SEQ ID NO: 10).[Figure 4] Figure 4 shows an amino acid sequence of an M30-H2 type heavy chain (SEQ ID NO: 10).
[Figura 5] La figura 5 muestra una secuencia de aminoácidos de una cadena pesada de tipo M30-H3 (SEQ ID NO: 11).[Figure 5] Figure 5 shows an amino acid sequence of a heavy chain of type M30-H3 (SEQ ID NO: 11).
[Figura 6] La figura 6 muestra una secuencia de aminoácidos de una cadena pesada de tipo M30-H4 (SEQ ID NO: 12).[Figure 6] Figure 6 shows an amino acid sequence of a heavy chain of type M30-H4 (SEQ ID NO: 12).
[Figura 7] La figura 7 muestra una secuencia de aminoácidos de una cadena ligera de tipo M30-L1 (SEQ ID NO:[Figure 7] Figure 7 shows an amino acid sequence of a light chain of type M30-L1 (SEQ ID NO:
13) .13).
[Figura 8] La figura 8 muestra una secuencia de aminoácidos de una cadena ligera de tipo M30-L2 (SEQ ID NO:[Figure 8] Figure 8 shows an amino acid sequence of a light chain of type M30-L2 (SEQ ID NO:
14) .14).
[Figura 9] La figura 9 muestra una secuencia de aminoácidos de una cadena ligera de tipo M30-L3 (SEQ ID NO:[Figure 9] Figure 9 shows an amino acid sequence of a light chain of type M30-L3 (SEQ ID NO:
15) .fifteen) .
[Figura 10] La figura 10 muestra una secuencia de aminoácidos de una cadena ligera de tipo M30-L4 (SEQ ID NO: 16).[Figure 10] Figure 10 shows an amino acid sequence of a light chain of type M30-L4 (SEQ ID NO: 16).
[Figura 11] La figura 11 muestra una secuencia de aminoácidos de una cadena ligera de tipo M30-L5 (SEQ ID NO: 17).[Figure 11] Figure 11 shows an amino acid sequence of a light chain of type M30-L5 (SEQ ID NO: 17).
[Figura 12] La figura 12 muestra una secuencia de aminoácidos de una cadena ligera de tipo M30-L6 (SEQ ID NO: 18).[Figure 12] Figure 12 shows an amino acid sequence of a light chain of type M30-L6 (SEQ ID NO: 18).
[Figura 13] La figura 13 muestra una secuencia de aminoácidos de una cadena ligera de tipo M30-L7 (SEQ ID NO: 19).[Figure 13] Figure 13 shows an amino acid sequence of a light chain of type M30-L7 (SEQ ID NO: 19).
[Figura 14] La figura 14 muestra una secuencia de aminoácidos de una cadena pesada de anticuerpo M30 (SEQ ID NO: 20).[Figure 14] Figure 14 shows an amino acid sequence of an M30 antibody heavy chain (SEQ ID NO: 20).
[Figura 15] La figura 15 muestra una secuencia de aminoácidos de una cadena ligera de anticuerpo M30 (SEQ ID NO: 21).[Figure 15] Figure 15 shows an amino acid sequence of an M30 antibody light chain (SEQ ID NO: 21).
[Figura 16] La figura 16 muestra una secuencia de nucleótidos de la variante 1 de B7-H3 (SEQ ID NO: 26).[Figure 16] Figure 16 shows a nucleotide sequence of variant 1 of B7-H3 (SEQ ID NO: 26).
[Figura 17] La figura 17 muestra el efecto de un conjugado de anticuerpo - fármaco (2) sobre células de la línea de melanoma humano A375 subcutáneamente transplantadas. En el dibujo, la línea con rombos abiertos muestra resultados acerca de un tumor sin tratar, la línea con triángulos abiertos muestra el efecto de un anticuerpo M30-H1-L4P y la línea con círculos abiertos muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco[Figure 17] Figure 17 shows the effect of an antibody-drug conjugate (2) on subcutaneously transplanted A375 human melanoma line cells. In the drawing, the line with open diamonds shows results about an untreated tumor, the line with open triangles shows the effect of an M30-H1-L4P antibody and the line with open circles shows the effect of the antibody-drug conjugate
(2).(2).
[Figura 18] La figura 18 muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco (2) sobre células de la línea de melanoma humano A375 subcutáneamente transplantadas. La línea con rombos abiertos muestra resultados acerca de un tumor sin tratar, la línea con cuadrados sólidos muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco (2) administrado a 0,1 mg/kg, la línea con marcas X muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco (2) administrado a 0,3 mg/kg, la línea con triángulos sólidos muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco (2) administrado a 1 mg/kg y la línea con círculos abiertos muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco (2) administrado a 3 mg/kg.[Figure 18] Figure 18 shows the effect of the antibody-drug conjugate (2) on subcutaneously transplanted A375 human melanoma line cells. The line with open diamonds shows results about an untreated tumor, the solid squares line shows the effect of the antibody-drug conjugate (2) administered at 0.1 mg / kg, the line with X marks shows the effect of the conjugate of antibody-drug (2) administered at 0.3 mg / kg, the solid triangle line shows the effect of the antibody-drug conjugate (2) administered at 1 mg / kg and the line with open circles shows the effect of the conjugate of antibody-drug (2) administered at 3 mg / kg.
[Figura 19] La figura 19 muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco (2) sobre células Calu-6 de línea de cancer de pulmón no de células pequeñas humano subcutáneamente transplantadas. La línea con rombos abiertos muestra resultados acerca de un tumor sin tratar, la línea con triángulos abiertos muestra el efecto de un anticuerpo M30-H1-L4P y la línea con círculos abiertos muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco (2).[Figure 19] Figure 19 shows the effect of the antibody-drug conjugate (2) on Calu-6 lung cancer line cells not of subcutaneously transplanted human small cells. The line with open diamonds shows results about an untreated tumor, the line with open triangles shows the effect of an M30-H1-L4P antibody and the line with open circles shows the effect of the antibody-drug conjugate (2).
[Figura 20] La figura 20 muestra los efectos de los conjugados de anticuerpo - fármaco (1), (13), (41) y (55) sobre células de la línea de melanoma humano A375 subcutáneamente transplantadas. En el dibujo, la línea con rombos abiertos muestra resultados acerca de un tumor sin tratar, la línea con círculos abiertos muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco (1), la línea con triángulos abiertos muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco (13), la línea con marcas X muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco (41) y la línea con cuadrados abiertos muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco (55).[Figure 20] Figure 20 shows the effects of antibody-drug conjugates (1), (13), (41) and (55) on cells of the subcutaneously transplanted A375 human melanoma line. In the drawing, the line with open diamonds shows results about an untreated tumor, the line with open circles shows the effect of the antibody-drug conjugate (1), the line with open triangles shows the effect of the antibody-drug conjugate (13), the line with X marks shows the effect of the antibody-drug conjugate (41) and the line with open squares shows the effect of the antibody-drug conjugate (55).
[Figura 21] La figura 21 muestra los efectos de los conjugados de anticuerpo - fármaco (13), (41) y (55) sobre células Calu-6 de línea de cáncer de pulmón no de células pequeñas humano subcutáneamente transplantadas. La línea con rombos abiertos muestra resultados acerca de un tumor sin tratar, la línea con círculos abiertos muestra el efecto de DE-310, la línea con triángulos abiertos muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco (13), la línea con marcas X muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco (41) y la línea con cuadrados abiertos muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco (55).[Figure 21] Figure 21 shows the effects of antibody-drug conjugates (13), (41) and (55) on Calu-6 lung cancer line cells not of subcutaneously transplanted human small cells. The line with open diamonds shows results about an untreated tumor, the line with open circles shows the effect of DE-310, the line with open triangles shows the effect of the antibody-drug conjugate (13), the line with X marks shows the effect of the antibody-drug conjugate (41) and the line with open squares shows the effect of the antibody-drug conjugate (55).
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[Figura 22] La figura 22 muestra los efectos de los conjugados de anticuerpo - fármaco (17), (18), (19), (59), (60) y (61) sobre células de la línea de melanoma humano A375 subcutáneamente transplantadas. En el dibujo, la línea con rombos sólidos muestra resultados acerca de un tumor sin tratar, la línea con cuadrados sólidos muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco (17), la línea con cuadrados abiertos muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco (18), la línea con círculos abiertos muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco (19), la línea con triángulos sólidos muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco (59), la línea con triángulos abiertos muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco (60) y la línea con marcas X muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco (61).[Figure 22] Figure 22 shows the effects of antibody-drug conjugates (17), (18), (19), (59), (60) and (61) on cells of the A375 human melanoma line subcutaneously transplanted In the drawing, the line with solid diamonds shows results about an untreated tumor, the line with solid squares shows the effect of the antibody-drug conjugate (17), the line with open squares shows the effect of the antibody-drug conjugate (18), the line with open circles shows the effect of the antibody-drug conjugate (19), the line with solid triangles shows the effect of the antibody-drug conjugate (59), the line with open triangles shows the effect of the conjugate of antibody-drug (60) and the X-labeled line shows the effect of the antibody-drug conjugate (61).
Descripción de realizacionesDescription of realizations
El conjugado de anticuerpo - fármaco de la presente invención es un fármaco antitumoral en el que un anticuerpo antitumoral está conjugado con un compuesto antitumoral por medio de un resto de estructura de enlazador y se explica con detalle en lo sucesivo en el presente documento.The antibody-drug conjugate of the present invention is an antitumor drug in which an antitumor antibody is conjugated to an antitumor compound by means of a linker structure moiety and is explained in detail hereafter.
[Anticuerpo][Antibody]
El anticuerpo usado en el conjugado de anticuerpo - fármaco de la presente invención quiere decir una inmunoglobulina y es una molécula que contiene un sitio de unión a antígeno que se une inmunoespecíficamente a un antígeno. La clase del anticuerpo de la presente invención puede ser cualquiera de IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY y es preferentemente IgG. La subclase del anticuerpo de la presente invención puede ser cualquiera de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2 y es preferentemente IgG1 o IgG2. El anticuerpo puede derivarse de cualquier especie, y los ejemplos preferidos de la especie pueden incluir seres humanos, ratas, ratones y conejos. En el caso en el que se deriva de una especie que no sea la humana, preferentemente este se quimeriza o se humaniza usando una técnica bien conocida. El anticuerpo de la presente invención puede ser un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal y es preferentemente un anticuerpo monoclonal.The antibody used in the antibody-drug conjugate of the present invention means an immunoglobulin and is a molecule that contains an antigen binding site that immunospecifically binds to an antigen. The antibody class of the present invention can be any of IgG, IgE, IgM, IgD, IgA and IgY and is preferably IgG. The subclass of the antibody of the present invention can be any of IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2 and is preferably IgG1 or IgG2. The antibody can be derived from any species, and preferred examples of the species can include humans, rats, mice and rabbits. In the case where it is derived from a species other than the human one, it is preferably chimerized or humanized using a well known technique. The antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody and is preferably a monoclonal antibody.
El anticuerpo de la presente invención puede ser uno que es capaz de seleccionar como diana células tumorales. Debido a que el anticuerpo de la presente invención está conjugado con un fármaco que tiene actividad antitumoral por medio de un enlazador, el anticuerpo preferentemente posee una o más de una propiedad de reconocer una célula tumoral, una propiedad de unirse a una célula tumoral, una propiedad de internalizarse en una célula tumoral y una propiedad de dañar una célula tumoral.The antibody of the present invention may be one that is capable of targeting tumor cells. Because the antibody of the present invention is conjugated to a drug that has antitumor activity by means of a linker, the antibody preferably possesses one or more of a property of recognizing a tumor cell, a property of binding to a tumor cell, a property of internalizing in a tumor cell and a property of damaging a tumor cell.
La actividad de unión del anticuerpo contra células tumorales puede confirmarse usando citometría de flujo. La internalización del anticuerpo en células tumorales puede confirmarse usando (1) un ensayo de visualización de un anticuerpo incorporado en células bajo un microscopio de fluorescencia usando un anticuerpo secundario (marcado fluorescentemente) que se une al anticuerpo terapéutico (Cell Death and Differentiation (2008) 15, 751-761), (2) un ensayo de medición de la cantidad de fluorescencia incorporada en células usando un anticuerpo secundario (marcado fluorescentemente) que se une al anticuerpo terapéutico (Molecular Biology of the Cell, Vol. 15, 52685282, diciembre de 2004) o (3) un ensayo de Mab-ZAP usando una inmunotoxina que se une al anticuerpo terapéutico en el que la toxina se libera tras la incorporación en células para inhibir el crecimiento celular (Bio Techniques 28: 162-165, enero de 2000).The binding activity of the antibody against tumor cells can be confirmed using flow cytometry. The internalization of the antibody in tumor cells can be confirmed using (1) a visualization assay of an antibody incorporated into cells under a fluorescence microscope using a secondary antibody (fluorescently labeled) that binds to the therapeutic antibody (Cell Death and Differentiation (2008) 15, 751-761), (2) an assay measuring the amount of fluorescence incorporated into cells using a secondary antibody (fluorescently labeled) that binds to the therapeutic antibody (Molecular Biology of the Cell, Vol. 15, 52685282, December 2004) or (3) a Mab-ZAP assay using an immunotoxin that binds to the therapeutic antibody in which the toxin is released after incorporation into cells to inhibit cell growth (Bio Techniques 28: 162-165, January 2000).
La actividad antitumoral del anticuerpo se refiere a una actividad citotóxica o efecto citocida contra células tumorales y puede confirmarse in vitro determinando la actividad inhibitoria contra el crecimiento celular. Por ejemplo, se cultiva una línea de células cancerosas que sobreexpresa una proteína diana para el anticuerpo, y el anticuerpo se añade a concentraciones variables en el sistema de cultivo para determinar una actividad inhibitoria contra la formación de focos, la formación de colonias y el crecimiento de esferoides. La actividad antitumoral puede confirmarse in vivo, por ejemplo, administrando el anticuerpo a un ratón desnudo con una línea de células tumorales transplantadas que expresa altamente la proteína diana, y determinando el cambio en la célula cancerosa. Debido a que el fármaco conjugado en el conjugado de anticuerpo - fármaco ejerce un efecto antitumoral, se prefiere en mayor medida, pero no es esencial, que el propio anticuerpo tenga un efecto antitumoral. Para ejercer el efecto antitumoral y también para dañar específica y selectivamente células tumorales mediante el fármaco, es importante y también se prefiere que el anticuerpo tenga la propiedad de internalizarse para migrar a células tumorales.The antitumor activity of the antibody refers to a cytotoxic activity or cytocidal effect against tumor cells and can be confirmed in vitro by determining inhibitory activity against cell growth. For example, a line of cancer cells that overexpresses a target protein for the antibody is cultured, and the antibody is added at varying concentrations in the culture system to determine an inhibitory activity against foci formation, colony formation and growth. of spheroids. The antitumor activity can be confirmed in vivo, for example, by administering the antibody to a naked mouse with a line of transplanted tumor cells that highly expresses the target protein, and determining the change in the cancer cell. Because the conjugate drug in the antibody-drug conjugate exerts an antitumor effect, it is more preferred, but not essential, for the antibody itself to have an antitumor effect. To exert the antitumor effect and also to specifically and selectively damage tumor cells by the drug, it is important and it is also preferred that the antibody has the property of internalizing to migrate to tumor cells.
Los ejemplos de un anticuerpo de este tipo pueden incluir, pero sin limitarse a, un anticuerpo anti-A33, un anticuerpo anti-B7-H3, un anticuerpo anti-CanAg, un anticuerpo anti-CD20, un anticuerpo anti-CD22, un anticuerpo anti-CD30, un anticuerpo anti-CD33, un anticuerpo anti-CD56, un anticuerpo anti-CD70, un anticuerpo anti-CEA, un anticuerpo anti-Cripto, un anticuerpo anti-EphA2, un anticuerpo anti-G250, un anticuerpo anti-MUC1, un anticuerpo anti- GPNMB, un anticuerpo anti-integrina, un anticuerpo anti-PSMA, un anticuerpo anti-tenascin-C, un anticuerpo anti- SLC44A4 y un anticuerpo anti-mesotelina.Examples of such an antibody may include, but are not limited to, an anti-A33 antibody, an anti-B7-H3 antibody, an anti-CanAg antibody, an anti-CD20 antibody, an anti-CD22 antibody, an antibody anti-CD30, an anti-CD33 antibody, an anti-CD56 antibody, an anti-CD70 antibody, an anti-CEA antibody, an anti-Crypto antibody, an anti-EphA2 antibody, an anti-G250 antibody, an anti-G250 antibody MUC1, an anti-GPNMB antibody, an anti-integrin antibody, an anti-PSMA antibody, an anti-tenascin-C antibody, an anti-SLC44A4 antibody and an anti-mesothelin antibody.
El anticuerpo de la presente invención es preferentemente un anticuerpo anti-CD30, un anticuerpo anti-CD33, un anticuerpo anti-CD70 o un anticuerpo anti-B7-H3 y, más preferentemente, un anticuerpo anti-B7-H3.The antibody of the present invention is preferably an anti-CD30 antibody, an anti-CD33 antibody, an anti-CD70 antibody or an anti-B7-H3 antibody and, more preferably, an anti-B7-H3 antibody.
El anticuerpo de la presente invención puede obtenerse usando un procedimiento llevado habitualmente a cabo en la técnica, que implica inmunizar animales con un polipéptido antigénico y recoger y purificar anticuerpos producidos in vivo. El origen del antígeno no se limita a los seres humanos, y los animales pueden inmunizarse con un antígenoThe antibody of the present invention can be obtained using a method usually carried out in the art, which involves immunizing animals with an antigenic polypeptide and collecting and purifying antibodies produced in vivo. The origin of the antigen is not limited to humans, and animals can be immunized with an antigen
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derivado de un animal no humano tal como un ratón, una rata y similares. En este caso, la reactividad cruzada de los anticuerpos que se unen al antígeno heterólogo obtenido con antígenos humanos puede someterse a prueba para explorar un anticuerpo aplicable a una enfermedad humana.derived from a non-human animal such as a mouse, a rat and the like. In this case, cross-reactivity of antibodies that bind to the heterologous antigen obtained with human antigens can be tested to explore an antibody applicable to a human disease.
Como alternativa, células productoras de anticuerpo que producen anticuerpos contra el antígeno se fusionan con células de mieloma de acuerdo con un procedimiento conocido en la técnica (por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature (1975) 256, pág. 495-497; y Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, págs. 365-367, Plenum Press, N. Y. (1980)) para establecer hibridomas, a partir de los cuales, a su vez, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales.Alternatively, antibody producing cells that produce antibodies against the antigen are fused with myeloma cells according to a method known in the art (e.g., Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p. 495-497; and Kennet , R. ed., Monoclonal Antibodies, pp. 365-367, Plenum Press, NY (1980)) to establish hybridomas, from which, in turn, monoclonal antibodies can be obtained.
El antígeno puede obtenerse modificando por ingeniería genética células hospedadoras para producir un gen que codifica la proteína antigénica. Específicamente, se preparan unos vectores que permiten la expresión del gen de antígeno y se transfieren a células hospedadoras de tal modo que el gen se expresa. El antígeno expresado de este modo puede purificarse.The antigen can be obtained by genetically engineered host cells to produce a gene that encodes the antigenic protein. Specifically, vectors that allow expression of the antigen gene are prepared and transferred to host cells such that the gene is expressed. The antigen expressed in this way can be purified.
El anticuerpo anti-CD30, el anticuerpo anti-CD33 y el anticuerpo anti-CD70 pueden obtenerse mediante un enfoque conocido en la técnica con referencia al documento WO2002/043661, la patente de EE. UU. n.° 5.773.001 y el documento WO2006/113909, respectivamente.The anti-CD30 antibody, the anti-CD33 antibody and the anti-CD70 antibody can be obtained by an approach known in the art with reference to WO2002 / 043661, US Pat. UU. No. 5,773,001 and WO2006 / 113909, respectively.
El anticuerpo B7-H3 usado en la presente invención es preferentemente uno que tiene propiedades según se describe a continuación.The B7-H3 antibody used in the present invention is preferably one that has properties as described below.
(1) Un anticuerpo que tiene las siguientes propiedades:(1) An antibody that has the following properties:
(a) unirse específicamente a B7-H3,(a) specifically join B7-H3,
(b) tener una actividad de fagocitosis mediada por células dependiente del anticuerpo (ADCP), y(b) have an antibody-dependent cell-mediated phagocytosis activity (ADCP), and
(c) tener actividad antitumoral in vivo.(c) have antitumor activity in vivo.
(2) El anticuerpo de acuerdo con (1), en el que B7-H3 es una molécula que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 o 2.(2) The antibody according to (1), wherein B7-H3 is a molecule comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2.
(3) El anticuerpo de acuerdo con (1) o (2), en el que el anticuerpo tiene CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 3, CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 4, y CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 5 como regiones de determinación de complementariedad de cadena pesada, y CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 6, CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 7, y CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 8 como regiones de determinación de complementariedad de cadena ligera.(3) The antibody according to (1) or (2), wherein the antibody has CDRH1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, CDRH2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and CDRH3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 as regions for determining heavy chain complementarity, and CDRL1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, CDRL2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, and CDRL3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 as light chain complementarity determination regions.
(4) El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de (1) a (3), en el que la región constante del mismo es una región constante derivada de ser humano.(4) The antibody according to any of (1) to (3), in which the constant region thereof is a constant region derived from human.
(5) El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de (1) a (4), en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.(5) The antibody according to any of (1) to (4), wherein the antibody is a humanized antibody.
(6) El anticuerpo de acuerdo con (5), en el que el anticuerpo tiene una región variable de cadena pesada que(6) The antibody according to (5), wherein the antibody has a heavy chain variable region that
comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en (a) una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 20 a 141 en la sEq ID NO: 9, (b) una secuencia decomprises an amino acid sequence selected from the group consisting of (a) an amino acid sequence described in amino acid positions 20 to 141 in sEq ID NO: 9, (b) a sequence of
aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 20 a 141 en la SEQ ID NO: 10, (c) una secuencia de
amino acids described in amino acid positions 20 to 141 in SEQ ID NO: 10, (c) a sequence of
aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 20 a 141 en la SEQ ID NO: 11, (d) una secuencia de
amino acids described at amino acid positions 20 to 141 in SEQ ID NO: 11, (d) a sequence of
aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 20 a 141 en la SEQ ID NO: 12, (e) una secuencia de
amino acids described at amino acid positions 20 to 141 in SEQ ID NO: 12, (e) a sequence of
aminoácidos que tiene una homología de al menos el 95 % o más alta con cualquiera de las secuencias (a) a (d) y (f) una secuencia de aminoácidos derivada de cualquiera de las secuencias (a) a (d) por las eliminaciones, sustituciones o adiciones de al menos un aminoácido, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en (g) una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 21 a 128 en la SEQ ID NO: 13, (h) una secuencia de aminoácidosamino acids having a homology of at least 95% or higher with any of the sequences (a) to (d) and (f) an amino acid sequence derived from any of the sequences (a) to (d) by deletions , substitutions or additions of at least one amino acid, and a variable light chain region comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of (g) an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO: 13, (h) an amino acid sequence
descrita en las posiciones de aminoácido 21 a 128 en la SEQ ID NO: 14, (i) una secuencia de aminoácidosdescribed in amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO: 14, (i) an amino acid sequence
descrita en las posiciones de aminoácido 21 a 128 en la SEQ ID NO: 15, (j) una secuencia de aminoácidosdescribed in amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO: 15, (j) an amino acid sequence
descrita en las posiciones de aminoácido 21 a 128 en la SEQ ID NO: 16, (k) una secuencia de aminoácidosdescribed in amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO: 16, (k) an amino acid sequence
descrita en las posiciones de aminoácido 21 a 128 en la SEQ ID NO: 17, (1) una secuencia de aminoácidosdescribed in amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO: 17, (1) an amino acid sequence
descrita en las posiciones de aminoácido 21 a 128 en la SEQ ID NO: 18, (m) una secuencia de aminoácidosdescribed at amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO: 18, (m) an amino acid sequence
descrita en las posiciones de aminoácido 21 a 128 en la SEQ ID NO: 19, (n) una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 95 % o más alta con cualquiera de las secuencias (g) a (m) y (o) una secuencia de aminoácidos derivada de cualquiera de las secuencias (g) a (m) por las eliminaciones, sustituciones o adiciones de al menos un aminoácido.described in amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO: 19, (n) an amino acid sequence having a homology of at least 95% or higher with any of the sequences (g) to (m) and (o) an amino acid sequence derived from any of the sequences (g) to (m) by deletions, substitutions or additions of at least one amino acid.
(7) El anticuerpo de acuerdo con (6), en el que el anticuerpo tiene una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 20 a 141 en la SEQ ID NO: 9 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 21 a 128 en la SEQ ID NO: 13, una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 20 a 141 en la SEQ ID NO: 9 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las(7) The antibody according to (6), wherein the antibody has a heavy chain variable region and a light chain variable region selected from the group consisting of a heavy chain variable region comprising a sequence of amino acids described at amino acid positions 20 to 141 in SEQ ID NO: 9 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO: 13, a variable region heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 141 in SEQ ID NO: 9 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence described in
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posiciones de aminoácido 21 a 128 en la SEQ ID NO: 14, una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 20 a 141 en la SEQ ID NO: 9 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 21 a 128 en la SEQ ID NO: 15, una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 20 a 141 en la SEQ ID NO: 9 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 21 a 128 en la SEQ ID NO: 16, una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 20 a 141 en la SEQ ID NO: 9 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 21 a 128 en la SEQ ID NO: 17, una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 20 a 141 en la SEQ ID NO: 9 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 21 a 128 en la SEQ ID NO: 18, una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 20 a 141 en la SEQ ID NO: 9 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 21 a 128 en la SEQ ID NO: 19, una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 20 a 141 en la SEQ ID NO: 12 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 21 a 128 en la SEQ ID NO: 13, una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 20 a 141 en la SEQ ID NO: 12 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 21 a 128 en la SEQ ID NO: 14, una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 20 a 141 en la SEQ ID NO: 12 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 21 a 128 en la SEQ ID NO: 15, y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 20 a 141 en la SEQ ID NO: 12 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 21 a 128 en la SEQ ID NO: 16.amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO: 14, a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence described in amino acid positions 20 to 141 in SEQ ID NO: 9 and a light chain variable region that comprises an amino acid sequence described in amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO: 15, a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence described in amino acid positions 20 to 141 in SEQ ID NO: 9 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO: 16, a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 141 in SEQ ID NO: 9 and a variable light chain region comprising an amino acid sequence described in amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO: 17, a variable region heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 141 in SEQ ID NO: 9 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO: 18, a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 141 in SEQ ID NO: 9 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence described at positions of amino acid 21 to 128 in SEQ ID NO: 19, a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 141 in SEQ ID NO: 12 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO: 13, a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence described in The amino acid positions 20 to 141 in SEQ ID NO: 12 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence described in amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO: 14, a heavy chain variable region which comprises an amino acid sequence described in amino acid positions 20 to 141 in SEQ ID NO: 12 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence described in amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO: 15, and a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 141 in SEQ ID NO: 12 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO: 16.
(8) El anticuerpo de acuerdo con (6) o (7), en el que el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera seleccionadas de entre el grupo que consiste en una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 20 a 471 en la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 21 a 233 en la SEQ ID NO:(8) The antibody according to (6) or (7), wherein the antibody comprises a heavy chain and a light chain selected from the group consisting of a heavy chain comprising an amino acid sequence described in the positions from amino acid 20 to 471 in SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising an amino acid sequence described in amino acid positions 21 to 233 in SEQ ID NO:
13, una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 20 a 471 en la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 21 a 233 en la SEQ ID NO: 14, una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 20 a 471 en la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 21 a 233 en la SEQ ID NO: 15, una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 20 a 471 en la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 21 a 233 en la SEQ ID NO: 16, una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 20 a 471 en la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 21 a 233 en la SEQ ID NO: 17, una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 20 a 471 en la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 21 a 233 en la SEQ ID NO: 18, una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 20 a 471 en la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 21 a 233 en la SEQ ID NO: 19, una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 20 a 471 en la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 21 a 233 en la SEQ ID NO: 13, una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 20 a 471 en la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 21 a 233 en la SEQ ID NO:13, a heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 471 in SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 233 in SEQ ID NO: 14, a heavy chain comprising an amino acid sequence described in amino acid positions 20 to 471 in SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising an amino acid sequence described in amino acid positions 21 to 233 in the SEQ ID NO: 15, a heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 471 in SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 233 in SEQ ID NO: 16, a heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 471 in SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising an amino acid sequence two described at amino acid positions 21 to 233 in SEQ ID NO: 17, a heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 471 in SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising a amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 233 in SEQ ID NO: 18, a heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 471 in SEQ ID NO: 9 and a light chain that comprises an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 233 in SEQ ID NO: 19, a heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 471 in SEQ ID NO: 12 and a chain a light chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 233 in SEQ ID NO: 13, a heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 471 in the SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 233 in SEQ ID NO:
14, una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 20 a 471 en la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 21 a 233 en la SEQ ID NO: 15, y una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 20 a 471 en la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 21 a 233 en la SEQ ID NO: 16.14, a heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 471 in SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 233 in SEQ ID NO: 15, and a heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 471 in SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 233 in SEQ ID NO: 16.
(9) El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de (6) a (8), en el que el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera seleccionadas de entre el grupo que consiste en una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende la secuencia(9) The antibody according to any of (6) to (8), wherein the antibody comprises a heavy chain and a light chain selected from the group consisting of a heavy chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising the sequence
- de aminoácidos representada por of amino acids represented by
- la SEQ ID NO: 13 , una cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 13, a heavy chain comprising the sequence of
- aminoácidos amino acids
- representada por la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende la secuencia de represented by SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising the sequence of
- aminoácidos amino acids
- representada por la SEQ ID NO: 14 una cadena pesada que comprende la secuencia de represented by SEQ ID NO: 14 a heavy chain comprising the sequence of
- aminoácidos amino acids
- representada por la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende la secuencia de represented by SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising the sequence of
- aminoácidos amino acids
- representada por la SEQ ID NO: 15 una cadena pesada que comprende la secuencia de represented by SEQ ID NO: 15 a heavy chain comprising the sequence of
- aminoácidos amino acids
- representada por la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende la secuencia de represented by SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising the sequence of
- aminoácidos representada por la SEQ ID NO 16 una cadena pesada que comprende la secuencia de amino acids represented by SEQ ID NO 16 a heavy chain comprising the sequence of
- aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende la secuencia de amino acids represented by SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising the sequence of
- aminoácidos representada por la SEQ ID NO 17 una cadena pesada que comprende la secuencia de amino acids represented by SEQ ID NO 17 a heavy chain comprising the sequence of
- aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende la secuencia de amino acids represented by SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising the sequence of
- 5 5
- aminoácidos representada por la SEQ ID NO 18 una cadena pesada que comprende la secuencia de amino acids represented by SEQ ID NO 18 a heavy chain comprising the sequence of
- aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende la secuencia de amino acids represented by SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising the sequence of
- aminoácidos representada por la SEQ ID NO 19 una cadena pesada que comprende la secuencia de amino acids represented by SEQ ID NO 19 a heavy chain comprising the sequence of
- aminoácidos representada por la SEQ ID NO 12 y una cadena ligera que comprende la secuencia de amino acids represented by SEQ ID NO 12 and a light chain comprising the sequence of
- aminoácidos representada por la SEQ ID NO 13 una cadena pesada que comprende la secuencia de amino acids represented by SEQ ID NO 13 a heavy chain comprising the sequence of
- 10 10
- aminoácidos representada por la SEQ ID NO 12 y una cadena ligera que comprende la secuencia de amino acids represented by SEQ ID NO 12 and a light chain comprising the sequence of
- aminoácidos representada por la SEQ ID NO 14 una cadena pesada que comprende la secuencia de amino acids represented by SEQ ID NO 14 a heavy chain comprising the sequence of
- aminoácidos representada por la SEQ ID NO 12 y una cadena ligera que comprende la secuencia de amino acids represented by SEQ ID NO 12 and a light chain comprising the sequence of
- aminoácidos representada por la SEQ ID N O: 15, y una cadena pesada que comprende la secuencia de amino acids represented by SEQ ID N O: 15, and a heavy chain comprising the sequence of
- aminoácidos representada por la SEQ ID NO 12 y una cadena ligera que comprende la secuencia de amino acids represented by SEQ ID NO 12 and a light chain comprising the sequence of
- 15 fifteen
- aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 16. amino acids represented by SEQ ID NO: 16.
- (10) El anticuerpo de acuerdo con (8) o (9) en el que el anticuerpo carece de un aminoácido en el extremo (10) The antibody according to (8) or (9) in which the antibody lacks an amino acid at the end
carboxilo de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 9 o 12 en la cadena pesada.Carboxyl of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 or 12 in the heavy chain.
(11) Un anticuerpo obtenido mediante un procedimiento para producir el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de(11) An antibody obtained by a method of producing the antibody according to any of
(1) a (10), comprendiendo el procedimiento las etapas de: cultivar una célula hospedadora transformada con un(1) to (10), the process comprising the steps of: culturing a transformed host cell with a
20 vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el anticuerpo; y recoger el anticuerpo de interés a20 expression vector containing a polynucleotide encoding the antibody; and collect the antibody of interest to
partir de los cultivos obtenidos en la etapa anterior.from the crops obtained in the previous stage.
(12) El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de (1) a (11), en el que la modificación de un glicano se regula con el fin de potenciar la actividad citotóxica dependiente del anticuerpo.(12) The antibody according to any of (1) to (11), in which the modification of a glycan is regulated in order to enhance the antibody-dependent cytotoxic activity.
En lo sucesivo en el presente documento, se describe el anticuerpo B7-H3 usado en la invención.Hereinafter, the B7-H3 antibody used in the invention is described.
25 Los términos "cáncer" y "tumor", tal como se usan en el presente documento, se usan con el mismo significado.25 The terms "cancer" and "tumor", as used herein, are used with the same meaning.
El término "gen", tal como se usa en el presente documento, incluye no solamente ADN, sino también ARNm del mismo, ADNc del mismo y ARNc del mismo.The term "gene", as used herein, includes not only DNA, but also mRNA thereof, cDNA thereof and cRNA thereof.
El término "polinucleótido", tal como se usa en el presente documento, se usa con el mismo significado que un ácido nucleico y también incluye ADN, ARN, sondas, oligonucleótidos y cebadores.The term "polynucleotide," as used herein, is used with the same meaning as a nucleic acid and also includes DNA, RNA, probes, oligonucleotides and primers.
30 Los términos "polipéptido" y "proteína", tal como se usan en el presente documento, se usan indistintamente.The terms "polypeptide" and "protein", as used herein, are used interchangeably.
El término "célula", tal como se usa en el presente documento, también incluye células en un individuo animal y células cultivadas.The term "cell," as used herein, also includes cells in an animal individual and cultured cells.
El término "B7-H3", tal como se usa en el presente documento, se usa con el mismo significado que proteína B7-H3, y también se refiere a la variante 1 de B7-H3 y/o la variante 2 de B7-H3.The term "B7-H3", as used herein, is used with the same meaning as B7-H3 protein, and also refers to variant 1 of B7-H3 and / or variant 2 of B7- H3
35 El término "CDR", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una región determinante de la complementariedad (CDR), y se sabe que cada cadena pesada y ligera de una molécula de anticuerpo tiene tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR). La CDR también se denomina región hipervariable y está presente en una región variable de cada cadena pesada y ligera de un anticuerpo. Es un sitio que tiene una variabilidad inusualmente alta en su estructura primaria, y hay tres CDR independientes en la estructura primaria de 40 cada cadena polipeptídica pesada y ligera. En la presente memoria descriptiva, con respecto a las CDR de un anticuerpo, las cDr de la cadena pesada están representadas por CDRH1, CDRH2 y CDRH3 desde el lado amino terminal de la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada, y las CDR de la cadena ligera están representadas por CDRL1, CDRL2 y CDRL3 desde el lado amino terminal de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera. Estos sitios están próximos entre sí en la estructura terciaria y determinan la especificidad para un antígeno al que 45 se une el anticuerpo.The term "CDR", as used herein, refers to a complementarity determining region (CDR), and it is known that each heavy and light chain of an antibody molecule has three complementarity determining regions. (CDR). The CDR is also called the hypervariable region and is present in a variable region of each heavy and light chain of an antibody. It is a site that has unusually high variability in its primary structure, and there are three independent CDRs in the primary structure of each heavy and light polypeptide chain. In the present specification, with respect to the CDRs of an antibody, the heavy chain cDr are represented by CDRH1, CDRH2 and CDRH3 from the amino terminal side of the amino acid sequence of the heavy chain, and the chain CDRs light are represented by CDRL1, CDRL2 and CDRL3 from the amino terminal side of the amino acid sequence of the light chain. These sites are close to each other in the tertiary structure and determine the specificity for an antigen to which the antibody binds.
La frase "la hibridación se realiza en condiciones rigurosas", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un procedimiento en el que la hibridación se realiza en condiciones en las cuales puede lograrse la identificación realizando hibridación a 68 °C en una solución de hibridación disponible en el mercado ExpressHyb Hybridization Solution (fabricada por Clontech, Inc.) o realizando hibridación a 68 °C en presencia de NaCl de 0,7 a 1,0 M usando 50 un filtro que tiene ADN inmovilizado sobre él, seguido de realizar lavado a 68 °C usando solución 0,1 a 2 x de SSC (1 x solución de SSC está compuesta por NaCl 150 mM y citrato de sodio 15 mM) o en condiciones equivalentes a las mismas.The phrase "hybridization is performed under stringent conditions", as used herein, refers to a procedure in which hybridization is performed under conditions in which identification can be achieved by hybridization at 68 ° C in a commercially available hybridization solution ExpressHyb Hybridization Solution (manufactured by Clontech, Inc.) or hybridizing at 68 ° C in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl using 50 a filter that has immobilized DNA on it, followed of washing at 68 ° C using 0.1 to 2 x SSC solution (1 x SSC solution is composed of 150 mM NaCl and 15 mM sodium citrate) or under conditions equivalent thereto.
1. B7-H31. B7-H3
B7-H3 es un miembro de la familia B7 expresado en células presentadoras de antígenos como una molécula 55 coestimuladora, y se considera que actúa sobre un receptor en linfocitos T para potenciar o suprimir la actividad inmunitaria.B7-H3 is a member of the B7 family expressed in antigen presenting cells as a costimulatory molecule, and is considered to act on a T-cell receptor to enhance or suppress immune activity.
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B7-H3 es una proteína que tiene una estructura transmembrana de un solo paso, y el dominio extracelular N-terminal de B7-H3 contiene dos variantes. La variante 1 de B7-H3 (4Ig-B7-H3) contiene un dominio de Ig de tipo V o de tipo C en dos sitios, respectivamente, y la variante 2 de B7-H3 (2Ig-B7-H3) contiene un dominio de Ig de tipo V o de tipo C en un sitio, respectivamente.B7-H3 is a protein that has a single-pass transmembrane structure, and the N-terminal extracellular domain of B7-H3 contains two variants. Variant 1 of B7-H3 (4Ig-B7-H3) contains a type V or type C Ig domain at two sites, respectively, and variant 2 of B7-H3 (2Ig-B7-H3) contains a domain of type V Ig or type C at a site, respectively.
Con respecto a B7-H3 que se usará en la invención, B7-H3 puede purificarse directamente a partir de células que expresan B7-H3 de un ser humano o un mamífero no humano (tal como una rata o un ratón) y usarse, o puede prepararse y usarse una fracción de membrana celular de las células descritas anteriormente. Además, B7-H3 puede obtenerse mediante síntesis in vitro de la misma o producción de la misma en una célula hospedadora mediante ingeniería genética. En la ingeniería genética, específicamente, después de que el ADNc de B7-H3 se integre en un vector capaz de expresar ADNc de B7-H3, puede obtenerse B7-H3 sintetizándola en una solución que contiene una enzima, un sustrato y una sustancia energética requeridas para la transcripción y la traducción, o expresando B7-H3 en otra célula hospedadora transformada procariota o eucariota.With respect to B7-H3 to be used in the invention, B7-H3 can be purified directly from cells expressing B7-H3 from a human being or a non-human mammal (such as a rat or mouse) and used, or A cell membrane fraction of the cells described above can be prepared and used. In addition, B7-H3 can be obtained by in vitro synthesis thereof or production thereof in a host cell by genetic engineering. In genetic engineering, specifically, after the B7-H3 cDNA is integrated into a vector capable of expressing B7-H3 cDNA, B7-H3 can be obtained by synthesizing it in a solution containing an enzyme, a substrate and an energy substance required for transcription and translation, or expressing B7-H3 in another prokaryotic or eukaryotic transformed host cell.
La secuencia de aminoácidos de un marco de lectura abierto (ORF) de un gen de la variante 1 de B7-H3 humana está representada por la SEQ ID NO: 1 en el listado de secuencias. Además, la secuencia de la SEQ ID NO: 1 se muestra en la figura 1.The amino acid sequence of an open reading frame (ORF) of a gene of variant 1 of human B7-H3 is represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. In addition, the sequence of SEQ ID NO: 1 is shown in Figure 1.
La secuencia de aminoácidos de un ORF de un gen de la variante 2 de B7-H3 humana está representada por la SEQ ID NO: 2 en el listado de secuencias. Además, la secuencia de la SEQ ID NO: 2 se muestra en la figura 2.The amino acid sequence of an ORF of a gene of variant 2 of human B7-H3 is represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. In addition, the sequence of SEQ ID NO: 2 is shown in Figure 2.
Además, una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos se sustituyen, eliminan y/o añaden en cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas anteriormente de B7-H3 y también tiene una actividad biológica equivalente a la de la proteína está también incluida en B7-H3.In addition, a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, removed and / or added in any of the amino acid sequences described above of B7-H3 and also has a biological activity equivalent to that of the Protein is also included in B7-H3.
La variante 1 de B7-H3 humana madura de la que se ha eliminado la secuencia señal corresponde a una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 27 a 534 de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID NO: 1. Además, la variante 2 de B7-H3 humana madura de la que se ha eliminado la secuencia señal corresponde a una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 27 a 316 de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID NO: 2.Variant 1 of mature human B7-H3 from which the signal sequence has been removed corresponds to an amino acid sequence consisting of amino acid residues 27 to 534 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. In addition, variant 2 of mature human B7-H3 from which the signal sequence has been removed corresponds to an amino acid sequence consisting of amino acid residues 27 to 316 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
2. Producción del anticuerpo anti-B7-H32. Production of anti-B7-H3 antibody
El anticuerpo contra B7-H3 de la invención puede obtenerse inmunizando un animal con B7-H3 o un polipéptido arbitrario seleccionado entre la secuencia de aminoácidos de B7-H3, y recogiendo y purificando el anticuerpo producido in vivo de acuerdo con un procedimiento común. La especie biológica de B7-H3 que se usará como antígeno no está limitada al ser humano, y puede inmunizarse un animal con B7-H3 derivado de un animal que no sea humano, tal como un ratón o una rata. En este caso, examinando la reactividad cruzada entre un anticuerpo que se une al B7-H3 heterólogo obtenido y B7-H3 humano, puede seleccionarse un anticuerpo aplicable a una enfermedad humana.The antibody against B7-H3 of the invention can be obtained by immunizing an animal with B7-H3 or an arbitrary polypeptide selected from the amino acid sequence of B7-H3, and collecting and purifying the antibody produced in vivo according to a common procedure. The biological species of B7-H3 that will be used as an antigen is not limited to humans, and an animal can be immunized with B7-H3 derived from a non-human animal, such as a mouse or rat. In this case, by examining the cross reactivity between an antibody that binds to the obtained heterologous B7-H3 and human B7-H3, an antibody applicable to a human disease can be selected.
Además, puede obtenerse un anticuerpo monoclonal a partir de un hibridoma establecido fusionando células productoras de anticuerpos que producen un anticuerpo contra B7-H3 con células de mieloma, de acuerdo con un procedimiento conocido (por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature, (1975) 256, págs. 495-497; Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, págs. 365-367, Plenum Press, N. Y. (1980).In addition, a monoclonal antibody can be obtained from an established hybridoma by fusing antibody producing cells that produce an antibody against B7-H3 with myeloma cells, according to a known procedure (eg, Kohler and Milstein, Nature, (1975) 256, pp. 495-497; Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, pp. 365-367, Plenum Press, NY (1980).
Puede obtenerse B7-H3 que se usará como un antígeno expresando el gen de B7-H3 en una célula hospedadora usando ingeniería genética.B7-H3 can be obtained which will be used as an antigen expressing the B7-H3 gene in a host cell using genetic engineering.
Específicamente, se produce un vector capaz de expresar el gen de B7-H3, y el vector resultante se transfecta en una célula hospedadora para expresar el gen, y a continuación, se purifica el B7-H3 expresado. En lo sucesivo en el presente documento, se describe específicamente un procedimiento para obtener un anticuerpo contra B7-H3.Specifically, a vector capable of expressing the B7-H3 gene is produced, and the resulting vector is transfected into a host cell to express the gene, and then the expressed B7-H3 is purified. Hereinafter, a procedure for obtaining an antibody against B7-H3 is specifically described.
(1) Preparación del antígeno(1) Antigen Preparation
Los ejemplos del antígeno que se usará para producir el anticuerpo anti-B7-H3 incluyen B7-H3, un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos parcial que comprende al menos 6 aminoácidos consecutivos de B7-H3, y un derivado obtenido añadiendo una secuencia de aminoácidos o vehículo dado al mismo.Examples of the antigen that will be used to produce the anti-B7-H3 antibody include B7-H3, a polypeptide consisting of a partial amino acid sequence comprising at least 6 consecutive amino acids of B7-H3, and a derivative obtained by adding a sequence. of amino acids or vehicle given to it.
B7-H3 puede purificarse directamente a partir de tejidos tumorales o células tumorales humanas y usarse. Además, B7-H3 puede obtenerse sintetizándolo in vitro o produciéndolo en una célula hospedadora mediante ingeniería genética.B7-H3 can be purified directly from tumor tissues or human tumor cells and used. In addition, B7-H3 can be obtained by synthesizing it in vitro or producing it in a host cell by genetic engineering.
Con respecto a la ingeniería genética, específicamente, después de que el ADNc de B7-H3 se integre en un vector capaz de expresar ADNc de B7-H3, puede obtenerse B7-H3 sintetizándola en una solución que contiene una enzima, un sustrato y una sustancia energética requeridas para la transcripción y la traducción, o expresando B7-H3 en otra célula hospedadora transformada procariota o eucariota.With respect to genetic engineering, specifically, after the B7-H3 cDNA is integrated into a vector capable of expressing B7-H3 cDNA, B7-H3 can be obtained by synthesizing it in a solution containing an enzyme, a substrate and a energy substance required for transcription and translation, or expressing B7-H3 in another prokaryotic or eukaryotic transformed host cell.
Además, el antígeno también puede obtenerse como una proteína secretora expresando una proteína de fusiónIn addition, the antigen can also be obtained as a secretory protein by expressing a fusion protein.
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obtenida ligando el dominio extracelular de B7-H3, que es una proteína de membrana, a la región constante de un anticuerpo en un sistema hospedador-vector apropiado.obtained by linking the extracellular domain of B7-H3, which is a membrane protein, to the constant region of an antibody in an appropriate host-vector system.
El ADNc de B7-H3 puede obtenerse mediante, por ejemplo, un llamado procedimiento de PCR en el que se realiza una reacción en cadena de la polimerasa (en lo sucesivo denominada "PCR") usando una biblioteca de ADNc que expresa ADNc de B7-H3 como molde y cebadores que amplifican específicamente el ADNc de B7-H3 (véase Saiki, R. K., y col., Science, (1988) 239, págs. 487-489).The B7-H3 cDNA can be obtained by, for example, a so-called PCR procedure in which a polymerase chain reaction (hereinafter referred to as "PCR") is performed using a cDNA library that expresses B7- cDNA. H3 as a template and primers that specifically amplify the B7-H3 cDNA (see Saiki, RK, et al., Science, (1988) 239, pp. 487-489).
Como síntesis in vitro del polipéptido, por ejemplo, puede indicarse como ejemplo el sistema Rapid Translation System (RTS) fabricado por Roche Diagnostics, Inc., aunque sin limitarse al mismo.As an in vitro synthesis of the polypeptide, for example, the Rapid Translation System (RTS) manufactured by Roche Diagnostics, Inc. may be indicated as an example, but not limited thereto.
Los ejemplos de las células hospedadoras procariotas incluyen Escherichia coli y Bacillus subtilis. Con el fin de transformar las células hospedadoras con un gen diana, las células hospedadoras se transforman mediante un vector plasmídico que comprende un replicón, es decir, un origen de replicación derivado de una especie compatible con el hospedador, y una secuencia reguladora. Además, el vector tiene preferentemente una secuencia capaz de imponer selectividad fenotípica en la célula transformada.Examples of prokaryotic host cells include Escherichia coli and Bacillus subtilis. In order to transform the host cells with a target gene, the host cells are transformed by a plasmid vector comprising a replicon, that is, an origin of replication derived from a species compatible with the host, and a regulatory sequence. In addition, the vector preferably has a sequence capable of imposing phenotypic selectivity on the transformed cell.
Los ejemplos de las células hospedadoras eucariotas incluyen células de vertebrados, células de insectos y células de levadura. Como células de vertebrados, por ejemplo, a menudo se usan células COS de simio (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, págs. 175-182, ATCC CRL-1650), fibroblastos murinos NIH3T3 (ATCC n.° CRL-1658) y cepas deficientes en dihidrofolato reductasa (Urlaub, G. y Chasin, LA, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. (1980) 77, págs. 4126-4220) de células de ovario de hámster chino (células CHO, ATCC: CCL-61); y similares, sin embargo, las células no se limitan a éstas.Examples of eukaryotic host cells include vertebrate cells, insect cells and yeast cells. As vertebrate cells, for example, simian COS cells (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, pp. 175-182, ATCC CRL-1650), murine fibroblasts NIH3T3 (ATCC No. CRL) are often used -1658) and strains deficient in dihydrofolate reductase (Urlaub, G. and Chasin, LA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 4126-4220) of Chinese hamster ovary cells ( CHO cells, ATCC: CCL-61); and the like, however, the cells are not limited to them.
El transformante obtenido de este modo puede cultivarse de acuerdo con un procedimiento común, y mediante el cultivo del transformante, se produce un polipéptido diana intracelular o extracelularmente.The transformant obtained in this way can be cultured according to a common procedure, and by culturing the transformant, a target polypeptide is produced intracellularly or extracellularly.
Un medio adecuado para usarlo para el cultivo puede seleccionarse entre diversos medios de cultivo usados comúnmente dependiendo de las células hospedadoras empleadas. Si se emplea Escherichia coli, por ejemplo, puede usarse un medio LB suplementado con un antibiótico tal como ampicilina o IPMG, según sea necesario.A suitable medium for use for culture can be selected from various commonly used culture media depending on the host cells employed. If Escherichia coli is used, for example, an LB medium supplemented with an antibiotic such as ampicillin or IPMG can be used as needed.
Una proteína recombinante producida intracelular o extracelularmente por el transformante a través de dicho cultivo puede separarse y purificarse mediante cualquiera de diversos procedimientos de separación conocidos que utiliza la propiedad física o química de la proteína.A recombinant protein produced intracellularly or extracellularly by the transformant through said culture can be separated and purified by any of several known separation methods using the physical or chemical property of the protein.
Los ejemplos específicos de los procedimientos incluyen tratamiento con un precipitante de proteína común, ultrafiltración, diversos tipos de cromatografía líquida tales como cromatografía de tamiz molecular (filtración en gel), cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad, diálisis y una combinación de los mismos.Specific examples of the procedures include treatment with a common protein precipitant, ultrafiltration, various types of liquid chromatography such as molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography and affinity chromatography, dialysis and a combination thereof.
Además, uniendo un identificador de seis restos de histidina a una proteína recombinante a expresar, la proteína puede purificarse eficazmente con una columna de afinidad de níquel. Como alternativa, uniendo la región Fc de IgG a una proteína recombinante a expresar, la proteína puede purificarse eficazmente con una columna de proteína A.In addition, by attaching an identifier of six histidine residues to a recombinant protein to be expressed, the protein can be effectively purified with a nickel affinity column. Alternatively, by binding the Fc region of IgG to a recombinant protein to be expressed, the protein can be effectively purified with a protein A column.
Combinando los procedimientos descritos anteriormente, puede producirse fácilmente una gran cantidad de un polipéptido diana con alto rendimiento y alta pureza.By combining the procedures described above, a large amount of a target polypeptide can be easily produced with high yield and high purity.
(2) Producción del anticuerpo monoclonal anti-B7-H3(2) Production of anti-B7-H3 monoclonal antibody
Los ejemplos del anticuerpo que se une específicamente a B7-H3 incluyen un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a B7-H3, y un procedimiento de obtención del anticuerpo es tal como se describe a continuación.Examples of the antibody that specifically binds to B7-H3 include a monoclonal antibody that specifically binds to B7-H3, and a method of obtaining the antibody is as described below.
La producción de un anticuerpo monoclonal generalmente requiere las siguientes etapas operativas de:The production of a monoclonal antibody generally requires the following operational steps of:
(a) purificar un biopolímero que se usará como antígeno;(a) purify a biopolymer that will be used as an antigen;
(b) preparar células productoras de anticuerpos inmunizando un animal mediante inyección del antígeno, recoger la sangre, ensayar su título de anticuerpos para determinar cuándo se escinde el bazo;(b) prepare antibody producing cells by immunizing an animal by injection of the antigen, collecting the blood, testing its antibody titer to determine when the spleen is cleaved;
(c) preparar células de mieloma (en lo sucesivo denominadas como "mieloma");(c) prepare myeloma cells (hereinafter referred to as "myeloma");
(d) fusionar las células productoras de anticuerpos con el mieloma;(d) fuse antibody producing cells with myeloma;
(e) cribar un grupo de hibridomas que producen un anticuerpo deseado;(e) screening a group of hybridomas that produce a desired antibody;
(f) dividir los hibridomas en clones de una sola célula (clonación);(f) dividing the hybridomas into single cell clones (cloning);
(g) opcionalmente, cultivar el hibridoma o criar un animal implantado con el hibridoma para producir una gran cantidad de un anticuerpo monoclonal;(g) optionally, culturing the hybridoma or raising an animal implanted with the hybridoma to produce a large amount of a monoclonal antibody;
(h) examinar el anticuerpo monoclonal producido de este modo para determinar la actividad biológica y la especificidad de unión, o evaluar el mismo para determinar propiedades como un reactivo etiquetado; y similares.(h) examine the monoclonal antibody produced in this way to determine the biological activity and binding specificity, or evaluate it to determine properties as a labeled reagent; and the like
En lo sucesivo en el presente documento, el procedimiento de producción de un anticuerpo monoclonal se describirá en detalle siguiendo las etapas anteriores, sin embargo, el procedimiento no se limita a esto, y, por ejemplo, pueden usarse células productoras de anticuerpos diferentes de células esplénicas y mieloma.Hereinafter, the method of producing a monoclonal antibody will be described in detail following the above steps, however, the procedure is not limited to this, and, for example, antibody producing cells other than cells can be used. splenic and myeloma.
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(a) Purificación de antígeno(a) Antigen purification
Como antígeno, puede usarse B7-H3 preparada mediante el procedimiento descrito anteriormente o un péptido parcial de la misma.As an antigen, B7-H3 prepared by the method described above or a partial peptide thereof can be used.
Además, también puede usarse como el antígeno una fracción de membrana preparada a partir de células recombinantes que expresan B7-H3 o las propias células recombinantes que expresan B7-H3, y también un péptido parcial de la proteína de la invención químicamente sintetizado mediante un procedimiento conocido por los expertos en la materia.In addition, a membrane fraction prepared from recombinant cells expressing B7-H3 or the recombinant cells themselves expressing B7-H3, and also a partial peptide of the protein of the invention chemically synthesized by a method can also be used as the antigen. known by experts in the field.
(b) Preparación de células productoras de anticuerpos(b) Preparation of antibody producing cells
El antígeno obtenido en la etapa (a) se mezcla con un adyuvante tal como adyuvante completo o incompleto de Freund o sulfato de aluminio y potasio y la mezcla resultante se usa como inmunógeno para inmunizar un animal experimental. Como animal experimental, puede usarse sin ningún problema cualquier animal usado en un procedimiento de producción de hibridoma conocido. Específicamente, por ejemplo, puede usarse un ratón, una rata, una cabra, vacas, un caballo o similar. Sin embargo, desde el punto de vista de la facilidad de disponibilidad de las células de mieloma para fusionarse con las células productoras de anticuerpos extraídas, se usa preferentemente un ratón o una rata como animal a inmunizar.The antigen obtained in step (a) is mixed with an adjuvant such as Freund's complete or incomplete adjuvant or potassium aluminum sulfate and the resulting mixture is used as an immunogen to immunize an experimental animal. As an experimental animal, any animal used in a known hybridoma production process can be used without any problem. Specifically, for example, a mouse, a rat, a goat, cows, a horse or the like can be used. However, from the point of view of the ease of availability of myeloma cells to fuse with the antibody producing cells removed, a mouse or rat is preferably used as an animal to be immunized.
Además, la cepa de un ratón o una rata que se usará no está particularmente limitada y, en el caso de un ratón, por ejemplo, pueden usarse diversas cepas tales como A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, dBa, FL, HtH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB y 129 y similares, y en el caso de una rata, por ejemplo, pueden usarse Wistar, Low, Lewis, Sprague, Dawley, ACI, BN, Fischer y similares.In addition, the strain of a mouse or a rat to be used is not particularly limited and, in the case of a mouse, for example, various strains such as A, AKR, BALB / c, BDP, BA, CE, C3H can be used. , 57BL, C57BL, C57L, dBa, FL, HtH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB and 129 and the like, and in the case of a rat, for example, Wistar can be used , Low, Lewis, Sprague, Dawley, ACI, BN, Fischer and the like.
Estos ratones y ratas están disponibles en el mercado de criadores/distribuidores de animales experimentales, por ejemplo, CLEA Japan, Inc. y Charles River Laboratories Japan, Inc.These mice and rats are commercially available from breeders / distributors of experimental animals, for example, CLEA Japan, Inc. and Charles River Laboratories Japan, Inc.
Entre estos, teniendo en cuenta la compatibilidad de fusión con células de mieloma descritas a continuación, en el caso de un ratón, la cepa BALB/c, y en el caso de una rata, las cepas Wistar y Low se prefieren particularmente como animal a inmunizar.Among these, taking into account the compatibility of fusion with myeloma cells described below, in the case of a mouse, the BALB / c strain, and in the case of a rat, the Wistar and Low strains are particularly preferred as an animal to immunize.
Además, teniendo en cuenta la homología antigénica entre seres humanos y ratones, También se prefiere usar un ratón que tiene función biológica reducida para eliminar autoanticuerpos, es decir, un ratón con una enfermedad autoinmunitaria.In addition, taking into account antigenic homology between humans and mice, it is also preferred to use a mouse that has reduced biological function to eliminate autoantibodies, that is, a mouse with an autoimmune disease.
La edad de dicho ratón o rata en el momento de la inmunización es, preferentemente, de 5 a 12 semanas de edad, más preferentemente, de 6 a 8 semanas de edad.The age of said mouse or rat at the time of immunization is preferably from 5 to 12 weeks of age, more preferably, from 6 to 8 weeks of age.
Con el fin de inmunizar un animal con B7-H3 o un recombinante de la misma, por ejemplo, puede usarse un procedimiento conocido descrito en detalle en, por ejemplo, Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. y Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964) o similares.In order to immunize an animal with B7-H3 or a recombinant thereof, for example, a known method described in detail can be used in, for example, Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964) or the like.
Entre todos estos procedimientos de inmunización, un procedimiento específico preferido en la invención es, por ejemplo, de la siguiente manera.Among all these immunization procedures, a specific preferred process in the invention is, for example, as follows.
Es decir, en primer lugar, una fracción de proteína de membrana que sirve como antígeno o células a las que se hizo expresar el antígeno se administran por vía intradérmica o intraperitoneal a un animal.That is, first, a fraction of membrane protein that serves as an antigen or cells to which the antigen was expressed is administered intradermally or intraperitoneally to an animal.
Sin embargo, se prefiere la combinación de ambas vías de administración para aumentar la eficacia de inmunización y, cuando la administración intradérmica se realiza en la primera mitad y la administración intraperitoneal se realiza en la segunda mitad o sólo en la última dosificación, la eficacia de la inmunización puede aumentarse particularmente.However, the combination of both routes of administration is preferred to increase immunization efficacy and, when intradermal administration is performed in the first half and intraperitoneal administration is performed in the second half or only in the last dosage, the efficacy of Immunization can be increased particularly.
El programa de administración del antígeno varía dependiendo del tipo de animal a inmunizar, diferencia individual o similares. Sin embargo, en general, es preferido un programa de administración en el que la frecuencia de administración del antígeno es de 3 a 6 veces y el intervalo de dosificación es de 2 a 6 semanas, y es más preferido un programa de administración en el que la frecuencia de administración del antígeno es de 3 a 4 veces y el intervalo de dosificación es de 2 a 4 semanas.The antigen administration program varies depending on the type of animal to be immunized, individual difference or the like. However, in general, an administration program in which the frequency of administration of the antigen is 3 to 6 times and the dosage range is 2 to 6 weeks is preferred, and an administration program in which the frequency of administration of the antigen is 3 to 4 times and the dosage interval is 2 to 4 weeks.
Además, La dosis del antígeno varía dependiendo del tipo de animal, diferencias individuales o similares, sin embargo, la dosis se establece, en general, en de 0,05 a 5 mg, preferentemente de aproximadamente 0,1 a 0,5 mg.In addition, the dose of the antigen varies depending on the type of animal, individual or similar differences, however, the dose is generally set at 0.05 to 5 mg, preferably about 0.1 to 0.5 mg.
Se realiza una inmunización de refuerzo de 1 a 6 semanas, preferentemente de 2 a 4 semanas, más preferentemente de 2 a 3 semanas después de la administración del antígeno tal como se ha descrito anteriormente.Booster immunization is performed for 1 to 6 weeks, preferably 2 to 4 weeks, more preferably 2 to 3 weeks after administration of the antigen as described above.
La dosis del antígeno en el momento de realizar la inmunización de refuerzo varía dependiendo del tipo o tamaño del animal o similar, sin embargo, en el caso de, por ejemplo, un ratón, la dosis generalmente se establece en de 0,05 aThe dose of the antigen at the time of performing the booster immunization varies depending on the type or size of the animal or the like, however, in the case of, for example, a mouse, the dose is generally set at 0.05 to
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5 mg, preferentemente de 0,1 a 0,5 mg, más preferentemente de aproximadamente 0,1 a 0,2 mg.5 mg, preferably 0.1 to 0.5 mg, more preferably about 0.1 to 0.2 mg.
Las células esplénicas o linfocitos que incluyen células productoras de anticuerpos se extirpan asépticamente del animal inmunizado de 1 a 10 días, preferentemente de 2 a 5 días, más preferentemente de 2 a 3 días después de la inmunización de refuerzo. En este momento, se mide el título del anticuerpo y, si se usa un animal que tiene un título de anticuerpos suficientemente aumentado como fuente de suministro de las células productoras de anticuerpos, el procedimiento posterior puede llevarse a cabo de manera más eficiente.Spleen cells or lymphocytes that include antibody producing cells are aseptically removed from the immunized animal for 1 to 10 days, preferably 2 to 5 days, more preferably 2 to 3 days after booster immunization. At this time, the antibody titer is measured and, if an animal having a sufficiently increased antibody titer is used as a source of supply of the antibody producing cells, the subsequent procedure can be carried out more efficiently.
Los ejemplos del procedimiento de medición del título de anticuerpos que se usarán aquí incluyen un procedimiento RIA y un procedimiento ELISA, pero el procedimiento no está limitado a estos.Examples of the antibody titer measurement procedure that will be used herein include an RIA procedure and an ELISA procedure, but the procedure is not limited to these.
Por ejemplo, si se emplea un procedimiento ELISA, la medición del título de anticuerpos en la invención puede llevarse a cabo de acuerdo con los procedimientos que se describen a continuación.For example, if an ELISA procedure is used, the measurement of the antibody titer in the invention can be carried out in accordance with the procedures described below.
En primer lugar, un antígeno purificado o parcialmente purificado se adsorbe a la superficie de una fase sólida tal como una placa de 96 pocillos para ELISA, y la superficie de la fase sólida que no tiene antígeno adsorbido en ella se cubre con una proteína no relacionada con el antígeno tal como albúmina de suero bovino (en lo sucesivo denominada "BSA"). Después de lavar la superficie, ésta se pone en contacto con una muestra diluida sucesivamente (por ejemplo, suero de ratón) como anticuerpo primario para permitir que el anticuerpo en la muestra se una al antígeno.First, a purified or partially purified antigen is adsorbed to the surface of a solid phase such as a 96-well plate for ELISA, and the surface of the solid phase that has no antigen adsorbed therein is covered with an unrelated protein with the antigen such as bovine serum albumin (hereinafter referred to as "BSA"). After washing the surface, it is contacted with a successively diluted sample (eg, mouse serum) as the primary antibody to allow the antibody in the sample to bind to the antigen.
Además, como anticuerpo secundario, se añade un anticuerpo etiquetado con una enzima contra un anticuerpo de ratón y se permite que se una al anticuerpo de ratón. Después del lavado, se añade un sustrato para la enzima y se mide un cambio en la absorbancia que se produce debido al desarrollo del color inducido por la degradación del sustrato o similar y el título del anticuerpo se calcula basándose en la medición.In addition, as a secondary antibody, an antibody labeled with an enzyme against a mouse antibody is added and allowed to bind to the mouse antibody. After washing, a substrate for the enzyme is added and a change in absorbance that is produced due to the color development induced by the degradation of the substrate or the like is measured and the antibody titer is calculated based on the measurement.
La separación de las células productoras de anticuerpos de las células esplénicas o linfocitos del animal inmunizado puede llevarse a cabo de acuerdo con un procedimiento conocido (por ejemplo, Kohler y col., Nature (1975), 256, pág. 495; Kohler y col., Eur. J. Immunol. (1977), 6, pág. 511; Milstein y col., Nature (1977), 266, pág. 550; Walsh, Nature (1977), 266, pág. 495). Por ejemplo, en el caso de las células esplénicas, puede emplearse un procedimiento general en el que las células productoras de anticuerpos se separan homogeneizando el bazo para obtener las células mediante filtración con una malla de acero inoxidable y suspendiendo las células en Medio Mínimo Esencial (MEM) de Eagle.Separation of the antibody producing cells from the spleen cells or lymphocytes of the immunized animal can be carried out according to a known procedure (eg, Kohler et al., Nature (1975), 256, p. 495; Kohler et al. ., Eur. J. Immunol. (1977), 6, p. 511; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550; Walsh, Nature (1977), 266, p. 495). For example, in the case of splenic cells, a general procedure can be employed in which antibody producing cells are separated by homogenizing the spleen to obtain the cells by filtration with a stainless steel mesh and suspending the cells in Minimum Essential Medium ( MEM) from Eagle.
(c) Preparación de células de mieloma (en lo sucesivo denominadas como "mieloma")(c) Preparation of myeloma cells (hereinafter referred to as "myeloma")
Las células de mieloma que se usarán para la fusión celular no están particularmente limitadas y las células adecuadas pueden seleccionarse de líneas celulares conocidas. Sin embargo, teniendo en cuenta la conveniencia cuando un hibridoma se selecciona de entre células fusionadas, se prefiere usar una cepa deficiente en HGPRT (hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa) cuyo procedimiento de selección se ha establecido.The myeloma cells that will be used for cell fusion are not particularly limited and suitable cells can be selected from known cell lines. However, taking into account the convenience when a hybridoma is selected from among fused cells, it is preferred to use a strain deficient in HGPRT (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase) whose selection procedure has been established.
De manera más específica, los ejemplos de la cepa deficiente en HGPRT incluyen X63-Ag8 (X63), NS1- ANS/1(NS1), P3X63-Ag8.U1(P3U1), X63-Ag8.653(X63.653), SP2/0-Ag14(SP2/0), MPC11-45.6TG1.7(45.6TG), FO, S149/5XXO y BU.1 derivadas de ratones; 210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3) derivada de ratas; y U266AR(SKO-007), GM1500- GTG-A12(GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2(HMy2) y 8226AR/NIP4-1(NP41) derivadas de seres humanos. Estas cepas deficientes en HGPRT están disponibles de, por ejemplo, la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) o similar.More specifically, examples of the strain deficient in HGPRT include X63-Ag8 (X63), NS1-ANS / 1 (NS1), P3X63-Ag8.U1 (P3U1), X63-Ag8.653 (X63.653), SP2 / 0-Ag14 (SP2 / 0), MPC11-45.6TG1.7 (45.6TG), FO, S149 / 5XXO and BU.1 derived from mice; 210.RSY3.Ag.1.2.3 (Y3) derived from rats; and U266AR (SKO-007), GM1500- GTG-A12 (GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2 (HMy2) and 8226AR / NIP4-1 (NP41) derived from humans. These strains deficient in HGPRT are available from, for example, the American Type Culture Collection (ATCC) or the like.
Estas cepas celulares se subcultivan en un medio apropiado tal como un medio de 8-azaguanina [un medio obtenido añadiendo 8-azaguanina a un medio RPMI 1640 suplementado con glutamina, 2-mercaptoetanol, gentamicina y suero de ternera fetal (en lo sucesivo denominado "FCS")], medio de Dulbecco modificado por Iscove (en lo sucesivo denominado" IMDM "), o medio de Eagle modificado por Dulbecco (en lo sucesivo denominado" DMEM "). En este caso, de 3 a 4 días antes de realizar la fusión celular, las células se subcultivan en un medio normal [por ejemplo, un medio ASF104 (fabricado por Ajinomoto Co., Ltd.) que contenía el 10 % de FCS] para garantizar no menos de 2 x 107 células el día de la fusión celular.These cell strains are subcultured in an appropriate medium such as an 8-azaguanine medium [a medium obtained by adding 8-azaguanine to an RPMI 1640 medium supplemented with glutamine, 2-mercaptoethanol, gentamicin and fetal calf serum (hereinafter referred to as " FCS ")], Dulbecco's medium modified by Iscove (hereinafter referred to as" IMDM "), or Eagle's medium modified by Dulbecco (hereinafter referred to as" DMEM "). In this case, 3 to 4 days before performing cell fusion, the cells are subcultured in a normal medium [eg, an ASF104 medium (manufactured by Ajinomoto Co., Ltd.) containing 10% FCS] to guarantee not less than 2 x 107 cells the day of cell fusion.
(d) Fusión celular(d) Cell Fusion
La fusión entre las células productoras de anticuerpos y las células de mieloma puede realizarse apropiadamente de acuerdo con un procedimiento conocido (Weir, DM Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. y Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher, Springfield, Illinois (1964), etc.), en condiciones tales que la tasa de supervivencia de las células no se reduzca excesivamente.Fusion between antibody producing cells and myeloma cells can be performed appropriately according to a known procedure (Weir, DM Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, EA and Mayer, MM, Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher, Springfield, Illinois (1964), etc.), under conditions such that the survival rate of the cells is not excessively reduced.
Como dicho procedimiento, por ejemplo, puede usarse un procedimiento químico en el que las células productoras de anticuerpos y las células de mieloma se mezclan en una solución que contiene un polímero tal como polietilenglicol a alta concentración, un procedimiento físico que usan estimulación eléctrica, o similar. Entre estos procedimientos, un ejemplo específico del procedimiento químico es tal como se describe a continuación.As such a procedure, for example, a chemical procedure can be used in which antibody producing cells and myeloma cells are mixed in a solution containing a polymer such as high concentration polyethylene glycol, a physical procedure using electrical stimulation, or Similary. Among these procedures, a specific example of the chemical process is as described below.
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Es decir, en el caso en el que se usa polietilenglicol en la solución que contiene un polímero a alta concentración, las células productoras de anticuerpos y las células de mieloma se mezclan en una solución de polietilenglicol que tiene un peso molecular de 1500 a 6000, más preferentemente de 2000 a 4000 a una temperatura de 30 a 40 °C, preferentemente de 35 a 38 °C durante de 1 a 10 minutos, preferentemente de 5 a 8 minutos.That is, in the case where polyethylene glycol is used in the solution containing a high concentration polymer, the antibody producing cells and myeloma cells are mixed in a polyethylene glycol solution having a molecular weight of 1500 to 6000, more preferably from 2000 to 4000 at a temperature of 30 to 40 ° C, preferably 35 to 38 ° C for 1 to 10 minutes, preferably 5 to 8 minutes.
(e) Selección de un grupo de hibridomas(e) Selection of a group of hybridomas
El procedimiento de selección de hibridomas obtenidos mediante la fusión celular descrita anteriormente no está particularmente limitado. Normalmente, se usa un procedimiento de selección HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina) (Kohler y col., Nature (1975), 256, pág. 495; Milstein y col., Nature (1977), 266, pág. 550).The hybridoma selection procedure obtained by the cell fusion described above is not particularly limited. Normally, a HAT selection procedure (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) (Kohler et al., Nature (1975), 256, p. 495; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550) is used.
Este procedimiento es eficaz cuando se obtienen hibridomas usando células de mieloma de una cepa deficiente en HGPRT que no pueden sobrevivir en presencia de aminopterina.This procedure is effective when hybridomas are obtained using myeloma cells of a strain deficient in HGPRT that cannot survive in the presence of aminopterin.
Es decir, cultivando células no fusionadas e hibridomas en un medio HAT, sólo se permite selectivamente sobrevivir y proliferar a los hibridomas resistentes a la aminopterina.That is, by culturing non-fused cells and hybridomas in a HAT medium, only aminopterin-resistant hybridomas are allowed selectively to survive and proliferate.
(f) División en clones de una sola célula (clonación)(f) Division into single cell clones (cloning)
Como procedimiento de clonación para hibridomas, puede usarse un procedimiento conocido tal como un procedimiento de metilcelulosa, un procedimiento de agarosa suave o un procedimiento de dilución limitante (véase, por ejemplo, Barbara, B. M. y Stanley, M. S.: Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980)). Entre estos procedimientos, particularmente, se prefiere un procedimiento de cultivo tridimensional tal como un procedimiento de metilcelulosa. Por ejemplo, el grupo de hibridomas producidos por fusión celular se suspenden en un medio de metilcelulosa tal como ClonaCell-HY Selection Medium D (fabricado por StemCell Technologies, Inc., n° 03804) y se cultiva. A continuación, se recogen las colonias de hibridoma formadas, con lo que pueden obtenerse hibridomas monoclonales. Las colonias de hibridoma recogidas respectivas se cultivan, y se selecciona un hibridoma que se ha confirmado que tiene un título de anticuerpo estable en un sobrenadante de cultivo de hibridoma obtenido como una cepa de hibridoma productor de anticuerpo monoclonal B7-H3.As a cloning procedure for hybridomas, a known method such as a methylcellulose procedure, a mild agarose procedure or a limiting dilution procedure can be used (see, for example, Barbara, BM and Stanley, MS: Selected Methods in Cellular Immunology, WH Freeman and Company, San Francisco (1980)). Among these procedures, particularly, a three-dimensional culture method such as a methyl cellulose process is preferred. For example, the group of hybridomas produced by cell fusion are suspended in a methylcellulose medium such as ClonaCell-HY Selection Medium D (manufactured by StemCell Technologies, Inc., No. 03804) and grown. Next, the hybridoma colonies formed are collected, whereby monoclonal hybridomas can be obtained. The respective collected hybridoma colonies are cultured, and a hybridoma that has been confirmed to have a stable antibody titer in a hybridoma culture supernatant obtained as a hybridoma strain producing monoclonal antibody B7-H3 is selected.
Los ejemplos de la cepa de hibridoma establecida de este modo incluyen el hibridoma M30 de B7-H3. En la presente memoria descriptiva, un anticuerpo producido por el hibridoma M30 de B7-H3 se denomina "anticuerpo M30" o simplemente "M30".Examples of the hybridoma strain established in this way include the M30 hybridoma of B7-H3. In the present specification, an antibody produced by the M30 hybridoma of B7-H3 is called "M30 antibody" or simply "M30."
La cadena pesada del anticuerpo M30 tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 20 en el listado de secuencias. Además, la cadena ligera del anticuerpo M30 tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 21 en el listado de secuencias. En la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada representada por la SEQ ID NO: 20 en el listado de secuencias, una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 1 a 19 es una secuencia señal, una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 20 a 141 es una región variable, y una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 142 a 471 es una región constante. Además, en la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera representada por la SEQ ID NO: 21 en el listado de secuencias, una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 1 a 22 es una secuencia señal, una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 23 a 130 es una región variable, y la secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 131 a 235 es una región constante.The M30 antibody heavy chain has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 in the sequence listing. In addition, the M30 antibody light chain has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 in the sequence listing. In the amino acid sequence of the heavy chain represented by SEQ ID NO: 20 in the sequence listing, an amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 19 is a signal sequence, an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 is a variable region, and an amino acid sequence consisting of amino acid residues 142 to 471 is a constant region. In addition, in the amino acid sequence of the light chain represented by SEQ ID NO: 21 in the sequence listing, an amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 22 is a signal sequence, an amino acid sequence consisting of in amino acid residues 23 to 130 it is a variable region, and the amino acid sequence consisting of amino acid residues 131 to 235 is a constant region.
(g) Preparación del anticuerpo monoclonal mediante cultivo de hibridoma(g) Preparation of the monoclonal antibody by hybridoma culture
Cultivando el hibridoma seleccionado de este modo, puede obtenerse de manera eficiente un anticuerpo monoclonal. Sin embargo, antes del cultivo, se prefiere realizar el cribado de un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal diana.By culturing the hybridoma selected in this way, a monoclonal antibody can be obtained efficiently. However, before culturing, it is preferred to screen a hybridoma that produces a target monoclonal antibody.
En dicho cribado, puede emplearse un procedimiento conocido.In said screening, a known procedure can be used.
La medición del título de anticuerpos en la invención puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante un procedimiento ELISA explicado en el punto (b) descrito anteriormente.The measurement of the antibody titer in the invention can be carried out, for example, by an ELISA procedure explained in point (b) described above.
