ES2677153T3 - Métodos para estimular respuestas de células T específicas de antígenos - Google Patents

Métodos para estimular respuestas de células T específicas de antígenos Download PDF

Info

Publication number
ES2677153T3
ES2677153T3 ES14718603.5T ES14718603T ES2677153T3 ES 2677153 T3 ES2677153 T3 ES 2677153T3 ES 14718603 T ES14718603 T ES 14718603T ES 2677153 T3 ES2677153 T3 ES 2677153T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
cells
antigen
specific
disease
pbmc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES14718603.5T
Other languages
English (en)
Inventor
Roberto Mallone
Georgia Afonso
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Paris Descartes
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Paris Descartes
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Universite Paris Descartes filed Critical Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Application granted granted Critical
Publication of ES2677153T3 publication Critical patent/ES2677153T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2006—IL-1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/545—IL-1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2301—Interleukin-1 (IL-1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2304—Interleukin-4 (IL-4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2307—Interleukin-7 (IL-7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/25—Tumour necrosing factors [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/26—Flt-3 ligand (CD135L, flk-2 ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/555—Interferons [IFN]
    • G01N2333/57—IFN-gamma
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70514—CD4
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70517—CD8
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Un método para estimular respuestas de células T específicas de antígeno (Ag) en una muestra de sangre o muestra de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas de un sujeto que comprende la etapa que consiste en cultivar dicha muestra de sangre o PBMC en un medio de cultivo apropiado que comprende una cantidad de IL-1beta y una cantidad de al menos un antígeno, siempre que el medio de cultivo no contenga ningún agente diferenciador seleccionado del grupo que consiste en Factor Estimulador de Colonias de Granulocitos/Macrófagos (GM-CSF), IL-4 y ligando de tirosina quinasa 3 tipo FMS (Flt-3) y en el que la dosis efectiva mínima de IL-1beta es de 10 ng/ml.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
DESCRIPCION
Metodos para estimular respuestas de celulas T espedficas de antfgenos Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a metodos para estimular respuestas de celulas T espedficas de antigeno. Antecedentes de la invencion
El estudio de las respuestas de celulas T espedficas de antigeno (Ag) plantea desaffos tecnicos formidables [Kern, Trends Immunol. 26:477, 2005]. Esto se debe principalmente al hecho de que las fracciones espedficas de Ag se representan comunmente a frecuencias muy bajas en la sangre periferica, una caractenstica que hace que su deteccion sea problematica [Mallone, Clin. Immunol. 110:232, 2004]. Esta deteccion es incluso mas problematica cuando se consideran celulas T CD4+, ya que estas fracciones estan frecuentemente presentes a frecuencias incluso mas bajas que sus homologos CD8+ [Homann, Nat. Med. 7: 913, 2001; Seder, Nat. Immunol. 4:835, 2003]. Actualmente se encuentran disponibles varias estrategias de deteccion que permiten detectar tales celulas T espedficas de Ag (CD4+ y CD8+) usando una variedad de lecturas estructurales o funcionales [Kern, Trends Immunol. 26:477, 2005]. Sin embargo, un inconveniente compartido por todas las tecnicas es que las celulas T CD4+ espedficas de Ag rara vez se pueden detectar directamente ex vivo. Mas comunmente, estas celulas necesitan expandirse preliminarmente a traves de etapas de cultivo in vitro de 5-14 d para alcanzar el umbral de deteccion [Mallone, Clin. Immunol. 110:232, 2004]. Recientemente, se descubrio que es posible estimular las respuestas de celulas T espedficas de Ag cocultivandolas con celulas dendnticas de diferenciacion directamente de muestras de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) no fraccionadas o sangre periferica, usando cocteles de citoquina y condiciones de cultivo apropiadas (documento WO 2010/119033 y Martinuzzi, Blood 118: 2128, 2011). El metodo (denominado tecnologfa acDC), que proporciono ventajas considerables, consiste en a) cultivar una muestra de sangre o PBMC en un medio que comprende GM-CSF e iL-4 en presencia de un antfgeno, y luego b) madurar los DC con un coctel de moleculas tales como el factor de necrosis tumoral (TNF)-alfa, prostaglandina (PG)E2 e interleucina (IL)-1beta.
Sumario de la invencion
La presente descripcion se refiere a metodos para estimular respuestas de celulas T espedficas de antfgeno. En particular, la presente invencion se define por las reivindicaciones.
Descripcion detallada de la invencion
Los inventores han identificado en el presente que la etapa de diferenciacion de la tecnologfa de acDC no es obligatoria y que es posible, con una interleuquina unica (es decir, IL-1beta), estimular respuestas de celulas T espedficas de Ag de una PBMC o muestra de sangre.
Por lo tanto, la presente descripcion se refiere a un metodo para estimular respuestas de celulas T espedficas de antfgeno (Ag) en una muestra de sangre o muestra de PBMc aislada de un sujeto que comprende la etapa que consiste en cultivar dicha muestra de sangre o PBMC en un medio de cultivo apropiado que comprende una cantidad de IL-1beta y una cantidad de al menos un antfgeno.
El termino "PBMC" o "celulas mononucleares de sangre periferica" o "PBMC no fraccionadas", como se usa en el presente documento, se refiere a PBMC completas, es decir, a una poblacion de globulos blancos que tienen un nucleo redondo, que no se ha enriquecido para un sub-poblacion dada. Las celulas mononucleares de sangre del cordon umbilical se incluyen en esta definicion. Tfpicamente, la muestra de PBMC segun la presente descripcion no se ha sometido a una etapa de seleccion para contener unicamente PBMC adherentes (que consisten esencialmente en > 90% de monocitos) o PBMC no adherentes (que contienen celulas T, celulas B, celulas asesinas naturales (NK), celulas T NK y precursores de DC). Una muestra de PBMC segun la presente descripcion contiene, por lo tanto, linfocitos (celulas B, celulas T, celulas NK, celulas NKT), monocitos y precursores de los mismos. Tfpicamente, estas celulas se pueden extraer de sangre completa usando Ficoll, un polisacarido hidrofilo que separa las capas de sangre, formando las PBMC un anillo celular bajo una capa de plasma. Ademas, las PBMC se pueden extraer de la sangre completa usando una lisis hipotonica que lisara preferentemente los globulos rojos. Tales procedimientos son conocidos por los expertos en la tecnica.
La expresion "muestra de sangre" o "muestra de sangre no fraccionada", como se usa en este documento, se refiere a una muestra de sangre cruda que ha sido aislada de un sujeto y recogida en tubos u otros recipientes que contienen un anticoagulante apropiado (por ejemplo, heparina de litio o citrato de sodio). La sangre del cordon umbilical se incluye en esta definicion. La muestra de sangre es sangre entera no fraccionada y contiene plasma y celulas sangumeas (globulos rojos, globulos blancos). Puede ser una muestra de sangre recien aislada (<48 h) o una muestra de sangre que se haya obtenido previamente y que se mantenga congelada hasta su uso.
El termino "sujeto", como se usa en el presente documento, se refiere a un mairnfero, tal como un roedor (por ejemplo, un raton o una rata), un felino, un canino o un primate. En algunas realizaciones, dicho sujeto es un sujeto
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
humano. El sujeto de acuerdo con la presente descripcion puede ser un sujeto saludable o un sujeto que padezca una enfermedad dada.
Se puede usar cualquier medio de cultivo adecuado para el crecimiento, la supervivencia y la diferenciacion de PBMc. ^picamente, consiste en un medio base que contiene nutrientes (una fuente de carbono, aminoacidos), un tampon de pH y sales, que se puede complementar con suero de origen humano o de otro origen y/o factores de crecimiento y/o antibioticos a los que IL-1beta y el antigeno se agregan. Tfpicamente, el medio base puede ser medio RPMI 1640, DMEM, IMDM, X-VIVO o AIM-V, todos los cuales son medios estandar disponibles comercialmente.
En la realizacion de la presente descripcion en la que se cultiva una muestra de sangre en lugar de una muestra de PBMC, es prescindible el uso de dicho medio de base, y se puede anadir IL-1beta y el antigeno directamente a la sangre, que sirve como medio de cultivo.
Una caractenstica esencial de la presente descripcion es que el medio de cultivo no contiene ningun agente diferenciador como se describe en el documento WO 2010/119033, es decir, el Factor de Estimulacion de Colonias de Granulocitos/Macrofagos (GM-CSF) y/o IL-4 y/o ligando de tirosina quinasa 3 (Flt-3) tipo FMS. Asimismo, dichos agentes no se agregan a la muestra de sangre.
