ES2682333T3 - Método y kit de partes para la extracción de ácidos nucleicos - Google Patents
Método y kit de partes para la extracción de ácidos nucleicos Download PDFInfo
- Publication number
- ES2682333T3 ES2682333T3 ES15712533.7T ES15712533T ES2682333T3 ES 2682333 T3 ES2682333 T3 ES 2682333T3 ES 15712533 T ES15712533 T ES 15712533T ES 2682333 T3 ES2682333 T3 ES 2682333T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- products
- composition
- dna
- sample
- nucleic acids
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 67
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 66
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 66
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 46
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 97
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims abstract description 48
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 40
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 38
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 33
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims abstract description 29
- 239000000391 magnesium silicate Substances 0.000 claims abstract description 23
- 229910052919 magnesium silicate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 23
- 235000019792 magnesium silicate Nutrition 0.000 claims abstract description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 20
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 17
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims abstract description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 72
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 51
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 32
- 235000003351 Brassica cretica Nutrition 0.000 claims description 28
- 235000003343 Brassica rupestris Nutrition 0.000 claims description 28
- QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N bis(2-chloroethyl) sulfide Chemical compound ClCCSCCCl QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 235000010460 mustard Nutrition 0.000 claims description 28
- ZADYMNAVLSWLEQ-UHFFFAOYSA-N magnesium;oxygen(2-);silicon(4+) Chemical compound [O-2].[O-2].[O-2].[Mg+2].[Si+4] ZADYMNAVLSWLEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 19
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims description 18
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims description 16
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 15
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 14
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 claims description 12
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 12
- 235000001543 Corylus americana Nutrition 0.000 claims description 11
- 235000007466 Corylus avellana Nutrition 0.000 claims description 11
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 claims description 11
- 239000013566 allergen Substances 0.000 claims description 11
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 11
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 11
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 claims description 11
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 11
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims description 11
- 244000144725 Amygdalus communis Species 0.000 claims description 10
- 235000011437 Amygdalus communis Nutrition 0.000 claims description 10
- 235000020224 almond Nutrition 0.000 claims description 10
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 claims description 10
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 10
- 240000009226 Corylus americana Species 0.000 claims description 9
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 claims description 9
- 240000007087 Apium graveolens Species 0.000 claims description 8
- 235000015849 Apium graveolens Dulce Group Nutrition 0.000 claims description 8
- 235000010591 Appio Nutrition 0.000 claims description 8
- 241000589876 Campylobacter Species 0.000 claims description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 8
- 241000989055 Cronobacter Species 0.000 claims description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 7
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 claims description 7
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 7
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims description 6
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 claims description 6
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 claims description 6
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000003434 Sesamum indicum Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 claims description 6
- 235000014571 nuts Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 claims description 6
- 244000226021 Anacardium occidentale Species 0.000 claims description 4
- 244000045195 Cicer arietinum Species 0.000 claims description 4
- 235000010523 Cicer arietinum Nutrition 0.000 claims description 4
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 claims description 4
- 241000186781 Listeria Species 0.000 claims description 4
- 241000219745 Lupinus Species 0.000 claims description 4
- 241000208467 Macadamia Species 0.000 claims description 4
- 240000006711 Pistacia vera Species 0.000 claims description 4
- 239000005018 casein Substances 0.000 claims description 4
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000020226 cashew nut Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 4
- 235000020233 pistachio Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 claims description 4
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 claims description 3
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 claims description 3
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 claims description 3
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 claims description 3
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims description 3
- 229920002907 Guar gum Polymers 0.000 claims description 3
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 claims description 3
- 241000589248 Legionella Species 0.000 claims description 3
- 208000007764 Legionnaires' Disease Diseases 0.000 claims description 3
- 235000003447 Pistacia vera Nutrition 0.000 claims description 3
- 241000607768 Shigella Species 0.000 claims description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 3
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 claims description 3
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 claims description 3
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 claims description 3
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 claims description 3
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 claims description 3
- 239000000665 guar gum Substances 0.000 claims description 3
- 235000010417 guar gum Nutrition 0.000 claims description 3
- 229960002154 guar gum Drugs 0.000 claims description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940032147 starch Drugs 0.000 claims description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 3
- 239000000230 xanthan gum Substances 0.000 claims description 3
- 229920001285 xanthan gum Polymers 0.000 claims description 3
- 235000010493 xanthan gum Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940082509 xanthan gum Drugs 0.000 claims description 3
- 244000000231 Sesamum indicum Species 0.000 claims description 2
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000005418 vegetable material Substances 0.000 claims description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 claims 4
- 244000056139 Brassica cretica Species 0.000 claims 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims 1
- HCWCAKKEBCNQJP-UHFFFAOYSA-N magnesium orthosilicate Chemical compound [Mg+2].[Mg+2].[O-][Si]([O-])([O-])[O-] HCWCAKKEBCNQJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 73
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 55
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 49
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 31
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 31
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 31
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 27
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 26
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 22
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 22
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 17
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 11
- 235000013580 sausages Nutrition 0.000 description 11
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 235000010746 mayonnaise Nutrition 0.000 description 8
- 239000008268 mayonnaise Substances 0.000 description 8
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 235000019219 chocolate Nutrition 0.000 description 7
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 7
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 6
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 6
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 6
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 6
- 235000011194 food seasoning agent Nutrition 0.000 description 6
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 6
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 6
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 6
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 6
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 6
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 6
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 5
- FPAFDBFIGPHWGO-UHFFFAOYSA-N dioxosilane;oxomagnesium;hydrate Chemical compound O.[Mg]=O.[Mg]=O.[Mg]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O FPAFDBFIGPHWGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 5
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 5
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 5
- PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 1-hexadecanoyl-2-octadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[C@@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 4
- 244000140786 Brassica hirta Species 0.000 description 4
- 235000011371 Brassica hirta Nutrition 0.000 description 4
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 4
- 229940127399 DNA Polymerase Inhibitors Drugs 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 241001522296 Erithacus rubecula Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000006439 Lemna minor Nutrition 0.000 description 4
- 244000242291 Lemna paucicostata Species 0.000 description 4
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 4
- 244000040738 Sesamum orientale Species 0.000 description 4
- 235000007264 Triticum durum Nutrition 0.000 description 4
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 4
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 4
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 4
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 4
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 4
- 235000013364 duck meat Nutrition 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000008347 soybean phospholipid Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 3
- 240000007582 Corylus avellana Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000209143 Triticum turgidum subsp. durum Species 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 235000019221 dark chocolate Nutrition 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 3
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 3
- 235000008939 whole milk Nutrition 0.000 description 3
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 2
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 235000010650 Hyssopus officinalis Nutrition 0.000 description 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 2
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 235000021152 breakfast Nutrition 0.000 description 2
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229940105329 carboxymethylcellulose Drugs 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 235000021219 chicken noodle soup Nutrition 0.000 description 2
- -1 clothing Substances 0.000 description 2
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 2
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 2
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical class OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000819 hypertonic solution Substances 0.000 description 2
- 229940021223 hypertonic solution Drugs 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 235000014594 pastries Nutrition 0.000 description 2
- 235000011197 perejil Nutrition 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 235000021067 refined food Nutrition 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 2
- 235000015067 sauces Nutrition 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QJZYHAIUNVAGQP-UHFFFAOYSA-N 3-nitrobicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic acid Chemical compound C1C2C=CC1C(C(=O)O)C2(C(O)=O)[N+]([O-])=O QJZYHAIUNVAGQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000006054 Agastache cana Species 0.000 description 1
- 241000589159 Agrobacterium sp. Species 0.000 description 1
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 235000009025 Carya illinoensis Nutrition 0.000 description 1
- 244000068645 Carya illinoensis Species 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N D-nopaline Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)N[C@@H](C(O)=O)CCC(O)=O LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 240000001812 Hyssopus officinalis Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 240000007049 Juglans regia Species 0.000 description 1
- 235000009496 Juglans regia Nutrition 0.000 description 1
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000288147 Meleagris gallopavo Species 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 102000036675 Myoglobin Human genes 0.000 description 1
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 description 1
- 235000008753 Papaver somniferum Nutrition 0.000 description 1
- 206010034203 Pectus Carinatum Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 240000009164 Petroselinum crispum Species 0.000 description 1
- 244000062780 Petroselinum sativum Species 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000081426 Ranunculus ficaria Species 0.000 description 1
- 235000002226 Ranunculus ficaria Nutrition 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241001237745 Salamis Species 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108091032917 Transfer-messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098345 Triticum durum Species 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 1
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 1
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 1
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 235000015895 biscuits Nutrition 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 235000005487 catechin Nutrition 0.000 description 1
- 150000001765 catechin Chemical class 0.000 description 1
- ADRVNXBAWSRFAJ-UHFFFAOYSA-N catechin Natural products OC1Cc2cc(O)cc(O)c2OC1c3ccc(O)c(O)c3 ADRVNXBAWSRFAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 108010031100 chloroplast transit peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 235000021310 complex sugar Nutrition 0.000 description 1
- 235000013409 condiments Nutrition 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000014510 cooky Nutrition 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 230000001909 effect on DNA Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000010685 fatty oil Substances 0.000 description 1
- 239000013568 food allergen Substances 0.000 description 1
- 235000014106 fortified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 239000004021 humic acid Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 235000013550 pizza Nutrition 0.000 description 1
- 150000008442 polyphenolic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 description 1
- 238000009702 powder compression Methods 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000000275 quality assurance Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 235000015175 salami Nutrition 0.000 description 1
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000007669 thermal treatment Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 235000020234 walnut Nutrition 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Composición para uso en la extracción y purificación de ácidos nucleicos a partir de muestras alimentarias caracterizada en que la composición es una mezcla de sólidos que comprende de 10 a 40 por ciento en peso de partículas que consisten en silicato de magnesio hidratado insoluble en agua y que tienen un tamaño mediano de partícula de 0,8 a 2,5 μm, y de 20 a 70 por ciento en peso de solución salina cristalina tamponada con fosfato que es fácilmente soluble en agua para producir una solución que tiene un pH de 5,5 a 7,0 a 70 hasta 95 grados Celsius.