El hibridoma obtenido mediante el procedimiento descrito anteriormente puede almacenarse en un estado congelado en nitrógeno líquido o en un congelador a -80 °C o menos.The hybridoma obtained by the procedure described above can be stored in a frozen state in liquid nitrogen or in a freezer at -80 ° C or less.
Después de la finalización de la clonación, el medio se cambia de un medio HT a un medio normal, y el hibridoma se cultiva.After completion of cloning, the medium is changed from an HT medium to a normal medium, and the hybridoma is cultured.
El cultivo a gran escala se lleva a cabo mediante cultivo de rotación usando una botella de cultivo grande o mediante un cultivo giratorio. A partir del sobrenadante obtenido mediante el cultivo a gran escala, puede obtenerse un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a la proteína de la invención por purificación usando un procedimiento conocido por los expertos en la materia, tales como filtración en gel.Large-scale cultivation is carried out by rotating culture using a large culture bottle or by a rotating culture. From the supernatant obtained by large-scale culture, a monoclonal antibody that specifically binds to the protein of the invention can be obtained by purification using a method known to those skilled in the art, such as gel filtration.
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Además, el hibridoma se inyecta en la cavidad abdominal de un ratón de la misma cepa que el hibridoma (por ejemplo, la BALB/c descrita anteriormente) o un ratón Nu/Nu para proliferar el hibridoma, por lo que puede obtenerse la ascitis que contiene una gran cantidad del anticuerpo monoclonal de la invención.In addition, the hybridoma is injected into the abdominal cavity of a mouse of the same strain as the hybridoma (for example, the BALB / c described above) or a Nu / Nu mouse to proliferate the hybridoma, whereby ascites can be obtained. It contains a large amount of the monoclonal antibody of the invention.
En el caso en el que el hibridoma se administra en la cavidad abdominal, si se administra un aceite mineral tal como 2,6,10,14-tetrametil pentadecano (pristano) de 3 a 7 días antes del mismo, puede obtenerse una mayor cantidad de ascitis.In the case where the hybridoma is administered in the abdominal cavity, if a mineral oil such as 2,6,10,14-tetramethyl pentadecane (pristane) is administered 3 to 7 days before it, a greater amount can be obtained of ascites.
Por ejemplo, un inmunosupresor se inyecta previamente en la cavidad abdominal de un ratón de la misma cepa que el hibridoma para inactivar los linfocitos T. 20 días después, de 106 a 107 células de clones de hibridoma se suspenden en un medio libre de suero (0,5 ml) y la suspensión se administra en la cavidad abdominal del ratón. En general, cuando el abdomen se expande y se llena con la ascitis, la ascitis se recoge del ratón. Mediante este procedimiento, el anticuerpo monoclonal puede obtenerse a una concentración que es aproximadamente 100 veces o mucho mayor que en la solución de cultivo.For example, an immunosuppressant is previously injected into the abdominal cavity of a mouse of the same strain as the hybridoma to inactivate T lymphocytes. 20 days later, 106 to 107 cells of hybridoma clones are suspended in a serum-free medium ( 0.5 ml) and the suspension is administered in the abdominal cavity of the mouse. In general, when the abdomen expands and fills with ascites, ascites is collected from the mouse. By this procedure, the monoclonal antibody can be obtained at a concentration that is approximately 100 times or much higher than in the culture solution.
El anticuerpo monoclonal obtenido mediante el procedimiento descrito anteriormente puede purificarse mediante un procedimiento descrito en, por ejemplo, Weir, D. M.: Handbook of Experimental Immunology vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978).The monoclonal antibody obtained by the procedure described above can be purified by a procedure described in, for example, Weir, D. M .: Handbook of Experimental Immunology vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978).
El anticuerpo monoclonal obtenido de este modo tiene una alta especificidad por el antígeno para B7-H3.The monoclonal antibody thus obtained has a high specificity for the antigen for B7-H3.
(h) Ensayo de anticuerpo monoclonal(h) Monoclonal antibody assay
El isotipo y la subclase del anticuerpo monoclonal obtenido de este modo pueden determinarse de la siguiente manera.The isotype and subclass of the monoclonal antibody obtained in this way can be determined as follows.
En primer lugar, los ejemplos del procedimiento de identificación incluyen un procedimiento de Ouchterlony, un procedimiento ELISA y un procedimiento RIA.First, examples of the identification procedure include an Ouchterlony procedure, an ELISA procedure and an RIA procedure.
Un procedimiento de Ouchterlony es sencillo, pero cuando la concentración del anticuerpo monoclonal es baja, se requiere una operación de condensación.An Ouchterlony procedure is simple, but when the concentration of the monoclonal antibody is low, a condensation operation is required.
Por otra parte, cuando se utiliza un procedimiento ELISA o un procedimiento RIA, haciendo reaccionar directamente el sobrenadante del cultivo con una fase sólida adsorbida al antígeno y usando anticuerpos correspondientes a diversos tipos de isotipos y subclases de inmunoglobulinas como anticuerpos secundarios, pueden identificarse el isotipo y la subclase del anticuerpo monoclonal.On the other hand, when an ELISA procedure or an RIA procedure is used, by directly reacting the culture supernatant with a solid phase adsorbed to the antigen and using antibodies corresponding to various types of isotypes and subclasses of immunoglobulins as secondary antibodies, the isotype can be identified. and the subclass of the monoclonal antibody.
Además, como un procedimiento más sencillo, también puede usarse un kit de identificación disponible en el mercado (por ejemplo, Mouse Typer Kit fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) o similar.In addition, as a simpler procedure, a commercially available identification kit (eg, Mouse Typer Kit manufactured by Bio-Rad Laboratories, Inc.) or the like can also be used.
Además, la determinación cuantitativa de una proteína puede realizarse mediante el procedimiento de Folin Lowry y un procedimiento de cálculo basado en la absorbancia a 280 nm [1,4 (DO 280) = Inmunoglobulina 1 mg/ml].In addition, quantitative determination of a protein can be carried out by the Folin Lowry procedure and a calculation procedure based on absorbance at 280 nm [1,4 (OD 280) = 1 mg / ml immunoglobulin].
Además, incluso cuando el anticuerpo monoclonal se obtiene por separado e independientemente realizando nuevamente las etapas de (a) a (h) en (2), es posible obtener un anticuerpo que tenga una actividad citotóxica equivalente a la del anticuerpo M30. Como ejemplo de dicho anticuerpo, puede indicarse como ejemplo un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo M30. El M30 reconoce un epítopo en el dominio IgC1 o IgC2, que es un dominio en el dominio extracelular de B7-H3, y se une al dominio IgC1 o al dominio IgC2 o a ambos. Por lo tanto, como el epítopo para el anticuerpo de la invención, particularmente, puede indicarse como ejemplo un epítopo presente en el dominio IgC1 o IgC2 de B7-H3. Si un anticuerpo monoclonal recién producido se une a un péptido parcial o a una estructura terciaria parcial a la que se une el anticuerpo M30, puede determinarse que el anticuerpo monoclonal se une al mismo epítopo que el anticuerpo M30. Además, confirmando que el anticuerpo monoclonal compite con el anticuerpo M30 por la unión a B7-H3 (es decir, el anticuerpo monoclonal inhibe la unión entre el anticuerpo M30 y B7-H3), puede determinarse que el anticuerpo monoclonal se une al mismo epítopo que el anticuerpo M30 incluso si no se ha determinado la secuencia o estructura específica del epítopo. Cuando se confirma que el anticuerpo monoclonal se une al mismo epítopo que el anticuerpo M30, se espera fuertemente que el anticuerpo monoclonal tenga una actividad citotóxica equivalente a la del anticuerpo M30.Furthermore, even when the monoclonal antibody is obtained separately and independently by performing the steps from (a) to (h) in (2) again, it is possible to obtain an antibody having a cytotoxic activity equivalent to that of the M30 antibody. As an example of said antibody, an antibody that binds to the same epitope as the M30 antibody can be indicated as an example. M30 recognizes an epitope in the IgC1 or IgC2 domain, which is a domain in the extracellular domain of B7-H3, and binds to the IgC1 domain or the IgC2 domain or both. Therefore, as the epitope for the antibody of the invention, in particular, an epitope present in the IgC1 or IgC2 domain of B7-H3 can be indicated as an example. If a newly produced monoclonal antibody binds a partial peptide or a partial tertiary structure to which the M30 antibody binds, it can be determined that the monoclonal antibody binds to the same epitope as the M30 antibody. In addition, confirming that the monoclonal antibody competes with the M30 antibody for binding to B7-H3 (i.e., the monoclonal antibody inhibits binding between the M30 antibody and B7-H3), it can be determined that the monoclonal antibody binds to the same epitope that the M30 antibody even if the specific sequence or structure of the epitope has not been determined. When it is confirmed that the monoclonal antibody binds to the same epitope as the M30 antibody, the monoclonal antibody is strongly expected to have a cytotoxic activity equivalent to that of the M30 antibody.
(3) Otros anticuerpos(3) Other antibodies
El anticuerpo de la invención incluye no solamente el anticuerpo monoclonal descrito anteriormente contra B7-H3 sino también un anticuerpo recombinante obtenido mediante modificación artificial con el fin de disminuir la antigenicidad heteróloga en seres humanos, tal como un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano. Estos anticuerpos pueden producirse usando un procedimiento conocido.The antibody of the invention includes not only the monoclonal antibody described above against B7-H3 but also a recombinant antibody obtained by artificial modification in order to decrease heterologous antigenicity in humans, such as a chimeric antibody, a humanized antibody and an antibody. human. These antibodies can be produced using a known procedure.
Como el anticuerpo quimérico, puede indicarse como ejemplo un anticuerpo en el que las regiones variable y constante de anticuerpo se derivan de diferentes especies, por ejemplo, un anticuerpo quimérico en el que una región variable de anticuerpo derivada de ratón o rata se conecta a una región constante de anticuerpo derivada de humano (véase Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 81,6851-6855, (1984).As the chimeric antibody, an antibody may be indicated as an example in which the variable and constant antibody regions are derived from different species, for example, a chimeric antibody in which a mouse or rat derived antibody variable region is connected to a human-derived antibody constant region (see Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81.6851-6855, (1984).
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Como el anticuerpo humanizado, puede indicarse como ejemplo un anticuerpo obtenido integrando solamente una región determinante de complementariedad (CDR) en un anticuerpo derivado de un ser humano (véase Nature (1986) 321, págs. 522-525), y un anticuerpo obtenido injertando una parte de los restos de aminoácido del marco así como la secuencia de CDR para un anticuerpo humano mediante un procedimiento de injerto de CDR (documento WO 90/07861).As the humanized antibody, an antibody obtained by integrating only one complementarity determining region (CDR) into an antibody derived from a human being can be indicated as an example (see Nature (1986) 321, pp. 522-525), and an antibody obtained by grafting a part of the amino acid residues of the framework as well as the CDR sequence for a human antibody by a CDR graft procedure (WO 90/07861).
Sin embargo, el anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo M30 no está limitado a un anticuerpo humanizado específico, siempre que el anticuerpo humanizado tenga los 6 tipos de secuencias de CDR del anticuerpo M30 y tenga una actividad antitumoral. La región variable de cadena pesada del anticuerpo M30 tiene CDRH1 (NYVMH) que consiste en una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 3 en el listado de secuencias, CDRH2 (YINPYNDDVKYNEKFKG) que consiste en una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 4, en el listado de secuencias, y CDRH3 (WGYYGSPLYYFDY) que consiste en una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 5 en el listado de secuencias. Además, la región variable de cadena ligera del anticuerpo M30 tiene CDRL1 (RASSRLIYMH) que consiste en una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 6 en el listado de secuencias, CDRL2 (ATSNLAS) que consiste en una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 7, en el listado de secuencias, y CDRL3 (QQWNSNPPT) que consiste en una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 8 en el listado de secuencias.However, the humanized antibody derived from the M30 antibody is not limited to a specific humanized antibody, as long as the humanized antibody has the 6 types of CDR sequences of the M30 antibody and has an antitumor activity. The heavy chain variable region of the M30 antibody has CDRH1 (NYVMH) consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, CDRH2 (YINPYNDDVKYNEKFKG) consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, in the sequence listing, and CDRH3 (WGYYGSPLYYFDY) consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 in the sequence listing. In addition, the M30 antibody light chain variable region has CDRL1 (RASSRLIYMH) consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 in the sequence listing, CDRL2 (ATSNLAS) consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, in the sequence listing, and CDRL3 (QQWNSNPPT) consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 in the sequence listing.
Como un ejemplo del anticuerpo humanizado de un anticuerpo de ratón M30, puede indicarse como ejemplo una combinación arbitraria de una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en una cualquiera de (1) una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 20 a 141 de la SEQ ID NO: 9, 10, 11 o 12 en el listado de secuencias, (2) una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 95 % o más con la secuencia de aminoácidos (1) descrita anteriormente, y (3) una secuencia de aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos secuencia de aminoácidos (1) descrita anteriormente se eliminan, se sustituyen o se añaden y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en cualquiera de (4) una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 21 a 128 de la SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19 en el listado de secuencias, (5) una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 95 % o más con secuencia de aminoácidos (4) descrita anteriormente, y (6) una secuencia de aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos (4) descrita anteriormente se eliminan, se sustituyen o se añaden.As an example of the humanized antibody of an M30 mouse antibody, an arbitrary combination of a heavy chain comprising an variable heavy chain region consisting of any one of (1) an amino acid sequence consisting of the moieties may be indicated as an example of amino acid 20 to 141 of SEQ ID NO: 9, 10, 11 or 12 in the sequence listing, (2) an amino acid sequence having a homology of at least 95% or more with the amino acid sequence (1 ) described above, and (3) an amino acid sequence in which one or several amino acid sequence amino acids (1) described above are removed, substituted or added and a light chain comprising a light chain variable region consisting of any of (4) an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18 or 19 in the sequence listing, (5) a sequence of amino acids that you have a homology of at least 95% or more with amino acid sequence (4) described above, and (6) an amino acid sequence in which one or more amino acids in the amino acid sequence (4) described above are removed, replaced or are added.
El término "varios", tal como se usa en el presente documento, se refiere a de 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, o 1 o 2.The term "various", as used herein, refers to from 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3 , or 1 or 2.
Como la sustitución de aminoácidos en la presente memoria descriptiva, se prefiere una sustitución conservativa de aminoácidos. La sustitución conservativa de aminoácidos se refiere a una sustitución que se produce dentro de un grupo de aminoácidos relacionados con las cadenas laterales de aminoácidos. Los grupos de aminoácidos preferidos son los siguientes: un grupo ácido (ácido aspártico y ácido glutámico); un grupo básico (lisina, arginina e histidina); un grupo no polar (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina y triptófano); y una familia polar no cargada (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina y tirosina). Grupos de aminoácidos más preferidos son los siguientes: un grupo hidroxi alifático (serina y treonina); un grupo que contiene amida (asparagina y glutamina); un grupo alifático (alanina, valina, leucina e isoleucina); y un grupo aromático (fenilalanina, triptófano y tirosina). Dicha sustitución de aminoácido se realiza preferentemente dentro de un intervalo que no altera las propiedades de una sustancia que tiene la secuencia de aminoácidos original.As the amino acid substitution herein, a conservative amino acid substitution is preferred. Conservative amino acid substitution refers to a substitution that occurs within a group of amino acids related to amino acid side chains. Preferred amino acid groups are the following: an acid group (aspartic acid and glutamic acid); a basic group (lysine, arginine and histidine); a non-polar group (alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine and tryptophan); and an uncharged polar family (glycine, asparagine, glutamine, cysteine, serine, threonine and tyrosine). Most preferred amino acid groups are the following: an aliphatic hydroxy group (serine and threonine); a group containing amide (asparagine and glutamine); an aliphatic group (alanine, valine, leucine and isoleucine); and an aromatic group (phenylalanine, tryptophan and tyrosine). Said amino acid substitution is preferably performed within a range that does not alter the properties of a substance that has the original amino acid sequence.
Como un anticuerpo que tiene una combinación preferida de una cadena pesada y una cadena ligera descrito anteriormente, un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 20 a 141 de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 21 a 128 de la SEQ ID NO: 13; un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 20 a 141 de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 21 a 128 de la SEQ ID NO: 14; un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 20 a 141 de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 21 a 128 de la SEQ ID NO: 15; un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 20 a 141 de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 21 a 128 de la SEQ ID NO: 16; un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 20 a 141 de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 21 a 128 de la SEQ ID NO: 17; un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 20 a 141 de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende una regiónAs an antibody having a preferred combination of a heavy chain and a light chain described above, an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues. at 141 of SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising a light chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 13; an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising a variable region of light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 14; an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising a variable region of light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 15; an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising a variable region of light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 16; an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising a variable region of light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 17; an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising a region
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variable de cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 21 a 128 de la SEQ ID NO: 18; un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácidolight chain variable consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 18; an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues
20 a 141 de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 21 a 128 de la SEQ ID NO: 19; un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 20 a 141 de la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 21 a 128 de la SEQ ID NO: 13; un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 20 a 141 de la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido20 to 141 of SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising a light chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 19; an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising a variable region of light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 13; an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising a variable region of light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues
21 a 128 de la SEQ ID NO: 14; un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 20 a 141 de la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 21 a 128 de la SEQ ID NO: 15; y un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 20 a 141 de la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 21 a 128 de la SEQ ID NO: 16 pueden indicarse como ejemplo.21 to 128 of SEQ ID NO: 14; an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising a variable region of light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 15; and an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising a variable region Light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 16 can be indicated as an example.
Además, como un anticuerpo que tiene una combinación más preferida de una cadena pesada y una cadena ligera descrito anteriormente, un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 20 a 471 de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 21 a 233 de la SEQ ID NO: 13; un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 20 a 471 de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 21 a 233 de la SEQ ID NO: 14; un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 20 a 471 de la sEq ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 21 a 233 de la SEQ ID NO: 15; un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 20 a 471 de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 21 a 233 de la SEQ ID NO: 16; un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 20 a 471 de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 21 a 233 de la SEQ ID NO: 17; un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 20 a 471 de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 21 a 233 de la SEQ ID NO: 18; un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 20 a 471 de la sEq ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 21 a 233 de la SEQ ID NO: 19; un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 20 a 471 de la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 21 a 233 de la SEQ ID NO: 13; un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 20 a 471 de la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 21 a 233 de la SEQ ID NO: 14; un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 20 a 471 de la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 21 a 233 de la SEQ ID NO: 15; y un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 20 a 471 de la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 21 a 233 de la SEQ ID NO: 16 pueden indicarse como ejemplo.In addition, as an antibody having a more preferred combination of a heavy chain and a light chain described above, an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: 13; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: 14; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of sEq ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: 15; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: 16; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: 17; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: 18; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of sEq ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: 19; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: 13; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: 14; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: 15; and an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of the amino acid residues amino acid 21 to 233 of SEQ ID NO: 16 can be indicated as an example.
Además, como un anticuerpo que tiene otra combinación más preferida de una cadena pesada y una cadena ligera descrito anteriormente, un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13; un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14; un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15; un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16; un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17; un anticuerpo que consiste en una cadena pesadaIn addition, as an antibody having another more preferred combination of a heavy chain and a light chain described above, an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of in an amino acid sequence of SEQ ID NO: 13; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 14; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 16; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 17; an antibody consisting of a heavy chain
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que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18; un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19; un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13; un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14; un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15; y un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 pueden indicarse como ejemplo.consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 18; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 13; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 14; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15; and an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 can be indicated as an example.
Combinando una secuencia que tiene una alta homología con la secuencia de aminoácidos de cadena pesada descrita anteriormente con una secuencia que tiene una alta homología con la secuencia de aminoácidos de cadena ligera descrita anteriormente, es posible seleccionar un anticuerpo que tenga una actividad citotóxica equivalente a la de cada uno de los anticuerpos descritos anteriormente. Dicha homología es generalmente una homología del 80 % o más, preferentemente una homología del 90 % o más, más preferentemente una homología del 95 % o más, lo más preferentemente una homología del 99 % o más. Además, combinando una secuencia de aminoácidos en la que uno a varios restos de aminoácido se sustituyen, eliminan o añaden en la secuencia de aminoácidos de cadena pesada o cadena ligera, también es posible seleccionar un anticuerpo que tenga una actividad citotóxica equivalente a la de cada uno de los anticuerpos descritos anteriormente.By combining a sequence that has a high homology with the heavy chain amino acid sequence described above with a sequence that has a high homology with the light chain amino acid sequence described above, it is possible to select an antibody having a cytotoxic activity equivalent to the of each of the antibodies described above. Said homology is generally a homology of 80% or more, preferably a homology of 90% or more, more preferably a homology of 95% or more, most preferably a homology of 99% or more. In addition, by combining an amino acid sequence in which one to several amino acid residues are substituted, removed or added in the heavy chain or light chain amino acid sequence, it is also possible to select an antibody that has a cytotoxic activity equivalent to that of each one of the antibodies described above.
La homología entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse usando parámetros por defecto del algoritmo Blast, versión 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller y David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). El algoritmo Blast también puede usarse a través de Internet accediendo al sitio
www.ncbi.nlm.nih.gov/blast.The homology between two amino acid sequences can be determined using default parameters of the Blast algorithm, version 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). The Blast algorithm can also be used over the Internet by accessing the site
www.ncbi.nlm.nih.gov/blast.
En la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada representada por la SEQ ID NO: 9, 10, 11 o 12 en el listado de secuencias, una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 1 a 19 es una secuencia señal, una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 20 a 141 es una región variable, y una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 142 a 471 es una región constante. La secuencia de la SEQ ID NO: 9, 10, 11 y 12 se muestran en las figuras 3, 4, 5 y 6, respectivamente.In the amino acid sequence of the heavy chain represented by SEQ ID NO: 9, 10, 11 or 12 in the sequence listing, an amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 19 is a signal sequence, a sequence of amino acids consisting of amino acid residues 20 to 141 is a variable region, and an amino acid sequence consisting of amino acid residues 142 to 471 is a constant region. The sequence of SEQ ID NO: 9, 10, 11 and 12 are shown in Figures 3, 4, 5 and 6, respectively.
Además, en la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera representada por la SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19 en el listado de secuencias, una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 1 a 20 es una secuencia señal, una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 21 a 128 es una región variable, y una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 129 a 233 es una región constante. La secuencia de la SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18 y 19 se muestran en las figuras 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13, respectivamente.In addition, in the amino acid sequence of the light chain represented by SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18 or 19 in the sequence listing, an amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 20 is a signal sequence, an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 128 is a variable region, and an amino acid sequence consisting of amino acid residues 129 to 233 is a constant region. The sequence of SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18 and 19 are shown in Figures 7, 8, 9, 10, 11, 12 and 13, respectively.
Además, el anticuerpo de la invención incluye un anticuerpo humano que se une al mismo epítopo que el anticuerpo M30. Un anticuerpo humano anti-B7-H3 se refiere a un anticuerpo humano que tiene solamente una secuencia de un anticuerpo derivado de un cromosoma humano. El anticuerpo humano anti-B7-H3 puede obtenerse mediante un procedimiento que usa un ratón productor de anticuerpos humanos que tiene un fragmento de cromosoma humano que comprende genes de cadena pesada y ligera de un anticuerpo humano (véase Tomizuka, K. y col., Nature Genetics (1997) 16, págs. 133-143; Kuroiwa, Y. y col., Nucl. Acids Res. (1998) 26, págs. 3447-3448; Yoshida, H. y col., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, págs. 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. e Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. (2000) 97, págs. 722727, etc.).In addition, the antibody of the invention includes a human antibody that binds to the same epitope as the M30 antibody. A human anti-B7-H3 antibody refers to a human antibody that has only one sequence of an antibody derived from a human chromosome. The human anti-B7-H3 antibody can be obtained by a method that uses a human antibody producing mouse that has a human chromosome fragment comprising heavy and light chain genes of a human antibody (see Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, pp. 133-143; Kuroiwa, Y. et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, pp. 3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, pp. 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA (2000) 97, pp. 722727, etc.).
Dicho ratón productor de anticuerpos humanos puede crearse específicamente de la siguiente manera. Un animal genéticamente modificado en el que se han alterado loci génicos de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina endógena, y en su lugar, se han introducido loci génicos de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana a través de un vector cromosómico artificial de levadura (YAC) o similar se crea produciendo un animal genomanipulado y un animal transgénico y haciendo aparearse a estos animales.Said human antibody producing mouse can be created specifically as follows. A genetically modified animal in which endogenous immunoglobulin heavy and light chain gene loci have been altered, and instead, human immunoglobulin heavy and light chain gene loci have been introduced through an artificial chromosomal yeast vector (YAC ) or similar is created by producing a genomanipulated animal and a transgenic animal and mating these animals.
Además, de acuerdo con una técnica de ADN recombinante, usando ADNc que codifican cada una de dichas cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo humano, y preferentemente un vector que comprende dichos ADNc, se transforman células eucariotas, y se cultiva una célula transformante que produce un anticuerpo monoclonal humano recombinante, por lo que el anticuerpo también puede obtenerse del sobrenadante del cultivo.Furthermore, according to a recombinant DNA technique, using cDNAs encoding each of said heavy chain and light chain of a human antibody, and preferably a vector comprising said cDNA, eukaryotic cells are transformed, and a transforming cell is cultured that produces a recombinant human monoclonal antibody, so the antibody can also be obtained from the culture supernatant.
En este caso, como hospedador, por ejemplo, pueden usarse células eucariotas, preferentemente células de mamífero tales como células CHO, linfocitos o células de mieloma.In this case, as a host, for example, eukaryotic cells, preferably mammalian cells such as CHO cells, lymphocytes or myeloma cells, can be used.
Además, También se conoce un procedimiento para obtener un anticuerpo humano derivado de presentación enIn addition, a method for obtaining a human antibody derived from presentation in
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fagos seleccionado de una biblioteca de anticuerpos humanos (véase Wormstone, I. M. y col., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), págs. 2301-2308; Carmen, S. y col., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), págs. 189-203; Siriwardena, D. y col., Ophthalmology (2002) 109 (3), págs. 427-431, etc.).phages selected from a library of human antibodies (see Wormstone, IM et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), pp. 2301-2308; Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), pp. 189-203; Siriwardena, D. et al., Ophthalmology (2002) 109 (3), pp. 427-431, etc.).
Por ejemplo, puede usarse un procedimiento de presentación en fagos en el que una región variable de un anticuerpo humano se expresa en la superficie de un fago como un anticuerpo monocatenario (scFv), y se selecciona un fago que se une a un antígeno (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), págs. 1105-1116).For example, a phage display method can be used in which a variable region of a human antibody is expressed on the surface of a phage as a single chain antibody (scFv), and a phage that binds to an antigen is selected (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), pp. 1105-1116).
Analizando el gen del fago seleccionado basándose en la unión a un antígeno, puede determinarse una secuencia de ADN que codifica la región variable de un anticuerpo humano que se une a un antígeno.By analyzing the selected phage gene based on binding to an antigen, a DNA sequence encoding the variable region of a human antibody that binds to an antigen can be determined.
Si se determina la secuencia de ADN de scFv que se une a un antígeno, puede obtenerse un anticuerpo humano preparando un vector de expresión que comprende la secuencia e introduciendo el vector en un hospedador apropiado para expresarlo (WO 92/01047, el documento WO 92/20791, el documento WO 93/06213, el documento Wo 93/11236, el documento WO 93/19172, el documento WO 95/01438, el documento WO 95/15388, Annu. Rev. Immunol. (1994) 12, págs. 433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), págs. 1105-1116).If the scFv DNA sequence that binds to an antigen is determined, a human antibody can be obtained by preparing an expression vector comprising the sequence and introducing the vector into an appropriate host to express it (WO 92/01047, WO 92 / 20791, WO 93/06213, Wo 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388, Annu. Rev. Immunol. (1994) 12, p. 433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), pp. 1105-1116).
Si un anticuerpo humano recién producido se une a un péptido parcial o a una estructura terciaria parcial a la que se une el anticuerpo M30, puede determinarse que el anticuerpo humano se une al mismo epítopo que el anticuerpo M30. Además, confirmando que el anticuerpo humano compite con el anticuerpo M30 por la unión a B7-H3 (es decir, el anticuerpo humano inhibe la unión entre el anticuerpo M30 y B7-H3), puede determinarse que el anticuerpo humano se une al mismo epítopo que el anticuerpo M30 incluso si no se ha determinado la secuencia o estructura específica del epítopo. Cuando se confirma que el anticuerpo humano se une al mismo epítopo que el anticuerpo M30, se espera fuertemente que el anticuerpo humano tenga una actividad citotóxica equivalente a la del anticuerpo M30.If a newly produced human antibody binds to a partial peptide or a partial tertiary structure to which the M30 antibody binds, it can be determined that the human antibody binds to the same epitope as the M30 antibody. In addition, by confirming that the human antibody competes with the M30 antibody for binding to B7-H3 (i.e., the human antibody inhibits binding between the M30 antibody and B7-H3), it can be determined that the human antibody binds to the same epitope that the M30 antibody even if the specific sequence or structure of the epitope has not been determined. When it is confirmed that the human antibody binds to the same epitope as the M30 antibody, it is strongly expected that the human antibody has a cytotoxic activity equivalent to that of the M30 antibody.
Los anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos obtenidos mediante el procedimiento descrito anteriormente se evalúan para determinar su propiedad de unión a un antígeno mediante un procedimiento conocido o similares, y puede seleccionarse un anticuerpo preferido.Chimeric antibodies, humanized antibodies or human antibodies obtained by the procedure described above are evaluated to determine their binding property to an antigen by a known method or the like, and a preferred antibody can be selected.
Como ejemplo de otro índice para su uso en la comparación de las propiedades de los anticuerpos, puede indicarse como ejemplo la estabilidad de los anticuerpos. El calorímetro diferencial de barrido (DSC) es un dispositivo capaz de medir de forma rápida y precisa una temperatura de punto medio de desnaturalización térmica (Tm) que se usará como un índice favorable de la estabilidad conformacional relativa de las proteínas. Midiendo los valores de Tm usando un DSC y comparando los valores, puede compararse una diferencia en la estabilidad térmica. Se sabe que la estabilidad en almacenamiento de los anticuerpos muestra cierta correlación con la estabilidad térmica de los mismos (Lori Burton, et. al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, págs. 265-273), y puede seleccionarse un anticuerpo preferido usando la estabilidad térmica como índice. Los ejemplos de otros índices para seleccionar anticuerpos incluyen las siguientes características: el rendimiento en una célula hospedadora apropiada es alto; y la agregabilidad en una solución acuosa es baja. Por ejemplo, un anticuerpo que muestra el rendimiento más alto no siempre muestra la estabilidad térmica más alta y, por lo tanto, es necesario seleccionar el anticuerpo más adecuado para la administración a seres humanos realizando una evaluación exhaustiva basada en los índices descritos anteriormente.As an example of another index for use in comparing the properties of the antibodies, the stability of the antibodies can be indicated as an example. The differential scanning calorimeter (DSC) is a device capable of quickly and accurately measuring a mid-point temperature of thermal denaturation (Tm) that will be used as a favorable index of the relative conformational stability of proteins. By measuring the values of Tm using a DSC and comparing the values, a difference in thermal stability can be compared. It is known that the storage stability of the antibodies shows some correlation with their thermal stability (Lori Burton, et. Al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, pp. 265-273), and an antibody can be selected preferred using thermal stability as an index. Examples of other indices for selecting antibodies include the following characteristics: the yield in an appropriate host cell is high; and the aggregation in an aqueous solution is low. For example, an antibody that shows the highest yield does not always show the highest thermal stability and, therefore, it is necessary to select the most suitable antibody for administration to humans by performing a thorough evaluation based on the indices described above.
En la invención, también se incluye una variante modificada del anticuerpo. La variante modificada se refiere a una variante obtenida sometiendo al anticuerpo de la invención a una modificación química o biológica. Los ejemplos de la variante químicamente modificada incluyen variantes químicamente modificadas enlazando un resto químico a una cadena principal de aminoácido, variantes químicamente modificadas con una cadena de carbohidrato enlazada a N o enlazada a O, etc. Los ejemplos de la variante biológicamente modificada incluyen variantes obtenidas por modificación después de la traducción (como glucosilación enlazada a N o enlazada a O, procesamiento N- o C- terminal, desamidación, isomerización de ácido aspártico u oxidación de metionina), y variantes en las que se ha añadido un resto de metionina al extremo N al expresarse en una célula hospedadora procariota.In the invention, a modified variant of the antibody is also included. The modified variant refers to a variant obtained by subjecting the antibody of the invention to a chemical or biological modification. Examples of the chemically modified variant include chemically modified variants by linking a chemical moiety to an amino acid backbone, chemically modified variants with an N-linked or O-linked carbohydrate chain, etc. Examples of the biologically modified variant include variants obtained by modification after translation (such as N-linked or O-linked glycosylation, N- or C-terminal processing, deamidation, aspartic acid isomerization or methionine oxidation), and variants in which has added a methionine residue to the N-terminus when expressed in a prokaryotic host cell.
Además, un anticuerpo etiquetado para permitir la detección o el aislamiento del anticuerpo o un antígeno de la invención, por ejemplo, un anticuerpo etiquetado con una enzima, un anticuerpo etiquetado con fluorescencia y un anticuerpo etiquetado por afinidad también están incluidos en el significado de la variante modificada. Dicha variante modificada del anticuerpo de la invención es útil para mejorar la estabilidad y la retención sanguínea del anticuerpo original de la invención, reduciendo la antigenicidad del mismo, detectando o aislando dicho anticuerpo o un antígeno, y así sucesivamente.In addition, an antibody labeled to allow detection or isolation of the antibody or an antigen of the invention, for example, an antibody labeled with an enzyme, a fluorescently labeled antibody and an affinity tagged antibody are also included in the meaning of the modified variant Said modified variant of the antibody of the invention is useful for improving the stability and blood retention of the original antibody of the invention, reducing the antigenicity thereof, detecting or isolating said antibody or an antigen, and so on.
Además, regulando la modificación de un glicano que está enlazado al anticuerpo de la invención (glucosilación, desfucosilación, etc.), es posible potenciar una actividad de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo. Como la técnica para regular la modificación de un glicano de anticuerpos, se conocen los documentos WO 99/54342, WO 00/61739, WO 02/31140, etc. Sin embargo, la técnica no está limitada a estas. En el anticuerpo de la invención, también está incluido un anticuerpo en el que la modificación de un glicano está regulada.In addition, by regulating the modification of a glycan that is bound to the antibody of the invention (glycosylation, de-glycosylation, etc.), it is possible to enhance an antibody-dependent cellular cytotoxicity activity. As the technique for regulating the modification of an antibody glycan, WO 99/54342, WO 00/61739, WO 02/31140, etc. are known. However, the technique is not limited to these. Also included in the antibody of the invention is an antibody in which the modification of a glycan is regulated.
En el caso en el que se produce un anticuerpo aislando en primer lugar un gen de anticuerpo e introduciendo, aIn the case where an antibody is produced by first isolating an antibody gene and introducing, to
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continuación, el gen en un hospedador apropiado, puede usarse una combinación de un hospedador apropiado y un vector de expresión apropiado. Los ejemplos específicos del gen de anticuerpo incluyen una combinación de un gen que codifica una secuencia de cadena pesada de un anticuerpo descrito en la presente memoria descriptiva y un gen que codifica una secuencia de cadena ligera del mismo. Cuando se transforma una célula hospedadora, es posible insertar el gen de la secuencia de cadena pesada y el gen de la secuencia de cadena ligera en el mismo vector de expresión, y también en diferentes vectores de expresión por separado.Then, the gene in an appropriate host, a combination of an appropriate host and an appropriate expression vector can be used. Specific examples of the antibody gene include a combination of a gene that encodes a heavy chain sequence of an antibody described herein and a gene that encodes a light chain sequence thereof. When a host cell is transformed, it is possible to insert the heavy chain sequence gene and the light chain sequence gene into the same expression vector, and also into different expression vectors separately.
En el caso en el que se usan células eucariotas como hospedador, pueden usarse células animales, células vegetales y microorganismos eucariotas. Como las células animales, pueden indicarse como ejemplo células de mamífero, por ejemplo, células COS de simio (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, págs. 175-182, AtCC CRL-1650), fibroblastos murinos NIH3T3 (ATCC n.° CRL-1658), y cepas deficientes en dihidrofolato reductasa (Urlaub, G. y Chasin, LA, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. (1980) 77, págs. 4126-4220) de células de ovario de hámster chino (células CHO; ATCC: CCL-61).In the case where eukaryotic cells are used as the host, animal cells, plant cells and eukaryotic microorganisms can be used. As animal cells, mammalian cells can be indicated as an example, for example, simian COS cells (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, pp. 175-182, AtCC CRL-1650), murine fibroblasts NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658), and strains deficient in dihydrofolate reductase (Urlaub, G. and Chasin, LA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 4126-4220) of Chinese hamster ovary (CHO cells; ATCC: CCL-61).
En el caso en el que se usan células procariotas, por ejemplo, pueden indicarse como ejemplo Escherichia coli y Bacillus subtilis.In the case where prokaryotic cells are used, for example, Escherichia coli and Bacillus subtilis can be indicated as an example.
Introduciendo un gen de anticuerpo deseado en estas células mediante transformación, y cultivando las células transformadas de este modo in vitro, puede obtenerse el anticuerpo. En el procedimiento de cultivo descritoBy introducing a desired antibody gene into these cells by transformation, and culturing the transformed cells in this way in vitro, the antibody can be obtained. In the culture procedure described
anteriormente, el rendimiento puede, algunas veces, variar dependiendo de la secuencia del anticuerpo y, por loPreviously, the yield may sometimes vary depending on the sequence of the antibody and, therefore,
tanto, es posible seleccionar un anticuerpo que se produzca fácilmente como un producto farmacéutico usando el rendimiento como índice entre los anticuerpos que tienen una actividad de unión equivalente. Por lo tanto, en el anticuerpo de la invención, un anticuerpo obtenido mediante un procedimiento de producción de un anticuerpo, caracterizado por incluir una etapa de cultivar la célula hospedadora transformada y una etapa de recoger un anticuerpo deseado a partir de un producto cultivado obtenido en la etapa de cultivo también está incluido.therefore, it is possible to select an antibody that is easily produced as a pharmaceutical product using the yield as an index among antibodies that have an equivalent binding activity. Therefore, in the antibody of the invention, an antibody obtained by a method of producing an antibody, characterized by including a step of culturing the transformed host cell and a step of collecting a desired antibody from a cultured product obtained in The cultivation stage is also included.
Se sabe que se elimina un resto de lisina en el extremo carboxilo de la cadena pesada de un anticuerpo producido en una célula de mamífero cultivada (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)), y también se sabe que se eliminan dos restos de aminoácido (glicina y lisina) en el extremo carboxilo de la cadena pesada de un anticuerpo producido en una célula de mamífero cultivada y se amida un resto de prolina recién localizado en el extremo carboxilo (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)). Sin embargo, dicha eliminación y modificación de laIt is known that a lysine residue is removed at the carboxyl end of the heavy chain of an antibody produced in a cultured mammalian cell (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)), and it is also known that they are removed two amino acid residues (glycine and lysine) at the carboxyl end of the heavy chain of an antibody produced in a cultured mammalian cell and a newly located proline residue at the carboxyl end is amidated (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 ( 2007)). However, said elimination and modification of the
secuencia de cadena pesada no afecta la afinidad de unión al antígeno y la función efectora (la activación de unheavy chain sequence does not affect the affinity of antigen binding and effector function (the activation of a
complemento, la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo, etc.) del anticuerpo. Por lo tanto, en la invención, también se incluye un anticuerpo sometido a dicha modificación, y una variante de eliminación en la que se han eliminado uno o dos aminoácidos en el extremo carboxilo de la cadena pesada, una variante obtenida por la amidación de la variante de eliminación (por ejemplo, una cadena pesada en la que se ha amidado el resto de prolina carboxilo terminal) y similares pueden indicarse como ejemplo. El tipo de variante de eliminación que tiene una eliminación en el extremo carboxilo de la cadena pesada del anticuerpo de acuerdo con la invención no se limita a las variantes anteriores siempre que se conserven la afinidad de unión al antígeno y la función efectora. Las dos cadenas pesadas que constituyen el anticuerpo de acuerdo con la invención pueden ser de un tipo seleccionado entre el grupo que consiste en una cadena pesada de longitud completa y la variante de eliminación descrita anteriormente, o pueden ser de dos tipos en combinación seleccionados a partir del mismo. La relación de la cantidad de cada variante de eliminación puede verse afectada por el tipo de células de mamífero cultivadas que producen el anticuerpo de acuerdo con la invención y las condiciones de cultivo, sin embargo, un caso en el que un resto de aminoácido en el extremo carboxilo se ha eliminado en ambos de las dos cadenas pesadas contenidas como componentes principales en el anticuerpo de acuerdo con la invención puede indicarse como ejemplo.complement, antibody-dependent cellular cytotoxicity, etc.) of the antibody. Therefore, an antibody subject to said modification is also included in the invention, and a deletion variant in which one or two amino acids have been removed at the carboxyl end of the heavy chain, a variant obtained by the amidation of the Elimination variant (for example, a heavy chain in which the rest of terminal carboxyl proline has been amidated) and the like can be indicated as an example. The type of elimination variant that has a carboxyl termination of the heavy chain of the antibody according to the invention is not limited to the above variants provided that the affinity for binding to the antigen and the effector function are preserved. The two heavy chains constituting the antibody according to the invention may be of a type selected from the group consisting of a full length heavy chain and the elimination variant described above, or they may be of two types in combination selected from of the same. The ratio of the amount of each elimination variant can be affected by the type of cultured mammalian cells that produce the antibody according to the invention and the culture conditions, however, a case in which an amino acid residue in the Carboxyl end has been removed in both of the two heavy chains contained as main components in the antibody according to the invention can be indicated as an example.
Puede indicarse como ejemplo un isótopo del anticuerpo de la invención, por ejemplo, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), y, preferentemente, puede indicarse como ejemplo IgG1 o IgG2.An isotope of the antibody of the invention can be indicated as an example, for example, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), and, preferably, IgG1 or IgG2 can be indicated as an example.
Como la función del anticuerpo, generalmente una actividad de unión a antígeno, una actividad de neutralización de la actividad de un antígeno, una actividad de potenciación de la actividad de un antígeno, una actividad de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) y una actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) pueden indicarse como ejemplo. la función del anticuerpo de la invención es una actividad de unión a B7-H3, preferentemente una actividad de fagocitosis mediada por células dependiente del anticuerpo (ADCP), más preferentemente una actividad citotóxica (actividad antitumoral) frente a célula tumoral mediada por una actividad ADCP. Además, el anticuerpo de la invención puede tener una actividad ADCC y/o una actividad CDC además de una actividad ADCP.As the function of the antibody, generally an antigen binding activity, a neutralization activity of the activity of an antigen, an activity enhancing the activity of an antigen, an activity of antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) and an activity of complement-dependent cytotoxicity (CDC) can be indicated as an example. The function of the antibody of the invention is a B7-H3 binding activity, preferably an antibody-dependent cell-mediated phagocytosis activity (ADCP), more preferably a cytotoxic activity (anti-tumor activity) versus tumor cell mediated by an ADCP activity . In addition, the antibody of the invention may have an ADCC activity and / or a CDC activity in addition to an ADCP activity.
El anticuerpo obtenido puede purificarse hasta homogeneidad. La separación y purificación del anticuerpo pueden realizarse empleando un procedimiento convencional de separación y purificación de proteínas. Por ejemplo, el anticuerpo puede separarse y purificarse seleccionando y combinando adecuadamente cromatografía en columna, filtración en filtro, ultrafiltración, precipitación con sales, diálisis, electroforesis en gel de poliacrilamida preparativa, electroforesis de enfoque isoeléctrico y similares (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak y col., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), pero el procedimiento no está limitado a estos.The antibody obtained can be purified until homogeneous. Separation and purification of the antibody can be performed using a conventional method of protein separation and purification. For example, the antibody can be separated and purified by properly selecting and combining column chromatography, filter filtration, ultrafiltration, salt precipitation, dialysis, preparative polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing electrophoresis and the like (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al., Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), but the procedure does not It is limited to these.
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Los ejemplos de dicha cromatografía incluyen cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de fase inversa y cromatografía de adsorción.Examples of such chromatography include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration chromatography, reverse phase chromatography and adsorption chromatography.
Dicha cromatografía puede realizarse empleando cromatografía líquida tal como HPLC o FPLC.Said chromatography can be performed using liquid chromatography such as HPLC or FPLC.
Como columna para usar en cromatografía de afinidad, pueden indicarse como ejemplo una columna de Proteína A y una columna de Proteína G. Por ejemplo, como una columna que usa una columna de Proteína A, pueden indicarse como ejemplo Hyper D, POROS, Sepharose FF (Pharmacia) y similares.As a column for use in affinity chromatography, a Protein A column and a Protein G column can be indicated as an example. For example, as a column using a Protein A column, Hyper D, POROS, Sepharose FF can be indicated as an example. (Pharmacia) and the like.
Además, usando un vehículo que tiene un antígeno inmovilizado sobre él, el anticuerpo también puede purificarse usando la propiedad de unión del anticuerpo al antígeno.In addition, using a vehicle that has an antigen immobilized on it, the antibody can also be purified using the antibody binding property to the antigen.
[Compuesto antitumoral][Anti-tumor compound]
Se explica el compuesto antitumoral que se conjugará con el conjugado de anticuerpo - fármaco de la presente invención. El compuesto antitumoral no está particularmente limitado si el mismo es un compuesto que tiene un efecto antitumoral y un grupo sustituyente o una estructura parcial que permite conectar con una estructura de enlazador. Cuando una parte o la totalidad de un enlazador se escinde en células tumorales, el resto de compuesto antitumoral se libera para mostrar el efecto antitumoral del compuesto antitumoral. Cuando el enlazador se escinde en una posición de conexión a fármaco, el compuesto antitumoral se libera en su estructura intrínseca para mostrar su efecto antitumoral intrínseco.The antitumor compound that will be conjugated to the antibody-drug conjugate of the present invention is explained. The antitumor compound is not particularly limited if it is a compound that has an antitumor effect and a substituent group or a partial structure that allows connection with a linker structure. When part or all of a linker is cleaved into tumor cells, the rest of the antitumor compound is released to show the antitumor effect of the antitumor compound. When the linker is cleaved in a drug connection position, the antitumor compound is released into its intrinsic structure to show its intrinsic antitumor effect.
Los ejemplos del compuesto antitumoral pueden incluir doxorrubicina, daunorrubicina, mitomicina C, bleomicina, ciclocitidina, vincristina, vinblastina, metotrexato, agente antitumoral a base de platino (cisplatino o derivados del mismo), taxol o derivados del mismo, y camptotecina o derivados de la misma (agente antitumoral descrito en la patente japonesa abierta a inspección pública n.° 6-87746). En el conjugado de anticuerpo - fármaco de la presente invención, puede usarse preferentemente exatecán como un derivado de camptotecina (((1S,9S)-1-amino-9-etil-5- fluoro-2,3-dihidro-9-hidroxi-4-metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-10,13(9H,15H)-diona; mostrada en la siguiente fórmula).Examples of the antitumor compound may include doxorubicin, daunorubicin, mitomycin C, bleomycin, cyclocytidine, vincristine, vinblastine, methotrexate, platinum-based antitumor agent (cisplatin or derivatives thereof), taxol or derivatives thereof, and camptothecin or derivatives thereof. same (antitumor agent described in the Japanese patent open for public inspection No. 6-87746). In the antibody-drug conjugate of the present invention, exatecan may preferably be used as a camptothecin derivative (((1S, 9S) -1-amino-9-ethyl-5- fluoro-2,3-dihydro-9-hydroxy -4-methyl-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinoline-10,13 (9H, 15H) -dione; shown in the following formula).
[Fórmula 43][Formula 43]
Pese a tener un efecto antitumoral excelente, exatecán no se ha comercializado como un fármaco antitumoral. El compuesto puede obtenerse fácilmente mediante un procedimiento conocido y el grupo amino en la posición 1 puede usarse preferentemente como una posición de conexión a la estructura de enlazador. Además, aunque exatecán también puede liberarse en células tumorales mientras parte del enlazador sigue estando unida al mismo, este es un compuesto excelente que muestra un efecto antitumoral excelente incluso en tal caso.Despite having an excellent antitumor effect, exatecan has not been marketed as an antitumor drug. The compound can be easily obtained by a known method and the amino group in position 1 can preferably be used as a connection position to the linker structure. In addition, although exatecan can also be released into tumor cells while part of the linker remains attached to it, this is an excellent compound that exhibits an excellent antitumor effect even in that case.
Con respecto al conjugado de anticuerpo - fármaco, el número de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticuerpo es un factor clave que tiene influencia sobre la eficacia y la seguridad. La producción del conjugado de anticuerpo - fármaco se realiza definiendo la condición de reacción incluyendo las cantidades de uso de materiales de partida y reactivos para la reacción con el fin de tener un número constante de moléculas de fármaco conjugadas, una mezcla que contiene diferentes números de moléculas de fármaco conjugadas se obtiene generalmente a diferencia de la reacción química de un compuesto de bajo peso molecular. El número de fármacos conjugados en una molécula de anticuerpo se expresa o especifica mediante el valor promedio, es decir, el número promedio de moléculas de fármaco conjugadas. A menos que específicamente se describa lo contrario como un principio, el número de moléculas de fármaco conjugadas significa un valor promedio excepto en un caso en el que este representa un conjugado de anticuerpo - fármaco que tiene un número específico de moléculas de fármaco conjugadas que se incluye en una mezcla de conjugado de anticuerpo - fármaco que tiene un diferente número de moléculas de fármaco conjugadas. El número de moléculas de exatecán conjugadas con una molécula de anticuerpo es controlable y, como un número promedio de moléculas de fármaco conjugadas por anticuerpo, pueden unirse aproximadamente de 1 a 10 exatecanos. Preferentemente, este es de 2 a 8 y, más preferentemente, de 3 a 8. Mientras tanto, un experto en la materia puede diseñar una reacción para conjugar un número requerido de moléculas de fármaco con una molécula de anticuerpo basándose en la descripción de los ejemplos de la presente solicitud y puede obtener un anticuerpo conjugado con un número controlado de moléculas de exatecán.With respect to the antibody-drug conjugate, the number of conjugated drug molecules per antibody molecule is a key factor that influences efficacy and safety. The production of the antibody-drug conjugate is carried out by defining the reaction condition including the amounts of use of starting materials and reagents for the reaction in order to have a constant number of conjugated drug molecules, a mixture containing different numbers of Conjugated drug molecules are generally obtained unlike the chemical reaction of a low molecular weight compound. The number of conjugated drugs in an antibody molecule is expressed or specified by the average value, that is, the average number of conjugated drug molecules. Unless specifically described otherwise as a principle, the number of conjugated drug molecules means an average value except in a case where it represents an antibody-drug conjugate that has a specific number of conjugated drug molecules that are It includes in a mixture of antibody-drug conjugate having a different number of conjugated drug molecules. The number of exatecan molecules conjugated with an antibody molecule is controllable and, as an average number of drug molecules conjugated by antibody, approximately 1 to 10 exatecanes can be attached. Preferably, this is from 2 to 8 and, more preferably, from 3 to 8. Meanwhile, one skilled in the art can design a reaction to conjugate a required number of drug molecules with an antibody molecule based on the description of the examples of the present application and can obtain an antibody conjugated with a controlled number of exatecan molecules.
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Debido a que exatecán tiene una estructura de camptotecina, se sabe que el equilibrio se desplaza a una estructura con un anillo de lactona cerrado (anillo cerrado) en un medio ácido acuoso (por ejemplo, pH 3 o así) pero este se desplaza a una estructura con un anillo de lactona abierto (anillo abierto) en un medio básico acuoso (por ejemplo, pH 10 o así). También se espera que un conjugado de fármaco que se introduce con un residuo de exatecán que se corresponde con la estructura de anillo cerrado y la estructura de anillo abierto tenga el mismo efecto antitumoral, y no resulta necesario indicar que cualquiera de los mismos está dentro del ámbito de la presente invención.Because exatecan has a camptothecin structure, it is known that equilibrium shifts to a structure with a closed lactone ring (closed ring) in an aqueous acidic medium (for example, pH 3 or so) but this moves to a structure with an open lactone ring (open ring) in a basic aqueous medium (for example, pH 10 or so). It is also expected that a drug conjugate that is introduced with an exatecan residue that corresponds to the closed ring structure and the open ring structure has the same antitumor effect, and it is not necessary to indicate that any of them is within the scope of the present invention.
[Estructura de enlazador][Linker structure]
Con respecto al conjugado de anticuerpo - fármaco de la presente invención, se explica la estructura de enlazador para conjugar un fármaco antitumoral con el anticuerpo. El enlazador tiene una estructura de la siguiente estructura:With respect to the antibody-drug conjugate of the present invention, the linker structure for conjugating an antitumor drug with the antibody is explained. The linker has a structure of the following structure:
-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-.-L1-L2-LP-NH- (CH2) n1-La-Lb-Lc-.
1 21 2
El anticuerpo está conectado al extremo terminal de L (extremo terminal opuesto a la conexión a L ), y el fármaco antitumoral está conectado al extremo terminal de Lc (extremo terminal opuesto a la conexión a Lb).The antibody is connected to the terminal end of L (terminal end opposite to the connection to L), and the antitumor drug is connected to the terminal end of Lc (terminal end opposite to the connection to Lb).
-i-i
n representa un número entero de 0 a 6 y es preferentemente un número entero de 1 a 5 y, más preferentemente, de 1 a 3.n represents an integer from 0 to 6 and is preferably an integer from 1 to 5 and, more preferably, from 1 to 3.
1. L11. L1
-i-i
L es un resto en el enlazador representado por la siguiente estructura:L is a remainder in the linker represented by the following structure:
-(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-,- (Succinimid-3-il-N) - (CH2) n2-C (= O) -,
-CH2-C(=O)-NH-(CH2)n3-C(=O)-,-CH2-C (= O) -NH- (CH2) n3-C (= O) -,
-C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-, o -C(=O)-(CH2)n4-C(=O)--C (= O) -cic.Hex (1,4) -CH2- (N-li-3-diminiccuS) -, or -C (= O) - (CH2) n4-C (= O) -
2 3 42. 3. 4
En lo anterior, n es un número entero de 2 a 8, n es un número entero de 1 a 8, y n es un número entero de 1 a 8.In the above, n is an integer from 2 to 8, n is an integer from 1 to 8, and n is an integer from 1 to 8.
2 1twenty-one
En el enlazador que tiene una estructura representada por -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n -C(=O)- de L , "-(Succinimid- 3-il-N)-" tiene una estructura representada por la siguiente fórmula:In the linker that has a structure represented by - (Succinimid-3-yl-N) - (CH2) n -C (= O) - of L, "- (Succinimid- 3-yl-N) -" has a structure represented by the following formula:
[Fórmula 44][Formula 44]
La posición 3 de la estructura parcial anterior es una posición de conexión al anticuerpo. El enlace al anticuerpo en la posición 3 está caracterizado por unirse con formación de tioéter. Por otra parte, el átomo de nitrógeno en la posición 1 del resto de estructura está conectado al átomo de carbono de metileno que está presente dentro del enlazador que incluye la estructura. Específicamente, -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-L2- es una estructura representada por la siguiente fórmula (en el presente documento, "anticuerpo-S-" se origina a partir de un anticuerpo).Position 3 of the previous partial structure is a position of connection to the antibody. The antibody binding at position 3 is characterized by binding with thioether formation. On the other hand, the nitrogen atom in position 1 of the rest of the structure is connected to the methylene carbon atom that is present within the linker that includes the structure. Specifically, - (Succinimid-3-yl-N) - (CH2) n2-C (= O) -L2- is a structure represented by the following formula (herein, "antibody-S-" originates from of an antibody).
[Fórmula 45][Formula 45]
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En la fórmula, n es un número entero de 2 a 8 y, preferentemente, de 2 a 5.In the formula, n is an integer from 2 to 8 and, preferably, from 2 to 5.
En el enlazador que tiene una estructura representada por - CH2-C(=O)-NH-(CH2)n -C(=O)- de L , n es un número entero de 1 a 8, preferentemente de 2 a 6. Este enlazador está conectado al anticuerpo en su átomo de carbono del metileno terminal y tiene la siguiente estructura para conectarse mediante formación de tioéter, al igual que con el enlazador anterior (en el presente documento, "anticuerpo-S-" se origina a partir de un anticuerpo). Anticuerpo-S- CH2-C(=O)-NH-(CH2)n3-C(=O)-L2-.In the linker having a structure represented by - CH2-C (= O) -NH- (CH2) n -C (= O) - of L, n is an integer from 1 to 8, preferably from 2 to 6. This linker is connected to the antibody in its terminal methylene carbon atom and has the following structure to connect by thioether formation, as with the previous linker (herein, "antibody-S-" originates from an antibody). Antibody-S- CH2-C (= O) -NH- (CH2) n3-C (= O) -L2-.
En el enlazador que tiene una estructura representada por - C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- de L , "-(N- li-3-diminiccuS)-" tiene una estructura representada por la siguiente fórmula:In the linker having a structure represented by - C (= O) -cic.Hex (1,4) -CH2- (N-li-3-diminiccuS) - of L, "- (N-li-3-diminiccuS ) - "has a structure represented by the following formula:
[Fórmula 46][Formula 46]
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En este resto de estructura, el átomo de nitrógeno en la posición 1 está conectado al átomo de carbono de metileno presente en la estructura de enlazador que contiene esta estructura. El átomo de carbono en la posición 3 está conectado al átomo de azufre terminal de -S-(CH2)n6-C(=O)- de L2 en el enlazador. Este resto -S-(CH2)n6-C(=O)- de L2 en el enlazador forma una estructura de enlazador combinada solo con -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3- diminiccuS)- de L1 en el enlazador. En lo anterior, '-cic.Hex(1,4)-" contenido en el enlazador representa un grupo 1,4-ciclohexileno. En el enlazador, -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- está conectado al anticuerpo con formación de enlace de amida en su carbono de carbonilo terminal (en el presente documento, "anticuerpo-NH-" se origina a partir de un anticuerpo).In this rest of the structure, the nitrogen atom in position 1 is connected to the methylene carbon atom present in the linker structure containing this structure. The carbon atom in position 3 is connected to the terminal sulfur atom of -S- (CH2) n6-C (= O) - of L2 in the linker. This remainder -S- (CH2) n6-C (= O) - of L2 in the linker forms a linker structure combined only with -C (= O) -cycl.Hex (1,4) -CH2- (N- li-3- diminiccuS) - of L1 in the linker. In the above, '-cic.Hex (1,4) - "contained in the linker represents a 1,4-cyclohexylene group. In the linker, -C (= O) -cic.Hex (1,4) -CH2 - (N-li-3-diminiccuS) - is connected to the amide bonding antibody in its carbonyl terminal carbon (here, "antibody-NH-" originates from an antibody).
[Fórmula 47][Formula 47]
el grupo amino del anticuerpo para esta formación de enlace de amida es el grupo amino terminal de una cadena lateral de un residuo de lisina en el anticuerpo o un grupo amino en el N terminal del anticuerpo. Dicho enlazador de una estructura puede conectarse formando un enlace de éster con el grupo hidroxi de un aminoácido en el anticuerpo que no sea tal enlace de amida.The amino group of the antibody for this amide bond formation is the amino terminal group of a side chain of a lysine residue in the antibody or an amino group in the N terminal of the antibody. Said linker of a structure can be connected by forming an ester bond with the hydroxy group of an amino acid in the antibody other than such an amide bond.
El resto de estructura '-cic.Hex(1,4)-" contenido en dicho enlazador puede ser un grupo alquileno cíclico saturado divalente que no sea el grupo 1,4-ciclohexileno, es decir, un grupo hidrocarburo saturado cíclico divalente tal como un grupo ciclobutileno, un grupo ciclopentileno, un grupo cicloheptaleno o un grupo ciclooctaleno, un grupo hidrocarburo aromático divalente tal como un grupo fenileno o un grupo naftileno, o un grupo heterocíclico divalente aromático, parcialmente saturado o saturado de 5 o 6 miembros que contiene 1 o 2 heteroátomos. Como alternativa, este resto puede ser un grupo alquileno divalente que tiene de 1 a 4 átomos de carbono. La conexión al grupo divalente puede tener lugar en posiciones adyacentes o en posiciones distantes.The rest of the structure '-cic.Hex (1,4) - "contained in said linker may be a divalent saturated cyclic alkylene group other than the 1,4-cyclohexylene group, that is, a divalent cyclic saturated hydrocarbon group such as a cyclobutylene group, a cyclopentylene group, a cycloheptalene group or a cyclooctalene group, a divalent aromatic hydrocarbon group such as a phenylene group or a naphthylene group, or a divalent aromatic, partially saturated or saturated 5 or 6 membered heterocyclic group containing 1 or 2 heteroatoms: Alternatively, this moiety can be a divalent alkylene group having 1 to 4 carbon atoms.The connection to the divalent group can take place in adjacent positions or in distant positions.
En el enlazador que tiene una estructura representada por - C(=O)-(CH2)n4-C(=O)- como L1, n4 es un número entero de 1 a 8 y, preferentemente, de 2 a 6. Este enlazador también está conectado mediante formación de enlace de amida en su grupo carbonilo terminal con un grupo amino del anticuerpo, al igual que con los enlazadores mencionados anteriormente (véase la siguiente fórmula; en la estructura de la misma, "anticuerpo-NH-" se origina a partir de un anticuerpo).In the linker having a structure represented by - C (= O) - (CH2) n4-C (= O) - as L1, n4 is an integer from 1 to 8 and, preferably, from 2 to 6. This linker it is also connected by amide bond formation in its terminal carbonyl group with an amino group of the antibody, as with the linkers mentioned above (see the following formula; in the structure thereof, "antibody-NH-" originates from an antibody).
anticuerpo-NH-C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-L2-.antibody-NH-C (= O) - (CH2) n4-C (= O) -L2-.
Ejemplos específicos de L1 en el enlazador pueden incluirSpecific examples of L1 in the linker may include
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-- (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2-C (= O) -
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-- (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2-C (= O) -
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-- (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2-C (= O) -
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-- (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -
-CH2C(=O)NH-CH2-C(=O)-,-CH2C (= O) NH-CH2-C (= O) -,
-CH2C(=O)NH-CH2CH2-C(=O)--CH2C (= O) NH-CH2CH2-C (= O) -
-CH2C(=O)NH-CH2CH2CH2-C(=O)--CH2C (= O) NH-CH2CH2CH2-C (= O) -
-CH2C(=O)NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)--CH2C (= O) NH-CH2CH2CH2CH2-C (= O) -
-CH2C(=O)NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)--CH2C (= O) NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -
-C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)--C (= O) -cic.Hex (1,4) -CH2- (N-li-3-diminiccuS) -
-C(=O)-aril-CH2-(N-li-3-diminiccuS)--C (= O) -aryl-CH2- (N-li-3-diminiccuS) -
-C(=O)-cic.Het-CH2-(N-li-3-diminiccuS)--C (= O) -cic.Het-CH2- (N-li-3-diminiccuS) -
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)--C (= O) -CH2CH2-C (= O) -
-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)--C (= O) -CH2CH2CH2-C (= O) -
-C (=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)--C (= O) -CH2CH2CH2CH2-C (= O) -
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)--C (= O) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-.-C (= O) -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -.
(Arilo representa un grupo hidrocarburo aromático divalente,(Aryl represents a divalent aromatic hydrocarbon group,
y cic.Het representa un grupo cíclico heterocíclicoand cic.Het represents a heterocyclic cyclic group
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divalente).divalent).
2. L22. L2
L2 es un enlazador representado por la siguiente estructura:L2 is a linker represented by the following structure:
-NH-(CH2CH2O)n5-CH2-CH2-C(=O)-, o -S-(CH2)n6-C(=O)-,-NH- (CH2CH2O) n5-CH2-CH2-C (= O) -, or -S- (CH2) n6-C (= O) -,
L2 puede no estar presente, y en un caso de este tipo, L2 es un enlace sencillo. En lo anterior, n5 es un número entero de 1 a 6, y n6 es un número entero de 1 a 6.L2 may not be present, and in such a case, L2 is a simple link. In the above, n5 is an integer from 1 to 6, and n6 is an integer from 1 to 6.
En el enlazador que tiene una estructura de -NH-(CH2CH2O)n5-CH2-CH2-C(=O)- como L2, n5 es un número entero de 1 a 6 y, preferentemente, de 2 a 4. Este resto en el enlazador está conectado a L1 en su grupo amino terminal y está conectado a LP en su grupo carbonilo en el otro extremo terminal.In the linker having a structure of -NH- (CH2CH2O) n5-CH2-CH2-C (= O) - as L2, n5 is an integer from 1 to 6 and, preferably, from 2 to 4. This remainder in The linker is connected to L1 in its amino terminal group and is connected to LP in its carbonyl group at the other terminal end.
En el enlazador que tiene una estructura de -S-(CH2)n6-C(=O)- como L2, n6 es un número entero de 1 a 6 y, preferentemente, de 2 a 4.In the linker having a structure of -S- (CH2) n6-C (= O) - as L2, n6 is an integer from 1 to 6 and, preferably, from 2 to 4.
Ejemplos específicos de L2 pueden incluirSpecific examples of L2 may include
-NH-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-,-NH-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -,
-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-,-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -,
-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-,-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -,
-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-,-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -,
-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-,-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -,
-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-.-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -.
Cuando L2 es -S-(CH2)n6-C(=O)-, L1 que se va a combinar con el mismo es -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3- diminiccuS)-. Ejemplos específicos de -L1-L2- pueden incluirWhen L2 is -S- (CH2) n6-C (= O) -, L1 to be combined with it is -C (= O) -cic.Hex (1,4) -CH2- (N-li -3- diminiccuS) -. Specific examples of -L1-L2- may include
-C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2-C(=O)--C (= O) -cic.Hex (1,4) -CH2- (N-li-3-diminiccuS) -S-CH2-C (= O) -
-C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)--C (= O) -cic.Hex (1,4) -CH2- (N-li-3-diminiccuS) -S-CH2CH2-C (= O) -
-C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2-C(=O)--C (= O) -cic.Hex (1,4) -CH2- (N-li-3-diminiccuS) -S-CH2CH2CH2-C (= O) -
-C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2-C(=O)--C (= O) -cic.Hex (1,4) -CH2- (N-li-3-diminiccuS) -S-CH2CH2CH2CH2-C (= O) -
-C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)--C (= O) -cic.Hex (1,4) -CH2- (N-li-3-diminiccuS) -S-CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -
-C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-.-C (= O) -cic.Hex (1,4) -CH2- (N-li-3-diminiccuS) -S-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -.
3. LP3. LP
El enlazador LP es un residuo de tetrapéptido de GGFG, que representa un residuo de péptido de -Gly-Gly-Phe-Gly-. El enlazador LP está conectado a L2 en su N terminal y está conectado al grupo amino del resto de -NH-(CH2)n1-La- Lb-Lc del enlazador en su C terminal.The LP linker is a GGFG tetrapeptide residue, which represents a peptide residue of -Gly-Gly-Phe-Gly-. The LP linker is connected to L2 at its N terminal and is connected to the amino group of the rest of -NH- (CH2) n1-La-Lb-Lc of the linker at its C terminal.
En la estructura representada por -NH-(CH2)n1- dentro del enlazador, n1 es un número entero de 0 a 6 y es preferentemente un número entero de 1 a 5 y, más preferentemente, de 1 a 3. el grupo amino de este resto está conectado al C terminal de LP en el enlazador.In the structure represented by -NH- (CH2) n1- within the linker, n1 is an integer from 0 to 6 and is preferably an integer from 1 to 5 and, more preferably, from 1 to 3. the amino group of This remainder is connected to the C terminal of LP on the linker.
4. La4. The
El enlazador La está representado por -O- o es un enlace sencillo.The linker La is represented by -O- or is a single link.
5. Lb5. Lb
El enlazador Lb es -CR2(-R3)- o es un enlace sencillo. En lo anterior, R2 y R3 representan cada uno independientemente un átomo de hidrógeno.The linker Lb is -CR2 (-R3) - or is a single link. In the foregoing, R2 and R3 each independently represent a hydrogen atom.
Ejemplos específicos preferidos de la estructura representada por -NH-(CH2)n1-La-Lb- como el enlazador pueden incluirSpecific preferred examples of the structure represented by -NH- (CH2) n1-La-Lb- as the linker may include
-NH-CH2--NH-CH2-
-NH-CH2CH2--NH-CH2CH2-
-NH-CH2-O-CH2--NH-CH2-O-CH2-
-NH-CH2CH2-O--NH-CH2CH2-O-
-NH-CH2CH2-O-CH2--NH-CH2CH2-O-CH2-
-NH-CH2CH2CH2--NH-CH2CH2CH2-
-NH-CH2CH2CH2CH2--NH-CH2CH2CH2CH2-
-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-.-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-.
Ejemplos preferidos adicionales de la misma pueden incluirAdditional preferred examples thereof may include
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-NH-(CH2)3-,-NH- (CH2) 3-,
-NH-CH2-O-CH2-, y -NH-(CH2)2-O-CH2-.-NH-CH2-O-CH2-, and -NH- (CH2) 2-O-CH2-.
6. Lc6. Lc
El enlazador Lc es -C(=O)-. Dicho enlazador está conectado al compuesto antitumoral.The linker Lc is -C (= O) -. Said linker is connected to the antitumor compound.
En el enlazador, la longitud de cadena de -NH-(CH2 n1-La-Lb-Lc es preferentemente una longitud de cadena de 4 a 7 átomos y, más preferentemente, una longitud de cadena de 5 o 6 átomos.In the linker, the chain length of -NH- (CH2 n1-La-Lb-Lc is preferably a chain length of 4 to 7 atoms and, more preferably, a chain length of 5 or 6 atoms.
Con respecto al conjugado de anticuerpo - fármaco de la presente invención, cuando este se transfiere al interior de células tumorales, el resto de enlazador se escinde y el derivado de fármaco que tiene una estructura representada por NH2-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX) se libera para expresar una acción antitumoral. Los ejemplos del derivado antitumoral que muestra un efecto antitumoral liberándose del conjugado de anticuerpo - fármaco de la presente invención incluyen un derivado antitumoral que tiene un resto de estructura en el que la estructura representada por - NH-(CH2)n1-La-Lb- del enlazador se une con Lc y tiene un grupo amino terminal, y los particularmente preferidos incluyen los siguientes.With respect to the antibody-drug conjugate of the present invention, when it is transferred into tumor cells, the linker moiety is cleaved and the drug derivative having a structure represented by NH2- (CH2) n1-La-Lb -Lc- (NH-DX) is released to express an antitumor action. Examples of the antitumor derivative that shows an antitumor effect freeing from the antibody-drug conjugate of the present invention include an antitumor derivative having a structure moiety in which the structure represented by - NH- (CH2) n1-La-Lb- of the linker binds with Lc and has an amino terminal group, and particularly preferred include the following.
NH2-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)NH2-CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
NH2-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)NH2-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)NH2-CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
NH2-CHCH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)NH2-CHCH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
Mientras tanto, en el caso de NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), se confirmó que, debido a que la estructura de aminal en la molécula es inestable, esta experimenta de nuevo una autodegradación para liberar lo siguienteMeanwhile, in the case of NH2-CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX), it was confirmed that, because the aminal structure in the molecule is unstable, it experiences again a self-degradation to release the following
HO-CH2-C(=O)-(NH-DX). Esos compuestos también pueden usarse preferentemente como un intermedio de producción del conjugado de anticuerpo - fármaco de la presente invención.HO-CH2-C (= O) - (NH-DX). These compounds may also preferably be used as an intermediate for producing the antibody-drug conjugate of the present invention.
Para el conjugado de anticuerpo - fármaco de la presente invención en el que exatecán se usa como un fármaco, es preferible que el resto de estructura de fármaco - enlazador que tiene la siguiente estructura [-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1- La-Lb-Lc-(NH-DX)] esté conectado a un anticuerpo. El número conjugado promedio del resto de estructura de fármaco - enlazador por anticuerpo puede ser de 1 a 10. Preferentemente, este es de 2 a 8 y, más preferentemente, de 3 a 8.For the antibody-drug conjugate of the present invention in which exatecan is used as a drug, it is preferable that the rest of the drug-linker structure having the following structure [-L1-L2-LP-NH- (CH2) n1- La-Lb-Lc- (NH-DX)] is connected to an antibody. The average conjugate number of the remaining drug-linker structure per antibody may be from 1 to 10. Preferably, this is from 2 to 8 and, more preferably, from 3 to 8.
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)- (Succinimid-3-yl-N) -CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)- (Succinimid-3-yl-N) -CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)- (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)- (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)- (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)- (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)- (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-- (Succinimid-3-yl-N) -CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-
DX)DX)
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)- (Succinimid-3-yl-N) -CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-- (Succinimid-3-yl-N) -CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-
CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-- (Succinimid-3-yl-N) -CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-
CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)-CH2-C (= O) -NH-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)-C (= O) -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
-C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)-C (= O) -cic.Hex (1,4) -CH2- (N-li-3-diminiccuS) -S-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
Entre ellos, los más preferidos son los siguientes.Among them, the most preferred are the following.
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)- (Succinimid-3-yl-N) -CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)- (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)- (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)- (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-- (Succinimid-3-yl-N) -CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-
DX)DX)
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-- (Succinimid-3-yl-N) -CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-
CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)-CH2-C (= O) -NH-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)-C (= O) -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
-C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).-C (= O) -cic.Hex (1,4) -CH2- (N-li-3-diminiccuS) -S-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX).
Los particularmente preferidos son los siguientes.Particularly preferred are the following.
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)- (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)- (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-- (Succinimid-3-yl-N) -CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-
DX).DX)
5 Con respecto a la estructura de enlazador para conjugar el anticuerpo y un fármaco en el conjugado de anticuerpo - fármaco de la presente solicitud, el enlazador preferido puede construirse conectando estructuras preferidas mostradas para cada parte del enlazador anteriormente explicado. Con respecto a la estructura de enlazador, pueden usarse preferentemente los que tienen la siguiente estructura. Mientras tanto, el extremo terminal izquierdo de la estructura es una posición de conexión con el anticuerpo y el extremo terminal derecho es una posición de 10 conexión con el fármaco.With respect to the linker structure to conjugate the antibody and a drug in the antibody-drug conjugate of the present application, the preferred linker can be constructed by connecting preferred structures shown for each part of the linker explained above. With respect to the linker structure, preferably those with the following structure can be used. Meanwhile, the left terminal end of the structure is a position of connection with the antibody and the right terminal end is a position of connection with the drug.
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- 15 -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-- (Succinimid-3-yl-N) -CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-C (= O) - - (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2-C (= O) - GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - - (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-C (= O) - - (Succinimid-3-il -N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - 15 - (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2- C (= O) -
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-- (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (= O) - - (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C ( = O) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (= O) -
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- 20 -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-- (Succinimid-3-yl-N) -CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - - (Succinimid-3 -il-N) -CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-C (= O) - 20 - (Succinimid-3-il-N ) -CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-
CH2CH2CH2-C(=O)-CH2CH2CH2-C (= O) -
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-C(=O)- -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-- (Succinimid-3-yl-N) -CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH- CH2CH2-C (= O) - - CH2-C (= O) -NH-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) -
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3--C (= O) -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - -C (= O) -cic.Hex (1,4) -CH2- (N-li- 3-
25 diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-25 diminiccuS) -S-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) -
Entre ellos, los más preferidos son los siguientes.Among them, the most preferred are the following.
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- 30 -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-- (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - - (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) - GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - - (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (= O) - 30 - ( Succinimid-3-yl-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (= O) -
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)- -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-- (Succinimid-3-yl-N) -CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - - (Succinimid-3 -il-N) -CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH- CH2CH2CH2-C (= O) - -CH2-C (= O) -NH-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) -
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3--C (= O) -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - -C (= O) -cic.Hex (1,4) -CH2- (N-li- 3-
35 diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.35 diminiccuS) -S-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) -.
Los particularmente preferidos incluyen los siguientes.Particularly preferred include the following.
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-- (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (= O) -
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-- (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (= O) -
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.- (Succinimid-3-yl-N) -CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) -.
40 [Procedimiento de producción]40 [Production procedure]
A continuación, se dan explicaciones para el procedimiento representativo para producir el conjugado de anticuerpo - fármaco de la presente invención o un intermedio de producción del mismo. Mientras tanto, los compuestos se describen en lo sucesivo en el presente documento con el número de compuestos mostrado en cada fórmula de reacción. Específicamente, se hace referencia a los mismos como "compuesto de la fórmula (1)", un "compuesto 45 (1)", o similares. Los compuestos con números que no sean esos también se describen de forma similar.Next, explanations are given for the representative procedure for producing the antibody-drug conjugate of the present invention or a production intermediate thereof. Meanwhile, the compounds are described hereinafter with the number of compounds shown in each reaction formula. Specifically, they are referred to as "compound of the formula (1)", a "compound 45 (1)", or the like. Compounds with numbers other than those are also described similarly.
1. Procedimiento de producción 11. Production procedure 1
El conjugado de anticuerpo - fármaco representado por la fórmula (1) en el que el anticuerpo se une a la estructura de enlazador por medio de tioéter puede producirse mediante el siguiente procedimiento, por ejemplo.The antibody-drug conjugate represented by the formula (1) in which the antibody binds to the linker structure by means of thioether can be produced by the following procedure, for example.
[Fórmula 48][Formula 48]
L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-LC-(NH-DX)L1-L2-LP-NH- (CH2) n1-La-Lb-LC- (NH-DX)
22
55
1010
15fifteen
20twenty
2525
3030
3535
[En la fórmula, AB representa un anticuerpo con un grupo sulfhidrilo, y L1' representa una estructura de enlazador de L1 en la que el extremo terminal de enlazador es un grupo maleimidilo (fórmula mostrada posteriormente)[In the formula, AB represents an antibody with a sulfhydryl group, and L1 'represents a linker structure of L1 in which the terminal end of linker is a maleimidyl group (formula shown below)
[Fórmula 49][Formula 49]
(en la fórmula, el átomo de nitrógeno es la posición de conexión)(in the formula, the nitrogen atom is the connection position)
o el extremo terminal es halógeno, y representa un grupo en el que el resto de -(Succinimid-3-il-N)- en -(Succinimid- 3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)- de L1 es un grupo maleimidilo o un grupo halógeno-CH2C(=O)NH-(CH2)n3-C(=O)- en el que el metileno terminal en -CH2C(=O)NH-(CH2)n3-C(=O)- de L1 se halogena para formar haloacetamida. Además, el -(NH- DX) representa una estructura representada por la siguiente fórmula:or the terminal end is halogen, and represents a group in which the rest of - (Succinimid-3-yl-N) - in - (Succinimid-3-yl-N) - (CH2) n2-C (= O) - of L1 is a maleimidyl group or a halogen-CH2C (= O) NH- (CH2) n3-C (= O) group - in which the terminal methylene in -CH2C (= O) NH- (CH2) n3- C (= O) - of L1 is halogenated to form haloacetamide. In addition, the - (NH-DX) represents a structure represented by the following formula:
[Fórmula 50][Formula 50]
y este representa un grupo que se obtiene retirando un átomo de hidrógeno del grupo amino en la posición 1 de exatecán.and this represents a group that is obtained by removing a hydrogen atom from the amino group at the exatecan position 1.