De acuerdo con la presente descripcion, la cantidad de IL-1beta se agrega directamente en la muestra una vez que se prepara (p. ej., Dfa 0 o Dfa 1, como se describe en los EJEMPLOS).
El cultivo celular se puede realizar a 37°C en una atmosfera al 5% de CO2, usando incubadoras de cultivo tisular adecuadas para este fin.
Como se usa en este documento, el termino "IL-1beta" tiene su significado general en la tecnica y se refiere a interleucina-1 beta. La dosis efectiva minima de IL-1beta es de 10 ng/ml. Puede ser IL-1p purificada o recombinante. IL-1p esta disponible comercialmente en diferentes compares, por ejemplo, R & D Systems o PeproTech.
En algunas realizaciones, se puede anadir IL-1beta en combinacion con al menos un agente seleccionado del grupo que consiste en factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), prostaglandina E2 (PGE2), anticuerpos monoclonales anti- CD40 (mAb), protemas quimericas recombinantes del ligando CD40 (CD40L), interferon-alfa (IFN-a), interferon- gamma (IFN-y), interleuquina-7 (IL-7), lipopolisacaridos (LPS), oligodesoxinucleotidos CpG, acido poliinosmico:policitidflico (poli I:C), Pam3CysSerLys4 (Pam3CSK4) e imiquimod. Se puede usar la combinacion de tales agentes. Dicho(s) agente(s) son agentes conocidos por estimular la respuesta inmune, y la persona experta podra seleccionar las concentraciones apropiadas.
En una realizacion, las respuestas de celulas T espedficas de Ag son respuestas de celulas T CD4+.
En otra realizacion, las respuestas de celulas T espedficas de Ag son respuestas de celulas T CD8+.
El termino "antfgeno" ("Ag"), como se usa en el presente documento, se refiere a protemas, peptidos, acidos nucleicos (p. ej., plasmidos de ADN) o preparaciones de tejidos o celulas capaces de provocar una respuesta de celulas T. En algunas realizaciones, dicho Ag es una protema que puede obtenerse mediante tecnologfa de ADN recombinante o mediante purificacion a partir de diferentes fuentes de tejidos o celulas. Dichas protemas no estan limitadas a las naturales, sino que tambien incluyen protemas modificadas o construcciones quimericas, obtenidas, por ejemplo, cambiando las secuencias de aminoacidos seleccionadas o fusionando porciones de protemas diferentes. En otra realizacion de la presente descripcion, dicho Ag es un peptido sintetico, obtenido mediante procedimientos bioqmmicos Fmoc, smtesis de peptidos multipin a gran escala, tecnologfa de ADN recombinante u otros procedimientos adecuados. En otra realizacion de la presente descripcion, dicho Ag es una protema o peptido codificado por un ADN u otra secuencia de acido nucleico adecuada que se ha introducido en las celulas mediante transfeccion, transduccion lentiviral o retroviral, transferencia de minigenes u otros procedimientos adecuados. En otra realizacion de la presente descripcion, el Ag es una preparacion de celulas o tejidos brutos (por ejemplo, celulas vivas o celulas/cuerpos apoptoticos) o una preparacion de celulas o tejidos parcialmente purificada obtenida por diferentes procedimientos bioqmmicos (por ejemplo, fijacion, lisis, fraccionamiento subcelular, separacion de gradiente de densidad) conocidos por los expertos en la tecnica.
En algunas realizaciones, dicho Ag es una protema que puede obtenerse mediante tecnologfa de ADN recombinante o mediante purificacion a partir de diferentes fuentes de tejidos o celulas. Tfpicamente, dicha protema tiene una longitud superior a 10 aminoacidos, preferiblemente superior a 15 aminoacidos, incluso mas preferiblemente superior a 20 aminoacidos sin lfmite superior teorico. Dichas protemas no estan limitadas a las naturales, sino que tambien incluyen protemas modificadas o construcciones quimericas, obtenidas, por ejemplo, cambiando las secuencias de aminoacidos seleccionadas o fusionando porciones de protemas diferentes.
En otra realizacion de la presente descripcion, dicho Ag es un peptido sintetico. Tfpicamente, dicho peptido sintetico tiene una longitud de 3-40 aminoacidos, preferiblemente de 5-30 aminoacidos de longitud, incluso mas preferiblemente de 8-20 aminoacidos de longitud. Los peptidos sinteticos pueden obtenerse mediante procedimientos bioqmmicos Fmoc, smtesis de peptidos multipin a gran escala, tecnologfa de ADN recombinante u
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
otros procedimientos adecuados. Dichos peptidos no se limitan a los naturales, sino que tambien incluyen peptidos modificados, peptidos modificados postraduccionalmente o peptidos quimericos, obtenidos, por ejemplo, cambiando o modificando las secuencias de aminoacidos seleccionadas o fusionando porciones de protemas diferentes.
En otra realizacion de la presente descripcion, dicho Ag es una protema o peptido codificado por un ADN u otra secuencia de acido nucleico adecuada que se ha introducido en las celulas mediante transfeccion, transduccion lentiviral o retroviral, transferencia de minigenes u otros procedimientos adecuados. Las celulas receptoras pueden ser celulas de terceros (por ejemplo, lmeas celulares obtenidas del mismo donante de PBMC/sangre o de donantes no relacionados) o las mismas celulas presentes en las PBMC no fraccionadas o muestras de sangre usadas para estimular respuestas de celulas T.
En otra realizacion de la presente descripcion, el Ag es una preparacion de tejido o celula (por ejemplo, celulas vivas o celulas/cuerpos apoptoticos) o una preparacion de tejido o celula bruta o parcialmente purificada obtenida por diferentes procedimientos bioqmmicos (por ejemplo, fijacion, lisis, fraccionamiento subcelular, separacion por gradiente de densidades) conocidos por los expertos en la tecnica.
El experto en la tecnica podra seleccionar el Ag apropiado, dependiendo de la estimulacion de celulas T deseada.
En algunas realizaciones, el metodo de la presente descripcion comprende ademas una etapa que consiste en detectar celulas T estimuladas.
Los metodos para la deteccion de celulas T estimuladas son conocidos por las personas expertas. Los procedimientos que se describen a continuacion proporcionan algunos ejemplos de metodos adecuados. Sin embargo, la persona experta en la tecnica puede interpretar facilmente que se puede usar cualquier metodo adecuado para evaluar la estimulacion de las celulas T en respuesta a un Ag.
En algunas realizaciones, dicho metodo puede consistir en un ensayo de inmunospot ligado a enzimas (ELISpot). Las celulas no adherentes de los pocillos de pre-cultivo se transfieren a una placa que ha sido recubierta con los anticuerpos de captura anti-citoquina deseados (Abs; por ejemplo, anti-IFN-Y, -IL-10, -IL-2, -IL-4). La revelacion se lleva a cabo con anticuerpos biotinilados secundarios y metodos de deteccion colorimetricos o fluorimetricos estandar tales como estreptavidina-fosfatasa alcalina y NBT-BCIP y las manchas son contadas. Las lecturas ELISpot se expresan entonces como celulas formadoras de manchas (SFC)/106 PBMC.
En algunas realizaciones, dicho metodo puede consistir en un ensayo de citocina sobrenadante. Las citocinas liberadas en el sobrenadante del cultivo se miden mediante diferentes tecnicas, tales como ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), matriz de perlas citometricas BD, ensayos de mutiplex de citoquinas de Biorad o Millipore y otros.
En algunas realizaciones, el metodo puede usar multimeros HLA Clase I o Clase II. Con este procedimiento, se detectan celulas T reactivas con Ag que reconocen epftopos espedficos de peptidos, usando reactivos disponibles en el mercado (por ejemplo, Pentameros Prolmmune MhC Clase I, Clase II Ultimers o Immudex MHC Dextramers) o generados internamente, por ejemplo, desde el NIH Tetramer Facility en Emory University, EE. UU.; del Dr. S. Buus, Universidad de Copenhague, Dinamarca [Leisner et al, PLoSOne 3: e1678, 2008], del Dr. G.T. Nepom, Benaroya Research Institute, Seattle, EE. UU. [Novak et al, J. Clin. Invest. 104:R63, 1999].
