ES2677443B2

ES2677443B2 - Procedimiento para el incremento de producción de lipasa en cultivos de Halomonas mediante inducción química y biológica

Info

Publication number: ES2677443B2
Application number: ES201700078A
Authority: ES
Inventors: Herva Francisco Javier Deive; Braga María Angeles Sanroman; Rodriguez Ana María Rodriguez; Arnillas Esther Gutierrez
Original assignee: Universidade de Vigo
Current assignee: Universidade de Vigo
Priority date: 2017-02-01
Filing date: 2017-02-01
Publication date: 2019-02-27
Anticipated expiration: 2037-02-01
Also published as: ES2677443A1

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para el incremento de producción de lipasa en cultivos de Halomonas mediante inducción biológica.

SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención se enmarca en el campo de la microbiología industrial, más específicamente en la producción de biomoléculas a partir de microorganismos extremófilos. Debido a que uno de los mayores problemas de la síntesis enzimática a partir de este tipo de microorganismos radica en los bajos niveles de actividad logrados, se pretende incrementar, mediante inducción biológica, los bajos niveles de producción de lipasa de una cepa halófila aislada recientemente en el sur de España, Halomonas sp LM1C (Gutiérrez-Arnillas et al., 2016, New sources o f halophilic lipases: Isolation of bacteria from Spanish and Turkish saltworks, Biochem. Eng. J. 109, 170 177), demostrando su viabilidad a escala matraz y biorreactor. La lipasa producida mediante este procedimiento puede ser empleada en la industria alimentaria, textil, farmacéutica, de detergentes y de papel, en la producción de blodiesel y de cosméticos y en el tratamiento de aguas residuales (Daiha et al., 2015, Are Lipases Still Important Biocatalysts? A Study of Scientific Publications and Patents for Technological Forecasting, PLoS ONE 10 (6)).

ESTADO DE LA TÉCNICA

El informe "Upase Market by Source (Microbial Lipases, Animal Lipases), Application (Animal Feed, Dairy, Bakery, Confectionery, Others), & by Geography (North America, Europe, Asia-Pacific, Latín America, RoW) - Global Forecast to 2020", elaborado por MarketsAndMarkets®, prevé que el mercado de lipasas llegue a casi 600 millones de dólares en el año 2020, con una tasa de crecimiento anual compuesto (CAGR, Compound annual growth rate) de 6,5% entre 2015 y 2020. Las lipasas (EC 3.1.1.3) son catalizadores con un alto grado de especificidad y velocidad de reacción, cuya principal función es la hidrólisis de triglicéridos. Además, en medios con baja actividad de agua, ejercen su función catalítica en reacciones de esterificación, transesterificación e interesterificación. La versatilidad de estas enzimas permite su diversificación en numerosos sectores industriales, impulsando su éxito mundial. El desarrollo industrial promueve la demanda de lipasas por parte de la industria de detergentes, alimentaria, textil, farmacéutica, cosmética, petroquímica, entre otras. Del mismo modo, nuevos sectores emergentes, como el de los biocombustibles, están desarrollando nuevas técnicas de producción más sostenibles gracias al empleo de las lipasas (Houde et al., 2004, Lipases and their industrial applications: An overview, Appl. Biochem. Biotechnol. Part A Enzym. Eng. Biotechnol. 118, 155-170).

Las empresas líderes en el mercado de lipasas como Novozymes® (Dinamarca), Koninklijke DSM N.V.®, (Holanda), Chr. Hansen Holdings A/S® (Dinamarca), y E. I. Du Pont de Nemours and Company® (Estados Unidos), orientan sus esfuerzos a la búsqueda de nuevas fuentes de producción más competitivas así como nuevas aplicaciones. Aunque existen lipasas de origen animal y vegetal, se ha demostrado que las lipasas microbianas presentan un mayor interés debido a ventajas tales como su gran diversidad catalítica, sus elevados rendimientos, y la posibilidad de mejorar la competitividad de los procesos de producción mediante la modificación genética o la utilización de residuos como sustratos (Sangeetha et al., 2011, Bacterial lipases as potential industrial biocatalysts: An overview, Res. J. Microbiol., 1-24).

