ES2678204T3 - Método para purificar inmunoconjugados - Google Patents

Abstract

Un método para producir un polipéptido purificado de una solución que comprende el polipéptido y una variante ácida del polipéptido, en el que dicha variante ácida del polipéptido da como resultado una inhibición de la potencia de dicho polipéptido, comprendiendo el método: (a) poner en contacto el polipéptido con una matriz de cromatografía de intercambio aniónico (AIEX); y (b) eluir el polipéptido unido de la matriz de cromatografía AIEX con un gradiente salino lineal que sea de aproximadamente NaCl 150 mM en Tris/HCl, pH 8,0 a aproximadamente NaCl 300 mM en Tris/HCl, pH 8,0, de aproximadamente NaCl 175 mM en Tris/HCl, pH 8,0 a aproximadamente NaCl 275 mM en Tris/HCl, pH 8,0 o de aproximadamente NaCl 192 mM en Tris/HCl, pH 8,0 a aproximadamente NaCl 245 mM en Tris/HCl, pH 8,0, separando de este modo dicho polipéptido de la variante ácida y produciendo un polipéptido purificado; en el que el polipéptido es un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une con el receptor de superficie celular CD22 y que comprende una exotoxina de Pseudomonas, o variante de la misma.

Description

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DESCRIPCION

Metodo para purificar inmunoconjugados Antecedentes de la invencion Campo de la invencion

La presente invencion proporciona metodos para purificar un inmunoconjugado de una solucion que contiene el inmunoconjugado y una variante acida del mismo, en los que dicha variante acida es una especie desamidada de dicho inmunoconjugado. Tambien se desvelan formulaciones que contienen dichos polipeptidos o inmunoconjugados purificados.

Tecnica antecedente

La purificacion economica, a gran escala, de protemas es un factor para la industria biofarmaceutica. Se producen tipicamente protemas terapeuticas usando lmeas celulares procariotas o eucariotas que se modifican tecnicamente para expresar la protema de interes de un plasmido recombinante que contiene el gen que codifica la protema. La separacion de la protema deseada de la mezcla de componentes suministrados a las celulas y productos secundarios celulares a una pureza adecuada, por ejemplo, suficiente para su uso como un producto terapeutico humano, plantea un reto formidable a los fabricantes de productos biologicos por varias razones.

Los fabricantes de productos farmaceuticos basados en protemas deben cumplir pautas reguladoras estrictas, incluyendo requisitos de pureza extremadamente rigurosos. Para asegurar la seguridad, las agencias reguladoras, tales como la administracion de farmacos y alimentos (FDA), requieren que los productos farmaceuticos basados en protemas esten sustancialmente libres de impurezas, incluyendo tanto contaminantes relacionados con productos tales como agregados, fragmentos y variantes de la protema recombinante y contaminantes relacionados con el proceso tales como protemas de celulas hospedadoras, componentes de medios, virus, ADN y endotoxinas. Aunque diversos esquemas de purificacion de protemas estan disponibles y se usan ampliamente en la industria biofarmaceutica, incluyen tfpicamente una etapa de purificacion de afinidad, tales como purificacion de protema A en el caso de anticuerpos, para alcanzar un grado de pureza farmaceuticamente aceptable.

El desarrollo de un esquema de purificacion aplicable a una biomolecula particular o diversas biomoleculas que pueda cambiarse de escala, que sea controlable y que emplee estrategicamente el uso de resinas particulares o una combinacion de resinas permitira su integracion en desarrollo de productos en un estadio muy temprano en el desarrollo de farmacos general. Este enfoque para el diseno de un esquema de purificacion puede minimizar cambios costosos para procesos de fabricacion que pueden de otro modo ser necesarios mas tarde en el desarrollo de farmacos o, aun peor, despues de la aprobacion. A medida que el proceso se aumenta de escala y se acerca a las condiciones de produccion de GMP, surgen complejidades inherentes adicionales, incluyendo las asociadas con empaquetamiento de resina y preparacion de tampon. El proceso de fabricacion, y su capacidad, puede mejorarse simplificando el esquema de purificacion, eliminando etapas del proceso y maximizando el rendimiento y la productividad, manteniendo al mismo tiempo la integridad y pureza de la molecula que se purifica. Por lo tanto, sena deseable y ventajoso comenzar con un proceso sencillo y eficaz que pueda producir una sustancia farmacologica de alta calidad y seguridad.

Una complejidad asociada con la purificacion de un producto farmacologico es el mantenimiento de la potencia a lo largo del proceso de purificacion. Muchos factores pueden contribuir a una reduccion o inhibicion de la potencia, incluyendo la modificacion del producto farmacologico durante el proceso de desarrollo. Dicha modificacion puede producirse en diversos estadios del proceso, por ejemplo, cuando la protema se expresa en la celula, o cuando una protema que se ha aislado de una celula se somete a diversas condiciones o tampones. La presente invencion proporciona un metodo para purificar un inmunoconjugado activo de una solucion que contiene una variante modificada del inmunoconjugado, donde la presencia de esta variante modificada da como resultado una inhibicion de la potencia del producto farmacologico final.

Breve sumario de la invencion

La presente invencion proporciona un metodo para purificar un polipeptido de interes de una solucion que contiene el polipeptido y una variante acida, tal como una variante desamidada, del polipeptido.

En particular, la presente invencion proporciona un metodo para purificar un inmunoconjugado activo, donde el inmunoconjugado esta desamidado en uno o mas restos y en el que la desamidacion da como resultado una inhibicion de la potencia de dicho inmunoconjugado, comprendiendo el metodo: (a) poner en contacto el inmunoconjugado con una matriz de cromatograffa de intercambio anionico AIEX; y (b) eluir el inmunoconjugado unido de la matriz de cromatograffa AIEX con un tampon de alta salinidad, como se define en las reivindicaciones, separando de este modo el inmunoconjugado activo de la variante desamidada.

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La invencion tambien proporciona un metodo, como se define en las reivindicaciones, para producir un polipeptido purificado de una solucion que comprende el polipeptido y una variante acida del polipeptido, donde la variante acida del polipeptido da como resultado una inhibicion de la potencia del polipeptido, comprendiendo el metodo: (a) poner en contacto el polipeptido con una matriz de cromatograffa de intercambio anionico (AIEX); y (b) eluir el polipeptido unido de la matriz de cromatograffa AIEX con un tampon de alta salinidad, separando de este modo dicho polipeptido de la variante acida y produciendo un polipeptido purificado.

En particular, la invencion proporciona un metodo para producir un polipeptido purificado de una solucion que comprende el polipeptido y una variante acida del polipeptido, en el que dicha variante acida del polipeptido da como resultado una inhibicion de la potencia de dicho polipeptido, comprendiendo el metodo: (a) poner en contacto el polipeptido con una matriz de cromatograffa de intercambio anionico (AIEX); y (b) eluir el polipeptido unido de la matriz de cromatograffa AIEX con un gradiente salino lineal que sea de aproximadamente NaCl 150 mM en Tris/HCl, pH 8,0 a aproximadamente NaCl 300 mM en Tris/HCl, pH 8,0, de aproximadamente NaCl 175 mM en Tris/HCl, pH 8,0 a aproximadamente NaCl 275 mM en Tris/HCl, pH 8,0 o de aproximadamente NaCl 192 mM en Tris/HCl, pH 8,0 a aproximadamente NaCl 245 mM en Tris/HCl, pH 8,0, separando de este modo dicho polipeptido de la variante acida y produciendo un polipeptido purificado; en el que el polipeptido es un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo o fragmento de union a anffgeno del mismo que se une con el receptor de superficie celular CD22 y que comprende una exotoxina de Pseudomonas, o variante de la misma.

Se desvela con la presente un metodo para producir un polipeptido o inmunoconjugado purificado de una solucion que comprende el polipeptido y una variante acida del polipeptido, comprendiendo el metodo: (a) producir el polipeptido o inmunoconjugado en una celula bacteriana que expresa el polipeptido o inmunoconjugado; (b) aislar cuerpos de inclusion que contienen el polipeptido o inmunoconjugado de las celulas bacterianas; (c) replegar el polipeptido o inmunoconjugado aislado de los cuerpos de inclusion; (d) poner en contacto la composicion que contiene el polipeptido o inmunoconjugado con una matriz de cromatograffa AIEX; y (e) eluir el polipeptido o inmunoconjugado unido de la matriz de cromatograffa AIEX con un tampon de alta salinidad, purificando de este modo el polipeptido o inmunoconjugado de la solucion.

En determinadas realizaciones, la variante acida es una variante desamidada. En realizaciones adicionales, se retira entre aproximadamente el 75 y aproximadamente el 99 % de la variante acida o desamidada durante el proceso de purificacion, en particular aproximadamente el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %.

La matriz AIEX empleada en los metodos de la invencion contiene grupos de intercambio ionico de amina cuaternaria o amina terciaria, un grupo amino cuaternario (Q). En determinadas realizaciones, la matriz AIEX es Q sepharose.

El polipeptido o inmunoconjugado puede eluirse con un gradiente salino lineal o por etapas. En determinadas realizaciones, el gradiente salino lineal es de aproximadamente NaCl 150 mM en Tris/HCl, pH 8,0 a

aproximadamente NaCl 300 mM en Tris/HCl, pH 8,0, de aproximadamente NaCl 175mM en Tris/HCl, pH 8,0 a

aproximadamente NaCl 275 mM en Tris/HCl, pH 8,0 o de aproximadamente NaCl 192 mM en Tris/HCl, pH 8,0 a

aproximadamente NaCl 245 mM en Tris/HCl, pH 8,0.

En una realizacion, el polipeptido o inmunoconjugado al que se aplican los metodos de la invencion comprende un anticuerpo o fragmento de union a anffgeno del mismo, donde el anticuerpo o fragmento de union a anffgeno comprende un Fab, un Fab', un F(ab')2, un Fd, un Fv monocatenario o scFv, un Fv con enlaces disulfuro, un dominio NAR V, un IgNar, un intracuerpo, un IgG-ACH2, un minicuerpo, un F(ab')3, un tetracuerpo, un triacuerpo, un diacuerpo, un anticuerpo de un solo dominio, DVD-Ig, Fcab, mAb2, un (scFv)2 o un scFv-Fc. En determinadas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de union a anffgeno se une a un receptor de superficie celular, tal como el receptor de superficie celular CD22. En realizaciones adicionales, el anticuerpo o fragmento de union a anffgeno del mismo comprende una secuencia de VH y VL, donde la celula de VH se selecciona entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 6-11 y la secuencia de VL se selecciona entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 y 12-15.

En otra realizacion, el polipeptido o inmunoconjugado comprende una toxina, donde la toxina se selecciona entre el grupo que consiste en: exotoxina de Pseudomonas, ricina, abrina, toxina difterica y subunidades de la misma, asf como toxinas botulmicas A a F o variantes, o derivados de las mismas. En determinadas realizaciones, la exotoxina de Pseudomonas, o variante de la misma tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 16-22. En una realizacion particular, el inmunoconjugado es la inmunotoxina CAT-8015 que comprende la subunidad VH-PE38 de SEQ ID NO: 1 y la subunidad VL de SeQ ID NO: 2.

Tambien se desvela con la presente una composicion que comprende un inmunoconjugado purificado que tiene menos de entre aproximadamente 25 % y aproximadamente 1 % de especies desamidadas, en la que dicho inmunoconjugado se purifica por cualquiera de los metodos descritos anteriormente. La composicion puede tener menos de aproximadamente 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % de la especie desamidada presente. La composicion puede ser una composicion farmaceutica que comprende un polipeptido o inmunoconjugado purificado y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.

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Se describe con la presente una formulacion que comprende CAT-8015 1 mg/ml en fosfato de sodio 25 mM, sacarosa 4 %, glicina 8 %, polisorbato 80 (PS80) 0,02 %, pH 7,4. La formulacion puede estar liofilizada.

La invencion tambien proporciona un metodo para modificar la bioactividad de una solucion polipepffdica que comprende un polipeptido y una variante desamidada, en el que el polipeptido es un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo o fragmento de union a anffgeno del mismo que se une con el receptor de superficie celular CD22 y que comprende una exotoxina de Pseudomonas o variante de la misma, comprendiendo el metodo separar el polipeptido de la variante desamidada por cromatograffa AIEX de elucion lineal; y combinar el polipeptido purificado y la variante desamidada en cantidades fijas para obtener la bioactividad deseada de la solucion polipepffdica.

Breves descripciones de los dibujos

Figura 1. Un grafico que representa un perfil de cromatograffa de intercambio ionico (IEC) de un patron de referencia CAT-8015. El pico previo de CAT-8015 representa la mayoffa de CAT-8015 desamidado o isodesamidado, mientras que el pico principal contiene la mayona del inmunoconjugado CAT-8015 intacto, activo.

Figura 2. Un grafico que representa la correlacion entre el porcentaje de potencia relativa de CAT-8015 y el porcentaje de pico previo en la muestra.

Figura 3. Un grafico que representa un perfil de elucion de purificacion a escala de laboratorio de CAT-8015 por cromatograffa de Q Sepharose HP. CAT-8015 se purifico usando Q sepharose HP. La mayor parte del CAT-8015 intacto, activo, residio en las fracciones D5, D7 y D9 (el pico principal que abarca de D3 a D12 como se indica sobre el pico).

Figura 4. Un analisis por SDS-PAGE de muestras de grupos de carga y eluato de QHP (purificacion a escala de laboratorio). El carril 1 corresponde al grupo de carga de QHP; el carril 2 corresponde al grupo de eluato de QHP; y el carril 3 corresponde a un patron de referencia de CAT-8015.

Figura 5. Purificacion a gran escala de CAT-8015 mediante cromatograffa de Q Sepharose HP. CAT-8015 se purifico usando Q sepharose HP. Como se muestra en la figura y en la Tabla 3, la mayor parte del CAT-8015 intacto, activo, residio en las fracciones 5, 6, 7.

Figura 6. Un analisis por SDS-PAGE de muestras de grupos de carga y eluato de QHP (purificacion a gran escala). El carril 1 corresponde al grupo de carga de QHP; y el carril 2 corresponde al grupo de eluato de QHP. Figura 7. Un grafico que representa el porcentaje del pico previo en el producto HA en funcion del pH de solubilizacion como se describe en el Ejemplo 6.

