ES2677353T3

ES2677353T3 - Procedimiento abreviado de purificación para la producción de polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae

Info

Publication number: ES2677353T3
Application number: ES11194173.8T
Authority: ES
Inventors: Yonghui Yuan; Mark Ruppen; Wei-Qiang Sun; Ling Chu; John Simpson; James Patch; Pamela Fink Charbonneau; Justin K. Moran
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 2007-03-23
Filing date: 2008-03-20
Publication date: 2018-08-01
Anticipated expiration: 2028-03-20
Also published as: MY150927A; MX2009010221A; DK3406635T3; PT2436700T; ES2922132T3; JP2010521972A; CA2681570A1; CN101663327A; PL2129693T3; CL2008000831A1; EP2129693B1; CO6251324A2; EP2436700B1; JP2019048844A; ES2614249T3; US20080286838A1; SI2436700T1; HUE059085T2; DK2436700T3; CA2681570C

Abstract

Un procedimiento de producción de polisacáridos capsulares purificados a partir de un lisado celular de Streptococcus pneumoniae, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) proporcionar un caldo de fermentación que comprende células bacterianas que producen un serotipo seleccionado de Streptococcus pneumoniae; (b) lisar las células bacterianas en la etapa (a) con un agente lítico, produciendo de ese modo un lisado celular que comprende desechos celulares, proteínas solubles, ácidos nucleicos y polisacáridos; (c) aclarar el lisado celular de la etapa (b) usando centrifugación o filtración para retirar los desechos celulares, produciendo de ese modo un lisado celular aclarado; (d) ultrafiltrar y diafiltrar el lisado celular aclarado de la etapa (c) para retirar las impurezas de bajo peso molecular y aumentar la concentración de polisacárido, produciendo de ese modo un retenido; (e) disminuir el pH del retenido de la etapa (d) hasta menos de 4,5 usando un ácido orgánico o uno mineral para precipitar las proteínas y los ácidos nucleicos, formando de ese modo una solución acidificada de retenido; (f) mantener la solución acidificada de retenido formada en la etapa (e) durante un tiempo suficiente para permitir la sedimentación del precipitado, seguido por filtración o centrifugación de la solución acidificada de retenido, produciendo de ese modo una solución aclarada de polisacárido; (g) filtrar la solución aclarada de polisacárido de la etapa (f) a través de un filtro de carbono activado; (h) ultrafiltrar y diafiltrar la solución filtrada producida por la etapa (g), produciendo de ese modo una solución concentrada de polisacárido purificado; y (i) filtrar la solución concentrada de polisacárido purificado producida por la etapa (h) usando un filtro estéril; mediante lo cual se producen polisacáridos capsulares purificados en forma de una solución.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento abreviado de purificacion para la produccion de polisacaridos capsulares de Streptococcus pneumoniae

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a procedimientos para retirar el exceso de protema soluble y otras impurezas de lisados celulares de serotipos de Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) usados en la produccion de polisacaridos purificados de neumococos.

Antecedentes de la invencion

Streptococcus pneumoniae son cocos gram-positivos con forma de lanceta que se observan habitualmente en parejas (diplococos), pero tambien en cadenas cortas o como celulas individuales. Crecen facilmente en placas de agar con sangre con colonias brillantes y presentan alfa hemolisis salvo que crezcan de forma anaerobica donde muestran beta hemolisis. Son sensibles a las sales biliares que pueden descomponer la pared celular con la presencia de la propia enzima de las celulas, autolisina. El organismo es un anaerobio aerotolerante y es exigente porque tiene necesidades nutritivas complejas.

Las celulas de la mayona de los serotipos de neumococos tienen una capsula que es un polisacarido de recubrimiento que rodea cada celula. Esta capsula es un determinante de virulencia en seres humanos porque impide la fagocitosis evitando que los anticuerpos ataquen a las celulas bacterianas. Actualmente existen 90 serotipos capsulares identificados, con 23 serotipos responsables de aproximadamente el 90 % de enfermedades invasivas. Como vacuna, el polisacarido puede conferir un grado razonable de inmunidad contra S. pneumoniae en individuos con sistemas inmunitarios desarrollados o no alterados. Sin embargo, cuando el polisacarido se conjuga con una protema de alto peso molecular tal como CRM197 y se formula en una vacuna que contiene conjugados de multiples serotipos, dichas vacunas de conjugado permiten una respuesta inmunitaria en lactantes y en ancianos que son los que estan en mayor riesgo de infecciones por neumococos.

El polisacarido capsular para cada serotipo de S. pneumoniae utilizado para productos de vacuna se produce cultivando el organismo en medio lfquido. La poblacion del organismo a menudo se aumenta en escala desde un vial de siembra hasta frascos de siembra y se pasa a traves de uno o mas fermentadores de siembra de volumen creciente hasta que se alcanzan los volumenes de fermentacion a escala de produccion. El final del ciclo de crecimiento puede determinarse por uno de varios medios, punto en el cual las celulas se lisan a traves de la adicion de un detergente u otro reactivo que ayude en la descomposicion de la pared celular y libere autolisina que causa la lisis celular cuando las celulas alcanzan la fase estacionaria. El caldo despues se recoge para procesamiento corriente abajo (purificacion). Los contaminantes principales son protemas celulares, acidos nucleicos, polisacarido- C y componentes del medio.

Para la mayona de los serotipos para la vacuna 7-valente de conjugado de neumococos (7vPnC) actualmente comercializada (Prevnar®), asf como la vacuna 13-valente de conjugado de neumococos (13vPnC) recientemente desarrollada, el procedimiento actual de purificacion requiere dieciseis etapas que incluyen muchas operaciones caras, muy laboriosas y exigen mucha tecnologfa, tal como cromatograffa y multiples separaciones en membrana. Los intentos previos de mejorar los procedimientos de purificacion para polisacaridos de S. pneumoniae han incluido, por ejemplo, manipulacion del pH durante la fermentacion y la recuperacion (vease la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2006/0228381) y precipitacion con disolvente y detergente. Sin embargo, la retirada de impurezas en estos procedimientos aun se extiende sobre muchas etapas muy laboriosas y costosas. El nivel de protemas es la especificacion mas problematica de cumplir debido a las propiedades ffsicas y qmmicas de las protemas solubles.

Por tanto, existe una necesidad de un procedimiento de purificacion simplificado para reducir los niveles de protema soluble en lisados de S. pneumoniae y eliminar las ineficacias del actual procedimiento de purificacion de produccion de polisacaridos capsulares sustancialmente purificados adecuados para su incorporacion en vacunas de conjugado de neumococos.

Sumario de la invencion

La presente invencion se refiere a un procedimiento de produccion de polisacaridos capsulares sustancialmente purificados a partir de un lisado celular de Streptococcus pneumoniae. Este procedimiento comprende las etapas de:

(a) proporcionar un caldo de fermentacion que comprende celulas bacterianas que producen un serotipo seleccionado de Streptococcus pneumoniae;

(b) lisar las celulas bacterianas en la etapa (a) con un agente lttico, produciendo de ese modo un lisado celular que comprende desechos celulares, protemas solubles, acidos nucleicos y polisacaridos;

(c) aclarar el lisado celular de la etapa (b) usando centrifugacion o filtracion para retirar los desechos celulares, produciendo de ese modo un lisado celular aclarado;

(d) ultrafiltrar y diafiltrar el lisado celular aclarado de la etapa (c) para retirar las impurezas de bajo peso

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molecular y aumentar la concentracion de polisacarido, produciendo de ese modo un retenido;

(e) disminuir el pH del retenido de la etapa (d) hasta menos de 4,5 usando un acido organico o uno mineral para precipitar las protemas y los acidos nucleicos, formando de ese modo una solucion acidificada de retenido;

(f) mantener la solucion acidificada de retenido formada en la etapa (e) durante un tiempo suficiente para permitir la sedimentacion del precipitado, seguido por filtracion o centrifugacion de la solucion acidificada de retenido, produciendo de ese modo una solucion aclarada de polisacarido;

(g) filtrar la solucion aclarada de polisacarido de la etapa (f) a traves de un filtro de carbono activado;

(h) ultrafiltrar y diafiltrar la solucion filtrada producida por la etapa (g), produciendo de ese modo una solucion concentrada de polisacarido purificado; y

(i) filtrar la solucion concentrada de polisacarido purificado producida por la etapa (h) usando un filtro esteril;

mediante lo cual se producen polisacaridos capsulares sustancialmente purificados en forma de una solucion. Los serotipos no limitantes ejemplares de S. pneumoniae seleccionados para esta realizacion de la invencion son 1,4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19a, 19F, y 23f. En una realizacion particular, el pH de la etapa (e) se disminuye hasta aproximadamente 3,5. En otra realizacion, la diafiltracion de la etapa (h) comprende un ajuste de pH entre aproximadamente 5,5 hasta aproximadamente 7,5. En otra realizacion, la diafiltracion de la etapa (h) comprende un ajuste de pH entre aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,5. En otra realizacion, la diafiltracion de la etapa (h) comprende un ajuste de pH hasta aproximadamente 7,4. En otra realizacion mas, la etapa (e) retira al menos el 98 % de las protemas del retenido de la etapa (d). En otra realizacion, la etapa (g) retira al menos el 90 % de las protemas de la solucion aclarada de polisacarido de la etapa (f). En otra realizacion, el filtro de carbono activado de la etapa (g) comprende carbono activado con acido fosforico basado en madera. En otra realizacion, la etapa (f) comprende mantener la solucion acidificada de retino formada en la etapa (e) durante al menos 2 horas. En otra realizacion mas, el agente lftico de la etapa (b) es desoxicolato sodico (DOC). En otra realizacion, el agente lftico de la etapa (b) es un agente lftico de origen no animal. En otra realizacion mas, el agente lftico de la etapa (b) es el agente lftico de origen no animal N-lauril sarcosina sodica (NLS).

El polisacarido capsular sustancialmente purificado producido por un procedimiento de la invencion a partir de un lisado celular de Streptococcus pneumoniae puede usarse en la fabricacion de una vacuna de neumococos, preferentemente una vacuna de neumococos que contiene polisacarido conjugado con un vehmulo proteico.

La presente invencion tambien se refiere a un procedimiento de produccion de polisacaridos capsulares sustancialmente purificados a partir de un lisado celular de Streptococcus pneumoniae que comprende el serotipo 1,

4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F o 23F. Este procedimiento comprende las etapas de:

(a) proporcionar un caldo de fermentacion que comprende celulas bacterianas que producen Streptococcus pneumoniae serotipo 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F o 23F;

(b) lisar las celulas bacterianas en la etapa (a) con un agente lftico, produciendo de ese modo un lisado celular que comprende desechos celulares, protemas solubles, acidos nucleicos y polisacaridos;

(d) ultrafiltrar y diafiltrar el lisado celular aclarado de la etapa (c) a temperatura ambiente a pH neutro en medio sin sal para retirar las impurezas de bajo peso molecular y aumentar la concentracion de polisacarido, produciendo de ese modo un retenido sin sal;

(e) disminuir el pH del retenido sin sal de la etapa (d) hasta menos de 4,5 usando un acido organico o uno mineral para precipitar las protemas y los acidos nucleicos, formando de ese modo una solucion acidificada de retenido;

(f) mantener la solucion acidificada de retenido formada en la etapa (e) durante al menos 2 horas a temperatura ambiente para permitir la sedimentacion del precipitado, seguido por filtracion o centrifugacion de la solucion acidificada de retenido, produciendo de ese modo una solucion aclarada de polisacarido;

mediante lo cual se producen polisacaridos capsulares sustancialmente purificados que comprenden el serotipo 1, 4,

5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F o 23F en forma de una solucion. En una realizacion particular, el pH de la etapa (e) se disminuye hasta aproximadamente 3,5. En otra realizacion, la diafiltracion de la etapa (h) comprende un ajuste de pH entre aproximadamente 5,5 hasta aproximadamente 7,5. En otra realizacion, la diafiltracion de la etapa (h) comprende un ajuste de pH entre aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,5. En otra realizacion, la diafiltracion de la etapa (h) comprende un ajuste de pH hasta aproximadamente 7,4. En otra realizacion mas, la etapa (e) retira al menos el 98 % de las protemas del retenido sin sal de la etapa (d). En otra realizacion, la etapa (g) retira al menos el 90 % de las protemas de la solucion aclarada de polisacarido de la etapa (f). En otra realizacion, el filtro de carbono activado de la etapa (g) comprende carbono activado con acido fosforico basado en madera. En otra realizacion mas, el agente lftico de la etapa (b) es desoxicolato sodico (DOC). En otra realizacion, el agente lftico de la etapa (b) es un agente lftico de origen no animal. En otra realizacion mas, el agente lftico de la etapa (b) es el agente lftico de origen no animal N-lauril sarcosina sodica (NLS).