Description
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
DESCRIPCION
Método y kit de partes para la extracción de ácidos nucleicos AREA DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere a un procedimiento para el aislamiento y la purificación de ácidos nucleicos a partir de muestras de alimentos para su posterior análisis, especialmente por PCR, y a una composición química y un kit para uso en el aislamiento de ácidos nucleicos.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Las regulaciones de seguridad alimentaria y etiquetado están aumentando con el volumen del comercio. Esto también representa una situación exigente para las cadenas de suministro de alimentos. El procesamiento industrial de alimentos aumenta aún más los riesgos de contaminación con microorganismos y alérgenos inadvertidos. Dado que los consumidores y los organismos reguladores exigen certeza con respecto a los productos, se necesita una correcta identificación y etiquetado de los ingredientes, por ejemplo, con respecto a las especies en mezclas procesadas de materiales cárnicos o vegetales. Esto se aplica también a productos biológicos tales como prendas de vestir, textiles y pieles; por ejemplo, muchos consumidores occidentales no desean usar pieles de gato debido a alergias o por motivos éticos.
El aislamiento y el análisis por PCR de ácidos nucleicos es un método común para la detección e identificación de especies u organismos no deseados. Comúnmente, la muestra de material biológico se rompe mecánicamente y se lisa mediante tratamiento químico, seguido de la posterior purificación de los ácidos nucleicos aislados. Sin embargo, las muestras crudas y procesadas exhiben composiciones muy diversas y, en consecuencia, requieren tratamiento y procesamiento de la muestra diferentes. Es difícil saber de antemano qué tipo de procesamiento de la muestra es necesario para obtener suficientes ácidos nucleicos y suficientemente puros para el posterior análisis de PCR.
EP 2 634 254 B1 (QIAGEN GmbH) describe un método para aislar ADN bacteriano a partir de cultivos de enriquecimiento, en el que la muestra se mezcla con una sustancia no miscible en agua. WO 2013/010674 A1 describe un método de aislamiento de ADN que usa un dispositivo de filtración que contiene bentonita para la eliminación de proteínas. El método más establecido para el aislamiento de ADN genómico emplea el tensioactivo catiónico bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) para la desnaturalización y eliminación de proteínas (Drábková LZ et al., DNA extraction from herbarium specimens, Methods Mol Biol. 2014;11 15:69-84). Este método requiere el uso de una sustancia química costosa y peligrosa, y también es laborioso y lleva mucho tiempo. El estado de la técnica representa, por lo tanto, un problema.
Otro método para el aislamiento y purificación de ADN se describe en EP 0 512 767 A1, US 2003/170664 A1, WO 2006/073472 A2 y por Sails AD y otros en "A Real-Time PCR Assay for the Detection of Campylobacter jejuni in Foods after Enrichment Culture", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 2003, 69: 1383-1390; O'Grady et al. "Rapid real-time PCR detection of Listeria monocytogenes in enriched food samples based on the ssrA gene, a novel diagnostic target", FOOD MICROBIOLOGY, 2007, 25:75-84; y Monaci L et al "Immunochemical and DNA based methods in food allergen analysis and quality assurance perspectives", TRENDS IN FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY, 2010, 21(6);272-283.
NEHA J et al describen en un artículo "Real-time loop-mediated isothermal amplification assay for rapid and sensitive detection of anthrax spores in spiked soil and talcum powder", WORLD JOURNAL OF MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, 2010, 27(6):1407-1413 una composición para uso en la extracción y purificación de ácidos nucleicos a partir de muestras, que comprende de 10 a 40 por ciento en peso de partículas que consisten en silicato de magnesio hidratado insoluble en agua enriquecido con esporas de B. anthracis y que tienen un tamaño mediano de partícula de 0,8 a 2,5 pm (es decir, polvo de talco) y solución salina tamponada líquida con fosfato.
RESUMEN DE LA INVENCION
El problema se resuelve mediante una composición y un método como se describe en las reivindicaciones 1 y 8. Las realizaciones preferidas de la invención se describen en las reivindicaciones dependientes 2 a 7 y 9 a 13.
La composición para uso en la extracción y purificación de ácidos nucleicos está hecha de una mezcla de sólidos que comprende de 10 a 40 por ciento en peso de partículas que consisten en silicato de magnesio hidratado insoluble en agua y que tienen un tamaño medio de partícula de 0,8 a 2,5 pm; y de 20 a 70 por ciento en peso de solución salina cristalina tamponada con fosfato que es fácilmente soluble en agua para producir una solución que tiene un pH de 5,5 a 7,0 a 70 hasta 95 grados Celsius. En una realización preferida, la composición y la mezcla de sólidos ha sido porcionado como un comprimido o una cápsula que tiene un peso predefinido conocido, de modo que solo es necesario pesar la cantidad de muestra y no la cantidad del agente de liberación y purificación. La composición comprende preferiblemente de 20 a 35 por ciento en peso de un coloide hidrófilo que es eficaz para
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
dispersar la mezcla de sólidos en agua. Las partículas de silicato de magnesio hidratado tienen preferiblemente un tamaño mediano de partícula de 1,0 a 2,0 pm, más preferiblemente de 1,2 a 1,5 pm.
En una realización preferida, la presente descripción se refiere a un comprimido o una cápsula que comprende esencialmente una composición que comprende de 10 a 25 por ciento en peso de partículas de silicato de magnesio hidratado insoluble en agua; de 45 a 70 por ciento en peso de solución salina tamponada con fosfato, y de 20 a 30 por ciento en peso de un coloide hidrófilo eficaz para dispersar la mezcla de sólidos en agua. La composición puede comprender además uno o más agentes de lisis celular no caotrópicos. El coloide hidrófilo se puede seleccionar entre uno o más de celulosa, carboxi-metil celulosa, derivados de celulosa, alginato, almidón, goma de xantano, goma arábiga, goma guar o mezclas de los mismos.
El método estándar descrito para aislar ADN a partir de diversas muestras alimentarias y alimentos para animales, incluidas las bebidas, para el posterior análisis de PCR, comprende los siguientes pasos: (i) obtener una cantidad de peso o volumen predefinidos de la muestra, preferiblemente como pequeñas partículas, solución o dispersión, y transferir la muestra a un recipiente; (ii) agregar una cantidad predefinida de la mezcla de sólidos como se describe anteriormente, para obtener en el recipiente una relación 1:5 a 5:1 de peso de sólidos a muestra; (iii) añadir además una cantidad de agua para disolver los componentes del tampón de la mezcla de sólidos para obtener una solución salina tamponada acuosa con fosfato que tiene un pH de 5,5 a 7,0 y una concentración de sal de 0,6 a 1,2 Mol/L, (iv) obtener una dispersión de la muestra y la mezcla de sólidos en solución salina tamponada con fosfato y calentar la solución o dispersión a una temperatura de 70 a 95 grados Celsius durante 1 minuto a 30 minutos, preferiblemente durante aproximadamente 5 minutos a 20 minutos, para liberar los ácidos nucleicos de los materiales celulares y otros componentes insolubles en agua de la muestra; (v) separar de la fase acuosa los componentes insolubles en agua de la muestra y de las mezclas de sólidos, preferiblemente por centrifugación o filtración, junto con los componentes adsorbidos a las partículas de silicato de magnesio de la mezcla de sólidos; (vi) retirar el sobrenadante acuoso o filtrado que contiene ácidos nucleicos solubles, seguido de un paso de desalinización para obtener una solución de ADN de la muestra adecuado para el análisis por PCR. Una persona experta en la técnica apreciará que uno o más pasos de este método son intercambiables sin apartarse del principio de purificación descrito.
Otra realización se refiere a un kit de partes para extraer y purificar ácidos nucleicos a partir de muestras, que comprende cantidades porcionadas de la composición y mezcla de sólidos descritos. La composición, el método y el kit se pueden usar para aislar y caracterizar el tipo de ácidos nucleicos a partir de materiales animales y vegetales crudos y/o procesados y sus productos procesados. Son particularmente adecuados para aislar ácidos nucleicos característicos de potenciales alérgenos presentes en cereales y sus productos, garbanzo y sus productos, caseína, almendra y sus productos, anacardo y sus productos, cacahuete y sus productos, avellana y sus productos, macadamia y sus productos, mostaza y sus productos, soja y sus productos, sésamo y sus productos, nuez y sus productos, pistacho y sus productos, altramuz y sus productos, apio y sus productos, pescados y sus productos, crustáceos y sus productos. Son adecuados además para aislar ácidos nucleicos característicos de organismos genéticamente modificados, patógenos, Salmonella spp., Listeria spp. Shigella spp., Campylobacter spp., Cronobacter spp., Clostridium spp., Legionella spp., Enterobacteriaceae, Escherichia spp..
En otra realización, la composición, el método y el kit se pueden usar para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de muestras fecales, preferiblemente muestras de heces de humanos y animales.
La composición para extraer y purificar ácidos nucleicos a partir de las muestras de alimentos puede comprender de 10 a 40 por ciento en peso de partículas de silicato de magnesio hidratado insoluble en agua; de 20 a 70 por ciento en peso de una solución salina cristalina tamponada con fosfato que es soluble en agua produciendo de manera efectiva una solución que tiene un pH de 5,5 a 7,0; y de 20 a 35 por ciento en peso de un coloide hidrofílico que se hincha en contacto con el agua y es efectivo para dispersar la mezcla de sólidos en el agua. El silicato de magnesio hidratado utilizado puede tener un tamaño mediano de partícula de 1,2 pm y una densidad de 2,8 g/cm3. En una realización preferida, la mezcla de sólidos puede ser un comprimido o una cápsula para que la disolución de la mezcla de sólidos en una solución acuosa pueda dar como resultado 5 a 7 veces solución salina tamponada con fosfato que tiene un pH de 5,5 a 7 a aproximadamente 70 hasta aproximadamente 95 grados Celsius.