Además, el compuesto de la fórmula (1) en la fórmula de reacción anterior se describe como una estructura en la que un resto de estructura desde el fármaco hasta el extremo terminal de enlazador conecta con un anticuerpo. Sin embargo, la descripción solo se da por razones de conveniencia, y en realidad hay muchos casos en los que una pluralidad de los restos de estructura están conectados a una molécula de anticuerpo. Esto mismo es de aplicación a la explicación del procedimiento de producción descrito posteriormente.]In addition, the compound of the formula (1) in the above reaction formula is described as a structure in which a structure moiety from the drug to the linker terminal end connects with an antibody. However, the description is only given for reasons of convenience, and in reality there are many cases in which a plurality of the structure residues are connected to an antibody molecule. The same applies to the explanation of the production procedure described below.]
Específicamente, el conjugado de anticuerpo - fármaco (1) puede producirse haciendo reaccionar el compuesto (2), que puede obtenerse mediante el procedimiento descrito posteriormente, con el anticuerpo (3a) que tiene un grupo sulfhidrilo.Specifically, the antibody-drug conjugate (1) can be produced by reacting the compound (2), which can be obtained by the procedure described below, with the antibody (3a) having a sulfhydryl group.
El anticuerpo (3a) que tiene un grupo sulfhidrilo puede obtenerse mediante un procedimiento bien conocido en la técnica (Hermanson, G. T, Bioconjugate Techniques, págs. 56-136, págs. 456-493, Academic Press (1996)). Los ejemplos incluyen: reactivo de Traut se hace reaccionar con el grupo amino del anticuerpo; S-acetiltioalcanoatos de N-succinimidilo se hacen reaccionar con el grupo amino del anticuerpo seguido de reacción con hidroxilamina; después de hacerse reaccionar con 3-(piridilditio)propionato de N-succinimidilo, el anticuerpo se hace reaccionar con un agente reductor; el anticuerpo se hace reaccionar con un agente reductor tal como ditiotreitol, 2-mercaptoetanol y clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) para reducir el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo para formar un grupo sulfhidrilo, aunque sin limitarse al mismo.The antibody (3a) having a sulfhydryl group can be obtained by a method well known in the art (Hermanson, G. T, Bioconjugate Techniques, pp. 56-136, pp. 456-493, Academic Press (1996)). Examples include: Traut reagent is reacted with the amino group of the antibody; N-succinimidyl S-acetylthioalkanoates are reacted with the amino group of the antibody followed by reaction with hydroxylamine; after reacting with N-succinimidyl 3- (pyridyldithio) propionate, the antibody is reacted with a reducing agent; The antibody is reacted with a reducing agent such as dithiothreitol, 2-mercaptoethanol and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) to reduce the disulfide bond in a hinge portion in the antibody to form a sulfhydryl group, although without limiting itself.
Específicamente, usando de 0,3 a 3 equivalentes molares de TCEP como un agente reductor por disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo y haciéndolo reaccionar con el anticuerpo en una solución tampón que contiene un agente quelante, puede obtenerse el anticuerpo con un disulfuro parcial o completamente reducido en una parte de bisagra en el anticuerpo. Los ejemplos del agente quelante incluyen ácido etilen diamina tetraacético (EDTA) y ácido dietilenotriamina pentaacético (DTPA). Este puede usarse a una concentración de 1 mM a 20 mM. Los ejemplos de la solución tampón que puede usarse incluyen una solución de fosfato sódico, borato sódico o acetato sódico. Como ejemplo específico, haciendo reaccionar el anticuerpo con TCEP de 4 °C a 37 °C durante de 1 a 4 horas, puede obtenerse el anticuerpo (3a) que tiene un grupo sulfhidrilo parcial o completamente reducido.Specifically, using 0.3 to 3 molar equivalents of TCEP as a disulfide reducing agent in a hinge portion in the antibody and reacting it with the antibody in a buffer solution containing a chelating agent, the antibody can be obtained with a disulfide. partially or completely reduced in a hinge part in the antibody. Examples of the chelating agent include ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) and diethylenetriamine pentaacetic acid (DTPA). This can be used at a concentration of 1 mM to 20 mM. Examples of the buffer solution that can be used include a solution of sodium phosphate, sodium borate or sodium acetate. As a specific example, by reacting the antibody with TCEP from 4 ° C to 37 ° C for 1 to 4 hours, the antibody (3a) having a partially or completely reduced sulfhydryl group can be obtained.
Mientras tanto, realizando la reacción para añadir un grupo sulfhidrilo a un resto de fármaco - enlazador, el resto de fármaco - enlazador puede conjugarse mediante un enlace de tioéter.Meanwhile, by carrying out the reaction to add a sulfhydryl group to a drug-linker moiety, the drug-linker moiety can be conjugated by a thioether bond.
A continuación, usando de 2 a 20 equivalentes molares del compuesto (2) por anticuerpo (3a) que tiene un grupoNext, using 2 to 20 molar equivalents of compound (2) per antibody (3a) having a group
55
1010
15fifteen
20twenty
2525
3030
3535
4040
45Four. Five
50fifty
5555
sulfhidrilo, puede producirse el conjugado de anticuerpo - fármaco (1) en el que están conjugadas de 2 a 8 moléculas de fármaco por anticuerpo. Específicamente, es suficiente que la solución que contiene el compuesto (2) disuelto en la misma se añada a una solución tampón que contiene el anticuerpo (3a) que tiene un grupo sulfhidrilo para la reacción. En el presente documento, los ejemplos de la solución tampón que puede usarse incluyen solución de acetato sódico, fosfato sódico y borato sódico. El pH para la reacción es de 5 a 9 y, más preferentemente, la reacción se realiza cerca de pH 7. Los ejemplos del disolvente para disolver el compuesto (2) incluyen un disolvente orgánico tal como dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), dimetil acetamida (DMA) y N-metil-2-piridona (NMP). Es suficiente que la solución de disolvente orgánico que contiene el compuesto (2) disuelto en la misma se añada a 1 a 20 % v/v a una solución tampón que contiene el anticuerpo (3a) que tiene un grupo sulfhidrilo para la reacción. La temperatura de reacción es de 0 a 37 °C, más preferentemente de 10 a 25 °C, y el tiempo de reacción es de 0,5 a 2 horas. La reacción puede terminarse desactivando la reactividad del compuesto sin reaccionar (2) con un reactivo que contiene tiol. Los ejemplos del reactivo que contiene tiol incluyen cisteína y N-acetil-L-cisteína (NAC). De manera más específica, se añaden de 1 a 2 equivalentes molares de NAC al compuesto (2) usado e, incubando a temperatura ambiente durante de 10 a 30 minutos, puede terminarse la reacción.sulfhydryl, the antibody-drug conjugate (1) in which 2 to 8 drug molecules per antibody can be conjugated can be produced. Specifically, it is sufficient that the solution containing the compound (2) dissolved therein is added to a buffer solution containing the antibody (3a) having a sulfhydryl group for the reaction. Here, examples of the buffer solution that can be used include sodium acetate solution, sodium phosphate and sodium borate. The pH for the reaction is 5 to 9 and, more preferably, the reaction is carried out near pH 7. Examples of the solvent for dissolving the compound (2) include an organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO), dimethylformamide (DMF) , dimethyl acetamide (DMA) and N-methyl-2-pyridone (NMP). It is sufficient that the organic solvent solution containing the compound (2) dissolved therein is added at 1 to 20% v / v to a buffer solution containing the antibody (3a) having a sulfhydryl group for the reaction. The reaction temperature is 0 to 37 ° C, more preferably 10 to 25 ° C, and the reaction time is 0.5 to 2 hours. The reaction can be terminated by deactivating the reactivity of the unreacted compound (2) with a thiol-containing reagent. Examples of the thiol-containing reagent include cysteine and N-acetyl-L-cysteine (NAC). More specifically, 1 to 2 molar equivalents of NAC are added to the compound (2) used and, incubating at room temperature for 10 to 30 minutes, the reaction can be terminated.
El conjugado de anticuerpo - fármaco producido (1) puede someterse a, después de la concentración, intercambio de tampón, purificación y medición de concentración de anticuerpo y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticuerpo de acuerdo con procedimientos comunes descritos posteriormente, identificación del conjugado de anticuerpo - fármaco (1).The antibody-drug conjugate produced (1) can be subjected to, after concentration, buffer exchange, purification and measurement of antibody concentration and average number of conjugated drug molecules per antibody molecule according to common procedures described below, identification of the antibody-drug conjugate (1).
Procedimiento común A: Concentración de solución acuosa de anticuerpo o conjugado de anticuerpo - fármacoCommon procedure A: Concentration of aqueous antibody solution or antibody-drug conjugate
A un recipiente Amicon Ultra (50.000 MWCO, Millipore Corporation), se añadió una solución de anticuerpo o conjugado de anticuerpo - fármaco y la solución del anticuerpo o conjugado de anticuerpo - fármaco se concentró por centrifugación (centrífuga durante de 5 a 20 minutos de 2000 G a 3800 G) usando una centrífuga (Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.).To an Amicon Ultra container (50,000 MWCO, Millipore Corporation), an antibody-antibody-drug conjugate solution was added and the antibody-drug conjugate or antibody solution was concentrated by centrifugation (centrifugal for 5 to 20 minutes 2000 G to 3800 G) using a centrifuge (Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.).
Procedimiento común B: Medición de concentración de anticuerpoCommon procedure B: Measurement of antibody concentration
Usando un detector UV (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.), la medición de la concentración de anticuerpo se realizó de acuerdo con el procedimiento definido por el fabricante. En ese momento, se usó un coeficiente de absorción de 280 nm diferente para cada anticuerpo (1,3 mlmg'1cm'1 a 1,8 mlmg'1cm'1).Using a UV detector (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.), the measurement of the antibody concentration was performed according to the procedure defined by the manufacturer. At that time, a different 280 nm absorption coefficient was used for each antibody (1.3 mlmg'1cm'1 to 1.8 mlmg'1cm'1).
Procedimiento común C-1: Intercambio de tampón para anticuerpoCommon procedure C-1: Exchange of antibody buffer
Una columna NAP-25 (n.° de cat. 17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) usando vehículo Sephadex G-25 se equilibró con tampón de fosfato (10 mM, pH 6,0) (a lo que se hace referencia como PBS6,0/EDTA en la memoria descriptiva) que contiene cloruro sódico (137 mM) y ácido etilen diamina tetraacético (EDTA, 5 mM) de acuerdo con el procedimiento definido por el manual de instrucciones del fabricante. Una solución acuosa del anticuerpo se aplicó en una cantidad de 2,5 ml a una única columna NAP-25, y entonces se recogió la fracción (3,5 ml) eluyendo con 3,5 ml de PBS6,0/EDTA. La fracción resultante se concentró mediante el procedimiento común A. Después de la medición de la concentración del anticuerpo usando el procedimiento común B, la concentración de anticuerpo se ajustó a 10 mg/ml usando PBS6,0/EDTA.A NAP-25 column (Cat. No. 17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) using Sephadex G-25 vehicle was equilibrated with phosphate buffer (10 mM, pH 6.0) (which is done reference as PBS6.0 / EDTA in the specification) containing sodium chloride (137 mM) and ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA, 5 mM) according to the procedure defined by the manufacturer's instruction manual. An aqueous solution of the antibody was applied in an amount of 2.5 ml to a single NAP-25 column, and then the fraction (3.5 ml) was collected eluting with 3.5 ml of PBS6.0 / EDTA. The resulting fraction was concentrated by common procedure A. After measurement of the antibody concentration using common procedure B, the antibody concentration was adjusted to 10 mg / ml using PBS6.0 / EDTA.
Procedimiento común C-2: Intercambio de tampón para anticuerpoCommon procedure C-2: Buffer exchange for antibody
Una columna NAP-25 (n.° de cat. 17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) usando vehículo Sephadex G-25 se equilibró con tampón de fosfato (50 mM, pH 6,5) (a lo que se hace referencia como PBS6,5/EDTA en la memoria descriptiva) que contiene cloruro sódico (50 mM) y EDTA (2 mM) de acuerdo con el procedimiento definido por el fabricante. Una solución acuosa del anticuerpo se aplicó en una cantidad de 2,5 ml a una única columna NAP-25, y entonces se recogió la fracción (3,5 ml) eluyendo con 3,5 ml de PBS6,5/EDTA. La fracción resultante se concentró mediante el procedimiento común A. Después de la medición de la concentración del anticuerpo usando el procedimiento común B, la concentración de anticuerpo se ajustó a 20 mg/ml usando PBS6,5/EDTA.A NAP-25 column (Cat. No. 17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) using Sephadex G-25 vehicle was equilibrated with phosphate buffer (50 mM, pH 6.5) (to which it is done reference as PBS6.5 / EDTA in the specification) containing sodium chloride (50 mM) and EDTA (2 mM) according to the procedure defined by the manufacturer. An aqueous solution of the antibody was applied in an amount of 2.5 ml to a single NAP-25 column, and then the fraction (3.5 ml) was collected eluting with 3.5 ml of PBS6.5 / EDTA. The resulting fraction was concentrated by common procedure A. After measurement of the antibody concentration using common procedure B, the antibody concentration was adjusted to 20 mg / ml using PBS6.5 / EDTA.
Procedimiento común D-1: Purificación del conjugado de anticuerpo - fármacoCommon procedure D-1: Purification of antibody-drug conjugate
Una columna NAP-25 se equilibró con cualquier tampón seleccionado de entre tampón de fosfato comercialmente disponible (PBS7,4, n.° de cat. 10010-023, Invitrogen), tampón de fosfato sódico (10 mM, pH 6,0; a lo que se hace referencia como PBS6,0) que contiene cloruro sódico (137 mM), y tampón de acetato que contiene sorbitol (5 %) (10 mM, pH 5,5; a lo que se hace referencia como ABS en la memoria descriptiva). Una solución acuosa de la reacción de conjugado de anticuerpo - fármaco se aplicó en una cantidad de aproximadamente 1,5 ml a la columna NAP-25, y entonces se eluyó con el tampón en una cantidad definida por el fabricante para recoger la fracción de anticuerpo. La fracción recogida se aplicó de nuevo a la columna NAP-25 y, repitiendo de 2 a 3 veces en total el proceso de purificación de filtración en gel para eluir con tampón, se obtuvo el conjugado de anticuerpo - fármaco excluyendo enlazador de fármaco no conjugado y un compuesto de bajo peso molecular, clorhidrato de (tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), N-acetil-L-cisteína (NAC) y dimetilsulfóxido). Procedimiento común E: Medición de concentración de anticuerpo en conjugado de anticuerpo - fármaco y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticuerpo.An NAP-25 column was equilibrated with any buffer selected from commercially available phosphate buffer (PBS7.4, Cat. No. 10010-023, Invitrogen), sodium phosphate buffer (10 mM, pH 6.0; a What is referred to as PBS6.0) containing sodium chloride (137 mM), and acetate buffer containing sorbitol (5%) (10 mM, pH 5.5; what is referred to as ABS in the report descriptive). An aqueous solution of the antibody-drug conjugate reaction was applied in an amount of approximately 1.5 ml to the NAP-25 column, and then eluted with the buffer in an amount defined by the manufacturer to collect the antibody fraction. . The collected fraction was applied again to the NAP-25 column and, repeating the gel filtration purification process to elute with buffer 2 to 3 times in total, the antibody-drug conjugate was obtained excluding unconjugated drug linker. and a low molecular weight compound, (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP), N-acetyl-L-cysteine (NAC) and dimethylsulfoxide). Common procedure E: Measurement of antibody concentration in antibody-drug conjugate and average number of conjugated drug molecules per antibody molecule.
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La concentración de fármaco conjugado en el conjugado de anticuerpo - fármaco puede calcularse midiendo la absorbancia UV de una solución acuosa del conjugado de anticuerpo - fármaco a dos longitudes de onda de 280 nm y 370 nm, seguido de la realización del cálculo mostrado posteriormente.The concentration of conjugate drug in the antibody-drug conjugate can be calculated by measuring the UV absorbance of an aqueous solution of the antibody-drug conjugate at two wavelengths of 280 nm and 370 nm, followed by performing the calculation shown below.
Debido a que la absorbancia total a cualquier longitud de onda es igual a la suma de la absorbancia de cada una de las especies químicas que absorben luz que están presentes en un sistema [aditividad de absorbancia], cuando los coeficientes de absorción molar del anticuerpo y el fármaco permanecen sin cambios antes y después de la conjugación entre el anticuerpo y el fármaco, la concentración de anticuerpo y la concentración de fármaco en el conjugado de anticuerpo - fármaco se expresan con las siguientes ecuaciones.Because the total absorbance at any wavelength is equal to the sum of the absorbance of each of the chemical species that absorb light that are present in a system [absorbance additivity], when the molar absorption coefficients of the antibody and The drug remains unchanged before and after the conjugation between the antibody and the drug, the antibody concentration and the drug concentration in the antibody-drug conjugate are expressed with the following equations.
A280 = Ad,280 + Aa,280 £d,28oCd + £a,28oCa Ecuación (1)A280 = Ad, 280 + AA, 280 £ d, 28oCd + £ a, 28oCa Equation (1)
A370 = Ad,370+ Aa,370 = £d,37oCd + £a,37oCa Ecuación (2)A370 = Ad, 370 + Aa, 370 = £ d, 37oCd + £ a, 37oCa Equation (2)
En lo anterior, A280 representa la absorbancia de una solución acuosa del conjugado de anticuerpo - fármaco a 280 nm, A370 representa la absorbancia de una solución acuosa del conjugado de anticuerpo - fármaco a 370 nm, Aa,280 representa la absorbancia de un anticuerpo a 280 nm, Aa,370 representa la absorbancia de un anticuerpo a 370 nm, Ad,280 representa la absorbancia de un precursor de conjugado a 280 nm, Ad,370 representa la absorbancia de un precursor de conjugado a 370 nm, £a,280 representa el coeficiente de absorción molar de un anticuerpo a 280 nm, £a,370 representa el coeficiente de absorción molar de un anticuerpo a 370 nm, £d,280 representa el coeficiente de absorción molar de un precursor de conjugado a 280 nm, £d,370 representa el coeficiente de absorción molar de un precursor de conjugado a 370 nm, Ca representa la concentración de anticuerpo en un conjugado de anticuerpo - fármaco, y Cd representa la concentración de fármaco en un conjugado de anticuerpo - fármaco.In the foregoing, A280 represents the absorbance of an aqueous solution of the antibody-drug conjugate at 280 nm, A370 represents the absorbance of an aqueous solution of the antibody-drug conjugate at 370 nm, Aa, 280 represents the absorbance of an antibody at 280 nm, Aa, 370 represents the absorbance of an antibody at 370 nm, Ad, 280 represents the absorbance of a conjugate precursor at 280 nm, Ad, 370 represents the absorbance of a conjugate precursor at 370 nm, £ a, 280 represents the molar absorption coefficient of an antibody at 280 nm, £ a, 370 represents the molar absorption coefficient of an antibody at 370 nm, £ d, 280 represents the molar absorption coefficient of a conjugate precursor at 280 nm, £ d, 370 represents the molar absorption coefficient of a conjugate precursor at 370 nm, Ca represents the concentration of antibody in an antibody-drug conjugate, and Cd represents the concentration of drug in an antibody conjugate - drug.
Con respecto a £a,280, £a,370, £d,280, y £d,370 en lo anterior, se usan valores previamente preparados (valor estimado basándose en el valor de cálculo o de medición obtenido mediante medición UV del compuesto). Por ejemplo, £a,280 puede estimarse a partir de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo usando un procedimiento de cálculo conocido (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423). £a,370 es generalmente cero. £d,280 y £d,370 pueden obtenerse basándose en la ley de Lambert-Beer (Absorbancia = concentración molar x coeficiente de absorción molar x longitud de ruta celular) midiendo la absorbancia de una solución en la que el precursor de conjugado que se va a usar se disuelve a una determinada concentración molar. Midiendo A280 y A370 de una solución acuosa del conjugado de anticuerpo - fármaco y resolviendo las ecuaciones simultáneas (1) y (2) usando los valores, pueden obtenerse Ca y Cd. Además, al dividir Cd entre Ca, puede obtenerse el número promedio de fármaco conjugado por anticuerpo.With respect to £ a, 280, £ a, 370, £ d, 280, and £ d, 370 in the above, previously prepared values are used (estimated value based on the calculation or measurement value obtained by UV measurement of the compound ). For example, £ a, 280 can be estimated from the amino acid sequence of an antibody using a known calculation procedure (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423). £ a, 370 is generally zero. £ d, 280 and £ d, 370 can be obtained based on the Lambert-Beer law (Absorbance = molar concentration x molar absorption coefficient x cell path length) by measuring the absorbance of a solution in which the conjugate precursor to be It will use dissolves at a certain molar concentration. By measuring A280 and A370 of an aqueous solution of the antibody-drug conjugate and solving the simultaneous equations (1) and (2) using the values, Ca and Cd can be obtained. In addition, by dividing Cd by Ca, the average number of antibody conjugated drug.
El compuesto representado por la fórmula (2) en el procedimiento de producción 1 es cualquier compuesto representado por la siguiente fórmula:The compound represented by the formula (2) in the production process 1 is any compound represented by the following formula:
[Fórmula 51][Formula 51]
Halógeno-CH2C(=O)NH-(CH2)n3-C(=O)-L2-Lp-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX)Halogen-CH2C (= O) NH- (CH2) n3-C (= O) -L2-Lp-NH- (CH2) n1-La-Lb-Lc- (NH-DX)
En la fórmula, n1, n2, n3, L2, LP, La, Lb, y Lc son como ya se ha definido, y Lc es una posición de conexión para elIn the formula, n1, n2, n3, L2, LP, La, Lb, and Lc are as already defined, and Lc is a connection position for the
fármaco.drug.
En un intermedio útil en la producción de tal compuesto de la presente invención, preferentemente, n2 es un número entero de 2 a 5, L2 es -NH-(CH2CH2O)n5-CH2CH2-C(=O)- o un enlace sencillo, n5 es un número entero de 2 a 4, LP es GGFG, y -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- es una estructura parcial de -NH-CH2CH2-C(=O)-, NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -NH- CH2-O-CH2-C(=O)- o -NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-. El halógeno es preferentemente bromo o yodo. Ejemplos específicos de estos compuestos pueden incluir los siguientes [en el presente documento, (maleimid-N-il) representa un grupo maleimidilo (grupo 2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-ilo)].In an intermediate useful in the production of such a compound of the present invention, preferably, n2 is an integer from 2 to 5, L2 is -NH- (CH2CH2O) n5-CH2CH2-C (= O) - or a single bond, n5 is an integer from 2 to 4, LP is GGFG, and -NH- (CH2) n1-La-Lb-Lc- is a partial structure of -NH-CH2CH2-C (= O) -, NH-CH2CH2CH2- C (= O) -, -NH- CH2-O-CH2-C (= O) - or -NH-CH2CH2-O-CH2-C (= O) -. The halogen is preferably bromine or iodine. Specific examples of these compounds may include the following [herein, (maleimid-N-yl) represents a maleimidyl group (2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrole-1-yl)] group.
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
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(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-(maleimid-N-il) -CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-
C(=O)-(NH-DX)C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-(maleimid-N-il) -CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-
CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)X-CH2-C (= O) -NH-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)X-CH2-C (= O) -NH-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)X-CH2-C (= O) -NH-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)X-CH2-C (= O) -NH-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)X-CH2-C (= O) -NH-CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)X-CH2-C (= O) -NH-CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)X-CH2-C (= O) -NH-CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)X-CH2-C (= O) -NH-CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)X-CH2-C (= O) -NH-CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)X-CH2-C (= O) -NH-CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)X-CH2-C (= O) -NH-CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)X-CH2-C (= O) -NH-CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)X-CH2-C (= O) -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)X-CH2-C (= O) -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)X-CH2-C (= O) -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)X-CH2-C (= O) -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
En la fórmula, X representa un átomo de bromo o un átomo de yodo. Todos estos compuestos de bromo y de yodo pueden usarse preferentemente como intermedios de producción.In the formula, X represents a bromine atom or an iodine atom. All these bromine and iodine compounds can preferably be used as production intermediates.
Con el fin de asegurar la cantidad del conjugado, se pueden mezclar una pluralidad de conjugados obtenidos en condiciones de producción similares para tener un número equivalente de fármacos (por ejemplo, aproximadamente ± 1) para preparar nuevos lotes. En este caso, el número promedio de fármacos cae entre los números promedio de fármacos en los conjugados antes del mezclado.In order to ensure the amount of the conjugate, a plurality of conjugates obtained under similar production conditions can be mixed to have an equivalent number of drugs (for example, approximately ± 1) to prepare new batches. In this case, the average number of drugs falls between the average numbers of drugs in the conjugates before mixing.
2. Procedimiento de producción 22. Production procedure 2
El conjugado de anticuerpo - fármaco representado por la fórmula (1) en el que el anticuerpo está conectado por medio de un grupo amida a un enlazador y que tiene un enlace de tioéter dentro del enlazador, específicamente, una estructura en la que -L1-L2- es -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-(CH2)n6-C (=o)-, también puede producirse mediante el siguiente procedimiento.The antibody-drug conjugate represented by the formula (1) in which the antibody is connected by means of an amide group to a linker and having a thioether bond within the linker, specifically, a structure in which -L1- L2- is -C (= O) -cic.Hex (1,4) -CH2- (N-li-3-diminiccuS) -S- (CH2) n6-C (= o) -, can also be produced by following procedure
En la fórmula, AB-L1' representa un grupo en el que el anticuerpo y el enlazador L1 están conectados y, además, el extremo terminal de L1 se convierte en un grupo N-maleimidilo. Este grupo tiene específicamente una estructura en la que -(N-li-3-diminiccuS)- en AB-C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- se convierte en un grupo maleimidilo. L2' representa un grupo HS-(CH2)n6-C(=O)- en el que el extremo terminal es un grupo mercapto, y aB representa elIn the formula, AB-L1 'represents a group in which the antibody and the L1 linker are connected and, in addition, the terminal end of L1 is converted into an N-maleimidyl group. This group specifically has a structure in which - (N-li-3-diminiccuS) - in AB-C (= O) -cic.Hex (1,4) -CH2- (N-li-3-diminiccuS) - It becomes a maleimidyl group. L2 'represents a group HS- (CH2) n6-C (= O) - in which the terminal end is a mercapto group, and aB represents the
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anticuerpo.antibody.
Específicamente, el conjugado de anticuerpo - fármaco (1) puede producirse haciendo reaccionar el compuesto (2a), que puede obtenerse mediante el procedimiento descrito posteriormente, con el anticuerpo (3b) que está conectado al enlazador que tiene un grupo maleimidilo.Specifically, the antibody-drug conjugate (1) can be produced by reacting the compound (2a), which can be obtained by the procedure described below, with the antibody (3b) that is connected to the linker having a maleimidyl group.
El anticuerpo (3b) que tiene un grupo maleimidilo también puede obtenerse mediante un procedimiento bien conocido en la técnica (Hermanson, G. T, Bioconjugate Techniques, págs. 56-136, págs. 456-493, Academic Press (1996)). Los ejemplos incluyen: un enlazador bifuncional, tal como succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1- carboxilato (SMCC), que es capaz de unirse a un grupo amino o un grupo hidroxilo y tiene un grupo maleimidilo se deja reaccionar en el grupo amino del ligando para introducir un grupo maleimidilo, aunque sin limitarse al mismo.The antibody (3b) having a maleimidyl group can also be obtained by a method well known in the art (Hermanson, G. T, Bioconjugate Techniques, pp. 56-136, pp. 456-493, Academic Press (1996)). Examples include: a bifunctional linker, such as succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), which is capable of binding to an amino group or a hydroxyl group and having a maleimidyl group is allowed to react in the amino group of the ligand to introduce a maleimidyl group, although not limited thereto.
Por ejemplo, puede usarse preferentemente un compuesto que tiene un resto reactivo con grupo amino y un resto reactivo con grupo tiol unido por medio de un enlazador. En este caso, el resto reactivo con grupo amino puede ser éster activo, éster de imida, o similares, y el resto reactivo con tiol puede ser maleimidilo, haluro de acetilo, haluro de alquilo, ditiopiridilo, o similares.For example, a compound having an amino group reactive moiety and a thiol reactive moiety linked by means of a linker can preferably be used. In this case, the amino group reactive moiety can be active ester, imide ester, or the like, and the thiol reactive moiety can be maleimidyl, acetyl halide, alkyl halide, dithiopyridyl, or the like.
Como un procedimiento para construir el enlazador con grupo amino o grupo hidroxi de un aminoácido que constituye el anticuerpo, particularmente por medio de un enlace de amida con el grupo amino, el compuesto que se va a hacer reaccionar en primer lugar con el anticuerpo puede ser un compuesto representado por la siguiente fórmula:As a process for constructing the linker with amino group or hydroxy group of an amino acid constituting the antibody, particularly by means of an amide bond with the amino group, the compound to be reacted first with the antibody can be a compound represented by the following formula:
Q1-L1a-Q2Q1-L1a-Q2
[En la fórmula, Q1 representa (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-, (3-sulfo-pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C (=O)-, RQ- O-C (=N)- u O=C=N-,[In the formula, Q1 represents (pyrrolidine-2,5-dione-N-yl) -OC (= O) -, (3-sulfo-pyrrolidine-2,5-dione-N-yl) -OC (= O ) -, RQ- OC (= N) - or O = C = N-,
L1a- representa -cic.Hex(1,4)-CH2-, un grupo alquileno que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un grupo fenileno, - (CH2)n4-C(=O)-, -(CH2)n-NH-C(=O)-(CH2)n4b-, o-(CH2)n4a-NH-C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-,L1a- represents -cic.Hex (1,4) -CH2-, an alkylene group having 1 to 10 carbon atoms, a phenylene group, - (CH2) n4-C (= O) -, - (CH2) n-NH-C (= O) - (CH2) n4b-, or- (CH2) n4a-NH-C (= O) -cyc.Hex (1,4) -CH2-,
Q2 representa (maleimid-N-ilo), un átomo de halógeno o -S-S-(2-piridilo),Q2 represents (maleimid-N-yl), a halogen atom or -S-S- (2-pyridyl),
Rq representa un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono,Rq represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms,
n4 representa un número entero de 1 a 8, n4a representa un número entero de 0 a 6, y n4b representa un número entero de 1 a 6.]n4 represents an integer from 1 to 8, n4a represents an integer from 0 to 6, and n4b represents an integer from 1 to 6.]
En lo anterior, RQ es un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono y, más preferentemente, un grupo metilo o un grupo etilo.In the foregoing, RQ is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms and, more preferably, a methyl group or an ethyl group.
El grupo alquileno de L1a puede ser uno que tiene de 1 a 10 átomos de carbono. El grupo fenileno puede ser de cualquiera de las configuraciones orto, meta y para y, más preferentemente, es un grupo para- o meta-fenileno.The alkylene group of L1a can be one having 1 to 10 carbon atoms. The phenylene group may be of any of the ortho, meta and para configurations and, more preferably, is a para- or meta-phenylene group.
Los ejemplos preferidos de L1a pueden incluir -cic.Hex(1,4)-CH2-, -(CH2)5-NH-C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-,-(CH2)2-NH- C(=O)-CH2-, -(CH2)5-NH-C(=O)-(CH2)2-, -CH2-,-(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)5-, -(CH2)10-, -(para-Ph)-,-(meta-Ph)-, -(para- Ph)-CH(-CHa)-, -(CH2)3-(meta-Ph)- y -(meta-Ph)-NH-C(=O)-CH2-.Preferred examples of L1a may include -cic.Hex (1,4) -CH2-, - (CH2) 5-NH-C (= O) -cic.Hex (1,4) -CH2 -, - (CH2) 2-NH- C (= O) -CH2-, - (CH2) 5-NH-C (= O) - (CH2) 2-, -CH2 -, - (CH2) 2-, - (CH2) 3- , - (CH2) 5-, - (CH2) 10-, - (para-Ph) -, - (meta-Ph) -, - (para- Ph) -CH (-CHa) -, - (CH2) 3 - (meta-Ph) - and - (meta-Ph) -NH-C (= O) -CH2-.
Q1 es preferentemente (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-, Q2 es preferentemente (maleimid-N-ilo), o puede usarse -S-S-(2-piridil) cuando se va a formar un enlace de disulfuro.Q1 is preferably (pyrrolidine-2,5-dione-N-yl) -OC (= O) -, Q2 is preferably (maleimid-N-yl), or -SS- (2-pyridyl) can be used when going to form a disulfide bond.
En lo anterior, (pirrolidina-2,5-diona-N-il)- es un grupo representado por la siguiente fórmula:In the foregoing, (pyrrolidine-2,5-dione-N-yl) - is a group represented by the following formula:
[Fórmula 53][Formula 53]
en la que el átomo de nitrógeno como una posición de conexión, y (3-sulfo-pirrolidina-2,5-diona-N-il)- es un grupo representado por la siguiente fórmula:wherein the nitrogen atom as a connecting position, and (3-sulfo-pyrrolidine-2,5-dione-N-yl) - is a group represented by the following formula:
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[Fórmula 54][Formula 54]
en la que el átomo de nitrógeno es una posición de conexión, y este ácido sulfónico es capaz de formar una sal de litio, sal de sodio o sal de potasio, y preferentemente sal de sodio,wherein the nitrogen atom is a connecting position, and this sulfonic acid is capable of forming a lithium salt, sodium salt or potassium salt, and preferably sodium salt,
cic.Hex(1,4) representa un grupo 1,4-ciclohexileno, (maleimid-N-il) es un grupo representado por la siguiente fórmula:cic.Hex (1,4) represents a 1,4-cyclohexylene group, (maleimid-N-il) is a group represented by the following formula:
[Fórmula 55][Formula 55]
en la que el átomo de nitrógeno es una posición de conexión, (2-piridil) representa un grupo 2-piridilo, (para-Ph) representa un grupo para-fenileno, y (meta-Ph) representa un grupo meta-fenileno.wherein the nitrogen atom is a connecting position, (2-pyridyl) represents a 2-pyridyl group, (para-Ph) represents a para-phenylene group, and (meta-Ph) represents a meta-phenylene group.
Los ejemplos de tal compuesto incluyen sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidilmetil)ciclohexano-1-carboxilato (sulfo- SMCC), N-succinimidil-4-(N-maleimidilmetil)-ciclohexano-1-carboxi-(6-amidocaproato) (LC-SMCC), éster N- succinimidílico del ácido K-maleimidil undecanoico (KMUA), éster N-succinimidílico del ácido Y-maleimidil butírico (GMBS), éster de N-hidroxisuccinimida del ácido £-maleimidil caproico (EMCS), éster de m-maleimidilbenzoil-N- hidroxisuccinimida (MBS), éster de N-(a-maleimidilacetoxi)-succinimida (AMAS), succinimidil-6-(p-Examples of such a compound include sulfosuccinimidyl-4- (N-maleimidylmethyl) cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC), N-succinimidyl-4- (N-maleimidylmethyl) -cyclohexane-1-carboxy- (6-amidocaproate) ( LC-SMCC), N-succinimidyl ester of K-maleimidyl undecanoic acid (KMUA), N-succinimidyl ester of Y-maleimidyl butyric acid (GMBS), N-hydroxysuccinimide ester of caproic acid £ -maleimidyl (EMCS), ester of m-maleimidylbenzoyl-N-hydroxysuccinimide (MBS), N- (a-maleimidylacetoxy) -succinimide (AMAS) ester, succinimidyl-6- (p-
maleimidilpropionamida)hexanoato (SMPH), N-succinimidil 4-(p-maleimidilfenil)-butirato (SMPB), N-(p-maleimidylpropionamide) hexanoate (SMPH), N-succinimidyl 4- (p-maleimidylphenyl) -butyrate (SMPB), N- (p-
maleimidilfenil)isocianato (PMPI), N-succinimidil-4-(yodoacetil)-aminobenzoato (SIAB), yodoacetato de N- succinimidilo (SIA), bromoacetato de N-succinimidilo (SBA), 3-(bromoacetamida)propionato de N-succinimidilo (SBAP), N-succinimidil-3-(2-piridoditio)propionato (SPDP) y succinimidiloxicarbonil-a-metil-a-(2-piridilditio)tolueno (SMPT).Maleimidylphenyl) isocyanate (PMPI), N-succinimidyl-4- (iodoacetyl) -aminobenzoate (SIAB), N-succinimidyl iodoacetate (SIA), N-succinimidyl bromoacetate (SBA), N-succinimidyl 3- (bromoacetamide) propionate (SBAP), N-succinimidyl-3- (2-pyridodithio) propionate (SPDP) and succinimidyloxycarbonyl-a-methyl-a- (2-pyridyldithio) toluene (SMPT).
Específicamente, por ejemplo, haciendo reaccionar de 2 a 6 equivalentes de SMCC con el anticuerpo (3) en un tampón de fosfato de pH 6 a 7 a temperatura ambiente durante de 1 a 6 horas, el éster activo de SMCC puede reaccionar con el anticuerpo para producir el anticuerpo (3b) que tiene un grupo maleimidilo. El anticuerpo obtenido (3b) puede purificarse mediante el procedimiento común D-2 descrito posteriormente, y usarse para la siguiente reacción con el compuesto (2a).Specifically, for example, by reacting 2 to 6 equivalents of SMCC with the antibody (3) in a phosphate buffer of pH 6 to 7 at room temperature for 1 to 6 hours, the active ester of SMCC can react with the antibody to produce the antibody (3b) having a maleimidyl group. The antibody obtained (3b) can be purified by the common D-2 procedure described below, and used for the next reaction with the compound (2a).
Procedimiento común D-2: Purificación de anticuerpo derivatizado con 4-(N-maleimidilmetil)-ciclohexano-1- carboxilato de succinimidilo (SMCC)Common procedure D-2: Purification of antibody derivatized with 4- (N-maleimidylmethyl) -cyclohexane-1-succinimidyl carboxylate (SMCC)
Una columna NAP-25 se equilibró con PBS6,5/EDTA. La solución de reacción que contiene el anticuerpo derivatizado con 4-(N-maleimidilmetil)-ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (al que se hace referencia en el presente documento como SMCC) se aplicó en una cantidad de aproximadamente 0,5 ml a la columna NAP-25, y entonces se eluyó con el tampón en una cantidad definida por el fabricante para recoger la fracción de anticuerpo para la purificación.A NAP-25 column was equilibrated with PBS6.5 / EDTA. The reaction solution containing the antibody derivatized with succinimidyl 4- (N-maleimidylmethyl) -cyclohexane-1-carboxylate (referred to herein as SMCC) was applied in an amount of approximately 0.5 ml to the NAP-25 column, and then eluted with the buffer in an amount defined by the manufacturer to collect the antibody fraction for purification.
el grupo amino del anticuerpo para conectar con el enlazador puede ser un grupo amino N-terminal y/o un grupo amino portado por un residuo de lisina, aunque sin limitarse al mismo. Como alternativa, el anticuerpo puede conectarse al enlazador con formación de enlace de éster mediante el uso de un grupo hidroxi portado por un residuo de serina.the amino group of the antibody to connect to the linker may be an N-terminal amino group and / or an amino group carried by a lysine residue, although not limited thereto. Alternatively, the antibody can be connected to the linker with ester bond formation through the use of a hydroxy group carried by a serine residue.
La reacción del compuesto (2a) con el anticuerpo (3b) conectado al enlazador que tiene un grupo maleimidilo puede realizarse de la misma forma que en el procedimiento para hacer reaccionar el compuesto (2) con el anticuerpo (3a) que tiene un grupo sulfhidrilo tal como se menciona en el procedimiento de producción 1.The reaction of the compound (2a) with the antibody (3b) connected to the linker that has a maleimidyl group can be carried out in the same way as in the procedure to react the compound (2) with the antibody (3a) that has a sulfhydryl group as mentioned in the production procedure 1.
Para el conjugado de anticuerpo - fármaco (1) preparado, puede realizarse la concentración, intercambio de tampón, purificación e identificación del conjugado de anticuerpo - fármaco (1) mediante la medición de concentración de anticuerpo y un número promedio de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticuerpo de la misma forma que en el procedimiento de producción 1.For the antibody-drug conjugate prepared (1), concentration, buffer exchange, purification and identification of the antibody-drug conjugate (1) can be performed by measuring antibody concentration and an average number of drug molecules conjugated by antibody molecule in the same way as in the production process 1.
El compuesto representado por la fórmula (3b) en el procedimiento de producción 2 tiene la siguiente estructura (véase la siguiente fórmula; en la estructura de la misma, "anticuerpo -NH-" se origina a partir de un anticuerpo).The compound represented by the formula (3b) in the production process 2 has the following structure (see the following formula; in the structure thereof, "-NH- antibody" originates from an antibody).
[Fórmula 56][Formula 56]
Un compuesto que es un intermedio para producir el conjugado de anticuerpo - fármaco de la presente invención y tiene la estructura anterior es como se describe a continuación (en la fórmula, n es un número entero de 1 a 10, 5 preferentemente de 2 a 8 y, más preferentemente, de 3 a 8).A compound that is an intermediate to produce the antibody-drug conjugate of the present invention and has the above structure is as described below (in the formula, n is an integer from 1 to 10, 5 preferably from 2 to 8 and, more preferably, from 3 to 8).
[Fórmula 57][Formula 57]
Además, los ejemplos del compuesto de la presente invención en los que el extremo terminal es un grupo mercapto pueden incluir los siguientes.In addition, examples of the compound of the present invention in which the terminal end is a mercapto group may include the following.
HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)HS-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)HS-CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
10 HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)10 HS-CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)HS-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)HS-CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)HS-CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
15 HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)15 HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)HS-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX) HS-CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2 -C (= O) - (NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
20 HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)20 HS-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)HS-CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)HS-CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)HS-CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
25 HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)HS-CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX)HS-CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
3. Procedimiento de producción 33. Production procedure 3
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El conjugado de anticuerpo - fármaco representado por la fórmula (1) en el que el anticuerpo está conjugada con el resto de enlazador de fármaco por medio de un enlace de amida puede producirse mediante un procedimiento descrito posteriormente. Por ejemplo, con respecto a -C(=O)-(CH2)n4-C(=O)- de L1, su éster activo L1', por ejemplo, (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-, puede usarse preferentemente. Cuando L2 es un enlace sencillo, el conjugado de anticuerpo - fármaco (1) puede producirse mediante el siguiente procedimiento, por ejemplo.The antibody-drug conjugate represented by the formula (1) in which the antibody is conjugated to the drug linker moiety through an amide bond can be produced by a procedure described below. For example, with respect to -C (= O) - (CH2) n4-C (= O) - of L1, its active ester L1 ', for example, (pyrrolidine-2,5-dione-N-yl) - OC (= O) - (CH2) n4-C (= O) -, can preferably be used. When L2 is a single bond, the antibody-drug conjugate (1) can be produced by the following procedure, for example.
[Fórmula 58][Formula 58]
ABAB
33
1 2 P labe 1 2 P labe1 2 P labe 1 2 P labe
L -L -L -NH-(CH2)n -L -L -L -(NH-DX) ---------------> AB-L -L -L -NH-(CH2)n -L -L -L -(NH-DX)L -L -L -NH- (CH2) n -L -L -L - (NH-DX) ---------------> AB-L -L -L -NH- (CH2) n -L -L -L - (NH-DX)
2b 12b 1
Específicamente, el conjugado de anticuerpo - fármaco (1) puede producirse haciendo reaccionar el compuesto (2b), que puede obtenerse mediante el procedimiento descrito posteriormente, con el anticuerpo (3).Specifically, the antibody-drug conjugate (1) can be produced by reacting the compound (2b), which can be obtained by the procedure described below, with the antibody (3).
El compuesto (2b) es capaz de conectar con el grupo amino o grupo hidroxilo del anticuerpo. El grupo amino y grupo hidroxilo del anticuerpo se refieren a, como se describe en el procedimiento de producción 2, por ejemplo, un grupo amino N-terminal portado por el anticuerpo y/o un grupo amino portado por un residuo de lisina y un grupo hidroxi portado por un residuo de serina, respectivamente, pero estos no se limitan a los mismos.The compound (2b) is capable of connecting with the amino group or hydroxyl group of the antibody. The amino group and hydroxyl group of the antibody refer to, as described in production method 2, for example, an N-terminal amino group carried by the antibody and / or an amino group carried by a lysine residue and a group hydroxy carried by a serine residue, respectively, but these are not limited thereto.
El compuesto (2 b) es un éster activo compuesto por un grupo éster N-hidroxisuccinimidílico. Como alternativa, pueden usarse otros ésteres activos, por ejemplo, un grupo éster sulfosuccinimidílico, éster N-hidroxiftalimidílico, éster N-hidroxisulfoftalimidílico, éster orto-nitrofenílico, éster para-nitrofenílico, éster 2,4-dinitrofenílico, éster 3- sulfonil-4-nitrofenílico, éster 3-carboxi-4-nitrofenílico y éster pentafluorofenílico.Compound (2b) is an active ester composed of an N-hydroxysuccinimidyl ester group. Alternatively, other active esters may be used, for example, a sulfosuccinimidyl ester group, N-hydroxyphthalimidyl ester, N-hydroxysulfophthalimidyl ester, ortho-nitrophenyl ester, para-nitrophenyl ester, 2,4-dinitrophenyl ester, 3- sulfonyl-4 ester -nitrophenyl, 3-carboxy-4-nitrophenyl ester and pentafluorophenyl ester.
Usando de 2 a 20 equivalentes molares del compuesto (2b) por anticuerpo (3) en la reacción del compuesto (2b) con el anticuerpo(3), puede producirse el conjugado de anticuerpo - fármaco (1) en el que se conjugan de 1 a 10 moléculas de fármaco por anticuerpo. Específicamente, la solución que contiene el compuesto (2b) disuelto en la misma se puede añadir a una solución tampón que contiene el anticuerpo (3) para la reacción para producir el conjugado de anticuerpo - fármaco (1). En el presente documento, los ejemplos de la solución tampón que puede usarse incluyen solución de acetato sódico, fosfato sódico y borato sódico. El pH para la reacción puede ser de 5 a 9 y, más preferentemente, la reacción se realiza cerca de pH 7. Los ejemplos del disolvente para disolver el compuesto (2b) incluyen un disolvente orgánico tal como dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), dimetil acetamida (DMA) y N-metil-2-piridona (NMP). Es suficiente que la solución de disolvente orgánico que contiene el compuesto (2b) disuelto en la misma se añada a 1 a 20 % v/v a una solución tampón que contiene el anticuerpo (3) para la reacción. La temperatura de reacción es de 0 a 37 °C, más preferentemente de 10 a 25 °C, y el tiempo de reacción es de 0,5 a 20 horas.Using 2 to 20 molar equivalents of the compound (2b) per antibody (3) in the reaction of the compound (2b) with the antibody (3), the antibody-drug conjugate (1) can be produced in which 1 to 10 drug molecules per antibody. Specifically, the solution containing the compound (2b) dissolved therein can be added to a buffer solution containing the antibody (3) for the reaction to produce the antibody-drug conjugate (1). Here, examples of the buffer solution that can be used include sodium acetate solution, sodium phosphate and sodium borate. The pH for the reaction can be from 5 to 9 and, more preferably, the reaction is carried out near pH 7. Examples of the solvent for dissolving the compound (2b) include an organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO), dimethylformamide (DMF ), dimethyl acetamide (DMA) and N-methyl-2-pyridone (NMP). It is sufficient that the organic solvent solution containing the compound (2b) dissolved therein is added at 1 to 20% v / v to a buffer solution containing the antibody (3) for the reaction. The reaction temperature is 0 to 37 ° C, more preferably 10 to 25 ° C, and the reaction time is 0.5 to 20 hours.
Para el conjugado de anticuerpo - fármaco producido (1), puede realizarse la concentración, intercambio de tampón, purificación e identificación del conjugado de anticuerpo - fármaco (1) mediante la medición de concentración de anticuerpo y un número promedio de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticuerpo de la misma forma que en el procedimiento de producción 1.For the antibody-drug conjugate produced (1), concentration, buffer exchange, purification and identification of the antibody-drug conjugate (1) can be performed by measuring antibody concentration and an average number of drug molecules conjugated by antibody molecule in the same way as in the production process 1.
El resto (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-(CH2)n4-C(=O)- en el procedimiento de producción 3 tiene la siguiente estructura.The rest (pyrrolidine-2,5-dione-N-yl) -O-C (= O) - (CH2) n4-C (= O) - in the production process 3 has the following structure.
[Fórmula 59][Formula 59]
Los ejemplos del compuesto de la presente invención que tiene la estructura parcial anterior pueden incluir los siguientes.Examples of the compound of the present invention having the above partial structure may include the following.
(Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl) -O-C (= O) -CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
(Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl) -O-C (= O) -CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
(Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl) -O-C (= O) -CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
(Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl) -O-C (= O) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
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(P(P
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rrolidina-2,5-diona-N-rrolidine-2,5-dione-N-
rrolidina-2,5-diona-N-rrolidine-2,5-dione-N-
rrolidina-2,5-diona-N-rrolidine-2,5-dione-N-
rrolidina-2,5-diona-N-rrolidine-2,5-dione-N-
rrolidina-2,5-diona-N-rrolidine-2,5-dione-N-
rrolidina-2,5-diona-N-rrolidine-2,5-dione-N-
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rrolidina-2,5-diona-N-rrolidine-2,5-dione-N-
rrolidina-2,5-diona-N-rrolidine-2,5-dione-N-
rrolidina-2,5-diona-N-rrolidine-2,5-dione-N-
rrolidina-2,5-diona-N-rrolidine-2,5-dione-N-
rrolidina-2,5-diona-N-rrolidine-2,5-dione-N-
rrolidina-2,5-diona-N-rrolidine-2,5-dione-N-
rrolidina-2,5-diona-N-rrolidine-2,5-dione-N-
rrolidina-2,5-diona-N-rrolidine-2,5-dione-N-
rrolidina-2,5-diona-N-rrolidine-2,5-dione-N-
rrolidina-2,5-diona-N-rrolidine-2,5-dione-N-
■il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) ■il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) ■il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) ■il)-O-(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) ■il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) ■il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=OMNH-DX) il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) il-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)■ il) -OC (= O) -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-C (= O) - (NH-DX) ■ il) -OC (= O) -CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX) ■ il) -OC (= O) -CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX) ■ il) -O - (= O) -CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX) ■ il) -OC (= O) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX) il) -OC (= O) -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX) ■ il) -OC (= O) -CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (= OMNH-DX) il) -OC ( = O) -CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX) il) -OC (= O) -CH2CH2CH2CH2-C (= O) - GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX) il) -OC (= O) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C ( = O) - (NH-DX) il) -OC (= O) -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX) il) - OC (= O) -CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX) il) -OC (= O) -CH2CH2CH2-C (= O ) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX) il) -OC (= O) -CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C (= O) - (NH-DX) il) -OC (= O) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX) il -OC (= O) -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX) il) -OC (= O) -CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2 -C (= O) -GGFG-NH- CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
(Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl) -O-C (= O) -CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-
NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
(Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl) -O-C (= O) -CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-
C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
4. Procedimiento de producción 44. Production procedure 4
El compuesto representado por la fórmula (2) o (2b) como un intermedio usado en el procedimiento de producción previo y una sal farmacológicamente aceptable del mismo puede producirse mediante el siguiente procedimiento, por ejemplo.The compound represented by the formula (2) or (2b) as an intermediate used in the previous production process and a pharmacologically acceptable salt thereof can be produced by the following procedure, for example.
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En la fórmula, Lc es -C(=O)- y está conectado a -(NH-DX) con formación de enlace de amida, L1' representa una estructura L1 en la que el extremo terminal se convierte en un grupo maleimidilo o un grupo haloacetilo, o en (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-, y P1, P2, y P3 representan cada uno un grupo protector.In the formula, Lc is -C (= O) - and is connected to - (NH-DX) with amide bond formation, L1 'represents a structure L1 in which the terminal end is converted into a maleimidyl group or a haloacetyl group, or in (pyrrolidine-2,5-dione-N-yl) -OC (= O) - (CH2) n4-C (= O) -, and P1, P2, and P3 each represent a protective group .
El compuesto (6) puede producirse derivatizando el ácido carboxílico (5) para dar un éster activo, anhídrido de ácido mixto, haluro de ácido, o similares y haciéndolo reaccionar con NH2-DX [que indica exatecán; nombre químico: (1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-dihidro-9-hidroxi-4-metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2- b]quinolin-10,13(9H,15H)-diona] (4) o una sal farmacológicamente aceptable del mismo.The compound (6) can be produced by derivatizing the carboxylic acid (5) to give an active ester, mixed acid anhydride, acid halide, or the like and reacting it with NH2-DX [indicating exatecan; chemical name: (1S, 9S) -1-amino-9-ethyl-5-fluoro-2,3-dihydro-9-hydroxy-4-methyl-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4' : 6.7] indolizino [1,2- b] quinolin-10,13 (9H, 15H) -dione] (4) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
Para la reacción pueden emplearse reactivos y condiciones de reacción que se usan habitualmente para la síntesis de péptidos. Hay diversos tipos de éster activo. Por ejemplo, este puede producirse haciendo reaccionar fenoles tales como p-nitrofenol, N-hidroxi benzotriazol, N-hidroxi succinimida, o similares, con el ácido carboxílico (5) usando un agente de condensación tal como N,N'-diciclohexilcarbodiimida o clorhidrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida. Además, el éster activo también puede producirse mediante una reacción del ácido carboxílico (5) con trifluoroacetato de pentafluorofenilo o similares; una reacción del ácido carboxílico (5) con oxitripirrolidinofosfonio hexafluorofosfito de 1-benzotriazolilo; una reacción del ácido carboxílico (5) con cianofosfonato de dietilo (procedimiento de disolución de proteínas por adición de sal); una reacción del ácido carboxílico (5) con trifenilfosfina y disulfuro de 2,2'-dipiridilo (procedimiento de Mukaiyama); una reacción del ácido carboxílico (5) con un derivado de triazina tal como cloruro de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinio (DMTMM); o similares. Además, la reacción también puede realizarse mediante, por ejemplo, un procedimiento de haluro de ácido mediante el cual el ácido carboxílico (5) se trata con haluro de ácido tal como cloruro de tionilo y cloruro de oxalilo en presencia de una base. Haciendo reaccionar el éster activo, anhídrido de ácido mixto o haluro de ácido del ácido carboxílico (5) obtenido en consecuencia con el compuesto (4) en presencia de una base adecuada en un disolvente inerte de -78 °C a 150 °C, puede producirse el compuesto (6) (paralelamente, "disolvente inerte" indica un disolvente que no inhibe una reacción para la que se usa el disolvente).Reagents and reaction conditions that are commonly used for peptide synthesis can be used for the reaction. There are different types of active ester. For example, this can be produced by reacting phenols such as p-nitrophenol, N-hydroxy benzotriazole, N-hydroxy succinimide, or the like, with carboxylic acid (5) using a condensing agent such as N, N'-dicyclohexylcarbodiimide or hydrochloride of 1-ethyl-3- (3- dimethylaminopropyl) carbodiimide. In addition, the active ester can also be produced by a reaction of the carboxylic acid (5) with pentafluorophenyl trifluoroacetate or the like; a reaction of the carboxylic acid (5) with 1-benzotriazolyl oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphite; a reaction of the carboxylic acid (5) with diethyl cyanophosphonate (method of dissolving proteins by adding salt); a reaction of the carboxylic acid (5) with triphenylphosphine and 2,2'-dipyridyl disulfide (Mukaiyama process); a reaction of the carboxylic acid (5) with a triazine derivative such as 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl) -4-methylmorpholinium chloride (DMTMM); or similar. In addition, the reaction can also be performed by, for example, an acid halide process whereby the carboxylic acid (5) is treated with acid halide such as thionyl chloride and oxalyl chloride in the presence of a base. By reacting the active ester, mixed acid anhydride or carboxylic acid acid halide (5) obtained accordingly with the compound (4) in the presence of a suitable base in an inert solvent from -78 ° C to 150 ° C, it can the compound (6) being produced (in parallel, "inert solvent" indicates a solvent that does not inhibit a reaction for which the solvent is used).
Ejemplos específicos de la base usada para cada etapa anteriormente descrita incluyen carbonato de un metal alcalino o un metal alcalinotérreo, un alcóxido de metal alcalino, hidróxido o hidruro de un metal alcalino incluyendo carbonato sódico, carbonato potásico, etóxido sódico, butóxido potásico, hidróxido sódico, hidróxido potásico, hidruro sódico e hidruro potásico, base organometálica representada por un alquil litio incluyendo n-butil-litio, dialquilamino litio incluyendo diisopropilamida de litio; base organometálica de bis-sililamina incluyendo bis(trimetilsilil)amida de litio; y base orgánica incluyendo piridina, 2,6-lutidina, collidina, 4-dimetilaminopiridina, trietilamina, N-metilmorfolina, diisopropiletilamina y diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU).Specific examples of the base used for each step described above include carbonate of an alkali metal or alkaline earth metal, an alkali metal alkoxide, hydroxide or hydride of an alkali metal including sodium carbonate, potassium carbonate, sodium ethoxide, potassium butoxide, sodium hydroxide , potassium hydroxide, sodium hydride and potassium hydride, organometallic base represented by an alkyl lithium including n-butyllithium, dialkylamino lithium including lithium diisopropylamide; organometallic base of bis-silylamine including lithium bis (trimethylsilyl) amide; and organic base including pyridine, 2,6-lutidine, collidine, 4-dimethylaminopyridine, triethylamine, N-methylmorpholine, diisopropylethylamine and diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene (DBU).
Los ejemplos del disolvente inerte que se usa para la reacción de la presente invención incluyen un disolvente de hidrocarburo halogenado tal como diclorometano, cloroformo y tetracloruro de carbono; un disolvente de éter tal como tetrahidrofurano, 1,2-dimetoxietano y dioxano; un disolvente de hidrocarburo aromático tal como benceno y tolueno; y un disolvente de amida tal como N,N-dimetilformamida, N,N-dimetilacetamida y N-metilpirrolidin-2-ona. Además de estos, se pueden usar, dependiendo de un caso, un disolvente de sulfóxido, tal como dimetilsulfóxido y sulfolano, y un disolvente de cetona tal como acetona y metil etil cetona.Examples of the inert solvent that is used for the reaction of the present invention include a halogenated hydrocarbon solvent such as dichloromethane, chloroform and carbon tetrachloride; an ether solvent such as tetrahydrofuran, 1,2-dimethoxyethane and dioxane; an aromatic hydrocarbon solvent such as benzene and toluene; and an amide solvent such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide and N-methylpyrrolidin-2-one. In addition to these, a sulfoxide solvent, such as dimethyl sulfoxide and sulfolane, and a ketone solvent such as acetone and methyl ethyl ketone can be used, depending on a case.
El grupo hidroxi, grupo carboxi, grupo amino, o similares de La y Lb en el compuesto (6) puede protegerse con un grupo protector que se usa habitualmente en la síntesis de compuestos orgánicos, como se menciona posteriormente. Específicamente, los ejemplos del grupo protector para un grupo hidroxilo incluyen un grupo alcoximetilo tal como grupo metoximetilo; un grupo arilmetilo tal como grupo bencilo, grupo 4-metoxibencilo y grupo trifenilmetilo; un grupo alcanoílo tal como grupo acetilo; un grupo aroílo tal como grupo benzoílo; y un grupo sililo tal como grupo terc-butil difenilsililo. El grupo carboxi puede protegerse, por ejemplo, como un éster con un grupo alquilo tal como grupo metilo, grupo etilo y grupo terc-butilo, un grupo alilo, o un grupo arilmetilo tal como grupo bencilo. Un grupo amino puede protegerse con un grupo protector para un grupo amino que se usa generalmente para la síntesis de péptidos, por ejemplo, un grupo alquiloxi carbonilo tal como grupo terc-butiloxi carbonilo, grupo metoxicarbonilo y grupo etoxicarbonilo; un grupo arilmetilo tal como aliloxicarbonilo, grupo 9-fluorenilmetiloxi carbonilo, grupo benciloxi carbonilo, grupo parametoxibenciloxi carbonilo y grupo para (u orto)nitroilbenciloxi carbonilo; un grupo alcanoílo tal como grupo acetilo; un grupo arilmetilo tal como grupo bencilo y grupo trifenil metilo; un grupo aroílo tal como grupo benzoílo; y un grupo aril sulfonilo tal como grupo 2,4-dinitrobenceno sulfonilo o grupo ortonitrobenceno sulfonilo. La protección con y la desprotección del grupo protector pueden realizarse de acuerdo con un procedimiento llevado a cabo habitualmente.The hydroxy group, carboxy group, amino group, or the like of La and Lb in the compound (6) can be protected with a protective group that is commonly used in the synthesis of organic compounds, as mentioned below. Specifically, examples of the protecting group for a hydroxyl group include an alkoxymethyl group such as methoxymethyl group; an arylmethyl group such as benzyl group, 4-methoxybenzyl group and triphenylmethyl group; an alkanoyl group such as acetyl group; an aroyl group such as benzoyl group; and a silyl group such as tert-butyl diphenylsilyl group. The carboxy group can be protected, for example, as an ester with an alkyl group such as methyl group, ethyl group and tert-butyl group, an allyl group, or an arylmethyl group such as benzyl group. An amino group can be protected with a protecting group for an amino group that is generally used for peptide synthesis, for example, an alkyloxycarbonyl group such as tert-butyloxycarbonyl group, methoxycarbonyl group and ethoxycarbonyl group; an arylmethyl group such as allyloxycarbonyl, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group, benzyloxycarbonyl group, paramethoxybenzyloxycarbonyl group and (or ortho) nitroylbenzyloxycarbonyl group; an alkanoyl group such as acetyl group; an arylmethyl group such as benzyl group and triphenyl methyl group; an aroyl group such as benzoyl group; and an aryl sulfonyl group such as 2,4-dinitrobenzene sulfonyl group or ortonitrobenzene sulfonyl group. Protection with and deprotection of the protective group can be carried out according to a procedure usually carried out.
Con respecto al grupo protector P1 para el grupo amino terminal del compuesto (6), se puede usar un grupo protector para un grupo amino que se usa generalmente para la síntesis de péptidos, por ejemplo, grupo terc-butiloxi carbonilo, grupo 9-fluorenilmetiloxi carbonilo y grupo benciloxi carbonilo. Los ejemplos del otro grupo protector para un grupo amino incluyen un grupo alcanoílo tal como grupo acetilo; un grupo alcoxicarbonilo tal como grupo metoxicarbonilo y grupo etoxicarbonilo; un grupo arilmetoxi carbonilo tal como grupo parametoxibenciloxi carbonilo, y grupo para (u orto)nitroilbenciloxi carbonilo; un grupo arilmetilo tal como grupo bencilo y grupo trifenil metilo; un grupo aroílo tal como grupo benzoílo; y un grupo aril sulfonilo tal como grupo 2,4-dinitrobenceno sulfonilo y grupo ortonitrobenceno sulfonilo. El grupo protector P1 puede seleccionarse dependiendo de, por ejemplo, las propiedades de un compuesto que tiene un grupo amino que se va a proteger.With respect to the protective group P1 for the amino terminal group of the compound (6), a protective group for an amino group that is generally used for the synthesis of peptides can be used, for example, tert-butyloxy carbonyl group, 9-fluorenylmethyloxy group carbonyl and benzyloxy carbonyl group. Examples of the other protecting group for an amino group include an alkanoyl group such as acetyl group; an alkoxycarbonyl group such as methoxycarbonyl group and ethoxycarbonyl group; an arylmethoxycarbonyl group such as paramethoxybenzyloxycarbonyl group, and (or ortho) nitroylbenzyloxycarbonyl group; an arylmethyl group such as benzyl group and triphenyl methyl group; an aroyl group such as benzoyl group; and an aryl sulfonyl group such as 2,4-dinitrobenzene sulfonyl group and ortonitrobenzene sulfonyl group. The protecting group P1 can be selected depending on, for example, the properties of a compound having an amino group to be protected.
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Desprotegiendo el grupo protector P1 para el grupo amino terminal del compuesto (6) obtenido, puede producirse el compuesto (7). Los reactivos y condiciones pueden seleccionarse dependiendo del grupo protector.By deprotecting the protecting group P1 for the amino terminal group of the compound (6) obtained, the compound (7) can be produced. Reagents and conditions can be selected depending on the protecting group.
El compuesto (9) puede producirse derivatizando el ácido carboxílico peptídico (8) que tiene el N terminal protegido con P2 para dar un éster activo, anhídrido de ácido mixto, o similares y haciéndolo reaccionar con el compuesto (7) obtenido. Las condiciones de reacción, reactivos, base y disolvente inerte usados para formar un enlace peptídico entre el ácido carboxílico peptídico (8) y el compuesto (7) se pueden seleccionar adecuadamente de entre los descritos para la síntesis del compuesto (6). El grupo protector P2 puede seleccionarse adecuadamente de entre los descritos para el grupo protector del compuesto (6), y la selección se puede realizar basándose en, por ejemplo, las propiedades del compuesto que tiene un grupo amino que se va a proteger. Debido a que el mismo se usa generalmente para la síntesis de péptidos, el compuesto (9) también puede producirse repitiendo secuencialmente la reacción y desprotección del aminoácido o péptido que constituye el ácido carboxílico peptídico (8) para su alargamiento.The compound (9) can be produced by derivatizing the peptide carboxylic acid (8) having the terminal N protected with P2 to give an active ester, mixed acid anhydride, or the like and reacting it with the compound (7) obtained. The reaction conditions, reagents, base and inert solvent used to form a peptide bond between the peptide carboxylic acid (8) and the compound (7) can be suitably selected from those described for the synthesis of the compound (6). The protecting group P2 can be suitably selected from those described for the protecting group of the compound (6), and the selection can be made based on, for example, the properties of the compound having an amino group to be protected. Because it is generally used for peptide synthesis, the compound (9) can also be produced by sequentially repeating the reaction and deprotection of the amino acid or peptide that constitutes the peptide carboxylic acid (8) for elongation.
Desprotegiendo P2 como el grupo protector para el grupo amino del compuesto (9) obtenido, puede producirse el compuesto (10). Los reactivos y condiciones pueden seleccionarse dependiendo del grupo protector.By deprotecting P2 as the protecting group for the amino group of the compound (9) obtained, the compound (10) can be produced. Reagents and conditions can be selected depending on the protecting group.
Es posible producir el compuesto (2) o (2b) derivatizando el ácido carboxílico (11) o (11b) para dar un éster activo, anhídrido de ácido mixto, haluro de ácido, o similares y haciéndolo reaccionar con el compuesto (10) obtenido. Las condiciones de reacción, reactivos, base y disolvente inerte usados para formar un enlace peptídico entre el ácido carboxílico (11) o (11b) y el compuesto (10) se pueden seleccionar adecuadamente de entre los descritos para la síntesis del compuesto (6).It is possible to produce the compound (2) or (2b) by derivatizing the carboxylic acid (11) or (11b) to give an active ester, mixed acid anhydride, acid halide, or the like and reacting it with the compound (10) obtained . The reaction conditions, reagents, base and inert solvent used to form a peptide bond between the carboxylic acid (11) or (11b) and the compound (10) can be suitably selected from those described for the synthesis of the compound (6) .
El compuesto (9) también puede producirse mediante el siguiente procedimiento, por ejemplo.The compound (9) can also be produced by the following procedure, for example.
El compuesto (13) puede producirse derivatizando el ácido carboxílico peptídico (8) que tiene el N terminal protegido con P2 para dar un éster activo, anhídrido de ácido mixto, o similares y haciéndolo reaccionar con el compuesto de amina (12) que tiene el grupo carboxi protegido con P3 en presencia de una base. Las condiciones de reacción, reactivos, base y disolvente inerte usados para formar un enlace peptídico entre el ácido carboxílico peptídico (8) y el compuesto (12) se pueden seleccionar adecuadamente de entre los descritos para la síntesis del compuesto (6). El grupo protector P2 para el grupo amino del compuesto (13) puede seleccionarse adecuadamente de entre los descritos para el grupo protector del compuesto (6). Con respecto al grupo protector P3 para un grupo carboxi, puede usarse un grupo protector usado habitualmente como un grupo protector para un grupo carboxi en la química de síntesis orgánica, en particular, síntesis de péptidos. Específicamente, este puede seleccionarse adecuadamente de entre los descritos para el grupo protector del compuesto (6), por ejemplo, ésteres con un grupo alquilo tal como un grupo metilo, un grupo etilo, o un terc-butilo, ésteres alílicos y ésteres bencílicos. En tal caso, es necesario que el grupo protector para un grupo amino y el grupo protector para un grupo carboxi se puedan retirar mediante un procedimiento diferente o condiciones diferentes. Por ejemplo, un ejemplo representativo incluye una combinación en la que P2 es un grupo terc-butiloxi carbonilo y P3 es un grupo bencilo. Los grupos protectores se pueden seleccionar de entre los mencionados anteriormente, dependiendo de, por ejemplo, las propiedades de un compuesto que tiene un grupo amino y un grupo carboxi que se va a proteger. Para la retirada de los grupos protectores, los reactivos y condiciones pueden seleccionarse dependiendo del grupo protector.The compound (13) can be produced by derivatizing the peptide carboxylic acid (8) having the N-terminal protected with P2 to give an active ester, mixed acid anhydride, or the like and reacting it with the amine compound (12) having the carboxy group protected with P3 in the presence of a base. The reaction conditions, reagents, base and inert solvent used to form a peptide bond between the peptide carboxylic acid (8) and the compound (12) can be suitably selected from those described for the synthesis of the compound (6). The protecting group P2 for the amino group of the compound (13) can be suitably selected from those described for the protecting group of the compound (6). With respect to the protecting group P3 for a carboxy group, a protecting group commonly used as a protecting group for a carboxy group can be used in organic synthesis chemistry, in particular, peptide synthesis. Specifically, this may be suitably selected from those described for the protecting group of the compound (6), for example, esters with an alkyl group such as a methyl group, an ethyl group, or a tert-butyl, allyl esters and benzyl esters. In such a case, it is necessary that the protecting group for an amino group and the protecting group for a carboxy group can be removed by a different procedure or different conditions. For example, a representative example includes a combination in which P2 is a tert-butyloxycarbonyl group and P3 is a benzyl group. The protecting groups can be selected from those mentioned above, depending on, for example, the properties of a compound having an amino group and a carboxy group to be protected. For the removal of the protective groups, the reagents and conditions can be selected depending on the protective group.
Desprotegiendo el grupo protector P3 para el grupo carboxi del compuesto (13) obtenido, puede producirse el compuesto (14). Los reactivos y condiciones se seleccionan dependiendo del grupo protector.By deprotecting the protecting group P3 for the carboxy group of the compound (13) obtained, the compound (14) can be produced. Reagents and conditions are selected depending on the protecting group.
El compuesto (9) puede producirse derivatizando el compuesto (14) obtenido para dar éster activo, anhídrido de ácido mixto, haluro de ácido, o similares y haciéndolo reaccionar con el compuesto (4) en presencia de una base. Para la reacción, también pueden usarse reactivos y condiciones de reacción que se usan generalmente para la síntesis de péptidos, y las condiciones de reacción, reactivos, base y disolvente inerte usados para la reacción se pueden seleccionar adecuadamente de entre los descritos para la síntesis del compuesto (6).The compound (9) can be produced by derivatizing the compound (14) obtained to give active ester, mixed acid anhydride, acid halide, or the like and reacting it with the compound (4) in the presence of a base. For the reaction, reagents and reaction conditions that are generally used for peptide synthesis can also be used, and the reaction conditions, reagents, base and inert solvent used for the reaction can be suitably selected from those described for the synthesis of the compound (6).
El compuesto (2) o (2b) también puede producirse mediante el siguiente procedimiento, por ejemplo.The compound (2) or (2b) can also be produced by the following procedure, for example.
Desprotegiendo el grupo protector P2 para el grupo amino del compuesto (13), puede producirse el compuesto (15). Los reactivos y condiciones pueden seleccionarse dependiendo del grupo protector.By deprotecting the protecting group P2 for the amino group of the compound (13), the compound (15) can be produced. Reagents and conditions can be selected depending on the protecting group.
El compuesto (16) o (16b) puede producirse derivatizando el derivado de ácido carboxílico (11) o (11b) para dar un éster activo, anhídrido de ácido mixto, haluro de ácido, o similares y haciéndolo reaccionar con el compuesto (15) obtenido en presencia de una base. Las condiciones de reacción, reactivos, base y disolvente inerte usados para formar un enlace de amida entre el ácido carboxílico peptídico (11) o (11b) y el compuesto (15) se pueden seleccionar adecuadamente de entre los descritos para la síntesis del compuesto (6).The compound (16) or (16b) can be produced by derivatizing the carboxylic acid derivative (11) or (11b) to give an active ester, mixed acid anhydride, acid halide, or the like and reacting it with the compound (15) obtained in the presence of a base. The reaction conditions, reagents, base and inert solvent used to form an amide bond between the peptide carboxylic acid (11) or (11b) and the compound (15) can be suitably selected from those described for the synthesis of the compound ( 6).
Desprotegiendo el grupo protector para el grupo carboxi del compuesto (16) o (16b) obtenido, puede producirse el compuesto (17) o (17b). Este puede realizarse de forma similar a la desprotección del grupo carboxi para producir el compuesto (14).By deprotecting the protective group for the carboxy group of the compound (16) or (16b) obtained, the compound (17) or (17b) can be produced. This can be done similarly to the deprotection of the carboxy group to produce the compound (14).
El compuesto (2) o (2b) puede producirse derivatizando el compuesto (17) o (17b) para dar un éster activo, anhídridoThe compound (2) or (2b) can be produced by derivatizing the compound (17) or (17b) to give an active ester, anhydride
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de ácido mixto, haluro de ácido, o similares y haciéndolo reaccionar con el compuesto (4) en presencia de una base. Para la reacción, también pueden usarse reactivos y condiciones de reacción que se usan generalmente para la síntesis de péptidos, y las condiciones de reacción, reactivos, base y disolvente inerte usados para la reacción se pueden seleccionar adecuadamente de entre los descritos para la síntesis del compuesto (6).of mixed acid, acid halide, or the like and reacting it with the compound (4) in the presence of a base. For the reaction, reagents and reaction conditions that are generally used for peptide synthesis can also be used, and the reaction conditions, reagents, base and inert solvent used for the reaction can be suitably selected from those described for the synthesis of the compound (6).
5. Procedimiento de producción 55. Production procedure 5
El compuesto representado por la fórmula (2) de un intermedio también puede producirse mediante el siguiente procedimiento.The compound represented by the formula (2) of an intermediate can also be produced by the following procedure.
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En la fórmula, L ' se corresponde con L que tiene una estructura en la que el extremo terminal se convierte en un grupo maleimidilo o un grupo haloacetilo, y P4 representa un grupo protector.In the formula, L 'corresponds to L which has a structure in which the terminal end is converted into a maleimidyl group or a haloacetyl group, and P4 represents a protective group.
El compuesto (19) puede producirse derivatizando el compuesto (11) para dar un éster activo, anhídrido de ácido mixto, o similares y haciéndolo reaccionar con el ácido carboxílico peptídico (18) que tiene el C terminal protegido con P4 en presencia de una base. Las condiciones de reacción, reactivos, base y disolvente inerte usados para formar un enlace peptídico entre el ácido carboxílico peptídico (18) y el compuesto (11) se pueden seleccionar adecuadamente de entre los descritos para la síntesis del compuesto (6). El grupo protector P4 para el grupo carboxi del compuesto (18) puede seleccionarse adecuadamente de entre los descritos para el grupo protector del compuesto (6).The compound (19) can be produced by derivatizing the compound (11) to give an active ester, mixed acid anhydride, or the like and reacting it with the peptide carboxylic acid (18) having the terminal C protected with P4 in the presence of a base . The reaction conditions, reagents, base and inert solvent used to form a peptide bond between the peptide carboxylic acid (18) and the compound (11) can be suitably selected from those described for the synthesis of the compound (6). The protecting group P4 for the carboxy group of the compound (18) can be suitably selected from those described for the protecting group of the compound (6).
Desprotegiendo el grupo protector para el grupo carboxi del compuesto (19) obtenido, puede producirse el compuesto (20). Esto puede realizarse de forma similar a la desprotección del grupo carboxi para producir el compuesto (14).By deprotecting the protecting group for the carboxy group of the compound (19) obtained, the compound (20) can be produced. This can be done similarly to the deprotection of the carboxy group to produce the compound (14).
El compuesto (2) puede producirse derivatizando el compuesto (20) obtenido para dar éster activo, anhídrido de ácido mixto, o similares y haciéndolo reaccionar con el compuesto (7). Para la reacción, también pueden usarse reactivos y condiciones de reacción que se usan generalmente para la síntesis de péptidos, y las condiciones de reacción, reactivos, base y disolvente inerte usados para la reacción se pueden seleccionar adecuadamente de entre los descritos para la síntesis del compuesto (6).The compound (2) can be produced by derivatizing the compound (20) obtained to give active ester, mixed acid anhydride, or the like and reacting it with the compound (7). For the reaction, reagents and reaction conditions that are generally used for peptide synthesis can also be used, and the reaction conditions, reagents, base and inert solvent used for the reaction can be suitably selected from those described for the synthesis of the compound (6).
6. Procedimiento de producción 66. Production procedure 6
El intermedio de producción (2a) descrito en el procedimiento de producción 2 en el que L2' se corresponde con L2 que tiene una estructura en la que el extremo terminal se convierte en un grupo mercaptoalcanoílo puede producirse mediante el siguiente procedimiento.The production intermediate (2a) described in the production process 2 in which L2 'corresponds to L2 having a structure in which the terminal end is converted into a mercaptoalkanoyl group can be produced by the following procedure.