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La presente invencion tambien se refiere a un proceso de produccion de polisacaridos capsulares sustancialmente purificados a partir de un lisado celular de Streptococcus pneumoniae que comprende el serotipo 19A. Este procedimiento comprende las etapas de:

(a) proporcionar un caldo de fermentacion que comprende celulas bacterianas que producen Streptococcus pneumoniae serotipo 19A;

(d) ultrafiltrar y diafiltrar el lisado celular aclarado de la etapa (c) a aproximadamente 4 °C a un pH de aproximadamente 6 en tampon fosfato sodico para retirar las impurezas de bajo peso molecular y aumentar la concentracion de polisacarido, produciendo de ese modo un retenido;

(f) mantener la solucion acidificada de retenido formada en la etapa (e) durante al menos 2 horas a aproximadamente 4 °C para permitir la sedimentacion del precipitado, seguido por filtracion o centrifugacion de la solucion acidificada de retenido, produciendo de ese modo una solucion aclarada de polisacarido;

(g) ajustar el pH de la solucion aclarada de polisacarido de la etapa (f) hasta aproximadamente 6, produciendo de ese modo una solucion aclarada de polisacarido de pH ajustado;

(h) filtrar la solucion aclarada de polisacarido de pH ajustado de la etapa (g) a traves de un filtro de carbono activado;

(i) ultrafiltrar y diafiltrar la solucion filtrada producida por la etapa (h), produciendo de ese modo una solucion concentrada de polisacarido purificado; y

(j) filtrar la solucion concentrada de polisacarido purificado producida por la etapa (i) usando un filtro esteril;

mediante lo cual se producen polisacaridos capsulares sustancialmente purificados que comprenden el serotipo 19A en forma de una solucion. En una realizacion particular, el pH de la etapa (e) se disminuye hasta aproximadamente 3,5. En otra realizacion, la diafiltracion de la etapa (i) comprende un ajuste de pH entre aproximadamente 5,5 hasta aproximadamente 7,5. En otra realizacion, la diafiltracion de la etapa (i) comprende un ajuste de pH entre aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,5. En otra realizacion, la diafiltracion de la etapa (i) comprende un ajuste de pH hasta aproximadamente 7,4. En otra realizacion mas, la etapa (e) retira al menos el 98 % de las protemas del retenido de la etapa (d). En otra realizacion, la etapa (h) retira al menos el 90 % de las protemas de la solucion aclarada de polisacarido de pH ajustado de la etapa (g). En otra realizacion, el filtro de carbono activado de la etapa (h) comprende carbono activado con acido fosforico basado en madera. En otra realizacion, el tampon fosfato sodico de la etapa (d) es fosfato sodico 25 mM. En otra realizacion mas, el agente lftico de la etapa (b) es desoxicolato sodico (DOC). En otra realizacion, el agente lftico de la etapa (b) es un agente lftico de origen no animal. En otra realizacion mas, el agente lftico de la etapa (b) es el agente lftico de origen no animal N-lauril sarcosina sodica (NLS).

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 muestra el rendimiento promedio de polisacarido en el procedimiento (PS), la relacion protema/PS y la relacion acido nucleico (NA)/PS para el serotipo 5 usando el procedimiento acortado de purificacion de la invencion. Los resultados se muestran para cada etapa de purificacion.

La Figura 2 muestra los espectros de NMR para PS de serotipo 4 del actual procedimiento de purificacion (A) en comparacion con el PS de serotipo 4 del procedimiento acortado de purificacion (B). No se observaron diferencias significativas entre los dos espectros. El segundo pico de la derecha en ambos espectros era piruvato, y la altura del pico del grupo piruvato era comparable en ambos espectros.

La Figura 3 muestra el rendimiento promedio de PS en el procedimiento, la relacion de protema/PS y la relacion de NA/PS para el serotipo 4 usando el procedimiento acortado de purificacion de la invencion. Los resultados se muestran para cada etapa de purificacion.

La Figura 4 muestra el rendimiento promedio de PS en el procedimiento, la relacion de protema/PS y la relacion de NA/PS para el serotipo 19A usando el procedimiento acortado de purificacion de la invencion. Los resultados se muestran para cada etapa de purificacion.

La Figura 5 muestra el rendimiento promedio de PS en el procedimiento, la relacion de protema/PS y la relacion de NA/PS para el serotipo 7F usando el procedimiento acortado de purificacion de la invencion. Los resultados se muestran para cada etapa de purificacion.

La Figura 6 muestra el rendimiento promedio de PS en el procedimiento, la relacion de protema/PS y la relacion de NA/PS para el serotipo 6B usando el procedimiento acortado de purificacion de la invencion. Los resultados se muestran para cada etapa de purificacion.

La Figura 7 muestra el rendimiento promedio de PS en el procedimiento, la relacion de protema/PS y la relacion de NA/PS para el serotipo 6B usando el procedimiento acortado de purificacion de la invencion. Los resultados se muestran para cada etapa de purificacion.

La Figura 8 muestra el rendimiento promedio de PS en el procedimiento, la relacion de protema/PS y la relacion de NA/PS para el serotipo 1 usando el procedimiento acortado de purificacion de la invencion. Los resultados se muestran para cada etapa de purificacion.

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La Figura 9 muestra el rendimiento promedio de PS en el procedimiento, la relacion de protema/PS y la relacion de NA/PS para el serotipo 14 usando el procedimiento acortado de purificacion de la invencion. Los resultados se muestran para cada etapa de purificacion.

La Figura 10 muestra una comparacion de los rendimientos de PS en el procedimiento para los serotipos 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, y 19F purificados usando el procedimiento acortado de purificacion de la invencion. La Figura 11 muestra una comparacion de las relaciones de protema/PS para los serotipos 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, y 19F purificados usando el procedimiento acortado de purificacion de la invencion. Los resultados se comparan para cada etapa de purificacion.

La Figura 12 muestra una comparacion de las relaciones de NA/PS para los serotipos 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, y 19F purificados usando el procedimiento acortado de purificacion de la invencion. Los resultados se comparan para cada etapa de purificacion.

La Figura 13 muestra la eficacia de retirada de protemas que se puede atribuir a la etapa de acidificacion del procedimiento acortado de purificacion de la invencion. La diferencia en la concentracion de protemas (SDS- PAGE) antes y despues de la acidificacion se representa frente a la concentracion inicial de protemas antes de la acidificacion para lotes de los serotipos 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, y 19F. La diferencia de concentracion de protemas dividida por la concentracion inicial de protemas reflejaba la tasa de retirada de protemas por la etapa de acidificacion.

La Figura 14 muestra la eficacia de retirada de protemas que se puede atribuir a la etapa de adsorcion en carbono del procedimiento acortado de purificacion de la invencion. La cantidad de protemas retirada (adsorbida sobre carbono) se represento frente a las cantidades iniciales de carga de protemas para lotes de los serotipos 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, y 19F. La cantidad de protemas retiradas dividida por las cantidades iniciales de carga de protemas reflejaba la tasa de retirada de protemas por la etapa de adsorcion en carbono.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion se refiere a un procedimiento acortado de purificacion para reducir los niveles de protemas solubles en lisados celulares de Streptococcus pneumoniae de produccion de polisacaridos capsulares sustancialmente purificados adecuados para su incorporacion en vacunas de conjugado de neumococos. Para la mayona de los serotipos para la vacuna 7-valente de conjugado de neumococos (7vPnC) actualmente comercializada (Prevnar®), asf como la vacuna 13-valente de conjugado de neumococos (13vPnC) recien desarrollada, el actual procedimiento de purificacion de polisacaridos requiere hasta dieciseis etapas. Estas etapas implican muchas operaciones caras, muy laboriosas y exigen mucha tecnologfa, tal como cromatograffa y multiples separaciones en membrana. El procedimiento de la presente invencion elimina hasta ocho de estas etapas consiguiendo al mismo tiempo la misma purificacion y elimina la necesidad de cromatograffa. Por tanto, la presente invencion se refiere a un procedimiento mas eficaz de purificacion que es menos caro, consume menos tiempo e implica menos etapas.

El procedimiento acortado de purificacion de la presente invencion se refiere al descubrimiento de que la ultrafiltracion y la diafiltracion de un caldo de lisado celular aclarado de S. pneumoniae, seguido por acidificacion del caldo de lisado concentrado con un acido organico o uno mineral hasta un pH de 4,5, preferentemente aproximadamente 3,5, precipita al menos el 98 % de las protemas en la solucion sin afectar de forma grave al rendimiento de polisacaridos. Ultrafiltrando y diafiltrando el caldo de fermentacion lisado y aclarado antes de la acidificacion hasta un pH de menos de 4,5, preferentemente aproximadamente 3,5, se eliminan los efectos de "salado" de las protemas y se aumenta la fraccion de protemas que esta "desalada". "Salacion" se refiere a solubilidad aumentada de las protemas mientras que "desalado" se refiere a precipitacion de las protemas en solucion segun alcanzan sus puntos isoelectricos. La etapa de ultrafiltracion y de diafiltracion tambien evita la formacion de espuma observada cuando el caldo tratado con carbonato sodico experimenta acidificacion incluso hasta un pH de 5,0 (vease la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2006/0228381). Por tanto, la ultrafiltracion y la diafiltracion del caldo de lisado aclarado hace posible usar cualquier agente de titulacion de pH de bajo peso molecular tal como carbonato sodico durante la fermentacion del serotipo de S. pneumoniae y evita la formacion de espuma del caldo de lisado aclarado cuando se acidifica hasta un pH de menos de 4,5.

"Caldo de lisado aclarado" se refiere a un caldo de lisado que ha experimentado centrifugacion o filtracion para retirar los desechos celulares.

"Diafiltrar", "diafiltracion", "DF" y terminos similares se refieren a, por ejemplo, usar membranas semipermeables con propiedades ffsicas y qmmicas apropiadas para retirar moleculas pequenas de una solucion.

"Ultrafiltrar", "ultrafiltracion", "UF" y terminos similares se refieren a, por ejemplo, usar membranas semipermeables con propiedades ffsicas y qmmicas apropiadas para discriminar entre moleculas en una solucion y moleculas de tipo concentrado en un volumen mas pequeno de solucion.

Dentro de los procedimientos de la presente invencion, la ultrafiltracion y la diafiltracion ffpicamente comprenden filtracion de "flujo transversal" o de "flujo tangencial" para evitar la obstruccion de las membranas de filtracion. En la filtracion de "flujo transversal", la solucion a filtrar se pasa a traves de la superficie de la membrana. Los materiales que pasan a traves de la membrana se mencionan como permeado. Los materiales que no pasan a traves de la membrana se mencionan como retenido. El retenido se recicla hasta un deposito de alimentacion para volver a

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filtrarse.

Como se usa en el presente documento, se usa un acido organico o uno mineral para disminuir el pH del caldo de lisado ultrafiltrado y diafiltrado siempre que se consiga un pH de menos 4,5, particularmente aproximadamente 3,5. Por consiguiente, pueden usarse acidos tanto organicos como minerales dentro de los procedimientos de la invencion. Como se usa en el presente documento, la expresion "acido mineral" se refiere a un acido derivado de mineral inorganico por reaccion qmmica en oposicion a los acidos organicos. Los ejemplos no limitantes, ejemplares de acidos minerales que pueden usarse dentro de los procedimientos de la presente invencion incluyen acido clortndrico, acido mtrico, acido fosforico y acido sulfurico. En realizaciones particulares, el pH del caldo de lisado concentrado se disminuye hasta menos de 4,4, 4,3, 4,2, 4,1, 4,0, 3,9, 3,8, 3,7, 3,6, 3,5, 3,4, 3,3, 3,2, 3,1 o 3,0. En otras realizaciones, el pH del caldo de lisado concentrado se disminuye hasta aproximadamente 4,4, aproximadamente 4,3, aproximadamente 4,2, aproximadamente 4,1, aproximadamente 4,0, aproximadamente 3,9,

aproximadamente 3,8, aproximadamente 3,7, aproximadamente 3,6, aproximadamente 3,5, aproximadamente 3,4,

aproximadamente 3,3, aproximadamente 3,2, aproximadamente 3,1, aproximadamente 3,0, aproximadamente 2,9,

aproximadamente 2,8, aproximadamente 2,7, aproximadamente 2,6, aproximadamente 2,5, aproximadamente 2,4,

aproximadamente 2,3, aproximadamente 2,2, aproximadamente 2,1 o aproximadamente 2,0.

El procedimiento acortado de purificacion de la presente invencion tambien se refiere al descubrimiento en que, en combinacion con las etapas de concentracion y bajo pH descritas anteriormente, la filtracion usando carbono activado precipita al menos el 90 % de las protemas restantes sin afectar de forma grave al rendimiento de polisacaridos. En realizaciones particulares, la filtracion con carbono usando carbono derivado de serrrn u otros productos de la madera y activado con acido fosforico se descubrio que es mas eficaz en reducir o retirar las impurezas de protemas que carbonos usados dentro de los actuales procedimientos de filtracion con carbono.