En algunas realizaciones, el metodo se basa en la deteccion de la regulacion por incremento de los marcadores de activacion (por ejemplo, CD69, CD25, CD137). Con este procedimiento, las respuestas de celulas T espedficas de Ag se detectan por su expresion diferencial de marcadores de activacion expuestos en la membrana despues del reconocimiento de Ag.
En algunas realizaciones, el metodo puede consistir en un ensayo de captura de citocina. Este sistema desarrollado por Miltenyi Biotech es una alternativa valida al ELISpot para visualizar celulas T espedficas de Ag segun su respuesta a las citocinas. Ademas, permite la clasificacion directa y la clonacion de las celulas T de interes (ver a continuacion).
En algunas realizaciones, el metodo puede consistir en un ensayo CD154. Este procedimiento ha sido descrito en detalle [Chattopadhyay et al, Nat. Medicina. 11:1113, 2005; Frentsch et al., Nat. Med. 11: 1118, 2005]. Esta limitado a la deteccion de celulas T CD4+ espedficas de Ag.
En algunas realizaciones, el metodo puede consistir en un ensayo CD107. Este procedimiento [Betts et al., J. Immunol. Methods 281: 65, 2003] permite la visualizacion de celulas T CD8+ espedficas de Ag con potencial citotoxico.
En algunas realizaciones, el metodo puede consistir en un ensayo de dilucion CFSE. Este procedimiento detecta celulas T espedficas de Ag (CD4+ y CD8+) de acuerdo con su proliferacion despues del reconocimiento de Ag [Mannering et al, J. Immunol. Methods 283: 173, 2003].
El metodo de la invencion puede encontrar diversas aplicaciones.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Por ejemplo, el metodo de la presente descripcion para estimular respuestas de celulas T espedficas de Ag puede ser util tanto para diagnosticar una enfermedad como para monitorizar los efectos inmunologicos de una terapia immune en varios entornos.
Tfpicamente, en esas realizaciones, se usan al menos antigenos asociados a la enfermedad en el metodo de la presente descripcion.
En algunas realizaciones, dicha enfermedad se selecciona del grupo que consiste en enfermedades autoinmunes. Este grupo incluye, pero no se limita a, diabetes tipo 1 (T1D), granulomatosis con poliangeitis (previamente granulomatosis de Wegener), enfermedad de Crohn, enfermedad celfaca y esclerosis multiple. En otra realizacion de la presente descripcion, dicha enfermedad se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad del cancer. Este grupo comprende, pero no se limita a, melanoma, cancer de colon, cancer renal y neoplasias hematologicas tales como leucemias, linfomas y mieloma multiple.
En otra realizacion, dicha enfermedad se selecciona del grupo que consiste en enfermedades infecciosas. Este grupo comprende, pero no se limita a, enfermedades causadas por agentes infecciosos tales como M. tuberculosis, VIH, virus de la hepatitis C, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, adenovirus, virus de la gripe.
En otra realizacion, dicha enfermedad es una enfermedad de injerto contra huesped que complica el trasplante de medula osea y procedimientos similares.
Para aplicaciones de diagnostico, el metodo de la presente descripcion puede usarse para detectar una o mas respuestas de celulas T espedficas de Ag que estan correlacionadas con la enfermedad, preferiblemente una enfermedad autoinmune. Por ejemplo, el metodo puede usarse para detectar respuestas de celulas T espedficas de preproinsulina o acido glutamico descarboxilasa (GAD) que estan correlacionadas con la diabetes tipo 1.
La expresion "monitorizar la terapia inmune", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la medicion de cambios en las respuestas de celulas T inducidas en un sujeto dado despues de la administracion in vivo de agentes inmunomoduladores. Para las aplicaciones de monitoreo, se encuentran diferentes tipos de situaciones, de acuerdo con el tipo de enfermedad. En las enfermedades autoinmunes, pueden usarse terapias inmunomoduladoras para mitigar las respuestas inmunes patologicas. Una estrategia para lograr este resultado se basa en intervenciones no espedficas de Ag basadas en una serie de agentes inmunomoduladores. Por ejemplo, agentes tales como ciclosporina A (Stiller et al., Science 223: 1362, 1984; Feutren et al., Lancet 19: 119, 1986; Bougneres et al., Diabetes 39: 1264, 1990), Daclizumab, micofenolato mofetilo, rapamicina, interleucina-2, anticuerpos monoclonales anti-CD3 (Herald et al, N. Engl. J. Med. 346: 1692, 2002; Keymeulen et al, N. Engl. J. Med. 352: 2598, 2005), anticuerpos monoclonales anti-CD20 tales como Rituximab (Pescovitz et al, N. Engl. J. Med. 361: 2143, 2009), autotrasplante de celulas madre hematopoyeticas de no mieloablacion (Voltarelli et al., JAMA 297: 1568, 2007), la infusion autologa de celulas sangumeas del cordon umbilical (Haller et al, Diabetes Care 32: 2041, 2009), las terapias adaptativas de celulas T reguladoras de la vitamina D, han sido, estan o probablemente seran probadas para la prevencion y/o intervencion de T1D. Un segundo enfoque se basa en estrategias espedficas de Ag, es decir, la administracion de un Ag relacionado con la enfermedad en una forma tolerogenica. Por ejemplo, agentes tales como (pro)insulina (DPT-1, N. Engl. J. Med. 346: 1685, 2002; Skyler et al., Diabetes Care 28: 1068, 2005; Nanto- Salonen et al., Lancet 372: 1746, 2008; Fourlanos et al, Diabetes 60: 1237, 2011), peptidos derivados de (pro)insulina (Orban et al, J. Autoinmun. 34:408, 2010; Thrower et al., Clin. Exp. Immunol. 155: 156, 2009), GAD (Ludvigsson et al, N. Engl. J. Med. 359: 1909, 2008; Wherrett et al., Lancet 378: 319, 2011; Axelsson et al., PLoS One 6: e29008, 2011; Ludvigsson et al, N. Engl. J. Med. 366:433, 2012), NBI-6024 (Alleva et al., Scand J. Immunol. 63:59, 2006), DiaPep277 (Raz et al., Diabetes Metab. Res. Rev. 23: 292, 2007) y combinaciones de los mismos, anti-CD3 en combinacion con Ags de celulas p (Bresson et al, J. Clin. Invest. 116: 1371, 2006), carga de DC Ag in vitro o in vivo (Mukhopadhaya et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 6374, 2008), multfmeros de epftopo HLA (Casares et al, Nat. Immunol. 3:383, 2002; Masteller et al., J. Immunol. 171: 5587, 2003; Mallone et al., Blood 106: 2798, 2005), L. lactis modificado transgenicamente para producir el Ag de interes (Takiishi et al, J. Clin. Invest. 122: 1717, 2012) han sido, estan o probablemente seran evaluados para la prevencion y/o intervencion de T1D.
En el cancer y las enfermedades infecciosas, la patogenesis no esta impulsada por respuestas inmunes patologicas, sino mas bien por celulas de los tejidos o agentes infecciosos que escapan al control del sistema inmune. Las respuestas inmunes contra el cancer o las celulas infectadas/agentes infecciosos son, por lo tanto, adaptaciones fisiologicas que intentan contrarrestar la enfermedad. Estos mecanismos fisiologicos pueden reforzarse terapeuticamente, usando estrategias no espedficas de Ag (por ejemplo, bloqueo de antfgeno 4 asociado a linfocitos T citotoxicos, solo o en combinacion con diversos agentes, en melanoma; Yuan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 20410, 2008; Maker et al., Ann. Surg. Oncol. 12: 1005, 2005) o enfoques espedficos de Ag, es decir, la administracion (denominada vacunacion) de Ag(s) relacionados con la enfermedad en una forma inmunogenica. Estos ultimos enfoques pueden llevarse a cabo administrando Ag(s) solos o en combinacion con diferentes agentes adyuvantes (por ejemplo, la administracion de Ag asociada a tumores en el melanoma; Di Pucchio et al., Cancer Res. 66:4943, 2006; Peterson et al., J. Clin. Oncol. 21: 2342, 2003; Bystryn et al., Clin. Cancer Res. 7: 1882, 2001); administrando DC pulsado con el Ag (por ejemplo, infusion de DC pulsada por Ag asociada al tumor en melanoma; Palucka et al., J. Immunother. 26:432, 2003; Banchereau et al., Cancer Res. 61: 6451, 2001; Thurner et al., J. Exp. Med. 190: 1669, 1999) o mediante transferencia adoptiva de celulas T espedficas de Ag asociadas a la enfermedad
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
(por ejemplo, infusion de celulas T espedficas de Ag asociadas a tumor en melanoma; Vignard et al., J. Immunol. 175:4797, 2005).