Un aspecto de la presente descripción se refiere a un método de purificación de ADN genómico a partir de muestras de alimentos, que comprende los pasos de i) obtener una cantidad predeterminada de una muestra de alimento; ii) transferir la muestra de alimento a un tubo de reacción; iii) agregar la mezcla de sólidos de la presente descripción a la muestra de alimento, dicha mezcla de sólidos comprendiendo solución salina tamponada con fosfato que es soluble en agua produciendo de manera efectiva una solución con un pH de 5,5 a 7,0; iv) añadir una cantidad predeterminada de agua: v) mezclar la muestra y dicha mezcla de sólidos, el contenido del comprimido siendo liberado, produciendo una solución que tiene una concentración de 5 a 7 veces de salino tamponado con fosfato; vi) calentar el tubo de reacción hasta una temperatura en el rango de 70 a 95 grados Celsius; y vii) extraer ácidos nucleicos de la matriz de alimentos, seguido de la recuperación de los ácidos nucleicos extraídos; la matriz de alimento siendo incubada con la composición de extracción de ácidos nucleicos en el paso vi) durante un período de tiempo suficiente para extraer los ácidos nucleicos.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
La descripción se refiere además a un método para preparar una composición de extracción de ácidos nucleicos, que comprende los pasos de i) proporcionar una mezcla sólida particulada de 10 a 40 por ciento en peso de partículas de silicato de magnesio hidratado insoluble en agua; y de 20 a 70 por ciento en peso de solución salina cristalina tamponada con fosfato; ii) añadir de 20 a 35 por ciento en peso de un colloide hidrófilo a dicha mezcla particulada; iii) compactar dicha mezcla partículada junto con el coloide hidrófilo en un comprimido o una cápsula; y opcionalmente, recubrir el comprimido o la cápsula con una película.
En otro aspecto, la descripción proporciona un kit de partes para extraer y purificar ácidos nucleicos a partir de muestras de alimentos, que comprende i) un comprimido o una cápsula que tiene la composición de acuerdo con la presente descripción; y opcionalmente, uno o más tubos de reacción con reactivos sólidos o líquidos.
En otra realización preferida, el método y el kit de partes pueden usarse para extraer ácidos nucleicos a partir de alérgenos seleccionados de cereales y sus productos, garbanzo y sus productos, caseína, almendra y sus productos, anacardo y sus productos, cacahuete y sus productos, avellana y sus productos, macadamia y sus productos, mostaza y sus productos, soja y sus productos, sésamo y sus productos, nuez y sus productos, pistacho y sus productos, altramuz y sus productos, apio y sus productos, pescado y sus productos, crustáceos y sus productos. En otra realización, el método y el kit de partes pueden usarse para extraer ácidos nucleicos de organismos genéticamente modificados.
Otra realización preferida se refiere al uso de la composición de acuerdo con la presente descripción en el análisis de ácidos nucleicos mediante reacción en cadena de la polimerasa.
Mediante la adición de un solo comprimido que comprende la mezcla de sólidos de acuerdo con la presente descripción, y de agua caliente de 70 a 95 °C, ya no hay necesidad de enzimas adicionales, disolventes orgánicos, tensioactivos, etc. para obtener una ruptura de la matriz de muestra. El comprimido o la cápsula de la composición puede usarse con todas las matrices de alimentos probadas porque la alta fuerza osmótica, debido a la gran cantidad de sal, en combinación con las altas temperaturas conduce a una liberación de ácidos nucleicos a partir de todas las matrices biológicas. Por otro lado, el tampón con fosfato ligeramente ácido estabiliza las cadenas de ácidos nucleicos incluso en soluciones acuosas de hasta 95 grados Celsius. Lo que es más importante, un método puede usarse con todo tipo de matrices biológicas como cuero, pieles, textiles, chocolate, cereales, materiales que contienen nueces, carne, etc. Esto es particularmente importante para los numerosos alimentos procesados y barras de chocolate.
Una importante ventaja es el establecimiento de un procedimiento de rutina en el análisis de muestras con diferentes propiedades físico-químicas tales como alimentos ricos en lípidos (chocolate/pastas de nueces), proteínas (carnes), polisacáridos (cereales) y, en particular, mezclas de los mismos. Ya no es necesario adaptar el método a la matriz alimentaria que, de nuevo, requiere experiencia de laboratorio y equipo adicional. A través de la presente descripción, cualquier persona sin una amplia experiencia de laboratorio puede así realizar una extracción de ácidos nucleicos a partir de cualquier muestra biológica, incluso cuando las muestras sean de diferente origen. La estandarización total de la extracción de ácido nucleico a partir de prácticamente cualquier matriz biológica o alimentaria se consigue con la composición y el método descritos (comprimido).
La extracción convencional de CTAB o de disolvente orgánico está, además, asociada con riesgos para la salud debido a los disolventes orgánicos y tensioactivos. Es más, los métodos convencionales requieren una eliminación completa de disolventes, reactivos y tensioactivos añadidos para evitar la interferencia con la reacción en cadena de la polimerasa. Estos incluyen detergentes iónicos tales como desoxicolato de sodio, sarcosilo y SDS, etanol e isopropanol, fenol y otros. Los tipos de muestras biológicas que se sabe que contienen inhibidores incluyen sangre, telas, tejidos y tierra. Inhibidores de PCR típicos endógenos a muestras biológicas son sales biliares (heces), polisacáridos complejos y otros (heces, materiales vegetales), colágeno, mioglobina, hemoglobina, inmunoglobulinas y hemo (carne y sangre), ácido húmico (suelo, materiales vegetales), melanina y eumelanina (cabello, piel), iones de calcio y proteinasas (leche, hueso). La presente descripción supera los problemas comúnmente asociados con los inhibidores de PCR endógenos y añadidos, en primer lugar, al no requerir ningún disolvente orgánico o agente tensioactivo y, en segundo lugar, mediante la eliminación de esos inhibidores junto con las partículas de silicato de magnesio hidratado. Sin querer limitarse a una teoría, se supone que el paso de calentamiento descrito conduce a una desnaturalización completa de inhibidores de la polimerasa proteínicos, mientras que los inhibidores hidrófobos, lipófilos y ácidos se adsorben sobre las partículas de silicato de magnesio. El polvo de silicato actúa como estabilizador del ADN genómico y se une, al menos, a una porción de lípidos, proteínas, polisacáridos y sales contenidas en la matriz, precipitándolos y eliminándolos de la fracción que contiene el ADN genómico.
La evaluación del contenido de ácido nucleico y/o la presencia de inhibidores en una muestra se lleva a cabo basándose en el valor de Ct obtenido mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real. Valores bajos de Ct indican que la ADN polimerasa requiere menos ciclos para amplificar el ADN blanco en la muestra. El método y el kit de la descripción permiten una extracción de ácidos nucleicos rápida, segura y económicamente ventajosa a partir de matrices alimentarias, sin las desventajas de los enfoques convencionales.
Como ya se mencionó, el agente tamponador es responsable de crear un choque osmótico, forzando al citoplasma y, en particular, al núcleo de la célula a liberar su contenido en el medio de extracción preservando la integridad del
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
ácido nucleico para su posterior análisis. Por lo tanto, se recomienda un paso de desalinización antes del análisis de PCR para reducir la concentración de sal en la reacción. Esto puede llevarse a cabo mediante cromatografía de exclusión por tamaño, ultrafiltración o cromatografía convencional de unión a ADN. Alternativamente, la muestra de PCR también puede diluirse simplemente para reducir la concentración de sal a niveles aceptables.
Ventajas, objetivos y realizaciones adicionales de la invención son evidentes a partir de las ilustraciones adjuntas, ejemplos representativos y reivindicaciones. La invención, sin embargo, no estará limitada por los ejemplos, sino que se ha definido en las reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS ILUSTRACIONES
En las ilustraciones:
Fig. 1 es un diagrama que muestra una comparación del umbral del ciclo para la detección de mostaza
por PCR en muestras con cantidades conocidas de mostaza (log ppm).
Fig. 2 es un diagrama que muestra una comparación del umbral del ciclo para la detección de mostaza
amarilla por PCR en muestras con cantidades conocidas de mostaza amarilla (log ppm).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La composición para uso en extraer y purificar ácidos nucleicos a partir de muestras de alimentos es una mezcla de sólidos que comprende de 10 a 40 por ciento en peso de silicato de magnesio hidratado insoluble en agua que tiene un tamaño mediano de partícula de 0,8 a 2,5 pm, y de 20 a 70 por ciento en peso de sal cristalina que es fácilmente soluble en agua para producir un tampón salino con fosfato que tiene un pH de 5,5 a 7,0 a 70 hasta 95 grados Celsius. Una mezcla de sólidos es una combinación de sustancias sólidas en forma de polvo, gránulos, partículas o cristales sin un disolvente líquido. El silicato de magnesio hidratado insoluble en agua es preferiblemente un silicato de magnesio hidratado o talco fino en forma de un polvo fino o finamente granulado. Dicho polvo de silicato de magnesio hidratado puede tener un tamaño mediano de partícula en el rango de 1,0 a 2,0 pm. preferiblemente de 1,2 a 1,5 pm; un diámetro mediano D50 en el rango de 0,8 a 2,5 pm; y una densidad de 2,6 a 2,8 g/cm3. El polvo de silicato insoluble tiene, por lo tanto, una gran superficie para la adsorción de lípidos, azúcares complejos y otros potenciales inhibidores de la polimerasa.
La sal tampón con fosfato puede estar presente en la mezcla de sólidos como cristales finos o en forma granulada y su composición es preferiblemente la siguiente: NaCl 137 mmol/L, Na2HPO4 • 2 H2O 10 mmoI/L, KCl 2,7 mmol/L, KH2PO4 2 mmol/L. La sal tampón con fosfato dará, después de disolverse, una solución hipertónica de modo que los ácidos nucleicos también se liberen de la muestra biológica a través del choque osmótico resultante. La composición de la solución salina tamponada con fosfato es preferiblemente tal que de un pH de 5,5 a 7 a una temperatura del agua de 70 a 95 grados Celsius.
Las partículas de la mezcla de sólidos se pueden presionar o comprimir y porcionar para obtener un comprimido. Un comprimido está hecho solo de la mezcla de sólidos. Una cápsula puede estar hecha de gelatina y rellenada con la mezcla de sólidos, sin ser presionada. La compactación de la composición se puede realizar mediante cualquier dispositivo convencional para compresión polvo conocido por el experto en la técnica.