Por consiguiente, la presente invencion se refiere a un procedimiento de produccion de polisacaridos capsulares sustancialmente purificados de un lisado celular de Streptococcus pneumoniae que comprende las etapas de:

(d) ultrafiltrar y diafiltrar el lisado celular aclarado de la etapa (c) para retirar las impurezas de bajo peso molecular y aumentar la concentracion de polisacarido, produciendo de ese modo un retenido;

(e) disminuir el pH del retenido de la etapa (d) hasta menos de 4,5, particularmente aproximadamente 3,5, usando un acido organico o uno mineral para precipitar las protemas y los acidos nucleicos, formando de ese modo una solucion acidificada de retenido;

(f) mantener la solucion acidificada de retenido formada en la etapa (e) durante un tiempo suficiente para permitir la sedimentacion del precipitado, particularmente durante al menos 2 horas con o sin agitacion, seguido por filtracion o centrifugacion de la solucion acidificada de retenido, produciendo de ese modo una solucion aclarada de polisacarido;

(g) filtrar la solucion aclarada de polisacarido de la etapa (f) a traves de un filtro de carbono activado, particularmente un filtro de carbono activado que comprende carbono activado por acido fosforico basado en madera;

mediante lo cual se producen polisacaridos capsulares sustancialmente purificados en forma de una solucion. La filtracion a esterilidad de la etapa (i) es util para retirar las bacterias y partmulas de la solucion concentrada de polisacarido purificado. Serotipos no limitantes ejemplares de S. pneumoniae seleccionados para esta realizacion de la invencion son 1,4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, y 23F. En una realizacion particular, la etapa (e) retira al menos el 98 % de las protemas del retenido de la etapa (d). En otra realizacion, la etapa (g) retira al menos el 90 % de las protemas de la solucion aclarada de polisacarido de la etapa (f). En otra realizacion, la diafiltracion de la etapa (h) comprende un ajusta de pH entre aproximadamente 5,5 hasta aproximadamente 7,5. Para una estabilidad mejorada del polisacarido capsular sustancialmente purificado durante el almacenamiento a largo plazo, sin embargo, la diafiltracion de la etapa (h) comprende un ajuste de pH entre aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,5, y mas particularmente hasta aproximadamente 7,4.

Como se usa en el presente documento, la expresion "lisado que contiene polisacarido capsular sustancialmente purificado" o "solucion que contiene polisacaridos capsulares sustancialmente purificados" se refieren a un lisado celular o solucion de Streptococcus pneumoniae a partir de la cual se han retirado las protemas de modo que la relacion porcentual de protema a polisacarido (protema/PS) sea de menos del 10 %, menos del 9 %, menos del 8 %, menos del 7 %, menos del 6 %, menos del 5 %, menos del 4 %, menos del 3 %, menos del 2 % o menos del 1 % y la relacion porcentual de acido nucleico a polisacarido (NA/PS) sea menos del 5 %, menos del 4 %, menos del 3 %, menos del 2 % o menos del 1 %. En realizaciones particulares, las relaciones porcentuales de protema/PS y NA/PS

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para lisados o soluciones que contienen polisacarido capsular sustancialmente purificado que comprenden serotipos espedficos son las siguientes: para el serotipo 1 la relacion de protema/PS es de menos del 2 % y la relacion de nA/PS es menor del 2 %, para el serotipo 4 la relacion de protema/PS es menor del 3 % y la relacion de NA/PS es menor del 2 %, para el serotipo 5 la relacion de protema/PS es menor o igual al 7,5 % y la relacion de NA/PS es menor o igual 2 %, para el serotipo 6A la relacion de protema/PS es menor del 2 % y la relacion de NA/PS es menor del 2 %, para el serotipo 6B la relacion de protema/PS es menor del 4 % y la relacion de NA/PS es menor del 1 %, para el serotipo 7F la relacion de protema/PS es menor del 5 % y la relacion de NA/PS es menor del 2 %, para el serotipo 9V la relacion de protema/PS es menor del 2 % y la relacion de NA/PS es menor del 1 %, para el serotipo 14 la relacion de protema/PS es menor del 3 % y la relacion de NA/PS es menor del 2 %, para el serotipo 18C la relacion de protema/PS es menor del 2 % y la relacion de NA/PS es menor del 2 %, para el serotipo 19A la relacion de protema/PS es menor del 2 % y la relacion de NA/PS es menor del 2 %, para el serotipo 19F la relacion de protema/PS es menor del 3 % y la relacion de NA/PS es menor del 2 %, y para el serotipo 23F la relacion de protema/PS es menor del 2 % y la relacion de NA/PS es menor del 2 %. Los procedimientos para la cuantificacion de concentraciones de protema, polisacarido y acido nucleico en el lisado celular o solucion son bien conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, analisis sDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sodico), HPLC (cromatograffa de ffquida de alto rendimiento) y SEC (cromatograffa por exclusion de tamano), ensayos de Lowry modificados, espectrofotometna, SEC-MALLS (cromatograffa por exclusion de tamano/dispersion de luz laser de multiple angulo), y NMR (resonancia magnetica nuclear).

Dentro de los procedimientos de la presente invencion, las celulas bacterianas pueden lisarse usando cualquier agente fftico. Un "agente fftico" es cualquier agente que ayuda en la descomposicion de la pared celular y libera la autolisina que causa lisis celular incluyendo, por ejemplo, detergentes. Como se usa en el presente documento, el termino "detergente" se refiere a cualquier detergente anionico o cationico capaz de inducir la lisis de celulas bacterianas. Ejemplos representativos de dichos detergentes para su uso dentro de los procedimientos de la presente invencion incluyen desoxicolato sodico (DOC), N-lauril sarcosina (NLS), acido quenodesoxicolico de sodio y saponinas.

En una realizacion de la presente invencion, el agente fftico usado para lisar las celulas bacterianas es DOC. DOC es la sal sodica del acido biliar acido desoxicolico, que se obtiene habitualmente de fuentes biologicas tales como vacas o bueyes. DOC activa la protema LytA, que es una autolisina que esta implicada en el crecimiento de la pared celular y en la division en Streptococcus pneumoniae. La protema LytA tiene dominios de union a colina en su parte C-terminal, y se sabe que mutaciones col gen lytA producen mutantes LytA que son resistentes a lisis con DOC.

Aunque no existen evidencias de que el uso de DOC durante la purificacion de polisacaridos de Streptococcus pneumoniae posea un riesgo para la salud, el uso de dichos reactivos biologicamente derivados podna generar preocupaciones reguladoras potenciales. Por consiguiente, en una realizacion de la presente invencion, el agente fftico usado para lisar las celulas bacterianas es un agente fftico de origen no animal. Los agentes ffticos de origen no animal para su uso dentro de los procedimientos de la presente invencion incluyen agentes de fuentes no animales con modos de accion similares a los de DOC (es decir, que afectan a la funcion LytA y provocan la lisis de celulas de Streptococcus pneumoniae). Dichos agentes ffticos de origen no animal incluyen, aunque sin limitacion, analogos de DOC, tensioactivos, detergentes y analogos estructurales de colina, y pueden determinarse usando procedimientos como se describe en la seccion experimental en el presente documento a continuacion. En una realizacion, el agente fftico de origen no animal se selecciona del grupo que consiste en acido decanosulfonico, tert- octilfenoxi poli(oxietilen)etanoles (por ejemplo, Igepal® CA-630, CAS n.° 9002-93-1, disponible en Sigma Aldrich, St. Louis, MO), condensados de octilfenol y oxido etileno (por ejemplo, Triton® X-100, disponible en Sigma Aldrich, St. Louis, MO), N-lauril sarcosina sodica (NLS), iminodipropionato de laurilo, dodecil sulfato sodico, quenodesoxicolato, hiodesoxicolato, glicodesoxicolato, taurodesoxicolato, tauroquenodesoxicolato y colato. En otra realizacion, el agente fftico de origen no animal es NLS.

La presente invencion tambien se refiere a modificaciones espedficas de serotipo al procedimiento descrito anteriormente. Por ejemplo, como el polisacarido de serotipo 19A es inestable y su peso molecular cambia durante la purificacion, se descubrio que modificaciones al procedimiento descrito eran utiles para estabilizar el polisacarido 19A. Estas modificaciones inclrnan realizar la etapa de ultrafiltracion y de diafiltracion antes de la acidificacion a aproximadamente 4 °C a un pH de aproximadamente 6 en tampon fosfato sodico, mantener la solucion acidificada de retenido durante al menos 2 horas a aproximadamente 4 °C para permitir la sedimentacion del precipitado y ajustar el pH de la solucion aclarada de polisacarido hasta 6 antes de la etapa de filtracion con carbono activado. En contraste, se descubrio que para los serotipos 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F, se perdfa menos polisacarido y se consegma mayor retirada de protemas cuando la etapa de ultrafiltracion y de diafiltracion antes de la acidificacion se realizaba en medios sin sal tales como agua, y esta etapa podfa realizarse a temperatura ambiente a pH neutro.

Por consiguiente, la presente invencion tambien se refiere a un procedimiento de produccion de polisacaridos capsulares sustancialmente purificados de un lisado celular de Streptococcus pneumoniae que comprende el serotipo 1,4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F o 23F, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un caldo de fermentacion que comprende celulas bacterianas que producen Streptococcus

pneumoniae serotipo 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F o 23F;

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(b) lisar las celulas bacterianas en la etapa (a) con un detergente, produciendo de ese modo un lisado celular que comprende desechos celulares, protemas solubles, acidos nucleicos y polisacaridos;

(e) disminuir el pH del retenido sin sal de la etapa (d) hasta menos de 4,5, particularmente aproximadamente 3,5, usando un acido organico o uno mineral para precipitar las protemas y los acidos nucleicos, formando de ese modo una solucion acidificada de retenido;

(f) mantener la solucion acidificada de retenido formada en la etapa (e) durante al menos 2 horas a temperatura ambiente con o sin agitacion para permitir la sedimentacion del precipitado, seguido por filtracion o centrifugacion de la solucion acidificada de retenido, produciendo de ese modo una solucion aclarada de polisacarido;

(g) filtrar la solucion aclarada de polisacarido de la etapa (f) a traves de un filtro de carbono activado, particularmente un filtro de carbono activo que comprende carbono activado con acido fosforico basado en madera;

mediante lo cual se producen polisacaridos capsulares sustancialmente purificados que comprenden el serotipo 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, l9F o 23F en forma de una solucion. En una realizacion particular, la etapa (e) retira al menos el 98 % de las protemas del retenido sin sal de la etapa (d). En otra realizacion, la etapa (g) retira al menos el 90 % de las protemas de la solucion aclarada de polisacarido de la etapa (f). En otra realizacion, la diafiltracion de la etapa (h) comprende un ajuste de pH entre aproximadamente 5,5 hasta aproximadamente 7,5. Para una estabilidad mejorada del polisacarido capsular sustancialmente purificado durante almacenamiento a largo plazo, sin embargo, la diafiltracion de la etapa (h) comprende un ajuste de pH entre aproximadamente 7,0 hasta aproximadamente 7,5, y mas particularmente hasta aproximadamente 7,4.

La presente invencion tambien se refiere a un procedimiento de produccion de polisacaridos capsulares sustancialmente purificados a partir de un lisado celular de Streptococcus pneumoniae que comprende el serotipo 19A, que comprende las etapas de:

(d) ultrafiltrar y diafiltrar el lisado celular aclarado de la etapa (c) a aproximadamente 4 °C a un pH de aproximadamente 6 en tampon fosfato sodico, fosfato sodico 25 mM, para retirar las impurezas de bajo peso molecular y aumentar la concentracion de polisacarido, produciendo de ese modo un retenido;

(f) mantener la solucion acidificada de retenido formada en la etapa (e) durante al menos 2 horas a aproximadamente 4 °C con o sin agitacion para permitir la sedimentacion del precipitado, seguido por filtracion o centrifugacion de la solucion acidificada de retenido, produciendo de ese modo una solucion aclarada de polisacarido;

(h) filtrar la solucion aclarada de polisacarido de pH ajustado de la etapa (g) a traves de un filtro de carbono activado, particularmente un filtro de carbono activo que comprende carbono activado con acido fosforico basado en madera;

mediante lo cual se producen polisacaridos capsulares sustancialmente purificados que comprenden el serotipo 19A en forma de una solucion. En una realizacion particular, la etapa (e) retira al menos el 98 % de las protemas del retenido sin sal de la etapa (d). En otra realizacion, la etapa (h) retira al menos el 90 % de las protemas de la solucion aclarada de polisacarido de pH ajustado de la etapa (g). En otra realizacion, la diafiltracion de la etapa (i) comprende un ajuste de pH entre aproximadamente 5,5 hasta aproximadamente 7,5. Para una estabilidad mejorada del polisacarido 19A sustancialmente purificado durante almacenamiento a largo plazo, sin embargo, la diafiltracion de la etapa (i) comprende un ajuste de pH entre aproximadamente 7,0 hasta aproximadamente 7,5, y mas particularmente hasta aproximadamente 7,4.

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Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustracion y no a modo limitacion.

Parte experimental

Los siguientes Ejemplos presentan resultados para los serotipos de polisacaridos de S. pneumoniae 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A y 19F purificados a escala de 10 l usando el procedimiento mejorado de la presente invencion, y los resultados se comparan con aquellos del actual procedimiento de purificacion.

Ejemplo 1. Procedimiento acortado de purificacion para los serotipos de polisacaridos de S. pneumoniae 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 14 y 19A.

Se obtuvieron clados de fermentacion de S. pneumoniae lisados con desoxicolato sodico (DOC) en dos dfas despues de su recoleccion o se almacenaron a 4 °C y se procesaron en la siguiente semana. Como se describe a continuacion, el presente procedimiento de purificacion inclrna los siguientes cambios en comparacion con el procedimiento existente de purificacion: 1) la etapa de acidificacion se movio desde el inicio hasta despues de la primera etapa de ultrafiltracion/diafiltracion (UF/DF), y el pH se ajusto hasta 7,5 en lugar de 5; 2) el tampon de diafiltracion se cambio de fosfato 0,025 M a agua desionizada (DI); 3) la adsorcion en carbono se cambio a 2 discos de carbono CUNO R32SP (CUNO Inc., Wayne, NJ) usando carbono activado con acido fosforico basado en madera, y el tiempo de adsorcion se prologo de 4 a 12 rotaciones (cada rotacion era de 22 minutos); y 4) el pH se ajusto hasta 7,4 durante la ultima etapa de diafiltracion 30 K cuando se diafiltraba aproximadamente 5 veces. Se aplico el mismo procedimiento de purificacion para los serotipos 1, 4, 5, 6A, 6B o 7F. Para el serotipo 19A, las etapas se modificaron adicionalmente y la purificacion se realizo en una habitacion refrigerada, como se describe a continuacion.

