ES2682520T3 - Variantes de la endoglucanasa con actividad mejorada y sus usos - Google Patents
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Abstract
Polipéptido aislado o purificado caracterizado por que tiene una actividad endoglucanasa mejorada con respecto a la actividad endoglucanasa de la proteína de referencia EG2, dicho polipéptido se selecciona entre el grupo que consiste en: i) una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 34; ii) una secuencia de aminoácidos que presenta un porcentaje de identidad de al menos 98 %, preferentemente 99 %, con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 o SEQ ID NO: 34.
Description
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DESCRIPCION
Variantes de la endoglucanasa con actividad mejorada y sus usos Estado de la técnica
La posibilidad de producir etanol a partir de celulosa ha recibido una gran atención debido a la disponibilidad de grandes cantidades de materia prima así como al interés del etanol como combustible. Las materias primas naturales celulósicas para tal procedimiento se denominan con el término "biomasa". Numerosos tipos de biomasa, por ejemplo madera, residuos agrícolas, cultivos herbáceos y desechos sólidos municipales, se han considerado como posibles materias primas para la producción de biocombustibles. Estas materias están constituidas principalmente de celulosa, hemicelulosa y lignina.
La celulosa es un polímero compuesto por moléculas de glucosa unidas por enlaces beta 1-4, que son muy resistentes a la degradación o a la despolimerización. Una vez que la celulosa se convierte en glucosa, ésta se fermenta fácilmente a biocombustible, por ejemplo etanol, utilizando levadura.
Los métodos más antiguos estudiados para convertir celulosa en glucosa se basan en la hidrólisis ácida. Este procedimiento puede realizarse en presencia de ácidos concentrados o diluidos. Sin embargo, varios inconvenientes tales como la escasa recuperación del ácido cuando se utilizan ácidos concentrados y la baja producción de glucosa en el contexto del uso de ácidos diluidos son perjudiciales para la economía del procedimiento de hidrólisis ácida.
Con el fin de superar las desventajas del procedimiento de hidrólisis ácida, los procedimientos de conversión de celulosa han aumentado más recientemente en la hidrólisis enzimática, utilizando enzimas tipo celulasa. Sin embargo, esta hidrólisis enzimática de la biomasa lignocelulósica (por ejemplo, celulosa) presenta el inconveniente de ser un procedimiento industrial costoso. Por lo tanto, es necesario utilizar cepas de microorganismos que secretan celulasa cada vez más eficientes. Como tal, muchos microorganismos constan de enzimas que hidrolizan la celulosa, tales como hongos Trichoderma, Aspergillus, Humicola, Fusarium, así como bacterias tales como Thermomonospora, Bacillus, Cellulomouas y Streptomyces. Las enzimas secretadas por estos microorganismos poseen tres tipos de actividades útiles en la conversión de celulosa en glucosa y se dividen en tres grupos: las endoglucanasas, que atacan las fibras de celulosas al azar de forma interna, las exoglucanasas que atacarán los extremos de las fibras liberando celobiosa y las p-glucosidasas que hidrolizarán esta celobiosa en glucosa. Otras clases de enzimas tales como hemicelulasas o la clase de enzimas recientemente descubierta de polisacáridos monooxigenasas también pueden desempeñar un papel en la eficacia de la hidrólisis.
Existe un fuerte interés industrial en reducir el costo de la hidrólisis enzimática, y esta reducción implica el uso de una dosis reducida de enzimas y, por lo tanto, cócteles enzimáticos más eficaces. En consecuencia, varias solicitudes de patente describen enzimas naturales con capacidades superiores a las de Trichoderma reesei, o variantes mejoradas por ingeniería genética. Se pueden mencionar las solicitudes de patente US2010304464, WO2010066411 y WO2013029176 con respecto a las exoglucanasas, las solicitudes WO2007109441, WO2012149192, WO2008088724, WO2010135836 o WO2010022518 con respecto a las endoglucanasas, las solicitudes WO2010029259, WO2010135836 o WO2010022518 con respecto a las p-glucosidasas, o las solicitudes WO12135659, WO12149344 con respecto a los polisacáridos monoxigenasas.
La solicitud WO2011/153516 describe asimismo cepas de levaduras que expresan enzimas sacarolíticas.
Las enzimas que hidrolizan la biomasa lignocelulósica se clasifican en el sistema CAZy (Cantarel, B.L., Coutinho, P. M., Rancurel, C., Bernard, T., Lombard, V., y Henrissat, B. (2009). The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics. Nucleic acids research, 37, D233-8) en criterios principalmente estructurales. Las endoglucanasas pueden pertenecer a familias GH 5, 6, 7, 8, 9, 12, 16, 18, 19, 26, 44, 45, 48, 51, 74 y 124.
Para que una hidrólisis de la biomasa lignocelulósica sea eficiente y económicamente rentable, la mezcla enzimática debe tener proporciones equilibradas de actividades enzimáticas diversas (entre otras, pero no exclusivamente, exoglucanasas, endoglucanasas, xilanasas y p-glucosidasas). A modo de ejemplo, en las mezclas nativas de Trichoderma reesei, se observa generalmente la presencia de 60-70 % de exoglucanasas, 15-20 % de endoglucanasas, algunos porcentajes de hemicelulasas y aproximadamente 5-10 % de p-glucosidasas. Esta mezcla es adecuada para hidrolizar la mayoría de los sustratos pretratados (p. ej., tipo paja de trigo explotada al vapor en condiciones ácidas) con rendimientos aceptables. En resumen, el aumento en la actividad de la endoglucanasa no debe hacerse a expensas de otras actividades enzimáticas. Las especificidades funcionales de estas enzimas son hoy en día poco conocidas. El genoma de Trichoderma reesei consta de al menos 3 enzimas principales, procedentes de las familias 7 (EG1, cel7b), 5 (EG2, cel5a) y 12 (EG3, Ce112a). Las enzimas EG1 y EG2 son las principales endoglucanasas y pueden representar hasta 10-20 % en masa del cóctel de enzimas completo producido por T. reesei.
Las endoglucanasas (EC 3.2.1.4), las primeras enzimas que actúan sobre la celulosa, son conocidas por tener un
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papel principal en la hidrólisis al aumentar el número de sitios que pueden atacar las exoglucanasas al tiempo que disminuye el grado de polimerización de las microfibrillas atacadas. Trabajos recientes (Szijártó, N., Siika-aho, M., Sontag-Strohm, T., y Viikari, L. (2011). Liquefaction of hydrothermally pretreated wheat straw at high-solids contení by purified Trichoderma enzymes. Bioresource technology, 102(2), 1968-74) destacan su papel en la reducción de la viscosidad de la biomasa durante las primeras horas de hidrólisis. Esta disminución en la viscosidad puede tener un impacto muy significativo en los costos operativos del procedimiento.
El problema de la viscosidad se ve agravado en el caso de procedimientos que obligan a utilizar una temperatura baja, tal como sacarificación y fermentación simultáneas (SFS), que involucra tanto a las enzimas que hidrolizan la biomasa como al microorganismo que convierte los monómeros de azúcares en etanol.
La hidrólisis y la fermentación se pueden llevar a cabo de acuerdo con diferentes esquemas. El más común consiste en una hidrólisis y una fermentación separadas (HFS) (SHF-Separate Hydrolysis and Fermentation). Este método permite optimizar cada etapa manteniendo condiciones óptimas de reacción. Esta fermentación se efectúa de manera extemporánea, a una temperatura comprendida entre aproximadamente 28 °C y aproximadamente 30 °C, mientras que la hidrólisis tiene lugar generalmente a una temperatura de al menos 45 °C. Sin embargo, en HFS, los azúcares liberados al final de reacción están presentes a una concentración muy alta y causan una inhibición de las enzimas, ralentizando la eficacia del procedimiento. Para evitar estos inconvenientes, se puede prever otro tipo de procedimiento. En SFS, las dos etapas (hidrólisis y fermentación de hexosas) tienen lugar de manera simultánea, evitando la acumulación de azúcares en concentraciones inhibidoras para las enzimas. Los costos de inversión también se reducen mediante el uso de un solo reactor. La tasa de hidrólisis es más elevada como resultado de la ausencia de inhibición ya que los azúcares liberados se utilizan inmediatamente para la fermentación de etanol. En este método, la temperatura del reactor constituye necesariamente un compromiso entre las temperaturas óptimas de hidrólisis y fermentación, normalmente entre aproximadamente 30 °C y aproximadamente 35 °C. Sin embargo, a dicha temperatura, la actividad de las enzimas celulolíticas disminuye aproximadamente un 30 %.
