ES2675104T3 - Moléculas de ácidos nucleicos que codifican una dextrano-sacarasa que cataliza la síntesis de dextrano que porta ramificaciones de tipo alfa-1,2 osídicas - Google Patents

Abstract

Utilización de una glucosiltransferasa capaz de formar dextranos que presentan ramificaciones α(1 Utilización de una glucosiltransferasa capaz de formar dextranos que presentan ramificaciones α(1 → 2) a partir de sacarosa, de α-D-fluoro-glucosa, de para-nitrofenil-α-D-glucopiranósido, de α-D-glucopiranósido-αDsorbofuranósido o de 4-O-α-D-galactopiranosilsacarosa, en la fabricación de una composición medicinal con efecto prebiótico destinada a mejorar el tránsito intestinal en animales o en el ser humano, comprendiendo dicha glucosiltransferasa una secuencia señal, una región variable, un primer dominio catalítico, un dominio de unión a glucano y un segundo dominio catalítico en la parte carboxílica de la glucosiltransferasa, y estando dicha glucosiltransferasa codificada por un ácido nucleico aislado, comprendiendo dicho ácido nucleico: i) dos secuencias de ácido nucleico que codifican dichos dominios catalíticos, teniendo dichas secuencias de ácido nucleico al menos un 50 %, y preferentemente al menos un 80 % de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 3, y una secuencia que codifica el dominio de unión a glucano cuyo tamaño es superior a 500 aminoácidos, estando dicho dominio de unión a glucano situado entre las dos secuencias que codifican dichos dominios catalíticos; o ii) una secuencia que presenta al menos un 80 % de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 4.

Description

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DESCRIPCION

Moléculas de ácidos nucleicos que codifican una dextrano-sacarasa que cataliza la síntesis de dextrano que porta ramificaciones de tipo alfa-1,2 osídicas

La presente solicitud se refiere al campo de la glucotecnología y, más particularmente, de la síntesis de oligosacáridos u oligósidos con efecto prebiótico, terapéutico o diagnóstico.

La presente solicitud divulga moléculas de ácidos nucleicos que codifican una enzima que tiene una actividad de glucosiltransferasa que cataliza la síntesis de dextranos o de oligósidos que portan ramificaciones de tipo a(1 ^ 2) osídicas.

La solicitud divulga también las enzimas sintetizadas por los ácidos nucleicos descritos en este contexto, así como sus sistemas de expresión en células procariotas o eucariotas. La solicitud divulga finalmente la utilización de dichas enzimas en la producción de oligosacáridos en la alimentación, o como principio activo de productos terapéuticos y/o cosméticos. La invención se refiere, más particularmente, a una utilización tal como se define en las reivindicaciones 1 a 3.

Los oligósidos y heterooligósidos juegan el papel de señales de reconocimiento y de efector tanto en animales como en plantas (se habla entonces de oligosacarinas), al unirse específicamente a lectinas, glucosiltransferasas, glucosidasas, moléculas de adhesión, etc... De este modo, los determinantes antigénicos de los grupos sanguíneos son ósidos, y nuestra defensa contra una serie de bacterias patógenas está dirigida contra las estructuras osídicas de la envuelta bacteriana. Por otro lado, una de las razones principales del rechazo de los xenoinjertos es la existencia de estructuras osídicas propias de cada especie. Estas propiedades, así como los conocimientos adquiridos estos últimos años sobre las glucosiltransferasas y las lectinas, contribuyen a hacer de ciertos oligósidos candidatos preferentes para terapéutica o profilaxis de trastornos asociados al equilibrio microbiológico de diferentes órganos tales como el intestino, o la piel. Por ejemplo, los oligósidos constituyen una alternativa interesante a la utilización de microorganismos y de antibióticos para regular la composición de la flora intestinal (efecto prebiótico). Ciertos oligósidos pueden ser considerados "fibras solubles" cuando no son metabolizados por las enzimas digestivas humanas y animales; al llegar al colon, interactúan con la flora microbiana y afectan específicamente al crecimiento y la adhesión de ciertas especies. Incorporadas a dosis baja (menos del 1 %) en la alimentación, ciertas de estas moléculas osídicas mejoran el estado de salud y estimulan el aumento de peso de los animales.

Una revisión de las diferentes glucosiltransferasas, su estructura y su actividad, se describe en Vincent Monchois et al. (1). En resumen:

a) Parece que la estructura de las glucosiltransferasas y/o dextrano-sacarasas estudiadas está muy conservada y está constituida, partiendo de la parte aminada de la proteína, por una secuencia señal, por un dominio variable, por un dominio catalítico y por un dominio de unión a glucano.

b) Los glucooligósidos (GOS) son sintetizables por glucosiltransferasas tales como dextrano-sacarasas, a partir de sustratos poco costosos tales como sacarosa y en presencia de un azúcar aceptor de glucosa. Otros sustratos, tales como a-D-fluoro-glucosa, paranitrofenil-a-D-glucopiranósido, a-D-glucopiranósido-a-D- sorbofuranósido o 4-O-a-D-galactopiranosilsacarosa también pueden utilizarse.

Estas enzimas catalizan a partir del sustrato la transferencia de unidades de glucosa en moléculas aceptoras. En presencia de un aceptor de glucosa tal como maltosa, o isomaltosa, las glucosiltransferasas catalizan la síntesis de oligosacáridos de bajo peso molecular que comprenden mayoritariamente cadenas de 3 a 7 glucosas, de acuerdo con la reacción:

sacarosa + aceptor ^ aceptor glucosilado + fructosa

En tal caso, las enzimas presentan generalmente una especificidad de síntesis de enlaces osídicos conformes a la que forma el polímero donador.

En cambio, en ausencia de aceptor, la enzima sintetiza glucanos de alto peso molecular de tipo dextrano mediante transferencias sucesivas de unidades a-D-glucopiranosilos a partir de sacarosa, de acuerdo con la reacción:

n sacarosa ^ (glucosa)n + n fructosa

c) Las estructuras y la función de los glucanos o de los oligósidos sintetizados por las glucosiltransferasas dependen de la cepa bacteriana productora.

En el conjunto de este texto, se denominará de forma genérica glucosiltransferasas a las diferentes enzimas capaces de catalizar la síntesis de polímeros de glucosa a partir de sacarosa. Éstas son producidas generalmente por cepas bacterianas de tipo Leuconostoc, Lactococcus, Streptococcus o Neisseria. El tamaño y la estructura de los glucanos producidos dependen de la cepa productora.

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Las unidades de glucosa se acoplan mediante enlaces osídicos a(1^6) como en el dextrano, mediante enlaces a(1^-3), como en el caso del mutano, o mediante una alternancia de los dos tipos (alternano).

De la misma forma, la existencia y la naturaleza de las ramificaciones, su longitud y su posición varían de acuerdo con el origen de la cepa productora.

Las glucosiltransferasas que producen glucanos o GOS que contienen al menos un 50 % de enlaces a(1^6) se denominan dextrano-sacarasas. Los GOS sintetizados por estas enzimas portan, llegado el caso, ramificaciones a(1^-2), a(1^-3) y/o a(1^4). Dichas dextrano-sacarasas son producidas concretamente por bacterias de tipo Leuconostoc mesenteroides.

d) La dextrano-sacarasa de L. mesenteroides NRRL B-1299 tiene la particularidad de producir, por su parte, un dextrano altamente ramificado cuya mayoría de ramificaciones son de tipo a(1^2). Utilizada en presencia de sacarosa y de maltosa, molécula aceptora de glucosa, conduce a la formación de GOS que presentan, para algunos, un enlace a(1^-2) en su extremo no reductor y, para otros, ramificaciones a(1^2) en los residuos intermedios entre los extremos. Por este motivo, resisten a la degradación por las enzimas (hidrolasas) del tracto digestivo superior, en ser humano y en animales, y solamente son degradados por géneros bacterianos capaces de fermentar tales como Bacteroides y Bifidobacterium, considerados beneficiosos para el organismo del huésped.

Un fenómeno idéntico se produce a nivel de la piel, permitiendo prever aplicaciones en cosmetología, ya que es el desequilibrio de la flora microbiana cutánea el que está en el origen de numerosos problemas cosméticos y dermatológicos. Es debido a estas características que se designan en este contexto mediante el término GOS de interés.

En el conjunto del texto, los polisacáridos sintetizados por las glucosiltransferasas descritas en este contexto son, bien dextranos de alto peso molecular cuando la reacción se realiza sin aceptor de glucosa, o bien oligósidos cuando la reacción se realiza en presencia de aceptor de glucosa tal como maltosa o isomaltosa sin que esto se especifique necesariamente. En efecto, la funcionalidad de la enzima se caracteriza por la naturaleza de los enlaces glucosa- glucosa [a(1^6), a(1^2)] u otros y no por el peso molecular del polisacárido sintetizado.

Las dextrano-sacarasas de L. mesenteroides encuentran ya numerosas aplicaciones en la industria, y en particular las de la cepa NRRL B-1299 para las cuales un procedimiento de síntesis de GOS que presentan ramificaciones a(1^2) se ha descrito en la patente EP 0325 872 Bl.

Marguerite Dols et al. (2) han mostrado que los GOS producidos por las dextrano-sacarasas de esta cepa son, de hecho, una mezcla de al menos tres familias de moléculas similares que difieren, de hecho, en el número y el posicionamiento de las ramificaciones de tipo a(1^-2), lo que conlleva la hipótesis de la existencia de diferentes actividades enzimáticas de tipo glucosiltransferasa en esta cepa bacteriana.

Teniendo en cuenta el interés industrial en el campo de los alimentos prebióticos, en cosmetología o en farmacia de los GOS que presentan ramificaciones a(1^2) y recordado anteriormente, se ha previsto aislar y caracterizar una enzima particular entre las producidas por L. mesenteroides NRRL B-1299 que estaría más particularmente implicada en la síntesis de oligósidos que presentan las ramificaciones a(1^2). La identificación y la caracterización de dicha enzima ofrecen la ventaja, por un lado, de proporcionar un procedimiento de producción uniforme y reproducible de los GOS de interés y, por otro lado, de identificar las características esenciales de la enzima productora de estos GOS de interés, para, llegado el caso, mejorar las prestaciones de los productos de la reacción enzimática en función de la utilización prevista.

El problema técnico sustentado por los desarrollos descritos en este contexto era, de este modo, poder disponer de una enzima y por lo tanto, ácidos nucleicos aislados que codifican esta enzima que permiten la producción mejorada de GOS con ramificaciones a(1^2).

La presente solicitud aporta una solución técnica a las diferentes cuestiones mencionadas anteriormente, proporcionando una nueva dextrano-sacarasa, denominada DSR-E codificada por un gen dotado de una estructura nueva e inesperada (dsrE) y capaz de catalizar la síntesis de glucanos o de oligosacáridos que comprenden ramificaciones a(1^-2).

Entre la fecha de depósito de la solicitud de patente francesa N°0103631, cuya prioridad se reivindica y en la que la dextrano-sacarasa se denominaba DSR-D, y la de la presente solicitud, otra dextrano-sacarasa, diferente de la enzima objeto de la solicitud prioritaria, se ha descrito y se ha denominado también DSR-D. Por esto, en el marco de la presente solicitud de patente, la dextrano-sacarasa descrita y representada en la figura 1b) ya no se denomina DSR-D como en el documento de prioridad, sino DSR-E. De hecho, las dextrano-sacarasas DSR-D de acuerdo con dicho documento de prioridad y DSR-E son completamente idénticas.

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Por estructura nueva e inesperada, se entiende el hecho de que la organización de la proteína difiere de la de todas las demás glucosiltransferasas descritas actualmente (1) y cuyo dominio catalítico está situado cadena arriba de un dominio de unión a glucano, constituyendo este último la parte carboxílica de la proteína.

De este modo, la presente solicitud divulga un polipéptido aislado que tiene una actividad enzimática de glucosiltransferasa capaz de formar dextranos que presentan ramificaciones a(1^-2), caracterizado por que comprende al menos un dominio de unión a glucano y un dominio con actividad catalítica situado cadena abajo del dominio de unión a glucano. Por situado cadena abajo, se entiende el hecho de que la parte aminada de la secuencia con actividad catalítica o dominio catalítico es proximal a la parte carboxílica del dominio de unión a glucano. Estos dos dominios pueden ser inmediatamente contiguos o, por el contrario, estar separados por una región variable.