Descripcion detallada de la invencion

La invencion proporciona metodos para purificar un inmunoconjugado como se define en las reivindicaciones de una solucion que contiene el polipeptido o inmunoconjugado y una variante acida del mismo. En una realizacion, la variante acida comprende una forma desamidada del polipeptido o inmunoconjugado. A diferencia del comportamiento de elucion esperado de una columna de intercambio anionico, la mayor parte de las variantes desamidadas eluyen antes que los polipeptidos intactos en condiciones de elucion en gradiente salino. Se proporcionan en el presente documento detalles de los metodos.

Los terminos "polipeptido", "peptido", "protema", y "fragmento de protema" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a un polfmero de restos de aminoacidos. Los terminos se aplican a poffmeros de aminoacidos en los que uno mas restos de aminoacidos son un mimetico qmmico artificial de un aminoacido correspondiente de origen natural, asf como a polfmeros de aminoacidos de origen natural y polfmeros de aminoacidos de origen no natural.

El termino "aminoacido" se refiere a aminoacidos de origen natural y sinteticos, asf como a analogos de aminoacidos y mimeticos de aminoacidos que actuan de una manera similar a los aminoacidos de origen natural. Son aminoacidos de origen natural los codificados por el codigo genetico, asf como los aminoacidos que se modifican posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, gamma-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Los analogos de aminoacidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura qmmica basica que un aminoacido de origen natural, por ejemplo, un carbono alfa que esta unido a un hidrogeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfoxido de metionina, metil sulfonio de metionina. Dichos analogos pueden tener grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o cadenas principales pepffdicas modificadas, pero conservan la misma estructura qmmica basica que un aminoacido de origen natural. Los mimeticos de aminoacidos se refieren a compuestos qmmicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura qmmica general de un aminoacido, pero que actuan de manera similar a un aminoacido de origen natural. Los aminoacidos con carga negativa incluyen acido aspartico (o aspartato) y acido glutamico (o glutamato). Los aminoacidos con carga positiva incluyen arginina, histidina y lisina.

La "composicion" para purificar en el presente documento comprende el polipeptido de interes y una o mas impurezas. La composicion puede estar "parcialmente purificada" (es decir, que se ha sometido a una o mas etapas de purificacion, tales como cromatograffa no de afinidad descrita en el presente documento) o puede obtenerse

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directamente de una celula hospedadora u organismo que produce el polipeptido (por ejemplo, la composicion puede comprender Kquido de cultivo celular recogido).

Las expresiones "polipeptido" o "polipeptido de interes" o "protema de interes" y "protema diana" o "protema" se usan indistintamente y se refieren a una protemas o un polipeptido tal como un anticuerpo o inmunoconjugado (como se define en el presente documento) que debe purificarse por un metodo de la invencion a partir de una mezcla de protemas y otros materiales tales como una variante acida del polipeptido de interes.

Una "variante acida" es una variante de un polipeptido o inmunoconjugado que es mas acido (por ejemplo, como se determina por cromatograffa de intercambio cationico) que el polipeptido de interes. Un ejemplo de una variante acida es una variante desamidada.

Son protemas desamidadas las que han tenido algunos o todos los grupos funcionales amida libres hidrolizados a acidos carboxflicos, tal como conversion glutaminas a acido glutamico. La velocidad de esta reaccion depende de la secuencia primaria, estructura tridimensional, pH, temperatura, tipo de tampon, fuerza ionica y otras propiedades de solucion. Es importante destacar que la reaccion de desamidacion introduce una carga negativa en la molecula. Como se describe adicionalmente a continuacion, la desamidacion de protemas puede tener una influencia negativa en la actividad proteica.

Como se usa en el presente documento, los terminos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se usan indistintamente en el sentido mas amplio e incluyen anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales de longitud completa o intactos), anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespedficos (por ejemplo, anticuerpos biespedficos siempre que muestren la actividad biologica deseada) y fragmentos de anticuerpos como se describen en el presente documento. Se pretende que la expresion "anticuerpo biespedfico" incluya cualquier anticuerpo que tenga dos especificidades de union diferentes, es decir, el anticuerpo se une con dos epttopos diferentes, que pueden localizarse en el mismo antfgeno diana o, mas habitualmente, en diferentes antfgenos diana.

Los anticuerpos nativos e inmunoglobulinas son habitualmente glucoprotemas heterotetramericas de aproximadamente 150.000 Dalton, compuestas de dos cadenas ligeras (L) identicas y dos cadenas pesadas (H) identicas. Cada cadena ligera esta unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el numero de enlaces disulfuro vana entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera tambien tiene enlaces disulfuro intracatenarios separados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (Vh) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (dominio Vl) y un dominio constante en su otro extremo. El dominio constante de la cadena ligera esta alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera esta alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que restos de aminoacidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y pesada (Clothia et al., J. Mol. Biol. 186, 651-66, 1985); Novotny y Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4592-4596 (1985)). Se definen cinco clases de inmunoglobulina humana basandose en su composicion de cadena pesad y se denominan IgG, IgM, IgA, IgE e IgD. Los anticuerpos de clase IgG e IgA se dividen ademas en subclases, concretamente, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, e IgA1 e IgA2. Las cadenas pesadas en anticuerpos IgG, IgA e IgD tienen tres dominios de region constante, que se designan CH1, CH2 y CH3, y las cadenas pesadas en anticuerpos IgM e IgE tienen cuatro dominios de region constante, CH1, CH2, CH3 y CH4. Por lo tanto, las cadenas pesadas tienen una region variable y tres o cuatro regiones constantes. La estructura y funcion de inmunoglobulinas se revisan, por ejemplo, en Harlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Capttulo 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1988).

La expresion "fragmento de anticuerpo" se refiere a una parte de un anticuerpo intacto y se refiere a las regiones variables determinantes antigenicas de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero sin limitacion, Fab, Fab', F(ab')2, Fv y fragmentos Fv monocatenarios, anticuerpos lineales, anticuerpos monocatenarios y anticuerpos multiespedficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

La expresion "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos salvo por las posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en pequenas cantidades. Los anticuerpos monoclonales son altamente espedficos y se unen con un unico antfgeno. Asimismo, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que tfpicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epttopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un unico determinante sobre el antfgeno. Que un anticuerpo "se una de manera selectiva" o "se una de manera espedfica" significa que el anticuerpo reacciona o se asocia mas frecuentemente, mas rapidamente, con mayor duracion, con mayor afinidad o con alguna combinacion de lo anterior con un epttopo que con sustancias alternativas, incluyendo protemas no relacionadas. "Se une de manera selectiva" o "se une de manera espedfica" significa, por ejemplo, que un anticuerpo se une con una protema con una Kd de al menos aproximadamente 0,1 mM, pero mas habitualmente al menos aproximadamente 1 |jM. "Se une de manera selectiva" o "se une de manera espedfica" significa en ocasiones que un anticuerpo se une con una protema en ocasiones con una Kd de al menos 0,1 jM o mejor, y en otras ocasiones 0,01 jM o mejor. Debido a la identidad de secuencia entre protemas

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homologas en diferentes especies, la union espedfica puede incluir un anticuerpo que reconoce una protema marcadora de celulas tumorales en mas de una especie.

Los anticuerpos del presente documento incluyen espedficamente anticuerpos "quimericos" en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es identica u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos procedentes de una especie concreta o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo concreta, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es identico u homologo a secuencias correspondientes en anticuerpos procedentes de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, asf como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que muestren la actividad biologica deseada (Patente de los Estados Unidos n.° 4.816.567; y Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quimericos que contienen una secuencia minima procedente de inmunoglobulina no humana. En su mayona, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que restos de una region hipervariable del receptor se reemplazan por restos de una region hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como raton, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, se reemplazan restos de region marco conservada (FR) de la inmunoglobulina humana por restos no humanos correspondientes. Asimismo, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se efectuan para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente la totalidad de al menos uno, y tfpicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado tambien comprendera opcionalmente al menos una parte de una region constante (Fc) de inmunoglobulina, tfpicamente la de una inmunoglobulina humana. Para mas detalles, vease Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Vease tambien los siguientes artmulos de revision y referencias citadas en los mismos: Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).

Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoacidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o se ha preparado usando cualquiera de las tecnicas para preparar anticuerpos humanos desveladas en el presente documento. Esta definicion de un anticuerpo humano excluye espedficamente un anticuerpo humanizado que comprenda restos de union a antfgeno no humanos.

El termino "inmunoconjugado" o "conjugado" o "inmunotoxina" como se usa en el presente documento se refiere a un compuesto o un derivado del mismo que esta unido a un agente de union celular (por ejemplo, un anticuerpo anti- CD22 o fragmento del mismo) y se define por una formula generica: C-L-A, en la que C = citotoxina, L = enlazador y A = agente de union celular (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-CD22). Los inmunoconjugados tambien pueden definirse por la formula generica en orden inverso: A-L-C.

La expresion "citotoxina" o "agente citotoxico" como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o previene la funcion de celulas y/o provoca la destruccion de celulas. Se pretende que el termino incluya isotopos radiactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isotopos radiactivos de Lu),

agentes quimioterapeuticos, por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etoposido), doxorrubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes, enzimas y fragmentos de los mismos tales como enzimas nucleoltticas, antibioticos y toxinas tales como toxinas de moleculas pequenas o toxinas enzimaticamente activas de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos, y los diversos agentes antitumorales o antineoplasicos desvelados posteriormente. Los ejemplos de agentes citotoxicos incluyen, pero sin limitacion, abrina, ricina, exotoxina de Pseudomonas (PE), toxina difterica (DT), toxina botulfnica o toxinas modificadas de las mismas. Por ejemplo, PE y DT son compuestos altamente toxicos que tfpicamente provocan la muerte mediante toxicidad hepatica. PE y DT, sin embargo, pueden modificarse a una forma para su uso como una inmunotoxina retirando el componente de direccion nativo de la toxina (por ejemplo, dominio la de PE o la cadena B de DT) y reemplazandolo con un resto de direccion diferente, tal como un anticuerpo.

En algunas realizaciones, la toxina es exotoxina de Pseudomonas. La exotoxina A de Pseudomonas (PE) es una protema monomerica extremadamente activa (peso molecular de 66 kD), secretada por Pseudomonas aeruginosa, que inhibe la smtesis de protemas en celulas eucariotas mediante la inactivacion del factor de elongacion 2 (EF-2) catalizando su ADP-ribosilacion (catalizando la transferencia del resto de ADP ribosilo de NAD oxidado en EF-2).

La toxina contiene tres dominios estructurales que actuan en concierto para provocar citotoxicidad. El dominio la (aminoacidos 1-252) media en la union celular. El dominio II (aminoacidos 253-364) es responsable de la traslocacion al citosol y el dominio III (aminoacidos 400-613) media en la ADP ribosilacion del factor de elongacion 2, que inactiva la protema y provoca la muerte celular. La funcion del dominio Ib (aminoacidos 365-399) sigue sin estar

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definida, aunque una gran parte de el, los aminoacidos 365-380, puede suprimirse sin perdida de citotoxicidad. Vease Siegall et al., J. Biol. Chem. 264: 14256-14261 (1989).

Las exotoxinas de Pseudomonas (PE) empleadas en la presente invencion incluyen la secuencia nativa, fragmentos citotoxicos de la secuencia nativa y variantes modificadas de forma conservativa de la PE nativa y sus fragmentos citotoxicos. Los fragmentos citotoxicos de PE incluyen los que son citotoxicos con o sin procesamiento proteofftico u otro posterior en la celula diana (por ejemplo, como una protema o preprotema). Los fragmentos citotoxicos de PE incluyen PE40, PE38 y PE35. PE40 es un derivado truncado de PE como se ha descrito previamente en la tecnica. Vease, Pai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:3358-62 (1991); Kondo et al., J. Biol. Chem. 263:9470-9475 (1988). PE38 es una PE truncada compuesta de los aminoacidos 253-364 y 381-613 de PE nativa. PE35 es un fragmento carboxilo terminal de 35 kD de PE compuesto de una Met en la posicion 280 seguida de los aminoacidos 281-364 y 381-613 de PE nativa. En una realizacion, se emplea el fragmento citotoxico PE38. PE38 es una proprotema que puede activarse en su forma citotoxica tras su procesamiento dentro de una celula.

Un "inmunoconjugado de PE" o una "inmunotoxina de PE" es un inmunoconjugado o una inmunotoxina que comprende un anticuerpo o fragmento de union a anffgeno del mismo y una toxina PE o variante de la misma.

Por "purificaf un polipeptido o inmunoconjugado de una composicion que comprende el polipeptido y una o mas impurezas se entiende aumentar el grado de pureza del polipeptido en la composicion retirando (completa o parcialmente) al menos una impureza de la composicion. Segun la presente invencion, se realiza purificacion sin el uso de una etapa de cromatograffa de afinidad.

El termino "cromatograffa" se refiere al proceso por el que un soluto de interes en una mezcla se separa de otros solutos en una mezcla como resultado de diferencias en las velocidades a las que los solutos individuales de la mezcla migran a traves de un medio estacionario bajo la influencia de una fase movil o en procesos de union y elucion.

La expresion "intercambio ionico" y "cromatograffa de intercambio ionico" se refiere al proceso cromatografico en el que un soluto de interes (tal como una protema) en una mezcla interacciona con un compuesto con carga unido (tal como mediante union covalente) a un material de intercambio ionico de fase solida de modo que el soluto de interes interaccione de manera no espedfica con el compuesto con carga mas o menos que las impurezas o los contaminantes del soluto en la mezcla. Los solutos contaminantes en la mezcla se eluyen de una columna del material de intercambio ionico mas rapido o mas lento que el soluto de interes o se unen con o se excluyen de la resina en relacion con el soluto de interes. La "cromatograffa de intercambio ionico" incluye espedficamente intercambio cationico, intercambio anionico y cromatograffa de modo mixto.

La expresion "material de intercambio ionico" se refiere a una fase solida que tiene carga negativa (es decir, una resina de intercambio cationico) o carga negativa (es decir, una resinas de intercambio anionico). La carga puede proporcionarse uniendo uno o mas ligandos con carga a la fase solida, por ejemplo, mediante enlace covalente. Como alternativa, o ademas, la carga puede ser una propiedad inherente de la fase solida (por ejemplo, como sucede para el sflice, que tiene una carga general negativa).