La SFS también permite la expresión de enzimas que degradan la celulosa en el organismo que fermenta los azúcares, lo que permite limitar, o en un caso extremo, suprimir el uso de enzimas producidas en una etapa separada.
En consecuencia, la obtención de enzimas que mantienen una actividad endoglucanasa eficaz a temperaturas óptimas de hidrólisis y fermentación (es decir, entre 30 °C y 50 °C) mientras se mantiene la proporción del conjunto de enzimas de la mezcla sería una ganancia significativa para el procedimiento de conversión de biomasa lignocelulósica en biocombustible.
Objeto de la invención
Los inventores han desarrollado un polipéptido que tiene una actividad endoglucanasa mejorada, especialmente con respecto a la actividad endoglucanasa de la proteína salvaje EG2 de la secuencia SEQ ID NO: 2. EG2 corresponde a la endoglucanasa 2 de Trichoderma reesei.
Con esta intención, los solicitantes han tenido el gran mérito de encontrar, después de numerosas investigaciones, un polipéptido aislado o purificado que tiene una actividad endoglucanasa mejorada con respecto a la actividad endoglucanasa de la proteína salvaje EG2 (SEQ ID NO: 2).
De acuerdo con la descripción, el polipéptido se selecciona entre el grupo que consiste en:
i) una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 34;
ii) una secuencia de aminoácidos que presenta un porcentaje de identidad de al menos 70 %, preferentemente
75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 %, con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ
ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 o SEQ ID NO: 34.
La invención se define en las reivindicaciones.
El porcentaje de identidad de una secuencia dada con respecto a SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 o SEQ ID NO: 34, corresponde al número de residuos idénticos entre esta secuencia dada y SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 o SEQ ID NO: 34 dividido por el número de residuos en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14, SEQ
ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ
ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 o SEQ ID NO: 34. Cuando se utiliza la base de datos GenomeQuest, dicho porcentaje de
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identidad con respecto a SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO:
14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:
28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 o SEQ ID NO: 34 corresponde al porcentaje de identidad de interrogación (% id Query), en el que interrogación corresponde a la secuencia SEQ ID NO: 4, sEq ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID
NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 o SEQ ID NO: 34.
En otro modo de realización, el polipéptido de la invención como se descrito anteriormente se caracteriza por que su expresión en un organismo fermentativo es al menos igual a la expresión de la proteína salvaje EG2 (SEq iD NO: 2).
Los expertos en la materia podrán determinar por ejemplo el aumento, o en otras palabras, la mejora de la actividad enzimática utilizando el sustrato de carboximetilcelulosa (CMC) o con un sustrato cromogénico (p-nitrofenil glicósido). La actividad enzimática se revelará, respectivamente, mediante un ensayo colorimétrico de los azúcares reductores o el nitrofenol liberado.
Preferentemente, el polipéptido de la invención tiene una actividad enzimática mejorada de al menos 10 %, preferentemente al menos 20 %, preferentemente al menos 30 %, con respecto a la actividad endoglucanasa de la proteína EG2 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2.
Un ejemplo de un protocolo, que podrá utilizar un experto en la materia para determinar si un polipéptido de acuerdo con la invención presenta una actividad enzimática mejorada en relación con la de la proteína salvaje EG2 (SEQ ID NO: 2), es el siguiente:
- formación de un cultivo madre de E. coli que expresa un polipéptido de acuerdo con la invención durante toda la noche a 37 °C;
- siembra de un medio de cultivo LB con 1 % de cultivo madre a 37 °C hasta que se obtenga una densidad óptica de 0,4;
- cultivo de dichas células a 20 °C durante 18 h;
- centrifugación durante 5 minutos a 7.900 rpm;
- resuspensión de residuos celulares con tampón citrato fosfato 100 mM a pH 5 que contiene 1 mg/ml de lisozima (DO600 final 100);
- incubación de las células resuspendidas durante 30 minutos en hielo;
- lisis de células en 3 ciclos de congelación/descongelación;
- fraccionamiento de ADN por sometimiento a ultrasonidos;
- centrifugación durante 30 minutos a 13.000 rpm;
- incubación de 100 pl de sobrenadante de ruptura diluido 50 veces con 100 pl de tampón citrato fosfato 100 mM a pH 5 que contiene 1 % de CMC durante 1 h a 35 y 50 °C;
- eliminación de 100 pl de reacción;
- adición de 100 pl de reactivo DNS (Miller, 1959);
- incubación durante 5 minutos a 100 °C;
- incubación durante 3 minutos en hielo;
- centrifugación durante 10 minutos a 3.000 rpm;
- lectura de la densidad óptica a 540 nm en 150 pl de sobrenadante.
La invención también tiene por objeto un ácido nucleico purificado o aislado que codifica al menos un polipéptido de acuerdo con la invención como se ha descrito anteriormente.
La TABLA 1 a continuación comprende las identificaciones de secuencias nucleicas y peptídicas para los genes EG2, los genes de las endoglucanasas 2 putativas de Botryotinia fuckeliana (gen BF) y la endoglucanasa 2 putativa de Sclerotinia sclerotiorum (gen SS), así como para las secuencias de ácidos nucleicos y polipéptidos de la invención y la descripción.
De acuerdo con la descripción, dicho ácido nucleico purificado o aislado se puede seleccionar entre las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 33.
TABLA 1
- Clones
- Ácido nucleico Polipéptido
- EG2 (salvaje)
- SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :2
- 37D12
- SEQ ID NO :3 SEQ ID NO :4
- 45A7
- SEQ ID NO :5 SEQ ID NO :6
- 46H1
- SEQ ID NO :7 SEQ ID NO :8
- 50F10
- SEQ ID NO :9 SEQ ID NO :10
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- Clones
- Ácido nucleico Polipéptido
- 108G5
- SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO 12
- 140F7
- SEQ ID NO :13 SEQ ID NO 14
- 146C4
- SEQ ID NO :15 SEQ ID NO 16
- 149E4
- SEQ ID NO :17 SEQ ID NO 18
- 173C6
- SEQ ID NO :19 SEQ ID NO 20
- 191H11
- SEQ ID NO :21 SEQ ID NO 22
- 222E1
- SEQ ID NO :23 SEQ ID NO 24
- 225C7
- SEQ ID NO :25 SEQ ID NO 26
- 227C4
- SEQ ID NO :27 SEQ ID NO 28
- 229D1
- SEQ ID NO :29 SEQ ID NO 30
- 231C9
- SEQ ID NO :31 SEQ ID NO 32
- 330F9
- SEQ ID NO :33 SEQ ID NO 34
- Gen BF
- SEQ ID NO :35 SEQ ID NO 36
- Gen SS
- SEQ ID NO :37 SEQ ID NO 38
La invención también se refiere a un vector que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la invención como se ha descrito anteriormente.
De acuerdo con la invención, se entiende por "vector" cualquier secuencia de ADN en la que es posible insertar fragmentos de ácido nucleico extraño, los vectores permiten introducir ADN extraño en una célula huésped. Se puede citar de manera no exhaustiva como vectores: plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales de levaduras (YAC), cromosomas artificiales de bacterias (BAC), cromosomas artificiales derivados del bacteriófago P1 (PAC) o vectores derivados de virus.
De acuerdo con la invención, el ácido nucleico como se ha descrito anteriormente puede unirse operativamente a un promotor, un terminador o cualquier otra secuencia necesaria para su expresión en la célula huésped.
El vector de acuerdo con la invención también podrá llevar un marcador de selección. Se entiende por "marcador de selección" un gen cuya expresión confiere a las células que lo contienen una característica que les permite ser seleccionadas. Se trata por ejemplo de un gen de resistencia a antibióticos.
La invención tiene también por objeto una célula huésped aislada que comprende al menos uno de los polipéptidos de acuerdo con la invención como se ha descrito previamente, al menos uno de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención como se ha descrito anteriormente o al menos uno de los vectores de acuerdo con la invención como se ha descrito anteriormente.
Los expertos en la materia pueden introducir uno de los polipéptidos, uno de los ácidos nucleicos o uno de los vectores de acuerdo con la invención como se ha descrito previamente en la célula huésped de acuerdo con la invención por métodos convencionales bien conocidos. Por ejemplo, se puede mencionar el tratamiento con cloruro de calcio, la electroporación, el uso de una pistola de partículas.
