ES2674264T3 - Método y dispositivo para tratamiento de micropartículas - Google Patents
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Abstract
Un método para manipulación de micropartículas, en el que las micropartículas (22) se utilizan como una fase sólida para fijar un componente deseado de una muestra, en donde el componente deseado está constituido por diversas biomoléculas, ácido nucleico, proteínas, péptidos, orgánulos celulares, bacterias, células o virus, en donde - se realizan al menos dos pasos de tratamiento de las micropartículas (22) en la misma vasija (26) sin mover las partículas a otra vasija, - las micropartículas son partículas magnéticas que son ferromagnéticas, paramagnéticas o superparamagnéticas, - los pasos de tratamiento son al menos un cambio de soluciones (23) y al menos una mezcladura, - las micropartículas (22) se tratan con una herramienta magnética (10) equipada con un blindaje protector (21), - en la vasija (26) las micropartículas (22) se recogen y se fijan sobre el blindaje protector (21) de la herramienta magnética (10) antes del cambio de soluciones (23), - las micropartículas (22) se mezclan por medio de la herramienta magnética (10), de tal manera que el blindaje protector de la herramienta se mueve en la solución (23), y que comprende (a) - utilizar un imán externo (13) y un manguito o placa ferromagnético (12) para suprimir o crear un campo magnético en la vasija; - retirar una solución (23) de la vasija (26) sea por aspiración de la solución (23) a través de un filtro o membrana (77) en el fondo de la vasija (26) o por medio de una pipeta o dispositivo de lavado desde la parte superior de la vasija (26), en donde las micropartículas (22) se recogen antes de retirar la solución (22) en la superficie interna de la vasija (26) para formar una capa; o (b) - utilizar un imán externo (13) y un manguito o placa ferromagnético (12); en donde el imán (13) y el manguito ferromagnético (12) están imantados transversalmente; adicionalmente existe una suspensión de resorte (81) bajo el imán (13); por presión de la placa de la vasija (26) hacia abajo, la vasija (26) presiona simultáneamente el imán (13) dentro del manguito ferromagnético (12) y el resorte (81) bajo el imán (13) se aprieta; cuando el imán (13) está dentro del manguito ferromagnético (12), no existe campo magnético alguno fuera, y las micropartículas (22) se mantienen homogeneizadas en la solución (23).
Description
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Descripción
Método y dispositivo para tratamiento de micropartículas.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere a un método para tratamiento de micropartículas. La invención se refiere adicionalmente a un dispositivo para tratamiento de micropartículas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Método de transferencia magnética se refiere a toda acción relacionada con el movimiento de partículas por medio de magnetismo, tal como clasificación, recogida, transferencia, mezcladura y dosificación en una solución o de una solución a otra.
Partículas, micropartículas o partículas magnéticas se refieren a la totalidad de tales partículas pequeñas cuyos diámetros están comprendidos dentro del intervalo de micrómetros, y que pueden ser movidas por magnetismo. Existen diversas partículas conocidas que son transferibles con un imán, y las aplicaciones en las que se utilizan aquéllas varían también notablemente., por ejemplo, las partículas utilizadas en microbiología tienen usualmente un tamaño de 0,01 a 100 pm, muy frecuentemente 0,05-10 pm. Tales partículas conocidas son, por ejemplo, partículas que contienen material ferromagnético, paramagnético o supramagnético. Las partículas pueden ser también magnéticas en sí mismas, en cuyo caso aquéllas pueden ser movidas por medio de cualquier objeto ferromagnético.
En un dispositivo destinado al tratamiento de micropartículas, existe una unidad que explota el magnetismo, a la que se hace referencia en lo sucesivo como un imán. Puede tratarse de un imán permanente o un electroimán, que atrae las partículas ferromagnéticas, o un objeto ferromagnético, que no es magnético en sí mismo, pero atrae todavía las partículas magnéticas.
Un imán es preferiblemente por lo general un imán de barra redondeada. Puede tratarse también de una barra de otra forma. Sin embargo, un imán no necesita en absoluto ser una barra. El mismo puede ser también corto y ancho o un objeto de cualquier forma. Un imán puede estar constituido también por uno o más objetos, tales como imanes u objetos ferromagnéticos.
Tiene que existir un blindaje que cubra el imán, que proteja el imán frente a diversas condiciones perjudiciales y que permita el tratamiento de micropartículas, tal como fijación y desprendimiento. La estructura del blindaje puede variar ampliamente, pudiendo ser el mismo, por ejemplo, una membrana delgada hecha de un material flexible o susceptible de estiramiento o incluso un vaso hecho de plástico elástico.
Usualmente se utilizan micropartículas como la fase sólida para fijar diversas biomoléculas, orgánulos celulares, bacterias o células. Por ejemplo, pueden inmovilizarse enzimas en la superficie de micropartículas, haciendo con ello eficiente el tratamiento y uso ulterior de las enzimas. La mayoría de las denominadas nanopartículas magnéticas (< 50 nm) no son adecuadas para tratamiento con imanes permanentes o electroimanes regulares, sino que requieren el uso de un gradiente magnético particularmente fuerte, como se describe en EP 0842704 (Miltenyi Biotec). Las partículas magnéticas, tales como micropartículas, que tienen un diámetro de aproximadamente 0,1 pm o mayor, pueden tratarse usualmente con imanes permanentes o electroimanes regulares. La viscosidad de la solución puede dificultar también considerablemente la captura de las partículas. Las partículas a capturar pueden estar suspendidas originalmente en la solución, en el caso de que se desee fijar una sustancia, o, por ejemplo, células en la superficie de las micropartículas.
TÉCNICA ANTERIOR
Micropartículas tratadas por medio de un imán se han utilizado desde los años 1970. Esta técnica llegó a hacerse muy popular en inmunoensayos, entre otros. El uso de micropartículas en inmunoensayos para separar el complejo antígeno-anticuerpo fijado de la fracción libre proporcionaba una ventaja considerable, particularmente en la velocidad de reacción. El desarrollo principal concerniente a la explotación del uso de micropartículas ha tenido lugar a lo largo de los últimos años en el campo de la biología molecular, microbiología y biología celular.
En un método clásico, las partículas magnéticas presentes en la solución de reacción, tales como micropartículas, son capturadas por medio de un imán externo a un lugar dado en la superficie interna del tubo. Después de ello, se hace un esfuerzo para retirar cuidadosamente la solución que se encuentra alrededor de las micropartículas. En un método clásico, se tratan líquidos activamente y las partículas magnéticas permanecen en la misma vasija durante todo el procedimiento.
En otro enfoque, se utiliza un imán para transferir activamente micropartículas. El imán se introduce en una solución que contiene micropartículas, con lo cual el imán atrae las micropartículas en la solución y las mismas forman un precipitado sólido. Después de ello, el imán y las micropartículas pueden extraerse del líquido. El imán junto con las partículas puede impregnarse luego en un líquido en otro tubo de ensayo, en el cual las micropartículas pueden desprenderse del imán. El documento DE 100 57 396 C1 describe un separador magnético de este tipo para separar
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una sustancia que está dispersada o disuelta en un primer líquido, donde dicho separador magnético tiene al menos una varilla de un material magnético blando dispuesta verticalmente con un extremo inferior y un extremo superior y está asegurado con su extremo superior en un soporte, tal que aquélla puede moverse a lo largo de su eje longitudinal y puede hacerse girar alrededor de su eje longitudinal de manera controlada por medios provistos en el soporte, estando rodeada la varilla por una bobina eléctrica excitadora, que está dispuesta de tal modo que la misma puede imantarse por activación de la bobina excitadora a lo largo de su eje longitudinal. El dispositivo puede utilizarse en un método para separar dicha sustancia dispersada o disuelta en dicho primer líquido utilizando los pasos siguientes: a) adición de partículas imantables al primer líquido, de tal modo que la sustancia pueda ser adsorbida en las partículas; b) inmersión de una varilla constituida por un material magnético blando en el primer líquido; c) imantación de la varilla a lo largo de su eje longitudinal con una bobina excitadora, lo que hace que las partículas con la sustancia adsorbida se depositen sobre la varilla; d) retirada del primer líquido de la varilla con las partículas depositadas sobre ella mientras la varilla está todavía imantada; e) desactivación de la bobina excitadora y separación por lavado de las partículas depositadas sobre la varilla con ayuda de un segundo líquido mientras la varilla está girando alrededor de su eje longitudinal. En este método, las fases de tratamiento, pipeteado y aspiración se minimizan hasta el extremo.
La Patente US 2.517.325 (Lamb) describe una solución para captura de objetos metálicos por medio de un imán.
La publicación describe un imán largo en forma de barra, que se mueve en el interior de un tubo de hierro. Los polos del imán de barra se encuentran en los extremos opuestos del eje longitudinal del imán físico. Al retirar el imán del tubo de hierro, el campo magnético se hace más intenso. La publicación describe una solución, en la cual los objetos metálicos pueden recogerse en la punta de la unidad magnética. La publicación describe también un blindaje de plástico sólido para proteger el imán.
La Patente US 2.970.002 (Laviano) describe una solución para recogida de objetos metálicos en líquidos por medio de un imán. La publicación describe un imán permanente largo, que recoge las partículas en la punta de la unidad magnética. El imán está unido a la barra metálica y protegido con un blindaje de plástico separado. La publicación describe el uso simultáneo del movimiento del imán permanente y el blindaje de plástico utilizado para proteger el imán. La publicación describe la recogida de objetos metálicos en la punta de la unidad magnética y el desprendimiento de los objetos metálicos de la parte superior del blindaje por medio de un diseño particular del blindaje de plástico.
Las Patentes US 3.985.649 (Eddelman), US 4,272,510 (Smith et al.), US 4,649,116 (Daty et al.), US 4,751,053 (Dodin et al.) y US 5,567,326 (Ekenberg et al.) describen soluciones, en las cuales un material imantable se recoge directamente de la solución con un imán en cada una de ellas. Es también común a estas publicaciones que los imanes no están protegidos con blindaje de plástico separados. Estas soluciones requieren también lavar la punta del imán antes de tratar la muestra siguiente para eliminar el riesgo de contaminación y el efecto de arrastre de impurezas.
La Patente US 5.288.119 (Crawford, Jr. et al) describe una solución, en la cual pueden recogerse objetos metálicos por medio de un imán. El imán del dispositivo conforme a la publicación no está protegido con un blindaje particular y no es adecuado para capturar objetos metálicos en líquidos. La publicación describe una solución para captura de objetos metálicos mayores. La publicación muestra un imán de barra larga, que se mueve dentro de un tubo no magnético. Una característica especial de este tubo es que el mismo actúa como bloqueador del campo magnético, aunque el mismo no está imantado. Como materiales alternativos para este propósito, la publicación muestra, por ejemplo, bismuto o plomo o una mezcla de ellos. El imán del dispositivo conforme a la solución no está protegido con un blindaje particular y no es adecuado para capturar objetos metálicos en líquidos.
La Solicitud WO 87/05536 (Schroder) describe el uso de un imán permanente, movible dentro del blindaje de plástico, para capturar material ferromagnético en una solución que lo contiene. El material ferromagnético se acumula en la punta de la unidad magnética, mientras que el imán se encuentra en su posición más baja. La publicación describe la transferencia del material ferromagnético recogido de esta manera en una solución a otra vasija y el desprendimiento en ella del material de la punta. El desprendimiento del material ferromagnético se describe por medio del diseño del blindaje de plástico que impide que el material se mueva mientras el imán se desplaza hacia arriba.
La Patente US 5.837.144 (Bienhaus et al.) describe un método para recogida de micropartículas por medio de un imán equipado con un blindaje de plástico particular. Esta publicación describe la fijación de micropartículas en una solución, que se retira de la vasija por diferentes dispositivos. Por desplazamiento del imán, puede conseguirse que las micropartículas se desprendan de la superficie del blindaje protector.
Las Patentes US 5,942,124 (Tuunanen), US 6,020,211(Tuunanen), US 6,040,192 (Tuunanen), US 6,065,605 (Korpela et al.), US 6,207,463 (Tuunanen) y la Solicitud de Patente US 20010022948 (Tuunanen) describen también dispositivos equipados con un blindaje de plástico para recogida de micropartículas en una solución y transferencia de las mismas a otra solución. Estas publicaciones describen primariamente soluciones, cuya intención es tratar micropartículas en volúmenes muy pequeños. La Patente US 5.942.124 (Tuunanen) describe un dispositivo, por medio del cual las micropartículas pueden enriquecerse directamente en la punta de la unidad magnética. La Patente US 6.020.211 (Tuunanen) describe el uso del dispositivo presentado en la publicación anterior para transferir micropartículas que se han reunido por medio de un imán de gran tamaño, denominado imán clásico, a vasijas más pequeñas. La Patente US 6.040.192 (Tuunanen) describe
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un método automático para utilización de micropartículas en ensayos específicos y para la manipulación de pequeños volúmenes. La Patente US 6.065.605 (Korpela et al.) continúa para aplicar ulteriormente la solución descrita en la Patente US 5.942.124 (Tuunanen) para la manipulación de volúmenes medianamente grandes. Se describe ahora un método, en el cual las partículas se han recogido primeramente por medio de una unidad magnética particular que contiene un imán de gran tamaño. Después de ello, se utiliza la unidad magnética descrita en la Patente US 5.942.124 (Tuunanen) para transferir ulteriormente el pélet de micropartículas a vasijas más pequeñas. La Patente US 6.207.463 (Tuunanen) aplica también la unidad magnética descrita previamente, por medio de la cual las partículas magnéticas pueden recogerse directamente en la punta del dispositivo. La Solicitud de Patente US 20010022948 (Tuunanen) describe también el tratamiento de una cantidad muy pequeña de micropartículas en vasijas particulares diseñadas para este fin.
Las Patentes US 5,942,124 (Tuunanen), US 6,020,211 (Tuunanen), US 6,065,605 (Korpela et al.), US 6,207,463 (Tuunanen) y EP 0 787 296 (Tuunanen) describen un método, cuyo objetivo es recoger una gran cantidad de micropartículas de una vasija medianamente grande por medio de un imán muy pequeño en la pequeña punta de una barra muy afilada y estrecha, resultando el método impracticable.
La Patente US 6.403.038 (Heermann) describe un dispositivo, que tiene un blindaje de plástico y un imán permanente fijado a una barra particular. Las micropartículas se recogen en la punta del blindaje de plástico y el método está destinado particularmente para tratar volúmenes pequeños. La barra tiene un saliente particular, por medio de la cual el imán y la barra se mantienen fijos en el tubo protector.
La Patente EP 1058851 (Korpela) y la Solicitud de Patente WO 01/60967 (Korpela) describen dispositivos, que tienen una membrana protectora elastómera elástica. En estas soluciones las micropartículas se recogen en la superficie de la membrana protectora elástica, pudiendo transferirse aquéllas ulteriormente a otra vasija. El blindaje protector del imán está hecho de un material elástico, siendo la membrana lo más delgada posible una vez estirada. De este modo se consigue una distancia lo más corta posible desde el imán al líquido.