Por lo tanto, es de interes terapeutico seguir los cambios inmunes inducidos por tal intervencion. Las intervenciones exitosas debenan traducirse en una disminucion (en el caso de las enfermedades autoinmunes) o un aumento (en el caso del cancer y las enfermedades infecciosas) de las respuestas de las celulas T espedficas de Ag relacionadas con la enfermedad. Tales cambios en las respuestas de celulas T espedficas de Ag relacionadas con la enfermedad podnan ser cuantitativas (por ejemplo, cambio en la frecuencia de celulas T espedficas de Ag) o cualitativas (por ejemplo, cambio en el fenotipo y/o funcion de tales celulas T). La disponibilidad de estos marcadores sustitutos inmunes de eficacia clmica puede ser de gran utilidad para una variedad de aplicaciones. Por ejemplo: mejor seleccion de pacientes para tratar y agentes terapeuticos para usar basados en la respuesta inmune del paciente (por ejemplo, la administracion de GAD en pacientes que presentan respuestas de celulas T espedficas de GAD); optimizacion y/o adaptacion de dosis terapeuticas o regfmenes de administracion (por ejemplo, aumento en las dosis/frecuencia de administracion si no se registra un cambio inmune), mejorando asf la relacion riesgo-beneficio; la estratificacion pronostica de los pacientes tratados segun su probabilidad de responder al tratamiento; la decision de si tratar nuevamente a los pacientes basandose en el mantenimiento o no de los cambios inmunes inducidos.
El metodo para estimular las respuestas de celulas T espedficas de Ag de la presente descripcion puede, por lo tanto, ser muy util para monitorizar la induccion de estos cambios inmunes.
La expresion "antfgenos asociados a la enfermedad (Ags)", como se usa en el presente documento, se refiere a protemas o peptidos que constituyen los objetivos moleculares de una respuesta inmune. Dichos objetivos moleculares se expresan por el(los) tejido(s) o celula(s) dirigidos por la respuesta inmune. La expresion de Ags asociada a la enfermedad puede limitarse al tejido diana o extenderse a compartimentos corporales adicionales. Los Ags asociados a la enfermedad pueden identificarse inicialmente como objetivos de respuestas inmunes de autoanticuerpos o celulas T, o en base a su expresion selectiva por el tejido diana. Algunos ejemplos de antfgenos proteicos asociados a enfermedades son preproinsulina (PPI), acido glutamico descarboxilasa (GAD), protema 2 asociada a insulinoma (IA-2), protema relacionada con subunidad catalttica de glucosa-6-fosfatasa espedfica de islote (IGRP), transportador de zinc 8 (ZnT8) y cromogranina A para T1D; mieloperoxidasa y proteinasa 3 para granulomatosis con poliangitis; glicoprotema de oligodendrocitos de mielina (MOG) y protema basica de mielina (MBP) en la esclerosis multiple; gliadinas en la enfermedad celfaca; tirosinasa, melan-A, MART-1, gp100 y NY-ESO- 1 en cancer de melanoma; ESAT-6 para infeccion por M. tuberculosis; mordaza para la infeccion del VIH; y protema hexon para la infeccion por adenovirus.
Los ejemplos de Ags peptfdicos asociados a enfermedad se derivan de la protema Ags antes mencionada despues del procesamiento por celulas presentadoras de Ag, incluyendo DC, y la presentacion en el contexto de diferentes moleculas HLA de Clase I o Clase II. Por lo tanto, dichos peptidos Ags son diferentes dependiendo no solo de su fuente Ag, sino tambien de las moleculas HLA mediante las cuales se presentan. Por ejemplo, se puede encontrar una lista de Ags de peptidos asociado a T1D tanto para raton como para humano en DiLorenzo et al., Clin. Exp. Immunol. 148:1, 2007. Los antfgenos peptfdicos asociados a enfermedad tambien incluyen secuencias de aminoacidos modificadas postraduccionalmente y secuencias derivadas de isoformas de corte y empalme alternativas.
La expresion "antfgenos asociados a enfermedad" tambien se refiere a tejidos o celulas que constituyen los objetivos de una respuesta inmune. Los tejidos/celulas asociados a enfermedades pueden identificarse como objetivos de la enfermedad basandose en la fisiopatologfa y la presentacion clmica de dicha enfermedad. Algunos ejemplos de tejidos/celulas asociados a enfermedad son celulas beta pancreaticas productoras de insulina para T1D; oligodendrocitos en la esclerosis multiple; epitelio intestinal en la enfermedad celfaca; melanocitos malignos en el cancer de melanoma; M. tuberculosis para la infeccion por tuberculosis; y VIH para la infeccion por el VIH.
La respuesta inmune montada contra los Ags asociados a la enfermedad puede ser patologica (es decir, en el caso de enfermedades autoinmunes) o fisiologica, potencialmente beneficiosa, dirigida a limitar las consecuencias de otro proceso patologico en curso (es decir, en el caso del cancer o enfermedades infecciosas). En virtud de las respuestas inmunologicas patologicas o fisiologicas subyacentes a dichas enfermedades, la deteccion de tales respuestas se puede usar para diagnosticar estas enfermedades, o para seguir su evolucion natural o terapeuticamente modificada. Al medir las respuestas de las celulas T espedficas de Ag asociadas a la enfermedad, el metodo descrito en la presente memoria puede aplicarse, por lo tanto, tanto al diagnostico inmune como a la monitorizacion (por ejemplo, estadificacion inmune, seguimiento terapeutico) de dichas enfermedades.
La persona experta en la tecnica sabra como seleccionar Ags asociados a enfermedad apropiados. Tal seleccion se basa en una amplia gama de estrategias. Ejemplos de tales estrategias para Ags asociados a T1D se pueden encontrar en Wenzlau et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2007; Peakman et al., J. Clin. Invest. 1999; Nepom et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001; Arif et al., J. Clin. Invest. 2004; Toma et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005; Blancou et al., J. Immunol. 2007; Skowera et al., J. Clin. Invest. 2009; Scotto et al, Diabetes 2012; Scotto, Afonso et al., Diabetologia 2012. Las revisiones de tales estrategias para epftopos peptfdicos asociados a T1D se pueden encontrar en Di Lorenzo et al., Clin. Exp. Immunol. 148: 1, 2007 y en Martinuzzi et al, Ann. N.Y. Acad. Sci. 1150:61, 2008.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Otra aplicacion del metodo de la presente descripcion se refiere a su uso para el estudio in vitro de la inmunogenicidad (o tolerabilidad) de protemas terapeuticas.
La expresion "protemas terapeuticas", como se usa en el presente documento, se refiere a compuestos de protemas o peptidos de cualquier longitud de aminoacidos que se administran o se planifica que se administren in vivo a sujetos humanos para lograr un efecto terapeutico. Los ejemplos de tales protemas terapeuticas son, pero no se limitan a, Ags asociados a enfermedad (como se define anteriormente), anticuerpos de diferentes especies (en su forma nativa o parcialmente/totalmente humanizados), citocinas, hormonas o analogos de hormonas, factores de coagulacion, enzimas, protemas bacterianas o virales. Dichas protemas no estan limitadas a las naturales, sino que tambien incluyen protemas modificadas o construcciones quimericas, obtenidas, por ejemplo, cambiando las secuencias de aminoacidos seleccionadas o fusionando porciones de protemas diferentes.
Sin pretender imponer ninguna teona, existen dos entornos terapeuticos diferentes en los que la evaluacion de la inmunogenicidad de las protemas terapeuticas es relevante.
Una primera configuracion terapeutica se refiere al uso de Ags asociado a enfermedad (como se define anteriormente) para la administracion in vivo, con el objetivo de inducir un efecto tolerogenico (por ejemplo, en el caso de enfermedades autoinmunes) o un efecto inmunogenico (por ejemplo, en el caso del cancer o enfermedades infecciosas). Es importante evaluar primero in vitro el potencial para lograr dicho efecto terapeutico deseado.