De acuerdo con un modo de realización, un experto en la materia puede introducir en la célula huésped de acuerdo con la invención y mediante métodos convencionales, varias copias de un ácido nucleico de acuerdo con la invención que codifica un polipéptido de acuerdo con la invención que tiene una actividad endoglucanasa mejorada de acuerdo con la invención.
De acuerdo con un modo de realización, la célula huésped aislada de acuerdo con la invención como se ha descrito anteriormente se selecciona entre Trichoderma, Aspergillus, Neurospora, Humicola, Myceliophthora, Chrysosporium, Penicillium, Fusarium, Thermomouspora, Bacillus, Pseudomouas, Escherichia, Clostridium, Cellulomouas, Streptomyces, Yarrowia, Pichia y Saccharomyces.
De acuerdo con un modo de realización preferente, la célula huésped aislada de acuerdo con la invención como se ha descrito anteriormente se selecciona entre Trichoderma reesei, Trichoderma viridae, Trichoderma koningii, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus wentii, Aspergillus oryzae, Aspergillus phoenicis, Myceliophthora thermopila, Chrysosporium lucknowense, Neurospora crassa, Humicola grisae, Penicillium pinophilum, Penicillium oxalicum, Escherichia coli, Clostridium acetobutylicum, Clostridium saccharolyticum, Clostridium benjerinckii, Clostridium butylicum, Pichia pastoris, Yarrowia lipolityca y Saccharomyces cerevisiae.
De acuerdo con un modo de realización preferente, la célula huésped aislada de acuerdo con la invención como se ha descrito anteriormente se selecciona entre Trichoderma reesei y Saccharomyces cerevisiae.
La invención también tiene por objeto el uso de uno cualquiera de los polipéptidos de acuerdo con la invención descritos anteriormente para la hidrólisis de celulosa.
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La invención también tiene por objeto el uso de uno cualquiera de los polipéptidos de acuerdo con la invención descritos anteriormente para la producción de biocombustible.
De acuerdo con la invención, el término biocombustible puede definirse como cualquier producto resultante de la transformación de biomasa y puede utilizarse con fines energéticos. Por una parte y sin querer limitarse, se puede hacer citar a modo de ejemplo biogás, productos que pueden incorporarse (posiblemente después de una transformación posterior) en un combustible o ser un combustible exclusivo, como los alcoholes (etanol, butanol y/o isopropanol de acuerdo con el tipo de organismo fermentativo utilizado), disolventes (acetona), ácidos (butírico), lípidos y sus derivados (ácidos grasos de cadenas cortas o largas, ésteres de ácidos grasos), así como hidrógeno.
Preferentemente, el biocombustible de acuerdo con la invención es un alcohol, por ejemplo etanol, butanol y/o isopropanol. Más preferentemente, el biocombustible de acuerdo con la invención es etanol.
En otro modo de realización, el biocombustible es biogás.
En otro modo de realización, el producto es una molécula de interés para la industria química, como por ejemplo, otro alcohol tal como 1,2-propanodiol, 1,3-propanodiol, 1,4-butanodiol. 2,3-butanodiol, ácidos orgánicos como ácido acético, propiónico, acrílico, butírico, succínico, málico, fumárico, cítrico, itacónico o hidroxiácidos como ácido glicólico, hidroxipropiónico o láctico.
A continuación se describe un modo de realización de producción de un cóctel enzimático útil para la hidrólisis de lignocelulosa. Las cepas de hongos filamentosos, preferentemente Trichoderma, más preferentemente T. reesei, capaces de expresar al menos un polipéptido de acuerdo con la invención se cultivan en fermentadores, en presencia de un sustrato carbonado, tal como lactosa o glucosa, seleccionado para el crecimiento del microorganismo. En un modo de realización, este sustrato carbonado, de acuerdo con su naturaleza, se introduce en el fermentador antes de la esterilización o se esteriliza por separado y se introduce en el fermentador después de la esterilización de este último para obtener una concentración inicial de 20 a 35 g/l.
Posteriormente se añade una solución acuosa que contiene el sustrato seleccionado para la producción de las enzimas. Una composición enzimática que actúa sobre la biomasa lignocelulósica producida por los hongos se recupera finalmente por filtración del medio de cultivo. En esta composición, se encuentran, en particular, p- glucosidasa, exoglucanasa y endoglucanasa de acuerdo con la invención. En un modo de realización, la solución acuosa que contiene el sustrato seleccionado para la producción de las enzimas se prepara a una concentración de 200-250 g/l y contiene además un sustrato inductor tal como lactosa. Esta solución acuosa se inyecta después del agotamiento del sustrato carbonado inicial a fin de proporcionar una cantidad optimizada, comprendida entre 35 y 45 mg/g de células ("fed batch" (proceso semicontinuo)). Durante esta fase de "proceso semicontinuo", la concentración residual de azúcar en el medio de cultivo es inferior a 1 g/l y las enzimas que actúan sobre la biomasa lignocelulósica son secretadas por el hongo. Estas últimas pueden recuperarse por filtración del medio de cultivo.
La invención tiene por objeto una composición enzimática capaz de actuar sobre la biomasa lignocelulósica, siendo dicha composición enzimática es producida preferentemente por hongos filamentosos y comprende al menos un polipéptido que tiene una actividad endoglucanasa mejorada con respecto a la actividad endoglucanasa de la proteína salvaje EG2. Por "hongos filamentosos" se entiende especialmente Trichoderma, más preferentemente T. reesei.
Finalmente, la invención tiene por objeto un procedimiento de producción de biocombustible a partir de biomasa que comprende las siguientes etapas sucesivas:
- poner suspensión en fase acuosa la biomasa que se va a hidrolizar;
- hidrólisis en presencia de una composición enzimática de la biomasa lignocelulósica como se ha descrito anteriormente para producir un hidrolizado que contiene glucosa;
- fermentación de la glucosa del hidrolizado para producir un mosto de fermentación;
- separación del biocombustible del mosto de fermentación.
En un modo de realización, la biomasa que se va a hidrolizar se pone en suspensión en fase acuosa a razón de 6 a 40 % de materia seca, preferentemente 2o a 30 %. El pH se ajusta entre 4 y 5,5; preferentemente entre 4,8 y 5,2 y la temperatura entre 40 y 60 °C, preferentemente entre 45 y 5o °C. La reacción de hidrólisis se inicia mediante la adición de la composición enzimática que actúa sobre la biomasa lignocelulósica; la cantidad habitualmente utilizada es de 10 a 30 mg de proteínas excretadas por gramo de sustrato pretratado o menos. La reacción dura generalmente de 15 a 48 horas. La reacción se controla determinando los azúcares liberados, especialmente la glucosa. La solución de azúcares se separa de la fracción sólida no hidrolizada, constituida esencialmente de lignina, por filtración o centrifugación y luego se trata en una unidad de fermentación.
En un modo de realización, el biocombustible puede separarse del mosto de fermentación, por ejemplo por destilación.
Otro objeto de la invención es un procedimiento de producción de biocombustible a partir de la biomasa,
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caracterizado por que comprende las siguientes etapas sucesivas:
- poner suspensión en fase acuosa la biomasa que se va a hidrolizar;
- adición simultánea de una composición enzimática como se ha definido anteriormente y de un organismo fermentativo, preferentemente a una temperatura comprendida entre 30 °C y 35 °C, para producir un mosto de fermentación;
- separación del biocombustible del mosto de fermentación.
Preferentemente, la composición enzimática y el organismo fermentativo se añaden simultáneamente y luego se incuban a una temperatura comprendida entre 30 °C y 35 °C para producir un mosto de fermentación.
De acuerdo con este modo de realización, la celulosa presente en la biomasa se convierte en glucosa, y al mismo tiempo, en el mismo reactor, el organismo fermentativo (por ejemplo, una levadura) convierte la glucosa en el producto final de acuerdo con un procedimiento de SFS (sacarificación y fermentación simultáneas) (Simultaneous Saccharification and Fermentation) conocido por los expertos en la materia. Dependiendo de las capacidades metabólicas e hidrolíticas del organismo fermentativo, el buen progreso de la operación puede requerir la adición de una cantidad mayor o menor de mezcla celulolítica exógena.
En otro modo de realización, el organismo fermentativo también produce el polipéptido objeto de la invención por secreción o en la superficie de su célula, opcionalmente junto con otras enzimas que actúan sobre la biomasa lignocelulósica, limitando o suprimiendo así la necesidad de enzimas producidas por el hongo filamentoso. Preferentemente, el organismo fermentativo es una célula huésped como se ha descrito anteriormente.