Etapas de purificacion

Todas las etapas se realizaron a temperatura ambiente excepto para el tipo 19A, en cuyo caso el procedimiento se realizo a 4 °C en una habitacion refrigerada.

Aclaracion del lisado: El proposito de esta etapa fue retirar los desechos celulares y aclarar el caldo. Esto se consiguio por centrifugacion o filtracion. El caldo se centrifugo a 10.000 g durante 30 minutos o hasta que el caldo estaba transparente a 20 °C (4 °C para el tipo 19A), o se filtro con un Millipore Prefilter (Millipore Corp., Billerica, MA) con la adicion de auxiliares de filtro Celpure® (Advanced Minerals, Santa Barbara, CA). El lisado aclarado se recogio para procesamiento adicional y se desecharon los sedimentos.

Primera UF/DF (Ultrafiltracion/Diafiltracion): Esta etapa proporciono reduccion del volumen e intercambio de tampon y tambien retiro las impurezas de bajo peso molecular. El lisado aclarado se concentro hasta aproximadamente 1/8 del volumen original. La diafiltracion se realizo usando aproximadamente 10 volumenes de agua DI (pH 6, fosfato 25 mM para 19A).

Acidificacion: Se retiro mas del 98 % de las protemas en esta etapa. Mientras se agitaba, se anadio cuidadosamente acido fosforico concentrado al retenido. El pH del retenido se ajusto hasta un valor diana de pH 3,5. El retenido acidificado se agito durante media hora y se curo a temperatura ambiente para curarlo durante una noche (2 horas a 4 °C para 19A), provocando la precipitacion de las protemas y de los acidos nucleicos.

Aclarado del retenido acidificado: Esta era la etapa de aclarado para retirar los precipitados despues de la acidificacion. La suspension de solucion acidificada se centrifugo en un rotor a 10.000 rpm (17.000 de fuerza centnfuga relativa o RCF) durante 1 hora a 20 °C (excepto para 6B, en cuyo caso la centrifugacion fue de 6 horas a 37 °C). El sobrenadante se recogio y se desecho el sedimento. Tambien puede usarse diafiltracion en profundidad con un Millipore Prefilter (Millipore Corp., Billerica, MA) con la adicion de auxiliares de filtro Celpure® (Advanced Minerals, Santa Barbara, CA) para esta etapa.

Adsorcion en carbono: En la mayona de los casos, habfa un ligero color amarillo despues de la centrifugacion del retenido acidificado 100 K. La eliminacion del color se consiguio por la adsorcion en carbono usando carbono activado con acido fosforico basado en madera. Esta etapa tambien retiro las protemas residuales que permanedan despues de la acidificacion. La solucion aclarada de polisacarido se hizo circular de nuevo a traves del filtro de carbono durante 5-6 horas o durante una noche (para 19A, el pH se ajusto hasta 6 antes de la adsorcion en carbono).

UF/DF 30 K final: Esta fue otra etapa de concentracion e intercambio de tampon para concentrar la solucion hasta una concentracion final de polisacarido (PS) de > 2 g/l, que se diafiltro en agua desionizada (DI). Se concentro la solucion de PS filtrada en carbono. Despues, el concentrado se diafiltro 10X con agua DI. El pH se ajusto hasta 7,4 durante la diafiltracion.

Filtracion final a esterilidad con 0,2 um: La solucion final de PS se filtro a esterilidad con un filtro de 0,22 pm o unidad desechable esteril de filtracion y se almaceno en un refrigerador a 4 °C.

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Procedimientos analiticos

La cuantificacion de concentraciones de protema, PS y acido nucleico se realizaron usando procedimientos que son bien conocidos en la tecnica, incluyendo analisis de SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sodico), HPLC (cromatograffa lfquida de alto rendimiento) y SEC (cromatograffa por exclusion de tamano), ensayos de Lowry modificados, espectrofotometna, SEC-MALLS (cromatograffa por exclusion de tamano/dispersion de luz laser de multiples angulos) y NMR (resonancia magnetica nuclear).

Resultados y analisis

Lotes de purificacion acortada de tipo 5: La comparacion del rendimiento final de PS, el peso molecular de PS y los niveles de impurezas principales de tres lotes de purificacion usando el procedimiento acortado y aquellos que se usan el procedimiento actual para el tipo 5 se muestran en la Tabla 1. Todos los casos de partida eran lotes de fermentacion de alta densidad celular lisados con DOC, que teman una mayor concentracion de polisacarido (~ 0,5 g/l) que el caldo convencional de fermentacion con SOP (~ 0,3 g/l). Se uso una membrana de 30 K o de 50 K para la primera etapa de UF/DF. Los niveles de impurezas se calcularon y usando relaciones de impureza/PS. Se uso el mismo enfoque para todos los demas serotipos descritos en el presente documento.

Tabla 1. Datos de ensayo para lotes del procedimiento acortado de purificacion de tipo 5.

LOTE N.°: RENDIMIENTO DE PS (%) RELACION DE PROTEfNA (%) RELACION DE NA (%) MOLECULAR DE PS (KG/MOL) RELACION DE C-PS (%)

L29276-27 (30K UF/DF): 56,7 1,2 0,12 299 20,7

L29276-32 (30K UF/DF): 54,6 1,8 0,12 282 24,7

L29276-52 (50K UF/DF): 60,2 1,4 0,03 275 22,8

Procedimiento actual: 57 3,6 0,18 320 15,9

Especificacion o valor esperado: 50-60 < 7,5 < 2,0 NA < 35

Como muestran los datos de la Tabla 1, las relaciones de protema de los tres lotes usando el procedimiento acortado de purificacion cumplfan la especificacion de < 7,5 %, y tambien eran comparables con los del procedimiento actual. Las relaciones de acido nucleico (NA), asf como de polisacarido-C (C-PS), tambien estaban muy por debajo de las especificaciones de < 2,0 % y de <35 %, respectivamente y eran comparables con los del procedimiento actual. Los resultados del rendimiento final de PS y los niveles de impurezas de los tres lotes mostrados en la Tabla 1 demuestran la reproducibilidad y robustez del procedimiento acortado.

Hubo alguna preocupacion acerca de si los polisacaridos podfan hidrolizarse a un pH inferior de 3,5. El cambio del tiempo de retencion de PS durante el procedimiento de purificacion, por lo tanto, se controlo y se midio el peso molecular del PS purificado final. No se observaron cambios significativos en el tiempo de retencion de PS de serotipo 5 a partir del cromatograma de HPLC. Tampoco hubo diferencias significativas en los pesos moleculares para el PS purificado por el procedimiento acortado y el del procedimiento actual (284 kg/mol) basandose en la medicion MALLS. Por tanto, se concluyo que el peso molecular del PS purificado no se vefa afectado de forma adversa por el procedimiento acortado de purificacion.

El rendimiento de polisacarido en el procedimiento, la relacion de protema/polisacarido y la relacion de acido nucleico/polisacarido en cada una de las etapas del procesamiento para los tres lotes del procedimiento acortado se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2. Rendimiento de PS en el procedimiento, relaciones de protema (SDS-PAGE) y acido nucleico del tipo 5.

ETAPA: RENDIMIENTO DE PS (%) PROTEiNA/PS (%)

L29276-27: L29276-32 L29276-52 L29276-27 L29276-32 L29276-52

Caldo: 100,0 100,0 100,0 384,40 1026,60 193,26

Centrifugacion: 99,9 95,6 94,6 274,60 642,00 209,78

UF/DF 30/50K: 71,1 82,8 93,9 152,10 561,00 204,76

Acidificacion: 56,1 65,9 58,6 9,00 7,50 0,20

Carbono: 57,7 55,7 58,7 0,20 1,90 0,50

UF/DF 30K: 54,5 54,6 60,3 0,10 1,00 0,09

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Tabla 2, Continuacion.

ETAPA: Acido nucleico/ps (%)

L29276-27: L29276-32 L29276-52

Caldo: 825,80 579,83 344,70

Centrifugacion: 505,10 484,30 311,90

UF/DF 30/50K: 107,30 139,90 137,60

Acidificacion: 9,44 16,40 7,38

Carbono: 0,22 0,30 0,74

UF/DF 30K: 0,11 0,12 0,19

Siempre existe una perdida de producto durante cada etapa de cualquier procedimiento de purificacion. Para estos tres lotes del procedimiento acortado, la perdida de PS sucedfa principalmente en la primera etapa de UF/DF y en la etapa de acidificacion. La perdida de PS en la primera etapa de UF/DF se debfa a la adsorcion de PS o complejo de PS/protema a la superficie de la membrana. Esta perdida se minimizo aclarando el lado de retenido de la membrana con agua DI despues de la diafiltracion y combinando el aclarado con el retenido original. La perdida de PS en la etapa de acidificacion podfa deberse a dos razones: adsorcion ffsica de PS a los solidos de precipitacion y union del polisacarido a la protema con co-precipitacion durante la acidificacion. Esta segunda posibilidad se investigo adicionalmente y los resultados mostraron evidencias de union de PS/protema.

La Figura 1 muestra la reduccion de la relacion de protema/PS en cada etapa de purificacion. Aunque la etapa de purificacion retiraba un pequeno porcentaje de protemas, la mayona de las protemas se retiraba en la etapa de acidificacion. Solamente se detecto una cantidad traza de protema despues de tratamiento a pH 3,5 incluso para el lote de mayor potencia de protemas.

Similar a la relacion de protema/PS, la relacion de acido nucleico/PS mostro variabilidad de niveles de impurezas entre los lotes. La etapa de UF/DF 30/50 K retiraba una cantidad significativa de acido nucleico en comparacion con la retirada de protemas en la misma etapa de procesamiento. Sin el deseo de limitarse a teona alguna, esto puede deberse al tamano molecular de los acidos nucleicos que es mas pequeno que el de las protemas, haciendolos relativamente mas faciles de retirar mediante la etapa de UF/DF 30/50 K. Esta primera etapa de centrifugacion y acidificacion tambien retiraba una cantidad considerable de acido nucleico.

La Tabla 2 muestra que la etapa de adsorcion con carbono activado tambien reduce el nivel de protema/PS y de NA/PS. La reduccion del porcentaje no era tan significativa como en las dos primeras etapas, pero esta etapa era importante para retirar el color de la solucion y aseguraba que el nivel de impurezas cumplfa la especificacion.

Lotes de purificacion acortada de tipo 4. Se muestra un sumario de tres lotes de purificacion acortada para el tipo 4 en la Tabla 3. Los caldos de alimentacion para los tres lotes estaban lisados con DOC.

Tabla 3. Sumario de lotes de purificacion acortada de tipo 4.

LOTE: RENDIMIENTO DE PS (%) PROTEfNA/PS (%) Acido NUCLEICO/PS (%) PESO MOLECULAR DE PS (KG/MOL) RELACION DE C-PS (%)

L29276-47: 56,3 0,7 0,04 289 15,4

L29276-55: 53,0 1,3 0,03 354 14,7

L29276-148: 57,3 1,16 0,02 293 10,0

Procedimiento actual: 71,1 0,05 0,02 285

Especificacion: NA <3,0 <2,0 >350 <25

El rendimiento de PS de tipo 4 tambien estaba entre el 50-60 %. La relacion de protema/PS y la relacion de acido nucleico/PS estaban dentro de sus especificaciones. La relacion de C-PS tambien estaba dentro de la especificacion. El peso molecular de los tres lotes estaba cercano a ~ 300 kg/mol. El PS de serotipo 4 purificado por el actual procedimiento de purificacion usando el caldo similar de fermentacion tambien dio un peso molecular inferior de 285 kg/mol. La comparacion de los cromatogramas de HPLC del PS del caldo de fermentacion y la solucion purificada final mostro que no habfa diferencias en el tiempo de retencion de PS. Esto sugirio que la diferencia en el peso molecular no estaba causada por el cambio del procedimiento, sino en su lugar se debfa a la naturaleza intrmseca del procedimiento de fermentacion.

El PS de tipo 4 contiene un grupo piruvato en la molecula modificada, y este piruvato era importante para la conjugacion para su uso en una vacuna de conjugado de neumococos. Para asegurar que la cantidad de piruvato no estaba afectada de forma adversa por el tratamiento acido, se realizo analisis de RMN. La Figura 2 muestra los espectros de RMN para PS de tipo 4 convencional y los del lote L29276-47. No se observaron diferencias significativas entre los dos espectros. El segundo pico desde la derecha en ambos espectros era piruvato, y la altura del pico del grupo piruvato era comparable en ambos espectros. Las relaciones de piruvato para los tres lotes del procedimiento acortado fueron de 0,8 mol/mol, y cumplfan la especificacion de > 0,7 mol/mol.

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El rendimiento de PS en el procedimiento, la relacion de protema/PS y de NA/PS para los tres lotes de tipo 4 se resumen en la Tabla 4. La perdida de PS sucedfa principalmente en la primera centrifugacion, las etapas de acidificacion y adsorcion en carbono activado, con un promedio del 10 %, del 8 % y del 20 % respectivamente. El rendimiento global de PS era cercano al de tipo 5, aproximadamente el 55 %.