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El compuesto (2a) puede producirse derivatizando el ácido carboxílico (21) que tiene el grupo mercapto terminal para dar un éster activo, anhídrido de ácido mixto, o similares y haciéndolo reaccionar con el compuesto (10). Para la reacción, también pueden usarse reactivos y condiciones de reacción que se usan generalmente para la síntesis de péptidos, y las condiciones de reacción, reactivos, base y disolvente inerte usados para la reacción se pueden seleccionar adecuadamente de entre los descritos para la síntesis del compuesto (4).The compound (2a) can be produced by derivatizing the carboxylic acid (21) having the mercapto terminal group to give an active ester, mixed acid anhydride, or the like and reacting it with the compound (10). For the reaction, reagents and reaction conditions that are generally used for peptide synthesis can also be used, and the reaction conditions, reagents, base and inert solvent used for the reaction can be suitably selected from those described for the synthesis of the compound (4).
Además, el compuesto (23) puede producirse derivatizando el compuesto (21) para dar un éster activo, anhídrido de ácido mixto, haluro de ácido, o similares, haciéndolo reaccionar con el compuesto (15), y desprotegiendo el grupo protector para el grupo carboxi del compuesto (22) obtenido.In addition, the compound (23) can be produced by derivatizing the compound (21) to give an active ester, mixed acid anhydride, acid halide, or the like, reacting it with the compound (15), and deprotecting the protecting group for the group carboxy of the compound (22) obtained.
El compuesto (2a) puede producirse derivatizando el compuesto (23) para dar un éster activo, anhídrido de ácido mixto, haluro de ácido, o similares y haciéndolo reaccionar con el compuesto (4) en presencia de una base. Para la reacción, también pueden usarse reactivos y condiciones de reacción que se usan generalmente para la síntesis de péptidos, y las condiciones de reacción, reactivos, base y disolvente inerte usados para la reacción se pueden seleccionar adecuadamente de entre los descritos para la síntesis del compuesto (6).The compound (2a) can be produced by derivatizing the compound (23) to give an active ester, mixed acid anhydride, acid halide, or the like and reacting it with the compound (4) in the presence of a base. For the reaction, reagents and reaction conditions that are generally used for peptide synthesis can also be used, and the reaction conditions, reagents, base and inert solvent used for the reaction can be suitably selected from those described for the synthesis of the compound (6).
7. Procedimiento de producción 77. Production procedure 7
En lo sucesivo en el presente documento, se describe con detalle el procedimiento para producir el compuesto (10c) que tiene n1 = 1, La = O y Lb = CR2(-R3) en el intermedio de producción (10) descrito en el procedimiento de producción 4. El compuesto representado por la fórmula (10c), una sal o un solvato del mismo puede producirse de acuerdo con el siguiente procedimiento, por ejemplo.Hereinafter, the process for producing the compound (10c) having n1 = 1, La = O and Lb = CR2 (-R3) in the production intermediate (10) described in the process is described in detail Production 4. The compound represented by the formula (10c), a salt or a solvate thereof can be produced according to the following procedure, for example.
[Fórmula 63][Formula 63]
En la fórmula, LP, R2, y R3 son como se han definido anteriormente, L representa un grupo acetilo, un átomo deIn the formula, LP, R2, and R3 are as defined above, L represents an acetyl group, an atom of
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hidrógeno, o similares, X e Y representan, cada uno, un oligopéptido que consiste en 1 a 3 aminoácidos, P5 y P7 representan, cada uno, un grupo protector para un grupo amino, y P6 representa un grupo protector para un grupo carboxi.hydrogen, or the like, X and Y each represent an oligopeptide consisting of 1 to 3 amino acids, P5 and P7 each represent a protective group for an amino group, and P6 represents a protective group for a carboxy group.
Un compuesto representado por la fórmula (24) puede producirse usando o aplicando el procedimiento descrito en la patente japonesa abierta a inspección pública n.° 2002-60351 o la literatura (J. Org. Chem., Vol. 51, página 3196, 1986) y, si es necesario, retirando los grupos protectores o modificando los grupos funcionales. Como alternativa, este también puede obtenerse tratando un aminoácido con un grupo amino terminal protegido o amida de ácido de oligopéptido con un grupo amino protegido con aldehido o cetona.A compound represented by the formula (24) can be produced using or applying the procedure described in Japanese patent open for public inspection No. 2002-60351 or literature (J. Org. Chem., Vol. 51, page 3196, 1986 ) and, if necessary, removing the protective groups or modifying the functional groups. Alternatively, this can also be obtained by treating an amino acid with a protected amino terminal group or oligopeptide acid amide with an amino group protected with aldehyde or ketone.
Haciendo reaccionar el compuesto (24) con el compuesto (25) que tiene un grupo hidroxilo a una temperatura que varía desde con enfriamiento a temperatura ambiente en un disolvente inerte en presencia de un ácido o una base, puede producirse el compuesto (26). Los ejemplos del ácido que puede usarse incluyen ácido inorgánico tal como ácido fluorhídrico, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y ácido bórico; un ácido orgánico tal como ácido acético, ácido cítrico, ácido paratolueno sulfónico y ácido metano sulfónico; y un ácido de Lewis tal como tetrafluoroborato, cloruro de cinc, cloruro de estaño, cloruro de aluminio y cloruro de hierro. El ácido paratolueno sulfónico es particularmente preferible. Con respecto a la base que se va a usar, puede seleccionarse y usarse adecuadamente una cualquiera de las bases anteriormente mencionadas. Los ejemplos preferidos de las mismas incluyen un alcóxido de metal alcalino tal como terc-butóxido potásico, un hidróxido de metal alcalino tal como hidróxido sódico e hidróxido potásico; hidruro de metal alcalino tal como hidruro sódico e hidruro potásico; base organometálica representada por dialquilamino litio tal como diisopropilamida de litio; y base organometálica de bis- sililamina tal como bis(trimetilsilil)amida de litio. Los ejemplos del disolvente que se va a usar para la reacción incluyen un disolvente de éter tal como tetrahidrofurano y 1,4-dioxano; y un disolvente de hidrocarburo aromático tal como benceno y tolueno. Esos disolventes pueden prepararse como una mezcla con agua. Además, el grupo protector para un grupo amino como se ilustra mediante P5 no ésta particularmente limitado si este es un grupo usado habitualmente para la protección de un grupo amino. Los ejemplos representativos incluyen los grupos protectores para un grupo amino que se describen en el procedimiento de producción 4. Sin embargo, en la presente reacción, el grupo protector para un grupo amino como se ilustra mediante P5 puede retirarse por escisión. En tal caso, es necesario realizar una reacción con un reactivo adecuado para proteger un grupo amino según pueda requerirse.By reacting the compound (24) with the compound (25) having a hydroxyl group at a temperature that varies from cooling to room temperature in an inert solvent in the presence of an acid or a base, the compound (26) can be produced. Examples of the acid that can be used include inorganic acid such as hydrofluoric acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid and boric acid; an organic acid such as acetic acid, citric acid, paratoluene sulfonic acid and methane sulfonic acid; and a Lewis acid such as tetrafluoroborate, zinc chloride, tin chloride, aluminum chloride and iron chloride. Paratoluene sulfonic acid is particularly preferable. With respect to the base to be used, any of the aforementioned bases can be properly selected and used. Preferred examples thereof include an alkali metal alkoxide such as potassium tert-butoxide, an alkali metal hydroxide such as sodium hydroxide and potassium hydroxide; alkali metal hydride such as sodium hydride and potassium hydride; organometallic base represented by lithium dialkylamino such as lithium diisopropylamide; and organometallic base of bis-silylamine such as lithium bis (trimethylsilyl) amide. Examples of the solvent to be used for the reaction include an ether solvent such as tetrahydrofuran and 1,4-dioxane; and an aromatic hydrocarbon solvent such as benzene and toluene. Those solvents can be prepared as a mixture with water. In addition, the protecting group for an amino group as illustrated by P5 is not particularly limited if this is a group commonly used for the protection of an amino group. Representative examples include the protecting groups for an amino group that are described in the production process 4. However, in the present reaction, the protecting group for an amino group as illustrated by P5 can be removed by cleavage. In such a case, it is necessary to carry out a reaction with a suitable reagent to protect an amino group as may be required.
El compuesto (27) puede producirse retirando el grupo protector P6 del compuesto (26). En el presente documento, aunque los ejemplos representativos del grupo protector para un grupo carboxi como se ilustra mediante P6 se describen en el procedimiento de producción 4, es deseable en este caso que el grupo protector P5 para un grupo amino y el grupo protector P6 para un grupo carboxi sean los grupos protectores que pueden retirarse mediante un procedimiento diferente o condiciones diferentes. Por ejemplo, un ejemplo representativo incluye una combinación en la que P5 es un grupo 9-fluorenilmetiloxi carbonilo y P6 es un grupo bencilo. Los grupos protectores pueden seleccionarse dependiendo de, por ejemplo, las propiedades de un compuesto que tiene un grupo amino y un grupo carboxi que se va a proteger. Para la retirada de los grupos protectores, los reactivos y condiciones se seleccionan dependiendo del grupo protector.The compound (27) can be produced by removing the protective group P6 from the compound (26). Here, although representative examples of the protecting group for a carboxy group as illustrated by P6 are described in the production process 4, it is desirable in this case that the protective group P5 for an amino group and the protective group P6 for a carboxy group are the protecting groups that can be removed by a different procedure or different conditions. For example, a representative example includes a combination in which P5 is a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group and P6 is a benzyl group. The protecting groups can be selected depending on, for example, the properties of a compound having an amino group and a carboxy group to be protected. For the removal of the protective groups, the reagents and conditions are selected depending on the protective group.
El compuesto (29) puede producirse derivatizando el ácido carboxílico (27) para dar un éster activo, anhídrido de ácido mixto, haluro de ácido, o similares y haciéndolo reaccionar con el compuesto (4) y una sal farmacológicamente aceptable del mismo para producir el compuesto (28) seguido de retirar el grupo protector P5 del compuesto (28) obtenido. Para la reacción entre el compuesto (4) y el ácido carboxílico (27) y la reacción para retirar el grupo protector P6, pueden usarse los mismos reactivos y condiciones de reacción que los descritos para el procedimiento de producción 4.The compound (29) can be produced by derivatizing the carboxylic acid (27) to give an active ester, mixed acid anhydride, acid halide, or the like and reacting it with the compound (4) and a pharmacologically acceptable salt thereof to produce the compound (28) followed by removing the protective group P5 of the compound (28) obtained. For the reaction between the compound (4) and the carboxylic acid (27) and the reaction to remove the protecting group P6, the same reagents and reaction conditions as described for the production process 4 can be used.
El compuesto (10c) puede producirse haciendo reaccionar el compuesto (29) con un aminoácido con grupo amino terminal protegido o el oligopéptido (30) con un grupo amino protegido para producir el compuesto (9c) y retirando el grupo protector P7 del compuesto (9c) obtenido. El grupo protector para un grupo amino como se ilustra mediante P7 no ésta particularmente limitado si este se usa generalmente para la protección de un grupo amino. Los ejemplos representativos del mismo incluyen los grupos protectores para un grupo amino que se describen en el procedimiento de producción 4. Para retirar el grupo protector, los reactivos y condiciones se seleccionan dependiendo del grupo protector. Para la reacción entre el compuesto (29) y el compuesto (30), pueden emplearse reactivos y condiciones de reacción que se usan habitualmente para la síntesis de péptidos. El compuesto (10c) producido mediante el procedimiento anteriormente mencionado puede derivatizarse para dar el compuesto (1) de la presente invención de acuerdo con el procedimiento anteriormente descrito.The compound (10c) can be produced by reacting the compound (29) with an amino acid with a protected terminal amino group or the oligopeptide (30) with a protected amino group to produce the compound (9c) and removing the protective group P7 from the compound (9c ) obtained. The protecting group for an amino group as illustrated by P7 is not particularly limited if it is generally used for the protection of an amino group. Representative examples thereof include the protecting groups for an amino group described in the production process 4. To remove the protecting group, the reagents and conditions are selected depending on the protecting group. For the reaction between the compound (29) and the compound (30), reagents and reaction conditions that are commonly used for peptide synthesis can be used. The compound (10c) produced by the aforementioned process can be derivatized to give the compound (1) of the present invention according to the procedure described above.
8. Procedimiento de producción 88. Production procedure 8
En lo sucesivo en el presente documento, se describe con detalle el procedimiento para producir el compuesto (2c) que tiene n1 = 1, La = O y Lb = CR2(-R3) en el intermedio de producción (2) descrito en el procedimiento de producción 4. El compuesto representado por la fórmula (2c), una sal o un solvato del mismo puede producirse de acuerdo con el siguiente procedimiento, por ejemplo.Hereinafter, the procedure for producing the compound (2c) having n1 = 1, La = O and Lb = CR2 (-R3) in the production intermediate (2) described in the process is described in detail Production 4. The compound represented by the formula (2c), a salt or a solvate thereof can be produced according to the following procedure, for example.
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Reacción de desprotecciónCheck out reaction
Pa-Z-OP9Pa-Z-OP9
(31)(31)
H-Z-OP9H-Z-OP9
(32)(32)
L1,-L2-OHL1, -L2-OH
(11)(eleven)
Reacción de desprotecciónCheck out reaction
L^-L^Z-OP9 ----------------------L^-^-Z-OHL ^ -L ^ Z-OP9 ---------------------- L ^ - ^ - Z-OH
(33) (34)(33) (34)
H-X-NH-CHj-0-CR2(-R3)-C(=0)-(IMH-DX)H-X-NH-CHj-0-CR2 (-R3) -C (= 0) - (IMH-DX)
(29)(29)
► L1,-L2-Lf,-NH-CH2-0-CR2(-R3)-C{=0)-(NH-DX) (2c)► L1, -L2-Lf, -NH-CH2-0-CR2 (-R3) -C {= 0) - (NH-DX) (2c)
En la fórmula, L1', L2, LP, R2, y R3 son como se han definido anteriormente, Z representa un oligopéptido que consiste en 1 a 3 aminoácidos, P8 representa un grupo protector para un grupo amino, y P9 representa un grupo protector para un grupo carboxi.In the formula, L1 ', L2, LP, R2, and R3 are as defined above, Z represents an oligopeptide consisting of 1 to 3 amino acids, P8 represents a protective group for an amino group, and P9 represents a protective group for a carboxy group.
El compuesto (33) puede producirse retirando el grupo protector P8 del aminoácido u oligopéptido (31) con grupo amino terminal protegido y grupo carboxi para producir el compuesto (32) y haciendo reaccionar la forma de amina obtenida (32) con el compuesto (11). El grupo protector para un grupo amino como se ilustra mediante P8 no ésta particularmente limitado si este es un grupo usado habitualmente para la protección de un grupo amino. Los ejemplos representativos incluyen los grupos protectores para un grupo amino que se describen en el procedimiento de producción 4. Además, para retirar el grupo protector P8, los reactivos y condiciones pueden seleccionarse dependiendo del grupo protector. Para la reacción entre el compuesto (32) y el ácido carboxílico (11), pueden usarse los mismos reactivos y condiciones de reacción que los descritos para el procedimiento de producción 4.The compound (33) can be produced by removing the protective group P8 from the amino acid or oligopeptide (31) with protected amino terminal group and carboxy group to produce the compound (32) and reacting the obtained amine form (32) with the compound (11 ). The protecting group for an amino group as illustrated by P8 is not particularly limited if this is a group commonly used for the protection of an amino group. Representative examples include the protecting groups for an amino group that are described in the production process 4. In addition, to remove the protecting group P8, the reagents and conditions can be selected depending on the protecting group. For the reaction between the compound (32) and the carboxylic acid (11), the same reagents and reaction conditions as described for the production process 4 can be used.
El intermedio de producción (2c) puede producirse retirando el grupo protector P9 del compuesto (33) para producir el compuesto (34) y haciendo reaccionar el ácido carboxílico (34) obtenido con el compuesto (29). Los ejemplos representativos del grupo protector para un grupo carboxi como se ilustra mediante P9 se describen en el procedimiento de producción 4. Para la reacción de desprotección del mismo, pueden usarse los mismos reactivos y condiciones de reacción que los descritos para el procedimiento de producción 4. Para la reacción entre el compuesto (29) y el ácido carboxílico (34), también pueden usarse reactivos y condiciones de reacción que se usan generalmente para la síntesis de péptidos. El compuesto (2c) producido mediante el procedimiento anteriormente mencionado puede derivatizarse para dar el compuesto (1) de la presente invención de acuerdo con el procedimiento anteriormente descrito.The production intermediate (2c) can be produced by removing the protecting group P9 from the compound (33) to produce the compound (34) and reacting the carboxylic acid (34) obtained with the compound (29). Representative examples of the protecting group for a carboxy group as illustrated by P9 are described in the production process 4. For the deprotection reaction thereof, the same reagents and reaction conditions as described for the production process 4 can be used. For the reaction between the compound (29) and the carboxylic acid (34), reagents and reaction conditions that are generally used for peptide synthesis can also be used. The compound (2c) produced by the aforementioned process can be derivatized to give the compound (1) of the present invention according to the procedure described above.
9. Procedimiento de producción 99. Production procedure 9
En lo sucesivo en el presente documento, se describe con detalle el procedimiento para producir el compuesto (17c) que tiene n1 = 1, La = O y Lb = CR2(-R3) en el intermedio de producción (17) descrito en el procedimiento de producción 4. El compuesto representado por la fórmula (17c), una sal o un solvato del mismo también puede producirse de acuerdo con el siguiente procedimiento, por ejemplo.Hereinafter, the procedure for producing the compound (17c) having n1 = 1, La = O and Lb = CR2 (-R3) in the production intermediate (17) described in the process is described in detail Production 4. The compound represented by the formula (17c), a salt or a solvate thereof can also be produced according to the following procedure, for example.
[Fórmula 65][Formula 65]
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En la fórmula, L1', L2, LP, R2, R3, X, Y, P5, P6 y P7 son como se han definido anteriormente.In the formula, L1 ', L2, LP, R2, R3, X, Y, P5, P6 and P7 are as defined above.
El compuesto (36) puede producirse desprotegiendo el grupo protector P5 para el grupo amino del compuesto (26) con grupo amino terminal protegido y grupo carboxi para producir el compuesto (35) y haciendo reaccionar la forma de amina obtenida (35) con el oligopéptido (30) con grupo amino terminal protegido o grupo amino protegido. El grupo protector para un grupo amino como se ilustra mediante P5 no ésta particularmente limitado si este es un grupo usado habitualmente para la protección de un grupo amino. Los ejemplos representativos incluyen los grupos protectores para un grupo amino que se describen en el procedimiento de producción 4. Además, para retirar el grupo protector P5, los reactivos y condiciones pueden seleccionarse dependiendo del grupo protector. En el presente documento, aunque los ejemplos representativos del grupo protector para un grupo carboxi como se ilustra mediante P6 y el grupo protector para un grupo amino como se ilustra mediante P7 incluyen los grupos protectores para un grupo carboxi y un grupo amino que se describen en el procedimiento de producción 4, es deseable que el grupo protector P6 para un grupo carboxi y el grupo protector P7 para un grupo amino sean los grupos protectores que pueden retirarse mediante el mismo procedimiento o las mismas condiciones. Por ejemplo, un ejemplo representativo incluye una combinación en la que P6 es un grupo éster bencílico y P7 es un grupo benciloxi carbonilo.The compound (36) can be produced by deprotecting the protective group P5 for the amino group of the compound (26) with protected amino terminal group and carboxy group to produce the compound (35) and reacting the obtained amine form (35) with the oligopeptide (30) with protected amino terminal group or protected amino group. The protecting group for an amino group as illustrated by P5 is not particularly limited if this is a group commonly used for the protection of an amino group. Representative examples include the protecting groups for an amino group that are described in the production process 4. In addition, to remove the protective group P5, the reagents and conditions can be selected depending on the protecting group. Here, although representative examples of the protecting group for a carboxy group as illustrated by P6 and the protecting group for an amino group as illustrated by P7 include the protecting groups for a carboxy group and an amino group described in the production process 4, it is desirable that the protecting group P6 for a carboxy group and the protecting group P7 for an amino group are the protecting groups that can be removed by the same procedure or the same conditions. For example, a representative example includes a combination in which P6 is a benzyl ester group and P7 is a benzyloxycarbonyl group.
El compuesto (37) puede producirse retirando el grupo protector P6 para el grupo carboxi del compuesto (36) y el grupo protector P7 para el grupo amino del compuesto (36). El compuesto (37) también puede producirse retirando secuencialmente el grupo protector P6 para el grupo carboxi y el grupo protector P7 para el grupo amino, o el compuesto (37) puede producirse retirando al mismo tiempo ambos de los grupos protectores P6y P7 que pueden retirarse mediante el mismo procedimiento o las mismas condiciones.The compound (37) can be produced by removing the protective group P6 for the carboxy group of the compound (36) and the protective group P7 for the amino group of the compound (36). The compound (37) can also be produced by sequentially removing the protective group P6 for the carboxy group and the protective group P7 for the amino group, or the compound (37) can be produced by simultaneously removing both of the protective groups P6 and P7 that can be removed by the same procedure or the same conditions.
El compuesto (17c) puede producirse haciendo reaccionar el compuesto obtenido (37) con el compuesto (11). Para la reacción entre el compuesto (37) y el compuesto (11), pueden usarse los mismos reactivos y condiciones de reacción que los descritos para el procedimiento de producción 4.The compound (17c) can be produced by reacting the compound obtained (37) with the compound (11). For the reaction between the compound (37) and the compound (11), the same reagents and reaction conditions as described for the production process 4 can be used.
En lo anterior, el compuesto representado por la siguiente fórmula:In the foregoing, the compound represented by the following formula:
[Fórmula 66][Formula 66]
se describe como un intermedio de producción útil para producir el conjugado de anticuerpo - fármaco de la presente invención. Además, un grupo de compuestos representada por la siguiente fórmula:It is described as a production intermediate useful for producing the antibody-drug conjugate of the present invention. In addition, a group of compounds represented by the following formula:
Q-(CH2)nQ-C(=O)-L2a-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX)Q- (CH2) nQ-C (= O) -L2a-LP-NH- (CH2) n1-La-Lb-Lc- (NH-DX)
también son compuestos que sirven como intermedios de producción útiles para producir el conjugado de anticuerpo - fármaco de la presente invención.they are also compounds that serve as useful production intermediates to produce the antibody-drug conjugate of the present invention.
Específicamente, en la fórmula anterior, Q es (maleimid-N-il)-, nQ es un número entero de 2 a 5,Specifically, in the above formula, Q is (maleimid-N-il) -, nQ is an integer from 2 to 5,
L2a representa -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)- o un enlace sencillo,L2a represents -NH- (CH2-CH2-O) n5-CH2-CH2-C (= O) - or a single bond,
en el que n5 representa un número entero de 2 a 4, LP representa un residuo de tetrapéptido de GGFG, n1 representa un número entero de 0 a 6,in which n5 represents an integer from 2 to 4, LP represents a GGFG tetrapeptide residue, n1 represents an integer from 0 to 6,
La representa -O- o un enlace sencillo,It represents -O- or a simple link,
Lb representa -CR2(-R3)- o un enlace sencillo,Lb represents -CR2 (-R3) - or a single link,
en el que R2 y R3 representan, independientemente cada uno, un átomo de hidrógeno,wherein R2 and R3 each independently represent a hydrogen atom,
Lc representa -C(=O)-,Lc represents -C (= O) -,
(maleimid-N-il)- es un grupo que tiene una estructura representada por la siguiente fórmula:(maleimid-N-il) - is a group that has a structure represented by the following formula:
[Fórmula 67][Formula 67]
(en la fórmula, el átomo de nitrógeno es la posición de conexión), y -(NH-DX) es un grupo que tiene una estructura representada por la siguiente fórmula:(in the formula, the nitrogen atom is the connection position), and - (NH-DX) is a group that has a structure represented by the following formula:
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(en la fórmula, el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 es la posición de conexión).(In the formula, the nitrogen atom of the amino group at position 1 is the connection position).
Además, con respecto al -NH-(CH2)n1-La-Lb-, un compuesto de -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH- CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2- o -NH-CH2CH2-O-CH2- se prefiere como un intermedio de producción. Un compuesto de NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2- o -NH-(CH2)2-O-CH2-C(=O)- es más preferido.In addition, with respect to -NH- (CH2) n1-La-Lb-, a compound of -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH- CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2- O-CH2- or -NH-CH2CH2-O-CH2- is preferred as a production intermediate. A compound of NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2- or -NH- (CH2) 2-O-CH2-C (= O) - is more preferred.
Un compuesto en el que L2a es un enlace sencillo o n5 es un número entero de 2 a 4 se prefiere como un intermedio de producción.A compound in which L2a is a single bond or n5 is an integer from 2 to 4 is preferred as a production intermediate.
Q 2a 1 a bQ 2a 1 a b
Un compuesto en el que n es un número entero de 2 a 5, L es un enlace sencillo y -NH-(CH2)n -L -L - es -NH- CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-,-NH-CH2-O-CH2- o -NH-CH2CH2-O- CH2- se prefiere como un intermedio de producción. Un compuesto en el que -NH-(CH2)n1-La-Lb- es -NH-CH2CH2-, - NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2- o -NH-CH2CH2-O-CH2- es más preferido. Un compuesto en el que nQ es un número entero de 2 o 5 se prefiere adicionalmente.A compound in which n is an integer from 2 to 5, L is a single bond and -NH- (CH2) n -L -L - is -NH- CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2 -, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2 -, - NH-CH2-O-CH2- or -NH-CH2CH2-O-CH2- is preferred as a production intermediate. A compound in which -NH- (CH2) n1-La-Lb- is -NH-CH2CH2-, - NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2- or -NH-CH2CH2-O-CH2- is more preferred A compound in which nQ is an integer of 2 or 5 is further preferred.
Además, un compuesto en el que nQ es un número entero de 2 a 5, L2a es -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)-, n5 es un número entero de 2 a 4, y -NH-(CH2)n1-La-Lb- es -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH- CH2CH2CH2CH2CH2-,-NH-CH2-O-CH2- o -NH-CH2CH2-O-CH2- se prefiere como un intermedio de producción. Un compuesto en el que n5 es un número entero de 2 o 4 es más preferido. Un compuesto en el que -NH-(CH2)n1-La-Lb- es -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2- o -NH-CH2CH2-O-CH2- se prefiere adicionalmente.In addition, a compound in which nQ is an integer from 2 to 5, L2a is -NH- (CH2-CH2-O) n5-CH2-CH2-C (= O) -, n5 is an integer from 2 to 4, and -NH- (CH2) n1-La-Lb- is -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH- CH2CH2CH2CH2CH2 -, - NH-CH2-O-CH2- or -NH-CH2CH2-O-CH2- is preferred as a production intermediate. A compound in which n5 is an integer of 2 or 4 is more preferred. A compound in which -NH- (CH2) n1-La-Lb- is -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2- or -NH-CH2CH2-O-CH2- is further preferred.
De manera más específica, los siguientes son compuestos preferidos como intermedios de producción.More specifically, the following are preferred compounds as production intermediates.
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2-(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2 - (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-il) -CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-(maleimid-N-il) -CH2CH2-C (= O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (= O) -GGFG-NH-
CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)CH2CH2CH2-C (= O) - (NH-DX)
Mientras tanto, el conjugado de anticuerpo - fármaco de la presente invención, cuando el mismo se deja al aire o se recristaliza, puede absorber humedad para tener agua de adsorción o convertirse en un hidrato, y también se incluyen en la presente invención tal compuesto y una sal que contiene agua.Meanwhile, the antibody-drug conjugate of the present invention, when it is left in the air or recrystallized, can absorb moisture to have adsorption water or become a hydrate, and such a compound is also included in the present invention. A salt that contains water.
Un compuesto etiquetado con diversos isótopos radiactivos o no radiactivos también se incluye en la presente invención. Uno o más átomos que constituyen el conjugado de anticuerpo - fármaco de la presente invención pueden contener un isótopo atómico en una relación no natural. Los ejemplos del isótopo atómico incluyen deuterio (2H), tritio (3H), yodo-125 (125I) y carbono-14 (14C). Además, el compuesto de la presente invención se puede etiquetar radiactivamente con un isótopo radiactivo tal como tritio (3H), yodo-125 (125I), carbono-14 (14C), cobre-64 (64Cu), zirconio-89 (89Zr), yodo-124 (124I), flúor-18 (18F), indio-111 (111I), carbono-11 (11C) y yodo-131 (131I). El compuesto etiquetado con un isótopo radiactivo es útil como un agente terapéutico o profiláctico, un reactivo para investigación tal como un reactivo de ensayo y un agente para diagnóstico tal como un agente de obtención de imágenes de diagnóstico in vivo. Sin relación con la radiactividad, cualquier tipo de variante de isótopo del conjugado de anticuerpo - fármaco de la presente invención está dentro del ámbito de la presente invención.A compound labeled with various radioactive or non-radioactive isotopes is also included in the present invention. One or more atoms constituting the antibody-drug conjugate of the present invention may contain an atomic isotope in an unnatural relationship. Examples of the atomic isotope include deuterium (2H), tritium (3H), iodine-125 (125I) and carbon-14 (14C). In addition, the compound of the present invention can be radiolabelled with a radioactive isotope such as tritium (3H), iodine-125 (125I), carbon-14 (14C), copper-64 (64Cu), zirconium-89 (89Zr) , iodine-124 (124I), fluorine-18 (18F), indium-111 (111I), carbon-11 (11C) and iodine-131 (131I). The compound labeled with a radioactive isotope is useful as a therapeutic or prophylactic agent, a research reagent such as a test reagent and a diagnostic agent such as a diagnostic imaging agent in vivo. Without regard to radioactivity, any type of isotope variant of the antibody-drug conjugate of the present invention is within the scope of the present invention.
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[Fármacos][Drugs]
El conjugado de anticuerpo - fármaco de la presente invención muestra una actividad citotóxica contra células cancerosas y, por lo tanto, este puede usarse como un fármaco, particularmente como un agente terapéutico y/o agente profiláctico para el cáncer.The antibody-drug conjugate of the present invention shows a cytotoxic activity against cancer cells and, therefore, it can be used as a drug, particularly as a therapeutic agent and / or prophylactic agent for cancer.
Los ejemplos del tipo de cáncer al que se aplica el conjugado de anticuerpo - fármaco de la presente invención incluyen cáncer de pulmón, cáncer de riñón, cáncer urotelial, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, glioblastoma multiforme, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de mama, melanoma, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de estómago o cáncer de esófago, sin embargo, este no se limita a los mismos siempre que sea una célula cancerosa que expresa, en una célula cancerosa como un sujeto de tratamiento, una proteína que puede ser reconocida por el anticuerpo dentro del conjugado de anticuerpo - fármaco.Examples of the type of cancer to which the antibody-drug conjugate of the present invention is applied include lung cancer, kidney cancer, urothelial cancer, colorectal cancer, prostate cancer, glioblastoma multiforme, ovarian cancer, pancreatic cancer, breast cancer, melanoma, liver cancer, bladder cancer, stomach cancer or esophageal cancer, however, this is not limited to them as long as it is a cancer cell that expresses, in a cancer cell as a treatment subject , a protein that can be recognized by the antibody within the antibody-drug conjugate.
El conjugado de anticuerpo - fármaco de la presente invención puede administrarse preferentemente a un mamífero, pero este se administra más preferentemente a un ser humano.The antibody-drug conjugate of the present invention may preferably be administered to a mammal, but this is more preferably administered to a human being.
Las sustancias usadas en una composición farmacéutica que contiene conjugado de anticuerpo - fármaco de la presente invención pueden seleccionarse y aplicarse adecuadamente a partir de aditivos de formulación o similares que se usan generalmente en la técnica, a la vista de la dosificación o concentración de administración.The substances used in a pharmaceutical composition containing antibody-drug conjugate of the present invention can be suitably selected and applied from formulation additives or the like that are generally used in the art, in view of the dosage or concentration of administration.
El conjugado de anticuerpo - fármaco de la presente invención puede administrarse como una composición farmacéutica que contiene al menos un ingrediente farmacéuticamente adecuado.The antibody-drug conjugate of the present invention can be administered as a pharmaceutical composition containing at least one pharmaceutically suitable ingredient.
Por ejemplo, la composición farmacéutica anterior típicamente contiene al menos un vehículo farmacéutico (por ejemplo, líquido esterilizado), por ejemplo, agua y aceite (crudo de petróleo y aceite de origen animal, origen vegetal u origen sintético (el aceite puede ser, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo o similares)). El agua es un vehículo más típico cuando la composición farmacéutica anterior se administra por vía intravenosa. También pueden usarse solución salina, una solución acuosa de dextrosa y una solución acuosa de glicerol como un vehículo líquido, en particular, para una solución en inyección. Se conoce en la técnica un vehículo farmacéutico adecuado. Si se desea, la composición anterior también puede contener una cantidad traza de un agente humectante, un agente emulsionante o un agente de tamponamiento de pH. Se describen algunos ejemplos de vehículo farmacéutico adecuado en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin. Las formulaciones se corresponden con un modo de administración.For example, the above pharmaceutical composition typically contains at least one pharmaceutical vehicle (eg, sterilized liquid), for example, water and oil (crude oil and oil of animal origin, plant origin or synthetic origin (the oil can be, by example, peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil or the like)). Water is a more typical vehicle when the above pharmaceutical composition is administered intravenously. Saline solution, an aqueous dextrose solution and an aqueous glycerol solution can also be used as a liquid vehicle, in particular, for an injection solution. A suitable pharmaceutical vehicle is known in the art. If desired, the above composition may also contain a trace amount of a wetting agent, an emulsifying agent or a pH buffering agent. Some examples of suitable pharmaceutical vehicle are described in "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin. The formulations correspond to a mode of administration.
Se conocen diversos sistemas de administración, y estos pueden usarse para administrar el conjugado de anticuerpo - fármaco de la presente invención. Los ejemplos de la ruta de administración incluyen las rutas intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea, pero sin limitarse a las mismas. La administración puede realizarse mediante inyección o inyección en bolo, por ejemplo. De acuerdo con una realización preferida específica, la administración del conjugado de anticuerpo - fármaco se realiza mediante inyección. La administración parenteral es una ruta de administración preferida.Various delivery systems are known, and these can be used to administer the antibody-drug conjugate of the present invention. Examples of the route of administration include intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous and subcutaneous routes, but not limited thereto. Administration can be done by injection or bolus injection, for example. According to a specific preferred embodiment, administration of the antibody-drug conjugate is performed by injection. Parenteral administration is a preferred route of administration.
De acuerdo con una realización representativa, la composición farmacéutica se prescribe, como una composición farmacéutica adecuada para la administración intravenosa a un ser humano, de acuerdo con los procedimientos convencionales. La composición para la administración intravenosa es típicamente una solución en una solución tampón acuosa estéril e isotónica. Si fuera necesario, el fármaco puede contener un agente solubilizante y un anestésico local para aliviar el dolor en un sitio de inyección (por ejemplo, lignocaína). Generalmente, el ingrediente anterior se proporciona individualmente como uno cualquiera de polvo liofilizado o un concentrado anhidro contenido en un recipiente que se obtiene mediante sellado en una ampolla o un sobre que tiene una cantidad del agente activo o como una mezcla en una forma de dosificación unitaria. Cuando el fármaco se va a administrar mediante inyección, este puede administrarse a partir de una botella de inyección que contiene agua o solución salina de calidad farmacéutica estéril. Cuando el fármaco se administra mediante inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril o solución salina para su inyección de tal modo que los ingredientes anteriormente mencionados se mezclan entre sí antes de la administración.According to a representative embodiment, the pharmaceutical composition is prescribed, as a pharmaceutical composition suitable for intravenous administration to a human being, in accordance with conventional procedures. The composition for intravenous administration is typically a solution in a sterile and isotonic aqueous buffer solution. If necessary, the drug may contain a solubilizing agent and a local anesthetic to relieve pain at an injection site (for example, lignocaine). Generally, the above ingredient is provided individually as any one of lyophilized powder or an anhydrous concentrate contained in a container that is obtained by sealing in a blister or an envelope having an amount of the active agent or as a mixture in a unit dosage form. . When the drug is to be administered by injection, it can be administered from an injection bottle containing sterile pharmaceutical grade water or saline. When the drug is administered by injection, a blister of sterile water or saline may be provided for injection such that the aforementioned ingredients are mixed together before administration.
La composición farmacéutica de la presente invención puede ser una composición farmacéutica que contiene solo el conjugado de anticuerpo - fármaco de la presente invención o una composición farmacéutica que contiene elThe pharmaceutical composition of the present invention may be a pharmaceutical composition containing only the antibody-drug conjugate of the present invention or a pharmaceutical composition containing the
conjugado de anticuerpo - fármaco y al menos un agente para tratar el cáncer que no sea el conjugado. Elantibody-drug conjugate and at least one agent to treat cancer other than the conjugate. He
conjugado de anticuerpo - fármaco de la presente invención puede administrarse con otro agente para tratar elantibody-drug conjugate of the present invention can be administered with another agent to treat the
cáncer. El efecto anti-cancerígeno puede potenciarse en consecuencia. Otro agente anti-cancerígeno usado para tal fin puede administrarse a un individuo de forma simultánea con, por separado de o subsiguientemente al conjugado de anticuerpo - fármaco, y este puede administrarse al tiempo que se varía el intervalo de administración para cada uno. Los ejemplos del agente para tratar el cáncer incluyen abraxano, carboplatino, cisplatino, gemcitabina, irinotecán (CPT-11), paclitaxel, pemetrexed, sorafenib, vinorelbina, fármacos descritos en la publicación internacional n.° WO 2003/038043, análogos de LH-RH (leuprorelina, goserelina, o similares), fosfato de estramustina, antagonista de estrógenos (tamoxifeno, raloxifeno, o similares), y un inhibidor de la aromatasa (anastrozol, letrozol, exemestano, o similares), pero este no está limitado siempre que el mismo sea un fármaco que tiene una actividad antitumoral.Cancer. The anti-cancer effect can be enhanced accordingly. Another anti-carcinogenic agent used for this purpose can be administered to an individual simultaneously with, separately from or subsequently to the antibody-drug conjugate, and this can be administered while varying the range of administration for each. Examples of the agent for treating cancer include abraxane, carboplatin, cisplatin, gemcitabine, irinotecan (CPT-11), paclitaxel, pemetrexed, sorafenib, vinorelbine, drugs described in International Publication No. WO 2003/038043, analogs of LH- RH (leuprorelin, goserelin, or the like), estramustine phosphate, estrogen antagonist (tamoxifen, raloxifene, or the like), and an aromatase inhibitor (anastrozole, letrozole, exemestane, or the like), but this is not limited as long as It is a drug that has an antitumor activity.
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La composición farmacéutica puede formularse en una formulación de liofilización o una formulación líquida como una formulación que tiene una composición deseada y una pureza requerida. Cuando se formula como una formulación de liofilización, esta puede ser una formulación que contiene aditivos de formulación adecuados que se usan en la técnica. También para una formulación líquida, esta puede formularse como una formulación líquida que contiene diversos aditivos de formulación que se usan en la técnica.The pharmaceutical composition may be formulated in a lyophilization formulation or a liquid formulation as a formulation having a desired composition and a required purity. When formulated as a lyophilization formulation, this may be a formulation containing suitable formulation additives that are used in the art. Also for a liquid formulation, it can be formulated as a liquid formulation containing various formulation additives that are used in the art.
La composición y la concentración de la composición farmacéutica pueden variar dependiendo del procedimiento de administración. Sin embargo, el conjugado de anticuerpo - fármaco contenido en la composición farmacéutica de la presente invención puede mostrar el efecto farmacéutico incluso a una dosificación pequeña cuando el conjugado de anticuerpo - fármaco tiene una afinidad más alta por un antígeno, es decir, una afinidad más alta (= valor de Kd más bajo) en términos de la constante de disociación (es decir, valor de Kd) para el antígeno. De ese modo, para determinar la dosificación del conjugado de anticuerpo - fármaco, la dosificación puede determinarse a la vista de una situación en relación con la afinidad entre el conjugado de anticuerpo - fármaco y antígeno. Cuando el conjugado de anticuerpo - fármaco de la presente invención se administra a un ser humano, por ejemplo, aproximadamente 0,001 a 100 mg/kg pueden administrarse una vez o administrarse varias veces con un intervalo de una vez durante de 1 a 180 días.The composition and concentration of the pharmaceutical composition may vary depending on the method of administration. However, the antibody-drug conjugate contained in the pharmaceutical composition of the present invention may show the pharmaceutical effect even at a small dosage when the antibody-drug conjugate has a higher affinity for an antigen, that is, a more affinity. high (= lower Kd value) in terms of the dissociation constant (that is, Kd value) for the antigen. Thus, to determine the dosage of the antibody-drug conjugate, the dosage can be determined in view of a situation in relation to the affinity between the antibody-drug and antigen conjugate. When the antibody-drug conjugate of the present invention is administered to a human being, for example, approximately 0.001 to 100 mg / kg can be administered once or administered several times at a time interval of 1 to 180 days.
EjemplosExamples
La presente invención se describe específicamente a la vista de los ejemplos mostrados posteriormente. Sin embargo, la presente invención no se limita a los mismos. Además, esta no se ha de interpretar en modo alguno en un sentido limitado. Además, a menos que específicamente se describa lo contrario, el reactivo, disolvente, y material de partida descritos en la memoria descriptiva pueden obtenerse fácilmente a partir de un proveedor comercial.The present invention is specifically described in view of the examples shown below. However, the present invention is not limited thereto. Moreover, it is not to be interpreted in any way in a limited sense. In addition, unless specifically described otherwise, the reagent, solvent, and starting material described in the specification can be readily obtained from a commercial supplier.
Ejemplo de referencia 1 Anticuerpo M30-H1-L4Reference Example 1 Antibody M30-H1-L4
De anticuerpos humanizados de un anticuerpo anti-B7-H3, un anticuerpo compuesto por una cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 20 a 471 en la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones de aminoácido 21 a 233 en la SEQ ID NO: 16 se produjo de acuerdo con un procedimiento conocido en la técnica para producir anticuerpo anti-B7-H3 humanizado designado como un anticuerpo M30-H1-L4 (o al que se hace referencia simplemente como "M30-H1-L4").Of humanized antibodies of an anti-B7-H3 antibody, an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 471 in SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of a Amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 233 in SEQ ID NO: 16 was produced according to a method known in the art to produce humanized anti-B7-H3 antibody designated as an M30-H1-L4 antibody (or referred to simply as "M30-H1-L4").
Ejemplo de referencia 2 Anticuerpo M30-H1-L4PReference Example 2 Antibody M30-H1-L4P
La modificación de un glicano unido al anticuerpo M30-H1-L4 obtenido anteriormente se reguló mediante desfucosilación de acuerdo con un procedimiento conocido en la técnica para producir anticuerpo con la modificación regulada de un glicano designado como un anticuerpo M30-H1-L4P (o al que se hace referencia simplemente como "M30-H1-L4P").Modification of a glycan bound to the M30-H1-L4 antibody obtained above was regulated by de-glycosylation according to a method known in the art to produce antibody with the regulated modification of a glycan designated as an M30-H1-L4P antibody (or al which is referred to simply as "M30-H1-L4P").
Ejemplo de referencia 3 Anticuerpo anti-CD30Reference Example 3 Anti-CD30 Antibody
Un anticuerpo anti-CD30 se produjo con referencia a la publicación nacional de la solicitud de patente internacional n.° 2005-506035. Su secuencia se muestra en las SEQ iD NO: 27 y 28.An anti-CD30 antibody was produced with reference to the national publication of international patent application No. 2005-506035. Its sequence is shown in SEQ iD NO: 27 and 28.
Ejemplo de referencia 4 Anticuerpo anti-CD33Reference Example 4 Anti-CD33 Antibody
Un anticuerpo anti-CD33 se produjo con referencia a la patente japonesa abierta a inspección pública n.° 8-48637. Su secuencia se muestra en las sEq ID NO: 29 y 30.An anti-CD33 antibody was produced with reference to the Japanese patent open for public inspection No. 8-48637. Its sequence is shown in sEq ID NO: 29 and 30.
Ejemplo de referencia 5 Anticuerpo anti-CD70Reference Example 5 Anti-CD70 Antibody
Un anticuerpo anti-CD70 se produjo con referencia a la publicación nacional de la solicitud de patente internacional n.° 2008-538292. Su secuencia se muestra en las SEQ iD NO: 31 y 32.An anti-CD70 antibody was produced with reference to the national publication of international patent application No. 2008-538292. Its sequence is shown in SEQ iD NO: 31 and 32.
Ejemplo 1 4-Amino-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]butanamidaExample 1 4-Amino-N - [(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro -1H, 12H- benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] butanamide
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Proceso 1: (4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-Process 1: (4 - {[(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro- 1H, 12H-
benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]aminol-4-oxobutil)carbamato de terc-butilobenzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] aminol-4-oxobutyl) tert-butyl carbamate
Se disolvió ácido 4-(terc-butoxicarbonilamino)butanoico (0,237 g, 1,13 mmol) en diclorometano (10 ml), Se añadieron N-hidroxisuccinimida (0,130 g, 1,13 mmol) y clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0,216 g, 1,13 mmol), y se agitó durante 1 hora. La solución de reacción se añadió gota a gota a una solución de N,N- dimetilformamida (10 ml) cargada con mesilato del compuesto (4) (0,500 g, 0,94 mmol) y trietilamina (0,157 ml, 1,13 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 día. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 8 : 2 (v/v)] para producir el compuesto del título (0,595 g, cuantitativo). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 5: 0,87 (3H, t, J = 7,2 Hz),4- (tert-Butoxycarbonylamino) butanoic acid (0.237 g, 1.13 mmol) was dissolved in dichloromethane (10 ml), N-hydroxysuccinimide (0.135 g, 1.13 mmol) and 1-ethyl-3- hydrochloride were added (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (0.216 g, 1.13 mmol), and stirred for 1 hour. The reaction solution was added dropwise to a solution of N, N-dimethylformamide (10 ml) charged with mesylate of compound (4) (0.500 g, 0.94 mmol) and triethylamine (0.157 ml, 1.13 mmol) and stirred at room temperature for 1 day. The solvent was removed under reduced pressure and the residue obtained was purified by silica gel column chromatography [chloroform-chloroform: methanol = 8: 2 (v / v)] to produce the title compound (0.595 g, quantitative). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 5: 0.87 (3H, t, J = 7.2 Hz),
1,31 (9H, s), 1,58 (1H, t, J = 7,2 Hz), 1,66 (2H, t, J = 7,2 Hz), 1,82-1,89 (2H, m), 2,12-2,21 (3H, m), 2,39 (3H, s), 2,92 (2H, t, J = 6,5 Hz), 3,17 (2H, s), 5,16 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,24 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,59-5,55 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,78 (1H, t, J = 6,3 Hz), 7,30 (1H, s), 7,79 (1H, d, J = 11,0 Hz), 8,40 (1H, d, J = 8,6 Hz).1.31 (9H, s), 1.58 (1H, t, J = 7.2 Hz), 1.66 (2H, t, J = 7.2 Hz), 1.82-1.89 (2H , m), 2.12-2.21 (3H, m), 2.39 (3H, s), 2.92 (2H, t, J = 6.5 Hz), 3.17 (2H, s) , 5.16 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.24 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.42 (2H, s), 5.59-5.55 ( 1H, m), 6.53 (1H, s), 6.78 (1H, t, J = 6.3 Hz), 7.30 (1H, s), 7.79 (1H, d, J = 11 , 0 Hz), 8.40 (1H, d, J = 8.6 Hz).
EM (APCI) m/z: 621 (M+H)+MS (APCI) m / z: 621 (M + H) +
Proceso 2: 4-Amino-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-Process 2: 4-Amino-N - [(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexahydro-1H, 12H-
benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]butanamidabenzo [de] pirano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] butanamide
El compuesto (0,388 g, 0,61 mmol) obtenido en el proceso 1 anterior se disolvió en diclorometano (9 ml). se añadió ácido trifluoroacético (9 ml) y se agitó durante 4 horas. El disolvente se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo - capa orgánica repartida de cloroformo : metanol : agua = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para producir trifluoroacetato del compuesto del título (0,343 g, cuantitativo). Este compuesto se confirmó en el tumor de un ratón portador de cáncer que recibió el conjugado de anticuerpo - fármaco (13) o (14).The compound (0.388 g, 0.61 mmol) obtained in the above process 1 was dissolved in dichloromethane (9 ml). Trifluoroacetic acid (9 ml) was added and stirred for 4 hours. The solvent was removed under reduced pressure and the obtained residues were purified by silica gel column chromatography [chloroform - distributed organic layer of chloroform: methanol: water = 7: 3: 1 (v / v / v)] to produce trifluoroacetate of the title compound (0.333 g, quantitative). This compound was confirmed in the tumor of a cancer-bearing mouse that received the antibody-drug conjugate (13) or (14).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 5: 0,87 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,79-1,92 (4H, m), 2,10-2,17 (2H, m), 2,27 (2H, t, J = 7,0 Hz), 2,40 (3H, s), 2,80-2,86 (2H, m), 3,15-3,20 (2H, m), 5,15 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,26 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,54-5,61 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,32 (1H, s), 7,72 (3H, s a), 7,82 (1H, d, J = 11,0 Hz), 8,54 (1H, d, J = 8,6 Hz).1H NMR (400 MHz, DMSO-da) 5: 0.87 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.79-1.92 (4H, m), 2.10-2.17 (2H , m), 2.27 (2H, t, J = 7.0 Hz), 2.40 (3H, s), 2.80-2.86 (2H, m), 3.15-3.20 ( 2H, m), 5.15 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.26 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.42 (2H, s), 5.54- 5.61 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.32 (1H, s), 7.72 (3H, sa), 7.82 (1H, d, J = 11.0 Hz ), 8.54 (1H, d, J = 8.6 Hz).
EM (APCI) m/z: 521 (M+H)+MS (APCI) m / z: 521 (M + H) +
Ejemplo 2 Conjugado de anticuerpo - fármaco (1)Example 2 Antibody-drug conjugate (1)
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Proceso 1: N-(terc-butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-Process 1: N- (tert-butoxycarbonyl) glycylglycyl-L-phenylalanyl-N- (4 - {[(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo -
2.3.9.10.13.15- hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3’,4’:6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida2.3.9.10.13.15- hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ’, 4’: 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] amino} -4-oxobutyl) glycinamide
Se disolvió N-(terc-butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanilglicina (0,081 g, 0,19 mmol) en diclorometano (3 ml), se añadieron N-hidroxisuccinimida (0,021 g, 0,19 mmol) y clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0,036 g, 0,19 mmol) y después se agitó durante 3,5 horas. La solución de reacción se añadió gota a gota a una solución de N,N-dimetilformamida (1,5 ml) cargada con el compuesto (0,080 g, 0,15 mmol) del Ejemplo 1, y se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. El disolvente se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 8 : 2 (v/v)] para producir el compuesto del título (0,106 g, 73 %).N- (tert-butoxycarbonyl) glycylglycyl-L-phenylalanylglycine (0.081 g, 0.19 mmol) was dissolved in dichloromethane (3 ml), N-hydroxysuccinimide (0.021 g, 0.19 mmol) and 1-ethyl hydrochloride were added -3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (0.036 g, 0.19 mmol) and then stirred for 3.5 hours. The reaction solution was added dropwise to a solution of N, N-dimethylformamide (1.5 ml) charged with the compound (0.080 g, 0.15 mmol) of Example 1, and stirred at room temperature for 4 hours . The solvent was removed under reduced pressure and the residues obtained were purified by silica gel column chromatography [chloroform-chloroform: methanol = 8: 2 (v / v)] to produce the title compound (0.106 g, 73%) .
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 5: 0,87 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,36 (9H, s), 1,71 (2H, m), 1,86 (2H, t, J = 7,8 Hz), 2,152,19 (4H, m), 2,40 (3H, s), 2,77 (1H, dd, J = 12,7, 8,8 Hz), 3,02 (1H, dd, J = 14,1, 4,7 Hz), 3,08-3,11 (2H, m), 3,163,19 (2H, m), 3,54 (2H, d, J = 5,9 Hz), 3,57-3,77 (4H, m), 4,46-4,48 (1H, m), 5,16 (1H, d, J = 19,2 Hz), 5,25 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,55-5,60 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,00 (1H, t, J = 6,3 Hz), 7,17-7,26 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,71 (1H, t, J = 5,7 Hz), 7,80 (1H, d, J = 11,0 Hz), 7,92 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,15 (1H, d, J = 8,2 Hz), 8,27 (1H, t, J = 5,5 Hz), 8,46 (1H, d, J = 8,2 Hz). EM (APCI) m/z: 939 (M+H)+1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 5: 0.87 (3H, t, J = 7.4 Hz), 1.36 (9H, s), 1.71 (2H, m), 1.86 ( 2H, t, J = 7.8 Hz), 2.152.19 (4H, m), 2.40 (3H, s), 2.77 (1H, dd, J = 12.7, 8.8 Hz), 3.02 (1H, dd, J = 14.1, 4.7 Hz), 3.08-3.11 (2H, m), 3,163.19 (2H, m), 3.54 (2H, d, J = 5.9 Hz), 3.57-3.77 (4H, m), 4.46-4.48 (1H, m), 5.16 (1H, d, J = 19.2 Hz), 5.25 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.42 (2H, s), 5.55-5.60 (1H, m), 6.53 (1H, s), 7.00 (1H, t, J = 6.3 Hz), 7.17-7.26 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.71 (1H, t, J = 5.7 Hz) , 7.80 (1H, d, J = 11.0 Hz), 7.92 (1H, t, J = 5.7 Hz), 8.15 (1H, d, J = 8.2 Hz), 8 , 27 (1H, t, J = 5.5 Hz), 8.46 (1H, d, J = 8.2 Hz). MS (APCI) m / z: 939 (M + H) +
Proceso 2: Trifluoroacetato de glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-Process 2: Glycylglycyl-L-phenylalanyl-N- (4 - {[(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo- trifluoroacetate)
2.3.9.10.13.15- hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3’,4’:6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida2.3.9.10.13.15- hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ’, 4’: 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] amino} -4-oxobutyl) glycinamide
El compuesto (1,97 g, 2,10 mmol) obtenido en el proceso 1 anterior se disolvió en diclorometano (7 ml). Después de añadir ácido trifluoroacético (7 ml), se agitó durante 1 hora. El disolvente se retiró a presión reducida, y se cargó con tolueno para la destilación azeotrópica. los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo - capa orgánica repartida de cloroformo : metanol: agua = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para producir el compuesto del título (1,97 g, 99 %).The compound (1.97 g, 2.10 mmol) obtained in the above process 1 was dissolved in dichloromethane (7 ml). After adding trifluoroacetic acid (7 ml), it was stirred for 1 hour. The solvent was removed under reduced pressure, and charged with toluene for azeotropic distillation. The obtained residues were purified by column chromatography on silica gel [chloroform - distributed organic layer of chloroform: methanol: water = 7: 3: 1 (v / v / v)] to produce the title compound (1.97 g , 99%).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 5: 0,87 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,71-1,73 (2H, m), 1,82-1,90 (2H, m), 2,12-2,20 (4H, m),1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 5: 0.87 (3H, t, J = 7.4 Hz), 1.71-1.73 (2H, m), 1.82-1.90 (2H , m), 2.12-2.20 (4H, m),
2,40 (3H, s), 2,75 (1H, dd, J = 13,7, 9,4 Hz), 3,03-3,09 (3H, m), 3,18-3,19 (2H, m), 3,58-3,60 (2H, m), 3,64 (1H, d, J =2.40 (3H, s), 2.75 (1H, dd, J = 13.7, 9.4 Hz), 3.03-3.09 (3H, m), 3.18-3.19 ( 2H, m), 3.58-3.60 (2H, m), 3.64 (1H, d, J =
5,9 Hz), 3,69 (1H, d, J = 5,9 Hz), 3,72 (1H, d, J = 5,5 Hz), 3,87 (1H, dd, J = 16,8, 5,9 Hz), 4,50-4,56 (1H, m), 5,16 (1H, d, J = 19,2 Hz), 5,25 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,55-5,60 (1H, m), 7,17-7,27 (5H, m), 7,32 (1H, s), 7,787,81 (2H, m), 7,95-7,97 (3H, m), 8,33-8,35 (2H, m), 8,48-8,51 (2H, m).5.9 Hz), 3.69 (1H, d, J = 5.9 Hz), 3.72 (1H, d, J = 5.5 Hz), 3.87 (1H, dd, J = 16, 8, 5.9 Hz), 4.50-4.56 (1H, m), 5.16 (1H, d, J = 19.2 Hz), 5.25 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.42 (2H, s), 5.55-5.60 (1H, m), 7.17-7.27 (5H, m), 7.32 (1H, s), 7,787.81 (2H, m), 7.95-7.97 (3H, m), 8.33-8.35 (2H, m), 8.48-8.51 (2H, m).
EM (APCI) m/z: 839 (M+H)+MS (APCI) m / z: 839 (M + H) +
Proceso 3: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3’,4’:6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-Process 3: N- [6- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoyl] glycylglycyl-L-phenylalanyl-N- (4 - {[(1S, 9S) - 9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4 ': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-
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il]amino}-4-oxobutil)glicinamidail] amino} -4-oxobutyl) glycinamide
A una solución de N,N-dimetilformamida (1,2 ml) del compuesto (337 mg, 0,353 mmol) obtenido en el proceso 2 anterior, se añadieron trietilamina (44,3 ml, 0,318 mmol) y hexanoato de N-succinimidil 6-maleimida (119,7 mg, 0,388 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El disolvente se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 5 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (278,0 mg, 76 %).To a solution of N, N-dimethylformamide (1.2 ml) of the compound (337 mg, 0.353 mmol) obtained in process 2 above, triethylamine (44.3 ml, 0.318 mmol) and N-succinimidyl hexanoate 6 were added -maleimide (119.7 mg, 0.388 mmol) and stirred at room temperature for 1 hour. The solvent was removed under reduced pressure and the obtained residues were purified by silica gel column chromatography [chloroform-chloroform: methanol = 5: 1 (v / v)] to produce the title compound as a colored solid. pale yellow (278.0 mg, 76%).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 5: 0,87 (3H, t, J = 7,3 Hz), 1,12-1,22 (2H, m), 1,40-1,51 (4H, m), 1,66-1,76 (2H, m), 1,80-1,91 (2H, m), 2,05-2,21 (6H, m), 2,39 (3H, s), 2,79 (1H, dd, J = 14,0, 9,8 Hz), 2,98-3,21 (5H, m), 3,55-3,77 (8H, m), 4,41-4,48 (1H, m), 5,15 (1H, d, J = 18,9 Hz), 5,24 (1H, d, J = 18,9 Hz), 5,40 (1H, d, J = 17,1 Hz), 5,44 (1H, d, J = 17,1 Hz), 5,54-5,60 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,20-7,27 (5H, m), 7,30 (1H, s), 7,70 (1H, t, J = 5,5 Hz), 7,80 (1H, d, J = 11,0 Hz), 8,03 (1H, t, J = 5,8 Hz), 8,08 (1H, t, J = 5,5 Hz), 8,14 (1H, d, J = 7,9 Hz), 8,25 (1H, t, J = 6,1 Hz), 8,46 (1H, d, J = 8,5 Hz). EM (APCI) m/z: 1032 (M+H)+1H NMR (400 MHz, DMSO-da) 5: 0.87 (3H, t, J = 7.3 Hz), 1.12-1.22 (2H, m), 1.40-1.51 (4H , m), 1.66-1.76 (2H, m), 1.80-1.91 (2H, m), 2.05-2.21 (6H, m), 2.39 (3H, s ), 2.79 (1H, dd, J = 14.0, 9.8 Hz), 2.98-3.21 (5H, m), 3.55-3.77 (8H, m), 4, 41-4.48 (1H, m), 5.15 (1H, d, J = 18.9 Hz), 5.24 (1H, d, J = 18.9 Hz), 5.40 (1H, d , J = 17.1 Hz), 5.44 (1H, d, J = 17.1 Hz), 5.54-5.60 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.99 (2H, s), 7.20-7.27 (5H, m), 7.30 (1H, s), 7.70 (1H, t, J = 5.5 Hz), 7.80 (1H, d, J = 11.0 Hz), 8.03 (1H, t, J = 5.8 Hz), 8.08 (1H, t, J = 5.5 Hz), 8.14 (1H, d, J = 7.9 Hz), 8.25 (1H, t, J = 6.1 Hz), 8.46 (1H, d, J = 8.5 Hz). MS (APCI) m / z: 1032 (M + H) +
Proceso 4: Conjugado de anticuerpo - fármaco (1)Process 4: Antibody-drug conjugate (1)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml sustituyendo el medio con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común C-1 y el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,61 mlmg-1cm-1) descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (1,25 ml) se puso en un tubo de polipropileno de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,025 ml; 3,0 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml by replacing the medium with PBS6.0 / EDTA using the common C-1 procedure and the procedure. common B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mlmg-1cm-1 was used) described in the production procedure 1. The solution (1.25 ml) was placed in a 1.5 ml polypropylene tube and charged with a 10 mM aqueous solution of TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.025 ml; 3.0 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc. ; 0.0625 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir dimetilsulfóxido (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,109 ml) y una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 3 anterior (0,039 ml; 4,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, esta se agitó usando un rotador de tubos (MTR-103, fabricado por As ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 40 minutos. A continuación, una solución acuosa (0,008 ml) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) se añadió a la misma y se agitó a temperatura ambiente para terminar la reacción del enlazador de fármaco durante otros 20 minutos.Conjugation between antibody and drug linker: After adding dimethylsulfoxide (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0.109 ml) and a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in the above process 3 (0.039 ml; 4.6 equivalents per molecule antibody) to the above solution at room temperature, this was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by As ONE Corporation) to conjugate the drug linker with the antibody at room temperature for 40 minutes. Next, an aqueous solution (0.008 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and stirred at room temperature to terminate the drug linker reaction for another 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 6 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título. Después de esto, la solución se concentró mediante el procedimiento común A.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 6 ml of a solution containing the antibody-drug title conjugate. After this, the solution was concentrated by common procedure A.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), £a,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 50 00 (valor promedio medido) y £d,370 = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 13,02 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,1 mg (73%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,4.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ a, 280 = 235300 (estimated calculation value), £ a, 370 = 0 (estimated calculation value) were used, £ d, 280 = 50 00 (measured average value) and £ d, 370 = 19000 (measured average value)), the following characteristic values were obtained. Antibody concentration: 13.02 mg / ml, antibody yield: 9.1 mg (73%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.4.
Ejemplo 3 Conjugado de anticuerpo - fármaco (2)Example 3 Antibody-drug conjugate (2)
[Fórmula 72][Formula 72]
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Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (2)Process 1: Antibody-drug conjugate (2)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,61 mlmg"1cm"1) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (4,0 ml) se recogió en un tubo de 15 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,118 ml; 4,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,200 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora. Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de incubar la solución anterior durante 10 minutos a 22 °C, una solución de dimetilsulfóxido (0,236 ml; 9,2 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 3 del Ejemplo 2 se añadió a la misma y se incubó para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a 22 °C durante 40 minutos. A continuación, se añadió una solución acuosa (0,00471 ml) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) a la misma y se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a 22 °C durante otros 20 minutos.Antibody reduction: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm , 1.61 mlmg "1cm" 1) was used and the common procedure C-1 described in the production procedure 1. The solution (4.0 ml) was collected in a 15 ml tube and charged with an aqueous solution 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.118 ml; 4.6 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc .; 0.200 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour. Conjugation between antibody and drug linker: After incubating the above solution for 10 minutes at 22 ° C, a solution of dimethylsulfoxide (0.236 ml; 9.2 equivalents per antibody molecule) containing 10 mM of the compound obtained in process 3 of Example 2 was added thereto and incubated to conjugate the drug linker with the antibody at 22 ° C for 40 minutes. Next, an aqueous solution (0.00471 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug linker reaction at 22 ° C for another 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 17,5 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 17.5 ml of a solution containing the antibody-title drug conjugate. .
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), £a,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 5000 (valor promedio medido) y £d,370 = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 1,80 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 26,1 mg (65%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 5,9.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ a, 280 = 235300 (estimated calculation value), £ a, 370 = 0 (estimated calculation value) were used, £ d, 280 = 5000 (measured average value) and £ d, 370 = 19000 (measured average value)), the following characteristic values were obtained. Antibody concentration: 1.80 mg / ml, antibody yield: 26.1 mg (65%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 5.9.
Ejemplo 4 Conjugado de anticuerpo - fármaco (3)Example 4 Antibody-drug conjugate (3)
[Fórmula 73][Formula 73]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (3)Process 1: Antibody-drug conjugate (3)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml sustituyendo el medio con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común C-1 y el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,61 mlmg'1cm'1) descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (1,25 ml) se puso en un tubo de polipropileno de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,051 ml; 6,0 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml by replacing the medium with PBS6.0 / EDTA using the common C-1 procedure and the procedure. common B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mlmg'1cm'1 was used) described in the production procedure 1. The solution (1.25 ml) was placed in a 1.5 ml polypropylene tube and charged with a 10 mM aqueous solution of TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.051 ml; 6.0 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc. ; 0.0625 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir dimetilsulfóxido (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,067 ml) y una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 3 del Ejemplo 2 (0,085 ml; 10,0 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, esta se agitó usando un rotador de tubos (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 60 minutos. A continuación, se añadió una solución acuosa (0,013 ml) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) a la misma y se agitó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente durante otros 20 minutos.Conjugation between antibody and drug linker: After adding dimethylsulfoxide (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0.067 ml) and a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in process 3 of Example 2 (0.085 ml; 10.0 equivalents per antibody molecule) to the above solution at room temperature, it was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug linker with the antibody at room temperature for 60 minutes. Next, an aqueous solution (0.013 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and stirred to terminate the drug linker reaction at room temperature for another 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS comoPurification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as
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solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 6 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.buffer solution) described in production process 1 to produce 6 ml of a solution containing the antibody-drug title conjugate.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,28o = 235300 (valor de cálculo estimado), £a,37o = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 5000 (valor promedio medido) y £d,370 = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 1,67 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 10,02 mg (80%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,3.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ a, 28o = 235300 (estimated calculation value), £ a, 37o = 0 (estimated calculation value) were used, £ d, 280 = 5000 (measured average value) and £ d, 370 = 19000 (measured average value)), the following characteristic values were obtained. Antibody concentration: 1.67 mg / ml, antibody yield: 10.02 mg (80%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 6.3.
Ejemplo 5 Conjugado de anticuerpo - fármaco (4)Example 5 Antibody-drug conjugate (4)
[Fórmula 74][Formula 74]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (4)Process 1: Antibody-drug conjugate (4)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml sustituyendo el medio con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común C-1 y el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,61 mlmg'1cm'1) descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (1,25 ml) se puso en un tubo de polipropileno de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,051 ml; 6,0 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,o625 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml by replacing the medium with PBS6.0 / EDTA using the common C-1 procedure and the procedure. common B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mlmg'1cm'1 was used) described in the production procedure 1. The solution (1.25 ml) was placed in a 1.5 ml polypropylene tube and charged with a 10 mM aqueous solution of TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.051 ml; 6.0 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc. ; 0, or 625 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir dimetilsulfóxido (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,025 ml) y una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 3 del Ejemplo 2 (0,127 ml; 15,0 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, esta se agitó usando un rotador de tubos (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 60 minutos. A continuación, se añadió una solución acuosa (0,019 ml) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) a la misma y se agitó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente durante otros 20 minutos.Conjugation between antibody and drug linker: After adding dimethylsulfoxide (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0.025 ml) and a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in process 3 of Example 2 (0.127 ml; 15.0 equivalents per antibody molecule) to the above solution at room temperature, it was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug linker with the antibody at room temperature for 60 minutes. Next, an aqueous solution (0.019 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and stirred to terminate the drug linker reaction at room temperature for another 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 6 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título. Después de esto, la solución se concentró mediante el procedimiento común A.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 6 ml of a solution containing the antibody-drug title conjugate. After this, the solution was concentrated by common procedure A.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,28o = 235300 (valor de cálculo estimado), £a,37o = 0 (valor de cálculo estimado), £d,28o = 5000 (valor promedio medido) y £d,37o = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 1,19 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 7,14 mg (57%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 7,5.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ a, 28o = 235300 (estimated calculation value), £ a, 37o = 0 (estimated calculation value) were used, £ d, 28o = 5000 (measured average value) and £ d, 37o = 19000 (measured average value)), the following characteristic values were obtained. Antibody concentration: 1.19 mg / ml, antibody yield: 7.14 mg (57%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 7.5.
Ejemplo 6 Conjugado de anticuerpo - fármaco (5)Example 6 Antibody-drug conjugate (5)
55
1010
15fifteen
20twenty
2525
Casi la totalidad de las cantidades de los conjugados de anticuerpo - fármaco de Ejemplos 4 y 5 se mezclaron y la solución se concentró mediante el procedimiento común A para producir el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Almost all of the amounts of the antibody-drug conjugates of Examples 4 and 5 were mixed and the solution was concentrated by common procedure A to produce the antibody-drug title conjugate.
Concentración de anticuerpo: 10,0 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 15,37 mg, y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,7.Antibody concentration: 10.0 mg / ml, antibody yield: 15.37 mg, and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 6.7.
Ejemplo 7 Conjugado de anticuerpo - fármaco (6)Example 7 Antibody-drug conjugate (6)
[Fórmula 76][Formula 76]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (6)Process 1: Antibody-drug conjugate (6)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo anti-CD30 producido en el Ejemplo de Referencia 3 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,75) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (1,0 ml) se recogió en un tubo de 2 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0297 ml; 4,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,050 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The anti-CD30 antibody produced in Reference Example 3 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, se used 1.75) and the common procedure C-1 described in the production process 1. The solution (1.0 ml) was collected in a 2 ml tube and charged with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0297 ml; 4.6 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc .; 0.050 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de incubar la solución anterior a 22 °C durante 10 minutos, una solución de dimetilsulfóxido (0,0593 ml; 9,2 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 3 del Ejemplo 2 se añadió a la misma y se incubó para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a 22 °C durante 40 minutos. A continuación, una solución acuosa (0,0119 ml; 18,4 equivalentes por molécula de anticuerpo) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) se añadió a la misma y se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a 22 °C durante otros 20 minutos. Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 6 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Conjugation between antibody and drug linker: After incubating the above solution at 22 ° C for 10 minutes, a solution of dimethylsulfoxide (0.0593 ml; 9.2 equivalents per antibody molecule) containing 10 mM of the compound obtained in the Process 3 of Example 2 was added thereto and incubated to conjugate the drug linker with the antibody at 22 ° C for 40 minutes. Next, an aqueous solution (0.0119 ml; 18.4 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug linker reaction to 22 ° C for another 20 minutes. Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 6 ml of a solution containing the antibody-drug title conjugate.
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1010
15fifteen
20twenty
2525
3030
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £A,28o4 = 270400 (valor de cálculo estimado), £a,37o = 0 (valor de cálculo estimado), £d,28o = 5000 (valor promedio medido) y £d,37o = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ A, 28o4 = 270400 (estimated calculation value), £ a, 37o = 0 (estimated calculation value) were used, £ d, 28o = 5000 (measured average value) and £ d, 37o = 19000 (measured average value)), the following characteristic values were obtained.
Concentración de anticuerpo: 0,99 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 5,94 mg (59%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,3.Antibody concentration: 0.99 mg / ml, antibody yield: 5.94 mg (59%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.3.
Ejemplo 8 Conjugado de anticuerpo - fármaco (7)Example 8 Antibody-drug conjugate (7)
[Fórmula 77][Formula 77]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (7)Process 1: Antibody-drug conjugate (7)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo anti-CD30 producido en el Ejemplo de Referencia 3 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,75) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (1,0 ml) se recogió en un tubo de 2 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 30 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0148 ml; 6,9 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,050 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The anti-CD30 antibody produced in Reference Example 3 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, se used 1.75) and the common procedure C-1 described in the production process 1. The solution (1.0 ml) was collected in a 2 ml tube and charged with an aqueous solution of 30 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0148 ml; 6.9 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc .; 0.050 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de incubar la solución anterior durante 10 minutos a 22 °C, una solución de dimetilsulfóxido (0,0297 ml; 13,8 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contiene 30 mM del compuesto obtenido en el proceso 3 del Ejemplo 2 se añadió a la misma y se incubó durante 40 minutos a 22 °C para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo. A continuación, una solución acuosa (0,0178 ml; 27,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) se añadió a la misma y se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a 22 °C durante otros 20 minutos.Conjugation between antibody and drug linker: After incubating the above solution for 10 minutes at 22 ° C, a solution of dimethylsulfoxide (0.0297 ml; 13.8 equivalents per antibody molecule) containing 30 mM of the compound obtained in the Process 3 of Example 2 was added thereto and incubated for 40 minutes at 22 ° C to conjugate the drug linker with the antibody. Next, an aqueous solution (0.0178 ml; 27.6 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug linker reaction to 22 ° C for another 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 6 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 6 ml of a solution containing the antibody-drug title conjugate.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,28o = 270400 (valor de cálculo estimado), £a,37o = 0 (valor de cálculo estimado), £d,28o = 5000 (valor promedio medido) y £d,37o = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 0,99 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 5,94 mg (59%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,8.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ a, 28o = 270400 (estimated calculation value), £ a, 37o = 0 (estimated calculation value) were used, £ d, 28o = 5000 (measured average value) and £ d, 37o = 19000 (measured average value)), the following characteristic values were obtained. Antibody concentration: 0.99 mg / ml, antibody yield: 5.94 mg (59%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.8.
55
1010
15fifteen
20twenty
2525
Ejemplo 9 Conjugado de anticuerpo - fármaco (8)Example 9 Antibody-drug conjugate (8)
[Fórmula 78][Formula 78]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (8)Process 1: Antibody-drug conjugate (8)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo anti-CD33 producido en el Ejemplo de Referencia 4 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,66) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (1,0 ml) se recogió en un tubo de 2 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0297 ml; 4,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,050 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The anti-CD33 antibody produced in Reference Example 4 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, se used 1.66) and the common C-1 procedure described in the production process 1. The solution (1.0 ml) was collected in a 2 ml tube and charged with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0297 ml; 4.6 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc .; 0.050 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de incubar la solución anterior durante 10 minutos a 22 °C, una solución de dimetilsulfóxido (0,0593 ml; 9,2 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 3 del Ejemplo 2 se añadió a la misma y se incubó para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a 22 °C durante 40 minutos. A continuación, una solución acuosa (0,0119 ml; 18,4 equivalentes por molécula de anticuerpo) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) se añadió a la misma y se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a 22 °C durante otros 20 minutos. Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 6 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Conjugation between antibody and drug linker: After incubating the above solution for 10 minutes at 22 ° C, a solution of dimethylsulfoxide (0.0593 ml; 9.2 equivalents per antibody molecule) containing 10 mM of the compound obtained in the Process 3 of Example 2 was added thereto and incubated to conjugate the drug linker with the antibody at 22 ° C for 40 minutes. Next, an aqueous solution (0.0119 ml; 18.4 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug linker reaction to 22 ° C for another 20 minutes. Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 6 ml of a solution containing the antibody-drug title conjugate.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,280 = 256400 (valor de cálculo estimado), £a,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 5000 (valor promedio medido) y £d,370 = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 1,06 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 6,36 mg (64%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,4.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ a, 280 = 256400 (estimated calculation value), £ a, 370 = 0 (estimated calculation value) were used, £ d, 280 = 5000 (measured average value) and £ d, 370 = 19000 (measured average value)), the following characteristic values were obtained. Antibody concentration: 1.06 mg / ml, antibody yield: 6.36 mg (64%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.4.
Ejemplo 10 Conjugado de anticuerpo - fármaco (9)Example 10 Antibody-drug conjugate (9)
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1010
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20twenty
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Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (9)Process 1: Antibody-drug conjugate (9)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo anti-CD33 producido en el Ejemplo de Referencia 4 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,66) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (1,0 ml) se recogió en un tubo de 2 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 30 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0148 ml; 6,9 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,050 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The anti-CD33 antibody produced in Reference Example 4 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, se used 1.66) and the common procedure C-1 described in the production process 1. The solution (1.0 ml) was collected in a 2 ml tube and charged with an aqueous solution of 30 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0148 ml; 6.9 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc .; 0.050 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de incubar la solución anterior durante 10 minutos a 22 °C, una solución de dimetilsulfóxido (0,0297 ml; 13,8 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contiene 30 mM del compuesto obtenido en el proceso 3 del Ejemplo 2 se añadió a la misma y se incubó para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a 22 °C durante 40 minutos. A continuación, una solución acuosa (0,0178 ml; 27,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) se añadió a la misma y se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a 22 °C durante otros 20 minutos.Conjugation between antibody and drug linker: After incubating the above solution for 10 minutes at 22 ° C, a solution of dimethylsulfoxide (0.0297 ml; 13.8 equivalents per antibody molecule) containing 30 mM of the compound obtained in the Process 3 of Example 2 was added thereto and incubated to conjugate the drug linker with the antibody at 22 ° C for 40 minutes. Next, an aqueous solution (0.0178 ml; 27.6 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug linker reaction to 22 ° C for another 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 6 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 6 ml of a solution containing the antibody-drug title conjugate.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,280 = 256400 (valor de cálculo estimado), £a,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 50 00 (valor promedio medido) y £d,370 = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 0,95 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 5,70 mg (57%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,7.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ a, 280 = 256400 (estimated calculation value), £ a, 370 = 0 (estimated calculation value) were used, £ d, 280 = 50 00 (measured average value) and £ d, 370 = 19000 (measured average value)), the following characteristic values were obtained. Antibody concentration: 0.95 mg / ml, antibody yield: 5.70 mg (57%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.7.
