ES2682761T3 - Formulaciones de anticuerpos monoclonales de alta concentración - Google Patents

Formulaciones de anticuerpos monoclonales de alta concentración Download PDF

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Abstract

Una formulacion de suspension que comprende un anticuerpo monoclonal secado por pulverizacion a una concentracion de aproximadamente 200 mg/ml o mas suspendido en un vehiculo de suspension no acuoso, en la que la viscosidad del vehiculo de suspension es inferior a aproximadamente 20 centipoise a aproximadamente 25 oC y en la que el vehiculo de suspension no acuoso comprende lactato de etilo.

Description

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DESCRIPCION
Formulaciones de anticuerpos monoclonales de alta concentracion Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a formulaciones de anticuerpos monoclonales de alta concentracion adecuadas para la administracion subcutanea, por ejemplo, a traves de una jeringa precargada. En particular, la invencion se refiere a una formulacion que comprende un anticuerpo monoclonal secado por pulverizacion a una concentracion de aproximadamente 200 mg/ml o mas suspendido en un vehffculo de suspension no acuoso, en la que la viscosidad del vetnculo de la suspension es inferior a aproximadamente 20 centipoise. La invencion tambien se refiere a un dispositivo de administracion subcutanea con la formulacion dentro del mismo, un metodo de fabricacion de la formulacion de suspension, un metodo de fabricacion de un arffculo de fabricacion que comprende la formulacion de suspension, el uso de la formulacion de suspension en la preparacion de un medicamento y un metodo de tratamiento de un paciente con la formulacion de suspension.
Antecedentes de la invencion
La administracion ambulatoria de anticuerpos monoclonales en dosis altas (varios mg por kg) a traves de inyeccion subcutanea (SC) es una forma preferida de entrega para el tratamiento de afecciones cronicas (Stockwin y Holmes, Expert Opin Biol Ther 3: 1133-1152 (2003); Shire et al., J Pharm Sci 93:1390-1402 (2004)). La via de administracion subcutanea que requiere inyecciones usando jeringas, autoinyectores u otros dispositivos generalmente restringe la formulacion del producto con respecto al volumen de inyeccion y la viscosidad de la solucion y las funcionalidades del dispositivo en terminos de fuerza de inyeccion y tiempo. Para la entrega de altas dosis de anticuerpos monoclonales con limitaciones de tiempo de inyeccion, volumen y fuerza, se requiere una formulacion de anticuerpo monoclonal de alta concentracion (100 mg/ml o mas) para la administracion subcutanea (Stockwin y Holmes, Expert Opin Biol Ther 3: 1133-1152 (2003); Shire et al., J Pharm Sci 93: 1390-1402 (2004)). Un posible desaffo en el desarrollo de formulaciones de alta concentracion de protemas es la viscosidad de la solucion dependiente de la concentracion. La fuerza de inyeccion (o la fuerza de deslizamiento) es un factor complejo influenciado por la viscosidad de la solucion, el tamano de la aguja (es decir, el calibre de la aguja) y la tension superficial del recipiente/cierre. Las agujas mas pequenas, por ejemplo, > calibre 26, presentaran menos sensacion de dolor a los pacientes. Overcashier y sus colaboradores establecieron una relacion de fuerza de deslizamiento-viscosidad en funcion del calibre de aguja basada en la ecuacion de Hagen-Poiseuille (Overcashier et al., Am. Pharm Rev. 9 (6): 77-83 (2006)). Con una aguja de pared delgada de calibre 27 (TW, por sus siglas en ingles) (DI, mm.: 0,241 mm), la viscosidad del ffquido debe mantenerse por debajo de 20 centipoise con el fin de no superar la fuerza de deslizamiento de 20 Newton. Desafortunadamente, los cienffficos de formulacion se enfrentan constantemente a una realidad conflictiva con la alta concentracion de anticuerpos monoclonales y la alta viscosidad de la solucion (Shire et al., J Pharm Sci 93: 1390-1402 (2004); Kanai et al., J Pharm Sci 97: 4219-4227 (2005)). Otro desaffo con las formulaciones ffquidas a una alta concentracion de anticuerpos monoclonales es la estabilidad ffsica de las protemas. En general, se observan mayores tasas de agregacion y una opalescencia indeseable en soluciones ffquidas con alta concentracion de anticuerpos monoclonales (Alford et al., J Pharm Sci 97: 3005-3021 (2008); Salinas et al., J Pharm Sci 99: 82-93 (2010); Sukumar et al., Pharm Res 21: 1087-1093 (2004)).