Una "resina de intercambio anionico" se refiere a una fase solida que tiene carga positiva, que tiene por lo tanto uno o mas ligandos con carga positiva unidos a la misma. Puede usarse cualquier ligando con carga positiva unido a la fase solida adecuado para formar la resina de intercambio anionico, tal como grupos amino cuaternarios. Las resinas de intercambio anionico disponibles en el mercado incluyen DEAE celulosa, Poros PI 20, PI 50, HQ 10, HQ 20, HQ 50, D 50 de Applied Biosystems, Sartobind Q de Sartorius, MonoQ, MiniQ, Source 15Q y 30Q, Q, DEAE y ANX Sepharose Fast Flow, Q Sepharose High Performance, QAE SEPHADEX™ y FAST Q SEPHAROSE™ (GE Healthcare), WP PEI, WP DEAM, WP QUAT de J. T. Baker, Hydrocell DEAE y Hydrocell QA de Biochrom Labs Inc., UNOsphere Q, Macro-Prep DEAE y Macro-Prep High Q de Biorad, Ceramic HyperD Q, ceramic HyperD DEAE, Trisacryl M y LS DEAE, Spherodex LS DEaE, QMA Spherosil LS, QMA Spherosil M y Mustang Q de Pall Technologies, resinas anionicas de base fuerte de malla fina de tipo I y de tipo II DOWEX y DOWEX MONOSPHER E 77, anion de base debil de Dow Liquid Separations, membrana Intercept Q, Matrex Cellufine A200, A500, Q500 y Q800, de Millipore, Fractogel EMD tMaE, Fractogel EMD DEAE y Fractogel EMD DMAE de EMD, intercambiadores anionicos debiles fuertes de tipo I y II Amberlite, intercambiadores anionicos debiles y fuertes de tipo I y II DOWEX, intercambiadores anionicos debiles y fuertes de tipo I y II Diaion, Duolite de Sigma-Aldrich, TSK gel Q y DEAE 5PW y 5PW-HR, Toyopearl SuperQ-650S, 650M y 650C, QAE-550C y 650S, DEAE-650M y 650C de Tosoh, QA52, DE23, DE32, DE51, De52, DE53, Express-Ion D y Express-Ion Q de Whatman.

Por "fase solida" se entiende una matriz no acuosa a la que pueden adherirse uno o mas ligandos con carga. La fase solida puede ser una columna de purificacion, una fase discontinua de partmulas discretas, una membrana o un filtro, etc. Los ejemplos de materiales para formar la fase solida incluyen polisacaridos (tales como agarosa y celulosa); y otras matrices mecanicamente estables tales como sflice (por ejemplo, vidrio de poro controlado), poli(estirendivinil)benceno, poliacrilamida, partmulas de ceramica y derivados de cualquiera de los anteriores.

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La expresion "union espedfica", como se usa en el presente documento, tal como para describir interacciones entre una molecula de interes y un ligando unido a una matriz de fase solida, se refiere a la union en general reversible de una protema de interes con un ligando mediante los efectos combinados de complementariedad espacial de estructuras de protema y ligando en un sitio de union acoplado con fuerzas electrostaticas, enlaces de hidrogeno, fuerzas hidrofobas y/o fuerzas de Van der Waals en el sitio de union. Cuanto mayor sea la complementariedad espacial y mas fuertes sean las otras fuerzas en el sitio de union, mayor sera la especificidad de union de una protema por su ligando respectivo. Los ejemplos no limitantes de union espedfica incluyen union de anticuerpo- antigeno, union de enzima-sustrato, union de enzima-cofactor, quelacion de ion metalico, union de protema de union a ADN-ADN, interacciones de protema reguladora-protema, y similares.

La expresion "union no espedfica", como se usa en el presente documento, tal como para describir interacciones entre una molecula de interes y un ligando u otro compuesto unido a una matriz de fase solida, se refiere a la union de una protema de interes con el ligando o compuesto en una matriz de fase solida mediante fuerzas electrostaticas, enlaces de hidrogeno, fuerzas hidrofobas y/o fuerzas de Van der Waals en un sitio de interaccion, pero que carece de complementariedad estructural que potencie los efectos de las fuerzas no estructurales. Los ejemplos de interacciones no espedficas incluyen, pero sin limitacion, fuerzas electrostaticas, hidrofobas y de van der Waals asf como enlaces de hidrogeno.

Una "sal" es un compuesto formado por la interaccion de un acido y una base. Una sal util en para la invencion incluye, pero sin limitacion, acetato (por ejemplo, acetato de sodio), citrato (por ejemplo, citrato de sodio), cloruro (por ejemplo, cloruro de sodio), sulfato (por ejemplo, sulfato de sodio) o una sal de potasio.

El termino "detergente" se refiere a tensioactivos ionicos y no ionicos tales como polisorbatos (por ejemplo, polisorbatos 20 u 80); poloxameros (por ejemplo, poloxamero 188); Triton; dodecil sulfato de sodio (SDS); lauril sulfato de sodio; octil glucosido de sodio; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sulfobetama; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sarcosina; linoleil-, miristil- o cetil-betama; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil- o isoestearamidopropil-betama (por ejemplo, lauroamidopropilo); miristamidopropil- , palmidopropil- o isoestearamidopropil-dimetilamina; metil cocoil-taurato de sodio o metil oleoil-taurato de disodio; y la serie MONAQUAT™ (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), Un detergente util es un polisorbato, tal como polisorbato 20 (TWEEN 20®) o polisorbato 80 (TWEEN 80®).

Un "tampon" usado en la presente invencion es una solucion que resiste cambios de pH por la adicion de acido o base mediante la accion de sus componentes de conjugados de acido-base. Pueden emplearse diversos tampones en un metodo de la presente invencion dependiendo del pH deseado del tampon y la etapa particular en el proceso de purificacion [vease Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation (1975)]. Los ejemplos no limitantes de componentes de tampon que pueden usarse para controlar el intervalo de pH deseable para un metodo de la invencion incluyen acetato, citrato, histidina, fosfato, tampones de amonio tales como acetato de amonio, succinato, MES, CHAPS, MOPS, MOPSO, HEPES, Tris, y similares, asf como combinaciones de estos TRIS-acido malico-NaOH, maleato, cloroacetato, formiato, benzoato, propionato, piridina, piperazina, ADA, PIPES, ACES, BES, TES, tricina, bicina, TAPS, etanolamina, CHES, CAPS, metilamina, piperidina, acido O-borico, acido carbonico, acido lactico, acido butanodioico, acido dietilmalonico, glicilglicina, HEPPS, HEPPSO, imidazol, fenol, POPSO, succinato, TAPS, basado en amina, bencilamina, trimetil o dimetil o etil o fenil amina, etilendiamina o morfolina. Pueden estar presentes componentes adicionales (aditivos) en un tampon segun sea necesario, por ejemplo, pueden usarse sales para ajustar la fuerza ionica del tampon, tales como cloruro de sodio, sulfato de sodio y cloruro de potasio; y otros aditivos tales como aminoacidos (tales como glicina e histidina), caotropos (tales como urea), alcoholes (tales como etanol, manitol, glicerol y alcohol bendlico), detergentes (vease anteriormente) y azucares (tales como sacarosa, manitol, maltosa, trehalosa, glucosa y fructosa). Los componentes de tampon y aditivos, y las concentraciones usadas, pueden variar segun el tipo de cromatograffa practicada en la invencion.

El "tampon de carga" es el que se usa para cargar la composicion que comprende la molecula polipeptfdica de interes y una o mas impurezas en la resina de intercambio ionico. El tampon de carga tiene una conductividad y/o un pH tal que la molecula polipeptfdica de interes (y en general una o mas impurezas) esta/n unida/s a la resina de intercambio ionico o de modo que la protema de interes fluya a traves de la columna mientras que las impurezas se unen con la resina.

La expresion "tampon de lavado" cuando se usa en el presente documento se refiere a un tampon usado para lavar o reequilibrar la resina de intercambio ionico, antes de eluir la molecula polipeptfdica de interes. De manera practica, el tampon de lavado y el tampon de carga pueden ser el mismo, pero esto no es necesario.

El "tampon de elucion" se usa para eluir el polipeptido de interes de la fase solida. La conductividad y/o el pH del tampon de elucion es/son tales que el polipeptido de interes se eluye de la resina de intercambio ionico.

El "pI" o "punto isoelectrico" de un polipeptido se refiere al pH al que la carga positiva del polipeptido equilibra su carga negativa, el pI puede calcularse a partir de la carga neta de los restos de aminoacidos o restos de acido sialico de carbohidratos unidos del polipeptido o puede determinarse por isoelectroenfoque.

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Por "union" de una molecula con un material de intercambio ionico se entiende exponer la molecula al material de intercambio ionico en las condiciones apropiadas (pH/conductividad) de modo que la molecula se inmovilice de forma reversible en o sobre el material de intercambio ionico en virtud de interacciones ionicas entre la molecula y un grupo con carga o grupos con carga del material de intercambio ionico.

Por "lavar" el material de intercambio ionico se entiende pasar un tampon apropiado a traves de o sobre el material de intercambio ionico.

Se entiende que "eluir" una molecula (por ejemplo, polipeptido o impureza) de un material de intercambio ionico retira la molecula del mismo alterando la fuerza ionica del tampon que rodea el material de intercambio ionico de modo que el tampon compite con la molecula por los sitios con carga en el material de intercambio ionico.

Como se usa en la presente divulgacion y las reivindicaciones, las formas singulares "un", "una", y "el" o "la" incluyen formas plurales salvo que el contexto dicte claramente otra cosa.

Se entiende que siempre que se describan realizaciones en el presente documento con la expresion "que comprende", tambien se proporcionan realizaciones por lo demas analogas descritas con expresiones de "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en".

Se pretende que la expresion "y/o" como se usa en una frase tal como "A y/o B" en el presente documento incluya "A y B", "A o B", "A", y "B". De forma similar, se pretende que la expresion "y/o" como se usa en una frase tal como "A, B y/o C" abarque cada una de las siguientes realizaciones: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).

Exotoxina de Pseudomonas y otras toxinas

Las toxinas pueden emplearse con anticuerpos de la presente invencion para producir inmunotoxinas. Las toxinas ejemplares incluyen ricina, abrina, toxina difterica y subunidades de la misma, asf como toxinas botulmicas A a F. Estas toxinas estan disponibles facilmente en fuentes comerciales (por ejemplo, Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.). La toxina difterica se afsla de Corynebacterium diphtheriae. La ricina es la lectina RCA60 de Ricinus communis (ricino). La expresion tambien hace referencia a variantes toxicas de la misma. Por ejemplo, vease, Patentes de los Estados Unidos n.° 5.079.163 y 4.689.401. La aglutinina de Ricinus communis (RCA) aparece en dos forma designadas RCA60 y RCA120 segun sus pesos moleculares de aproximadamente 65 y 120 kD, respectivamente (Nicholson y Blaustein, J. Biochem. Biophys. Acta 266:543 (1972)). La cadena A es responsable de inactivar la smtesis de protemas y destruir celulas. La cadena B une ricina con restos de galactosa de la superficie celular y facilita el transporte de la cadena A al citosol (Olsnes, et al., Nature 249:627-631 (1974) y Patente de los Estados Unidos n.° 3.060.165).

La abrina incluye lectinas toxicas de Abrus precatorius. Los principios toxicos, abrina a, b, c y d, tienen un peso molecular de aproximadamente 63 a 67 kD y estan compuestos de dos cadenas polipeptfdicas unidas por enlaces disulfuro A y B. La cadena A inhibe la smtesis de protemas; la cadena B (abrina b) se une con restos de D-galactosa (vease, Funatsu, et al., Agr. Biol. Chem. 52:1095 (1988); y Olsnes, Methods Enzymol. 50:330-335 (1978)).

En realizaciones preferidas de la presente invencion, la toxina es exotoxina de Pseudomonas (PE). La exotoxina de Pseudomonas (o exotoxina A) es una exotoxina producida por Pseudomonas aeruginosa. La expresion "exotoxina de Pseudomonas" como se usa en el presente documento se refiere a una PE nativa (de origen natural) de longitud completa o una PE que se ha modificado. Tales modificaciones pueden incluir, pero sin limitacion, eliminacion del dominio la, diversas supresiones de aminoacidos en los dominios Ib, II y III, sustituciones de aminoacidos individuales y la adicion de una o mas secuencias en el extremo carboxilo terminal tales como KDEL (SEQ ID NO: 3) y REDL (SEQ ID NO: 4). Vease Siegall, et al., J. Biol. Chem. 264:14256-14261 (1989). En una realizacion preferida, el fragmento citotoxico de PE conserva al menos 50 %, preferentemente 75 %, mas preferentemente al menos 90 % y mas preferentemente 95 % de la citotoxicidad de PE nativa. En una realizacion mas preferida, el fragmento citotoxico es mas toxico que PE nativa.

La exotoxina A de Pseudomonas (PE) nativa es una protema monomerica extremadamente activa (peso molecular de 66 kD), secretada por Pseudomonas aeruginosa, que inhibe la smtesis de protemas en celulas eucariotas. La secuencia de PE nativa se proporciona en la patente de los Estados Unidos de cesion comun n.° 5.602.095. El metodo de accion es inactivacion de la ADP ribosilacion del factor de elongacion 2 (EF-2). La exotoxina contiene tres dominios estructurales que actuan en concierto para provocar citotoxicidad. El dominio Ia (aminoacidos 1-252) media en la union celular. El dominio II (aminoacidos 253-364) es responsable de la traslocacion al citosol y el dominio III (aminoacidos 400-613) media en la ADP ribosilacion del factor de elongacion 2. La funcion del dominio Ib (aminoacidos 365-399) sigue sin estar definida, aunque una gran parte de el, los aminoacidos 365-380, puede suprimirse sin perdida de citotoxicidad. Vease Siegall, et al, (1989), mencionado anteriormente.