Ejemplo 11 Conjugado de anticuerpo - fármaco (10)Example 11 Antibody-drug conjugate (10)
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Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (10)Process 1: Antibody-drug conjugate (10)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo anti-CD70 producido en el Ejemplo de Referencia 5 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,69) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (1,0 ml) se recogió en un tubo de 2 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0297 ml; 4,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,050 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The anti-CD70 antibody produced in Reference Example 5 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, se used 1.69) and the common procedure C-1 described in the production process 1. The solution (1.0 ml) was collected in a 2 ml tube and charged with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0297 ml; 4.6 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc .; 0.050 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de incubar la solución anterior a 22 °C durante 10 minutos, una solución de dimetilsulfóxido (0,0593 ml; 9,2 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 3 del Ejemplo 2 se añadió a la misma y se incubó para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a 22 °C durante 40 minutos. A continuación, una solución acuosa (0,0119 ml; 18,4 equivalentes por molécula de anticuerpo) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) se añadió a la misma y se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a 22 °C durante otros 20 minutos. Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 6 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Conjugation between antibody and drug linker: After incubating the above solution at 22 ° C for 10 minutes, a solution of dimethylsulfoxide (0.0593 ml; 9.2 equivalents per antibody molecule) containing 10 mM of the compound obtained in the Process 3 of Example 2 was added thereto and incubated to conjugate the drug linker with the antibody at 22 ° C for 40 minutes. Next, an aqueous solution (0.0119 ml; 18.4 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug linker reaction to 22 ° C for another 20 minutes. Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 6 ml of a solution containing the antibody-drug title conjugate.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £A,280 = 262400 (valor de cálculo estimado), £A,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 5000 (valor promedio medido) y £d,370 = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ A, 280 = 262400 (estimated calculation value), £ A, 370 = 0 (estimated calculation value) were used, £ d, 280 = 5000 (measured average value) and £ d, 370 = 19000 (measured average value)), the following characteristic values were obtained.
Concentración de anticuerpo: 1,00 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 6,00 mg (60%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,2.Antibody concentration: 1.00 mg / ml, antibody yield: 6.00 mg (60%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.2.
Ejemplo 12 Conjugado de anticuerpo - fármaco (11)Example 12 Antibody-drug conjugate (11)
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1010
15fifteen
20twenty
2525
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (11)Process 1: Antibody-drug conjugate (11)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo anti-CD70 producido en el Ejemplo de Referencia 5 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/E0TA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,69) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (1,0 ml) se recogió en un tubo de 2 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 30 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0148 ml; 6,9 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,050 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The anti-CD70 antibody produced in Reference Example 5 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / E0TA using the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, se used 1.69) and the common procedure C-1 described in the production process 1. The solution (1.0 ml) was collected in a 2 ml tube and charged with an aqueous solution of 30 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0148 ml; 6.9 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc .; 0.050 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de incubar la solución anterior a 22 °C durante 10 minutos, una solución de dimetilsulfóxido (0,0297 ml; 13,8 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contiene 30 mM del compuesto obtenido en el proceso 3 del Ejemplo 2 se añadió a la misma y se incubó durante 40 minutos a 22 °C para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo. A continuación, una solución acuosa (0,0178 ml; 27,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) se añadió a la misma y se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a 22 °C durante otros 20 minutos.Conjugation between antibody and drug linker: After incubating the above solution at 22 ° C for 10 minutes, a solution of dimethylsulfoxide (0.0297 ml; 13.8 equivalents per antibody molecule) containing 30 mM of the compound obtained in the Process 3 of Example 2 was added thereto and incubated for 40 minutes at 22 ° C to conjugate the drug linker with the antibody. Next, an aqueous solution (0.0178 ml; 27.6 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug linker reaction to 22 ° C for another 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 6 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 6 ml of a solution containing the antibody-drug title conjugate.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £A280 = 262400 (valor de cálculo estimado), eA|370 = 0 (valor de cálculo estimado), £0,370 = 5000 (valor promedio medido) y £0370 = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 0,96 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 5,76 mg (58 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,6.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ A280 = 262400 (estimated calculation value), eA | 370 = 0 (estimated calculation value), £ 0.370 = 5000 (measured average value) and £ 0370 = 19000 (measured average value)), the following characteristic values were obtained. Antibody concentration: 0.96 mg / ml, antibody yield: 5.76 mg (58%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.6.
Ejemplo 13 Conjugado de anticuerpo - fármaco (12)Example 13 Antibody-drug conjugate (12)
Proceso 1: N-[3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanoil]glicilgMcil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-Process 1: N- [3- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) propanoyl] glycylgMcil-L-phenylalanyl-N- (4 - {[(1S, 9S) - 9-ethyl-5-fluoro-9-
hidroxi-4-metiM0,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indoNzino[1,2-b]quinoNn-1-hydroxy-4-metiM0,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indoNzino [1,2- b] quinoNn-1-
il]amino}-4-oxobutil)glicinamidail] amino} -4-oxobutyl) glycinamide
5 El compuesto (80 mg, 0,084 mmol) obtenido en el proceso 2 del Ejemplo 2 se hizo reaccionar de la misma forma que en el proceso 3 del Ejemplo 2 usando propionato de N-succinimidil 3-maleimida (24,6 mg, 0,0924 mmol) en lugar de hexanoato de N-succinimidil 6-maleimida para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (60,0 mg, 73 %).The compound (80 mg, 0.084 mmol) obtained in process 2 of Example 2 was reacted in the same manner as in process 3 of Example 2 using N-succinimidyl 3-maleimide propionate (24.6 mg, 0, 0924 mmol) instead of N-succinimidyl 6-maleimide hexanoate to produce the title compound as a pale yellow solid (60.0 mg, 73%).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,89 (3H, t, J = 7,3 Hz), 1,70-1,78 (2H, m), 1,81-1,94 (2H, m), 2,12-2,23 (4H, m), 10 2,42 (3H, s), 2,81 (1H, dd, J = 13,7, 9,8 Hz), 3,01-3,15 (3H, m), 3,16-3,23 (2H, m), 3,30-3,35 (1H, m), 3,58-3,71 (6H,1H NMR (400 MHz, DMSO-da) 8: 0.89 (3H, t, J = 7.3 Hz), 1.70-1.78 (2H, m), 1.81-1.94 (2H , m), 2.12-2.23 (4H, m), 10 2.42 (3H, s), 2.81 (1H, dd, J = 13.7, 9.8 Hz), 3.01 -3.15 (3H, m), 3.16-3.23 (2H, m), 3.30-3.35 (1H, m), 3.58-3.71 (6H,
m), 3,71-3,79 (1H, m), 4,44-4,51 (1H, m), 5,19 (1H, d, J = 19,0 Hz), 5,27 (1H, d, J = 19,0 Hz), 5,43 (1H, d, J = 17,6 Hz), 5,47 (1H, d, J = 17,6 Hz), 5,57-5,63 (1H, m), 6,56 (1H, s), 7,02 (2H, s), 7,17-7,22 (1H, m), 7,22-7,30 (5H, m), 7,34 (1H, s), 7,73 (1H, t, J = 5,6 Hz), 7,83 (1H, d, J = 10,7 Hz), 8,08 (1H, t, J = 5,6 Hz), 8,15 (1H, d, J = 7,8 Hz), 8,30 (2H, dt, J = 18,7, 5,7 Hz), 8,49 9 (1H, d, J = 8,8 Hz).m), 3.71-3.79 (1H, m), 4.44-4.51 (1H, m), 5.19 (1H, d, J = 19.0 Hz), 5.27 (1H , d, J = 19.0 Hz), 5.43 (1H, d, J = 17.6 Hz), 5.47 (1H, d, J = 17.6 Hz), 5.57-5.63 (1H, m), 6.56 (1H, s), 7.02 (2H, s), 7.17-7.22 (1H, m), 7.22-7.30 (5H, m), 7.34 (1H, s), 7.73 (1H, t, J = 5.6 Hz), 7.83 (1H, d, J = 10.7 Hz), 8.08 (1H, t, J = 5.6 Hz), 8.15 (1H, d, J = 7.8 Hz), 8.30 (2H, dt, J = 18.7, 5.7 Hz), 8.49 9 (1H, d, J = 8.8 Hz).
15 EM (APCI) m/z: 990 (M+H)+15 MS (APCI) m / z: 990 (M + H) +
Proceso 2: Conjugado de anticuerpo - fármaco (12)Process 2: Antibody-drug conjugate (12)
Usando el anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 y el compuesto obtenido en el proceso 1 anterior, el conjugado de anticuerpo - fármaco del título se obtuvo de la misma forma que en el proceso 4 del Ejemplo 2. Concentración de anticuerpo: 12,16 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,5 mg (68%), y número promedio 20 de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,4.Using the M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 and the compound obtained in the above process 1, the antibody-drug title conjugate was obtained in the same manner as in process 4 of Example 2. Concentration of antibody: 12.16 mg / ml, antibody yield: 8.5 mg (68%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.4.
Ejemplo 14 Conjugado de anticuerpo - fármaco (13)Example 14 Antibody-drug conjugate (13)
Proceso 1: N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanoil]amino}etoxi)etoxi]propanoil}glicilglicil-L-Process 1: N- {3- [2- (2 - {[3- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) propanoyl] amino} ethoxy) ethoxy] propanoyl} glycylglycyl -L-
fenilalanil-N-(4-{[(1S,9s)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-phenylalanyl-N- (4 - {[(1S, 9s) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro -1H, 12H-
benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]aminol-4-oxobutil)glicinamidabenzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] aminol-4-oxobutyl) glycinamide
5 El compuesto (100 mg, 0,119 mmol) obtenido en el proceso 2 del Ejemplo 2 se hizo reaccionar de la misma forma que en el proceso 3 del Ejemplo 2 usando diisopropiletilamina (20,8 ^l, 0,119 mmol) en lugar de trietilamina y 3-(2- (2-(3-maleinimidapropanamida)etoxi)etoxi)propanoato de N-succinimidilo (50,7 mg, 0,119 mmol) en lugar de hexanoato de N-succinimidil 6-maleimida para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (66,5 mg, 48 %).The compound (100 mg, 0.119 mmol) obtained in process 2 of Example 2 was reacted in the same manner as in process 3 of Example 2 using diisopropylethylamine (20.8 ^ 1, 0.119 mmol) instead of triethylamine and N-succinimidyl 3- (2- (2- (3-maleinimidapropanamide) ethoxy) ethoxy) propanoate (50.7 mg, 0.119 mmol) instead of N-succinimidyl 6-maleimide hexanoate to produce the title compound as of a pale yellow solid (66.5 mg, 48%).
10 RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 5: 0,85 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,65-1,74 (2H, m), 1,77-1,90 (2H, m), 2,07-2,19 (4H, m), 2,30 (2H, t, J = 7,2 Hz), 2,33-2,36 (2H, m), 2,38 (3H, s), 2,76 (1H, dd, J = 13,7, 9,8 Hz), 2,96-3,18 (9H, m), 3,42-3,44 (4H, m), 3,53-3,76 (10H, m), 4,43 (1H, td, J = 8,6, 4,7 Hz), 5,14 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,23 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,38 (1H, d, J = 17,2 Hz), 5,42 (1H, d, J = 17,2 Hz), 5,52-5,58 (1H, m), 6,52 (1H, s), 6,98 (2H, s), 7,12-7,17 (1H, m), 7,187,25 (4H, m), 7,29 (1H, s), 7,69 (1H, t, J = 5,5 Hz), 7,78 (1H, d, J = 11,3 Hz), 7,98-8,03 (2H, m), 8,11 (1H, d, J = 7,8 15 Hz), 8,16 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,23 (1H, t, J = 5,9 Hz), 8,44 (1H, d, J = 9,0 Hz).10 1H NMR (400 MHz, DMSO-da) 5: 0.85 (3H, t, J = 7.4 Hz), 1.65-1.74 (2H, m), 1.77-1.90 ( 2H, m), 2.07-2.19 (4H, m), 2.30 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.33-2.36 (2H, m), 2.38 (3H, s), 2.76 (1H, dd, J = 13.7, 9.8 Hz), 2.96-3.18 (9H, m), 3.42-3.44 (4H, m ), 3.53-3.76 (10H, m), 4.43 (1H, td, J = 8.6, 4.7 Hz), 5.14 (1H, d, J = 18.8 Hz) , 5.23 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.38 (1H, d, J = 17.2 Hz), 5.42 (1H, d, J = 17.2 Hz), 5 , 52-5.58 (1H, m), 6.52 (1H, s), 6.98 (2H, s), 7.12-7.17 (1H, m), 7,187.25 (4H, m ), 7.29 (1H, s), 7.69 (1H, t, J = 5.5 Hz), 7.78 (1H, d, J = 11.3 Hz), 7.98-8.03 (2H, m), 8.11 (1H, d, J = 7.8 15 Hz), 8.16 (1H, t, J = 5.7 Hz), 8.23 (1H, t, J = 5 , 9 Hz), 8.44 (1H, d, J = 9.0 Hz).
EM (APCI) m/z: 1149 (M+H)+MS (APCI) m / z: 1149 (M + H) +
Proceso 2: Conjugado de anticuerpo - fármaco (13)Process 2: Antibody-drug conjugate (13)
Usando el anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 y el compuesto obtenido en el proceso 1 anterior, el conjugado de anticuerpo - fármaco del título se obtuvo de la misma forma que en el proceso 4 del 20 Ejemplo 2. Concentración de anticuerpo: 12,76 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,9 mg (71%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,4.Using the M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 and the compound obtained in process 1 above, the antibody-drug title conjugate was obtained in the same manner as in process 4 of Example 20. Concentration of antibody: 12.76 mg / ml, antibody yield: 8.9 mg (71%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.4.
Ejemplo 15 Conjugado de anticuerpo - fármaco (14)Example 15 Antibody-drug conjugate (14)
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (14)Process 1: Antibody-drug conjugate (14)
5 Usando el anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 y el compuesto obtenido en el proceso 1 del Ejemplo 14, el conjugado de anticuerpo - fármaco del título se obtuvo de la misma forma que en el proceso 1 del Ejemplo 4. Concentración de anticuerpo: 1,60 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,60 mg (77%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,1.5 Using the M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 and the compound obtained in process 1 of Example 14, the antibody-drug title conjugate was obtained in the same manner as in process 1 of Example 4 Antibody concentration: 1.60 mg / ml, antibody yield: 9.60 mg (77%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 6.1.
Ejemplo 16 Conjugado de anticuerpo - fármaco (15)Example 16 Antibody-drug conjugate (15)
[Fórmula 85][Formula 85]
10 Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (15)10 Process 1: Antibody-drug conjugate (15)
Usando el anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 y el compuesto obtenido en el proceso 1 del Ejemplo 14, el conjugado de anticuerpo - fármaco del título se obtuvo de la misma forma que en el proceso 1 del Ejemplo 5. Concentración de anticuerpo: 1,64 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,84 mg (79%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 7,1.Using the M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 and the compound obtained in process 1 of Example 14, the antibody-drug title conjugate was obtained in the same manner as in process 1 of Example 5. Antibody concentration: 1.64 mg / ml, antibody yield: 9.84 mg (79%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 7.1.
15 Ejemplo 17 Conjugado de anticuerpo - fármaco (16)15 Example 17 Antibody-drug conjugate (16)
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Casi la totalidad de las cantidades de los conjugados de anticuerpo - fármaco de Ejemplos 15 y 16 se mezclaron y la solución se concentró mediante el procedimiento común A para producir el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Almost all of the amounts of the antibody-drug conjugates of Examples 15 and 16 were mixed and the solution was concentrated by common procedure A to produce the antibody-drug title conjugate.
Concentración de anticuerpo: 10,0 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 17,30 mg, y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,5.Antibody concentration: 10.0 mg / ml, antibody yield: 17.30 mg, and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 6.5.
Ejemplo 18 Conjugado de anticuerpo - fármaco (17)Example 18 Antibody-drug conjugate (17)
[Fórmula 87][Formula 87]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (17)Process 1: Antibody-drug conjugate (17)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,61 mlmg-1cm-1) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (100 ml, 1 g del anticuerpo) se puso en un matraz de 250 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (2,43 ml; 3,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) y adicionalmente con una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (5 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH cerca de 7,4 usando un pehachímetro, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm , 1.61 mlmg-1cm-1) was used and the common C-1 procedure described in the production procedure 1. The solution (100 ml, 1 g of the antibody) was placed in a 250 ml flask and charged with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (2.43 ml; 3.6 equivalents per antibody molecule) and additionally with a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (5 ml). After confirming that the solution had a pH near 7.4 using a pehachmeter, the disulfide bond on a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir dimetilsulfóxido (2,14 ml) y una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 1 del Ejemplo 14 (3,51 ml; 5,2 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó con un agitador para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo en un baño de agua a 15 °C durante 130 minutos. A continuación, una solución acuosa (0,547 ml) de NAC 100 mM se añadió a la misma y se incubó adicionalmente para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente durante 20 minutos.Conjugation between antibody and drug linker: After adding dimethylsulfoxide (2.14 ml) and a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in process 1 of Example 14 (3.51 ml; 5.2 equivalents per molecule of antibody) to the above solution at room temperature, it was stirred with a stirrer to conjugate the drug linker with the antibody in a water bath at 15 ° C for 130 minutes. Next, an aqueous solution (0.547 ml) of 100 mM NAC was added thereto and further incubated to terminate the drug linker reaction at room temperature for 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación por ultrafiltración usando un aparato de ultrafiltración compuesto por una membrana de ultrafiltración (Merck Japan, Casete Pellicon XL, Biomax 50 KDa), una bomba de tubo (Cole-Parmer International, Bomba MasterFlex modelo 77521-40, Cabezal de Bomba modelo 7518-00), y unPurification: The above solution was subjected to ultrafiltration purification using an ultrafiltration apparatus composed of an ultrafiltration membrane (Merck Japan, Pellicon XL Cassette, Biomax 50 KDa), a tube pump (Cole-Parmer International, Model 77521 MasterFlex Pump- 40, Pump Head model 7518-00), and a
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1010
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3030
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tubo (Cole-Parmer International, Tubo MasterFlex L/S16). Específicamente, al tiempo que se añadía ABS gota a gota (un total de 800 ml) como una solución tampón para la purificación a la solución de reacción, se realizó una purificación por ultrafiltración para retirar enlazadores de fármaco no conjugados y otros reactivos de bajo peso molecular, sustituir también la solución tampón con ABS, y concentrar adicionalmente la solución, para producir aproximadamente 70 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.tube (Cole-Parmer International, MasterFlex Tube L / S16). Specifically, while ABS was added dropwise (a total of 800 ml) as a buffer solution for purification to the reaction solution, ultrafiltration purification was performed to remove unconjugated drug linkers and other low weight reagents molecular, also replace the buffer solution with ABS, and further concentrate the solution, to produce approximately 70 ml of a solution containing the antibody-drug title conjugate.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £A,28o = 235300 (valor de cálculo estimado), £a,37o = 0 (valor de cálculo estimado), £d,28o = 4964 (valor medido) y £d,37o = 18982 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as molar absorption coefficient, £ A, 28o = 235300 (estimated calculation value), £ a, 37o = 0 (estimated calculation value) were used, £ d, 28o = 4964 (measured value) and £ d, 37o = 18982 (measured value)), the following characteristic values were obtained.
Concentración de anticuerpo: 14,5 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 1,0 g (aproximadamente 100 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,5.Antibody concentration: 14.5 mg / ml, antibody yield: 1.0 g (approximately 100%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.5.
Ejemplo 19 Conjugado de anticuerpo - fármaco (18)Example 19 Antibody-drug conjugate (18)
[Fórmula 88][Formula 88]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (18)Process 1: Antibody-drug conjugate (18)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,61 mlmg"1cm"1) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (5 ml, 50 mg del anticuerpo) se puso en un tubo de 15 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,135 ml; 4 equivalentes por molécula de anticuerpo). Después de confirmar que la solución tenía un pH cerca de 7,4 usando un pehachímetro, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm , 1.61 mlmg "1cm" 1) was used and the common C-1 procedure described in the production procedure 1. The solution (5 ml, 50 mg of the antibody) was placed in a 15 ml tube and loaded with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.135 ml; 4 equivalents per antibody molecule). After confirming that the solution had a pH near 7.4 using a pehachmeter, the disulfide bond on a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir dimetilsulfóxido (0,064 ml) y una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 1 del Ejemplo 14 (0,219 ml; 6,5 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior, se incubó para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo en un baño de agua a 15 °C durante 90 minutos. A continuación, una solución acuosa (0,033 ml; 9,8 equivalentes por molécula de anticuerpo) de NAC 100 mM se añadió a la misma y se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente durante otros 20 minutos.Conjugation between antibody and drug linker: After adding dimethylsulfoxide (0.064 ml) and a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in process 1 of Example 14 (0.219 ml; 6.5 equivalents per antibody molecule) to the The above solution was incubated to conjugate the drug linker with the antibody in a water bath at 15 ° C for 90 minutes. Next, an aqueous solution (0.033 ml; 9.8 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC was added thereto and incubated to terminate the drug linker reaction at room temperature for another 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 19 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 19 ml of a solution containing the antibody-drug title conjugate.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,28o = 235300 (valor de cálculo estimado), £a,37o = 0 (valor de cálculo estimado), £d,28o = 4964 (valor medido) y £d,37o = 18982 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ a, 28o = 235300 (estimated calculation value), £ a, 37o = 0 (estimated calculation value) were used, £ d, 28o = 4964 (measured value) and £ d, 37o = 18982 (measured value)), the following characteristic values were obtained.
Concentración de anticuerpo: 2,17 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 41 mg (82%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 5,0.Antibody concentration: 2.17 mg / ml, antibody yield: 41 mg (82%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 5.0.
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Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (19)Process 1: Antibody-drug conjugate (19)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,61 mlmg"1cm"1) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (4 ml, 40 mg del anticuerpo) se puso en un tubo de 15 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,140 ml; 5,2 equivalentes por molécula de anticuerpo). Después de confirmar que la solución tenía un pH cerca de 7,4 usando un pehachímetro, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora. Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 1 del Ejemplo 14 (0,232 ml; 8,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior, se incubó para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo en un baño de agua a 15 °C durante 90 minutos. A continuación, una solución acuosa (0,035 ml; 12,9 equivalentes por molécula de anticuerpo) de NAC 100 mM se añadió a la misma y se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente durante otros 20 minutos.Antibody reduction: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm , 1.61 mlmg "1cm" 1) was used and the common C-1 procedure described in the production procedure 1. The solution (4 ml, 40 mg of the antibody) was placed in a 15 ml tube and loaded with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.134 ml; 5.2 equivalents per antibody molecule). After confirming that the solution had a pH near 7.4 using a pehachmeter, the disulfide bond on a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour. Conjugation between antibody and drug linker: After adding a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in process 1 of Example 14 (0.232 ml; 8.6 equivalents per antibody molecule) to the above solution, it was incubated to conjugate the drug linker with the antibody in a water bath at 15 ° C for 90 minutes. Next, an aqueous solution (0.035 ml; 12.9 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC was added thereto and incubated to terminate the drug linker reaction at room temperature for another 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 13 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 13 ml of a solution containing the antibody-drug title conjugate.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,28ü = 235300 (valor de cálculo estimado), £a,37ü = 0 (valor de cálculo estimado), £D2s0 = 4964 (valor medido) y £D,37ü = 18982 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ a, 28ü = 235300 (estimated calculation value), £ a, 37ü = 0 (estimated calculation value) were used, £ D2s0 = 4964 (measured value) and £ D, 37ü = 18982 (measured value)), the following characteristic values were obtained.
Concentración de anticuerpo: 2,36 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 31 mg (77%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 5,9.Antibody concentration: 2.36 mg / ml, antibody yield: 31 mg (77%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 5.9.
Ejemplo 21 Conjugado de anticuerpo - fármaco (20)Example 21 Antibody-drug conjugate (20)
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Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (20)Process 1: Antibody-drug conjugate (20)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4 producido en el Ejemplo de Referencia 1 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,61 mlmg"1cm"1) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (1,25 ml, 12,5 mg del anticuerpo) se puso en un tubo de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0287 ml; 3,4 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The M30-H1-L4 antibody produced in Reference Example 1 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm , 1.61 mlmg "1cm" 1) was used and the common C-1 procedure described in the production process 1. The solution (1.25 ml, 12.5 mg of the antibody) was placed in a 1 tube, 5 ml and charged with a 10 mM aqueous solution of TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0287 ml; 3.4 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc .; 0.0625 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir dimetilsulfóxido (0,0267 ml) y una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 1 del Ejemplo 14 (0,0439 ml; 5,2 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se incubó para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo en un baño de agua a 15 °C durante 1 hora. A continuación, una solución acuosa (0,0066 ml) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) se añadió a la misma y se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente durante otros 20 minutos.Conjugation between antibody and drug linker: After adding dimethylsulfoxide (0.0267 ml) and a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in process 1 of Example 14 (0.0439 ml; 5.2 equivalents per molecule of antibody) to the above solution at room temperature, it was incubated to conjugate the drug linker with the antibody in a water bath at 15 ° C for 1 hour. Next, an aqueous solution (0.0066 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug linker reaction at room temperature for another 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 6 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título. Después de esto, la solución se concentró mediante el procedimiento común A.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 6 ml of a solution containing the antibody-drug title conjugate. After this, the solution was concentrated by common procedure A.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,28ü = 235300 (valor de cálculo estimado), £a,37ü = 0 (valor de cálculo estimado), £d,28ü = 4964 (valor medido) y £d,37ü = 18982 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ a, 28ü = 235300 (estimated calculation value), £ a, 37ü = 0 (estimated calculation value) were used, £ d, 28ü = 4964 (measured value) and £ d, 37ü = 18982 (measured value)), the following characteristic values were obtained.
Concentración de anticuerpo: 10,0 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,7 mg (70%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,5.Antibody concentration: 10.0 mg / ml, antibody yield: 8.7 mg (70%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.5.
Ejemplo 22 Conjugado de anticuerpo - fármaco (21)Example 22 Antibody-drug conjugate (21)
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Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (21)Process 1: Antibody-drug conjugate (21)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4 producido en el Ejemplo de Referencia 1 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,61 mlmg-1cm-1) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (1,25 ml, 12,5 mg del anticuerpo) se puso en un tubo de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0439 ml; 5,2 equivalentes por molécula de anticuerpo) (0,0287 ml; 3,4 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The M30-H1-L4 antibody produced in Reference Example 1 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm , 1.61 mlmg-1cm-1) was used and the common C-1 procedure described in the production procedure 1. The solution (1.25 ml, 12.5 mg of the antibody) was placed in a 1-tube, 5 ml and charged with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0439 ml; 5.2 equivalents per antibody molecule) (0.0287 ml; 3.4 equivalents per molecule of antibody) and an aqueous solution of dipotassium hydrogen phosphate 1 M (Nacalai Tesque, Inc .; 0.0625 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 1 del Ejemplo 14 (0,0726 ml; 8,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se incubó para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo en un baño de agua a 15 °C durante 1 hora. A continuación, una solución acuosa (0,011 ml) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) se añadió a la misma y se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente durante otros 20 minutos.Conjugation between antibody and drug linker: After adding a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in process 1 of Example 14 (0.0726 ml; 8.6 equivalents per antibody molecule) to the above solution at temperature ambient, it was incubated to conjugate the drug linker with the antibody in a water bath at 15 ° C for 1 hour. Next, an aqueous solution (0.011 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug linker reaction at room temperature for another 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 6 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título. Después de esto, la solución se concentró mediante el procedimiento común A.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 6 ml of a solution containing the antibody-drug title conjugate. After this, the solution was concentrated by common procedure A.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £A,28o = 235300 (valor de cálculo estimado), £A,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 4964 (valor medido) y £d,370 = 18982 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ A, 28o = 235300 (estimated calculation value), £ A, 370 = 0 (estimated calculation value) were used, £ d, 280 = 4964 (measured value) and £ d, 370 = 18982 (measured value)), the following characteristic values were obtained.
Concentración de anticuerpo: 10,0 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,3 mg (66%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 5,5.Antibody concentration: 10.0 mg / ml, antibody yield: 8.3 mg (66%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 5.5.
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1010
15fifteen
20twenty
2525
[Fórmula 92][Formula 92]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (22)Process 1: Antibody-drug conjugate (22)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo anti-CD30 producido en el Ejemplo de Referencia 3 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,75 mlmg"1cm"1) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (0,4 ml, 4 mg del anticuerpo) se puso en un tubo de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0065 ml; 2,5 equivalentes por molécula de anticuerpo). El enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The anti-CD30 antibody produced in Reference Example 3 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, se used 1.75 mlmg "1cm" 1) and the common C-1 procedure described in the production procedure 1. The solution (0.4 ml, 4 mg of the antibody) was placed in a 1.5 ml tube and charged with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0065 ml; 2.5 equivalents per antibody molecule). The disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir dimetilsulfóxido (0,0098 ml) y una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 1 del Ejemplo 14 (0,0116 ml; 4,5 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, esta se agitó usando un rotador de tubos (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, una solución acuosa (0,0017 ml) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) se añadió a la misma y se incubó adicionalmente para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente durante 20 minutos.Conjugation between antibody and drug linker: After adding dimethylsulfoxide (0.0098 ml) and a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in process 1 of Example 14 (0.0116 ml; 4.5 equivalents per molecule of antibody) to the above solution at room temperature, this was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug linker with the antibody at room temperature for 1 hour. Next, an aqueous solution (0.0017 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and further incubated to terminate the drug linker reaction at room temperature for 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 2,5 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 2.5 ml of a solution containing the antibody-title drug conjugate. .
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £A,280 = 270400 (valor de cálculo estimado), £A,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 4964 (valor medido) y £0,370 = 18982 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ A, 280 = 270400 (estimated calculation value), £ A, 370 = 0 (estimated calculation value) were used, £ d, 280 = 4964 (measured value) and £ 0.370 = 18982 (measured value)), the following characteristic values were obtained.
Concentración de anticuerpo: 0,86 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 2,2 mg (54%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 2,5.Antibody concentration: 0.86 mg / ml, antibody yield: 2.2 mg (54%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 2.5.
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15fifteen
20twenty
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[Fórmula 93][Formula 93]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (23)Process 1: Antibody-drug conjugate (23)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo anti-CD30 producido en el Ejemplo de Referencia 3 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,75 mlmg"1cm"1) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (0,35 ml, 3,5 mg del anticuerpo) se puso en un tubo de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0113 ml; 5 equivalentes por molécula de anticuerpo). El enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The anti-CD30 antibody produced in Reference Example 3 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, se used 1.75 mlmg "1cm" 1) and the common C-1 procedure described in production procedure 1. The solution (0.35 ml, 3.5 mg of the antibody) was put in a 1.5 ml tube and charged with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0113 ml; 5 equivalents per antibody molecule). The disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 1 del Ejemplo 14 (0,0204 ml; 9 equivalentes por molécula de anticuerpo) y propilenglicol (Kanto Chemical Co., Inc., 0,18 ml) a la solución anterior a temperatura ambiente, esta se agitó usando un rotador de tubos (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, una solución acuosa (0,0031 ml) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) se añadió a la misma y se incubó adicionalmente para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente durante 20 minutos.Conjugation between antibody and drug linker: After adding a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in process 1 of Example 14 (0.0204 ml; 9 equivalents per antibody molecule) and propylene glycol (Kanto Chemical Co., Inc., 0.18 ml) to the above solution at room temperature, this was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug linker with the antibody at room temperature for 1 hour. . Next, an aqueous solution (0.0031 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and further incubated to terminate the drug linker reaction at room temperature for 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 2,5 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 2.5 ml of a solution containing the antibody-title drug conjugate. .
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron eAj280 = 270400 (valor de cálculo estimado), £Aj370 = 0 (valor de cálculo estimado), eDj280 = 4964 (valor medido) y eDj370 = 18982 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as molar absorption coefficient, eAj280 = 270400 (estimated calculation value), £ Aj370 = 0 (estimated calculation value), eDj280 = 4964 (value measured) and eDj370 = 18982 (measured value)), the following characteristic values were obtained.
Concentración de anticuerpo: 0,41 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 1,0 mg (29%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 7,1.Antibody concentration: 0.41 mg / ml, antibody yield: 1.0 mg (29%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 7.1.
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1010
15fifteen
20twenty
2525
[Fórmula 94][Formula 94]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (24)Process 1: Antibody-drug conjugate (24)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo anti-CD33 producido en el Ejemplo de Referencia 4 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,66 mlmg^cm"1) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (0,4 ml, 4 mg del anticuerpo) se puso en un tubo de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0065 ml; 2,5 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0058 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,0 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The anti-CD33 antibody produced in Reference Example 4 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, se used 1.66 mlmg ^ cm "1) and the common C-1 procedure described in the production procedure 1. The solution (0.4 ml, 4 mg of the antibody) was placed in a 1.5 ml tube and charged with a 10 mM aqueous solution of TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0065 ml; 2.5 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc. ; 0.0058 ml.) After confirming that the solution had a pH of 7.0 ± 0.1, the disulfide bond on a hinge portion in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir dimetilsulfóxido (0,0101 ml) y una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 1 del Ejemplo 14 (0,0116 ml; 4,5 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, esta se agitó usando un rotador de tubos (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, una solución acuosa (0,0017 ml) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) se añadió a la misma y se incubó adicionalmente para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente durante 20 minutos.Conjugation between antibody and drug linker: After adding dimethylsulfoxide (0.0101 ml) and a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in process 1 of Example 14 (0.0116 ml; 4.5 equivalents per molecule of antibody) to the above solution at room temperature, this was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug linker with the antibody at room temperature for 1 hour. Next, an aqueous solution (0.0017 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and further incubated to terminate the drug linker reaction at room temperature for 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 2,5 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 2.5 ml of a solution containing the antibody-title drug conjugate. .
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,28ü = 256400 (valor de cálculo estimado), £a,37ü = 0 (valor de cálculo estimado), £d,28ü = 4964 (valor medido) y £d,37ü = 18982 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ a, 28ü = 256400 (estimated calculation value), £ a, 37ü = 0 (estimated calculation value) were used, £ d, 28ü = 4964 (measured value) and £ d, 37ü = 18982 (measured value)), the following characteristic values were obtained.
Concentración de anticuerpo: 1,25 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 3,1 mg (78%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,7.Antibody concentration: 1.25 mg / ml, antibody yield: 3.1 mg (78%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.7.
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1010
15fifteen
20twenty
2525
[Fórmula 95][Formula 95]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (25)Process 1: Antibody-drug conjugate (25)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo anti-CD33 producido en el Ejemplo de Referencia 4 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,66 mlmg-1cm-1) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (0,4 ml, 4 mg del anticuerpo) se puso en un tubo de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0129 ml; 5 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,006 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,0 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The anti-CD33 antibody produced in Reference Example 4 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, se used 1.66 mlmg-1cm-1) and the common C-1 procedure described in production procedure 1. The solution (0.4 ml, 4 mg of the antibody) was placed in a 1.5 ml tube and loaded with a 10 mM aqueous solution of TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0129 ml; 5 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc .; 0.006 ml) After confirming that the solution had a pH of 7.0 ± 0.1, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 1 del Ejemplo 14 (0,0233 ml; 9 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, esta se agitó usando un rotador de tubos (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, una solución acuosa (0,0035 ml) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) se añadió a la misma y se incubó adicionalmente para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente durante 20 minutos.Conjugation between antibody and drug linker: After adding a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in process 1 of Example 14 (0.0233 ml; 9 equivalents per antibody molecule) to the above solution at room temperature, This was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug linker with the antibody at room temperature for 1 hour. Next, an aqueous solution (0.0035 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and further incubated to terminate the drug linker reaction at room temperature for 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 2,5 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 2.5 ml of a solution containing the antibody-title drug conjugate. .
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £A,2so = 256400 (valor de cálculo estimado), £A,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £Dj280 = 4964 (valor medido) y £Dj370 = 18982 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ A, 2so = 256400 (estimated calculation value), £ A, 370 = 0 (estimated calculation value) were used, £ Dj280 = 4964 (measured value) and £ Dj370 = 18982 (measured value)), the following characteristic values were obtained.
Concentración de anticuerpo: 1,17 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 2,9 mg (73%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 7,3.Antibody concentration: 1.17 mg / ml, antibody yield: 2.9 mg (73%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 7.3.
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1010
15fifteen
20twenty
2525
[Fórmula 96][Formula 96]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (26)Process 1: Antibody-drug conjugate (26)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo anti-CD70 producido en el Ejemplo de Referencia 5 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,69 mlmg"1cm"1) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (0,4 ml, 4 mg del anticuerpo) se puso en un tubo de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0065 ml; 2,5 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0058 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,0 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The anti-CD70 antibody produced in Reference Example 5 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, se used 1.69 mlmg "1cm" 1) and the common C-1 procedure described in the production process 1. The solution (0.4 ml, 4 mg of the antibody) was put in a 1.5 ml tube and charged with a 10 mM aqueous solution of TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0065 ml; 2.5 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc. ; 0.0058 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.0 ± 0.1, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir dimetilsulfóxido (0,0101 ml) y una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 1 del Ejemplo 14 (0,0116 ml; 4,5 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, esta se agitó usando un rotador de tubos (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, una solución acuosa (0,0017 ml) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) se añadió a la misma y se incubó adicionalmente para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente durante 20 minutos.Conjugation between antibody and drug linker: After adding dimethylsulfoxide (0.0101 ml) and a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in process 1 of Example 14 (0.0116 ml; 4.5 equivalents per molecule of antibody) to the above solution at room temperature, this was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug linker with the antibody at room temperature for 1 hour. Next, an aqueous solution (0.0017 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and further incubated to terminate the drug linker reaction at room temperature for 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 2,5 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 2.5 ml of a solution containing the antibody-title drug conjugate. .
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £Aj280 = 262400 (valor de cálculo estimado), £Aj370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 4964 (valor medido) y £0,370 = 18982 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as molar absorption coefficient, £ Aj280 = 262400 (estimated calculation value), £ Aj370 = 0 (estimated calculation value), £ d, 280 were used = 4964 (measured value) and £ 0.370 = 18982 (measured value)), the following characteristic values were obtained.
Concentración de anticuerpo: 1,14 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 2,9 mg (71%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,8.Antibody concentration: 1.14 mg / ml, antibody yield: 2.9 mg (71%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.8.
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2525
[Fórmula 97][Formula 97]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (27)Process 1: Antibody-drug conjugate (27)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo anti-CD70 producido en el Ejemplo de Referencia 5 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,69 mlmg-1cm-1) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (0,4 ml, 4 mg del anticuerpo) se puso en un tubo de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0129 ml; 5 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,006 6 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,0 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The anti-CD70 antibody produced in Reference Example 5 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, se used 1.69 mlmg-1cm-1) and the common C-1 procedure described in production procedure 1. The solution (0.4 ml, 4 mg of the antibody) was placed in a 1.5 ml tube and loaded with a 10 mM aqueous solution of TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0129 ml; 5 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc .; 0.006 6 ml) After confirming that the solution had a pH of 7.0 ± 0.1, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir una solución de dimetilsulfóxido (0,0233 ml; 9 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 1 del Ejemplo 14 a la solución anterior a temperatura ambiente, esta se agitó usando un rotador de tubos (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, una solución acuosa (0,0035 ml) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) se añadió a la misma y se incubó adicionalmente para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente durante 20 minutos.Conjugation between antibody and drug linker: After adding a solution of dimethylsulfoxide (0.0233 ml; 9 equivalents per antibody molecule) containing 10 mM of the compound obtained in process 1 of Example 14 to the above solution at room temperature, This was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug linker with the antibody at room temperature for 1 hour. Next, an aqueous solution (0.0035 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and further incubated to terminate the drug linker reaction at room temperature for 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 2,5 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 2.5 ml of a solution containing the antibody-title drug conjugate. .
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,280 = 262400 (valor de cálculo estimado), £a,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 4964 (valor medido) y £d,370 = 18982 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ a, 280 = 262400 (estimated calculation value), £ a, 370 = 0 (estimated calculation value) were used, £ d, 280 = 4964 (measured value) and £ d, 370 = 18982 (measured value)), the following characteristic values were obtained.
Concentración de anticuerpo: 1,13 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 2,8 mg (71%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 7,4.Antibody concentration: 1.13 mg / ml, antibody yield: 2.8 mg (71%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 7.4.
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1010
15fifteen
20twenty
2525
3030
3535
[Fórmula 98][Formula 98]
Proceso 1: N-[19-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-17-oxo-4,7,10,13-tetraoxo-16-azanonadecan-1-oil]glicilglicil-L-Process 1: N- [19- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -17-oxo-4,7,10,13-tetraoxo-16-azanonadecan-1- oil] glycylglycyl-L-
fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-phenylalanyl-N- (4 - {[(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro -1H, 12H-
benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamidabenzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] amino} -4-oxobutyl) glycinamide
El compuesto (90 mg, 0,107 mmol) obtenido en el proceso 2 del Ejemplo 2 se hizo reaccionar de la misma forma que en el proceso 3 del Ejemplo 2 usando diisopropiletilamina (18,7 pl, 0,107 mmol) en lugar de trietilamina y 1- maleinimida-3-oxo-7,10,13,16-tetraoxa-4-azanonadecan-19-oato de N-succinimidilo (55,1 mg, 0,107 mmol) en lugar de hexanoato de N-succinimidil 6-maleimida para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (50 mg, 37 %).The compound (90 mg, 0.107 mmol) obtained in process 2 of Example 2 was reacted in the same manner as in process 3 of Example 2 using diisopropylethylamine (18.7 pl, 0.107 mmol) instead of triethylamine and 1- N-succinimidyl maleoimide-3-oxo-7,10,13,16-tetraoxa-4-azanonadecan-19-oate (55.1 mg, 0.107 mmol) instead of N-succinimidyl 6-maleimide hexanoate to produce the title compound in the form of a pale yellow solid (50 mg, 37%).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 5: 0,85 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,64-1,74 (2H, m), 1,77-1,90 (2H, m), 2,06-2,19 (4H, m), 2,27-2,32 (2H, m), 2,33-2,37 (2H, m), 2,38 (3H, s), 2,72-2,80 (3H, m), 2,96-3,19 (6H, m), 3,39-3,48 (10H, m), 3,523,75 (10H, m), 4,39-4,48 (1H, m), 5,14 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,23 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,38 (1H, d, J = 17,0 Hz), 5,42 (1H, d, J = 17,0 Hz), 5,52-5,58 (1H, m), 6,52 (1H, s), 6,98 (1H, s), 7,13-7,24 (5H, m), 7,29 (1H, s), 7,69 (1H, t, J = 5,5 Hz), 7,78 (1H, d, J = 10,9 Hz), 7,98-8,03 (2H, m), 8,10 (1H, d, J = 7,8 Hz), 8,16 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,23 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,44 (1H, d, J = 8,6 Hz).1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 5: 0.85 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.64-1.74 (2H, m), 1.77-1.90 (2H , m), 2.06-2.19 (4H, m), 2.27-2.32 (2H, m), 2.33-2.37 (2H, m), 2.38 (3H, s ), 2.72-2.80 (3H, m), 2.96-3.19 (6H, m), 3.39-3.48 (10H, m), 3,523.75 (10H, m), 4.39-4.48 (1H, m), 5.14 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.23 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.38 (1H , d, J = 17.0 Hz), 5.42 (1H, d, J = 17.0 Hz), 5.52-5.58 (1H, m), 6.52 (1H, s), 6 , 98 (1H, s), 7.13-7.24 (5H, m), 7.29 (1H, s), 7.69 (1H, t, J = 5.5 Hz), 7.78 ( 1H, d, J = 10.9 Hz), 7.98-8.03 (2H, m), 8.10 (1H, d, J = 7.8 Hz), 8.16 (1H, t, J = 5.7 Hz), 8.23 (1H, t, J = 5.7 Hz), 8.44 (1H, d, J = 8.6 Hz).
EM (APCI) m/z: 1237 (M+H)+MS (APCI) m / z: 1237 (M + H) +
Proceso 2: Conjugado de anticuerpo - fármaco (28)Process 2: Antibody-drug conjugate (28)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml sustituyendo el medio con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común C-1 y el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,61 mlmgxm"1) descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (1,25 ml) se puso en un tubo de polipropileno de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,025 ml; 3,0 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml by replacing the medium with PBS6.0 / EDTA using the common C-1 procedure and the procedure. common B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mlmgxm "1) described in the production procedure 1 was used. The solution (1.25 ml) was placed in a 1.5 ml polypropylene tube and loaded with a 10 mM aqueous solution of TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.025 ml; 3.0 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc .; 0 , 0625 ml.) After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide bond on a hinge portion in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir dimetilsulfóxido (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,102 ml) y una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 1 anterior (0,047 ml; 5,5 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, esta se agitó usando un rotador de tubos (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 40 minutos. A continuación, se añadió una solución acuosa (0,009 ml) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) a la misma y se agitó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente durante otros 20 minutos.Conjugation between antibody and drug linker: After adding dimethylsulfoxide (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0.102 ml) and a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in the above process 1 (0.047 ml; 5.5 equivalents per molecule antibody) to the above solution at room temperature, this was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug linker with the antibody at room temperature for 40 minutes. Next, an aqueous solution (0.009 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and stirred to terminate the drug linker reaction at room temperature for another 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 6 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título. Después de esto, la solución se concentró mediante el procedimientoPurification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 6 ml of a solution containing the antibody-drug title conjugate. After this, the solution was concentrated by the procedure
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15fifteen
20twenty
2525
3030
común A.commune.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £A,28o = 235300 (valor de cálculo estimado), £A,37o = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 50 00 (valor promedio medido) y £d,370 = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 13,60 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,5 mg (76%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,3.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ A, 28o = 235300 (estimated calculation value), £ A, 37o = 0 (estimated calculation value) were used, £ d, 280 = 50 00 (measured average value) and £ d, 370 = 19000 (measured average value)), the following characteristic values were obtained. Antibody concentration: 13.60 mg / ml, antibody yield: 9.5 mg (76%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.3.
Ejemplo 30 Conjugado de anticuerpo - fármaco (29)Example 30 Antibody-drug conjugate (29)
[Fórmula 99][Formula 99]
Proceso 1: N-(terc-butoxicarbonil)p-alanilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-Process 1: N- (tert-butoxycarbonyl) p-alanylglycylglycyl-L-phenylalanyl-N- (4 - {[(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13 -
dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] amino} -4-
oxobutil)glicinamidaoxobutyl) glycinamide
El compuesto (0,839 g, 1,00 mmol) obtenido en el proceso 2 del Ejemplo 2 se hizo reaccionar de la misma forma que en el proceso 1 del Ejemplo 1 usando N-(terc-butoxicarbonil)-p-alanina en lugar de ácido 4-(terc- butoxicarbonilamino)butanoico. El producto en bruto obtenido se usó en el siguiente proceso sin purificación.The compound (0.839 g, 1.00 mmol) obtained in process 2 of Example 2 was reacted in the same manner as in process 1 of Example 1 using N- (tert-butoxycarbonyl) -p-alanine instead of acid 4- (tert-butoxycarbonylamino) butanoic acid. The crude product obtained was used in the following process without purification.
Proceso 2: p-Alanilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamidaProcess 2: p-Alanylglycylglycyl-L-phenylalanyl-N- (4 - {[(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3, 9,10,13,15- hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] amino} -4-oxobutyl ) glycinamide
El producto en bruto obtenido en el proceso 1 anterior se hizo reaccionar de la misma forma que en el proceso 2 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,610 g, 67 %).The crude product obtained in process 1 above was reacted in the same manner as in process 2 of Example 2 to produce the title compound as a pale yellow solid (0.610 g, 67%).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 5: 0,87 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,67-1,77 (2H, m), 1,79-1,92 (2H, m), 2,09-2,22 (4H, m),1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 5: 0.87 (3H, t, J = 7.4 Hz), 1.67-1.77 (2H, m), 1.79-1.92 (2H , m), 2.09-2.22 (4H, m),
2,40 (3H, s), 2,46-2,55 (2H, m), 2,82-2,73 (1H, m), 2,95-3,13 (5H, m), 3,14-3,21 (2H, m), 3,55-3,80 (6H, m), 4,44-4,52 (1H, m), 5,20 (2H, dd, J = 35,0, 19,0 Hz), 5,42 (2H, s), 5,53-5,60 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,14-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,67 (2H, s a), 7,72-7,78 (1H, m), 7,80 (1H, d, J = 11,0 Hz), 8,10-8,17 (2H, m), 8,29 (1H, t, J = 5,9 Hz), 8,42 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,47 (1H, d, J = 8,6 Hz).2.40 (3H, s), 2.46-2.55 (2H, m), 2.82-2.73 (1H, m), 2.95-3.13 (5H, m), 3, 14-3.21 (2H, m), 3.55-3.80 (6H, m), 4.44-4.52 (1H, m), 5.20 (2H, dd, J = 35.0 , 19.0 Hz), 5.42 (2H, s), 5.53-5.60 (1H, m), 6.54 (1H, s), 7.14-7.28 (5H, m) , 7.31 (1H, s), 7.67 (2H, sa), 7.72-7.78 (1H, m), 7.80 (1H, d, J = 11.0 Hz), 8, 10-8.17 (2H, m), 8.29 (1H, t, J = 5.9 Hz), 8.42 (1H, t, J = 5.7 Hz), 8.47 (1H, d , J = 8.6 Hz).
Proceso 3: N-(bromoacetil)-p-alanilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-Process 3: N- (bromoacetyl) -p-alanylglycylglycyl-L-phenylalanyl-N- (4 - {[(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13- dioxo-
2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] amino} -4-oxobutyl) glycinamide
A una solución de diclorometano (4,5 ml) de ácido 2-bromoacético (96,3 mg, 0,693 mmol), se añadieron N- hidroxisuccinimida (79,7 mg, 0,693 mmol) y 1,3-diisopropilcarbodiimida (0,107 ml, 0,693 mmol) y se agitó a temperatura ambiente. La solución de reacción se añadió a una solución de N,N-dimetilformamida (4,5 ml) del compuesto (473 mg, 0,462 mmol) obtenido en el proceso 2 anterior y trietilamina (0,154 ml, 1,11 mmol) a 0 °C y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La solución de reacción se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice [disolvente de elución: cloroformo - cloroformo : metanol = 85 : 15 (v/v)]. El sólido obtenido se lavó con disolvente mixto de cloroformo : metanol : éter dietílico para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (191 mg, 40 %).To a solution of dichloromethane (4.5 ml) of 2-bromoacetic acid (96.3 mg, 0.693 mmol), N-hydroxysuccinimide (79.7 mg, 0.693 mmol) and 1,3-diisopropylcarbodiimide (0.107 ml, were added. 0.693 mmol) and stirred at room temperature. The reaction solution was added to a solution of N, N-dimethylformamide (4.5 ml) of the compound (473 mg, 0.462 mmol) obtained in the above process 2 and triethylamine (0.154 ml, 1.11 mmol) at 0 ° C and stirred at room temperature for 1 hour. The reaction solution was purified by column chromatography on silica gel [elution solvent: chloroform-chloroform: methanol = 85: 15 (v / v)]. The solid obtained was washed with mixed solvent of chloroform: methanol: diethyl ether to produce the title compound as a pale yellow solid (191 mg, 40%).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 5: 0,87 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,67-1,77 (2H, m), 1,79-1,92 (2H, m), 2,08-2,22 (4H, m),1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 5: 0.87 (3H, t, J = 7.4 Hz), 1.67-1.77 (2H, m), 1.79-1.92 (2H , m), 2.08-2.22 (4H, m),
55
1010
15fifteen
20twenty
2525
3030
3535
2,33 (2H, t, J = 7,0 Hz), 2,40 (3H, s), 2,74-2,83 (1H, m), 2,99-3,12 (3H, m), 3,14-3,21 (2H, m), 3,24-3,30 (2H, m), 3,56-3,77 (6H, m), 3,82 (2H, s), 4,41-4,51 (1H, m), 5,20 (2H, c, J = 18,9 Hz), 5,42 (2H, s), 5,54-5,60 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,15-7,27 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,69-7,74 (1H, m), 7,80 (1H, d, J = 10,9 Hz), 8,06 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,13 (1H, d, J = 7,8 Hz), 8,21-8,34 (3H, m), 8,46 (1H, d, J = 8,6 Hz).2.33 (2H, t, J = 7.0 Hz), 2.40 (3H, s), 2.74-2.83 (1H, m), 2.99-3.12 (3H, m) , 3.14-3.21 (2H, m), 3.24-3.30 (2H, m), 3.56-3.77 (6H, m), 3.82 (2H, s), 4 , 41-4.51 (1H, m), 5.20 (2H, c, J = 18.9 Hz), 5.42 (2H, s), 5.54-5.60 (1H, m), 6.54 (1H, s), 7.15-7.27 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.69-7.74 (1H, m), 7.80 (1H, d, J = 10.9 Hz), 8.06 (1H, t, J = 5.7 Hz), 8.13 (1H, d, J = 7.8 Hz), 8.21-8.34 ( 3H, m), 8.46 (1H, d, J = 8.6 Hz).
EM (IEN) m/z: 1030, 1032 (M+H)+MS (ESI) m / z: 1030, 1032 (M + H) +
Proceso 4: Conjugado de anticuerpo - fármaco (29)Process 4: Antibody-drug conjugate (29)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml sustituyendo el medio con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común C-1 y el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,61 mlmg-1cm-1) descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (1,25 ml) se puso en un tubo de polipropileno de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,025 ml; 3,0 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml by replacing the medium with PBS6.0 / EDTA using the common C-1 procedure and the procedure. common B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mlmg-1cm-1 was used) described in the production procedure 1. The solution (1.25 ml) was placed in a 1.5 ml polypropylene tube and charged with a 10 mM aqueous solution of TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.025 ml; 3.0 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc. ; 0.0625 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir dimetilsulfóxido (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,09 ml) y una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 3 (0,059 ml; 7,0 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, esta se agitó usando un rotador de tubos (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 40 minutos. A continuación, se añadió una solución acuosa (0,009 ml) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) a la misma y se agitó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente durante otros 20 minutos.Conjugation between antibody and drug linker: After adding dimethylsulfoxide (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0.09 ml) and a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in process 3 (0.059 ml; 7.0 equivalents per antibody molecule) to the above solution at room temperature, this was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug linker with the antibody at room temperature for 40 minutes. Next, an aqueous solution (0.009 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and stirred to terminate the drug linker reaction at room temperature for another 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 6 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título. Después de esto, la solución se concentró mediante el procedimiento común A.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 6 ml of a solution containing the antibody-drug title conjugate. After this, the solution was concentrated by common procedure A.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £A,28o = 235300 (valor de cálculo estimado), £A,37o = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 5000 (valor promedio medido) y £d,370 = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 13,9 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,7 mg (78%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,2.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ A, 28o = 235300 (estimated calculation value), £ A, 37o = 0 (estimated calculation value) were used, £ d, 280 = 5000 (measured average value) and £ d, 370 = 19000 (measured average value)), the following characteristic values were obtained. Antibody concentration: 13.9 mg / ml, antibody yield: 9.7 mg (78%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.2.
Ejemplo 31 Conjugado de anticuerpo - fármaco (30)Example 31 Antibody-drug conjugate (30)
[Fórmula 100][Formula 100]
Usando el anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 y el compuesto obtenido en el proceso 3 del Ejemplo 30, el conjugado de anticuerpo - fármaco del título se obtuvo de la misma forma que en el proceso 1 del Ejemplo 4. Concentración de anticuerpo: 1,94 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 11,64 mg (93%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 5,6.Using the M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 and the compound obtained in process 3 of Example 30, the antibody-drug title conjugate was obtained in the same manner as in process 1 of Example 4. Antibody concentration: 1.94 mg / ml, antibody yield: 11.64 mg (93%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 5.6.
[Fórmula 101][Formula 101]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (31)Process 1: Antibody-drug conjugate (31)
Usando el anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 y el compuesto obtenido en el proceso 3 del Ejemplo 30, el conjugado de anticuerpo - fármaco del título se obtuvo de la misma forma que en el proceso 1 del 5 Ejemplo 5.Using the M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 and the compound obtained in process 3 of Example 30, the antibody-drug title conjugate was obtained in the same manner as in process 1 of 5 Example 5 .
Concentración de anticuerpo: 1,90 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 11,40 mg (91%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,7.Antibody concentration: 1.90 mg / ml, antibody yield: 11.40 mg (91%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 6.7.
Ejemplo 33 Conjugado de anticuerpo - fármaco (32)Example 33 Antibody-drug conjugate (32)
[Fórmula 102][Formula 102]
Casi la totalidad de las cantidades de los conjugados de anticuerpo - fármaco de Ejemplos 31 y 32 se mezclaron y la 10 solución se concentró mediante el procedimiento común A para producir el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Almost all of the amounts of the antibody-drug conjugates of Examples 31 and 32 were mixed and the solution was concentrated by common procedure A to produce the antibody-drug title conjugate.
Concentración de anticuerpo: 10,0 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 21,06 mg, y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,0.Antibody concentration: 10.0 mg / ml, antibody yield: 21.06 mg, and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 6.0.
[Fórmula 103][Formula 103]
Proceso 1: 4-({N6-(terc-butoxicarbonil)-N2-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-lisil}amino)butanoato de terc-butiloProcess 1: 4 - ({N6- (tert-butoxycarbonyl) -N2 - [(9H-fluoren-9-ylmethoxy) carbonyl] -L-lysyl} amino) tert-butyl butanoate
A una solución de N,N-dimetilformamida (10,0 ml) de NE-(terc-butoxicarbonil)-Na-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L- lisina (1,00 g, 2,14 mmol), N-hidroxisuccinimida (0,370 g, 3,20 mmol) y clorhidrato de éster de ácido terc-butil 45 aminobutanoico (0,830 g, 4,27 mmol), se añadieron clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0,610 g, 3,20 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (0,410 ml, 2,35 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 3 días. La solución de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con una solución acuosa de ácido cítrico al 10 % y una solución saturada acuosa de hidrogenocarbonato sódico, y salmuera saturada, y entonces la capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. El disolvente se retiró a presión reducida para producir el compuesto del título en 10 forma de un sólido incoloro (1,35 g, cuantitativo).To a solution of N, N-dimethylformamide (10.0 ml) of NE- (tert-butoxycarbonyl) -Na - [(9H-fluoren-9-ylmethoxy) carbonyl] -L-lysine (1.00 g, 2, 14 mmol), N-hydroxysuccinimide (0.370 g, 3.20 mmol) and tert-butyl aminobutanoic acid ester hydrochloride (0.830 g, 4.27 mmol), 1-ethyl-3- hydrochloride (3- dimethylaminopropyl) carbodiimide (0.610 g, 3.20 mmol) and N, N-diisopropylethylamine (0.410 ml, 2.35 mmol) and stirred at room temperature for 3 days. The reaction solution was diluted with ethyl acetate and washed with a 10% aqueous solution of citric acid and a saturated aqueous solution of sodium hydrogen carbonate, and saturated brine, and then the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate. The solvent was removed under reduced pressure to produce the title compound as a colorless solid (1.35 g, quantitative).
RMN 1H (400 MHz, DIVISOR) 6: 1,14-1,42 (4H, m), 1,36 (9H, s), 1,37 (9H, s), 1,48-1,67 (4H, m), 2,18 (2H, t, J = 7,6 Hz), 2,84-2,93 (2H, m), 2,99-3,11 (2H, m), 3,84-3,94 (1H, m), 4,18-4,30 (3H, m), 6,76 (1H, t, J = 5,4 Hz), 7,33 (2H, t, J = 7,3 Hz), 7,39-7,45 (3H, m), 7,73 (2H, dd, J = 7,3, 2,7 Hz), 7,85-7,92 (3H, m).1H NMR (400 MHz, DIVIDER) 6: 1.14-1.42 (4H, m), 1.36 (9H, s), 1.37 (9H, s), 1.48-1.67 (4H , m), 2.18 (2H, t, J = 7.6 Hz), 2.84-2.93 (2H, m), 2.99-3.11 (2H, m), 3.84- 3.94 (1H, m), 4.18-4.30 (3H, m), 6.76 (1H, t, J = 5.4 Hz), 7.33 (2H, t, J = 7, 3 Hz), 7.39-7.45 (3H, m), 7.73 (2H, dd, J = 7.3, 2.7 Hz), 7.85-7.92 (3H, m).
Proceso 2: 4-{[N6-(terc-butoxicarbonil)-L-lisil]amino}butanoato de terc-butiloProcess 2: 4 - {[N6- (tert-butoxycarbonyl) -L-lysyl] amino} tert-butyl butanoate
15 A una solución de N,N-dimetilformamida (8,00 ml) del compuesto (1,35 g, 2,22 mmol) obtenido en el proceso 1 anterior, se añadió piperidina (2,00 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas. El disolvente se retiró a presión reducida para producir una mezcla que contiene el compuesto del título. La mezcla se usó para la siguiente reacción sin purificación adicional.To a solution of N, N-dimethylformamide (8.00 ml) of the compound (1.35 g, 2.22 mmol) obtained in process 1 above, piperidine (2.00 ml) was added and stirred at temperature ambient for 1.5 hours. The solvent was removed under reduced pressure to produce a mixture containing the title compound. The mixture was used for the next reaction without further purification.
Proceso 3: N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-valil-N6-(terc-butoxicarbonil)-N-(4-terc-butoxi-4-oxobutil)-L-lisinamida 20 A una solución de N,N-dimetilformamida (30,0 ml) de la mezcla (2,22 mmol) obtenida en el proceso 2 anterior, seProcess 3: N - [(9H-fluoren-9-ylmethoxy) carbonyl] -L-valyl-N6- (tert-butoxycarbonyl) -N- (4-tert-butoxy-4-oxobutyl) -L-lysinamide 20 A solution of N, N-dimethylformamide (30.0 ml) of the mixture (2.22 mmol) obtained in process 2 above, is
55
1010
15fifteen
20twenty
2525
3030
3535
4040
45Four. Five
50fifty
5555
añadieron N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-valina (1,13 g, 3,32 mmol), N-hidroxisuccinimida (0,310 g, 2,66 mmol) y clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0,550 g, 2,88 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. La solución de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con una solución saturada acuosa de hidrogenocarbonato sódico y salmuera saturada, y entonces la capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. El disolvente se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 9 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido incoloro (0,363 g, 23 %).added N - [(9H-fluoren-9-ylmethoxy) carbonyl] -L-valine (1.13 g, 3.32 mmol), N-hydroxysuccinimide (0.310 g, 2.66 mmol) and 1-ethyl- hydrochloride 3- (3-Dimethylaminopropyl) carbodiimide (0.550 g, 2.88 mmol) and stirred at room temperature for 18 hours. The reaction solution was diluted with ethyl acetate and washed with a saturated aqueous solution of sodium hydrogen carbonate and saturated brine, and then the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate. The solvent was removed under reduced pressure and the obtained residues were purified by column chromatography on silica gel [chloroform-chloroform: methanol = 9: 1 (v / v)] to produce the title compound as a colorless solid ( 0.363 g, 23%).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,84 (6H, t, J = 6,0 Hz), 1,12-1,64 (8H, m), 1,34 (9H, s), 1,38 (9H, s), 1,90-2,04 (1H, m), 2,17 (2H, t, J = 7,3 Hz), 2,79-2,90 (2H, m), 2,99-3,09 (2H, m), 3,83-3,91 (1H, m), 4,08-4,44 (4H, m), 6,71 (1H, t, J = 5,4 Hz), 7,32 (2H, t, J = 7,3 Hz), 7,42 (3H, t, J = 7,3 Hz), 7,74 (2H, t, J = 7,0 Hz), 7,85-7,91 (4H, m).1H NMR (400 MHz, DMSO-da) 8: 0.84 (6H, t, J = 6.0 Hz), 1.12-1.64 (8H, m), 1.34 (9H, s), 1.38 (9H, s), 1.90-2.04 (1H, m), 2.17 (2H, t, J = 7.3 Hz), 2.79-2.90 (2H, m) , 2.99-3.09 (2H, m), 3.83-3.91 (1H, m), 4.08-4.44 (4H, m), 6.71 (1H, t, J = 5.4 Hz), 7.32 (2H, t, J = 7.3 Hz), 7.42 (3H, t, J = 7.3 Hz), 7.74 (2H, t, J = 7, 0 Hz), 7.85-7.91 (4H, m).
EM (IEN) m/z: 709 (M+H)+MS (ESI) m / z: 709 (M + H) +
Proceso 4: Formiato de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-valil-N-(3-carboxipropil)-L-lisinamidaProcess 4: N - [(9H-fluoren-9-ylmethoxy) carbonyl] -L-valyl-N- (3-carboxypropyl) -L-lysinamide
Al compuesto (0,363 mg, 0,512 mmol) obtenido en el proceso 3 anterior, se añadió ácido fórmico (10,0 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. El disolvente se retiró a presión reducida para producir el compuesto del título. El compuesto se usó para la siguiente reacción sin purificación adicional.To the compound (0.363 mg, 0.512 mmol) obtained in the above process 3, formic acid (10.0 ml) was added and stirred at room temperature for 4 hours. The solvent was removed under reduced pressure to produce the title compound. The compound was used for the next reaction without further purification.
Proceso 5: N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-valil-N6-(terc-butoxicarbonil)-N-(3-carboxipropil)-L-lisinamidaProcess 5: N - [(9H-fluoren-9-ylmethoxy) carbonyl] -L-Valyl-N6- (tert-butoxycarbonyl) -N- (3-carboxypropyl) -L-lysinamide
A una suspensión de 1,4-dioxano (5,00 ml) del compuesto (0,512 mmol) obtenido en el proceso 4 anterior, se añadieron una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato sódico (20,0 ml) y dicarbonato de di-terc-butilo (0,178 ml, 0,769 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La solución de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con una solución acuosa de ácido cítrico al 10 % y salmuera saturada, y entonces la capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. El disolvente se retiró a presión reducida para producir el compuesto del título en forma de un sólido incoloro (0,295 g, 88 %).To a suspension of 1,4-dioxane (5.00 ml) of the compound (0.512 mmol) obtained in process 4 above, a saturated aqueous solution of sodium hydrogen carbonate (20.0 ml) and di-tert-dicarbonate were added butyl (0.178 ml, 0.769 mmol) and stirred at room temperature for 3 hours. The reaction solution was diluted with ethyl acetate and washed with a 10% aqueous citric acid solution and saturated brine, and then the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate. The solvent was removed under reduced pressure to produce the title compound as a colorless solid (0.295 g, 88%).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,84 (6H, t, J = 6,7 Hz), 1,13-1,39 (4H, m), 1,35 (9H, s), 1,48-1,62 (4H, m), 1,912,04 (1H, m), 2,20 (2H, t, J = 7,3 Hz), 2,80-2,89 (2H, m), 2,99-3,11 (2H, m), 3,87 (1H, dd, J = 8,5, 6,7 Hz), 4,06-4,35 (4H, m), 6,71 (1H, t, J = 6,0 Hz), 7,32 (2H, t, J = 7,6 Hz), 7,39-7,46 (3H, m), 7,74 (2H, t, J = 7,6 Hz), 7,83-7,94 (4H, m).1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0.84 (6H, t, J = 6.7 Hz), 1.13-1.39 (4H, m), 1.35 (9H, s), 1.48-1.62 (4H, m), 1,912.04 (1H, m), 2.20 (2H, t, J = 7.3 Hz), 2.80-2.89 (2H, m) , 2.99-3.11 (2H, m), 3.87 (1H, dd, J = 8.5, 6.7 Hz), 4.06-4.35 (4H, m), 6.71 (1H, t, J = 6.0 Hz), 7.32 (2H, t, J = 7.6 Hz), 7.39-7.46 (3H, m), 7.74 (2H, t, J = 7.6 Hz), 7.83-7.94 (4H, m).
EM (IEN) m/z: 653 (M+H)+MS (ESI) m / z: 653 (M + H) +
Proceso 6: N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-valil-N6-(terc-butoxicarbonil)-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-Process 6: N - [(9H-fluoren-9-ylmethoxy) carbonyl] -L-valyl-N6- (tert-butoxycarbonyl) -N- (4 - {[(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro -9-hydroxy-4-
metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] amino} -4-
oxobutil)-L-lisinamidaoxobutyl) -L-lysinamide
Mesilato del compuesto (4) (0,240 g, 0,452 mmol) se hizo reaccionar de la misma forma que en el proceso 1 del Ejemplo 1 usando el compuesto (0,295 g, 0,452 mmol) obtenido en el proceso 5 anterior en lugar de ácido 4-(terc- butoxicarbonilamino)butanoico para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color naranja pálido (0,208 g, 43 %).Mesylate of compound (4) (0.240 g, 0.452 mmol) was reacted in the same manner as in process 1 of Example 1 using the compound (0.295 g, 0.452 mmol) obtained in process 5 above instead of acid 4- (tert-butoxycarbonylamino) butanoic acid to produce the title compound as a pale orange solid (0.208 g, 43%).
EM (IEN) m/z: 1071 (M+H)+MS (ESI) m / z: 1071 (M + H) +
Proceso 7: L-Valil-N6-(terc-butoxicarbonil)-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)-L-lisinamidaProcess 7: L-Valyl-N6- (tert-butoxycarbonyl) -N- (4 - {[(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] amino} -4-oxobutyl) -L-lysinamide
El compuesto (0,208 g, 0,194 mmol) obtenido en el proceso 6 anterior se hizo reaccionar de la misma forma que en el proceso 2 para producir una mezcla que contiene el compuesto del título. La mezcla se usó para la siguiente reacción sin purificación adicional.The compound (0.208 g, 0.194 mmol) obtained in process 6 above was reacted in the same manner as in process 2 to produce a mixture containing the title compound. The mixture was used for the next reaction without further purification.
Proceso 8: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-valil-N6-(terc-butoxicarbonil)-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-Process 8: N- [6- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoyl] -L-valyl-N6- (tert-butoxycarbonyl) -N- (4- { [(1S, 9S) -9-ethyl-5-
fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-
b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)-L-lisinamidab] quinolin-1-yl] amino} -4-oxobutyl) -L-lysinamide
La mezcla (0,194 mmol) obtenida en el proceso 7 anterior se hizo reaccionar de la misma forma que en el proceso 3 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,133 g, 56 %). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,77 (6H, t, J = 5,7 Hz), 0,87 (3H, t, J = 7,3 Hz), 1,14-1,71 (10H, m), 1,35 (9H, s), 1,77-1,95 (3H, m), 2,02-2,23 (7H, m), 2,40 (3H, s), 2,84 (3H, c, J = 6,4 Hz), 3,05 (2H, d, J = 6,7 Hz), 3,17 (2H, s), 3,26-3,39 (3H, m), 4,01-4,16 (2H, m), 5,15 (1H, d, J = 18,7 Hz), 5,24 (1H, d, J = 18,7 Hz), 5,36-5,48 (2H, m), 5,515,60 (1H, m), 6,52 (1H, s), 6,72 (1H, t, J = 6,0 Hz), 6,99 (2H, s), 7,31 (1H, s), 7,71-7,85 (5H, m), 8,41 (1H, d, J = 9,1 Hz).The mixture (0.194 mmol) obtained in the above process 7 was reacted in the same manner as in the process 3 of Example 2 to produce the title compound as a pale yellow solid (0.133 g, 56%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0.77 (6H, t, J = 5.7 Hz), 0.87 (3H, t, J = 7.3 Hz), 1.14-1, 71 (10H, m), 1.35 (9H, s), 1.77-1.95 (3H, m), 2.02-2.23 (7H, m), 2.40 (3H, s) , 2.84 (3H, c, J = 6.4 Hz), 3.05 (2H, d, J = 6.7 Hz), 3.17 (2H, s), 3.26-3.39 ( 3H, m), 4.01-4.16 (2H, m), 5.15 (1H, d, J = 18.7 Hz), 5.24 (1H, d, J = 18.7 Hz), 5.36-5.48 (2H, m), 5,515.60 (1H, m), 6.52 (1H, s), 6.72 (1H, t, J = 6.0 Hz), 6.99 (2H, s), 7.31 (1H, s), 7.71-7.85 (5H, m), 8.41 (1H, d, J = 9.1 Hz).
EM (IEN) m/z: 1041 (M+H)+MS (ESI) m / z: 1041 (M + H) +
Proceso 9: Trifluoroacetato de N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-valil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-Process 9: N- [6- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoyl] -L-valyl-N- (4 - {[(1S, 9S)) trifluoroacetate -9-ethyl-5-fluoro-
9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [ 1,2-b] quinolin-1-
il]aminol-4-oxobutil)-L-lisinamidail] aminol-4-oxobutyl) -L-lysinamide
A una solución de diclorometano (10,0 ml) del compuesto (0,110 mg, 0,106 mmol) obtenido en el proceso 8 anterior, se añadió ácido trifluoroacético (4,00 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. El disolvente se retiró aTo a dichloromethane solution (10.0 ml) of the compound (0.115 mg, 0.106 mmol) obtained in the above process 8, trifluoroacetic acid (4.00 ml) was added and stirred at room temperature for 5 hours. The solvent was removed at
55
1010
15fifteen
20twenty
2525
3030
3535
presión reducida para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (70,0 mg, 64 %). RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 5: 0,76-0,81 (6H, m), 0,87 (3H, t, J = 7,3 Hz), 1,12-1,31 (4H, m), 1,39-1,56 (8H, m), 1,57-1,74 (3H, m), 1,79-1,96 (3H, m), 2,06-2,18 (7H, m), 2,40 (3H, s), 2,70-2,80 (2H, m), 3,01-3,10 (2H, m), 3,13-3,22 (2H, m), 4,04 (1H, t, J = 7,6 Hz), 4,10-4,20 (1H, m), 5,15 (1H, d, J = 18,7 Hz), 5,24 (1H, d, J = 18,7 Hz), 5,36-5,47 (2H, m), 5,52-5,60 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,00 (2H, s), 7,32 (1H, s), 7,61 (3H, s a), 7,75-7,88 (4H, m), 8,43 (1H, d, J = 8,5 Hz). EM (IEN) m/z: 941 (M+H)+reduced pressure to produce the title compound as a pale yellow solid (70.0 mg, 64%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-da) 5: 0.76-0.81 (6H, m), 0.87 (3H, t, J = 7.3 Hz), 1.12-1.31 (4H , m), 1.39-1.56 (8H, m), 1.57-1.74 (3H, m), 1.79-1.96 (3H, m), 2.06-2.18 (7H, m), 2.40 (3H, s), 2.70-2.80 (2H, m), 3.01-3.10 (2H, m), 3.13-3.22 (2H , m), 4.04 (1H, t, J = 7.6 Hz), 4.10-4.20 (1H, m), 5.15 (1H, d, J = 18.7 Hz), 5 , 24 (1H, d, J = 18.7 Hz), 5.36-5.47 (2H, m), 5.52-5.60 (1H, m), 6.53 (1H, s), 7.00 (2H, s), 7.32 (1H, s), 7.61 (3H, sa), 7.75-7.88 (4H, m), 8.43 (1H, d, J = 8.5 Hz). MS (ESI) m / z: 941 (M + H) +
Proceso 10: Conjugado de anticuerpo - fármaco (33)Process 10: Antibody-drug conjugate (33)
Usando el anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 y el compuesto obtenido en el proceso 9 anterior, el conjugado de anticuerpo - fármaco del título se obtuvo de la misma forma que en el proceso 2 del Ejemplo 29. Concentración de anticuerpo: 12,0 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,4 mg (67%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,2.Using the M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 and the compound obtained in process 9 above, the antibody-drug title conjugate was obtained in the same manner as in process 2 of Example 29. Concentration of antibody: 12.0 mg / ml, antibody yield: 8.4 mg (67%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.2.
Ejemplo 35 Conjugado de anticuerpo - fármaco (34)Example 35 Antibody-drug conjugate (34)
[Fórmula 104][Formula 104]
Proceso 1: N-(3-sulfanilpropanoil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-Process 1: N- (3-sulfanylpropanoyl) glycylglycyl-L-phenylalanyl-N- (4 - {[(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo -
2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] amino} -4-oxobutyl) glycinamide
El compuesto (84,0 mg, 0,100 mmol) obtenido en el proceso 2 del Ejemplo 2 se hizo reaccionar de la misma forma que en el proceso 3 del Ejemplo 2 usando N-succinimidil 3-mercaptopropionato en lugar de hexanoato de N- succinimidil 6-maleimida para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (61,2 mg, 66 %).The compound (84.0 mg, 0.100 mmol) obtained in process 2 of Example 2 was reacted in the same manner as in process 3 of Example 2 using N-succinimidyl 3-mercaptopropionate instead of N-succinimidyl hexanoate 6 -maleimide to produce the title compound as a pale yellow solid (61.2 mg, 66%).
RMN 1H (DMSO-Da) 5: 0,87 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,77-1,66 (2H, m), 1,79-1,92 (2H, m), 2,07-2,24 (4H, m), 2,31-2,47 (3H, m), 2,40 (3H, s), 2,59-2,69 (2H, m), 2,78 (1H, dd, J = 13,7, 9,8 Hz), 2,98-3,13 (3H, m), 3,14-3,23 (2H, m), 3,543,79 (6H, m), 4,40-4,50 (1H, m), 5,20 (2H, dd, J = 36,8, 19,2 Hz), 5,36-5,47 (2H, m), 5,52-5,63 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,14-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,68-7,74 (1H, m), 7,80 (1H, d, J = 10,9 Hz), 8,03-8,09 (1H, m), 8,13 (1H, d, J = 7,8 Hz), 8,19-8,29 (2H, m), 8,46 (1H, d, J = 8,6 Hz).1H NMR (DMSO-Da) 5: 0.87 (3H, t, J = 7.4 Hz), 1.77-1.66 (2H, m), 1.79-1.92 (2H, m) , 2.07-2.24 (4H, m), 2.31-2.47 (3H, m), 2.40 (3H, s), 2.59-2.69 (2H, m), 2 , 78 (1H, dd, J = 13.7, 9.8 Hz), 2.98-3.13 (3H, m), 3.14-3.23 (2H, m), 3,543.79 (6H , m), 4.40-4.50 (1H, m), 5.20 (2H, dd, J = 36.8, 19.2 Hz), 5.36-5.47 (2H, m), 5.52-5.63 (1H, m), 6.54 (1H, s), 7.14-7.28 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.68-7, 74 (1H, m), 7.80 (1H, d, J = 10.9 Hz), 8.03-8.09 (1H, m), 8.13 (1H, d, J = 7.8 Hz ), 8.19-8.29 (2H, m), 8.46 (1H, d, J = 8.6 Hz).