Los enfoques conocidos actualmente requieren, o bien transferir las micropartículas de una vasija a otra que contiene una solución nueva, o fijar las micropartículas en la superficie interna de la vasija mientras se retira la solución previa y se reemplaza la misma con una nueva solución. La modalidad anterior consume un gran número de vasijas, dado que cada nuevo lavado o incubación requiere el uso de una nueva vasija. En este método, el uso de vasijas desechables es excesivo y además las soluciones concernientes a los dispositivos requieren el desarrollo de un dispositivo de gran tamaño. La última modalidad, es decir la denominada manera convencional de tratar las micropartículas presenta el problema de controlar el campo magnético a utilizar y la homogeneización de las micropartículas. La manera normal, por ejemplo, utilizando placas de 96 pocillos, consiste en usar una placa magnética, que tiene pivotes magnéticos o barras magnéticas en la parte superior de la placa. Los imanes dispuestos en la placa magnética están situados de tal manera que los mismos se introducen en los espacios y holguras entre los pocillos de la placa de 96 pocillos que se utiliza. Mientras la placa de 96 pocillos está situada encima de dicha placa magnética, los imanes desarrollan un campo magnético en los pocillos de la placa de 96 pocillos y las micropartículas contenidas en estos pocillos se fijan a la superficie interna del pocillo para formar una capa de micropartículas. A continuación, la solución puede retirarse del pocillo, por ejemplo, por medio de una pipeta y puede introducirse la solución siguiente. Las micropartículas necesitan ser homogeneizadas en la solución fuera de la superficie interna del pocillo y, para este propósito, la placa de 96 pocillos tiene que retirarse de su posición encima de la placa magnética a fin de desconectar el campo magnético. En el método convencional, la homogeneización de las micropartículas en la solución, la mezcladura de la solución y las micropartículas en el pocillo, así como la evaporación del líquido son problemas no fáciles de resolver. Estos problemas son particularmente acusados en vasijas pequeñas, tal como, por ejemplo, cuando se utilizan placas de 96, 384 y 1536 pocillos.
Conforme a una realización preferida, las micropartículas se fijan en la superficie de un dispositivo magnético específico y las soluciones pueden cambiarse a través de un orificio existente en el fondo de la vasija. Sin embargo, en este método particular no se resuelven la transferencia de las micropartículas de una vasija a otra, la retirada de las micropartículas temporalmente de la vasija mientras se cambian las soluciones, la mezcladura de la solución y/o las micropartículas, ni el cierre de la vasija.
Ninguna de las publicaciones descritas anteriormente describe un método, por el cual las micropartículas pudieran recogerse, mezclarse e incubarse eficientemente, en particular en volúmenes pequeños. Las publicaciones no describen tampoco una manera eficiente de transferir las micropartículas dentro de una vasija, transferir las micropartículas de la vasija ni cambiar las soluciones cuando es necesario dependiendo de la aplicación.
MÉTODO
El propósito de esta invención como se define por la reivindicación 1 es desarrollar un método de este tipo para tratamiento de micropartículas que no presenta las desventajas expuestas anteriormente. Una característica del método conforme a la invención es que se realizan al menos dos pasos de tratamiento en la misma vasija sin mover las partículas a otra vasija.
La invención se refiere particularmente a la recogida de micropartículas, retirada y adición de soluciones en una vasija, mezcla de las micropartículas en la vasija, cierre de la abertura de la vasija y transferencia de las
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micropartículas de una solución a otra. Por medio del método conforme a la invención, puede realizarse la operación de un gran volumen de muestra por medio de una vasija que incluye un filtro y revestimiento de la unidad magnética o su membrana protectora con micropartículas. Un revestimiento, producido de este modo, puede utilizarse, por ejemplo, en purificaciones e inmunoensayos.
El método puede utilizarse particularmente en dispositivos automáticos, en los cuales pueden realizarse diversas transferencias, lavados e incubaciones de micropartículas. Es posible unir el dispositivo automático a unidades, cuyo propósito es, por ejemplo, detectar reacciones PCR y/o diversos marcadores utilizados en inmunoensayos.
DISPOSITIVO
Es una característica del dispositivo para tratamiento de micropartículas de acuerdo con la reivindicación 5 que existen órganos en el dispositivo para cambiar la solución, de tal manera que pueden realizarse al menos dos pasos de tratamiento para las micropartículas en la misma vasija sin transferir las partículas a otra vasija.
La descripción se refiere adicionalmente a un dispositivo para mezcladura de micropartículas, cierre de la abertura de la vasija a utilizar, un dispositivo de mezcladura específico, que opera un gran volumen de muestra por medio de una vasija que incluye un filtro y una unidad magnética, así como su membrana protectora.
La propiedad crucial de la estación de lavado para micropartículas conforme a la invención es que las micropartículas no precisan ser transferidas a otra vasija, sino que pueden realizarse varias incubaciones y lavados en la misma vasija. La solución se cambia en la vasija, bien por aspiración de la solución retirándola así de la vasija a través de un filtro situado en el fondo de la vasija, o bien por un canal específico. La aspiración de la solución puede realizarse, por ejemplo, por medio de un dispositivo de aspiración o vacío, que está unido a la vasija de que se trata. Alternativamente, la aspiración de la solución de la vasija se realiza por medio de una pipeta o un dispositivo de lavado. Las micropartículas se fijan en la parte superior de la membrana protectora de la unidad magnética o en la superficie interna de la vasija a utilizar por medio de un imán externo y un manguito ferromagnético, mientras se cambian las soluciones. La nueva solución puede introducirse en la vasija por pipeteado o mediante diversos dispensadores/lavadores. Una de las ventajas de la estación de lavado para micropartículas conforme a la invención es que las micropartículas no precisan ser transferidas siempre a vasijas nuevas, mientras que se introducen nuevas soluciones. De este modo, puede ahorrarse una gran cantidad de material plástico desechable, tal como, por ejemplo, placas y tubos, y el tamaño de los dispositivos automáticos puede adaptarse hasta hacerse notablemente pequeño. Cuando se utiliza la estación de lavado conforme a la invención, es particularmente fácil desconectar y conectar el campo magnético. Una estación de lavado conforme a la invención se realiza por medio de un imán externo y un manguito/placa ferromagnética. En este caso, el manguito ferromagnético se utiliza de una manera adecuada para crear el campo magnético en la vasija. La retirada de la solución de la vasija se realiza por aspiración de la solución a través de un filtro/membrana/canal en el fondo de la vasija, o por medio de un dispositivo de pipeteado/lavado desde la parte superior de la vasija. Las micropartículas se recogen antes de retirar las soluciones, sea en la superficie interna de la vasija para formar una capa o sobre la membrana protectora de la unidad magnética. La solución siguiente puede introducirse por medio de una pipeta o un dispensador/lavador. En una realización de la invención, se incorpora en la vasija una herramienta específica de mezcladura, herramienta que está constituida por una barra dentro de una membrana protectora constituida por material elastómero, pudiendo utilizarse dicha barra para estirar o aflojar la membrana protectora. De este modo se realiza una mezcladura eficiente en la solución dentro de vasija. La mezcladura puede realizarse también por medio de la membrana protectora de la unidad magnética, en cuyo caso se aprovecha el movimiento del imán y el manguito ferromagnético en el interior de la membrana protectora, uno con relación al otro.
Un imán externo y el manguito/placa ferromagnético de apertura actúan alternativamente junto con la vasija, de tal manera que existe un resorte apropiado bajo/a un lado del imán. Mientras se encuentra en reposo, el imán está situado fuera del manguito/placa ferromagnético de apertura por medio del resorte y se dirige un campo magnético hacia la vasija. Cuando se empuja el imán dentro del campo ferromagnético, el resorte cede y no hay campo magnético alguno dirigido hacia la vasija. Un mecanismo de inmovilización específico puede estar dispuesto en la estación de lavado a fin de mantener el resorte cedido. Es posible reemplazar el resorte con una solución motorizada específica, por medio de la cual el imán se mueve en condiciones controladas en relación con el manguito ferromagnético.
La abertura de la vasija puede cerrarse herméticamente por medio de una unidad magnética que no forma parte de la invención, utilizada junto con una estación de lavado conforme a la invención, por ejemplo, durante las incubaciones. Esta propiedad tiene gran importancia cuando se utilizan pequeños volúmenes de solución, en cuyo caso la evaporación de la solución es a menudo un problema considerable. Las incubaciones a temperaturas elevadas y tiempos de incubación largos requieren también el cierre de las vasijas durante las incubaciones. Por medio de herramientas conforme a la invención, pueden mezclarse las soluciones y/o micropartículas, mientras la vasija está cerrada sin ayuda de un mezclador/vibrador externo. En la modalidad de mezcladura conforme a la invención, por estiramiento y aflojamiento de la membrana protectora constituida por material elastómero puede lograrse una mezcladura eficiente incluso en vasijas pequeñas. La membrana protectora puede tener formas apropiadas para mejorar la eficacia de la mezcladura.
Las micropartículas pueden conformarse para formar una capa de micropartículas en la superficie de un filtro o una membrana por medio del método conforme a un ejemplo que no forma parte de la invención. Por medio de dicho
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método de aplicación de micropartículas, por ejemplo, puede ser aspirado un gran volumen de muestra a través de la capa de micropartículas y el filtro situado bajo ella. Las micropartículas en la capa de micropartículas pueden revestirse, por ejemplo, con anticuerpos específicos, a los cuales se fijan los componentes deseados en la muestra. Después de ello, las micropartículas pueden recogerse de la capa en la superficie de la membrana protectora por medio de la unidad magnética y transferirse de la vasija que incluye el filtro. Los componentes recogidos de la muestra pueden desprenderse a una solución apropiada desde la superficie de las micropartículas, o bien pueden procesarse las micropartículas ulteriormente dependiendo de la aplicación en cuestión.
En un método conforme a la invención, las micropartículas se fijan a la membrana protectora de la unidad magnética para formar una capa. La unidad magnética y la solución que contiene las micropartículas se mezclan adecuadamente a fin de hacer la capa situada encima de la membrana protectora lo más homogénea y delgada posible. Por utilización de un imán imantado transversalmente puede aprovecharse un área muy grande de la superficie de la membrana protectora para recoger las micropartículas a fin de formar una capa delgada encima de la membrana protectora. Por otra parte, un imán que está imantado a lo largo del eje longitudinal de la unidad magnética, cuyo imán recoge las micropartículas exactamente en la punta de la membrana protectora, es una alternativa cuando no se necesita un área muy grande de fase sólida para el ensayo/purificación, pero los volúmenes de solución deseados son muy pequeños. En esta solución, la circunstancia más importante no es una cantidad grande de micropartículas, sino el tamaño del área y la homogeneidad de la capa en la que están dispuestas las micropartículas. El uso de un revestimiento de micropartículas, producido de este modo, es particularmente preferido, por ejemplo, cuando se realiza un inmunoensayo. En los inmunoensayos, así como en muchas otras aplicaciones analíticas, se desea que la fase sólida de recogida sea lo mayor posible, con lo cual puede aumentarse la sensibilidad de la medida y mejorarse la cinética de la reacción. En este caso, las micropartículas no tienen que desprenderse de la superficie de la membrana protectora, sino que todas las incubaciones y lavados se realizan junto con la capa de micropartículas. Por medio de esta solución, se asegura también que no se pierden micropartículas durante el proceso, comparado con el caso en que las micropartículas se desprenden en cada paso de lavado a la solución y se recuperan de nuevo de ella después del paso de lavado. En este caso pueden utilizarse también la estación de lavado, la mezcladura y el cierre de la abertura de la vasija. En un ejemplo que no forma parte de la invención, todas las soluciones y micropartículas necesarias pueden dispensarse fácilmente con anterioridad en vasijas separadas y las vasijas pueden estar cerradas también. Un enfoque de este tipo se prefiere cuando se desea desarrollar un método muy simple y fácil de utilizar. En un ejemplo que no forma parte de la invención, no existe blindaje o membrana protectora separada alguna alrededor del imán o los imanes en la unidad magnética, pero el imán puede estar revestido de manera apropiada, por ejemplo, con un revestimiento de fosfato, epoxi o níquel.
El imán de la unidad magnética conforme a una realización preferida de la invención tiene la característica técnica esencial de que la intensidad y el ajuste del campo magnético pueden regularse en relación con la membrana protectora que rodea el imán. Esto puede lograrse desplazando el imán en el interior del tubo ferromagnético de tal manera que el mismo puede estar completamente dentro del tubo, en cuyo caso la eficiencia del imán es insignificante o inexistente, o el mismo puede estar parcial o completamente fuera del tubo, estando entonces la eficiencia y el área de recogida del imán en relación con la parte sobresaliente del imán. Combinando estas características se logra un evento muy eficiente de recogida y enriquecimiento para transferir partículas magnéticas a vasijas de tamaños apropiados.
Un tubo ferromagnético puede estar constituido por hierro u otro material adecuado, que tenga características apropiadas para detener el paso del flujo magnético a través del tubo. La eficiencia del imán puede regularse por cambio de la posición del imán en relación con el tubo ferromagnético de tal manera que una parte del imán está dentro del tubo. Alternativamente, el imán puede mantenerse fijo y el tubo ferromagnético se mueve en relación con el imán. El imán está fijado a una barra, que puede ser ferromagnética o no ferromagnética, y por medio de la cual el imán puede moverse en el interior del tubo ferromagnético.
El imán puede tener la forma de una barra redonda o una espiga, pero el mismo puede tener también otra forma.
El eje de imantación del imán puede variar también. El eje de imantación puede ser longitudinal, en cuyo caso el mismo es paralelo al eje longitudinal de la barra y los polos del imán se encuentran en los extremos de la barra. En tal caso, la imantación es paralela al tubo ferromagnético, es decir paralela a la dirección de movimiento del imán o el tubo.
Sin embargo, el eje de imantación del imán puede ser también transversal en cuyo caso el mismo es perpendicular en relación al eje longitudinal tanto del tubo ferromagnético como del imán en forma de barra. En este caso, la dirección de imantación es transversal a la dirección de movimiento del imán o el tubo.
Por otro lado, el imán puede estar constituido también por varios imanes separados, que pueden ser iguales o diferentes y que pueden estar unidos unos a otros por medio de fuerza magnética o por un material, que es ferromagnético o no ferromagnético. El imán puede ser también una combinación de material magnético y ferromagnético. El imán puede ser también un imán permanente o un electroimán.
Mediante la disposición del imán, la membrana protectora y las vasijas a utilizar, pueden tratarse muy eficientemente micropartículas tanto en volúmenes de líquido grandes como pequeños. El enfoque de las micropartículas en la punta de la unidad magnética propiamente dicha permite tanto la concentración de grandes volúmenes como el
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tratamiento de micropartículas en pequeños volúmenes. De hecho, en la invención se describe una solución universal para aplicaciones que incluyen micropartículas tanto en grande como en pequeña escala.
La descripción expone que por el diseño de la forma de la superficie externa del blindaje de plástico o el elastómero de una manera particular se consigue soporte suficiente para recoger la masa de micropartículas que debe recogerse alrededor del blindaje de una manera preferible y fiable. El término diseño o forma particular se refiere, por ejemplo, a ranuras, cavidades y/o protuberancias de diferentes tamaños y profundidades. Cuando se acumula entre estas formaciones, el pélet de micropartículas consigue un soporte particular del blindaje, mientras la unidad magnética se mueve contra las corrientes líquidas. El efecto producido por muestras viscosas es muy importante, lo que significa, en el peor de los casos, que las micropartículas no se mantienen unidas a un lado del blindaje, sino que permanecen en la solución. La forma arriba descrita tiene naturalmente un gran beneficio para la fiabilidad de recogida, cuando se manipulan volúmenes grandes.