Tabla 4. Rendimiento de PS en el procedimiento, relacion de protema (SDS-PAGE)/PS y relacion de NA/PS.

: RENDIMIENTO DE PS (%) PROTEiNA/PS (%)

ETAPA: L29276- L29276- L29276- L29276- L29276- L29276-

47: 55 148 47 55 148

Caldo: 100,0 100,0 100,0 231,22 297,33 499,75

Centrifugacion: 85,8 97,8 88,0 198,69 247,40 534,61

UF/DF 50/100K: 85,1 86,4 87,7 235,90 249,24 364,98

Acidificacion: 84,2 72,0 78,6 0,42 1,81 0,41

Carbono: 65,3 48,9 58,6 0,09 0,39 0,34

UF/DF 30K: 57,9 50,6 57,4 0,08 0,09 1,31

Tabla 4. Continuacion.

ETAPA: NA/PS (%)

L29276-47: L29276-55 L29276-148

Caldo: 312,84 282,50 302,71

Centrifugacion: 301,40 261,82 243,28

UF/DF 50/100K: 80,99 67,67 92,00

Acidificacion: 4,24 5,01 1,17

Carbono: 0,08 0,92 0,38

UF/DF 30K: 0,05 0,06 0,07

La Tabla 3 muestra el cambio promedio en el rendimiento de PS, la relacion de protema/PS y de NA/PS en cada una de las etapas de purificacion para los tres lotes de la Tabla 4. La retirada de protemas sucedfa principalmente en la etapa de acidificacion como se esperaba. La primera centrifugacion y las etapas de UF/DF tambien retiraban colectivamente una cierta cantidad de protemas, pero la reduccion de protemas era menor que en la etapa de acidificacion.

Similar al tipo 5, la mayor parte de la reduccion de la relacion de acido nucleico/PS tema lugar en las etapas UF/DF 50/100 K, en la primera centrifugacion y en la acidificacion, y la reduccion de NA en la primera etapa de UF/DF era mas significativa que para protemas. De nuevo, como se muestra en la Figura 3, la etapa de carbono activado retiraba una cierta cantidad de protemas y NA y llevaba los niveles de impurezas por debajo de las especificaciones. Tambien se retiraba el color de la solucion.

Lotes de purificacion acortada de tipo 19A: El polisacarido de tipo 19A es inestable y el peso molecular cambia durante la purificacion. El procedimiento acortado de purificacion se modifico ligeramente para estabilizar el polisacarido 19A. Estas modificaciones se resumen del siguiente modo: 1) las etapas de purificacion se realizaron principalmente a 4 °C en la habitacion refrigerada; 2) la primera diafiltracion 100 K se refrigero usando tampon fosfato 25 mM (4 °C) con un pH de 6 en lugar de usar agua a temperatura ambiente; 3) el tiempo de mantenimiento de acidificacion se redujo desde una noche a 2 horas; y 4) despues de aclarar el retenido 100 K acidificado, el pH se ajusto hasta 6 y se realizo adsorcion en carbono activado a pH 6 en lugar de a 3,5.

Los resultados de dos lotes 19A purificados por el procedimiento acortado de purificacion se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5. Sumario de lotes de purificacion acortada de tipo 19A.

LOTE: RENDIMIENTO DE PS (%) PROTEINA/PS (%) NA/PS (%) PESO MOLECULAR (KG/MOL) C-PS (%)

L29276-116: 61,58 0,14 0,01 525 3,8

L29276-143: 76,15 1,43 0,01 488 2,8

Especificacion: NA <2 <2 NA <10

Los rendimientos de PS de los dos lotes de purificacion acortada fueron del 62 y 76 %, respectivamente. La relacion final de protema/PS, la relacion de acido nucleico y la relacion de C-PS cumplieron todas sus especificaciones respectivas. Los pesos moleculares finales de los polisacaridos de los dos lotes fueron de 525 kg/mol y de 488 kg/mol, respectivamente, y estaban cercanos a los de PS de 19A usado en ensayos clmicos en fase III (486 kg/mol).

La relacion de protema/PS para los dos lotes cumplfa ambos la especificacion de < 2 %. La relacion tanto de NA como de C-PS de los dos lotes estaba dentro de sus especificaciones.

El rendimiento de PS, la reduccion de protema y NA en cada una de las etapas de purificacion se muestra en la Tabla 6 y en la Figura 4. Los resultados mostraron la perdida de PS en cada una de las etapas de purificacion

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excepto en la primera etapa de centrifugacion. Como los serotipos 5 y 4, la retirada de protemas y NA tuvo lugar principalmente en las tres primeras etapas, y habfa apenas protema y NA detectables despues de la acidificacion. Aunque la etapa de adsorcion en carbono activado no retiraba una cantidad significativa de protemas y NA, posiblemente debido a la muy baja concentracion de protemas y NA despues de la acidificacion, la etapa aun era necesaria para la eliminacion del color.

Tabla 6. Rendimiento de PS en el procedimiento, relacion de protema/PS y de NA/PS de tipo 19A.

ETAPA: RENDIMIENTO DE PS (%) PROTEiNA/PS (%) NA/PS (%)

: L29276-116 L29276-143 L29276-116 L29276-143 L29276-116 L29276-143

Caldo: 100,0 100,0 224,41 144,08 277,55 134,73

Concentrado: 100,8 101,2 121,60 119,11 189,64 100,64

UF/DF 100K: 87,7 90,3 103,83 105,16 56,87 26,36

Acidificacion: 90,4 72,1 0,28 0,84 0,03 0,03

Carbono: 77,8 71,7 0,96 0,03 0,04 0,02

UF/DF 30K: 61,0 76,1 0,54 0,00 0,02 0,01

Lotes de purificacion acortada de tipo 7F: El tipo 7F es un polisacarido no ionico, que tfpicamente requiere cambio en las etapas durante la purificacion usando el procedimiento existente en comparacion con los serotipos descritos anteriormente. Sin embargo, el procedimiento acortado de purificacion de la presente invencion se aplico satisfactoriamente al serotipo 7F sin la necesidad de desviacion del procedimiento. Se purificaron dos lotes de caldo de tipo 7F usando el procedimiento acortado. Uno fue un caldo de fermentacion convencional (L29276-107) y uno fue un caldo de alta densidad celular (L29276-157). Los resultados de los dos lotes se resumen en la Tabla 7.

Tabla 7. Sumario de lotes de purificacion acortada de tipo 7F.

LOTE N.°: RENDIMIENTO DE PS (%) PROTEINA/PS (%) NA/PS (%) PESO MOLECULAR (KG/MOL) C-PS (%)

L29276-107: 65,27 0,49 0,02 968 3,3

L29276-157: 79,06 0,26 0,04 881 2,9

Especificacion: NA <5 <2 NA <17

El rendimiento de PS de tipo 7F era realmente mayor que en los otros serotipos, posiblemente debido a menor union del polfmero no ionico a las moleculas proteicas cargadas. Las relaciones finales de protema, de NA y de C-PS estan todas dentro de sus especificaciones. El peso molecular del tipo 7F era comparable al de los lotes convencionales y aunque el peso molecular de 7F era bastante alto, la solucion de PS no era muy viscosa debido al volumen excluido mas pequeno del polfmero no ionico.

El rendimiento de PS, la relacion de protema y de NA del tipo 7F en cada una de las etapas de purificacion se muestran en la Tabla 8 y se represento el promedio de los dos lotes en la Figura 5.

Tabla 8. Rendimiento de PS en el procedimiento, relacion de protema/PS y de NA/PS del tipo 7F.

ETAPA: RENDIMIENTO DE PS (%) PROTEiNA/ PS (%) ACIDO NUCLEICO/PS (%)

L29276-107: L29276-157 L29276-107 L29276-157 L29276-107 L29276-157

Caldo: 100,00 100,00 274,10 189,24 258,55 134,64

Centrifugacion: 100,31 95,57 110,60 107,20 163,38 83,14

UF/DF 100K: 84,19 95,39 139,38 27,53 54,02 32,74

Acidificacion: 70,89 84,08 0,44 0,10 1,80 0,94

Carbono: 63,96 79,40 0,70 0,09 2,29 0,23

UF/DF 30K: 57,24 77,70 0,30 0,05 0,06 0,00

Hubo alguna perdida de PS de tipo 7F en cada etapa de purificacion. Globalmente, la perdida de PS fue menor que la de los serotipos 5 y 4. La reduccion de la relacion de protema y de NA fue principalmente por las etapas de primera centrifugacion, de UF/DF 100 K y de acidificacion. Similar a otros serotipos, la UF/DF 100 K fue mas eficaz en retirar NA que en protemas. Aunque la etapa de adsorcion en carbono activado no retiro una cantidad significativa de protema y de NA debido a niveles muy bajos de impurezas despues de la acidificacion, la etapa aun era necesaria para la eliminacion del color.

Lotes de purificacion acortada de tipo 6B: Se purificaron dos lotes de 6B usando el procedimiento acortado de purificacion. Se descubrio que el aclarado del retenido 100 K acidificado tardaba mas tiempo que los otros serotipos (6 horas en lugar de 1 hora). Excepto por esta diferencia, el procedimiento de purificacion fue similar al de los serotipos. Los resultados de los dos lotes se resumen en la Tabla 9.

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Tabla 9. Sumario de purificacion acortada de tipo 6B.

LOTE: RENDIMIENTO DE PS (%) PROTEfNA/PS (%) NA/PS (%) PESO MOLECULAR (KG/MOL) C-PS (%)

L29276-161: 69,50 1,73 0,28 857 3,6

L29276-164: 74,50 1,41 0,17 1142 3,9

Especificacion: NA <4 <1 >800 <10

Todos los niveles de impurezas (protemas, NA y C-PS) estaban dentro de sus especificaciones. El rendimiento de PS fue relativamente alto, y tambien la relacion de protema de NA en comparacion con los otros serotipos.

El rendimiento de PS en el procedimiento, las relaciones de protema y de NA en cada una de las etapas de purificacion se muestran en la Tabla 10 y en la Figura 6.

Tabla 10. Rendimiento de PS en el procedimiento promedio, relacion de protema y de NA de tipo 6B.

ETAPA: RENDIMIENTO DE PS (%) PROTEiNA/PS (%) ACIDO NUCLEICO /PS (%)

L29276 -161: L29276-164 L29276-161 L29276-164 L29276-161 L29276-164

Caldo: 100,00 100,00 238,20 288,80 215,12 237,67

Centrifugacion: 101,43 116,54 95,88 123,59 104,08 104,47

UF/DF 100K: 104,11 105,47 68,15 88,14 22,13 47,81

Acidificacion: 91,98 101,45 0,71 0,43 1,06 2,24

Carbono: 80,71 91,42 0,39 0,23 0,45 0,74

UF/DF 30K: 72,67 77,28 1,23 0,46 0,37 0,25

Similar a 19A, la perdida de PS sucedfa en cada una de las etapas de purificacion excepto en la primera etapa de centrifugacion, en que hubo un ligero aumento de PS. La retirada de protemas y de NA se consiguio principalmente por la primera centrifugacion, por la primera UF/DF 100 K y por la etapa de acidificacion. Sin embargo, tambien hubo alguna reduccion de la relacion de protema y de NA en la etapa de adsorcion en carbono.

Lotes de purificacion acortada de tipo 6A: Se purificaron dos lotes de tipo 6A usando el procedimiento acortado de purificacion. El rendimiento de PS, los niveles de impurezas y el peso molecular de las soluciones finales se resumen en la Tabla 11.

Tabla 11. Sumario de lotes de purificacion acortada de tipo 6A.

LOTE: CALDO RENDIMIENTO PROTEiNA/ PS NA/PS PESO MOLECULAR C-PS

DE PS (%): (%) (%) (KG/MOL) (%)

L29276-138: Convencional 75,75 1,23 0,04 640 7,3

L29276-183: Alta densidad celular 72,56 0,20 0,01 670 5,1

Especificacion: NA <2,00 <2,00 NA <15

Los rendimientos finales de PS de los dos lotes 6A fueron ambos > 70 %, que eran los mas altos entre los serotipos procesados usando el procedimiento acortado. Las relaciones de protema, de NA y de C-PS estaban todas dentro de las especificaciones.

La Tabla 12 y la Figura 7 muestran el cambio en el rendimiento de PS en el procedimiento, la relacion de protema y de NA en cada una de las etapas de purificacion. Apenas hubo perdida de PS en la primera centrifugacion y en la etapa de UF/DF 100 K. Aproximadamente el 10-15 % de la perdida de PS sucedfa en las etapas de acidificacion y de adsorcion en carbono activado, que estaba cercana a la de los otros serotipos. La reduccion principal de la relacion de protema y de NA era por la primera centrifugacion, por UF/DF 100 K y por acidificacion. Despues de la acidificacion, ambas relaciones de protema y de NA ya estaban por debajo de sus especificaciones. Para las protemas, la acidificacion era la etapa mas eficaz, mientras que para NA, la UF/DF 100 K reducfa la mayor cantidad de la relacion de NA/PS. Aunque la etapa de adsorcion en carbono activado no retiraba una cantidad significativa de protemas y de NA debido a niveles muy bajos de impurezas despues de la acidificacion, la etapa aun era necesaria para la eliminacion del color.

Tabla 12. Rendimiento de PS en el procedimiento, relacion de protema y de NA de tipo 6A.