La necesidad de nuevas enzimas más resistentes, que mantengan su capacidad de catálisis en condiciones extremas habitualmente encontradas en los procesos industriales, ha promovido el interés de buscar nuevos organismos productores entre los extremófilos. La mayoría de ellos son microorganismos que pueden ser clasificados atendiendo al tipo de condiciones extremas en las que habitan. Así, los organismos termófilos o psicrófilos son aquellos con un óptimo de temperatura de crecimiento superior a 60 °C o por debajo de 15 °C, respectivamente. De igual modo, se han encontrado organismos sobreviviendo a presiones por encima de 130 MPa (piezófilos), mientras que los organismos radiófilos como Deinococcus radiodurans soportan elevados niveles de radiación (Rothschild and Mancinelli, 2001, Life in extreme environments, Nature 409, 1092-1101). Atendiendo a su supervivencia en hábitats con niveles altos (> 9) y bajos (cerca de 0) de pH, son típicos los alcalófilos y acidófilos, respectivamente, y aquellos organismos que son capaces de crecer en ambientes con bajo contenido en agua se clasifican como xerófilos. Por último, los organismos halófilos se desarrollan a concentraciones elevadas de sal (entre 2 y 5 M de NaCI) (Kamekura et al., 1998, Diversity of extremely halophilic bacteria, Extremophiles 2, 289-295).

Como ya se ha mencionado, el principal atractivo de estos microorganismos radica en su capacidad de sintetizar enzimas que permanecen activas al operar en las condiciones extremas en las que el microorganismo es capaz de desarrollarse. En este sentido, las haloenzimas ejercen su acción catalítica no sólo a altas concentraciones de sal sino también en presencia de disolventes orgánicos y temperaturas elevadas (Oren, 2010, Industrial and environmental applications of halophilic microorganisms, Environ. Technol. 31, 825-834). Aparte de estas características, la diversidad filogenática observada en halófilos, que incluye desde archaeas, bacterias y hongos hasta protistas, protozoos y algas, es otro atractivo para asegurar la existencia de enzimas con características adecuadas para una determinada aplicación.

Una de las ventajas de la producción microbiana de lipasa es que el medio de cultivo y las condiciones operacionales pueden ser optimizados para maximizar la biosíntesis enzimática. Sin embargo, en la mayoría de los casos los niveles de producción son bajos y es necesario el empleo de agentes inductores que generan aumentos en la producción enzimática en los cultivos microbianos (Benjamín and Pandey, 1996, Optimization o f liquid media for lipase production by Candida rugosa, Bior.Technol., 55, 167-170). La elección del agente inductor se realiza en base a la enzima de interés. La mayoría de las sustancias empleadas utilizadas como inductores en cultivos microbianos son químicas o bien de naturaleza orgánica, de cualquier modo, se trata de un aumento en los costes de producción. En el caso de las lipasas, diversos estudios muestran buenos resultados de inducción con compuestos de naturaleza lipídica.

Los agentes inductores se pueden diferenciar en función del mecanismo de acción. En la mayoría de los casos el inductor empleado tiene efecto directo en la actividad catalítica. De modo que, los inductores ampliamente utilizados en la producción de lipasas son los ácidos grasos, los triglicéridos y algunos ésteres. En el caso de los ácidos grasos, existe una relación entre el tamaño de cadena y la producción enzimática. Se observa una mayor actividad ¡¡política con el aumento de la longitud de la cadena, pudiendo estar relacionada con la solubilidad de los ácidos grasos en el agua y el fenómeno de la activación interfacial. También, se ha observado que los ácidos grasos inducen mayores niveles de producción en comparación con otros compuestos de naturaleza lipídica (Obradors et al., 1993, Effects of different fa tty acids in lipase production by Candida rugosa, Biotechnol. Letters, 15, 357-360). Los triglicéridos como el aceite de oliva, de girasol, de palma, de coco, de maíz, etc., exhiben buenos resultados en cultivos para la producción de lipasas (Gulati R, Saxena RK, Gupta et al., 1999, Parametric optimisation of Aspergillus terreus lipase production and its potential in ester synthesis, Proc. Biochem., 35, 459-464). Por otro lado, otros compuestos que pueden contribuir a aumentar la actividad lipolítica extracelular debido a su capacidad para aumentar la permeabilidad de la membrana celular y facilitar la liberación de las enzimas al medio, son los surfactantes (Domínguez et al., 2003, Effect of lipids and surfactants on extracellular lipase production by Yarrowia lipolytica, J. Chem. Technol. and Biotechnol., 78, 1166-1170).