El coloide hidrofílico hinchable puede estar presente en la mezcla en forma granulada o microcristalina. El material hinchable adecuado para la disolución rápida del comprimido o la cápsula con polvo puede elegirse entre celulosa, carboximetilcelulosa, derivados de celulosa, alginato, almidón, goma de xantano, goma arábiga, goma guar o sus mezclas. El coloide hidrófilo hinchable puede facilitar tanto la compactación de la composición como la dispersión de la mezcla de sólidos al contacto con agua. El material hinchable debe estar libre de contaminantes, en particular ácidos nucleicos animales, organismos genéticamente modificados y alérgenos. Además, el comprimido puede contener uno o más detergentes no caotrópicos y enzimas termoestables. El comprimido puede recubrirse opcionalmente con una película, preferiblemente hecha de celulosa, preferiblemente derivados de celulosa, la más preferida hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) para excluir la humedad y evitar residuos del comprimido.
El comprimido o la cápsula puede comprender una mezcla de sólidos compuesta de 10 a 25 por ciento en peso de partículas de silicato de magnesio hidratado insoluble en agua; de 45 a 70 por ciento en peso de sal tamponada con fosfato; y de 20 a 30 por ciento en peso de un coloide hidrofílico hinchable eficaz para asistir en la dispersión en agua de la mezcla de sólidos.
El método estándar para aislar ADN a partir de una diversidad de muestras para el posterior análisis por PCR puede comprender los siguientes pasos: se prepara una cantidad predefinida de peso o volumen de 10 a 100 g (ml) de la muestra usando una báscula o pipeta. La muestra puede disociarse preferiblemente usando un molinillo o mezclador que da como resultado pequeñas partículas, solución o dispersión. Una porción de 50 mg a 5 g de la muestra disociada puede pesarse con una balanza y, con una espátula, transferirse a un recipiente que tenga un seguro para evitar la contaminación y el derramamiento. Se puede agregar a la muestra una cantidad predefinida de la mezcla de sólidos de 50 mg a 1 g para obtener en el recipiente una relación de peso de sólidos de 1:5 a 5:1 de mezcla de sólidos a muestra. Una cantidad de agua, previamente calentada a una temperatura de 70 a 95 grados centígrados
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
usando un hervidor puede ser agregado para disolver los componentes del tampón de la mezcla de sólidos para obtener una solución salina tamponada acuosa con fosfato que tiene un pH de 5,5 a 7,0 y una concentración de sal de 0,6 a 1,2 Mol/L. La dispersión de la muestra y la mezcla de sólidos en tampón salino con fosfato se puede obtener agitando en vórtex o sacudiendo la muestra de 1 segundo a 120 segundos. Alternativamente, se puede usar un mezclador, preferiblemente un mezclador de pistón. La solución o dispersión se puede calentar a una temperatura de 70 a 95 grados Celsius usando cualquier baño de agua, bloque térmico, horno o cualquier otro aparator de calentamiento como un microondas. El tratamiento térmico puede tomar de 1 minuto a 30 minutos, preferiblemente durante aproximadamente 5 minutos a 20 minutos, para liberar los ácidos nucleicos de los materiales celulares y otros componentes insolubles en agua de la muestra. Debido al exceso de sal y fosfato, incluso un tratamiento prolongado de los ácidos nucleicos a 95 grados Celsius demostró no tener ningún efecto adverso apreciable en la estabilidad del ADN, si se prueba posteriormente mediante PCR. Se considera que una liberación de ácidos nucleicos ha tenido lugar cuando las estructuras celulares (membranas, orgánulos, etc.) están tan alteradas que ya no se produce una interacción de ácidos nucleicos con proteínas estructurales, lípidos y polisacáridos. La diferencia osmótica creada por la solución hipertónica también promueve una liberación de los ácidos nucleicos a partir de los núcleos celulares. Las altas temperaturas no solo rompen las paredes celulares y conducen a una desnaturalización de proteínas; también provocan un aumento de la solubilización de lípidos y polisacáridos que, sin embargo, se adsorben y se precipitan en estado de unión sobre las partículas de silicato de magnesio insolubles en agua. Al menos, son adheridas principalmente por las partículas de silicato de magnesio hidratado insolubles en agua y menos por las paredes internas del recipiente. Una separación de la fase acuosa de la mezcla de sólidos junto con los componentes insolubles en agua se puede realizar preferiblemente por centrifugación (por ejemplo, centrífuga de mesa) o filtración (por ejemplo, filtros de celulosa). El sobrenadante acuoso o filtrado que contiene ácidos nucleicos solubles libres de inhibidores de la ADN polimerasa se puede pipetear o decantar en un recipiente limpio.
El método estándar de aislamiento de ácidos nucleicos normalmente sigue con un paso de desalinización, que puede llevarse a cabo usando cromatografía de exclusión por tamaño, ultrafiltración o cromatografía de afinidad, tal como una columna de extracción de ácidos nucleicos comercial basada en sílice. Alternativamente, la muestra de ácido nucleico puede diluirse de modo que la concentración de sal se reduzca a niveles aceptables y la muestra sea adecuada para el análisis por PCR.
Otro aspecto se refiere a un kit de partes para extracción y detección de ácidos nucleicos a partir de una muestra alimentaria y puede comprender un comprimido que comprende una cantidad conocida de un composición lista para usar (mezcla de sólidos) para extraer ácidos nucleicos de acuerdo con la presente descripción y, opcionalmente, uno o más tubos de reacción con reactivos sólidos o líquidos.
En una realización preferida de la descripción, la composición, el método y el kit de partes para la extracción de ácidos nucleicos se pueden usar para aislar y caracterizar ácidos nucleicos de materiales animales y vegetales crudos y/o procesados y sus productos procesados. Materia cruda animal y vegetal significa partes o fragmentos de los organismos de donde derivan, sin experimentar previamente disociación mecánica, tratamiento químico o térmico. El material animal y vegetal procesado y sus productos implica materia que ha sido disociada mecánicamente y/o tratada químicamente o térmicamente, de modo que su forma original y propiedades físicas han sido alteradas.
En otra realización preferida, la composición, el método y el kit de partes para la extracción de ácidos nucleicos pueden usarse para aislar ácidos nucleicos característicos de potenciales alérgenos presentes en cereales y sus productos, garbanzo y sus productos, caseína, almendra y sus productos, anacardo y sus productos, cacahuete y sus productos, avellana y sus productos, macadamia y sus productos, mostaza y sus productos, soja y sus productos, sésamo y sus productos, nueces y sus productos, pistachos y sus productos, altramuces y sus productos, apio y sus productos, pescado y sus productos, crustáceos y sus productos. Animales, plantas o microorganismos son fuentes de alérgenos biológicos. La composición, el método y el kit de partes pueden utilizarse además para aislar ácidos nucleicos característicos de organismos genéticamente modificados, patógenos, Salmonella spp.. Listeria spp. Shigella spp., Campylobacter spp., Cronobacter, Clostridium spp., Legionella spp., Enterobacteriaceae, Escherichia spp. Un organismo modificado geneticamente (OMG) es un organismo tal como bacteria, levadura, insectos, plantas, peces y mamíferos, cuyo material genético ha sido cambiado usando técnicas de ingeniería genética. Un patógeno significa cualquier organismo tal como bacterias, hongos o protozoos que pueden inducir una enfermedad en su organismo huésped.
En otra realización preferida, la composición, el método y el kit de partes para la extracción de ácidos nucleicos se pueden usar para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de muestras fecales, preferiblemente muestras fecales de animales y humanos.
La detección y cuantificación de material foráneo en muestras alimentarias mediante una reacción en cadena de la polimerasa es conocida por los expertos en la técnica. Sin embargo, la purificación de ácidos nucleicos a partir de matrices complejas requirió una adición de diversas enzimas de disrupción, disolventes orgánicos y tensioactivos. ADN suficientemente puro significa aquí "libre de inhibidores específicos de ADN polimerasa" de modo que se obtenga una amplificación del ADN extraído. La extracción de ADN y la eficacia de purificación se pueden describir
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
mediante el denominado umbral de ciclo (Ct), que es el número de reacciones de polimerasa necesarias para amplificar un molde de ADN en la muestra hasta el nivel de detección. Los valores más bajos de Ct significan un menor número de ciclos requeridos para amplificar el ADN molde y, por lo tanto, una mayor sensibilidad de detección.
Más allá del análisis de muestras de alimentos, también es posible la detección de pieles de animales domésticos (es decir, gatos, perros) en productos de prendas falsamente etiquetados. También otros materiales sólidos (por ejemplo, textiles, paños, etc.) pueden someterse eficazmente a una extracción de ácidos nucleicos como se ha descrito. La composición, el método y el kit de la descripción se pueden aplicar uniformemente a todos los tipos de muestras de alimentos, reduciendo considerablemente los pasos de extracción de ácidos nucleicos así como minimizando los errores de pipeteo y la contaminación. De manera más importante, se puede aplicar a matrices de muestras desconocidas y ya no es necesario usar diferentes métodos de purificación de ácidos nucleicos para la diversidad de muestras. En otras palabras, el método ya no debe probarse previamente en una muestra. El método de la presente descripción es sensible y reproducible para diferentes laboratorios y muestras, así como diferentes reacciones de PCR, permitiendo el establecimiento de curvas estándar para la determinación de ácidos nucleicos en una muestra a partir de animales, plantas, bacterias, organismos genéticamente modificados y alérgenos.
Otras realizaciones, objetos y ventajas de la invención serán evidentes a partir del estudio de los ejemplos que se dan a continuación.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Composición para la extracción de ADN y comprimido de sal/talco
Talco de calidad farmacéutica en forma de polvo se utilizó para la preparación de los comprimidos de extracción de ADN. El talco tuvo un tamaño medio de partícula de 1,2 pm, un diámetro mediano D50 de 0,65 pm y una densidad de 2,8 g/cm3. El polvo de talco (silicato de magnesio hidratado) tuvo la siguiente composición; SO2 (61,5%), MgO (31,0%), CaO (0,4%), Fe2O3 (0.6%), (AI2O3) 0,5%, con un pH de 8,8. El segundo componente fue solución salina tamponada con fosfato de acuerdo a Dulbecco (1 x PBS = NaCl 137 mmol/L, Na2HPO4. 2 H2O 10 mmol/L, KCl 2,7 mmol/L, KH2PO4 2 mmol/L) y se añadió como una sal microcristalina. Como agente de desintegración se usó celulosa microcristalina hinchable de calidad farmacéutica libre de contaminantes. Los tres componentes fueron comprimidos en un comprimido usando una prensa de estampado. El comprimido de "sal" tuvo un peso unitario total de 117 mg y consistió en partículas de talco; 20 mg (17,1%); sal cristalina de PBS; 68 mg (58,1%) celulosa hinchable, 29 mg (24,8%). El comprimido se dimensionó para la extracción de muestras de alimentos en aproximadamente 200 mg.