Se han intentado diferentes estrategias de formulacion para reducir la viscosidad de la solucion ffquida de anticuerpos monoclonales de alta concentracion mediante la formulacion con sal, aminoacidos o azucar para equilibrar las fuerzas repulsivas y atractivas a traves de fuerzas ionicas intermedias (Sukumar et al., Pharm Res 21: 1087-1093 (2004); He et al., J Pharm Sci 100: 1330-1340 (2011)). Sin embargo, la eficacia de estos enfoques puede estar limitada a una concentracion de anticuerpos monoclonales superior a 100 mg/ml o debido a caractensticas espedficas de ciertos anticuerpos monoclonales. Dani y sus colaboradores aplicaron el enfoque de reconstituir polvo de anticuerpos monoclonales secado por pulverizacion para preparar una solucion ffquida de alta concentracion de anticuerpos monoclonales antes de la inyeccion subcutanea (Dani et al., J Pharm Sci 96: 1504-1517 (2007)). Este enfoque puede ciertamente mejorar la estabilidad de la protema en estado solido durante toda la vida util, sin embargo, el problema de la alta viscosidad permanece porque el polvo de anticuerpos monoclonales secado por pulverizacion necesita reconstituirse a una concentracion de anticuerpo monoclonal alta antes de la inyeccion. Recientemente, un enfoque basado en polvo surgio usando suspensiones de partmulas cristalinas de anticuerpos monoclonales (Yang et al., Proc Natl Acad Sci 100: 6934-6939 (2003); Trilisky et al., "Crystallization and liquid-liquid phase separation of monoclonal antibodies and Fc-fusion proteins: Screening results", publicacion en ffnea AICHE DOI 10, 1002/btrp.621 (publicado por Wiley Online Library) (2011)). Se basa en la percepcion de que la viscosidad de una suspension cristalina de anticuerpos monoclonales puede ser menor que la de una formulacion ffquida a la misma concentracion de anticuerpos monoclonales. Sin embargo, no se presentaron datos de viscosidad o fuerza de inyeccion en estas referencias y este concepto siguio siendo especulativo. Ademas, la cristalizacion de anticuerpos monoclonales aun no es una plataforma de proceso madura aplicable a una amplia gama de anticuerpos monoclonales, aunque se han presentado algunos ejemplos satisfactorios (Trilisky et al., "Crystallization and liquid- liquid phase separation of monoclonal antibodies and Fc-fusion proteins: Screening results", publicacion en ffnea AICHE DOI 10, 1002/btrp.621 (publicado por Wiley Online Library) (2011)).
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La presente invencion representa un concepto diferente basado en polvo que emplea una suspension de polvo de anticuerpos monoclonales de alta concentracion en un vetnculo de suspension no acuoso. El enfoque de la suspension se ha revisado exhaustivamente (Floyd y Jain, "Injectable emulsions and suspensions", en: Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Volumen 2 (editores Lieberman HA, Rieger MM, Banker GS). Dekker, NY, NY, paginas 261-318 (1996), Akers et al., J Parent Sci & Techn 41: 88-96 (1987)) y ha informado de suspensiones de microesferas/emulsion en aceites vegetales, tales como aceite de sesamo (Larsen et al., Eur J Pharm Sci 29: 348-354 (2006); Hirano et al., J Pharm Sci 71: 495-500 (1982)), aceite de soja (Salmeron et al., Drug Dev Ind Pharm 23: 133-136 (1997); Karasulu et al., Drug Dev 14: 225-233 (2007)) y aceite de cacahuete (Santucci et al., J Contr Rel 42: 157-164 (1996)) como inyectables parenterales. Las fuerzas ffsicas y qmmicas que influyen en las propiedades de las suspensiones no acuosas pueden ser bastante diferentes de las de la suspension acuosa debido a la ausencia de efectos electricos asociados a la teona DLVO (atraccion de van der Waals y repulsion electrostatica como resultado de la doble capa de contraiones).
Pena y colaboradores (Pena et al., Intl J Pharm 113: 89-96 (1995)) informaron de la caracterizacion reologica de suspension de polvo de somatotropina bovina (rbSt) sin excipientes (liofilizada o secada por pulverizacion) en aceite de triglicerido capnlico/caprico (MIGLYOL 812®) con o sin polisorbato 80. RbSt es un peptido de 191 aminoacidos con un peso molecular de 22.000 Dalton. Pena et al. determinaron que se observo una red formada entre las partfculas de farmaco, polisorbato 80 y MIGLYOL 812® y una mayor viscosidad con el aumento de polisorbato 80 y las concentraciones de polvo. Estos estudios tambien descubrieron que la forma/morfologfa de las partfculas desempenaba un papel importante en la viscosidad de la suspension. Las partfculas esfericas mas pequenas (empaquetadas mas densamente) secadas por pulverizacion dieron como resultado suspensiones mas viscosas que el homologo liofilizado que presentaba escamas de forma irregular mas grandes.
El enfoque basado en polvo no acuoso para suspensiones de anticuerpos monoclonales de alta concentracion sigue sin explorarse. Estudios con el pequeno peptido rbSt en Pena et al. no predecinan la capacidad de formular eficazmente un anticuerpo monoclonal tetramerico grande (aproximadamente 150.000 Dalton). Ademas, los vetnculos de aceite utilizados por Pena et al. eran demasiado viscosos como para tenerse en cuenta para su uso en la administracion de jeringas precargadas. La viscosidad de MIGLYOL 812®, aceite de sesamo, aceite de soja, aceite de cacahuete es de ~30 centipoise (cP) a 25 °C, 43 cP a 25 °C, 50 cP a 25 °C y 35 cP a 37 °C, respectivamente. Ademas, Pena et al. determino que el rendimiento de la suspension del polvo secado por pulverizacion era inferior a la de su homologo liofilizado.