La glucosiltransferasa descrita en este contexto consta preferentemente de un péptido señal.

En una realización descrita en este contexto, la glucosiltransferasa comprende dos dominios catalíticos situados a uno y otro lado del dominio de unión a glucano.

La presencia de un dominio con actividad catalítica en la parte carboxílica de la enzima es una característica esencial de esta última en su capacidad para formar enlaces a(1^-2) osídicos. En efecto, como muestran los experimentos descritos a continuación, la deleción de este dominio en una enzima que tiene al menos dos dominios catalíticos conduce a la producción de glucanos o de oligósidos que tienen esencialmente enlaces osídicos de tipo a(1^6) y desprovistos de enlaces de tipo a(1^-2).

Más exactamente, el dominio catalítico, en cuanto está situado cadena abajo de un dominio de unión a glucano, permite la síntesis de oligósidos que contienen enlaces a(1^2).

Además, los experimentos descritos a continuación demuestran que la especificidad de función de la dextrano- sacarasa DSR-E, a saber su capacidad para catalizar la formación de enlaces osídicos a(1^2) es imputable, no a la presencia concomitante de dos dominios catalíticos, sino más bien a la concatenación de un dominio de unión a glucano y de un dominio catalítico, y más particularmente del dominio catalítico CD2.

El análisis comparativo de las diferentes glucosiltransferasas que incluyen las dextrano-sacarasas puso de manifiesto un muy fuerte grado de conservación de su dominio catalítico.

El dominio catalítico situado en la parte carboxi-terminal de la glucosiltransferasa descrita en este contexto tiene una secuencia que presenta al menos un 44 % de identidad y un 55 % de similitud con los dominios catalíticos de las otras glucosiltransferasas analizadas. En particular, el dominio catalítico en la parte carboxílica de la glucosiltransferasa descrita en este contexto tiene al menos un 65 % de identidad y al menos un 80 % de similitud con la secuencia ID No. 1, estando la tríada catalítica Asp/Glu/Asp en posiciones respectivas 230/268/342 conservada.

En el conjunto del texto, se entiende por X % de similitud con respecto a una secuencia de referencia, el hecho de que un X % de los aminoácidos son idénticos o están modificados por sustitución conservativa tal como se define en el software de alineamiento de las secuencias de aminoácidos ClustalW (
http:///bioweb.pasteur.fr/docs/doc- gensoft/clustalw//) y que (100-X) % pueden delecionarse, sustituirse por otros aminoácidos, o incluso que (100-X) % pueden añadirse a la secuencia de referencia. Una estructura primaria particular de la enzima de acuerdo con la presente descripción se representa en la secuencia ID No. 2 que representa una secuencia de 2835 aminoácidos de una dextrano-sacarasa de L. mesenteroides NRRL B-1299.

Esta dextrano-sacarasa, denominada DSR-E, posee como la mayor parte de las glucosiltransferasas y de las dextrano-sacarasas una secuencia señal, una región variable poco conservada, un dominio catalítico altamente conservado (CD1), un dominio de unión a glucano (GBD) y un segundo dominio catalítico (CD2) en la parte carboxílica de la proteína. DSR-E es la primera glucosiltransferasa analizada y que presenta dos dominios catalíticos, en la configuración presentada en la figura 1 b). Es también la primera glucosiltransferasa de la que un dominio catalítico está situado en la parte carboxílica de la proteína.

La figura 1b) hace que se manifieste también que el dominio de unión a glucano es sensiblemente más largo que el descrito anteriormente para las dextrano sacarasas conocidas; de este modo, otra característica de las enzimas descritas en este contexto es el tamaño de este dominio que es superior a 500 aminoácidos.

La comparación y el análisis de la secuencia de DSR-E con las secuencias de las glucosiltransferasas o de las dextrano-sacarasas ya descritas (1), así como los medios utilizados para este fin se indican en el ejemplo 2 detallado a continuación. Aparece claramente que si la existencia de dos dominios catalíticos diferencia sustancialmente DSR- E de las otras enzimas, en cambio las secuencias de dichos dominios están sustancialmente conservadas. En particular, los aminoácidos necesarios para la actividad catalítica se conservan en el segundo dominio catalítico, a saber la tríada Asp/Glu/Asp situada en las posiciones respectivas 2210/2248/2322 de la secuencia ID No. 2.

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De este modo, la presente solicitud divulga también cualquier polipéptido aislado que tiene una actividad catalítica de glucosiltransferasa capaz de formar dextranos u oligosacáridos que tienen ramificaciones a(1^-2) tal como obtenido por modificación, sustitución, inserción o deleción de secuencias de aminoácidos pero que consta de secuencias que presentan al menos un 80 % y preferentemente al menos un 90 % de similitud con las secuencias siguientes de la secuencia ID No. 2:

423 - 439 478 - 501 519 - 539 560 - 571 631 - 645 1014 - 1021

2120 - 2138 2161 - 2184 2202 - 2214 2243 - 2250 2315 - 2322 2689 - 2696

De acuerdo con una realización particular, finalmente, un polipéptido con actividad catalítica tal como se describe en este contexto contiene los siguientes aminoácidos:

W en posiciones 425 y 2122,

E en posiciones 430, 565 y 2127, 2248,

D en posiciones 487, 489, 527, 638, 2170, 2172, 2210 y 2322,

H en posición 637 y 2321,

Q en posición 1019 y 2694.

Los polipéptidos con actividad de glucosiltransferasas capaces de formar enlaces osídicos a(1^-2) pueden presentarse en forma aislada, o por el contrario integrarse en una proteína más amplia, como por ejemplo una proteína de fusión. En efecto, puede ser ventajoso incluir secuencias que presentan otra función, como por ejemplo una secuencia etiqueta específico de un ligando que permite facilitar su purificación. Estas secuencias etiqueta puede ser de tipo GST (glutatión-S-transferasa), Inteína - CBD (Chitine-Binding Domain), (comercializado por New England Biolabs,
http://www.neb.com), MBD (Maltose Binding Domain), polipéptidos que contienen residuos histidina contiguos que permiten facilitar la purificación del polipéptido con el que está fusionado. El experto en la materia puede concebir cualquier otra proteína de fusión que permite asociar la función de la DSR-E descrita en este contexto con otra función, como por ejemplo, y sin ser limitante, una secuencia que aumenta la estabilidad de la enzima producida por expresión en un huésped recombinante o una secuencia capaz de aumentar la especificidad o la eficacia de acción de esta enzima, o una secuencia que pretende asociar otra actividad enzimática afín.

Dichas proteínas de fusión forman también parte de la presente divulgación en cuanto contienen el dominio CD2 y el sitio de unión al glucano. De la misma forma, los fragmentos de la secuencia ID No. 2, que comprenden al menos la secuencia ID No. 1 y el dominio de unión a glucano, solos o integrados en una secuencia polipeptídica más amplia forman parte de la presente divulgación, a partir del momento en que la actividad enzimática de dextrano-sacarasa se conserva.

Las variantes de las secuencias polipeptídicas definidas anteriormente forman también parte de la presente divulgación. Además de los polipéptidos obtenidos por sustitución conservativa de los aminoácidos tal como se ha definido anteriormente, las variantes incluyen polipéptidos cuya actividad enzimática está mejorada por ejemplo por mutagénesis dirigida o aleatoria, por evolución molecular, o por duplicación del dominio catalítico CD2.

La estructura particular de esta enzima identificada en la presente solicitud resulta de un proceso que comprende:

a) la identificación y el aislamiento de la dextrano-sacarasa de L. mesenteroides que cataliza la producción de GOS de interés que portan las ramificaciones a(1^-2);

b) la secuenciación de fragmentos de la enzima;

c) la síntesis de cebadores de amplificación capaces de amplificar el gen correspondiente de la cepa productora o de fragmentos de ésta;

d) la secuenciación de los fragmentos amplificados;

e) la clonación en vectores específicos y su expresión en huéspedes apropiados.

Las modalidades del procedimiento implementado se detallan en la parte experimental a continuación. La primera etapa consiste en una separación de las proteínas por electroforesis en gel de poliacrilamida, e identificación de las bandas que presentan la actividad de dextrano sacarasa mediante una reacción enzimática in situ en presencia de sustrato y de aceptor. La naturaleza de los GOS sintetizados se identifica a continuación en cada banda mediante análisis por HPLC de acuerdo con los métodos descritos en (1). El tiempo de retención de los oligósidos en HPLC depende de la naturaleza y de la organización de sus enlaces osídicos. Es posible, en particular, distinguir aquellos constituidos por residuos enlazados en a(1^6), en a(1^6) con una ramificación a(1^2) en el extremo no reductor de la molécula, y los buscados compuestos por una cadena lineal a(1^6) con ramificaciones a(1^2).

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Los inventores han, por lo tanto, aislado e identificado la dextrano-sacarasa de L. mesenteroides NRRL B-1299 productora de GOS de interés.

Un procedimiento de ingeniería inversa implementado en las etapas b) a e) anteriores permitió a continuación proporcionar la secuencia nucleotídica que codifica la enzima y que permite producirla en cantidad industrial y, llegado el caso, modificarla, mejorando sus prestaciones mediante las técnicas a disposición del experto en la materia. A modo de ejemplo, se pueden citar mutagénesis dirigida o aleatoria, o la evolución molecular (DNA shuffling) (3).

Otro aspecto de la presente solicitud se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una enzima con actividad glucosiltransferasa capaz de formar dextranos u oligósidos que presentan ramificaciones a(1^-2) y que comprenden al menos una secuencia que codifica un dominio de unión a glucano, y al menos una secuencia nucleotídica que codifica un dominio catalítico situado en 3' respecto a la anterior, codificando dicha secuencia un dominio catalítico que tiene al menos un 50 % y preferentemente al menos un 70 % de similitud con la secuencia ID No. 3 que tiene la estructura presentada en la figura 1 b.

Por similitud, se entiende el hecho de que, para un mismo marco de lectura, un triplete dado se traduce por el mismo aminoácido. Este término incluye, por lo tanto, las modificaciones de bases que resultan de la degeneración del código genético.

El porcentaje de similitud se determina comparando una secuencia dada con la secuencia de referencia. Cuando éstas son de longitudes diferentes, el porcentaje de similitud está basado en el porcentaje de nucleótidos de la secuencia más corta similares a los de la secuencia más larga.

El grado de similitud puede determinarse convencionalmente mediante utilización de softwares tales como ClustalW (Thompson et al., Nucleic Acid Research (1994), 22: 4673-4680) distribuidos por Julie Thompson (
Thompson@EMBL-Heidelberg.DE) y Toby Gibson (
Gibson@EMBL-Heidelberg.DE) del Laboratorio Europeo de Biología Molecular, Meyerhosfstrasse 1, D-69117 Heidelberg, Alemania. ClustalW también puede cargarse desde varios sitios web incluyendo IGBMC (Instituto de Genética y de Biología Molecular y Celular, B.P. 163, 67404 Illkirch cedex Francia;
ftp://ftp-igbmc.u-strabg.fr/pub/) y EBI (
ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/) y todos los sitios que reenvían al Instituto de Bioinformática (Wellcome T rust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, RU).

Los ácidos nucleicos aislados descritos en el presente contexto pueden comprender concretamente otras secuencias destinadas a mejorar la expresión y/o la actividad de la enzima producida.

Puede tratarse, a modo de ejemplo:

- de secuencias que codifican una secuencia señal para su secreción;

- de una duplicación de la secuencia que codifica el dominio catalítico CD2.

Preferentemente, un ácido nucleico aislado descrito en este contexto comprende:

a) dos secuencias que codifican dominios catalíticos que tienen al menos un 50 %, y preferentemente al menos un 80 % de similitud con la secuencia ID n° 3 que tiene la estructura presentada en la figura 1 b;

b) una secuencia que codifica el dominio de unión a glucano, estando este último situado preferentemente entre las dos secuencias en a).