Existe otro método de inducción que puede sustituir o bien coexistir con la inducción química. La inducción biológica ha sido ampliamente estudiada en la producción de lacasas y permite un aumento de los niveles de producción de lacasas mediante cultivo mixtos (Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Método para el incremento de la producción de lacasa en Coriolopsis mediante un inductor biológico. Patente española 2 365 460, 13-03-2010). Sin embargo, no existe referencia acerca de procesos de inducción biológica en cultivos microbianos para la producción de lipasas. En realidad, la ausencia de estudios centrados en el campo de las lipasas halófilas ha impedido hasta la fecha su comercialización a gran escala. Por ello, la investigación de agentes inductores de la actividad lipolítica y la ¡mplementación a escala biorreactor de cultivos de producción de lipasa halófila es crucial para contribuir al desarrollo de nuevos procesos catalíticos con menor impacto ambiental que los métodos convencionales.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un proceso de producción de lipasa por la bacteria del género Halomonas mediante inducción biológica que comprende las siguientes etapas:

a) preparación del medio de cultivo;

b) preparación del inoculo de Halomonas-,

c) crecimiento de un cultivo y producción de lipasa en un cultivo mixto compuesto de Halomonas y del agente microbiano inductor;

donde el cultivo mixto de Halomonas y agente inductor se prepara en la etapa b) de preparación del inoculo o bien en la etapa c) de crecimiento del cultivo donde el microorganismo inductor se añade tras un tiempo de crecimiento del microorganismo Halomonas.

La composición base del medio de cultivo es (CECT 17 modificado):

7,5 g/L de peptona de caseína, 10,0 g/L de extracto de levadura, 3,0 g/L de citrato trisódico, 2,0 g/L de KCI, 20g/L de MgS04-7H20, 0,05 g/L de FeSOWEhO, 0,25 mg/L de MnS04-4H20 y 150,0 g/L NaCI.

Es conveniente destacar que la composición base del medio de cultivo puede sufrir ciertas modificaciones, es decir, se puede optar por el empleo de otras composiciones base del medio de cultivo distintas al listado en el párrafo anterior.

En una realización preferente, para la inducción biológica se pueden emplear especies de microorganismo pertenecientes a los géneros Acinetobacter, Actinopolyspora, Alteromonas, Arhodomonas, Bacillus, Chromohalobacter, Dlchotomicrobium, Dunaliella, Exiguobacterium, Flavobacterium, Haloarcula, Halobacillus, Halobacterium, Halobaculum, Halococcus, Haloferax, Halomonas, Halorhabdus, Halorubum, Haloterrigena, Halothermothrix, Halovibrio, Marinobacter, Marinococcus, Natrialba, Natronobacterium, Natronococcus, Natronomonas, Nesterenkonia, Nocardiopsis, Ocenoabacillus, Pelagibacterium, Pseudalteromonas, Pseudomonas, Salinicoccus, Salinivibrio, Spirochaeta, Staphylococcus, Tetragenococcu, Vibrio u otro microorganismo capaz de crecer en concentraciones elevadas de sal: 10-15% de NaCI.

Durante el procedimiento de producción de lipasas, el medio CECT17 modificado se esteriliza a 120 °C durante 20 minutos.

En una realización más preferente, el inoculo de microorganismos del género Halomonas (2-5 % v/v) se añade al medio de cultivo seleccionado, esterilizado y atemperado. La inducción biológica, se puede hacer un cultivo mixto inoculando células activas del género Halomonas y del microorganismo inductor con una concentración 2-5 % v/v, o bien se puede añadir inoculo del organismo inductor (2-5 % v/v) tras un tiempo de crecimiento del organismo del género Halomonas.

El crecimiento del cultivo de células del género Halomonas se puede realizar en matraces Erlenmeyer de 50-2.000 mL, los cuales serán tapados con tapón de celulosa que permita la aireación pasiva. El cultivo realizado en este tipo de recipientes se llevará a cabo en shakers que permitan controlar la temperatura (10-40 °C) y la agitación (50-200rpm). Otro tipo de vasija para el cultivo de Halomonas puede ser un biorreactor con diferentes configuraciones: tipo air-lift o tipo tanque con agitación mecánica. En ambos casos, el volumen de trabajo puede ser de 1-10 L y estar conectados a una unidad de control que permite fijar la velocidad de agitación (50-700 rpm), la aireación (0,25-1 vvm) y la temperatura de operación (10-40 °C).