Las publicaciones que describen formulaciones de anticuerpos monoclonales incluyen: la Patente de los EE.UU. 6.284.282 (Maa et al.); las Patentes de los EE.UU. N.° 6.267.958 y 6.685.940 (Andya et al.); la Patente de los EE.UU. N.° 6.171.586 (Lam et al.); las Patentes de los EE.UU. N.° 6.875.432 y 7.666.413 (Liu et al.); el documento WO2006/044908 (Andya et al.); el documento US-2011-0076273-A1 (Adler et al.); el documento US 2011/0044977 y el documento WO 2011/012637 (Adler et al.); el documento US 2009/0226530A1 (Lassner et al.); el documento USA 2003/0190316 (Kakuta et al); el documento US-A 2005/0214278 y el documento US-A 2005/0118163 (Mizushima et al.); el documento US-A 2009/0291076 (Morichika et al); y el documento US-A 2010/0285011 (Imaeda et al.)
Sumario de la invencion
Los objetivos del presente estudio fueron: (1) identificar los parametros del proceso que dictan el rendimiento de la suspension; (2) evaluar la viabilidad de establecer suspensiones de polvo de anticuerpos monoclonales (es decir, > 250 mg de anticuerpo monoclonal/ml) con una inyectabilidad aceptable (es decir, fuerza de inyeccion < 20 N a traves de una aguja de pared delgada (TW, por sus siglas en ingles) de calibre 27) y una estabilidad ffsica de la suspension; y/o (3) comprender el mecanismo de rendimiento de la suspension. Para preparar polvos de anticuerpos monoclonales, se uso secado por pulverizacion. El secado por pulverizacion es un proceso de fabricacion maduro, escalable y eficiente. El efecto a corto plazo del secado por pulverizacion sobre el anticuerpo monoclonal se estudio a temperatura acelerada. Un criterio importante para la seleccion del vetnculo de suspension era que la viscosidad del vetnculo de suspension fuera inferior a 10 centipoise (cP). Los tres vetnculos de suspension modelo, dicaprilato/dicaprato de propilenglicol, benzoato de bencilo y lactato de etilo, sometidos a ensayo en el presente estudio tienen una baja viscosidad y satisfacen este requisito.
Se ha usado cromatograffa de gases inversa (CGI) para el analisis de energfa superficial (AES) (Newell et al., Pharm Res 18: 662-666 (2001); Grimsey et al., J Pharm Sci 91: 571-583 (2002); Newell y Buckton, Pharm Res 21: 14401444 (2004); Saleem y Smyth, Drug Devel & Ind Pharm 34: 1002-1010 (2008); Panzer y Schreiber, Macromolecules 25: 3633-3637 (1992)). En la CGI, se inyecta una sonda en una columna empaquetada con el polvo de interes (fase estacionaria) y el tiempo requerido para que la sonda pase a traves de la columna (tr) es una medida de la magnitud de la interaccion entre la sonda y la fase estacionaria. La energfa superficial normalmente puede dividirse en componentes polares y dispersivos (no polares). Por tanto, el uso de sondas no polares (alcanos) y polares (donadores-aceptores de electrones o disolventes acido-base) permitio cuantificar estos dos componentes de energfa de superficie. Las energfas superficiales de las partfculas secadas por pulverizacion pueden servir como un indicador mas directo y pertinente para el rendimiento de la suspension que otras caractensticas de las partfculas. Otro parametro es el calor de sorcion, que es una medida directa de la fuerza de las interacciones entre un solido y moleculas de gas adsorbidas en la superficie (Thielmann F., "Inverse gas chromatography: Characterization of
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alumina and related surfaces", en "Encidopedia of Surface and Colloid Science" Volumen 4 (edicion de P. Somasundaran). CRC Press, Boca Raton, FL., paginas 3009-3031 (2006); Thielmann y Butler, "Heat of sorption on microcrystalline cellulose by pulse inverse gas chromatography at infinite dilution', en Nota de Solicitud de Servicios de Medicion de Superficie 203 (http: //
www.thesorptionsolution.eom/Information_Application_Notes_IGC.php#Aps) (2007)). El metodo de CGI se empleo para medir el calor de sorcion entre las partmulas secadas por pulverizacion y el vehmulo de suspension en el presente estudio.
Los datos experimentales en el presente documento demuestran que se alcanzaron los objetivos y se desarrollaron formulaciones de suspension de anticuerpos monoclonales de alta concentracion adecuadas para la administracion subcutanea.
Por tanto, en un primer aspecto, la invencion se refiere a una formulacion de suspension que comprende un anticuerpo monoclonal secado por pulverizacion a una concentracion de aproximadamente 200 mg/ml o mas suspendido en un vefnculo de suspension no acuoso, en el que la viscosidad del vefnculo de suspension es inferior a aproximadamente 20 centipoise, como se define en las reivindicaciones.