La invención describe una unidad magnética, por medio de la cual pueden recogerse micropartículas en muchas aplicaciones diferentes. La solución técnica esencial en la invención es la posibilidad de, por medio de un tubo ferromagnético, regular la fuerza y el ajuste del campo magnético a la membrana protectora circundante, alrededor de la cual se recogen las micropartículas. El imán puede moverse hacia dentro y hacia fuera en relación con el tubo ferromagnético, con lo cual se modifica el campo magnético del imán. Mientras el imán está fuera, un campo magnético igual a la cantidad de imán fuera del tubo ferromagnético se ajusta al blindaje. Entonces las micropartículas pueden recogerse fuera del blindaje protector. Cuando el imán se mueve completamente dentro del tubo ferromagnético, no hay ajuste considerable alguno del campo magnético externa. En este caso, las micropartículas no se acumulan alrededor de la membrana protectora, sino que se mantienen en solución. El tubo puede ser sólido o ajustable a fin de conseguir la eficiencia de recogida óptima posible. El imán y el tubo/manguito ferromagnético conforme a la invención se utilizan también en la solución extra-vasija, en cuyo caso la recogida de las micropartículas en la superficie interna de la vasija se controla por medio del imán.
Las micropartículas pueden contener ligandos de afinidad, enzimas, anticuerpos, bacterias, células u orgánulos celulares. La fijación de los componentes deseados puede lograrse también por selección de las propiedades de superficie de las micropartículas a utilizar y la composición de los tampones de una manera apropiada preferible a fin de fijar los componentes deseados de las muestras. Ejemplos incluyen intercambio iónico, cromatografía hidrófoba y cromatografía en fase inversa. Entonces, por ejemplo, la fijación y el desprendimiento de las proteínas de la superficie de las micropartículas se realizan por medio de tampones y soluciones seleccionados adecuadamente., por ejemplo, el contenido de sal y el valor de pH son entonces factores muy importantes.
Un ligando de afinidad puede ser, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos mono- o bicatenarios, tales como, por ejemplo, DNA (ácido desoxirribonucleico), RNA, mRNA o cDNA (DNA complementario) o PNA (ácido nucleico peptídico), una proteína, un péptido, un polisacárido, un oligosacárido, un compuesto de molécula pequeña o una lectina. Un ligando de afinidad puede ser también uno de los siguientes: Ovomucoide, Proteína A, Ácido Aminofenil Borónico, Rojo Procion, Fosforil Etanolamina, Proteína G, Fenil Alanina, Proteamina, Pepstatina, Sulfato de Dextrano, EDTA (Ácido Etilenodiaminatetraacético), PEG (Polietilen-Glicol), N-acetilglucosamina, Gelatina, Glutatión, Heparina, Ácido Iminodiacético, NTA (Ácido NItrilotriacético), Lectina de Lenteja, Lisina, NAD (Nicotinamida Adenina Dinucleótido), Amino- benzamidina, Acriflavina, AMP, Aprotinina, Avidina, Estreptavidina, Seroalbúmina Bovina (BSA), Biotina, Concanavalina A (ConA) y Azul Cibacron.
Inmovilización de una enzima o un ligando de afinidad significa que una enzima o un ligando de afinidad está unido a la superficie de las partículas o que el mismo está capturado en el interior de una partícula “tipo jaula”, sin embargo, de tal manera que la solución que lo rodea está en contacto con el mismo.
La fijación de la enzima o el ligando de afinidad a las micropartículas puede hacerse por medio de un enlace covalente, por ejemplo, por medio de los grupos amino e hidroxilo en el soporte. Alternativamente, la fijación puede lograrse por medio de un par de bioafinidad, por ejemplo, un par biotina/estreptavidina. Conforme a una vía, la enzima a inmovilizar se produce con tecnología de DNA, por ejemplo, en bacterias Escherichia coli y se ha preparado una cola enzimática particular para la enzima. Esta cola de afinidad se fija a micropartículas, a las cuales se une un componente, que se fija fuertemente a la cola de afinidad en cuestión de una manera apropiada. La cola de afinidad puede ser un compuesto de molécula pequeña o una proteína. Con esta disposición, podrían utilizarse eficientemente las micropartículas mientras se purifica la enzima deseada y, al mismo tiempo, la enzima fijada a las micropartículas podría inmovilizarse fácilmente en la superficie de las micropartículas a utilizar en el método descrito en la invención.
La fijación de la enzima o el ligando de afinidad puede ser también inespecífica, no covalente, tal como por adsorción.
La definición “micropartícula” se refiere en esta memoria a partículas que tienen un tamaño recomendado de 0,10100 pm. Una micropartícula puede ser también una partícula notablemente mayor, por ejemplo, una partícula que tiene un diámetro de varios milímetros. En la invención, las micropartículas son magnéticas, tales como, por ejemplo, para-, superpara- o ferromagnéticas, o estar constituida por material imantable, o las micropartículas están unidas a una pieza magnética o imantable. Micropartículas a las cuales, por ejemplo, pueden estar unidos ligandos de afinidad o enzimas, se capturan en la vasija por medio de una unidad magnética empapada en la vasija, las
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micropartículas se lavan en la misma vasija, la abertura de la vasija puede cerrarse, la solución y las micropartículas pueden mezclarse por estiramiento de la membrana protectora constituida por material elastómero, la unidad magnética se transfiere posiblemente a otra vasija y las micropartículas se desprenden por la acción del imán de diversas maneras apropiadas como se describe en la invención. Alternativamente, las micropartículas no precisan desprenderse particularmente de la unidad magnética.
El imán por medio del cual se capturan las partículas, puede ser un imán permanente o un electroimán. La forma de los imanes puede variar dependiendo de la aplicación. El campo magnético puede ser diferente en los imanes: un imán imantado longitudinalmente, un imán imantado a lo largo del diámetro del imán o varios polos magnéticos en la misma pieza magnética. Los imanes individuales pueden estar unidos también unos a otros por medio de separadores ferromagnéticos o no ferromagnéticos apropiados.
La membrana protectora puede estar constituida por material inelástico, tal como, por ejemplo, polipropileno, poliestireno, policarbonato, polisulfona y polietileno. La membrana protectora puede estar constituida también por metal no ferromagnético o metal ferromagnético. La membrana protectora puede estar constituida también por material elastómero elástico, tal como, por ejemplo, caucho de silicona, fluoroelastómero, policloropreno, poliuretano o polietileno clorosulfonado. La membrana protectora puede estar tratada también con agentes particulares y alterar con ello las propiedades de la membrana protectora. La primera protectora puede recubrirse así, por ejemplo, con teflón (PTFE, politetrafluoroetileno). Es particularmente importante poder seleccionar el material protector y el tratamiento posible adicional de tal manera que el resultado permita una acción conforme a la invención incluso con productos químicos muy fuertes o corrosivos. La membrana protectora puede estar diseñada también de tal manera que la misma permita el blindaje de las unidades magnéticas separadas, por ejemplo, en dispositivos que contienen 8, 12 ó 96 canales. La forma de la membrana protectora puede ser la de un tubo, de una placa, o puede ser de diseño irregular. Existen particularmente muchas alternativas cuando se utiliza una membrana protectora elastómera, dado que entonces el imán en su interno y el tubo ferromagnético pueden conferir también una forma a la membrana protectora. Una alternativa a la membrana protectora es una membrana protectora plana o en forma de placa constituida por material elástico. Una membrana protectora de este tipo puede ser una membrana elástica individual en un marco particular. El marco tiene por objeto facilitar el uso de la membrana protectora y aportar propiedades adecuadas para el estiramiento de la membrana. Otra alternativa es una realización en forma de rollo, en cuyo caso la membrana protectora puede cambiarse enrollando simplemente membrana protectora nueva a partir de una bobina. Esta alternativa puede incluir también el uso de un marco, un soporte específico o un puntal en el caso de que la membrana protectora esté siendo estirada durante el uso real. El uso de una membrana protectora de este tipo, constituida por una sola placa, es una alternativa recomendada cuando se desea evitar consumo de material en los eventos de aislamiento y lavado. El uso de una membrana protectora que tiene la forma de una placa es también económicamente más ventajoso que el uso de membranas protectoras de gran tamaño que se han preparado y diseñado con herramientas de moldeo.
El uso de una membrana protectora laminar en un dispositivo automático es una alternativa muy simple y eficiente. Cuando se utiliza una membrana protectora laminar, puede realizarse un estiramiento inicial en la primera etapa por medio de un manguito ferromagnético. En esta etapa, el imán está todavía dentro del manguito ferromagnético y no existe campo magnético alguno dirigido a las micropartículas que se encuentran fuera de la membrana protectora. Al mismo tiempo que la membrana protectora se mantiene estirada adicionalmente, el imán puede retirarse del campo magnético de manera apropiada. Entonces el imán estira adicionalmente la membrana protectora y da lugar a una acumulación de micropartículas alrededor de la membrana protectora en un lugar en el que se encuentran el o los polos magnéticos. Desplazando el imán dentro o fuera del manguito, la solución contenida en el tubo se mezcla por medio del imán. La mezcladura puede realizarse también moviendo el manguito ferromagnético hacia arriba y hacia abajo.
El método arriba presentado es particularmente preferible cuando se tratan micropartículas en vasijas pequeñas, tal como, por ejemplo, en microplacas que tienen, por ejemplo, 96, 384 ó 1536 pocillos. Se prefiere la vía presentada de mezclar la solución y las micropartículas, dado que no precisa moverse el dispositivo completo. La mezcladura se logra moviendo únicamente el imán y/o el manguito ferromagnético. El enfoque presentado es particularmente preferible por la razón de que no son necesarios en el proceso vibradores convencionales y las vasijas pueden estar cerradas simultáneamente. Los vibradores convencionales no son capaces de mezclar eficientemente pequeñas cantidades de solución y particularmente no lo son de mantener las micropartículas en solución. Un gran problema de los dispositivos y métodos conocidos es la sedimentación rápida de las micropartículas en el fondo del pocillo.
En las microplacas conocidas arriba mencionadas, cuando se utilizan pequeños volúmenes de líquido, la evaporación del líquido durante las incubaciones y mezcladuras es un problema crítico. Por la utilización de la membrana protectora de la manera presentada, las micropartículas pueden tratarse también en volúmenes pequeños, debido que la membrana protectora cierra la abertura del pocillo al mismo tiempo, con lo cual disminuye la evaporación del líquido. Por esta razón no es necesaria conforme a la invención tapa separada alguna constituida por aluminio, caucho o cinta de goma para cubrir las microplacas durante las mezcladuras e incubaciones.
Particularmente cuando se utilizan membranas protectoras separadas en los dispositivos de transferencia, la membrana protectora puede estar diseñada de una manera específica en su punta. El diseño de la punta puede estar destinado a lograr la transferencia de una cantidad de micropartículas lo mayor posible de una manera fiable, por ejemplo, de una muestra biológica viscosa a otra vasija. Mientras se acumulan grandes cantidades de micropartículas en la punta de la membrana protectora oblonga, como sucede cuando se utiliza un imán permanente
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imantado longitudinalmente, se corre continuamente el riesgo de que las capas externas de micropartículas se desprendan y queden en la solución. Asimismo, la turgencia en la interfase de la solución y el aire es muy fuerte y produce un defecto similar que causa el desprendimiento de las micropartículas.
La membrana protectora puede estar diseñada de hecho de tal manera que las micropartículas se mantienen unidas lo más posible a la membrana protectora mientras se mueve el dispositivo de transferencia a pesar de las corrientes emergentes y a pesar de la penetración de la superficie líquida y el efecto de la tensión superficial en la superficie del líquido. Por esta razón pueden practicarse diversos huecos y protuberancias en la membrana protectora, con lo cual se logra una transferencia fiable de las micropartículas recogidas a otra solución. En este caso, la membrana protectora puede estar constituida por material elástico o inelástico.
La membrana protectora hecha de material elástico puede tener un diseño particular, que asegura la recogida y transferencia fiables de una gran cantidad de micropartículas de una vasija a otra. Para este propósito, los bordes de la membrana protectora pueden tener protuberancias y huecos particulares, donde se acumulan las micropartículas. En este caso es preferible un imán imantado transversalmente por medio del cual las micropartículas pueden recogerse en un área extensa. Por diseño de la membrana protectora se logran estructuras particulares que soportan masas de micropartículas. El diseño influye también en los efectos perturbadores de las corrientes líquidas y la tensión del líquido. Cuando se utiliza material elástico y lugares de espesor variable, las protuberancias y huecos de la membrana protectora se estiran de diversas maneras. Este fenómeno puede utilizarse a la vez eficientemente en el desprendimiento de las micropartículas y particularmente en la consecución de una mezcladura eficiente en la solución.
En el modo presentado, la membrana protectora actúa en sí misma como un elemento que da lugar a la mezcladura y es por tanto un dispositivo muy eficiente para la realización de la mezcladura. Muy preferiblemente, el diseño de la membrana protectora varía en diferentes lugares de la membrana protectora. Cuando se desea que las micropartículas se recojan de la solución, el imán se desplaza hacia abajo y la membrana se estira simultáneamente. Mientras se está estirando la membrana protectora, el diseño específico de su superficie produce la acumulación de micropartículas en las áreas protegidas y soportantes en la superficie de la membrana protectora. Cuando se desea que las micropartículas se desprendan de la membrana protectora, el imán se desplaza hacia arriba en el manguito ferromagnético. A fin de asegurar el desprendimiento de las micropartículas, el manguito ferromagnético puede moverse simultáneamente hacia abajo, con lo cual la membrana protectora se estira, y luego nuevamente hacia arriba y repetir estos movimientos de manera apropiada. En una realización, una unidad específica de mezcladura está constituida por una membrana protectora elástica y una barra móvil dentro de la membrana protectora. La misma no necesita ser un imán, sino que su función es estirar y aflojar la membrana protectora desde el interior a fin de lograr una mezcladura eficiente en la solución. Una unidad mezcladora de este tipo puede utilizarse simultáneamente para cerrar la abertura de la vasija.
Al mismo tiempo se consigue una mezcladura muy eficiente en el líquido de la vasija, dado que la forma apropiada de la superficie de la membrana protectora actúa como una bomba sumergida oscilante. Alternativamente, es posible mover el imán hacia abajo y estirar con ello la membrana protectora, cuando se desea conseguir una mezcladura eficiente basándose en el fenómeno descrito anteriormente. El movimiento del imán en lugar del tubo ferromagnético produce también al mismo tiempo el movimiento de las micropartículas hacia el imán y la superficie de la membrana protectora, lo cual mejora la mezcladura aún más. Estos métodos mencionados anteriormente para mezclar un líquido pueden combinarse también de manera apropiada. Este tipo de método para mezcladura funciona también cuando se utiliza un imán imantado longitudinalmente.