Un ácido nucleico tal como se describe en este contexto podrá comprender además:

- un promotor, capaz de su expresión en una célula huésped seleccionada,

- una secuencia que codifica un péptido señal, y/o

- una o varias secuencias variables,

estando esta o estas secuencias todas situadas en la parte 5' de las secuencias que codifican el o los dominios catalíticos.

Un ejemplo particular de un ácido nucleico aislado de la presente solicitud comprende más particularmente:

a) la secuencia ID No. 4,

b) una secuencia que presenta al menos un 80 % de similitud con la secuencia ID n° 4 que tiene la estructura presentada en la figura 1b, o

c) la cadena complementaria de la secuencia a) o b), o

d) una secuencia que hibrida con a), b) o c).

La hibridación en d) se realiza en condiciones estándar, y preferentemente en condiciones rigurosas. Por hibridación en condiciones rigurosas, se entiende el hecho de que existe una identidad de secuencias de al menos un 80 % de

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la secuencia que se busca hibridar y preferentemente una identidad de al menos un 90 % de la secuencia que se busca hibridar, en condiciones descritas por ejemplo en Sambrook y Russel (3a edición, 2001, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY).

La solicitud también se refiere a un gen que codifica una dextrano-sacarasa capaz de formar al menos un 15 % de ramificaciones a(1^-2). Además de la secuencia codificante, el gen comprende las secuencias que permiten el inicio de la transcripción así como las secuencias que permiten la fijación de ARN mensajero al ribosoma (RBS). La secuencia ID No. 5 representa una estructura del gen tal como se aísla de L. mesenteroides NRRL B-1299.

Los nucleótidos cadena arriba de la ATG de inicio de la traducción se numeran de 1 a 232.

Se puede identificar la existencia de una secuencia RBS entre los nucleótidos 218 y 223, así como las secuencias consenso - 35 y - 10 situadas entre los nucleótidos 82 y 86 (TTGAA), por un lado y 1O0 y 105 (ATAAAT), por el otro.

Cualquier secuencia de ácido nucleico hibridable con el ADN de la secuencia ID No. 4 o su cadena complementaria es susceptible de codificar una enzima que tiene las propiedades y características de la enzima descrita en este contexto. Esto se aplica tanto a las secuencias naturales que existen en microorganismos diferentes de L. mesenteroides NRRL B-1299 y aisladas de bancos genómicos de microorganismos, como a las preparadas mediante ingeniería genética o por síntesis química.

En particular, las secuencias cadena arriba del ATG de inicio de la traducción y necesarias para la expresión de la proteína pueden sustituirse ventajosamente por secuencias de inicio de la transcripción y/o de fijación al ribosoma adaptados al sistema de expresión seleccionado por la secuencia codificante.

Una secuencia de ácidos nucleicos susceptible de hibridar en condiciones rigurosas con el ácido nucleico aislado de acuerdo con la presente solicitud comprende también fragmentos, derivados, o variantes alélicas de la secuencia de ácidos nucleicos de la presente solicitud que codifica una proteína que tiene la actividad enzimática descrita anteriormente. De este modo, los fragmentos se definen como fragmentos de moléculas de ácidos nucleicos suficientemente largos para codificar una proteína que tenga conservada su actividad enzimática. Ésta incluye también fragmentos desprovistos de la secuencia que codifica el péptido señal responsable de la secreción de la proteína.

El término "derivado" significa secuencia, diferente de la secuencia original, en una o varias posiciones, pero que presenta un alto grado de similitud con estas secuencias. En este contexto, similitud significa una identidad de al menos un 80 % de los nucleótidos, y preferentemente de al menos un 90 % con la secuencia original. Las modificaciones en este caso se refieren a deleciones, sustituciones, inserciones o recombinaciones, a partir del momento en que la enzima codificada por estas secuencias homologues presenta la actividad enzimática se los polipéptidos descritos en este contexto.

Las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con la presente solicitud tal como se han descrito anteriormente y calificadas como derivados de estas moléculas tal como se han descrito anteriormente, son generalmente variantes que ejercen la misma función biológica. Estas variaciones pueden ser variaciones naturales, concretamente aquellas observables de una especie a otra y que resultan de una variabilidad interespecífica o, por el contrario, ser introducidas por medio de una mutagénesis dirigida, aleatoria o mediante DNA Shuffling (evolución molecular).

De la misma forma, forman parte de la presente divulgación los ácidos nucleicos aislados que codifican una glucosiltransferasa capaz de catalizar la síntesis de dextrano o de oligosacárido que portan al menos un 20 % y preferentemente al menos un 30 % de ramificaciones de tipo a(1^2) y obtenidos por evolución molecular (DNA shuffling) y que comprenden:

- una etapa de modificación aleatoria de una de las secuencias descritas anteriormente y, en particular, secuencias ID No. 3 y 4 y de establecimiento de variantes;

- una etapa de expresión de estas secuencias modificadas en una célula huésped apropiada, un huésped que alberga una variante;

- una etapa de cribado de los huéspedes que expresan una enzima capaz de formar más del 20 % y preferentemente más del 30 % de enlaces a(1 ^ 2) en un sustrato apropiado y una etapa de aislamiento del o de los genes mejorados.

Un ácido nucleico aislado de acuerdo con la presente solicitud también podrá comprender:

a) una secuencia que tiene al menos un 80 % de similitud con la secuencia que codifica una dextrano-sacarasa expresada por el plásmido pCR-T7-dsrE en E. coli depositado en la CNCM el 15 de marzo de 2001 con el número I-2649 (E. coli JM 109 [pCR-T7-dsriD]), o

b) una secuencia complementaria de la secuencia en a).

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La denominación de la cepa transformada por el plásmido recombinante pCR-T7-dsrE y depositada en la CNCM es la indicada anteriormente entre paréntesis. Ésta no afecta al cambio de denominación del gen operado posteriormente al depósito de dicha cepa por las razones mencionadas anteriormente.

La solicitud divulga también los fragmentos de ácidos nucleicos, tal como se han definido anteriormente, hibridables con la secuencia ID No. 4, y utilizables como sondas de hibridación para la detección de secuencias que codifican enzimas descritas en este contexto. Estos fragmentos pueden prepararse mediante todas las técnicas conocidas por el experto en la materia.

Además de las sondas de hibridación, cebadores de amplificación forman también parte de la presente solicitud. Dichos cebadores son fragmentos hibridables con la SEQ ID No. 4 o con su cadena complementaria y permiten la amplificación de secuencias específicas que codifican dextrano-sacarasas presentes en un organismo procariota o eucariota, animal o vegetal.

La utilización de dichos cebadores de amplificación permite la implementación de un procedimiento de identificación de la existencia eventual de un gen que codifica una enzima capaz de catalizar la síntesis de GOS con ramificaciones a(1^-2) en dicho organismo, formando dicho procedimiento también parte de la presente divulgación.

También se divulgan vectores de expresión que comprenden un ácido nucleico tal como se ha descrito anteriormente, bajo el control de secuencia que permite su expresión y, preferentemente, su excreción en células procariotas o eucariotas. Como células procariotas, se seleccionarán preferentemente bacterias seleccionadas entre un grupo que comprende E. coli, Lactococcus, Bacillus, Leuconostoc. Como células eucariotas, se seleccionarán preferentemente las eucariotas seleccionadas entre un grupo que contiene levaduras, hongos o plantas.

El vector comprende un promotor adaptado a la expresión del ácido nucleico aislado de acuerdo con la presente descripción en el sistema de expresión seleccionado. A modo de ejemplo, el promotor del bacteriófago T7 podría seleccionarse ventajosamente para una expresión en E. coli.

La solicitud divulga también células huésped, procariotas o eucariotas, transformadas con un ácido nucleico tal como se ha descrito en este contexto preferentemente comprendido en un vector de expresión que porta un promotor, adaptado para una expresión en las células huésped seleccionadas. Las células transformadas se seleccionan entre el grupo de las bacterias Gram- tales como E. coli, o entre el grupo de las bacterias Gram+ tales como Lactococcus, Bacillus, Leuconostoc o entre las eucariotas en un grupo que comprende levaduras u hongos, o plantas.

Un ejemplo particular de una célula transformada de acuerdo con la presente descripción es la cepa de E. coli que alberga un plásmido denominado PCR-T7dsrE portador de la secuencia ID No. 4 bajo el control del promotor del bacteriófago T7 y depositada en la CNCM el 15 de marzo de 2001 con el número I-2649.

La presente solicitud, por otro lado, divulga un procedimiento de producción de una glucosiltransferasa capaz de formar dextranos u oligósidos que presentan al menos un 15 % y preferentemente al menos un 20 % de ramificaciones de tipo a(1^2) osídicas y que comprende:

a) la inserción de un ácido nucleico o de un vector tal como se ha descrito anteriormente en una célula huésped capaz de expresar y preferentemente de secretar glucosiltransferasa;

b) la caracterización de la actividad enzimática buscada mediante todos los métodos accesibles para el experto en la materia;

c) la purificación de la enzima a partir de un extracto celular.

Mediante método de caracterización de la actividad enzimática conocida por el experto en la materia, se entenderán los métodos descritos en la bibliografía, por ejemplo en la referencia (2), así como nuevos métodos susceptibles de ser desarrollados que permitan identificar y discriminar los glucooligosacáridos que presentan la tasa de ramificación buscada.

Se trata, de hecho, de cualquier procedimiento de cribado que permita identificar la presencia de ramificaciones a(1^2) en un GOS.

A modo de ejemplo, se utilizarán:

- HPLC para la cual la migración de los GOS varía en función de la naturaleza y el posicionamiento de las ramificaciones, concretamente aquellas que tienen el enlace a(1^2) en el extremo reductor y aquellas que tienen este enlace en la penúltima glucosa, y/o

- resonancia magnética nuclear (RMN),

- la existencia de una reacción positiva con anticuerpos monoclonales específicos de los enlaces a(1^-2) en el extremo reductor y/o de anticuerpos monoclonales específicos de los enlaces a(1^-2) en la penúltima glucosa del GOS.

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La solicitud divulga también un procedimiento de obtención de una glucosiltransferasa capaz de presentar oligósidos o dextranos que presentan una tasa de ramificación a(1^-2) superior al 15 % y preferentemente superior al 30 % de la totalidad de los enlaces osídicos y que comprende una etapa de modificación de la secuencia ID No. 4 por adición, deleción, mutación a partir del momento en que:

- el marco de lectura no está modificado, y

- los siguientes aminoácidos se conservan después de la traducción:

W en posiciones 425 o 2122, codificado por el triplete TGG en posiciones 1273 y 6364,

E en posiciones 430, 565, 2127 y 2248 codificados por los tripletes GAA en posiciones 1288, 1693, 6379 y 6742 respectivamente,

D en posiciones 487, 489, 527, 638, 2170 y 2210 codificados por los tripletes GAT en posiciones 1459, 1465, 1579, 1912, 6508 y 6628 respectivamente,

D en posiciones 2172 y 2322 codificados por los tripletes GAT en posiciones 6514 y 6964,

H en posición 637 y 2321, codificados respectivamente por los tripletes CAT en posición 1909 y CAC en posición 6961,

Q en posiciones 1019 y 2694 codificados respectivamente por los tripletes CAA (posición 3055) y CAG (posición 8080).

Un procedimiento de producción de una glucosiltransferasa de acuerdo con la presente solicitud que tiene las mismas características que anteriormente también puede comprender:

- una etapa de modificación aleatoria de la secuencia ID n° 4 y de establecimiento de un banco de variantes,

- una etapa de expresión de estas secuencias modificadas en una célula huésped apropiada, un huésped que alberga una variante,

- una etapa de cribado de huésped que expresan una enzima capaz de formar más del 15 % y preferentemente más del 30 % de enlace a(1 ^ 2) en un sustrato apropiado,

- una etapa de aislamiento del o de los genes mejorados.

En otra realización, el procedimiento consiste en modificar la secuencia ID No. 3 mediante duplicación de todo o parte del dominio catalítico CD2.

