ES2677945T3 - Producción de tejidos artificiales mediante ingeniería tisular utilizando biomateriales de fibrina y agarosa - Google Patents

Producción de tejidos artificiales mediante ingeniería tisular utilizando biomateriales de fibrina y agarosa Download PDF

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José Ignacio MUÑOZ ÁVILA
Miguel GONZÁLEZ ANDRADES
Antonio CAMPOS MUÑOZ
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Abstract

La presente invención proporciona un método in vitro de preparación de un tejido artificial, el tejido artificial obtenible por dicho método, la composición farmacéutica que lo comprende y el uso de este tejido o de esta composición para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de un tejido o un órgano dañado, preferiblemente piel, vejiga, uretra, córnea, mucosa oral, conjuntiva, pared abdominal, tímpano, faringe, laringe, intestino, peritoneo, ligamento, tendón, hueso, meninge o vagina. El método de la invención comprende los pasos de añadir fibrinógeno a células aisladas, preferiblemente, a fibroblastos o queratocitos, añadir un agente antifibrinolítico a la mezcla, añadir además un factor de coagulación, una fuente de calcio y trombina, añadir un polisacárido, preferiblemente agarosa, cultivar células, preferiblemente células epiteliales o células madre del cordón umbilical, en o sobre el producto resultante e inducir la nanoestructuracion de dicho producto. El método contempla también un paso intermedio que consiste en la adición de fibronectina tras el agente fibrinolítico, y otro paso en el que se añade colágeno después de la agarosa.

Description

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DESCRIPCION
Produccion de tejidos artificiales mediante ingeniena tisular utilizando biomateriales de fibrina y agarosa
La presente invencion se encuadra en el campo de la biomedicina y, mas espedficamente, de la ingeniena tisular. Espedficamente, se refiere a un metodo de preparacion in vitro de un tejido artificial, al tejido artificial obtenible por dicho metodo y al uso de este tejido artificial para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de un tejido o un organo danado.
Estado de la tecnica anterior
La ingeniena tisular constituye un conjunto de tecnicas y disciplinas que permite disenar y generar en laboratorio tejidos artificiales a partir de celulas madre procedentes de muestras tisulares obtenidas de biopsias y, por tanto, supone un enorme avance en el trasplante de organos y en la medicina regenerativa. La ingeniena tisular es una de las areas de la biotecnologfa que mas se ha desarrollado en los ultimos anos, debido a su utilidad potencial para la fabricacion in vitro de tejidos y organos para su implante en pacientes que necesitan estos tejidos. No obstante, los tejidos artificiales descritos hasta la fecha presentan numerosos problemas y complicaciones; algunos de los cuales se exponen a continuacion, utilizando, como ejemplo, los tejidos artificiales de piel, cornea, vejiga y uretra.
La vejiga urinaria es el organo encargado de la recepcion y el almacenamiento de la orina. Situada en el suelo pelvico, la vejiga urinaria se caracteriza por su capacidad y su distensibilidad, lo que la permite almacenar y retener la orina. La continencia es resultado de la contraccion del esfmter urinario, que cierra la uretra y el cuello vesical impidiendo la salida de orina, asf como de la relajacion y distension de la vejiga para almacenar la orina que se va acumulando en ella. Numerosas patologfas congenitas o adquiridas pueden afectar a la integridad de la vejiga, alterando la funcion continente de esta. Por un lado, las malformaciones de la vejiga suelen asociarse a defectos graves de la pared vesical que requieren reparacion quirurgica urgente. Por otro lado, los traumatismos pelvicos, el cancer vesical y las lesiones traumaticas de la medula espinal constituyen patologfas frecuentes que requieren el uso de tejidos extravesicales para reparar la vejiga danada. En este contexto, actualmente se llevan a cabo ampliaciones vesicales utilizando intestino (enterocistoplastia), estomago (gastrocistoplastia) o urotelio (ureterocistoplastia), siendo muy frecuentes las complicaciones asociadas a estas tecnicas.
Hasta el momento, se han descrito muy pocos modelos de sustitutos de la vejiga urinaria que presenten utilidad clmica. Recientemente (Atala et al. Lancet. 15 de abril de 2006; 367(9518):124l-6), investigadores del Children's Hospital de Boston lograron implantar un sustituto de vejiga artificial generado a partir de colageno y acido poliglicolico en siete pacientes con dano vesical grave. Sin embargo, los modelos de vejiga artificial, disponibles para el tratamiento de los pacientes que lo necesiten, son muy escasos y presentan multitud de inconvenientes, incluyendo la mala calidad y la escasa manipulabilidad de los tejidos generados. Ademas, el colageno es un producto que tiende a la contraccion y a la perdida de volumen cuando se usa en ingeniena tisular, siendo escasa su consistencia y, por tanto, su manipulabilidad quirurgica.
La uretra es el conducto por el que se elimina hacia el exterior la orina almacenada en la vejiga urinaria. Ademas de su funcion excretora en ambos sexos, la uretra cumple una funcion reproductora en el hombre, al permitir el paso del contenido seminal desde las vesmulas seminales durante la eyaculacion. Son multiples las afecciones congenitas (hipospadias y epispadias principalmente) o adquiridas (traumatismos, estenosis, etc.) que afectan a su integridad funcional y que precisan que sea sustituida en mayor o menor grado, para conseguir restablecer su funcion normal (Baird et al. J Urol. 2005; 174:1421-4; Persichetti et al. Plast Reconstr Surg. 2006; 117:708-10).
Tradicionalmente, la reparacion de tejidos lesionados se ha venido haciendo con elementos protesicos artificiales o tejidos tomados de una parte del propio paciente (autoinjerto o autotrasplante) o de otro individuo (trasplante heterologo). Actualmente, para la correccion de la mayor parte de las patologfas uretrales, se recurre a colgajos autologos de tejidos adyacentes o a injertos libres, principalmente de mucosa oral o vesical. Sin embargo, la obtencion de colgajos locales no siempre es factible, y la extraccion de mucosa oral o vesical no esta exenta de complicaciones y efectos secundarios tanto en la zona donante como en la receptora (Corvin et al. Urologe A. 2004; 43(10):1213-6; Schultheiss et al. World J Urol. 2000; 18: 84-90). Por otro lado, la utilizacion de tejidos heterologos ha arrojado resultados bastante pobres en la sustitucion de uretra, siendo muy frecuente la aparicion de rechazos inmunologicos del tejido trasplantado.
Hasta la fecha, se han descrito muy pocos modelos de sustitutos de uretra con probable utilidad clmica, siendo muy escasos los casos descritos en la bibliograffa, en los que se ha implantado un sustituto uretral en pacientes. La mayona de los modelos descritos hasta la fecha se basan en biomateriales de colageno (De Filippo et al. J Urol. Octubre de 2002; 168(4 Pt 2):1789-92; El-Kassaby et al. J Urol. Enero de 2003; 169(1):170-3; comentario 173) o en piel del propio paciente (Lin et al. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 20 de abril de 2005; 85(15):1057-9). Sin embargo, todos estos modelos presentan numerosos problemas y complicaciones, y aun no se ha desarrollado ningun sustituto uretral exento de estos problemas. Por un lado, el colageno es un producto que tiende a la contraccion y a la perdida de volumen cuando se usa en ingeniena tisular, siendo escasa su consistencia y, por tanto, su manipulabilidad quirurgica. Por otro lado, el uso de piel autologa aun no ha demostrado suficientemente su capacidad para
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adaptarse a las condiciones de la uretra, siendo muy diffcil recelularizar fragmentos de dermis descelularizados.
La cornea es una estructura transparente que carece de vasos, a traves de la cual la luz penetra en el ojo, constituyendo la principal barrera del globo ocular con el medio exterior. Por ese motivo, la integridad y el correcto funcionamiento de la misma son imprescindibles para una correcta funcion visual. La patologfa congenita o adquirida de la cornea constituye uno de los problemas mas frecuentes en oftalmologfa, siendo numerosas las causas que provocan una alteracion grave de la fisiologfa y la estructura corneal. En estos casos, suele ser necesario recurrir a tratamientos agresivos y no exentos de complicaciones, como son los implantes de membrana amniotica, los diferentes tipos de queratoprotesis e incluso el trasplante heterologo de cornea (queratoplastia). Sin embargo, el trasplante corneal es una tecnica que depende enormemente de la disponibilidad de corneas procedentes de donantes cadavericos, lo cual hace que un gran numero de personas permanezcan en lista de espera para trasplante durante periodos de tiempo prolongados. Por otro lado, es bien sabido que el trasplante de organos procedentes de un donante esta sujeto a la posibilidad de rechazo inmunologico cuando estos organos son implantados, obligando al paciente a someterse a terapia inmunosupresora durante toda su vida. Finalmente, el trasplante de cualquier tipo de organo o tejido, incluida la cornea, es una tecnica sujeta a la posibilidad de transmitir todo tipo de enfermedades infecciosas del donante al receptor, incluyendo el VIH, la hepatitis, el herpes, las enfermedades bacterianas y fungicas, etc. Todos estos problemas y complicaciones derivados del implante corneal, hacen necesaria la busqueda de alternativas terapeuticas al trasplante heterologo.
La produccion en laboratorio de un sustituto corneal (construccion corneal o cornea artificial) es una de las areas que esta experimentando mayor auge dentro de la ingeniena tisular, siendo numerosos los laboratorios que actualmente estan intentando, sin demasiado exito, conseguir un sustituto corneal de calidad que pueda utilizarse en la practica clmica humana o para la evaluacion de productos farmacologicos y qmmicos (Griffith et al. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999; 286(5447):2169-72; Orwin et al. Tissue Eng. 2000; 6(4):307- 19; Reichl et al. Int J Pharm. 2003; 250:191-201). En este sentido, se han desarrollado corneas artificiales de origen animal y humano. En ambos casos, los modelos desarrollados han utilizado biomateriales diversos como el colageno de tipo I, fibroina procedente de la seda (Higa y Shimazaki. Cornea. Septiembre de 2008; 27 Suppl 1:S41- 7), quitosano (Gao et al. J Mater Sci Mater Med. Diciembre de 2008; 19(12):3611-9), acido poliglicolico (Hu et al. Tissue Eng. Nov-Dic de 2005; 11(11-12):1710-7) y fibrina con agarosa (Alaminos et al. Invest Ophthalmol Vis Sci (IOVS). 2006; 47: 3311-3317; Gonzalez-Andrades et al. J Tissue Eng Regen Med. 5 de mayo de 2009). De todos estos biomateriales, los mejores resultados obtenidos hasta ahora son los que tienen como base fibrina y agarosa. Las corneas de colageno de tipo I presentan tendencia a la perdida de volumen y a la retraccion de las mismas, con el inconveniente anadido del origen animal del colageno utilizado. La fibroina y el quitosano son productos generados a partir de animales invertebrados, lo cual genera problemas significativos en relacion con la biocompatibilidad. En cambio, las corneas desarrolladas de fibrina y agarosa tienen la ventaja de que contienen fibrina procedente de la sangre del mismo paciente, mientras que la agarosa constituye un producto inerte desde el punto de vista inmunologico.
La piel es el organo mas grande del cuerpo humano, y juega un papel fundamental en el mantenimiento del equilibrio interno, formando la principal barrera protectora del organismo frente a cualquier tipo de agresion externa. Existen numerosas patologfas que afectan a la piel, siendo las mas frecuentes las heridas, las ulceras por presion y las quemaduras. Los tratamientos actuales, basados en el uso de colgajos o injertos de piel o incluso en el implante de piel procedente de donante, estan asociados a numerosos problemas.
La necesidad de solucionar estos problemas hace necesaria la busqueda de alternativas basadas en la generacion de productos de piel artificial humana generados mediante ingeniena tisular (Horch et al. Burns. Agosto de 2005; 31(5):597-602). En concreto, hasta el momento se han disenado distintos tipos de piel artificial, incluyendo coberturas cutaneas sinteticas y biologicas, aunque ninguno de ellos ha logrado reproducir fielmente la estructura y las funciones de la piel humana natural. Por un lado, las coberturas dermicas sinteticas consisten en biomateriales no reabsorbibles y exentos de celulas vivas que se pueden utilizar como coberturas temporales o como agentes inductores de la reparacion tisular guiada. Estos tejidos artificiales e inertes poseen muy poca actividad biologica, por lo que no pueden utilizarse en lesiones profundas o amplias. Por otro lado, las coberturas biologicas consisten en la utilizacion de piel humana artificial en la que existen celulas vivas y matrices extracelulares que tratan de reproducir la estructura de la piel humana normal. Hasta el momento, la piel humana artificial que mejores resultados esta ofreciendo es la piel artificial generada mediante ingeniena tisular a partir de celulas madre de la piel utilizando como biomaterial fibrina procedente de plasma humano (Meana et al. Burns 1998; 24: 621-630; Del Rio et al. Hum Gene Ther. 20 de mayo de 2002; 13(8):959-68; Llames et al. Transplantation. 15 de febrero de 2004; 77(3):350-5; Llames et al. Cell Tissue Bank 2006; 7: 4753.). Aunque estas tecnicas supusieron un gran avance, su utilizacion clmica es limitada principalmente debido a su escasa consistencia, su diffcil manipulacion y su extrema fragilidad. Uno de los sustitutos de tejido mas consistentes es aquel que combina el uso de fibrina con agarosa. Hasta el momento, la agarosa se ha utilizado para la generacion de sustitutos del carfflago (Miyata et al. J Biomech Eng. Octubre de 2008; 130(5):051016), la cornea (Alaminos et al. Invest Ophthalmol Vis Sci (IOVS). 2006; 47: 3311-3317) y la mucosa oral humana (Alaminos et al. J Tissue Eng Regen Med. Sep-Oct de 2007; 1(5):350-9; Sanchez- Quevedo et al. Histol Histopathol. Junio de 2007; 22(6):631-40), pero no existe experiencia previa en el uso de este biomaterial para la fabricacion de piel artificial.
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La ingeniena tisular es una de las areas que esta experimentando mayor auge dentro de la biotecnolog^a. Sin embargo, las desventajas de los tejidos artificiales hasta ahora existentes, hacen necesario el desarrollo de nuevas tecnicas que permitan la obtencion de tejidos artificiales que puedan utilizarse en la practica clmica humana o para la evaluacion de productos farmacologicos y qmmicos, superando las limitaciones hasta ahora detectadas.
Sumario de la invencion
En un primer aspecto, la invencion se refiere a un metodo de preparacion in vitro de un tejido artificial que comprende:
a) anadir una composicion que comprende fibrinogeno a una muestra de celulas aisladas,
b) anadir un agente antifibrinolttico al producto resultante de la etapa (a),
c) anadir, al menos, un factor de coagulacion, una fuente de calcio, trombina, o cualquier combinacion de los anteriores, al producto resultante de la etapa (b),
d) anadir una composicion de un polisacarido al producto resultante de la etapa (c),
e) cultivar celulas aisladas en o sobre el producto resultante de la etapa (d), e
f) inducir la nanoestructuracion del producto resultante de la etapa (e), comprendiendo dicha induccion de nanoestructuracion la deshidratacion y/o compresion mecanica del producto resultante de la etapa (e), y siendo el polisacarido de la etapa (d) agarosa.
En un segundo aspecto, la invencion se refiere a un tejido artificial obtenible por el metodo de la invencion.
En un tercer aspecto, la invencion se refiere tejido artificial de la invencion para su uso en medicina.
En un cuarto aspecto, la invencion se refiere al tejido artificial de la invencion para su uso en incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de un tejido o un organo enfermo o danado.
En un quinto aspecto, la invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende el tejido artificial de la invencion.
Breve sumario de las figuras
Figura 1. Muestra un esquema del metodo utilizado para la nanoestructuracion del tejido artificial.
Figura 2. Muestra la evaluacion del producto de piel humana artificial. A. Analisis microscopico in vitro. B. Analisis macro y microscopico de la piel humana artificial evaluada in vivo. C. Analisis inmunohistoqmmico.
Figura 3. Muestra la evaluacion del producto de piel humana artificial con celulas de la gelatina de Wharton. A. Determinacion de la viabilidad de las celulas madre de la gelatina de Wharton. B. Analisis microscopico. C. Analisis inmunohistoqmmico de las siguientes protemas: pancitoqueratina (PANC), queratina 1 (KRT1), queratina 10 (KRT10), involucrina (INVOL) y filagrina (FILAG).
Figura 4. Muestra la evaluacion de los productos corneales. A. Analisis microscopico e inmunohistoqmmico: inmunofluorescencia de diferentes protemas relacionadas con uniones intercelulares en el epitelio de las corneas humanas control (C) y de los productos corneales mantenidos in vitro en diferentes estadios de maduracion y desarrollo (1: cornea con una unica capa de epitelio, 2: cornea con 2-3 capas, 3: cornea con epitelio estratificado, 4: cornea con epitelio estratificado y sometido a tecnica aire-lfquido). B. Control de calidad reologico. C. Control de calidad optica. D. Control genetico: Principales funciones genicas expresadas por las construcciones corneales artificiales generadas mediante ingeniena tisular. E. Evaluacion in vivo del comportamiento clmico de los productos corneales artificiales en un modelo animal. A: tras eliminar la hemicornea anterior, la construccion corneal se coloco sobre la superficie del estroma; B: aspecto final una vez suturado; C: evolucion a las 3 semanas; D: evolucion a las 6 semanas.
Figura 5. Muestra la evaluacion del producto de uretra humana artificial. A. Analisis microscopico. B. Analisis inmunohistoqmmico (expresion de integrinas).
Figura 6. Muestra la evaluacion del producto de vejiga urinaria artificial. A. Analisis microscopico: Vejiga humana artificial fabricada en laboratorio y mantenida en cultivo durante 1 y 3 semanas, respectivamente. B. Analisis inmunohistoqmmico: Analisis mediante inmunofluorescencia de la vejiga artificial humana generada mediante ingeniena tisular y de la vejiga humana control normal para las citoqueratinas (CK) 7, 8, 4, 13 y pancitoqueratina.
Figura 7. Muestra la evaluacion de los productos de mucosa oral humana artificial. A. Analisis mediante microscopico optico de los tejidos de fibrina, agarosa y colageno (este ultimo a una concentracion final de 2,8 g/l) tenidos con hematoxilina y eosina tras 1, 2, 3 y 4 semanas de desarrollo en cultivo y del estroma de la mucosa oral humana utilizada como control. B. Analisis mediante microscopio electronico de barrido de los tejidos artificiales basados en fibrina, agarosa y colageno con una concentracion final preferida de colageno de 2,8 g/l (A) en
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comparacion con los tejidos artificiales de fibrina, agarosa y colageno con una concentracion final de colageno de 3,8 g/l (B), de fibrina, agarosa y colageno con una concentracion final de colageno de 1,9 g/l (C), o de colageno a una concentracion final de 5,6 g/l en ausencia de fibrina y agarosa (D) y del estroma de la mucosa oral humana normal utilizada como control (E). C. Esfuerzo umbral de los tejidos artificiales basados en fibrina, agarosa y colageno con una concentracion final preferida de colageno de 2,8 g/l (A) en comparacion con los tejidos artificiales de fibrina, agarosa y colageno con una concentracion final de colageno de 3,8 g/l (B), de fibrina, agarosa y colageno con una concentracion final de colageno de 1,9 g/l (C), o de colageno a una concentracion final de 5,6 g/l en ausencia de fibrina y agarosa (D).
Figura 8. Muestra la mejora del esfuerzo umbral (en Pascales) de los tejidos nanoestructurados con respecto a los no nanoestructurados.
Figura 9. Muestra el modulo viscoso G'' de las muestras sometidas a nanoestructuracion y de las muestras no nanoestructuradas (datos en Pascales).
Figura 10. Muestra el modulo elastico G' de los tejidos nanoestructurados y de los biomateriales naturales no nanoestructurados.
Figura 11. Muestra la transparencia de los tejidos sometidos a nanoestructuracion de fibrina-agarosa 0,1 %, y de los biomateriales no nanoestructurados de fibrina-agarosa 0,1 %. Los datos se dan como porcentaje de transmitancia del espectro de la luz visible (aproximadamente, de 400 a 700 nm).