Ejemplo 2- Extracción de ADN de muestras de alimentos complejos ("Protocolo de sal")
Extracción de ADN: 10 g de muestra (salchicha Bockwurst en tripa, desayuno de agricultor (tipo de jamón), salchicha roja, pizza con salami, salsa boloñesa, salchicha ahumada, pollo cordon bleu, sopa de fideos con pollo y alimento para animales) se homogeneizaron mecánicamente usando un molinillo con cuchillas giratorias. Cuando la muestra molida se volvió líquida se homogeneizó adicionalmente usando un homogeneizador de vidrio con un pistón. Se transfirieron 200 mg de muestra homogénea a un tubo Eppendorf de 2 ml usando una pipeta o espátula. Se añadió un (1) comprimido de extracción de muestra del ejemplo 1 junto con 1 ml de agua destilada. La concentración de PBS en la solución de muestra resultante fue aproximadamente 5 veces. El tubo se sometió a vórtex durante 5 segundos y se colocó en un baño de agua a 95 grados Celsius durante 20 minutos. Después de la centrifugación a
14.000 rpm, a temperatura ambiente durante 5 minutos, el sedimento con el precipitado se descartó y el sobrenadante claro se usó para análisis adicionales.
Desalinización: el sobrenadante se desalinizó utilizando una columna de afinidad de ADN (Centrispin, Genaxxon) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, se añadieron 100 ml de sobrenadante a 500 pL de tampón de unión y el volumen (600 pL) se cargó en una columna de centrifugación de ADN equilibrada, seguido de
14.000 rpm durante 2 minutos a temperatura ambiente. El flujo circulado se descartó, la columna se lavó con 700 pl de tampón de lavado y la muestra de ADN se eluyó con 50 pL de tampón de elución.
Ejemplo 3 - Extracción CTAB convencional de ADN
Con fines comparativos, las mismas muestras homogenizadas también se sometieron a extracción de ADN utilizando el protocolo CTAB de extracción de ADN. Para este fin, 100 ml tampón de lisis CTAB se preparó mezclando 2,0 g de CTAB (bromuro de hexadeciltrimetilamonio). 10,0 ml de Tris 1M, pH 8,0, 4,0 ml de EDtA 0,5 M, pH 8,0, 28,0 ml de NaCl 5 M, 40,0 ml H2O. El pH se ajustó con HCl a pH 8,0 y se añadió agua destilada hasta un volumen de 100 ml. Se mezclaron 2 g de muestra homogeneizada con 10 ml de tampón de lisis de CTAB y 25 pL de proteinasa K (20 mg/ml) y se incubó durante la noche a 60 grados Celsius bajo agitación suave. Después de la centrifugación a 4.000 g a temperatura ambiente durante 5 minutos, el primer sedimento se descartó y el sobrenadante se centrifugó de nuevo a 14.000 g, a temperatura ambiente durante 10 minutos. Despues se extrajo el sobrenadante con un volumen igual de cloroformo. 600 pL de fase acuosa se mezclaron con 1,2 ml de tampón de precipitación CTAB (5 g/L de CTAB, 0,04 mol/L de NaCl), el ADN precipitó a temperatura ambiente durante 60
5
10
15
20
25
30
35
40
minutos, seguido de centrifugación a 14.000 g, a temperatura ambiente durante 10 minutos. El sobrenadante fue descartado y el sedimento de ADN recogido en 350 pL de solución de NaCI 1,2 mol/L. Después de otra extracción con 350 pL de cloroformo, el ADN en la fase acuosa volvió a precipitarse con isopropanol a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después de la centrifugación, el sobrenadante fue descartado y el sedimento de ADN se centrifugó con 500 pL de etanol al 70% frío y se secó a temperatura ambiente. El sedimento de ADN seco se disolvió en 100 pl de TE 0,1x. RT-PCR y la determinación del valor de Ct se realizaron como se describe en el ejemplo 2.
Ejemplo 4 - PCR en tiempo real, valor de Ct y evaluación de la inhibición de PCR
RT-PCR se realizó utilizando el instrumento RotorGene (Qiagen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La PCR se realizó en un volumen de 20 pL que comprende 10 pL 2x SensiFAST™ Multiplex Master Mix (Bioline GmbH, Luckenwalde, DE), ADN de referencia 200 nM, cebadores 400 nM y 10 pL de extracto de ADN. El SensiFast Multiplex MasterMix consta de un sistema tampón, Mg2+, los cuatro dNTP y la ADN polimerasa. El termociclador para PCR se programó con un paso inicial de incubación a 95°C durante 5 minutos seguido de 45 ciclos de incubación a 95°C durante 15 segundos, 60°C durante 15 segundos y 72°C durante 10 segundos. La PCR se llevó a cabo en duplicados. El valor de Ct fue determinado por el software RotorGene usando un umbral de 0,02.
Para la evaluación de la inhibición de PCR (control de inhibición), se añadieron 2 ng de ADN extraído y preparado de acuerdo al ejemplo 2 ("Sal") o al ejemplo convencional 3 (CTAB) a partir de carne de cerdo, pollo, pavo, rumiante, etc. en un volumen de 10 pL sin primers. De lo contrario, se agregaron cebadores específicos para la detección del ADN diana de cerdo, vaca, pollo, pavo, rumiante.
La inhibición relativa de PCR por la muestra puede obtenerse de los valores de Ct para la amplificación de ADN de referencia (control de inhibición). Los resultados se muestran en la tabla 1.
TABLA 1
- Sistema de ensayo Sistema de ensayo Control de Control de inhibición inhibición
- Matriz
- Especie Ct Sal Ct CTAB Ct Sal Ct CTAB
- Salchicha Bockwurst en tripa
- Cerdo 18.13 22,20 30,35 29,55
- Desayuno de agricultor
- Cerdo 18,93 23,04 29,49 29,39
- Salchicha roja
- Cerdo 20,86 24,99 31,76 29,75
- Pizza Salami
- Cerdo 19,83 22,01 28,32 28,23
- Salsa boloñesa
- Vaca 31,32 34,97 30,61 30,80
- Salchicha ahumada
- Vaca 22,65 25,84 30,41 30,95
- Cordon bleu de pollo
- Pollo 20,71 21,73 28,52 29,70
- Sopa de fideos con pollo
- Pollo 20,00 22,12 28,81 28,57
- Cordon bleu de pollo
- Pavo 20,09 21,84 28,83 28,85
- Alimento animal
- Rumiante 32,79 32,26 31,36 31,49
Los experimentos de control de inhibición muestran valores de Ct muy similares independientemente de la matriz de muestra a partir de la cual se preparó el ADN e independientemente del método de purificación (ejemplo 2 "Sal" o ejemplo 3 "CTAB").
Los resultados sugieren que los métodos de purificación de ADN aquí descritos (talco/sal PBS y protocolo CTAB) son equivalentes y se pueden usar para muchas matrices de alimentos diferentes, ya que resultan en sondas de ADN equivalentes en términos de sus propiedades de amplificación ("sin inhibición de la ADN polimerasa"). Esto confirma el alto rendimiento y la viabilidad del protocolo de extracción de talco/sal PBS, mientras que es más rápido (la extracción y RT PCR se puede hacer el mismo día), menos laborioso y no requiere el uso de productos químicos caros y desagradables. No se requieren caotrópicos químicos como CTAB o urea y no se deben realizar extracciones con solventes orgánicos como el cloroformo que requieren el uso de una campana extractora de laboratorio por razones de salud.
Lo que es más importante, la calidad del ADN diana (probado en cerdo, pollo, pavo, vaca o rumiante) fue regularmente mejor, independientemente de la matriz alimentaria original, cuando se usó el protocolo de talco/PBS. Si bien las soluciones de muestra fueron equivalentes con respecto a la cantidad de inhibidores de la PCR, los bajos valores de Ct para el ADN diana sugieren que el ADN diana aislado de acuerdo al ejemplo 2 puede haber tenido una calidad superior que el ADN extraído y purificado de acuerdo al protocolo CTAB.
Ejemplo 5 - Efectos del talco
Harina de soja, lecitina de soja y condimento comercial se homogeneizaron como se ha descrito y se extrajo y se aisló el ADN de muestra de acuerdo al método del ejemplo 2. Para comparar, solo se añadió celulosa y sal PBS (sin talco). Después de la centrifugación, se observaron dos fases bien definidas en las preparaciones de ADN con talco/PBS añadido, es decir, un sobrenadante claro y un sedimento precipitado definido, mientras que el
5
10
15
20
25
30
35
40
sobrenadante en la preparación sin talco todavía estaba turbio. El sobrenadante se usó en cada caso para la purificación de ADN como se ha descrito. PCR en tiempo real y los valores de Ct para el ADN de soja y de apio se determinaron como se ha descrito anteriormente. Para los resultados, véase la tabla 2.
TABLA 2
- Matriz
- Parámetro PCR Sin talco Con talco
- Harina de soja
- Soja 21,7 21,1
- Lecitina de soja
- Soja 33,5 30,7
- Condimento
- Apio 25,5 25,1
En cada caso, el talco añadido había adsorbido y precipitado inhibidores de la ADN polimerasa presentes en la matriz de lecitina o el condimento como se muestra en la valores más bajos de Ct. La adición de talco facilita aún más el manejo de muestras que contienen muchos fosfolípidos, ácidos grasos y triglicéridos.
Ejemplo 6 - Extracción de ADN a partir de lecitina de soja
La lecitina de soja se homogeneizó y se extrajo y purificó el ADN como se describe en el ejemplo 2 (talco/sal PBS) o el ejemplo comparativo 3 (CTAB). El rendimiento de ADN se analizó midiendo la DO a 280 nm y la relación de OD a 260 nm/280 nm. Los resultados se muestran en la Tabla 3.
TABLA 3
- Sal/Talco CTAB
- Valor DO 260nm
- 0,017 0,118
- Relación 260nm/280nm
- -3,2 1.67
- Concentración de ADN
- 0,9 ng/pL 5,9 ng/pL
El protocolo CTAB dió un mayor rendimiento y pureza de ADN (proteína/ADN). Sin embargo, estas ventajas no se mantuvieron cuando el ADN se sometió a análisis de PCR.