ETAPA: RENDIMIENTO DE PS (%) PROTEiNA/PS (%) ACIDO NUCLEICO/PS (%)

L29276-138: L29276-183 L29276-138 L29276-183 L29276-138 L29276-183

Caldo: 100,00 100,00 214,35 138,71 211,45 163,88

Centrifugacion: 99,35 97,80 183,43 149,71 177,03 150,41

UF/DF 100K: 93,19 100,40 114,72 103,00 43,38 40,43

Acidificacion: 89,87 87,90 0,16 0,87 1,09 0,97

Carbono: 76,02 75,70 0,62 0,85 0,09 0,07

UF/DF 30K: 75,57 72,90 0,00 0,07 0,04 0,02

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Lotes de purificacion acortada de tipo 1: Se resumen dos lotes de tipo 1 purificados por el procedimiento acortado en la Tabla 13. El lote L29276-170 se purifico a partir de caldo de fermentacion de alta densidad celular y L29276-173 era de caldo de fermentacion convencional.

Tabla 13. Sumario de lotes de purificacion acortada de tipo 1.

LOTE: CALDO RENDIMIENTO DE PS (%) PROTEiNA/PS (%) NA/PS (%) PESO MOLECULAR (KG/MOL) C-PS (%)

L29276-170: Alta densidad celular 50,96 0,44 0,08 501 5,3

L29276-173: SOP 53,84 1,23 0,01 458 11,9

Especificacion: NA <2 <2 NA <15

Los rendimientos de PS para ambos lotes fueron de aproximadamente el 50 %, y los niveles de impurezas para protemas, para NA y para C-PS estuvieron todos dentro de sus especificaciones.

El rendimiento de PS en el procedimiento, las relaciones de protema y de NA despues de cada una de las etapas de purificacion se muestran en la Tabla 14 y en la Figura 8. Las tendencias fueron similares a otros serotipos modificados. La perdida de PS sucedfa principalmente en las etapas de acidificacion y adsorcion en carbono activado, y la mayona de la retirada de protemas y de NA sucedfa en las tres primeras etapas. Se retiraba mas NA en la etapa de UF/DF 100 K que protemas. Aunque la etapa de adsorcion en carbono activado no retiraba una cantidad significativa de protemas y de NA debido a niveles muy bajos de impurezas despues de la acidificacion, la etapa aun era necesaria para la eliminacion del color.

Tabla 14. Rendimiento de PS en el procedimiento promedio, relacion de protema y de NA de tipo 1.

ETAPA: RENDIMIENTO DE PS (%) PROTEiNA/PS (%) NA/PS (%)

L29276-170: L29276-173 L29276-170 L29276-173 L29276-170 L29276-173

Caldo: 100,00 100,00 453,30 595,20 594,41 1178,98

Centrifugacion: 93,99 105,63 301,86 396,97 340,55 1018,47

UF/DF 50/100K: 88,33 105,62 232,34 235,08 17,49 182,56

Acidificacion: 66,54 87,67 0,54 4,87 1,09 5,85

Carbono: 55,85 59,69 1,91 1,86 0,49 0,01

UF/DF 30K: 51,24 55,59 0,36 0,92 1,65 0,01

Lotes de purificacion acortada de tipo 14: Se purificaron dos lotes de serotipo 14 usando el procedimiento acortado de purificacion sin desviaciones del procedimiento. El rendimiento final de PS y los niveles de impurezas se resumen en la Tabla 15.

Tabla 15. Sumario de lotes de purificacion acortada de tipo 14.

LOTE: CALDO RENDIMIENTO DE PROTEiNA/ NA/PS PESO MOLECULAR C-PS

PS (%)
PS (%): (%) (KG/MOL) (%)

L32874-155: Alta densidad celular 51,3 2,06 0,03 520 4,2

L32874-163: SOP 56,7 1,39 0,03 662 2,9

Especificacion: NA <3 <2 >400 <15

Similar al serotipo 7F, el serotipo 14 es un polisacarido no ionico, y su procedimiento actual de purificacion es ligeramente diferente de los otros serotipos. Sin embargo, el procedimiento acortado de purificacion de la presente invencion se aplico satisfactoriamente al serotipo 14 sin la necesidad de dichas etapas adicionales. Los rendimientos de PS de los dos lotes del procedimiento acortado de purificacion fueron del 50-60 %, y las relaciones de protema y de NA estuvieron dentro de sus especificaciones. Los pesos moleculares del PS purificado tambien cumplfan la especificacion.

El rendimiento de PS en el procedimiento, las relaciones de protemas y de NA se resumen en la Tabla 16 y en la Figura 9. Se observaron tendencias similares de perdida de PS, retirada de protemas y de NA que para los otros serotipos ensayados descritos anteriormente.

Tabla 16. Rendimiento de PS en el procedimiento promedio, relacion de protema y de NA de tipo 14.

ETAPA: RENDIMIENTO DE PS (%) PROTEiNA/PS (%)

L32874-155: L232874-163 L32874-155 L232874-163

Caldo: 100,00 100,00 109,73 286,56

Centrifugacion: 91,40 90,80 110,88 201,48

UF/DF 50/100K: 82,40 68,70 45,52 165,69

Acidificacion: 65,40 93,90 0,65 0,47

Carbono: 59,40 74,60 0,60 0,10

UF/DF 30K: 53,10 57,60 0,57 0,41

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Tabla 16, continuacion.

ETAPA: NA/PS (%)

L32874-155: L232874-163

Caldo: 192,80 272,50

Centrifugacion: 135,50 201,82

UF/DF 50/100K: 47,10 64,54

Acidificacion: 0,89 1,08

Carbono: 0,17 0,21

UF/DF 30K: 0,13 0,25

Ejemplo 2. Comparacion de diferentes serotipos (serotipos 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A y 19F).

Para comparer la purificacion de los diferentes serotipos usando el procedimiento acortado de purificacion de la presente invencion, se represento la retirada de PS de todos los serotipos descritos en el Ejemplo 1 mas los serotipos 9V, 18C y 19F en un grafico en la Figura 10. La mayona de los serotipos segma una tendencia similar con perdida de PS en cada una de las etapas de purificacion. Hubo un aumento en el rendimiento de PS para el tipo 6B en la primera etapa de centrifugacion y del tipo 14 en la etapa de acidificacion. El porcentaje de perdida de PS vario de un serotipo a otro. El tipo 5 parecfa perder la mayona de PS en la etapa de acidificacion y el tipo 14 en la etapa de adsorcion en carbono activado.

Las relaciones de protema/PS para cada etapa de purificacion para cada uno de los serotipos se muestran en la Figura 11. La figura muestra que habfa una diferencia en las relaciones iniciales de protema/PS para los diferentes serotipos, teniendo los tipos 1, 4, 5, 9V, 19F y 18C las mayores relaciones iniciales de protema/PS. Aunque las relaciones de protema/PS eran mucho mayores para los tipos 1, 4, 5, 9V, 19F y 18C en comparacion con los otros serotipos incluso despues de la primera etapa de UF/DF, la etapa de acidificacion reducfa enormemente la relacion de protema/PS y no quedaba mucha mas protema despues de esta etapa.

Como se muestra en la Figura 2, las relaciones de NA/PS tambien variaban de un serotipo a otro. Los tipos 1 y 5 teman la mayor relacion de NA/PS, seguido por los tipos 18C y 4. La primera etapa de centrifugacion y de UF/DF retiraba una cantidad significativa de NA de estos serotipos y el tipo 1 parecfa ser el mas eficaz. Habfa muy poco NA despues de la etapa de acidificacion.

Ejemplo 3. Analisis de eficacia de la etapa de acidificacion y de adsorcion en carbono activado (serotipos 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A y 19F).

Para la purificacion de polisacaridos PnC, la impureza mas significativa y diffcil de retirar son las protemas. Para entender mejor la eficacia de retirada de impurezas del procedimiento acortado, se analizaron dos de las etapas principales de purificacion, la acidificacion y la adsorcion en carbono activado, para la retirada de protemas. Para la etapa de acidificacion, la diferencia en la concentracion de protemas (SDS-PAGE) antes y despues de la acidificacion se represento frente a la concentracion inicial de protemas antes de la acidificacion para los serotipos 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9v, 14, 18C, 19A y 19F usando el procedimiento acortado de purificacion de la invencion (Figura 13).

Debido a los cambios relativamente pequenos en el volumen de solucion antes y despues de la etapa de acidificacion, la diferencia en la concentracion de protemas dividida por la concentracion inicial de protemas reflejaba la tasa de retirada de protemas por la etapa de acidificacion. La Figura 13 muestra la pendiente del ajuste lineal de la diferencia en la concentracion de protemas con respecto a la concentracion inicial de protemas (por ensayo de SDS- PAGE). Se observo una muy buena relacion lineal entre el cambio de concentracion de protemas y la concentracion inicial, con el R2 cercano a 1. La pendiente era de 0.9876, que corresponde a una retirada de protemas del 98,76 % (asumiendo un cambio insignificante de volumen de solucion). Por lo tanto, para todos los serotipos estudiados, la etapa de acidificacion era muy eficaz y, de promedio, retiraba mas del 98 % de las protemas.

Similar a la etapa de acidificacion, tambien se evaluo la eficacia de la etapa de adsorcion en carbono activado representando la cantidad de protemas retirada (adsorbida en carbono) con respecto a la carga inicial de protemas (Figura 14). Se observo una buena relacion lineal entre las protemas retiradas y la carga inicial de protemas, aunque el R2 (0,9723) no era tan alto como para la etapa de acidificacion. Como la pendiente de este ajuste lineal corresponde a la tasa de retirada de protemas, la etapa de adsorcion en carbono activado produda una retirada de protemas del 93,87 %.

Basandose en un analisis de las etapas de acidificacion y de adsorcion en carbono activado, despues de las dos etapas quedaba solamente aproximadamente un 0,1 % de protemas en la solucion.

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Conclusiones para los Ejemplos 1-3

Se desarrollo un procedimiento acortado de purificacion para remplazar el actual procedimiento de purificacion para polisacaridos capsulares de S. pneumoniae. El procedimiento acortado de purificacion se aplicaba directamente a los serotipos 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C y 19F y para 19A con una ligera desviacion. El procedimiento se realizo a escala de 10 l usando caldos de fermentacion lisados con DOC. Los niveles de impurezas, incluyendo las relaciones de protema/PS, de NA/PS y de C-PS/PS, cumplfan, todos, sus respectivas especificaciones. Los rendimientos de PS eran por encima del 50 % y comprables a los del actual procedimiento de purificacion. El rendimiento de PS en el procedimiento, las relaciones de protema/PS y de NA/PS se representaron para comparar el comportamiento de diferentes serotipos. Se descubrio que los serotipos 1,5, 9V, 19F y 18C eran los mas diffciles de purificar basandose en las relaciones de protema/PS antes y despues de la etapa de Uf/DF 100 K.

El analisis de etapas mostro que las etapas de acidificacion y de adsorcion en carbono activado retiraban mas del 98 % y del 90 % de las protemas, respectivamente (medido por SDS-PAGE).

Ejemplo 4. Sustitucion de agentes liticos de origen no animal por desoxicolato sodico en la produccion de polisacaridos

El presente ejemplo investigo si agentes ltticos de origen no animal podnan usarse como sustituto para desoxicolato sodico (DOC) dentro del procedimiento descrito anteriormente para la produccion de polisacaridos capsulares sustancialmente purificados de Streptococcus pneumoniae. Como se describe anteriormente, DOC activa la protema LytA, que es una autolisina que esta implicada en el crecimiento de la pared celular y en la division en Streptococcus pneumoniae. La protema LytA tiene dominios de union a colina en su parte C-terminal, y se sabe que mutaciones del gen lytA producen mutantes LytA que son resistentes a lisis con DOC.

Se desarrollo un rapido ensayo en placa de microtitulacion para identificar compuestos que causan lisis celular por un mecanismo similar al de DOC. Se identificaron varias alternativas de origen no animal a DOC que son igual de eficaces que DOC en la eliminacion de celulas de Streptococcus pneumoniae y en la liberacion de polisacarido. Despues del procesamiento usando condiciones convencionales, el tamano y la pureza de los polisacaridos producidos con los compuestos de origen no animal eran identicos a los producidos con DOC.

Procedimientos

Lisis celular: Los compuestos a ensayar se anadieron al caldo de fermentacion a una concentracion final del 0,1 al 0,01 % (v/v) y se permitio que la solucion se incubara a 37 °C durante una hora. La solucion despues se almaceno a 2-8 °C durante una noche. La siguiente manana la solucion se centrifugo para retirar todos los desechos celulares. Se analizo el caldo sin celulas por SEC-HPLC para determinar la concentracion de polisacarido liberado. La lisis podfa realizarse a cualquier temperatura entre 2-37 °C, preferentemente a un intervalo de pH de 6,0-7,5. La concentracion del detergente era tfpicamente entre el 0,05-0,2 % dependiendo del detergente particular.