Descripcion detallada de la invencion
La ingeniena tisular es una de las areas de la biotecnologfa que mas se ha desarrollado en los ultimos anos, debido a su utilidad para la produccion in vitro de tejidos y organos para su implante en pacientes que necesitan estos tejidos. Sin embargo, las limitaciones de los tejidos artificiales hasta ahora existentes hacen necesario el desarrollo de nuevas tecnicas que permitan la obtencion de tejidos artificiales que puedan utilizarse en la practica clmica humana o para la evaluacion de productos farmacologicos y qmmicos.
Metodo de la invencion
La presente invencion proporciona un metodo in vitro de preparacion de un tejido artificial, el tejido artificial obtenible por dicho metodo y el uso de este tejido artificial para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de un tejido o un organo danado.
Un primer aspecto de la invencion se refiere a un metodo in vitro de preparacion de un tejido artificial (de aqu en adelante, metodo de la invencion) que comprende:
a) anadir una composicion que comprende fibrinogeno a una muestra de celulas aisladas,
b) anadir un agente antifibrinolftico al producto resultante de la etapa (a),
c) anadir, al menos, un factor de coagulacion, una fuente de calcio, trombina, o cualquier combinacion de los anteriores, al producto resultante de la etapa (b),
d) anadir una composicion de un polisacarido al producto resultante de la etapa (c),
e) cultivar celulas aisladas en o sobre el producto resultante de la etapa (d), y
f) inducir la nanoestructuracion del producto resultante de la etapa (e), comprendiendo dicha induccion de nanoestructuracion la deshidratacion y/o compresion mecanica del producto resultante de la etapa (e), y siendo el polisacarido de la etapa (d) agarosa.
En la etapa (a) del metodo de la invencion se anade una composicion que comprende fibrinogeno a celulas aisladas, preferentemente, de un mairnfero. Dichas celulas pueden obtenerse mediante diferentes metodos descritos en el estado de la tecnica, que pueden depender del tipo celular particular relacionado. Algunos de estos metodos son, por ejemplo, pero sin limitarse, biopsia, procesado mecanico, tratamiento enzimatico (por ejemplo, pero sin limitarse, tratamiento con tripsina o colagenasa de tipo I), centrifugacion, lisis eritrocitaria, filtracion, cultivo en soportes o medios que favorezcan la proliferacion selectiva de dicho tipo celular o inmunocitometna. Algunos de estos metodos se describen en detalle en los ejemplos de esta memoria descriptiva.
Las celulas de la etapa (a) pueden ser celulas diferenciadas tal como, por ejemplo, pero sin limitarse, fibroblastos, queratocitos o celulas musculares lisas, o celulas no diferenciadas con la capacidad para diferenciarse en dichas celulas tales como, por ejemplo, celulas madre adultas.
En una realizacion preferida del metodo de la invencion, las celulas de la etapa (a) son fibroblastos o celulas no diferenciadas con la capacidad para diferenciarse en fibroblastos. Los fibroblastos pueden obtenerse de cualquier tejido u organo, sin embargo, preferentemente, los fibroblastos de la etapa (a) proceden del tejido o del organo en el que va a utilizarse como sustituto el tejido artificial. Por ejemplo, cuando el metodo de la invencion se utiliza para preparar un tejido sustituto de piel o una piel artificial, los fibroblastos proceden, preferentemente, de piel
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(fibroblastos dermicos); cuando se utiliza para preparar un tejido sustituto de vejiga o una vejiga artificial, los fibroblastos proceden, preferentemente, de vejiga; cuando se utiliza para preparar un tejido sustituto de uretra o una uretra artificial los fibroblastos proceden, preferentemente, de uretra; o cuando se utiliza para preparar un tejido sustituto de mucosa oral o una mucosa oral artificial los fibroblastos proceden preferentemente, de mucosa oral. No obstante, los fibroblastos pueden obtenerse de cualquier otro tejido u organo, tal como, por ejemplo, la mucosa oral, la pared abdominal o cualquier tejido conjuntivo. Por ejemplo, los fibroblastos obtenidos de mucosa oral pueden utilizarse para preparar un tejido sustituto de piel o una piel artificial, un tejido sustituto de vejiga o una vejiga artificial, un tejido sustituto de uretra o una uretra artificial, o un tejido sustituto de cornea o una cornea artificial.
En otra realizacion preferida del metodo de la invencion, las celulas de la etapa (a) son queratocitos o celulas no diferenciadas con la capacidad para diferenciarse en queratocitos. Por ejemplo, cuando el metodo de la invencion se utiliza para preparar un tejido sustituto de cornea o una cornea artificial, preferentemente, se utilizan queratocitos del estroma corneal.
La posibilidad de que todos los componentes del tejido artificial sean de origen autologo permite que el trasplante de dicho tejido pueda realizarse sin que sea necesaria la inmunosupresion del sujeto trasplantado. Sin embargo, los componentes del tejido artificial tambien puedan ser de origen alogenico, es decir, pueden proceder de un individuo diferente a aquel al que se le va a trasplantar el tejido artificial. Incluso la especie de la cual proceden dichos componentes, puede ser diferente; en cuyo caso se dice que su origen es xenogenico. Esto abre la posibilidad de que el tejido artificial este preparado de antemano cuando se necesite con urgencia, aunque en este caso sf sena recomendable proceder a la inmunosupresion del sujeto al que se trasplante el tejido artificial.
Por lo tanto, en una realizacion preferida, las celulas de la etapa (a) de la invencion son de origen autologo. No obstante, las celulas de la etapa (a) tambien pueden ser de origen alogenico o xenogenico.
Mediante la adicion a las celulas de la etapa (a) de los diferentes componentes descritos en las etapas (a)-(d) del metodo de la invencion, y tras dejar reposar el producto resultante de la etapa (e) en un soporte, se produce la formacion de una matriz que comprende fibrina, el polisacarido y, en el caso correspondiente, la protema anadida en la etapa (d2) si se ha aplicado dicha etapa, en la que quedan embebidas dichas celulas y sobre la cual y/o en cuyo interior estas pueden crecer. Preferentemente, las celulas de la etapa (a) crecen en el interior de dicha matriz.
La formacion de una matriz de fibrina tiene lugar por la polimerizacion del fibrinogeno inducida por trombina. El fibrinogeno es una protema de elevado peso molecular que esta presente en el plasma sangumeo. La trombina es una enzima proteolttica que provoca la ruptura de la molecula de fibrinogeno en polipeptidos de bajo peso molecular y en monomeros de fibrina. Dichos monomeros polimerizan en dfmeros y posteriormente se unen entre sf mediante enlaces covalentes por la accion del factor XIII, previamente activado por la trombina, y en presencia de iones de calcio.
La composicion que comprende fibrinogeno de la etapa (a) puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse, plasma sangumeo. La composicion de la etapa (a) puede asimismo prepararse a partir de un derivado plasmatico, tal como, por ejemplo, pero sin limitarse, un crioprecipitado o un concentrado de fibrinogeno. Ademas de fibrinogeno, la composicion de la etapa (a) puede contener otros factores de coagulacion.
En una realizacion preferida, la concentracion de fibrinogeno en el producto resultante de la etapa (c) es de entre 0,5 y 10 g/l, opcionalmente entre 1 y 10 g/l. En una realizacion mas preferida, la concentracion en el producto resultante de la etapa (d) es de entre 1 y 4 g/l, opcionalmente entre 2 y 4 g/l. No obstante, tambien podna utilizarse una concentracion mas alta o mas baja.
En una realizacion preferida, el fibrinogeno de la composicion de la etapa (a) o la composicion que comprende fibrinogeno de la etapa (a) es de origen autologo. No obstante, el fibrinogeno de la composicion de la etapa (a) o la composicion que comprende fibrinogeno de la etapa (a) tambien puede ser de origen alogenico o xenogenico.
En una realizacion preferida de este primer aspecto de la invencion, la composicion que contiene fibrinogeno de la etapa (a) es plasma sangumeo. En este caso, la polimerizacion del fibrinogeno puede inducirse mediante la adicion de una fuente de calcio en la etapa (c).
En una realizacion mas preferida de este primer aspecto de la invencion, la fuente de calcio de la etapa (c) es una sal de calcio tal como, por ejemplo, pero sin limitarse, cloruro calcico, gluconato calcico o una combinacion de ambas. La concentracion de la sal de calcio debera ser suficiente para inducir la polimerizacion del fibrinogeno. En una realizacion mas preferida, la sal de calcio es cloruro calcico. En una realizacion aun mas preferida, la concentracion de cloruro de calcio en el producto resultante de la etapa (e) es de entre 0,25 y 3 g/l, opcionalmente entre 0,5 y 4 g/l. No obstante, tambien podna utilizarse una concentracion mas alta o mas baja.
El termino “factor de coagulacion”, tal y como se utiliza en la presente descripcion, se refiere a un componente, generalmente, una protema, presente en el plasma sangumeo y que interviene en la reaccion en cadena que hace posible la coagulacion. Son trece los factores de coagulacion, nombrados con numeros romanos: I: fibrinogeno; II:
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protrombina; III: factor tisular o tromboplastina; IV: calcio; V: proacelerina; VI: factor inactivo o cimogeno; VII: proconvertina; VIII: factor antihemofflico A o factor von Willebrand; IX: factor antihemofflico B o factor de Christmas; X: factor de Stuart-Prower; XI: factor antihemofflico C; XII: Factor Hageman; XIII: Factor estabilizante de la fibrina; XIV: Fitzgerald; XV: Fletcher; XVI: plaquetas y XVII: Somocurcio. Preferentemente, el otro factor de coagulacion anadido en la etapa (c) del metodo de la presente invencion es el factor XIII.
El poftmero de fibrina puede degradarse mediante el proceso denominado fibrinolisis. Durante la fibrinolisis, el plasminogeno es convertido en la enzima activa plasmina, por el activador tisular del plasminogeno; la plasmina se une a la superficie de la fibrina a traves de sus sitios de union, para producir la degradacion del poftmero de fibrina. Para impedir la fibrinolisis de la matriz de fibrina, en la etapa (b) de la presente invencion se anade un agente antifibrinolftico tal como, por ejemplo, pero sin limitarse, acido epsilon aminocaproico, acido tranexamico o aprotinina.
El acido tranexamico es un producto sintetico derivado del aminoacido lisina con gran afinidad por los sitios de union de lisina del plasminogeno; bloquea estos sitios e impide la union del plasminogeno activado a la superficie de fibrina, ejerciendo un efecto antifibrinolftico. El acido tranexamico tiene la ventaja, frente a otros agentes antifibrinoftticos de origen animal, de que no transmite enfermedades. Por tanto, en una realizacion preferida, el agente antifibrinolftico es el acido tranexamico. En una realizacion aun mas preferida, la concentracion de acido tranexamico en el producto resultante de la etapa (e) es de entre 0,5 y 2 g/l, preferentemente entre 1 y 2 g/l. No obstante, tambien podna utilizarse una concentracion mas alta o mas baja.
Las matrices de fibrina son muy versatiles, por lo que se han utilizado para la preparacion de diferentes tejidos artificiales, sin embargo, la utilizacion cftnica de las mismas se ha visto limitada debido al hecho, fundamentalmente, de su escasa consistencia, su diffcil manipulacion y su enorme fragilidad. Por ese motivo, en la etapa (d) del metodo de la invencion se anade un polisacarido. En general, dicho polisacarido se utiliza para aportar resistencia y consistencia al tejido, y es conveniente que sea soluble en el mismo. Ejemplos de polisacaridos que pueden utilizarse en la etapa (d) del metodo de la presente invencion son pero, sin limitarse, agar-agar, agarosa, alginato, quitosano o carragenanos, o cualquier combinacion de los anteriores. El polisacarido anadido en la etapa (d) del metodo de la invencion es agarosa.
La agarosa es un polisacarido formado por galactosas alfa y beta que se extrae de algas de generos tales como Gellidium o Gracillaria. La agarosa, frente a otros polisacaridos que pueden utilizarse en la etapa (d) de la presente invencion, tiene la ventaja de que forma una matriz inerte desde el punto de vista inmunologico. Por tanto, en una realizacion preferida, el polisacarido de la etapa (d) del metodo de la invencion es agarosa. Existen diferentes tipos de agarosa que vanan en sus propiedades ffsicas y qrnmicas tales como, por ejemplo, la temperatura de gelificacion, la resistencia y/o la porosidad del gel. Preferentemente, la agarosa de la etapa (d) del metodo de la invencion es una agarosa con un punto de fusion bajo, es decir, una agarosa que se repolimeriza y solidifica a una temperatura, preferentemente, menor de 65 °C y, mas preferentemente, menor de 40 °C; de esta manera puede utilizarse para preparar el tejido a temperaturas muy bajas, minimizando la probabilidad de muerte celular. En una realizacion mas preferida, la agarosa utilizada en la etapa (d) del metodo de la invencion es agarosa de tipo VII. En una realizacion aun mas preferida, la agarosa, preferentemente, agarosa de tipo VII, en el producto resultante de la etapa (e) esta a una concentracion, ventajosamente, de entre 0,1 y 6 g/l, opcionalmente entre 0,2 y 6 g/l, preferentemente, de entre 0,15 y 3 g/l, opcionalmente entre 0,3 y 3 g/l y mas preferentemente, de entre 0,25 y 2 g/l, opcionalmente entre 0,5 y 2 g/l. No obstante, tambien podna utilizarse una concentracion mas alta o mas baja.
En una realizacion preferida, el metodo de la invencion comprende una etapa adicional entre la etapa (b) y la (c) etapa (b2)) en el que se anade una protema. Son ejemplos de protemas que pueden utilizarse en la etapa (b2) del metodo de la presente invencion pero sin limitarse, fibronectina, laminina, colageno de tipo VII o entactina, o cualquier combinacion de los anteriores. Estas protemas forman parte de la matriz extracelular del tejido conjuntivo de manera natural en los tejidos, por lo que las celulas embebidas en un tejido artificial obtenido mediante el metodo de la invencion, encuentran un microambiente mas parecido al fisiologico, mejorando la adhesion, la diferenciacion y/o la supervivencia de dichas celulas.
En una realizacion preferida, la protema que se anade en la etapa (b2) es fibronectina. La fibronectina es una glicoprotema presente en la matriz extracelular (MEC) de la mayona de los tejidos celulares animales desempenando un importante papel en la adhesion de las celulas a la matriz. En una realizacion mas preferida, la protema anadida entre la etapa (b) y la (c) del metodo de la invencion es fibronectina. El objeto de esta adicion es favorecer la adhesion de las celulas de la etapa (e) al producto resultante de la etapa (d). Por ejemplo, cuando el metodo de la invencion se utiliza para preparar un tejido sustituto de cornea o una cornea artificial, la adicion de fibronectina minimiza el desprendimiento de las celulas del epitelio corneal anadidas en la etapa (e) lo que supone una importante ventaja con respecto a otros metodos descritos en el estado de la tecnica. En una realizacion aun mas preferida, la concentracion de fibronectina en el producto resultante de la etapa (d) es de entre 0,25 y 1 g/l, opcionalmente entre 0,5 y 1 g/l. No obstante, tambien podna utilizarse una concentracion mas alta o mas baja.
En una realizacion preferida, el metodo de la invencion comprende una etapa adicional (etapa d2) entre la etapas (d) y (e), que comprende la adicion de una composicion que comprende una protema al producto resultante de la etapa
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(d). Son ejemplos de protemas que pueden utilizarse en la etapa (e) del metodo de la presente invencion, pero sin limitarse, colageno, reticulina o elastina. La adicion de una protema entre la etapa (d) y la (e) da lugar a tejidos que presentan una mayor densidad fibrilar a nivel del estroma, un mejor comportamiento viscoelastico y un esfuerzo umbral creciente. En una forma de realizacion aun mas preferida, la protema que se anade en la etapa (d2) es colageno.
La adicion de dichas protemas en la etapa (d2) del metodo de la invencion tambien mejora las propiedades ffsicas (reologicas, mecanicas o biomecanicas) del tejido artificial obtenido. En los ejemplos de esta memoria descriptiva se demuestra que en los tejidos artificiales que comprenden fibrina, agarosa y colageno, el uso concentraciones crecientes de colageno mejora el comportamiento viscoelastico, lo que se pone de manifiesto por un aumento del esfuerzo umbral dependiente de la concentracion de colageno.
Las principales propiedades reologicas de un material solido o semisolido son la viscosidad y la elasticidad. La viscosidad es la resistencia que ofrece un fluido a la deformacion tangencial, y sena equivalente a la consistencia o rigidez. La elasticidad es la propiedad mecanica de ciertos materiales de sufrir deformaciones reversibles cuando se encuentran sujetos a la accion de fuerzas externas, y de recuperar la forma original cuando cesan estas fuerzas externas. El analisis de estos parametros se realiza mediante reometna, tecnica ffsica que utiliza instrumentos denominados reometros.
El esfuerzo umbral es la energfa necesaria para provocar una deformacion irreversible en un solido o un fluido. Normalmente, todos los materiales tienen una region elastica, en la que la fuerza aplicada provoca una deformacion totalmente reversible cuando cesa la fuerza. Si esa fuerza supera un lfmite (modulo elastico), la deformacion pasa a ser irreversible, entrando en una region plastica. Finalmente, si la fuerza supera el modulo plastico, el material se rompe (punto de fractura).
El colageno es una protema de facil disponibilidad en la naturaleza y desde el punto de vista biologico se caracteriza por su baja inmunidad y elevada actividad tisular. El colageno forma las fibras de colageno, que son flexibles, pero ofrecen gran resistencia a la traccion. En la presente invencion se demuestra que los tejidos artificiales de fibrina, agarosa y colageno tienen una mayor densidad fibrilar a nivel del estroma, un mejor comportamiento viscoelastico y un esfuerzo umbral creciente segun se aumenta la concentracion de colageno, y mas elevado que el de los tejidos artificiales de colageno. Portanto, en una realizacion preferida la protema anadida en la etapa (e) es colageno.
En una realizacion preferida, el colageno anadido en la etapa (d2) se selecciona de la lista que comprende: colageno de tipo I, colageno de tipo II, colageno de tipo III, colageno de tipo IV, colageno de tipo V, colageno de tipo VI, colageno de tipo VII, colageno de tipo VIII, colageno de tipo IX, colageno de tipo X, colageno de tipo XI, colageno de tipo XII, colageno de tipo XIII o cualquier combinacion de los anteriores. En una realizacion mas preferida, el colageno anadido en la etapa (e) se selecciona de la lista que comprende: colageno de tipo I, colageno de tipo II, colageno de tipo III, colageno de tipo IV, colageno de tipo V, colageno de tipo IX o cualquier combinacion de los anteriores. La seleccion de un tipo particular de colageno en la etapa (e) del metodo de la invencion, depende del tejido artificial que se desee preparar y se realiza en funcion de las caractensticas de cada colageno que son conocidas en el estado de la tecnica.
Por ejemplo, la funcion principal del colageno de tipo I es la de resistencia al estiramiento, y se encuentra abundantemente en la dermis, el hueso, el tendon y la cornea. Asf, en la presente invencion se demuestra que la adicion de colageno de tipo I en la etapa (e) otorga excelentes propiedades al tejido artificial cuando se quiere preparar, por ejemplo, pero sin limitacion, un tejido sustituto de cornea o una cornea artificial. Por tanto, en una realizacion preferida el colageno es colageno de tipo I.
En una realizacion aun mas preferida, el colageno, preferentemente, colageno de tipo I, en el producto resultante de la etapa (d), esta a una concentracion, ventajosamente, de entre 0,5 y 5 g/l, preferentemente, de entre 1,8 y 3,7 g/l, y mas preferentemente, de entre 2,5 y 3 g/l. No obstante, tambien podna utilizarse una concentracion mas alta o mas baja.
En una realizacion particular, el colageno utilizado es un atelocolageno, es decir, un colageno del cual se han eliminado las regiones terminales de estructura no helicoidal denominadas telopeptidos. Estos telopeptidos pueden hacer que el colageno que sea insoluble y son portadores de los principales determinantes antigenicos del colageno. El atelocolageno se obtiene, por ejemplo, mediante tratamiento proteasico con pepsina.
Dependiendo de las concentraciones de fibrinogeno que se utilicen en la etapa (a), de la concentracion de polisacarido que se utilice en la etapa (d) y, en el caso de que se aplique una etapa (d2), de la concentracion de colageno que se utilice en la etapa (d2), el tejido artificial resultante de la etapa (e) puede comprender concentraciones variables de dos/tres componentes.