En otro aspecto, la invencion se refiere a una formulacion de suspension que comprende un anticuerpo monoclonal IgG1 de longitud completa humano secado por pulverizacion a una concentracion de aproximadamente 200 mg/ml a aproximadamente 400 mg/ml suspendido en un vefnculo de suspension no acuoso con una viscosidad inferior a aproximadamente 20 centipoise, en la que la formulacion tiene un tamano de partmula promedio de aproximadamente 2 micrometros a aproximadamente 10 micrometros y una fuerza de deslizamiento de la inyeccion inferior a aproximadamente 15 Newton, como se define en las reivindicaciones.
La invencion se refiere adicionalmente a un dispositivo de administracion subcutanea (por ejemplo, una jeringa precargada) con la formulacion dentro del mismo.
En otro aspecto, la invencion se refiere a un metodo de fabricacion de una suspension que comprende suspender un anticuerpo monoclonal secado por pulverizacion en un vefnculo de suspension no acuoso con una viscosidad inferior a aproximadamente 20 centipoise, en el que la concentracion de anticuerpo en la formulacion de suspension es de aproximadamente 200 mg/ml o mas, como se define en las reivindicaciones.
Adicionalmente, la invencion proporciona un metodo de fabricacion de un artmulo de fabricacion que comprende cargar un dispositivo de administracion subcutanea con la formulacion del presente documento.
En aspectos relacionados, la invencion se refiere al uso de la formulacion en la preparacion de un medicamento para el tratamiento de un paciente que necesita tratamiento con el anticuerpo monoclonal de la formulacion, asf como la formulacion para su uso en un metodo de tratamiento de un paciente que comprende la administracion de la formulacion a un paciente que necesita tratamiento con el anticuerpo monoclonal de la formulacion.
Breve descripcion de los dibujos
Figura 1: Estabilidad del anticuerpo (como cambio de monomero en % por cromatograffa de exclusion por tamano (CET) desde justo despues del secado por pulverizacion) en funcion del tiempo de almacenamiento a 40 °C para una formulacion de bevacizumab/trehalosa secada por pulverizacion (•) y secada por congelacion (o) asf como para una formulacion de trastuzumab/trehalosa secada por pulverizacion (■) y liofilizada por congelacion (□).
Figura 2: Los perfiles de viscosidad-concentracion de polvo para suspensiones de dicaprilato/dicaprato de propilenglicol con tres polvos de anticuerpos monoclonales (mAb) secados por pulverizacion con un secador por pulverizacion a escala piloto o a escala experimental: bevacizumab por escala piloto (0), bevacizumab por escala experimental (♦), trastuzumab por escala piloto (□), trastuzumab por escala experimental (■), rituximab por escala piloto (A), rituximab por escala experimental (▲), ajuste empmco (lmea continua) y ajuste teorico a partir de la Ecuacion 4 (lmea de trazos).
Figura 3: Los perfiles de fuerza de deslizamiento-concentracion de mAb para una suspension de polvo de rituximab en dicaprilato/dicaprato de propilenglicol (A), lactato de etilo (0), benzoato de bencilo (o) y fuerza de deslizamiento prevista para una solucion lfquida de mAb extrafda de la Figura 4 en Overcashier et al. Am. Pharm Rev. 9 (6): 77-83 (2006) (■).
Figura 4: Los perfiles de viscosidad-concentracion de mAb para la suspension de polvo de rituximab en dicaprilato/dicaprato de propilenglicol (A), en benzoato de bencilo (0) y en lactato de etilo (o).
Figura 5: Distribucion de tamano de partmula de suspensiones de rituximab en dicaprilato/dicaprato de propilenglicol (0), en benzoato de bencilo (□) y en lactato de etilo (A).
Figuras 6A-C: Fotograffas de suspension de rituximab a 150 mg/ml en lactato de etilo despues de 2 semanas de almacenamiento (6A), en lactato de etilo agitado con formacion de vortice despues de 1 dfa de almacenamiento (6B) y en dicaprilato/dicaprato de propilenglicol despues de 2 semanas de almacenamiento (6C). (Nota: la cinta no es parte de la suspension, pero se usa para enfoque optico durante la toma de fotograffas).
Figuras 7A y 7B: Suspensiones de rituximab. Figura 7A: Distribucion de tamano de partmula de suspensiones de rituximab en mezclas de dicaprilato/dicaprato de propilenglicol y lactato de etilo a 100/0 (0), 75/25 (■), 50/50 (□),
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25/75 (♦) y 0/100 (A). Figura 7B: Fotograffa de suspension de rituximab en mezcla 75/25 de dicaprilato/dicaprato de propilenglicol/lactato de etilo despues de 2 semanas de almacenamiento. (Nota: la cinta no es parte de la suspension, pero se usa para enfoque optico durante la toma de fotograffas).