Ensayo de microtitulacion: Se ideo un rapido ensayo en placa de microtitulacion para examinar la lisis dependiente de lytA de neumococos por diferentes detergentes o tensioactivos. Se usaron dos pares de cepas isogenicas de S. pneumoniae en el ensayo; un miembro de cada par era de tipo silvestre para el gen lytA mientras que la otra cepa portaba una delecion en el gen lytA. Por tanto, si la lisis era dependiente de una funcion lytA activa, ese detergente no lisana las cepas mutantes. Las cuatro cepas, R6X, R6X AlytA, D39 y D39 AlytA, se cultivaron en medio HySoy hasta aproximadamente fase semi-log (DO600 ~0,2-0,8; DO600 = densidad optica a 600 nm). Las celulas despues se centrifugaron y se resuspendieron los sedimentos celulares en medio HySoy. A cada pocillo de la placa de microtitulacion, se le anadieron 100 pl de suspension celular, junto con 10 pl de soluciones madre de detergente o agua como control. Despues de aproximadamente 15 minutos a 36 °C, se midio la DO600 de las muestras con un espectrofotometro Spectramax® (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Se observaron los siguientes resultados para celulas recien preparadas o para celulas congeladas y descongeladas: celulas de tipo silvestre expuestas a DOC, dodecil sulfato sodico, Triton® X-100 y N-lauril sarcosina todas teman valores de DO comparables al blanco de medio, que indicaba que habfa sucedido lisis. Por otro lado, las celulas AlytA no se lisaban en presencia de estos detergentes, lo que indica que la funcion LytA es necesaria para que estos detergentes lisen las celulas.

Aislamiento de PS usado para estudios analiticos comparativos: Se hicieron crecer cultivos en medio Hy-Soy en biorreactores de 10 l. El pH se controlo a aproximadamente 7,0 usando NaOH o Na2CO3. Al final del cultivo (indicado por ausencia de aumento adicional en la densidad optica), los cultivos se trataron con DOC al 0,12 % o con NLS al 0,1 %. Los cultivos se incubaron durante 12-16 horas. La eficacia de eliminacion celular se confirmo sembrando una muestra de caldo tratado en placas de agar con sangre-TSA. El polisacarido se purifico del lisado aclarado usando procedimientos convencionales (como se describe anteriormente). El polisacarido purificado se examino usando una diversidad de tecnicas analfticas convencionales apropiadas para determinar la pureza e identidad del material.

El contenido de PS del lisado se determino usando SEC-HPLC acoplada a un detector del mdice de refraccion (RI).

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Seleccion de agentes liticos de origen no animal usando los serotipos 1 y 6B

Se cultivaron por separados los serotipos 1 y 6B de S. pneumoniae en medios basados en Hy-Soy. Los cultivos se recogieron por separado y se distribuyeron por separado en tubos. Los compuestos de origen no animal a seleccionar para la actividad lttica comparable con DOC se prepararon como soluciones madre (en disolventes adecuados) y se anadieron a los cultivos. Despues de incubacion durante una noche, los tubos se centrifugaron y se determino el contenido de PS de los lisados para cada serotipo por SEC-HPLC y se compararon con DOC.

Seleccion de agentes liticos de origen no animal usando mutantes lytA

Se cultivaron pares isogenicos de cepas que conteman la mutacion lytA en un medio basado en Hy-Soy. Las celulas se recogieron y se distribuyeron en pocillos en una placa de microtitulacion. El compuesto de ensayo se anadio y se incubo el cultivo. Despues de 15 minutos a 36 °C, se determino la densidad optica (DO600) de cada pocillo usando un lector de placa SpectraMax® (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) (veanse las Tablas 17 y 18, que resumen los resultados de dos ensayos diferentes para compuestos ejemplares).

Tabla 17. Cambio en la densidad optica para cepas mutantes lytA (Ensayo 1)

: Cambio en la DO600

Compuesto: R6X R6X AlytA D39 D39 AlytA

Blanco

Sin adicion

Acido desoxicolico, 0,1 %: 100 % 34 % 99 % 47 %

Acido litocolico, 0,1 %: 20 % 16 % 8 % -2 %

Acido tauroglicocolico, 0,1 %: 51 % -16 % 47 % -20 %

Acido heptanoico, 0,1 %: 25 % -57 % 7 % -30 %

SDS, 0,1 %: 99 % 28 % 95 % 36 %

Acido octanosulfonico, 0,1 %: 43 % 6 % 34 % 16 %

Triton® X-100, 0,1 %: 91 % 22 % 97 % 30 %

Tween 80, 0,1 %: 36 % 14 % 20 % 19 %

Tween 20, 0,1 %: 44 % 22 % 28 % 19 %

N-lauril sarcosina, 0,1 %: 100 % -34 % 89 % -44 %

Pluronic L31, 0,1 %: 39 % 0 % 17 % -38 %

Pluronic L-61, 0,1 %: 23 % -3 % -19 % 14 %

Pluronic L81, 0,1 %: 21 % -3 % -14 % 10 %

Antarox 17-R-2, 0,1 %: 37 % 24 % 7 % 16 %

Tabla 18. Cambio en la densidad optica para cepas mutantes de lytA (Ensayo 2)

: Cambio en la DO600

Compuesto: R6X R6X AlytA D39 D39 AlytA

Blanco

Sin adicion

Agua: -8 % -8 % 3 % -8 %

Acido desoxicolico, 0,1 %: 103 % 20 % 101 % 41 %

SDS, 0,1 %: 102 % -13 % 100 % 16 %

N-lauril sarcosina, 0,1 %: 102 % -40 % 101 % 14 %

Triton® X-100, 0,1 %: 101 % -19 % 100 % 4 %

Tween 20, 0,1 %: 6 % -17 % -5 % -3 %

Acido octanosulfonico, 0,1 %: 13 % 3 % 18 % -3 %

Basandose en los estudios de seleccion descritos anteriormente, se identificaron las siguientes alternativas de agente lftico de origen no animal a DOC: acido decanosulfonico, Igepal® CA-630 (terc-octilfenoxi poli(oxietileno)etanol; CAS n.°: 9002-93-1; disponible en Sigma Aldrich, St. Louis, MO), N-lauril sarcosina sodica (NLS), iminodipropionato de laurilo, dodecil sulfato sodico, Triton® X-100, quenodesoxicolato, hiodesoxicolato, glicodesoxicolato, taurodesoxicolato, tauroquenodesoxicolato y colato.

Comparacion de PS lisado con DOC a PS lisado con NLS

Se purificaron los serotipos 1, 4, 5, 6A, 6B y 7F de polisacaridos de S. pneumoniae a la escala de 10 l como se describe anteriormente en los Ejemplos 1 y 2 usando el procedimiento mejorado de la presente invencion. Sin embargo, en un grupo se uso NLS (0,1 %) como agente lftico mientras que en otro grupo se uso DOC (0,12 %) como agente lftico.

Se midieron el rendimiento de PS, las relaciones de protema/PS, las relaciones de NA/PS y el peso molecular de PS como se describe anteriormente, y los resultados se resumen en la Tabla 19. Estos resultados mostraron que el uso

de NLS como agente lttico en los procedimientos de purificacion de la invencion produda rendimientos relativamente altos de PS con niveles relativamente bajos de protemas y de acido nucleicos. De hecho, para la mayona de los serotipos ensayados, el uso de NLS como agente lttico produda mayores rendimientos de PS en comparacion con el uso de DOC.

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Tabla 19. Caracterizacion de PS para diferentes serotipos usando DOC frente a NLS

Serotipo: Agente litico Rendimiento de PS (%) Protema/PS (%) Acido nucleico/PS (%) PM por SEC MALLS (g/mol, 106)

1: DOC 0,12 % 20 % 4,2 % 0,04 % 0,615

1: NLS 0,1 % 41 % 2 % 0,04 % 0,65

4: DOC 0,12 % 72 % 0,05 % 0,02 % 0,38

4: NLS 0,1 % 57 % 0,67 % 0,25 % 0,34

5: DOC 0,12 % 57 % 3,6 % 0,18 % 0,32

5: NLS 0,1 % 63 % 1,8 % 0,01 % 0,35

6A: DOC 0,12 % 56 % 0,7 % 0,00 % 0,55

6A: NLS 0,1 % 66 % 1,1 % 0,05 % 0,43

6B: DOC 0,12 % 38 % 0,6 % 0,05 % 0,969

6B: NLS 0,1 % 55 % 0,1 % 0,01 % 1,0

7F: DOC 0,12 % 73 % 0,7 % 0,06 % 0,814

7F: NLS 0,1 % 76 % 0,5 % 0,02 % 0,912

Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de los expertos en la materia a la que pertenece la presente invencion.

Aunque la invencion anterior se ha descrito en algun detalle a modo de ilustracion y ejemplo con propositos de 10 claridad de comprension, sera obvio que pueden ponerse en practica ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Las realizaciones particulares de la invencion se exponen en los siguientes parrafos numerados:

1. Un procedimiento de produccion de polisacaridos capsulares sustancialmente purificados a partir de un lisado celular de Streptococcus pneumoniae, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

15 (a) proporcionar un caldo de fermentacion que comprende celulas bacterianas que producen un serotipo

seleccionado de Streptococcus pneumoniae;

(c) aclarar el lisado celular de la etapa (b) usando centrifugacion o filtracion para retirar los desechos celulares,

20 produciendo de ese modo un lisado celular aclarado;

25 (f) mantener la solucion acidificada de retenido formada en la etapa (e) durante un tiempo suficiente para permitir

la sedimentacion del precipitado, seguido por filtracion o centrifugacion de la solucion acidificada de retenido, produciendo de ese modo una solucion aclarada de polisacarido;

(h) ultrafiltrar y diafiltrar la solucion filtrada producida por la etapa (g), produciendo de ese modo una solucion

30 concentrada de polisacarido purificado; y

(i) filtrar la solucion concentrada de polisacarido purificado producida por la etapa (h) usando un filtro esteril; mediante lo cual se producen polisacaridos capsulares sustancialmente purificados en forma de una solucion.

2. El procedimiento del parrafo 1, en el que el serotipo seleccionado de Streptococcus pneumoniae se selecciona del grupo que consiste en 1, 4,5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F.

35 3. El procedimiento del parrafo 1 o 2, en el que el pH de la etapa (e) se disminuye hasta aproximadamente 3,5.

4. El procedimiento del parrafo 1, 2 o 3, en el que la diafiltracion de la etapa (h) comprende un ajuste de pH entre aproximadamente 5,5 hasta aproximadamente 7,5.

5. El procedimiento del parrafo 1, 2 o 3, en el que la diafiltracion de la etapa (h) comprende un ajuste de pH entre aproximadamente 7,0 hasta aproximadamente 7,5.

40 6. El procedimiento del parrafo 1, 2 o 3, en el que la diafiltracion de la etapa (h) comprende un ajuste de pH hasta

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aproximadamente 7,4.

7. El procedimiento de uno cualquiera de los parrafos 1 a 6, en el que la etapa (e) retira al menos el 98 % de las protemas del retenido de la etapa (d).

8. El procedimiento de uno cualquiera de los parrafos 1 a 7, en el que la etapa (g) retira al menos el 90 % de las protemas de la solucion aclarada de polisacarido de la etapa (f).

9. El procedimiento de uno cualquiera de los parrafos 1 a 8, en el que el filtro de carbono activado de la etapa (g) comprende carbono activado con acido fosforico basado en madera.

10. El procedimiento de uno cualquiera de los parrafos 1 a 9, en el que la etapa (f) comprende mantener la solucion acidificada de retenido formada en la etapa (e) durante al menos 2 horas.

11. El procedimiento de uno cualquiera de los parrafos 1 a 10, en el que el agente lftico de la etapa (b) es desoxicolato sodico.

12. El procedimiento de uno cualquiera de los parrafos 1 a 10, en el que el agente lftico de la etapa (b) es un agente lftico de origen no animal.

13. El procedimiento del parrafo 12, en el que dicho agente lftico de origen no animal se selecciona del grupo que consiste en: acido decanosulfonico, terc-octilfenoxi poli(oxietilen)etanoles; condensados de octilfenol y oxido etileno, N-lauril sarcosina sodica (NLS), iminodipropionato de laurilo, dodecil sulfato sodico, quenodesoxicolato, hiodesoxicolato, glicodesoxicolato, taurodesoxicolato, tauroquenodesoxicolato y colato.

14. El procedimiento del parrafo 12, en el que dicho agente lftico de origen no animal es N-lauril sarcosina sodica.

15. Un procedimiento para producir polisacaridos capsulares sustancialmente purificados a partir de un lisado celular de Streptococcus pneumoniae que comprenden el serotipo 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F o 23F, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

mediante lo cual se producen polisacaridos capsulares sustancialmente purificados que comprenden el serotipo 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F o 23F en forma de una solucion.

16. El procedimiento del parrafo 15, en el que el pH de la etapa (e) se disminuye hasta aproximadamente 3,5.

17. El procedimiento del parrafo 15 o 16, en el que la diafiltracion de la etapa (h) comprende un ajuste de pH entre aproximadamente 5,5 hasta aproximadamente 7,5.

18. El procedimiento del parrafo 15 o 16, en el que la diafiltracion de la etapa (h) comprende un ajuste de pH entre aproximadamente 7,0 hasta aproximadamente 7,5.

19. El procedimiento del parrafo 15 o 16, en el que la diafiltracion de la etapa (h) comprende un ajuste de pH hasta aproximadamente 7,4.

20. El procedimiento de uno cualquiera de los parrafos 15 a 19, en el que la etapa (e) retira al menos el 98 % de las protemas del retenido sin sal de la etapa (d).

21. El procedimiento de uno cualquiera de los parrafos 15 a 20, en el que la etapa (g) retira al menos el 90 % de las

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protemas de la solucion aclarada de polisacarido de la etapa (f).