En una realizacion preferida, en el producto resultante de la etapa (e), la concentracion de fibrinogeno es de entre 0,5 y 10 g/l, la concentracion de agarosa, preferentemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,1 y 6 g/l. Si se ha incluido una etapa (d2), la concentracion del colageno, preferentemente, colageno de tipo I, es de entre 0,5 y 5 g/l.
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En otra realizacion preferida, en el producto resultante de la etapa (e), la concentracion de fibrinogeno es de entre 0,5 y 10 g/l, la concentracion de agarosa, preferentemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,15 y 3 g/l. Si se ha incluido una etapa (d2), la concentracion del colageno, preferentemente, colageno de tipo I, es de entre 0,5 y 5 g/l.
En otra realizacion preferida, en el producto resultante de la etapa (e), la concentracion de fibrinogeno es de entre 0,5 y 10 g/l, la concentracion de agarosa, preferentemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,25 y 2 g/l. Si se ha incluido una etapa (d2), la concentracion del colageno, preferentemente, colageno de tipo I, es de entre 0,5 y 5 g/l.
En otra realizacion preferida, en el producto resultante de la etapa (e), la concentracion de fibrinogeno es de entre 0,5 y 10 g/l, la concentracion de agarosa, preferentemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,1 y 6 g/l. Si se ha incluido una etapa (d2), la concentracion del colageno, preferentemente, colageno de tipo I, es de entre 1,8 y 3,7 g/l.
En otra realizacion preferida, en el producto resultante de la etapa (e), la concentracion de fibrinogeno es de entre 0,5 y 10 g/l, la concentracion de agarosa, preferentemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,15 y 3 g/l. Si se ha incluido una etapa (d2), la concentracion del colageno, preferentemente, colageno de tipo I, es de entre 1,8 y 3,7 g/l.
En otra realizacion preferida, en el producto resultante de la etapa (e), la concentracion de fibrinogeno es de entre 0,5 y 10 g/l, la concentracion de agarosa, preferentemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,25 y 2 g/l. Si se ha incluido una etapa (d2), la concentracion del colageno, preferentemente, colageno de tipo I, es de entre 1,8 y 3,7 g/l.
En otra realizacion preferida, en el producto resultante de la etapa (e), la concentracion de fibrinogeno es de entre 0,5 y 10 g/l, la concentracion de agarosa, preferentemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,1 y 6 g/l. Si se ha incluido una etapa (d2), la concentracion del colageno, preferentemente, colageno de tipo I, es de entre 2,5 y 3 g/l.
En otra realizacion preferida, en el producto resultante de la etapa (e), la concentracion de fibrinogeno es de entre 0,5 y 10 g/l, la concentracion de agarosa, preferentemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,15 y 3 g/l. Si se ha incluido una etapa (d2), la concentracion del colageno, preferentemente, colageno de tipo I, es de entre 2,5 y 3 g/l.
En otra realizacion preferida, en el producto resultante de la etapa (e), la concentracion de fibrinogeno es de entre 0,5 y 10 g/l, la concentracion de agarosa, preferentemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,25 y 2 g/l. Si se ha incluido una etapa (d2), la concentracion del colageno, preferentemente, colageno de tipo I, es de entre 2,5 y 3 g/l.
En otra realizacion preferida, en el producto resultante de la etapa (e), la concentracion de fibrinogeno es de entre 1 y 4 g/l, la concentracion de agarosa, preferentemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,1 y 6 g/l. Si se ha incluido una etapa (d2), la concentracion del colageno, preferentemente, colageno de tipo I, es de entre 0,5 y 5 g/l.
En otra realizacion preferida, en el producto resultante de la etapa (e), la concentracion de fibrinogeno es de entre 1 y 4 g/l, la concentracion de agarosa, preferentemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,15 y 3 g/l. Si se ha incluido una etapa (d2), la concentracion del colageno, preferentemente, colageno de tipo I, es de entre 0,5 y 5 g/l.
En otra realizacion preferida, en el producto resultante de la etapa (e), la concentracion de fibrinogeno es de entre 1 y 4 g/l, la concentracion de agarosa, preferentemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,25 y 2 g/l. Si se ha incluido una etapa (d2), la concentracion del colageno, preferentemente, colageno de tipo I, es de entre 0,5 y 5 g/l.
En otra realizacion preferida, en el producto resultante de la etapa (e), la concentracion de fibrinogeno es de entre 1 y 4 g/l, la concentracion de agarosa, preferentemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,1 y 6 g/l. Si se ha incluido una etapa (d2), la concentracion del colageno, preferentemente, colageno de tipo I, es de entre 1,8 y 3,7 g/l.
En otra realizacion preferida, en el producto resultante de la etapa (e), la concentracion de fibrinogeno es de entre 1 y 4 g/l, la concentracion de agarosa, preferentemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,15 y 3 g/l. Si se ha incluido una etapa (d2), la concentracion del colageno, preferentemente, colageno de tipo I, es de entre 1,8 y 3,7 g/l.
En otra realizacion preferida, en el producto resultante de la etapa (e), la concentracion de fibrinogeno es de entre 1 y 4 g/l, la concentracion de agarosa, preferentemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,25 y 2 g/l. Si se ha incluido una etapa (d2), la concentracion del colageno, preferentemente, colageno de tipo I, es de entre 1,8 y 3,7 g/l.
En otra realizacion preferida, en el producto resultante de la etapa (e), la concentracion de fibrinogeno es de entre 1 y 4 g/l, la concentracion de agarosa, preferentemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,1 y 6 g/l. Si se ha incluido una etapa (d2), la concentracion del colageno, preferentemente, colageno de tipo I, es de entre 2,5 y 3 g/l.
En otra realizacion preferida, en el producto resultante de la etapa (e), la concentracion de fibrinogeno es de entre 1 y 4 g/l, la concentracion de agarosa, preferentemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,15 y 3 g/l. Si se ha incluido una etapa (d2), la concentracion del colageno, preferentemente, colageno de tipo I, es de entre 2,5 y 3 g/l.
En otra realizacion preferida, en el producto resultante de la etapa (e), la concentracion de fibrinogeno es de entre 1 y 4 g/l, la concentracion de agarosa, preferentemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,25 y 2 g/l. Si se ha incluido
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una etapa (d2), la concentracion del colageno, preferentemente, colageno de tipo I, es de entre 2,5 y 3 g/l.
Mediante la adicion a las celulas de los diferentes componentes descritos en la etapa (a), una vez realizadas las etapas (a)-(d) del metodo de la invencion, y tras dejar reposar el producto resultante de la etapa (e) en un soporte, se produce la formacion de una matriz que comprende fibrina, el polisacarido y, en el caso de que se haya incluido la etapa (d2), la protema anadida en dicha etapa, en la que quedan embebidas dichas celulas y sobre la cual y/o en cuyo interior estas pueden crecer. Preferentemente, las celulas de la etapa (a) crecen en el interior de dicha matriz.
Una vez realizadas las etapas (a)-(d) del metodo de la invencion, el producto resultante de la etapa (d) se deja reposar en un soporte para que se produzca la formacion de la matriz que comprende la fibrina, el polisacarido y, dependiendo de si se ha llevado a cabo una etapa (b2), la protema anadida en dicha etapa, en la que quedan embebidas las celulas de la etapa (a). Soportes que pueden utilizarse son, por ejemplo, pero sin limitarse, placas de cultivo tisular o insertos porosos de cultivo celular. Preferentemente, dichos soportes estaran en condiciones de esterilidad.
La etapa (e) del metodo de la invencion, consiste en cultivar celulas aisladas, preferentemente, de un mairnfero, en o sobre el producto resultante de la etapa (e). Dichas celulas pueden obtenerse mediante diferentes metodos descritos en el estado de la tecnica y que pueden depender del tipo celular particular del que se trate. Algunos de estos metodos son, por ejemplo, pero sin limitarse, biopsia, procesado mecanico, tratamiento enzimatico (por ejemplo, pero sin limitarse, con tripsina o colagenasa de tipo I), centrifugacion, lisis eritrocitaria, filtracion, cultivo en soportes o medios que favorezcan la proliferacion selectiva de dicho tipo celular o inmunocitometna. Algunos de estos metodos se describen en detalle en los ejemplos de esta invencion.
Las celulas de la etapa (e) pueden ser celulas diferenciadas, tales como, por ejemplo, pero sin limitarse, celulas epiteliales, o celulas no diferenciadas con la capacidad para diferenciarse en dichas celulas, tales como, por ejemplo, celulas madre adultas.
En una realizacion preferida, las celulas diferenciadas de la etapa (e) son celulas epiteliales, tales como, por ejemplo, pero sin limitarse, queratinocitos, celulas epiteliales de la mucosa oral, celulas epiteliales de la vejiga, celulas epiteliales de la uretra, celulas epiteliales de la cornea o celulas endoteliales vasculares.
Preferentemente, las celulas epiteliales de la etapa (e) proceden del tejido o del organo en el que va a utilizarse como sustituto el tejido artificial. Por ejemplo, cuando el metodo de la invencion se utiliza para preparar un tejido sustituto de piel o una piel artificial, las celulas epiteliales proceden, preferentemente, de la epidermis de la piel, es decir, son queratinocitos; cuando se utiliza para preparar un tejido sustituto de vejiga o una vejiga artificial, las celulas epiteliales proceden, preferentemente, del epitelio o urotelio de la vejiga; cuando se utiliza para preparar un tejido sustituto de uretra o una uretra artificial las celulas epiteliales proceden, preferentemente, del epitelio de la uretra; cuando se utiliza para preparar un tejido sustituto de cornea o una cornea artificial, preferentemente, las celulas epiteliales son celulas epiteliales de la cornea; cuando se utiliza para preparar un tejido sustituto de mucosa oral, preferentemente, las celulas epiteliales proceden, preferentemente, del epitelio de la mucosa oral.
Sin embargo, las celulas epiteliales de la etapa (e) tambien pueden obtenerse de un tejido u organo distinto del tejido u organo en el que va a utilizarse como sustituto el tejido artificial. Por ejemplo, cuando el metodo de la invencion se utiliza para preparar un tejido sustituto de piel o una piel artificial, un tejido sustituto de vejiga o una vejiga artificial, un tejido sustituto de uretra o una uretra artificial, o un tejido sustituto de cornea o una cornea artificial, las celulas epiteliales de la etapa (e) pueden ser celulas epiteliales de la mucosa oral. O, por ejemplo, cuando el metodo de la invencion se utiliza para preparar un tejido sustituto de vejiga o una vejiga artificial, o cuando se utiliza para preparar un tejido sustituto de uretra o una uretra artificial, las celulas epiteliales pueden ser queratinocitos.
Uno de los problemas que se asocian a la generacion de tejido artificial en laboratorio, es la produccion de un numero significativo de celulas diferenciadas, por lo que con frecuencia, se considera como una fuente alternativa el uso de celulas madre, con capacidad para diferenciarse a dichas celulas. Se entiende por “celula madre” aquella que tiene una elevada capacidad para dividirse y diferenciarse morfologica y funcionalmente en distintos tipos de celulas mas especializadas. Durante el proceso de diferenciacion, una celula indiferenciada modifica su fenotipo y morfologfa para convertirse en una celula diferenciada, con una estructura y funcion especializada.
Segun su potencialidad, es decir, a su capacidad para diferenciarse en distintos tipos celulares, las celulas madre se pueden clasificar en: (a) totipotentes (no forman parte de la invencion): capaces de diferenciarse tanto en tejido embrionario como en tejido extraembrionario; (b) pluripotentes con capacidad para diferenciarse en cualquiera de los tejidos procedentes de las tres capas embrionarias (endodermo, mesodermo y ectodermo); (c) multipotentes: capaces de diferenciarse en distintos tipos celulares derivados de una misma capa embrionaria (endodermo, mesodermo o ectodermo); y (d) unipotentes: con capacidad para formar un unico linaje celular.
Segun su origen, las celulas madre se han dividido en: (a) embrionarias: de la masa celular interna del blastocisto en el estadio embrionario de preimplantacion o de la cresta gonadal, y que son totipotentes (no parte de la invencion) o pluripotentes; y (b) adultas: en el adulto, el feto y el cordon umbilical, y que son multipotentes o unipotentes. Dentro
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de las celulas madre adultas, nos encontramos con las celulas madre mesenquimaticas, que se encuentran repartidas en el tejido conectivo de diversos organos, tales como, por ejemplo, pero sin limitarse, la medula osea, la sangre periferica, el tejido adiposo o el cordon umbilical. En una realizacion preferida, las celulas madre adultas son celulas madre adultas de la medula osea, del tejido adiposo o del cordon umbilical.
El cordon umbilical constituye una interesante fuente de celulas madre adultas, debido a que, a diferencia de las celulas madre adultas obtenidas de otras fuentes; (a) su metodo de obtencion no es invasivo ni doloroso; y (b) su capacidad proliferativa y su potencial de diferenciacion no disminuye como consecuencia del proceso de envejecimiento. Entre las diferentes fuentes de celulas madre del cordon umbilical destacan las llamadas celulas madre de la gelatina de Wharton del cordon umbilical, por: (a) su gran capacidad de proliferacion y a su rapidez de expansion en cultivo; y (b) la baja expresion del Complejo Mayor de Histocompatibilidad de clase I y ausencia de expresion del Complejo Mayor de Histocompatibilidad de clase II, lo que las convierte en buenas candidatas para la terapia celular alogenica.
Por tanto, en otra realizacion preferida, las celulas de la etapa (e) son celulas madre de la gelatina de Wharton del cordon umbilical. Estas celulas expresan, en su superficie, diversos marcadores caractensticos de las celulas mesenquimaticas, tales como, por ejemplo, SH2, Sh3, CD10, CD13, CD29, CD44, CD54, CD73, CD90, CD105 o CD166, y no tienen marcadores de linaje hematopoyetico, tales como, por ejemplo, CD31, CD34, CD38, CD40 o CD45. Las celulas madre de la gelatina de Wharton del cordon umbilical pueden diferenciarse, por ejemplo, en condroblastos, osteoblastos, adipocitos, precursores neuronales, cardiomiocitos, celulas del musculo esqueletico, celulas endoteliales o hepatocitos.
Las celulas madre adultas pueden caracterizarse mediante la identificacion de protemas de superficie y/o intracelulares, genes, y/u otros marcadores indicativos de su estado indiferenciado, mediante diferentes metodos conocidos en el estado de la tecnica tales como, por ejemplo, pero sin limitarse, inmunocitometna, analisis inmunocitoqmmico, analisis por transferencia Northern, RT-PCR, analisis de expresion genica en micromatrices, estudios proteomicos o analisis por presentacion diferencial.
Las celulas madre pueden inducirse para diferenciarse in vitro para dar lugar a celulas que expresen, al menos, una o mas caractensticas propias de celulas diferenciadas. Son ejemplos de celulas diferenciadas que pueden diferenciarse de las celulas madre, pero sin limitarse, los fibroblastos, los queratinocitos, las celulas uroteliales, las celulas del epitelio de la uretra, las celulas del epitelio corneal, las celulas epiteliales de la mucosa oral, los condroblastos, osteoblastos, adipocitos o las neuronas. En una realizacion preferida de la invencion, la celula diferenciada de la celula madre multipotente de la invencion expresa una o mas caractensticas propias de una celula diferenciada seleccionada de la lista que comprende: fibroblasto, queratinocito, celula urotelial, celula del epitelio de la uretra, celula del epitelio corneal, celula epitelial de la mucosa oral, condroblasto, osteoblasto, adipocito o neurona.
Las celulas diferenciadas pueden caracterizarse mediante la identificacion de protemas de superficie y/o intracelulares, genes, y/u otros marcadores indicativos de su estado diferenciado, mediante diferentes metodos conocidos en el estado de la tecnica tales como, por ejemplo, pero sin limitarse, inmunocitometna, analisis inmunocitoqmmico, analisis por transferencia Northern, RT-PCR, analisis de expresion genica en micromatrices, estudios proteomicos o analisis por presentacion diferencial.
En una realizacion preferida, las celulas de la etapa (e) de la invencion son de origen autologo. No obstante, las celulas de la etapa (e) tambien pueden ser de origen alogenico o xenogenico.
Las celulas de la etapa (e) son capaces de proliferar sobre el producto resultante de la etapa (d) y/o en su interior. Preferentemente, las celulas de la etapa (e) proliferan sobre la superficie del producto resultante de la etapa (d).
Las celulas de la etapa (e) se dejan proliferar hasta que alcanzan un numero adecuado hasta que alcanzan, tipicamente, al menos, un 70 % de confluencia, ventajosamente, al menos, un 80 % de confluencia, preferentemente, al menos, un 90 % de confluencia, mas preferentemente, al menos, un 95 % de confluencia y, aun mas preferentemente, al menos, un 100 % de confluencia. Durante el tiempo que las celulas se mantienen en cultivo, el medio de cultivo en el que se encuentran puede reemplazarse parcial o totalmente por un medio nuevo para reemplazar ingredientes agotados y eliminar metabolitos y catabolitos potencialmente daninos.
Para la correcta diferenciacion de algunos tipos celulares, puede ser necesaria una etapa adicional. Por ejemplo, en el caso de celulas epiteliales de la mucosa oral, queratinocitos o celulas del epitelio corneal, puede ser necesario exponer al aire la superficie epitelial para promover la correcta estratificacion y maduracion del epitelio, manteniendo la matriz que comprende las celulas de la etapa (a), sumergida en el medio de cultivo (tecnica de aire y lfquido).
Por tanto, en una realizacion preferida, el metodo de la invencion, ademas de las etapas (a)-(f) descritas anteriormente, comprende una etapa adicional en la que el producto resultante de la etapa (e) se expone al aire. En general, el metodo de la invencion incluye generalmente esta etapa cuando se utiliza para obtener un tejido artificial que sirva para reemplazar a un tejido natural cuyo epitelio se encuentra normalmente expuesto al contacto con el
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aire, tal como, por ejemplo, pero sin limitarse, la piel, la cornea, la mucosa oral, la uretra o la vagina. Preferentemente, esta etapa se realiza cuando se prepara un tejido sustituto de piel o una piel artificial, o cuando se prepara un tejido sustituto de cornea o una cornea artificial, o cuando se prepara un tejido sustituto de mucosa oral o una mucosa oral artificial.
Una de las innovaciones mas importantes del metodo de la invencion, consiste en la existencia de una etapa (f) en la que se induce la nanoestructuracion del producto resultante de la etapa (e). La expresion “nanoestructuracion”, tal y como se utiliza en la presente descripcion, se refiere a una modificacion estructural que consiste en la generacion de enlaces de tamano inferior a un micrometro entre las fibras de fibrina y entre estas y las moleculas de agarosa. Este proceso de nanoestructuracion permite obtener tejidos artificiales que muestran propiedades inesperadamente ventajosas con respecto a los biomateriales no estructurados. En concreto, los biomateriales sometidos a un proceso de nanoestructuracion segun la presente invencion, presentan (i) una mejora significativa de las propiedades biomecanicas del tejido, lo que permite la manipulacion del tejido nanoestructurado y supone una mejora sustancial e inesperada de las propiedades reologicas del biomaterial, caracterizada como una mayor resistencia (vease la figura 8) y una mayor elasticidad (veanse las figuras 9 y 10); (ii) una mejora sustancial de la manipulabilidad del tejido nanoestructurado, lo cual permitio su manipulacion quirurgica, la sutura en el lecho receptor y el implante en animales de experimentacion, (iii) una mejora significativa de la transparencia de los tejidos sometidos a nanoestructuracion (vease la figura 11), lo que no es en absoluto previsible puesto que los tejidos nanoestructurados son mas densos y con menor contenido acuoso que los tejidos no nanoestructurados y (iv) un mejor resultado clmico una vez implantados en animales de laboratorio relacionados, por un lado, debido a la mayor eficacia del implante clmico gracias a las adecuadas propiedades biomecanicas del biomaterial y, por otro lado, al hecho de que los biomateriales sometidos a nanoestructuracion tienen una mayor densidad de fibras por mm2 y, por tanto, una remodelacion mas lenta por parte del organismo receptor.