Por lo tanto, preferentemente, la invención tiene por objeto un procedimiento de producción de biocombustible a partir de biomasa, que comprende las siguientes etapas sucesivas:
- poner en suspensión en fase acuosa la biomasa que se va a hidrolizar;
- adición de una o más células huésped como se ha descrito anteriormente, con un organismo fermentativo y/o una composición enzimática como se ha descrito anteriormente, para producir un mosto de fermentación;
- separación del biocombustible del mosto de fermentación.
Preferentemente, las células huésped con la composición enzimática y/o el organismo fermentativo se añaden e incuban posteriormente a una temperatura comprendida entre 30 °C y 35 °C para producir un mosto de fermentación.
El uso del polipéptido de acuerdo con la invención que presenta una mejor actividad endoglucanasa de acuerdo con la presente invención presenta así la ventaja de obtener un mejor rendimiento de producción de glucosa. Por lo tanto, la presente invención permite utilizar menos enzima que antes, lo que presenta una ventaja desde el punto de vista económico.
Descripción de las figuras
Otros aspectos, objetos, ventajas y características de la invención se expondrán tras la lectura de la siguiente descripción no restrictiva que describe modos de realización preferentes de la invención proporcionados mediante ejemplos y FIGURAS.
La FIGURA 1 es un gráfico que representa la hidrólisis de p-nitrofenil-p-celotriosida (pNPC3) por la endoglucanasa de referencia EG2 (SEQ ID NO: 2) y los mutantes 222e1 y 225C7 (respectivamente SeQ ID NO: 24 y 26) secretados en el medio de cultivo de las cepas Sca-EG2, Sca-222E1 y Sca-225C7, respectivamente.
La FIGURA 2 es un gráfico que representa la hidrólisis de CMC al 1 % por la endoglucanasa de referencia EG2 (SEQ ID: 2) y los mutantes 222E1 y 225C7 (respectivamente SEQ ID No: 24 y 26) secretados en el medio de cultivo de cepas Sca-EG2, Sca-222E1 y Sca-225C7, respectivamente.
La FIGURA 3 es un gráfico que representa los resultados de HFS para el cóctel resultante de la cepa 146C4/7, un cóctel de referencia producido por la cepa CL847 AEG1 (AEG1) suplementado con p-glucosidasa y otro cóctel de referencia producido por la cepa CL847 AEG1 retransformada con el gen de referencia EG2 (AEG1cEG2) suplementado con p-glucosidasa.
La FIGURA 4 es un gráfico que presenta los resultados de HFS para el cóctel de la cepa 222E1/1 (SEQ ID NO: 24) y el cóctel resultante de la cepa 225C7/7 (SEQ ID NO: 26), un cóctel de referencia producido por la cepa CL847 AEG1 (AEG1) suplementado con p-glucosidasa y otro cóctel de referencia producido por la cepa CL847 AEG1 retransformada con el gen de referencia EG2 (AEGlcEG2) suplementado con p-glucosidasa.
La FIGURA 5 es un gráfico que presenta los resultados de SFS para el cóctel resultante de la cepa 146C4/7 (SEQ ID NO: 16) y para el cóctel resultante de la cepa 191H1l/9 (SEQ ID NO 22), un cóctel de referencia
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producido por la cepa CL847 AEG1 (AEG1) suplementado con p-glucosidasa y otro cóctel de referencia producido por la cepa CL847 AEG1 retransformada con el gen de referencia EG2 (AEG1cEG2) suplementado con p-glucosidasa.
La FIGURA 6 es un gráfico que presenta la media de los resultados de SFS para los 3 cócteles resultantes de las cepas 222E1/1, 222E1/2 y 222E1/7 (SEQ ID NO: 24) y los resultados para el cóctel resultante de la cepa 225C7/7 (SEQ ID NO: 26), un cóctel de referencia producido por la cepa CL847 AEG1 (AEG1) suplementado con p-glucosidasa y otro cóctel de referencia producido por la cepa CL847 AEG1 retransformada con el gen de referencia EG2 (AEG1cEG2) suplementado con p-glucosidasa.
Descripción detallada de la invención
Ejemplos
EJEMPLO 1: Evolución por transposición en L
La secuencia del gen de endoglucanasa 2 (EG2) de Trichoderma reesei se sometió a un giro de transposición en L de acuerdo con el procedimiento patentado descrito en el documento EP1104457B1 con los genes de endoglucanasa 2 putativa de Botryotinia fuckeliana (gen BF) y la endoglucanasa 2 putativa de Sclerotinia sclerotiorum (gen SS) que presenta cada uno un 64 % de identidad con el gen de referencia EG2 (SEQ ID NO: 1).
1 - Identificación sistemática de alto rendimiento
Se desarrolló un ensayo de identificación sistemática de alto rendimiento para seleccionar los mejores clones resultantes de la transposición en L, es decir, aquellos con al menos un 20 % de mejora en la actividad endoglucanasa en comparación con la enzima de T. reesei.
El ensayo de identificación sistemática de alto rendimiento se realizó de acuerdo con las siguientes etapas:
- aislamiento en agar de clones de E. coli que expresan las variantes de la enzima recombinante de acuerdo con la invención y precultivados en medio LB de dichas colonias durante la noche a 37 °C;
- inoculación de un medio LB al 6 % con el precultivo y luego incubación durante 5 h a 37 °C y 17 h a 20 °C;
- centrifugación durante 10 minutos a 3.000 rpm;
- lisis de las células por adición de 80 pl de una solución de lisozima a 1 mg/ml en tampón citrato fosfato 0,1 M a pH 5;
- incubación durante 4 h a temperatura ambiente;
- adición de 80 pl de tampón citrato fosfato 0,1 M pH 5 que contiene 1 % de carboximetilcelulosa;
- incubación durante 3 h a 35 °C;
- centrifugación durante 10 minutos a 3.000 rpm;
- eliminación de 100 pl de sobrenadante;
- adición de 100 pl de reactivo DNS;
- incubación durante 10 minutos a 100 °C y luego durante 5 minutos en hielo;
- lectura de la DO a 540 nm en 120 pl.
En estas condiciones de identificación sistemática, se ha descubierto una mejora de la actividad endoglucanasa (aumento de la DO a 540 nm) con respecto a la enzima de referencia EG2 (SEQ ID NO: 2) en los clones 37D12, 45A7, 46H1, 50F10, 108G5, 140F7, 146C4, 149E4, 173C6, 191H11, 222E1,225C7, 227C4, 229D1, 231C9 y 330F9.
2 - Determinación de la mejora de la actividad endoglucanasa
2-1/Sobre el sustrato de carboximetilcelulosa (CMC)
Para estimar el kcat de los clones 37D12, 45A7, 46H1, 50F10, 108G5, 140F7, 146C4, 149E4, 173C6, 191H11, 222E1, 225C7, 227C4, 229D1, 231C9 y 330F9 con respecto a las enzimas de referencia, se procede de la siguiente manera:
- preparación de un cultivo madre de E. coli que expresa una enzima recombinante de acuerdo con la invención durante la noche a 37 °C;
- inoculación de un medio de cultivo LB con 1 % de cultivo madre a 37 °C hasta que se obtiene una densidad óptica a 600 nm de 0,4;
- cultivo de dichas células a 20 °C durante 18 h;
- centrifugación durante 5 minutos a 7.900 rpm;
- resuspensión de los residuos celulares con tampón citrato fosfato 0,1 M a pH 5 que contiene 1 mg/ml de lisozima (D0600 final 100);
- incubación de células resuspendidas durante 30 minutos en hielo;
- lisis de las células por tres ciclos de congelación/descongelación;
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- fraccionamiento del ADN mediante sometimiento a ultrasonidos durante 3 segundos con una potencia de 5;
- centrifugación durante 30 minutos a 13.000 rpm;
- incubación de 100 pl de sobrenadante de rotura con 100 pl de tampón fosfato citrato 0,1 M a pH 5 que contiene 1 % de CMC durante 1 hora a 35 y 50 °C;
- eliminación de 100 pl de reacción;
- adición de 100 p de reactivo DNS;
- incubación durante 5 minutos a 100 °C;
- incubación durante 3 minutos en hielo;
- centrifugación durante 10 minutos a 3.000 rpm;
- lectura de la densidad óptica a 540 nm en 150 pl.