Se podrá entender que los procedimientos anteriores pretenden, no solamente la obtención de una glucosiltransferasa capaz de formar oligósidos que presenten un tasa de ramificación a(1 ^ 2) constante y reproducible, superior al 15 % de las ramificaciones totales, sino también mejorar la tasa de ramificación a(1 ^ 2) con el objetivo de modificar las propiedades de los oligósidos obtenidos en el sentido de una mejora de sus propiedades dietéticas o de su capacidad para mantener o restablecer la flora bacteriana asociada a ciertos órganos del cuerpo humano o animal.

La presente solicitud divulga finalmente glucosiltransferasas susceptibles de ser obtenidas mediante un procedimiento citado anteriormente y capaces de formar al menos un 15 % y preferentemente al menos un 30 % de ramificaciones de tipo a(1 ^ 2) osídicas en glucooligosacáridos.

La solicitud divulga finalmente la utilización de las glucosiltransferasas descritas en este contexto así como las susceptibles de ser obtenidas mediante los procedimientos anteriores, en la fabricación de una composición con efecto prebiótico o en la fabricación de una composición dermatológica, cosmética o farmacéutica. La invención se refiere, más particularmente, a la utilización de una glucosiltransferasa, de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3.

A modo de ejemplos non limitantes, se puede citar la mejora del tránsito intestinal en animales y en el ser humano, la mejora de la asimilación del calcio y/o del magnesio y de los minerales en general, la prevención del cáncer de colon, la prevención o el tratamiento de las afecciones de la piel tales como acné, caspa, olores corporales.

La ventaja de los polipéptidos y de los ácidos nucleicos que codifican estos polipéptidos descritos en este contexto se sitúa no solamente al nivel de la mejora en términos de calidad, de rendimiento, de reproducibilidad, y de precio de coste de las glucosiltransferasas capaces de formar oligosacáridos con ramificaciones de tipo a(1 ^ 2) osídicas pero también en la perspectiva de producir nuevas enzimas cuya funcionalidad esté mejorada.

Las figuras, ejemplos y la descripción detallada a continuación permiten ilustrar las características y las funcionalidades particulares de los polipéptidos con actividad enzimática y de las secuencias que los codifican. Éstas permiten en particular ilustrar de forma más precias la especificidad del dominio catalítico presente en la parte carboxílica de la enzima descrita en este contexto y su evolución potencial para la obtención de enzimas mejoradas.

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Leyenda de las figuras:

Figura 1: estructura de las glucosiltransferasas nativas y de las proteínas recombinantes derivadas: la figura 1a) representa la estructura de las glucosiltransferasas y de las dextrano-sacarasas descritas en la bibliografía (1). pS: péptido señal; ZV: región variable, CD: dominio catalítico, GBD: dominio de unión a glucano. La figura 1b) representa la estructura de la glucosiltransferasa de la presente solicitud. Las figuras 1c) a 1i) representan diferentes construcciones que constan de las deleciones en comparación con la proteína DSR-E nativa. A(PS) corresponde al control constituido por la forma completa clonada en el sistema pBAD-TOPO Thiofusion (Invitrogen).

Figura 2: esquema resumen del método de clonación de la secuencia nucleotídica que codifica una glucosiltransferasa de acuerdo con la presente solicitud con ayuda de una biblioteca genómica utilizando una sonda de PCR descrita en la tabla I y una sonda HindllI/EcoRV respectivamente.

Figura 3: comparación de las secuencias señal de diferentes glucosiltransferasas de L. mesenteroides. Los aminoácidos conservados están en negrita. DSR-B: L. mesenteroides NRRL B-1299 (4); DSR-S: L. mesenteroides NRRL B-512F (5); ASR: L. mesenteroides NRRL B-1355 (6).

Figura 4: alineamiento de las 11 secuencias repetidas de la enzima DSR-E y observadas en la zona variable. Figura 5: alineamiento de las secuencias conservadas del dominio catalítico.

- Bloque A: aminoácidos esenciales de la parte N-terminal del dominio catalítico;

- Bloque B: aminoácidos de la parte del dominio catalítico de unión a sacarosa;

- Bloques C, D, E: bloques que contienen los tres residuos de aminoácidos implicados en la tríada catalítica

(6);

- Bloque F: secuencia que contiene la glutamina 937 de GTF-I estudiada por Monchois et al. (7).

Los aminoácidos conservados completamente se indican en negrita. «*»: sustituciones conservativas; «:»: sustituciones semiconservativas; —: GAP. Las numeraciones son las de la secuencia ID No. 2.

Figura 6: caracterización por HPLC de los productos sintetizados por la enzima recombinante DSR-E.

6A: análisis por HPLC de los glucooligosacáridos obtenidos con las dextrano-sacarasas de L. mesenteroides NRRL B-1299.

6B: análisis por HPLC de los glucooligosacáridos obtenidos mediante DSR-E recombinante. La identificación de los diferentes picos siguientes:

1: fructosa,

2: maltosa,

3: sacarosa,

4: panosa,

5: R4,

6: OD4,

7: R5,

8: OD5,

A, B, C: picos no identificados.

6C: DSR-E recombinante delecionada del dominio catalítico de la parte carboxílica de la enzima (A DSR-E). Figura 7: análisis por HPLC de los productos de la reacción de aceptor en maltosa, sintetizados por las diferentes formas completas y delecionadas de la proteína DSR-E.

L. m. B-1299: mezcla de dextrano-sacarasas producida por L. mesenteroides NRRL B-1299.

La identificación de los diferentes picos se realiza de la siguiente manera:

F: fructosa M: maltosa S: sacarosa P: panosa

R4, R5: GOS que constan de los enlaces a(1^-2)

OD4, OD5: GOS desprovistos de enlaces a(1^2).

Materiales y métodos:

1) Cepas bacterianas, plásmidos y condiciones de crecimiento:

Todas las cepas se conservan a -80 °C en tubos que contienen un 15 % de glicerol (v/v).

Leuconostoc mesenteroides B-1299 (NRRL, Peoria, EE. UU.) se cultiva a 27 °C, con agitación (200 RPM) en medio estándar (sacarosa 40 g.l'1, fosfato de potasio 20 g.l-1, extracto de levadura 20 g.l'1, MgSO4-7H2O 0,2 g.l'1, MnSO4- H2O 0,01 g.l'1, NaCl 0,01g.l-1, CaCl2 0,02 g.l'1, FeSO4-7H2O 0,01 g.l'1), ajustándose el pH a 6,9.

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Escherichia coli DH5a y JM109 se cultivaron en medio LB (Luria-Bertani).

La selección de los clones recombinantes de pUC18 o pGEM-T Easy se efectúa en placas de LB-agar supplementado con 100 pg.ml'1 de ampicilina, 0,5 mM de isopropil-p-D-tiogalactopiranósido (IPTG) y 40 pg.ml'1 de 5- bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactopiranósido (X-gal). Se utilizaron células de E. coli TOP 10 para el sistema de clonación de producto de PCR TOPO Cloning (Invitrogen), y se cultivaron en medio LB suplementado con kanamicina a la concentración de 50 pg.ml-1.

En lo que concierne a la expresión de dsrE, el kit de clonación ECHO Cloning System (Invitrogen) permite la clonación de un producto de PCR en un vector donador (pUNI/V5-His-TOPO), precediendo a una etapa de recombinación con un vector aceptor adaptado (pCR-T7-E). Este sistema requiere células de E. coli PYR1, TOP 10 y BL21(DE3)pLysS cultivadas en medio LB suplementado con 50 pg.ml-1 de kanamicina, así como con 34 pg.ml-1 de cloranfenicol para la cepa BL21(DE3)pLysS.

Los plásmidos pUC18 digeridos y desfosforilados provienen de Pharmacia (Amersham Pharmacia Biotech) y han sido utilizados para la constitución de un banco de ADN genómico de L. mesenteroides NRRL B-1299. La clonación de producto de PCR, por su parte, necesitó el empleo de plásmido pGEM-T Easy (Promega), y para los fragmentos de más de 2 kpb, de plásmido TOPO-XL (Invitrogen).

El sistema pBAD-TOPO Thiofusion (Invitrogen), utilizado para construir las diferentes formas delecionadas de la proteína DSR-E, pone en juego el promotor araBAD, cuyos mecanismos de control implican la proteína reguladora AraC. En ausencia de inductor, es decir L-arabinosa, la proteína dimérica AraC se asocia a las estructuras reguladoras del operón y conlleva la formación de un bucle de ADN, bloqueando dicho bucle de este modo la transcripción de los genes colocados bajo el control del promotor araBAD. En presencia de L-arabinosa en cambio, AraC forma un complejo, lo que libera el bucle de ADN y permite el inicio de la transcripción. La expresión basal puede limitarse añadiendo glucosa al medio de cultivo: esto actúa disminuyendo el nivel de AMP cíclico, y, por lo tanto, la activación concomitante de la proteína CAP (cAMP activator protein). El nivel de activación obtenido está en función de la concentración de L-arabinosa, de modo que las condiciones óptimas de producción de la proteína de interés pueden seleccionarse con precisión.

Además, el empleo de este vector permite situar una etiqueta de tiorredoxina de 12 kDa en el lado N-terminal de la proteína de interés. Esta fusión pretende favorecer la traducción del gen que codifica dicha proteína de interés. La proteína etiqueta permite además aumentar la solubilidad de la proteína a la que se encuentra fusionada. El sistema pBAD-TOPO Thiofusion está diseñado para permitir eliminar fácilmente la etiqueta de tiorredoxina, mediante simple escisión con ayuda de enteroquinasa. Finalmente, gracias a este sistema de expresión, se inserta una etiqueta de histidina en el lado del extremo C-terminal de la proteína de interés. Dicha etiqueta es útil para purificar dicha proteína por afinidad.

En el marco de la utilización de este sistema, la cepa E. coli TOP 10 se cultivó en medio LB suplementado con 100 pg.ml-1 de ampicilina.

2) Electroforesis en gel, localización y caracterización de la enzima:

Después de un cultivo de L. mesenteroides NRRL B-1299 de 7 h, el medio se centrifugó (7000 RPM, 4 °C, 30 min) y las células, donde se encuentra el 90 % de la actividad enzimática, se concentraron 10 veces en una solución de tampón acetato (20 mM, pH 5,4), se calentaron 5 minutos a 95 °C en presencia de solución de desnaturalización (Tris HCl 62,5 mM, SDS al 4 %, urea 6 M, azul de bromofenol al 0,01 % y p-mercaptoetanol 200 mM). Se depositaron 300 pl de la mezcla sobre gel de poliacrilamida al 7 %. Después de la migración, las proteínas totales se revelaron por tinción con negro amido, mientras que la actividad dextrano-sacarasa se detectó mediante tinción del polímero con reactivo de Schiff después de la síntesis de dextrano in situ. Las bandas que corresponden a dextrano- sacarasas activas se escindieron y se incubaron por separado en 2 ml de solución de acetato de sodio 20 mM pH 5,4 que contiene 100 g.l-1 de sacarosa y 50 g.l-1 de maltosa. Después del consumo total de la sacarosa, la reacción se detuvo mediante calentamiento a 95 °C durante 5 minutos, y el medio de reacción se centrifugó 5 minutos a 15000 g para eliminar el dextrano insoluble. Las muestras se analizaron mediante cromatografía en fase inversa (columna C18, Ultrasep 100, 6 pm, 5x300mm, Bishoff Chromatography) utilizando agua ultrapura como eluyente, a un caudal constante de 0,5 ml.min-1. Los oligosacáridos se separaron durante 30 minutos a temperatura ambiente, y se detectan por refractometría. La secuenciación peptídica se realizó en las bandas proteicas seleccionadas por el Laboratorio de Microsecuenciación, Instituto Pasteur, París.

3) Técnicas de biología molecular utilizadas:

La purificación del plásmido de E. coli y la purificación del ADN genómico de L. mesenteroides se realizaron utilizando respectivamente el QiaPrep Spin Plasmid kit y el Cell Culture DNA maxi kit (QiaGen). Los procedimientos de amplificación y de clonación se realizaron utilizando las técnicas estándar (Sambrook y Russel, 2001, anteriormente). Las enzimas de restricción y de modificación, que provienen de las compañías comerciales New England Biolabs o Gibco BRL, se utilizaron de acuerdo con los protocolos de los fabricantes.