Las PE empleadas en la presente invencion incluyen la secuencia nativa, fragmentos citotoxicos de la secuencia nativa y variantes modificadas de forma conservativa de la PE nativa y sus fragmentos citotoxicos. Se describen

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variantes de PE utiles en la invencion en los documentos US 7.355.012 y WO 2007/016150 y WO 2009/032954. Los fragmented citotoxicos de PE incluyen los que son citotoxicos con o sin procesamiento proteolttico u otro posterior en la celula diana (por ejemplo, como una proterna o preprotema). Los fragmentos citotoxicos de PE incluyen PE40, PE38 y PE35.

En realizaciones preferidas, la PE se ha modificado para reducir o eliminar la union celular inespedfica, frecuentemente suprimiendo el dominio la como se ensena en la patente de los Estados Unidos n.° 4.892.827, aunque esto tambien puede conseguirse, por ejemplo, mutando determinados restos del dominio la. La patente de los Estados Unidos n.° 5.512.658, por ejemplo, desvela que una PE mutada en la que esta presente el dominio la pero en la que los restos basicos del dominio la en las posiciones, 57, 246, 247 y 249 se reemplazan con restos acidos (acido glutamico o "E") muestra citotoxicidad no espedfica muy disminuida. Esta forma mutante de PE se denomina en ocasiones PE4E.

PE40 es un derivado truncado de PE como se ha descrito previamente en la tecnica, con una supresion del dominio la de la molecula de PE nativa. Vease, Pai, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:3358-62 (1991); y Kondo, et al., J. Biol. Chem. 263:9470-9475 (1988). PE35 es un fragmento carboxilo terminal de 35 kD de PE en el que los restos de aminoacidos 1-279 se han suprimido y la molecula comienza con una Met en la posicion 280 seguida de los aminoacidos 281-364 y 381-613 de PE nativa. Se desvelan PE35 y PE40, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos n.° 5.602.095 y 4.892.827. PE4E es una forma de PE donde todos los dominios de PE nativa estan presentes, pero donde los restos basicos del dominio la en las posiciones 57, 246, 247 y 249 se reemplazan con restos acidos (acido glutamico o "E").

En algunas realizaciones preferidas, se emplea el fragmento citotoxico PE38. PE38 es una proproterna de PE truncada compuesta de los aminoacidos 253-364 y 381-613 que se activa en su forma citotoxica tras su procesamiento en una celula (vease, por ejemplo, patentes de los Estados Unidos n.° 5.608.039, 7.355.012 y Pastan et al., Biochim. Biophys. Acta 1333:C1-C6 (1997)).

Como se ha observado anteriormente, parte o la totalidad del dominio lb puede suprimirse, y las partes restantes unirse por un enlazador o directamente por un enlace peptfdico. Puede suprimirse algo de la parte amino del dominio ll. Ademas, el extremo C terminal puede contener la secuencia nativa de los restos 609-613 (REDLK) (SEQ lD NO: 5) o puede contener una variacion que se ha descubierto que mantiene la capacidad de la construccion para traslocarse al citosol, tal como REDL (SEQ lD NO: 4) o KDEL (SEQ lD NO: 3) y repeticiones de estas secuencias. Vease, por ejemplo, patentes de los Estados Unidos n.° 5.854.044; 5.821.238; y 5.602.095 y WO 99/51643. Aunque en realizaciones preferidas, la PE es PE4E, PE40 o PE38, cualquier forma de PE en la que la citotoxicidad inespedfica se haya eliminado o reducido hasta niveles en los que no se produzca toxicidad significativa a celulas no diana puede usarse en las inmunotoxinas de la presente invencion siempre que siga teniendo capacidad de traslocacion y ribosilacion de EF-2 en una celula diana.

Variantes modificadas de forma conservativa de PE

Las variantes modificadas de forma conservativa de PE o fragmentos citotoxicos de las misma tienen al menos 80 % de similitud de secuencias, preferentemente al menos el 85 % de similitud de secuencias, mas preferentemente al menos 90 % de similitud de secuencias y mas preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencias al nivel de aminoacidos, con la PE de interes, tal como PE38.

La expresion "variantes modificadas de forma conservativa" se aplica a secuencias tanto de aminoacidos como de acido nucleico. Con respecto a secuencias de acidos nucleicos concretas, variantes modificadas de forma conservativa se refieren a las secuencias de acido nucleico que codifican secuencias de aminoacidos identicas o esencialmente identicas, o si el acido nucleico no codifica una secuencia de aminoacidos, a secuencias de acido nucleico esencialmente identicas. Debido a la degeneracion del codigo genetico, un gran numero de acidos nucleicos funcionalmente identicos codifican cualquier polipeptido dado. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoacido alanina. Por lo tanto, en cada posicion donde una alanina se especifica mediante un codon, el codon se puede alterar a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipeptido codificado. Dichas variaciones de acido nucleico son "variaciones silenciosas", que son un tipo de variaciones modificadas de forma conservativa. Cada secuencia de acido nucleico del presente documento que codifica un polipeptido tambien describe todas las posibles variaciones silenciosas del acido nucleico. Un experto en la materia reconocera que cada codon en un acido nucleico (excepto AUG, que es habitualmente el unico codon para metionina) puede modificarse para producir una molecula funcionalmente identica. En consecuencia, cada variacion silenciosa de un acido nucleico que codifica un polipeptido esta implteita en cada secuencia descrita.

Con respecto a secuencias de aminoacidos, un experto reconocera que las sustituciones, supresiones o adiciones individuales a una secuencia de acido nucleico, peptido, polipeptido o proterna que altere, anada o elimine un unico aminoacido o un pequeno porcentaje de aminoacidos en la secuencia codificada es una "variante modificada conservativamente" donde la alteracion da como resultado la sustitucion de un aminoacido con un aminoacido qmmicamente similar.

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Las exotoxinas de Pseudomonas empleadas en la invencion pueden ensayarse con respecto al nivel deseado de citotoxicidad mediante ensayos bien conocidos por los expertos en la materia. Por lo tanto, los fragmented citotoxicos de PE y variantes modificadas de forma conservativa de dichos fragmentos pueden ensayarse facilmente con respecto a citotoxicidad. Puede ensayarse un gran numero de moleculas de PE candidatos simultaneamente con respecto a citotoxicidad por metodos bien conocidos en la materia. Por ejemplo, pueden ensayarse subgrupos de las moleculas candidatas con respecto a citotoxicidad. Los subgrupos de reaccion positiva de las moleculas candidatas pueden subdividirse de forma continua y volver a ensayarse hasta que se identifiquen el fragmento o los fragmentos citotoxicos deseados. Dichos metodos permiten la exploracion rapida de grandes numeros de fragmentos citotoxicos o variantes conservativas de PE.

Inmunoconjugados de anti-CD22/PE

En una realizacion, el polipeptido de interes comprende un anticuerpo que se une de manera espedfica con CD22. "CD22" se refiere a un antfgeno de linfocitos B restringido al linaje que pertenece a la superfamilia de Ig. Se expresa en el 60-70 % de linfomas de linfocitos B y leucemias y no esta presente en la superficie celular en estadios tempranos del desarrollo de linfocitos B o en celulas madre. Vease, por ejemplo, Vaickus et al., Crit. Rev. Oncol/Hematol. 11:267-297 (1991). En otra realizacion, el polipeptido de interes es un fragmento de anticuerpo que se une con CD22 (por ejemplo, Fab o scFv).

Como se usa en el presente documento, la expresion "anti CD22" en referencia a un anticuerpo, se refiere a un anticuerpo que se une espedficamente con CD22 e incluye referencia a un anticuerpo que se genera contra CD22. En algunas realizaciones, el CD22 es un CD22 de primate tal como CD22 humano. En una realizacion, el anticuerpo se genera contra CD22 humano sintetizado por un mairnfero no primate despues de la introduccion en el animal de ADNc que codifica CD22 humano. En una realizacion adicional, el polipeptido de interes es un inmunoconjugado de anticuerpo CD22 que comprende la exotoxina PE38.

Un ejemplo de un inmunoconjugado de CD22/PE38 es CAT-8015 descrito en las publicaciones de solicitud de patente internacional n.° WO 98/41641 y WO2003/27135, las patentes de los Estados Unidos n.° 7.541.034,

7.355.012 y la publicacion de los Estados Unidos n.° 2007/0189962. CAT-8015 es una protema de inmunotoxina recombinante compuesta de un fragmento Fv de anticuerpo basado en el anticuerpo anti-CD22 murino RFB4 fusionado con una forma truncada de la protema de exotoxina de Pseudomonas, PE38. El fragmento Fv anti CD22 consiste en dos dominios, un Vl y Vh, donde este ultimo se modifico para mejorar la union con la diana de CD22 humano. La protema CAT-8015 esta comprendida por dos polipeptidos independientes, la cadena Vl (SEQ ID NO: 2) y la cadena Vh, fusionados en el extremo C terminal con el dominio PE38 (Vh-PE38) (SEQ ID NO:1). Otras secuencias de VL y VH-PE38 utiles en la presente invencion se describen en los documentos US 7.541.034,

7.355.012 y 2007/0189962. Ambos dominios se disenaron para contener cada uno restos de cistema modificados tecnicamente que permiten la formacion de un enlace disulfuro intermolecular. Esta caractenstica aumenta la estabilidad de la protema de fusion.

La secuencia de aminoacidos de la subunidad Vh-P38 (SEQ ID NO: 1) de CAT-8015 es la siguiente:

MEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMSWVRQTPEKCLEWV

AYISSGGGTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEQTAMYYCA

rhsgygthwgvlfaywgqgtlvtvsakasggpeggslaaltahqachlp

LE T F T RHRQP RGWEQ LE QC GY PVQRLVALY LAARL S WNQ VD QVIRNALA SPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAANGP ADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEE RGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYG YAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVER LIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTWIPSAIPTDPRNV GGDLDPSSIPDKEQAISAIiPDYASQPGKPPREDLK (SEQ ID NO:l)

La secuencia de PE38 se muestra en negrita y el enlazador de cinco aminoacidos entre el dominio Vh y el dominio PE38 se muestra subrayado.

La secuencia de aminoacidos de la subunidad Vl (SEQ ID NO: 2) de CAT-8015 es la siguiente:

MDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLI YYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGNTLPWT FGCGTKLEIK (SEQ ID NO:2)

En realizaciones adicionales, la secuencia de aminoacidos del dominio VH del inmunoconjugado es una de las siguientes:

MEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMSWVRQTPEKCLEWV AYISSGGGTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCA RHSGYGTHWGVLFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO:6)

MEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMSWVRQTPEKCLEWV AYISSGGGTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCA RHSGYGYNWGVLFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO:7)

MEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMSWVRQTPEKCLEWV AYISSGGGTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCA RHSGYGTTWGVLFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO:8)

MEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMSWVRQTPEKCLEWV AYISSGGGTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCA RHSGYGSTYGVLFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO:9)

MEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMSWVRQTPEKCLEWV AYISSGGGTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCA RHSGYGTHWGVLFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO:10)

MEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMSWVRQTPEKCLEWV

AYISSGGGTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCA

RHSGYGSSYGVLFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO:11)

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En realizaciones adicionales, la secuencia de aminoacidos del dominio VL del inmunoconjugado es una de las siguientes:

MDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIARYLNWYQQKPDGTVKLLI YYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGNTLPWT FGCGTKLEIK (SEQ ID NO:12)

MDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIHGYLNWYQQKPDGTVKLLI YYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGNTLPWT FGCGTKLEIK (SEQ ID NO:13)

MDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIGRYLNWYQQKPDGTVKLLI YYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGNTLPWT FGCGTKLEIK (SEQ ID NO:14)

MDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRGYLNWYQQKPDGTVKLLI YYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGNTLPWT FGCGTKLEIK (SEQ ID NO:15)

En otras realizaciones determinadas, la toxina PE del inmunoconjugado es una PE o variante de la misma seleccionada de las siguientes:

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PE nativa

AEEAFDLWNECAKACVLDLKDGVRSSRMSVDPAIADTNGQGVLHYSMVL

eggndalklaidnalsitsdgltirleggvepnkpvrysytrqargsws

LNWLVPIGHEKPSNIKVFIHELNAGNQLSHMSPIYTIEMGDELLAKLAR DATFFVRAHESNEMQPTLAISHAGVSWMAQTQPRREKRWSEWASGKVL CLLDPLDGVYNYLAQQRCNLDDTWEGKIYRVLAGNPAKHDLDIKPTVIS HRLHFPEGGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRL VALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLA AAESERFVRQGTGNDEAGAANGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVS FSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRA RSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRS SLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETI LGWPLAERTWIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQP GKPPREDLK (SEQ ID NO:16)

10 PE40

GGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAAR

LSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVR

QGTGNDEAGAANADWSLTCPVAAGECAGPADSGDALLERNYPTGAEFLG

DGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVF

GGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVY

VPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRL

ETILGWPLAERTWIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYAS QPGKPPREDLK (SEQ ID NO:17)

PE38

GGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAAR LSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVR QGTGNDEAGAANGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWT VERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRG FYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSETL AAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTWIP SAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK (SEQ ID NO:18)

PE35

MWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAI REQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAANGPADSGDALLERNYP TGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLE AAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRN GALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGP EEEGGRLETILGWPLAERTWIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAIS 5 AAFDYASQPGKFiOANG.K ; RKQ I D

PE-LR

RHRQPRGWEQLPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERG YVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQ DQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGH PLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTWIPSAIPTDPRNVGGDLD PSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK (SEQ ID NO:20)

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PE-LR-6X

RHRQPRGWEQLPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEEGG

YVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWAGFYIAGDPALAYGYAQ

DQEPDAAGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYATSLTLAAPEAAGEVERLIGH

PLPLRLDAITGPEEAGGRLETILGWPLAERTWIPSAIPTDPRNVGGDLD PSSIPDSEQAISAIPDYASQPGKPPREDLK (SEQ ID NO:21)

15 PE-38 (CAT-8015)

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PEGGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLA ARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERF VRQGTGNDEAGAANGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQN WTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIW RGFYIAGDP ALAY GYAQDQEPDARGRIRN GALLRVYVPRS SLPGFYRTSL TLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVV IPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK (SEQ ID NO:22}

La toxina PE del inmunoconjugado se fusiona o conjuga con el dominio VH o VL directamente o mediante un enlazador en el extremo N o el extremo C del dominio VH o VL. Un ejemplo de un enlazador se ha descrito anteriormente para CAT-8015 y corresponde a la secuencia de aminoacidos KASGG (SEQ ID NO: 23). Los enlazadores adicionales pueden generarse facilmente por tecnicas conocidas en este campo.