Segun la invencion, la induccion de la nanoestructuracion de la etapa (f) comprende la deshidratacion y/o la compresion mecanica del producto resultante de la etapa (e). El objetivo de la etapa (f) es generar una modificacion estructural entre las fibras de fibrina y las moleculas de agarosa del tejido artificial para alcanzar niveles optimos de consistencia y elasticidad, que no se obtienen mediante otros metodos descritos en el estado de la tecnica. El resultado final es una modificacion irreversible de las fibras que genera cualidades biomecanicas muy favorables para la manipulacion quirurgica y el implante clmico.
El termino “deshidratacion” se refiere a una eliminacion parcial y/o total de lfquido intersticial del producto resultante de la etapa (e). Por ejemplo, la cantidad de lfquido intersticial eliminado del producto resultante de la etapa (e) puede ser de, al menos, un 50 %, al menos, un 60 %, al menos, un 70 %, al menos, un 80 %, al menos, un 90 % o, al menos, un 99 % de lfquido intersticial contenido originalmente en el producto resultante de la etapa (e).
La deshidratacion del producto resultante de la etapa (e) puede conseguirse por medio de cualquier metodo ffsico o qrnmico. En una realizacion preferida, la deshidratacion del producto resultante de la etapa (e) comprende un metodo seleccionado de la lista que comprende: drenaje, evaporacion, succion, presion capilar, osmosis o electroosmosis.
El lfquido intersticial puede eliminarse inclinando el producto resultante de la etapa (e); el lfquido intersticial se drena despues debido al efecto de la gravedad y el gradiente.
El lfquido puede eliminarse mediante succion, por ejemplo, aplicando vacfo mediante una bomba mecanica a la superficie donde se encuentra el producto resultante de la etapa (e).
El lfquido intersticial puede eliminarse mediante evaporacion, por ejemplo, incubando el producto resultante de la etapa (e) en condiciones que promueven la evaporacion, por ejemplo, a una presion menor que la presion atmosferica y/o a una temperatura mayor que la temperatura ambiente.
El lfquido intersticial tambien puede eliminarse utilizando un agente osmotico con tendencia a absorber agua, tal como, por ejemplo, pero sin limitarse, una solucion de cloruro sodico hiperosmotica, separando al producto resultante de la etapa (e) de esta solucion mediante una membrana semipermeable, una esponja u otro material secante.
En una realizacion preferida, el lfquido intersticial puede eliminarse mediante presion capilar, por ejemplo, mediante la aplicacion de un material absorbente al producto resultante de la etapa (e). Algunos ejemplos de material absorbente que podnan utilizarse en la etapa (f) de la invencion, pero sin limitarse, son papel de filtro, papel 3M de la casa comercial Whatman, fibra de celulosa o tela absorbente. Preferentemente, el material absorbente estara esterilizado.
El tiempo requerido para la deshidratacion dependera del metodo o metodos utilizados, y puede determinarlo con facilidad un experto en la materia. La idoneidad del tejido artificial obtenido mediante la aplicacion de un determinado metodo de deshidratacion durante un determinado periodo de tiempo puede comprobarse mediante diversos metodos de evaluacion conocidos en el estado de la tecnica tales como, por ejemplo, pero sin limitarse, los descritos
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en los ejemplos de esta memoria descriptiva.
El Ifquido intersticial tambien puede eliminarse mediante compresion mecanica del producto resultante de la etapa (e). La compresion mecanica del producto resultante de la etapa (e) ademas puede servir para dar al producto resultante de la etapa (e) una forma definida deseada.
La compresion del producto resultante de la etapa (e) puede realizarse mediante cualquier metodo descrito en el estado de la tecnica. Puede utilizarse un metodo de compresion “estatico”, donde el producto resultante de la etapa (e) permanece estacionario tal como, por ejemplo, pero sin limitarse, la aplicacion de una carga estatica (por ejemplo, un peso muerto), un elemento hidraulico o una leva. Tambien puede utilizarse un metodo de compresion “dinamica”, donde el producto resultante de la etapa (e) se mueve durante la compresion tal como, por ejemplo, mediante la aplicacion de uno o mas rodillos o mediante la extrusion a traves de un orificio constrictivo.
La compresion mecanica del producto resultante de la etapa (e) puede realizarse mediante extrusion, por ejemplo, haciendo pasar el producto resultante de la etapa (e) a traves de un orificio que lo constrina, por ejemplo, una camara conica. La camara conica puede tener paredes porosas, de manera que permitina la eliminacion del lfquido intersticial del producto resultante de la etapa (e) mientras este pasa a traves de la misma.
La compresion del producto resultante de la etapa (e) puede realizarse mediante la centrifugacion del producto resultante de la etapa (e). Por ejemplo, el producto resultante de la etapa (e) puede colocarse sobre un tubo con el fondo poroso, de manera que, ademas de la compresion mecanica, se producina la eliminacion del lfquido intersticial del producto resultante de la etapa (e).
La compresion del producto resultante de la etapa (e) puede realizarse mediante la aplicacion de un globo en su interior para comprimir el producto resultante de la etapa (e) contra una superficie solida. La superficie solida puede formar, por ejemplo, un tubo alrededor del producto resultante de la etapa (e), permitiendo la formacion de un tejido artificial tubular.
En una realizacion preferida, la compresion del producto resultante de la etapa (e) comprende la aplicacion de un peso encima del producto resultante de la etapa (e), de manera que se ejerce una accion mecanica de presion sobre el tejido. Resulta evidente que cuanto mayor sea el peso, menor sera el tiempo necesario para obtener un tejido artificial con las caractensticas apropiadas. El peso utilizado para la compresion puede tener una superficie plana o puede colocarse sobre un material que tenga una superficie plana, por ejemplo, plastico, ceramica, metal o madera.
En la figura 1 de la presente memoria descriptiva se muestra un esquema no limitativo de como puede realizarse la nanoestructuracion del producto resultante de la etapa (e) mediante su deshidratacion y compresion. En dicho esquema puede observarse como puede obtenerse la nanoestructuracion situando el producto resultante de la etapa (e) entre dos papeles de filtro esteril, y colocando sobre el mismo un peso de aproximadamente 250 g (equivalente a aproximadamente 2.000 N/m2) sobre una superficie plana de vidrio esteril durante aproximadamente 10 minutos; entre el tejido y el papel de filtro sobre el que se coloca el peso se puede disponer un material poroso para impedir que el producto resultante de la etapa (e) se adhiera al papel de filtro. El material utilizado para impedir la adherencia debe ser poroso para permitir la salida de agua desde el tejido hacia el agente deshidratante: dicho material poroso utilizado para impedir la adherencia puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse, nylon, vidrio, ceramica, metal perforado o una membrana de policarbonato.
En una realizacion preferida, la compresion del producto resultante de la etapa (e) comprende la aplicacion de una presion sobre el mismo. Preferentemente, la magnitud de la presion es de entre 1.000 y 5.000 N/m2, mas preferentemente, de entre 1.500 y 2.500 N/m2 y, aun mas preferentemente, de aproximadamente 2.000 N/m2. La aplicacion de dicha presion puede hacerse manual, automatica o semi-automaticamente. El tiempo que se necesita para ejercer la presion depende de la magnitud de la presion aplicada y puede determinarlo con facilidad un experto en la materia. Resulta evidente que cuanto mayor sea la presion menor sera el tiempo necesario para obtener un tejido artificial con las caractensticas apropiadas. La idoneidad del tejido artificial obtenido mediante la aplicacion de una determinada magnitud de presion durante un determinado periodo de tiempo, puede comprobarse mediante diversos metodos de evaluacion conocidos en el estado de la tecnica, tales como, por ejemplo, pero sin limitarse, los descritos en los ejemplos de esta memoria descriptiva.
Para inducir la nanoestructuracion del producto resultante de la etapa (e) pueden utilizarse uno o mas procedimientos, de manera secuencial o simultanea. El tiempo requerido para la nanoestructuracion puede ser menor de 12 horas, menor de 6 horas, menor de 3 horas, menor de 1 hora, menor de 30 minutos, menor de 10 minutos, menor de 2 minutos o menor de 1 minuto. El tiempo requerido para la nanoestructuracion dependera del metodo o metodos utilizados, y puede determinarlo con facilidad un experto en la materia. La idoneidad del tejido artificial obtenido mediante la aplicacion de un determinado metodo durante un determinado periodo de tiempo, puede comprobarse mediante diversos metodos de evaluacion conocidos en el estado de la tecnica, tales como, por ejemplo, pero sin limitarse, los descritos en los ejemplos de esta memoria descriptiva.
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Tejido artificial de la invencion
Un segundo aspecto de la presente invencion, se refiere a un tejido artificial obtenible por el metodo de la invencion anteriormente descrito (de ahora en adelante, tejido artificial de la invencion).
En una realizacion preferida de este segundo aspecto de la invencion, el tejido artificial de la invencion es un tejido sustituto de piel o una piel artificial.
En otra realizacion preferida de este segundo aspecto de la invencion, el tejido artificial es un tejido sustituto de vejiga o una vejiga artificial.
En otra realizacion preferida de este segundo aspecto de la invencion, el tejido artificial de la invencion es un tejido sustituto de uretra o una uretra artificial.
En otra realizacion preferida de este segundo aspecto de la invencion, el tejido artificial de la invencion es un tejido sustituto de cornea o una cornea artificial.
En otra realizacion preferida de este segundo aspecto de la invencion, el tejido artificial de la invencion es un tejido sustituto de mucosa o una mucosa artificial.
El tejido artificial obtenible por el metodo de la invencion se puede cortar en el tamano deseado y/o disponer en una conformacion adecuada para su uso.
Antes de su uso, puede evaluarse la idoneidad del tejido artificial de la invencion para ejercer su funcion, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante cualquiera de los metodos descritos en los ejemplos de la presente descripcion.
Usos del tejido artificial de la invencion en la evaluacion de productos farmacologicos o qmmicos
Los farmacos y productos qmmicos deben evaluarse antes de su administracion en animales de experimentacion. A este respecto, son varios los informes y directivas aprobados por la Union Europea que tratan de restringir o incluso prohibir la experimentacion con animales en el sector de los productos cosmeticos (Directiva 76/768/CEE del Consejo Europeo relativa a la aproximacion de las legislaciones de los Estados Miembros en materia de productos cosmeticos), y es de esperar que la prohibicion total sea efectiva durante los proximos anos. La Union Europea apoya todas las medidas cuyo objetivo principal sea el bienestar de los animales utilizados con fines experimentales y para lograr metodos cientfficos de sustitucion para reducir al mmimo el numero de animales utilizados en experimentacion (Decision 1999/575/CE del Consejo, de 23 de marzo de 1998, relativa a la celebracion por la Comunidad del Convenio Europeo sobre la proteccion de animales vertebrados utilizados para experimentacion y otros fines cientfficos - Diario oficial L 222 de 24.08.1999).
Portanto, un tercer aspecto de la invencion se refiere al uso del tejido artificial de la invencion para la evaluacion de un producto farmacologico y/o qmmico.
Usos terapeuticos de los tejidos artificiales de la invencion
Una enfermedad infecciosa, inflamatoria, genetica o degenerativa, un dano ffsico o qmmico, o una interrupcion del flujo sangmneo, pueden dar lugar a una perdida de celulas de un tejido o un organo. Esta perdida celular conllevana una alteracion de la funcion normal de dicho tejido u organo; y por consiguiente, conducina al desarrollo de enfermedades o secuelas ffsicas que merman la calidad de vida de la persona. Por tanto, es importante tratar de regenerar o y restablecer la funcion normal de dichos tejidos u organos. El tejido o el organo danado pueden sustituirse por un tejido u organo nuevo que se haya fabricado en el laboratorio mediante tecnicas de ingeniena tisular. El objetivo de la ingeniena tisular es la construccion de tejidos biologicos artificiales y la utilizacion de los mismos con fines medicos para restaurar, sustituir o incrementar las actividades funcionales de los tejidos y organos enfermos. El uso terapeutico de este tipo de tecnicas es practicamente ilimitado con aplicaciones en todos los campos. El uso de las tecnicas de ingeniena tisular permite disminuir las listas de espera de tejidos y organos, con la consiguiente disminucion de la morbimortalidad de la enfermedad en el receptor. Logicamente, tambien tiene como consecuencia una disminucion de la morbimortalidad en los donantes de organos. Por otra parte, existen numerosas ventajas asociadas a la utilizacion de celulas o tejidos autologos en la ingeniena tisular, entre las que se incluyen: (a) una reduccion significativa del numero de infecciones del donante al receptor por agentes infecciosos; y (b) la ausencia de rechazo inmune de injerto contra huesped, por lo que el paciente no tiene necesidad de tomar tratamiento inmunosupresor, evitandose los efectos secundarios y los problemas asociados a la inmunodepresion.
Por tanto, un cuarto aspecto de la invencion se refiere al uso del tejido artificial de la invencion para su uso incrementando, restaurando o sustituyendo, parcial o totalmente, la actividad funcional de un tejido o un organo enfermo o danado.
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El tejido artificial de la invencion puede utilizarse para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de cualquier tejido u organo enfermo o danado de un organismo vivo. El tejido o el organo pueden ser internos, tal como, por ejemplo, pero sin limitarse, la uretra o la vejiga, o externos, tal como, por ejemplo, pero sin limitarse, la cornea o la piel. En una realizacion preferida, el tejido o el organo danado se seleccionan de la lista que comprende: piel, vejiga, uretra, cornea, mucosa, conjuntiva, pared abdominal, conjuntiva, timpano, faringe, laringe, intestino, peritoneo, ligamento, tendon, hueso, meninge o vagina. El tejido o el organo pueden estar enfermos o danados como consecuencia de una disfuncion, una lesion o una enfermedad, por ejemplo, pero sin limitarse, una enfermedad infecciosa, inflamatoria, genetica o degenerativa; un dano tisico, tal como un traumatismo o una intervencion quirurgica, un dano qrnmico o una interrupcion del flujo sangumeo.
Una realizacion preferida de este quinto aspecto se refiere al uso del tejido artificial de la invencion para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una piel. Una realizacion mas preferida se refiere al uso del tejido artificial de la invencion para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una piel enferma o danada como consecuencia de una disfuncion, una lesion o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una herida, una ulcera, una quemadura, una neoplasia benigna o maligna, una infeccion, una contusion, un traumatismo, una causticacion o una malformacion congenita.
Una realizacion preferida de este quinto aspecto se refiere al uso del tejido artificial de la invencion para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una vejiga. Una realizacion mas preferida se refiere al uso del tejido artificial de la invencion para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una vejiga enferma o danada como consecuencia de una disfuncion, una lesion o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una neoplasia benigna o maligna, una infeccion, un traumatismo, una malformacion congenita (tal como, por ejemplo, pero sin limitarse, extrofia vesical, vejiga contrafda o extrofia de cloaca), una vejiga neurogena, incontinencia urinaria, una disfuncion vesical, una infeccion o una litiasis vesical.
Una realizacion preferida de este quinto aspecto se refiere al uso del tejido artificial de la invencion para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una uretra. Una realizacion mas preferida refiere al uso del tejido artificial de la invencion para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una uretra enferma o danada como consecuencia de una disfuncion, una lesion o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una neoplasia benigna o maligna, una infeccion, un traumatismo, una malformacion congenita (tal como, por ejemplo, pero sin limitarse, hispospadias o epispadias) o una estenosis.
Una realizacion preferida de este quinto aspecto se refiere al uso del tejido artificial de la invencion para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una cornea. Una realizacion mas preferida se refiere al uso del tejido artificial de la invencion para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una cornea enferma o danada como consecuencia de una disfuncion, una lesion o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una ulcera corneal, un queratocono, un queratoglobo, un descematocele, un traumatismo, una causticacion, una insuficiencia lfmbica, una queratitis atrofica, una distrofia corneal, una queratopatia primaria o secundaria, una infeccion, un leucoma, una queratopatia bullosa, un insuficiencia endotelial corneal o una neoplasia benigna o maligna.
Una realizacion preferida de este quinto aspecto se refiere al uso del tejido artificial de la invencion para la preparacion de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una mucosa, preferentemente de una mucosa oral. Una realizacion aun mas preferida se refiere al uso del tejido artificial de la invencion para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una mucosa oral enferma o danada como consecuencia de una disfuncion, una lesion o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una herida, una ulcera, una quemadura, una neoplasia benigna o maligna, una infeccion, una contusion, un traumatismo, una causticacion, una malformacion congenita, una perdida de sustancia o una enfermedad periodontal. En una realizacion preferida, el tejido que se utiliza para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una mucosa es un tejido que entre la etapa (d) y la etapa (e) se ha sometido a una etapa (d2) de adicion de una protema. En una realizacion aun mas preferida, dicha etapa se lleva a cabo anadiendo, al material obtenido en la etapa (d), una composicion que comprende colageno, tal y como se describio en detalle anteriormente.
Un quinto aspecto de la presente invencion se refiere al uso del tejido artificial de la invencion en la preparacion de un medicamento.
Dicho medicamento es un medicamento de terapia celular somatica. Por “terapia celular somatica” se entiende el uso de celulas somaticas vivas, autologas, alogenicas o xenogenicas, cuyas caracteristicas biologicas se han alterado sustancialmente como resultado de su manipulacion para obtener un efecto terapeutico, de diagnostico o preventivo, por medios metabolicos, farmacologicos o inmunologicos. Entre los medicamentos de terapia celular somatica se encuentran, por ejemplo, pero sin limitarse: celulas manipuladas para modificar sus propiedades inmunologicas, metabolicas o funcionales de otro tipo en aspectos cualitativos o cuantitativos; celulas clasificadas, seleccionadas y manipuladas, que se someten posteriormente a un proceso de fabricacion con el fin de obtener el producto final; celulas manipuladas y combinadas con componentes no celulares (por ejemplo, matrices o
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dispositivos medicos biologicos o inertes) que ejercen la accion pretendida en principio en el producto acabado; derivados de celulas autologas expresadas ex vivo (in vitro) en condiciones espedficas de cultivo; celulas modificadas geneticamente o sometidas a otro tipo de manipulacion para expresar propiedades funcionales homologas o no homologas no expresadas anteriormente.
Un quinto aspecto de la presente invencion se refiere al uso del tejido artificial de la invencion para la preparacion de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de un tejido o un organo. En una realizacion preferida, el tejido o el organo danado se seleccionan de la lista que comprende: piel, vejiga, uretra, cornea, mucosa, conjuntiva, pared abdominal, conjuntiva, timpano, faringe, laringe, intestino, peritoneo, ligamento, tendon, hueso, meninge o vagina.
Una realizacion preferida de este quinto aspecto se refiere al uso del tejido artificial de la invencion para la preparacion de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de un tejido o un organo enfermo o danado como consecuencia de una enfermedad infecciosa, inflamatoria, genetica o degenerativa, un dano tisico o qmmico o una interrupcion del flujo sangumeo.
Una realizacion mas preferida de este quinto aspecto se refiere al uso del tejido artificial de la invencion para la preparacion de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una piel. Una realizacion aun mas preferida se refiere al uso del tejido artificial de la invencion para la preparacion de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una piel enferma o danada como consecuencia de una disfuncion, una lesion o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una herida, una ulcera, una quemadura, una neoplasia benigna o maligna, una infeccion, una contusion, un traumatismo, una causticacion o una malformacion congenita.
Una realizacion mas preferida de este quinto aspecto se refiere al uso del tejido artificial de la invencion para la preparacion de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una vejiga. Una realizacion aun mas preferida de este quinto aspecto se refiere al uso del tejido artificial de la invencion para la preparacion de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una vejiga enferma o danada como consecuencia de una disfuncion, una lesion o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una neoplasia benigna o maligna, una infeccion, un
traumatismo, una malformacion congenita (como por ejemplo, pero sin limitarse, una extrofia vesical, vejiga contrafda o extrofia de cloaca), una vejiga neurogena, incontinencia urinaria, una disfuncion vesical, una infeccion o una litiasis vesical.
Una realizacion mas preferida de este quinto aspecto se refiere al uso del tejido artificial de la invencion para la preparacion de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una uretra. Una realizacion aun mas preferida de este quinto aspecto se refiere al uso del tejido artificial de la invencion para la preparacion de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una uretra enferma o danada como consecuencia de una disfuncion, una lesion o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una neoplasia benigna o maligna, una infeccion, un
traumatismo, una malformacion congenita (tal como, por ejemplo, pero sin limitarse, hispospadias o epispadias) o una estenosis.