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La PCR se realizó con cebadores seleccionados basándose en la secuencia proteica obtenida en una banda de gel de electroforesis aislada (véase anteriormente, electroforesis en gel y localización de la enzima). Se seleccionaron dos péptidos:

- 29-FYFESGK, y

- 24-FESQNNNP

y se utilizaron para sintetizar oligonucleótidos degenerados e indicados en la tabla I a continuación.

En esta tabla donde las numeraciones son las de la secuencia ID no. 4, parece que la presencia de un residuo serina en los dos péptidos necesita la síntesis de dos cebadores para cada péptido en la medida en que la serina puede estar codificada por seis codones diferentes. ECHO-dir y ECHO-inv son los cebadores utilizados que han permitido la amplificación de dsrE mediante PCR para su clonación en el sistema de expresión ECHO Cloning (Invitrogen).

TABLA I:

Designación

Descripción Secuencia 5'-3'

29-dir1 29- dir2

FYFESGK TT(C/T)TA(C/T)TT(C/T)GA(A/G)TCAGG(C/G)AA(A/G) TT(C/T)TA(C/T)TT(C/T)GA(A/G)AGCGG(C/G)AA(A/G)

24-inv1 24- inv2

FESQNNNP (T/G)GG(G/A)TT(G/A)TT(G/A)TTTTG TGA(T/C)T CAAA (T/G)GG(G/A)TT(G/A)TT(G/A)TTTTGGCT(T/C)TCAAA

IPCR-inv IPCR-dir

secuencia nt 5769-5798 secuencia nt 8311-8342 CCCTTT ACAAGCTGATTTTGCTT AT CTGCG GGGT CAAATCCTTACTAT ACATTGT CACACGG

ECHO-dir ECHO-inv

secuencia nt -6 - 39 secuencia nt 8457-8504 AGTT GTAT GAGAGACAT GAGGGT AATTTGT GACCGT AAAAAATTG ATTTGAGGT AATGTTGATTT AT CACCAT CAAGCTTGAAATATTGACC

PCR:

La PCR se realizó utilizando un termociclador Perkin-Elmer, modelo 2400, y con 50 nanogramos de ADN genómico. Las cantidades de cebadores utilizadas eran de 10 pM de 29-Dir1 y de 24-Inv1. A la mezcla de reacción, se le añadieron 250 pM de cada desoxinucleótido trifosfato, y la Taq Polimerasa.

Después de una amplificación de 25 ciclos a 94 °C durante 30 segundos y a continuación a 50 °C durante 30 segundos, a continuación a 72 °C durante 5 minutos, se obtuvo un fragmento de 666 pares de bases.

Ciertos fragmentos se amplificaron con ayuda del sistema «Expand Long Template PCR» (Roche Boehringer Mannheim), de acuerdo con las indicaciones de utilización del proveedor. Este sistema permite amplificar fragmentos de gran tamaño, hasta aproximadamente 20 kpb, de manera muy eficaz. La combinación de dos ADN polimerasas permite concretamente minimizar la tasa de error durante las etapas de alargamiento.

Hibridación Southern y biblioteca genómica de L. mesenteroides NRRL B-1299:

El ADN cromosómico de L. mesenteroides NRRL B-1299 se digirió con diferentes enzimas de restricción, a continuación se separó por electroforesis en gel de agarosa al 0,8 % en tampón TAE 0,5X.

Bibliotecas genómicas de la bacteria se transfirieron en membranas de nylon hybond N+ (Amersham PharmaciaBiotech). La hibridación se realizó utilizando el fragmento de 666 pares de bases con desoxiadenosina- trifosfato marcado con 32P. La reacción de marcado se realizó utilizando el kit de marcado "Mega Prime DNA Labelling System Kit" (Amersham PharmaciaBiotech), seguida por la purificación de la sonda en columnas MicroSpin S-200HR. La pre-hibridación y la hibridación se realizaron en condiciones fuertemente rigurosas (65 °C durante la noche, de acuerdo con los métodos habituales) (Sambrook y Russel, 2001, anteriormente).

PCR inversa:

La reacción de PCR inversa permite obtener un fragmento de ADN lineal a partir de una matriz circular utilizando cebadores divergentes.

El ADN genómico de L. mesenteroides NRRL B-1299 se digirió por EcoRV en las condiciones recomendadas por el proveedor.

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Después de la re-circularización, los productos de digestión se utilizaron como matriz en una reacción de PCR inversa [Extrapol II DNA polymerase (Eurobio), volumen de reacción de 50 pl, parámetros de la reacción de PCR inversa: 25 ciclos; 94 °C, 30 segundos; 51 °C, 30 segundos; 72 °C, 3 minutos]. Los dos cebadores se seleccionaron en función de la secuencia del inserto de pSB2 como se indica en la figura 2.

La figura 2 resume las modalidades de obtención de los diferentes plásmidos portadores de los fragmentos de dsrE mediante cribado de la biblioteca genómica y utilización de las sondas descritas anteriormente.

Secuencia de ADN y análisis:

Después de la secuenciación de los péptidos, se sintetizaron cebadores degenerados diseñados teniendo en cuenta la frecuencia de utilización de los codones en los genes de dextrano-sacarasas de L. mesenteroides NRRL B-1299, y se permitió la amplificación de un fragmente de 666 pb. La secuenciación de este fragmento reveló fuertes homologías con los genes de dextrano-sacarasas ya conocidos, siendo todo totalmente nuevo.

La utilización de este fragmento como sonda homóloga en experimentos de Southern, permitió identificar señales positivas en diferentes pistas de ADN genómico digerido. De este modo, se cribó un primer banco HindllI, y se purificó un plásmido recombinante, denominado pSB2, que contenía un inserto de 5,6 kpb. El análisis de la secuencia de este fragmento HindllI reveló un marco abierto de lectura que cubre la totalidad del inserto. A continuación, se cribó un banco EcoRV con una sonda HindIII/EcoRV aislada en el extremo N-terminal del inserto HindllI de 5,6 kpb. Un plásmido recombinante pSB3, ensayado positivamente por dot-blot, demostró contener un inserto de 3,8 kpb que, después de la secuenciación, mostró contener el codón de inicio de la traducción y la región promotora del nuevo gen de dextrano-sacarasa denominado dsrE.

Con el objetivo de obtener el codón de terminación de dsrE, se realizó una PCR inversa en el ADN genómico de L. mesenteroides NRRL B-1299 digerido mediante EcoRV y religado sobre sí mismo, utilizando cebadores oligonucleotídicos divergentes diseñados a partir de la secuencia del inserto pSB2. Un fragmento único con el tamaño esperado de 1 kpb se amplificó y a continuación se clonó en un pGEM-T Easy, para obtener el plásmido pSB4. Después de la secuenciación, la secuencia amplificada situada cadena abajo del sitio HindIII consta de 221 pb y contiene el codón de terminación del marco de lectura de dsrE, situado 30 pb cadena abajo del sitio de restricción HindIII.

La secuenciación de los diferentes fragmentos portados por los tres plásmidos fue realizada por la compañía Génome Express y esto, en las dos cadenas. Los análisis de las secuencias de nucleótidos se realizaron utilizando el "ORF Finder" (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html), Blast (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi, Altschul et al., 1997) ClustalW (
http://www2.ebi.ac.uk/clustalw, Thompson et al., 1994), PRODOM

(
http://protein.toulouse.inra.fr/pro-dom.html, Corpet et al., 2000), PFAM (
http://pfam.wustl.edu/hmmsearch.shtml, Bateman et al., 2000) y SAPS (
http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/saps.html, Brendel et al., 1992), siendo el conjunto de estos softwares accesible por internet.

Expresión de la proteína:

Se utilizaron dos sistemas de clonación y de expresión con fines de la producción de proteínas recombinantes en E. coli, a saber los sistemas ECHO-Cloning y pBAD-TOPO Thiofusion (Invitrogen).

A modo de ejemplo, se describe brevemente a continuación el método de clonación de la secuencia nucleotídica que codifica la proteína DSR-E por medio del sistema ECHO-Cloning.

Se utilizaron dos cebadores tal como se proponen en la tabla I anterior en el marco de la amplificación con ayuda del sistema "Expand Long Template" en las siguientes condiciones: 94 °C durante 3 minutos seguidos de 25 ciclos a 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 30 segundos, y 68 °C durante 7 minutos. Los productos de PCR se clonaron a continuación en el vector pUNI/V5-His-TOPO, que permite la obtención de un vector donador (pUNI-dsrE) a recombinar con un vector aceptor (pCR-T7-E) y adaptado a la expresión en E. coli. El plásmido final se designó como pCR-T7-dsrE.

Esta construcción, que coloca el gen dsrE bajo el control del promotor del bacteriófago T7, permitió la expresión inducible del gen dsrE.

Después de la inducción con 1 mM de IPTG, las células de E. coli BL21 transformadas se recogieron mediante centrifugado después de 4 horas de crecimiento, y se resuspendieron a una densidad óptica final de 80 a 600 nm en tampón acetato de sodio 20 mM pH 5,4 y Triton X100 al 1 % (v/v) en presencia de PMSF 1 mM para impedir la proteólisis en los extractos celulares después de la sonicación.

Experimentos similares, realizados con el sistema pBAD-TOPO Thiofusion, permitieron construir el vector recombinante pBAD-TOPO-dsrE.

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Ensayos enzimáticos:

Las reacciones enzimáticas se realizaron en las condiciones estándar a 30 °C en tampón acetato de sodio 20 mM pH 5,4, NaN3 1 g/l'1 y sacarosa 100 g/l-1. La actividad de la enzima DSR-E se determinó midiendo la velocidad de liberación de los azúcares reductores, representados en este caso particular por fructosa, con ayuda del método con ácido dinitro-salicílico bien conocido por el experto en la materia. Una unidad se definió como la cantidad de enzima que catalizaba la formación de 1 pmol de fructosa por minuto en las condiciones estándar. Los oligosacáridos se sintetizaron en un medio de reacción que contenía 100 g/l de maltosa, 200 g/l de sacarosa y 0,5 unidades/ml de DSR-E.

Como para la síntesis de dextrano, la reacción enzimática continuó durante 24 horas en presencia de 100 g/l de glucosa. El dextrano producido se precipitó en presencia de etanol al 50 % (v/v) y se lavó dos veces en etanol al 50 % (v/v) antes de la liofilización. A continuación se disolvió a 10 mg/ml en D2O y se analizó mediante espectrometría de RMN del 13C.

Separación por HPLC:

Se tomaron muestras de 100 pl y se calentaron a 95 °C durante 5 minutos, a continuación se diluyeron en agua ultra-pura para obtener una concentración final de azúcares totales inferior a 5 g.l-1. Después del centrifugado, los sustratos residuales y las diferentes especies formadas se analizaron por HPLC en columna C18 (Ultrasep 100, 6 pm, 5x300 mm, Bishoff Chromatography).

La separación de los oligósidos se realizó a temperatura ambiente, durante 30 minutos, en agua ultra-pura aplicada como eluyente a un caudal de 0,5 ml/min. La detección se consiguió por refractometría.

Dichas condiciones permitieron separar las siguientes especies: fructosa, maltosa, leucrosa, sacarosa, así como los oligósidos cuyo grado de polimerización no superaba 6.

Cálculo de los rendimientos:

El método de cálculo de los rendimientos de las reacciones de síntesis de oligósidos tuvo en cuenta la concentración residual de aceptor, de acuerdo con la siguiente fórmula:

R = {[GOS finales] - [GOS iniciales]} / {0,474 x [sacarosa consumida] + [aceptor consumido]}

donde R representa el rendimiento real de la reacción de síntesis de los GOS totales, expresándose las concentraciones en g/l.

Construcción de las diferencias formas delecionadas de la proteína DSR-E:

Las diferentes formas delecionadas de la proteína DSR-E [figura 1c) a 1i)] se obtuvieron mediante amplificación por PCR de los fragmentos correspondientes del gen dsrE, a continuación clonación en el vector pBAD-TOPO Thiofusion, cuya descripción se proporciona anteriormente. Los cebadores utilizados para la amplificación de las regiones seleccionadas a partir del gen dsrE se enumeran en la tabla II siguiente. Las posiciones de los cebadores se indican en referencia a la secuencia ID no. 5, con respecto a la secuencia del gen dsrE. Las bases mutadas para introducir el sitio de restricción Ncol están en caracteres en negrita y el sitio Ncol resultante está subrayado.

