ES2673123T3

ES2673123T3 - Receptor quimérico de antígenos

Info

Publication number: ES2673123T3
Application number: ES15709320.4T
Authority: ES
Inventors: Martin PULÉ; John Anderson; Simon Thomas
Original assignee: UCL Business Ltd
Current assignee: UCL Business Ltd
Priority date: 2014-03-06
Filing date: 2015-03-06
Publication date: 2018-06-19
Anticipated expiration: 2035-03-06
Also published as: US10975162B2; PT3114147T; SG11201606790XA; EP3241851A1; US20240301088A1; DK3114147T3; EP3553091A1; EP3114147B1; HUE038625T2; RU2016138422A3; JP6422134B2; CN106536563B; KR101965040B1; US20210403596A1; CA2941159C; CL2016002196A1; CA2941159A1; CN106536563A; US20170066838A1; PL3114147T3

Abstract

Un receptor quimérico de antígenos (CAR) que comprende un dominio de unión a disialogangliósido (GD2) que comprende a) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende un dominio VH que tiene la secuencia mostrada como la SEQ ID NO 10; y b) una región variable de cadena ligera (VL) que comprende un dominio VL que tiene la secuencia mostrada como la SEQ ID NO 12.

Description

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DESCRIPCION

Receptor quimérico de antígenos Campo de la invención

La presente invención se refiere a un receptor quimérico de antígenos (CAR) que se une al antígeno canceroso disialogangliósido (GD2). Los linfocitos T que expresan dicho CAR son útiles en el tratamiento de enfermedades cancerosas tales como neuroblastoma.

Antecedentes de la invención

El disialogangliósido (GD2, pubchem: 6450346) es un glucoesfingolípido que contiene ácido siálico expresado principalmente en la superficie celular. La función de este antígeno de carbohidrato no está completamente entendida; sin embargo, se cree que desempeña una función importante en la adhesión de las células tumorales a las proteínas de matriz extracelular. GD2 se expresa de forma densa, homogénea y casi universal en neuroblastoma. En tejidos normales, la expresión de GD2 está limitada en gran medida a melanocitos de la piel, y vainas de mielina de las fibras de dolor periféricas. Dentro del SNC, GD2 parece ser un antígeno embrionario, pero se encuentra expresado vagamente en oligodendrocitos dispersados y dentro de la pituitaria posterior. Esto hace que GD2 sea muy adecuado para tratamiento antitumoral dirigido.

Se han ensayado ampliamente anticuerpos anti-GD2, como tratamiento en neuroblastoma. Dos clones y sus derivados están en uso clínico actual: clon 3F814 y 3F8. Otro clon 14.187 se ha ensayado como una IgG3 de ratón, después del cambio de isotipo a IgG2a (14g2a) y finalmente después de quimerización con IgG1 humana para formar ch14.18. Este último anticuerpo ha producido una clara eficacia en un estudio aleatorizado: el US Children's Oncology Group informó de un estudio en fase III aleatorio de ch14:18 en niños con neuroblastoma de alto riesgo que han conseguido remisión radiológica después del tratamiento inicial. En estos pacientes, hubo una mejora de un 20 % en EFS en el brazo ch14:18 con un seguimiento medio de 2,1 años. De forma importante, La neurotoxicidad muy habitualmente como dolor crónico que induce neuropatía y menos habitualmente una oftalmoplejía es la toxicidad limitante de dosis principal con estos agentes.

Estos mAb terapéuticos siguen teniendo que refinarse: se ha descrito una inmunocitocina IL-2 derivada de ch14.18. Es un agente bastante tóxico con algún efecto sobre enfermedad residual mínima, pero ninguno contra enfermedad voluminosa. Ch14.18 se ha humanizado completamente y se ha mutado su Fc para inhibir la activación del complemento. Esta versión humanizada de Ch14.18 está en estudio clínico, pero hay únicamente datos muy limitados disponibles. También se ha descrito la humanización del anticuerpo 3F8. Aunque los datos clínicos de seroterapia de GD2 son prometedores, las remisiones completas mantenidas aún están limitadas y no hay evidencias de una función clínicamente útil para los anticuerpos excepto en un entorno de enfermedad mínima.

Por tanto, existe una necesidad de estrategias terapéuticas mejoradas para tratar el neuroblastoma y otros cánceres que expresan GD2.

Receptores quiméricos de antígeno (CAR)

Los receptores quimérico de antígenos son proteínas que, en su formato habitual, injertan la especificidad de un anticuerpo monoclonal (mAb) con la función efectora de un linfocito T. Su forma habitual es la de una proteína de dominio transmembranario de tipo I con un extremo amino que reconoce antígeno, un espaciador, un dominio transmembranario, todo ello conectado a un endodominio de compuesto que transmite señales de supervivencia y activación de linfocitos T (véase la figura 1a).