Las Figuras 8A y 8B proporcionan las secuencias de aminoacidos de la cadena pesada (SEQ ID No. 1) y la cadena ligera (SEQ ID No. 2) de anticuerpo rituximab. Se identifican cada una de las regiones marco conservadas (FR, por sus siglas en ingles) y cada una de las regiones de region determinante de la complementariedad (CDR, por sus siglas en ingles) en cada region variable, asf como la secuencia constante de la cadena pesada 1 gamma humana y la secuencia constante de la cadena ligera kappa humana. La region pesada variable (VH, por sus siglas en ingles) esta en la SEQ ID No. 3. La region ligera variable (VL, por sus siglas en ingles) esta en la SEQ ID No. 4. Los identificadores de secuencia para las CDR son: CDR H1 (SEQ ID No. 5), CDR H2 (SEQ ID N0. 6), CDR H3 (SEQ ID No. 7), CDR L1 (SEQ ID No. 8), CDR L2 (SEQ ID No. 9) y CDR L3 (SEQ ID No. 10).
Las Figuras 9A y 9B. proporcionar las secuencias de aminoacidos de la cadena pesada (SEQ ID No. 11) y la cadena ligera (SEQ ID No. 12) del anticuerpo bevacizumab. El final de cada region variable se indica con ||. La region pesada variable (VH, por sus siglas en ingles) esta en la SEQ ID No. 13. La region ligera variable (VL, por sus siglas en ingles) esta en la SEQ ID No. 14. Cada una de las tres CDR en cada region variable esta subrayada. Los identificadores de secuencia para las CDR son: CDR H1 (SEQ ID No. 15), CDR H2 (SEQ ID No. 16), CDR H3 (SEQ ID No. 17), CDR L1 (SEQ ID No. 18), CDR L2 (SEQ ID No. 19) y CDR L3 (SEQ ID No. 20). Las Figuras 10A y 10B proporcionan las secuencias de aminoacidos de la cadena pesada (SEQ ID No. 21) y la cadena ligera (sEq ID No. 22) del anticuerpo trastuzumab. El final de cada region variable se indica con ||. La region variable pesada (VH, por sus siglas en ingles) esta en la SEQ ID No. 23. La region ligera variable (VL, por sus siglas en ingles) esta en la SEQ ID No. 24. Cada una de las tres CDR en cada region variable esta subrayada. Los identificadores de secuencia para las CDR son: CDR H1 (SEQ ID No. 25), CDR H2 (SEQ ID No. 26), CDR H3 (SEQ ID No. 27), CDR L1 (SEQ ID No. 28), CDR L2 (SEQ ID No. 29) y CDR L3 (SEQ ID No. 30).
Descripcion detallada de las realizaciones preferidas
I. Definiciones
La expresion "formulacion farmaceutica" se refiere a una preparacion que esta en un tipo de forma que permite que la actividad biologica del agente activo (por ejemplo, anticuerpo monoclonal) sea eficaz y que no contenga componentes adicionales que son inaceptablemente toxicos para un sujeto al que se administraffa la formulacion. Dichas formulaciones son esteriles. En una realizacion, la formulacion farmaceutica es adecuada para la administracion subcutanea.
"Farmaceuticamente aceptable" con respecto a un excipiente en una formulacion farmaceutica significa que el excipiente es adecuado para la administracion a un paciente humano.
Una formulacion "esteril" es aseptica o esta libre de todos los microorganismos vivos y sus esporas.
La "administracion subcutanea" se refiere a la administracion (de una formulacion) bajo la piel de un sujeto o paciente.
Una formulacion "estable" es una en la que el agente activo (por ejemplo, anticuerpo monoclonal) retiene esencialmente en la misma su estabilidad ffsica y/o estabilidad qrnmica y/o actividad biologica tras la suspension y/o el almacenamiento. Preferentemente, la formulacion retiene esencialmente su estabilidad ffsica y qrnmica, asf como su actividad biologica tras la suspension y el almacenamiento. El penodo de almacenamiento generalmente se selecciona en funcion de la vida util prevista de la formulacion. Hay disponibles diversas tecnicas analfticas para medir la estabilidad de protemas en la tecnica y se revisan en Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Editor, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, Nueva York, Pubs. (1991); y Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 2990 (1993), por ejemplo. En una realizacion, la estabilidad de la formulacion de suspension se evalua alrededor del tiempo en el que las parffculas secadas por pulverizacion se suspenden en el vehmulo para producir la formulacion de suspension. En una realizacion, la estabilidad puede evaluarse cuando la formulacion se mantiene a una temperatura seleccionada durante un penodo de tiempo seleccionado. En una realizacion, la estabilidad del anticuerpo monoclonal se evalua mediante distribucion de tamano (porcentaje de monomero, agregacion y/o fragmentacion) antes y despues del secado por pulverizacion (por ejemplo, antes y despues del secado por pulverizacion durante 3 meses de almacenamiento a la temperatura acelerada de 40 °C). En una realizacion, la distribucion del tamano se evalua usando cromatograffa de exclusion por tamano-cromatograffa ffquida de alta resolucion (CET-HPLC). En una realizacion, el porcentaje de perdida de monomero (segun se mide por CET-HPLC) durante 3 meses es inferior a aproximadamente el 10 %, por ejemplo, inferior al 5 %, por ejemplo, a una temperatura acelerada de 40 °C. En una realizacion, la estabilidad se evalua mediante la evaluacion la estabilidad ffsica de la suspension, por ejemplo, inspeccion visual de la velocidad de sedimentacion y/o sedimentacion de parffculas.