Expresion de un inmunoconjugado de PE

El inmunoconjugado de PE empleado en la presente invencion se expresa en celulas, tales como celulas bacterianas, y despues se afsla de cuerpos de inclusion. El inmunoconjugado de PE aislado de cuerpos de inclusion se purifica adicionalmente despues usando etapas de purificacion corriente abajo.

Puede utilizarse una diversidad de sistemas de vectores de expresion-hospedador para expresar el inmunoconjugado de PE empleado en la presente invencion. Dichos sistemas de expresion-hospedador representa vehnculos por los que las secuencias codificantes de interes pueden producirse y purificarse posteriormente, pero tambien representan celulas que pueden, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes de nucleotidos apropiadas, expresan una molecula de anticuerpo desvelada con la presente in situ. Estos incluyen, pero sin limitacion, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas con vectores de ADN de bacteriofago recombinante, ADN plasirndico o aDn cosmfdico que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; levadura (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadas con vectores de expresion de levadura recombinante que contienen secuencias codificantes de anticuerpo; sistemas de celulas de insecto infectadas con vectores de expresion de virus recombinante (por ejemplo, baculovirus) que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de celulas vegetales infectados con vectores de expresion de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico de la coliflor, TMV) o transformados con vectores de expresion de plasmidos recombinantes que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; o sistemas de celulas de mai^ero (por ejemplo, celulas COS, CHO, BLK, 293, 3T3) que albergan construcciones de expresion recombinante que contienen promotores procedentes del genoma de celulas de mai^ero (por ejemplo, promotor de metalotionema) o de virus de mai^ero (por ejemplo, el promotor tardfo de adenovirus; el promotor de 7,5 K de virus vaccinia).

Se introduce ADN que codifica cada uno de los polipeptidos de toxina PE-VH y VL (por ejemplo, VH-PE38) en un vector de expresion por tecnicas bien conocidas en este campo.

Un "vector" se refiere a cualquier vehfculo para la clonacion y/o transferencia de un acido nucleico en una celula hospedadora. Un vector puede ser un replicon al que puede unirse otro segmento de ADN para provocar la replicacion del segmento unido. Un "replicon" se refiere a cualquier elemento genetico (por ejemplo, plasmido, fago, cosmido, cromosoma, virus) que actua como una unidad autonoma de replicacion de ADN in vivo, es decir, con capacidad de replicacion bajo su propio control. El termino "vector" incluye vehfculos para introducir el acido nucleico en una celula in vitro, ex vivo o in vivo. Puede usarse un gran numero de vectores conocidos en la tecnica para manipular acidos nucleicos, incorporar elementos de respuesta y promotores, tales como promotores inducibles, en genes, etc. Posibles vectores incluyen, por ejemplo, plasmidos tales como pBR322 o derivados plasmfdicos de pUC o el vector Bluescript. Por ejemplo, la insercion de los fragmentos de ADN correspondientes a elementos de respuesta y promotores en un vector adecuado puede realizarse ligando los fragmentos de ADN apropiados en un vector elegido que tiene extremos cohesivos complementarios. Como alternativa, los extremos de las moleculas de ADN pueden modificarse enzimaticamente o puede producirse cualquier sitio ligando secuencias de nucleotidos (enlazadores) en los extremos de ADN. Dichos vectores pueden modificarse tecnicamente para contener genes marcadores seleccionables que posibilitan la seleccion de celulas. Dichos marcadores permiten la identificacion y/o seleccion de celulas hospedadoras que expresan las protemas codificadas por el marcador.

La expresion "vector de expresion" se refiere a un vector, plasmido o vehfculo disenado para permitir la expresion de una secuencia de acido nucleico insertada despues de transformacion en el hospedador. El gen clonado, es decir, la

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secuencia de acido nucleico insertada, por ejemplo, un gen que codifica un VH anti CD22, VL anti-CD22 o VH anti- CD22 o VL fusionado con una toxina PE, se situa habitualmente bajo el control de elementos de control tales como un promotor, un promotor mmimo, un potenciador o similares. Las regiones de control del inicio o promotores, que son utiles para conducir la expresion de un acido nucleico en la celula hospedadora deseada son numerosos y conocidos para los expertos en la materia. Practicamente cualquier promotor capaz de conducir la expresion de estos genes puede usarse en un vector de expresion, incluyendo, pero sin limitacion, promotores vfficos, promotores bacterianos, promotores animales, promotores mairnferos, promotores sinteticos, promotores constitutivos, promotores espedficos de tejido, promotores relacionados con patogenia o enfermedad, promotores espedficos del desarrollo, promotores inducibles, promotores regulados por luz; incluyendo, pero sin limitacion, la region promotora temprana de SV40 (SV40), el promotor contenido en la repeticion terminal larga (LTR) 3' del virus del sarcoma de Rous (RSV), el E1A o promotor tardfo principal (MLP) de adenovirus (Ad), el promotor inmediato temprano de citomegalovirus (CMV) humano, el promotor de timidina quinasa (TK) del virus del herpes simple (VHS), el promotor de IE1 de baculovirus, el promotor del factor de elongacion 1 alfa (EF1), el promotor de la gliceraldeddo -3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), el promotor de la fosfoglicerato quinasa (PGK), el promotor de la ubiquitina C (Ube), el promotor de la albumina, las secuencias reguladoras de las regiones promotora de metalotionema L y de control de la transcripcion, los promotores ubicuos (HPRT, vimentina, p-actina, tubulina y similares), los promotores de los filamentos intermedios (desmina, neurofilamentos, queratina, GFAP y similares), los promotores de genes terapeuticos (del tipo MDR, CFTR o de factor VIII y similares), promotores relacionados con patogenia o enfermedad. Ademas, estas secuencias de expresion pueden modificarse mediante la adicion de secuencias potenciadoras o reguladoras y similares.

El termino "expresion" se refiere a la produccion biologica de un producto codificado por una secuencia codificante. En la mayona de los casos una secuencia de ADN, que incluye la secuencia codificante, se transcribe para formar un ARN mensajero (ARNm). El ARN mensajero se traduce despues para formar un producto polipepffdico que tiene una actividad biologica relevante. Ademas, el proceso de expresion puede implicar ademas etapas de procesamiento para el producto de ARN de transcripcion, tales como corte y empalme para retirar intrones y/o procesamiento postraduccional de un producto polipepffdico.

Los polipeptidos de VL y VH-PE38 se expresan en celulas, por ejemplo, celulas bacterianas, tales como E. coli. Los polipeptidos se expresan, por ejemplo, en celulas de E. coli y despues se afslan de cuerpos de inclusion. En determinadas realizaciones, las subunidades de VL y VH-PE38 se expresan en diferentes celulas. Por ejemplo, el VL se expresa en una celula en un primer vector y el VH-PE38 se expresa en una celula diferente en un segundo vector. Se recuperan y solubilizan cuerpos de inclusion de cada ffnea celular. En determinadas realizaciones, los cuerpos de inclusion se solubilizan a un pH en un intervalo de aproximadamente 9,0 a aproximadamente 10,5. En realizaciones adicionales, los cuerpos de inclusion se solubilizan a un pH de 9,0, a un pH de 9,5, a un pH de 10,0 o un pH de 10,5. Los cuerpos de inclusion de VL y VH-PE38 solubilizados se combinan para formar un inmunoconjugado que comprende las subunidades de VL y VH-PE38.

En otras realizaciones, las subunidades de VL y VH-PE38 se expresan en la misma celula en diferentes vectores, por ejemplo, el VL se expresa en una celula en un primer vector y el VH-PE38 se expresa en la misma celula en un vector diferente. Se recuperan cuerpos de inclusion de la celula, se solubilizan y las subunidades de VL y VH-PE38 se combinan para formar un inmunoconjugado. En otras realizaciones determinadas, las subunidades de VL y VH- PE38 se expresan en el mismo vector en la misma celula.

Se utilizan etapas de cromatograffa corriente abajo para purificar adicionalmente este inmunoconjugado.

Condiciones de cromatograffa

Como se aprecia en la tecnica, las condiciones de carga, lavado y elucion para su uso en la cromatograffa de la invencion dependeran de los medios/ligandos de cromatograffa espedficos usados. El proceso de la invencion puede, por supuesto, usarse en combinacion con otras metodologfas de purificacion de protemas, tales como precipitacion salina, cromatograffa de afinidad, cromatograffa de hidroxiapatita, cromatograffa ffquida de fase inversa o cualquier otra tecnica de purificacion de protemas usada habitualmente. Se contempla, sin embargo, que el proceso de la presente invencion eliminara o reducira significativamente la necesidad de otras etapas de purificacion.

Tambien se realiza cromatograffa de intercambio anionico durante la separacion cromatografica del polipeptido de interes. Como es bien sabido en la tecnica, los intercambiadores anionicos pueden basarse en diversos materiales con respecto a la matriz asf como los grupos con carga unidos. Por ejemplo, pueden usarse las siguientes matrices, en las que los materiales mencionados pueden estar mas o menos reticulados: basados en agarosa (tales como SEPHaRoSE Fast Flow® (tales como Q-SEPHAROSE FF) y SEPHAROSE High Performance®; basados en celulosa (tales como DEAE SEPHACEL®); basados en sflice y basados en poffmeros sinteticos, o resinas tales como SuperQ-650 (de TOSOH BIOSEP) y Macro High Q (de BIO-RAD). Para la resina de intercambio anionico, los grupos con carga que se unen covalentemente con la matriz pueden, por ejemplo, ser dietilaminoetilo (DEAE), aminoetilo cuaternario (QAE) y/o amonio cuaternario (Q). En determinadas realizaciones, la resina se selecciona entre el grupo que incluye, pero sin limitacion, Q Sepharose High Performance, Q Sepharose Fast Flow, DEAE

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Sepharose Fast Flow, Capto Q, Capto DEAE, Toyopearls SuperQ 650 (M), Toyopearls SuperQ 650 (S), Toyopearls DEAE 650 (M), Toyopearls DEAE 650 (S), TSKgel SuperQ-5PW (30), TSKgel SuperQ-5PW (20), TSKgel DEAE- 5PW (30), TSKgel DEAE-5PW (20), EMD Chemicals: Fractogel EMD DEAE (S), Fractogel EMD DEAE (M), Fractogel EMD DMAE (S), Fractogel EMD DMAE (M), Fractogel EMD TMAE (S), Fractogel EMD TMAE (M) y Baker Bond XWP500 PolyQuat-35, SPE. En una realizacion del presente proceso, la resina de intercambio anionico empleada es Q-SEPHAROSE FF®.

Aunque cualquiera de estas resinas puede usarse para purificacion a pequena escala de anticuerpos, las resinas de determinado tamano y menor coste son susceptibles a separacion de escala de fabricacion. Si el tamano de la resina es demasiado pequeno, se genera contrapresion considerable generada en el sistema. Ademas, la cantidad del polipeptido que puede purificarse esta limitada. Si la resina es costosa de producir o comprar, no es economicamente factible/practica para su uso en la purificacion a gran escala.

Por lo tanto, la resina usada en la presente invencion debe ser de un determinado tamano para proporcionar aumento de escala eficaz sin ser prohibitivamente caro. La "purificacion en el nivel de fabricacion" significa purificacion de anticuerpos de una preparacion recombinante en una escala que alcanza la produccion a escala comercial. La resina usada en la etapa de predeterminacion debena ser igual que la usada en el protocolo final para purificacion en el nivel de fabricacion debido a que no se puede predecir facilmente la variacion en condiciones necesarias para separar los agregados si se cambia la resina. Una resina particular que es util en purificacion a pequena escala o de sobremesa puede no ser susceptible de purificacion a gran escala. Dichas resinas utiles para la presente invencion incluyen, por ejemplo, Q-SEPHAROSE HP. Sin embargo, el experto en la materia reconocena otras resinas de intercambio anionico utiles para produccion a escala comercial.

El volumen de resina usado cuando se empaqueta una columna de cromatograffa de intercambio anionico es reflejado por las dimensiones de la columna, es decir, el diametro de la columna y la altura de la resina, y vana dependiendo de, por ejemplo, la cantidad de anticuerpo en la solucion aplicada y la capacidad de union de la resina usada.

Antes de realizar una cromatograffa de intercambio anionico, la resina de intercambio puede equilibrarse con un tampon. Cualquiera de una diversidad de tampones son adecuados para el equilibrado de resina de intercambio, por ejemplo, acetato de sodio, fosfato de sodio, TRIS(hidroximetil)aminometano, TRIS, fosfato, bis-TRIS y L-histidina. Los expertos en la materia apreciaran que pueden usarse numerosos otros tampones para el equilibrado siempre que el pH y la conductividad sean aproximadamente iguales que para la solucion de anticuerpo aplicada. Cuando se realiza el proceso de "union-depuracion", los tampones de equilibrado y los tampones de lavado son los mismos. Cuando se realiza el proceso de "union-elucion", los tampones de elucion pueden componerse de una o mas sustancias tamponantes para controlar el pH. La sal utilizada es, por ejemplo, una sal altamente soluble, tal como cloruro de sodio o fosfato de potasio, pero puede usarse cualquier sal que mantenga la funcionalidad del anticuerpo y permite la retirada del monomero del anticuerpo de la resina.

Al realizar el proceso de "union-elucion", la elucion de los monomeros de anticuerpos de la resina puede realizarse con un tampon sustancialmente no desnaturalizante que tiene un pH y una fuerza ionica suficientes para eluir eficazmente el anticuerpo monomerico, recuperando de este modo un eluato que contiene el anticuerpo, dejando al mismo tiempo los agregados unidos a la resina. En este contexto, la elucion eficaz significa que al menos 75 %, o al menos 80 %, o al menos 85 %, o al menos 90 % o al menos 95 % del anticuerpo cargado en la resina se recupera. Solamente aproximadamente 1,0 %, preferentemente aproximadamente 0,5 %, mas preferentemente menos de 0,1 % de agregados permanecen en la preparacion de anticuerpos despues del intercambio ionico.