La forma más habitual de estas moléculas es fusiones de fragmentos variables de cadena sencilla (scFv) derivados de anticuerpos monoclonales que reconocen un antígeno diana, fusionados mediante un espaciador y un dominio transmembranario a un endodominio de señalización. Dichas moléculas producen la activación de los linfocitos T en respuesta al reconocimiento por el scFv de su diana. Cuando los linfocitos T expresan dicho CAR, reconocen y eliminan células diana que expresan el antígeno diana. Se han desarrollado varios CAR contra antígenos asociados a tumor, y las estrategias de transferencia adoptiva usando dichos linfocitos T que expresan CAR están actualmente en ensayo clínico para el tratamiento de diversos cánceres.

Se han descrito receptores quimérico de antígeno contra GD2 en que el dominio de unión a antígeno se basa en el scFv 14g2a (documento WO 2013/040371 y Yvon et al., (2009, Clin Cancer Res 15:5852-5860)).

Los linfocitos T humanos que expresan un CAR 14g2a-CD28-OX40-Z demostraron tener alguna actividad antitumoral, pero no podían erradicar completamente la enfermedad (Yvon et al., (2009) como anteriormente).

Los autores de la presente invención buscan generar un CAR dirigido a GD2 alternativo con propiedades mejoradas.

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Descripción de las figuras

Figura 1 - Diseño del receptor quimérico de antígenos (CAR).

(a) arquitectura generalizada de un CAR: Un dominio de unión reconoce el antígeno; el espaciador eleva el dominio de unión desde la superficie celular; el dominio transmembranario ancla la proteína a la membrana y el endodominio transmite señales. (b) a (d): Diferentes generaciones y permutaciones de endodominios de CAR: (b) los diseños iniciales transmitían señales ITAM en solitario a través de FceRI-y o el endodominio CD3-Zeta, mientras que los diseños posteriores transmitían una (c) o dos (d) señales coestimuladores adicionales en cis.

Figura 2 - Variantes de CAR anti-GD2 construidos (a) CAR anti-GD2 CAR usando anticuerpo de KM666 de ratón como scFv con espaciador de IgG1 humana y endodominio CD28-OX40-Zeta; (b) CAR anti-GD2 CAR usando anticuerpo humanizado de Nakamura huKM666 en el mismo formato que (a); (c) mismo formato que (b) excepto que el dominio Fc está modificado para eliminar los motivos de reconocimiento del receptor Fc; (d) mismo formato que (c) excepto que el espaciador es la bisagra de IgG1 - tallo de CD8; (e) igual que (c) excepto que el espaciador es el tallo de CD8 únicamente; (f) igual que (c) excepto que el espaciador es la bisagra de IgG1 únicamente.

Figura 3 - Comparación de CAR basados en muKM666 y huKM666. (a) Expresión en linfocitos T de sangre periférica de 3 donantes normales; (b) intensidad media de fluorescencia de estos diagramas de facs mostrados como un histograma; (c) Ensayo de liberación de cromo usando linfocitos T no transducidos, linfocitos T transducidos con muKM666 y huKM666, como efectores contra dianas A204 (GD2 negativas), y LAN-1 (GD2 positivas); (d) producción de IL-2 a partir de la misma exposición; (e) producción de interferón-gamma a partir de la misma exposición; y (f) proliferación factorial a partir de la misma exposición.

Figura 4. (a) Construcción retrovírica que permite coexpresión 1:1 del gen marcador CD34 con CAR; (b) Análisis de citometría de flujo de la expresión de CAR (marca HA) frente al gen marcador CD34; (c) Ensayo de liberación de cromo de linfocitos T no transducidos y linfocitos T transducidos con las 3 diferentes variantes de CAR contra dianas GD2 positivas (LAN-1) y dianas GD2 negativas (A204); (d) liberación de interferón gamma; (e) liberación de IL-2; y (f) proliferación de las mismas dianas y efectores.

Figura 5 - Introducción de mutaciones que alteran la unión a FcR en el espaciador Fc (a) mutaciones introducidas; (b) Expresión de CAR determinada por tinción anti-Fc: no transducido, wt y mutado; (c) Eliminación de dianas GD2 negativas y GD2 positivas con linfocitos T de CAR anti-GD2 no transducidos, con wt Fc y Fc mutado; (d) Activación de linfocitos T anti-GD2 no transducidos, con wt Fc y Fc mutado con la línea celular que expresa FcR THP-1; liberación de IL-1Beta por la línea celular THP-1 en respuesta a linfocitos T de CAR no transducidos, con wt Fc y Fc mutado.