El tubo ferromagnético descrito en la invención puede ser también un tubo individual, una serie de varios tubos juntos o una configuración, en la que tubos individuales conforman una formación de tubos específica. El tubo ferromagnético puede ser una placa ferromagnética específica, que tiene uno o varios orificios, en los que pueden moverse uno o varios imanes. Una disposición de este tipo es particularmente preferida cuando se utilizan volúmenes pequeños, por ejemplo, formatos de placas de 8, 24, 48, 96 y 384 pocillos, tales como microplacas y análogas. Puede contemplarse también un enfoque que incluye una unidad magnética separada para recogida de micropartículas y un dispositivo o barra específico para mover la superficie líquida de una manera apropiada descrita. Este enfoque permite soluciones, en las que las barras magnéticas no se mueven en absoluto, sino que el movimiento del líquido y las micropartículas se aprecia por medio de un órgano diseñado particularmente para este fin. La vasija utilizada en dicho enfoque o el reactor está diseñada de una manera apropiada para satisfacer las necesidades descritas en esta memoria. Pueden existir varias unidades magnéticas separadas, todas las cuales incluyen su propia membrana protectora. Estas unidades magnéticas pueden agruparse en una formación apropiada, tal como, por ejemplo, como un abanico en línea, a lo largo del arco de un círculo o varios arcos de un círculo unos dentro de otros, con lo cual cada barra acumula una cantidad apropiada de partículas a su alrededor.
El dispositivo y el método conforme a la invención no se limitan, por ejemplo, a biología molecular o purificación de proteínas, sino que son aplicables generalmente en campos en los que pueden utilizarse ligandos fijados a micropartículas para sintetizar, fijar, aislar, purificar o enriquecer componentes biológicos deseados de diversas muestras: aplicaciones de diagnóstico, biomedicina, enriquecimiento de patógenos, síntesis de productos químicos, aislamiento de venenos, virus, bacterias, levaduras y células. También están dentro del alcance de la invención métodos analíticos, inmunoensayos y métodos de hibridación de DNA.
APLICACIÓN DEL MÉTODO DE LA INVENCIÓN
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El dispositivo y el método conforme a la invención son aplicables para utilización en un gran número de áreas de aplicación, por ejemplo, química de proteínas, biología molecular, microbiología, biología celular y proteómica. La invención tiene aplicaciones en la industria, diagnósticos, análisis e investigación.
Para la purificación de las proteínas son necesarios experimentos de purificación en volúmenes pequeños y, por otra parte, aumento de la capacidad incluso a volúmenes muy grandes. Por medio de la invención descrita pueden realizarse purificaciones de proteínas, cuando se presenta la necesidad, a partir de diversos volúmenes de muestra. Los químicos expertos en proteínas precisan poder purificar una proteína a partir de una muestra lo más pequeña posible que ha sido pretratada, tal como, por ejemplo, lisados celulares. Es también importante cambiar la capacidad de purificación de acuerdo con necesidades continuamente cambiantes. En la actualidad, ello es posible cambiando los tamaños de columna a utilizar. A medida que progresa la purificación, el enriquecimiento de la proteína es una de las operaciones esenciales. En la práctica esto significa disminuir el volumen de líquido sin pérdida o desnaturalización significativa alguna de las proteínas. En la actualidad los métodos utilizados más ampliamente incluyen diálisis o filtración. Ambos métodos requieren mucho tiempo. Por medio del dispositivo y el método descritos en esta invención puede aportarse al campo de las proteínas un método versátil, que es aplicable para volúmenes de muestra variables. El cambio de capacidad es fácil, sin adquirir o preparar nuevas columnas. Para un volumen de muestra mayor, se elige simplemente una mayor cantidad de micropartículas, y después que se ha fijado la proteína se recogen las micropartículas y la proteína de la solución por medio del dispositivo y el método descritos en la invención. Los pasos de lavado pueden realizarse en la misma vasija o cambiando la vasija. En el caso anterior, los tampones de lavado utilizados tienen que retirarse de la vasija y reemplazarse con un nuevo tampón de lavado. El cambio de tampón puede realizarse también por medio de diversos dispositivos de válvulas o aspiración. Después de los lavados, las proteínas fijadas a las micropartículas pueden desprenderse a un volumen pequeño y la solución de proteína puede enriquecerse eficientemente.
Cuando es necesario, la reducción de volumen puede realizarse en etapas hasta un volumen más pequeño.
Por medio del dispositivo y el método descritos en la invención, por ejemplo, pueden realizarse purificaciones por cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase inversa, cromatografía hidrófoba y cromatografía de afinidad. Asimismo, con el dispositivo descrito puede realizarse la filtración con gel, si bien la filtración con gel requiere ser realizada en una columna y recoger después de ello las micropartículas por medio de un dispositivo conforme a la invención y flujo de salida de las proteínas a un volumen pequeño. El método permite, por ejemplo, eliminar sal de las muestras sin aumentar notablemente el volumen comparado con las columnas clásicas de filtración con gel.
El uso de enzimas inmovilizadas para procesar diversas proteínas, azúcares, grasas y diversos de los denominados biopolímeros es un área de aplicación muy importante para la invención descrita. Una característica importante comparada con el uso de enzimas solubles es la posibilidad de reutilizar fácilmente las enzimas inmovilizadas. El lavado de la enzima inmovilizada por medio de la invención descrita para uso ulterior es muy fácil y eficiente.
Ejemplos de grupos esenciales de enzimas y enzimas individuales, utilizadas por ejemplo en la industria, incluye:
- CARbOhIDRASAS: Alfa-Amilasas, Beta-Amilasa, Celulasa, Dextranasa, Alfa-Glucosidasa, Alfa- Galactosidasa, Glucoamilasa, Hemicelulasa, Pentosanasa, Xilanasa, lnvertasa, Lactasa, Pectinasa, Pululanasa
- PROTEASAS: Proteasa Ácida, Proteasa Alcalina, Bromelaína, Ficina, Proteasas Neutras, Papaína, Pepsina, Peptidasas, Rennina, Quimosina, Subtilisina, Termolisina, Tripsina
- LIPASAS Y ESTERASAS: Trigliceridasas, Fosfolipasas, Esterasas, Acetilcolinesterasa, Fosfatasas, Fitasa, Amidasas, Aminoacilasa, Glutaminasa, Lisozima, Penicilin-Acilasa
- ISOMERASAS: Glucosa lsomerasa, epimerasas, racemasas
- OXIDORREDUCTASAS: Aminoácido-Oxidasa, Catalasa, Cloroperoxidasa, Glucosa-Oxidasa,
Hidroxiesteroide-Deshidrogenasa, Alcohol-deshidrogenasa, Aldehído-deshidrogenasa, Peroxidasas
- LIASAS: Acetolactato-Descarboxilasa, Beta-Descarboxilasa Aspártica, Fumarasa, Histidasa, DOPA- descarboxilasa
- TRANSFERASAS: Ciclodextrina-Glicosiltransferasa, Metiltransferasa, Transaminasa, Quinasas
- LIGASAS
- FOSFATASAS: Fosfatasa Alcalina
El uso de enzimas es muy común en muchas ramas de la industria, algunos ejemplos de las cuales se indican a continuación: la síntesis y modificación de lípidos, proteínas, péptidos, esteroides, azúcares, aminoácidos, medicinas, plásticos, perfumes, productos químicos y los denominados productos químicos quirales.
Diversas enzimas de síntesis y escisión asociadas a la glicobiología, tales como, por ejemplo, endo- y exoglicosidasas, están también dentro del alcance de la invención. Enzimas habituales de aplicaciones de biología molecular, tales como enzimas de restricción, nucleases, ribozimas, polimerasas, ligasas, transcriptasas inversas, quinasas y fosfatasas están también dentro del alcance del método descrito en la invención. Como ejemplos de enzimas modificadoras de DNA/RNA pueden mencionarse las siguientes: CIAP (Fosfatasa Alcalina Intestinal de Ternero), fosfatasa alcalina de Escherichia Coli, exonucleasas (por ejemplo, nucleasa P1, nucleasa S1), ribonucleasas, RNasas (v.g. RNasa Pancreática, RNasa H, RNasa T1, RNasa M, RNasa T2), DNA ligasas, RnA ligasas, DNA polimerasas, enzima Klenow, RNA polimerasas, DNA quinasas, RNA quinasas, transferasas
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terminales, transcriptasa inversa AMV y fosfodiesterasas. El uso de estas y otras enzimas modificadoras DNA/RNA es muy polimorfo tanto en investigación como en aplicaciones de biología molecular. Las proteasas son enzimas muy importantes en proteómica y química de proteínas, ejemplos de las cuales incluyen tripsina, quimotripsina, papaína, pepsina, colagenasa, dipeptidil-peptidasa IV y diversas endoproteinasas. Enzimas sintéticas, anticuerpos catalíticos y complejos multi-enzimáticos pueden utilizarse de las maneras descritas en la invención. El uso de la invención no está limitado tampoco por el uso de enzimas y otros componentes catalíticos en condiciones anhidras, por ejemplo, en disolventes orgánicos.
Como ejemplos concretos en el campo de la biología molecular pueden mencionarse los siguientes:
CLONACIÓN DE LAS INSERCIONES DE DNA:
Para clonación de las inserciones de DNA son necesarias enzimas de restricción, (e.g. EcoR 1, Hind III, Bam HI, Pst I, Sal I, Bgl II, Kpn I, Xba I, Sac I, Xho I, Hae III, Pvu II, Not I, Sst I, Bgl I), que crean extremos romos (e.g. polimerasas termoestables, DNA-Polimerasa I del Fragmento Klenow, nucleasa de Haba Mung), ligaciones (e.g. DNA-Ligasa T4, DNA-Ligasa de E. coli, RNA-Ligasa T4), fosforilación (e.g. Polinucleótido-Quinasa T4), desfosforilación (e.g. CIAP, Fosfatasa Alcalina de E. coli, Polinucleótido-Quinasa T4) y deleciones (e.g. DNA-Polimerasa T4, polimerasas termoestables, Exonucleasa III, Nucleasa de Haba Mung).
SÍNTESIS Y CLONACIÓN DEL cDNA:
Transcriptasa inversa, RNasa H, DNA-polimerasa I, DNA-polimerasa I T4, DNA-Ligasa de E. Coli.
MARCACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS:
Marcación 5’ (e.g. Polinucleótido-quinasa T4), adición 3’ (e.g. RNA-ligasa T4), rellenado 3’ (e.g. DNA-polimerasa I de fragmento Klenow, DNA-polimerasa T4), intercambio 3’ (e.g. polimerasa T4, polimerasas termoestables), traslación de muesca (e.g. DNA-polimerasa I de E. coli, polimerasas termoestables), síntesis de reemplazamiento (e.g. DNA-polimerasa T4, polimerasas termoestables, Exo-Nucleasa III), cebado aleatorio (e.g. DNA-polimerasa I de Fragmento Klenow, polimerasas termoestables) y sondas de RNA (e.g. polimerasa T7, RNA-polimerasa SP6).
SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS:
Secuenciación de DNA (v.g. DNA-polimerasa I de E. Coli, DNA-polimerasa I de fragmento Klenow, polimerasas termoestables) y secuenciación de RNA (esim. transcriptasa inversa, transcriptasas inversas termoestables).
MUTAGENIZACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS:
Dirigida por oligonucleótidos (v.g. DNA-polimerasa T4, DNA-polimerasa T7, polimerasas termoestables) e incorporación errónea (v.g. Exonucleasa III, DNA-polimerasa I de fragmento Klenow, polimerasas termoestables).
MAPEADO:
Restricción (v.g. Exonucleasa III), Huella (v.g. Exonucleasa III) y Transcripción (v.g. Transcriptasa Inversa, Nucleasa de Haba Mung).
PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS:
Aislamiento y purificación de DNA genómico, fragmentos PCR, sondas DNA/RNA y DNA plasmídico.
TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO DE DNA:
Mapeado de DNA, secuenciación de DNA, análisis de SNP (Polimorfismo de Nucleótidos Simples), análisis de cromosomas, bibliotecas de DNA, PCR (Reacción en Cadena de Polimerasa), PCR Inversa, LCR (Reacción en Cadena de Ligasa), NASBA (Amplificación Basada en Cadenas de Ácido Nucleico), replicasa beta Q, Ensayo de Blindaje de Ribonucleasas.
DIAGNÓSTICOS DE DNA:
RFLP (Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Restricción), AFLP (Polimorfismo de Fragmentos Amplificados), diagnósticos de infecciones bacterianas, resistencia bacteriana a los antibióticos, huellas dactilares de DNA, SAGE (Análisis Seriado de Expresión Génica) y secuenciación de DNA.
El método descrito para cultivo y aislamiento de células puede utilizarse de manera general. Células de interés incluyen, por ejemplo, células madre, linfocitos B, linfocitos T, células endoteliales, granulocitos, células de Langerhans, leucocitos, monocitos, macrófagos, células mieloides, células asesinas naturales, reticulocitos, trofoblastos, células de cáncer, células transfectadas y células de hibridoma. Métodos conocidos comúnmente, tales como, por ejemplo, un método de aislamiento directo o indirecto, pueden utilizarse en el aislamiento de células. En el primero de ellos, el método de aislamiento directo, las células deseadas se separan por fijación de las mismas a
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la superficie de micropartículas utilizando, por ejemplo, anticuerpos específicos. En el método indirecto, se fijan a las micropartículas no las células deseadas, sino todas las demás células. Las células deseadas permanecen en este caso en la solución.
El método descrito en la invención se aplica satisfactoriamente al cultivo, aislamiento, purificación y/o enriquecimiento de bacterias, virus, levaduras y muchos otros organismos uni- o multicelulares. Un área de aplicación particularmente importante es el enriquecimiento de bacterias patógenas, tales como, por ejemplo, Salmonella, Listeria, Campylobacter, E. Coli 0157 y Clostridium, virus, parásitos, protozoos u otros pequeños organismos a partir de un gran volumen de líquido. El dispositivo y el método descritos en la invención pueden explotarse también en estas áreas de aplicación.
La biocatálisis se refiere comúnmente al uso de bacterias, enzimas u otros componentes que contienen enzimas en el proceso. Las enzimas o bacterias pueden inmovilizarse en un soporte sólido adecuado y el agente de que se trata se pone en conexión con los componentes inmovilizados utilizando, por ejemplo, columnas clásicas. Conforme a esta invención, las células o enzimas pueden fijarse a micropartículas de una manera apropiada, y las micropartículas pueden utilizarse luego conforme a la invención para realizar diversas reacciones enzimáticas.
Están también dentro del alcance de la invención métodos analíticos, inmunoensayos y métodos de hibridación de DNA como ejemplos para ensayos de investigación y rutina.
Está también dentro del alcance del área de aplicación de la invención el aislamiento de orgánulos celulares, así como diversas fracciones de células. Los orgánulos celulares pueden purificarse de una manera normal utilizando, por ejemplo, anticuerpos específicos y diversos ligandos de afinidad.
Existen diferentes necesidades de purificar ácidos nucleicos, partiendo de la purificación de cantidades minúsculas de DNA (Ácido Desoxirribonucleico), RNA (Ácido Ribonucleico) o mRNA (RNA Mensajero) hasta volúmenes grandes de varios litros. El método conforme a la invención puede utilizarse para aislar eficientemente ácidos nucleicos a partir tanto de volúmenes grandes de muestra cómo de volúmenes pequeños.
Por medio del método puede formarse una cadena entre eventos de cultivo/crecimiento, aislamiento y purificación de acuerdo con diversas necesidades. Las células deseadas pueden, por ejemplo, aislarse primeramente de la muestra y purificarse. Después de ello, por ejemplo, pueden aislarse de las células los orgánulos celulares. Los orgánulos celulares se purifican y el proceso puede continuar, por ejemplo, con la purificación de DNA o proteínas. Micropartículas equipadas con diversos revestimientos y características pueden utilizarse en ciertas etapas durante el proceso. La última etapa puede ser, por ejemplo, el enriquecimiento del producto purificado hasta el volumen deseado, amplificación y detección del producto.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
- Fig.