En otros entornos terapeuticos, el objetivo no es inducir respuestas inmunogenicas de ningun tipo a la protema administrada, sino evitar tales respuestas para permitir que dicha protema alcance el efecto terapeutico para el que esta disenada. Ejemplo de tales configuraciones incluyen, sin limitacion, inmunoterapias basadas en citocinas, terapias de reemplazo hormonal y terapias de reemplazo para factores de coagulacion (por ejemplo, factor VIII en hemofilia A) o deficits enzimaticos (por ejemplo, beta-glucuronidasa en mucopolisacaridosis VII). En todas estas situaciones, no es deseable el montaje de respuestas inmunogenicas contra la protema administrada, ya que esto sena contraproducente para lograr el efecto terapeutico deseado (por ejemplo, efectos secundarios tales como smdromes de liberacion de citocina o neutralizacion/degradacion de la protema terapeutica).
Otra aplicacion del metodo de la presente descripcion se refiere a su uso para el estudio in vitro de adyuvantes de vacunas de posible relevancia en entornos terapeuticos humanos.
El termino "adyuvantes", como se usa en el presente documento, se refiere a agentes farmacologicos o inmunologicos que mejoran la inmunogenicidad de una vacuna mejorando la cantidad (es decir, frecuencia de celulas inmunes que responden) o la calidad de la respuesta inmune (por ejemplo, polifuncionalidad de las celulas T que responden) definida como la capacidad de dichas celulas T para producir multiples citocinas y/o ejercer multiples funciones efectoras, citotoxicidad contra celulas diana que presentan los Ag afines, y/o avidez funcional, definida como la fuerza de reconocimiento de los Ag afines por celulas T y la magnitud de las funciones efectoras resultantes de tal reconocimiento). La tecnologfa descrita se puede usar para definir in vitro la cantidad y/o calidad de respuestas de celulas T provocadas por la estimulacion con Ag en presencia de dichos adyuvantes.
Sin pretender imponer ninguna teona, los ejemplos de adyuvantes de vacunas incluyen ligandos del receptor tipo toll, citocinas, compuestos bacterianos, toxinas o toxoides (es decir, toxinas desprovistas de efectos toxicos).
Las tecnologfas descritas pueden usarse de manera similar para definir el potencial in vitro para un efecto tolerogenico in vivo de agentes que pueden atenuar la respuesta a Ag(s) dados. Dichos agentes pueden ser relevantes para aplicaciones in vivo, donde el(los) Ag(s) se administran para atenuar en lugar de para estimular respuestas inmunes contra dichos Ag(s), p.ej. en enfermedades autoinmunes o de injerto contra huesped.
Sin pretender imponer ninguna teona, los ejemplos de agentes tolerogenicos incluyen citocinas inmunomoduladoras tales como IL-10 o el factor de crecimiento transformante (TGF) -beta o protemas quimericas que interaccionan con receptores coestimuladores negativos tales como Ag Citotoxico T-Linfocito (CTLA)- 4-Ig o antagonista del receptor de IL-1.
Otra aplicacion del metodo de la presente descripcion es su uso para el descubrimiento de Ag o epftopos (tambien conocido como "mapeo"), es decir, para seleccionar Ags y epftopos con el fin de seleccionar aquellos que provocan una respuesta de celulas T espedficas de Ag.
El termino "epftopo", como se usa en el presente documento, se refiere a la porcion de una protema Ag reconocida por una celula T. Los epftopos son peptidos de diferente longitud de aminoacidos que se pueden unir a las moleculas de clase I o clase II del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). El complejo peptido-MHC asf formado puede ser reconocido por el receptor de celulas T (TCR) expresado en las celulas T, lo que conduce a la activacion de las celulas T y al montaje de respuestas de celulas T espedficas de Ag del epftopo.
Como Ags y epftopos son los objetivos moleculares definidos de las celulas T, a menudo es relevante identificar con precision tales objetivos para disenar protemas o peptidos apropiados para aplicaciones in vitro (p. ej., deteccion de respuestas de celulas T espedficas de Ag para diagnostico, pronostico o con fines terapeuticos) o para la administracion in vivo (por ejemplo, terapias tolerogenicas basadas en Ag o en epftopos en enfermedades
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
autoinmunes, o vacunas basadas en Ag o epftopos en cancer y enfermedades infecciosas). Ademas, la definicion de reglas comunes que rigen la union de epftopos a una molecula de MHC dada (p. ej., HLA-A2, A*02:01; o HLA-DR4, DR*04:01) y/o el desencadenamiento de la senalizacion de TCR y la activacion de celulas T a menudo se persigue con el objetivo de desarrollar algoritmos computarizados capaces de predecir el comportamiento de un epftopo dado. El desarrollo de tales algoritmos frecuentemente requiere la disponibilidad de grandes conjuntos de datos experimentales.
Dicho candidato Ag tambien pueden ser tejido(s) o celula(s) dirigidos por una respuesta inmune o cualquier tipo de celula revestida, cargada u obligada a expresar Ags o epftopos candidatos mediante tecnicas bioqmmicas o de biologfa molecular conocidas por los expertos en la materia.
Todavfa otra aplicacion del metodo de la presente descripcion se refiere a su uso para producir celulas T policlonales y lmeas de celulas T o clones que reconocen un Ag dado o una combinacion de Ags. Por consiguiente, la presente descripcion se refiere a un metodo para producir celulas T que muestran propiedades inmunologicas espedficas de un sujeto que comprende las etapas que consisten en realizar el metodo de la presente descripcion y aislar al menos una celula T que presenta al menos una propiedad inmunologica espedfica. Dichas propiedades inmunologicas espedficas incluyen, pero no se limitan a, el reconocimiento por las celulas T aisladas del Ag agregado durante la etapa a) y/o b). A modo de ejemplo, dichas propiedades inmunologicas espedficas tambien pueden incluir la produccion de IFN-y o la capacidad de ejercer efectos citotoxicos sobre las celulas que presentan el Ag reconocido. Las celulas T que producen IFN-y o que exhiben citotoxicidad pueden ser utiles, por ejemplo, para el tratamiento de cancer y enfermedades infecciosas. A modo de ejemplo, otra posible propiedad inmunologica espedfica puede ser la produccion de IL-10. Las celulas T que producen IL-10 se pueden usar como celulas T reguladoras para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.
El experto en la tecnica esta familiarizado con los metodos para expandir dichas celulas T espedficas de Ag una vez aisladas de una muestra de sangre o una muestra de PBMc, segun sea necesario. Se pueden encontrar ejemplos de tales metodos en Reijonen et al., Diabetes 51: 1375, 2002; Mallone et al., Blood 106: 2798, 2005; Mannering et al., J. Immunol. Methods 298: 83, 2005; Yee et al., J. Immunol. 162:2227, 1999; Mandruzzato et al., J. Immunol. 169:4017, 2002; Oelke et al., Nat.Med. 9: 619, 2003; Skowera et al., J. Clin. Invest. 118:3390, 2009.
El experto en la tecnica tambien esta familiarizado con metodos adecuados para aislar dichas celulas T espedficas de Ag en un estado viable basado en diferentes propiedades inmunologicas. Por ejemplo, la seleccion de celulas T productoras de IFN-y o IL-10 se puede obtener mediante ensayos de captura de citocina de Miltenyi. Como otro ejemplo, la seleccion de celulas T citotoxicas puede obtenerse basandose en la regulacion positiva de CD107 [Betts et al., J. Immunol. Methods 281: 65, 2003]. Como otro ejemplo mas, dichas celulas T pueden aislarse por medio de multfmeros MHC de Clase I o Clase II [Mallone et al., Diabetes 53: 971, 2004; Mallone et al., Blood 106: 2798, 2005; Skowera et al., J. Clin. Invest. 118:3390, 2008; Ladell et al, Immunity 38: 425, 2013].
La presente descripcion se ilustrara adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes del alcance de la presente invencion.
Figuras:
Figura 1. IL-1p es el ingrediente mmimo crftico para amplificar respuestas de celulas T de IFN-y espedficas de protema. (A) PBMC frescas no fraccionadas (106/pocillo en placas de fondo plano de 96 pocillos) se cultivaron en presencia (barras negras) o ausencia (barras blancas) de TTX y de diferentes combinaciones de citocinas anadidas en el dfa 0 (GM-CSF/IL-4, IL-4, GM-CSF, sin citoquinas o Flt3L, como se indica), luego el dfa 1, es decir, despues de las primeras 24 h (TNF-a, PGE2, 10 ng/ml de IL-1p y combinaciones de los mismos, como se indica, donde "Todos" significa TNF-a/PGE2/IL-1p).