Figura 6 - Optimización del casete de expresión

(a) optimizaciones del mapa que se introdujeron en el casete: SAR o CHS4; (b) expresión representativa de CAR con diferentes modificaciones con fase de lectura abierta wt o de codones optimizados. La construcción SAR da un pico estricto de expresión que es lo que se desea. (c) Representación de diagrama de barras de estos datos FACS de 3 donantes normales.

Figura 7 - Comparación de diferentes endodominios

Se compararon tres diferentes receptores quimérico de antígenos. Los receptores que comprendían todos el scFv huK666, el dominio Fc de IgG1 se mutaron para reducir la unión a FcR y el dominio transmembranario CD28. El CAR "28tmZ" tiene un endodominio CD3 Zeta; "28Z" tiene un endodominio compuesto CD28 - CD3Zeta; "28OXZ" tiene un endodominio compuesto que comprende CD28, OX40 y CD3Zeta, Los linfocitos T de sangre periférica de donantes normales se transdujeron con estas construcciones con vectores retrovíricos de valoraciones similares. Estas diferentes líneas de linfocitos T se compararon, junto con linfocitos T no transducidos como controles. Los linfocitos T se expusieron con células A204 (una línea celular de rabdomiosarcoma que es GD2 negativa) y células LAN-1 (una línea celular de neuroblastoma que es GD2 positiva). La proliferación y la liberación de citocinas muestran que la actividad del receptor es 28tmZ < 28Z < 28OXZ.

Figura 8 - Coexpresión con el gen suicida iCasp9

(a) Coexpresión de iCasp9 con CAR anti-GD2 usando la secuencia FMD-2A; (b) expresión de CAR en linfocitos T NT, linfocitos T transducidos con GD2CAR y linfocitos T iCasp9-2A-GD2CAR en solitario y después de tratamiento con CID; (c) Eliminación de dianas GD2 positivas (LAN-1) y negativas (A204) con linfocitos T no transducidos, transducidos con GD2CAR y transducidos con iCasp9-2A-GD2CAR con o sin tratamiento con CID. Promedio de 5 linfocitos T donadores normales.

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Figura 9 - Coexpresión con el gen suicida RQR8

(a) Se coexpresó CARhuK666Fc con el gen de tipo suicida RQR8 en un vector retrovírico. (b) Los linfocitos T se transdujeron con este vector retrovírico y se determinó la coexpresión del CAR y RQR8 por tinción de los linfocitos T transducidos con un anticuerpo policlonal anti-Fc y el anticuerpo monoclonal QBend10. (c) La población positiva a CAR de estos linfocitos T pudo reducirse en presencia de Rituximab y complemento. (d) Los linfocitos T reducidos con Rituximab ya no reconocían dianas que expresan GD2.

Figura 10 - (a) Vector bicistrónico que expresa sintasa de GM3 y sintasa de GD2. (b) Las células SupT1 transducidas con este vector llegan a ser gD2 positivas (área de gráfica vacía no transducido; área de gráfica en gris transducido).

Figura 11 - Curvas de crecimiento de tumores individuales en ratones en las siguientes cohortes: parte superior izquierda: ratones con tumores CT26 que expresan GD2 que reciben esplenocitos con CAR anti-GD2; parte superior derecha: tumores CT26 que expresan GD2 que reciben esplenocitos con transducción simulada; parte inferior izquierda: tumores CT26 GD2 negativos (wt) con esplenocitos con CAR anti-GD2; parte inferior derecha: y tumores CT26 que expresan GD2 que no reciben esplenocitos

Figura 12 - Secuencias de aminoácidos

A. CAR anti-GD2 mostrado como (a) en la figura 2 (muKM666-HCH2CH3-CD28OXZ - SEQ ID NO 26)

B. CAR anti-GD2 mostrado como (b) en la figura 2 (huKM666-HCH2CH3-CD28OXZ - SEQ ID NO 27)

C. CAR anti-GD2 mostrado como (c) en la figura 2 (huKM666-HCH2CH3pvaa-CD28OXZ - SEQ ID NO 28)

D. CAR anti-GD2 mostrado como (d) en la figura 2 (huKM666-HSTK-CD28OXZ - SEQ ID NO 29)

E. CAR anti-GD2 mostrado como (e) en la figura 2 (huKM666-STK-CD28XOXZ - SEQ ID NO 30)

F. CAR anti-GD2 mostrado como (f) en la figura 2 (huKM666-HNG-CD28OXZ - SEQ ID NO 31)

G. CAR anti-GD2 CAR mostrado como (c) en la figura 2, pero con endodominio de 1.a generación (huKM666- HCH2CH3pvaa-CD28tmZ - SEQ ID NO 32)

H. CAR anti-GD2 mostrado como (c) en la figura 2, pero con endodominio de 2.a generación (huMK666- HCH2CH3pvaa-CD28Z - SEQ ID NO 33)