- 1
- Fig.
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- Fig.
- 3
- Fig.
- 4
- Fig.
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- Fig.
- 6
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- 7
- Fig.
- 8
- Fig.
- 9
- Fig.
- 10-26
- Fig.
- 31-40
- Fig.
- 41-46
- Fig.
- 47-59
- Fig.
- 60-71
- Fig.
- 72-82
- Fig.
- 83-94
- Fig.
- 95 y 96
presenta una vista parcialmente en corte de un ejemplo de la unidad magnética equipada con otra clase de membrana protectora.
corresponde a la Fig. 1 y presenta la acción de la unidad magnética en otra etapa.
corresponde a la Fig. 1 y presenta la acción de la unidad magnética en la tercera etapa.
corresponde a la Fig. 1 y presenta la acción de la unidad magnética en la cuarta etapa.
presenta una vista parcialmente en sección de otro ejemplo más de la unidad magnética equipada con otra clase de membrana protectora.
presenta esquemáticamente una vista en sección de varias unidades magnéticas paralelas, que tienen una membrana protectora mutua laminar.
corresponde a la Fig. 6 y presenta unidades magnéticas paralelas conforme a un segundo ejemplo.
corresponde a la Fig. 6 y presenta unidades magnéticas paralelas conforme a un tercer ejemplo. corresponde a la Fig. 6 y presenta unidades magnéticas paralelas conforme a un cuarto ejemplo. presentan la acción de vasijas que contienen filtros, la unidad de mezcladura y la unidad magnética durante el tratamiento de micropartículas.
presentan la acción de una capa de micropartículas, vasijas que contienen filtros y la unidad magnética durante el tratamiento de micropartículas.
presentan el cierre de vasijas que contienen filtros y la acción de la unidad magnética durante el tratamiento de micropartículas.
presentan el uso de un imán externo y un manguito ferromagnético como tales, junto con la unidad
de mezcladura y la unidad magnética durante el tratamiento de micropartículas.
presentan el uso de un imán y manguito ferromagnético externos junto con la vasija, la unidad de
mezcladura y la unidad magnética durante el tratamiento de micropartículas.
presentan el uso de un imán y manguito ferromagnético externos junto con la vasija, la unidad de
mezcladura y la unidad magnética durante el tratamiento de micropartículas.
presentan diversas unidades de mezcladura.
presentan el uso de un imán externo, manguito ferromagnético y un resorte bajo el imán durante el tratamiento de micropartículas.
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Fig. 97-104 presentan el uso de un imán imantado transversalmente y una capa de micropartículas en el caso en que las micropartículas no se desprenden durante el proceso de la parte superior de la membrana protectora.
Fig. 105-112 presentan el uso de un imán, imantado a lo largo de su eje longitudinal, y una capa de micropartículas en el caso en que las micropartículas no se desprenden durante el proceso de la parte superior de la membrana protectora.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LOS DIBUJOS
Fig. 1 presenta una unidad magnética 10, que incluye un imán 13 imantado transversalmente, un manguito ferromagnético 12 y una membrana protectora 21, que contiene nervios 29 en su superficie externa. Entre los bordes 29 existen huecos, en los cuales se acumulan las micropartículas 22 y por medio de los cuales se asegura una recogida fiable de una gran cantidad de micropartículas en superficies anchas y su transferencia de una vasija a otra.
Fig. 2 presenta la unidad magnética 10 de la Fig. 17 en una posición, en la que el imán 13 está empujado completamente fuera del manguito ferromagnético 12. A continuación, el imán 13 imantado transversalmente recoge las micropartículas 22 en su membrana protectora 21 en toda su longitud. Cuando se empuja fuera el imán 13, la membrana protectora 21 se estira con ello de tal manera que se formarán grandes huecos o bolsas entre los nervios 29. Las micropartículas 22 se mantendrán en estas bolsas de tal manera, que es fácil mantenerlas todavía en su lugar mientras se eleva la unidad magnética 10. Las corrientes líquidas causadas por el movimiento de la unidad magnética 10 y el efecto perturbador de la tensión superficial causada por la penetración de la superficie no desprenden las micropartículas 22 de las bolsas.
Fig. 3 presenta una situación, en la cual el imán 13 está empujado completamente fuera del manguito magnético 12 y simultáneamente el manguito ferromagnético 12 está empujado también completamente fuera. Entonces el manguito ferromagnético 12 empujado encima del imán 13 neutraliza la fuerza magnética del imán 13 y las micropartículas 22 se desprenden de la membrana protectora y se transfieren al líquido.
Fig. 4 presenta de nuevo una situación, en la cual únicamente el manguito ferromagnético 12 está empujado totalmente fuera. En este caso, el imán 13 no tienen fuerza magnética alguna, y por tanto las micropartículas 22 no se acumulan en la superficie de la membrana protectora 21. Esta etapa presentada en la Fig. 26 puede utilizarse paso a paso con la etapa representada en la Fig. 23, con lo cual se logra un efecto eficiente de bomba de mezcladura en el líquido. Asimismo, las etapas representadas en la Fig. 18 y 19 pueden utilizarse naturalmente de manera sucesiva, es decir, mientras el imán 13 está completamente empujado fuera, se mueve sólo el manguito ferromagnético 12 hacia atrás y adelante. De esta manera se consigue también en el líquido un efecto de bomba de mezcladura.
Fig. 5 presenta otra unidad magnética 10, que incluye un imán imantado longitudinalmente 13, un manguito ferromagnético 12 y una membrana protectora 21, que tiene una bolsa 42 en su extremo para las micropartículas 22. Por medio de tal estructura puede recogerse una gran cantidad de partículas 22, partículas que no se desprenden fácilmente de la superficie de la membrana protectora 21 durante la transferencia.
Fig. 6 presenta una sección vertical de una microplaca 82, que tiene varios pocillos 83. Encima de la microplaca 82 existen varias unidades magnéticas paralelas 10, que tienen una membrana protectora 21 laminar común. La membrana protectora 21 está constituida por un material elástico, por lo que la misma membrana puede utilizarse juntamente para las unidades magnéticas 10 adyacentes. La membrana se toma muy preferiblemente de una bobina, por lo cual la misma es también fácilmente cambiable.
Fig. 7 presenta dos unidades magnéticas paralelas 10a y 10b, que tienen una membrana protectora 21 común. En el ejemplo ilustrativo de la Fig. 7, la acción de las unidades magnéticas 10a y 10b tiene lugar en etapas diferentes. Los manguitos ferrometálicos 12a y 12b de ambas unidades magnéticas 10a y 10b están presionados contra la membrana protectora 21 de tal manera que la membrana protectora 21 está presionada contra los bordes 84 de los pocillos 83 de la microplaca 82, cerrando y sellando con ello los pocillos 83 con la membrana 21. El imán de la unidad magnética 10b esta empujado adicionalmente en dirección descendente hacia el pocillo 83 de la microplaca 82, de tal manera que la membrana protectora 21 y la parte superior del imán 13b dentro de ella se encuentran en el líquido 23. Entonces las micropartículas 22 en el líquido 23 se acumulan en el extremo del imán 13b imantado transversalmente encima de la membrana protectora 21.
Fig. 8 presenta un ejemplo, en el cual las unidades magnéticas 10a y 10b no contienen manguitos ferrometálicos separados. Los mismos están reemplazados por una placa ferrometálica 12, que está diseñada de tal manera, que existen salientes que se proyectan directamente hacia abajo por los pocillos de la microplaca. Los imanes 13a y 13b están situados en las aberturas directamente por los salientes de la placa ferrometálica 12. En la Fig. 8, la acción de los imanes 13a y 13b de las unidades magnéticas 10a y 10b tiene lugar en etapas diferentes del mismo modo que en la Fig. 7.
Fig. 9 presenta un ejemplo, en el cual las unidades magnéticas 10a y 10b tienen también una placa ferrometálica 12 común que reemplaza los manguitos, placa que en este caso es una placa recta. Los imanes 13a y 13b están situados en las aberturas de la placa ferrometálica 12. En esta figura, los imanes 13a y 13b de las unidades
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magnéticas 10a y 10b se encuentran también en etapas diferentes. A diferencia de la solución en la Fig. 7, la membrana protectora 21 está presionada contra los bordes 84 de los pocillos 83 de la microplaca 82 por medio de imanes 13a y 13b y no por medio de manguitos ferrometálicos. El imán 13a de la unidad magnética 10a se encuentra en la posición de sellado, mientras que el imán 13b de la otra unidad magnética 10b se encuentra en la posición de recogida de las micropartículas.
Fig. 10-26 presentan paso a paso una solución conforme a un ejemplo, en la cual las micropartículas 22 en la vasija 26 están atraídas por medio de la unidad magnética 10, que contiene una membrana protectora 21 constituida por material elastómero, tal como, por ejemplo, caucho de silicona. Fig. 10 presenta una vasija 26, que contiene micropartículas apropiadas 22 en una solución 23, pudiendo haberse incubado adecuadamente dicha solución 23 y dichas micropartículas 22 a fin de fijar los componentes biológicos deseados de la muestra en la solución 23.
Fig. 11 presenta una unidad magnética 10, dentro de la cual se encuentra un imán 13 imantado transversalmente y cuyo imán 13 puede moverse dentro del manguito ferromagnético 12. Dicha unidad magnética 10 está incorporada en una vasija 26 y las micropartículas 22 se acumulan en la superficie de la membrana protectora 21 en el lugar exacto en que el imán 13 está fuera del manguito ferromagnético 12. La membrana protectora 21 puede tener también nervios 29, entre los cuales pueden sedimentarse muy satisfactoriamente las micropartículas 22. La membrana protectora 21 está estirada por medio del imán 13, con lo cual la distancia entre los nervios 29 de la membrana protectora aumenta también y está disponible más área para la recogida.
Fig. 12 presenta una situación, en la cual las micropartículas 22 recogidas en la unidad magnética 10 pueden transferirse lejos de la solución 23 por retirada de la unidad magnética 10 de la vasija 26.
En la Fig. 13, la unidad magnética 10 está introducida en una vasija 76 que incluye un filtro, conteniendo la vasija un líquido 23 apropiado, tal como, por ejemplo, tampones de lavado apropiados. El filtro 77 puede estar constituido por diversos materiales y puede tener diversos espesores, cuyo grado de porosidad puede variar notablemente dependiendo de las diferentes necesidades. En lugar del filtro 77 puede existir una membrana o una solución específica que incluye válvulas. En la vasija 76 que incluye un filtro, el imán 13 de la unidad magnética 10 está desplazado hacia arriba dentro del manguito ferromagnético 12, por lo que no existe campo magnético alguno alrededor de la membrana protectora 21 y las micropartículas 22 pueden desprenderse de la superficie de la membrana protectora 21 en la solución 23.
En la Fig. 14, el manguito ferromagnético 12 se utiliza para estirar y aflojar la membrana protectora 21 adecuadamente de manera sucesiva y con ello se producen corrientes en la solución 23. Por medio del método descrito en la invención es posible mezclar eficientemente la solución y desprender a la vez las micropartículas 22 de la superficie de la membrana protectora 21.
En la Fig. 15, las micropartículas 22 se recogen de la vasija 76 que incluye un retirando el imán 13 de la unidad magnética 10 fuera del manguito ferromagnético 12 y estirando la membrana protectora elastómera 21 de manera apropiada. En la Fig. 16, la unidad magnética 10 se ha levantado desde la vasija 76 que incluye un filtro. El estiramiento hacia atrás y adelante de la membrana protectora 21 producido por medio del manguito ferromagnético 12 y la recogida de las micropartículas 22 por medio del imán 13 pueden realizarse también apropiadamente de manera sucesiva, en caso de que se desee alcanzar propiedades de mezcladura muy eficientes. En la Fig. 17, se presenta la retirada de la solución de la vasija 76 a través del filtro 77 en su fondo por el canal 85 unido al fondo de la vasija 76 por medio de una unidad aspiración/vacío, unidad que no se presenta en la figura.
En la Fig. 18, se añade solución nueva adecuada 23 a la vasija 76 que contiene el filtro 77. Sí existe un espacio apropiado en la vasija 76, la unidad magnética 10 no precisa ser retirada de la vasija 76 mientras se añade la solución 23 siguiente. La unidad magnética 10 puede estar dispuesta adecuadamente para ello, por ejemplo, por una pared de la vasija 76 que incluye un filtro durante la adición de la solución 23. En el paso siguiente se añade una solución 23 nueva a la vasija que incluye un filtro.
En la Fig. 19, la unidad magnética 10 se introduce de nuevo en la vasija 76 que un filtro, a cuya vasija se añade una solución 23 nueva. Estos cambios de tampón y recogida de las micropartículas pueden realizarse con la vasija que incluye un filtro consecutivamente tantas veces como se desee. Por medio de un método realizado de este modo, la cantidad de materiales desechables a utilizar puede reducirse notablemente, dado que se pueden realizar lavados e incubaciones múltiples en la misma vasija. Fig. 19 presenta el desprendimiento de micropartículas 22 de la unidad magnética 10 a la solución 23, como se describe en la Fig. 13.
En la Fig. 20, las micropartículas 22 se mezclan por medio de la unidad magnética 10 en la solución 23 como se ha descrito anteriormente en la Fig. 14. En la Fig. 21, el imán 13 de la unidad magnética 10 está transferido fuera del manguito ferromagnético 12, y las micropartículas 22 se recogen de la solución 23 encima de la membrana protectora 21, como se describe en la Fig. 14. En la Fig. 22, la unidad magnética 10 y las micropartículas 22 recogidas encima de la membrana protectora 21 se transfieren lejos de la vasija 76 que incluye un filtro. En la Fig. 23, la unidad magnética 10 se ha transferido a una vasija nueva 26. En la Fig. 24, las micropartículas 22 se desprenden de la solución 23 de la manera presentada en la Fig. 14.
Fig. 25 presenta una situación, en la cual la unidad magnética 10 se retira de la vasija 26 y las micropartículas 22 desprendidas de la parte superior de la membrana protectora 21 se encuentran en la solución 23. El proceso puede
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continuarse desde esta vasija en caso necesario. Por último, las micropartículas 22 pueden retirarse totalmente de la vasija y los componentes fijados en la superficie de las micropartículas 22 al comienzo del proceso desde la vasija se 26 presentada en la Fig. 10 pueden desprenderse en la solución.
Fig. 26 presenta otro modo de proceder distinto de la situación descrita en la Fig. 19. En la Fig. 26, las micropartículas 22 se mezclan en la solución 23 por medio de la unidad magnética 10 en la vasija 76 que incluye un filtro como se ha descrito previamente en la Fig. 14. En la Fig. 27, la unidad magnética 10 se retira de la vasija 76 que incluye un filtro y las micropartículas 22 quedan en la solución 23. Fig. 28 presenta la aspiración de la solución 23 desde la vasija 76 que contiene el filtro 77, por ejemplo, por el canal 85 unido al fondo de la vasija por medio de un dispositivo de aspiración o vacío. Las micropartículas 22 no acompañan a la solución, sino que quedan en el filtro 77. Fig. 29 presenta la adición de la solución siguiente a la vasija 76 que incluye un filtro.