TABLA II:

Designación

Posiciones Secuencia 5'-3'

pBAD-PS/ZV-dir

344-373 GCCAT GGCAAAT ACGATTGCAGTTGACACG

pBAD-ZV/CD1-dir

971-1001 GCCAT GGACGGT AAAACCT ATTTTCTTGACG

pBAD-CD1/GBD-dir

3656-3682 TCCATGGGTGAAAAAACAAGCACCGGC

pBAD-GBD/CD2-dir

6167-6189 ACCATG GAT ATGTCTACT AATGC

pBAD-CD1/GBD-inv

3638-3658 TAACTGTTTAGGCAAGAATCC

pBAD-GBD/CD2-inv

6146-6172 T AAT GTATTAGT GAAT AAGTATTCACC

pBAD-ent-inv

8714-8737 AATTTGAGGT AATGTTGATTT AT C

Los cebadores directos e inversos anteriores se diseñaron para garantizar la fusión traduccional de la etiqueta de tiorredoxina en N-terminal y la etiqueta polihistidina en C-terminal de las formas proteicas truncadas respetando los marcos abiertos de lectura de las regiones que codifican dichas formas.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

En la medida en que el plásmido pBAD-TOPO Thiofusion contiene un sitio de restricción específico de la enzima NcoI situado a nivel del extremo 5' de la región que codifica la tiorredoxina, se introdujo un segundo sitio NcoI en cada cebador directo para poder, llegado el caso, extraer dicha región.

Las reacciones de amplificación por PCR se realizaron con ayuda del sistema «Expand Long Template» en las siguientes condiciones: una pre-desnaturalización a 94 °C durante 3 minutos, seguida de 25 ciclos a 94 °C durante 30 segundos, 52 °C durante 30 segundos y 68 °C durante 7 minutos.

Los productos de amplificación generados de este modo se clonaron a continuación en el vector pBAD-TOPO Thiofusion para fines de la transformación posterior de la cepa E. coli TOP 10. Se seleccionaron clones recombinantes, su perfil de restricción se analizó para identificar, para cada una de las formas buscadas, un plásmido recombinante que porta la inserción orientada como se esperaba.

Ejemplo 1: caracterización y purificación de la enzima DSR-E y obtención del gen dsrE

Las enzimas producidas por los cultivos de L. mesenteroides y obtenidas en gel de poliacrilamida en SDS tal como se describe en la parte Materiales y Métodos se aislaron mediante recorte del gel.

Los GOS producidos por las enzimas aisladas de este modo se analizaron por HPLC de acuerdo con los métodos descritos en (1). La enzima cuya actividad se buscaba se dedujo de la naturaleza de los GOS producidos. Después de la proteólisis trípsica y separación por HPLC de los péptidos producidos, 2 péptidos: 29-FYFESGK y 24- FESQNNNP se secuenciaron y se utilizaron como modelo para la síntesis de cebadores nucleotídicos degenerados.

Las diferentes etapas de amplificación y de clonación se representan en la figura 2. El gen completo se insertó en el plásmido pCR-T7-E y se expresó en E. coli.

La producción de una enzima funcional se certifica mediante la producción de los GOS cuyo análisis por HPLC se representa en la figura 6b).

Se destacará en particular la importancia de los picos 5 y 7 representativos de los GOS con ramificación a(1^-2). Ejemplo 2: caracterización de las secuencias de dsrE y DSR-E

2.1 Secuencia nucleotídica:

La secuencia nucleotídica de la enzima se representa en la secuencia ID No. 4. Está compuesta por un marco de lectura de 8506 nucleótidos.

La secuencia nucleotídica del inserto en el plásmido pCR-T7-dsrE contiene un sitio de unión al ribosoma (RBS), 9 bases cadena arriba del codón de inicio ATG y está compuesta por un hexa-nucleótido GAGGAA.

2.2 Análisis de la secuencia de aminoácidos:

La secuencia de 8506 nucleótidos de dsrE codifica una proteína de 2835 aminoácidos representada en la secuencia ID No. 2. El punto isoeléctrico de esta proteína es de 4,88 y su peso molecular teórico de 313,2 kDa. A pesar de las fuertes similitudes con las dextrano-sacarasas ya conocidas, DSR-E se caracteriza por una estructura original.

El alineamiento de la secuencia de aminoácidos con el conjunto de las glucosiltransferasas y de las dextrano- sacarasas conocidas confirma que la estructura en dominio de las glucosiltransferasas y de las dextrano-sacarasas está conservada, a saber: una secuencia señal, una región variable, un dominio catalítico altamente conservado y un dominio de unión a glucano. Esta estructura se representa en la figura 1a).

Como indica la figura 1b), un segundo dominio catalítico forma la parte carboxi-terminal de la enzima como se ha confirmado mediante PRODOM y un análisis Blast.

Con un peso molecular de 313,2 kDa, DSR-E tiene aproximadamente 2 veces el peso molecular medio de las otras glucosiltransferasas y dextrano-sacarasas (1), lo que está de acuerdo con la presencia de un segundo dominio catalítico en el extremo C-terminal y también con un dominio de unión a glucano más largo.

a) análisis de la secuencia señal:

La secuencia señal y la secuencia nucleotídica que codifica el péptido señal están extremadamente conservadas si se les compara con las otras dextrano-sacarasas como se indica en la figura 3. El sitio de escisión está localizado entre los aminoácidos 40 y 41.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

b) dominio variable:

Cadena abajo del péptido señal, DSR-E tiene un dominio variable de 207 aminoácidos. Cuando se le compara con los otros dominios variables de las glucosiltransferasas, utilizando un programa de alineamiento de tipo SAPS, se pone de manifiesto la presencia de un motivo de 14 aminoácidos repetido 11 veces como se indica en la figura 4.

Este motivo repetido, rico en alanina, treonina y ácido aspártico no ha sido identificado nunca anteriormente.

El papel y el significado de esta región no han sido dilucidados nunca. Diferentes estudios han demostrado que su deleción no afecte a la actividad enzimática (4). El papel del motivo repetido de 14 aminoácidos que no existe en las otras glucosiltransferasas aún está, no obstante, por determinar.

c) análisis de los dominios catalíticos:

El primer dominio catalítico se extiende de los aminoácidos 248 a 1142 (CD1) de la secuencia ID No. 2, mientras que el segundo está localizado entre los aminoácidos 1980 y 2836 (CD2). Estos dos dominios presentan un 45 % de identidad y un 65 % de similitud entre sí.

CD1 y CD2 contienen los aminoácidos ya identificados en las glucosiltransferasas y las dextrano-sacarasas como esenciales por su actividad enzimática, y como se indica en la figura 5.

Las tríadas catalíticas de CD1 y CD2 determinadas por analogía con a amilasa (7) están presentes en las posiciones siguientes: (Asp 527/Glu 565/Asp 638 para CD1 y Asp 2210/Glu 2248/Asp 2322 para Cd2).

Otros residuos conservados se identificaron como importantes para la actividad enzimática: los residuos Trp 425/Glu 430 para CD1 y Trp 2122/Glu 2127 para CD2, los cuales son análogos a los del dominio N-terminal de GFTI descritos por Monchois et al. (4): Trp 344/Glu 349.

En cambio, ciertas secuencias situadas en la región conservada de las glucosiltransferasas y de las dextrano- sacarasas no se encuentran en el CD2 de DSR-E. De este modo, como se indica en la figura 5 a continuación, las secuencias FIHNDTI (2214-2220) y KGVQEKV (2323-2329) divergen de las otras secuencias consenso de las dextrano-sacarasas ya estudiadas que son, respectivamente, NVDADLL y SEVQTVI.

d) dominio de unión a glucano:

Cuando se compara la secuencia de DSR-E con las secuencias conocidas, parece que el dominio de unión a glucano es sensiblemente más largo. En efecto, este dominio tiene una longitud de aproximadamente 500 aminoácidos en las glucosiltransferasas y las dextrano-sacarasas estudiadas mientras que, en DSR-E, representa 836 aminoácidos. Varios motivos repetidos A y C y, en particular, se han podido identificar una serie de repeticiones AC. En la tabla III siguiente, se indican las secuencias consenso de los motivos repetidos del GBD, concretamente motivos A y C, descritos en la bibliografía con respecto a dextrano-sacarasas de Leuconostoc y Streptococcus spp.

_______________________________TABLA III:_______________________________

Motivo Secuencia consenso

A WWYFNxDGQAATGLQTIDGQTVFDDNGxQVKG

B VNGKTYYFGSDGTAQTQANPKGQTFKDGSGVLRFYNLEGQYVSGSGWY

C DGKIYFFDPDSGEVVKNRFV

D GGVVKNADGTYSKY

N YYFxAxQGxxxL

x: aminoácido indiferente.

Ejemplo 3: expresión de dsrE en E. coli

Se cultivaron células de E. coli BL21 (DE3) pLysS pCR-T7-dsrE como se ha descrito anteriormente. Después del gel de electroforesis en poliacrilamida-(page-SDS), el análisis de los extractos proteicos reveló efectivamente la presencia de varias bandas que tienen la actividad de dextrano sacarasa, midiéndose dicha actividad como anteriormente.

La línea E. coli JM109 [pCR-T7-dsrD] se depositó en la CNCM el 15 de marzo de 2001 con el número I-2649.

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20

25

30

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Identificación y caracterización de la actividad enzimática:

Utilizando una molécula aceptora de glucosa, las dextrano-sacarasas producidas por E. coli recombinante se compararon con las producidas por L. mesenteroides NRRL B-1299.

El análisis por HPLC de los productos de la reacción con DSR-E recombinante muestra (figura 6) tiempos de retención que corresponden a los GOS identificados previamente R4 y R5 (2). Los oligosacáridos de tipo R son las series de GOS lineales, estando el enlace a(1^2) unido al extremo no reductor. La serie OD, GOS lineales que resultan de enlaces glucosídicos a(1^6) con un residuo maltosa en el extremo reductor, se observó en muy bajas cantidades. En cambio, tres nuevos compuestos son detectados en los productos de la enzima recombinante.

Identificación de los GOS producidos:

Finalmente, la figura 6b muestra claramente que los picos 5 y 7 que representan los GOS de la serie R son relativamente más importantes con la enzima recombinante que con la enzima nativa cuyos picos que corresponden a panosa y a OD5 son más grandes.

Ejemplo 4: efecto de la deleción de CD2 sobre la actividad enzimáticas de DSR-E

El ADN genómico de L. mesenteroides NRRL B-1299 se utilizó como matriz para amplificar por PCR el gen dsrE delecionado de la secuencia que corresponde al segundo dominio catalítico. Para ello, 2 oligonucleótidos, ECHO-dir (5'-AGTTGTATGAGAGACATGAGGGTAATTTGTGACCGTAAAAAATTG) (SEQ. ID No. 6), que corresponden a la secuencia nucleotídica -6 a 39 y que contienen el codón de inicio de la traducción, y ECHO-inv-del (5'- GTATTAGTGAATAAGTATTCACCATTGCATTTATCGTCAAAATAGTACG) (SEQ. ID No. 7) complementaria de la secuencia 5889-5937 y que corresponde a la secuencia peptídica YYFDDKGNGEYCFTNT, se sintetizaron, para fusionar el extremo C-terminal de la proteína delecionada con una etiqueta His presente en el vector de clonación. La reacción de PCR se realizó gracias a un DNA thermal cycler, modelo 2400 (Perkin-Elmer), con el sistema Expand Long Template System (Boehringer Mannheim), siguiendo el ciclo de temperatura: 94 °C durante 3 min, a continuación 25 ciclos con: 30 s a 94 °C, 30 s a 55 °C y 7 min a 68 °C. El producto de PCR se clonó a continuación en el vector donador pUNI, y el plásmido resultante, utilizado en una reacción de recombinación con el vector de expresión pCR-T7-AdsrE.

La preparación de los extractos celulares, las reacciones enzimáticas, el análisis de los productos de la reacción son los mismos que en el ejemplo 3 anteriormente.