I. CAR anti-GD2 coexpresado con el gen suicida iCasp9 - SEQ ID NO 34

J. CAR anti-GD2 coexpresado con el gen suicida RqR8 - SEQ ID NO 35

Figura 13 - Estructura de GD2

Figura 14 - Comparación de los CAR huK666 y 14g2a. (a) mapas de construcciones ensayadas: Se ensayaron dos construcciones en linfocitos T primarios. Ambos son vectores retrovíricos que codifican RQR8 y un GD2 CAR de 2.a generación coexpresado con una secuencia de tipo FMD-2A. La única diferencia entre las construcciones es que en una, el scFv es huK666 y en la otra es 14g2a. Los linfocitos T transducidos por estas construcciones se expusieron 1:1 con A204 (una línea celular de rabdomiosarcoma GD2 negativa) y LAN-1 (una línea celular GD2 positiva). (b) A las 24 horas, se midió el interferón-gamma del sobrenadante. Los linfocitos T con CAR huK666 producen más IF-G. (c) Después de una semana se cuentan los linfocitos T, huK666 muestra más proliferación.

Figura 15 - Análisis de citometría de flujo del cocultivo entre CAR de 2.a generación basados en huK666 o 14g2a y la línea celular de neuroblastoma LAN1. (a) Configuración del experimento. Después de una semana de cocultivo, las células se recogieron y se analizaron por citometría de flujo. La expresión de CD45 permitió la discriminación de células linfoides y células no linfoides siendo las células CD45- células LAN-1. La tinción adicional con CD3/QBEND/10 permitió el recuento de los linfocitos T con CAR. (b) linfocitos T en solitario; (c) linfocitos T NT y células LAN-1; (d) linfocitos T con CAR huK666-28-Z y células LaN-1; (e) linfocitos T con cAr 14g2a-28-Z y células LAN-1. Se observa un residuo de células LAN-1 en el cocultivo de linfocitos T con CAR 14g2a.

Sumario de aspectos de la invención

Los autores de la presente invención han construido un nuevo receptor quimérico de antígenos (CAR) dirigido a GD2 que comprende un dominio de unión a GD2 basado en el anticuerpo K666.

El anticuerpo anti-GD2 14g2a puede observarse como tratamiento de referencia, porque se usa como anticuerpo terapéutico y es el único scFv ensayado hasta la fecha en un estudio de CAR (PMID: 18978797). Los autores de la presente invención compararon CAR basado en 14g2a y huK666 en un formato de segunda generación ya que este es el formato de CAR más ampliamente usado en estudios clínicos. Se descubrió que los linfocitos T con CAR huK666 liberan más IFN-y, proliferan mejor y eliminan más completamente que los equivalentes 14g2a.

Por tanto, En un primer aspecto, la presente invención proporciona un receptor quimérico de antígenos (CAR) que comprende un dominio de unión a disialogangliósido (GD2), que comprende

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a) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende un dominio VH que tiene la secuencia mostrada como la SEQ ID NO 10 y

b) una región variable de cadena ligera (VL) que comprende un dominio VL que tiene la secuencia mostrada como la SEQ ID NO 12.

El dominio de unión a GD2 puede comprender la secuencia mostrada como la SEQ ID NO 8.

El dominio de unión a GD2 y el dominio transmembranario pueden conectarse por un espaciador.

El espaciador puede comprender uno de los siguientes: un dominio Fc de IgG1 humana; una bisagra de IgG1; una bisagra de IgG1 -tallo de CD8; o un tallo de CD8.

El espaciador puede comprender una bisagra de IgG1-tallo de CD8 o un tallo de CD8.

El espaciador puede comprender un dominio Fc de IgG1 o una variante del mismo.

El espaciador puede comprender un dominio Fc de IgG1 que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID NO 23 o SEQ ID NO 24 o una variante de las mismas que tenga al menos un 80 % de identidad de secuencia.

El CAR puede comprender o asociarse con un dominio de señalización de linfocitos T intracelular. El dominio de señalización de linfocitos T intracelular puede comprender uno o más de los siguientes endodominios: endodominio de CD28; endodominio de OX40 y CD3-Zeta.

El dominio de señalización de linfocitos T intracelular puede comprender todos los siguientes endodominios: endodominio de CD28; endodominio de OX40 y CD3-Zeta.

El CAR, que comprende un dominio VH y VL que tiene las secuencias mostradas como SEQ ID NO 10 y 12, puede comprender la secuencia mostrada como cualquiera de las SEQ ID NO 27 a 35 o una variante de las mismas que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia pero retiene la capacidad de i) unirse a GD2 y ii) inducir la señalización de linfocitos T.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

La secuencia de ácido nucleico puede tener los codones optimizados.