Fig. 30 presenta adicionalmente la retirada de la solución añadida en la figura anterior de la manera descrita en la Fig. 28. Finalmente, los componentes fijados a las micropartículas 22 pueden desprenderse y recogerse en una vasija separada localizada en la vasija 76 que contiene el filtro. Todas las separaciones hechas por medio de la vasija 76 que incluye un filtro pueden realizarse utilizando vacío o una centrífuga. Las adiciones de la solución 23 hechas a la vasija 76 que incluye un filtro pueden realizarse por medio de dispositivos ordinarios para manipulación de líquidos, tales como pipetas o dispensadores manuales. También pueden aplicarse en el método dispositivos automáticos para manipulación de líquidos.
Fig. 31 -40 presentan paso a paso un método conforme a un ejemplo, en el cual las micropartículas 22 se encuentran en la vasija 76 que contiene el filtro 77, en cuya vasija la retirada de soluciones y la adición de la solución siguiente pueden repetirse muchas veces. En la Fig. 31, las micropartículas 22 se encuentran en la solución 23 en la vasija 76 que incluye un filtro. En la Fig. 32, la solución 23 es aspirada de la vasija 76 que incluye un filtro y las micropartículas 22 permanecen en la parte superior del filtro 77 para formar una capa de micropartículas 78.
La solución siguiente que puede ser, por ejemplo, una muestra, se introduce en la vasija 76 que incluye un filtro en la Fig. 33. La solución puede ser aspirada ulteriormente de la vasija 76, con lo cual los componentes deseados se fijan a la superficie de las micropartículas 22 en la capa de micropartículas 78. Estos pasos pueden repetirse muchas veces y finalmente se añade una cantidad apropiada de solución 23, solución que no es aspirada de la vasija 76 que incluye un filtro.
En la Fig. 34 se introduce una herramienta magnética 10 en la vasija 76 que incluye un filtro. Por movimiento del manguito ferromagnético 12 y el imán 13 de manera apropiada, se realiza el estiramiento y aflojamiento de la membrana protectora 21, y con ello una mezcladura eficiente en la solución 23. En la superficie de la membrana protectora 21 pueden existir nervios apropiados 29 a fin de aumentar la eficiencia de mezcladura y para la recogida ulterior de las micropartículas 22. Por la mezcladura de la solución 23, se consigue la homogeneización de la capa de micropartículas 78 sobre el filtro 77 a la solución 23. En la Fig. 34, se presenta la membrana protectora 21 en su forma estirada y en la Fig. 35 la membrana protectora 21 se presenta en su forma no estirada o contraída.
En la Fig. 36, el imán 13 de la unidad magnética 10 imantado transversalmente se ha retirado fuera del manguito ferromagnético 12 y el imán 13 estira la membrana protectora 21 de una manera apropiada. Las micropartículas 22 de la solución 23 se acumulan en la parte superior de la membrana protectora 21. En la Fig. 37, la unidad magnética 10 se retira de la vasija 76 que incluye un filtro junto con las micropartículas 22 recogidas encima de la membrana protectora 21. En la Fig. 38 la herramienta magnética 10 y las micropartículas 22 se transfieren a la nueva vasija 28, que contiene la nueva solución 23.
En la Fig. 39, las micropartículas 22 se desprenden de la superficie de la membrana protectora 21 moviendo el manguito ferromagnético 12 encima del imán 13. El desprendimiento de las micropartículas 22 puede mejorarse estirando adecuadamente la membrana protectora 21 por medio del manguito ferromagnético 12 o moviendo la herramienta magnética entera 10 de manera apropiada.
En la Fig. 40, la herramienta magnética 10 se retira de la vasija 26 y las micropartículas 22 se desprenden en la solución 23. Es posible proseguir a continuación de este paso y desprender, por ejemplo, los componentes fijados de la muestra original a las micropartículas 21 a la solución 23. Si las micropartículas causan perturbación en las aplicaciones extendidas, las micropartículas pueden retirarse de la solución en caso necesario. Puede haber diversos números de adiciones de la solución y/o la muestra descrita anteriormente a la vasija 76 que incluye un filtro. El número de tratamientos realizados en la vasija 26 puede variar también cuando es necesario. Puede haber diversas cantidades de micropartículas 22, en cuyo caso su capacidad de fijación puede aumentarse o disminuirse notablemente cuando es necesario. Una aplicación particularmente importante consiste en pasar un gran volumen de muestra a través de la capa de micropartículas 78, con lo cual la muestra deseada se fija a la superficie de las micropartículas 22. Pueden existir ligandos específicos, tales como, por ejemplo, anticuerpos, péptidos o nucleótidos fijados en la superficie de las micropartículas 22. Puede existir un componente biológico, tal como, por ejemplo, bacterias, virus, células, ácidos nucleicos, proteínas o péptidos en la muestra, componente que se desea recoger en la superficie de las micropartículas 22. Los componentes fijados en la superficie de las micropartículas 22 pueden desprenderse finalmente en un volumen pequeño. Esto es particularmente aplicable al caso en el que hay una cantidad muy pequeña del componente a recoger, tal como bacterias, en un gran volumen de muestra.
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Después del tratamiento y los posibles lavados, las micropartículas se recogen del filtro por medio de la unidad magnética. Puede haber preferiblemente un imán imantado transversalmente en la unidad magnética y una membrana protectora diseñada adecuadamente, que juntos hacen posible la recogida de incluso grandes masas de micropartículas del filtro. Por el estiramiento del material protector elastómero conforme a la invención, se logra una mezcladura de la solución, después de lo cual las micropartículas acumuladas en el filtro pueden desprenderse satisfactoriamente del mismo. Por medio de la unidad magnética, las micropartículas pueden transferirse ulteriormente a otras vasijas para sus posibles lavado, incubación, elución, amplificación y/o detección ulteriores.
Los ejemplos no se limitan al uso de una membrana protectora elastómera y un imán imantado transversalmente, sino al uso de una herramienta magnética en general junto con una vasija que incluye un filtro conforme al método. No es necesario que exista ninguna membrana protectora separada encima del imán.
Fig. 41-46 presentan paso a paso un enfoque conforme a una realización, en cuyo enfoque se presenta el uso de más de una unidad magnética y vasijas 76 que incluyen un filtro para tratamiento de micropartículas, tal como mezcladura, recogida, desprendimiento y transferencia, cierre y apertura de las vasijas, así como soluciones de manipulación, tales como retirada y adición de soluciones. Las unidades magnéticas y las vasijas que contienen filtros pueden estar dispuestas, por ejemplo, en una fila de 8 ó 12 unidades. Un método de aplicación muy conveniente pueden ser también placas de 24, 48, 96 y 384 pocillos, en cuyo caso el tratamiento de las muestras es notablemente más rápido.
Un enfoque de este tipo para tratamiento de micropartículas es particularmente aplicable a un dispositivo automático, que incluye el dispensador necesario para manipulación de líquidos, una estación de trabajo a vacío (v.g. formato de 96 y 384 pocillos) para vasijas que contienen filtros y una unidad de imanes multimagnética (por ejemplo, que contiene 8,12 ó 96 imanes).
Fig. 41 presenta el cierre de la vasija 76 que incluye un filtro por medio de unidades magnéticas 10a y 10b moviendo la unidad magnética 10 y las micropartículas 22 a la vasija 76 que incluye un filtro. En la Fig. 42, las micropartículas 22 se desprenden de la parte superior de la membrana protectora 21 a la solución 23 por movimiento del imán 13 en el interior del manguito ferromagnético 12. En la Fig. 43, la membrana protectora se estira por movimiento del manguito ferromagnético 12 y con ello se consigue una mezcladura eficiente en la solución. Una propiedad importante es que la unidad magnética 10 no se mueve en su totalidad, sino que únicamente se realiza el movimiento de estiramiento de la membrana protectora 21 en la solución por medio del manguito ferromagnético 12. La membrana protectora 21 sella la vasija simultáneamente con la mezcladura de la solución. En la Fig. 44, el imán 13 de la unidad magnética 10 se desplaza fuera del manguito ferromagnético 12 y estira la membrana protectora 21. Las micropartículas 22 se acumulan desde la solución 23 encima de la membrana protectora 21. En la Fig. 45, la unidad magnética 10 y las micropartículas 22 se retiran de la vasija 76 que incluye un filtro y la solución es aspirada también de la vasija. En la Fig. 46, se añade la solución siguiente a la vasija 76 que incluye un filtro y el proceso puede continuar conforme a la Fig. 41-45.
La membrana protectora de la unidad magnética 10 puede tener un diseño específico para aumentar la hermeticidad de la unión entre la membrana protectora 21 en la unidad magnética 10 y la vasija 76 que incluye un filtro. La forma más sencilla de hacer más hermética la unión consiste en prensar la unidad magnética 10 fuertemente contra la vasija 76 que incluye un filtro. Las propiedades de estiramiento del material elastómero en la membrana protectora
21 pueden utilizarse para cerrar la vasija herméticamente y abrirla con facilidad. Las soluciones 23 pueden cambiarse varias veces cuando es necesario por simple aspiración de la solución previa a través de un filtro antes de añadir una nueva solución a la vasija.
Fig. 47-59 presentan paso a paso un enfoque conforme a una realización, en cuyo enfoque Fig. 47 presenta una vasija 26 que contiene micropartículas 22. Las micropartículas 22 pueden estar revestidas con un ligando apropiado y puede haber una muestra apropiada en la solución 23, de cuya muestra se desea que un componente biológico dado se fije a la superficie de las micropartículas 22. En la Fig. 48, la vasija 26 se mueve junto al imán 13 fuera de la vasija 26, con lo cual las micropartículas 22 se acumulan para formar una capa de micropartículas 78 en la proximidad del imán 13 en la superficie interna de la vasija. Fig. 49 presenta una situación, en la cual la solución 23 es aspirada de la vasija 26, de tal manera que las micropartículas 20 quedan en la superficie de la vasija 26. En la Fig. 50 se añade la solución siguiente 23 a la vasija 26 y se retira el campo magnético moviendo el manguito ferromagnético 12 en la parte superior del imán 13. Cuando el campo magnético está ausente, las micropartículas
22 pueden llevarse a un estado homogeneizado en la solución 23 por mezcladura de la solución 23 de diferentes maneras.
En la Fig. 51, las micropartículas 22 se han homogeneizado desde la capa de micropartículas 78 a la solución 23, por ejemplo, por medio de la punta de una pipeta moviendo la solución 23 hacia atrás y adelante en la proximidad de la capa de micropartículas 78. En la Fig. 52, el manguito ferromagnético 12 se retira de alrededor del imán 13, con lo cual el campo magnético extrae las partículas magnéticas para formar un pélet. Después de ello la solución
23 es aspirada y se añade la solución siguiente. Estos pasos intermedios pueden repetirse en caso necesario dependiendo de la aplicación. Comparado con el método convencional, este método no requiere separar mucho físicamente uno de otro la vasija o el imán.
En la Fig. 53, la herramienta magnética 10 descrita en la invención se lleva a la solución 23 en la vasija 26 y la membrana protectora 21 se estira en dirección descendente por medio del manguito ferromagnético 12. En la Fig.
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54, el manguito ferromagnético 12 se mueve hacia arriba y el estiramiento de la membrana protectora 21 se reduce en la solución 23. Por estiramiento y aflojamiento repetidos de la membrana protectora elastómera 21 de tal manera que el imán 13 no esté fuera del manguito ferromagnético 12, se obtiene una mezcladura satisfactoria y las micropartículas 22 de la capa de micropartículas 78 se homogeneízan en la solución 23. El estiramiento de la membrana protectora 21 se realiza por medio del manguito ferromagnético 12. Al mismo tiempo que la solución 23 está siendo mezclada por estiramiento de la membrana protectora 21, la vasija 26 puede cerrarse herméticamente por medio de la unidad magnética 10 y la membrana protectora 21, y de este modo puede inhibirse la evaporación de las soluciones de la vasija 26. Esta realización es particularmente preferida en el caso de que se desee utilizar incubaciones largas y/o temperaturas elevadas, en donde la evaporación llega a ser un problema considerable.
En la Fig. 55, las micropartículas 22 se recogen por medio de la unidad magnética 10 sobre la membrana protectora 21 por movimiento del imán 13 fuera del manguito ferromagnético 12. En la Fig. 56, las micropartículas 22 se transfieren junto con la unidad magnética 10 desde la vasija 26. La solución 23 puede ser aspirada de la vasija 26 y la solución siguiente y las micropartículas 22 pueden llevarse de nuevo a la misma vasija 26. Otra vía consiste en transferir las micropartículas 22 a otra vasija, donde las micropartículas 22 pueden desprenderse también en caso necesario.
En la Fig. 57, se introduce en la vasija 26 una herramienta específica de mezcladura y la membrana protectora 21 se halla en su forma estirada. El principio básico de la herramienta de mezcladura 80 en relación con el efecto de mezcladura es el mismo que se ha presentado en la Fig. 53 y 54, es decir por estiramiento de la membrana protectora elastómera 21 hacia atrás y adelante, se provocan corrientes en la solución y se cierra simultáneamente la abertura de la vasija. En este caso no existe imán alguno en la herramienta de mezcladura 80, sino una barra específica 11 situada dentro de la membrana protectora 21, por movimiento de cuya barra la membrana protectora constituida por material elastómero puede estirarse y aflojarse en caso necesario.
Fig. 58 presenta la herramienta de mezcladura cuando la membrana protectora se halla en su forma aflojada y se obtiene una solución homogeneizada 23 de las micropartículas 22. En la Fig. 59, el manguito ferromagnético 12 se retira de alrededor del imán 13 fuera de la vasija 26, con lo cual las micropartículas forman una capa de micropartículas 78 en la superficie interna de la vasija. La herramienta de mezcladura 80 se retira de la vasija 26 o se encuentra dentro de la vasija 26 incluso cuando la solución 23 es aspirada de la vasija 26 y se añade la solución siguiente a la vasija 26.
Fig. 60-71 presentan paso a paso un enfoque conforme a una realización, en cuyo enfoque el tratamiento de una serie de vasijas que contienen filtros, tales como, v.g. una placa de formato 96, y micropartículas 22 junto con la unidad magnética 10 y la herramienta de mezcladura 80. En la Fig. 60, existe un imán 13 bajo la serie de vasijas que contienen filtros y entre las vasijas 76 separadas, alrededor de cuyo imán se encuentra el manguito ferromagnético 12 que puede moverse en relación con el imán 13. Las micropartículas 22 se encuentran en la solución 23 en las vasijas que contienen filtros.
En la Fig. 60, el manguito ferromagnético 12 se encuentra en la parte superior del imán 13 y el campo magnético está desconectado. En la Fig. 61, el manguito ferromagnético 12 está retirado de alrededor del imán 13, con lo cual el campo magnético del imán 13 acumula las micropartículas 22 para formar una capa de micropartículas 78 en la superficie interna de las vasijas 76. En la Fig. 62, la solución 23 puede ser aspirada a través del fondo 77 del filtro, por ejemplo, por medio de un dispositivo de vacío, y la capa de micropartículas 78 se mantiene unida a la superficie interna de la vasija 76 que incluye un filtro por medio del campo magnético del imán 13.