Se describe con la presente el metodo en el que la elucion se lleva a cabo como una elucion de gradiente por etapas. En una realizacion, la elucion se lleva a cabo en un gradiente lineal.

Sorprendentemente, las variantes desamidadas de las protemas inmunoconjugadas se eluyeron a mayor concentracion salina a pesar del aparente aumento neto de la carga negativa debido a desamidacion de un resto de asparagina. Por lo tanto, estas variantes de potencia reducida se separaron de las protemas mas activas por la cromatograffa de intercambio ionico descrita en el presente documento.

En determinadas realizaciones de la invencion, de aproximadamente el 75 % a aproximadamente el 99 % de la variante acida o desamidada presente en la muestra de partida del polipeptido o inmunoconjugado se retira durante el proceso de purificacion. En otras realizaciones, al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % de la variante desamidada se retira. La composicion que comprende el polipeptido o inmunoconjugado activo tiene por lo tanto menos de entre aproximadamente el 25 % y aproximadamente el 1 % de especies desamidadas, por ejemplo, menos del 25 %, menos del 20 %, menos del 15 %, menos del 10 %, menos del 5 %, menos del 4 %, menos del 3 %, menos del 2 % o menos del 1 %.

Las variantes desamidadas de la invencion incluyen inmunoconjugados que comprenden una toxina PE o variante de la misma, en los que la desamidacion se produce en uno o mas restos en el inmunoconjugado, por ejemplo, en uno o mas restos en la toxina PE o variante de la misma. En determinadas realizaciones, se produce desamidacion

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en 1, 2, 3, 4 o 5 restos en el inmunoconjugado. En otras realizaciones, un inmunoconjugado que comprende una toxina PE o variante de la misma se desamida en 1, 2, 3, 4 o 5 restos en la toxina PE o variante de la misma, por ejemplo en la posicion 358 de SEQ ID NO: 1, en la posicion 495 de SEQ ID NO: 16, en la posicion 243 de SEQ ID

NO: 17, en la posicion 227 de SEQ ID NO: 18, en la posicion 200 de SEQ ID NO: 19, en la posicion 212 de SEQ ID

NO: 20, en la posicion 212 de SEQ ID NO: 21 o en la posicion 229 de SEQ ID NO: 22.

En una realizacion, la concentracion salina del tampon de elucion es suficientemente alta para desplazar los monomeros de anticuerpos de la resina sin desplazar los agregados. Sin embargo, se contempla que puede usarse un aumento del pH y una concentracion salina menor para eluir los monomeros de anticuerpos de la resina.

Puede llevarse a cabo cualquiera o todas de las etapas cromatograficas de la presente invencion por cualquier medio mecanico. Puede llevarse a cabo cromatograffa, por ejemplo, en una columna. La columna puede procesarse con o sin presion y de la parte superior a la inferior o de la inferior a la superior. La direccion del flujo de ffquido en la columna puede invertirse durante el proceso de cromatograffa. La cromatograffa tambien puede llevarse a cabo usando un proceso discontinuo en el que el medio solido se separa del ffquido usado para cargar, lavar y eluir la muestra por cualquier medio adecuado, incluyendo gravedad, centrifugacion o filtracion. Tambien puede llevarse a cabo cromatograffa poniendo en contacto la muestra con un filtro que absorbe o retiene algunas moleculas en la muestra mas fuertemente que otros. En la siguiente descripcion, las diversas realizaciones de la presente invencion se describen en el contexto de cromatograffa llevada a cabo en una columna. Se entiende, sin embargo, que el uso de una columna es unicamente una de varias modalidades cromatograficas que pueden usarse, y la ilustracion de la presente invencion usando una columna no limita la aplicacion de la presente invencion a cromatograffa en columna, ya que los expertos en la materia pueden aplicar facilmente las ensenanzas a otras modalidades tambien, tales como las que usan un proceso discontinuo o filtro.

Puede usarse una diversidad de diferentes condiciones de carga, lavado y elucion, segun se desee. En algunas realizaciones, las condiciones de carga iniciales se adaptan de modo que la protema (por ejemplo, anticuerpo) eluida de la columna no HT inicial se aplique directamente a la columna HT.

Puede realizarse elucion, por ejemplo, cambiando las condiciones salinas en la fase ffquida. Por ejemplo, la sal y/o conductividad de la fase ffquida se aumenta (linealmente o por etapas) hasta un punto en que eluye el anticuerpo. Las condiciones de lavado ejemplares incluyen, por ejemplo, fosfato 10 mM, pH 6,7, con elucion realizada aumentando la concentracion salina (por etapas o de modo lineal) (por ejemplo, hasta fosfato 10 mM, NaCl 1,5 mM, pH 6,7). Todas las diversas realizaciones u opciones descritas en el presente documento pueden combinarse en todas y cada una de las variaciones.

Antes de aplicarse la muestra a la columna, la columna puede equilibrarse en el tampon o la sal que se usara para cromatografiar la protema. Como se analiza mas adelante, puede realizarse cromatograffa (y carga de la protema para purificar) en una diversidad de tampones o sales incluyendo sales de sodio, potasio, amonio, magnesio, calcio, cloruro, fluoruro, acetato, fosfato y/o citrato y/o tampon de Tris. Los expertos en la materia prefieren tampones y sales de citrato por su facilidad de eliminacion. Dichos tampones o sales pueden tener un pH de al menos aproximadamente 5,5. En algunas realizaciones, el equilibrado puede tener lugar en una solucion que comprende un tampon de Tris o de fosfato de sodio. En algunas realizaciones, el equilibrado tiene lugar a un pH de al menos aproximadamente 5,5. El equilibrado puede tener lugar a pH entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 8,6, preferentemente a pH entre aproximadamente 6,5 y 7,5. Mas preferentemente, la solucion comprende un tampon de fosfato de sodio a una concentracion de aproximadamente 25 milimolar y a un pH de aproximadamente 6,8.

El proceso de purificacion de protemas de la presente invencion es aplicable a la retirada de una variante acida de cualquier protema. Algunas protemas contempladas espedficamente para su uso con la invencion incluyen anticuerpos o fragmentos de los mismos. Otras protemas incluyen, pero sin limitacion protemas de fusion recombinantes que comprenden uno o mas dominios de inmunoglobulina de anticuerpos constantes, opcionalmente una parte Fc de un anticuerpo y una protema de interes.

Formulaciones

Se preparan formulaciones de los polipeptidos o inmunoconjugados purificados para almacenamiento y uso combinando un polipeptido o inmunoconjugado purificado empleado en la presente invencion con un vetffculo farmaceuticamente aceptable (por ejemplo, transportador, excipiente) (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20a edicion Mack Publishing, 2000). Los vetffculos farmaceuticamente aceptables adecuados incluyen, pero sin limitacion, tampones no toxicos, tales como fosfato, citrato y otros acidos organicos; sales tales como cloruro de sodio; antioxidantes, incluyendo acido ascorbico y metionina; conservantes (por ejemplo, cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol bufflico o bencffico; alquil parabenos, tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3- pentanol; y m-cresol); polipeptidos de bajo peso molecular (por ejemplo, menos de aproximadamente 10 restos de aminoacidos); protemas tales como albumina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; poffmeros hidrofilos tales como polivinilpirrolidona; aminoacidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; carbohidratos, tales como monosacaridos, disacaridos, glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA;

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azucares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metalicos (por ejemplo, complejos de Zn-protema); y tensioactivos no ionicos, tales como TWEEN o polietilenglicol (PEG).

Las composiciones de anticuerpo y/o inmunoconjugado descritas con la presente (es decir, PE unida a un anticuerpo), son particularmente utiles para administracion parenteral, tal como administracion intravenosa o administracion en una cavidad corporal o luz de un organo. Las composiciones para administracion comprenderan habitualmente una solucion del anticuerpo y/o inmunoconjugado disuelto en un transportador farmaceuticamente aceptable, preferentemente un transportador acuoso. Se puede usar una diversidad de transportadores acuosos, por ejemplo, solucion salina tamponada y similares. Estas soluciones son esteriles y estan generalmente libres de materia no deseada. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante tecnicas de esterilizacion convencionales bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias adyuvantes farmaceuticamente aceptables segun sea necesario para aproximarse a las condiciones fisiologicas tales como agentes de ajuste del pH y tamponantes, agentes de ajuste de la toxicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares. La concentracion de protema de fusion en estas formulaciones puede variar ampliamente y se seleccionara principalmente basandose en los volumenes de lfquido, las viscosidades, el peso corporal y similares, de acuerdo con el modo particular de administracion seleccionado y con las necesidades del paciente.

Por lo tanto, una composicion de inmunoconjugado farmaceutica tfpica para administracion intravenosa estana a un tratamiento total de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 50 pg/kg al dfa, en particular 20-50 pg/kg al dfa con la dosificacion administrada preferentemente de forma continua o distribuida en tres veces al dfa. Los metodos reales para preparar composiciones administrables seran conocidos o evidentes para los expertos en la materia y se describen en mas detalle en publicaciones tales como Remington's Pharmaceutical Science, 19a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1995).

La composicion que incluye el inmunoconjugado desvelado por la presente puede administrarse para tratamientos terapeuticos. En aplicaciones terapeuticas, se administran composiciones a un paciente que padece una enfermedad, en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para conseguir esto se define como una "dosis terapeuticamente eficaz". Las cantidades eficaces para este uso dependeran de la gravedad de la enfermedad y el estado general de salud del paciente.

Pueden administrarse administraciones individuales o multiples de las composiciones dependiendo de la dosificacion y la frecuencia segun lo necesite y tolere el paciente. En cualquier caso, la composicion debena proporcionar una cantidad suficiente de las protemas desveladas con la presente para tratar eficazmente al paciente. La dosificacion puede administrarse tres veces al dfa cada dos dfas o continuamente cada dos dfas durante un ciclo de, por ejemplo, 21 dfas, pero puede aplicarse periodicamente hasta que se consigue un resultado terapeutico o hasta que los efectos secundarios requieren detener la terapia. En general, la dosis debena ser suficiente para tratar o aliviar smtomas o senales de enfermedad sin producir toxicidad inaceptable al paciente. Una cantidad eficaz del compuesta es la que proporciona al sujeto alivio de un smtoma o smtomas o una mejora identificable de manera objetiva observada por el especialista clmico u otro observador cualificado.

El inmunoconjugado puede formularse como una composicion farmaceutica que comprende al menos un excipiente aceptable. Las formulacion de inmunoconjugado CAT-8015 farmaceuticamente aceptables incluyen CAT-8015 de 0,5 mg/ml a 2,5 mg/ml, habitualmente 1,0 mg/ml, 1,1 mg/ml, 1,2 mg ml, 1,3 mg/ml, 1,4 mg/ml o 1,5 mg/ml en fosfato de sodio 25 mM, sacarosa 4 %, glicina 8 %, polisorbato 80 (PS80) 0,02 %, pH 7,4. En realizaciones adicionales, el fosfato de sodio puede estar en un intervalo de 20 mM a 100 mM, 25 mM a 50 mM o 25 mM a 35 mM; la sacarosa puede estar a 2 %, 3 %, 4 %, 5 % o 6 %; la glicina puede estar en el intervalo de 5-10 %, habitualmente, 5 %, 6 % o 7 %; el polisorbato 80 puede estar en un intervalo de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 1 %, habitualmente 0,01 %, 0,02 %, 0,03 %, 0,04 % o 0,05 %; con una pH en el intervalo de 6,5 a 8,0, habitualmente a pH 7,2, 7,3, 7,4, 7,5 o 7,6. Tambien pueden utilizarse otros agentes tamponantes conocidos por los expertos en la materia.

La formulacion puede estar liofilizada. El termino "liofilizada" se refiere a cualquier composicion o formulacion que se prepare en forma seca por congelacion y deshidratacion rapida, en el estado congelado a alto vacm. "Liofilizar" o "liofilizacion" se refiere a un proceso de congelacion y secado de una solucion. Las formulaciones o composiciones liofilizadas se preparan con frecuencia para su uso o se reconstituyen mediante la adicion de agua destilada esteril. La formulacion liofilizada puede reconstituirse en un vial.

Para administracion intravenosa, una formulacion como se describe con la presente, tal como una formulacion lfquida o una formulacion reconstituida a partir de una formulacion liofilizada puede colocarse en un vial en el que el inmunoconjugado en la formulacion esta presente a concentraciones como se ha descrito anteriormente. Esta formulacion se extrae del vial y se anade a una solucion de bolsa intravenosa (IV), donde la bolsa IV contiene de aproximadamente 30 ml a aproximadamente 100 ml de solucion, habitualmente 50 ml, 60 ml, 70 ml u 80 ml. Una "solucion protectora" de bolsa IV separada tambien puede anadirse al volumen total de la bolsa IV donde la solucion

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protectora contiene polisorbato 80 en una cantidad tal que el polisorbato 80 presente en la solucion de bolsa IV final este en un intervalo de 0,001 % a aproximadamente 3 % de polisorbato 80, habitualmente en el intervalo de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 0,1 % y mas habitualmente a 0,01 %, 0,02 %, 0,03 %, 0,04 % o 0,05 %. La solucion protectora puede preformularse en un vial tal que el polisorbato 80 este a una concentracion de aproximadamente 0,5 % a aproximadamente 5 % y puede ser de 0,5 %, 1,0 %, 1,5 %, 2,0 %, 2,5 %, 3,0 %, 3,5 %, 4,0 %, 4,5 % o 5,0 %. La solucion protectora evita la adsorcion del inmunoconjugado o farmaco (por ejemplo, CAT- 8015) en superficies de contacto de la bolsa IV, evitando o inhibiendo de este modo que el inmunoconjugado o farmaco se pegue a la bolsa IV durante la administracion y permitiendo que el paciente reciba la dosificacion apropiada de inmunoconjugado o farmaco. La solucion de bolsa IV puede administrarse por infusion al paciente durante diversas duraciones, habitualmente de 30 minutos a 1 hora, habitualmente 30 minutos.