De acuerdo con la invención, el cálculo de kcat se realiza de la
- expresión de las DO a 540 nm en función de la cantidad de
- resta del valor del control negativo;
- división por el coeficiente del intervalo patrón de glucosa DNS);
- división por el tiempo de reacción.
La TABLA 2 presenta el valor de los kcat así como el factor de mejora con respecto a la proteína de referencia EG2 (SEQ ID NO: 2) obtenidos para los clones 37D12, 45A7, 46H1, 50E10, 108G5, 140E7, 146C4, 149E4, 173C6, 191H11, 222E1, 225C7, 227C4, 229D1, 231C9 y 330E9 en las condiciones experimentales del ensayo de actividad en CMC.
siguiente manera: proteína de interés (en nM);
(se revelan diferentes cantidades de glucosa con el
TABLA 2: Actividad endoglucanasa en CMC
- 35°C 50°C
- Clon Kcat (mi n ) Factor de mejora Kcat (mi n ) Factor de mejora
- Clones de transposición en L
- 37D12 2717,1 2,27 5574,1 2,73
- 45A7
- 3183,8 2,66 6500 3,18
- 46H1
- 1933,1 1,61 3124,6 1,53
- 50F10
- 2864,8 2,39 5284,6 2,59
- 108G5
- 2062,2 1,72 4235,5 2,07
- 140F7
- 2024 1,69 4079,6 2,00
- 146C4
- 1692,3 1,41 3221,5 1,58
- 149E4
- 3132,9 2,61 5316,8 2,60
- 173C6
- 2472,9 2,06 6596,2 3,23
- 191H11
- 3247,8 2,71 5275,3 2,58
- 222E1
- 4484,5 3,74 9036,8 4,43
- 225C7
- 2778,2 2,32 4026 1,97
- 227C4
- 2340,3 1,95 3671,6 1,80
- 229D1
- 2737,3 2,28 6597 3,23
- 231C9
- 2344 1,95 3441,2 1,69
- 330F9
- 2172,8 1,81 4222,8 2,07
- Proteína de referencia
- EG2 1199,05 1 2041,7 1
Los resultados muestran mejoras en la actividad enzimática significativas en comparación con la enzima de referencia EG2 (SEQ ID NO: 2) para estos clones.
2-2/Sobre el sustrato de celulosa hinchada con ácido fosfórico (PASC)
La mejora de la actividad de los clones 37D12, 45A7, 46H1, 50F10, 108G5, 140F7, 146C4, 149E4, 173C6, 191H11, 222E1, 225C7, 227C4, 229D1, 231C9 y 330F9 se confirmó en un segundo sustrato: celulosa hinchada con ácido fosfórico (PAsC).
La TABLA 3 presenta el valor de los kcat así como los factores de mejora obtenidos para los clones 37D12, 45A7, 46H1, 50F10, 108G5, 140F7, 146C4, 149E4, 173C6, 191H11, 222E1, 225C7, 227C4, 229D1, 231C9 y 330F9 a 50 °C con respecto a la proteína de referencia EG2 (SEQ ID NO: 2) en las condiciones experimentales del ensayo 5 de actividad en PASC.
TABLA 3: Actividad endoglucanasa en PASC
- 51 D°C
- Clon Kcat (min" ) Factor de mejora
- Clones de transposición en L
- 37D12 4,51 1,12
- 45A7
- 5,86 1,45
- 46H1
- 6,56 1,62
- 50F10
- 5,04 1,25
- 108G5
- 8,49 2,10
- 140F7
- 7,82 1,94
- 146C4
- 8,12 2,01
- 149E4
- 5,96 1,48
- 173C6
- 5,87 1,45
- 191H11
- 8,38 2,07
- 222E1
- 5,14 1,27
- 225C7
- 5,44 1,35
- 227C4
- 4,76 1,18
- 229D1
- 3,91 0,97
- 231C9
- 4,62 1,14
- 330F9
- 4,3 1,06
- Proteína de referencia
- EG2 4,04 1
Los resultados muestran mejoras en la actividad enzimática significativas con respecto a la enzima de referencia 10 EG2 (SEQ ID NO: 2) para estos clones.
2-3/En el substrato Sigmacell
La mejora de los clones 37D12, 45A7, 46H1, 50F10, 108G5, 140F7, 146C4, 149E4, 173C6, 191H11, 222E1, 225C7, 15 227C4, 229D1, 231C9 y 330F9 también se evaluó en un tercer sustrato: Sigmacell. El protocolo de ensayo es el
mismo que el descrito anteriormente con el sustrato CMC. La incubación con el sustrato tiene lugar durante 24 h a 50 °C.
La TABLA 4 presenta el valor de los kcat así como los factores de mejora obtenidos para los clones 37D12, 45A7, 20 46H1, 50E10, 108G5, 140E7, 146C4, 149E4, 173C6, 191H11, 222E1, 225C7, 227C4, 229D1, 231C9 y 330E9 a
50 °C con respecto a la proteína de referencia EG2 (SEQ ID NO: 2) en las condiciones experimentales del ensayo de actividad en Sigmacell.
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TABLA 4: Actividad endoglucanasa en Sigmacell
- 51 D°C
- Clon Kcat (min"1) Factor de mejora
- Clones de transposición en L
- 37D12 6,84 1,20
- 45A7
- 6,54 1,15
- 46H1
- 6,04 1,06
- 50F10
- 7,12 1,25
- 108G5
- 5,95 1,05
- 140F7
- 6,9 1,21
- 146C4
- 9,3 1,63
- 149E4
- 5,71 1,00
- 173C6
- 5,85 1,03
- 191H11
- 5,99 1,05
- 222E1
- 9,16 1,61
- 225C7
- 7,16 1,26
- 227C4
- 7,22 1,27
- 229DI
- 6,25 1,10
- 231C9
- 6,46 1,14
- 330F9
- 5,99 1,05
- Proteína de referencia
- EG2 5,69 1
Los resultados muestran que la mejora de actividad para los clones 37D12, 45A7, 46H1, 50E10, 108G5, 140E7, 146C4, 149E4, 173C6, 191H11, 222E1, 225C7, 227C4, 229D1, 231C9 y 330E9 es visible con respecto a la enzima de referencia EG2 (SEQ ID NO: 2) con el sustrato Sigmacell.
Ejemplo 2:
Las variantes 146C4, 191H11, 222E1 y 225C7, así como el gen de referencia EG2 de T. reesei (SEQ ID NO: 2) fueron clonados entre el promotor y el terminador cbhl en el plásmido pUT1040 que contiene un gen de resistencia a la fleomicina como marcador, utilizando una doble digestión con BamH1/XhoI. Se utilizaron 5 |jg de cada vector para la transformación de la cepa T. reesei CL847AEG1. Los protoplastos se transformaron de acuerdo con un método convencional conocido por los expertos en la materia, mediante choque cálcico y PEG, con 5 jg de cada construcción. Los transformantes se seleccionaron en medio selectivo PDA/sacarosa que contenía 30 jg/l de fleomicina. Después de tres subcultivos sucesivos que permitieron obtener clones puros, se obtuvieron entre once y quince clones para cada una de las variantes. El conjunto de los clones se cultivó en medio F45 (800 jl de H3PO4 85 %, 4,2 g (NH4)2SO4, 0,3 g de MgSO4.7H2O, 0,75 g de maíz macerado, 1 ml de Oligo Ferment, 6 g de potasio ftalato, pH 5,8-6) con 5 g/l de glucosa y 10 g/l de sorbosa como sustrato de carbono e inductor. Después de 7 días de cultivo a 30 °C, se elimina el sobrenadante y se utiliza el equivalente de 10 mg/l de proteínas medidas por el método Lowry para un ensayo de actividad en carboximetilcelulosa.
Para las mediciones de actividad, se mezclaron 150 jl de una solución de CMC al 2 % en tampón citrato 50 mM, pH 4,8, con 150 jl de tampón citrato que contenía 10 mg/l de proteínas. La reacción se incuba a 50 °C y 35 °C durante 10 min y luego se inactiva al baño maría hirviendo. Después de la centrifugación durante 5 minutos, se eliminan 20 |jl para realizar una determinación de azúcares reductores utilizando ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS). La reducción de DNS y la formación de ácido 3-amino-5-nitrosalicílico se controlan mediante la lectura de absorción a 540 nm, y los azúcares reductores se cuantifican utilizando un intervalo de glucosa.