La secuencia de ácido nucleico, que codifica un CAR de acuerdo con el primer aspecto de la invención, puede comprender la secuencia mostrada como SEQ ID NO 25 o una variante de la misma que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia.

El ácido nucleico también puede codificar un gen suicida.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto de la invención.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona una célula que expresa un CAR de acuerdo con el primer aspecto de la invención. La célula puede ser una célula inmunitaria citolítica, tal como un linfocito T o linfocito citolítico natural (NK).

La célula puede coexpresar un CAR de acuerdo con el primer aspecto de la invención y un gen suicida.

El gen suicida puede ser, por ejemplo, iCasp9 o RQR8.

En un quinto aspecto, la presente invención proporciona un método para generar una célula de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención, que comprende la etapa de introducir un ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto de la invención ex vivo en una célula.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un vector de acuerdo con el tercer aspecto de la invención o una célula de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención, junto con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar el cáncer, que comprende la etapa de administrar un vector de acuerdo con el tercer aspecto de la invención o una célula de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención a un sujeto.

El cáncer puede ser neuroblastoma.

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En un octavo aspecto, la presente invención proporciona un vector de acuerdo con el tercer aspecto de la invención o una célula de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención para su uso en el tratamiento de un cáncer.

Descripción detallada

RECEPTORES QUIMÉRICOS DE ANTÍGENOS (CAR)

Los receptores quiméricos de antígenos (CAR), también conocidos como receptores quiméricos de linfocitos T, receptores artificiales de linfocitos T e inmunorreceptores quiméricos, son receptores genomanipulados, que injertan una especificidad arbitraria en una célula efectora inmunitaria. En un CAR clásico, la especificidad de un anticuerpo monoclonal se injerta en un linfocitos T. Los ácidos nucleicos que codifican CAR pueden transferirse a linfocitos T usando, por ejemplo, vectores retrovíricos. De esta manera, puede generarse una gran cantidad de linfocitos T específicos de cáncer para transferencia celular adoptiva. Los estudios clínicos en fase I de esta estrategia muestran eficacia.

El dominio de unión a antígeno diana de un CAR se fusiona habitualmente mediante un espaciador y dominio transmembranario a un endodominio de señalización. Cuando el CAR se une al antígeno diana, esto provoca la transmisión de una señal de activación al linfocito T sobre el que se expresa.

El CAR de la presente invención comprende un dominio de unión a GD2 que está basado en el anticuerpo monoclonal KM666 (Nakamura et al., (2001) Cancer Immunol. Immunother. 50:275-284).

El CAR de la presente invención comprende un dominio de unión a GD2 que comprende

a) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende un dominio VH que tiene la secuencia mostrada como la SEQ ID NO 10

El CAR descrito en este documento comprende un dominio de unión a GD2 que comprende

a) una región variable de cadena pesada (VH) que tiene regiones determinantes de complementariedad (CDR) con las siguientes secuencias:

CDR1 - SYNIH (SEQ ID NO 1);

CDR2 - VIWAGGSTNYNSALMS (SEQ ID NO 2)

CDR3 - RSDDYSWFAY (SEQ ID NO 3); y

b) una región variable de cadena ligera (VL) que tiene CDR con las siguientes secuencias:

CDR1 - RASSSVSSSYLH (SEQ ID NO 4);

CDR2 - STSNLAS (SEQ ID NO 5)

CDR3 - QQYSGYPIT (SEQ ID NO 6). No es parte de la invención, aunque de acuerdo con la divulgación puede ser posible introducir una o más mutaciones (sustituciones, adiciones o eliminaciones) en cada CDR sin afectar de forma negativa a la actividad de unión a GD2. Cada CDR puede tener, por ejemplo, una, dos o tres mutaciones de aminoácido.

La secuencia de KM666 murina tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como la SEQ ID NO 7. SEQ ID NO 7 (secuencia de KM666 murina)

QVQLKESGPVLVAPSQTLSITCTVSGFSLASYNIHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGS

TNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLQMNSLQTDDTAMYYCAKRSDDYSWFAYWGQG

TLVTVSASGGGGSGGGGSGGGGSENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSSS

YLHWYQQKSGASPKVWIYSTSNLASGVPGRFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYY

CQQYSGYPITFGAGTKVEVKR

Esta secuencia comprende las siguientes secuencias VH y VL:

SEQ ID NO 9 (secuencia de VH de KM666)

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QVQLKESGPVLVAPSQTLSITCTVSGFSLASYNIHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGS

TNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLQMNSLQTDDTAMYYCAKRSDDYSWFAYWGQG

TLVTVSA

SEQ ID NO 11 (secuencia de VL de KM666)

ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSSSYLHWYQQKSGASPKVWIYSTSNLA

SGVPGRFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYYCQQYSGYPITFGAGTKVEVK

El CAR de la presente invención puede comprender la siguiente secuencia de aminoácidos:

SEQ ID NO 8 (secuencia de KM666 humanizada)

QVQLQESGPGLVKPSQTLSITCTVSGFSLASYNIHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGS

TNYNSALMSRLTISKDNSKNQVFLKMSSLTAADTAVYYCAKRSDDYSWFAYWGQG

TLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSENQMTQSPSSLSASVGDRVTMTCRASSSVSSS

YLHWYQQKSGKAPKVWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYY

CQQYSGYPITFGQGTKVEIKR

El CAR de la presente invención comprende la siguiente secuencia de VH:

SEQ ID NO 10 (secuencia de VH de KM666 humanizada)

QVQLQESGPGLVKPSQTLSITCTVSGFSLASYNIHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGS

TNYNSALMSRLTISKDNSKNQVFLKMSSLTAADTAVYYCAKRSDDYSWFAYWGQG

TLVTVSS

El CAR de la presente invención comprende la siguiente secuencia de VL:

SEQ ID NO 12 (secuencia de VH de KM666 humanizada)

ENQMTQSPSSLSASVGDRVTMTCRASSSVSSSYLHWYQQKSGKAPKVWIYSTSNL

ASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYSGYPITFGQGTKVEIK

El porcentaje de identidad entre dos secuencias polipeptídicas puede determinarse fácilmente por programas tales como BLAST que está libremente disponible en
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov.

DOMINIO TRANSMEMBRANARIO

El CAR de la invención también puede comprender un dominio transmembranario que abarca la membrana. Puede comprender una hélice alfa hidrófoba. El dominio transmembranario puede obtenerse de CD28, que da una buena estabilidad de receptor.

El dominio transmembranario puede comprender la secuencia mostrada como la SEQ ID NO 13.

SEQ ID NO 13

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV

DOMINIO DE SEÑALIZACIÓN DE LINFOCITOS T INTRACELULARES (ENDODOMINIO)

El endodominio es la parte de transmisión de señales del CAR. Después del reconocimiento de antígeno, los receptores se agrupan y se transmite una señal a la célula. El componente de endodominio más habitualmente usado es el de CD3-zeta que contiene 3 ITAM. Este transmite una señal de activación a linfocito T después de que se una el antígeno. CD3-zeta puede no proporcionar una señal de activación completamente competente y puede necesitarse una señalización coestimuladora adicional. Por ejemplo, puede usarse CD28 quimérica y OX40 con CD3-Zeta para transmitir una señal proliferativa/de supervivencia, o pueden usarse los tras conjuntamente.

El endodominio del CAR de la presente invención puede comprender el endodominio de CD28 y el endodominio de OX40 y CD3-Zeta.

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El dominio transmembranario y de señalización de linfocitos T intracelular (endodominio) del CAR de la presente invención pueden comprender la secuencia mostrada como las SEQ ID NO 14, 15, 16, 17 o 18 o una variante de las mismas que tengan al menos un 80 % de identidad de secuencia.

SEQ ID NO 14 (endodominio de CD28)

RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAY

SEQ ID NO 15 (endodominio de CD40)

RSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI

SEQ ID NO 16 (endodominio de CD3 zeta)

RSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRK

NPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ

ALPPR

SEQ ID NO 17 (CD28Z)

RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQ

QGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMA

EAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO 18 (CD28OXZ)

RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPG

GGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDV

LDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDG

LYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

Una secuencia variante puede tener al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 13, 14, 15, 16, 17 o 18, con la condición de que la secuencia proporcione un dominio transmembranario/dominio de señalización de linfocitos T intracelular eficaz.

PÉPTIDO SEÑAL

El CAR de la presente invención puede comprender un péptido señal de modo que, cuando el CAR se exprese dentro de una célula, tal como un linfocito T, la proteína naciente se dirija al retículo endoplasmático y posteriormente a la superficie celular, donde se expresa.

El núcleo del péptido señal puede comprender un largo tramo de aminoácidos hidrófobos que tiene tendencia a formar una única hélice alfa. El péptido señal puede empezar con un corto tramo cargado positivamente de aminoácidos, que ayuda a garantizar la topología apropiada del polipéptido durante el traslado. Al final del péptido señal típicamente hay un tramo de aminoácidos que se reconoce y escinde por peptidasa señal. La peptidasa señal puede escindir durante o después de completarse el traslado para generar un péptido señal libre y una proteína madura. Los péptidos señal libres entonces se digieren por proteasas específicas.

El péptido señal puede estar en el extremo amino de la molécula.

El CAR de la invención puede tener la fórmula general:

Péptido señal - dominio de unión a GD2 - dominio espaciador - dominio transmembranario - dominio de señalización de linfocitos T intracelular.