Para evitar la formación de espuma se adiciona un antiespumante que puede ser del tipo emulsión de un polímero de silicona activa y un emulsionante no iónico. La adición de dicho antiespumante se puede realizar de forma automática mediante una sonda de detección de espuma en el interior de las vasijas de cultivo conectada a un controlador que permita regular los ciclos de bombeo del antiespumante a la vasija de reacción.

Durante crecimiento del cultivo y producción de lipasa en presencia del agente químico o biológico, el control de la biomasa y la actividad lipolítica comprende:

a) medir la biomasa y la actividad lipolítica tomando muestras de las vasijas de cultivo

b) si la actividad lipolítica en la vasija de cultivo se encuentra alrededor de la actividad óptima, se detiene la reacción biológica y proceder a la separación de la biomasa del medio de cultivo por centrifugación y conservar la disolución sobrenadante a 20 °C, ya que su producción es extracelular.

La herramienta utilizada para determinar la biomasa y la actividad lipolítica es la espectrofotometría ultravioleta, considerando tanto los valores de concentración celular por calibrado de peso seco (turbidimetría a 600 nm) como los de producción enzimática, En este último caso, se monitoríza la hidrólisis de p-nitrofenil laurato (2,5 mM) para obtener p-nitrofenol, siguiendo el proceso detallado previamente (Fuciños et al., 2005, Production of thermostable lipolytic activity by Thermus species, Biotechnol. Prog. 21, 1198-1205) y considerando una unidad de actividad como la cantidad de enzima que produce un 1 |jmol de p-nitrofenol por minuto.

Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Seguimiento de la actividad lipolítica (U/L) Halomonas sp. LM1C en cultivo matraz mediante inducción biológica de Staphylococcus equorum AMC7. Se muestra la actividad lipolítica de un cultivo puro de Halomonas sp. LM1C como referencia. Las barras de error expresan la desviación estándar.

Figura 2. Seguimiento de la actividad lipolítica (U/L) de Halomonas sp. LM1C en cultivo en biorreactor de tanque agitado mediante inducción biológica de Staphylococcus equorum AMC7 y seguimiento de la biomasa (g/L) del cultivo mixto. Las líneas representan el ajuste de los datos a un modelo logístico.

EJEMPLOS DE UNA REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN

Ejemplo 1

Producción de lipasa por Halomonas sp. LM1C mediante inducción biológica por Staphylococcus equorum AMC7 en matraz Erlenmeyer de 250 mi

En primer lugar se prepara un cultivo de Halomonas sp. LM1C y Staphylococcus equorum AMC7 de 50 mL con medio CECT17 modificado (pH 6,9) a 14 "C y 150 rpm durante 24 horas, que servirá de inoculo para el matraz (3 % v/v). A continuación, se esteriliza (120 °C durante 20 minutos) 50 mL de medio CECT17 modificado (pH 6,9) junto con el matraz Erlenmeyer de 250 mL. El matraz se llena con el medio manteniendo las condiciones de esterilidad y se inocula en una proporción del 3% v/v. Se utiliza un shaker (Thermo Fischer Scientific® MAxQ 8000) para regular los parámetros operacionales a 14 °C de temperatura y 150 rpm de agitación.

Transcurridas 144 horas y verificados los niveles máximos de producción en torno a las 3.000 U/L (Figura 1), se detiene el proceso biológico para proceder a la eliminación de las células del medio de cultivo por centrifugación a 10.000 rpm, y conservándose el caldo de cultivo libre de células a -20 °C.

Ejemplo 2

Producción de lipasa por Halomonas sp. LM1C mediante inducción biológica por Staphylococcus equorum AMC7 en biorreactor de tanque agitado