"Secado por pulverizacion" se refiere al proceso de atomizacion y secado de un ffquido o suspension que comprende una protema o anticuerpo monoclonal usando gas (normalmente aire o nitrogeno) a una temperatura superior a la temperatura ambiente para producir parffculas de polvo seco que comprenden la protema o anticuerpo monoclonal.
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Durante el proceso, el Ifquido se evapora y se forman partmulas secas. En una realizacion, el secado por pulverizacion se realiza usando un secador por pulverizacion, por ejemplo, que tiene una temperatura de entrada de aire de aproximadamente 100 °C a aproximadamente 220 °C y una temperatura de salida de aire de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 100 °C. Las partmulas pueden separarse del gas mediante diversos metodos tales como ciclon, gas a alta presion, carga electrostatica, etc. Esta definicion de secado por pulverizacion en el presente documento excluye expresamente el secado por congelacion o la cristalizacion del anticuerpo monoclonal.
Una partfcula, protema o anticuerpo monoclonal "secos" de la presente invencion se ha sometido a un proceso de secado de manera que su contenido de agua se ha reducido significativamente. En una realizacion, la partfcula, protema o anticuerpo monoclonal tiene un contenido de agua inferior a aproximadamente el 10 %, por ejemplo, inferior a aproximadamente el 5 %, por ejemplo, donde el contenido de agua se mide mediante un metodo de titulacion qrnmica (por ejemplo, metodo de Karl Fischer) o un metodo de perdida de peso (calefaccion a alta temperatura).
Para los fines del presente documento, una "preparacion secada previamente por pulverizacion" se refiere a una preparacion del anticuerpo monoclonal (por lo general un anticuerpo monoclonal producido recombinantemente que ha sido sometido a una o mas etapas de purificacion) y uno o mas excipientes, tales como estabilizadores (por ejemplo, sacaridos, tensioactivos y/o aminoacidos) y, opcionalmente, un tampon. En una realizacion, la preparacion esta en forma lfquida. En una realizacion, la preparacion esta congelada.
Una "formulacion de suspension" es una formulacion lfquida que comprende partmulas solidas (por ejemplo, partmulas de anticuerpos monoclonales secadas por pulverizacion) dispersadas en toda una fase lfquida en la que no son solubles. En una realizacion, las partmulas solidas en la formulacion de suspension tienen un diametro de partmula promedio de aproximadamente 2 a aproximadamente 30 micrometros, por ejemplo, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 micrometros (por ejemplo, como se analiza por difraccion laser). Opcionalmente, las partmulas solidas en la formulacion de suspension tienen un tamano de partmula maximo (porcentaje mas alto) inferior a aproximadamente 30 micrometros y, opcionalmente, inferior a aproximadamente 10 micrometros (por ejemplo, segun se analiza por difraccion laser). La formulacion de suspension puede prepararse mediante la combinacion de partmulas de anticuerpos monoclonales secadas por pulverizacion con un vehmulo de suspension no acuoso. En una realizacion, la formulacion de suspension esta adaptada o es adecuada para la administracion subcutanea a un sujeto o paciente.
Como se usa en el presente documento, "vehmulo de suspension no acuoso" se refiere a un lfquido farmaceuticamente aceptable que no es a base de agua y en el que las partmulas de anticuerpo monoclonal secadas por pulverizacion pueden suspenderse con el fin de generar una formulacion de suspension. En una realizacion, el vehmulo comprende un lfpido lfquido o ester de acido graso o alcohol (por ejemplo, dicaprilato/dicaprato de propilenglicol), u otro compuesto organico tal como benzoato de bencilo o lactato de etilo. El vehmulo de la presente invencion incluye mezclas de dos o mas lfquidos, tales como una mezcla de dicaprilato/dicaprato de propilenglicol y lactato de etilo. Preferentemente, el vehmulo de suspension no acuoso tiene una viscosidad (a 25 °C) inferior a aproximadamente 20 centipoise (cP), opcionalmente inferior a aproximadamente 10 cP, y, en una realizacion, inferior a aproximadamente 5 cP. Los ejemplos de vehmulos de suspension no acuosos incluyen los vehmulos de la Tabla 1 a continuacion:
Tabla 1-Vehiculos de suspension no acuosos de ejemplo y su viscosidad
Vehfculo
Viscosidad (cP)
Etanol
1,3 (25 °C)
Dimetilsulfoxido
2,0 (20 °C)
N -metil-2-pirrolidona
1,66 (25 °C)
Acetona
0,33 (20 °C)
Benzoato de bencilo
9 (25 °C)
Alcohol tetrahidrofurfunlico
6,2 (25 °C)
Dimetileter de dietilenglicol (Diglym)
1,2 (15 °C)
Lactato de etilo
2 (20 °C)
Oleato de etilo
7,4 (20 °C)
Miristato de isopropilo
5,7 (20 °C)
Dicaprilato/dicaprato de propilenglicol (MIGLYOL 840®)
9 (25 °C)
"Viscosidad" se refiere a la medida de la resistencia de un fluido que se deforma por tension de cizalla o tension de traccion; puede evaluarse usando un viscosfmetro o reometro. A menos que se indique lo contrario, la medicion de la viscosidad (centipoise, cP) es aquella a aproximadamente 25 °C. La viscosidad como se usa en el presente documento puede referirse a la del vehmulo de suspension no acuoso en sf o al de la formulacion de suspension.