El péptido señal puede comprender la SEQ ID NO 19 o una variante de la misma que tiene 5, 4, 3, 2 o 1 mutaciones de aminoácido (inserciones, sustituciones o adiciones) con la condición de que el péptido señal aún funcione causando la expresión del CAR en la superficie celular.

SEQ ID NO 19: METDTLLLWVLLLWVPGSTG

5

10

15

20

25

30

35

40

El péptido señal de la SEQ ID NO 19 es compacto y altamente eficaz. Se predice que dará aproximadamente un 95 % de escisión después de la glicina terminal, dando una eliminación eficaz por la peptidasa señal.

ESPACIADOR

El CAR de la presente invención puede comprender una secuencia espaciadora para conectar el dominio de unión a GD2 con el dominio transmembranario y conectar espacialmente el dominio de unión a GD2 desde el endodominio. Un espaciador flexible permite que el dominio de unión a GD2 se oriente en diferente direcciones para posibilitar la unión de GD2.

La secuencia espaciadora puede comprender, por ejemplo, una región Fc de IgG1, una bisagra de IgG1 o un tallo de CD8, o una combinación de los mismos. El espaciador puede comprender, de forma alternativa, una secuencia alternativa que tiene longitud y/o propiedades espaciadoras de dominios similares como una región Fc de IgG1, una bisagra de IgG1 o un tallo de Cd8.

Un espaciador de IgG1 humana puede alterarse para eliminar los motivos de unión a Fc.

Los ejemplos de secuencias de aminoácidos para estos espaciadores se dan a continuación:

SEQ ID NO 20 (bisagra CH2CH3 de IgG1 humana)

AEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCWVDVSHEDPE

VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA

LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN

GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK

SLSLSPGKKD

SEQ ID NO 21 (tallo de CD8 humana):

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI

SEQ ID NO 22 (bisagra de IgG1 humana):

AEPKSPDKTHTCPPCPKDPK

SEQ ID NO 23 (bisagra-Fc de lgG1)

AEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDP

EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK

ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN

GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK

SLSLSPGKKDPK

SEQ ID NO 24 (bisagra - Fc de lgG1 modificada para eliminar los motivos de reconocimiento del receptor de Fc)

AEPKSPDKTHTCPPCPAPPVA*GPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCWVDVSHEDP

EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK

ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN

GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK

SLSLSPGKKDPK

Los restos modificados están subrayados; * indica una eliminación.

GD2

GD2 es un disialogangliósido expresado en tumores de origen neuroectodérmico, incluyendo neuroblastoma y melanoma humano, con expresión altamente restringida en tejido normales, principalmente al cerebelo y los nervios periféricos en seres humanos.

5 La expresión relativamente específica de tumor de GD2 hace que sea una diana adecuada para inmunoterapia. SECUENCIA DE ÁCIDO NUCLEICO

El segundo aspecto de la invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR del primer 10 aspecto de la invención.

La secuencia de ácido nucleico puede ser capaz de codificar un CAR que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como cualquiera de las SEQ ID NO 27-35. La secuencia de ácido nucleico puede ser o comprende la siguiente secuencia:

15

SEQ ID NO 25 secuencia de ADN de casete retrovírico que comprende CAR anti-GD2 coexpresado con el gen suicida RQR8 con una fase de codones optimizados y una región SAR para potenciar la expresión

1: tgaaagaccc cacctgtagg tttggcaagc tagcttaagt aacgccattt tgcaaggcat ggaaaaatac

71: ataactgaga atagaaaagt tcagatcaag gtcaggaaca gatggaacag ctgaatatgg gccaaacagg

141: atatctgtgg taagcagttc ctgccccggc tcagggccaa gaacagatgg aacagctgaa tatgggccaa

211: acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc

281: cagccctcag cagtttctag agaaccatca gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa atgaccctgt

351: gccttatttg aactaaccaa tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc ttatgctccc cgagctcaat

421: aaaagagccc acaacccctc actcggggcg ccagtcctcc gattgactga gtcgcccggg tacccgtgta

4 91: tccaataaac cctcttgcag ttgcatccga cttgtggtct cgctgttcct tgggagggtc tcctctgagt

561: gattgactac ccgtcagcgg gggtctttca tttgggggct cgtccgggat cgggagaccc ctgcccaggg

631: accaccgacc caccaccggg aggtaagctg gccagcaact tatctgtgtc tgtccgattg tctagtgtct

701: atgactgatt ttatgcgcct gcgtcggtac tagttagcta actagctctg tatctggcgg acccgtggtg