Entre diversos usos de los inmunoconjugados y las formulaciones descritos con la presente se incluyen una diversidad de condiciones de enfermedad provocadas por celulas humanas espedficas que pueden eliminarse mediante la accion toxica de la protema. Una aplicacion para los inmunoconjugados descritos con la presente es para el tratamiento de neoplasias malignas de linfocitos B o linfocitos B malignos que expresan CD22. Las neoplasias malignas de linfocitos B ejemplares incluyen leucemia linfodtica cronica B (lLC-B), leucemia linfodtica aguda pediatrica (LLAp), linfoma folicular (LF), linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG), linfoma no hodgkiniano (LNH) y leucemia por tricoleucitos (LTL).

Ejemplos

Ejemplo 1. Expresion, recuperacion y aislamiento de cuerpos de inclusion de CAT-8015

Se realizo fermentacion de lmeas celulares separadas que contienen vectores de expresion de CAT-8015 VL y CAT- 8015 VH-PE38. El fermentador se recogio por centrifugacion continua. La recogida del fermentador se paso a traves de una centnfuga continua a 2 a 8 °C a una velocidad de 0,5 a 0,8 l por minuto y se centrifugo a una velocidad de aproximadamente 15.000 rpm. Despues de centrifugacion la pasta celular se congelo a <-70 °C.

Despues de este tratamiento, las pastas celulares Vh-PE38 y Vl se descongelaron durante 12 a 24 horas a 2 a 8 °C. Las celulas se lisaron para liberar cuerpos de inclusion que contienen los productos de VL VH-PE38. Los cuerpos de inclusion resultantes se solubilizaron posteriormente y se obtuvieron los productos de Vh-PE38 y Vl.

El producto se concentro hasta aproximadamente 1 mg/ml (determinado por ensayo de protema total de Coomassie) usando un cartucho de fibras huecas de ultrafiltracion de 30 kDa. El material retenido se diafiltro despues con 5 a 6 volumenes de Tris 20 mM, urea 100 mM pH 7,4 para conseguir una conductividad de 2,5 a 3,0 mS/cm. Este producto se almaceno hasta 72 horas a 2 a 8 °C.

Ejemplo 2. Purificacion a escala analftica de CAT-8015 activo mediante cromatograffa de intercambio anionico con resinas de alto rendimiento.

La expresion de la subunidad Vh-P38 dio como resultado una formacion de una variante desamidada de la subunidad. Se descubrio que la desamidacion se produjo en la parte PE38 del inmunoconjugado. La desamidacion de la subunidad VH-P38 dio como resultado reduccion de la potencia de la protema CAT-8015. Sorprendentemente, las condiciones cromatograficas descritas posteriormente fueron exitosas en la retirada de la variante desamidada, proporcionando de este modo la capacidad de retirar la especie inactiva durante la purificacion. Ya que la desamidacion se produjo en la parte PE38 de la construccion de fusion, las condiciones cromatograficas pueden aplicarse a la retirada de cualquier variante desamidada de un conjugado de PE.

CAT-8015 se renaturalizo a partir de cuerpos de inclusion aislados y se purificaron posteriormente por un proceso de 4 columnas. La Tabla 1 proporciona una vision de conjunto de las operaciones de unidades de renaturalizacion y purificacion.

Tabla 1 diagrama de flujo de produccion de CAT-8015

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imagen1

La Figura 1 muestra el perfil de cromatograffa de intercambio ionico (IEC) analftico de una muestra de un patron de referencia de CAT-8015. Como se muestra en el perfil, un pico previo surge antes de la elucion del pico principal. Las fracciones individuals eluidas de la IEC se ensayan con respecto a actividad biologica de CAT-8015 en relacion con un patron de referencia usando un bioensayo de apoptosis que mide la capacidad de la muestra de ensayo para inducir muerte apoptotica dependiente de dosis de la lmea celular Daudi que expresa receptor de CD22. Una vez unido a CD22 e internalizado, CAT-8015 induce que celulas Daudi experimenten apoptosis mediante activacion de caspasa 3/7 que puede medirse mediante el sistema de ensayo de caspasa-GloTM 3/7. La potencia de la muestra de ensayo se determina dividiendo la concentracion eficaz al 50 % (CE50) del patron de referencia por la CE50 de la muestra de ensayo. Los resultados del bioensayo de apoptosis demostraron que la potencia relativa de CAT-8015 esta correlacionada con el porcentaje de pico previo de cAT-8015 como se representa graficamente en la Figura 1. La Figura 2 muestra la correlacion entre esta potencia relativa y el porcentaje del pico previo.

Se recogieron fracciones de pico previo y pico principal de analisis de IEC multiple, se agruparon y se sometieron a mapeo de peptidos y analisis por espectrometna de masas- cromatograffa ffquida/espectrometna de masas (LC- MS/MS). Los resultados se compararon con los obtenidos de experimentos de mapeo de peptidos y LC-MS/MS de CAT-8015 purificado. El analisis de sustancia farmacologica CAT-8015 purificada revelo que Asn-358 estaba parcialmente desamidada a Asp-358 e iso-Asp-358 (Tabla 2). Se descubrio que Asp-358 e iso-Asp358 estaban significativamente enriquecidas en la fraccion de pico previo mientras que la fraccion de pico principal estaba enriquecida en CAT-8015 (Tabla 2). En conjunto, los resultados demuestran que la desamidacion en Asn-358 conduce a una perdida de potencia relativa en un bioensayo basado en celulas. El resto de Asp-358 esta presente en la parte de toxina PE del inmunoconjugado lo que indica por lo tanto que un inmunoconjugado que contiene una toxina PE, o variante de la misma, en la que este presente Asp-358 probablemente este sujeto a desamidacion y sujeto a una perdida de potencia o actividad.

Tabla 2

Distribucion del aminoacido 358 en fracciones de sustancia farmacologica, pico previo y pico principal de CAT-8015 basandose en el analisis de mapeo de peptidos y LC-MS/MS.

Aminoacido

Sustancia farmacologica (%) Pico previo (%) Pico principal (%)

N358

78,1 3,1 88,9

D358

11,9 44,0 2,2

iso-D358

10,0 52,9 8,9

D358 = Asn-358 desamidada

; iso-D358 = Asn-358 iso-desamidada; N358 = Asn-358.

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Se realizo separacion de CAT-8015 desamidado de CAT-8015 intacto mediante cromatograffa de intercambio anionico con grupos de intercambio ionico fuertes tales como Q (amino cuaternario) acoplados con resinas de diametro pequeno tales como Source 15 (diametro de parffcula: 15 pm; GE Healthcare) y Sepharose High Performance (diametro de parffcula: 34 pm; GE Healthcare). La aplicacion de resina de cromatograffa de diametro pequeno en procesos de biofabricacion se complica por la generacion de contrapresiones significativas en condiciones operativas ffpicas como se define por la geometna de columna, caudales y composicion del tampon. Basandose en estas consideraciones y el requisito de una etapa de cromatograffa de alto rendimiento de eligio Q Sepharose High Performance para la separacion de CAT-8015 desamidado de CAT-8015 intacto. Se desarrollaron condiciones de cromatograffa que consiguieron alta resolucion manteniendo al mismo tiempo la operabilidad a diversas escalas de fabricacion.

Ejemplo 3. Purificacion a escala de laboratorio de CAT-8015

La columna se preequilibro en primer lugar con 5 volumenes de columna (VC) de tampon C (tampon de preequilibrado/retirada: Tris/HCl 10 mM, pH 8,0, NaCl 1,0 M) y se equilibro posteriormente con 5 VC de tampon A (tampon de equilibrado: Tris/HCl 10 mM, pH 8,0) a caudal lineal de 100 cm/h. La resina de cromatograffa fue Q Sepharose High Performance (QHP, GE Healthcare) en una columna Millipore Vantage, de 2,2 cm x 19,5 cm, y se proceso en un AKTA Explorer. El grupo de producto de purificacion intermedio se preparo para carga en la columna de intercambio anionico de alto rendimiento por diafiltracion con 10 volumenes de tampon A usando una membrana de PCPM de 10 kDa. El grupo de producto de interaccion hidrofoba diafiltrado se cargo en la columna QHP a un caudal lineal de 100 cm/h, seguido de una etapa de reequilibrado de 2 VC con tampon A al mismo caudal. CAT-8015 se eluyo con un gradiente lineal de 10 VC de tampon B 35 % (tampon de elucion: Tris/HCl 10 mM, pH 8,0, NaCl 500 mM) a tampon B 55 % a un caudal lineal de 100 cm/h. La elucion del producto se superviso a 280 nm. Se recogieron fracciones y se analizaron con respecto a % de pico previo mediante cromatograffa de intercambio ionico (IEC) anafftica. Las fracciones que conteman menos del 25 % de pico previo se agruparon. El grupo de QHP se analizo con respecto a % de pico previo mediante IEC anafftica en una columna de intercambio anionico fuerte. Se midio la potencia relativa mediante un bioensayo de apoptosis como se ha descrito anteriormente.

A pH 8,0, CAT-8015 se unio fuertemente con la resina de intercambio anionico sin ninguna protema detectada en la fraccion de flujo continuo por absorbancia a A280. Despues de una etapa de lavado inicial con NaCl 175 mM en Tris/HCl, pH 8,0, CAT-8015 se eluyo de la columna con un gradiente salino lineal de B 35 % (NaCl 175 mM en Tris/HCl, pH 8,0) a B 55 % (NaCl 275 mM en Tris/HCl, pH 8,0). CAT-8015 se eluyo de la columna entre B 39 % (NaCl 192 mM en Tris/HCl, pH 8,0) y B 49 % (NaCl 245 mM en Tris/HCl, pH 8,0). La Fig. 3 muestra el perfil de cromatograffa de QHP de CAT-8015.

Las fracciones se analizaron mediante IEC anafftica. La Tabla 3 muestra los resultados para fracciones eluidas entre B 44,5 % (NaCl 223 mM) y B 47,2 % (NaCl 236 mM).

Tabla 3

Analisis por IEC de fracciones de QHP recogidas

N.° de fraccion

% de pico previo a % de pico principal

C12

41,0 59

D12

34,5 65,5

D11

27,0 73

D9

17,6 82,4

D7

15,9 84,1

D5

18,7 81,3

D3

21,9 78,1

aEl pico previo contiene >90 % de CAT-8015 desamidado.

La Tabla 3 demuestra que la cromatograffa de intercambio anionico realizada en un modo de elucion de gradiente salino lineal es capaz de separar CAT-8015 desamidado de CAT-8015 intacto de una manera eficaz.

Sorprendentemente, CAT-8015 intacto se eluyo a una mayor concentracion salina a pesar del aparente aumento neto de la carga negativa debido a desamidacion de un resto de asparagina. Este resultado es coherente con el perfil de cromatograffa observado por IEC. Se inyectaron muestras que conteman CAT-8015 en una columna de intercambio anionico anafftica (PL-SAX, Varian) equilibrada a pH 8,0 con un sistema de tampon de Tris/HCl y se eluyeron por una combinacion de etapa y etapas de elucion de gradiente (Fig. 1).

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Las fracciones se combinaron segun los criterios de agrupamiento de menos del 25 % de contenido de pico previo. El grupo de QHP se analizo con respecto a % de pico previo y potencia relativa mediante SDS-PAGE, lEc analftica y bioensayo de apoptosis. El analisis por SDS-PAGe, como se muestra en la Fig. 4, demuestra que las muestras de grupo de carga y eluato de QHP conteman CAT-8015 altamente purificado. Sin embargo, el grupo de carga de QHP no cumplio la especificacion objetivo para pureza por IEC y bioactividad. Las mediciones de pureza y potencia para el grupo de carga de QHP en comparacion con el grupo de eluato de QHP, como se presenta en la Tabla 4 posterior, demuestran que la etapa de cromatograffa de intercambio anionico con QHP dio como resultado un aumento significativo de la pureza por IEC y la potencia relativa de CAT-8015. El grupo de carga de QHP se genero a partir de la etapa de purificacion de intermedio II.

Tabla 4

Pureza de CAT-8015 por IEC y bioactividad

Etapa

% de pico previo % de pico principal Potencia relativa (%)

Grupo de carga de QHP

53,8 46,2 52

Grupo de Eluato de QHP

16,5 83,8 80

El grupo de producto de QHP se diafiltro posteriormente en tampon de formulacion para generar sustancia farmacologica de CAT-8015.

Por lo tanto, la fabricacion de sustancia farmacologica de CAT-8015 requiere la separacion de CAT-8015 desamidado de CAT-8015 activo. La capacidad de cromatograffa de intercambio anionico con resinas de alto rendimiento tales como QHP para separar CAT-8015 desamidado de CAT-8015 intacto y para aumentar la bioactividad hasta especificaciones objetivo es un prerrequisito para la fabricacion exitosa de sustancia farmacologica de CAT-8015.

Ejemplo 4. Purificacion a gran escala de CAT-8015

La columna se preequilibro en primer lugar con 5 VC de tampon C (tampon de preequilibrado/retirada: Tris/HCl 10 mM, pH 8,0, NaCl 1,0 M) a un caudal lineal de 66 cm/h y posteriormente se equilibro con 5 VC de tampon A a un caudal lineal de 76 cm/h. La resina de cromatograffa fue Q Sepharose High Performance (QHP, GE Healthcare), en un lecho de columna BP300, de 30 cm x 22 cm, procesado en un instrumento K Prime. El grupo de producto de purificacion intermedio se preparo para carga en la columna de intercambio anionico de alto rendimiento por diafiltracion con 10 volumenes de tampon A (tampon de equilibrado: Tris/HCl 10 mM, pH 8,0) usando una membrana de PCPM 10 kDa. El grupo de producto diafiltrado se cargo en la columna QHP a un caudal lineal de 64 cm/h, seguido de una etapa de reequilibrado de 2 VC con tampon A a 76 cm/h. CAT-8015 se eluyo con un gradiente lineal de 10 VC de tampon B 35 % (tampon de elucion: Tris/HCl 10 mM, pH 8,0, NaCl 500 mM) a tampon B 55 % a un caudal lineal de 76 cm/h. La elucion del producto se superviso a 280 nm. Se recogieron fracciones y se analizaron con respecto a % de pico previo mediante cromatograffa de intercambio ionico (IEC) analftica. Las fracciones que conteman menos del 25 % de pico previo se agruparon. El grupo de QHP se analizo con respecto a % de pico previo mediante IEC analftica en una columna de intercambio anionico fuerte. Se midio la potencia relativa mediante un bioensayo de apoptosis.