Una realizacion mas preferida de este quinto aspecto se refiere al uso del tejido artificial de la invencion para la preparacion de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una cornea. Una realizacion aun mas preferida de este quinto aspecto se refiere al uso del tejido artificial de la
invencion para la preparacion de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la
actividad funcional de una cornea enferma o danada como consecuencia de una disfuncion, una lesion o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una ulcera corneal, un queratocono, un queratoglobo, un descematocele, un traumatismo, una causticacion, una deficiencia lfmibica, una queratitis atrofica, una distrofia corneal, una queratopatia primaria o secundaria, una infeccion, un leucoma, una queratopatia bullosa, un insuficiencia endotelial corneal o una neoplasia benigna o maligna.
Una realizacion mas preferida de este quinto aspecto se refiere al uso del tejido artificial de la invencion para la preparacion de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una mucosa, preferentemente una mucosa oral. Una realizacion aun mas preferida se refiere al uso del tejido artificial de la invencion para la preparacion de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una mucosa oral enferma o danada como consecuencia de una disfuncion, una lesion o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una herida, una ulcera, una quemadura, una neoplasia benigna o maligna, una infeccion, una contusion, un traumatismo, una causticacion, una malformacion congenita, una perdida de sustancia o una enfermedad periodontal. En una realizacion preferida, el tejido que se utiliza para la preparacion de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una mucosa es un tejido que entre la etapa (d) y la etapa (e), se ha sometido a una etapa (d2) de adicion de una protema. En una realizacion aun mas preferida, dicha etapa se lleva a cabo anadiendo, al material obtenido en la etapa (d), una composicion que comprende colageno, tal y como se describio en detalle anteriormente.
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Un sexto aspecto de la invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende el tejido artificial de la invencion.
Una realizacion preferida de este sexto aspecto de la invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende el tejido artificial de la invencion para su uso en terapia celular somatica.
Una realizacion mas preferida de este sexto aspecto de la invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende el tejido artificial de la invencion para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de un tejido o un organo.
Una realizacion preferida de este sexto aspecto de la invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende el tejido artificial de la invencion para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de un tejido o un organo enfermo o danado como consecuencia de una enfermedad infecciosa, inflamatoria, genetica o degenerativa, un dano ffsico o qmmico o una interrupcion del flujo sangumeo.
Una realizacion mas preferida de este sexto aspecto de la invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende el tejido artificial de la invencion para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una piel. Una realizacion aun mas preferida se refiere a una composicion farmaceutica que comprende el tejido artificial de la invencion para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una piel enferma o danada como consecuencia de una disfuncion, una lesion o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una herida, una ulcera, una quemadura, una neoplasia benigna o maligna, una infeccion, una contusion, un traumatismo, una causticacion o una malformacion congenita.
Una realizacion mas preferida de este sexto aspecto de la invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende el tejido artificial de la invencion para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una vejiga. Una realizacion aun mas preferida se refiere a una composicion farmaceutica que comprende el tejido artificial de la invencion para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una vejiga enferma o danada como consecuencia de una disfuncion, una lesion o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una neoplasia benigna o maligna, una infeccion, un traumatismo, una malformacion congenita (tal como, por ejemplo, pero sin limitarse, una extrofia vesical, vejiga contrafda o extrofia de cloaca), una vejiga neurogena, incontinencia urinaria, una disfuncion vesical, una infeccion o una litiasis vesical.
Una realizacion mas preferida de este sexto aspecto de la invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende el tejido artificial de la invencion para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una uretra. Una realizacion aun mas preferida se refiere a una composicion farmaceutica que comprende el tejido artificial de la invencion para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una uretra enferma o danada como consecuencia de una disfuncion, una lesion o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una neoplasia benigna o maligna, una infeccion, un traumatismo, una malformacion congenita (tal como, por ejemplo, pero sin limitarse, hispospadias o epispadias) o una estenosis.
Una realizacion mas preferida de este sexto aspecto de la invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende el tejido artificial de la invencion para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una cornea. Una realizacion aun mas preferida se refiere a una composicion farmaceutica que comprende el tejido artificial de la invencion para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una cornea enferma o danada como consecuencia de una disfuncion, una lesion o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una ulcera corneal, un queratocono, un queratoglobo, un descematocele, un traumatismo, una causticacion, una deficiencia lfmibica, una queratitis atrofica, una distrofia corneal, una queratopatfa primaria o secundaria, una infeccion, un leucoma, una queratopatfa bullosa, un insuficiencia endotelial corneal o una neoplasia benigna o maligna.
Una realizacion mas preferida de este quinto aspecto se refiere a una composicion farmaceutica que comprende el tejido artificial de la invencion para la preparacion de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una mucosa, preferentemente una mucosa oral. Una realizacion aun mas preferida se refiere una composicion farmaceutica que comprende el tejido artificial de la invencion para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una mucosa oral enferma o danada como consecuencia de una disfuncion, una lesion o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una herida, una ulcera, una quemadura, una neoplasia benigna o maligna, una infeccion, una contusion, un traumatismo, una causticacion, una malformacion congenita, una perdida de sustancia o una enfermedad periodontal. En una forma, la composicion farmaceutica que comprende el tejido artificial de la invencion para la preparacion de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir, parcial o totalmente, la actividad funcional de una mucosa o de una mucosa oral es un tejido que, entre la etapa (d) y la etapa (e), se ha sometido a una etapa (d2) de adicion de una protema. En una forma de realizacion aun mas preferida, dicha etapa se lleva a cabo anadiendo, al material obtenido en la etapa (d), una composicion que comprende colageno, tal y como se describio en detalle anteriormente.
En una realizacion preferida de este aspecto de la invencion, la composicion farmaceutica comprende el tejido artificial de la invencion, y ademas, un vetuculo farmaceuticamente aceptable. En otra realizacion preferida de este
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aspecto de la invencion, la composicion farmaceutica comprende el tejido artificial de la invencion, y ademas, otro principio activo. En una realizacion preferida de este aspecto de la invencion, la composicion farmaceutica comprende el tejido artificial de la invencion y, ademas, junto con un veldculo farmaceuticamente aceptable, otro principio activo.
Tal y como se utilizan en el presente documento, las expresiones “principio activo”, “substancia activa”, “substancia farmaceuticamente activa” o “principio farmaceuticamente activo”, significan cualquier componente que proporcione en potencia una actividad farmacologica u otro efecto diferente en el diagnostico, cura, mitigacion, tratamiento o prevencion de una enfermedad, o que afecte a la estructura o funcion del cuerpo de un ser humano o de otros animales.
Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden utilizarse en un metodo de tratamiento de forma aislada o junto con otros compuestos farmaceuticos.
A lo largo de la descripcion y de las reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variantes, no pretenden excluir otras caractensticas tecnicas, aditivos, componentes o etapas. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caractensticas de la invencion se entenderan en parte a partir de la descripcion y en parte a partir de la practica de la invencion. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustracion, y no se pretende que sean limitativos de la presente invencion.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos espedficos que se proporcionan en este documento de patente, sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invencion. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invencion que se reivindica en el presente documento. Por tanto, los ejemplos descritos mas adelante ilustran la invencion sin limitar su campo de aplicacion
Ejemplo 1. Protocolo de preparacion de un producto de piel humana artificial
A. -Obtencion de muestras de piel humana
Se utilizan muestras de piel de espesor completo obtenidas de donantes, extrafdas con anestesia local y locorregional. Una vez obtenida la muestra de forma esteril, con la ayuda de unas tijeras se eliminara el tejido graso subcutaneo hasta dejar expuesta la capa de dermis. A continuacion, los tejidos extrafdos se introduciran inmediatamente en un medio de transporte esteril constituido por medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con antibioticos (500 U/ml de penicilina G y 500 pg/ml de estreptomicina) y antimicoticos (1,25 pg/ml de anfotericina B) para impedir una eventual contaminacion de la muestra.
B. - Generacion de cultivos primarios de fibroblastos y queratinocitos
Transcurrido el periodo de transporte, todas las muestras deben lavarse dos veces en una solucion esteril de PBS con penicilina, estreptomicina y anfotericina B (500 U/ml, 500 pg/ml y 1,25 pg/ml, respectivamente) para eliminar todos los restos de sangre, fibrina, grasa o materiales extranos que pudieran encontrarse adheridos a las muestras.
En primer lugar, para separar la dermis de la epidermis, las muestras se incuban a 37 °C en una solucion esteril con 2 mg/ml de dispasa II en PBS. De este modo, se consigue disgregar la membrana basal sobre la cual se ancla el epitelio a la dermis, por lo que tras esto, se conseguira separar mecanicamente, por un lado, el epitelio y, por el otro, la dermis.
Una vez separado, el epitelio correspondiente a la epidermis, se fragmenta con tijeras hasta obtener pequenos fragmentos para posteriormente incubarlos en una solucion de tripsina-EDTA. Con la ayuda de una pipeta empapada en tripsina-EDTA, este epitelio se transfiere a un matraz con un agitador magnetico previamente esterilizado. Al matraz con agitador se anaden 2,5 ml de tripsina-EDTA y se incuba a 37 °C durante 10 minutos para separar enzimaticamente los queratinocitos de la epidermis. Transcurrido este tiempo, la tripsina que contema los queratinocitos separados se recoge en un tubo conico de 50 ml con ayuda de una pipeta, procurando no arrastrar con ella fragmentos de epitelio. Se neutraliza con la misma cantidad de medio de cultivo complementado con suero bovino fetal al 10 % y se centrifuga durante 10 minutos a 1000 rpm. El sedimento resultante que contiene una gran cantidad de queratinocitos separados se resuspende en 2-3 ml de medio de cultivo de queratinocitos, que favorece preferentemente el crecimiento de las celulas epiteliales sobre los fibroblastos. Este medio esta compuesto por 3 partes de medio DMEM rico en glucosa y una parte de medio Ham F-12, todo ello complementado con suero bovino fetal al 10 %, antibioticos-antimicoticos (100 U/ml de penicilina G, 100 pg/ml de estreptomicina y 0,25 pg/ml de anfotericina B), 24 pg/ml de adenina y distintos factores de crecimiento: 0,4 pg/ml de hidrocortisona, 5 pg/ml de insulina, 10 ng/ml de factor de crecimiento epitelial (EGF), 1,3 ng/ml de triyodotironina y 8 ng/ml de toxina colerica.
Para llevar a cabo la digestion de la matriz extracelular de la dermis de la piel y conseguir la separacion de los fibroblastos estromales incluidos en dicha matriz, las muestras deben incubarse a 37 °C en una solucion esteril de 2
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mg/ml de colagenasa de tipo I de Clostridium hystoliticum en medio de cultivo DMEM sin suero bovino fetal durante 6 horas. Esta solucion es capaz de digerir el colageno de la dermis y liberar los fibroblastos estromales. Para la obtencion de cultivos primarios de fibroblastos, la solucion de digestion que contiene las celulas estromales digeridas, debe centrifugarse a 1 .000 rpm durante 10 minutos y el sedimento celular correspondiente a los fibroblastos se cultiva en matraces de cultivo de 15 cm2 3 4 5 de superficie. Como medio de cultivo, se utiliza DMEM enriquecido en glucosa complementado con antibioticos y antimicoticos (100 U/ml de penicilina G, 100 pg/ml de estreptomicina y 0,25 pg/ml de anfotericina B) y suero bovino fetal (SBF) al 10 %. A este medio de cultivo basico se le denomina medio de fibroblastos.
En todos los casos, las celulas se incubaran a 37 °C con dioxido de carbono al 5 % en condiciones estandar de cultivo celular. Los medios de cultivo se renuevan cada tres dfas.
C. - Subcultivo de las celulas procedentes de cultivos primarios de piel.
Una vez alcanzada la confluencia celular, los distintos cultivos celulares de fibroblastos o queratinocitos deben lavarse con PBS esteril e incubarse en 1-3 ml de una solucion de tripsina 0,5 g/l y EDTA 0,2 g/l a 37 °C durante 10 minutos. Asf se consigue disgregar los mecanismos de adhesion celular y obtener celulas separadas y no adheridas a la superficie del matraz de cultivo de queratinocitos y dermis.
Para el caso de la dermis, una vez que las celulas se desprenden de la superficie de los matraces de cultivo, se procede a inactivar la tripsina utilizada mediante la adicion de 10 ml de medio de cultivo de fibroblastos. La presencia de abundantes protemas sericas puede inactivar la accion proteolftica de la tripsina. En los queratinocitos, se utiliza el medio de cultivo de queratinocitos.
Posteriormente, las soluciones de queratinocitos y de fibroblastos en las que se encuentran las celulas desprendidas, se centrifugan a 1000 rpm durante 10 minutos para obtener un sedimento o agrupacion celular con las celulas de interes, desechandose el sobrenadante con la tripsina. El sedimento celular se resuspende cuidadosamente en 5 ml de medio de cultivo y estas celulas se cultivan en matraces de cultivo de 15, 25 o 75 cm2 de superficie.
Habitualmente, los cultivos de queratinocitos se expanden hasta aproximadamente cinco veces en nuevos matraces de cultivo.
En todos los casos, y para garantizar una adecuada viabilidad celular, la preparacion de sustitutos de piel se llevo a cabo utilizando celulas correspondientes a los cuatro primeros subcultivos.
D. - Construccion de productos de piel humana artificial basados en fibrina y agarosa mediante ingeniena tisular.
1- Generacion de sustitutos de la dermis con fibroblastos inmersos en su interior utilizando matrices extracelulares de fibrina y agarosa. Estos sustitutos dermicos se generaran directamente sobre insertos porosos de 0,4 pm de diametro para permitir el paso de nutrientes pero no de las propias celulas. Para preparar 10 ml de sustituto dermico se procedera del siguiente modo:
- obtencion de 7,6 ml de plasma sangumeo humano procedente de donaciones (posiblemente de origen autologo).
- adicion de 150.000 fibroblastos de piel humana previamente cultivados y resuspendidos en 750 pl de medio de cultivo DMEM.
- adicion de 150 pl de acido tranexamico para impedir la fibrinolisis del gel de fibrina.
- adicion de 1 ml de ClCa2 al 1 % para inducir la reaccion de coagulacion y generar una red de fibras de fibrina.
- adicion rapida de 0,5 ml de agarosa de tipo VII al 2 % disuelta en PBS y calentada hasta alcanzar el punto de fusion y mezclado suave con agitacion. La concentracion final de agarosa en la mezcla sera del 0,1 %. El intervalo de concentraciones de agarosa que permite obtener productos dermicos viables vana entre 0,025 % y 0,3 % y debera establecerse en relacion con el paciente objeto de su utilizacion.
- dividir en alfcuotas, lo antes posible, en los insertos porosos de cultivo celular.
- dejar polimerizar en reposo durante al menos 30 min.
2. - Desarrollo de una capa de epitelio (epidermis) en la superficie del sustituto dermico mediante subcultivo de queratinocitos sobre el sustituto dermico. Cubrir con medio de cultivo espedfico para queratinocitos.
3. - Mantener en una incubadora a 37 °C con CO2 al 5 % en ambiente humedo siguiendo protocolos estandar de cultivo celular. Los medios de cultivo se renuevan cada 3 dfas hasta que las celulas epiteliales alcanzan la confluencia en la superficie del sustituto dermico (alrededor de una semana).
4. - Exponer la superficie epitelial al aire (tecnica de aire y lfquido) manteniendo el sustituto dermico sumergido en medio de cultivo para promover la estratificacion y la maduracion de la epidermis (alrededor de una semana).
5. - Extraer el producto de piel humana artificial de la superficie de cultivo y proceder a su deshidratacion parcial depositandolo sobre un papel de filtro esteril de 3-5 mm de espesor colocado sobre una superficie plana de vidrio esteril. Colocar un fragmento de tul o tela porosa de nylon esterilizada con alcohol al 70 % sobre la superficie del sustituto de piel para impedir que la capa epitelial del sustituto de piel se adhiera al papel de filtro. Tras ello, colocar
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un segundo papel de filtro esteril de 3-5 mm de espesor sobre el sustituto de piel cubierto con tela. Depositar un fragmento plano de vidrio esteril en su superficie y colocar un objeto de aproximadamente 250 g de peso sobre este (Figura 1). Todo el proceso ha de realizarse en una campana de flujo laminar a temperatura ambiente durante 10 minutos. El objetivo de este proceso es reducir significativamente los niveles de hidratacion del producto para alcanzar niveles optimos de consistencia y elasticidad.
Evaluacion del producto artificial de piel humana (Figura 2):
1) Analisis microscopico del producto de piel artificial humana (control de calidad histologico).
La evaluacion del producto de piel artificial revelo que su estructura presentaba numerosas similitudes con la piel humana normal natural, aunque el tiempo de desarrollo en cultivo inflrna directamente sobre la estructura de estos productos artificiales. En concreto, el analisis de muestras mantenidas en cultivo durante cuatro semanas, revelo lo siguiente:
Evaluacion in vitro (Figura 2A):
• Los productos de piel evaluados a la semana de su preparacion presentaron una gruesa capa estromal en la que existe una abundante poblacion de fibroblastos en proliferacion. Sobre la superficie de este sustituto estromal, se aprecio una unica capa de celulas epiteliales.
• En la segunda semana de desarrollo en cultivo, se observo un mayor numero de celulas en el estroma, asf como una estratificacion inicial del epitelio, formandose una o dos hileras de queratinocitos en su superficie.
• A partir de este momento, continua la proliferacion de queratinocitos, observandose en la tercera semana una nueva hilera de celulas en el epitelio.
• En la cuarta semana habfa un total de 3 a 4 hileras de celulas, pero no fue posible distinguir los distintos estratos del epitelio. No se apreciaron papilas, anejos cutaneos o estrato corneo.
Evaluacion in vivo (Figura 2B): Al contrario de lo que se observo en los productos de piel artificial mantenidos en cultivo, la piel artificial implantada en un modelo animal presento niveles de estructuracion y diferenciacion tisular muy adecuados, tal como se describe a continuacion.
• El dfa diez, tras haber realizado la implantacion del producto en el raton, se pudo observar la presencia de una dermis muy rica en celulas y con algunas fibras y material extracelular desorganizado. Destaca la presencia de infiltrados leucocitarios en la dermis, asf como la neoformacion de un tejido vascular importante que comprende arteriolas, venulas y capilares. A nivel epitelial, se observan entre tres y cinco capas celulares, no apreciandose de forma clara los estratos espinoso y granuloso, aunque sf el basal y un estrato corneo incipiente. De igual modo, se observa una lmea dermoepidermica homogenea, aunque sin la presencia de papilas ni anejos cutaneos.
• Despues de veinte dfas del implante en los animales atfmicos, se aprecio una disminucion en la concentracion de fibroblastos y leucocitos de la dermis, asf como un aumento significativo del contenido fibrilar en la dermis. De igual modo, se observo la existencia de entre cuatro y seis capas de queratinocitos epidermicos, distinguiendose en este momento cuatro estratos diferenciados: basal, espinoso, granuloso y corneo, siendo el estrato espinoso el menos evidente de los cuatro. Al igual que a los diez dfas de evolucion, se aprecia una lmea dermoepidermica homogenea, aunque sin la presencia de papilas ni anejos cutaneos.
• En la muestra del dfa treinta se observo un mayor contenido fibrilar en la dermis que en dfas anteriores, apreciandose ya gran cantidad de estratos en el epitelio, existiendo entre seis y nueve capas de queratinocitos, con una clara diferenciacion de estratos epiteliales (basal, espinoso, granuloso y corneo). Tampoco se apreciaron papilas ni anejos cutaneos.
• El dfa cuarenta de evolucion in vivo, se observo un mayor contenido en fibras en el estrato dermico, estabilizandose el numero de capas de queratinocitos del epitelio (entre seis y nueve). No se evidenciaron papilas en union dermoepidermica ni anejos cutaneos.
2) Analisis inmunohistoqmmico del producto de piel artificial humana (Figura 2C).