La PCR en tiempo real se realizó como se describe en el ejemplo 4. El ADN diana fue para contaminación con soja Roundup Ready™ modificada genéticamente, es decir, se agregaron pares de cebadores para la detección de 35S (promotor 35S, originado a partir del virus del mosaico de la coliflor), nos (nopalina sintasa-terminador, derivado de Agrobacterium tumefaciens), RRS (5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa, obtenida de la cepa CP4 de A. tumefaciens). Las condiciones de control de la inhibición de la PCR se realizaron como se describe en el Ejemplo 4. Consúltese la tabla 4 para los resultados.
TABLA 4
- Sistema de ensayo Sistema de ensayo Control de inhibición Control de inhibición
- Gen de ensayo
- Valor Ct Sal Valor Ct CTAB Valor Ct Sal Valor Ct CTAB
- Soja
- 28,67 31,64 29,5 31,2
- 35S
- 36,78 37,85 29,42 32,19
- NOS
- 39,53 39,09 29,83 31,6
- RRS
- 39,54 34,93 30,32 30,36
Nuevamente, los experimentos de control de inhibición dieron como resultado valores de Ct similares. Si bien no se encontraron diferencias importantes, la inhibición ligeramente mayor en las muestras preparadas de acuerdo al protocolo CTAB sugiere que trazas del CTAB añadido, que también tiene actividad inhibidora de la ADN polimerasa, podrían haber estado presentes en esas muestras, mientras que el talco y la sal de PBS pueden eliminarse más fácilmente y de forma segura.
El protocolo talco/PBS resultó en valores de Ct generalmente más bajos que el protocolo CTAB. A pesar de los rendimientos de ADN más bajos con el protocolo de talco/PBS (véase la tabla 2), los valores de Ct para los transgenes analizados fueron equivalentes para ambos métodos de extracción de ADN. Los valores de Ct fueron diferentes para los diversos genes investigados, lo que indica diferente cantidades de contaminación.
Ejemplo 7- Detección de organismos genéticamente modificados en cereales y plantas
Se analizaron granos de maíz, proteína aislada de soja, soja, pan tostado multicereal, harina de mostaza, semillas de colza y alimento animal como se ha descrito anteriormente. Se añadieron cebadores para la detección de 35S,
5
10
15
20
25
RRS, FMV (promotor del virus figwort de mosaico), nos, Ctp2 (GTP2-CP4EPSPS, intersección del péptido de tránsito de cloroplastos a 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa; de Arabidopsis thaliana y Agrobacterium sp. resistencia al herbicida Roundup Ready) y CAMV (CaMV, promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor). Véase tabla 5 para los resultados.
TABLA 5
- Sistema de ensayo Sistema de ensayo Control de inhibición Control de inhibición
- Matriz
- Gen Ct Sal Ct CTAB Ct Sal Ct CTAB
- Maiz
- 35S 29,27 30,59 29,61 29,48
- Proteína de soja
- RRS 31,36 34,69 31,46 31,34
- Soja
- FMV 36,98 38,21 31,44 33,24
- Tostada multicereal
- nos 27,40 26,91 30,70 29,58
- Harina de mostaza
- Ctp2 33,40 34,10 30,27 31,42
- Semilla de colza
- 35S 33,28 37,44 30,02 29,10
- Alimento animal
- CAMV 30,19 30,48 29,99 30,53
Los controles de inhibición dieron nuevamente valores de Ct similares para el ADN de referencia, de modo que ambos métodos de extracción de ADN pudieron usarse con todas las matrices de muestras probadas. Sin embargo, los valores de Ct obtenidos para los ADN diana sugieren que el ADN purificado utilizando talco/sal PBS generalmente está más intacto ("rendimiento de ADN de mejor calidad") que el ADN preparado a partir de una matriz de muestra usando el protocolo de extracción CTAB.
Ejemplo 8 - Extracción de ADN a partir de vegetales complejos/muestras de plantas
Pasta de almendra cruda, galletas (sin aromatizantes), arroz crujiente, mezcla de semillas de amapola y pasta de avellana oscura fueron examinados. La muestra de ADN se extrajo y se purificó como se ha descrito. Los resultados se muestran en la tabla 6.
TABLA 6
- Sistema de ensayo Sistema de ensayo Control de inhibición Control de inhibición
- Matriz
- Especies Ct Sal Ct CTAB Ct Sal Ct CTAB
- Pasta de almendra cruda
- Almendra 21,94 22,20 28,94 30,80
- Galleta (sin aromatizantes)
- Almendra 25,94 27,03 32,17 32,79
- Arroz crujiente
- Maíz 20,62 21,34 27,71 28,23
- Mezcla de semillas de amapola
- Maíz 29,16 27,79 30,78 31,74
- Pasta de avellana oscura
- So¡a 38,36 No Ct 31,55 33,23
Los valores de Ct para el ADN de referencia volvieron a ser similares para todas las preparaciones de muestras y matrices alimentarias, mientras que de nuevo notamos menos inhibición en las muestras preparadas de acuerdo al protocolo de talco/sal PBS. Los resultados sugieren aún mejor calidad de rendimiento de aDn con el protocolo de talco/sal PBS que con el protocolo CTAB ya que trazas de soja eran detectables en la "pasta de avellana oscura" probada que no se encontraron en la preparación comparativa de ADN utilizando el protocolo CTAB.
Ejemplo 9 - Detección basada en ADN de alérgenos en muestras de alimentos
Leche para untar que comprende copos de chocolate y avellanas, agente de pulverización para carne de cerdo ahumada, pulpa de avellana (tratada térmicamente a 166°C), hisopo, almendra (molida, pedazos de tamaño 1-2 mm), perejil (molido), mezcla de condimentos y salmón gratinado se analizaron para detectar ADN de fuentes típicas de alérgenos (avellana, mostaza, nuez pecana, pescado, cacahuete y apio). Los valores de extracción de ADN, RT- PCR y Ct fueron análogos a los de los ejemplos 2, 3 y 4. Los resultados se muestran en la tabla 7.
TABLA 7
- Sistema de ensayo Sistema de ensayo Control de inhibición Control de inhibición
- Matriz
- Alérgeno Ct Sal Ct CTAB Ct Sal Ct CTAB
- Leche para untar con copos de chocolate y avellanas
- Avellana 29,95 28,07 31,72 32,48
- Agente de pulverización para carne de cerdo
- Mostaza 38,19 38,78 32,44 31,85
5
10
15
20
25
30
- ahumada
- Pulpa de avellana (tratada térmicamente a 166 °C)
- Pecana 37,73 40,71 32,35 32,69
- Hisopo
- Pescado 31,91 32,89 26,74 32,11
- Almendra (molida, pedazos de tamaño 1-2 mm)
- Cacahuete 31,47 34,04 34,59 37,31
- Perejil (molido)
- Apio 27,02 24,65 32,09 31,78
- Mezcla de condimentos
- Mostaza 24,49 No Ct 32,80 No Ct
- Salmón gratinado
- Pescado 26,74 32,11 31,91 32,89
Los valores de Ct para la referencia interna de ADN (control de inhibición) fueron similares en todas las matrices alimentarias, excepto en la mezcla de condimentos. Los resultados nuevamente sugieren una mejor calidad del rendimiento de ADN con el protocolo de talco/PBS ya que ni ADN de mostaza ni ADN de referencia fue detectable en la mezcla de condimentos cuando se extrajo usando el protocolo CTAB.
Ejemplo 10 - Sensibilidad y linealidad
Muestras de harina de maíz con cantidades conocidas de mostaza (1, 10, 102, 103 y 104 ppm) se procesaron como se describe en el ejemplo 2 y los valores de Ct determinados para ADN de a) mostaza normal y b) mostaza amarilla (ver figura 1) como se ha descrito. Lo mismo fue hecho también para muestras de mayonesa con cantidades conocidas de mostaza (1, 10, 102, 103 y 104 ppm). Todas las mediciones de Ct se realizaron por duplicado y el valor promedio se usó para calcular la linealidad y la sensibilidad de la detección. Los resultados se muestran en la tabla 8.
TABLA 8
- Parámetro
- Mostaza Mostaza amarilla
- Matriz
- Valor Ct Valor Ct Valor Ct Valor Ct Log
- CTAB
- SAL CTAB SAL PPm
- Mostaza en harina de maíz 10000 ppm
- 12,62 15,55 23,97 25,96 4
- Mostaza en harina de maiz 1000 ppm
- 16,14 18,04 27,22 28,74 3
- Mostaza en harina de maíz 100 ppm
- 19,26 21,53 30,06 33,1 2
- Mostaza en harina de maíz 10 ppm
- 21,46 25,09 32,78 35,11 1
- Mostaza en harina de maíz 1 ppm
- 25,22 28,88 0
- Mostaza en mayonesa 10000 ppm
- 8,33 12,08 20,1 23,23 4
- Mostaza en mayonesa 1000 ppm
- 11,6 14,92 23,23 26,05 3
- Mostaza en mayonesa 100 ppm
- 15,08 18,04 26,42 29,41 2
- Mostaza en mayonesa 10 ppm
- 18,44 20,42 29,97 32,23 1
- Mostaza en mayonesa 1 ppm
- 21,03 24,10 32,51 36,38 0
Los valores de Ct para la presencia de mostaza o mostaza amarilla en harina de maíz y mayonesa se han representado en las figuras 1 y 2. Los resultados muestran un comportamiento lineal de detección de ADN por PCR en tiempo real, cuando el ADN se extrajo y purificó de acuerdo al protocolo de talco/sal. La linealidad fue comparable a las muestras extraídas con CTAB. Es importante destacar que esto se encontró para dos matrices alimentarias muy diferentes, a saber, harina de maíz, que es rica en polisacáridos, y mayonesa, que tiene un alto contenido de lípidos, ácidos grasos y aceite. La extracción con comprimidos de talco/sal permitió una detección de cantidades extremadamente bajas de contaminantes, hasta 1 ppm. Si bien la sensibilidad de detección fue algo menor, esta fue comparable a la de CTAB. El comportamiento lineal, por lo tanto, permite el establecimiento de curvas estándar que hace posible una estimación, con gran confianza, de la cantidad absoluta de contaminantes dentro de una matriz alimentaria.