La TABLA 5 resume las actividades (expresadas en jmol equivalente glucosa/mg de proteína/min) obtenidas para los mejores clones para cada variante. El valor para la cepa AEG1 transformada con el gen EG2 nativo (AEG1cEG2) es una media de los cuatro mejores clones.
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TABLA 5: Actividad endoglucanasa en CMC
- clon
- actividad específica a 50 °C (pmol/mg/min) relación variante/AEG2cEG2 a 50 °C actividad específica a 30 °C (pmol/mg/min) relación variante/AEG2cEG2 a 35 °C
- AEG2cEG 2
- 10,8 ± 1,8 8,6 ± 2,2
- 191H11/2
- 23,1 ± 1,8 2,1 9,9 ± 2,8 1,2
- 191H11/9
- 21,9 ±4,0 2,0 10,8 ± 1,6 1,3
- 191H11/12
- 17,4 ± 0,4 1,6 9,7 ± 2,0 1,1
- 146C4/1
- 12,0 ±1,1 1,1 8,5 ± 0,7 1,0
- 146C4/6
- 11,7 ± 0,4 1,1 8,6 ± 1,2 1,0
- 146C4/7
- 16,1 ± 1,1 1,5 11,9 ± 3,2 1,4
- 222E1/1
- 21,4 ± 0,8 2,0 13,9 ± 3,3 1,6
- 222E1/2
- 18,3 ± 1,3 1,7 13,7 ± 1,4 1,6
- 222E1/4
- 13,5 ± 0,6 1,3 10,4 ± 0,8 1,2
- 222E1/7
- 16,2 ± 1,3 1,5 11,4 ± 0,3 1,3
- 225C7/7
- 11,4 ± 0,1 1,1 10,3 ± 3,3 1,2
- 225C7/9
- 14,7 ± 0,4 1,4 8,1 ± 1,4 0,9
Para cada variante, al menos un clon posee una actividad de CMCasa superior a la cepa AEG1cEG2 a 35 °C o a 50 °C, los mejores clones muestran dos veces más actividad que la cepa AEG1cEG2.
Ejemplo 3: Expresión recombinante de endoglucanasa de referencia EG2 y variantes 222E1 y 225C7 en Saccharomyces cerevisiae
1- Producción de la proteína de referencia endoglucanasa de referencia EG2 y su variante 222E1 en el medio extracelular
El gen de endoglucanasa de referencia EG2 de Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 1) y los genes de las variantes 222E1 y 225C7 (SEQ ID NO: 23 y 25, respectivamente) se clonaron sin su péptido señal en el vector pESC- LeuaAmyc (CNRS-CERMAV). Esta construcción permite la expresión de las proteínas en el medio de cultivo de la cepa Saccharomyces cerevisiae EBY100, auxótrofa para leucina y triptófano (Boder ET y Wittrup KD, Biotechnol Prog, 1998, 14: 55-62). Este plásmido permite colocar la expresión de genes bajo el control del promotor GAL1 inducible a galactosa, y posee el gen marcador de selección de la auxotrofia (Leu2) que permite la selección de transformantes.
La transformación de Saccharomyces cerevisiae EBY100 se llevó a cabo de acuerdo con los métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia (transformación de levaduras por choque térmico y acetato de litio). Los transformantes se seleccionaron en medio YNB 0,67 %-Glc 2 %-Trp 0,01 %.
Se utilizó un transformante para cada gen (Sca-EG2, Sca-222E1 y Sca-225C7) para sembrar 15 ml de un medio mínimo YNB 0,67 %-Glc 2 %-SD-Trp 0,01 %. SD es una mezcla de aminoácidos (40 mg/l de adenina sulfato, 20 mg/l de L-arginina, 100 mg/l de ácido L-aspártico, 100 mg/l de ácido L-glutámico, 20 mg/l de L-histidina, 30 mg/l de L- lisina, 20 mg/l de L-metionina, 50 mg/l de L-fenilalanina, 375 mg/l de L-serina, 200 mg/l de L-treonina, 30 mg/l de L- tirosina, 150 mg/l de L-valina y 20 mg/l de uracilo). Después de 24 h de precultivo a 30 °C con agitación a 220 rpm, se inocularon las tres cepas Sca-EG2, Sca-222E1 y Sca-225C7 (DO600 de 0,5) 150 ml de medio YNB 0,67 %-Gal 2 %-SD-Trp 0,01 %. Los cultivos se incubaron a 25 °C con agitación a 220 rpm. Después de 8 h de incubación, se añadieron 6 ml de citrato de sodio a pH 5,6 a cada cultivo para estabilizar el pH a 5.
Después de 4 días de incubación, se eliminaron 20 ml de cultivo. El sobrenadante del cultivo se obtuvo después de la centrifugación a 3.000 g a 4 °C durante 5 minutos.
2- Determinación de la actividad endoglucanasa en p-nitrofenil-B-celotriosida
La actividad endoglucanasa de los sobrenadantes de cultivo se midió por hidrólisis del sustrato pNPC3 en un volumen de 450 pl en las siguientes condiciones:
- 50 mM de tampón de citrato a pH 5
- 2 mM de pNPC3
- 56,3 pl del sobrenadante de cultivo de las cepas Sca-EG2, Sca-221E1 y Sca-225C7
- incubación a 35 °C durante 6 h.
La reacción se detuvo mediante la adición de 100 pl de carbonato de sodio 1 M a 100 pl de reacción de hidrólisis. La concentración de para-nitrofenol (pNP) liberada por hidrólisis de pNPC3 se determinó midiendo la absorbancia a 415 nm en comparación con un intervalo patrón de para-nitrofenol (lineal de 0,36 pM a 360 pM).
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Los resultados de la FIGURA 1 muestran que la cepa Sca-222E1 posee una actividad endoglucanasa mejorada con un factor 1,6 en comparación con la cepa Sca-EG2 que expresa la enzima de referencia EG2 (SEQ ID NO: 2). La cepa Sca-225C7 demuestra, por su parte, menos eficacia para la hidrólisis de este sustrato.
3- Determinación de la actividad endoglucanasa en carboximetilcelulosa
La actividad endoglucanasa de los sobrenadantes de cultivo se midió por hidrólisis de carboximetilcelulosa (CMC) en un volumen de 700 pl en las siguientes condiciones:
- 50 mM de tampón citrato a pH 5
- 1 % de CMC
- 210 |jl de sobrenadante de cultivo de cepas Sca-EG2, Sca-222E1 y Sca-225C7 dializadas contra el tampón citrato 50 mM pH 5 en membrana de 10 kDa y concentrados dos veces
- incubación a 35 °C durante 24 h.
La reacción se detuvo mediante la adición de 150 pl de reactivo DNS a 100 pl de reacción de hidrólisis. Después de un calentamiento durante 5 minutos a 100 °C y enfriamiento en hielo, la cantidad de azúcares reductores liberados se determinó midiendo la absorbancia a 550 nm en comparación con un intervalo patrón preparado con glucosa.
Los resultados de la FIGURA 2 indican que la cantidad de azúcares reductores liberados por la acción de las variantes de las cepas Sca-222E1 y Sca-225C7 es mayor que con la cepa Sca-EG2. Por lo tanto, después de 1 h de hidrólisis de la CMC, el factor de mejora a 35 °C en este sustrato es de 3,5 para Sca-222E1 y 2,6 para Sca- 225C7 con respecto a Sca-EG2. Más allá de este tiempo de incubación, la CMC continúa hidrolizándose por las dos variantes mientras que la velocidad de reacción se vuelve prácticamente cero en presencia de la proteína de referencia EG2 (SEQ ID NO: 2).
Ejemplo 4: Producción de enzimas por T. reesei en matraces alimentados
Las cepas de referencia y las que presentan la mejor actividad en CMC (CL847, AEG1, AEG1cEG2, 146C4/7, 191H11/9, 222E1/1, 222E1/2, 222E1/7, 225C7/7) se cultivaron en matraces Erlenmeyer de 250 ml. 55 ml de medio F45 (10 g/l de tampón dipotasio ftalato pH 6, 4,2 g/l (NH4)2SO4, 300 mg/l de MgSO4.7H2O, 150 mg/l de CaCb.2H2O, 1,5 g/l de maceración del maíz, 0,07 % de ácido ortofosfórico, 5 mg/l de FeSO4, 1,4 mg/l de MnSO4, 1,4 mg/l de ZnSO4, 3,7 mg/l de CoCb y 12,5 g/l de glucosa) se siembran y agitan a 150 rpm y 30 °C. La producción se realiza en dos fases: una fase continua en glucosa y una fase discontinua en lactosa. Los muestreos regulares permiten determinar el momento en el que la concentración de glucosa cae por debajo de 3 g/l. En este estadio, se inicia un suministro semicontinuo con una bomba de jeringa (6 vías). Los cultivos se suministran con una solución de 50 g/l de lactosa y 0,3 % de NH3 a un caudal de 40 mg de azúcar/g de biomasa por hora. Se toman muestras diarias para determinar el pH, el peso en seco y la concentración de proteínas en el sobrenadante. Después de 5 días de cultivo semicontinuo, el cultivo se filtra a través de un filtro de 0,45 jm y el sobrenadante se congela.