El perfil de HPLC de los GOS obtenidos con la enzima DSR-E delecionada del dominio CD2 aparece en la figura 6 c).

Los GOS de tipo R, representados por los picos 5 y 7 visibles en la figura 6 a) y 6 b) están totalmente ausentes de los productos obtenidos con la enzima recombinante delecionada de CD2. Los únicos productos analizables son aquellos que corresponden a oligósidos lineales que resultan de enlaces a(1 ^ 6) con un residuo maltosa en la parte reductora. Este resultado indica claramente el papel esencial del dominio catalítico situado en la parte carboxi- terminal de la enzima en su capacidad para formar enlaces osídicos a(1 ^ 2).

Ejemplo 5: estudio de las relaciones estructura-función de la proteína DSR-E

El gen dsrE, dado que es el primer gen que codifica una dextrano-sacarasa que cataliza la síntesis de enlaces a(1^2) en haber sido clonado, reviste un interés particular. Por lo tanto, es importante caracterizar este gen así como su producto de expresión, en el caso en que se determina cuál es la implicación de los diferentes dominios que componen la proteína DSR-E en la función que le ha sido asignada, a saber de corresponder a una dextrano- sacarasa específica de la síntesis de enlaces a(1^-2).

5.1 Formas delecionadas de la proteína DSR-E:

El estudio de seis formas diferentes obtenidas por deleción de uno o de varios dominios de la proteína DSR-E se proyectó para determinar, en referencia a la figura 1 a continuación: (i) la influencia de la presencia del dominio CD2 estudiando las construcciones GBD-CD2 y A(CD2); (ii) la influencia de la presencia de la zona variable analizando las formas A(ZV) y CD1-GBD; y (iii) el potencial catalítico intrínseco de los dominios CD1 y CD2 expresados de forma aislada (construcciones CD1 y CD2).

La actividad catalítica de cada una de las diferentes formas se comparó con la observada con el control que corresponde a la forma completa delecionada del único péptido señal A(PS) [figura 1c)].

5

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15

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25

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35

40

45

50

5.2 Análisis de las construcciones:

Al finalizar el procedimiento experimental de amplificación por PCR y de clonación detallada anteriormente, se obtuvieron varios clones que presentan una inserción de acuerdo con la orientación esperada para cada una de las construcciones previstas, con la excepción de la forma truncada GBD-CD2 para la cual el producto de amplificación deseado no se pudo clonar.

Las secuencias de las inserciones se determinaron para asegurarse de la ausencia de mutaciones susceptibles de modificar, después de la traducción, aminoácidos situados a nivel de posiciones presumidas esenciales para la actividad enzimática de la proteína codificada de este modo.

Se identificó una mutación a nivel de la 31a base de la inserción con respecto a control A(PS), induciendo la sustitución de un ácido aspártico por una asparagina en posición 10 de la zona variable. Al no estar situada al nivel de los motivos repetidos S de la zona variable (figura 4), parecería que la incidencia de esta mutación sobre la función finalmente observada sería despreciable.

Se introdujo una mutación en el producto de amplificación correspondiente a la construcción A(CD2), que modifica el residuo aromático F1411 a leucina. Esta mutación está situada en el primer tercio del dominio de unión a glucano GBD, a nivel de una unión entre dos motivos repetidos.

La construcción A(ZV), habida cuenta de los errores efectuados por la polimerasa durante la reacción de amplificación por PCR, no presentaba la secuencia esperada. En efecto, la inserción contenía un marco abierto de lectura, correspondiendo dicho marco, en lo esencial, a la forma GBD-CD2 que no se había podido clonar. No obstante, en la forma GBD-CD2 obtenida en definitiva en lugar de A(ZV), los 46 residuos N-terminales estaban ausentes. Ahora bien, el dominio GBD cuenta con más de 800 aminoácidos que forman una concatenación de 24 unidades repetidas. Esta concatenación es tal que, en los 46 residuos truncados, solamente los 9 últimos estaban situados a nivel de una de dichas unidades, y en particular a nivel de la primera de ellas. Parecía en consecuencia plausible considerar que la deleción de estos aminoácidos no tenía influencia sobre la reacción enzimática catalizada por la forma proteica correspondiente. Esta hipótesis era tanto más verosímil en cuanto a que ha mostrado en otras dextrano-sacarasas, que la pérdida cierto número de unidades repetidas del dominio GBD no reducía la actividad de la proteína resultante de manera significativa (8).

La inserción que codifica la forma CD1-GBD contenía una mutación que afecta al residuo F633, situado en el dominio CD1, y más exactamente, a nivel de una región fuertemente conservada entre las dextrano-sacarasas, localizada a su vez justo antes del segundo ácido aspártico de la tríada catalítica (figura 5). La fenilalanina esperada estaba sustituida por una leucina. Es difícil, en esta fase, estimar el impacto de dicha mutación sobre la actividad catalítica observada.

De la misma manera que para las otras construcciones, se determina la secuencia de las inserciones que codifican los dominios catalíticos CD1 y CD2 aislados.

5.3 Productos de expresión y actividades enzimáticas:

Las proteínas que corresponden a las diversas formas delecionadas de DSR-E se expresaron sometiendo a las células recombinantes de E. coli a una inducción por L-arabinosa de acuerdo con una concentración del 0,002 %. La actividad enzimática se observó durante las cuatro primeras horas que seguían a la inducción.

Los extractos proteicos obtenidos por sonicación de los sedimentos celulares se analizaron en electroforesis SDS- PAGE (Sambrook y Russel, 2001, anteriormente). Las masas moleculares de las proteínas recombinantes se estimaron a partir de los perfiles electroforéticos obtenidos, correspondiendo dichas masas en lo esencial a las masas esperadas, teniendo en cuenta el aumento de 12 kDa asociado a la etiqueta de tiorredoxina. La tabla IV a continuación resume los valores estimados de las masas moleculares de las diferentes formas truncadas y proporciona, a modo de comparación, las masas esperadas.

TABLA IV:

Forma proteica

Masa esperada (kDa) Masa esperada + tiorredoxina (kDa) Masa estimada (kDa)

A (PS)

309 321 324

A (CD2)

218 230 ND

GBD-CD2

224 / 233

CD1-GBD

193 205 199

CD1

99 111 111

CD2

95 107 ND

ND: no determinada.

5

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15

20

25

30

35

40

45

En la tabla V siguiente, se indican la naturaleza y la posición de los aminoácidos que marcan el inicio y el fin de las formas proteicas construidas en el marco de este estudio. Las diferentes posiciones hacen referencia a la secuencia ID no. 2 que corresponde a la proteína DSR-E.

TABLA V:

Forma proteica

Aminoácido de inicio Aminoácido de fin Longitud total

A (PS)

N41 I2835 2795

A (CD2)

M1 L1980 1980

GBD-CD2

M1188 I2835 1648

CD1-GBD

I248 L1980 1733

CD1

I248 Q1141 894

CD2

D1981 I2835 855

La forma GBD-CD2 no poseía la etiqueta de tiorredoxina. En efecto, esta forma derivaba de los riesgos experimentales ocasionados por el procedimiento de amplificación por PCR de la secuencia que se supone que codifica la forma A(ZV). Habida cuenta de las deleciones de secuencias generadas entonces, la etiqueta de tiorredoxina, en principio situada en 5' de la proteína de interés, no se pudo fusionar con la región GBD-CD2.

La calidad de los geles de electroforesis no permitió determinar si el nivel de expresión de las diferentes formas era cuantitativamente idéntico y, en consecuencia, si dichas formas estaban presentes en las mismas proporciones en los extractos celulares.

También las medidas de actividad proporcionadas se establecieron sobre la base de un volumen dado de extractos celulares, pero no se pudieron llevar a la cantidad de cada proteína contenida realmente en dicho volumen de extractos.

La síntesis de polímeros de dextrano in situ por incubación de los geles de electroforesis en una solución de sacarosa, y la tinción con reactivo de Schiff posterior confirmaron la presencia de proteínas que poseen una actividad glucano-sacarasa en los extractos celulares que corresponden a A(PS), A(CD2), GBD-CD2 y CD1-GBD.

En la tabla VI a continuación, se presentan las actividades enzimáticas máximas observadas para cada construcción. Los resultados confirmaron los datos extraídos de los experimentos de tinción de los geles con reactivo de Schiff, a saber el hecho de que los extractos celulares relativos a las formas A(PS), A(CD2), GBD-CD2 y CD1- GBD presentaban una actividad sacarasa, al contrario que los dos dominios catalíticos tomados de forma aislada. Este resultado estaba conforme a la bibliografía, dado que se había demostrado para otras dextrano-sacarasas, que la ausencia del dominio GBD inducía una pérdida da actividad enzimática drástica (8, 9, 10).

TABLA VI:

Forma proteica

A (PS) A (CD2) GBD-CD2 CD1-GBD CD1 CD2

Actividad máxima (U/I)

1063 181 86 235 5,3 0

La forma CD1 poseía una actividad intrínseca de nivel suficiente para ser detectada. En cuanto a la forma GBD-CD2, ésta presentaba un nivel de actividad no despreciable, de la que se puede concluir que la organización estructural correspondiente, a saber un dominio catalítico cadena abajo del dominio de unión a glucano, seguía siendo enzimáticamente activa.

5.4 Efectos de las deleciones sobre la síntesis de oligósidos:

En la medida en que la especificidad de síntesis de los enlaces a(1^-2) se conserva durante la reacción en presencia de un aceptor, en primer lugar se efectuaron experimentos de síntesis de oligósidos a partir de maltosa (figura 7).

Cuando las reacciones se llevaron a término, es decir cuando toda la sacarosa se ha consumido, se calcularon los rendimientos de síntesis en oligósidos. Los resultados aparecen en la tabla VII siguiente. Solamente la reacción que implica el extracto celular que contiene la forma proteica CD1 no pudo permitir dicho cálculo. El efecto de la temperatura condujo probablemente a la inactivación de la muy baja actividad presente en el extracto proteico.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

TABLA VII:

Forma proteica

Rendimiento en oligósidos de la serie OD (%) Rendimiento en oligósidos de la serie R (%) Rendimiento en oligósidos totales

Enzima nativa

36 28 64

A (PS)

41 14 55

A CD2)

67 1 68

GBD-CD2

45 47 92

CD1-GBD

100 0 100

Como se indica en la figura 7 a continuación, la presencia de oligósidos de la serie R solamente se detectaba con las formas enzimáticas que poseen el dominio catalítico CD2, con la excepción del caso en que dicho dominio estaba aislado y entonces inactivado completamente. En efecto, los tiempos de retención de los oligósidos sintetizados por la forma delecionada del segundo dominio catalítico, así como por la forma CD1-GBD, correspondían únicamente a los de la serie OD, es decir a los GOS desprovistos de enlaces a(1^-2). Estos resultados indicaban, por lo tanto, que el dominio CD2 se requería para la formación de los enlaces a(1^-2).

Los productos obtenidos con la forma GBD-CD2 permitieron respaldar estas observaciones. Esta construcción, que poseía CD2 como único dominio catalítico, era capaz de catalizar de manera preponderante la síntesis de oligósidos de la serie R, que poseen enlaces a(1^-2). Este resultado demostraba, por lo tanto, que la especificidad en términos de función de la enzima DSR-E reside en la secuencia muy original de este dominio, y no en la asociación de dos dominios catalíticos. Además, la forma proteica GBD-CD2 permitía también la síntesis de enlaces a(1^6). Sin embargo, los bajos rendimientos obtenidos para estos oligósidos indicaban que se habían convertido preferentemente en oligósidos de grado de polimerización superior que pertenecen a la serie R, lo que impedía su acumulación en el medio de reacción, a diferencia de las moléculas de la serie R que, éstas, no se convirtieron (2).

Comparando los perfiles de los productos obtenidos, tal como se muestran en la figura 7, aparece que la forma completa A(PS) sintetizaba mayoritariamente oligósidos lineales. En efecto, la molécula R4 estaba ausente y el oligósido R5 presente escasamente. El dominio catalítico CD1 permitía, por su parte, catalizar la síntesis exclusiva de enlaces a(1^6) y su actividad parecía preponderante con respecto a la del dominio CD2. También, en la forma completa de la enzima, la implicación del dominio CD2 sería, por lo tanto, menos importante debido a: (i) parámetros catalíticos intrínsecos más bajos; y/o (ii) de una configuración global de la enzima desfavorable para su actividad.