EM (IEN) m/z: 927 (M+H)+MS (ESI) m / z: 927 (M + H) +
Proceso 2: Conjugado de anticuerpo - fármaco (34)Process 2: Antibody-drug conjugate (34)
Derivatización con SMCC de anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 20 mg/ml sustituyendo el medio con PBS6,5/EDTA usando el procedimiento común C-2 y el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,61 mlmg- 1cm-1). La solución (0,25 ml) se puso en un tubo de 1,5 ml, se cargó con una solución de DMSO (0,0063 ml; que se corresponde con aproximadamente 2,55 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contiene succinimidil-4-(N- maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato 27,6 mM (SMCC, Thermo Fisher Scientific Inc.) a temperatura ambiente, y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas. Esta solución de reacción se sometió a purificación usando el procedimiento común D-2 para producir 0,7 ml de una solución que contiene aproximadamente 5 mg del anticuerpo derivatizado con SMCC. Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir DMSO (0,045 ml) y una solución de DMSO que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 1 (0,015 ml; que se corresponde con aproximadamente 2,4 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior aDerivatization with SMCC antibody: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have an antibody concentration of 20 mg / ml by replacing the medium with PBS6.5 / EDTA using the common procedure C-2 and the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mlmg-1cm-1 was used). The solution (0.25 ml) was placed in a 1.5 ml tube, loaded with a DMSO solution (0.0063 ml; corresponding to approximately 2.55 equivalents per antibody molecule) containing succinimidyl- 4- (N-Maleimidomethyl) 27.6 mM cyclohexane-1-carboxylate (SMCC, Thermo Fisher Scientific Inc.) at room temperature, and reacted at room temperature for 2 hours. This reaction solution was subjected to purification using the common D-2 procedure to produce 0.7 ml of a solution containing approximately 5 mg of the SMCC derivatized antibody. Conjugation between antibody and drug linker: After adding DMSO (0.045 ml) and a DMSO solution containing 10 mM of the compound obtained in process 1 (0.015 ml; which corresponds to approximately 2.4 equivalents per antibody molecule) to the solution before
temperatura ambiente, esta se agitó usando un rotador de tubos (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 16 horas.room temperature was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug linker with the antibody at room temperature for 16 hours.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) para producir 3,5 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título. 5 Después de esto, la solución se concentró mediante el procedimiento común A.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as a buffer solution) to produce 3.5 ml of a solution containing the antibody-title drug conjugate. 5 After this, the solution was concentrated by common procedure A.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,28o = 235300 (valor de cálculo estimado), £A,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £D,280 = 5000 (valor promedio medido) y £d,37o = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.Physicochemical characterization: Using the common procedure E (as molar absorption coefficient, £ a, 28o = 235300 (estimated calculation value), £ A, 370 = 0 (estimated calculation value), £ D, 280 = 5000 ( average value measured) and £ d, 37o = 19000 (average value measured)), the following characteristic values were obtained.
Concentración de anticuerpo: 3,85 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 0,8 mg (16%), y número promedio de 10 moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 2,9.Antibody concentration: 3.85 mg / ml, antibody yield: 0.8 mg (16%), and average number of 10 conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 2.9.
Ejemplo 36 Conjugado de anticuerpo - fármaco (35)Example 36 Antibody-drug conjugate (35)
[Fórmula 105][Formula 105]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (35)Process 1: Antibody-drug conjugate (35)
Derivatización con SMCC de anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 20 mg/ml sustituyendo el medio con PBS6,5/EDTA usando el 15 procedimiento común C-2 y el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,61 mlmg" 1cm-1). La solución (0,25 ml) se puso en un tubo de 1,5 ml, se cargó con una solución de DMSO (0,0125 ml; que se corresponde con aproximadamente 5,1 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contiene succinimidil-4-(N- maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato 27,6 mM (SMCC, Thermo Fisher Scientific Inc.) a temperatura ambiente, y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas. Esta solución de reacción se sometió a purificación 20 usando el procedimiento común D-2 para producir 0,7 ml de una solución que contiene aproximadamente 5 mg del anticuerpo derivatizado con SMCC.Derivatization with SMCC antibody: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have an antibody concentration of 20 mg / ml by replacing the medium with PBS6.5 / EDTA using the common procedure C-2 and the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mlmg "1cm-1) was used. The solution (0.25 ml) was placed in a 1.5 ml tube, loaded with a solution DMSO (0.0125 ml; corresponding to approximately 5.1 equivalents per antibody molecule) containing 27.6 mM succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC, Thermo Fisher Scientific Inc. ) at room temperature, and was reacted at room temperature for 2 hours This reaction solution was subjected to purification using the common D-2 procedure to produce 0.7 ml of a solution containing approximately 5 mg of the antibody derivatized with SMCC
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir DMSO (0,03 ml) y una solución de DMSO que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 1 del Ejemplo 35 (0,03 ml; que se corresponde con aproximadamente 4,8 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, esta 25 se agitó usando un rotador de tubos (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 16 horas.Conjugation between antibody and drug linker: After adding DMSO (0.03 ml) and a DMSO solution containing 10 mM of the compound obtained in process 1 of Example 35 (0.03 ml; corresponding to approximately 4, 8 equivalents per antibody molecule) to the above solution at room temperature, this was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug linker with the antibody at room temperature for 16 hours .
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) para producir 3,5 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título. Después de esto, la solución se concentró mediante el procedimiento común A.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as a buffer solution) to produce 3.5 ml of a solution containing the antibody-title drug conjugate. After this, the solution was concentrated by common procedure A.
30 Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,28o = 235300 (valor de cálculo estimado), £Aj370 = 0 (valor de cálculo estimado), £Dj280 = 50 00 (valor promedio medido) y £D370 = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.30 Physicochemical characterization: Using the common procedure E (as molar absorption coefficient, £ a, 28o = 235300 (estimated calculation value), £ Aj370 = 0 (estimated calculation value), £ Dj280 = 50 00 (average value) measured) and £ D370 = 19000 (average measured value)), the following characteristic values were obtained.
Concentración de anticuerpo: 2,43 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 0,5 mg (10%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 4,2.Antibody concentration: 2.43 mg / ml, antibody yield: 0.5 mg (10%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 4.2.
Ejemplo 37 Conjugado de anticuerpo - fármaco (36)Example 37 Antibody-drug conjugate (36)
[Fórmula 106][Formula 106]
Proceso 1: N-{8-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]-8-oxooctanoil}glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- 5 hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3’,4’:6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-Process 1: N- {8 - [(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) oxy] -8-oxooctanoyl} glycylglycyl-L-phenylalanyl-N- (4 - {[(1S, 9S) -9-ethyl- 5-fluoro-9- 5 hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6 , 7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-
il]amino}-4-oxobutil)glicinamidail] amino} -4-oxobutyl) glycinamide
El compuesto (84,0 mg, 0,100 mmol) obtenido en el proceso 2 del Ejemplo 2 se hizo reaccionar de la misma forma que en el proceso 3 del Ejemplo 2 usando suberato de di(N-succinimidilo) en lugar de hexanoato de N-succinimidil 6- maleimida para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (77,1 mg, 71 %).The compound (84.0 mg, 0.100 mmol) obtained in process 2 of Example 2 was reacted in the same manner as in process 3 of Example 2 using di (N-succinimidyl) suberate instead of N- hexanoate succinimidyl 6- maleimide to produce the title compound as a pale yellow solid (77.1 mg, 71%).
10 RMN 1H (DMSO-De) 6: 0,87 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,21-1,38 (4H, m), 1,43-1,50 (2H, m), 1,55-1,63 (2H, m), 1,68-1,76 (2H, m), 1,80-1,91 (2H, m), 2,07-2,22 (6H, m), 2,40 (3H, s), 2,60-2,67 (2H, m), 2,76-2,84 (5H, m), 2,97-3,22 (5H, m), 3,56-3,76 (6H, m), 4,40-4,50 (1H, m), 5,20 (2H, c, J = 18,8 Hz), 5,37-5,48 (2H, m), 5,53-5,62 (1H, m), 6,54 (1H, s),10 1 H NMR (DMSO-De) 6: 0.87 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.21-1.38 (4H, m), 1.43-1.50 (2H, m ), 1.55-1.63 (2H, m), 1.68-1.76 (2H, m), 1.80-1.91 (2H, m), 2.07-2.22 (6H , m), 2.40 (3H, s), 2.60-2.67 (2H, m), 2.76-2.84 (5H, m), 2.97-3.22 (5H, m ), 3.56-3.76 (6H, m), 4.40-4.50 (1H, m), 5.20 (2H, c, J = 18.8 Hz), 5.37-5, 48 (2H, m), 5.53-5.62 (1H, m), 6.54 (1H, s),
7,15-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,71 (1H, t, J = 5,5 Hz), 7,80 (1H, d, J = 10,9 Hz), 8,04 (1H, t, J = 5,9 Hz), 8,09 (1H, t, J = 5,9 Hz), 8,14 (1H, d, J = 7,8 Hz), 8,26 (1H, t, J = 5,9 Hz), 8,47 (1H, d, J = 8,6 Hz).7.15-7.28 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.71 (1H, t, J = 5.5 Hz), 7.80 (1H, d, J = 10, 9 Hz), 8.04 (1H, t, J = 5.9 Hz), 8.09 (1H, t, J = 5.9 Hz), 8.14 (1H, d, J = 7.8 Hz ), 8.26 (1H, t, J = 5.9 Hz), 8.47 (1H, d, J = 8.6 Hz).
15 EM (IEN) m/z: 1092 (M+H)+15 MS (ESI) m / z: 1092 (M + H) +
Proceso 2: Conjugado de anticuerpo - fármaco (36)Process 2: Antibody-drug conjugate (36)
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 20 mg/ml sustituyendo el medio con PBS6,5/EDTA usando el procedimiento común C-2 y el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 20 280 nm, se usó 1,61 mlmg"1cm"1). La solución (0,25 ml) se puso en un tubo de 1,5 ml, se cargó con una solución deConjugation between antibody and drug linker: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have an antibody concentration of 20 mg / ml by replacing the medium with PBS6.5 / EDTA using the common procedure C- 2 and the common procedure B (as absorption coefficient at 20 280 nm, 1.61 mlmg "1cm" 1 was used). The solution (0.25 ml) was placed in a 1.5 ml tube, loaded with a solution of
DMSO que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 1 anterior (0,025 ml; que se corresponde con aproximadamente 3,7 equivalentes por molécula de anticuerpo) a temperatura ambiente, y se agitó usando un rotador de tubos (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 16 horas. Purificación: La solución anterior se sometió a purificaciónDMSO containing 10 mM of the compound obtained in the above process 1 (0.025 ml; corresponding to approximately 3.7 equivalents per antibody molecule) at room temperature, and stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug linker with the antibody at room temperature for 16 hours. Purification: The above solution was subjected to purification
55
1010
15fifteen
20twenty
2525
usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) para producir 3,5 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título. Después de esto, la solución se concentró mediante el procedimiento común A.using the common D-1 procedure (ABS was used as a buffer solution) to produce 3.5 ml of a solution containing the antibody-title drug conjugate. After this, the solution was concentrated by common procedure A.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), £a,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 5000 (valor promedio medido) y £D,370 = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.Physicochemical characterization: Using the common procedure E (as molar absorption coefficient, £ a, 280 = 235300 (estimated calculation value), £ a, 370 = 0 (estimated calculation value), £ d, 280 = 5000 ( average value measured) and £ D, 370 = 19000 (average value measured)), the following characteristic values were obtained.
Concentración de anticuerpo: 6,25 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 1,3 mg (26%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,2.Antibody concentration: 6.25 mg / ml, antibody yield: 1.3 mg (26%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.2.
Ejemplo 38 Conjugado de anticuerpo - fármaco (37)Example 38 Antibody-drug conjugate (37)
[Fórmula 107][Formula 107]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (37)Process 1: Antibody-drug conjugate (37)
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 20 mg/ml sustituyendo el medio con PBS6,5/EDTA usando el procedimiento común C-2 y el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,61 mlmg-1cm-1). La solución (0,5 ml) se puso en un tubo de 1,5 ml, a continuación se cargó con una solución de DMSO que contiene DMSO (0,025 ml) y 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 1 del Ejemplo 37 (0,025 ml; que se corresponde con aproximadamente 7,4 equivalentes por molécula de anticuerpo) a temperatura ambiente, y se agitó usando un rotador de tubos (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 16 horas.Conjugation between antibody and drug linker: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have an antibody concentration of 20 mg / ml by replacing the medium with PBS6.5 / EDTA using the common procedure C- 2 and the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mlmg-1cm-1 was used). The solution (0.5 ml) was placed in a 1.5 ml tube, then loaded with a DMSO solution containing DMSO (0.025 ml) and 10 mM of the compound obtained in process 1 of Example 37 (0.025 ml; which corresponds to approximately 7.4 equivalents per antibody molecule) at room temperature, and was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug linker with the antibody at temperature ambient for 16 hours.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) para producir 3,5 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título. Después de esto, la solución se concentró mediante el procedimiento común A.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as a buffer solution) to produce 3.5 ml of a solution containing the antibody-title drug conjugate. After this, the solution was concentrated by common procedure A.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), £a,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 5000 (valor promedio medido) y £d,370 = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.Physicochemical characterization: Using the common procedure E (as molar absorption coefficient, £ a, 280 = 235300 (estimated calculation value), £ a, 370 = 0 (estimated calculation value), £ d, 280 = 5000 ( average value measured) and £ d, 370 = 19000 (average value measured)), the following characteristic values were obtained.
Concentración de anticuerpo: 4,36 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 0,9 mg (18%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 4,1.Antibody concentration: 4.36 mg / ml, antibody yield: 0.9 mg (18%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 4.1.
[Fórmula 108][Formula 108]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (38)Process 1: Antibody-drug conjugate (38)
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: El anticuerpo anti-CD30 producido en el Ejemplo de Referencia 3 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml sustituyendo el medio con 5 PBS6,5/EDTA usando el procedimiento común C-2 y el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,75 mlmg-1cm-1). La solución (0,4 ml, 4 mg del anticuerpo) se puso en un tubo de 1,5 ml, a continuación se cargó con DMSO (0,017 ml) y una solución de DMSO que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 1 del Ejemplo 37 (0,023 ml; que se corresponde con 9 equivalentes por molécula de anticuerpo) a temperatura ambiente, y se agitó usando un rotador de tubos (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para 10 conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 4 horas.Conjugation between antibody and drug linker: The anti-CD30 antibody produced in Reference Example 3 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml by replacing the medium with 5 PBS6.5 / EDTA using the common C-2 procedure. and the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.75 mlmg-1cm-1 was used). The solution (0.4 ml, 4 mg of the antibody) was placed in a 1.5 ml tube, then loaded with DMSO (0.017 ml) and a DMSO solution containing 10 mM of the compound obtained in process 1 of Example 37 (0.023 ml; corresponding to 9 equivalents per antibody molecule) at room temperature, and stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug linker with the antibody at room temperature for 4 hours.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) para producir 2,5 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título. Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,280 = 270400 (valor de cálculo estimado), £a,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 2670 (valor medido) y £d,370 15 = 15820 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 0,55Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as a buffer solution) to produce 2.5 ml of a solution containing the antibody-title drug conjugate. Physicochemical characterization: Using the common procedure E (as molar absorption coefficient, £ a, 280 = 270400 (estimated calculation value), £ a, 370 = 0 (estimated calculation value), £ d, 280 = 2670 ( measured value) and £ d, 370 15 = 15820 (measured value)), the following characteristic values were obtained. Antibody concentration: 0.55
mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 1,4 mg (34%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 2,7.mg / ml, antibody yield: 1.4 mg (34%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 2.7.
[Fórmula 109][Formula 109]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (39)Process 1: Antibody-drug conjugate (39)
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: El anticuerpo anti-CD33 producido en el Ejemplo de Referencia 4 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml sustituyendo el medio con 5 PBS6,5/EDTA usando el procedimiento común C-2 y el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,66 mlmg-1cm-1). La solución (0,4 ml, 4 mg del anticuerpo) se puso en un tubo de 1,5 ml, a continuación se cargó con DMSO (0,017 ml) y una solución de DMSO que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 1 del Ejemplo 37 (0,023 ml; que se corresponde con 9 equivalentes por molécula de anticuerpo) a temperatura ambiente, y se agitó usando un rotador de tubos (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para 10 conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 4 horas.Conjugation between antibody and drug linker: The anti-CD33 antibody produced in Reference Example 4 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml by replacing the medium with 5 PBS6.5 / EDTA using the common C-2 procedure. and the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.66 mlmg-1cm-1 was used). The solution (0.4 ml, 4 mg of the antibody) was placed in a 1.5 ml tube, then loaded with DMSO (0.017 ml) and a DMSO solution containing 10 mM of the compound obtained in process 1 of Example 37 (0.023 ml; corresponding to 9 equivalents per antibody molecule) at room temperature, and stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug linker with the antibody at room temperature for 4 hours.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) para producir 2,5 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título. Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,280 = 256400 (valor de cálculo estimado), £a,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 2670 (valor medido) y £d,370 15 = 15820 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 0,93Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as a buffer solution) to produce 2.5 ml of a solution containing the antibody-title drug conjugate. Physicochemical characterization: Using the common procedure E (as molar absorption coefficient, £ a, 280 = 256400 (estimated calculation value), £ a, 370 = 0 (estimated calculation value), £ d, 280 = 2670 ( measured value) and £ d, 370 15 = 15820 (measured value)), the following characteristic values were obtained. Antibody concentration: 0.93
mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 2,3 mg (58 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 4,0.mg / ml, antibody yield: 2.3 mg (58%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 4.0.
[Fórmula 110][Formula 110]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (40)Process 1: Antibody-drug conjugate (40)
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: El anticuerpo anti-CD70 producido en el Ejemplo de Referencia 5 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml sustituyendo el medio con 5 PBS6,5/EDTA usando el procedimiento común C-2 y el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,69 mlmg-1cm-1). La solución (0,4 ml, 4 mg del anticuerpo) se puso en un tubo de 1,5 ml, a continuación se cargó con DMSO (0,017 ml) y una solución de DMSO que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 1 (0,023 ml; que se corresponde con 9 equivalentes por molécula de anticuerpo) del Ejemplo 37 a temperatura ambiente, y se agitó usando un rotador de tubos (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para 10 conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 4 horas.Conjugation between antibody and drug linker: The anti-CD70 antibody produced in Reference Example 5 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml by replacing the medium with 5 PBS6.5 / EDTA using the common method C-2 and the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.69 mlmg-1cm-1 was used). The solution (0.4 ml, 4 mg of the antibody) was placed in a 1.5 ml tube, then loaded with DMSO (0.017 ml) and a DMSO solution containing 10 mM of the compound obtained in process 1 (0.023 ml; corresponding to 9 equivalents per antibody molecule) of Example 37 at room temperature, and stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug linker with the antibody at room temperature for 4 hours.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) para producir 2,5 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título. Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,280 = 262400 (valor de cálculo estimado), £a,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 2670 (valor medido) y £d,370 15 = 15820 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 1,04Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as a buffer solution) to produce 2.5 ml of a solution containing the antibody-title drug conjugate. Physicochemical characterization: Using the common procedure E (as molar absorption coefficient, £ a, 280 = 262400 (estimated calculation value), £ a, 370 = 0 (estimated calculation value), £ d, 280 = 2670 ( measured value) and £ d, 370 15 = 15820 (measured value)), the following characteristic values were obtained. Antibody concentration: 1.04
mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 2,6 mg (65%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 4,1.mg / ml, antibody yield: 2.6 mg (65%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 4.1.
Ejemplo 42 2-(2-Aminoetoxi)-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro- 1H,12H-benzo[de]pirano[3’,4’:6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]acetamidaExample 42 2- (2-Aminoethoxy) -N - [(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13 , 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] acetamide
[Fórmula 111][Formula 111]
20 Proceso 1: [2-(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-Process 1: [2- (2 - {[(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13, 15-hexahydro-1H, 12H-
benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetoxi)etil]carbamato de terc-butilobenzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] amino} -2-oxoethoxy) ethyl] tert-butyl carbamate
Mesilato del compuesto (4) (3,10 g, 5,47 mol) se hizo reaccionar de la misma forma que en el proceso 1 del Ejemplo 1 usando ácido {2-[(terc-butoxicarbonil)amino]etoxi}acético (J. Med. Chem., 1992, vol. 35, págs. 2928) (1,55 g, 6,01 mmol) en lugar de ácido 4-(terc-butoxicarbonilamino)butanoico para producir el compuesto del título en forma de unMesylate of compound (4) (3.10 g, 5.47 mol) was reacted in the same manner as in process 1 of Example 1 using {2 - [(tert-butoxycarbonyl) amino] ethoxy} acetic acid (J Med. Chem., 1992, vol. 35, pp. 2928) (1.55 g, 6.01 mmol) instead of 4- (tert-butoxycarbonylamino) butanoic acid to produce the title compound as a
sólido de color amarillo pálido (2,56 g, 73 %). RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J = 7,3 Hz), 1,26 (9H, s), 1,81-1,91 (2H, m), 2,13-2,22 (2H, m), 2,40 (3H, s), 3,08-3,26 (4H, m), 3,43-3,53 (2H, m), 4,00 (1H, d, J = 15,1 Hz), 4,05 (1H, d, J = 15,1 Hz), 5,14 (1H, d, J = 18,7 Hz), 5,22 (1H, d, J = 18,7 Hz), 5,40 (1H, d, J = 16,6 Hz), 5,44 (1H, d, J = 16,6 Hz), 5,59-5,66 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,86 (1H, t, J = 5,4 Hz), 7,31 (1H, s), 7,79 (1H, d, J = 10,9 Hz), 8,49 (1H, 5 d, J = 9,1 Hz).pale yellow solid (2.56 g, 73%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-da) 8: 0.87 (3H, t, J = 7.3 Hz), 1.26 (9H, s), 1.81-1.91 (2H, m), 2.13-2.22 (2H, m), 2.40 (3H, s), 3.08-3.26 (4H, m), 3.43-3.53 (2H, m), 4, 00 (1H, d, J = 15.1 Hz), 4.05 (1H, d, J = 15.1 Hz), 5.14 (1H, d, J = 18.7 Hz), 5.22 ( 1H, d, J = 18.7 Hz), 5.40 (1H, d, J = 16.6 Hz), 5.44 (1H, d, J = 16.6 Hz), 5.59-5, 66 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.86 (1H, t, J = 5.4 Hz), 7.31 (1H, s), 7.79 (1H, d, J = 10.9 Hz), 8.49 (1H, 5 d, J = 9.1 Hz).
EM (APCI) m/z: 637 (M+H)+MS (APCI) m / z: 637 (M + H) +
Proceso 2: 2-(2-Aminoetoxi)-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-Process 2: 2- (2-Aminoethoxy) -N - [(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10, 13,15-hexahydro-
1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]acetamida1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] acetamide
El compuesto (1,50 g, 2,36 mol) obtenido en el proceso 1 anterior se hizo reaccionar de la misma forma que en el 10 proceso 2 del Ejemplo 1 para producir trifluoroclorhidrato del compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (1,50 g, cuantitativo). Este compuesto se confirmó en el tumor de un ratón portador de cáncer que recibió el conjugado de anticuerpo - fármaco (41). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J = 7,5 Hz), 1,811,92 (2H, m), 2,15-2,23 (2H, m), 2,41 (3H, s), 3,05 (2H, t, J = 5,1 Hz), 3,15-3,23 (2H, m), 3,71 (2H, t, J = 5,1 Hz), 4,10 (2H, s), 5,19 (1H, d, J = 18,7 Hz), 5,24 (1H, d, J = 18,7 Hz), 5,43 (2H, s), 5,58-5,66 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,33 (1H, s), 15 7,73-7,84 (4H, m), 8,55 (1H, d, J = 9,1 Hz).The compound (1.50 g, 2.36 mol) obtained in process 1 above was reacted in the same manner as in process 2 of Example 1 to produce trifluorohydrochloride of the title compound as a yellow solid. pale (1.50 g, quantitative). This compound was confirmed in the tumor of a cancer-bearing mouse that received the antibody-drug conjugate (41). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0.87 (3H, t, J = 7.5 Hz), 1,811.92 (2H, m), 2.15-2.23 (2H, m), 2.41 (3H, s), 3.05 (2H, t, J = 5.1 Hz), 3.15-3.23 (2H, m), 3.71 (2H, t, J = 5, 1 Hz), 4.10 (2H, s), 5.19 (1H, d, J = 18.7 Hz), 5.24 (1H, d, J = 18.7 Hz), 5.43 (2H , s), 5.58-5.66 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.33 (1H, s), 15.73-7.84 (4H, m), 8 , 55 (1H, d, J = 9.1 Hz).
EM (APCI) m/z: 537 (M+H)+MS (APCI) m / z: 537 (M + H) +
Ejemplo 43 Conjugado de anticuerpo - fármaco (41)Example 43 Antibody-drug conjugate (41)
[Fórmula 112][Formula 112]
Proceso 1: N-(terc-butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-[2-(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-Process 1: N- (tert-butoxycarbonyl) glycylglycyl-L-phenylalanyl-N- [2- (2 - {[(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-
2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]aminol-2- 20 oxoetoxi)etilglicinamida2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] aminol- 2- 20 oxoethoxy) ethylglycineamide
El compuesto (554 mg, 0,85 mmol) del Ejemplo 42 se hizo reaccionar de la misma forma que en el proceso 1 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título (775 mg, 95 %).The compound (554 mg, 0.85 mmol) of Example 42 was reacted in the same manner as in process 1 of Example 2 to produce the title compound (775 mg, 95%).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,85 (3H, t, J = 7,3 Hz), 1,36 (9H, s), 1,78-1,89 (2H, m), 2,13-2,22 (2H, m), 2,39 (3H, s), 2,71 (1H, dd, J = 13,4, 9,8 Hz), 2,95 (1H, dd, J = 13,4, 4,3 Hz), 3,09-3,23 (1H, m), 3,23-3,32 (2H, m), 3,4025 3,62 (8H, m), 3,73 (1H, dd, J = 16,5, 5,5 Hz), 4,03 (2H, s), 4,39-4,47 (1H, m), 5,17 (1H, d, J = 18,9 Hz), 5,25 (1H, d, J1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0.85 (3H, t, J = 7.3 Hz), 1.36 (9H, s), 1.78-1.89 (2H, m), 2.13-2.22 (2H, m), 2.39 (3H, s), 2.71 (1H, dd, J = 13.4, 9.8 Hz), 2.95 (1H, dd, J = 13.4, 4.3 Hz), 3.09-3.23 (1H, m), 3.23-3.32 (2H, m), 3.4025 3.62 (8H, m), 3.73 (1H, dd, J = 16.5, 5.5 Hz), 4.03 (2H, s), 4.39-4.47 (1H, m), 5.17 (1H, d, J = 18.9 Hz), 5.25 (1H, d, J
= 18,9 Hz), 5,41 (1H, d, J = 16,8 Hz), 5,45 (1H, d, J = 16,8 Hz), 5,57-5,64 (1H, m), 6,54 (1H, s), 6,99 (1H, t, J = 5,8= 18.9 Hz), 5.41 (1H, d, J = 16.8 Hz), 5.45 (1H, d, J = 16.8 Hz), 5.57-5.64 (1H, m ), 6.54 (1H, s), 6.99 (1H, t, J = 5.8
55
1010
15fifteen
20twenty
2525
3030
3535
Hz), 7,13-7,26 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,76-7,82 (2H, m), 7,90 (1H, t, J = 5,2 Hz), 8,13 (1H, d, J = 7,9 Hz), 8,27 (1H, t, J = 5,8 Hz), 8,49 (1H, d, J = 8,5 Hz). EM (APCI) m/z: 955 (M+H)+Hz), 7.13-7.26 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.76-7.82 (2H, m), 7.90 (1H, t, J = 5, 2 Hz), 8.13 (1H, d, J = 7.9 Hz), 8.27 (1H, t, J = 5.8 Hz), 8.49 (1H, d, J = 8.5 Hz ). MS (APCI) m / z: 955 (M + H) +
Proceso 2: Trifluoroacetato de glicilglicil-L-fenilalanil-N-[2-(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-Process 2: Glycylglycyl-L-phenylalanyl-N- [2- (2 - {[(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-] trifluoroacetate
2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3’,4’:6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] amino} -2-
oxoetoxi)etil]glicinamidaoxoethoxy) ethyl] glycinamide
El compuesto (630 mg, 0,659 mmol) obtenido en el proceso 1 anterior se hizo reaccionar de la misma forma que en el proceso 2 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título (588 mg, 92%).The compound (630 mg, 0.659 mmol) obtained in process 1 above was reacted in the same manner as in process 2 of Example 2 to produce the title compound (588 mg, 92%).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 5: 0,86 (3H, t, J = 7,3 Hz), 1,79-1,90 (2H, m), 2,13-2,22 (2H, m), 2,39 (3H, s), 2,71 (1H, dd, J = 13,4, 10,1 Hz), 2,99 (1H, dd, J = 13,4, 4,3 Hz), 3,09-3,23 (1H, m), 3,24-3,32 (3H, m), 3,41-3,71 (7H, m), 3,86 (1H, dd, J = 16,8, 5,8 Hz), 4,04 (2H, s), 4,52 (1H, td, J = 9,0, 4,1 Hz), 5,17 (1H, d, J = 18,9 Hz), 5,25 (1H, d, J =1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 5: 0.86 (3H, t, J = 7.3 Hz), 1.79-1.90 (2H, m), 2.13-2.22 (2H , m), 2.39 (3H, s), 2.71 (1H, dd, J = 13.4, 10.1 Hz), 2.99 (1H, dd, J = 13.4, 4.3 Hz), 3.09-3.23 (1H, m), 3.24-3.32 (3H, m), 3.41-3.71 (7H, m), 3.86 (1H, dd, J = 16.8, 5.8 Hz), 4.04 (2H, s), 4.52 (1H, td, J = 9.0, 4.1 Hz), 5.17 (1H, d, J = 18.9 Hz), 5.25 (1H, d, J =
18.9 Hz), 5,41 (1H, d, J = 16,5 Hz), 5,45 (1H, d, J = 16,5 Hz), 5,56-5,65 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,13-7,26 (5H, m), 7,32 (1H, s), 7,80 (1H, d, J = 11,0 Hz), 7,87-8,01 (4H, m), 8,29-8,36 (2H, m), 8,46-8,55 (2H, m).18.9 Hz), 5.41 (1H, d, J = 16.5 Hz), 5.45 (1H, d, J = 16.5 Hz), 5.56-5.65 (1H, m), 6 , 55 (1H, s), 7.13-7.26 (5H, m), 7.32 (1H, s), 7.80 (1H, d, J = 11.0 Hz), 7.87- 8.01 (4H, m), 8.29-8.36 (2H, m), 8.46-8.55 (2H, m).
EM (APCI) m/z: 855 (M+H)+MS (APCI) m / z: 855 (M + H) +
Proceso 3: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1 -il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[2-(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-Process 3: N- [6- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoyl] glycylglycyl-L-phenylalanyl-N- [2- (2 - {[(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-
hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3’,4’:6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-
il]amino}-2-oxoetoxi)etil]glicinamidail] amino} -2-oxoethoxy) ethyl] glycinamide
El compuesto (240 mg, 0,247 mmol) obtenido en el proceso 2 anterior se hizo reaccionar de la misma forma que en el proceso 3 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título (162 mg, 62 %).The compound (240 mg, 0.247 mmol) obtained in process 2 above was reacted in the same manner as in process 3 of Example 2 to produce the title compound (162 mg, 62%).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 5: 0,86 (3H, t, J = 7,6 Hz), 1,13-1,22 (2H, m), 1,40-1,51 (4H, m), 1,78-1,90 (2H, m),1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 5: 0.86 (3H, t, J = 7.6 Hz), 1.13-1.22 (2H, m), 1.40-1.51 (4H , m), 1.78-1.90 (2H, m),
2.09 (2H, t, J = 7,6 Hz), 2,14-2,21 (2H, m), 2,39 (3H, s), 2,74 (1H, dd, J = 13,6, 9,7 Hz), 2,96 (1H, dd, J = 13,6, 4,5 Hz), 3,08-3,24 (1H, m), 3,24-3,30 (1H, m), 3,33-3,40 (4H, m), 3,47-3,68 (7H, m), 3,72 (1H, dd, J = 16,6, 5,7 Hz), 4,03 (2H, s), 4,42 (1H, td, J = 8,6, 4,2 Hz), 5,17 (1H, d, J = 18,7 Hz), 5,25 (1H, d, J = 18,7 Hz), 5,40 (1H, d, J = 17,2 Hz), 5,44 (1H, d, J = 17,2 Hz), 5,57-5,64 (1H, m), 6,52 (1H, s), 6. 99 (2H, s), 7,13-7,25 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,74-7,81 (2H, m), 7,99 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,03-8,11 (2H, m), 8,22 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,47 (1H, d, J = 9,1 Hz).2.09 (2H, t, J = 7.6 Hz), 2.14-2.21 (2H, m), 2.39 (3H, s), 2.74 (1H, dd, J = 13.6, 9.7 Hz), 2.96 (1H, dd, J = 13.6, 4.5 Hz), 3.08-3.24 (1H, m), 3.24-3.30 (1H, m ), 3.33-3.40 (4H, m), 3.47-3.68 (7H, m), 3.72 (1H, dd, J = 16.6, 5.7 Hz), 4, 03 (2H, s), 4.42 (1H, td, J = 8.6, 4.2 Hz), 5.17 (1H, d, J = 18.7 Hz), 5.25 (1H, d , J = 18.7 Hz), 5.40 (1H, d, J = 17.2 Hz), 5.44 (1H, d, J = 17.2 Hz), 5.57-5.64 (1H , m), 6.52 (1H, s), 6. 99 (2H, s), 7.13-7.25 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.74-7, 81 (2H, m), 7.99 (1H, t, J = 5.7 Hz), 8.03-8.11 (2H, m), 8.22 (1H, t, J = 5.7 Hz ), 8.47 (1H, d, J = 9.1 Hz).
EM (APCI) m/z: 1048 (M+H)+MS (APCI) m / z: 1048 (M + H) +
Proceso 4: Conjugado de anticuerpo - fármaco (41)Process 4: Antibody-drug conjugate (41)
Usando el anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 y el compuesto obtenido en el proceso 3 anterior, el conjugado de anticuerpo - fármaco del título se obtuvo de la misma forma que en el proceso 2 del Ejemplo 29. Concentración de anticuerpo: 12,0 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,4 mg (67%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,5.Using the M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 and the compound obtained in process 3 above, the antibody-drug title conjugate was obtained in the same manner as in process 2 of Example 29. Concentration of antibody: 12.0 mg / ml, antibody yield: 8.4 mg (67%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.5.
Ejemplo 44 Conjugado de anticuerpo - fármaco (42)Example 44 Antibody-drug conjugate (42)
[Fórmula 113][Formula 113]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (42)Process 1: Antibody-drug conjugate (42)
Usando el anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 y el compuesto obtenido en el proceso 3 del Ejemplo 43, el conjugado de anticuerpo - fármaco del título se obtuvo de la misma forma que en el proceso 1 del Ejemplo 5.Using the M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 and the compound obtained in process 3 of Example 43, the antibody-drug title conjugate was obtained in the same manner as in process 1 of Example 5.
Concentración de anticuerpo: 0,83 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 4,98 mg (40%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 7,2.Antibody concentration: 0.83 mg / ml, antibody yield: 4.98 mg (40%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 7.2.
[Fórmula 114][Formula 114]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (43)Process 1: Antibody-drug conjugate (43)
Usando el anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 y el compuesto obtenido en el proceso 3 del Ejemplo 43, el conjugado de anticuerpo - fármaco del título se obtuvo de la misma forma que en el proceso 1 del 5 Ejemplo 4. Concentración de anticuerpo: 1,06 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 6,36 mg (51%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,3.Using the M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 and the compound obtained in process 3 of Example 43, the antibody-drug title conjugate was obtained in the same manner as in process 1 of 5 Example 4 Antibody concentration: 1.06 mg / ml, antibody yield: 6.36 mg (51%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 6.3.
Ejemplo 46 Conjugado de anticuerpo - fármaco (44)Example 46 Antibody-drug conjugate (44)
[Fórmula 115][Formula 115]
Casi la totalidad de las cantidades de los conjugados de anticuerpo - fármaco de Ejemplos 44 y 45 se mezclaron y la solución se concentró mediante el procedimiento común A para producir el conjugado de anticuerpo - fármaco del 10 título.Almost all of the amounts of the antibody-drug conjugates of Examples 44 and 45 were mixed and the solution was concentrated by common procedure A to produce the antibody-drug conjugate of the title.
Concentración de anticuerpo: 10,0 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 10,21 mg, y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,6.Antibody concentration: 10.0 mg / ml, antibody yield: 10.21 mg, and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 6.6.
55
1010
15fifteen
20twenty
2525
[Fórmula 116][Formula 116]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (45)Process 1: Antibody-drug conjugate (45)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4 producido en el Ejemplo de Referencia 1 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,61 mlmg"1cm"1) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (1,25 ml, 12,5 mg del anticuerpo) se puso en un tubo de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0287 ml; 3,4 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The M30-H1-L4 antibody produced in Reference Example 1 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm , 1.61 mlmg "1cm" 1) was used and the common C-1 procedure described in the production process 1. The solution (1.25 ml, 12.5 mg of the antibody) was placed in a 1 tube, 5 ml and charged with a 10 mM aqueous solution of TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0287 ml; 3.4 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc .; 0.0625 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir dimetilsulfóxido (0,0267 ml) y una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 3 del Ejemplo 43 (0,0439 ml; 5,2 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se incubó para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo en un baño de agua a 15 °C durante 1 hora. A continuación, una solución acuosa (0,0066 ml) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) se añadió a la misma y se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente durante otros 20 minutos.Conjugation between antibody and drug linker: After adding dimethylsulfoxide (0.0267 ml) and a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in process 3 of Example 43 (0.0439 ml; 5.2 equivalents per molecule of antibody) to the above solution at room temperature, it was incubated to conjugate the drug linker with the antibody in a water bath at 15 ° C for 1 hour. Next, an aqueous solution (0.0066 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug linker reaction at room temperature for another 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 6 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título. Después de esto, la solución se concentró mediante el procedimiento común A.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 6 ml of a solution containing the antibody-drug title conjugate. After this, the solution was concentrated by common procedure A.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,28o = 235300 (valor de cálculo estimado), £Aí37o = 0 (valor de cálculo estimado), £d,28o = 5193 (valor medido) y £d,37o = 20347 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in the production procedure 1 (as molar absorption coefficient, £ a, 28o = 235300 (estimated calculation value), £ Ai37o = 0 (estimated calculation value), £ d , 28o = 5193 (measured value) and £ d, 37o = 20347 (measured value)), the following characteristic values were obtained.
Concentración de anticuerpo: 10,0 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,3 mg (74%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,7.Antibody concentration: 10.0 mg / ml, antibody yield: 9.3 mg (74%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.7.
55
1010
15fifteen
20twenty
2525
[Fórmula 117][Formula 117]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (46)Process 1: Antibody-drug conjugate (46)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4 producido en el Ejemplo de Referencia 1 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,61 mlmg-1cm-1) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (1,25 ml, 12,5 mg del anticuerpo) se puso en un tubo de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0439 ml; 5,2 equivalentes por molécula de anticuerpo) (0,0287 ml; 3,4 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The M30-H1-L4 antibody produced in Reference Example 1 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm , 1.61 mlmg-1cm-1) was used and the common C-1 procedure described in the production procedure 1. The solution (1.25 ml, 12.5 mg of the antibody) was placed in a 1-tube, 5 ml and charged with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0439 ml; 5.2 equivalents per antibody molecule) (0.0287 ml; 3.4 equivalents per molecule of antibody) and an aqueous solution of dipotassium hydrogen phosphate 1 M (Nacalai Tesque, Inc .; 0.0625 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir una solución de dimetilsulfóxido (0,0726 ml; 8,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 3 del Ejemplo 43 a la solución anterior a temperatura ambiente, se incubó para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo en un baño de agua a 15 °C durante 1 hora. A continuación, una solución acuosa (0,011 ml) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) se añadió a la misma y se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente durante otros 20 minutos.Conjugation between antibody and drug linker: After adding a solution of dimethylsulfoxide (0.0726 ml; 8.6 equivalents per antibody molecule) containing 10 mM of the compound obtained in process 3 of Example 43 to the above temperature solution ambient, it was incubated to conjugate the drug linker with the antibody in a water bath at 15 ° C for 1 hour. Next, an aqueous solution (0.011 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug linker reaction at room temperature for another 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 6 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título. Después de esto, la solución se concentró mediante el procedimiento común A.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 6 ml of a solution containing the antibody-drug title conjugate. After this, the solution was concentrated by common procedure A.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), £a,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 5 1 93 (valor medido) y £d,370 = 20347 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ a, 280 = 235300 (estimated calculation value), £ a, 370 = 0 (estimated calculation value) were used, £ d, 280 = 5 1 93 (measured value) and £ d, 370 = 20347 (measured value)), the following characteristic values were obtained.
Concentración de anticuerpo: 10,0 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 7,8 mg (62%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 5,2.Antibody concentration: 10.0 mg / ml, antibody yield: 7.8 mg (62%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 5.2.
Ejemplo 49 N-[(1S,9S)-9-etN-5-fluoro-9-hidroxi-4-metiM0,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-Example 49 N - [(1S, 9S) -9-etN-5-fluoro-9-hydroxy-4-metiM0,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-
benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-P-alaninamidabenzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] -P-alaninamide
[Fórmula 118][Formula 118]
55
1010
15fifteen
20twenty
2525
3030
Proceso 1: (3-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-Process 1: (3 - {[(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro- 1H, 12H-
benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]aminol-3-oxopropil)carbamato de terc-butilobenzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] aminol-3-oxopropyl) tert-butyl carbamate
Mesilato del compuesto (4) (500 mg, 0,941 mmol) se hizo reaccionar de la misma forma que en el proceso 1 del Ejemplo 1 usando N-(terc-butoxicarbonil)-p-alanina en lugar de ácido 4-(terc-butoxicarbonilamino)butanoico para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo parduzco (616 mg, cuantitativo).Mesylate of compound (4) (500 mg, 0.941 mmol) was reacted in the same manner as in process 1 of Example 1 using N- (tert-butoxycarbonyl) -p-alanine instead of 4- (tert-butoxycarbonylamino acid) ) butanoic acid to produce the title compound as a brownish yellow solid (616 mg, quantitative).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,29 (9H, s), 1,86 (2H, dt, J = 15,1, 7,3 Hz), 2,04-2,22 (2H, m), 2,31 (2H, t, J = 6,8 Hz), 2,40 (3H, s), 3,10-3,26 (4H, m), 5,15 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,26 (1H, d, J = 19,2 Hz), 5,42 (2H, dd, J = 18,8, 16,4 Hz), 5,57 (1H, dt, J = 8,5, 4,2 Hz), 6,53 (1H, s), 6,78 (1H, t, J = 5,5 Hz), 7,30 (1H, s), 7,80 (1H, d, J = 11,0 Hz), 8,46 (1H, d, J = 8,6 Hz).1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0.87 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.29 (9H, s), 1.86 (2H, dt, J = 15.1 , 7.3 Hz), 2.04-2.22 (2H, m), 2.31 (2H, t, J = 6.8 Hz), 2.40 (3H, s), 3.10-3 , 26 (4H, m), 5.15 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.26 (1H, d, J = 19.2 Hz), 5.42 (2H, dd, J = 18.8, 16.4 Hz), 5.57 (1H, dt, J = 8.5, 4.2 Hz), 6.53 (1H, s), 6.78 (1H, t, J = 5 , 5 Hz), 7.30 (1H, s), 7.80 (1H, d, J = 11.0 Hz), 8.46 (1H, d, J = 8.6 Hz).
EM (IEN) m/z: 607 (M+H)+MS (ESI) m / z: 607 (M + H) +
Proceso 2: N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-Process 2: N - [(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-
benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-p-alaninamidabenzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] -p-alaninamide
El compuesto obtenido en el proceso 1 anterior se hizo reaccionar de la misma forma que en el proceso 2 del Ejemplo 1 para producir trifluoroacetato del compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (499 mg, 86The compound obtained in the above process 1 was reacted in the same manner as in the process 2 of Example 1 to produce trifluoroacetate of the title compound as a yellow solid (499 mg, 86
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,86 (2H, dquin, J = 14,6, 7,2, 7,2, 7,2, 7,2 Hz), 2,06-2,27 (1H, m), 2,41 (3H, s), 2,46-2,57 (2H, m), 3,08 (2H, t, J = 6,8 Hz), 3,14-3,24 (2H, m), 5,22 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,29 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,43 (2H, s), 5,58 (1H, dt, J = 8,5, 4,5 Hz), 6,55 (1H, s), 7,32 (1H, s), 7,74 (3H, s a), 7,82 (1H, d, J = 11,0 Hz), 8,67 (1H, d, J = 8,6 Hz).1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0.87 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.86 (2H, dquin, J = 14.6, 7.2, 7.2, 7.2, 7.2 Hz), 2.06-2.27 (1H, m), 2.41 (3H, s), 2.46-2.57 (2H, m), 3.08 (2H , t, J = 6.8 Hz), 3.14-3.24 (2H, m), 5.22 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.29 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.43 (2H, s), 5.58 (1H, dt, J = 8.5, 4.5 Hz), 6.55 (1H, s), 7.32 (1H, s), 7.74 (3H, sa), 7.82 (1H, d, J = 11.0 Hz), 8.67 (1H, d, J = 8.6 Hz).
EM (IEN) m/z: 507 (M+H)+MS (ESI) m / z: 507 (M + H) +
Ejemplo 50 Conjugado de anticuerpo - fármaco (47)Example 50 Antibody-drug conjugate (47)
[Fórmula 119][Formula 119]
Proceso 1: N-(terc-butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-Process 1: N- (tert-butoxycarbonyl) glycylglycyl-L-phenylalanylglycyl-N - [(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-
2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-p-alaninamida2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] -p -alaninamide
El compuesto (484 mg, 0,780 mmol) del Ejemplo 49 se hizo reaccionar de la misma forma que en el proceso 1 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (626 mg, 87 %).The compound (484 mg, 0.780 mmol) of Example 49 was reacted in the same manner as in process 1 of Example 2 to produce the title compound as a pale yellow solid (626 mg, 87%).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,27-1,42 (9H, m), 1,77-1,93 (2H, m), 2,06-2,22 (2H, m), 2,36 (2H, t, J = 7,2 Hz), 2,40 (3H, d, J = 1,6 Hz), 2,44-2,54 (2H, m), 2,76 (1H, dd, J = 14,5, 10,2 Hz), 3,02 (1H, dd, J = 13,9, 4,5 Hz), 3,12-3,22 (2H, m), 3,52 (6H, d, J = 6,3 Hz), 4,42-4,54 (1H, m), 5,19 (1H, d, J = 19,2 Hz), 5,26 (1H, d, J = 18,4 Hz), 5,42 (1H, dd, J = 18,4, 16,4 Hz), 5,57 (1H, dt, J = 8,7, 4,4 Hz), 6,53 (1H, s), 6,98 (1H, t, J = 5,9 Hz), 7,147,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,77-7,84 (1H, m), 7. 91 (1H, t, J = 5,5 Hz), 8,16 (1H, d, J = 7,8 Hz), 8,27 (1H, t, J = 5,1 Hz), 8,52 (1H, d, J = 9,0 Hz).1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0.87 (3H, t, J = 7.4 Hz), 1.27-1.42 (9H, m), 1.77-1.93 (2H , m), 2.06-2.22 (2H, m), 2.36 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.40 (3H, d, J = 1.6 Hz), 2 , 44-2.54 (2H, m), 2.76 (1H, dd, J = 14.5, 10.2 Hz), 3.02 (1H, dd, J = 13.9, 4.5 Hz ), 3.12-3.22 (2H, m), 3.52 (6H, d, J = 6.3 Hz), 4.42-4.54 (1H, m), 5.19 (1H, d, J = 19.2 Hz), 5.26 (1H, d, J = 18.4 Hz), 5.42 (1H, dd, J = 18.4, 16.4 Hz), 5.57 ( 1H, dt, J = 8.7, 4.4 Hz), 6.53 (1H, s), 6.98 (1H, t, J = 5.9 Hz), 7.147.28 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.77-7.84 (1H, m), 7. 91 (1H, t, J = 5.5 Hz), 8.16 (1H, d, J = 7, 8 Hz), 8.27 (1H, t, J = 5.1 Hz), 8.52 (1H, d, J = 9.0 Hz).
Proceso 2: Trifluoroacetato de glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-Process 2: Glycylglycyl-L-phenylalanylglycyl-N - [(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo- trifluoroacetate
2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-p-alaninamida2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] -p -alaninamide
55
1010
15fifteen
20twenty
2525
3030
3535
4040
El compuesto (624 mg, 0,675 mmol) obtenido en el proceso 1 anterior se hizo reaccionar de la misma forma que en el proceso 2 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (626 mg, 92The compound (624 mg, 0.675 mmol) obtained in process 1 above was reacted in the same manner as in process 2 of Example 2 to produce the title compound as a yellow solid (626 mg, 92
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 5: 0,87 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,86 (2H, tt, J = 14,5, 7,2 Hz), 2,07-2,22 (2H, m), 2,36 (2H, t, J = 7,2 Hz), 2,40 (3H, s), 2,44-2,54 (2H, m), 2,75 (1H, dd, J = 13,7, 9,8 Hz), 3,04 (1H, dd, J = 13,7, 4,3 Hz), 3,123,22 (2H, m), 3,58 (2H, d, J = 4,7 Hz), 3,69 (3H, td, J = 11,2, 5,7 Hz), 3,87 (1H, dd, J = 17,0, 5,7 Hz), 4,54 (1H, m, J = 17,8, 4,5 Hz), 5,19 (1H, d, J = 19,2 Hz), 5,26 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,43 (2H, s), 5,51-5,60 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,147,29 (5H, m), 7,32 (1H, s), 7,81 (1H, d, J = 10,9 Hz), 7,88 (1H, t, J = 5,7 Hz), 7,97 (3H, s a), 8,29-8,38 (2H, m), 8,50 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,55 (1H, d, J = 8,6 Hz).1H NMR (400 MHz, DMSO-da) 5: 0.87 (3H, t, J = 7.4 Hz), 1.86 (2H, tt, J = 14.5, 7.2 Hz), 2, 07-2.22 (2H, m), 2.36 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.40 (3H, s), 2.44-2.54 (2H, m), 2 , 75 (1H, dd, J = 13.7, 9.8 Hz), 3.04 (1H, dd, J = 13.7, 4.3 Hz), 3,123.22 (2H, m), 3, 58 (2H, d, J = 4.7 Hz), 3.69 (3H, td, J = 11.2, 5.7 Hz), 3.87 (1H, dd, J = 17.0, 5, 7 Hz), 4.54 (1H, m, J = 17.8, 4.5 Hz), 5.19 (1H, d, J = 19.2 Hz), 5.26 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.43 (2H, s), 5.51-5.60 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.147.29 (5H, m), 7.32 ( 1H, s), 7.81 (1H, d, J = 10.9 Hz), 7.88 (1H, t, J = 5.7 Hz), 7.97 (3H, sa), 8.29- 8.38 (2H, m), 8.50 (1H, t, J = 5.7 Hz), 8.55 (1H, d, J = 8.6 Hz).
EM (IEN) m/z: 825 (M+H)+MS (ESI) m / z: 825 (M + H) +
Proceso 3: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-Process 3: N- [6- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoyl] glycylglycyl-L-phenylalanylglycyl-N - [(1S, 9S) -9-ethyl- 5-fluoro-9-
hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl] -
p-alaninamidap-alaninamide
El compuesto (60,0 mg, 0,0646 mmol) obtenido en el proceso 2 anterior se hizo reaccionar de la misma forma que en el proceso 3 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título en forma de un sólido (14,0 mg, 21 %).The compound (60.0 mg, 0.0646 mmol) obtained in process 2 above was reacted in the same manner as in process 3 of Example 2 to produce the title compound as a solid (14.0 mg , twenty-one %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 5: 0,86 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,12-1,22 (2H, m), 1,39-1,51 (4H, m), 1,79-1,91 (2H, m), 2,02-2,20 (2H, m), 2,07 (2H, t, J = 7,4 Hz), 2,30-2,42 (4H, m), 2,40 (3H, s), 2,78 (1H, dd, J = 14,1, 9,4 Hz), 3,02 (1H, dd, J = 14,7, 4,9 Hz), 3,12-3,21 (2H, m), 3,26-3,42 (2H, m), 3,50-3,80 (6H, m), 4,40-4,51 (1H, m), 5,19 (1H, d, J = 19,6 Hz), 5,26 (1H, d, J = 19,2 Hz), 5,42 (2H, s a), 5,51-5,62 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,13-7,28 (5H, m),1H NMR (400 MHz, DMSO-da) 5: 0.86 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.12-1.22 (2H, m), 1.39-1.51 (4H , m), 1.79-1.91 (2H, m), 2.02-2.20 (2H, m), 2.07 (2H, t, J = 7.4 Hz), 2.30- 2.42 (4H, m), 2.40 (3H, s), 2.78 (1H, dd, J = 14.1, 9.4 Hz), 3.02 (1H, dd, J = 14, 7, 4.9 Hz), 3.12-3.21 (2H, m), 3.26-3.42 (2H, m), 3.50-3.80 (6H, m), 4.40 -4.51 (1H, m), 5.19 (1H, d, J = 19.6 Hz), 5.26 (1H, d, J = 19.2 Hz), 5.42 (2H, sa) , 5.51-5.62 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.99 (2H, s), 7.13-7.28 (5H, m),
7,31 (1H, s), 7,74-7,84 (2H, m), 8,01 (1H, t, J = 5,3 Hz), 8,06 (1H, t, J = 5,77 Hz), 8,14 (1H, d, J = 8,2 Hz), 8,25 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,53 (1H, d, J = 8,6 Hz).7.31 (1H, s), 7.74-7.84 (2H, m), 8.01 (1H, t, J = 5.3 Hz), 8.06 (1H, t, J = 5, 77 Hz), 8.14 (1H, d, J = 8.2 Hz), 8.25 (1H, t, J = 5.7 Hz), 8.53 (1H, d, J = 8.6 Hz ).
EM (IEN) m/z: 1018 (M+H)+MS (ESI) m / z: 1018 (M + H) +
Proceso 4: Conjugado de anticuerpo - fármaco (47)Process 4: Antibody-drug conjugate (47)
Usando el anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 y el compuesto obtenido en el proceso 3 anterior, el conjugado de anticuerpo - fármaco del título se obtuvo de la misma forma que en el proceso 4 del Ejemplo 2. Concentración de anticuerpo: 12,27 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,6 mg (69%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,4.Using the M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 and the compound obtained in process 3 above, the antibody-drug title conjugate was obtained in the same manner as in process 4 of Example 2. Concentration of antibody: 12.27 mg / ml, antibody yield: 8.6 mg (69%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.4.
Ejemplo 51 Conjugado de anticuerpo - fármaco (48)Example 51 Antibody-drug conjugate (48)
[Fórmula 120][Formula 120]
Proceso 1: N-[3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanoil]glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-Process 1: N- [3- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) propanoyl] glycylglycyl-L-phenylalanylglynyl-N - [(1S, 9S) -9-ethyl- 5-fluoro-9-
hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl] -
p-alaninamidap-alaninamide
El compuesto (60,0 mg, 0,0646 mmol) obtenido en el proceso 2 del Ejemplo 50 se hizo reaccionar de la misma forma que en el proceso 3 del Ejemplo 2 usando propionato de N-succinimidil 3-maleimida en lugar de hexanoato de N- succinimidil 6-maleimida para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (36,0 mg, 57 %).The compound (60.0 mg, 0.0646 mmol) obtained in process 2 of Example 50 was reacted in the same manner as in process 3 of Example 2 using N-succinimidyl 3-maleimide propionate instead of hexanoate. N-succinimidyl 6-maleimide to produce the title compound as a pale yellow solid (36.0 mg, 57%).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 5: 0,86 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,85 (2H, dt, J = 14,4, 7,5 Hz), 2,05-2,22 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,30-2,44 (5H, m), 2,73-2,84 (1H, m), 3,02 (1H, dd, J = 13,9, 4,5 Hz), 3,17 (3H, d, J = 5,1 Hz), 3,26-3,40 (2H, m), 3,41-3,81 (6H, m), 4,40-4,51 (1H, m), 5,19 (1H, d, J = 19,2 Hz), 5,26 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,42 (2H, s a), 5,52-5,61 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,13-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,80 (2H, d, J = 10,2 Hz), 8,03 (1H, t, J = 5,5 Hz), 8,12 (1H, d, J = 8,2 Hz), 8,20-8,31 (2H, m), 8,52 (1H, d, J = 8,6 Hz).1H NMR (400 MHz, DMSO-da) 5: 0.86 (3H, t, J = 7.4 Hz), 1.85 (2H, dt, J = 14.4, 7.5 Hz), 2, 05-2.22 (2H, m), 2.40 (3H, s), 2.30-2.44 (5H, m), 2.73-2.84 (1H, m), 3.02 ( 1H, dd, J = 13.9, 4.5 Hz), 3.17 (3H, d, J = 5.1 Hz), 3.26-3.40 (2H, m), 3.41-3 , 81 (6H, m), 4.40-4.51 (1H, m), 5.19 (1H, d, J = 19.2 Hz), 5.26 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.42 (2H, sa), 5.52-5.61 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.99 (2H, s), 7.13-7.28 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.80 (2H, d, J = 10.2 Hz), 8.03 (1H, t, J = 5.5 Hz), 8.12 (1H, d, J = 8.2 Hz), 8.20-8.31 (2H, m), 8.52 (1H, d, J = 8.6 Hz).
EM (IEN) m/z: 976 (M+H)+MS (ESI) m / z: 976 (M + H) +
55
1010
15fifteen
20twenty
2525
Usando el anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 y el compuesto obtenido en el proceso 1 anterior, el conjugado de anticuerpo - fármaco del título se obtuvo de la misma forma que en el proceso 4 del Ejemplo 2. Concentración de anticuerpo: 11,59 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,1 mg (65%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,7.Using the M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 and the compound obtained in the above process 1, the antibody-drug title conjugate was obtained in the same manner as in process 4 of Example 2. Concentration of antibody: 11.59 mg / ml, antibody yield: 8.1 mg (65%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.7.
Ejemplo 52 Conjugado de anticuerpo - fármaco (49)Example 52 Antibody-drug conjugate (49)
[Fórmula 121][Formula 121]
Proceso 1: N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanoil]amino})etoxi]propanoil}glicilglicil-L-Process 1: N- {3- [2- (2 - {[3- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) propanoyl] amino}) ethoxy] propanoyl} glycylglycyl- L-
fenilalanilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-phenylalanylglynyl-N - [(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H -
benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-p-alaninamidabenzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] -p-alaninamide
El compuesto (60,0 mg, 0,0646 mmol) obtenido en el proceso 2 del Ejemplo 50 se hizo reaccionar de la misma forma que en el proceso 3 del Ejemplo 2 usando 3-(2-(2-(3-maleinimidapropanamida)etoxi)etoxi)propanoato de N- succinimidilo en lugar de hexanoato de N-succinimidil 6-maleimida para producir el compuesto del título en forma de un sólido (23,0 mg, 31 %).The compound (60.0 mg, 0.0646 mmol) obtained in process 2 of Example 50 was reacted in the same manner as in process 3 of Example 2 using 3- (2- (2- (3-maleinimidepropanamide) N-succinimidyl ethoxy) ethoxy) propanoate instead of N-succinimidyl 6-maleimide hexanoate to produce the title compound as a solid (23.0 mg, 31%).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 5: 0,86 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,77-1,92 (2H, m), 2,07-2,21 (2H, m), 2,27-2,42 (6H, m),1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 5: 0.86 (3H, t, J = 7.4 Hz), 1.77-1.92 (2H, m), 2.07-2.21 (2H , m), 2.27-2.42 (6H, m),
2,40 (3H, s), 2,74-2,84 (1H, m), 2,97-3,06 (1H, m), 3,09-3,21 (4H, m), 3,25-3,39 (6H, m), 3,45 (4H, s), 3,50-3,80 (8H, m), 4,41-4,51 (1H, m), 5,19 (1H, d, J = 18,4 Hz), 5,26 (1H, m, J = 18,4 Hz), 5,42 (2H, s a), 5,51-5,61 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,00 (2H, s), 7,13-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,74-7,87 (2H, m), 7,93-8,07 (2H, m), 8,09-8,21 (2H, m), 8,26 (1H, s a), 8,54 (1H, d, J = 8,6 Hz).2.40 (3H, s), 2.74-2.84 (1H, m), 2.97-3.06 (1H, m), 3.09-3.21 (4H, m), 3, 25-3.39 (6H, m), 3.45 (4H, s), 3.50-3.80 (8H, m), 4.41-4.51 (1H, m), 5.19 ( 1H, d, J = 18.4 Hz), 5.26 (1H, m, J = 18.4 Hz), 5.42 (2H, sa), 5.51-5.61 (1H, m), 6.54 (1H, s), 7.00 (2H, s), 7.13-7.28 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.74-7.87 (2H, m), 7.93-8.07 (2H, m), 8.09-8.21 (2H, m), 8.26 (1H, sa), 8.54 (1H, d, J = 8, 6 Hz)
EM (IEN) m/z: 1135 (M+H)+MS (ESI) m / z: 1135 (M + H) +
Proceso 2: Conjugado de anticuerpo - fármaco (49)Process 2: Antibody-drug conjugate (49)
Usando el anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 y el compuesto obtenido en el proceso 1 anterior, el conjugado de anticuerpo - fármaco del título se obtuvo de la misma forma que en el proceso 2 del Ejemplo 29. Concentración de anticuerpo: 14,50 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 10,2 mg (82%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,8.Using the M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 and the compound obtained in process 1 above, the antibody-drug title conjugate was obtained in the same manner as in process 2 of Example 29. Concentration of antibody: 14.50 mg / ml, antibody yield: 10.2 mg (82%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.8.
[Fórmula 122][Formula 122]
Proceso 1: N-[19-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-17-oxo-4,7,10,13-tetraoxa-16-azanonadecan-1-oil]glicilglicil-L- fenilalanilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro- 1H,12H- benzo[de]pirano[3’,4’:6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-p-alaninamidaProcess 1: N- [19- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -17-oxo-4,7,10,13-tetraoxa-16-azanonadecan-1- oil] glycylglycyl-L-phenylalanylglycyl-N - [(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13.15 -hexahydro- 1H, 12H- benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] -p-alaninamide
5 El compuesto (60,0 mg, 0,0646 mmol) obtenido en el proceso 2 del Ejemplo 50 se hizo reaccionar de la misma forma que en el proceso 3 del Ejemplo 2 usando N-succinimidil 1-maleinimida-3-oxo-7,10,13,16-tetraoxa-4- azanonadecanoato en lugar de hexanoato de N-succinimidil 6-maleimida para producir el compuesto del título en forma de un sólido (23,0 mg, 29 %).The compound (60.0 mg, 0.0646 mmol) obtained in process 2 of Example 50 was reacted in the same manner as in process 3 of Example 2 using N-succinimidyl 1-maleinimide-3-oxo-7 , 10,13,16-tetraoxa-4- azanonadecanoate instead of N-succinimidyl 6-maleimide hexanoate to produce the title compound as a solid (23.0 mg, 29%).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 5: 0,86 (3H, t, J = 7,0 Hz), 1,85 (2H, tt, J = 14,6, 7,1 Hz), 2,06-2,22 (2H, m), 2,40 (3H, 10 s), 2,28-2,43 (6H, m), 2,78 (1H, dd, J = 13,7, 9,4 Hz), 3,02 (1H, dd, J = 14,1, 3,9 Hz), 3,09-3,22 (4H, m), 3,27-3,411H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 5: 0.86 (3H, t, J = 7.0 Hz), 1.85 (2H, tt, J = 14.6, 7.1 Hz), 2, 06-2.22 (2H, m), 2.40 (3H, 10 s), 2.28-2.43 (6H, m), 2.78 (1H, dd, J = 13.7, 9, 4 Hz), 3.02 (1H, dd, J = 14.1, 3.9 Hz), 3.09-3.22 (4H, m), 3.27-3.41
(4H, m), 3,47 (12H, d, J = 8,6 Hz), 3,53-3,81 (10H, m), 4,41-4,51 (1H, m), 5,19 (1H, d, J = 19,2 Hz), 5,26 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,42 (2H, s a), 5,53-5,61 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,00 (2H, s), 7,12-7,29 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,74-7,85 (2H, m), 8,03 (2H, d, J = 6. Hz), 8,11-8,21 (2H, m), 8,27 (1H, t, J = 5,9 Hz), 8,54 (1H, d, J = 8,6 Hz).(4H, m), 3.47 (12H, d, J = 8.6 Hz), 3.53-3.81 (10H, m), 4.41-4.51 (1H, m), 5, 19 (1H, d, J = 19.2 Hz), 5.26 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.42 (2H, sa), 5.53-5.61 (1H, m ), 6.54 (1H, s), 7.00 (2H, s), 7.12-7.29 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.74-7.85 ( 2H, m), 8.03 (2H, d, J = 6. Hz), 8.11-8.21 (2H, m), 8.27 (1H, t, J = 5.9 Hz), 8 , 54 (1H, d, J = 8.6 Hz).
EM (IEN) m/z: 1224 (M+H)+MS (ESI) m / z: 1224 (M + H) +
15 Proceso 2: Conjugado de anticuerpo - fármaco (50)15 Process 2: Antibody-drug conjugate (50)
Usando el anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 y el compuesto obtenido en el proceso 1 anterior, el conjugado de anticuerpo - fármaco del título se obtuvo de la misma forma que en el proceso 4 del Ejemplo 2. Concentración de anticuerpo: 13,47 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,4 mg (75%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,1.Using the M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 and the compound obtained in the above process 1, the antibody-drug title conjugate was obtained in the same manner as in process 4 of Example 2. Concentration of antibody: 13.47 mg / ml, antibody yield: 9.4 mg (75%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.1.
20twenty
[Fórmula 123][Formula 123]
Proceso 1: (6-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-Process 1: (6 - {[(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro- 1H, 12H-
benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]aminol-6-oxohexil)carbamato de terc-butilobenzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] aminol-6-oxohexyl) tert-butyl carbamate
Mesilato del compuesto (4) (0,500 g, 0,882 mmol) se hizo reaccionar de la misma forma que en el proceso 1 del 5 Ejemplo 1 usando ácido 6-(terc-butoxicarbonilamino)hexanoico en lugar de ácido 4-(terc- butoxicarbonilamino)butanoico para producir el compuesto del título (0,620 g, cuantitativo).Mesylate of compound (4) (0.500 g, 0.882 mmol) was reacted in the same manner as in process 1 of Example 1 using 6- (tert-butoxycarbonylamino) hexanoic acid instead of 4- (tert-butoxycarbonylamino) acid butanoic to produce the title compound (0.620 g, quantitative).
RMN 1H (DMSO-da) 8: 0,83 (3H, t, J = 7,8 Hz), 1,14-1,28 (2H, m), 1,31 (9H, s), 1,47-1,61 (2H, m), 1,75-1,89 (2H, m), 2,04-2,17 (4H, m), 2,35 (3H, s), 2,81-2,88 (2H, m), 3,09-3,16 (2H, m), 5,10 (1H, d, J = 19,4 Hz), 5,16 (1H, d, J = 19,4 Hz), 5,39 (2H, s), 5,48-5,55 (1H, m), 6,50 (1H, s), 6,73-6,78 (1H, m), 7,26 (1H, s), 7,74 (1H, d, J = 10,9 Hz), 8,39 (1H, 10 d, J = 9,0 Hz).1H NMR (DMSO-da) 8: 0.83 (3H, t, J = 7.8 Hz), 1.14-1.28 (2H, m), 1.31 (9H, s), 1.47 -1.61 (2H, m), 1.75-1.89 (2H, m), 2.04-2.17 (4H, m), 2.35 (3H, s), 2.81-2 , 88 (2H, m), 3.09-3.16 (2H, m), 5.10 (1H, d, J = 19.4 Hz), 5.16 (1H, d, J = 19.4 Hz), 5.39 (2H, s), 5.48-5.55 (1H, m), 6.50 (1H, s), 6.73-6.78 (1H, m), 7.26 (1H, s), 7.74 (1H, d, J = 10.9 Hz), 8.39 (1H, 10 d, J = 9.0 Hz).
Proceso 2: trifluoroacetato de 6-amino-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]hexanamidaProcess 2: 6-amino-N - [(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13 trifluoroacetate, 15- hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] hexanamide
El compuesto (0,397 g, 0,611 mmol) obtenido en el proceso 1 anterior se hizo reaccionar de la misma forma que en el proceso 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título (0,342 g, 84 %).The compound (0.397 g, 0.611 mmol) obtained in process 1 above was reacted in the same manner as in process 2 of Example 1 to produce the title compound (0.342 g, 84%).
15 RMN 1H (DMSO-d6) 8: 0,88 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,31-1,41 (2H, m), 1,52-1,70 (4H, m), 1,80-1,94 (2H, m), 2,05-2,18 (2H, m), 2,21 (2H, t, J = 7,4 Hz), 2,40 (3H, s), 2,81 (2H, t, J = 7,4 Hz), 3,10-3,25 (2H, m), 3,33 (2H, s a), 5,18 (1H, d, J = 19,8 Hz), 5,22 (1H, d, J = 19,8 Hz), 5,41 (2H, d, J = 16,6 Hz), 5,45 (2H, d, J = 16,6 Hz), 5,53-5,60 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,32 (1H, s), 7,80 (1H, d, J = 10,9 Hz), 8,49 (1H, d, J = 9,2 Hz).1 H NMR (DMSO-d6) 8: 0.88 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.31-1.41 (2H, m), 1.52-1.70 (4H, m ), 1.80-1.94 (2H, m), 2.05-2.18 (2H, m), 2.21 (2H, t, J = 7.4 Hz), 2.40 (3H, s), 2.81 (2H, t, J = 7.4 Hz), 3.10-3.25 (2H, m), 3.33 (2H, sa), 5.18 (1H, d, J = 19.8 Hz), 5.22 (1H, d, J = 19.8 Hz), 5.41 (2H, d, J = 16.6 Hz), 5.45 (2H, d, J = 16 , 6 Hz), 5.53-5.60 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.32 (1H, s), 7.80 (1H, d, J = 10.9 Hz ), 8.49 (1H, d, J = 9.2 Hz).
Proceso 3: N-(terc-butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-(6-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo- 20 2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-6-oxo-Process 3: N- (tert-butoxycarbonyl) glycylglycyl-L-phenylalanyl-N- (6 - {[(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo - 20 2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] amino} -6-oxo-
55
1010
15fifteen
20twenty
2525
3030
3535
4040
45Four. Five
50fifty
hexil)glicinamidahexyl) glycinamide
El compuesto (0,170 g, 0,516 mmol) obtenido en el proceso 2 anterior se hizo reaccionar de la misma forma que en el proceso 1 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título (0,225 g, 91%).The compound (0.160 g, 0.516 mmol) obtained in process 2 above was reacted in the same manner as in process 1 of Example 2 to produce the title compound (0.225 g, 91%).
RMN 1H (DMSO-da) 8: 0,88 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,43-1,70 (6H, m), 1,87 (2H, td, J = 15,0, 7,4 Hz), 2,10-2,22 (3H, m), 2,28-2,37 (1H, m), 2,42 (3H, s), 2,78-2,85 (1H, m), 3,01-3,10 (3H, m), 3,15-3,22 (2H, m), 3,54-3,61 (5H, m), 3,62-3,69 (1H, m), 4,44-4,53 (1H, m), 5,17 (1H, d, J = 19,2 Hz), 5,25 (1H, d, J = 19,2 Hz), 5,45 (2H, s), 5,54-5,61 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,02 (1H, t, J = 6,1 Hz), 7,11-7,28 (5H, m), 7,33 (1H, s), 7,63-7,69 (1H, m), 7,82 (1H, d, J = 11,0 Hz), 7,907,96 (1H, m), 8,17 (1H, d, J = 7,8 Hz), 8,28 (1H, t, J = 5,5 Hz), 8,46 (1H, d, J = 9,0 Hz).1H NMR (DMSO-da) 8: 0.88 (3H, t, J = 7.4 Hz), 1.43-1.70 (6H, m), 1.87 (2H, td, J = 15, 0.4 Hz), 2.10-2.22 (3H, m), 2.28-2.37 (1H, m), 2.42 (3H, s), 2.78-2.85 (1H, m), 3.01-3.10 (3H, m), 3.15-3.22 (2H, m), 3.54-3.61 (5H, m), 3.62-3 , 69 (1H, m), 4.44-4.53 (1H, m), 5.17 (1H, d, J = 19.2 Hz), 5.25 (1H, d, J = 19.2 Hz), 5.45 (2H, s), 5.54-5.61 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.02 (1H, t, J = 6.1 Hz), 7.11-7.28 (5H, m), 7.33 (1H, s), 7.63-7.69 (1H, m), 7.82 (1H, d, J = 11.0 Hz) , 7,907.96 (1H, m), 8.17 (1H, d, J = 7.8 Hz), 8.28 (1H, t, J = 5.5 Hz), 8.46 (1H, d, J = 9.0 Hz).
Proceso 4: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-(6-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-Process 4: Glycylglycyl-L-phenylalanyl-N- (6 - {[(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-10,13-dioxo-2,3,9,10,13, 15-hexahydro-
1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-6-oxohexil)glicinamida1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] amino} -6-oxohexyl) glycinamide
El compuesto (0,105 g, 0,108 mmol) obtenido en el proceso 3 anterior se hizo reaccionar de la misma forma que en el proceso 2 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título (0,068 mg, 65 %).The compound (0.105 g, 0.108 mmol) obtained in process 3 above was reacted in the same manner as in process 2 of Example 2 to produce the title compound (0.068 mg, 65%).
RMN 1H (DMSO-d6) 8: 0,89 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,15-1,67 (6H, m), 1,79-1,97 (2H, m), 2,08-2,24 (4H, m), 2,42 (3H, s), 2,76-2,82 (1H, m), 3,00-3,10 (5H, m), 3,19 (1H, s), 3,50-3,63 (2H, m), 3,64-3,76 (3H, m), 3,84-3,92 (1H, m), 4,51-4,59 (1H, m), 5,17 (1H, d, J = 19,4 Hz), 5,24 (1H, d, J = 19,4 Hz), 5,44 (2H, s), 5,53-5,61 (1H, m), 6,55 (1H, s a), 7,15-7,29 (5H, m), 7,33 (1H, s), 7,72-7,78 (1H, m), 7,82 (1H, d, J = 11,0 Hz), 7,96-8,08 (2H, m), 8,30-8,38 (2H, m), 8,46-8,56 (2H, m).1H NMR (DMSO-d6) 8: 0.89 (3H, t, J = 7.4 Hz), 1.15-1.67 (6H, m), 1.79-1.97 (2H, m) , 2.08-2.24 (4H, m), 2.42 (3H, s), 2.76-2.82 (1H, m), 3.00-3.10 (5H, m), 3 , 19 (1H, s), 3.50-3.63 (2H, m), 3.64-3.76 (3H, m), 3.84-3.92 (1H, m), 4.51 -4.59 (1H, m), 5.17 (1H, d, J = 19.4 Hz), 5.24 (1H, d, J = 19.4 Hz), 5.44 (2H, s) , 5.53-5.61 (1H, m), 6.55 (1H, sa), 7.15-7.29 (5H, m), 7.33 (1H, s), 7.72-7 , 78 (1H, m), 7.82 (1H, d, J = 11.0 Hz), 7.96-8.08 (2H, m), 8.30-8.38 (2H, m), 8.46-8.56 (2H, m).
Proceso 5: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-(6-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidroxi-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H, 12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}- 6-oxohexil)glicinamidaProcess 5: N- [6- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoyl] glycylglycyl-L-phenylalanyl-N- (6 - {[(1S, 9S) - 9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6, 7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] amino} - 6-oxohexyl) glycinamide
El compuesto (58 mg, 0,060 mmol) obtenido en el proceso 4 anterior se hizo reaccionar de la misma forma que en el proceso 3 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título (39 mg, 62 %).The compound (58 mg, 0.060 mmol) obtained in process 4 above was reacted in the same manner as in process 3 of Example 2 to produce the title compound (39 mg, 62%).
RMN 1H (CD3OD) 8: 0,99 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,27 (2H, td, J = 11,6, 6,1 Hz), 1,38-1,44 (2H, m), 1,50-1,63 (6H, m), 1,65-1,80 (2H, m), 1,89-1,98 (2H, m), 2,17-2,25 (3H, m), 2,26-2,36 (3H, m), 2,40 (3H, s), 2,95 (1H, dd, J = 14,3, 9,2 Hz), 3,12 (1H, dd, J = 13,7, 5,7 Hz), 3,15-3,25 (4H, m), 3,44 (2H, t, J = 7,2 Hz), 3,65 (1H, d, J = 17,2 Hz), 3,76 (1H, d, J = 17,2 Hz), 3,79-3,86 (4H, m), 4,43 (1H, dd, J = 8,9, 6,0 Hz), 5,10 (1H, d, J = 18,9 Hz), 5,25 (1H, d, J = 18,9 Hz), 5,35 (1H, d, J = 16,6 Hz), 5,56 (1H, d, J = 16,0 Hz), 5,60-5,64 (1H, m), 6,76 (2H, s), 7,12-7,24 (6H, m), 7,58 (1H, s), 7,60 (1H, d, J = 10,9 Hz), 7,68 (1H, t, J = 5,7 Hz).1H NMR (CD3OD) 8: 0.99 (3H, t, J = 7.4 Hz), 1.27 (2H, td, J = 11.6, 6.1 Hz), 1.38-1.44 (2H, m), 1.50-1.63 (6H, m), 1.65-1.80 (2H, m), 1.89-1.98 (2H, m), 2.17-2 , 25 (3H, m), 2.26-2.36 (3H, m), 2.40 (3H, s), 2.95 (1H, dd, J = 14.3, 9.2 Hz), 3.12 (1H, dd, J = 13.7, 5.7 Hz), 3.15-3.25 (4H, m), 3.44 (2H, t, J = 7.2 Hz), 3 , 65 (1H, d, J = 17.2 Hz), 3.76 (1H, d, J = 17.2 Hz), 3.79-3.86 (4H, m), 4.43 (1H, dd, J = 8.9, 6.0 Hz), 5.10 (1H, d, J = 18.9 Hz), 5.25 (1H, d, J = 18.9 Hz), 5.35 ( 1H, d, J = 16.6 Hz), 5.56 (1H, d, J = 16.0 Hz), 5.60-5.64 (1H, m), 6.76 (2H, s), 7.12-7.24 (6H, m), 7.58 (1H, s), 7.60 (1H, d, J = 10.9 Hz), 7.68 (1H, t, J = 5, 7 Hz)
EM (IEN) m/z: 1060 (M+H)+MS (ESI) m / z: 1060 (M + H) +
Proceso 6: Conjugado de anticuerpo - fármaco (51)Process 6: Antibody-drug conjugate (51)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,61) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (1,0 ml) se recogió en un tubo de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0147 ml; 2,3 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,050 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora. Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de incubar la solución a 22 °C durante 10 minutos, una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 5 anterior (0,0295 ml; 4,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) se añadió a la misma y se incubó para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a 22 °C durante 40 minutos. A continuación, una solución acuosa (0,00590 ml; 9,2 equivalentes por molécula de anticuerpo) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) se añadió a la misma y se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a 22 °C durante otros 20 minutos.Antibody reduction: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm , 1.61) was used and the common procedure C-1 described in the production process 1. The solution (1.0 ml) was collected in a 1.5 ml tube and charged with an aqueous solution of TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0147 ml; 2.3 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc .; 0.050 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour. Conjugation between antibody and drug linker: After incubating the solution at 22 ° C for 10 minutes, a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in the above process (0.0295 ml; 4.6 equivalents per molecule of antibody) was added thereto and incubated to conjugate the drug linker with the antibody at 22 ° C for 40 minutes. Next, an aqueous solution (0.00590 ml; 9.2 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug linker reaction to 22 ° C for another 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó PBS7,4 como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 6 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (PBS7.4 was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 6 ml of a solution containing the antibody-title drug conjugate. .