Ejemplo 11 - Determinación cuantitativa de material foráneo en muestras alimentarias
Se obtuvo ADN de albóndiga, semilla de colza, hojaldre, salchicha, sémola de trigo duro y harina de trigo duro como se describe en los ejemplos 2 y 3. Se identificaron materiales foráneos utilizando cebadores específicos para búfalo, GT73 (marcador de semilla de colza genéticamente modificada, RRS, cerdo y trigo. Se seleccionó un gen estándar correspondiente y cebadores específicos se utilizaron en cada condición. Se determinó el porcentaje relativo de ADN foráneo en la muestra de ADN total para diferentes matrices alimentarias usando una preparación de ADN convencional y la descrita aqui. Se muestran los resultados. en la tabla 9.
TABLA 9
- Matriz
- Parámetro PCR SAL CTAB
- Albóndiga
- Búfalo 0,02% 0,02%
- Semilla de colza
- GT73 0,03% 0,03%
- Semilla de colza
- GT73 0,77% 0,61%
- Hojaldre
- RRS 0,18% 0,19%
- Salchicha
- Cerdo 1,88% 1,97%
- Salchicha
- Cerdo 0,15% 0,33%
- Sémola de trigo duro
- Trigo_______ 19% 12%
- Harina de trigo duro
- Trigo_______ 5,10% 5,20%
Los resultados en la tabla 9 confirman una detección sensible y cuantitativa de materiales foráneos cuando las matrices de muestras fueron procesadas y trabajadas de acuerdo al protocolo de talco/sal. Los valores obtenidos 5 son muy similares para cualquiera de los protocolos de extracción y purificación. Se observa una sensibilidad de detección constante para las matrices de muestra dadas.
Ejemplo 12 - Determinación cuantitativa de ADN de OMG en alimentos para animales
Muestras de 12 diferentes alimentos para animales comercialmente disponibles se analizaron en base a su ADN como se describió anteriormente. Se usaron cebadores para soja genéticamente modificada y el gen RRS. 10 Cebadores para un gen estándar se eligieron para cuantificar el ADN total. Los resultados se muestran a continuación en la tabla 10.
TABLA 10
- Matriz
- Parámetro PCR SAL CTAB
- Alimento animal 1
- MON89788 0,16% 0,10%
- Alimento animal 2
- RRS 0,14% 0,1
- Alimento animal 3
- RRS 42% 54%
- Alimento animal 4
- RRS 0,10% 0,13%
- Alimento animal 5
- RRS 0,11% 0,09%
- Alimento animal 6
- RRS 0,35% 0,46%
- Alimento animal 7
- RRS 0,04% 0,07%
- Alimento animal 8
- RRS 0,73% 0,85%
- Alimento animal 9
- RRS 49% 47%
- Alimento animal 10
- RRS 49% 57%
- Alimento animal 11
- RRS 62% 58%
- Alimento animal 12
- RRS 43% 47%
Los resultados confirman que el método de extracción de ADN basado en talco/sal proporciona una muestra que 15 puede usarse de manera segura para determinar el contenido relativo de materiales biológicos en matrices alimentarias altamente procesadas.
Ejemplo 13 - Extracción de ADN bacteriano y detección a partir de cultivos de enriquecimiento de alimentos
Los cultivos de preenriquecimiento se prepararon inoculando 225 ml de caldo de agua de peptona tamponada (BPW) (relación 1:9), calentados a 37°C, con una sonda. Las sondas probadas fueron un trapo/paño (tejido 20 Kleenex™), agua del circuito de refrigeración, chocolate, cobertura de chocolate negro, agua potable, vaca (round robin 01-03), sésamo, cebolla, salchicha mettwurst, productos lácteos, carne de pato en tiras, pechuga de pollo, carne de pato marinada, leche entera y carne de muslo de pavo. El cultivo de enriquecimiento se incubó a 37°C durante 18 horas en agitación. Se mezclaron 900 pL de cultivo de enriquecimiento con 100 pL de una dilución de un cultivo nocturno de Salmonella spp., Listeria monocytogenes. Cronobacter spp, y Campylobacter spp., asi que 25 contenía 103 unidades formadoras de colonias (ufc) por condición experimental. 200 pL de cultivo post-inóculo (200 cfu) se sometieron a extracción de ADN de acuerdo a los ejemplos 2 o 3. Cuando se extrae de acuerdo al protocolo talco/sal, el procedimiento siguió como se ha descrito hasta el primer paso de centrifugación. Sin embargo, una dilución (1:20) del sobrenadante se sometió directamente a análisis de PCR. RT-PCR y los valores de Ct se determinaron como en el ejemplo 4. Se usaron cebadores específicos para la detección de Salmonella spp., Listeria 30 monocytogenes, Cronobacter spp. y Campylobacter spp..
En el caso de la extracción comparativa con CTAB, la solución para la extracción de ADN bacteriano contenía CTAB al 2%, 100 ml Tris-HCl, pH 8, eDtA 20 mM, NaCl 1,4 M, 0,2% lí-mercaptoetanol, 0,1 mg proteinasa K. Se añadieron 0,8 ml de tampón CTAB a 60°C a 200 ml de muestra de cultivo enriquecido y se incubaron a 60°C durante 1 hora con movimiento regular cada 10 minutos. Se agregaron 0,8 ml de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1), se mezclaron
durante 2 minutos, seguido de centrifugación a 14.000 rpm durante 10 minutos a 4°C, para obtener dos fases. Se retiró la fase acuosa clara superior sobre una capa de interfaz blanca y se usó para la purificación y desalinización del ADN como se describe en el ejemplo 2. La determinación cualitativa de RT-PCR y del valor de Ct se realizó como se describe en el ejemplo 4. Los resultados se muestran en la tabla 11. Los valores de Ct de los sistemas de 5 ensayo indican si el ADN del patógeno respectivo estaba presente o no en la muestra tomada.
TABLA 11
- Sistema de ensayo Sistema de ensayo Control de inhibición Control de inhibición
- Matriz
- Patógeno Ct Sal Ct CTAB Ct Sal Ct CTAB
- Paño
- Salmonella spp. 33,23 36,55 28,89 31,06
- Paño
- Salmonella spp. 31,96 31,66 29,59 29,17
- Agua del circuito de refrigeración
- Salmonella spp. 25,90 27,02 29,84 30,44
- Chocolate
- Salmonella spp. 20,48 18,97 27,83 28,25
- Cobertura de chocolate negro
- Salmonella spp. 23,66 21,68 29,25 27,99
- Agua potable
- Salmonella spp. 26,91 27,90 29,44 29,90
- Ensayo Round robin 01
- Salmonella spp. 18,79 19,76 27,73 29,32
- Ensayo Round robin 02
- Salmonella spp. 17,54 20,88 28,71 27,8
- Ensayo Round robin 03
- Salmonella spp. 17,40 20,88 27,31 28,47
- Sésamo
- Salmonella spp. 25,27 30,13 31,06 28,32
- Salchicha mettwurst
- Salmonella spp. 32,00 30,56 29,32 30,23
- Producto lácteo
- L. monocytogenes no Ct No Ct 28,92 29,52
- Carne de pato en tiras
- L. monocytogenes 30,41 30,64 29,89 30,85
- Pechuga de pavo
- L. monocytogenes 21,96 34,16 30,21 30,29
- Carne de pato marinada
- L. monocytogenes 33,66 35,53 29,02 31,33
- Producto lácteo
- Cronobacter spp. 37,86 42,00 28,33 28,94
- Producto lácteo
- Cronobacter spp. 35,32 36,47 28,99 28,88
- Leche entera
- Campylobacter spp. 23,19 30,50 27,90 31,63
- Leche entera
- Campylobacter spp. 18,96 23,46 27,63 29,48
- Pavo
- Campylobacter spp. 17,33 19,10 28,02 29,03
Los valores de Ct para el ADN de referencia ("control de inhibición") confirman la calidad del método de extracción, es decir, que la reacción de RT-PCR no fue inhibida por los inhibidores de la ADN polimerasa a partir de la matriz de
10 alimentos extraídos. Un valor de Ct reducido en el sistema de ensayo indicaría que la muestra estaba contaminada con patógeno. En esencia, el método CTAB produjo resultados muy similares al protocolo talco/sal. El ADN preparado usando el protocolo de talco/sal generalmente tuvo una calidad superior en comparación con el método CTAB, con la única excepción del "chocolate negro" que es rico en polifenoles y catequinas. Sin embargo, se contempla una extracción opcional después de la extracción de talco/sal PBS antes de la desalanización del ADN.
15 No obstante, el protocolo de talco/sal resultó ser totalmente satisfactorio para esta matriz alimentaria tradicionalmente difícil.
Claims (9)
1.
10
2.
3. 15
4.
20
5.
25
6.
30
7.
35 8.
40
45
50
55
REIVINDICACIONES
Composición para uso en la extracción y purificación de ácidos nucleicos a partir de muestras alimentarias caracterizada en que la composición es una mezcla de sólidos que comprende
de 10 a 40 por ciento en peso de partículas que consisten en silicato de magnesio hidratado insoluble en agua y que tienen un tamaño mediano de partícula de 0,8 a 2,5 pm, y
de 20 a 70 por ciento en peso de solución salina cristalina tamponada con fosfato que es fácilmente soluble en agua para producir una solución que tiene un pH de 5,5 a 7,0 a 70 hasta 95 grados Celsius.
Composición como reivindicada en la reivindicación 1, en la que la mezcla de sólidos se ha porcionado como un comprimido o una cápsula que tiene un peso predefinido conocido.
Composición como reivindicada en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que además comprende de 20 a 35 por ciento en peso de un coloide hidrófilo eficaz para dispersar la mezcla de sólidos en agua.
Composición como reivindicada en cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 3, que comprende partículas de silicato de magnesio hidratado que tienen un tamaño mediano de partícula de 1,0 a 2,0 pm, preferiblemente de 1,2 a 1,5 pm.
Comprimido o cápsula que comprende esencialmente una composición como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende
de 10 a 25 por ciento en peso de partículas de silicato de magnesio hidratado insoluble en
agua;
de 45 a 70 por ciento en peso de solución salina tamponada con fosfato, y de 20 a 30 por ciento en peso de un coloide hidrófilo eficaz para dispersar la mezcla de sólidos en agua.
Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que además comprende uno o más agentes de lisis no caotrópicos.
Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el coloide hidrófilo es celulosa, carboximetilcelulosa, derivados de celulosa, alginato, almidón, goma de xantano, goma arábiga, goma de guar o mezclas de los mismos.
Método estándar de aislar ADN a partir de una diversidad de alimentos para animales y muestras alimentarias, incluyendo bebidas, para el posterior análisis de PCR, que comprende los siguientes pasos:
obtener una cantidad predefinida de peso o volumen de la muestra, preferiblemente como partículas pequeñas, solución o dispersión, y transferir la muestra a un recipiente;
añadir una cantidad predefinida de la mezcla de sólidos contenida en la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o el comprimido o la cápsula de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 para obtener en el recipiente una relación en peso de sólidos a muestra de 1:5 a 5:1;
añadir además una cantidad de agua para disolver los componentes del tampón de la mezcla de sólidos para obtener una solución salina acuosa tamponada con fosfato que tiene un pH de 5,5 a 7,0 y una concentración de sal de 0,6 a 1,2 Mol/L,
obtener una dispersión de la muestra y la mezcla de sólidos en solución salina tamponada con fosfato y calentar la solución o dispersión hasta una temperatura de 70 a 95 grados Celsius durante 1 minuto a 30 minutos, preferiblemente durante aproximadamente 5 minutos a 20 minutos, para liberar los ácidos nucleicos de los materiales celulares y otros componentes insolubles en agua de la muestra;
separar de la fase acuosa los componentes insolubles en agua de la muestra y de las mezclas de sólidos, preferiblemente mediante centrifugación o filtración, junto con los componentes adsorbidos a las partículas de silicato de magnesio de la mezcla de sólidos;
retirar el sobrenadante acuoso o filtrado que contiene ácidos nucleicos solubles, seguido de un paso de desalinización para obtener una solución de ADN de la muestra adecuada para el análisis de PCR.
Kit de partes para extraer y purificar ácidos nucleicos de muestras, que comprende cantidades porcionadas de la composición reivindicada en cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 4 o el comprimido o la cápsula que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes 5 a 7.
5 11.
10
Uso de la composición, el comprimido o la cápsula, el método y el kit de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 para aislar y caracterizar el tipo de ácidos nucleicos de materiales animales y vegetales crudos y/o procesados y sus productos procesados.
Uso de la composición, el comprimido o la cápsula, el método y el kit de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 para aislar los ácidos nucleicos característicos de posibles alérgenos presentes en cereales y sus productos, garbanzo y sus productos, caseína, almendra y sus productos, anacardo y sus productos, cacahuete y sus productos, avellana y sus productos, macadamia y sus productos, mostaza y sus productos, soja y sus productos, sésamo y sus productos, nuez y sus productos, pistacho y sus productos, altramuz y sus productos, apio y sus productos, pescado y sus productos, crustáceos y sus productos.
12. Uso de la composición, el comprimido o la cápsula, el método y el kit de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 para aislar los ácidos nucleicos característicos de organismos genéticamente 15 modificados, patógenos, Salmonella spp., Listeria spp., Shigella spp., Campylobacter spp., Cronobacter,
Clostridium spp., Legionella spp., Enterobacteriaceae, Escherichia spp.
13.
20
Uso de la composición, el comprimido o la cápsula, el método y el kit de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de muestras fecales, preferiblemente muestras fecales humanas y de animales.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP14158441 | 2014-03-07 | ||
| EP14158441 | 2014-03-07 | ||
| DE102014103107 | 2014-03-07 | ||
| DE102014103107.5A DE102014103107B4 (de) | 2014-03-07 | 2014-03-07 | Verfahren und kit zur extraktion von nukleinsäuren |
| PCT/EP2015/054341 WO2015132216A1 (en) | 2014-03-07 | 2015-03-03 | Method and kit of parts for extraction of nucleic acids |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2682333T3 true ES2682333T3 (es) | 2018-09-20 |
Family
ID=52745861
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES15712533.7T Active ES2682333T3 (es) | 2014-03-07 | 2015-03-03 | Método y kit de partes para la extracción de ácidos nucleicos |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10106838B2 (es) |
| EP (1) | EP3114224B1 (es) |
| AU (1) | AU2015226239A1 (es) |
| CA (1) | CA2941548A1 (es) |
| ES (1) | ES2682333T3 (es) |
| WO (1) | WO2015132216A1 (es) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TR201606310A2 (tr) | 2016-05-12 | 2017-11-21 | Akdeniz Ueniversitesi | Genomik dna izolasyon yöntemi ve kiti. |
| US20210172004A1 (en) * | 2018-04-13 | 2021-06-10 | National Agricultural Genotyping Center | Universal lactic acid bacteria quantification kit for fermentation monitoring |
| RU188424U1 (ru) * | 2018-08-02 | 2019-04-11 | Мераб Георгиевич Чикобава | Дозированная форма для выделения днк |
| RU188425U1 (ru) * | 2018-08-02 | 2019-04-11 | Мераб Георгиевич Чикобава | Дозированная форма для выделения днк |
| CN117587109A (zh) * | 2024-01-19 | 2024-02-23 | 吉林金域医学检验所有限公司 | 一种pcr检测方法及其应用 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2067711C (en) | 1991-05-03 | 2000-08-08 | Daniel Lee Woodard | Solid phase extraction purification of dna |
| JP3580801B2 (ja) * | 2001-08-01 | 2004-10-27 | 富士写真フイルム株式会社 | 核酸の分離精製方法 |
| CA2567599C (en) * | 2004-05-21 | 2015-07-21 | Mo Bio Laboratories, Inc. | Kits and processes for removing contaminants from nucleic acids in environmental and biological samples |
| DE102005003457B4 (de) | 2004-07-30 | 2009-12-03 | IfP Privates Institut für Produktqualität GmbH | Verfahren und Teilesatz zur mikrobiologischen Bestimmung von Vitamen |
| DE102008028908B3 (de) | 2008-06-18 | 2009-12-31 | IfP Privates Institut für Produktqualität GmbH | Nachweis eines Analyten in einem wässrigen Medium |
| US20140158619A1 (en) | 2011-07-20 | 2014-06-12 | Qiagen Gmbh | Filtering devices comprising clay minerals |
| EP2798024B1 (en) | 2011-12-30 | 2016-07-20 | Dow Corning Corporation | Solid state light and method of forming |
| EP2634254A1 (en) | 2012-02-29 | 2013-09-04 | QIAGEN GmbH | Method for isolating nucleic acids from a food sample |
-
2015
- 2015-03-03 ES ES15712533.7T patent/ES2682333T3/es active Active
- 2015-03-03 CA CA2941548A patent/CA2941548A1/en not_active Abandoned
- 2015-03-03 AU AU2015226239A patent/AU2015226239A1/en not_active Abandoned
- 2015-03-03 US US15/123,655 patent/US10106838B2/en active Active
- 2015-03-03 WO PCT/EP2015/054341 patent/WO2015132216A1/en not_active Ceased
- 2015-03-03 EP EP15712533.7A patent/EP3114224B1/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2015132216A1 (en) | 2015-09-11 |
| US20170081704A1 (en) | 2017-03-23 |
| US10106838B2 (en) | 2018-10-23 |
| EP3114224B1 (en) | 2018-05-09 |
| AU2015226239A1 (en) | 2016-09-22 |
| EP3114224A1 (en) | 2017-01-11 |
| CA2941548A1 (en) | 2015-09-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2682333T3 (es) | Método y kit de partes para la extracción de ácidos nucleicos | |
| Sadh et al. | Fermentation approach on phenolic, antioxidants and functional properties of peanut press cake | |
| Shao et al. | Characteristics of isolation and functionality of protein from tomato pomace produced with different industrial processing methods | |
| Machado et al. | Effects of heating on protein quality of soybean flour devoid of Kunitz inhibitor and lectin | |
| WO2008017097A1 (en) | Method for isolating cells | |
| Mertens et al. | Comparative evaluation of eleven commercial DNA extraction kits for real-time PCR detection of Bacillus anthracis spores in spiked dairy samples | |
| de Jongh et al. | Application potential of food protein modification | |
| KR101235894B1 (ko) | 클로렐라 생면 제조 방법 | |
| CN108251387B (zh) | 一种玉米赤霉烯酮降解酶及其基因和制备方法及应用以及降解玉米赤霉烯酮的方法 | |
| Novianty et al. | Identification of pork contamination in meatball using genetic marker mitochondrial DNA cytochrome b gene by duplex-PCR | |
| DE102014103107B4 (de) | Verfahren und kit zur extraktion von nukleinsäuren | |
| CN102835650A (zh) | 5’-核糖核苷酸含量高的酵母提取物及其制备方法 | |
| Djurkin Kušec et al. | Comparison of commercial DNA kits and traditional DNA extraction procedure in PCR detection of pork in dry/fermented sausages | |
| US6492114B2 (en) | Method for preparing template DNA from processed vegetable food, which is feasible for amplification of DNA region by PCR method | |
| Ren et al. | DNA extraction and fingerprinting of commercial rice cereal products | |
| Lau et al. | Detection and characterization of recombinant DNA in the Roundup Ready® soybean insert | |
| Liyana et al. | Detection of porcine DNA in cooked meatballs using polymerase chain reaction (PCR) assay | |
| Omoruyi et al. | Genotoxicity of processed food items and ready-to-eat snacks in Finland | |
| JP2018157763A (ja) | 天然原料中の化合物由来のリン酸を有する食品物性改良剤 | |
| JP2003516754A (ja) | 核酸の単離精製方法 | |
| KR102395589B1 (ko) | 개똥쑥과 돼지풀 판별용 바이오마커 | |
| Niyi | Chemical, In-vitro Multienzyme Digestibility and Amino Acid of Sorghum (Sorghum bicolor (L) Moench) Fortified with Soybean (Glycine max) Composite Meal flour | |
| Sari et al. | Comparative Study of DNA Extraction Methods for Halal Food Testing: Advantages, Disadvantages, and Recommended Methods | |
| Abd-Elfattah et al. | Occurrence of genetically modified food in Egyptian food market | |
| Ihoș et al. | Applications of PCR technique to identify the raw materials in different foods and feed products. |