El analisis de la expresion de citoqueratinas (pancitoqueratina, citoqueratina 1 y citoqueratina 10), filagrina e involucrina de los controles de piel humana normal y los productos de piel obtenidos en el laboratorio, permitio determinar un patron de expresion espedfico de estas protemas para cada tipo de muestra, demostrandose que la piel humana artificial es capaz de expresar las mismas protemas de superficie que la piel humana normal.
Ejemplo 2. Preparacion de un producto de piel humana artificial utilizando celulas madre de gelatina de Wharton
A.-Obtencion de muestras de piel y de cordon umbilical humano.
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Se utilizan muestras de piel de espesor completo obtenidas de donantes, ex^das con anestesia local y locorregional. Una vez obtenida la muestra de forma esteril, con la ayuda de unas tijeras se eliminara el tejido graso subcutaneo hasta dejar expuesta la capa de dermis. A continuacion, los tejidos extrafdos se introduciran inmediatamente en un medio de transporte esteril constituido por medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con antibioticos (500 U/ml de penicilina G y 500 pg/ml de estreptomicina) y antimicoticos (1,25 pg/ml de anfotericina B) para impedir una eventual contaminacion de la muestra.
Los cordones umbilicales utilizados se obtienen de partos por cesarea de mujeres gestantes a termino. Despues de cada parto, se obtiene un fragmento de 10-15 cm del cordon umbilical que se lleva inmediatamente al laboratorio en un medio de transporte similar al que se utiliza para la piel.
B. - Generacion de cultivos primarios de fibroblastos y de celulas madre de gelatina de Wharton.
Transcurrido el periodo de transporte, todas las muestras deberan lavarse dos veces en una solucion esteril de PBS con penicilina, estreptomicina y anfotericina B (500 U/ml, 500 pg/ml y 1,25 pg/ml, respectivamente) para eliminar todos los restos de sangre, fibrina, grasa o materiales extranos que pudieran encontrarse adheridos a las muestras. Posteriormente, se procesa cada tipo de muestra de forma independiente:
- En el caso de la piel, primero se separa la dermis de la epidermis incubando las muestras a 37 °C en una solucion esteril con 2 mg/ml de dispasa II en PBS. De este modo, se consigue disgregar la membrana basal sobre la cual se ancla el epitelio a la dermis, por lo que tras esto se conseguira separar mecanicamente por un lado el epitelio y por otro la dermis.
Para llevar a cabo la digestion de la matriz extracelular de la dermis de la piel y conseguir la separacion de los fibroblastos estromales incluidos en dicha matriz, las muestras deben incubarse durante 6 horas a 37 °C en una solucion esteril de 2 mg/ml de colagenasa de tipo I de Clostridium hystoliticum en medio de cultivo DMEM sin suero bovino fetal. Esta solucion es capaz de digerir el colageno de la dermis y liberar los fibroblastos estromales. Para la obtencion de cultivos primarios de fibroblastos, se debe centrifugar a 1 .000 rpm durante 10 minutos la solucion de digestion que contiene las celulas estromales disgregadas de la dermis y el sedimento celular correspondiente a los fibroblastos se cultiva en matraces de cultivo de 15 cm2 de superficie. Como medio de cultivo, se utiliza DMEM enriquecido en glucosa complementado con antibioticos y antimicoticos (100 U/ml de penicilina G, 100 pg/ml de estreptomicina y 0,25 pg/ml de anfotericina B) y suero bovino fetal (SBF) al 10 %. A este medio de cultivo basico se le denomina medio de fibroblastos.
- En el caso del cordon umbilical, las muestras se seccionan longitudinalmente a traves de la vena umbilical. Se retiraran cuidadosamente las arterias y la vena umbilical para separar la gelatina de Wharton. Posteriormente, se fragmenta la gelatina hasta convertirla en fragmentos de tejido muy pequenos. Estos fragmentos de gelatina de Wharton se incuban en 30 ml de colagenasa de tipo I (Gibco BRL Life Technologies, Karlsruhe, Alemania) a 37 °C con agitacion durante aproximadamente 4-6 horas, para posteriormente recoger las celulas disociadas mediante centrifugacion durante 7 min a 1050 revoluciones por minuto (rpm). A continuacion, se elimina cuidadosamente el sobrenadante y el sedimento celular se resuspende en 5-10 ml de tripsina previamente diluida (Sigma-Aldrich). De nuevo, se incuba a 37 °C en un bano con agitacion durante 30 minutos. Despues, se neutralizaron los efectos de la tripsina anadiendo 10-20 ml de medio de cultivo complementado con suero bovino fetal al 10 %, centrifugandose de nuevo a 1000 rpm durante 10 minutos para obtener las celulas aisladas. Finalmente, estas celulas se resuspenden en medio de cultivo Amniomax en un matraz de cultivo de 25 cm2.
En todos los casos, las celulas se incubaran a 37 °C con dioxido de carbono al 5 % en condiciones de cultivo celular estandar. Los medios de cultivo se renuevan cada tres dfas.
C. - Subcultivo de celulas procedentes de cultivos primarios de piel y de celulas madre de gelatina de Wharton.
Una vez alcanzada la confluencia celular, los distintos cultivos de fibroblastos o de celulas madre de gelatina de Wharton se deben lavar con PBS esteril e incubar en 1-3 ml de una solucion de tripsina 0,5 g/l y EDTA 0,2 g/l a 37 °C durante 10 minutos.
Asf se consigue disgregar los mecanismos de adhesion celular y obtener celulas individualizadas y no adheridas a la superficie del matraz de cultivo.
Una vez que las celulas se desprenden de la superficie de los matraces de cultivo, se procede a inactivar la tripsina utilizada anadiendo 10 ml de medio de cultivo de fibroblastos. La presencia de abundantes protemas sericas es capaz de inactivar la accion proteolttica de la tripsina.
Posteriormente, las soluciones en las que se encuentran las celulas desprendidas, se centrifugan a 1000 rpm durante 10 minutos para obtener un sedimento o agrupacion celular con las celulas de interes, desechandose el sobrenadante con la tripsina. El sedimento celular se resuspende cuidadosamente en 5 ml de medio de cultivo y estas celulas se cultivan en matraces de cultivo de 15, 25 o 75 cm2 de superficie.
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Habitualmente, los cultivos de queratinocitos se expanden hasta aproximadamente cinco veces en nuevos matraces de cultivo.
D.- Construccion de piel humana artificial basada en fibrina y agarosa mediante ingeniena tisular.
1- Generacion de sustitutos de dermis con fibroblastos inmersos en su interior utilizando matrices extracelulares de fibrina y agarosa. Estos sustitutos dermicos se generaran directamente sobre insertos porosos de 0,4 pm de diametro para permitir el paso de nutrientes pero no el de las propias celulas. Para preparar 10 ml de sustituto dermico se procedera del siguiente modo:
- obtencion de 7,6 ml de plasma sangumeo humano procedente de donaciones (posiblemente de origen autologo).
- adicion de 150.000 fibroblastos de piel humana previamente cultivados y resuspendidos en 750 pl de medio de cultivo DMEM.
- adicion de 150 pl de acido tranexamico para impedir la fibrinolisis del gel de fibrina.
- adicion de 1 ml de ClCa2 al 1 % para inducir la reaccion de coagulacion y generar una red de fibras de fibrina.
- adicion rapida de 0,5 ml de agarosa de tipo VII al 2 % disuelta en PBS y calentada hasta alcanzar el punto de fusion y mezclado suave con agitacion. La concentracion final de agarosa en la mezcla sera del 0,1 %. El intervalo de concentraciones de agarosa que permite obtener productos dermicos viables vana entre 0,025 % y 0,3 % y debera establecerse en relacion con el paciente objeto de su utilizacion.
- dividir en alfcuotas, lo antes posible, en los insertos porosos de cultivo celular.
- dejar polimerizar en reposo durante al menos 30 min.
2. Desarrollo de una capa de epitelio en la superficie del sustituto dermico mediante subcultivo de celulas madre de gelatina de Wharton sobre el sustituto dermico. Cubrir con medio de cultivo espedfico para queratinocitos. Este medio esta compuesto por 3 partes de medio DMEM rico en glucosa y una parte de medio Ham F-1 2, todo ello complementado con suero bovino fetal al 10 %, antibioticos-antimicoticos (100 U/ml de penicilina G, 100 pg/ml de estreptomicina y 0,25 pg/ml de anfotericina B), 24 pg/ml de adenina y distintos factores de crecimiento: 0,4 pg/ml de hidrocortisona, 5 pg/ml de insulina, 10 ng/ml de factor de crecimiento epitelial (EGF), 1,3 ng/ml de triyodotironina y 8 ng/ml de toxina colerica.
3. - Mantener en una incubadora a 37 °C con CO2 al 5 % en ambiente humedo siguiendo protocolos estandar de cultivo celular. Los medios de cultivo se renuevan cada 3 dfas hasta que las celulas epiteliales alcanzan la confluencia en la superficie del sustituto dermico (alrededor de una semana).
4. - Exponer la superficie epitelial al aire (tecnica de aire y lfquido) manteniendo el sustituto dermico sumergido en medio de cultivo para promover la estratificacion y la maduracion de la epidermis (alrededor de una semana).
5. - Extraer el producto de piel humana artificial de la superficie de cultivo y proceder a su deshidratacion parcial depositandolo sobre un papel de filtro esteril de 3-5 mm de espesor colocado sobre una superficie plana de vidrio esteril. Colocar un fragmento de tul o tela porosa de nylon esterilizada con alcohol al 70 % sobre la superficie del sustituto de piel para impedir que la capa epitelial del sustituto de piel se adhiera al papel de filtro. Tras ello, colocar un segundo papel de filtro esteril de 3-5 mm de espesor sobre el sustituto de piel cubierto con tela. Depositar un fragmento plano de vidrio esteril en su superficie y colocar un objeto de aproximadamente 250 g de peso sobre este (Figura 1). Todo el proceso ha de realizarse en una campana de flujo laminar a temperatura ambiente durante 10 minutos. El objetivo de este proceso es reducir significativamente los niveles de hidratacion del producto para alcanzar niveles optimos de consistencia y elasticidad.
Evaluacion del producto de piel humana artificial con celulas de gelatina de Wharton (Figura 3):
1) Determinacion de la viabilidad de celulas madre de gelatina de Wharton (control de calidad microanalttico) (Figura 3A).
La determinacion de la viabilidad celular mediante las tecnicas de microanalisis de energfa dispersiva de rayos X permite determinar el perfil de concentracion intracelular de iones de Na, Mg, P, Cl, K, S y Ca, y por tanto conocer el subcultivo mas adecuado para su utilizacion posterior en la construccion de tejidos artificiales. Para ello es necesario realizar la siguiente metodologfa.
a) Cultivo de las celulas sobre rejillas de oro previamente recubiertas con una capa de resina (pioloform). Una vez alcanzada la subconfluencia de las celulas, las rejillas se lavan con agua destilada a 4 °C durante 10 segundos para eliminar el medio de cultivo.
b) Criofijacion de las celulas en nitrogeno lfquido.
c) Desecacion de las muestras criofijadas mediante la tecnica de liofilizacion al vado a baja temperatura (-100 °C) durante 20 horas. La criofijacion se realiza en un liofilizador Polaron E5300.
d) Montaje de las muestras criofijadas y desecadas en portamuestras espedficos.
e) Recubrimiento de las celulas con carbon en un pulverizador Polaron E-5000.
f) Observacion con un Microscopio Electronico de Barrido Philips XL-30 equipado con un detector de energfa
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dispersiva de rayos X (EDAX), y un detector de electrones retrodispersados.
g) Analisis microanalttico cualitativo utilizando las siguientes constantes: voltaje 10 Kv, aumento 10.000 x, angulo de superficie 0°, angulo de percepcion .35°, 500 cps, tiempo de acumulacion de cuentas: 200 segundos. De este modo, se obtienen los espectros cualitativos de cada celula estudiada. En dichos espectros se seleccionan los niveles de Na, Mg, P, Cl, K, Ca en sus orbitales K, contabilizandose las cuentas por segundo (CPS), el fondo (BKGD, background) o radiaciones no caractensticas y el mdice de pico/fondo (P/B).
h) Analisis microanalftico cuantitativo. En primer lugar, se cuantifican las concentraciones de los elementos Na, Mg, P, Cl, S, K, y Ca en mmol/Kg de peso seco mediante una modificacion del metodo de Hall (Hall et al., 1973; Staham y Pawley, 1978). Para ello, se utilizan sales estandares de Na, Mg, P, Cl, K, S y Ca disueltas en dextrano al 20 % (300.000 Dalton), obteniendose una curva o recta patron. Estas sales se tratan del mismo modo que los espedmenes a analizar. Finalmente, se calculan las concentraciones de cada uno de los elementos analizados utilizando el metodo de la regresion lineal a partir de las curvas patron.
Los resultados obtenidos tras la cuantificacion de los niveles ionicos en las celulas madre de la gelatina de Wharton, ponen claramente de manifiesto que los niveles mas elevados del mdice K/Na corresponden a los subcultivos cuarto y quinto y por tanto, estos se consideran los mas idoneos para su utilizacion en la fabricacion de piel humana mediante ingeniena tisular.
2) Analisis microscopico de los productos de piel artificial humana (control de calidad histologico) (Figura 3B).
La evaluacion de los productos de piel artificial humana con celulas de gelatina de Wharton revelo que la estructura de estos presentaba numerosas similitudes con la piel humana normal natural, aunque el tiempo de desarrollo en cultivo inflma directamente sobre la estructura de estos tejidos artificiales. En concreto, el analisis de muestras mantenidas en cultivo durante cuatro semanas revelo la formacion progresiva de hasta 5 capas de epitelio en la superficie de la construccion, aunque las uniones intercelulares no se formaron hasta las ultimas fases. Posteriormente, la evaluacion in vivo de los productos de piel humana generada con celulas madre de gelatina de Wharton, mostro el desarrollo de una gruesa capa de epitelio sobre el estroma artificial, formandose numerosas uniones intercelulares de tipo desmosoma y una membrana basal bien constituida. Todo ello dio como resultado un producto de piel artificial indistinguible de la piel humana normal natural, demostrando la utilidad del producto generado.
3) Analisis inmunohistoqmmico del producto de piel artificial humana (Figura 3C).
El analisis de la expresion de citoqueratinas (pancitoqueratina, citoqueratina 1 y citoqueratina 10), filagrina e involucrina de los controles de piel humana normal y los productos de piel obtenidos en el laboratorio a partir de celulas madre de gelatina de Wharton, permitio determinar un patron de expresion espedfico de estas protemas para cada tipo de muestra, demostrandose que los productos de piel humana artificial son capaces de expresar las mismas protemas de superficie que la piel humana normal.
Ejemplo 3. Preparacion de corneas artificiales.
Protocolo de preparacion de corneas artificiales:
El protocolo descrito a continuacion es semejante en el producto corneal humano y animal, a excepcion de la incorporacion del estrato endotelial en el producto corneal animal.
A. Generacion de cultivos primarios de celulas de la cornea. Para establecer cultivos primarios de epitelio corneal, queratocitos estromales y endotelio corneal, si procede, se utilizaron los siguientes metodos y protocolos:
- Obtencion de una biopsia del limbo esclerocorneal con anestesia local o general y transporte al laboratorio en suero fisiologico esteril.
- Tallado quirurgico de la cornea para eliminar restos de iris, conjuntiva y coagulos sangumeos.
- En el producto corneal animal, diseccion quirurgica de la membrana de Descemet para aislar las celulas epiteliales, las cuales se cultivan en medio para celulas endoteliales. La composicion de este medio es la siguiente: 3 partes de medio DMEM y una parte de medio Ham F-12, todo ello complementado con suero bovino fetal al 10 %, antibioticos-antimicoticos, 24 pg/ml de adenina y distintos factores de crecimiento: 0,4 pg/ml de hidrocortisona, 5 |jg/ml de insulina, 1,3 ng/ml de triyodotironina y 8 ng/ml de toxina colerica.
- Diseccion de 2 mm de cornea central e incubacion en colagenasa I al 2 % durante 6 h a 37°C. Centrifugacion a 1000 rpm durante 10 min para recoger las celulas madre adultas del estroma corneal (queratocitos), las cuales se cultivaran en medio DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) con suero bovino fetal al 10 % y antibioticos.
- Fragmentacion del limbo esclerocorneal en pequenos explantes de alrededor de 1 mm y cultivo de estos explantes directamente sobre la superficie de matraces de cultivo para la obtencion de cultivos primarios de celulas epiteliales corneales. El medio de cultivo a utilizar (medio de celulas epiteliales) esta compuesto por 3 partes de medio DMEM y una parte de medio Ham F-12, todo ello complementado con suero bovino fetal al 10 %,, antibioticos-antimicoticos, 24 pg/ml de adenina y distintos factores de crecimiento: 0,4 pg/ml de hidrocortisona, 5
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pg/ml de insulina, 1,3 ng/ml de triyodotironina, 8 ng/ml de toxina colerica y 10 ng/ml de factor de crecimiento epitelial (EGF).
Todos los cultivos se mantienen en una incubadora a 37 °C con CO2 al 5 % en un ambiente humedo siguiendo protocolos estandar de cultivo celular. Los medios de cultivo se renuevan cada 3 dfas hasta que las celulas alcanzan la confluencia en cultivo.
B. Construccion en laboratorio de productos corneales mediante ingeniena tisular.
1 - Subcultivo de las celulas endoteliales previamente aisladas, utilizando para ello insertos porosos de 0,4 pm de diametro para permitir el paso de nutrientes pero no de las propias celulas. Las celulas seleccionadas deben pertenecer al cuarto subcultivo (maxima viabilidad de las celulas endoteliales). Esta primera etapa solo se realizara para la generacion del producto corneal animal trilaminar.
2- Generacion de sustitutos del estroma corneal con queratocitos inmersos en su interior utilizando matrices extracelulares de fibrina y agarosa sobre los insertos porosos de 0,4 pm de diametro (esta sera la primera etapa en el caso del producto corneal humano bilaminar). Para preparar 10 ml de sustituto estromal:
- obtencion de 7,6 ml de plasma sangumeo humano procedente de donaciones (posiblemente de origen
autologo).
- adicion de 150.000 fibroblastos de piel humana previamente cultivados y resuspendidos en 750 pl de medio de cultivo DMEM.
- adicion de 150 pl de acido tranexamico para impedir la fibrinolisis del gel de fibrina.
- adicion de 1 ml de ClCa2 al 1 % para inducir la reaccion de coagulacion y generar una red de fibras de fibrina.
- adicion rapida de 0,5 ml de agarosa de tipo VII al 2 % disuelta en PBS y calentada hasta alcanzar el punto de fusion y mezclado suave con agitacion. La concentracion final de agarosa en la mezcla sera del 0,1 %. El intervalo de concentraciones de agarosa que permite obtener productos dermicos viables vana entre 0,025 % y 0,3 % y debera establecerse en relacion con el paciente objeto de su utilizacion.
- dividir en alfcuotas, lo antes posible, en los insertos porosos de cultivo celular.
- dejar polimerizar en reposo durante al menos 30 min.
3. - Desarrollo de una capa de epitelio corneal en la superficie del sustituto del estroma corneal mediante subcultivo de las celulas epiteliales corneales sobre el sustituto estromal. Cubrir con medio de cultivo espedfico para celulas epiteliales.
4. Mantener en una incubadora a 37 °C con CO2 al 5% en ambiente humedo siguiendo protocolos estandar de cultivo celular. Los medios de cultivo se renuevan cada 3 dfas hasta que las celulas epiteliales alcanzan la confluencia en la superficie del sustituto estromal (alrededor de una semana).
5. Exponer la superficie epitelial al aire (tecnica de aire y lfquido) manteniendo el sustituto estromal sumergido en medio de cultivo para promover la estratificacion y la maduracion del epitelio corneal (alrededor de una semana).
6. Extraer el producto de piel humana artificial de la superficie de cultivo y proceder a su deshidratacion parcial depositandolo sobre un papel de filtro esteril de 3-5 mm de espesor colocado sobre una superficie plana de vidrio esteril. Colocar un fragmento de tul o tela porosa de nylon esterilizada con alcohol al 70 % sobre la superficie del sustituto de piel para impedir que la capa epitelial del sustituto de piel se adhiera al papel de filtro. Tras ello, colocar un segundo papel de filtro esteril de 3-5 mm de espesor sobre el sustituto de piel cubierto con tela. Depositar un fragmento plano de vidrio esteril en su superficie y colocar un objeto de aproximadamente 250 g de peso sobre este (Figura 1). Todo el proceso ha de realizarse en una campana de flujo laminar a temperatura ambiente durante 10 minutos. El objetivo de este proceso es reducir significativamente los niveles de hidratacion del producto para alcanzar niveles optimos de consistencia y elasticidad.