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), £a,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 5000 (valor promedio medido) y £d,370 = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 0,97 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 5,82 mg (58 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 1,7.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ a, 280 = 235300 (estimated calculation value), £ a, 370 = 0 (estimated calculation value) were used, £ d, 280 = 5000 (measured average value) and £ d, 370 = 19000 (measured average value)), the following characteristic values were obtained. Antibody concentration: 0.97 mg / ml, antibody yield: 5.82 mg (58%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 1.7.
55
1010
15fifteen
20twenty
2525
[Fórmula 124][Formula 124]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (52)Process 1: Antibody-drug conjugate (52)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,61) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (1,0 ml) se recogió en un tubo de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0295 ml; 4,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,050 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora. Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de incubar la solución anterior a 22 °C durante 10 minutos, una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 5 del Ejemplo 54 (0,0590 ml; 9,2 equivalentes por molécula de anticuerpo) se añadió a la misma y se incubó para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a 22 °C durante 40 minutos. A continuación, una solución acuosa (0,0118 ml; 18,4 equivalentes por molécula de anticuerpo) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) se añadió a la misma y se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a 22 °C durante otros 20 minutos.Antibody reduction: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm , 1.61) was used and the common procedure C-1 described in the production process 1. The solution (1.0 ml) was collected in a 1.5 ml tube and charged with an aqueous solution of TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0295 ml; 4.6 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc .; 0.050 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour. Conjugation between antibody and drug linker: After incubating the previous solution at 22 ° C for 10 minutes, a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in process 5 of Example 54 (0.0590 ml; 9.2 equivalents per antibody molecule) was added thereto and incubated to conjugate the drug linker with the antibody at 22 ° C for 40 minutes. Next, an aqueous solution (0.0118 ml; 18.4 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug linker reaction to 22 ° C for another 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó PBS7,4 como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 6 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (PBS7.4 was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 6 ml of a solution containing the antibody-title drug conjugate. .
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), £a,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 50 00 (valor promedio medido) y £d,370 = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ a, 280 = 235300 (estimated calculation value), £ a, 370 = 0 (estimated calculation value) were used, £ d, 280 = 50 00 (measured average value) and £ d, 370 = 19000 (measured average value)), the following characteristic values were obtained.
Concentración de anticuerpo: 0,94 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 5,64 mg (56%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,1.Antibody concentration: 0.94 mg / ml, antibody yield: 5.64 mg (56%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.1.
[Fórmula 125][Formula 125]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (53)Process 1: Antibody-drug conjugate (53)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4 producido en el Ejemplo de Referencia 1 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como 5 coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,61) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (1,0 ml) se recogió en un tubo de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0147 ml; 2,3 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,050 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C 10 durante 1 hora. Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de incubar la solución anterior a 22 °C durante 10 minutos, una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 5 del Ejemplo 54 (0,0295 ml; 4,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) se añadió a la misma y se incubó para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a 22 °C durante 40 minutos. A continuación, una solución acuosa (0,00590 ml; 9,2 equivalentes por molécula de anticuerpo) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) se 15 añadió a la misma y se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a 22 °C durante otros 20 minutos.Antibody reduction: The M30-H1-L4 antibody produced in Reference Example 1 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using common procedure B (as 5 absorption coefficient at 280 nm, 1.61) was used and the common C-1 procedure described in the production process 1. The solution (1.0 ml) was collected in a 1.5 ml tube and charged with an aqueous TCEP solution 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0147 ml; 2.3 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc .; 0.050 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour. Conjugation between antibody and drug linker: After incubating the above solution at 22 ° C for 10 minutes, a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in process 5 of Example 54 (0.0295 ml; 4.6 equivalents per antibody molecule) was added thereto and incubated to conjugate the drug linker with the antibody at 22 ° C for 40 minutes. Next, an aqueous solution (0.00590 ml; 9.2 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug linker reaction. at 22 ° C for another 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó PBS7,4 como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 6 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (PBS7.4 was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 6 ml of a solution containing the antibody-title drug conjugate. .
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 20 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), £a,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 50 00 (valor promedio medido) y £d,370 = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 1,22 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 7,32 mg (73%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 1,5.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in the production process 1 20 (as molar absorption coefficient, £ a, 280 = 235300 (estimated calculation value), £ a, 370 = 0 (estimated calculation value) were used , £ d, 280 = 50 00 (measured average value) and £ d, 370 = 19000 (measured average value)), the following characteristic values were obtained. Antibody concentration: 1.22 mg / ml, antibody yield: 7.32 mg (73%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 1.5.
[Fórmula 126][Formula 126]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (54)Process 1: Antibody-drug conjugate (54)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4 producido en el Ejemplo de Referencia 1 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como 5 coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,61) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (1,0 ml) se recogió en un tubo de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0295 ml; 4,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,050 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C 10 durante 1 hora. Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de incubar la solución anterior a 22 °C durante 10 minutos, una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 5 del Ejemplo 54 (0,0590 ml; 9,2 equivalentes por molécula de anticuerpo) se añadió a la misma y se incubó para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a 22 °C durante 40 minutos. A continuación, una solución acuosa (0,0118 ml; 18,4 equivalentes por molécula de anticuerpo) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) se 15 añadió a la misma y se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a 22 °C durante otros 20 minutos.Antibody reduction: The M30-H1-L4 antibody produced in Reference Example 1 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using common procedure B (as 5 absorption coefficient at 280 nm, 1.61) was used and the common C-1 procedure described in the production process 1. The solution (1.0 ml) was collected in a 1.5 ml tube and charged with an aqueous TCEP solution 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0295 ml; 4.6 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc .; 0.050 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour. Conjugation between antibody and drug linker: After incubating the previous solution at 22 ° C for 10 minutes, a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in process 5 of Example 54 (0.0590 ml; 9.2 equivalents per antibody molecule) was added thereto and incubated to conjugate the drug linker with the antibody at 22 ° C for 40 minutes. Next, an aqueous solution (0.0118 ml; 18.4 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug linker reaction. at 22 ° C for another 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó PBS7,4 como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 6 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (PBS7.4 was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 6 ml of a solution containing the antibody-title drug conjugate. .
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 20 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), £a,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 50 00 (valor promedio medido) y £d,370 = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 1,06 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 6,36 mg (64%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,0.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in the production process 1 20 (as molar absorption coefficient, £ a, 280 = 235300 (estimated calculation value), £ a, 370 = 0 (estimated calculation value) were used , £ d, 280 = 50 00 (measured average value) and £ d, 370 = 19000 (measured average value)), the following characteristic values were obtained. Antibody concentration: 1.06 mg / ml, antibody yield: 6.36 mg (64%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.0.
55
1010
15fifteen
20twenty
2525
Proceso 1: ({N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]glicil}amino)acetato de metiloProcess 1: ({N - [(9H-fluoren-9-ylmethoxy) carbonyl] glycyl} amino) methyl acetate
A una mezcla que contiene N-9-fluorenilmetoxicarbonMglicilgMcina (4,33 g, 12,2 mmol), tetrahidrofurano (120 ml) y tolueno (40,0 ml), se añadieron piridina (1,16 ml, 14,7 mmol) y tetraacetato de plomo (6,84 g, 14,7 mmol) y se calentó a reflujo durante 5 horas. Después de que la solución de reacción se enfriara a temperatura ambiente, los materiales insolubles se retiraron por filtración a través de Celite, y se concentraron a presión reducida. los residuos obtenidos se disolvieron en acetato de etilo y se lavaron con agua y salmuera saturada, y entonces la capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Después de que el disolvente se retirara a presión reducida, los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [hexano : acetato de etilo = 9 : 1 (v/v) - acetato de etilo] para producir el compuesto del título en forma de un sólido incoloro (3,00 g, 67 %).To a mixture containing N-9-fluorenylmethoxycarbonMglycylgMcina (4.33 g, 12.2 mmol), tetrahydrofuran (120 ml) and toluene (40.0 ml), pyridine (1.16 ml, 14.7 mmol) were added and lead tetraacetate (6.84 g, 14.7 mmol) and heated at reflux for 5 hours. After the reaction solution cooled to room temperature, insoluble materials were filtered off through Celite, and concentrated under reduced pressure. The obtained residues were dissolved in ethyl acetate and washed with water and saturated brine, and then the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate. After the solvent was removed under reduced pressure, the obtained residues were purified by column chromatography on silica gel [hexane: ethyl acetate = 9: 1 (v / v) -ethyl acetate] to yield the title compound in the form of a colorless solid (3.00 g, 67%).
RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8: 2,07 (3H, s), 3,90 (2H, d, J = 5,1 Hz), 4,23 (1H, t, J = 7,0 Hz), 4,46 (2H, d, J = 6,6 Hz), 5,26 (2H, d, J = 7,0 Hz), 5,32 (1H, s a), 6,96 (1H, s a), 7,32 (2H, t, J = 7,3 Hz), 7,41 (2H, t, J = 7,3 Hz), 7,59 (2H, d, J = 7,3 Hz), 7,77 (2H, d, J = 7,3 Hz).1H NMR (400 MHz, CDCla) 8: 2.07 (3H, s), 3.90 (2H, d, J = 5.1 Hz), 4.23 (1H, t, J = 7.0 Hz) , 4.46 (2H, d, J = 6.6 Hz), 5.26 (2H, d, J = 7.0 Hz), 5.32 (1H, sa), 6.96 (1H, sa) , 7.32 (2H, t, J = 7.3 Hz), 7.41 (2H, t, J = 7.3 Hz), 7.59 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7 , 77 (2H, d, J = 7.3 Hz).
Proceso 2: [({N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]glicil}amino)metoxi]acetato de benciloProcess 2: [({N - [(9H-fluoren-9-ylmethoxy) carbonyl] glycyl} amino) methoxy] benzyl acetate
A una solución de tetrahidrofurano (40,0 ml) del compuesto (3,68 g, 10,0 mmol) obtenido en el proceso 1 anterior y glicolato de bencilo (4,99 g, 30,0 mmol), se añadió terc-butóxido potásico (2,24 g, 20,0 mmol) a 0 °C y se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. La solución de reacción se cargó con acetato de etilo y agua a 0 °C y se extrajo con acetato de etilo y cloroformo. La capa orgánica obtenida se secó sobre sulfato sódico y se filtró. El disolvente se eliminó a presión reducida. Los residuos obtenidos se disolvieron en dioxano (40,0 ml) y agua (10,0 ml), se cargaron con hidrogenocarbonato sódico (1,01 g, 12,0 mmol) y cloroformiato de 9-fluorenilmetilo (2,59 g, 10,0 mmol) y se agitaron a temperatura ambiente durante 2 horas. La solución de reacción se cargó con agua y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica obtenida se secó sobre sulfato sódico y se filtró. El disolvente se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [hexano :To a solution of tetrahydrofuran (40.0 ml) of the compound (3.68 g, 10.0 mmol) obtained in the above process 1 and benzyl glycolate (4.99 g, 30.0 mmol), tertiary was added potassium butoxide (2.24 g, 20.0 mmol) at 0 ° C and stirred at room temperature for 15 minutes. The reaction solution was charged with ethyl acetate and water at 0 ° C and extracted with ethyl acetate and chloroform. The organic layer obtained was dried over sodium sulfate and filtered. The solvent was removed under reduced pressure. The obtained residues were dissolved in dioxane (40.0 ml) and water (10.0 ml), loaded with sodium hydrogen carbonate (1.01 g, 12.0 mmol) and 9-fluorenylmethyl chloroformate (2.59 g, 10.0 mmol) and stirred at room temperature for 2 hours. The reaction solution was charged with water and extracted with ethyl acetate. The organic layer obtained was dried over sodium sulfate and filtered. The solvent was removed under reduced pressure and the obtained residues were purified by column chromatography on silica gel [hexane:
55
1010
15fifteen
20twenty
2525
3030
3535
4040
45Four. Five
50fifty
5555
acetato de etilo = 100 : 0 (v/v) - 0 : 100] para producir el compuesto del título en una sustancia oleosa incolora (1,88 g, 40 %).ethyl acetate = 100: 0 (v / v) - 0: 100] to produce the title compound in a colorless oily substance (1.88 g, 40%).
RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8: 3,84 (2H, d, J = 5,5 Hz), 4,24 (3H, t, J = 6,5 Hz), 4,49 (2H, d, J = 6,7 Hz), 4,88 (2H, d, J = 6,7 Hz), 5,15-5,27 (1H, m), 5,19 (2H, s), 6,74 (1H, s a), 7,31-7,39 (7H, m), 7,43 (2H, t, J = 7,4 Hz), 7,61 (2H, d, J = 7,4 Hz), 7,79 (2H, d, J = 7,4 Hz).1H NMR (400 MHz, CDCla) 8: 3.84 (2H, d, J = 5.5 Hz), 4.24 (3H, t, J = 6.5 Hz), 4.49 (2H, d, J = 6.7 Hz), 4.88 (2H, d, J = 6.7 Hz), 5.15-5.27 (1H, m), 5.19 (2H, s), 6.74 ( 1H, sa), 7.31-7.39 (7H, m), 7.43 (2H, t, J = 7.4 Hz), 7.61 (2H, d, J = 7.4 Hz), 7.79 (2H, d, J = 7.4 Hz).
Proceso 3: Ácido [({N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]glicil}amino)metoxi]acéticoProcess 3: [({N - [(9H-fluoren-9-ylmethoxy) carbonyl] glycyl} amino) methoxy] acetic acid
El compuesto (1,88 g, 3,96 mmol) obtenido en el proceso 2 anterior se disolvió en etanol (40,0 ml) y acetato de etilo (20,0 ml). Después de añadir catalizador de paladio-carbono (376 mg), se agitó bajo una atmósfera de hidrógeno a temperatura ambiente durante 2 horas. Los materiales insolubles se retiraron por filtración a través de Celite, y el disolvente se retiró a presión reducida para producir el compuesto del título en forma de un sólido incoloro (1,52 g, cuantitativo).The compound (1.88 g, 3.96 mmol) obtained in the above process 2 was dissolved in ethanol (40.0 ml) and ethyl acetate (20.0 ml). After adding palladium-carbon catalyst (376 mg), it was stirred under a hydrogen atmosphere at room temperature for 2 hours. Insoluble materials were removed by filtration through Celite, and the solvent was removed under reduced pressure to yield the title compound as a colorless solid (1.52 g, quantitative).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 3,62 (2H, d, J = 6,3 Hz), 3,97 (2H, s), 4,18-4,32 (3H, m), 4,60 (2H, d, J = 6,7 Hz), 7,29-7,46 (4H, m), 7,58 (1H, t, J = 5,9 Hz), 7,72 (2H, d, J = 7,4 Hz), 7,90 (2H, d, J = 7,4 Hz), 8,71 (1H, t, J = 6,5 Hz).1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8: 3.62 (2H, d, J = 6.3 Hz), 3.97 (2H, s), 4.18-4.32 (3H, m), 4.60 (2H, d, J = 6.7 Hz), 7.29-7.46 (4H, m), 7.58 (1H, t, J = 5.9 Hz), 7.72 (2H , d, J = 7.4 Hz), 7.90 (2H, d, J = 7.4 Hz), 8.71 (1H, t, J = 6.5 Hz).
Proceso 4: 9H-Fluoren-9-ilmetil(2-{[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro- 1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetoxi)metil]amino}-2-oxoetil)carbamatoProcess 4: 9H-Fluoren-9-ylmethyl (2 - {[(2 - {[(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2, 3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] amino} -2 -oxoethoxy) methyl] amino} -2-oxoethyl) carbamate
Con enfriamiento con hielo, a una solución de N,N-dimetilformamida (10,0 ml) de mesilato del compuesto (4) (0,283 g, 0,533 mmol), N-hidroxisuccinimida (61,4 mg, 0,533 mmol), y el compuesto (0,205 g, 0,533 mmol) obtenido en el proceso 3 anterior, se añadieron N,N-diisopropiletilamina (92,9 pl, 0,533 mmol) y N,N'-diciclohexilcarbodiimida (0,143 g, 0,693 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 3 días. El disolvente se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo - capa orgánica repartida de cloroformo : metanol : agua = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color pardo pálido (0,352 g, 82 %). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,81 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,73-1,87 (2H, m), 2,06-2,20 (2H, m), 2,34 (3H, s), 3,01-3,23 (2H, m), 3,58 (2H, d, J = 6,7 Hz), 3,98 (2H, s), 4,13-4,25 (3H, m), 4,60 (2H, d, J = 6,7 Hz), 5,09-5,22 (2H, m), 5,32-5,42 (2H, m), 5,50-5,59 (1H, m), 6,49 (1H, s), 7,24-7,30 (3H, m), 7,36 (2H, t, J = 7,4 Hz), 7,53 (1H, t, J = 6,3 Hz), 7,66 (2H, d, J = 7,4 Hz), 7,75 (1H, d, J = 11,0 Hz), 7,84 (2H, d, J = 7,4 Hz), 8,47 (1H, d, J = 8,6 Hz), 8,77 (1H, t, J = 6,7 Hz).With ice cooling, to a solution of N, N-dimethylformamide (10.0 ml) mesylate of compound (4) (0.283 g, 0.533 mmol), N-hydroxysuccinimide (61.4 mg, 0.533 mmol), and the compound (0.205 g, 0.533 mmol) obtained in the above process 3, N, N-diisopropylethylamine (92.9 pl, 0.533 mmol) and N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (0.133 g, 0.693 mmol) were added and stirred at temperature atmosphere for 3 days. The solvent was removed under reduced pressure and the obtained residues were purified by silica gel column chromatography [chloroform - distributed organic layer of chloroform: methanol: water = 7: 3: 1 (v / v / v)] to produce the title compound in the form of a pale brown solid (0.352 g, 82%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0.81 (3H, t, J = 7.4 Hz), 1.73-1.87 (2H, m), 2.06-2.20 (2H , m), 2.34 (3H, s), 3.01-3.23 (2H, m), 3.58 (2H, d, J = 6.7 Hz), 3.98 (2H, s) , 4.13-4.25 (3H, m), 4.60 (2H, d, J = 6.7 Hz), 5.09-5.22 (2H, m), 5.32-5.42 (2H, m), 5.50-5.59 (1H, m), 6.49 (1H, s), 7.24-7.30 (3H, m), 7.36 (2H, t, J = 7.4 Hz), 7.53 (1H, t, J = 6.3 Hz), 7.66 (2H, d, J = 7.4 Hz), 7.75 (1H, d, J = 11 , 0 Hz), 7.84 (2H, d, J = 7.4 Hz), 8.47 (1H, d, J = 8.6 Hz), 8.77 (1H, t, J = 6.7 Hz)
EM (IEN) m/z: 802 (M+H)+MS (ESI) m / z: 802 (M + H) +
Proceso 5: N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-Process 5: N - [(2 - {[(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13.15 -hexahydro-1H, 12H-
benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetoxi)metil]glicinamidabenzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] amino} -2-oxoethoxy) methyl] glycinamide
A una solución de N,N-dimetilformamida (11,0 ml) del compuesto (0,881 g, 1,10 mmol) obtenido en el proceso 4 anterior, se añadió piperidina (1,1 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se retiró a presión reducida para producir una mezcla que contiene el compuesto del título. La mezcla se usó para la siguiente reacción sin purificación adicional.To a solution of N, N-dimethylformamide (11.0 ml) of the compound (0.881 g, 1.10 mmol) obtained in process 4 above, piperidine (1.1 ml) was added and stirred at room temperature for 2 hours. The solvent was removed under reduced pressure to produce a mixture containing the title compound. The mixture was used for the next reaction without further purification.
Proceso 6: N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-Process 6: N - [(9H-fluoren-9-ylmethoxy) carbonyl] glycylglycyl-L-phenylalanyl-N - [(2 - {[(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4 -methyl-
10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin- 1-yl] amino} -2-
oxoetoxi)metil]glicinamidaoxoethoxy) methyl] glycinamide
Con enfriamiento con hielo, a una solución de N,N-dimetilformamida (50,0 ml) de la mezcla (0,439 mmol) obtenida en el proceso 5 anterior, N-hidroxisuccinimida (0,101 g, 0,878 mmol), y N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]glicilglicil-L- fenilalanina (el compuesto descrito en la patente japonesa abierta a inspección pública n.° 2002-60351) (0,440 g, 0,878 mmol), se añadió N,N'-diciclohexilcarbodiimida (0,181 g, 0,878 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 4 días. El disolvente se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 9 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color naranja pálido (0,269 g, 58 %).With ice cooling, to a solution of N, N-dimethylformamide (50.0 ml) of the mixture (0.439 mmol) obtained in the above process, N-hydroxysuccinimide (0.101 g, 0.878 mmol), and N - [( 9H-fluoren-9-ylmethoxy) carbonyl] glycylglycyl-L-phenylalanine (the compound described in Japanese patent open for public inspection No. 2002-60351) (0.440 g, 0.878 mmol), N, N'-dicyclohexylcarbodiimide was added (0.181 g, 0.878 mmol) and stirred at room temperature for 4 days. The solvent was removed under reduced pressure and the residues obtained were purified by silica gel column chromatography [chloroform-chloroform: methanol = 9: 1 (v / v)] to produce the title compound as a colored solid. pale orange (0.269 g, 58%).
EM (IEN) m/z: 1063 (M+H)+MS (ESI) m / z: 1063 (M + H) +
Proceso 7: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-Process 7: Glycylglycyl-L-phenylalanyl-N - [(2 - {[(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9 , 10,13,15-
hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetoxi)metil]glicinamidahexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6,7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] amino} -2-oxoethoxy) methyl] glycinamide
A una solución de N,N-dimetilformamida (4,00 ml) del compuesto (0,269 g, 0,253 mmol) obtenido en el proceso 6 anterior, se añadió piperidina (0,251 ml, 2,53 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se retiró a presión reducida para producir una mezcla que contiene el compuesto del título. La mezcla se usó para la siguiente reacción sin purificación adicional.To a solution of N, N-dimethylformamide (4.00 ml) of the compound (0.269 g, 0.253 mmol) obtained in the above process 6, piperidine (0.251 ml, 2.53 mmol) was added and stirred at room temperature for 2 hours. The solvent was removed under reduced pressure to produce a mixture containing the title compound. The mixture was used for the next reaction without further purification.
Proceso 8: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-Process 8: N- [6- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoyl] glycylglycyl-L-phenylalanyl-N - [(2 - {[(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-
hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-
il]amino}-2-oxoetoxi)metil]glicinamidail] amino} -2-oxoethoxy) methyl] glycinamide
A una solución de N,N-dimetilformamida (10,0 ml) del compuesto (0,253 mmol) obtenido en el proceso 7 anterior, se añadió hexanoato de N-succinimidil 6-maleimida (0,156 g, 0,506 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 3 días. El disolvente se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columnaTo a solution of N, N-dimethylformamide (10.0 ml) of the compound (0.253 mmol) obtained in the above process 7, N-succinimidyl 6-maleimide hexanoate (0.156 g, 0.506 mmol) was added and stirred at temperature atmosphere for 3 days. The solvent was removed under reduced pressure and the obtained residues were purified by column chromatography.
55
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20twenty
2525
3030
3535
sobre gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 9 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,100 g, 38 %).on silica gel [chloroform - chloroform: methanol = 9: 1 (v / v)] to produce the title compound as a pale yellow solid (0.100 g, 38%).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,83 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,09-1,21 (2H, m), 1,33-1,47 (4H, m), 1,75-1,90 (2H, m), 2,00-2,23 (4H, m), 2,36 (3H, s), 2,69-2,81 (1H, m), 2,94-3,03 (1H, m), 3,06-3,22 (2H, m), 3,23-3,74 (8H, m), 3,98 (2H, s), 4,39-4,50 (1H, m), 4,60 (2H, d, J = 6,7 Hz), 5,17 (2H, s), 5,39 (2H, s), 5,53-5,61 (1H, m), 6,50 (1H, s), 6,96 (2H, s), 7,11-7,24 (5H, m), 7,28 (1H, s), 7,75 (1H, d, J = 11,0 Hz), 7,97 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,03 (1H, t, J = 5,9 Hz), 8,09 (1H, d, J = 7,8 Hz), 8,27 (1H, t, J = 6,5 Hz), 8,48 (1H, d, J = 9,0 Hz), 8,60 (1H, t, J = 6,5 Hz).1H NMR (400 MHz, DMSO-da) 8: 0.83 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.09-1.21 (2H, m), 1.33-1.47 (4H , m), 1.75-1.90 (2H, m), 2.00-2.23 (4H, m), 2.36 (3H, s), 2.69-2.81 (1H, m ), 2.94-3.03 (1H, m), 3.06-3.22 (2H, m), 3.23-3.74 (8H, m), 3.98 (2H, s), 4.39-4.50 (1H, m), 4.60 (2H, d, J = 6.7 Hz), 5.17 (2H, s), 5.39 (2H, s), 5.53 -5.61 (1H, m), 6.50 (1H, s), 6.96 (2H, s), 7.11-7.24 (5H, m), 7.28 (1H, s), 7.75 (1H, d, J = 11.0 Hz), 7.97 (1H, t, J = 5.7 Hz), 8.03 (1H, t, J = 5.9 Hz), 8, 09 (1H, d, J = 7.8 Hz), 8.27 (1H, t, J = 6.5 Hz), 8.48 (1H, d, J = 9.0 Hz), 8.60 ( 1H, t, J = 6.5 Hz).
EM (IEN) m/z: 1034 (M+H)+MS (ESI) m / z: 1034 (M + H) +
Proceso 9: Conjugado de anticuerpo - fármaco (55)Process 9: Antibody-drug conjugate (55)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml sustituyendo el medio con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común C-1 y el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,61 mlmg'1cm'1) descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (1,25 ml) se puso en un tubo de polipropileno de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,025 ml; 3,0 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml by replacing the medium with PBS6.0 / EDTA using the common C-1 procedure and the procedure. common B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mlmg'1cm'1 was used) described in the production procedure 1. The solution (1.25 ml) was placed in a 1.5 ml polypropylene tube and charged with a 10 mM aqueous solution of TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.025 ml; 3.0 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc. ; 0.0625 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir dimetilsulfóxido (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,109 ml) y una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 8 anterior (0,039 ml; 4,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, esta se agitó usando un rotador de tubos (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 40 minutos. A continuación, se añadió una solución acuosa (0,008 ml) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) a la misma y se agitó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente durante otros 20 minutos.Conjugation between antibody and drug linker: After adding dimethylsulfoxide (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0.109 ml) and a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in the above process 8 (0.039 ml; 4.6 equivalents per molecule antibody) to the above solution at room temperature, this was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug linker with the antibody at room temperature for 40 minutes. Next, an aqueous solution (0.008 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and stirred to terminate the drug linker reaction at room temperature for another 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 6 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título. Después de esto, la solución se concentró mediante el procedimiento común A descrito en el procedimiento de producción 1.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 6 ml of a solution containing the antibody-drug title conjugate. After this, the solution was concentrated by the common procedure A described in the production process 1.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), £a,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 5000 (valor promedio medido) y £d,370 = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 12,57 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,8 mg (70%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,2.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ a, 280 = 235300 (estimated calculation value), £ a, 370 = 0 (estimated calculation value) were used, £ d, 280 = 5000 (measured average value) and £ d, 370 = 19000 (measured average value)), the following characteristic values were obtained. Antibody concentration: 12.57 mg / ml, antibody yield: 8.8 mg (70%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.2.
Ejemplo 59 Conjugado de anticuerpo - fármaco (56)Example 59 Antibody-drug conjugate (56)
[Fórmula 128][Formula 128]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (56)Process 1: Antibody-drug conjugate (56)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml sustituyendo el medio con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común C-1 y el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,61 mlmg'1cm'1) descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (1,25 ml) se puso en un tubo de polipropileno de 1,5 ml y se cargóAntibody reduction: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml by replacing the medium with PBS6.0 / EDTA using the common C-1 procedure and the procedure. common B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mlmg'1cm'1 was used) described in the production procedure 1. The solution (1.25 ml) was placed in a 1.5 ml polypropylene tube and it was loaded
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con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,051 ml; 6,0 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.with a 10 mM aqueous solution of TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.051 ml; 6.0 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc .; 0, 0625 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir dimetilsulfóxido (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,067 ml) una solución de dimetilsulfóxido que contiene y 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 8 del Ejemplo 58 (0,085 ml; 10,0 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, esta se agitó usando un rotador de tubos (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 60 minutos. A continuación, se añadió una solución acuosa (0,013 ml) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) a la misma y se agitó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente durante otros 20 minutos.Conjugation between antibody and drug linker: After adding dimethylsulfoxide (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0.067 ml) a solution of dimethylsulfoxide containing and 10 mM of the compound obtained in process 8 of Example 58 (0.085 ml; 10.0 equivalents per antibody molecule) to the above solution at room temperature, it was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug linker with the antibody at room temperature for 60 minutes. Next, an aqueous solution (0.013 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and stirred to terminate the drug linker reaction at room temperature for another 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 6 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 6 ml of a solution containing the antibody-drug title conjugate.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), £a,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 50 00 (valor promedio medido) y £d,370 = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 1,33 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 7,98 mg (64%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 4,9.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ a, 280 = 235300 (estimated calculation value), £ a, 370 = 0 (estimated calculation value) were used, £ d, 280 = 50 00 (measured average value) and £ d, 370 = 19000 (measured average value)), the following characteristic values were obtained. Antibody concentration: 1.33 mg / ml, antibody yield: 7.98 mg (64%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 4.9.
Ejemplo 60 Conjugado de anticuerpo - fármaco (57)Example 60 Antibody-drug conjugate (57)
[Fórmula 129][Formula 129]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (57)Process 1: Antibody-drug conjugate (57)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml sustituyendo el medio con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común C-1 y el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,61 mlmg-1cm-1) descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (1,25 ml) se puso en un tubo de polipropileno de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,051 ml; 6,0 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml by replacing the medium with PBS6.0 / EDTA using the common C-1 procedure and the procedure. common B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mlmg-1cm-1 was used) described in the production procedure 1. The solution (1.25 ml) was placed in a 1.5 ml polypropylene tube and charged with a 10 mM aqueous solution of TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.051 ml; 6.0 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc. ; 0.0625 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir dimetilsulfóxido (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,025 ml) y una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 8 del Ejemplo 58 (0,127 ml; 15,0 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, esta se agitó usando un rotador de tubos (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 60 minutos. A continuación, se añadió una solución acuosa (0,019 ml) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) a la misma y se agitó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente durante otros 20 minutos.Conjugation between antibody and drug linker: After adding dimethylsulfoxide (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0.025 ml) and a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in the process 8 of Example 58 (0.127 ml; 15.0 equivalents per antibody molecule) to the above solution at room temperature, it was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug linker with the antibody at room temperature for 60 minutes. Next, an aqueous solution (0.019 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and stirred to terminate the drug linker reaction at room temperature for another 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 6 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título. Después de esto, la solución se concentró mediante el procedimiento común A descrito en el procedimiento de producción 1.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 6 ml of a solution containing the antibody-drug title conjugate. After this, the solution was concentrated by the common procedure A described in the production process 1.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in the production procedure 1
(como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), £a,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 50 00 (valor promedio medido) y £d,370 = 190 00 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 0,91 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 5,46 mg (44%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,3.(as a molar absorption coefficient, £ a, 280 = 235300 (estimated calculation value), £ a, 370 = 0 (estimated calculation value), £ d, 280 = 50 00 (average measured value) and £ d were used , 370 = 190 00 (measured average value)), the following characteristic values were obtained. Antibody concentration: 0.91 mg / ml, antibody yield: 5.46 mg (44%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 6.3.
5 Ejemplo 61 Conjugado de anticuerpo - fármaco (58)5 Example 61 Antibody-drug conjugate (58)
[Fórmula 130][Formula 130]
Casi la totalidad de las cantidades de los conjugados de anticuerpo - fármaco de Ejemplos 59 y 60 se mezclaron y la solución se concentró mediante el procedimiento común A descrito en el procedimiento de producción 1 para producir el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Almost all of the amounts of the antibody-drug conjugates of Examples 59 and 60 were mixed and the solution was concentrated by the common procedure A described in the production process 1 to produce the antibody-drug title conjugate.
Concentración de anticuerpo: 10,0 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 12,30 mg, y número promedio de moléculas de 10 fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 5,4.Antibody concentration: 10.0 mg / ml, antibody yield: 12.30 mg, and average number of 10 conjugate drug molecules (n) per antibody molecule: 5.4.
Ejemplo 62 Conjugado de anticuerpo - fármaco (59)Example 62 Antibody-drug conjugate (59)
[Fórmula 131][Formula 131]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (59)Process 1: Antibody-drug conjugate (59)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 1 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como 15 coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,61 mlmg-1cm-1) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (100 ml, 1 g del anticuerpo) se puso en un matraz de 250 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (2,43 ml; 3,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) y adicionalmente con una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (5 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH cerca de 7,4 usando un pehachímetro, el enlace de disulfuro en 20 una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 1 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using the common procedure B (as 15 absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mlmg-1cm-1) was used and the common C-1 procedure described in the production process 1. The solution (100 ml, 1 g of the antibody) was placed in a 250 ml flask and charged with a 10 mM aqueous solution of TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (2.43 ml; 3.6 equivalents per antibody molecule) and additionally with a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (5 ml). After confirming that the solution had a pH near 7.4 using a pehachmeter, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 8 del Ejemplo 58 (3,51 ml; 5,2 equivalentes por molécula de anticuerpo) y dimetilsulfóxido (2,14 ml) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó con un agitador para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo en un baño de agua a 15 °C durante 130 minutos. A 25 continuación, una solución acuosa (0,547 ml) de NAC 100 mM se añadió a la misma y se incubó adicionalmente para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente durante 20 minutos.Conjugation between antibody and drug linker: After adding a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in process 8 of Example 58 (3.51 ml; 5.2 equivalents per antibody molecule) and dimethylsulfoxide (2.14 ml) at the above solution at room temperature, it was stirred with a stirrer to conjugate the drug linker with the antibody in a water bath at 15 ° C for 130 minutes. Then, an aqueous solution (0.547 ml) of 100 mM NAC was added thereto and further incubated to terminate the drug linker reaction at room temperature for 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación por ultrafiltración usando un aparato de ultrafiltración compuesto por una membrana de ultrafiltración (Merck Japan, Casete Pellicon XL, Biomax 50 KDa), una bomba de tubo (Cole-Parmer International, Bomba MasterFlex modelo 77521-40, Cabezal de Bomba modelo 7518-00), y unPurification: The above solution was subjected to ultrafiltration purification using an ultrafiltration apparatus composed of an ultrafiltration membrane (Merck Japan, Pellicon XL Cassette, Biomax 50 KDa), a tube pump (Cole-Parmer International, Model 77521 MasterFlex Pump- 40, Pump Head model 7518-00), and a
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tubo (Cole-Parmer International, Tubo MasterFlex L/S16). Específicamente, al tiempo que se añadía ABS gota a gota (un total de 800 ml) como una solución tampón para la purificación a la solución de reacción, se realizó una purificación por ultrafiltración para retirar enlazadores de fármaco no conjugados y otros reactivos de bajo peso molecular, sustituir también la solución tampón con ABS, y concentrar adicionalmente la solución, para producir aproximadamente 70 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.tube (Cole-Parmer International, MasterFlex Tube L / S16). Specifically, while ABS was added dropwise (a total of 800 ml) as a buffer solution for purification to the reaction solution, ultrafiltration purification was performed to remove unconjugated drug linkers and other low weight reagents molecular, also replace the buffer solution with ABS, and further concentrate the solution, to produce approximately 70 ml of a solution containing the antibody-drug title conjugate.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), £a,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 5178 (valor medido) y £d,370 = 20217 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ a, 280 = 235300 (estimated calculation value), £ a, 370 = 0 (estimated calculation value) were used, £ d, 280 = 5178 (measured value) and £ d, 370 = 20217 (measured value)), the following characteristic values were obtained.
Concentración de anticuerpo: 14,2 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 1,0 g (aproximadamente 100 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,2.Antibody concentration: 14.2 mg / ml, antibody yield: 1.0 g (approximately 100%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.2.
Ejemplo 63 Conjugado de anticuerpo - fármaco (60)Example 63 Antibody-drug conjugate (60)
[Fórmula 132][Formula 132]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (60)Process 1: Antibody-drug conjugate (60)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 1 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,61 mlmg'1cm'1) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (5 ml, 50 mg del anticuerpo) se puso en un tubo de 15 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,075 ml; 4 equivalentes por molécula de anticuerpo). Después de confirmar que la solución tenía un pH cerca de 7,0 usando un pehachímetro, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 1 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm , 1.61 mlmg'1cm'1) was used and the common C-1 procedure described in the production procedure 1. The solution (5 ml, 50 mg of the antibody) was placed in a 15 ml tube and loaded with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.075 ml; 4 equivalents per antibody molecule). After confirming that the solution had a pH near 7.0 using a pehachmeter, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 8 del Ejemplo 58 (0,219 ml; 6,5 equivalentes por molécula de anticuerpo) y dimetilsulfóxido (0,064 ml) a la solución anterior, se incubó para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo en un baño de agua a 15 °C durante 90 minutos. A continuación, una solución acuosa (0,033 ml; 9,8 equivalentes por molécula de anticuerpo) de NAC 100 mM se añadió a la misma y se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente durante otros 20 minutos. Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 19 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Conjugation between antibody and drug linker: After adding a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in process 8 of Example 58 (0.219 ml; 6.5 equivalents per antibody molecule) and dimethylsulfoxide (0.064 ml) to the The above solution was incubated to conjugate the drug linker with the antibody in a water bath at 15 ° C for 90 minutes. Next, an aqueous solution (0.033 ml; 9.8 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC was added thereto and incubated to terminate the drug linker reaction at room temperature for another 20 minutes. Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 19 ml of a solution containing the antibody-drug title conjugate.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), £a,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 5178 (valor medido) y £d,370 = 20217 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ a, 280 = 235300 (estimated calculation value), £ a, 370 = 0 (estimated calculation value) were used, £ d, 280 = 5178 (measured value) and £ d, 370 = 20217 (measured value)), the following characteristic values were obtained.
Concentración de anticuerpo: 2,19 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 42 mg (83%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 4,7.Antibody concentration: 2.19 mg / ml, antibody yield: 42 mg (83%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 4.7.
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[Fórmula 133][Formula 133]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (61)Process 1: Antibody-drug conjugate (61)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 1 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,61 mlmg-1cm-1) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (4 ml, 40 mg del anticuerpo) se puso en un tubo de 15 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,14 ml; 5,2 equivalentes por molécula de anticuerpo). Después de confirmar que la solución tenía un pH cerca de 7,0 usando un pehachímetro, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora. Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 8 del Ejemplo 58 (0,232 ml; 8,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior, se incubó para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo en un baño de agua a 15 °C durante 60 minutos. A continuación, una solución acuosa (0,035 ml; 12,9 equivalentes por molécula de anticuerpo) de NAC 100 mM se añadió a la misma y se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente durante otros 20 minutos.Antibody reduction: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 1 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm , 1.61 mlmg-1cm-1) was used and the common C-1 procedure described in the production procedure 1. The solution (4 ml, 40 mg of the antibody) was placed in a 15 ml tube and loaded with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.14 ml; 5.2 equivalents per antibody molecule). After confirming that the solution had a pH near 7.0 using a pehachmeter, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour. Conjugation between antibody and drug linker: After adding a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in process 8 of Example 58 (0.232 ml; 8.6 equivalents per antibody molecule) to the above solution, it was incubated to conjugate the drug linker with the antibody in a water bath at 15 ° C for 60 minutes. Next, an aqueous solution (0.035 ml; 12.9 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC was added thereto and incubated to terminate the drug linker reaction at room temperature for another 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 13 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 13 ml of a solution containing the antibody-drug title conjugate.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £A,28o = 235300 (valor de cálculo estimado), £A,37o = 0 (valor de cálculo estimado), £D,28o = 5178 (valor medido) y £d,370 = 20217 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ A, 28o = 235300 (estimated calculation value), £ A, 37o = 0 (estimated calculation value) were used, £ D, 28o = 5178 (measured value) and £ d, 370 = 20217 (measured value)), the following characteristic values were obtained.
Concentración de anticuerpo: 2,03 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 26 mg (66%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 5,7.Antibody concentration: 2.03 mg / ml, antibody yield: 26 mg (66%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 5.7.
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[Fórmula 134][Formula 134]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (62)Process 1: Antibody-drug conjugate (62)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4 producido en el Ejemplo de Referencia 1 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,61 mlmg^cm"1) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (1,25 ml, 12,5 mg del anticuerpo) se puso en un tubo de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0287 ml; 3,4 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The M30-H1-L4 antibody produced in Reference Example 1 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm , 1.61 mlmg ^ cm "1) was used and the common C-1 procedure described in the production process 1. The solution (1.25 ml, 12.5 mg of the antibody) was placed in a 1-tube, 5 ml and charged with a 10 mM aqueous solution of TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0287 ml; 3.4 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc .; 0.0625 ml.) After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide bond on a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 8 del Ejemplo 58 (0,0439 ml; 5,2 equivalentes por molécula de anticuerpo) y dimetilsulfóxido (0,0267 ml) a la solución anterior a temperatura ambiente, se incubó para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo en un baño de agua a 15 °C durante 1 hora. A continuación, una solución acuosa (0,0066 ml) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) se añadió a la misma y se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente durante otros 20 minutos. Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 6 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título. Después de esto, la solución se concentró mediante el procedimiento común A.Conjugation between antibody and drug linker: After adding a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in process 8 of Example 58 (0.0439 ml; 5.2 equivalents per antibody molecule) and dimethylsulfoxide (0.0267 ml) at the above solution at room temperature, it was incubated to conjugate the drug linker with the antibody in a water bath at 15 ° C for 1 hour. Next, an aqueous solution (0.0066 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug linker reaction at room temperature for another 20 minutes. Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 6 ml of a solution containing the antibody-drug title conjugate. After this, the solution was concentrated by common procedure A.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £A,28o = 235300 (valor de cálculo estimado), £Aí370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 5178 (valor medido) y £d,370 = 20217 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ A, 28o = 235300 (estimated calculation value), £ A370 = 0 (estimated calculation value), £ d were used , 280 = 5178 (measured value) and £ d, 370 = 20217 (measured value)), the following characteristic values were obtained.
Concentración de anticuerpo: 10,0 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 7,8 mg (62%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,4.Antibody concentration: 10.0 mg / ml, antibody yield: 7.8 mg (62%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.4.
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[Fórmula 135][Formula 135]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (63)Process 1: Antibody-drug conjugate (63)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4 producido en el Ejemplo de Referencia 1 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,61 mlmg"1cm"1) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (1,25 ml, 12,5 mg del anticuerpo) se puso en un tubo de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0439 ml; 5,2 equivalentes por molécula de anticuerpo) (0,0287 ml; 3,4 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The M30-H1-L4 antibody produced in Reference Example 1 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm , 1.61 mlmg "1cm" 1) was used and the common C-1 procedure described in the production process 1. The solution (1.25 ml, 12.5 mg of the antibody) was placed in a 1 tube, 5 ml and charged with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0439 ml; 5.2 equivalents per antibody molecule) (0.0287 ml; 3.4 equivalents per molecule of antibody) and an aqueous solution of dipotassium hydrogen phosphate 1 M (Nacalai Tesque, Inc .; 0.0625 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 8 del Ejemplo 58 (0,0726 ml; 8,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se incubó para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo en un baño de agua a 15 °C durante 1 hora. A continuación, una solución acuosa (0,011 ml) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) se añadió a la misma y se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente durante otros 20 minutos.Conjugation between antibody and drug linker: After adding a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in process 8 of Example 58 (0.0726 ml; 8.6 equivalents per antibody molecule) to the above solution at temperature ambient, it was incubated to conjugate the drug linker with the antibody in a water bath at 15 ° C for 1 hour. Next, an aqueous solution (0.011 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug linker reaction at room temperature for another 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 6 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título. Después de esto, la solución se concentró mediante el procedimiento común A.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 6 ml of a solution containing the antibody-drug title conjugate. After this, the solution was concentrated by common procedure A.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), £a,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 5178 (valor medido) y £d,370 = 20217 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ a, 280 = 235300 (estimated calculation value), £ a, 370 = 0 (estimated calculation value) were used, £ d, 280 = 5178 (measured value) and £ d, 370 = 20217 (measured value)), the following characteristic values were obtained.
Concentración de anticuerpo: 10,0 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 7,3 mg (58 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 5,4.Antibody concentration: 10.0 mg / ml, antibody yield: 7.3 mg (58%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 5.4.
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1010
15fifteen
20twenty
2525
[Fórmula 136][Formula 136]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (64)Process 1: Antibody-drug conjugate (64)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo anti-CD30 producido en el Ejemplo de Referencia 3 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,75 mlmg-1cm-1) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (0,4 ml, 4 mg del anticuerpo) se puso en un tubo de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0065 ml; 2,5 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0058 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,0 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The anti-CD30 antibody produced in Reference Example 3 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, se used 1.75 mlmg-1cm-1) and the common C-1 procedure described in production procedure 1. The solution (0.4 ml, 4 mg of the antibody) was placed in a 1.5 ml tube and charged with a 10 mM aqueous solution of TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0065 ml; 2.5 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc. ; 0.0058 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.0 ± 0.1, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 8 del Ejemplo 58 (0,0116 ml; 4,5 equivalentes por molécula de anticuerpo) y dimetilsulfóxido (0,0101 ml) a la solución anterior a temperatura ambiente, esta se agitó usando un rotador de tubos (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, una solución acuosa (0,0017 ml) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) se añadió a la misma y se incubó adicionalmente para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente durante 20 minutos.Conjugation between antibody and drug linker: After adding a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in process 8 of Example 58 (0.0116 ml; 4.5 equivalents per antibody molecule) and dimethylsulfoxide (0.0101 ml) to the above solution at room temperature, this was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug linker with the antibody at room temperature for 1 hour. Next, an aqueous solution (0.0017 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and further incubated to terminate the drug linker reaction at room temperature for 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 2,5 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 2.5 ml of a solution containing the antibody-title drug conjugate. .
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,280 = 270400 (valor de cálculo estimado), £a,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 5178 (valor medido) y £d,370 = 20217 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ a, 280 = 270400 (estimated calculation value), £ a, 370 = 0 (estimated calculation value) were used, £ d, 280 = 5178 (measured value) and £ d, 370 = 20217 (measured value)), the following characteristic values were obtained.
Concentración de anticuerpo: 0,96 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 2,4 mg (60%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,7.Antibody concentration: 0.96 mg / ml, antibody yield: 2.4 mg (60%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.7.
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15fifteen
20twenty
2525
[Fórmula 137][Formula 137]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (65)Process 1: Antibody-drug conjugate (65)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo anti-CD30 producido en el Ejemplo de Referencia 3 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,75 mlmg"1cm"1) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (0,4 ml, 4 mg del anticuerpo) se puso en un tubo de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0129 ml; 5 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,006 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,0 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The anti-CD30 antibody produced in Reference Example 3 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, se used 1.75 mlmg "1cm" 1) and the common C-1 procedure described in the production procedure 1. The solution (0.4 ml, 4 mg of the antibody) was placed in a 1.5 ml tube and loaded with a 10 mM aqueous solution of TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0129 ml; 5 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc .; 0.006 ml) After confirming that the solution had a pH of 7.0 ± 0.1, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 8 del Ejemplo 58 (0,0233 ml; 9 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, esta se agitó usando un rotador de tubos (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, una solución acuosa (0,0035 ml) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) se añadió a la misma y se incubó adicionalmente para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente durante 20 minutos.Conjugation between antibody and drug linker: After adding a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in process 8 of Example 58 (0.0233 ml; 9 equivalents per antibody molecule) to the above solution at room temperature, This was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug linker with the antibody at room temperature for 1 hour. Next, an aqueous solution (0.0035 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and further incubated to terminate the drug linker reaction at room temperature for 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 2,5 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 2.5 ml of a solution containing the antibody-title drug conjugate. .
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,280 = 270400 (valor de cálculo estimado), £a,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 5178 (valor medido) y £0,370 = 20217 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ a, 280 = 270400 (estimated calculation value), £ a, 370 = 0 (estimated calculation value) were used, £ d, 280 = 5178 (measured value) and £ 0.370 = 20217 (measured value)), the following characteristic values were obtained.
Concentración de anticuerpo: 0,39 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 1,0 mg (24%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,8.Antibody concentration: 0.39 mg / ml, antibody yield: 1.0 mg (24%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 6.8.
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1010
15fifteen
20twenty
2525
[Fórmula 138][Formula 138]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (66)Process 1: Antibody-drug conjugate (66)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo anti-CD33 producido en el Ejemplo de Referencia 4 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,66 mlmg"1cm"1) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (0,4 ml, 4 mg del anticuerpo) se puso en un tubo de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0065 ml; 2,5 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0058 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,0 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The anti-CD33 antibody produced in Reference Example 4 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, se used 1.66 mlmg "1cm" 1) and the common C-1 procedure described in the production procedure 1. The solution (0.4 ml, 4 mg of the antibody) was put in a 1.5 ml tube and charged with a 10 mM aqueous solution of TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0065 ml; 2.5 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc. ; 0.0058 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.0 ± 0.1, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 8 del Ejemplo 58 (0,0116 ml; 4,5 equivalentes por molécula de anticuerpo) y dimetilsulfóxido (0,0101 ml) a la solución anterior a temperatura ambiente, esta se agitó usando un rotador de tubos (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, una solución acuosa (0,0017 ml) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) se añadió a la misma y se incubó adicionalmente para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente durante 20 minutos.Conjugation between antibody and drug linker: After adding a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in process 8 of Example 58 (0.0116 ml; 4.5 equivalents per antibody molecule) and dimethylsulfoxide (0.0101 ml) to the above solution at room temperature, this was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug linker with the antibody at room temperature for 1 hour. Next, an aqueous solution (0.0017 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and further incubated to terminate the drug linker reaction at room temperature for 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 2,5 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 2.5 ml of a solution containing the antibody-title drug conjugate. .
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,280 = 256400 (valor de cálculo estimado), £a,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 5178 (valor medido) y £d,370 = 20217 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ a, 280 = 256400 (estimated calculation value), £ a, 370 = 0 (estimated calculation value) were used, £ d, 280 = 5178 (measured value) and £ d, 370 = 20217 (measured value)), the following characteristic values were obtained.
Concentración de anticuerpo: 1,19 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 3,0 mg (74%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,8.Antibody concentration: 1.19 mg / ml, antibody yield: 3.0 mg (74%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.8.
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1010
15fifteen
20twenty
2525
[Fórmula 139][Formula 139]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (67)Process 1: Antibody-drug conjugate (67)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo anti-CD33 producido en el Ejemplo de Referencia 4 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,66 mlmg"1cm"1) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (0,4 ml, 4 mg del anticuerpo) se puso en un tubo de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0129 ml; 5 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,006 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,0 ± 0,1, el enlace de disulfuro en la parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The anti-CD33 antibody produced in Reference Example 4 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, se used 1.66 mlmg "1cm" 1) and the common C-1 procedure described in the production procedure 1. The solution (0.4 ml, 4 mg of the antibody) was put in a 1.5 ml tube and loaded with a 10 mM aqueous solution of TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0129 ml; 5 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc .; 0.006 ml) After confirming that the solution had a pH of 7.0 ± 0.1, the disulfide bond in the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 8 del Ejemplo 58 (0,0233 ml; 9 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, esta se agitó usando un rotador de tubos (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, una solución acuosa (0,0035 ml) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) se añadió a la misma y se incubó adicionalmente para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente durante 20 minutos.Conjugation between antibody and drug linker: After adding a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in process 8 of Example 58 (0.0233 ml; 9 equivalents per antibody molecule) to the above solution at room temperature, This was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug linker with the antibody at room temperature for 1 hour. Next, an aqueous solution (0.0035 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and further incubated to terminate the drug linker reaction at room temperature for 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 2,5 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 2.5 ml of a solution containing the antibody-title drug conjugate. .
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,280 = 256400 (valor de cálculo estimado), £a,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 5 1 78 (valor medido) y £d,370 = 20217 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ a, 280 = 256400 (estimated calculation value), £ a, 370 = 0 (estimated calculation value) were used, £ d, 280 = 5 1 78 (measured value) and £ d, 370 = 20217 (measured value)), the following characteristic values were obtained.
Concentración de anticuerpo: 1,24 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 3,1 mg (78%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 7,0.Antibody concentration: 1.24 mg / ml, antibody yield: 3.1 mg (78%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 7.0.
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1010
15fifteen
20twenty
2525
[Fórmula 140][Formula 140]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (68)Process 1: Antibody-drug conjugate (68)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo anti-CD70 producido en el Ejemplo de Referencia 5 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,69 mlmg"1cm"1) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (0,4 ml, 4 mg del anticuerpo) se puso en un tubo de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0065 ml; 2,5 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0058 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,0 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The anti-CD70 antibody produced in Reference Example 5 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, se used 1.69 mlmg "1cm" 1) and the common C-1 procedure described in the production process 1. The solution (0.4 ml, 4 mg of the antibody) was put in a 1.5 ml tube and charged with a 10 mM aqueous solution of TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0065 ml; 2.5 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc. ; 0.0058 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.0 ± 0.1, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 8 del Ejemplo 58 (0,0116 ml; 4,5 equivalentes por molécula de anticuerpo) y dimetilsulfóxido (0,0101 ml) a la solución anterior a temperatura ambiente, esta se agitó usando un rotador de tubos (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, una solución acuosa (0,0017 ml) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) se añadió a la misma y se incubó adicionalmente para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente durante 20 minutos.Conjugation between antibody and drug linker: After adding a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in process 8 of Example 58 (0.0116 ml; 4.5 equivalents per antibody molecule) and dimethylsulfoxide (0.0101 ml) to the above solution at room temperature, this was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug linker with the antibody at room temperature for 1 hour. Next, an aqueous solution (0.0017 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and further incubated to terminate the drug linker reaction at room temperature for 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 2,5 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 2.5 ml of a solution containing the antibody-title drug conjugate. .
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron £a,280 = 262400 (valor de cálculo estimado), £a,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 5 1 78 (valor medido) y £d,370 = 20217 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as a molar absorption coefficient, £ a, 280 = 262400 (estimated calculation value), £ a, 370 = 0 (estimated calculation value) were used, £ d, 280 = 5 1 78 (measured value) and £ d, 370 = 20217 (measured value)), the following characteristic values were obtained.
Concentración de anticuerpo: 1,10 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 2,8 mg (69%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,8.Antibody concentration: 1.10 mg / ml, antibody yield: 2.8 mg (69%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.8.
55
1010
15fifteen
20twenty
2525
[Fórmula 141][Formula 141]
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo - fármaco (69)Process 1: Antibody-drug conjugate (69)
Reducción del anticuerpo: El anticuerpo anti-CD70 producido en el Ejemplo de Referencia 5 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1,69 mlmg"1cm"1) y el procedimiento común C-1 descrito en el procedimiento de producción 1. La solución (0,4 ml, 4 mg del anticuerpo) se puso en un tubo de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0129 ml; 5 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,006 ml). Después de confirmar que la solución tenía un pH de 7,0 ± 0,1, el enlace de disulfuro en una parte de bisagra en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C durante 1 hora.Antibody reduction: The anti-CD70 antibody produced in Reference Example 5 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg / ml with PBS6.0 / EDTA using the common procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, se used 1.69 mlmg "1cm" 1) and the common C-1 procedure described in the production process 1. The solution (0.4 ml, 4 mg of the antibody) was put in a 1.5 ml tube and loaded with a 10 mM aqueous solution of TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0129 ml; 5 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc .; 0.006 ml) After confirming that the solution had a pH of 7.0 ± 0.1, the disulfide bond in a hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37 ° C for 1 hour.
Conjugación entre anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir una solución de dimetilsulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el proceso 8 del Ejemplo 58 (0,0233 ml; 9 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, esta se agitó usando un rotador de tubos (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, una solución acuosa (0,0035 ml) de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) se añadió a la misma y se incubó adicionalmente para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente durante 20 minutos.Conjugation between antibody and drug linker: After adding a solution of dimethylsulfoxide containing 10 mM of the compound obtained in process 8 of Example 58 (0.0233 ml; 9 equivalents per antibody molecule) to the above solution at room temperature, This was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug linker with the antibody at room temperature for 1 hour. Next, an aqueous solution (0.0035 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and further incubated to terminate the drug linker reaction at room temperature for 20 minutes.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) descrito en el procedimiento de producción 1 para producir 2,5 ml de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo - fármaco del título.Purification: The above solution was subjected to purification using the common D-1 procedure (ABS was used as the buffer solution) described in production procedure 1 to produce 2.5 ml of a solution containing the antibody-title drug conjugate. .
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común E descrito en el procedimiento de producción 1 (como coeficiente de absorción molar, se usaron ea,280 = 262400 (valor de cálculo estimado), £a,370 = 0 (valor de cálculo estimado), £d,280 = 5178 (valor medido) y £0,370 = 20217 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.Physicochemical characterization: Using the common procedure E described in production procedure 1 (as molar absorption coefficient, ea, 280 = 262400 (estimated calculation value), £ a, 370 = 0 (estimated calculation value), £ d, 280 = 5178 (measured value) and £ 0.370 = 20217 (measured value)), the following characteristic values were obtained.
Concentración de anticuerpo: 1,16 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 2,9 mg (73%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 7,0.Antibody concentration: 1.16 mg / ml, antibody yield: 2.9 mg (73%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 7.0.
55
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[Fórmula 142][Formula 142]
Proceso 1: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1 -il)hexanoM]glicMglicil-L-fenMo alaninato de terc-butiloProcess 1: N- [6- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrole-1-yl) hexane M] glyc-Glycyl-L-fenMo tert-butyl alaninate
Con enfriamiento con hielo, a una solución de THF (12,0 ml) de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilo alaninato de terc-butilo (J. Pept. Res., 1999, vol. 53, págs. 393) (0,400 g, 0,717 mmol), se añadió 1,8- diazabiciclo[5.4.0]-7-undeceno (0,400 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 4 días, y entonces se añadió adicionalmente hexanoato de N-succinimidil 6-maleimida (0,221 g, 0,717 mmol) y se agitó durante 3 horas. La solución de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con una solución acuosa de ácido cítrico al 10 %, una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato sódico, y salmuera saturada, y entonces la capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Después de que el disolvente se retirara a presión reducida, los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 9 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,295 g, 78%).With ice cooling, to a THF solution (12.0 ml) of tert-butyl N - [(9H-fluoren-9-ylmethoxy) carbonyl] glycylglycyl-L-phenyl alaninate (J. Pept. Res., 1999 , vol. 53, pp. 393) (0.400 g, 0.717 mmol), 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene (0.400 ml) was added and stirred at room temperature for 4 days, and then additionally added N-succinimidyl 6-maleimide hexanoate (0.221 g, 0.717 mmol) and stirred for 3 hours. The reaction solution was diluted with ethyl acetate and washed with a 10% aqueous solution of citric acid, a saturated aqueous solution of sodium hydrogen carbonate, and saturated brine, and then the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate. After the solvent was removed under reduced pressure, the residues obtained were purified by column chromatography on silica gel [chloroform-chloroform: methanol = 9: 1 (v / v)] to produce the title compound as a pale yellow solid (0.295 g, 78%).
RMN 1H (400 MHz, CDCh) 5: 1,28-1,36 (2H, m), 1,41 (9H, s), 1,57-1,71 (4H, m), 2,23 (2H, t, J = 7,6 Hz), 3,09 (2H, d, J = 6,0 Hz), 3,51 (2H, t, J = 7,6 Hz), 3,85-4,02 (4H, m), 4,69-4,78 (1H, m), 6,15 (1H, t, J = 4,6 Hz), 6,33 (1H, d, J = 7,3 Hz), 6,60 (1H, t, J = 5,0 Hz), 6,68 (2H, s), 7,10-7,16 (2H, m), 7,22-7,31 (3H, m).1H NMR (400 MHz, CDCh) 5: 1.28-1.36 (2H, m), 1.41 (9H, s), 1.57-1.71 (4H, m), 2.23 (2H , t, J = 7.6 Hz), 3.09 (2H, d, J = 6.0 Hz), 3.51 (2H, t, J = 7.6 Hz), 3.85-4.02 (4H, m), 4.69-4.78 (1H, m), 6.15 (1H, t, J = 4.6 Hz), 6.33 (1H, d, J = 7.3 Hz) , 6.60 (1H, t, J = 5.0 Hz), 6.68 (2H, s), 7.10-7.16 (2H, m), 7.22-7.31 (3H, m ).
EM (IEN) m/z: 529 (M+H)+MS (ESI) m / z: 529 (M + H) +
Proceso 2: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1 -il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalaninaProcess 2: N- [6- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoyl] glycylglycyl-L-phenylalanine
A una solución de diclorometano (8,00 ml) del compuesto (0,295 g, 0,558 mmol) obtenido en el proceso 1 anterior, se añadió ácido trifluoroacético (4,00 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. El disolvente se retiró a presión reducida para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,240 g, 91To a dichloromethane solution (8.00 ml) of the compound (0.295 g, 0.588 mmol) obtained in process 1 above, trifluoroacetic acid (4.00 ml) was added and stirred at room temperature for 18 hours. The solvent was removed under reduced pressure to produce the title compound as a pale yellow solid (0.240 g, 91
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 5: 1,15-1,23 (2H, m), 1,40-1,53 (4H, m), 2,10 (2H, t, J = 7,6 Hz), 2,88 (1H, dd, J = 13,7, 8,9 Hz), 3,04 (1H, dd, J = 13,7, 5,0 Hz), 3,35-3,43 (2H, m), 3,58-3,77 (4H, m), 4,41 (1H, td, J = 7,8, 5,0 Hz), 7,00 (2H, s), 7,16-7,31 (5H, m), 8,00 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,06 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,13 (1H, d, J = 7,8 Hz).1H NMR (400 MHz, DMSO-da) 5: 1.15-1.23 (2H, m), 1.40-1.53 (4H, m), 2.10 (2H, t, J = 7, 6 Hz), 2.88 (1H, dd, J = 13.7, 8.9 Hz), 3.04 (1H, dd, J = 13.7, 5.0 Hz), 3.35-3, 43 (2H, m), 3.58-3.77 (4H, m), 4.41 (1H, td, J = 7.8, 5.0 Hz), 7.00 (2H, s), 7 , 16-7.31 (5H, m), 8.00 (1H, t, J = 5.7 Hz), 8.06 (1H, t, J = 5.7 Hz), 8.13 (1H, d, J = 7.8 Hz).
Proceso 3: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-Process 3: N- [6- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoyl] glycylglycyl-L-phenylalanyl-N - [(2 - {[(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-
hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-
il]amino}-2-oxoetoxi)metil]glicinamidail] amino} -2-oxoethoxy) methyl] glycinamide
El compuesto (0,572 g, 1,21 mmol) obtenido en el proceso 2 anterior se disolvió en diclorometano (12,0 ml), se cargó con N-hidroxisuccinimida (0,152 g, 1,32 mmol) y clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (0,253 g,The compound (0.572 g, 1.21 mmol) obtained in the above process 2 was dissolved in dichloromethane (12.0 ml), loaded with N-hydroxysuccinimide (0.152 g, 1.32 mmol) and 1- (3 hydrochloride) -dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide (0.253 g,
1,32 mmol), y se agitó durante 1 hora. La solución de reacción se añadió a una solución de N,N-dimetilformamida (22,0 ml) de la mezcla (1,10 mmol) obtenida en el proceso 5 del Ejemplo 58, y se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La solución de reacción se cargó con una solución acuosa de ácido cítrico al 10 % y se extrajo con cloroformo. La capa orgánica obtenida se secó sobre sulfato sódico y se filtró. El disolvente se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 8 : 2 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,351 g, 31 %). Los datos instrumentales del compuesto fueron los mismos que los del compuesto del proceso 8 del Ejemplo 58.1.32 mmol), and stirred for 1 hour. The reaction solution was added to a solution of N, N-dimethylformamide (22.0 ml) of the mixture (1.10 mmol) obtained in process 5 of Example 58, and stirred at room temperature for 3 hours. The reaction solution was charged with a 10% aqueous citric acid solution and extracted with chloroform. The organic layer obtained was dried over sodium sulfate and filtered. The solvent was removed under reduced pressure and the residues obtained were purified by silica gel column chromatography [chloroform-chloroform: methanol = 8: 2 (v / v)] to produce the title compound as a colored solid. pale yellow (0.351 g, 31%). The instrumental data of the compound were the same as those of the compound of process 8 of Example 58.
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[Fórmula 143][Formula 143]
Proceso 1: [({N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]glicil}amino)metoxi]acetato de benciloProcess 1: [({N - [(9H-fluoren-9-ylmethoxy) carbonyl] glycyl} amino) methoxy] benzyl acetate
A una solución de tetrahidrofurano (200 ml) del compuesto (7,37 g, 20,0 mmol) obtenido en el proceso 1 del Ejemplo 58, se añadieron glicolato de bencilo (6,65 g, 40,0 mmol) y ácido p-tolueno sulfónico monohidrato (0,381 g, 2,00 mmol) a 0 °C y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y 30 minutos. La solución de reacción se cargó con una solución saturada acuosa de hidrogenocarbonato sódico y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica obtenida se secó sobre sulfato sódico y se filtró. El disolvente se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [hexano : acetato de etilo = 100 : 0 (v/v) - 0 : 100] para producir el compuesto del título en forma de un sólido incoloro (6,75 g, 71 %). Los datos instrumentales del compuesto fueron los mismos que los del compuesto del proceso 2 del Ejemplo 58.To a solution of tetrahydrofuran (200 ml) of the compound (7.37 g, 20.0 mmol) obtained in process 1 of Example 58, benzyl glycolate (6.65 g, 40.0 mmol) and p-acid were added -toluene sulfonic monohydrate (0.381 g, 2.00 mmol) at 0 ° C and stirred at room temperature for 2 hours and 30 minutes. The reaction solution was charged with a saturated aqueous solution of sodium hydrogen carbonate and extracted with ethyl acetate. The organic layer obtained was dried over sodium sulfate and filtered. The solvent was removed under reduced pressure and the obtained residues were purified by column chromatography on silica gel [hexane: ethyl acetate = 100: 0 (v / v) - 0: 100] to produce the title compound as a colorless solid (6.75 g, 71%). The instrumental data of the compound were the same as those of the compound of process 2 of Example 58.
Proceso 2: N-[(benciloxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalanina-N-{[(2-(benciloxi)-2-oxoetoxi]metil}glicinamidaProcess 2: N - [(benzyloxy) carbonyl] glycylglycyl-L-phenylalanine-N - {[(2- (benzyloxy) -2-oxoethoxy] methyl} glycinamide
A una solución de N,N-dimetilformamida (140 ml) del compuesto (6,60 g, 13,9 mmol) obtenido en el proceso 1 anterior, se añadió 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (2,22 g, 14,6 mmol) a 0 °C y se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. La solución de reacción se cargó con una solución de N,N-dimetilformamida (140 ml) de N- [(benciloxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalanina (6,33 g, 15,3 mmol), N-hidroxisuccinimida (1,92 g, 16,7 mmol) y clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (3,20 g, 16,7 mmol) agitara por adelantado a temperatura ambiente durante 1 hora, y se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La solución de reacción se cargó con ácido clorhídrico 0,1 N y se extrajo con cloroformo. La capa orgánica obtenida se secó sobre sulfato sódico y se filtró. El disolvente se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 8 : 2 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido incoloro (7,10 g, 79%).To a solution of N, N-dimethylformamide (140 ml) of the compound (6.60 g, 13.9 mmol) obtained in process 1 above, 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene was added (2.22 g, 14.6 mmol) at 0 ° C and stirred at room temperature for 15 minutes. The reaction solution was charged with a solution of N, N-dimethylformamide (140 ml) of N- [(benzyloxy) carbonyl] glycylglycyl-L-phenylalanine (6.33 g, 15.3 mmol), N-hydroxysuccinimide (1 , 92 g, 16.7 mmol) and 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (3.20 g, 16.7 mmol) were stirred in advance at room temperature for 1 hour, and stirred at room temperature During 4 hours. The reaction solution was charged with 0.1 N hydrochloric acid and extracted with chloroform. The organic layer obtained was dried over sodium sulfate and filtered. The solvent was removed under reduced pressure and the obtained residues were purified by column chromatography on silica gel [chloroform-chloroform: methanol = 8: 2 (v / v)] to produce the title compound as a colorless solid ( 7.10 g, 79%).
RMN 1H (DMSO-D6) 5: 2,78 (1H, dd, J = 13,9, 9,6 Hz), 3,05 (1H, dd, J = 13,9, 4,5 Hz), 3,56-3,80 (6H, m), 4,15 (2H, s), 4,47-4,55 (1H, m), 4,63 (2H, d, J = 6,6 Hz), 5,03 (2H, s), 5,15 (2H, s), 7,16-7,38 (15H, m), 7,52 (1H, t, J = 5,9 Hz), 8,03 (1H, t, J = 5,5 Hz), 8,17 (1H, d, J = 8,2 Hz), 8,36 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,61 (1H, t, J = 6,6 Hz).1H NMR (DMSO-D6) 5: 2.78 (1H, dd, J = 13.9, 9.6 Hz), 3.05 (1H, dd, J = 13.9, 4.5 Hz), 3 , 56-3.80 (6H, m), 4.15 (2H, s), 4.47-4.55 (1H, m), 4.63 (2H, d, J = 6.6 Hz), 5.03 (2H, s), 5.15 (2H, s), 7.16-7.38 (15H, m), 7.52 (1H, t, J = 5.9 Hz), 8.03 (1H, t, J = 5.5 Hz), 8.17 (1H, d, J = 8.2 Hz), 8.36 (1H, t, J = 5.7 Hz), 8.61 (1H , t, J = 6.6 Hz).
Proceso 3: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(carboximatoxi)metil]glicinamidaProcess 3: Glycylglycyl-L-phenylalanyl-N - [(carboximatoxy) methyl] glycinamide
A una solución de N,N-dimetilformamida (216 ml) del compuesto (7,00 g, 10,8 mmol) obtenido en el proceso 2 anterior, se añadió catalizador de paladio-carbono (7,00 g) y se agitó bajo una atmósfera de hidrógeno a temperatura ambiente durante 24 horas. Los materiales insolubles se retiraron por filtración a través de Celite, y el disolvente se retiró a presión reducida. los residuos obtenidos se disolvieron en agua, el material insoluble se retiró por filtración a través de Celite, y el disolvente se retiró a presión reducida. Este procedimiento se repitió dos veces para producir el compuesto del título en forma de un sólido incoloro (3,77 g, 82 %).To a solution of N, N-dimethylformamide (216 ml) of the compound (7.00 g, 10.8 mmol) obtained in process 2 above, palladium-carbon catalyst (7.00 g) was added and stirred under an atmosphere of hydrogen at room temperature for 24 hours. Insoluble materials were removed by filtration through Celite, and the solvent was removed under reduced pressure. The obtained residues were dissolved in water, the insoluble material was filtered off through Celite, and the solvent was removed under reduced pressure. This procedure was repeated twice to produce the title compound as a colorless solid (3.77 g, 82%).
RMN 1H (DMSO-D6) 5: 2,84 (1H, dd, J = 13,7, 9,8 Hz), 3,08 (1H, dd, J = 13,7, 4,7 Hz), 3,50-3,72 (4H, m), 3,77-3,86 (2H, m), 3,87 (2H, s), 4,52-4,43 (1H, m), 4,61 (2H, d, J = 6,6 Hz), 7,12-7,30 (5H, m), 8,43 (1H, t, J = 5,9 Hz), 8,541H NMR (DMSO-D6) 5: 2.84 (1H, dd, J = 13.7, 9.8 Hz), 3.08 (1H, dd, J = 13.7, 4.7 Hz), 3 , 50-3.72 (4H, m), 3.77-3.86 (2H, m), 3.87 (2H, s), 4.52-4.43 (1H, m), 4.61 (2H, d, J = 6.6 Hz), 7.12-7.30 (5H, m), 8.43 (1H, t, J = 5.9 Hz), 8.54
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(1H, d, J = 7,8 Hz), 8,70 (1H, t, J = 6,3 Hz), 8,79 (1H, t, J = 5,5 Hz).(1H, d, J = 7.8 Hz), 8.70 (1H, t, J = 6.3 Hz), 8.79 (1H, t, J = 5.5 Hz).
Proceso 4: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1 -M)hexanoM]glicMgMcil-L-fenilalanM-N-Process 4: N- [6- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-1 H -pyrrole-1-M) hexane M] glycgMcil-L-phenylalanM-N
[(carboximatoxi)metil]glicinamida[(carboximatoxy) methyl] glycinamide
A una solución de N,N-dimetilformamida (85,0 ml) del compuesto (3,59 g, 8,48 mmol) obtenido en el proceso 3 anterior, se añadieron hexanoato de N-succinimidil 6-maleimida (2,88 g, 9,33 mmol) y trietilamina (0,858 g, 8,48 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La solución de reacción se cargó con ácido clorhídrico 0,1 N y se extrajo con cloroformo y un disolvente mixto de cloroformo y metanol [cloroformo : metanol = 4 : 1 (v/v)]. La capa orgánica obtenida se secó sobre sulfato sódico y se filtró. El disolvente se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo - capa orgánica repartida de cloroformo : metanol: agua = 7 : 3: 1 (v/v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido incoloro (3,70 g, 71 %). RMN 1H (DMSO-Da) 5: 1,13-1,24 (2H, m), 1,42-1,53 (4H, m), 2,11 (2H, t, J = 7,4 Hz), 2,80 (1H, dd, J = 13,7, 9,8 Hz), 3,06 (1H, dd, J = 13,9, 4,5 Hz), 3,37 (2H, t, J = 7,2 Hz), 3,56-3,78 (6H, m), 3,97 (2H, s), 4,46-4,53 (1H, m), 4,61 (2H, d, J = 6,3 Hz), 7,00 (2H, s), 7,15-7,29 (5H, m), 8,03-8,20 (3H, m), 8,32 (1H, t, J = 5,9 Hz), 8,60 (1H, t, J = 6,7 Hz).To a solution of N, N-dimethylformamide (85.0 ml) of the compound (3.59 g, 8.48 mmol) obtained in process 3 above, N-succinimidyl 6-maleimide hexanoate (2.88 g) was added , 9.33 mmol) and triethylamine (0.858 g, 8.48 mmol) and stirred at room temperature for 1 hour. The reaction solution was charged with 0.1 N hydrochloric acid and extracted with chloroform and a mixed solvent of chloroform and methanol [chloroform: methanol = 4: 1 (v / v)]. The organic layer obtained was dried over sodium sulfate and filtered. The solvent was removed under reduced pressure and the obtained residues were purified by silica gel column chromatography [chloroform - distributed organic layer of chloroform: methanol: water = 7: 3: 1 (v / v / v)] to produce the title compound in the form of a colorless solid (3.70 g, 71%). 1H NMR (DMSO-Da) 5: 1.13-1.24 (2H, m), 1.42-1.53 (4H, m), 2.11 (2H, t, J = 7.4 Hz) , 2.80 (1H, dd, J = 13.7, 9.8 Hz), 3.06 (1H, dd, J = 13.9, 4.5 Hz), 3.37 (2H, t, J = 7.2 Hz), 3.56-3.78 (6H, m), 3.97 (2H, s), 4.46-4.53 (1H, m), 4.61 (2H, d, J = 6.3 Hz), 7.00 (2H, s), 7.15-7.29 (5H, m), 8.03-8.20 (3H, m), 8.32 (1H, t , J = 5.9 Hz), 8.60 (1H, t, J = 6.7 Hz).
Proceso 5: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-Process 5: N- [6- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoyl] glycylglycyl-L-phenylalanyl-N - [(2 - {[(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-
hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-
il]amino}-2-oxoetoxi)metil]glicinamidail] amino} -2-oxoethoxy) methyl] glycinamide
A una solución de N,N-dimetilformamida (40,0 ml) de mesilato del compuesto (4) (1,14 g, 2,00 mmol), trietilamina (0,202 g, 2,00 mmol), se añadieron a 0 °C el compuesto (1,48 g, 2,40 mmol) obtenido en el proceso 4 anterior, y cloruro de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinio (0,993 g, 3,00 mmol) que contiene agua al 16,4 % y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El disolvente se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 8 : 2 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (1,69 g, 82%). Los datos instrumentales del compuesto fueron los mismos que los del compuesto del proceso 8 del Ejemplo 58.To a solution of N, N-dimethylformamide (40.0 ml) mesylate of compound (4) (1.14 g, 2.00 mmol), triethylamine (0.202 g, 2.00 mmol), were added at 0 ° C the compound (1.48 g, 2.40 mmol) obtained in the above process 4, and 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl) -4-methylmorpholinium chloride ( 0.993 g, 3.00 mmol) containing 16.4% water and stirred at room temperature for 1 hour. The solvent was removed under reduced pressure and the residues obtained were purified by silica gel column chromatography [chloroform-chloroform: methanol = 8: 2 (v / v)] to produce the title compound as a colored solid. pale yellow (1.69 g, 82%). The instrumental data of the compound were the same as those of the compound of process 8 of Example 58.