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"Inyectabilidad" se refiere a la facilidad con que la formulacion de suspension puede administrarse a un sujeto. De acuerdo con una realizacion de la invencion, la inyectabilidad de una formulacion de suspension dada puede ser superior a la inyectabilidad de una formulacion lfquida que comprende la misma concentracion de anticuerpo monoclonal y el mismo excipiente o excipientes y la concentracion o concentraciones de los mismos. En una realizacion, la inyectabilidad se refiere a la fuerza de deslizamiento de inyeccion.
La "fuerza de deslizamiento de inyeccion" como se usa en el presente documento se refiere a la fuerza necesaria para la inyeccion de una solucion a una velocidad de inyeccion dada a traves de una aguja de calibre y longitud predeterminados. En una realizacion, se evalua usando una jeringa precargada (jeringa de 10 ml de longitud con aguja de calibre < 25 o preferentemente aguja de calibre < 27) analizando la fuerza de deslizamiento y estableciendose como una funcion de la distancia del vastago del embolo que se desplaza dentro la jeringa a una tasa de compresion constante (por ejemplo, usando "Medicion de la Fuerza de Deslizamiento de la Jeringa" como en el Ejemplo del presente documento). El tiempo y la fuerza necesarios para una inyeccion manual (o el tiempo necesario para una inyeccion usando un autoinyector) pueden afectar a la usabilidad del producto por parte del usuario final (y, por tanto, el cumplimiento con el uso previsto del producto). En una realizacion, la ecuacion de Hagen-Poiseuille se utiliza para estimar la fuerza de desplazamiento (o deslizamiento) (Ecuacion 1).
(Ecuacion 1)
imagen1
Q = Caudal volumetrico |j = Viscosidad del fluido L = Longitud de la aguja R = Diametro interno de la aguja
A = Area de la seccion transversal del embolo de la jeringa F = Fuerza de desplazamiento sin friccion
De acuerdo con la Ecuacion 1, la fuerza de deslizamiento depende de una serie de parametros. El unico parametro en el que un cientffico de formulacion puede influir es la viscosidad. Todos los demas parametros (diametro interno de la aguja, longitud de la aguja y area de la seccion transversal del embolo de la jeringa) estan determinados por la propia jeringa precargable. Las formulaciones con una alta viscosidad pueden conducir a fuerzas de inyeccion altas y tiempos de inyeccion largos puesto que ambos parametros son proporcionales a la viscosidad. Los lfmites generalmente aceptados para la fuerza de inyeccion y el tiempo de inyeccion pueden depender, por ejemplo, de la indicacion y la destreza de la poblacion de pacientes. En una realizacion ejemplificada en el presente documento, los parametros de la Ecuacion 1 fueron:
Q = Caudal volumetrico = 0,1 ml/segundo j = Viscosidad del fluido = 20 centipoise L = longitud de la aguja = 1,25 cm
R = diametro interior de la aguja = 0,0105 cm (aguja de calibre 27)
A = Area de la seccion transversal del embolo de la jeringa = 0,00316 cm2 F = fuerza de desplazamiento sin friccion = 16,6 x 105 dina = 16,6 Newton
En una realizacion, la fuerza de deslizamiento de inyeccion se determina como una funcion de la concentracion de anticuerpos monoclonales mediante la inyeccion de 1 ml de formulacion de suspension usando una jeringa de 1 ml de largo a traves de una aguja de calibre 27 de pared delgada (TW, por sus siglas en ingles) en 10 segundos.
En una realizacion, la fuerza de deslizamiento de inyeccion de la formulacion de suspension es de aproximadamente 20 Newton o menos.
En una realizacion, la fuerza de deslizamiento de inyeccion de la formulacion de suspension es de aproximadamente 15 Newton o menos.
En una realizacion, la fuerza de deslizamiento de la inyeccion es de aproximadamente 2 Newton a aproximadamente 20 Newton.
En una realizacion, la fuerza de deslizamiento de inyeccion es de aproximadamente 2 Newton a aproximadamente 15 Newton.
En una realizacion, la fuerza de deslizamiento de la inyeccion es inferior a aproximadamente 20 Newton.
En una realizacion, la fuerza de deslizamiento de la inyeccion es inferior a aproximadamente 15 Newton.