Todas las condiciones tambien recibieron IL-7 (0,5 ng/ml) el dfa 1. Al final de estas 48 h, se realizo un ELISpot de IFN-y de 6 h segun se detalla en Metodos. Se muestra un experimento representativo de 3 realizados en tres donantes diferentes, con resultados expresados como IFN-y SFC/106 PBMC. Se muestran las medias ± SE del pocillo por triplicado. La lrnea de puntos indica respuestas de IFN-y espedficas de TTX obtenidas en ausencia de citocinas. (B) Resumen de los resultados obtenidos en 3 donantes diferentes y expresados como numeros de respuestas de IFN-y espedficas de TTX en comparacion con la condicion "sin citocinas". Cada barra representa la media ± numero de respuestas de SE de los 3 experimentos, donde los valores de cada experimento individual se basaron en la sustraccion basal (es decir, las respuestas TTX netas despues de la resta de las respuestas en ausencia de Ag). *p <0,05; **p <0,01. (C) La estimulacion con PBMC se realizo como antes en ausencia de citoquinas, con o sin la adicion de un anticuerpo bloqueante anti-IL1p en el dfa 0. La representacion de los datos es la misma que para el panel A y los resultados se refieren a un experimento representativo realizado en tres ocasiones distintas.
Figura 2. Una dosis de IL-1 p de 10 ng/ml anadida en el dfa 0 o en el dfa 1 es suficiente para amplificar las respuestas de celulas T de IFN-y espedficas de la protema Ag. (A) Se estimularon PBMC recientes no fraccionadas como en la Figura 1A en presencia (barras negras) o ausencia (barras blancas) de TTX, sin una adicion adicional de ninguna citocina, GM-CSF/IL-4 (dfa 0) seguido de TNF-a/PGE2/IL-1p/IL-7 (dfa 1) anadio o IL-1p solo (10 ng/ml) en el
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
d^a 0 o en el dfa 1. Al final de estas 48 h, se realizo un ELISpot de IFN-y de 6 h segun se detalla en Metodos. Se muestra un experimento representativo de 9 realizados en 9 donantes diferentes, con medias ± SE de pocillos por triplicado. (B) Resumen de los resultados obtenidos en 9 donantes diferentes y expresados como numero de respuestas de IFN-y espedficas de TTX en comparacion con la condicion "sin citocinas". La representacion de los datos es como para la Figura IB. *p <0,05. (C) Resumen de los resultados obtenidos en 5 donantes diferentes que comparaban diferentes concentraciones de IL-1p anadidas en el dfa 0 o en el dfa 1. La representacion de datos es como para la Figura 2B. *p = 0,06 comparado con GM-CSF/IL-4 + Todos.
Figura 3. Una dosis de IL-1p de 10 ng/ml anadida en el dfa 0 es suficiente para expandir las celulas T CD8+ espedficas de Ag del epftopo. Se estimularon PBMC frescas no fraccionadas (106/pocillo en placas de fondo plano de 96 pocillos) de un donante sano HLA-A2+ (HLA - A* 02:01) en presencia o ausencia de peptido Flu MP58-66 de restriccion de HLA-A2, con la adicion adicional de los cocteles de citocina indicados (donde "Todos" significa TNF- a/PGE2/IL-1p/IL-7), como se detalla en Metodos. Estos cultivos se tineron el dfa 10 con HLA-A2 TMrs cargado con peptido Flu MP58-66. Se muestran los eventos seleccionados en celulas CD8+ negativas a CD14/CD19/CD4 viables y se dan los porcentajes de celulas TMr+ fuera de la poblacion total de CD8+. Los resultados se refieren a un experimento representativo realizado tres veces.
Figura 4. La estimulacion con IL-1 p expande de manera eficiente tanto la memoria como las celulas T CD8+ espedficas del epftopo naive. (A) PbmC frescas no fraccionadas (106/pocillo en placas de 96 pocillos de fondo plano) de un donante sano HLA-A2+ (HLA-A * 02:01) se estimularon en presencia de Flu MP58-66 con restriccion de HLA-A2 o peptido Melan-A26-35ELA, con la adicion adicional de los cocteles de citoquina indicados (donde "Todos" significa TNF-a/PGE2/IL-1p/IL-7), como se detalla en Metodos. Estos cultivos se tineron el dfa 10 con HLA-A2 TMrs cargados con peptido Flu MP58-66 o Melan-A26-35ELA, como se indico. Cada condicion se tino con Flu y Melan-A TMrs para controlar la especificidad de Ag de la expansion. Las PBMC tenidas con estos TMrs directamente ex vivo se representan para comparar en la ultima fila. Se muestran los eventos seleccionados en celulas CD8+ cD14/CD19/CD4-negativas viables y se dan porcentajes de celulas TMr+ fuera de la poblacion total de CD8+ para cada grafica. La mediana de la intensidad de fluorescencia de la puerta TMr+ esta indicada adicionalmente para algunas grafica. Los resultados se refieren a un experimento representativo realizado tres veces. (B) Las celulas TMr+ de cultivos estimulados con IL-1p se clasificaron por celulas individuales y se expandieron como se detalla en Metodos. Se muestran clones CD8+ representativos obtenidos al final de esta expansion. Para la expansion espedfica de Melan-A, 11,7% (14/120) de los pocillos sembrados produjeron crecimiento visible, con 100% (14/14) de ellos analizando Ag-espedfico por tincion de Melan-A26-35ELA TMr. La tincion con un TMr HLA-A2 cargado con un peptido irrelevante se muestra para un mayor control.
Figura 5. IL-1 p no induce ninguna diferenciacion significativa de DC. Se estimularon PBMC frescas no fraccionadas (106/pocillo en placas de 96 pocillos de fondo plano) durante 48 h en presencia de los cocteles de citoquina indicados: GM-CSF/IL-4, Flt3L o IL-1p (10 ng/mL) en el dfa 0, seguido de TNF-a/PGE2/IL-1p/IL-7 ("Todos") en el dfa 1 en el caso de GM-CSF/IL-4 y Flt3L.
Al final de este cultivo de 48 h, se recuperaron las celulas adherentes y se tineron para los marcadores indicados. Los perfiles de expresion para cada coctel de citocinas se muestran (perfiles continuos) en comparacion con los obtenidos en ausencia de citocinas (los mismos anticuerpos usados, perfiles de puntos) y despues de la tincion con anticuerpos de control de isotipo (perfiles discontinuos). Los histogramas estan bloqueados en celulas CD19/CD3 negativas viables. Los resultados se refieren a un experimento representativo de tres independientes.
Ejemplo 1:
Metodos:
Antfgenos
El toxoide tetanico (TTX; Statens Serum Institut) fue > 99% puro y tema una concentracion de endotoxina <0,035 EU/|jg por ensayo de lisado Limulus (Lonza). Los peptidos de la protema de la matriz de la gripe (MP)58-66 (GILGFVFTL), el antfgeno del melanoma (Melan-A)27-35 (AAGIGILTV), Melan-A26-35ELA (ELAGIGILTV) teman una pureza > 85% (ChinaPeptides).
Estimulacion acelerada de celulas dendnticas co-cultivadas (acDC)
Se aislaron celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) y se usaron frescas como se describe previamente12. El dfa 0, las PBMC se pusieron en placas a 106/100 jl/pocillo en placas de fondo plano de 96 pocillos con medio AIM-V (Invitrogen) y las siguientes citoquinas se anadieron o no en diferentes combinaciones como se detalla en las leyendas de la figura: granulocitos/factor estimulante de colonias de macrofagos (GM-CSF; 1000U/ml; R & D Systems), interleucina (IL)-4 (500 U/ml; R&D), ligando de tirosina quinasa-3 tipo Fms (Flt3L; 50 ng/ml; R&D). Se anadieron antfgenos proteicos (4-40 ng/pL) al mismo tiempo en concentraciones ajustadas de acuerdo con las respuestas de cada donante. En experimentos seleccionados, se anadio un anticuerpo bloqueante anti-IL1p (clon AS10; R & D) a 10 pg/ml desde el inicio del cultivo, como se detalla en las leyendas de la figura. Despues de 24 horas (es decir, el dfa 1), se agregaron los siguientes reactivos en diferentes combinaciones, como se detalla en las leyendas de la figura: factor de necrosis tumoral (TNF)-a (1000 U/ml; R&D), IL-1p (10-50-100 ng/ml; R&D), IL-7 (0,5
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
ng/ml; R&D), IL-2 (0,5 U/ml; Proleukin), prostaglandina E2 (PGE2; 1 pM; Merck Calbiochem). Cuando se usaron, se anadieron antigenos peptfdicos cortos (es decir, cortados a la longitud optima para la union directa a la molecula de HLA-A2 de restriccion) en el d^a 1, a concentraciones (0,06-10 pM) individualmente valoradas para cada donante. El dfa 2 (es decir, 48 horas despues del inicio del cultivo), las celulas no adherentes se recogieron, lavaron y analizaron. En algunos experimented, las celulas adherentes se recuperaron para el analisis por citometna de flujo de la diferenciacion de DC (vease a continuacion).