La concentración final de proteínas se encontraba en el orden de 3 a 4 g/l. Si la concentración era inferior a 3 g/l, los sobrenadantes se concentraron en una columna (Vivaspin MWC05, Sartorius).
Ejemplo 5: Eficacia de las enzimas resultantes de la transposición en L en la hidrólisis de la biomasa lignocelulósica de acuerdo con un procedimiento HFS
El sustrato de referencia utilizado es una paja de trigo que se ha sometido a un pretratamiento por explosión de vapor (19 bar - 3 minutos) después de la impregnación ácida al 0,01 % de H2SO4 durante 10 horas, que se ha lavado, neutralizado a pH 5, prensado, secado. Sus características se presentan en la Tabla 9.
Tabla 6: Composición de la paja utilizada para el ensayo de hidrólisis
- Composición
- % m/m
- SIA
- 97,52
- Contenido en cenizas
- 5
- Celulosa
- 51,7
- Xilanos corregidos
- 3,57
- Hemicelulosa
- 4,14
- Lignina de Klason (sobreestimada)
- 36,49
- Acetil
- 0,6
Las hidrólisis se llevaron a cabo al 10 % de materia seca m/m, o en un equivalente al 5,4 % de celulosa m/m.
La tasa de proteínas se fija a 10 mg/g de materia seca o aproximadamente 19 mg/g de celulosa. La concentración de cócteles enzimáticos se midió por el método Lowry utilizando ASB como referencia. Cada cóctel se suplementó con actividad p-glucosidasa con un máximo de 120 ± 2 lU/g de celulosa, añadiendo p-glucosidasa SP188 (Novozymes).
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Los ensayos se llevan a cabo en tubos Eppendorf de 2 ml útiles (1g de reacción) que contienen:
- 0,11 ± 0,001 g de sustrato de paja lavada
- 0,9 ± 0,02 ml de medio de reacción de hidrólisis compuesto de tampón acetato 50 mM - pH 4,8 y cloranfenicol (0,05 g/l)
- entre 0,1 y 0,2 ± 0,02 g de cóctel enzimático en función de su tasa de proteínas.
Las hidrólisis enzimáticas se llevan a cabo a 45 ± 2 °C bajo agitación tipo vórtex a 900 rotaciones por minuto en un Thermomixer Comfort Eppendorf.
Todas los ensayos se llevan a cabo por duplicado con tiempos de muestreo fijados a t 24, 48 y 96 horas, algunos de los cuales se muestrean a t 72 horas.
En cada tiempo de muestreo, los hidrolizados se escaldan durante 5 minutos en los tubos Eppendorf sacrificados. Estos tubos se enfrían y centrifugan. La determinación de glucosa se realiza por HPLC. Paralelamente, los residuos sólidos de cada tubo Eppendorf se lavan y se centrifugan 3 veces antes de secarse a 105 °C durante 24 horas para evaluar los SIA (sólidos insolubles en agua). El cálculo del rendimiento de la hidrólisis se realiza teniendo en cuenta los SIA.
Los cócteles resultantes del ejemplo 4 fueron evaluados. Se llevan a cabo dos ensayos de control con cócteles de referencia también suplementados con p-glucosidasa para comparación: un cóctel producido por la cepa CL847 AEG1 (AEG1) y un cóctel producido por la cepa CL847 AEG1 retransformada con el gen de referencia EG2 (AEG1cEG2).
La FIGURA 3 presenta los resultados de HFS para el cóctel resultante de la cepa 146C4/7 (SEQ ID NO: 16).
Los resultados presentados en la FIGURA 3 muestran que la velocidad inicial de hidrólisis del cóctel producido por la variante 146C4 es superior a la de los cócteles de referencia AEG1 y AEG1cEG2. El rendimiento final de la hidrólisis también es superior al de los cócteles de referencia AEG1 y AEG1cEG2.
La FIGURA 4 presenta los resultados de HFS para el cóctel resultante de la cepa 222E1/1 (SEQ ID NO: 24) y el cóctel resultante de la cepa 225C7/7 (SEQ ID nO: 26).
Los resultados presentados en la FIGURA 4 muestran que las velocidades iniciales de hidrólisis de los cócteles producidos por la variante 222E1 y la variante 225C7 son superiores a las de los cócteles de referencia AEG1 y AEG1cEG2. Los rendimientos finales de hidrólisis también son superiores a los de los cócteles de referencia AEG1 y AEG1cEG2.
Ejemplo 6: Eficacia de las enzimas en la hidrólisis de biomasa lignocelulósica de acuerdo con un procedimiento SFS
El sustrato utilizado es el mismo que el descrito en la TABLA 6 (Ejemplo 4).
Las SFS se realizan por triplicado en reactores de laboratorio. Se constituyen de los siguientes elementos:
- un frasco de vidrio de 30 ml de volumen útil;
- un tapón de seguridad de poliéter éter cetona (Peek);
- una válvula unidireccional DV-118 comercializada por la sociedad Vaplock fijada a través del tapón. La válvula está configurada para abrirse cuando la presión relativa en la botella es superior a 70 mbar;
- un tubo hueco de polipropileno, unido a través de un segundo que atraviesa el tapón y equipado en el extremo inferior de dicho tubo con un septo;
- una junta plana dispuesta entre el cuello del frasco y el tapón.
El principio de implementación de los biorreactores es el siguiente: el CO2 producido durante la fermentación etanólica se acumula en el cielo sobre el medio de reacción que causa por acumulación un aumento en la presión en el biorreactor (Pg). Cuando Pg es superior a la presión de apertura de la válvula unidireccional (Ps), ésta se abre para liberar una cantidad de gas que por ejemplo se determina mediante pesaje. Cuando Pg < Ps, la válvula se cierra hasta que Pg sea superior a Ps. Por lo tanto, el biorreactor en funcionamiento todavía está bajo presión para proporcionar un medio anaeróbico estable para la fermentación. La cantidad de etanol producida se evalúa por la producción de CO2 estimada por la pérdida de peso a partir de la siguiente ecuación estequiométrica de fermentación de glucosa en etanol:
C6H12O6 (glucosa)^ 2 CO2 + 2 CH3CH2OH (etanol) + energía
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El medio de cultivo utilizado para SFS es un medio acuoso que comprende:
- un tampón acetato 50 mM para pH 5;
- cloranfenicol a 0,1 g/l;
- medio nutritivo con 3 g/l de KH2PO4, 2 g/l de (NH4)2SO4, 0,4 g/l de MgSO4, 7H2O y 1 g/l de extracto de levadura.
Las SFS se prepararon con 10 ± 0,01 % m/m de materia seca o un equivalente de 5,4 % de celulosa m/m para una masa de reacción total de 15 ± 0,003 g. La tasa de proteínas se fija en 10 ± 0,01 mg de celulasas por gramo de materia seca, o aproximadamente 19 mg/g de celulosa. La concentración de cócteles enzimáticos se midió por el método de Lowry utilizando ASB (albúmina sérica bovina) como referencia. Cada cóctel se suplementó con actividad de p-glucosidasa a un máximo de 120 ± 2 lU/g de celulosa, añadiendo p-glucosidasa SP188 (Novozymes).
La levadura de fermentación de azúcares (Saccharomyces cerevisiae, cepa de etanol rojo, Fermentis, Francia) se añade al medio para obtener un contenido de 2 ± 0,1 g/kg.
Se añaden enzimas y levaduras a los biorreactores después de una hora de acondicionamiento de la paja de trigo pretratada a 35 °C con el tampón, cloranfenicol y medio de cultivo.
La reacción de SFS se realiza a una temperatura de aproximadamente 35 °C, colocando el biorreactor de laboratorio en una incubadora tipo INFORS Multitron HT Standard con una velocidad de rotación orbital de 150 rpm.