20

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

1. Un receptor quimérico de antígenos (CAR) que comprende un dominio de unión a disialogangliósido (GD2) que comprende

a) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende un dominio VH que tiene la secuencia mostrada como la SEQ ID NO 10; y

b) una región variable de cadena ligera (VL) que comprende un dominio VL que tiene la secuencia mostrada como la SEQ ID NO 12.
2. Un CAR de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el dominio de unión a GD2 comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID NO 8.
3. Un CAR de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que comprende la secuencia mostrada como cualquiera de las SEQ ID NO 27 a 35 o una variante de las mismas que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia, pero retiene la capacidad de i) unirse a GD2 y ii) inducir señalización de linfocitos T.
4. Una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR de acuerdo con cualquier reivindicación precedente.
5. Una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID NO 25 o una variante de la misma que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia.
6. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, que también codifica un gen suicida.
7. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.
8. Una célula que expresa un CAR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
9. Una célula que coexpresa un CAR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un gen suicida.
10. Una célula de acuerdo con la reivindicación 9, en la que el gen suicida es iCasp9 o RQR8.
11. Un método para generar una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, que comprende la etapa de introducir un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 ex vivo en una célula.
12. Una composición farmacéutica que comprende un vector de acuerdo con la reivindicación 7, o una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, junto con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
13. Un vector de acuerdo con la reivindicación 7 o una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 para su uso en el tratamiento de un cáncer.
14. Una célula para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en la que el cáncer es neuroblastoma.

imagen1

scFv huKóód

scFv huK666

scFv muK666

Conector

.Conector

.Bisagra

Bisagra

Bisagra

Bisagra

Biill

0X40

(b) Endodonnnios de primera generación

(c) Endodommios de segunda generación

■ a ■*!

(d) Endodonunios de tercera generación

F GURA 2

huKS66-hFc hul<666-hFtPvaa huK66S-hSTK huK666-hSTK i

-vi

K)

tyoo

imagen2

imagen3

dCD34

a<3D2CAR

¿A

C

Bisagra

HCH2CH3

- •- - MCMJCHJ UvvitJi AJ04

. J.J

Brt^gra mpmji asj

■o 23.0

•Mjgr»Tjno

IMPWSS)

IMPMMIUA-I

Bisagra-Tallo

Tallo

Relación efector:diana

imagen4

*3PVftA

Dominio lgG1 de Fe pvaa

simulado

lvt.bisagraCD28.CD3£

pvaa.bisagra.CD28,CD3£

■ medio

Relación elector diana

Relación efector diana

Relación elector diana

Sin modificar

Sin c exiones optimizados

■Sin modificar

OSAR

aCHR

Codones

optimizados

CHS4

Ncol

SCFv'

BamHI

r^iui

CD2*5

CHjCH;

MI ■

Dominio IgGI de Fcwt

52%

sr4- k

^ : :

pvaa CD28 jeta v.t CD2S jeta

F GURA 6

j-(E33I

;-AR

HA

ra 290,0

re 200,0

Optimizados

No optimizados

% de lisis de células diana

imagen5

imagen6

imagen7

O NT

E3 28tmZ Q 28Z O 280XZ

FIGURA 8

imagen8

imagen9

RQR8 (QBEND/1Ü) ;

imagen10

imagen11

CAR (anti-Fc)

FIGURA 10

(a)

ZA

5'LTR

I-----------------------1 Sintasa de GM3 Sintasa de GD2 ¡ 3'LTR

imagen12

Volumen del tumor (mm3) Volumen del tumor (mm3)

imagen13

Día después de la inoculación del tumor CT26 n.° 7 Trans T

imagen14

CT26wt Trans T

imagen15

Día después de la inoculación del tumor

CT26 n.° 7 y sin Trans T

imagen16

Tumor CT26 n.° 7 únicamente

imagen17

METJlít J 1 B7 í I ' '"'i ■ ■■ ¿VOI.KESGm.VAPSaVLSXTCTVSGFSLÍU?7Nii«íVRSÍ--PGXGL2«L3VIWftS-33

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ii.

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t;;'ni./:PBPrr.vyyc:'CYSCYPT,i,;-,COOTKVR~-yp. •'rlMIiililllliil

Región

Descripción

imagen27

¡Casp9 o RQR8 Péptido 2A de fiebre aftosa Péptido señal

scFv (muKM666 o huKM666) Conector y rotura de cadena Tallo de CD8alfa

Dominio transmembranario de CD28 Endodominio de CD28 Endodominio de 0X40 Endodominio de CD3 zeta

FIGURA 13

OH OH O

imagen28

imagen29

imagen30

L»n-l

C045- 90,29% ’’

14g2a-28Zeta + Lanlv

CD45

20K . «9K

» F$Ar*« FS

(a) Individuales

Células vivas

D45+

CD3+ frente a CD34+

¿.-a

Lan 1 en solitario

Camp-FL8Lao C03I APC

v ■ bb.44%

PBMCs +

Lan-1

HK , «9K MK

FlNH

HuK-28Zeta +

Lanl

0,03%

■10-