En la Fig. 63, puede añadirse la solución siguiente 23 a la vasija 76 que incluye un filtro y el manguito ferromagnético 12 se ha desplazado de nuevo a la parte superior del imán 13. En la Fig. 64, no existe ya un campo magnético proyectado hasta la capa de micropartículas 78, pero la capa de micropartículas 78 no puede homogeneizarse en la solución 23 sin mezcladura. En una realización de la invención, tanto el imán 13 como el manguito ferromagnético 12 pueden moverse por separado. Entonces, el lugar en el que se acumulan las micropartículas 22, y el área de este lugar pueden controlarse simplemente por medio del imán 13 y el manguito ferromagnético 12. Fig. 60-63 presentan una realización, en la cual el imán 13 no se mueve, sino que únicamente se mueve el manguito ferromagnético 12 en relación con el imán 13.
En la Fig. 65, se introduce una herramienta específica de mezcladura en la vasija 76 que incluye un filtro, herramienta que tiene una membrana protectora elástica 21 y una barra 11, que puede moverse hacia arriba y hacia abajo en el interior de la membrana protectora 21. Por movimiento de la barra 11 hacia abajo, la membrana protectora 21 se estira, y en la Fig. 65 la membrana protectora 21 se presenta en su forma estirada. En la Fig. 66, la barra 11 se mueve hacia arriba y la tensión de la membrana protectora 21 se restablece. Por medio de dicha mezcladura, se logran corrientes líquidas en la solución 23, y el método es particularmente adecuado para mezcladura de micropartículas 22 en volúmenes pequeños, tales como, v.g. en placas de 96 pocillos. La herramienta de mezcladura 80 propiamente dicha no se mueve durante este evento, sino que únicamente se mueve la barra 11 dentro de la membrana protectora 21. En este caso, la herramienta de mezcladura 80 y la membrana protectora 21 en ella pueden cerrar la vasija 76 que incluye un filtro durante la mezcladura. Mientras la herramienta de mezcladura 80 está realizando dicha operación de mezcladura, el imán externo a la vasija 76 que incluye un filtro está totalmente cubierto con el manguito ferromagnético 12.
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En la Fig. 67, el manguito ferromagnético 12 se ha desplazado de modo que ya no se encuentra alrededor del imán 13 fuera de la vasija 76 que incluye un filtro, y las micropartículas 22 pueden recogerse para formar una capa de micropartículas 78 en la superficie interna de la vasija 76 que incluye un filtro. La herramienta de mezcladura 80 se retira de la vasija 76 que incluye un filtro. Después de este paso, la solución 23 puede ser aspirada a través del filtro 77 y puede añadirse la solución siguiente a la vasija 76 que incluye un filtro. Si la abertura de la vasija 76 que incluye un filtro no precisa estar cerrada durante el paso de mezcladura, la membrana protectora de la herramienta de mezcladura 80 no precisa estar constituida por material elastómero, y es posible que no tenga que ser en absoluto una membrana protectora. En este caso, la mezcladura se realiza por medio de una varilla, una barra o una espiga constituida exclusivamente por plástico u otro material adecuado.
En la Fig. 68, la unidad magnética 10 está introducida en la vasija 76 que incluye un filtro, encima de cuya unidad existe una membrana protectora 21, que se estira para lograr la mezcladura de la manera presentada en la Fig. 65 y 66, en cuyo caso el imán 13 está en todo momento dentro del manguito ferromagnético 12. En la Fig. 68, la membrana protectora 21 se halla en su forma estirada. El manguito ferromagnético 12 actúa como el factor de estiramiento y aflojamiento de la membrana protectora 21. Asimismo, en este caso la unidad magnética 10 y la membrana protectora 21 pueden cerrar la abertura de la vasija 76 que incluye un filtro durante la mezcladura y otros eventos. En la Fig. 69, la membrana protectora se encuentra en su forma aflojada y las micropartículas 22 se homogeneízan en la solución 23.
En la Fig. 70, las micropartículas 22 se recogen en la parte superior de la membrana protectora 21 por movimiento del imán 13 fuera del manguito ferromagnético 12 y por estiramiento de la membrana protectora 21 por medio del imán 13. En la Fig. 71, la unidad magnética 10 y las micropartículas 22 recogidas en la parte superior de la membrana protectora 21 se retiran de la vasija 76 que incluye un filtro. La solución 23 puede ser aspirada a través del filtro 77 y la solución siguiente puede añadirse a la vasija 76 que incluye un filtro. Las micropartículas 22 pueden introducirse de nuevo por medio de la unidad magnética 10 en la vasija 76 que incluye un filtro y las mezcladuras y recogidas descritas anteriormente pueden realizarse en caso necesario. Las micropartículas 22 pueden llevarse también a otra vasija para tratamiento ulterior.
Fig. 72-82 presentan paso a paso un enfoque conforme a una realización, en cuyo enfoque se presenta el tratamiento de una serie de vasijas que contienen filtros, tales como, v.g. una placa de 8, 24, 48 ó 96 pocillos, y micropartículas 22 junto con la unidad magnética 10 y la herramienta de mezcladura 80. En la Fig. 72 existe un imán 13 bajo la serie de vasijas que contienen filtros y entre las vasijas 76 separadas, alrededor de cuyo imán se encuentra el manguito ferromagnético 12 que puede moverse en relación con el imán 13. Las micropartículas 22 se hallan en la solución 23 en las vasijas 26. En la Fig. 72 existe un manguito ferromagnético 12 encima del imán 13 y el campo magnético está desconectado.
En la Fig. 73, el manguito ferromagnético 12 se ha desplazado de alrededor del imán 13, con lo cual el campo magnético del imán 13 recoge las micropartículas 22 en la superficie interna de las vasijas 26 para formar una capa de micropartículas 78. En la Fig. 74, la solución 23 puede ser aspirada, por ejemplo, por medio de lavadores o pipetas y la capa de micropartículas 78 se mantiene unida a la superficie interna de las vasijas 26 por medio del campo magnético del imán 13. En la Fig. 75, la solución siguiente 23 puede añadirse a la vasija 26 y el manguito ferromagnético 12 se desplaza nuevamente a la parte superior del imán 13. En una realización de la invención, tanto el imán 13 como el manguito ferromagnético 12 pueden desplazarse por separado. Entonces, el lugar en el que se acumulan las micropartículas 22 y el área de este lugar pueden controlarse simplemente por medio del imán 13 y el manguito ferromagnético 12. Fig. 72-75 presentan una realización, en la cual el imán 13 no se mueve, sino que únicamente se mueve el manguito ferromagnético 12 en relación con el imán 13.
En la Fig. 76, se introduce en la vasija 26 una herramienta de mezcladura específica, herramienta que tiene una membrana protectora elastómera 21 y una barra 11, que puede moverse hacia arriba y hacia abajo dentro de la membrana protectora 21. Por movimiento de la barra 11 hacia abajo, la membrana protectora elastómera 21 se estira y en la Fig. 76 la membrana protectora 21 se presenta en su forma estirada. En la Fig. 77 la barra 11 se mueve hacia arriba y la tensión de la membrana protectora 21 se restablece. Por medio de dicha mezcladura, se provocan corrientes líquidas en la solución 23 y el método es particularmente adecuado para mezcladura de micropartículas 22 en volúmenes pequeños, tales como, v.g. en placas de 96 y 384 pocillos. La herramienta de mezcladura 80 propiamente dicha no se mueve durante este evento, sino que se mueve únicamente la barra 11 dentro de la membrana protectora 21. En este caso, la herramienta de mezcladura 80 y la membrana protectora 21 en ella pueden cerrar la vasija 76 que incluye un filtro durante la mezcladura. Mientras la herramienta de mezcladura 80 está mezclando, el imán situado fuera de la vasija 26 está cubierto completamente con el manguito ferromagnético 12.
En la Fig. 78, el manguito ferromagnético 12 se ha distanciado de alrededor del imán 13 fuera de la vasija 26 y las micropartículas 22 pueden recogerse para formar una capa de micropartículas 78 en la superficie interna de la vasija 26. La herramienta de mezcladura 80 está retirada de la vasija 26. Después de este paso, la solución 23 puede ser aspirada y la solución siguiente puede añadirse a la vasija 26. Si la abertura de la vasija 26 no precisa ser cerrada durante el paso de mezcladura, la membrana protectora de la herramienta de mezcladura 80 no precisa estar constituida por material elastómero, y es posible que no necesite tener una membrana protectora en absoluto. En este caso, la mezcladura se realiza por medio de una varilla, una barra o una espiga constituida exclusivamente por plástico u otro material adecuado. Las varillas, barras y espigas utilizadas para la mezcladura pueden ser desechables y pueden encontrarse, por ejemplo, en formato 96, si se está mezclando una placa de 96 pocillos.
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En la Fig. 79, una unidad magnética 10 está introducida en la vasija 26, encima de cuya unidad se encuentra una membrana protectora 21, que está estirada para producir mezcladura de la manera presentada en la Fig. 76 y 77, en cuyo caso el imán 13 de la unidad magnética 10 está en todo momento dentro del manguito ferromagnético 12 de la herramienta magnética 10. En la Fig. 79, la membrana protectora 21 se halla en su forma estirada. El manguito ferromagnético 12 de la unidad magnética 10 actúa como el factor de estiramiento y aflojamiento de la membrana protectora 21. Asimismo, en este caso la unidad magnética 10 y la membrana protectora 21 pueden cerrar la abertura de la vasija 26 durante la mezcladura y otros eventos.
En la Fig. 80, la membrana protectora 21 se halla en su forma aflojada y las micropartículas 22 están homogeneizadas en la solución 23. En la Fig. 81, las micropartículas 22 se recogen en la parte superior de la membrana protectora 21 por movimiento del imán 13 de la unidad magnética 10 fuera del manguito ferromagnético 12 y por estiramiento de la membrana protectora 21 por medio del imán 13. En la Fig. 82, la unidad magnética 10 y las micropartículas 22 recogidas encima de la membrana protectora 21 se retiran de la vasija 26. La solución 23 puede ser aspirada y la solución siguiente puede añadirse a la vasija 26. Las micropartículas 22 pueden introducirse de nuevo mediante la unidad magnética 10 en la vasija 26 y las mezcladuras y recogidas descritas anteriormente pueden realizarse en caso necesario. Las micropartículas 22 pueden introducirse también en otra vasija para tratamiento ulterior.
Fig. 83-94 presentan paso a paso un enfoque conforme a otro ejemplo más. Fig. 83 presenta una herramienta de mezcladura 80, que tiene una membrana protectora 21. La membrana protectora 21 tiene diferentes nervios 29 y la membrana protectora 21 se encuentra en su forma estirada en la solución 23. Dentro de la membrana protectora 21 existe una barra 11, barra que puede moverse hacia arriba y hacia abajo. La barra 11 puede estar hecha de materiales diferentes (por ejemplo, plástico o metal). Pueden provocarse corrientes en la solución 23 cuando se estira la membrana protectora 21 presionando la barra 11 hacia abajo y aflojando el estiramiento moviendo la barra 11 hacia arriba. Las corrientes pueden aumentarse adicionalmente cuando se utilizan nervios 29 diferentes en la superficie de la membrana protectora 21 y mediante selección adecuada de la vasija 26.
En la Fig. 84, la membrana protectora 21 se encuentra en su forma aflojada. En la Fig. 83 y 84, la abertura de la vasija 26 se cierra por medio de la herramienta de mezcladura 80 a fin de disminuir la evaporación y minimizar el riesgo de salpicaduras. El cierre de la vasija 26 puede realizarse durante la mezcladura, dado que únicamente está moviéndose la barra 11 dentro de la herramienta de mezcladura 80, estirando con ello la membrana protectora 21 constituida por material elastómero. Un enfoque de este tipo es particularmente eficiente en dispositivos automáticos y cuando se mezclan volúmenes pequeños.
Fig. 85 presenta un enfoque, en el cual la membrana protectora 21 es compacta para herramientas de mezcladura adyacente 80 y vasijas 26 que contienen la solución 23. La membrana protectora 21 se estira y se afloja por medio de la barra 11. En la Fig. 85, la membrana protectora 21 se encuentra en su forma aflojada y la membrana protectora 21 compacta para las vasijas 26 cierra la abertura de las vasijas 26. En la Fig. 86, la membrana protectora 21 se encuentra en su forma estirada y la barra 11 está presionada hacia abajo. Puede existir, por ejemplo, una sola membrana protectora compacta, por ejemplo, una placa constituida por caucho de silicona encima de la placa de microtitulación, tal como, por ejemplo, placas de 96, 384 ó 1536 pocillos. En este enfoque, el cierre de los pocillos puede disponerse también simultáneamente mientras las soluciones en los pocillos están siendo mezcladas. Por medio de un ejemplo de este tipo pueden mezclarse todos los pocillos o pueden mezclarse sólo los pocillos deseados mientras demás pocillos pueden dejarse sin mezclar. Una realización particularmente preferida son reacciones e incubaciones realizadas a temperatura elevada, en las cuales la evaporación es considerable. Por cierre hermético de las vasijas, la evaporación puede reducirse notablemente.
Fig. 87-94 presentan herramientas de mezcladura diferentes como pares, donde uno de los miembros del par se encuentra en su forma estirada y el otro en su forma aflojada. Las figuras presentan alternativas diferentes para el diseño de la membrana protectora 21. El diseño apropiado de la membrana protectora depende también de las medidas internas y los nervios de la vasija, así como de la cantidad de solución a utilizar en la vasija.
Fig. 95 y 96 presentan paso a paso un enfoque conforme a una realización, en el cual se presenta un método posible para el uso de un imán externo y un manguito ferromagnético, por ejemplo, con placas de 96 pocillos. En la Fig. 95 se muestra el imán 13 imantado transversalmente y el manguito ferromagnético 12. Adicionalmente, puede existir una suspensión de resorte 81 bajo el imán. Presionando hacia abajo la vasija 26, por ejemplo, una placa de 96 pocillos, la vasija 26 presiona simultáneamente el imán 13 dentro del manguito ferromagnético 12 y el resorte 81 situado bajo el imán 13 se aprieta. Cuando el imán 13 se encuentra en el interior del manguito ferromagnético 12, no existe campo magnético alguno fuera y las micropartículas 22 se mantienen en la solución homogénea y 23.
En la Fig. 96, la vasija 26 ya no está presionada, pero debido al resorte 81 el imán 13 está fuera del campo ferromagnético 12 y la fuerza magnética del imán 13 afecta a las vasijas 26 adyacentes. Las micropartículas 22 contenidas en las vasijas se acumulan en la proximidad del imán 13 para formar una capa de micropartículas 76 en la superficie interna de la vasija.
El prensado de la vasija 26 puede realizarse, por ejemplo, por medio de la unidad magnética 10, descrita en la invención, o la herramienta de mezcladura 80. Las mezcladuras descritas en la invención y el cierre de la vasija 26 pueden realizarse eficientemente por medio de un enfoque de resorte de este tipo. Presionando la vasija 26 hacia
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abajo, por ejemplo, por medio de la unidad magnética 10, las aberturas de la vasija se cierran y simultáneamente se presiona el imán externo 13 dentro del manguito ferromagnético 12. Cuando la vasija 26 se oprime por medio de la unidad magnética 10, las mezcladuras descritas en la invención y las homogeneizaciones, recogidas y transferencias pueden realizarse eficientemente. Al mismo tiempo, la vasija 26 se mantiene cerrada en condiciones de seguridad. Las vasijas 26 pueden tener también filtros en el fondo y las ventajas descritas en la invención para utilización de vasijas con fondo de filtro se presentan también claramente en este enfoque. El resorte 81 descrito no precisa ser en absoluto un resorte, sino que el movimiento del imán puede disponerse por medio de un motor específico, con lo cual la vasija no es necesaria en absoluto para el prensado del imán 13 dentro del manguito ferromagnético 12. La versión motorizada hace posible el movimiento tanto del imán como de la vasija durante su uso.