Ejemplo 75 N-[(1S,9S)-9-etN-5-fluoro-9-hidroxi-4-metiM0,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-Example 75 N - [(1S, 9S) -9-etN-5-fluoro-9-hydroxy-4-metiM0,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-
benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-2-hidroxiacetamidabenzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] -2-hydroxyacetamide
[Fórmula 144][Formula 144]
Proceso 1: 2-{[(1S,9S)-9-Etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-Process 1: 2 - {[(1S, 9S) -9-Ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H , 12H-
benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetilacetatobenzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] amino} -2-oxoethylacetate
Con enfriamiento con hielo, a una suspensión de N,N-dimetilformamida (20,0 ml) de mesilato del compuesto (4) (0,500 g, 0,941 mmol), se añadieron N,N-diisopropiletilamina (0,492 ml, 2,82 mmol) y cloruro de acetoxiacetilo (0,121 ml, 1,13 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El disolvente se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo - capa orgánica repartida de cloroformo : metanol: agua = 7 : 3: 1 (v/v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,505 g, cuantitativo).With ice cooling, to a suspension of N, N-dimethylformamide (20.0 ml) mesylate of compound (4) (0.500 g, 0.941 mmol), N, N-diisopropylethylamine (0.492 ml, 2.82 mmol) was added ) and acetoxyacetyl chloride (0.121 ml, 1.13 mmol) and stirred at room temperature for 1 hour. The solvent was removed under reduced pressure and the obtained residues were purified by silica gel column chromatography [chloroform - distributed organic layer of chloroform: methanol: water = 7: 3: 1 (v / v / v)] to produce the title compound in the form of a pale yellow solid (0.505 g, quantitative).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 5: 0,87 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,81-1,92 (2H, m), 2,08 (3H, s), 2,08-2,22 (2H, m), 2,41 (3H, s), 3,14-3,21 (2H, m), 4,51 (2H, dd, J = 19,4, 14,7 Hz), 5,22 (2H, dd, J = 40,1, 19,0 Hz), 5,43 (2H, s), 5,56-5,611H NMR (400 MHz, DMSO-da) 5: 0.87 (3H, t, J = 7.4 Hz), 1.81-1.92 (2H, m), 2.08 (3H, s), 2.08-2.22 (2H, m), 2.41 (3H, s), 3.14-3.21 (2H, m), 4.51 (2H, dd, J = 19.4, 14 , 7 Hz), 5.22 (2H, dd, J = 40.1, 19.0 Hz), 5.43 (2H, s), 5.56-5.61
(1H, m), 6,53 (1H, s), 7,31 (1H, s), 7,81 (1H, d, J = 11,0 Hz), 8,67 (1H, d, J = 8,6 Hz).(1H, m), 6.53 (1H, s), 7.31 (1H, s), 7.81 (1H, d, J = 11.0 Hz), 8.67 (1H, d, J = 8.6 Hz).
EM (IEN) m/z: 536 (M+H)+MS (ESI) m / z: 536 (M + H) +
Proceso 2: N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-Process 2: N - [(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-
benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-2-hidroxiacetamidabenzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] -2-hydroxyacetamide
A una suspensión de metanol (50,0 ml) del compuesto (0,504 g, 0,941 mmol) obtenido en el proceso 1 anterior, se añadieron tetrahidrofurano (20,0 ml) y una solución acuosa de hidróxido sódico 1 N (4,00 ml, 4,00 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción se terminó mediante la adición de ácido clorhídrico 1 N (5,00 ml, 5,00 mmol), y el disolvente se retiró a presión reducida. los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo-capa orgánica repartida de cloroformo : metanol : agua = 7 : 3: 1 (v/v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,412 g, 89 %). Este compuesto se confirmó en el tumor de un ratón portador de cáncer que recibió el conjugado de anticuerpo - fármaco (55) o (56). RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 5: 0,87 (3H, t, J = 7,3 Hz), 1,78-1,95 (2H, m), 2,09-2,28 (2H, m), 2,39 (3H, s), 3,073,27 (2H, m), 3,96 (2H, d, J = 6,0 Hz), 5,11-5,26 (2H, m), 5,42 (2H, s), 5,46-5,54 (1H, m), 5,55-5,63 (1H, m), 6,52To a suspension of methanol (50.0 ml) of the compound (0.504 g, 0.941 mmol) obtained in process 1 above, tetrahydrofuran (20.0 ml) and an aqueous solution of 1 N sodium hydroxide (4.00 ml) were added , 4.00 mmol) and stirred at room temperature for 1 hour. The reaction was terminated by the addition of 1 N hydrochloric acid (5.00 ml, 5.00 mmol), and the solvent was removed under reduced pressure. The obtained residues were purified by column chromatography on silica gel [chloroform-distributed organic layer of chloroform: methanol: water = 7: 3: 1 (v / v / v)] to produce the title compound as a solid pale yellow (0.412 g, 89%). This compound was confirmed in the tumor of a cancer-bearing mouse that received the antibody-drug conjugate (55) or (56). 1H NMR (400 MHz, DMSO-da) 5: 0.87 (3H, t, J = 7.3 Hz), 1.78-1.95 (2H, m), 2.09-2.28 (2H , m), 2.39 (3H, s), 3.073.27 (2H, m), 3.96 (2H, d, J = 6.0 Hz), 5.11-5.26 (2H, m) , 5.42 (2H, s), 5.46-5.54 (1H, m), 5.55-5.63 (1H, m), 6.52
55
1010
15fifteen
20twenty
2525
3030
3535
(1H, s), 7,30 (1H, s), 7,78 (1H, d, J = 10,9 Hz), 8,41 (1H, d, J = 9,1 Hz). EM (IEN) m/z: 494 (M+H)+ Ejemplo 76 (Otro procedimiento para sintetizar el compuesto del Ejemplo 75)(1H, s), 7.30 (1H, s), 7.78 (1H, d, J = 10.9 Hz), 8.41 (1H, d, J = 9.1 Hz). MS (ESI) m / z: 494 (M + H) + Example 76 (Another procedure for synthesizing the compound of Example 75)
[Fórmula 145][Formula 145]
Proceso 1: N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-Process 1: N - [(1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-
benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-2-hidroxiacetamidabenzo [de] pyrano [3 ', 4': 6.7] indolizino [1,2-b] quinolin-1-yl] -2-hydroxyacetamide
Se disolvió ácido glicólico (0,0201 g, 0,27 mmol) en N,N-dimetilformamida (1,0 ml), se cargó con N- hidroxisuccinimida (0,0302 g, 0,27 mmol) y clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (0,0508 g, 0,27 mmol), y se agitó durante 1 hora. La solución de reacción se añadió a una suspensión de N,N-dimetilformamida (1,0 ml) cargada con mesilato del compuesto (4) (0,1 g, 0,176 mmol) y trietilamina (0,025 ml, 0,18 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. El disolvente se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 10 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,080 g, 92%). Los datos instrumentales del compuesto fueron los mismos que los del compuesto obtenido en el proceso 2 del Ejemplo 75.Glycolic acid (0.0201 g, 0.27 mmol) was dissolved in N, N-dimethylformamide (1.0 ml), charged with N-hydroxysuccinimide (0.0302 g, 0.27 mmol) and 1- hydrochloride (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide (0.0508 g, 0.27 mmol), and stirred for 1 hour. The reaction solution was added to a suspension of N, N-dimethylformamide (1.0 ml) charged with mesylate of compound (4) (0.1 g, 0.176 mmol) and triethylamine (0.025 ml, 0.18 mmol) and It was stirred at room temperature for 24 hours. The solvent was removed under reduced pressure and the obtained residues were purified by silica gel column chromatography [chloroform-chloroform: methanol = 10: 1 (v / v)] to produce the title compound as a colored solid. pale yellow (0.080 g, 92%). The instrumental data of the compound were the same as those of the compound obtained in process 2 of Example 75.
(Ejemplo de prueba 1) Producción de vector de expresión de variante 1 de B7-H3 humano de longitud completa(Test example 1) Production of full length human B7-H3 variant 1 expression vector
ADNc que codifica la variante 1 de B7-H3 humano se amplificó mediante reacción de PCR usando ADNc sintetizado a partir del ARN total de una célula LNCaP (Colección Americana de Cultivos Tipo: ATCC) como un molde y el siguiente conjunto de cebadores:CDNA encoding variant 1 of human B7-H3 was amplified by PCR reaction using cDNA synthesized from the total RNA of an LNCaP cell (American Type Culture Collection: ATCC) as a template and the following set of primers:
cebador 1:primer 1:
5'-ctatagggagacccaagctggctagcatgctgcgtcggcggggcag-3' (SEQ ID NO: 22) y cebador 2:5'-ctatagggagacccaagctggctagcatgctgcgtcggcggggcag-3 '(SEQ ID NO: 22) and primer 2:
5 ' -5 ' -
aacgggccctctagactcgagcggccgctcaggctatttcttgtccatcatcttc tttgctgtcag-3' (SEQ ID NO: 23).aacgggccctctagactcgagcggccgctcaggctatttcttgtccatcatcttc tttgctgtcag-3 '(SEQ ID NO: 23).
A continuación, el producto de PCR obtenido de este modo se purificó usando MagExtractor PCR & Gel cleanup (Toyobo Co., Ltd.). El producto purificado se digirió adicionalmente con enzimas de restricción (NheI/NotI) y a continuación se purificó usando MagExtractor PCR & Gel cleanup (Toyobo Co., Ltd.). pcDNA3.1 (+) AdN plasmídico (Life Technologies) se digirió con las mismas enzimas de restricción que anteriormente (NheI/NotI) y a continuación se purificó usando MagExtractor PCR & Gel cleanup (Toyobo Co., Ltd.).Next, the PCR product obtained in this way was purified using MagExtractor PCR & Gel cleanup (Toyobo Co., Ltd.). The purified product was further digested with restriction enzymes (NheI / NotI) and then purified using MagExtractor PCR & Gel cleanup (Toyobo Co., Ltd.). pcDNA3.1 (+) Plasmid AdN (Life Technologies) was digested with the same restriction enzymes as above (NheI / NotI) and then purified using MagExtractor PCR & Gel cleanup (Toyobo Co., Ltd.).
Estas soluciones de ADN purificadas se mezclaron, se cargaron adicionalmente con Ligation high (Toyobo Co., Ltd.), y se incubaron para el ligamiento a 16 °C durante 8 horas.These purified DNA solutions were mixed, further loaded with Ligation high (Toyobo Co., Ltd.), and incubated for ligation at 16 ° C for 8 hours.
Células DH5a de Eschenchia coli competentes (Life Technologies) se transformaron mediante la adición del producto de reacción obtenido.Competent Eschenchia coli DH5a cells (Life Technologies) were transformed by adding the reaction product obtained.
Las colonias así obtenidas se sometieron a PCR directa de colonias usando cebadores de PCR y cebador inverso de BGH para seleccionar clones candidatos.The colonies thus obtained were subjected to direct colony PCR using PCR primers and BGH reverse primer to select candidate clones.
Los clones candidatos obtenidos se cultivaron en un medio líquido (LB/Amp), y se extrajo un ADN plasmídico con MagExtractor-Plasmid- (Toyobo Co., Ltd.).The candidate clones obtained were cultured in a liquid medium (LB / Amp), and a plasmid DNA was extracted with MagExtractor-Plasmid- (Toyobo Co., Ltd.).
Cada clon obtenido se comparó con la secuencia CDS proporcionada mediante el análisis de secuenciación entre el cebador 3 (cebador promotor de CMV):Each clone obtained was compared with the CDS sequence provided by sequencing analysis between primer 3 (CMV promoter primer):
55
1010
15fifteen
20twenty
2525
3030
3535
4040
45Four. Five
50fifty
5'-cgcaaatgggcggtaggcgtg-3' (SEQ ID NO: 24) y cebador 4 (cebador inverso de BGH):5'-cgcaaatgggcggtaggcgtg-3 '(SEQ ID NO: 24) and primer 4 (BGH reverse primer):
5'-tagaaggcacagtcgagg-3' (SEQ ID NO: 25) con el ADN plasmídico obtenido como molde.5'-tagaaggcacagtcgagg-3 '(SEQ ID NO: 25) with the plasmid DNA obtained as a template.
Después de confirmar la secuencia, el clon obtenido se cultivó en 200 ml de medio LB/Amp, y se extrajo un ADN plasmídico usando el kit VioGene Plasmid Midi V-100.After confirming the sequence, the obtained clone was cultured in 200 ml of LB / Amp medium, and a plasmid DNA was extracted using the VioGene Plasmid Midi V-100 kit.
La cepa se denominó como pcDNA3.1-B7-H3. La secuencia de un sitio de ORF del gen de la variante 1 de B7-H3 clonado en el vector se muestra en las posiciones de nucleótido 1 a 1602 en la SEQ ID NO: 26 (figura 16) en el listado de secuencias. Además, la secuencia de aminoácidos de la variante 1 de B7-H3 se muestra en la SEQ ID NO: 1 en el listado de secuencias.The strain was named as pcDNA3.1-B7-H3. The sequence of an ORF site of the gene of variant 1 of B7-H3 cloned in the vector is shown at nucleotide positions 1 to 1602 in SEQ ID NO: 26 (Figure 16) in the sequence listing. In addition, the amino acid sequence of variant 1 of B7-H3 is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
(Ejemplo de prueba 2) Preparación de célula CCRF-CEM que expresa de forma estable el gen de la variante 1 de B7-H3(Test example 2) Preparation of CCRF-CEM cell stably expressing the gene of variant 1 of B7-H3
pcDNA3.1-B7-H3 producido en el ejemplo de prueba 1 se transfectó en células CCRF-CEM (ATCC) por electroporación usando Nucleofector II (fabricado por Lonza Group Ltd ). A continuación, las células se cultivaron adicionalmente durante dos noches en medio de RPMI1640 (Life Technologies) que contiene suero bovino fetal al 10 % (FBS) (al que se hace referencia posteriormente en el presente documento como FBS al 10 %-RPMI1640) en condiciones de 37 °C y CO2 al 5 %.pcDNA3.1-B7-H3 produced in test example 1 was transfected into CCRF-CEM cells (ATCC) by electroporation using Nucleofector II (manufactured by Lonza Group Ltd). The cells were then further cultured for two nights in RPMI1640 medium (Life Technologies) containing 10% fetal bovine serum (FBS) (referred to hereinafter as 10% FBS -RPMI1640) in 37 ° C conditions and 5% CO2.
Después del cultivo de 2 días, el cultivo se inició en FBS al 10 %-RPMI1640 que contiene 750 pg/ml de G418 (Life Technologies) con el fin de seleccionar células CCRF-CEM en las que se integró de forma estable pcDNA3.1-B7-H3.After the 2-day culture, the culture was started in 10% FBS-RPMI1640 containing 750 pg / ml of G418 (Life Technologies) in order to select CCRF-CEM cells in which pcDNA3.1 was stably integrated. -B7-H3.
Después del cultivo de 1 mes, se realizó una clonación mediante el procedimiento de dilución limitante con el fin de producir un clon de una sola célula. Específicamente, las células que tienen resistencia a G418 se diluyeron a 10 células/ml, se inocularon en una placa de 96 pocillos a una concentración de 100 pl/pocillo, y se cultivaron, y las células que se dejaron proliferar se recuperaron de pocillos individuales.After 1 month culture, cloning was performed by the limiting dilution procedure in order to produce a single cell clone. Specifically, cells that have resistance to G418 were diluted to 10 cells / ml, inoculated in a 96-well plate at a concentration of 100 pl / well, and cultured, and cells that were allowed to proliferate were recovered from individual wells. .
Se usó citometría de flujo para confirmar la expresión de B7-H3 en cada clon recuperado. Específicamente, cada clon recuperado se lavó dos veces con PBS que contiene FBS al 5 %, a continuación se suspendió mediante la adición de PBS que contiene FBS al 5 % y 10 pg/ml de M30, y se dejó reposar a 4 °C durante 30 minutos. El clon se lavó dos veces con PBS que contiene FBS al 5 %, a continuación se suspendió mediante la adición de fracción de IgG de cabra conjugada con fluoresceína a IgG de ratón (molécula completa) (n.° 55493, fabricado por ICN Pharmaceuticals, Inc.) se diluyó 1000 veces con PBS que contiene FBS al 5 %, y se dejó reposar a 4 °C durante 30 minutos. El clon se lavó dos veces con PBS que contiene FBS al 5 %, a continuación se volvió a suspender en PBS que contiene FBS al 5 %, y se detectó usando un citómetro de flujo (FC500: Beckman Coulter, Inc.).Flow cytometry was used to confirm the expression of B7-H3 in each clone recovered. Specifically, each recovered clone was washed twice with PBS containing 5% FBS, then suspended by the addition of PBS containing 5% FBS and 10 pg / ml of M30, and allowed to stand at 4 ° C for 30 minutes. The clone was washed twice with PBS containing 5% FBS, then suspended by the addition of fluorescein-conjugated goat IgG fraction to mouse IgG (complete molecule) (# 55493, manufactured by ICN Pharmaceuticals, Inc.) was diluted 1000 times with PBS containing 5% FBS, and allowed to stand at 4 ° C for 30 minutes. The clone was washed twice with PBS containing 5% FBS, then resuspended in PBS containing 5% FBS, and was detected using a flow cytometer (FC500: Beckman Coulter, Inc.).
Las células CCRF-CEM que expresan de forma estable el gen de la variante 1 de B7-H3 obtenido de este modo mediante estos procedimientos se designaron como células CEM_V1_3.1_2. Las células CCRF-CEM de línea parental se usaron como una línea celular que carece de expresión de B7-H3.CCRF-CEM cells that stably express the gene of variant 1 of B7-H3 thus obtained by these procedures were designated as CEM_V1_3.1_2 cells. The parental line CCRF-CEM cells were used as a cell line that lacks B7-H3 expression.
(Ejemplo de prueba 3) Prueba de citotoxicidad (1) de conjugado de anticuerpo - fármaco(Test example 3) Cytotoxicity test (1) of antibody-drug conjugate
Las células CEM_V1_3.1_2 producidas en el ejemplo de prueba 2 o las células CCRF-CEM (ATCC) se cultivaron en RPMI1640 (GIBCO) que contiene suero bovino fetal al 10 % (MOREGATE) (al que se hace referencia posteriormente en el presente documento como medio). Las células CEM_V1_3.1_2 o las células CCRF-CEM se prepararon para tener una concentración de 8 x 104 células/ml usando un medio, se añadieron a una concentración de 25 pl/pocillo a una microplaca de 96 pocillos para cultivo celular cargada con 65 pl/pocillo de un medio, y se cultivaron durante una noche. Al día siguiente, el anticuerpo M30-H1-L4, anticuerpo M30-H1-L4P, y conjugado de anticuerpo - fármaco diluido cada uno en 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1,6 nM, 0,32 nM y 0,064 nM usando un medio se añadieron a una concentración de 10 pl/pocillo a la microplaca. Un medio se añadió a una concentración de 10 pl/pocillo a pocillos no suplementados con sustancia de prueba. Las células se cultivaron bajo CO2 al 5 % a 37CEM_V1_3.1_2 cells produced in test example 2 or CCRF-CEM cells (ATCC) were grown in RPMI1640 (GIBCO) containing 10% fetal bovine serum (MOREGATE) (referred to herein below as a medium). CEM_V1_3.1_2 cells or CCRF-CEM cells were prepared to have a concentration of 8 x 104 cells / ml using medium, added at a concentration of 25 pl / well to a 96-well microplate for cell culture loaded with 65 pl / well of a medium, and grown overnight. The next day, the M30-H1-L4 antibody, M30-H1-L4P antibody, and antibody-drug conjugate each diluted in 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM and 0.064 nM using a medium was added at a concentration of 10 pl / well to the microplate. A medium was added at a concentration of 10 pl / well to wells not supplemented with test substance. Cells were grown under 5% CO2 at 37
°C durante 3 días. Después del cultivo, la microplaca se sacó de la incubadora y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. La solución de cultivo se cargó con una cantidad igual de ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo (Promega) y se agitó. Después de que la microplaca se dejara reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos, la cantidad de emisión de luz se midió usando un lector de placas (PerkinElmer). El valor de CI50 se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación:° C for 3 days. After cultivation, the microplate was removed from the incubator and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. The culture solution was loaded with an equal amount of CellTiter-Glo luminescent cell viability assay (Promega) and stirred. After the microplate was allowed to stand at room temperature for 10 minutes, the amount of light emission was measured using a plate reader (PerkinElmer). The IC50 value was calculated according to the following equation:
CI50 (nM) = antilog ((50 - d) * (LOG-iüb - LOG^a) / (d - c) + LOG-iüb)IC50 (nM) = antilog ((50 - d) * (LOG-iüb - LOG ^ a) / (d - c) + LOG-iüb)
a: Concentración a de la sustancia de prueba b: Concentración b de la sustancia de pruebaa: Concentration a of the test substance b: Concentration b of the test substance
c: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración a d: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración bc: Relationship of living cells supplemented with the test substance having the concentration a d: Relationship of living cells supplemented with the test substance having the concentration b
Las concentraciones a y b establecen la relación a > b que corta una relación de un 50 % de células vivas.The a and b concentrations establish the a> b ratio that cuts a 50% ratio of living cells.
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La tasa de supervivencia de las células a cada concentración se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación:The survival rate of the cells at each concentration was calculated according to the following equation:
Tasa de supervivencia de las células (%) = a / b * 100Cell survival rate (%) = a / b * 100
a: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de los pocillos suplementados con sustancia de prueba (n = 2) b: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de los pocillos no suplementados con sustancia de prueba (n = 10)a: Average amount of light emission from wells supplemented with test substance (n = 2) b: Average amount of light emission from wells not supplemented with test substance (n = 10)
Los conjugados de anticuerpo - fármaco (5), (16), (21), (32), (44), (45), (46), (52) y (54) mostraron una actividad citotóxica de CI50 < 0,1 (nM) contra las células CEM_V1_3.1_2. Los conjugados de anticuerpo - fármaco (1), (12), (13), (20), (28), (29), (35), (36), (37), (41), (49) y (53) mostraron una actividad citotóxica de 0,1 < CI50 < 1 (nM) contra las células. Los conjugados de anticuerpo - fármaco (33), (34), (47), (48), (50) y (51) mostraron una actividad citotóxica de 1 < CI50 < 100 (nM) contra las células. Por otra parte, ninguno de estos conjugados de anticuerpo - fármaco mostró una actividad citotóxica contra las células CCRF-CEM (> 100 (nM)). Ni el anticuerpo M30-H1-L4 ni el anticuerpo M30-H1-L4P mostraron una actividad citotóxica contra ambas de las células (> 100 (nM)).Antibody-drug conjugates (5), (16), (21), (32), (44), (45), (46), (52) and (54) showed a cytotoxic activity of IC50 <0, 1 (nM) against CEM_V1_3.1_2 cells. Antibody-drug conjugates (1), (12), (13), (20), (28), (29), (35), (36), (37), (41), (49) and (53) showed a cytotoxic activity of 0.1 <IC50 <1 (nM) against cells. Antibody-drug conjugates (33), (34), (47), (48), (50) and (51) showed a cytotoxic activity of 1 <IC50 <100 (nM) against the cells. On the other hand, none of these antibody-drug conjugates showed a cytotoxic activity against CCRF-CEM cells (> 100 (nM)). Neither the M30-H1-L4 antibody nor the M30-H1-L4P antibody showed a cytotoxic activity against both of the cells (> 100 (nM)).
(Ejemplo de prueba 4) Prueba de citotoxicidad (2) de conjugado de anticuerpo - fármaco(Test example 4) Cytotoxicity test (2) of antibody-drug conjugate
Células positivas para antígeno células SR (ATCC) o células negativas para antígeno células Daudi (ATCC) se cultivaron en RPMI1640 (GIBCO) que contiene suero bovino fetal al 10 % (MOREGATE) (al que se hace referencia posteriormente en el presente documento como medio). Las células SR o células Daudi se prepararon para tener una concentración de 2,8 * 104 células/ml usando un medio y se añadieron a una concentración de 90 pl/pocillo a una microplaca de 96 pocillos para cultivo celular. Dos horas después, el anticuerpo anti-CD30 y conjugados de anticuerpo - fármaco (6) y (7) diluido cada uno en 40 nM, 8 nM, 1,6 nM, 320 pM, 64 pM, 12,8 pM y 2,6 pM usando un medio se añadieron a una concentración de 10 pl/pocillo a la microplaca. Un medio se añadió a una concentraciónCells positive for antigen SR cells (ATCC) or cells negative for antigen Daudi cells (ATCC) were cultured in RPMI1640 (GIBCO) containing 10% fetal bovine serum (MOREGATE) (referred to hereinafter as medium ). SR cells or Daudi cells were prepared to have a concentration of 2.8 * 104 cells / ml using a medium and added at a concentration of 90 pl / well to a 96-well microplate for cell culture. Two hours later, the anti-CD30 antibody and antibody-drug conjugates (6) and (7) each diluted in 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 320 pM, 64 pM, 12.8 pM and 2, 6 pM using a medium was added at a concentration of 10 pl / well to the microplate. A medium was added at a concentration
de 10 pl/pocillo a pocillos no suplementados con sustancia de prueba. Las células se cultivaron bajo CO2 al 5 % a 3710 pl / well to wells not supplemented with test substance. Cells were grown under 5% CO2 at 37
°C durante 3 días. Después del cultivo, la microplaca se sacó de la incubadora y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. La solución de cultivo se cargó con una cantidad igual de ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo (Promega) y se agitó. Después de que la microplaca se dejara reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos, la cantidad de emisión de luz se midió usando un lector de placas (PerkinElmer). El valor de CI50 se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación:° C for 3 days. After cultivation, the microplate was removed from the incubator and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. The culture solution was loaded with an equal amount of CellTiter-Glo luminescent cell viability assay (Promega) and stirred. After the microplate was allowed to stand at room temperature for 10 minutes, the amount of light emission was measured using a plate reader (PerkinElmer). The IC50 value was calculated according to the following equation:
CI50 (nM) = antilog ((50 - d) * (LOG-iüb - LOG^a) / (d - c) + LOG-iüb)IC50 (nM) = antilog ((50 - d) * (LOG-iüb - LOG ^ a) / (d - c) + LOG-iüb)
a: Concentración a de la sustancia de prueba b: Concentración b de la sustancia de pruebaa: Concentration a of the test substance b: Concentration b of the test substance
c: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración ac: Relationship of supplemented living cells with the test substance that has the concentration a
d: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración bd: Relationship of supplemented living cells with the test substance that has the concentration b
Las concentraciones a y b establecen la relación a > b que corta una relación de un 50 % de células vivas.The a and b concentrations establish the a> b ratio that cuts a 50% ratio of living cells.
La tasa de supervivencia de las células a cada concentración se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación:The survival rate of the cells at each concentration was calculated according to the following equation:
Tasa de supervivencia de las células (%) = a / b * 100Cell survival rate (%) = a / b * 100
a: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de los pocillos suplementados con sustancia de prueba (n = 2) b: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de los pocillos no suplementados con sustancia de prueba (n = 12)a: Average amount of light emission from wells supplemented with test substance (n = 2) b: Average amount of light emission from wells not supplemented with test substance (n = 12)
Los conjugados de anticuerpo - fármaco (6) y (7) mostraron una actividad citotóxica de CI50 < 0,01 (nM) contra las células Sr. Por otra parte, los conjugados de anticuerpo - fármaco (6) y (7) no mostraron actividad citotóxica alguna contra las células Daudi (> 4,0 (nM)). El anticuerpo anti-CD30 no mostró actividad citotóxica alguna contra ambas de las células (> 4,0 (nM)).Antibody-drug conjugates (6) and (7) showed a cytotoxic activity of IC50 <0.01 (nM) against Mr. cells. On the other hand, antibody-drug conjugates (6) and (7) did not show any cytotoxic activity against Daudi cells (> 4.0 (nM)). The anti-CD30 antibody showed no cytotoxic activity against both of the cells (> 4.0 (nM)).
(Ejemplo de prueba 5) Prueba de citotoxicidad (3) de conjugado de anticuerpo - fármaco(Test example 5) Cytotoxicity test (3) of antibody-drug conjugate
Células positivas para antígeno células SR (ATCC) se cultivaron en RPMI1640 (GIBCO) que contiene suero bovino fetal al 10 % (MOREGATE) (al que se hace referencia posteriormente en el presente documento como medio). Las células SR se prepararon para tener una concentración de 2,8 * 104 células/ml usando un medio y se añadieron a una concentración de 90 pl/pocillo a una microplaca de 96 pocillos para cultivo celular. Dos horas después, el anticuerpo anti-CD30 y conjugados de anticuerpo - fármaco (22), (23), (38), (64) y (65) diluido cada uno en 1000 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM y 1 pM usando un medio se añadieron a una concentración de 10 pl/pocillo a la microplaca. Un medio se añadió a una concentración de 10 pl/pocillo a pocillos no suplementados con sustancia de prueba. Las células se cultivaron bajo CO2 al 5 % a 37 °C durante 6 días. Después del cultivo, la microplaca se sacó de la incubadora y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. La solución de cultivo se cargó con una cantidad igual de ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo (Promega) y se agitó. Después de que la microplaca se dejara reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos, la cantidad de emisión de luz se midió usando un lector de placas (PerkinElmer). El valor de CI50 se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación:Positive cells for SR antigen cells (ATCC) were cultured in RPMI1640 (GIBCO) containing 10% fetal bovine serum (MOREGATE) (referred to hereinafter as a medium). SR cells were prepared to have a concentration of 2.8 * 104 cells / ml using a medium and were added at a concentration of 90 pl / well to a 96-well microplate for cell culture. Two hours later, the anti-CD30 antibody and antibody-drug conjugates (22), (23), (38), (64) and (65) each diluted in 1000 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM and 1 pM using a medium were added at a concentration of 10 pl / well to the microplate. A medium was added at a concentration of 10 pl / well to wells not supplemented with test substance. The cells were grown under 5% CO2 at 37 ° C for 6 days. After cultivation, the microplate was removed from the incubator and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. The culture solution was loaded with an equal amount of CellTiter-Glo luminescent cell viability assay (Promega) and stirred. After the microplate was allowed to stand at room temperature for 10 minutes, the amount of light emission was measured using a plate reader (PerkinElmer). The IC50 value was calculated according to the following equation:
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CI50 (nM) = antilog ((50 - d) x (LOGiob - LOGioa) / (d - c) + LOGiob)IC50 (nM) = antilog ((50 - d) x (LOGiob - LOGioa) / (d - c) + LOGiob)
a: Concentración a de la sustancia de prueba b: Concentración b de la sustancia de pruebaa: Concentration a of the test substance b: Concentration b of the test substance
c: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración a d: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración bc: Relationship of living cells supplemented with the test substance having the concentration a d: Relationship of living cells supplemented with the test substance having the concentration b
Las concentraciones a y b establecen la relación a > b que corta una relación de un 50 % de células vivas.The a and b concentrations establish the a> b ratio that cuts a 50% ratio of living cells.
La tasa de supervivencia de las células a cada concentración se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación:The survival rate of the cells at each concentration was calculated according to the following equation:
Tasa de supervivencia de las células (%) = a / b x 100Cell survival rate (%) = a / b x 100
a: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de los pocillos suplementados con sustancia de prueba (n = 2) b: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de los pocillos no suplementados con sustancia de prueba (n = 12)a: Average amount of light emission from wells supplemented with test substance (n = 2) b: Average amount of light emission from wells not supplemented with test substance (n = 12)
Los conjugados de anticuerpo - fármaco (23), (38), (64) y (65) mostraron una actividad citotóxica de CI50 < 0,01 (nM) contra las células SR. El conjugado de anticuerpo - fármaco (22) mostró una actividad citotóxica de CI50 < 0,1 (nM) contra las células SR. El anticuerpo anti-CD30 no mostró actividad citotóxica alguna contra las células SR (> 4,0 (nM)).Antibody-drug conjugates (23), (38), (64) and (65) showed a cytotoxic activity of IC50 <0.01 (nM) against SR cells. The antibody-drug conjugate (22) showed a cytotoxic activity of IC50 <0.1 (nM) against SR cells. The anti-CD30 antibody showed no cytotoxic activity against SR cells (> 4.0 (nM)).
(Ejemplo de prueba 6) Prueba de citotoxicidad (4) de conjugado de anticuerpo - fármaco(Test example 6) Cytotoxicity test (4) of antibody-drug conjugate
Células positivas para antígeno células HL-60 (ATCC) o células negativas para antígeno células Raji (ATCC) se cultivaron en RPMI1640 (GIBCO) que contiene suero bovino fetal al 10 % (MOREGATE) (al que se hace referencia posteriormente en el presente documento como medio). Las células HL-60 o células Raji se prepararon para tener una concentración de 8 x 104 células/ml usando un medio y se añadieron a una concentración de 25 pl/pocillo a una microplaca de 96 pocillos para cultivo celular cargada con 65 pl/pocillo de un medio. El anticuerpo anti-CD33 y conjugados de anticuerpo - fármaco (8) y (9) diluido cada uno en 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1,6 nM, 0,32 nM y 0,064 nM usando un medio se añadieron a una concentración de 10 pl/pocillo a la microplaca. Un medio se añadió a una concentración de 10 pl/pocillo a pocillos no suplementados con sustancia de prueba. Las células se cultivaron bajo CO2 al 5 % a 37 °C durante 3 días. Después del cultivo, la microplaca se sacó de la incubadora y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. La solución de cultivo se cargó con una cantidad igual de ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo (Promega) y se agitó. Después de que la microplaca se dejara reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos, la cantidad de emisión de luz se midió usando un lector de placas (PerkinElmer). El valor de CI50 se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación:HL-60 antigen positive cells (ATCC) or Raji cell antigen negative cells (ATCC) were grown in RPMI1640 (GIBCO) containing 10% fetal bovine serum (MOREGATE) (referred to herein below as a medium). HL-60 cells or Raji cells were prepared to have a concentration of 8 x 104 cells / ml using a medium and added at a concentration of 25 pl / well to a 96-well microplate for cell culture loaded with 65 pl / well of a medium. The anti-CD33 antibody and antibody-drug conjugates (8) and (9) each diluted in 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM and 0.064 nM using a medium added at a concentration of 10 pl / well to the microplate. A medium was added at a concentration of 10 pl / well to wells not supplemented with test substance. The cells were grown under 5% CO2 at 37 ° C for 3 days. After cultivation, the microplate was removed from the incubator and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. The culture solution was loaded with an equal amount of CellTiter-Glo luminescent cell viability assay (Promega) and stirred. After the microplate was allowed to stand at room temperature for 10 minutes, the amount of light emission was measured using a plate reader (PerkinElmer). The IC50 value was calculated according to the following equation:
CI50 (nM) = antilog ((50 - d) x (LOG^b - LOG^a) / (d - c) + LOG^b)IC50 (nM) = antilog ((50 - d) x (LOG ^ b - LOG ^ a) / (d - c) + LOG ^ b)
a: Concentración a de la sustancia de prueba b: Concentración b de la sustancia de pruebaa: Concentration a of the test substance b: Concentration b of the test substance
c: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración ac: Relationship of supplemented living cells with the test substance that has the concentration a
d: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración bd: Relationship of supplemented living cells with the test substance that has the concentration b
Las concentraciones a y b establecen la relación a > b que corta una relación de un 50 % de células vivas.The a and b concentrations establish the a> b ratio that cuts a 50% ratio of living cells.
La tasa de supervivencia de las células a cada concentración se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación:The survival rate of the cells at each concentration was calculated according to the following equation:
Tasa de supervivencia de las células (%) = a / b x 100Cell survival rate (%) = a / b x 100
a: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de los pocillos suplementados con sustancia de prueba (n = 2)a: Average amount of light emission from wells supplemented with test substance (n = 2)
b: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de los pocillos no suplementados con sustancia de prueba (n = 5)b: Average amount of light emission from wells not supplemented with test substance (n = 5)
Los conjugados de anticuerpo - fármaco (8) y (9) mostraron una actividad citotóxica de CI50 < 0,1 (nM) contra las células HL-60. Por otra parte, los conjugados de anticuerpo - fármaco (8) y (9) no mostraron actividad citotóxica alguna contra las células Raji (> 100 (nM)). El anticuerpo anti-CD33 no mostró actividad citotóxica alguna contra ambas de las células (> 100 (nM)).Antibody-drug conjugates (8) and (9) showed a cytotoxic activity of IC50 <0.1 (nM) against HL-60 cells. On the other hand, the antibody-drug conjugates (8) and (9) showed no cytotoxic activity against Raji cells (> 100 (nM)). The anti-CD33 antibody showed no cytotoxic activity against both of the cells (> 100 (nM)).
(Ejemplo de prueba 7) Prueba de citotoxicidad (5) de conjugado de anticuerpo - fármaco(Test example 7) Cytotoxicity test (5) of antibody-drug conjugate
Células positivas para antígeno células NOMO-1 (HSRRB) se cultivaron en RPMI1640 (GIBCO) que contiene suero bovino fetal al 10 % (MOREGATE) (al que se hace referencia posteriormente en el presente documento como medio). Las células NOMO-1 se prepararon para tener una concentración de 2,8 x 104 células/ml usando un medio y se añadieron a una concentración de 90 pl/pocillo a una microplaca de 96 pocillos para cultivo celular. Dos horas después, el anticuerpo anti-CD33 y conjugados de anticuerpo - fármaco (24), (25) y (67) diluido cada uno en 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1,6 nM, 0,32 nM y 0,064 nM usando un medio se añadieron a una concentración de 10 pl/pocillo a la microplaca. Un medio se añadió a una concentración de 10 pl/pocillo a pocillos no suplementados con sustancia de prueba. Las células se cultivaron bajo CO2 al 5 % a 37 °C durante 6 días. Después del cultivo, la microplaca se sacó de la incubadora y se dejó reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente. La solución deNOMO-1 antigen-positive cells (HSRRB) cells were cultured in RPMI1640 (GIBCO) containing 10% fetal bovine serum (MOREGATE) (referred to hereinafter as a medium). NOMO-1 cells were prepared to have a concentration of 2.8 x 104 cells / ml using a medium and added at a concentration of 90 pl / well to a 96-well microplate for cell culture. Two hours later, the anti-CD33 antibody and antibody-drug conjugates (24), (25) and (67) each diluted in 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM and 0.064 nM using a medium were added at a concentration of 10 pl / well to the microplate. A medium was added at a concentration of 10 pl / well to wells not supplemented with test substance. The cells were grown under 5% CO2 at 37 ° C for 6 days. After cultivation, the microplate was removed from the incubator and allowed to stand for 30 minutes at room temperature. The solution of
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cultivo se cargó con una cantidad igual de ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo (Promega) y se agitó. Después de que la microplaca se dejara reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos, la cantidad de emisión de luz se midió usando un lector de placas (PerkinElmer). El valor de CI50 se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación:culture was loaded with an equal amount of CellTiter-Glo luminescent cell viability assay (Promega) and stirred. After the microplate was allowed to stand at room temperature for 10 minutes, the amount of light emission was measured using a plate reader (PerkinElmer). The IC50 value was calculated according to the following equation:
CI50 (nM) = antilog ((50 - d) * (LOGiob - LOGioa) / (d - c) + LOGiob)IC50 (nM) = antilog ((50 - d) * (LOGiob - LOGioa) / (d - c) + LOGiob)
a: Concentración a de la sustancia de prueba b: Concentración b de la sustancia de pruebaa: Concentration a of the test substance b: Concentration b of the test substance
c: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración ac: Relationship of supplemented living cells with the test substance that has the concentration a
d: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración bd: Relationship of supplemented living cells with the test substance that has the concentration b
Las concentraciones a y b establecen la relación a > b que corta una relación de un 50 % de células vivas.The a and b concentrations establish the a> b ratio that cuts a 50% ratio of living cells.
La tasa de supervivencia de las células a cada concentración se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación:The survival rate of the cells at each concentration was calculated according to the following equation:
Tasa de supervivencia de las células (%) = a / b * 100Cell survival rate (%) = a / b * 100
a: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de los pocillos suplementados con sustancia de prueba (n = 2)a: Average amount of light emission from wells supplemented with test substance (n = 2)
b: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de los pocillos no suplementados con sustancia de prueba (n = 5)b: Average amount of light emission from wells not supplemented with test substance (n = 5)
El conjugado de anticuerpo - fármaco (25) mostró una actividad citotóxica de CI50 < 0,1 (nM) contra las células NOMO-1. Los conjugados de anticuerpo - fármaco (24) y (67) mostraron una actividad citotóxica de 1 < CI50 < 100 (nM) contra las células. El anticuerpo anti-CD33 no mostró actividad citotóxica alguna contra las células NOMO-1 (> 100 (nM)).The antibody-drug conjugate (25) showed a cytotoxic activity of IC50 <0.1 (nM) against NOMO-1 cells. Antibody-drug conjugates (24) and (67) showed a cytotoxic activity of 1 <IC50 <100 (nM) against cells. The anti-CD33 antibody showed no cytotoxic activity against NOMO-1 cells (> 100 (nM)).
(Ejemplo de prueba 8) Prueba de citotoxicidad (6) de conjugado de anticuerpo - fármaco(Test example 8) Cytotoxicity test (6) of antibody-drug conjugate
Células positivas para antígeno células U251 (ATCC) o células negativas para antígeno células MCF-7 (ATCC) se cultivaron en RPMI1640 (GIBCO) que contiene suero bovino fetal al 10 % (MOREGATE) (al que se hace referencia posteriormente en el presente documento como medio). Las células U251 o células MCF-7 se prepararon para tener una concentración de 2,8 * 104 células/ml usando un medio, se añadieron a una concentración de 90 pl/pocillo a una microplaca de 96 pocillos para cultivo celular, y se cultivaron durante una noche. Al día siguiente, el anticuerpo anti- CD70 y conjugados de anticuerpo - fármaco (10) y (11) diluido cada uno en 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1,6 nM, 0,32 nM y 0,064 nM usando un medio se añadieron a una concentración de 10 pl/pocillo a la microplaca. Un medio se añadió a una concentración de 10 pl/pocillo a pocillos no suplementados con sustancia de prueba. Las células se cultivaron bajo CO2 al 5 % a 37 °C durante 6 días. Después del cultivo, la microplaca se sacó de la incubadora y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. La solución de cultivo se cargó con una cantidad igual de ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo (Promega) y se agitó. Después de que la microplaca se dejara reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos, la cantidad de emisión de luz se midió usando un lector de placas (PerkinElmer). El valor de CI50 se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación:U251 antigen-positive cells (ATCC) or MCF-7 antigen-negative cells (ATCC) cells were grown in RPMI1640 (GIBCO) containing 10% fetal bovine serum (MOREGATE) (referred to herein below as a medium). U251 cells or MCF-7 cells were prepared to have a concentration of 2.8 * 104 cells / ml using a medium, added at a concentration of 90 pl / well to a 96-well microplate for cell culture, and cultured during one night The next day, the anti-CD70 antibody and antibody-drug conjugates (10) and (11) each diluted in 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM and 0.064 nM using a medium they were added at a concentration of 10 pl / well to the microplate. A medium was added at a concentration of 10 pl / well to wells not supplemented with test substance. The cells were grown under 5% CO2 at 37 ° C for 6 days. After cultivation, the microplate was removed from the incubator and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. The culture solution was loaded with an equal amount of CellTiter-Glo luminescent cell viability assay (Promega) and stirred. After the microplate was allowed to stand at room temperature for 10 minutes, the amount of light emission was measured using a plate reader (PerkinElmer). The IC50 value was calculated according to the following equation:
CI50 (nM) = antilog ((50 - d) * (LOG-iüb - LOG^a) / (d - c) + LOG-iüb)IC50 (nM) = antilog ((50 - d) * (LOG-iüb - LOG ^ a) / (d - c) + LOG-iüb)
a: Concentración a de la sustancia de prueba b: Concentración b de la sustancia de pruebaa: Concentration a of the test substance b: Concentration b of the test substance
c: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración a d: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración bc: Relationship of living cells supplemented with the test substance having the concentration a d: Relationship of living cells supplemented with the test substance having the concentration b
Las concentraciones a y b establecen la relación a > b que corta una relación de un 50 % de células vivas.The a and b concentrations establish the a> b ratio that cuts a 50% ratio of living cells.
La tasa de supervivencia de las células a cada concentración se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación:The survival rate of the cells at each concentration was calculated according to the following equation:
Tasa de supervivencia de las células (%) = a / b * 100Cell survival rate (%) = a / b * 100
a: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de los pocillos suplementados con sustancia de prueba (n = 2) b: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de los pocillos no suplementados con sustancia de prueba (n = 12)a: Average amount of light emission from wells supplemented with test substance (n = 2) b: Average amount of light emission from wells not supplemented with test substance (n = 12)
Los conjugados de anticuerpo - fármaco (10) y (11) mostraron una actividad citotóxica de CI50 < 1 (nM) contra las células U251. Por otra parte, los conjugados de anticuerpo - fármaco (10) y (11) no mostraron actividad citotóxica alguna contra las células MCF-7 (> 90 (nM)). El anticuerpo anti-CD70 no mostró actividad citotóxica alguna contra ambas de las células (> 100 (nM)).Antibody-drug conjugates (10) and (11) showed a cytotoxic activity of IC50 <1 (nM) against U251 cells. On the other hand, the antibody-drug conjugates (10) and (11) showed no cytotoxic activity against MCF-7 cells (> 90 (nM)). The anti-CD70 antibody showed no cytotoxic activity against both of the cells (> 100 (nM)).
(Ejemplo de prueba 9) Prueba de citotoxicidad (7) de conjugado de anticuerpo - fármaco(Test example 9) Cytotoxicity test (7) of antibody-drug conjugate
Células positivas para antígeno células U251 (ATCC) se cultivaron en RPMI1640 (GIBCO) que contiene suero bovino fetal al 10 % (MOREGATE) (al que se hace referencia posteriormente en el presente documento como medio). Las células U251 se prepararon para tener una concentración de 2,8 * 104 células/ml usando un medio y se añadieron a una concentración de 90 pl/pocillo a una microplaca de 96 pocillos para cultivo celular. Dos horasU251 antigen positive cells (ATCC) cells were cultured in RPMI1640 (GIBCO) containing 10% fetal bovine serum (MOREGATE) (referred to herein below as a medium). U251 cells were prepared to have a concentration of 2.8 * 104 cells / ml using a medium and added at a concentration of 90 pl / well to a 96-well microplate for cell culture. Two hours
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después, el anticuerpo anti-CD70 y conjugados de anticuerpo - fármaco (26), (27), (40), (68) y (69) diluido cada uno en 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1,6 nM, 0,32 nM y 0,064 nM usando un medio se añadieron a una concentración de 10 |jl/pocillo a la microplaca. Un medio se añadió a una concentración de 10 jl/pocillo a pocilios no suplementados con sustancia de prueba. Las células se cultivaron bajo CO2 al 5 % a 37 °C durante 6 días. Después del cultivo, la microplaca se sacó de la incubadora y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. La solución de cultivo se cargó con una cantidad igual de ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo (Promega) y se agitó. Después de que la microplaca se dejara reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos, la cantidad de emisión de luz se midió usando un lector de placas (PerkinElmer). El valor de CI50 se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación:then, the anti-CD70 antibody and antibody-drug conjugates (26), (27), (40), (68) and (69) each diluted in 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1, 6 nM, 0.32 nM and 0.064 nM using a medium were added at a concentration of 10 µl / well to the microplate. A medium was added at a concentration of 10 µl / well to wells not supplemented with test substance. The cells were grown under 5% CO2 at 37 ° C for 6 days. After cultivation, the microplate was removed from the incubator and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. The culture solution was loaded with an equal amount of CellTiter-Glo luminescent cell viability assay (Promega) and stirred. After the microplate was allowed to stand at room temperature for 10 minutes, the amount of light emission was measured using a plate reader (PerkinElmer). The IC50 value was calculated according to the following equation:
CI50 (nM) = antilog ((50 - d) * (LOG-iüb - LOG^a) / (d - c) + LOG-iüb)IC50 (nM) = antilog ((50 - d) * (LOG-iüb - LOG ^ a) / (d - c) + LOG-iüb)
a: Concentración a de la sustancia de prueba b: Concentración b de la sustancia de pruebaa: Concentration a of the test substance b: Concentration b of the test substance
c: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración a d: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración bc: Relationship of living cells supplemented with the test substance having the concentration a d: Relationship of living cells supplemented with the test substance having the concentration b
Las concentraciones a y b establecen la relación a > b que corta una relación de un 50 % de células vivas.The a and b concentrations establish the a> b ratio that cuts a 50% ratio of living cells.
La tasa de supervivencia de las células a cada concentración se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación:The survival rate of the cells at each concentration was calculated according to the following equation:
Tasa de supervivencia de las células (%) = a / b * 100Cell survival rate (%) = a / b * 100
a: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de los pocillos suplementados con sustancia de prueba (n = 2) b: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de los pocillos no suplementados con sustancia de prueba (n = 12)a: Average amount of light emission from wells supplemented with test substance (n = 2) b: Average amount of light emission from wells not supplemented with test substance (n = 12)
Los conjugados de anticuerpo - fármaco (26), (27), (40) y (69) mostraron una actividad citotóxica de 1 < CI50 < 10 (nM) contra las células U251. El conjugado de anticuerpo - fármaco (68) mostró una actividad citotóxica de 10 < CI50 < 100 (nM) contra las células. El anticuerpo anti-CD70 no mostró actividad citotóxica alguna contra las células U251 (> 100 (nM)).Antibody-drug conjugates (26), (27), (40) and (69) showed a cytotoxic activity of 1 <IC50 <10 (nM) against U251 cells. The antibody-drug conjugate (68) showed a cytotoxic activity of 10 <IC50 <100 (nM) against the cells. The anti-CD70 antibody showed no cytotoxic activity against U251 cells (> 100 (nM)).
(Ejemplo de prueba 10) Prueba de citotoxicidad (8) de fármaco liberado(Test example 10) Cytotoxicity test (8) of drug released
Células A375 (ATCC) se cultivaron en DMEM (GIBCO) que contiene suero bovino fetal al 10 % (MOREGATE) (al que se hace referencia posteriormente en el presente documento como medio). Las células A375 se prepararon para tener una concentración de 4 * 104 células/ml usando un medio, se añadieron a una concentración de 25 jl/pocillo a una microplaca de 96 pocillos para cultivo celular (CORNING) cargada con 65 jl/pocillo de un medio, y se cultivaron durante una noche. Al día siguiente, cada sustancia de prueba diluida en 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1,6 nM, 0,32 nM y 0,064 nM usando DMSO se añadió a una concentración de 0,5 jl/pocillo a la microplaca. Se añadió DMSO a una concentración de 0,5 jl/pocillo a pocillos no suplementados con sustancia de prueba. El volumen del medio en cada pocillo se ajustó a 100 jl mediante la adición de 10 jl/pocillo de un medio, y las células se cultivaron bajo CO2 al 5 % a 37 °C durante 6 días. Después del cultivo, la microplaca se sacó de la incubadora y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. La solución de cultivo se cargó con una cantidad igual de ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo (Promega) y se agitó. Después de que la microplaca se dejara reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos, la cantidad de emisión de luz se midió usando un lector de placas. El valor de CI50 se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación:A375 cells (ATCC) were cultured in DMEM (GIBCO) containing 10% fetal bovine serum (MOREGATE) (referred to hereinafter as a medium). A375 cells were prepared to have a concentration of 4 * 104 cells / ml using a medium, added at a concentration of 25 jl / well to a 96-well microplate for cell culture (CORNING) loaded with 65 jl / well of a medium, and they were grown overnight. The next day, each test substance diluted in 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM and 0.064 nM using DMSO was added at a concentration of 0.5 jl / well to the microplate DMSO was added at a concentration of 0.5 µl / well to wells not supplemented with test substance. The volume of the medium in each well was adjusted to 100 µl by adding 10 µl / well of a medium, and the cells were grown under 5% CO2 at 37 ° C for 6 days. After cultivation, the microplate was removed from the incubator and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. The culture solution was loaded with an equal amount of CellTiter-Glo luminescent cell viability assay (Promega) and stirred. After the microplate was allowed to stand at room temperature for 10 minutes, the amount of light emission was measured using a plate reader. The IC50 value was calculated according to the following equation:
CI50 (nM) = antilog ((50 - d) * (LOG-iüb - LOG^a) / (d - c) + LOG-iüb)IC50 (nM) = antilog ((50 - d) * (LOG-iüb - LOG ^ a) / (d - c) + LOG-iüb)
a: Concentración a de la sustancia de prueba b: Concentración b de la sustancia de pruebaa: Concentration a of the test substance b: Concentration b of the test substance
c: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración a d: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración bc: Relationship of living cells supplemented with the test substance having the concentration a d: Relationship of living cells supplemented with the test substance having the concentration b
Las concentraciones a y b establecen la relación a > b que corta una relación de un 50 % de células vivas.The a and b concentrations establish the a> b ratio that cuts a 50% ratio of living cells.
La tasa de supervivencia de las células se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación:The survival rate of the cells was calculated according to the following equation:
Tasa de supervivencia de las células (%) = a / b * 100Cell survival rate (%) = a / b * 100
a: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de los pocillos suplementados con sustancia de prueba (n = 2) b: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de los pocillos no suplementados con sustancia de prueba (n = 10)a: Average amount of light emission from wells supplemented with test substance (n = 2) b: Average amount of light emission from wells not supplemented with test substance (n = 10)
El compuesto del Ejemplo (75) y exatecán mostró una actividad citotóxica de 0,1 < CI50 < 1 (nM) contra las células A375. El compuesto del Ejemplo (42) mostró una actividad citotóxica contra 1 < CI50 < 10 (nM) contra las células. El compuesto del Ejemplo (1) mostró una actividad citotóxica contra 10 < CI50 < 100 (nM) contra las células.The compound of Example (75) and exatecan showed a cytotoxic activity of 0.1 <IC50 <1 (nM) against A375 cells. The compound of Example (42) showed a cytotoxic activity against 1 <IC50 <10 (nM) against the cells. The compound of Example (1) showed a cytotoxic activity against 10 <IC50 <100 (nM) against the cells.
(Ejemplo de prueba 11) Prueba antitumoral (1)(Test example 11) Anti-tumor test (1)
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Ratón: ratones desnudos BALB/c hembra de 5 a 6 semanas de edad (Charles River Laboratories Japan, Inc.) se aclimataron durante 4 a 7 días en condiciones de SPF antes de su uso en el experimento. Los ratones se alimentaron con pienso sólido esterilizado (FR-2, Funabashi Farms Co., Ltd) y se les dio agua del grifo esterilizada (preparada mediante la adición de una solución de hipoclorito sódico de 5 a 15 ppm).Mouse: Female BALB / c nude mice 5 to 6 weeks old (Charles River Laboratories Japan, Inc.) were acclimatized for 4 to 7 days under SPF conditions before use in the experiment. Mice were fed with sterilized solid feed (FR-2, Funabashi Farms Co., Ltd) and were given sterile tap water (prepared by adding a solution of sodium hypochlorite of 5 to 15 ppm).
Ensayo y expresión de cálculo: En todos los estudios, el eje mayor y el eje menor del tumor se midieron dos veces a la semana usando un calibrador electrónico digital (CD-15C, Mitutoyo Corp.), y se calculó el volumen tumoral (mm3). La expresión de cálculo es como se muestra posteriormente.Test and calculation expression: In all studies, the major axis and the minor axis of the tumor were measured twice a week using a digital electronic caliper (CD-15C, Mitutoyo Corp.), and tumor volume was calculated (mm3 ). The calculation expression is as shown below.
Volumen tumoral (mm3) = 1/2 * Eje mayor (mm) * [Eje menor (mm)]2Tumor volume (mm3) = 1/2 * Major axis (mm) * [Minor axis (mm)] 2
La totalidad de los conjugados de anticuerpo - fármaco se diluyeron con solución salina fisiológica (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.) y se usaron a un volumen de 10 ml/kg para su administración intravenosa a la cola de cada ratón. Se adquirieron células de la línea de melanoma humano A375 de ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo). 8 * 106 células suspendidas en solución salina fisiológica se transplantaron subcutáneamente al lado derecho del abdomen de cada ratón desnudo hembra (día 0), y los ratones se agruparon aleatoriamente el día 11. El anticuerpo M30-H1-L4P y conjugado de anticuerpo - fármaco (2) se administraron, cada uno, por vía intravenosa a una dosis de 10 mg/kg a la cola de cada ratón los días 11, 18 y 25.All antibody-drug conjugates were diluted with physiological saline (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.) and used at a volume of 10 ml / kg for intravenous administration to the tail of each mouse. Cells of the human melanoma line A375 from ATCC (American Type Culture Collection) were purchased. 8 * 106 cells suspended in physiological saline were transplanted subcutaneously to the right side of the abdomen of each female nude mouse (day 0), and the mice were randomly grouped on day 11. The M30-H1-L4P antibody and antibody-drug conjugate (2) were each administered intravenously at a dose of 10 mg / kg to the tail of each mouse on days 11, 18 and 25.
Los resultados se muestran en la Figura 17. En el dibujo, la línea con rombos abiertos muestra los resultados acerca de un tumor sin tratar, la línea con triángulos abiertos muestra el efecto del anticuerpo M30-H1-L4P y la línea con círculos abiertos muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco (2).The results are shown in Figure 17. In the drawing, the line with open rhombuses shows the results about an untreated tumor, the line with open triangles shows the effect of the M30-H1-L4P antibody and the line with open circles shows the effect of the antibody-drug conjugate (2).
Como se observa de estos resultados, la administración del conjugado de anticuerpo - fármaco (2) disminuyó notablemente el volumen tumoral, y no se observó crecimiento tumoral alguno después de la administración final. Por el contrario, la administración del anticuerpo M30-H1-L4P dio como resultado el avance del crecimiento tumoral.As can be seen from these results, administration of the antibody-drug conjugate (2) markedly decreased tumor volume, and no tumor growth was observed after final administration. In contrast, administration of the M30-H1-L4P antibody resulted in the progression of tumor growth.
Además, los ratones que recibieron el conjugado de anticuerpo - fármaco (2) no presentaron signos notables tales como pérdida de peso, lo que sugiere que el conjugado de anticuerpo - fármaco (2) es de baja toxicidad y sumamente seguro.In addition, mice that received the antibody-drug conjugate (2) did not show noticeable signs such as weight loss, suggesting that the antibody-drug conjugate (2) is of low toxicity and extremely safe.
(Ejemplo de prueba 12) Prueba antitumoral (2)(Test example 12) Anti-tumor test (2)
Se adquirieron células de la línea de melanoma humano A375 de ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo). 6 * 106 células suspendidas en solución salina fisiológica se transplantaron subcutáneamente al lado derecho del abdomen de cada ratón desnudo hembra (día 0), y los ratones se agruparon aleatoriamente el día 18. El conjugado de anticuerpo - fármaco (2) se administró por vía intravenosa a cada dosis (0,1, 0,3, y 1,3 mg/kg) a la cola de cada ratón los días 18, 25 y 32 en un programa de cs * 3.Cells of the human melanoma line A375 from ATCC (American Type Culture Collection) were purchased. 6 * 106 cells suspended in physiological saline were transplanted subcutaneously to the right side of the abdomen of each female nude mouse (day 0), and the mice were randomly grouped on day 18. The antibody-drug conjugate (2) was administered via intravenously at each dose (0.1, 0.3, and 1.3 mg / kg) to the tail of each mouse on days 18, 25 and 32 in a cs * 3 program.
Los resultados se muestran en la Figura 18. En el dibujo, la línea con rombos abiertos muestra los resultados acerca de un tumor sin tratar, la línea con cuadrados sólidos muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco (2) administrado a 0,1 mg/kg, la línea con marcas X muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco (2) administrado a 0,3 mg/kg, la línea con triángulos sólidos muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco (2) administrado a 1 mg/kg y la línea con círculos abiertos muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco (2) administrado a 3 mg/kg. El conjugado de anticuerpo - fármaco (2) fue eficaz para contraer el tumor de una forma dependiente de la dosis.The results are shown in Figure 18. In the drawing, the line with open diamonds shows the results about an untreated tumor, the line with solid squares shows the effect of the antibody-drug conjugate (2) administered at 0.1 mg / kg, the line with X marks shows the effect of the antibody-drug conjugate (2) administered at 0.3 mg / kg, the line with solid triangles shows the effect of the antibody-drug conjugate (2) administered at 1 mg / kg and the open circle line shows the effect of the antibody-drug conjugate (2) administered at 3 mg / kg. The antibody-drug conjugate (2) was effective in contracting the tumor in a dose-dependent manner.
(Ejemplo de prueba 13) Prueba antitumoral (3)(Test example 13) Anti-tumor test (3)
Las células Calu-6 de línea de cáncer de pulmón no de células pequeñas humano se adquirieron de ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo). 5 * 106 células suspendidas en solución salina fisiológica se transplantaron subcutáneamente al lado derecho del abdomen de cada ratón desnudo hembra (día 0), y los ratones se agruparon aleatoriamente el día 11. El anticuerpo M30-H1-L4P y conjugado de anticuerpo - fármaco (2) se administraron, cada uno, por vía intravenosa a una dosis de 10 mg/kg a la cola de cada ratón los días 11, 18, y 25 en un programa de cs * 3.Calu-6 cells from non-human small cell lung cancer line were purchased from ATCC (American Type Culture Collection). 5 * 106 cells suspended in physiological saline were transplanted subcutaneously to the right side of the abdomen of each female nude mouse (day 0), and the mice were randomly grouped on day 11. The M30-H1-L4P antibody and antibody-drug conjugate (2) each was administered intravenously at a dose of 10 mg / kg to the tail of each mouse on days 11, 18, and 25 in a cs * 3 program.
Los resultados se muestran en la Figura 19. En el dibujo, la línea con rombos abiertos muestra los resultados acerca de un tumor sin tratar, la línea con triángulos abiertos muestra el efecto del anticuerpo M30-H1-L4P y la línea con círculos abiertos muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco (2). La administración del conjugado de anticuerpo - fármaco (2) disminuyó notablemente el volumen tumoral, y no se observó crecimiento tumoral alguno después de la administración final. Por el contrario, la administración del anticuerpo M30-H1-L4P dio como resultado el avance del crecimiento tumoral.The results are shown in Figure 19. In the drawing, the line with open rhombuses shows the results about an untreated tumor, the line with open triangles shows the effect of the M30-H1-L4P antibody and the line with open circles shows the effect of the antibody-drug conjugate (2). Administration of the antibody-drug conjugate (2) markedly decreased tumor volume, and no tumor growth was observed after final administration. In contrast, administration of the M30-H1-L4P antibody resulted in the progression of tumor growth.
Además, los ratones que recibieron el conjugado de anticuerpo - fármaco (2) no presentaron signos notables tales como pérdida de peso, lo que sugiere que el conjugado de anticuerpo - fármaco (2) es de baja toxicidad y sumamente seguro.In addition, mice that received the antibody-drug conjugate (2) did not show noticeable signs such as weight loss, suggesting that the antibody-drug conjugate (2) is of low toxicity and extremely safe.
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(Ejemplo de prueba 14) Prueba antitumoral (4)(Test example 14) Anti-tumor test (4)
Se adquirieron células de la línea de melanoma humano A375 de ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo). 8 *Cells of the human melanoma line A375 from ATCC (American Type Culture Collection) were purchased. 8 *
106 células suspendidas en solución salina fisiológica se transplantaron subcutáneamente al lado derecho del abdomen de cada ratón desnudo hembra (día 0), y los ratones se agruparon aleatoriamente el día 21. Los conjugados de anticuerpo - fármaco (1), (13), (41) y (55) se administraron, cada uno, por vía intravenosa a una dosis de 10 mg/kg a la cola de cada ratón el día 21.106 cells suspended in physiological saline were transplanted subcutaneously to the right side of the abdomen of each female nude mouse (day 0), and the mice were randomly grouped on day 21. Antibody-drug conjugates (1), (13), ( 41) and (55) were each administered intravenously at a dose of 10 mg / kg to the tail of each mouse on day 21.
Los resultados se muestran en la Figura 20. En el dibujo, la línea con rombos abiertos muestra los resultados acerca de un tumor sin tratar, la línea con círculos abiertos muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco administrado (1), la línea con triángulos abiertos muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco administrado (13), la línea con marcas X muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco administrado (41) y la línea con cuadrados abiertos muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco administrado (55). La administración del conjugado de anticuerpo - fármaco (1), (13), (41) o (55) disminuyó notablemente el volumen tumoral, y la totalidad de estos conjugados de anticuerpo - fármaco ejercieron un efecto inhibidor del crecimiento tumoral.The results are shown in Figure 20. In the drawing, the line with open rhombuses shows the results about an untreated tumor, the line with open circles shows the effect of the antibody-drug administered conjugate (1), the line with open triangles show the effect of the antibody-administered drug conjugate (13), the X-marked line shows the effect of the antibody-administered drug conjugate (41) and the line with open squares shows the effect of the antibody-administered drug conjugate (55). Administration of the antibody-drug conjugate (1), (13), (41) or (55) markedly decreased tumor volume, and all of these antibody-drug conjugates exerted a tumor growth inhibitory effect.
Además, los ratones que recibieron el conjugado de anticuerpo - fármaco (1), (13), (41) o (55) no presentaron signos notables tales como pérdida de peso, lo que sugiere que los conjugados de anticuerpo - fármaco (1), (13), (41) y (55) son de baja toxicidad y sumamente seguros.In addition, mice that received the antibody-drug conjugate (1), (13), (41) or (55) did not show noticeable signs such as weight loss, suggesting that the antibody-drug conjugates (1) , (13), (41) and (55) are of low toxicity and extremely safe.
(Ejemplo de prueba 15) Prueba antitumoral (5)(Test sample 15) Anti-tumor test (5)
Las células Calu-6 de línea de cáncer de pulmón no de células pequeñas humano se adquirieron de ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo). 5 * 106 células suspendidas en solución salina fisiológica se transplantaron subcutáneamente al lado derecho del abdomen de cada ratón desnudo hembra (día 0), y los ratones se agruparon aleatoriamente el día 12. Los conjugados de anticuerpo - fármaco (13), (41) y (55) se administraron, cada uno, por vía intravenosa a una dosis de 10 mg/kg a la cola de cada ratón el día 12. Como control comparativo, se administró DE-310 por vía intravenosa a una dosis de 0,1 mg/kg a la cola de cada ratón el día 12. En este caso, la dosis anteriormente mencionada del conjugado de anticuerpo - fármaco estaba basada en la cantidad del anticuerpo en el conjugado y la dosis anteriormente mencionada de DE-310 estaba basada en la cantidad del fármaco contenido en el mismo. A este respecto, las cantidades de los fármacos respectivamente contenidos en el conjugado de anticuerpo - fármaco y DE-310 eran de aproximadamente 1 : 100. Esto significa que las dosis del conjugado de anticuerpo - fármaco y DE-310 eran iguales en términos de las cantidades de los fármacos contenidos en el mismo.Calu-6 cells from non-human small cell lung cancer line were purchased from ATCC (American Type Culture Collection). 5 * 106 cells suspended in physiological saline were transplanted subcutaneously to the right side of the abdomen of each female nude mouse (day 0), and the mice were randomly grouped on day 12. Antibody-drug conjugates (13), (41) and (55) each was administered intravenously at a dose of 10 mg / kg to the tail of each mouse on day 12. As a comparative control, DE-310 was administered intravenously at a dose of 0.1 mg / kg at the tail of each mouse on day 12. In this case, the aforementioned dose of the antibody-drug conjugate was based on the amount of the antibody in the conjugate and the aforementioned dose of DE-310 was based on the amount of the drug contained in it. In this regard, the amounts of the drugs respectively contained in the antibody-drug conjugate and DE-310 were approximately 1: 100. This means that the doses of the antibody-drug conjugate and DE-310 were equal in terms of the quantities of drugs contained therein.
Los resultados se muestran en la Figura 21. En el dibujo, la línea con rombos abiertos muestra los resultados acerca de un tumor sin tratar, la línea con círculos abiertos muestra el efecto de DE-310, la línea con triángulos abiertos muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco (13), la línea con marcas X muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco (41) y la línea con cuadrados abiertos muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco (55). La administración del conjugado de anticuerpo - fármaco (13), (41) o (55) disminuyó notablemente el volumen tumoral, mientras que la administración de DE-310 no mostró reducción alguna en el volumen tumoral.The results are shown in Figure 21. In the drawing, the line with open rhombuses shows the results about an untreated tumor, the line with open circles shows the effect of DE-310, the line with open triangles shows the effect of antibody-drug conjugate (13), the line with X-marks shows the effect of the antibody-drug conjugate (41) and the line with open squares shows the effect of the antibody-drug conjugate (55). Administration of the antibody-drug conjugate (13), (41) or (55) markedly decreased tumor volume, while administration of DE-310 showed no reduction in tumor volume.
Además, los ratones que recibieron el conjugado de anticuerpo - fármaco (13), (41) o (55) no presentaron signos notables tales como pérdida de peso, lo que sugiere que estos conjugados de anticuerpo - fármaco son de baja toxicidad y sumamente seguros.In addition, the mice that received the antibody-drug conjugate (13), (41) or (55) showed no notable signs such as weight loss, suggesting that these antibody-drug conjugates are low toxicity and extremely safe. .
(Ejemplo de prueba 16) Prueba antitumoral (6)(Test example 16) Anti-tumor test (6)
Se adquirieron células de la línea de melanoma humano A375 de ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo). 1 *Cells of the human melanoma line A375 from ATCC (American Type Culture Collection) were purchased. one *
107 células suspendidas en solución salina fisiológica se transplantaron subcutáneamente al lado derecho del abdomen de cada ratón desnudo hembra (día 0), y los ratones se agruparon aleatoriamente el día 11. Los conjugados de anticuerpo - fármaco (17), (18), (19), (59), (60) y (61) se administraron, cada uno, por vía intravenosa a una dosis de 3 mg/kg a la cola de cada ratón los días 11 y 18 en un programa de cs * 2.107 cells suspended in physiological saline were transplanted subcutaneously to the right side of the abdomen of each female nude mouse (day 0), and the mice were randomly grouped on day 11. Antibody-drug conjugates (17), (18), ( 19), (59), (60) and (61) were each administered intravenously at a dose of 3 mg / kg to the tail of each mouse on days 11 and 18 in a cs * 2 program.
Los resultados se muestran en la Figura 22. En el dibujo, la línea con rombos sólidos muestra los resultados acerca de un tumor sin tratar, la línea con cuadrados sólidos muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco administrado (17), la línea con triángulos abiertos muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármacoThe results are shown in Figure 22. In the drawing, the solid diamond line shows the results about an untreated tumor, the solid square line shows the effect of the antibody-drug administered conjugate (17), the line with open triangles shows the effect of the antibody-drug conjugate
administrado (18), la línea con círculos abiertos muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármacoadministered (18), the line with open circles shows the effect of the antibody-drug conjugate
administrado (19), la línea con triángulos sólidos muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármacoadministered (19), the solid triangle line shows the effect of the antibody-drug conjugate
administrado (59), la línea con cuadrados abiertos muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármacoadministered (59), the line with open squares shows the effect of the antibody-drug conjugate
administrado (60) y la línea con marcas X muestra el efecto del conjugado de anticuerpo - fármaco administrado (61).administered (60) and the X-labeled line shows the effect of the antibody-administered drug conjugate (61).
La administración del conjugado de anticuerpo - fármaco (17), (18), (19), (59), (60) o (61) disminuyó notablemente el volumen tumoral, y la totalidad de estos conjugados de anticuerpo - fármaco ejercieron un efecto inhibidor del crecimiento tumoral.Administration of the antibody-drug conjugate (17), (18), (19), (59), (60) or (61) markedly decreased tumor volume, and all of these antibody-drug conjugates exerted an effect tumor growth inhibitor.
Además, los ratones que recibieron el conjugado de anticuerpo - fármaco (17), (18), (19), (59), (60) o (61) noIn addition, mice that received the antibody-drug conjugate (17), (18), (19), (59), (60) or (61) did not
55
1010
15fifteen
20twenty
2525
3030
3535
4040
45Four. Five
presentaron signos notables tales como pérdida de peso, lo que sugiere que estos conjugados de anticuerpo - fármaco son de baja toxicidad y sumamente seguros.they showed notable signs such as weight loss, suggesting that these antibody-drug conjugates are of low toxicity and extremely safe.
Texto libre del Listado de secuenciasFree text of the Sequence Listing
SEQ ID NO: 1 - secuencia de aminoácidos de la variante 1 de B7-H3SEQ ID NO: 1 - amino acid sequence of variant 1 of B7-H3
SEQ ID NO: 2 - secuencia de aminoácidos de la variante 2 de B7-H3SEQ ID NO: 2 - amino acid sequence of variant 2 of B7-H3
SEQ ID NO: 3 - Secuencia de aminoácidos de CDRH1 del anticuerpo M30SEQ ID NO: 3 - CDRH1 amino acid sequence of the M30 antibody
SEQ ID NO: 4 - Secuencia de aminoácidos de CDRH2 del anticuerpo M30SEQ ID NO: 4 - CDRH2 amino acid sequence of the M30 antibody
SEQ ID NO: 5 - Secuencia de aminoácidos de CDRH3 del anticuerpo M30SEQ ID NO: 5 - CDRH3 amino acid sequence of the M30 antibody
SEQ ID NO: 6 - Secuencia de aminoácidos de CDRL1 del anticuerpo M30SEQ ID NO: 6 - CDRL1 amino acid sequence of the M30 antibody
SEQ ID NO: 7 - Secuencia de aminoácidos de CDRL2 del anticuerpo M30SEQ ID NO: 7 - CDRL2 amino acid sequence of the M30 antibody
SEQ ID NO: 8 - Secuencia de aminoácidos de CDRL3 del anticuerpo M30SEQ ID NO: 8 - CDRL3 amino acid sequence of the M30 antibody
SEQ ID NO: 9 - Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo M30-H1SEQ ID NO: 9 - M30-H1 type heavy chain amino acid sequence
SEQ ID NO: 10 - Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo M30-H2SEQ ID NO: 10 - M30-H2 type heavy chain amino acid sequence
SEQ ID NO: 11 - Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo M30-H3SEQ ID NO: 11 - Amino acid sequence of the heavy chain type M30-H3
SEQ ID NO: 12 - Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo M30-H4SEQ ID NO: 12 - M30-H4 type heavy chain amino acid sequence
SEQ ID NO: 13 - Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo M30-L1SEQ ID NO: 13 - Amino acid sequence of the M30-L1 light chain
SEQ ID NO: 14 - Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo M30-L2SEQ ID NO: 14 - Amino acid sequence of the M30-L2 light chain
SEQ ID NO: 15 - Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo M30-L3SEQ ID NO: 15 - M30-L3 light chain amino acid sequence
SEQ ID NO: 16 - Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo M30-L4SEQ ID NO: 16 - Amino acid sequence of the M30-L4 light chain
SEQ ID NO: 17 - Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo M30-L5SEQ ID NO: 17 - Amino acid sequence of the M30-L5 light chain
SEQ ID NO: 18 - Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo M30-L6SEQ ID NO: 18 - M30-L6 light chain amino acid sequence
SEQ ID NO: 19 - Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo M30-L7SEQ ID NO: 19 - M30-L7 light chain amino acid sequence
SEQ ID NO: 20 - Secuencia de aminoácidos de una cadena pesada del anticuerpo M30SEQ ID NO: 20 - Amino acid sequence of an M30 antibody heavy chain
SEQ ID NO: 21 - Secuencia de aminoácidos de una cadena ligera del anticuerpo M30SEQ ID NO: 21 - Amino acid sequence of an M30 antibody light chain
SEQ ID NO: 22 - Cebador de PCR 1SEQ ID NO: 22 - PCR primer 1
SEQ ID NO: 23 - Cebador de PCR 2SEQ ID NO: 23 - PCR primer 2
SEQ ID NO: 24 - Cebador promotor de CMV: cebador 3SEQ ID NO: 24 - CMV promoter primer: primer 3
SEQ ID NO: 25 - Cebador inverso de BGH: cebador 4SEQ ID NO: 25 - BGH reverse primer: primer 4
SEQ ID NO: 26 - Secuencia de nucleótidos de la variante 1 de B7-H3SEQ ID NO: 26 - Nucleotide sequence of variant 1 of B7-H3
SEQ ID NO: 27 - Secuencia de aminoácidos de una cadena pesada del anticuerpo anti-CD30 SEQ ID NO: 28 - Secuencia de aminoácidos de una cadena ligera del anticuerpo anti-CD30 SEQ ID NO: 29 - Secuencia de aminoácidos de una cadena pesada del anticuerpo anti-CD33 SEQ ID NO: 30 - Secuencia de aminoácidos de una cadena ligera del anticuerpo anti-CD33 SEQ ID NO: 31 - Secuencia de aminoácidos de una cadena pesada del anticuerpo anti-CD70 SEQ ID NO: 32 - Secuencia de aminoácidos de una cadena ligera del anticuerpo anti-CD70SEQ ID NO: 27 - Amino acid sequence of a heavy chain of the anti-CD30 antibody SEQ ID NO: 28 - Amino acid sequence of a light chain of the anti-CD30 antibody SEQ ID NO: 29 - Amino acid sequence of a heavy chain of the anti-CD33 antibody SEQ ID NO: 30 - Amino acid sequence of a light chain of anti-CD33 antibody SEQ ID NO: 31 - Amino acid sequence of a heavy chain of anti-CD70 antibody SEQ ID NO: 32 - Amino acid sequence of a light chain of the anti-CD70 antibody
LISTADO DE SECUENCIASSEQUENCE LIST
<110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED<110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED
<120> CONJUGADO DE ANTICUERPO - FÁRMACO<120> ANTIBODY CONJUGATE - DRUG
<130> PD20-9003WO<130> PD20-9003WO
<150> JP2012-225887 <151> 11/10/2012<150> JP2012-225887 <151> 10/11/2012
<160> 32<160> 32
<170> PatentIn versión 3.5<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 534 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 1 <211> 534 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 1<400> 1
Claims (25)
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