Con el tiempo, la pérdida de masa se controló mediante el pesaje de los biorreactores. Al final de la reacción, el mosto de fermentación se calienta a 100 °C durante 5 minutos, se enfría y se centrifuga para separar las materias sólidas no hidrolizadas del zumo de fermentación. Este último se analiza luego por cromatografía en fase gaseosa para determinar su concentración de etanol.
Se evaluaron los cócteles del ejemplo 4. Dos ensayos de control se llevan a cabo con cócteles de referencia también suplementados con p-glucosidasa para la comparación: un producto con la cepa CL847 AEG1 (AEG1) y uno con la cepa CL847 AEG1 retransformada con el gen de referencia EG2 (AEG1cEG2).
La FIGURA 5 presenta los resultados de SFS para el cóctel resultante de la cepa 146C4/7 y para el cóctel resultante de la cepa 191H11/9 (SEQ ID NO 22):
Los resultados presentados en la FIGURA 5 muestran que los progresos (producciones de etanol para la misma dosis de enzimas) de SFS en 100 horas para el cóctel que expresa endoglucanasa 146C4 y el cóctel que expresa endoglucanasa 191H11 son superiores a los de los cócteles de referencia AEG1 y AEG1cEG2.
La FIGURA 6 presenta los resultados de SFS para los 3 cócteles resultantes de las cepas 222E1/1, 222E1/2 y 222E1/7 (media de los resultados obtenidos con las 2 variantes) y para el cóctel resultante de la cepa 225C7/7.
Los resultados presentados en la FIGURA 6 muestran que los progresos de SFS en 100 horas para el cóctel que expresa la endoglucanasa 222E1 y el cóctel que expresa la endoglucanasa 225C7 son equivalentes y superiores a los de los cócteles de referencia aEG1 y AEG1cEG2.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> IFPEN
<120> VARIANTES DE LA ENDOGLUCANASA CON ACTIVIDAD MEJORADA Y SUS USOS <130> BFF130 <160> 38
<170> PatentIn versión 3.5
<210> 1 <211>1257 <212> ADN
<213> Trichoderma reesei <400> 1
- atgaacaagt
- ocgtggctoc attgctgott gcagcgtcca tactatatgg cggcgccgct 60
- gcacagcaga
- otgtotgggg ccagtgtgga ggtattggtt ggagcggacc tacgaattgt 120
- gotoctggct
- oagcttgttc gaccctcaat octtattatg cgcaatgtat tccgggagcc 180
- actactatca
- ccacttcgac ccggccacca tccggtccaa ccaccaccac cagggctacc 240
- tcaacaagct
- catcaactcc acccacgagc tctggggtcc gatttgocgg cgttaacatc 300
- gcgggttttg
- actttggctg taccacagat ggcacttgcg ttacctcgaa ggtttatcct 360
- ccgttgaaga
- acttcaccgg ctcaaacaac taccccgatg gcatcggcca gatgcagcac 420
- ttcgtcaacg
- acgacgggat gactattttc cgcttacctg tcggatggca gtacctcgtc 480
- aacaacaatt
- tgggcggcaa tcttgattcc acgagcattt ccaagtatga tcagcttgtt 540
- caggggtgcc
- tgtctctggg cgcatactgc atcgtcgaca tccacaatta tgctcgatgg 600
- aacggtggga
- tcattggtca gggcggccct actaatgctc aattcacgag cctttggtcg 660
- cagttggcat
- caaagtacgc atctcagtcg agggtgtggt tcggcatcat gaatgagccc 720
- cacgacgtga
- acatcaacac ctgggctgcc acggtccaag aggttgtaac cgcaatccgc 780
- aacgctggtg
- ctacgtcgca attcatctct ttgcotggaa atgattggca atctgctggg 840
- gotttoatat
- ccgatggcag tgcagccgcc ctgtctcaag tcacgaaccc ggatgggtca 900
- acaacgaatc
- tgatttttga cgtgcacaaa tacttggact cagacaactc cggtactcac 960
- gccgaatgta
- ctacaaataa cattgacggc gccttttctc cgcttgccac ttggctccga 1020
- cagaacaatc
- gccaggctat cctgacagaa accggtggtg gcaacgttca gtcctgcata 1080
- caagacatgt
- gccagcaaat ccaatatctc aaccagaact cagatgtcta tcttggotat 1140
- gttggttggg
- gtgcoggatc atttgatagc acgtatgtcc tgacggaaac accgactggc 1200
- agtggtaact
- catggacgga cacatccttg gtcagctcgt gtctagcaag aaagtag 1257
<210>2 <211> 418 5 <212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 2
Claims (14)
- 51015202530354045505560651. Polipéptido aislado o purificado caracterizado por que tiene una actividad endoglucanasa mejorada con respecto a la actividad endoglucanasa de la proteína de referencia EG2, dicho polipéptido se selecciona entre el grupo que consiste en:i) una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 34;ii) una secuencia de aminoácidos que presenta un porcentaje de identidad de al menos 98 %, preferentemente 99 %, con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 o SEQ ID NO: 34.
- 2. Ácido nucleico purificado o aislado, caracterizado por que codifica al menos un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1.
- 3. Ácido nucleico purificado o aislado de acuerdo con la reivindicación 2 seleccionado entre las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 33.
- 4. Vector caracterizado por que comprende un ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 2 o 3.
- 5. Célula huésped aislada caracterizada por que comprende el ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 2 o 3 o el vector de acuerdo con la reivindicación 4.
- 6. Célula huésped aislada de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizada por que se selecciona entre Trichoderma, Aspergillus, Neurospora, Humicola, Penicillium, Fusarium, Thermomonospora, Myceliophthora, Chrysosporium, Bacillus, Pseudomonas, Escherichia, Clostridium, Cellulomonas, Streptomyces, Yarrowia, Pichia y Saccharomyces.
- 7. Célula huésped aislada de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, caracterizada por que se selecciona entre Trichoderma reesei, Trichoderma viridae, Trichoderma koningii, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus wentii, Aspergillus oryzae, Aspergillus phoenicis, Neurospora crassa, Humicola grisae, Myceliophthora thermopila, Chrysosporium lucknowense, Penicillium pinophilum, Penicillium oxalicum, Escherichia coli, Clostridium acetobutylicum, Clostridium saccharolyticum, Clostridium benjerinckii, Clostridium butylicum, Pichia pastoris, Yarrowia lipolityca y Saccharomyces cerevisiae.
- 8. Uso de dicho polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 para la hidrólisis de celulosa.
- 9. Uso de dicho polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 para la producción de biocombustible.
- 10. Composición enzimática capaz de actuar sobre la biomasa lignocelulósica que comprende al menos un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1.
- 11. Procedimiento de producción de biocombustible a partir de biomasa, caracterizado por que comprende las siguientes etapas sucesivas:- poner en suspensión en fase acuosa la biomasa que se va a hidrolizar;- hidrólisis en presencia de una composición enzimática de acuerdo con la reivindicación 10 de la biomasa lignocelulósica a fin de producir un hidrolizado que contiene glucosa;- fermentación de la glucosa del hidrolizado a fin de producir un mosto de fermentación;- separación del biocombustible del mosto de fermentación.
- 12. Procedimiento de producción de biocombustible a partir de biomasa, caracterizado por que comprende las siguientes etapas sucesivas:- poner en suspensión en fase acuosa la biomasa que se va a hidrolizar;- adición simultánea de una composición enzimática de acuerdo con la reivindicación 10 y de un organismo fermentativo a fin de producir un mosto de fermentación;- separación del biocombustible del mosto de fermentación.
- 13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el organismo fermentativo se selecciona entre una célula huésped de acuerdo con una de las reivindicaciones 6 o 7.
- 14. Procedimiento de producción de biocombustible a partir de biomasa, caracterizado por que comprende lassiguientes etapas sucesivas:- poner en suspensión en fase acuosa la biomasa que se va a hidrolizar;- adición de una o más células huésped de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 a 7 con un organismo 5 fermentativo y/o una composición enzimática de acuerdo con la reivindicación 10, a fin de producir un mosto defermentación;- separación del biocombustible del mosto de fermentación.Equivalentes reductores (lig/ml de cultivo)
imagen1 FIGURA 1imagen2 ~*~225C7 2 22 ElFIGURA 2Progreso de la HFS en %imagen3 FIGURA 3imagen4 imagen5
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