22. El procedimiento de uno cualquiera de los parrafos 15 a 21, en el que el filtro de carbono activado de la etapa (g) comprende carbono activado con acido fosforico basado en madera.

23. El procedimiento de uno cualquiera de los parrafos 15 a 22, en el que el agente lftico de la etapa (b) es desoxicolato sodico.

24. El procedimiento de uno cualquiera de los parrafos 15 a 22, en el que el agente lftico de la etapa (b) es un agente lftico de origen no animal.

25. El procedimiento del parrafo 24, en el que dicho agente lftico de origen no animal se selecciona del grupo que consiste en: acido decanosulfonico, terc-octilfenoxi poli(oxietilen)etanoles; condensados de octilfenol y oxido etileno, N-lauril sarcosina sodica (NLS), iminodipropionato de laurilo, dodecil sulfato sodico, quenodesoxicolato, hiodesoxicolato, glicodesoxicolato, taurodesoxicolato, tauroquenodesoxicolato y colato.

26. El procedimiento del parrafo 24, en el que dicho agente lftico de origen no animal es N-lauril sarcosina sodica.

27. Un procedimiento para producir polisacaridos capsulares sustancialmente purificados a partir de un lisado celular de Streptococcus pneumoniae que comprenden el serotipo 19A, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

mediante lo cual se producen polisacaridos capsulares sustancialmente purificados que comprenden el serotipo 19A en forma de una solucion.

28. El procedimiento del parrafo 27, en el que el pH de la etapa (e) se disminuye hasta aproximadamente 3,5.

29. El procedimiento del parrafo 27 o 28, en el que la diafiltracion de la etapa (i) comprende un ajuste de pH entre aproximadamente 5,5 hasta aproximadamente 7,5.

30. El procedimiento del parrafo 27 o 28, en el que la diafiltracion de la etapa (i) comprende un ajuste de pH entre aproximadamente 7,0 hasta aproximadamente 7,5.

31. El procedimiento del parrafo 27 o 28, en el que la diafiltracion de la etapa (i) comprende un ajuste de pH hasta aproximadamente 7,4.

32. El procedimiento de uno cualquiera de los parrafos 27 a 31, en el que la etapa (e) retira al menos el 98 % de las protemas del retenido de la etapa (d).

33. El procedimiento de uno cualquiera de los parrafos 27 a 32, en el que la etapa (h) retira al menos el 90 % de las protemas de la solucion aclarada de polisacarido de pH ajustado de la etapa (g).

34. El procedimiento de uno cualquiera de los parrafos 27 a 33, en el que el filtro de carbono activado de la etapa (h) comprende carbono activado con acido fosforico basado en madera.

35. El procedimiento de uno cualquiera de los parrafos 27 a 34, en el que el tampon fosfato sodico de la etapa (d) es fosfato sodico 25 mM.

36. El procedimiento de uno cualquiera de los parrafos 27 a 35, en el que el agente lftico de la etapa (b) es desoxicolato sodico.

37. El procedimiento de uno cualquiera de los parrafos 27 a 35, en el que el agente lftico de la etapa (b) es un agente lftico de origen no animal.

5 38. El procedimiento del parrafo 37, en el que dicho agente lftico de origen no animal se selecciona del grupo que

consiste en: acido decanosulfonico, terc-octilfenoxi poli(oxietilen)etanoles; condensados de octilfenol y oxido etileno, N-lauril sarcosina sodica (NLS), iminodipropionato de laurilo, dodecil sulfato sodico, quenodesoxicolato, hiodesoxicolato, glicodesoxicolato, taurodesoxicolato, tauroquenodesoxicolato y colato.

39. El procedimiento del parrafo 37, en el que dicho agente lftico de origen no animal es N-lauril sarcosina sodica.

10 40. Un procedimiento de fabricacion de una vacuna de neumococos, que comprende producir polisacaridos

capsulares sustancialmente purificados a partir de un lisado celular de Streptococcus pneumoniae por un procedimiento como se describe en uno cualquiera de los parrafos 1 a 39 y usando dichos polisacaridos capsulares purificados en la fabricacion de una vacuna de neumococos.

41. El procedimiento como se describe en la reivindicacion 40 en el que la vacuna de neumococos contiene 15 polisacarido conjugado con un vehftculo proteico.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de produccion de polisacaridos capsulares purificados a partir de un lisado celular de Streptococcus pneumoniae, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

(a) proporcionar un caldo de fermentacion que comprende celulas bacterianas que producen un serotipo seleccionado de Streptococcus pneumoniae;

(b) lisar las celulas bacterianas en la etapa (a) con un agente lttico, produciendo de ese modo un lisado celular que comprende desechos celulares, protemas solubles, acidos nucleicos y polisacaridos;

(c) aclarar el lisado celular de la etapa (b) usando centrifugacion o filtracion para retirar los desechos celulares, produciendo de ese modo un lisado celular aclarado;

(d) ultrafiltrar y diafiltrar el lisado celular aclarado de la etapa (c) para retirar las impurezas de bajo peso molecular y aumentar la concentracion de polisacarido, produciendo de ese modo un retenido;

(e) disminuir el pH del retenido de la etapa (d) hasta menos de 4,5 usando un acido organico o uno mineral para precipitar las protemas y los acidos nucleicos, formando de ese modo una solucion acidificada de retenido;

(f) mantener la solucion acidificada de retenido formada en la etapa (e) durante un tiempo suficiente para permitir la sedimentacion del precipitado, seguido por filtracion o centrifugacion de la solucion acidificada de retenido, produciendo de ese modo una solucion aclarada de polisacarido;

(g) filtrar la solucion aclarada de polisacarido de la etapa (f) a traves de un filtro de carbono activado;

(h) ultrafiltrar y diafiltrar la solucion filtrada producida por la etapa (g), produciendo de ese modo una solucion concentrada de polisacarido purificado; y

(i) filtrar la solucion concentrada de polisacarido purificado producida por la etapa (h) usando un filtro esteril; mediante lo cual se producen polisacaridos capsulares purificados en forma de una solucion.
2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el serotipo seleccionado de Streptococcus pneumoniae se selecciona del grupo que consiste en 1, 4,5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F.
3. El procedimiento de la reivindicacion 1 que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un caldo de fermentacion que comprende celulas bacterianas que producen Streptococcus pneumoniae serotipo 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F o 23F;

(b) lisar las celulas bacterianas en la etapa (a) con un agente lttico, produciendo de ese modo un lisado celular que comprende desechos celulares, protemas solubles, acidos nucleicos y polisacaridos;

(c) aclarar el lisado celular de la etapa (b) usando centrifugacion o filtracion para retirar los desechos celulares, produciendo de ese modo un lisado celular aclarado;

(d) ultrafiltrar y diafiltrar el lisado celular aclarado de la etapa (c) a temperatura ambiente a pH neutro en medio sin sal para retirar las impurezas de bajo peso molecular y aumentar la concentracion de polisacarido, produciendo de ese modo un retenido sin sal;

(e) disminuir el pH del retenido sin sal de la etapa (d) hasta menos de 4,5 usando un acido organico o uno mineral para precipitar las protemas y los acidos nucleicos, formando de ese modo una solucion acidificada de retenido;

(f) mantener la solucion acidificada de retenido formada en la etapa (e) durante al menos 2 horas a temperatura ambiente para permitir la sedimentacion del precipitado, seguido por filtracion o centrifugacion de la solucion acidificada de retenido, produciendo de ese modo una solucion aclarada de polisacarido;

(g) filtrar la solucion aclarada de polisacarido de la etapa (f) a traves de un filtro de carbono activado;

(h) ultrafiltrar y diafiltrar la solucion filtrada producida por la etapa (g), produciendo de ese modo una solucion concentrada de polisacarido purificado; y

(i) filtrar la solucion concentrada de polisacarido purificado producida por la etapa (h) usando un filtro esteril;

mediante lo cual se producen polisacaridos capsulares purificados que comprenden el serotipo 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F o 23F en forma de una solucion.
4. El procedimiento de la reivindicacion 1, 2 o 3, en el que el pH de la etapa (e) se disminuye hasta aproximadamente 3,5.
5. El procedimiento de la reivindicacion 1, 2, 3 o 4 en el que la diafiltracion de la etapa (h) comprende un ajuste de pH entre aproximadamente 5,5 hasta aproximadamente 7,5, preferentemente en el que la diafiltracion de la etapa (h) comprende un ajuste de pH entre aproximadamente 7,0 hasta aproximadamente 7,5, incluso mas preferentemente en el que la diafiltracion de la etapa (h) comprende un ajuste de pH hasta aproximadamente 7,4.
6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la etapa (e) retira al menos el 98 % de las protemas del retenido de la etapa (d).
7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la etapa (g) retira al menos el 90 % de las protemas de la solucion aclarada de polisacarido de la etapa (f).

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8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1a 7, en el que el filtro de carbono activado de la etapa (g) comprende carbono activado con acido fosforico basado en madera.
9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la etapa (f) comprende mantener la solucion acidificada de retenido formada en la etapa (e) durante al menos 2 horas.
10. El procedimiento de la reivindicacion 1, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

(a) proporcionar un caldo de fermentacion que comprende celulas bacterianas que producen Streptococcus pneumoniae serotipo 19A;

(b) lisar las celulas bacterianas en la etapa (a) con un agente lftico, produciendo de ese modo un lisado celular que comprende desechos celulares, protemas solubles, acidos nucleicos y polisacaridos;

(c) aclarar el lisado celular de la etapa (b) usando centrifugacion o filtracion para retirar los desechos celulares, produciendo de ese modo un lisado celular aclarado;

(d) ultrafiltrar y diafiltrar el lisado celular aclarado de la etapa (c) a aproximadamente 4 °C a un pH de aproximadamente 6 en tampon fosfato sodico para retirar las impurezas de bajo peso molecular y aumentar la concentracion de polisacarido, produciendo de ese modo un retenido;

(e) disminuir el pH del retenido de la etapa (d) hasta menos de 4,5 usando un acido organico o uno mineral para precipitar las protemas y los acidos nucleicos, formando de ese modo una solucion acidificada de retenido;

(f) mantener la solucion acidificada de retenido formada en la etapa (e) durante al menos 2 horas a aproximadamente 4 °C para permitir la sedimentacion del precipitado, seguido por filtracion o centrifugacion de la solucion acidificada de retenido, produciendo de ese modo una solucion aclarada de polisacarido;

(g) ajustar el pH de la solucion aclarada de polisacarido de la etapa (f) hasta aproximadamente 6, produciendo de ese modo una solucion aclarada de polisacarido de pH ajustado;

(h) filtrar la solucion aclarada de polisacarido de pH ajustado de la etapa (g) a traves de un filtro de carbono activado;

(i) ultrafiltrar y diafiltrar la solucion filtrada producida por la etapa (h), produciendo de ese modo una solucion concentrada de polisacarido purificado; y

(j) filtrar la solucion concentrada de polisacarido purificado producida por la etapa (i) usando un filtro esteril;

mediante lo cual se producen polisacaridos capsulares purificados que comprenden el serotipo 19A en forma de una solucion.
11. El procedimiento de la reivindicacion 10, en el que el pH de la etapa (e) se disminuye hasta aproximadamente 3,5.
12. El procedimiento de la reivindicacion 10 u 11, en el que la diafiltracion de la etapa (i) comprende un ajuste de pH entre aproximadamente 5,5 hasta aproximadamente 7,5, preferentemente en el que la diafiltracion de la etapa (i) comprende un ajuste de pH entre aproximadamente 7,0 hasta aproximadamente 7,5, incluso mas preferentemente en el que la diafiltracion de la etapa (i) comprende un ajuste de pH hasta aproximadamente 7,4.
13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que la etapa (e) retira al menos el 98 % de las protemas del retenido de la etapa (d).
14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que la etapa (h) retira al menos el 90 % de las protemas de la solucion aclarada de polisacarido de pH ajustado de la etapa (g).
15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que el filtro de carbono activado de la etapa (h) comprende carbono activado con acido fosforico basado en madera.
16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, en el que el tampon fosfato sodico de la etapa (d) es fosfato sodico 25 mM.
17. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que el agente lftico de la etapa (b) es desoxicolato sodico.
18. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que el agente lftico de la etapa (b) es un agente lftico de origen no animal, preferentemente en el que dicho agente lftico de origen no animal se selecciona del grupo que consiste en: acido decanosulfonico, terc-octilfenoxi poli(oxietilen)etanoles; condensados de octilfenol y oxido etileno, N-lauril sarcosina sodica (NLS), iminodipropionato de laurilo, dodecil sulfato sodico, quenodesoxicolato, hiodesoxicolato, glicodesoxicolato, taurodesoxicolato, tauroquenodesoxicolato, y colato, incluso mas preferentemente en el que dicho agente lftico de origen no animal es N-lauril sarcosina sodica.
19. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que dicho acido mineral se selecciona del grupo que consiste en acido clorhfdrico, acido nftrico, acido fosforico y acido sulfurico.
20. Un procedimiento de fabricacion de una vacuna de neumococos, que comprende producir polisacaridos capsulares purificados a partir de un lisado celular de Streptococcus pneumoniae por un procedimiento reivindicado

en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 y usando dichos polisacaridos capsulares purificados en la fabricacion de una vacuna de neumococos.
21. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 20, en el que la vacuna de neumococos contiene polisacarido conjugado con un vehnculo proteico.

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