Además, la enzima completa A(PS) catalizaba la síntesis de oligósidos de la serie R con un rendimiento inferior al observado con la mezcla de dextrano-sacarasas producida por L. mesenteroides NRRL B-1299 (figura 7). El rendimiento obtenido, del 28 %, estaba situado entre los observados con la forma completa A(PS) por un lado, y la forma GBD-CD2 por otro lado. Ahora bien, se sabe que la cepa silvestre produce varias formas de dextrano- sacarasas susceptibles de sintetizar enlaces osídicos, y concretamente enlaces a(1^2). Se formuló una hipótesis, de acuerdo con la cual dichas formas eran productos de degradación de DSR-E. De este modo, en la medida en que formas truncadas de DSR-E, tales como GBD-CD2, podían catalizar la síntesis de oligósidos de la serie R más eficazmente, parecería que los rendimientos obtenidos con la mezcla heterogénea producida por L. mesenteroides NRRL B-1299 fueran imputables a la contribución de las actividades catalíticas del conjunto de estas diferentes formas enzimáticas.

En conclusión, los inventores consiguieron, aislando una dextrano sacarasa particular producida por L. mesenteroides, caracterizar una estructura particular e inesperada de esta enzima capaz de producir oligósidos de interés y que presentan ramificaciones de tipo a(1^-2). La identificación y la caracterización de esta secuencia permiten, por un lado, construir células u organismos recombinantes que expresan de forma específica esta enzima y, por otro lado, prever su modificación mediante mutagénesis dirigida o aleatoria o mediante evolución molecular (DNA Shuffling) para mejorar aún más sus características.

Este aporte permite además mejorar el rendimiento y la reproducibilidad de la producción de los GOS de interés para las diferentes aplicaciones citadas anteriormente.

Referencias bibliográficas

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the maltose acceptor-products synthesised by Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299 dextransucrase.

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(4) Monchois V. Vignon M., Russel R.R.B. (1999). Isolation of key amino-acid residues at the N-terminal end of the core region of Streptococcus downei glucansucrase GTF-I. Appl. Microbiol. Biotechnol. 52, 660-665.

(5) Wilke-Douglas M., Perchorowicz J.T., Houck C.M., Thomas B.R. (1989). Methods and compositions for altering physical characteristics of fruit and fruit products. Patente PCT, WO 89/12386.

(6) Arguello-MOrales M.A., Remaud-Simeon M., Pizzut S., Sargabal P., Willemot R.M., Monsan P. (2000). Sequence analysis of the gene encoding alternansucrase, a sucrose glucosyltransferase from Leuconostoc mesenteroides NrRL B-1355. FEMS Microb. Lett. 182, 81-85.

(7) Devulapalle K.S., Goodman S., Gao Q., Hemsley A., Mooser G. (1997). Knowledge-based model of a glusocyltransferase from oral bacterial group of mutants streptococci. Protein Sci. 6, 2489-2493.

(8) Kato C., y Kuramitsu H.K. (1990). Carboxy-terminal deletion analysis of the Streptococcus mutans glucosyltransferase-I enzyme. FEmS Microbiol. Lett. 72, 299-302.

(9) Lis M., Shiroza T., y Kuramitsu H.K. (1995). Role of the C-terminal direct repeating units of the Streptococcus mutans glucosyltransferase-S in glucan binding. Appl. Env. Microbiol. 61, 2040-2042.

(10) Monchois V., Remaud-Simeon M., Russel R.R.B., Monsan P., y Willemot R.M. (1997). Characterization of Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F dextransucrase (DSR-S) and identification of amino-acid residues playing a key role in enzyme activity. Appl. Microbiol. Biotechnol. 48, 465-472

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Instituto Nacional de Ciencias Aplicadas de Toulouse (INSA)

<120> MOLÉCULA DE ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICA UNA DEXTRANO-SACARASA QUE CATALIZA LA SÍNTESIS DE DEXTRANO QUE PORTA RAMIFICACIONES DE TIPO ALFA-1,2 OSÍDICAS

<130> B4787AAAA JAZ

<140> EP xxxxxxxx <141> 27 de enero de 2012

<150> 0103631 <151> 16/03/2001

<150> 0116495 <151> 19/12/2001

<160> 17

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1 <211> 855 <212> PRT

<213> Leuconostoc mesenteroides <220>

<223> Dominio catalítico n° 2 <400> 1

Claims (3)

1. REIVINDICACIONES

   1. Utilización de una glucosiltransferasa capaz de formar dextranos que presentan ramificaciones a(1 ^ 2) a partir de sacarosa, de a-D-fluoro-glucosa, de para-nitrofenil-a-D-glucopiranósido, de a-D-glucopiranósido-aD-

   5 sorbofuranósido o de 4-O-a-D-galactopiranosilsacarosa, en la fabricación de una composición medicinal con efecto prebiótico destinada a mejorar el tránsito intestinal en animales o en el ser humano, comprendiendo dicha glucosiltransferasa una secuencia señal, una región variable, un primer dominio catalítico, un dominio de unión a glucano y un segundo dominio catalítico en la parte carboxílica de la glucosiltransferasa, y estando dicha glucosiltransferasa codificada por un ácido nucleico aislado, comprendiendo dicho ácido nucleico:

   10

   i) dos secuencias de ácido nucleico que codifican dichos dominios catalíticos, teniendo dichas secuencias de ácido nucleico al menos un 50 %, y preferentemente al menos un 80 % de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 3, y una secuencia que codifica el dominio de unión a glucano cuyo tamaño es superior a 500 aminoácidos, estando dicho dominio de unión a glucano situado entre las dos secuencias que codifican dichos dominios

   15 catalíticos; o

   ii) una secuencia que presenta al menos un 80 % de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 4.
2. 2. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el ácido nucleico aislado comprende la secuencia SEQ ID NO: 4.

   20
3. 3. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el ácido nucleico comprende una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia que codifica una dextrano sacarasa expresada por el plásmido pCR-7- dsrD depositado en la CNCM el 15 de marzo de 2001 con el número I-2649.

   CT>

   a)

   PS zv

   m------------

   rn-------

   O 35

   CD GBD

   niimmuinmiinmiimiiiiin

   1--------------------------------------------------1----------------------------------------1

   150 1100 1600

   PS zv

   b)

   DSR-E : 2835 aa

   c)

   A(PS): 2795 aa

   d)

   GBD-CD2: 1694 aa

   e)

   A(CD2): 1980 aa

   0

   A(ZV) : 2588 aa

   9)

   CD1-GBD: 1733

   h)

   CDI : 894 aa

   ¡)

   CD2: 855 aa

   CDI

   niiiiiiniiiuiiiimiiimj

   GBD

   CD2

   1111 n 1111111 n 11111111111 n

   llllllll I llUMIlllimillL

   imagen1

   nrmTiTinri

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   i ■ ■ ■

   ■íiiiiiimmiiimiiiiiiii

   imuinimiimnimmr

   imagen2

   11 u i n i iri 111 m 11 in i ii h l

   Fig. 1

   TTGAA_______ATAAAT

   promotor -!0<

   ATG

   imagen3

   dsrE

   Codón de terminación TAA

   Fig. 2

   IZZ2

   666 pb

   PCR

   llinúWi t-coRV

   EcoRW ___1___

   Bcn

   f/im

   5,6 kb

   p$B2

   F.coRV

   pSB3

   £cí>RV

   3,8 kb

   Fragmento de IPCR

   EcoRV

   I__

   3 6 kb

   ¿coRV

   ±J

   Fig. 3

   DSR-E

   mrdmrvi cdrkklyksgkvlvtag^ i falmmfgvttasvsa

   mfmikernvrkklixsgkswvigglilstimlsmtats—

   -MPFTEKVMRKKLYKVGKSWVVGG---VCAFALTAS____

   -MKQQETVTROt-YKSQKVWVAAATAFAVLGVSTVTTVHA-

   00

   Fig. 4

   73AAKWAVATTP-AT 06FVADKTVSA 95 PAADKAVDTTS S T T 10 9 PATDKAVDTTP-T T 122 PAADKAVDTTP-T T 135PAADKAVDTTP-TT 14 8PAANKAVDTTP-AT 161AATDKAV-ATP-AT 17 3 PAADKLA NT T-- AT

   185-----DKAVATTP-AT

   196fvankaa

   PAADKAVDTTP-

   4— Secuencia consenso propuesta para repetición S

   Fig.5

   A

   gtfb

   GTFI

   GTFS

   dsrS

   dsrA

   dsrB

   asr

   CD1

   CD2

   341 SAWNSDSEK---PFDDHLQN

   341 PQWNGESEK---PYDDHLQN

   327 NQWSIASENETVYPNQDHMQG

   444 PQWNETSED---MSNDHLQN

   181 PNWNIDSEA---KGDDHLQG

   426 PQWNMSSED---PKNDHLQN

   525 ANWNKQTEDEAF-DGLQWLQG

   423 ANWNIDSES---KGNDHLQG

   2120 FIWNKDSEYKG--GGDAWFQG

   c

   GTFB

   443 ANFDSIRVDAVDNVDADLLQI

   GTFI

   445 ANFDSIRVDAVDNVDADLLQI

   GTFS

   429 ANFDGVRVDAVDNVNADLLQI

   dsrS

   543 ANFDGIRVDAVDNVDADLLQI

   dsrA

   278 ANFDGYRVDAVDNVDADLLQI

   dsrB

   525 ANFDGIRVDAVDNVDADLLQI

   asr

   626 ANFDGIRVDAVDNVDADLLKI

   CD1

   519 ANFDGYRVDAVDNVDADLLQI

   CD2

   2202 ANFDSIRIDAVDFIHNDTIQR

   B

   402 GGYEFLLANDVDNSNPVVQAEQLN 404 CGYELLLANDVDNSNPIVQAEQLN 388 AGYELLLANDVDNSNPVVQAEQLN 502 GGFELLLANDVDNSNPVVQAEQLN 237 GGFELLLANDVDNSNPVVQAEQLN 484 GGFELLLANDVDNSNPVVQSEQLN 585 KGSEFLLANDIDNSNPIVQAEQLN 478 GGYEMLLANDVDNSNPVVQAEQLN 2161 NAFDFLLANDVDNSNPVVQAENLN

   D E

   484

   HLSILEAWSDND 555 YSFIRAHDSEVQDLI 928

   486

   HVSIVEAWSDND 557 YSFARAHDSEVQDLI 932

   470

   HLSILEAWSGND 540 YVFIPAHDSEVQTRI 915

   584

   HLSILEDWSHND 655 YSFVRAHDSEVQTVI 1024

   319

   IYQFWKTGEMKI 390 YSFIRAHDSEVQTII 765

   566

   HLSILEDWSHND 637 YSFVRAHDSEVQTVI 1005

   667

   HLSILEDWNGKD 759 YSFVRAHDYDAQDPI 1168

   560

   HISILEDWDNND 631 YAFIRAHDSEVQTVI 1014

   2243

   HISLVEAG--- 2315 Y S11HAHDKGVQEKV ★ » • * * *■ * 2689

   F

   DWVPDQMY DWVPDQMY DLVPNQLY DWVPDQIY DWVPDQIY DWVPDQIY

   DWVPDQIY DWVPDQIY DVVDNQVY * * - * ♦ *

   Fig. 6

   1

   2 4 A

   )iiA_j__

   1 a

   B

   -AJ

   * i 3 7 rÁxX^j__

   1

   3 C

   J

   liJ i_i

   imagen4

   L. m. B-1299

   m} od¡

   APS)

   ZV CDI GBD CD2

   A(PS)

   A(CD2j i’.’vvy-syyy?jxaxaaji

   GBD-CD2

   W/7//7—2—

   R5 °D5

   CD1

   GD2

   sva\ss

   A(CD2)

   OD4

   ODS

   Vi__/'

   GBD-CD2

   A 004 \ OD5

   Fig. 7

   CD1-GBD

   OD4

   0D5

   CD1

   CD2