Evaluacion de los productos corneales (Figura 4):
1) Analisis microscopico e inmunohistoqmmico de los productos corneales (control de calidad histologico) (Figura 4A).
El analisis microscopico revelo que los productos corneales generados mediante ingeniena tisular eran estructuralmente similares a las corneas naturales utilizadas como control. En concreto, se pudo apreciar un epitelio corneal bien formado, con abundantes uniones intercelulares y un estroma compuesto por numerosas fibras de fibrina entre las que se dispoman los queratocitos. Todo ello sugiere que los productos corneales artificiales bi o trilaminares construidos basandose en el protocolo descrito anteriormente, son compatibles con corneas humanas y animales ortotfpicas.
En lo que respecta a la estructura del epitelio de los productos corneales, es de destacar el hecho de que todas las celulas del epitelio expresaron elevados niveles de citoqueratinas tfpicas y exclusivas del epitelio corneal (CK3 y CK1 2), lo cual sugiere que estas celulas podnan ser funcionales in vitro. Del mismo modo, el analisis de protemas relacionadas con uniones intercelulares revelo la expresion secuencial de diversos componentes de los desmosomas (placoglobina, desmoglema 3 y desmoplaquina), las uniones estrechas (ZO-1 y ZO-2) y las uniones
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comunicantes gap (conexina 37) a nivel epitelial, siendo todo ello similar a la cornea normal natural.
2) Control de calidad reologico (Figura 4B).
El analisis de las propiedades mecanicas de los productos corneales artificiales bi o trilaminares construidos basandose en el protocolo descrito anteriormente mostro un comportamiento viscoelastico de dichos tejidos, con un modulo de elasticidad creciente en las corneas con mayor contenido en agarosa y un punto de fractura significativamente menor cuando la agarosa se utilizo a menores concentraciones. Los analisis de viscosimetna y punto de fractura revelaron que las caractensticas ffsicas de los productos de fibrina y agarosa eran superiores a aquellos que solo conteman fibrina o colageno. Todo ello sugiere que las propiedades ffsicas de las corneas de fibrina y agarosa son optimas y, en parte, similares a las de las corneas humanas normales utilizadas como control.
3) Control de calidad optico (Figura 4C).
Las propiedades opticas de los productos corneales artificiales fueron adecuadas para un tejido que ha de cumplir las funciones de la cornea humana o animal. En concreto, los analisis de transmitancia espectral mostraron que los productos corneales tendfan a mostrar niveles muy adecuados de transparencia, comparables a los de la cornea humana normal, con niveles de dispersion muy similares. Ademas, los coeficientes de absorcion, dispersion y extincion de los productos de fibrina y agarosa fueron superiores a los obtenidos con los tejidos de fibrina. Sin embargo, la absorbancia para longitudes de onda pequenas (intervalo de ultravioleta) fue menor en los productos corneales artificiales bi o trilaminares que en los controles, lo cual sugiere la necesidad de utilizar filtros de luz ultravioleta en este tipo de productos. En suma, la translucidez de los productos corneales fue aceptable, especialmente en aquellos productos cuyo espesor no superaba los 0,7 mm.
4) Control de calidad genetico (Figuras 4C y 4D).
Para el analisis de expresion genica se extrajo el ARN total de los cultivos corneales primarios de celulas epiteliales y queratocitos estromales humanos y de los productos corneales artificiales bilaminares humanos, analizandose este mediante micromatriz (Affymetrix Human Genome U133 plus 2.0®). Este analisis demostro que los genes que se expresaban en los productos corneales artificiales humanos eran compatibles con una funcion corneal normal, aunque numerosos genes relacionados con el desarrollo tisular estaban sobreexpresados en relacion con la cornea normal. En concreto, los productos corneales artificiales expresaron un gran numero de genes cuya funcion se centraba en el establecimiento de uniones intercelulares (conexinas, integrinas, desmoplaquina, placoglobina, etc.), desarrollo epitelial (Sema3A, RUNX2, TBX1), diferenciacion celular (PLXNA4A, FLG, DKK4, DCN), membrana basal (lamininas, colageno IV), matriz extracelular (colagenos, decorina, biglican, MMP, fibronectina), etc. Estos resultados sugieren que los productos corneales construidos podnan estar experimentando un proceso de desarrollo similar al que ocurre en la cornea normal y que las funciones genicas expresadas por estos productos son compatibles con la normalidad.
4) Evaluacion in vivo (Figura 4E).
Para evaluar el comportamiento clmico de los productos corneales artificiales, se procedio al implante de 6 corneas humanas bilaminares de espesor parcial en conejos de laboratorio y a su seguimiento evolutivo durante 6 meses. Los resultados de este ensayo muestran niveles de biocompatibilidad adecuados, con total ausencia de inflamacion o infeccion, manteniendo buenos niveles de transparencia. Todo esto sugiere que los productos corneales generados mediante ingeniena tisular podnan presentar posible utilidad desde un punto de vista clmico y farmacologico experimental.
Ejemplo 4. Preparacion de un producto de uretra humana artificial.
Protocolo de preparacion de un producto de uretra humana artificial:
A. -Obtencion de muestras de uretra humana.
Para la generacion de uretras artificiales, se utilizan pequenas biopsias de uretra humana normal obtenidas mediante endoscopia de pacientes o donantes normales. Una vez obtenida la muestra de forma esteril, los tejidos extrafdos se introduciran inmediatamente en un medio de transporte esteril constituido por medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con antibioticos (500 U/ml de penicilina G y 500 pg/ml de estreptomicina) y antimicoticos (1,25 pg/ml de anfotericina B) para impedir una eventual contaminacion de la muestra.
Como alternativa, en los casos en los que no es factible la toma de muestras de uretra humana, se pueden utilizar muestras de mucosa oral o de piel para la generacion de sustitutos de la uretra.
B. - Generacion de cultivos primarios de celulas estromales y epiteliales.
Transcurrido el periodo de transporte, todas las muestras deberan lavarse dos veces en una solucion esteril de PBS
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con penicilina, estreptomicina y anfotericina B (500 U/ml, 500 |jg/ml y 1,25 jg/ml, respectivamente) para eliminar todos los restos de sangre, fibrina, grasa o materiales extranos que pudieran encontrarse adheridos a las muestras.
En primer lugar, para separar el estroma del epitelio, las muestras se incuban a 37 °C en una solucion esteril con tripsina 0,5 g/l y EDTA 0,2 g/l en PBS, recogiendose el sobrenadante con las celulas tras 30 minutos mediante centrifugacion. Este proceso se repite hasta 5 veces anadiendo nueva solucion de tripsina-EDTA cada vez. De este modo, se consigue una cantidad apreciable de celulas epiteliales de la uretra, las cuales se cultivan en medio de cultivo de celulas epiteliales, el cual favorece preferentemente el crecimiento de las celulas epiteliales sobre los fibroblastos. Este medio esta compuesto por 3 partes de medio DMEM rico en glucosa y una parte de medio Ham F- 12, todo ello complementado con suero bovino fetal al 10 %, antibioticos-antimicoticos (100 U/ml de penicilina G, 100 jg/ml de estreptomicina y 0,25 jg/ml de anfotericina B), 24 jg/ml de adenina y distintos factores de crecimiento: 0,4 jg/ml de hidrocortisona, 5 jg/ml de insulina, 10 ng/ml de factor de crecimiento epitelial (EGF), 1,3 ng/ml de triyodotironina y 8 ng/ml de toxina colerica.
Para llevar a cabo la digestion de la matriz extracelular del estroma uretral y conseguir la separacion de los fibroblastos estromales incluidos en dicha matriz, las muestras deben incubarse durante 6 horas a 37 °C en una solucion esteril de 2 mg/ml de colagenasa de tipo I de Clostridium hystoliticum en medio de cultivo DMEM sin suero bovino fetal. Esta solucion es capaz de digerir el colageno de la dermis y liberar los fibroblastos estromales. Para la obtencion de cultivos primarios de fibroblastos, se debe centrifugar a 1 .000 rpm durante 10 minutos la solucion de digestion que contiene las celulas estromales disgregadas de la dermis y el sedimento celular correspondiente a los fibroblastos se cultiva en matraces de cultivo de 15 cm2 de superficie. Como medio de cultivo, se utiliza DMEM enriquecido en glucosa complementado con antibioticos y antimicoticos (100 U/ml de penicilina G, 100 jg/ml de estreptomicina y 0,25 jg/ml de anfotericina B) y suero bovino fetal (SBF) al 10 %. A este medio de cultivo basico se le denomina medio de fibroblastos
En todos los casos, las celulas se incubaran a 37 °C con dioxido de carbono al 5 %, en condiciones estandar de cultivo celular. Los medios de cultivo se renuevan cada tres dfas.
C.- Construccion de productos de uretra humana artificial basados en fibrina y agarosa mediante ingeniena tisular.
1. - Generacion de sustitutos estromales con fibroblastos inmersos en su interior utilizando matrices extracelulares de fibrina y agarosa. Estos sustitutos estromales se generaran directamente sobre placas de Petri para cultivo celular. Para preparar 10 ml de sustituto estromal se procedera del siguiente modo:
- obtencion de 7,6 ml de plasma sangumeo humano procedente de donaciones (posiblemente de origen autologo).
- adicion de 150.000 fibroblastos de piel humana previamente cultivados y resuspendidos en 750 jl de medio de cultivo DMEM.
-adicion de 150 jl de acido tranexamico para impedir la fibrinolisis del gel de fibrina.
-adicion de 1 ml de ClCa2 al 1 % para inducir la reaccion de coagulacion y generar una red de fibras de fibrina.
- adicion rapida de 0,5 ml de agarosa de tipo VII al 2 % disuelta en PBS y calentada hasta alcanzar el punto de fusion y mezclado suave con agitacion. La concentracion final de agarosa en la mezcla sera del 0,1 %. El intervalo de concentraciones de agarosa que permite obtener productos dermicos viables vana entre 0,025 % y 0,3 % y debera establecerse en relacion con el paciente objeto de su utilizacion.
- dividir en alfcuotas, lo antes posible, en los insertos porosos de cultivo celular.
- dejar polimerizar en reposo durante al menos 30 min.
2. - Desarrollo de una capa de epitelio (epidermis) en la superficie del sustituto dermico mediante subcultivo de las celulas epiteliales sobre el sustituto estromal. Cubrir con medio de cultivo espedfico para celulas epiteliales.
3. - Mantener en la incubadora a 37 °C con CO2 al 5 % en ambiente humedo siguiendo protocolos estandar de cultivo celular. Los medios de cultivo se renuevan cada 3 dfas hasta que las celulas epiteliales alcanzan la confluencia en la superficie del sustituto dermico (alrededor de una semana).
4. - Extraer el producto de uretra humana artificial de la superficie de cultivo y proceder a su deshidratacion parcial depositandolo sobre un papel de filtro esteril de 3-5 mm de espesor colocado sobre una superficie plana de vidrio esteril. Colocar un fragmento de tul o tela porosa de nylon esterilizada con alcohol al 70 % sobre la superficie del sustituto de piel para impedir que la capa epitelial del sustituto de uretra se adhiera al papel de filtro. Tras ello, colocar un segundo papel de filtro esteril de 3-5 mm de espesor sobre el sustituto de estroma cubierto con tela. Depositar un fragmento plano de vidrio esteril en su superficie y colocar un objeto de aproximadamente 250 g de peso sobre este (Figura 1). Todo el proceso ha de realizarse en una campana de flujo laminar a temperatura ambiente durante 10 minutos. El objetivo de este proceso es reducir significativamente los niveles de hidratacion del producto para alcanzar niveles optimos de consistencia y elasticidad. 5
5. - Una vez deshidratado el tejido, cortar a medida el sustituto uretral y enrollarlo sobre sf mismo, procediendo a suturarlo con hilo de sutura quirurgica monofilamento. De este modo, se consigue un sustituto de la uretra con forma tubular muy similar a la uretra humana natural. Cabe destacar que la deshidratacion del tejido da como resultado
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niveles de consistencia y elasticidad adecuados, permitiendo llevar a cabo el enrollamiento y la sutura sin ninguna dificultad.
Evaluacion del producto de uretra humana artificial (Figura 5):
1) Analisis microscopico del producto de uretra artificial humana (control de calidad histologico) (Figura 5A).
La evaluacion de los productos de uretra artificial revelo que la estructura de estos presentaba numerosas similitudes con la uretra humana normal natural En concreto, el analisis de muestras mantenidas en cultivo durante cuatro semanas revelo la formacion de un epitelio escamoso estratificado en la superficie del estroma artificial y la generacion de un estroma denso, rico en fibras, en el que las celulas estromales proliferaban activamente. Todo ello sugiere que la estructura de la uretra artificial era igual a la de la uretra normal natural.
En aquellos casos en los que se utilizaron celulas de la mucosa oral, se obtuvieron sustitutos estromales muy similares a los obtenidos a partir de celulas uretrales.
2) Analisis inmunohistoqmmico del producto de uretra artificial humana (Figura 5B).
El analisis de expresion de citoqueratina de los controles de uretra normal y los productos de uretra artificial obtenidos en el laboratorio, demostro la expresion de integrinas por parte del epitelio uretral artificial, lo cual sugiere que este epitelio es plenamente funcional y podna utilizarse para la sustitucion de la uretra humana.
Ejemplo 5. Preparacion de un producto de vejiga urinaria artificial
Protocolo de fabricacion de un producto de vejiga urinaria humana artificial:
A. -Obtencion de muestras de vejiga urinaria humana.
Para la generacion de sustitutos artificiales de la vejiga urinaria, se utilizan pequenas biopsias de la vejiga humana normal obtenidas mediante endoscopia de pacientes o donantes normales. Una vez obtenida la muestra de forma esteril, los tejidos extrafdos se introduciran inmediatamente en un medio de transporte esteril constituido por medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con antibioticos (500 U/ml de penicilina G y 500 pg/ml de estreptomicina) y antimicoticos (1,25 pg/ml de anfotericina B) para impedir una eventual contaminacion de la muestra.
Como alternativa, en los casos en los que no es factible la toma de muestras de vejiga humana, se pueden utilizar muestras de mucosa oral o de piel para la generacion de sustitutos vesicales.
B. - Generacion de cultivos primarios de celulas estromales y epiteliales.
Transcurrido el periodo de transporte, todas las muestras deben lavarse dos veces en una solucion esteril de PBS con penicilina, estreptomicina y anfotericina B (500 U/ml, 500 pg/ml y 1,25 pg/ml, respectivamente) para eliminar todos los restos de sangre, fibrina, grasa o materiales extranos que pudieran encontrarse adheridos a las muestras.
En primer lugar, para separar el estroma del epitelio, las muestras se incuban a 37 °C en una solucion esteril con tripsina 0,5 g/l y EDTA 0,2 g/l en PBS, recogiendose el sobrenadante con las celulas despues de 30 minutos mediante centrifugacion. Este proceso se repite hasta 5 veces anadiendo nueva solucion de tripsina-EDTA cada vez. De este modo, se consigue una cantidad apreciable de celulas epiteliales de la vejiga, las cuales se cultivan en medio de cultivo de celulas epiteliales, el cual favorece preferentemente el crecimiento de las celulas epiteliales sobre los fibroblastos. Este medio esta compuesto por 3 partes de medio DMEM rico en glucosa y una parte de medio Ham F-12, todo ello complementado con suero bovino fetal al 10 %, anti bioticos-antimicoticos (100 U/ml de penicilina G, 100 pg/ml de estreptomicina y 0,25 pg/ml de anfotericina B), 24 pg/ml de adenina y distintos factores de crecimiento: 0,4 pg/ml de hidrocortisona, 5 pg/ml de insulina, 10 ng/ml de factor de crecimiento epitelial (EGF), 1,3 ng/ml de triyodotironina y 8 ng/ml de toxina colerica.
Para llevar a cabo la digestion de la matriz extracelular del estroma vesical y conseguir la separacion de los fibroblastos estromales incluidos en dicha matriz, las muestras deben incubarse durante 6 horas a 37 °C en una solucion esteril de 2 mg/ml de colagenasa de tipo I de Clostridium hystoliticum en medio de cultivo DMEM sin suero bovino fetal. Esta solucion es capaz de digerir el colageno del estroma y liberar los fibroblastos inmersos en este. Para la obtencion de cultivos primarios de fibroblastos, la solucion de digestion que contiene las celulas estromales disgregadas se debe centrifugar a 1.000 rpm durante 10 minutos y el sedimento celular correspondiente a los fibroblastos se cultiva en matraces de cultivo de 15 cm2 de superficie. Como medio de cultivo, se utiliza DMEM enriquecido en glucosa complementado con antibioticos y antimicoticos (100 U/ml de penicilina G, 100 pg/ml de estreptomicina y 0,25 pg/ml de anfotericina B) y suero bovino fetal (SBF) al 10 %. A este medio basico de cultivo se le denomina medio de fibroblastos.
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En todos los casos, las celulas se incubaran a 37 °C con dioxido de carbono al 5 %, en condiciones estandar de cultivo celular. Los medios de cultivo se renuevan cada tres d^as.
C.- Construccion de productos de vejiga urinaria humana artificial basados en fibrina y agarosa mediante ingeniena tisular.
1 - Generacion de sustitutos estromales con fibroblastos inmersos en su interior utilizando matrices extracelulares de fibrina y agarosa. Estos sustitutos estromales se generaran directamente sobre placas de Petri para cultivo celular. Para preparar 10 ml de sustituto estromal se procedera del siguiente modo:
- obtencion de 7,6 ml de plasma sangurneo humano procedente de donaciones (posiblemente de origen autologo).
- adicion de 150.000 fibroblastos de vejiga humana previamente cultivados y resuspendidos en 750 pl de medio de cultivo DMEM.
-adicion de 150 pl de acido tranexamico para impedir la fibrinolisis del gel de fibrina.
-adicion de 1 ml de ClCa2 al 1 % para inducir la reaccion de coagulacion y generar una red de fibras de fibrina.
- adicion rapida de 0,5 ml de agarosa de tipo VII al 2 % disuelta en PBS y calentada hasta alcanzar el punto de fusion y mezclado suave con agitacion. La concentracion final de agarosa en la mezcla sera del 0,1 %. El intervalo de concentraciones de agarosa que permite obtener productos dermicos viables vana entre 0,025 % y 0,3 % y debera establecerse en relacion con el paciente objeto de su utilizacion.
- dividir en alfcuotas, lo antes posible, en las placas de Petri de cultivo celular.
- dejar polimerizar en reposo durante al menos 30 min.
2. - Desarrollo de una capa de epitelio (urotelio) en la superficie del sustituto dermico mediante subcultivo de las celulas epiteliales sobre este sustituto. Cubrir con medio de cultivo espedfico para celulas epiteliales.
3. - Mantener en una incubadora a 37 °C con CO2 al 5 % en ambiente humedo siguiendo protocolos estandar de cultivo celular. Los medios de cultivo se renuevan cada 3 dfas hasta que las celulas epiteliales alcanzan la confluencia en la superficie del sustituto dermico (alrededor de una semana).
4. - Extraer el producto de vejiga humana artificial de la superficie de cultivo y proceder a su deshidratacion parcial depositandolo sobre un papel de filtro esteril de 3-5 mm de espesor colocado sobre una superficie plana de vidrio esteril. Colocar un fragmento de tul o tela porosa de nylon esterilizada con alcohol 70% sobre la superficie del sustituto estromal para impedir que la capa epitelial del sustituto vesical se adhiera al papel de filtro. Tras ello, colocar un segundo papel de filtro esteril de 3-5 mm de grosor sobre el sustituto estromal cubierto portela. Depositar un fragmento plano de vidrio esteril en su superficie y colocar un objeto de aproximadamente 250 g de peso sobre este (Figura 1). Todo el proceso debe realizarse en una campana de flujo laminar a temperatura ambiente durante 10 minutos. El objetivo de este proceso es reducir significativamente los niveles de hidratacion del producto para alcanzar niveles optimos de consistencia y elasticidad.