En primer lugar se prepara un cultivo de Halomonas sp. LM1C y Staphylococcus equorum AMC7 de 50 mL con medio CECT17 modificado1 (pH 6,9) a 14 °C y 150 rpm durante 24 horas, que servirá de inoculo para el biorreactor (3 % v/v). A continuación, se esteriliza (120 °C durante 20 minutos) 1,5 L de medio CECT17 junto con el biorreactor de tanque agitado equipado con un impulsor dual tipo Rushton. El biorreactor se llena con el medio manteniendo las condiciones de esterilidad. Se utiliza una unidad de control (Biostat B, Braun Melsungen, Germany) para regular los parámetros operacionales. Es importante conectar la sonda de espuma para evitar los efectos negativos originados por la formación de espuma en el medio antes de fijar las condiciones operacionales en 300 rpm de agitación mecánica y de 0,3 vvm de aireación. Esta sonda está conectada a un depósito que contiene antiespumante SE-15 de Sigma Aldrich®. Una vez fijada la temperatura del biorreactor a 14 °C se lleva a cabo la inoculación con 50 mL de células viables (24 horas) de Halomonas sp LM1C y Staphylococcus equorum AMC7.

Transcurridas 240 horas y verificados los niveles máximos de producción en torno a las 1.400 U/L (Figura 2), se detiene el proceso biológico para proceder a la eliminación de las células del medio de cultivo por centrifugación a 10.000 rpm, y conservándose el caldo de cultivo libre de células a -20 °C.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para el incremento de producción de lipasa en cultivos de Halomonas mediante inducción biológica que comprende las siguientes etapas:

a) preparación del medio de cultivo;

b) preparación del inoculo de Halomonas;

c)
crecimiento del cultivo y producción de lipasa en un cultivo mixto compuesto de Halomonas y del agente microbiano inductor;

donde el cultivo mixto de Halomonas y agente microbiano inductor se prepara en la etapa b) de preparación del inoculo o bien en la etapa c) de crecimiento de cultivo donde el microorganismo inductor se añade tras un tiempo de crecimiento del microorganismo Halomonas.

2. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por el inductor biológico es un microorganismos seleccionado entre los siguientes géneros: Acinetobacter, Actinopolyspora, Alteromonas, Arhodomonas, Bacillus, Chromohalobacter, Dichotomicrobium, Dunaliella, Exiguobacterium, Flavobacterium, Haloarcula, Halobacillus, Halobacterium, Halobaculum, Halococcus, Haloferax, Halomonas, Halorhabdus, Halorubum, Haloterrigena, Halothermothrix, Halovibrio, Marinobacter, Marinococcus, Natrialba, Natronobacterium, Natronococcus, Natronomonas, Nesterenkonia, Nocardiopsis, Ocenoabacillus, Pelagibacterium, Pseudalteromonas, Pseudomonas, Salinicoccus, Salinivibrio, Spirochaeta, Staphylococcus, Tetragenococcus y/o Vibrio.

3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la etapa b) y c) de crecimiento del cultivo de Halomonas en presencia del agente biológico se inocula un cultivo puro o mixto en una proporción comprendida entre 2 y 5 % v/v.

4. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la etapa c) de crecimiento del cultivo de Halomonas en presencia del biológico se realiza en vasijas tipo matraces Erlernmeyer de 50-2000 mL.

5. Procedimiento según las reivindicaciones 18 3, caracterizado porque la etapa c) de crecimiento del cultivo de Halomonas en presencia del biológico se realiza en vasijas tipo biorreactor con configuración air-Uft o tipo tanque con agitación mecánica, con volumen de trabajo en el rango de 1-10 L.

6. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la etapa c) de crecimiento del cultivo de Halomonas en presencia biológico utiliza velocidades de agitación del cultivo comprendidas entre 50- 700 rpm.

7. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la etapa c) de crecimiento del cultivo de Halomonas en presencia del agente biológico se emplea niveles de aireación del cultivo comprendidos en el rango 0,25-1 vvm.

8. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la etapa c) de crecimiento del cultivo de Halomonas en presencia del agente biológico se opera a temperaturas de cultivo comprendidas entre 10 y 40 °C.

9. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la etapa c) de crecimiento del cultivo de Halomonas en presencia del agente biológico se realiza en presencia de un antiespumante en un rango 0,01-1% (v/v).

10. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la etapa c) de crecimiento del cultivo de Halomonas en presencia del agente biológico comprende:

a) determinación de la biomasa y la actividad lipolítica mediante toma de muestras del cultivo

b) cuando la actividad lipolítica en el cultivo se encuentre alrededor de la actividad óptima, dependiente del inductor empleado, se detiene la reacción biológica y se procede a la separación de la biomasa del medio de cultivo por centrifugación y conservación de la disolución sobrenadante a 20 °C.