Fig. 97-112 presentan paso a paso un enfoque conforme a otro ejemplo más, en el cual el uso de las micropartículas 22 encima de la membrana protectora 21 de la unidad magnética 10 a lo largo todo el proceso, tal como, por ejemplo, cuando se realizan purificaciones de ácido nucleico o proteínas, inmunoensayos y ensayos de hibridación de DNA.
Las micropartículas 22 pueden estar revestidas con ligandos apropiados (por ejemplo, con anticuerpos, oligonucleótidos y péptidos) para fijar componentes biológicos deseados de la solución/muestra. Es esencial que las micropartículas 22 se recojan al comienzo del proceso en la superficie de la unidad magnética, como se describe en las figuras 97 y 105, y que las micropartículas no se desprendan en los diversos pasos de lavado o pasos de incubación del proceso, dependiendo de la aplicación. Por medio del método descrito puede establecerse una superficie activa de reacción particular recogiendo las micropartículas 22 por medio del imán 13 en la superficie de la membrana protectora 21. Las micropartículas no se pierden durante los pasos de lavado y los pasos de incubación, dado que las micropartículas 22 no se desprenden durante el proceso. Finalmente, puede realizarse una medida en la solución 23 o en la capa de micropartículas 78.
Fig. 97 presenta una vasija 76 que incluye un filtro, en cuya vasija existe una solución 23 que contiene micropartículas 22. En la Fig. 98, la unidad magnética 10 está introducida en la solución 23 dentro de la vasija 76 que incluye un filtro y las micropartículas 22 se recogen en la superficie de la membrana protectora 21 para formar una capa particular de micropartículas 78. La membrana protectora 21 puede estar constituida por material elastómero o no elastómero. El imán 13 presentado en la figura está imantado transversalmente, y el manguito ferromagnético 13 no se encuentra en la parte superior del imán 13. Utilizando el imán 13 imantado transversalmente, las micropartículas 22 pueden recogerse en un área muy extensa alrededor de la membrana protectora 21. Un enfoque de este tipo es particularmente preferido, cuando son necesarias un área muy grande para recogida y cinética de reacción, por ejemplo, en inmunoensayos sensibles. La capa de micropartículas 78 puede lavarse en la vasija 76 que incluye un filtro por aspiración y adición de soluciones apropiadas a la vasija que incluye un filtro. Las adiciones y aspiraciones de las soluciones en la vasija 76 que incluye un filtro pueden realizarse, por ejemplo, por medio de dispositivos y dispensadores de aspiración/vacío.
En la Fig. 99, la unidad magnética 10 se ha retirado de la vasija 76 que incluye un filtro a otra vasija 26 que contiene una solución 23 nueva. La capa de micropartículas 78 no está homogeneizada en la solución 23, pero la unidad magnética 10 puede moverse adecuadamente en la solución 23. En la vasija 26 pueden realizarse también incubaciones particulares dejando que la unidad magnética 10 y la membrana protectora 21 permanezcan en la solución 23. La unidad magnética 10 y la membrana protectora 21 pueden cerrar adecuadamente la abertura de la vasija 26 y prevenir la evaporación de la solución 23. En la Fig. 100, la unidad magnética 10 se retira de la vasija 26 y la capa de micropartículas 78 se halla encima de la membrana protectora 21.
Fig. 101 presenta la retirada de la solución 23 de la vasija 26, por ejemplo, por medio de un lavador o una pipeta.
En la Fig. 102 se describe la adición de una nueva solución a la misma vasija 26. En la Fig. 103, la unidad magnética 10 se transfiere a la vasija 23 que contiene ahora una nueva solución 23. La capa de micropartículas 78 no está homogeneizada en la solución 23, pero la capa de micropartículas 78 puede moverse y dejarse en reposo en la solución 23 durante un periodo de tiempo apropiado. En la Fig. 104, la unidad magnética 10 y la capa de micropartículas 78 encima de la membrana protectora 21 se retiran de la vasija 26. Las soluciones pueden cambiarse en el proceso descrito tantas veces como sea necesario, y finalmente puede realizarse una medida para determinación de la concentración del componente biológico aislado en la solución 23 que se encuentra la vasija 26. Alternativamente, la concentración del componente biológico puede determinarse en la capa de micropartículas 78.
Fig. 105 presenta una vasija 76 que incluye un filtro, en cuya vasija existe una solución 23 que contiene micropartículas 22. En la Fig. 106, la unidad magnética 10 se ha introducido en la solución 23 de la vasija 76 que incluye un filtro y las micropartículas 22 se recogen en la superficie de la membrana protectora 21 para formar una capa de micropartículas 78 particular. La membrana protectora 21 puede estar constituida por material elastómero o no elastómero. El imán 13 presentado en la figura está imantado a lo largo del eje longitudinal de la unidad magnética 10, y el manguito ferromagnético 13 no se encuentra en la parte superior del imán 13. Utilizando el imán 13 imantado a lo largo del eje longitudinal de la unidad magnética 10, las micropartículas 22 pueden recogerse con precisión alrededor de la punta de la membrana protectora 21. Un enfoque de este tipo es particularmente preferido cuando se manipulan volúmenes muy pequeños de soluciones. La capa de micropartículas 78 puede lavarse en la vasija 76 que incluye un filtro por aspiración y adición de soluciones apropiadas a la vasija 76 que incluye un filtro.
Las adiciones y aspiraciones de soluciones en la vasija 76 que incluye un filtro pueden realizarse, por ejemplo, por medio de dispositivos y dispensadores de aspiración/vacío.
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En la Fig. 107, la unidad magnética 10 se retira de la vasija 76 que incluye un filtro a otra vasija 26 que contiene una nueva solución 23. La capa de micropartículas 78 no está homogeneizada en la solución 23, pero la unidad magnética 10 puede moverse adecuadamente en la solución 23. En la vasija 26 pueden realizarse también incubaciones particulares dejando que la unidad magnética 10 y la membrana protectora 21 se mantengan en la solución 23. La unidad magnética 10 y la membrana protectora 21 pueden cerrar adecuadamente la abertura de la vasija 26 y prevenir la evaporación de la solución 23. En la Fig. 108, la unidad magnética 10 se retira de la vasija 26 y la capa de micropartículas 78 se encuentra encima de la membrana protectora 21. Fig. 109 presenta la retirada de la solución 23 de la vasija 26, por ejemplo, por medio de un lavador o una pipeta.
En la Fig. 110 se describe la adición de una nueva solución a la misma vasija 26. En la Fig. 111, la unidad magnética 10 se transfiere a la vasija 23 que contiene ahora una nueva solución 23. La capa de micropartículas 78 no está homogeneizada en la solución 23, pero la capa de micropartículas 78 puede moverse y mantenerse en reposo en la solución 23 durante un periodo de tiempo apropiado. En la Fig. 112, la unidad magnética 10 y la capa de micropartículas 78 que se encuentra encima de la membrana protectora 21 se retiran de la vasija 26. Las soluciones pueden cambiarse en el proceso descrito tantas veces como sea necesario, y finalmente puede realizarse en la vasija 26 una medida para determinación de la concentración del componente biológico aislado en la solución 23. Alternativamente, la concentración del componente biológico puede determinarse en la capa de micropartículas 78.
Un ejemplo del método presentado en la Fig. 97-112 es la utilización de vasijas que contienen todas las soluciones, micropartículas, anticuerpos, marcadores, tampones de lavado y sustratos necesarios dispensados fácilmente. Las vasijas que contienen las soluciones mencionadas anteriormente pueden cerrarse también por medio de papel metalizado de aluminio, pegatinas diferentes o soluciones elastómeras.
Fig. 97-112 presentan un modo de producir y utilizar la capa de micropartículas como una sólida expansiva, que es aplicable también con diferentes vasijas, tales como, por ejemplo, tubos y pocillos. En tal caso, por utilización de un imán externo y un manguito ferromagnético, las micropartículas se fijan a la superficie interna de la vasija para formar una capa apropiada. El enfoque del imán puede ser también de otra clase, tal como, un electroimán o un imán permanente regular. La capa de micropartículas debe ser relativamente delgada, a fin de conseguir las ventajas descritas. También es posible utilizar los métodos de mezcladura descritos en esta invención con una vasija de este tipo, y el cierre de la abertura de la vasija en el caso de que se desee que los métodos se exploten eficientemente.
La transferencia y utilización de la unidad magnética, incluso cuando la misma no contiene una membrana protectora elastómera, junto con vasijas que contienen filtros y un imán externo, están dentro del alcance de la invención de la patente. Las realizaciones de la invención arriba mencionadas sirven únicamente como ejemplos de aplicación de la idea conforme a la invención. Para las personas expertas en la técnica, es evidente que pueden existir diversas realizaciones dentro del alcance de las reivindicaciones expuestas más adelante con mayor detalle.
LISTA DE LOS NÚMEROS DE REFERENCIA
10 Unidad magnética
11 barra
12 tubo o manguito ferromagnético
13 imán
21 membrana protectora
22 micropartículas
23 solución
25 superficie líquida
26 vasija
28 eje de rotación
29 nervio de la membrana protectora
40 dispositivo de transferencia multi-canal para micropartículas
41 grupo de unidades magnéticas
42 bolsa
76 vasija que incluye un filtro en su fondo
77 filtro
78 capa de micropartículas
79 punta de una pipeta o un dispensador/lavador
80 dispositivo de mezcladura
81 resorte
82 microplaca
83 pocillo
84 borde del pocillo
85 canal de salida
Claims (8)
- 5101520253035404550556065Reivindicaciones1. Un método para manipulación de micropartículas, en el que las micropartículas (22) se utilizan como una fase sólida para fijar un componente deseado de una muestra, en donde el componente deseado está constituido por diversas biomoléculas, ácido nucleico, proteínas, péptidos, orgánulos celulares, bacterias, células o virus, en donde- se realizan al menos dos pasos de tratamiento de las micropartículas (22) en la misma vasija (26) sin mover las partículas a otra vasija,- las micropartículas son partículas magnéticas que son ferromagnéticas, paramagnéticas o superparamagnéticas,- los pasos de tratamiento son al menos un cambio de soluciones (23) y al menos una mezcladura,- las micropartículas (22) se tratan con una herramienta magnética (10) equipada con un blindaje protector (21),- en la vasija (26) las micropartículas (22) se recogen y se fijan sobre el blindaje protector (21) de la herramienta magnética (10) antes del cambio de soluciones (23),- las micropartículas (22) se mezclan por medio de la herramienta magnética (10), de tal manera que el blindaje protector de la herramienta se mueve en la solución (23), y que comprende(a)- utilizar un imán externo (13) y un manguito o placa ferromagnético (12) para suprimir o crear un campo magnético en la vasija;- retirar una solución (23) de la vasija (26) sea por aspiración de la solución (23) a través de un filtro o membrana (77) en el fondo de la vasija (26) o por medio de una pipeta o dispositivo de lavado desde la parte superior de la vasija (26), en donde las micropartículas (22) se recogen antes de retirar la solución (22) en la superficie interna de la vasija (26) para formar una capa; o(b)- utilizar un imán externo (13) y un manguito o placa ferromagnético (12); en donde el imán (13) y el manguito ferromagnético (12) están imantados transversalmente; adicionalmente existe una suspensión de resorte (81) bajo el imán (13); por presión de la placa de la vasija (26) hacia abajo, la vasija (26) presiona simultáneamente el imán (13) dentro del manguito ferromagnético (12) y el resorte (81) bajo el imán (13) se aprieta; cuando el imán (13) está dentro del manguito ferromagnético (12), no existe campo magnético alguno fuera, y las micropartículas (22) se mantienen homogeneizadas en la solución (23).
- 2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque- durante el cambio de soluciones (23), las micropartículas (22) se fijan a la superficie interna de la vasija (26) por medio del imán externo (13),- las micropartículas (22) se homogeneízan desde la superficie interna de la vasija (26) a la solución (23) por medio del imán (13) de la herramienta magnética (10) equipada con un blindaje o revestimiento elastómero o no elastómero (21),- las micropartículas (22) se transfieren fuera de la vasija (26) a otra vasija (26) por medio de la herramienta magnética (10).
- 3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque- durante el al menos un cambio de soluciones (23) las micropartículas (22) se fijan en la superficie interna de la vasija (26) por medio del imán externo (13),- las micropartículas (22) se homogeneízan en la solución (23) de tal manera que las mismas se mezclan por medio de una herramienta por estiramiento y aflojamiento de la membrana elastómera que cubre la herramienta.
- 4. Un método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque- las micropartículas (22) se recogen en el filtro (77) existente en el fondo de la vasija (26) de tal manera que la solución (23) se retira a través del filtro.
- 5. Un dispositivo para manipulación de micropartículas (22), dispositivo que incluye al menos una vasija (26), donde las micropartículas (22) se encuentran como la fase sólida para fijar componentes deseados de la muestra, en donde los componentes deseados son biomoléculas, ácido nucleico, proteínas, péptidos, orgánulos celulares, bacterias, células o virus, y en donde el dispositivo está provisto de un medio para realizar al menos dos pasos de tratamiento de las micropartículas (22) en la misma vasija (26) sin retirar las micropartículas a otra vasija, en donde las micropartículas son micropartículas magnéticas que son ferromagnéticas, paramagnéticas o superparamagnéticas, en51015202530donde los pasos de tratamiento comprenden realizar al menos un cambio de soluciones (23) y al menos una mezcladura en la misma vasija (26), en donde los medios comprenden- una herramienta magnética (10) equipada con un blindaje protector (21) para recogida de las micropartículas (22) en el blindaje y para fijación de las micropartículas durante el al menos un cambio de soluciones (23),- y un dispositivo de mezcladura, tal como la herramienta magnética (10) que tiene un blindaje protector, que puede moverse para mezclar las micropartículas (22), en donde la vasija (26) está provista de un imán externo (13) para fijar las micropartículas (22) en la superficie interna de la vasija durante el al menos un cambio de soluciones, en donde el imán externo (13) tiene un tubo ferromagnético (12), y en donde el imán externo (13) y el tubo ferromagnético (12) pueden moverse cada uno en relación al otro para ajustar la intensidad del campo magnético del imán externo (12).
- 6. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque en el dispositivo- la herramienta magnética (10) está provista de un imán (13) equipado con dicho blindaje protector (21), en donde el blindaje es un blindaje elastómero o no elastómero o un revestimiento para la homogeneización de las micropartículas (22) desde la superficie interna de la vasija (26) en la solución (23).
- 7. Un dispositivo conforme a cualquiera de las reivindicaciones 5 y 6, caracterizado porque el dispositivo de mezcladura es la herramienta magnética (10) y el blindaje protector (21) es una membrana elastómera que cubre el imán (13) para mezcladura de las micropartículas (22).
- 8. Un dispositivo conforme a cualquiera de las reivindicaciones 5-7, caracterizado porque el dispositivo está provisto de- un canal (85) en el fondo de la vasija (26) para conducir la solución (23) a través de un filtro (77) fuera de la vasija.
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