Inmunospot ligado a enzimas (ELISpot)
Los ensayos de interferon (IFN)-y ELIspot se realizaron como se describio previamente3 Brevemente, se recubrieron placas de PVDF de 96 pocillos (Millipore) durante la noche con un anticuerpo anti-IFN-Y (U-Cytech). Las placas se lavaron y se bloquearon con RPMI (Invitrogen) suplementado con suero humano inactivado por calor al 10% (PAA). Al final de las 48 horas de estimulacion con acDC, las celulas no adherentes se lavaron, se resuspendieron en medio AIM-V recien preparado y se sembraron en placas de Elispot recubiertas a 105 celulas/pocillo en pocillos por triplicado. Despues de una incubacion de 6 horas a 37°C y CO2 al 5%, las placas se lavaron y el IFN-y detectado se revelo con un anticuerpo anti-IFN-Y conjugado con biotina (U-Cytech), extravidina conjugada con fosfatasa alcalina y tabletas de SigmaFast 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/nitroblue tetrazolio (BCIP/NBT) (ambos de Sigma). Los puntos se contaron en un lector Bioreader 5000 Pro-SF (BioSys) y se calcularon los pocillos por triplicado. Las lecturas ELISpot se expresan como celulas formadoras de manchas (SFC)/106 PBMC. El valor de corte para una respuesta positiva se establecio en 3SD por encima de la actividad basal promedio (es decir, en ausencia de antigeno). Estas respuestas de fondo espontaneas se muestran en cada grafico o se restan de las respuestas espedficas del antfgeno (Ag).
Expansion de celulas T CD8+ y analisis de tetramero de clase I Ag (HLA) en leucocitos humanos
Despues de 48 horas de estimulacion con acDC, se anadio suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (FBS, por sus siglas en ingles, PAA) a cada pocillo. Cada 2-3 dfas, la mitad del medio se reemplazo con RPMI fresco suplementado con 10% de SFB. El dfa 10 despues del inicio de la estimulacion de acDC, las celulas no adherentes se recuperaron y se tineron con tetrameros de HLA-A2 marcados con ficoeritrina (PE) (TMrs) cargados con Flu MP58- 66, Melan-A27-35 o Melan-A26-35ELA. Para este fin, las celulas se incubaron a ~ 0,5-1x106 celulas/200 pL en una solucion de dasatinib 50 nM durante 30 min a 37°C, se lavaron y se hicieron reaccionar con TMrs durante 20 min a temperatura ambiente (RT). Se anadio una premezcla de anticuerpos contra CD14/CD19 (PerCP-Cy5.5), CD4 (Alexa-700 o APC) y CD8 (APC o Alexa-700) durante 15 minutos a 4°C, despues de lo cual las celulas se incubaron con LiveDead Aqua (Invitrogen/Molecular Probes) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Despues del lavado, las celulas se fijaron con una solucion de paraformaldelddo al 3,2% durante 20 minutos a temperatura ambiente y se adquirieron en un citometro de flujo BD LSRFortessa. Para el analisis de tincion TMr, las celulas fueron la primera puerta en las celulas vivas, luego en los eventos negativos CD14/CD19 y en los CD4 negativos/CD8+.
Clonacion de celulas T
Para los experimentos de clonacion de celulas T, las celulas se tineron con TMr el dfa 10-12 como se indico anteriormente y las celulas CD8+ TMr+ individuales se clasificaron en cada pocillo de una placa con fondo en U de 96 pocillos utilizando un BD FACSAria II equipado con laseres de 488, 633 y 405 nm. Cada pocillo contema una mezcla de 2x105 celulas de alimentacion de PBMC irradiadas a 5.000 rad de 3 donantes diferentes en medio RPMI de 100 pL suplementado con 10% de SFB, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, 2 pg/ml de Fungizona, 5 % de Cellkine (Zeptometrix), 200 U/ml de IL-2, 25 ng/ml de IL-15 (R & D) y 1 pg/ml de PHA-L. Se verifico visualmente el crecimiento de las placas despues de 1-2 semanas y se transfirieron a placas de 48 pocillos para probar la especificidad de Ag por tincion de TMr y para una expansion adicional.
Fenotipado DC y agotamiento
Despues de 48 horas de estimulacion con acDC, las celulas adherentes se recuperaron y se tineron con anticuerpos anti-CD19, -CD80, -CD86, -HLA-DR, -CD14, -CD11c y con el marcador de viabilidad LiveDead. Para los analisis de DC, la puerta esta en las celulas negativas CD19/CD3 vivas.
Analisis estadfstico
Todos los analisis se realizaron con los softwares GraphPad Prism 5 y Flow Jo. Los valores de P se calcularon mediante la prueba t de Student emparejada o la prueba de rango con signo de Wilcoxon segun la distribucion.
Resultados:
En conjunto, los datos proporcionados muestran que IL-1beta es el ingrediente cntico mmimo necesario para la amplificacion eficiente de respuestas de celulas T espedficas de Ag utilizando los cultivos de acDC previamente descritos, en los que las DC se diferencian in situ de las PBMC en dos pasos: a) GM-CSF/IL-4 o Flt3L agregados en el dfa 0; y b) cocteles de TNF-alfa, PGE2, IL-1beta e IL-7 u otras citoquinas anadidas en el dfa 1. Los analisis combinatorios de cocteles en los que se omiten diferentes ingredientes indican que se obtienen resultados similares o mejores cuando se usa IL-1beta solo (Fig. 1). En otras palabras, la IL-1 beta sola es suficiente para amplificar
respuestas de celulas T espedficas de Ag en comparacion con cultivos de PBMC llevados a cabo en ausencia de citoquinas (Figura 1A-B). Esta amplificacion mediada por IL-1 beta tiene lugar tambien en condiciones no manipuladas, porque el bloqueo de iL-1 beta en PBMC cultivadas con Ag y en ausencia de citoquinas disminuye las respuestas de celulas T espedficas de Ag (Figura 1C). La dosis eficaz minima es de 10 ng/ml y la adicion en el dfa 0 5 o en el dfa 1 es equivalente para amplificar las respuestas de las celulas T IFN-y espedficas de la protema Ag (Fig. 2). Sin embargo, la adicion de IL-1beta en el dfa 0 es mas eficiente para expandir las celulas T CD8+ espedficas de Ag de epftopo y no es equivalente a una coestimulacion de citoquinas mas convencional en presencia de IL-2 o IL-7 (Figura 3). La expansion se obtiene tanto para la celulas T CD8+ espedficas de Ag para el epftopo nativo como de memoria (Figura 4A) y conduce a la generacion efectiva de clones de celulas T (Figura 4B). Finalmente, esta 10 amplificacion mediada por IL-1 beta de respuestas de celulas T espedficas de Ag no induce ninguna diferenciacion de DC detectable en comparacion con los protocolos de acDC descritos previamente (Figura 5). Por lo tanto, este metodo conlleva todas las ventajas descritas para los protocolos acDC previos haciendo uso de un solo ingrediente de citocina. Sin querer ser exhaustivo, las principales ventajas son: rapidez y sencillez de uso; sensibilidad de deteccion; requisitos irftnimos de sangre; posibilidad de detectar celulas T que reconocen multiples Ags o epitopes a 15 la vez trabajando con fuentes de Ag celulares, proteicas u otras crudas, haciendo que el epftopo preliminar y la identificacion HLA sean prescindibles; posibilidad de detectar celulas T CD4+ y CD8+; y la posibilidad de expandir celulas T espedficas de Ag, tanto CD4+ como CD8+. Si bien todas estas ventajas se comparten con los metodos acDC anteriores, los cultivos de acDC con IL-1 beta se caracterizan por una mejor facilidad de uso y un menor costo (al usar una unica citocina) y por una mayor amplificacion de las respuestas de las celulas T, lo que resulta a partir 20 de niveles de activacion de celulas T mas altas espedficas de Ag y/o de fondo mas bajo.