5. - Una vez deshidratado el tejido, cortar a medida el sustituto vesical y suturarlo sobre sf mismo dandole la forma deseada, utilizando hilo de sutura quirurgica monofilamento. Cabe destacar que la deshidratacion del tejido da como resultado niveles de consistencia y elasticidad adecuados, permitiendo llevar a cabo la sutura sin ninguna dificultad.
Evaluacion del producto de vejiga urinaria humana artificial (Figura 6):
1) Analisis microscopico e inmunohistoqmmico del producto de vejiga artificial humana (control de calidad histologico) (Figuras 6A y 6B).
La evaluacion de los productos de vejiga artificial revelo que la estructura de estos presentaba numerosas similitudes con la vejiga humana normal natural. En concreto, el analisis de muestras mantenidas en cultivo durante cuatro semanas revelo la formacion de un epitelio simple cubico o escamoso en la superficie del estroma artificial y la generacion de un estroma denso, rico en fibras, en el que las celulas estromales proliferaban activamente (Figura 6A).
El analisis inmunohistoqmmico revelo que estos tejidos expresaban citoqueratina 13 y pancitoqueratina, al igual que los tejidos de vejiga humana control normal, asf como citoqueratinas 7 y 8, tfpicas de tejidos embrionarios o en proceso de maduracion (Figura 6B). Todo ello sugiere que la estructura de la vejiga artificial era igual que la de la vejiga normal natural.
En aquellos casos en los que se utilizaron celulas de la mucosa oral, se obtuvieron sustitutos estromales muy similares a los obtenidos a partir de celulas vesicales.
Ejemplo 6. Preparacion de productos artificiales mediante biomateriales de fibrina, agarosa y colageno.
Protocolo de preparacion de productos de mucosa oral humana artificial:
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A. Generacion de cultivos primarios de celulas epiteliales y estromales.
Para establecer cultivos primarios de celulas epiteliales (celulas epiteliales de la mucosa oral) y estromales (fibroblastos), se utilizan biopsias de mucosa oral normal procedente de donantes humanos o de animales de laboratorio, utilizando los siguientes metodos y protocolos:
- obtencion de una biopsia de la mucosa oral y transporte al laboratorio en suero fisiologico esteril.
- aislamiento y cultivo de celulas epiteliales y estromales utilizando tecnicas estandar de digestion enzimatica (tripsina o dispasa para aislamiento epitelial y colagenasa para el estroma) o de explante tisular.
- cultivo en medios espedficos para celulas epiteliales o estromales hasta alcanzar la confluencia celular.
Todos los cultivos se mantienen en una incubadora a 37 °C con CO2 al 5 % en un ambiente humedo siguiendo protocolos estandar de cultivo celular. Los medios de cultivo se renuevan cada 3 dfas hasta que las celulas alcanzan la confluencia en cultivo.
B. Construccion en laboratorio de sustitutos tisulares de fibrina, agarosa y colageno mediante ingeniena tisular.
1- Generacion de sustitutos del estroma tisular con celulas estromales inmersas en su interior. Para preparar 20 ml de sustituto estromal:
a. -Preparar 10 ml de colageno de tipo I lfquido tomando un volumen de colageno lfquido concentrado a 6,4 mg/ml de 8,81 ml. Anadir 1,1 ml de PBS 10X y ajustar el pH a 7,4±0,2 mediante la adicion de aproximadamente 90 pl de NaOH. Para elevar el pH se suele utilizar NaOH a una concentracion de entre 0,1 y 1 M, aunque tambien pueden utilizarse otros productos. Mezclar mediante agitacion suave y mantener en hielo para impedir la gelificacion prematura.
b. - Preparar 10 ml de una mezcla de fibrina y agarosa procediendo del siguiente modo:
- obtencion de 7,6 ml de plasma sangumeo humano procedente de donaciones (posiblemente de origen autologo).
- adicion de 150.000 fibroblastos de vejiga humana previamente cultivados y resuspendidos en 750 pl de medio de cultivo DMEM.
- adicion de 150 pl de acido tranexamico para impedir la fibrinolisis del gel de fibrina.
- adicion de 1 ml de ClCa2 al 1 % para inducir la reaccion de coagulacion y generar una red de fibras de fibrina.
- adicion rapida de 0,5 ml de agarosa de tipo VII al 2 % disuelta en PBS y calentada hasta alcanzar el punto de fusion y mezclado suave con agitacion. La concentracion final de agarosa en la mezcla sera del 0,1 %. El intervalo de concentraciones de agarosa que permite obtener productos dermicos viables vana entre 0,025 % y 0,3 % y debera establecerse en relacion con el paciente objeto de su utilizacion.
c. - Mezclar ambas soluciones (de colageno y de fibrina-agarosa) en proporcion variable dependiendo del producto que se quiera generar. En todos los casos, mezclar lo mas rapidamente posible ambas soluciones, manteniendo la solucion de colageno en frio hasta el momento exacto de la mezcla.
- Para generar el producto A (2,8 g/l de colageno, 1,25 g/l de fibrina y 0,5 g/l de agarosa), anadir 10 ml de la solucion de colageno y 10 ml de la solucion de fibrina-agarosa.
- Para generar el producto B (3,8 g/l de colageno, 0,6 g/l de fibrina y 0,25 g/l de agarosa), anadir 15 ml de la solucion de colageno y 5 ml de la solucion de fibrina-agarosa.
- Para generar el producto C (1,9 g/l de colageno, 1,9 g/l de fibrina y 0,75 g/l de agarosa), anadir 5 ml de la solucion de colageno y 15 ml de la solucion de fibrina-agarosa.
d. - Dividir en alfcuotas lo antes posible en insertos porosos de cultivo celular o en placas de Petri esteriles.
e. - Dejar polimerizar en reposo durante al menos 30 min en una incubadora a 37 °C.
2- Desarrollo de una capa de epitelio en la superficie del sustituto estromal mediante subcultivo de las celulas epiteliales de la mucosa oral sobre el sustituto estromal. Cubrir con medio de cultivo espedfico para celulas epiteliales.
3- Mantener en la incubadora a 37 °C con CO2 al 5 % en ambiente humedo siguiendo protocolos estandar de cultivo celular. Los medios de cultivo se renuevan cada 3 dfas hasta que las celulas epiteliales alcanzan la confluencia en la superficie del sustituto estromal (alrededor de una semana). 4
4- Exponer la superficie epitelial al aire (tecnica de aire y lfquido) manteniendo el sustituto estromal sumergido en medio de cultivo para promover la estratificacion y la maduracion del epitelio (alrededor de una semana).
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5- Extraer el tejido artificial de la superficie de cultivo y proceder a su deshidratacion parcial depositandolo sobre un papel de filtro esteril de 3-5 mm de espesor colocado sobre una superficie plana de vidrio esteril. Colocar un fragmento de tul o tela porosa de nylon esterilizada con alcohol al 70 % sobre la superficie del sustituto estromal para impedir que la capa epitelial del sustituto tisular se adhiera al papel de filtro. Tras ello, colocar un segundo papel de filtro esteril de 3-5 mm de grosor sobre el sustituto estromal cubierto por tela. Depositar un fragmento plano de vidrio esteril en su superficie y colocar un objeto de aproximadamente 250 g de peso sobre este (Figura 1). Todo el proceso debe realizarse en una campana de flujo laminar a temperatura ambiente durante 10 minutos. El objetivo de este proceso es reducir significativamente los niveles de hidratacion del producto para alcanzar niveles optimos de consistencia y elasticidad.
6- Una vez deshidratado el tejido, cortarlo a medida dandole la forma deseada, utilizando hilo de sutura quirurgica monofilamento. Cabe destacar que el deshidratado del tejido da como resultado niveles de consistencia y elasticidad adecuados, permitiendo llevar a cabo la sutura sin ninguna dificultad.
C. Construccion en laboratorio de sustitutos tisulares de colageno mediante ingeniena tisular.
1- Generacion de sustitutos del estroma tisular con celulas estromales inmersas en su interior. Para preparar 20 ml de sustituto estromal:
- Tomar 17,62 ml de colageno lfquido concentrado a 6,4 mg/ml; anadir 1,45 ml de PBS 10X y ajustar el pH a 7,4±0,2 mediante la adicion de aproximadamente 180 pl de NaOH. Para elevar el pH se suele utilizar NaOH a una concentracion de entre 0,1 y 1 M, aunque tambien pueden utilizarse otros productos. Mezclar mediante agitacion suave y mantener en hielo para impedir la gelificacion prematura.
- Anadir 150.000 celulas estromales previamente cultivadas y resuspendidas en 750 pl de medio de cultivo DMEM.
- Dividir en alfcuotas lo antes posible en insertos porosos de cultivo celular o en placas de Petri esteriles.
- Dejar polimerizar en reposo durante al menos 30 min en una incubadora a 37 °C.
2- Desarrollo de una capa de epitelio en la superficie del sustituto estromal mediante subcultivo de las celulas epiteliales de la mucosa oral sobre el sustituto estromal. Cubrir con medio de cultivo espedfico para celulas epiteliales.
3- Mantener en una incubadora a 37 °C con CO2 al 5 % en ambiente humedo siguiendo protocolos estandar de cultivo celular. Los medios de cultivo se renuevan cada 3 dfas hasta que las celulas epiteliales alcanzan la confluencia en la superficie del sustituto estromal (alrededor de una semana).
4- Exponer la superficie epitelial al aire (tecnica aire lfquido) manteniendo el sustituto estromal sumergido en medio de cultivo para promover la estratificacion y la maduracion del epitelio (alrededor de una semana).
5- Extraer el tejido artificial de la superficie de cultivo y proceder a su deshidratacion parcial depositando el mismo sobre un papel de filtro esteril de 3-5 mm de espesor colocado sobre una superficie plana de vidrio esteril. Colocar un fragmento de tul o tela porosa de nylon esterilizada con alcohol al 70 % sobre la superficie del sustituto estromal para impedir que la capa epitelial del sustituto tisular se adhiera al papel de filtro. Tras ello, colocar un segundo papel de filtro esteril de 3-5 mm de grosor sobre el sustituto estromal cubierto por tela. Depositar un fragmento plano de vidrio esteril en su superficie y colocar un objeto de aproximadamente 250 g de peso sobre este (Figura 1). Todo el proceso debe realizarse en una campana de flujo laminar a temperatura ambiente durante 10 minutos. 6
6- Una vez deshidratado el tejido, cortarlo a medida dandole la forma deseada, utilizando hilo de sutura quirurgica monofilamento.
Evaluacion de los productos de mucosa oral humana artificial (Figura 7):
Se llevo a cabo la evaluacion de los productos obtenidos segun el protocolo anterior. Las concentraciones de fibrina, agarosa y colageno para cada uno de los productos elaborados se indican a continuacion:
A. - fibrina (1,25 g/l), agarosa (0,5 g/l) y colageno (2,8 g/l).
B. - fibrina (0,6 g/l), agarosa (0,25 g/l) y colageno (3,8 g/l).
C. - fibrina (1,9 g/l), agarosa (0,75 g/l) y colageno (1,9 g/l).
D. - fibrina (0 g/l), agarosa (0 g/l) y colageno (5,6 g/l).
1) Analisis microscopico de lostejidos artificiales (control de calidad histologico) (Figura 7A).
El analisis microscopico revelo que los tejidos artificiales generados mediante ingeniena tisular eran estructuralmente similares a los tejidos naturales utilizados como control. En concreto, se pudo apreciar un estroma
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compuesto por numerosas fibras entre las que se dispoman las celulas estromales, mostrando niveles adecuados de proliferacion celular. En comparacion con otros modelos previamente descritos (especialmente, los modelos de fibrina y de fibrina con agarosa), los tejidos de fibrina, agarosa y colageno presentan mayor densidad fibrilar a nivel del estroma. Todo ello sugiere que los productos tisulares construidos basandose en el protocolo expuesto anteriormente, son compatibles con los tejidos humanos normales naturales.
2) Control de calidad reologico (Figura 7B).
El analisis de las propiedades biomecanicas de los productos tisulares construidos basandose en el protocolo expuesto anteriormente se realiza mediante un reometro. Los resultados se muestran en la figura 7C y revelan que el mejor tejido es el producto A seguido del C, siendo el B muy similar al D (colageno solo). Por tanto, el analisis realizado demostro una mejora del comportamiento viscoelastico y un esfuerzo umbral creciente segun se aumenta la concentracion de colageno, y mas elevado que el mostrado por los tejidos artificiales de colageno.
Los datos presentados en estos ejemplos muestran que las propiedades ffsicas de los tejidos de fibrina, agarosa y colageno son optimas y similares a las de los tejidos humanos normales utilizados como control, lo que supone una mejora con respecto a los tejidos artificiales descritos con respecto a su utilizacion clmica.
Ejemplo 8: Mejora de los biomateriales de fibrina-agarosa tras la aplicacion de tecnicas de estructuracion.
La aplicacion de tecnicas de nanoestructuracion es capaz de modificar sustancialmente la estructura y el comportamiento de los biomateriales sometidos a este proceso. Los principales efectos de la nanoestructuracion sobre el biomaterial de fibrina y agarosa al 0,1 % (concentracion final preferida de la solicitud de patente) son los siguientes:
- Mejora significativa de las propiedades biomecanicas del tejido. Este aumento permite la manipulacion del tejido nanoestructurado y supone una mejora sustancial y no esperada de las propiedades reologicas del biomaterial. Como se muestra en la figura 8, el esfuerzo umbral fue 3,8 veces superior en los tejidos nanoestructurados respecto a los no nanoestructurados (16,2 y 4,23 Pascales, respectivamente). En la misma lmea, el modulo viscoso G'' de las muestras sometidas a nanoestructuracion fue 5,26 veces mayor respecto a las muestras no nanoestructuradas (19,3 y 3,67 Pa, respectivamente) (figura 9). Estos datos indican que la resistencia de los biomateriales nanoestructurados es muy superior a la de los tejidos no nanoestructurados.
Del mismo modo, el modulo elastico G' de los tejidos nanoestructurados fue 5,55 veces mayor (figura 10) respecto a los biomateriales naturales no nanoestructurados (152 y 27,4 Pa, respectivamente), lo cual significa que estos tejidos presentan niveles de elasticidad significativamente mas altos.
Todos estos fenomenos son muy significativos y evidentemente no dependen de la concentracion de agua en el biomaterial, sino de las reacciones internas generadas en el biomaterial como consecuencia del proceso de nanoestructuracion.
- Mejora sustancial de la manipulabilidad del tejido nanoestructurado, lo cual permitio su manipulacion quirurgica, la sutura al lecho receptor y el implante en animales de experimentacion. Es importante destacar que los tejidos no nanoestructurados fueron significativamente mas diffciles de manipular, tendiendo a la ruptura y dificultando notablemente la sutura y el implante clmico. Esta mejora es muy significativa y no puede explicarse simplemente por la disminucion de la concentracion de agua en el biomaterial, sino por la formacion de estructuras tridimensionales de enlace entre las distintas fibras de fibrina y agarosa, modificandose de forma inesperada las propiedades del biomaterial.
- Mejora significativa de la transparencia de los tejidos sometidos a nanoestructuracion. La transparencia de los biomateriales no nanoestructurados de fibrina-agarosa 0,1 %, medida como porcentaje de transmitancia del espectro de la luz visible (aproximadamente, de 400 a 700 nm), alcanzo niveles del 90-94 %, dependiendo de la longitud de onda considerada (media 92 %), mientras que los biomateriales no nanoestructurados presentaron una transmitancia del 87-90 % (media 88,5 %) (figura 10). Existe por tanto una mejor transparencia (mayor transmitancia de la luz visible) en los biomateriales sometidos al proceso de nanoestructuracion. Al igual que en los casos anteriores, este fenomeno es el resultado de un proceso complejo de reacciones qmmicas y ffsicas en la estructura interna del biomaterial y no es en absoluto previsible encontrar una mejora de la transparencia, puesto que los tejidos nanoestructurados son mas densos y mas pobres en contenido de agua que los tejidos no nanoestructurados.
- Resultado clmico una vez implantados en animales de laboratorio. El implante de los biomateriales sometidos a nanoestructuracion ha demostrado ser mas efectivo desde un punto de vista clmico que el de los biomateriales no nanoestructurados. Este hecho, que no es previsible de antemano, habna que relacionarlo, por un lado, con la mayor eficacia del implante clmico debido a las adecuadas propiedades biomecanicas del biomaterial y, por otro lado, al hecho de que los biomateriales sometidos a nanoestructuracion presentan una mayor densidad de fibras por mm2 y, por tanto, presentan remodelacion mas lenta por parte del organismo receptor.

Claims (19)

  1. 5
    10
    15
    20
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    30
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    40
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    65
    REIVINDICACIONES
    1. Metodo in vitro de preparacion de un tejido artificial que comprende:
    a) anadir una composicion que comprende fibrinogeno a una muestra de celulas aisladas,
    b) anadir un agente antifibrinoltiico al producto resultante de la etapa (a),
    c) anadir, al menos, un factor de coagulacion, una fuente de calcio, trombina, o cualquier combinacion de los anteriores al producto resultante de la etapa (b),
    d) anadir una composicion de un polisacarido al producto resultante de la etapa (c),
    e) cultivar celulas aisladas en o sobre el producto resultante de la etapa (d), e
    f) inducir la nanoestructuracion del producto resultante de la etapa (e), comprendiendo dicha induccion de nanoestructuracion la deshidratacion y/o compresion mecanica del producto resultante de la etapa (e), y siendo el polisacarido de la etapa (d) agarosa.
  2. 2. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que las celulas de la etapa (a) son fibroblastos o queratocitos.
  3. 3. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que entre las etapas (b) y (c) comprende adicionalmente una etapa (etapa b2) en la que se anade una protema.
  4. 4. El metodo segun la reivindicacion 3, en el que la protema anadida en la etapa (b2) es fibronectina.
  5. 5. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que entre las etapas (d) y (e), comprende una etapa (b2) que comprende la adicion, al producto resultante de la etapa (d), de una composicion que comprende una protema.
  6. 6. El metodo segun la reivindicacion 5, en el que la protema anadida en la etapa (d2) es colageno.
  7. 7. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las celulas de la etapa (e) comprenden celulas madre de cordon umbilical.
  8. 8. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que las celulas de la etapa (e) comprenden celulas epiteliales.
  9. 9. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la deshidratacion del producto resultante de la etapa (e), comprende un metodo seleccionado de la lista que comprende: drenaje, evaporacion, succion, presion capilar, osmosis o electroosmosis.
  10. 10. El metodo segun la reivindicacion 9, en el que la deshidratacion del producto resultante de la etapa (e) mediante presion capilar, comprende la aplicacion de un material absorbente sobre el producto resultante de la etapa (e).
  11. 11. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la compresion mecanica de la etapa (f) comprende un metodo seleccionado de la lista que comprende: aplicacion de una carga estatica, aplicacion de un hidraulico, aplicacion de una leva, aplicacion de uno o mas rodillos, aplicacion de un globo, extrusion o centrifugacion.
  12. 12. El metodo segun la reivindicacion 11, en el que la aplicacion de una carga estatica de la etapa (f) comprende la colocacion de un peso sobre el producto resultante de la etapa (e).
  13. 13. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que entre la etapa (e) y la etapa (f) hay una etapa adicional en la que el producto resultante de la etapa (e) se expone al aire.
  14. 14. Un tejido artificial obtenible por el metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
  15. 15. El uso del tejido artificial segun la reivindicacion 14, para la evaluacion de un producto farmacologico y/o qmmico.
  16. 16. El tejido artificial segun la reivindicacion 14 para su uso en medicina.
  17. 17. El tejido artificial segun la reivindicacion 14 para su uso en incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de un tejido o un organo enfermo o danado.
  18. 18. El tejido artificial para su uso segun la reivindicacion 17, en la que el tejido o el organo danado se selecciona de la lista que comprende: piel, vejiga, uretra, cornea, mucosa, conjuntiva, pared abdominal, conjuntiva, timpano, faringe, laringe, intestino, peritoneo, ligamento, tendon, hueso, meninge o vagina.
  19. 19. Una composicion farmaceutica que comprende el tejido artificial segun la reivindicacion 14.
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