Se realizo cromatograffa de intercambio anionico a gran escala de CAT-8015 con QHP como se ha descrito anteriormente. La purificacion por QHP se llevo a cabo a caudales reducidos debido a restricciones de equipamiento. CAT-8015 eluido de la columna a conductividades entre 22,3 mS/cm y 26,4 mS/cm. La Figura 5 muestra el perfil de cromatograffa de QHP de CAT-8015 purificado segun el metodo descrito anteriormente.

Las fracciones se analizaron mediante IEC analftica. La Tabla 5 muestra los resultados para fracciones eluidas a conductividades entre 23,8 y 25,4 mS/cm. La Tabla 5 demuestra que la cromatograffa de intercambio anionico realizada en un modo de elucion de gradiente salino lineal fue capaz de separar CAT-8015 desamidado de CAT- 8015 intacto. La separacion de CAT-8015 desamidado de CAT-8015 intacto tuvo lugar en un intervalo de conductividad de menos de 2 mS/cm.

Tabla 5

Analisis por IEC de % de pureza de pico previo de fracciones recogidas

Fraccion

% de pico previo % de pico principal

1

55,1 44,9

2

39,0 61

3

30,1 69,9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

4

25,1 74,9

5

18,7 81,3

6

14,7 85,3

7

16,4 83,6

Las fracciones 4-7 se combinaron segun los criterios de agrupamiento de menos del 25 % de contenido de pico previo. El grupo de QHP se analizo con respecto a % de pico previo y potencia relativa mediante SDS-PAGE y SEC, IEC anafftica y bioensayo de apoptosis. El analisis por SDS-PAGE, como se muestra en la Fig. 6, demuestra que las muestras de grupo de carga y eluato de QHP conteman CAT-8015 altamente purificado. Sin embargo, el grupo de carga de QHP no cumplio la especificacion objetivo para pureza por SEC, IEC y potencia relativa. Las mediciones de pureza y potencia para el grupo de carga de QHP en comparacion con el grupo de eluato de QHP, como se presenta en las Tablas 6 y 7 posteriores, demuestran que la etapa de cromatograffa de intercambio anionico con QHP dio como resultado un aumento significativo de la pureza por SEC, IEC y potencia relativa de CAT-8015. El grupo de carga de QHP se genero a partir de la etapa de purificacion de intermedio II.

Tabla 6

Pureza de CAT-8015 por SEC

Etapa

% de monomero % de agregado % de otros

Grupo de carga de QHP

92,7 0,7 6,6

Grupo de Eluato de QHP

99,0 1,0 0

Tabla 7

Pureza de CAT-8015 por IEC y bioactividad

Etapa

% de pico previo % de pico principal Potencia relativa (%)

Grupo de carga de QHP

50,3 49,7 51

Grupo de Eluato de QHP

17 83 75

El grupo de producto de QHP se diafiltro posteriormente en tampon de formulacion para generar sustancia farmacologica de CAT-8015.

Los ejemplos 2-4 demuestran la capacidad de la cromatograffa de intercambio anionico con resinas tal como Q Sepharose High Performance para separar CAT-8015 desamidado de CAT-8015 intacto y para aumentar su potencia relativa para cumplir las especificaciones objetivo (vease Tablas 4 y 6). CAT-8015 desamidado difiere de CAT-8015 intacto por una carga negativa adicional. A diferencia del comportamiento de elucion esperado de una columna de intercambio anionico, la mayor parte del CAT-8015 desamidado eluye antes que el CAT-8015 intacto en condiciones de elucion en gradiente salino (vease Tablas 3 y 5). Este patron de elucion inesperado se observo a escala analftica, escala de laboratorio y cromatograffa de intercambio anionico a gran escala. Este patron de elucion era inesperado ya que se esperaffa que el tampon de elucion de alta salinidad lineal diera como resultado una carga negativa mayor de la variante. Por lo tanto, los ejemplos 2-4 demuestran que usando un tampon de elucion lineal, puede retirarse una especie desamidada de inmunoconjugados activos usando cromatograffa de intercambio anionico. La separacion de CAT-8015 desamidado de cAT-8015 intacto tuvo lugar en un intervalo particular de conductividades, subrayando la necesidad de resinas de intercambio anionico de alta resolucion, el control cuidadoso de las condiciones de elucion y el ensayo en proceso de fracciones recogidas.

Ejemplo 5. Modificacion de la bioactividad de formulaciones de CAT-8015

La potencia de las composiciones de CAT-8015 se calibro mezclando cantidades espedficas del pico previo desamidado con el pico principal activo. Para obtener composiciones que comprendieran una potencia particular de CAT-8015, se combinaron alfcuotas de producto de pico previo de CAT-8015 con alfcuotas de producto de pico principal de CAT-8015 para conseguir una composicion con una potencia particular de CAT-8015. Controlando el nivel de potencia de CAT-8015 en la composicion, se genero una formulacion de CAT-8015 para administracion de un volumen particular de CAT-8015 reconstituido a una dosis deseada.

Ejemplo 6. El ajuste del pH durante la solubilizacion da como resultado especies de desamidacion reducida como se mide despues de las etapas de captura y purificacion de intermedio

Aunque pueden retirarse especies desamidadas de inmunoconjugados activos usando las etapas de purificacion como se ha descrito anteriormente, los niveles de especies desamidadas de CAT-8015 tambien pueden reducirse

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eficazmente ajustando el pH en etapas anteriores en el proceso de purificacion (es dedr, la etapa de replegamiento (etapa 4 de la Tabla 1 anterior). El procedimiento de replegamiento utilizado para conseguir un nivel menor de especies desamidadas de CAT-8015 incluye las siguientes subetapas:

Subetapa de replegamiento 1: Solubilizacion. Clarificacion y concentracion: Se descongelaron cuerpos de inclusion de VH-PE38 y VL durante 12-24 horas a temperatura ambiente (15-30 °C). Los cuerpos de inclusion de VH-PE38 y VL se combinaron en una relacion molar 1:1 y se ajustaron hasta 15 % (p/v) de solidos anadiendo Tris 50 mM, EDTA 20 mM, pH 7,4. Los cuerpos de inclusion se solubilizaron anadiendo 5 kg del tampon de solubilizacion de cuerpos de inclusion (etanolamina 50 mM, urea 8 M, arginina 0,5 M, EDTA 2 mM, DTE 10 mM) para cada kg de 15 % (p/v) de solidos de suspension de cuerpos de inclusion. El pH del tampon de solubilizacion de cuerpos de inclusion se modifico entre pH 9,0 y 10,5 en incrementos de 0,5 unidades de pH. Se llevo a cabo solubilizacion durante 2 horas a temperatura ambiente (15-30 °C) con agitacion constante. Los cuerpos de inclusion solubilizados se clarificaron por filtracion en profundidad a traves de una serie de filtros. El filtrado clarificado se concentro por filtracion de flujo tangencial hasta 5-6 g/l usando una membrana de ultrafiltracion de punto de corte de peso molecular (PCPM) de 5 kDa.

Subetapa de replegamiento 2: Replegamiento: El replegamiento de CAT-8015 se inicio por una dilucion de 10 veces del filtrado de cuerpos de inclusion clarificado y concentrado en tampon de replegamiento preenfriado (2-8 °C) (etanolamina 50 mM, arginina 1 M, EDTA 2 mM, glutation oxidado 0,91 mM, pH 9,5). La solucion de replegamiento se mantuvo a 2-8 °C durante 48-72 horas con mezclado continuo. El replegamiento se termino llevando la solucion de replegamiento a temperatura ambiente (15-30 °C) antes de la concentracion y diafiltracion. La solucion de replegamiento se concentro por filtracion de flujo tangencial con una membrana de PCPM 10 kDa y se diafiltro con 10 volumenes de fosfato de potasio 20 mM, pH 7,4. La solucion de replegamiento concentrada y diafiltrada se filtro a traves de un filtro de 0,2 pm (carga de TMAE).

Como parte de la etapa de captura (etapa 5 de la Tabla 1 anterior), la preparacion de CAT-8015 obtenida del procedimiento de replegamiento anterior se cargo en una columna Fractogel TMAE (EMD Biosciences o equivalente) equilibrada con fosfato de potasio 20 mM, pH 7,4. Despues de la carga, la columna se lavo en primer lugar con fosfato de potasio 20 mM, pH 7,4, y despues con fosfato de potasio 20 mM, Triton X 100 0,1 % (p/p), pH 7,4, seguido de un lavado posterior con fosfato de potasio 20 mM, cloruro de sodio 100 mM, pH 7,4. El producto se eluyo de la columna en flujo inverso con fosfato de potasio 20 mM, cloruro de sodio 200 mM pH 7,4. La columna se retiro con cloruro de sodio 2 M, se limpio con hidroxido de sodio 1 N y se almaceno en hidroxido de sodio 0,1 N a temperatura ambiente.

Como parte de la etapa de purificacion intermedia 1, se realizo cromatograffa de hidroxiapatita. La etapa de cromatograffa de hidroxiapatita se realizo como una etapa de cromatograffa de flujo continuo. El producto obtenido de la etapa de captura anterior se cargo directamente sin ningun ajuste adicional en una columna de hidroxiapatita de ceramica (Bio-Rad Laboratories o equivalente) equilibrada con fosfato de potasio 400 mM, cloruro de sodio 200 mM, pH 7,4, seguido de fosfato de potasio 20 mM, cloruro de sodio 200 mM, pH 7,4. En las condiciones de la cromatograffa, el producto se recogio en la fraccion de flujo continuo (producto de HA). La columna se retiro con fosfato de potasio 400 mM, cloruro de sodio 200 mM, pH 7,4, se limpio con hidroxido de sodio 1 N y se almaceno en hidroxido de sodio 0,1 N a temperatura ambiente.

El porcentaje de pico previo en el producto de HA anterior se analizo por cromatograffa de intercambio anionico de alto rendimiento. La Tabla 8 y la Figura 7 muestran el porcentaje de pico previo en producto de HA en funcion del pH de solubilizacion. Como se muestra en la Tabla 8 y la Figura 7, la solubilizacion de los cuerpos de inclusion de VH- PE38 y VL a un pH menor conduce a menos producto de CAT-8015 desamidado. La capacidad de control de la desamidacion de CAT-8015 en una etapa temprana en el proceso de renaturalizacion y purificacion puede aumentar el rendimiento del proceso general manteniendo al mismo tiempo la calidad de la sustancia farmacologica purificada final.

Tabla 8

Porcentaje de pico previo en el producto HA en funcion del pH de solubilizacion

pH de solubilizacion

9,0 9,5 10,0 10,5

Pico previo (%)

9,8 14,5 22,1 31,8

Claims (13)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para producir un polipeptido purificado de una solucion que comprende el polipeptido y una variante acida del polipeptido, en el que dicha variante acida del polipeptido da como resultado una inhibicion de la potencia de dicho polipeptido, comprendiendo el metodo: (a) poner en contacto el polipeptido con una matriz de cromatograffa de intercambio anionico (AIEX); y (b) eluir el polipeptido unido de la matriz de cromatograffa AIEX con un gradiente salino lineal que sea de aproximadamente NaCl 150 mM en Tris/HCl, pH 8,0 a aproximadamente NaCl 300 mM en Tris/HCl, pH 8,0, de aproximadamente NaCl 175 mM en Tris/HCl, pH 8,0 a aproximadamente NaCl 275 mM en Tris/HCl, pH 8,0 o de aproximadamente NaCl 192 mM en Tris/HCl, pH 8,0 a aproximadamente NaCl 245 mM en Tris/HCl, pH 8,0, separando de este modo dicho polipeptido de la variante acida y produciendo un polipeptido purificado; en el que el polipeptido es un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo o fragmento de union a anffgeno del mismo que se une con el receptor de superficie celular CD22 y que comprende una exotoxina de Pseudomonas, o variante de la misma.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la variante acida es una variante desamidada.
3. 3. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la matriz AIEX contiene grupos de intercambio ionico de amina cuaternaria y amina terciaria.
4. 4. El metodo de la reivindicacion 3, en el que la matriz AIEX contiene un grupo amino cuaternario (Q).
5. 5. El metodo de la reivindicacion 3 o 4, en el que la matriz AIEX es Q sepharose.
6. 6. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que entre aproximadamente 75 y aproximadamente 99 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % de la variante acida o desamidada se retira.
7. 7. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el anticuerpo o fragmento de union a anffgeno comprende un Fab, un Fab', un F(ab')2, un Fd, un Fv monocatenario o scFv, un Fv con enlaces disulfuro, un dominio V-NAr, un IgNar, un intracuerpo, una IgGACH2, un minicuerpo, un F(ab')3, un tetracuerpo, un triacuerpo, un diacuerpo, un anticuerpo de un solo dominio, DVD-Ig, Fcab, mAb2, un (scFv)2, o un scFv-Fc.
8. 8. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que dicha exotoxina de Pseudomonas, o variante de la misma, tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 16 a 22.
9. 9. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que dicho anticuerpo o fragmento de union a anffgeno del mismo comprende una secuencia de VH y VL.
10. 10. El metodo de la reivindicacion 9, en el que dicha secuencia de VH se selecciona entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 6 a 11.
11. 11. El metodo de la reivindicacion 9, en el que dicha secuencia de VL se selecciona entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 y 12-15.
12. 12. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el inmunoconjugado es la inmunotoxina CAT- 8015 que comprende la subunidad Vh-PE38 de SEQ ID NO: 1 y la subunidad Vl de SeQ ID NO: 2.
13. 13. Un metodo para modificar la bioactividad de una solucion polipepffdica que comprende un polipeptido y una variante desamidada, en el que el polipeptido es un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo o fragmento de union a anffgeno del mismo que se une con el receptor de superficie celular CD22 y que comprende una exotoxina de Pseudomonas o variante de la misma, comprendiendo el metodo separar el polipeptido de la variante desamidada por cromatograffa AIEX de elucion lineal; y combinar el polipeptido purificado y la variante desamidada en cantidades fijas para obtener la bioactividad deseada de la solucion polipepffdica.