Referencias:
A lo largo de esta solicitud, varias referencias describen el estado de la tecnica a la que pertenece esta invencion.
1. Afonso G, Scotto M, Renand A, et al. Critical parameters in blood processing for T-cell assays: validation on ELISpot and tetramer platforms. J Immunol Methods. 2010;359(l-2):28-36.
25 2. Mallone R, Mannering SI, Brooks-Worrell BM, et al. Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear
cells for analysis of islet antigen-reactive T cell responses: position statement of the T-Cell Workshop Committee of the Immunology of Diabetes Society. Clin Exp Immunol. 2011;163(l):33-49.
3. Fourlanos S, Perry C, Gellert SA, et al. Evidence that nasal insulin induces immune tolerance to insulin in adults with autoimmune diabetes. Diabetes. 2011;60(4): 1237-45.
30 4. Martinuzzi E, Afonso G, Gagnerault MC, et al. acDCs enhance human antigen-specific T-cell responses. Blood.
2011;118(8):2128-2137.
5. Axelsson S, Cheramy M, Hjorth M, et al. Long-lasting immune responses 4 years after GAD-alum treatment in children with type 1 diabetes. PLoS One. 2011;6(12):e29008.
6. de Jongste AH, de Graaf MT, Martinuzzi E, et al. Three sensitive assays do not provide evidence for circulating 35 HuD-specific T cells in the blood of patients with paraneoplastic neurological syndromes with anti-Hu antibodies.
Neuro Oncol. 2012;14(7):841-8.
7. Iglesias MC, Briceno O, Gostick E, et al. Immuno dominance of HLA-B27- restricted HIV KK10-specific CD8(+) T- cells is not related to naive precursor frequency. Immunol Lett. 2013; 149(1-2): 119-22.

Claims (11)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para estimular respuestas de celulas T espedficas de antigeno (Ag) en una muestra de sangre o muestra de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) aisladas de un sujeto que comprende la etapa que consiste en cultivar dicha muestra de sangre o PBMC en un medio de cultivo apropiado que comprende una cantidad de IL-1beta y una cantidad de al menos un antigeno, siempre que el medio de cultivo no contenga ningun agente diferenciador seleccionado del grupo que consiste en Factor Estimulador de Colonias de Granulocitos/Macrofagos (GM-CSF), IL-4 y ligando de tirosina quinasa 3 tipo FMS (Flt-3) y en el que la dosis efectiva minima de IL-1beta es de 10 ng/ml.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el antfgeno se selecciona del grupo que consiste en protemas, peptidos, acidos nucleicos o preparaciones de tejidos o celulas.
  3. 3. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el antfgeno es un antfgeno asociado a enfermedad.
  4. 4. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el antfgeno es una protema terapeutica.
  5. 5. El uso del metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para diagnosticar una enfermedad o para controlar el tratamiento de una enfermedad, tal como la terapia inmune.
  6. 6. El uso de la reivindicacion 5, en el que la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en enfermedades autoinmunes, enfermedades del cancer y enfermedades infecciosas.
  7. 7. El uso del metodo segun la reivindicacion 4 para estudiar la inmunogenicidad de la protema terapeutica.
  8. 8. El uso del metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 para estudiar un adyuvante de vacuna.
  9. 9. El uso del metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 para estudiar el efecto tolerogenico de un agente.
  10. 10. El uso del metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 para el mapeo de epitopes.
  11. 11. El uso del metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 para producir celulas T policlonales y lmeas de celulas T o clones que reconocen un Ag dado o una combinacion de Ags.
ES14718603.5T 2013-04-23 2014-04-22 Métodos para estimular respuestas de células T específicas de antígenos Active ES2677153T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13305530 2013-04-23
EP13305530 2013-04-23
PCT/EP2014/058051 WO2014173858A1 (en) 2013-04-23 2014-04-22 Methods for stimulating antigen-specific t cell responses

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2677153T3 true ES2677153T3 (es) 2018-07-30

Family

ID=48193236

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES14718603.5T Active ES2677153T3 (es) 2013-04-23 2014-04-22 Métodos para estimular respuestas de células T específicas de antígenos

Country Status (5)

Country Link
US (1) US9708583B2 (es)
EP (1) EP2989459B1 (es)
JP (1) JP6474788B2 (es)
ES (1) ES2677153T3 (es)
WO (1) WO2014173858A1 (es)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016180852A1 (en) 2015-05-12 2016-11-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for preparing antigen-specific t cells from an umbilical cord blood sample
KR20180040706A (ko) * 2015-09-01 2018-04-20 인네이트 튜머 이뮤니티, 인코포레이티드 면역억제 시토카인에 대해 증가된 면역 또는 저항성을 갖는 면역 세포 및 그의 용도
US11781112B2 (en) * 2016-03-06 2023-10-10 Kareem Thomas Robinson Method of generating antigen-specific immunological memory in a subject that rejects classical vaccines
CN109810945A (zh) * 2019-01-31 2019-05-28 金浩范 一种自体γδ-Τ细胞制备方法及实施该方法的试剂盒

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009013166A (ja) * 2007-06-04 2009-01-22 Osaka Prefecture Univ 腫瘍治療用組成物およびその応用
CN102026647B (zh) * 2008-03-28 2013-08-21 桃太郎源株式会社 诱导单核细胞的树突状细胞样分化并提高抗癌免疫活性的用于癌症治疗或预防的医药组合物
WO2010119307A1 (en) * 2009-04-14 2010-10-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method for stimulating antigen-specific t cell responses using accelerated co-cultured dendritic cells
WO2012002582A1 (ja) * 2010-07-01 2012-01-05 国立大学法人岡山大学 REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチド

Also Published As

Publication number Publication date
JP6474788B2 (ja) 2019-02-27
JP2016519925A (ja) 2016-07-11
EP2989459B1 (en) 2018-06-13
US20160068808A1 (en) 2016-03-10
US9708583B2 (en) 2017-07-18
EP2989459A1 (en) 2016-03-02
WO2014173858A1 (en) 2014-10-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4714767B2 (ja) ヒト血液由来のｃｄ４＋ｃｄ２５＋調節ｔ細胞
Jin et al. The effects of TLR activation on T‐cell development and differentiation
JP5776684B2 (ja) 促進された共培養樹状細胞を使用して抗原特異的ｔ細胞応答を刺激するための方法
KR102768442B1 (ko) CD8+CD45RClow TREGS의 신규한 아집단 및 이들의 용도
RU2009122204A (ru) Микроорганизмы и их фракции, индуцирующие специфичный к углеводу клеточный иммунитет
Hirayama et al. Overcoming regulatory T‐cell suppression by a lyophilized preparation of Streptococcus pyogenes
TWI572718B (zh) 免疫抑制細胞及其製造方法和組成物
JP2022503505A (ja) 腫瘍関連反応性免疫細胞（ｔｕｒｉｃ）の製造及び選択
ES2677153T3 (es) Métodos para estimular respuestas de células T específicas de antígenos
EP2016414B1 (en) T-cell vaccine
US7659084B2 (en) Methods for detecting and isolating antigen-specific T lymphocytes with CD40/C154 inhibitors
Oka et al. WT1 peptide vaccine as a paradigm for “cancer antigen-derived peptide”-based immunotherapy for malignancies: successful induction of anti-cancer effect by vaccination with a single kind of WT1 peptide
WO2021119293A2 (en) T-cell epitopes of human parainfluenza virus 3 for adoptive t-cell immunotherapy
Li et al. An in vivo MAIT cell activation and rejuvenation system for liver cancer therapy
Magno et al. Engineering T Cells with a Tumor-Reactive Chimeric T Cell Receptor Reduces Exhaustion and Promotes Persistence to Elicit Enhanced Antitumor Responses
Vadakekolathu Characterisation of high and low avidity peptide specific CD8+ T cells using immunologic, transcriptomic and proteomic tools
Lehtimaki Staphylococcus aureus as a source of antigens stimulating bovine dendritic cells and lymphocytes in vitro
Peng Methods and Applications of Immunomodulating Assays
Flavell Invited Speaker Abstracts BSI 2014
CN106986932A (zh) 一种c‑Met表位肽及其应用