Como se usa en el presente documento, "tampon" se refiere a una solucion tamponada que resiste los cambios en el pH por la accion de sus componentes conjugados acido-base. El tampon de la presente invencion (si se usa)
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generalmente tiene un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 8,0, por ejemplo, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0, por ejemplo, de aproximadamente 5,8 a aproximadamente 6,2 y en una realizacion su pH es aproximadamente 6,0. Los ejemplos de tampones que controlaran el pH en este intervalo incluyen acetato, succinato, succinato, gluconato, histidina, citrato, glicilglicina y otros tampones de acidos organicos. En una realizacion en el presente documento, el tampon es un tampon de histidina. Generalmente, se incluye un tampon en la preparacion secada previamente por pulverizacion y puede estar presente en la formulacion de suspension preparada a partir de la misma (pero no se requiere en la misma).
Un "tampon de histidina" es un tampon que comprende iones de histidina. Los ejemplos de tampones de histidina incluyen cloruro de histidina, acetato de histidina, fosfato de histidina, sulfato de histidina. En una realizacion, el tampon de histidina es histidina-acetato o histidina-HCl. En una realizacion, el tampon de histidina tiene un pH de 5,5 a 6,5, opcionalmente un pH de 5,8 a 6,2, por ejemplo, un pH de 6,0.
El termino "excipiente" se refiere a un agente que puede anadirse a una preparacion o formulacion, por ejemplo: como un estabilizador, para conseguir una consistencia deseada (por ejemplo, alterando las propiedades de volumen) y/o para ajustar la osmolalidad. Los ejemplos de excipientes en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, estabilizadores, azucares, polioles, aminoacidos, tensioactivos, agentes quelantes y polfmeros.
Un "estabilizador" en el presente documento es un excipiente, o mezcla de dos o mas excipientes, que estabiliza una formulacion farmaceutica. Por ejemplo, el estabilizador puede evitar la inestabilidad debido al secado por pulverizacion a temperatura elevada. Los estabilizadores de ejemplo del presente documento incluyen sacaridos, tensioactivos y aminoacidos.
Un "sacarido" en el presente documento comprende la composicion general (CH2O)n y derivados de la misma, incluyendo monosacaridos, disacaridos, trisacaridos, polisacaridos, alcoholes de azucar, azucares reductores, azucares no reductores, etc. Los ejemplos de sacaridos en el presente documento incluyen glucosa, sacarosa, trehalosa, lactosa, fructosa, maltosa, dextrano, glicerina, dextrano, eritritol, glicerol, arabitol, silitol, sorbitol, manitol, melibiosa, melecitosa, rafinosa, manotriosa, estaquiosa, maltosa, lactulosa, maltulosa, glucitol, maltitol, lactitol, iso- maltulosa, etc. El sacarido preferido en el presente documento es un disacarido no reductor, tal como trehalosa o sacarosa.
En el presente documento, un "tensioactivo" se refiere a un agente tensioactivo, preferentemente un tensioactivo no ionico. Los ejemplos de tensioactivos en el presente documento incluyen polisorbato (por ejemplo, polisorbato 20 y polisorbato 80); poloxamero (por ejemplo, poloxamero 188); Triton; dodecilsulfato de sodio (SDS); lauril sulfato de sodio; octilglicosido de sodio; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sulfobetama; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil- sarcosina; linoleMo, miristilo o cetil-betama; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil- o isostearamidopropil-betama (por ejemplo, lauroamidopropilo); miristamidopropil-, palmidopropil- o isostearamidopropil-dimetilamina; metil cocoil-taurato de sodio o metil oleil-taurato disodico; y la serie MONAQUAT™ (Mona Industries, Inc., Paterson, Nueva Jersey); polietilglicol, polipropilglicol y copolfmeros de etileno y propilenglicol (por ejemplo, Pluronics, PF68, etc.); etc. En una realizacion, el tensioactivo es polisorbato 20 o polisorbato 80. El tensioactivo puede incluirse para evitar o reducir la agregacion o desnaturalizacion del anticuerpo monoclonal en la preparacion y/o formulacion.
El termino "aminoacido" como se usa en el presente documento denota una molecula organica farmaceuticamente aceptable que posee un resto amino localizado en posicion a con respecto a un grupo carboxflico. Los ejemplos de aminoacidos incluyen: arginina, glicina, ornitina, lisina, histidina, acido glutamico, acido aspargico, isoleucina, leucina, alanina, fenilalanina, tirosina, triptofano, metionina, serina y prolina. El aminoacido empleado esta opcionalmente en la forma L. Los ejemplos de aminoacidos que pueden incluirse como estabilizadores en las preparaciones y/o formulaciones del presente documento incluyen: histidina, arginina, glicina y/o alanina.
Por "isotonico" se entiende que la formulacion de interes tiene esencialmente la misma presion osmotica que la sangre humana. Las formulaciones isotonicas generalmente tendran una presion osmotica de aproximadamente 250 a 350 mOsm. La isotonicidad puede medirse usando un osmometro de presion de vapor o de tipo de congelacion por hielo, por ejemplo.
La expresion "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos y/o se unen al mismo epftopo, excepto las posibles variantes que puedan surgir durante la produccion del anticuerpo monoclonal, estando dichas variantes generalmente presentes en cantidades menores. Al contrario que las preparaciones de anticuerpos policlonales que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epftopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un unico determinante en el antfgeno. Ademas de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque no estan contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica que el caracter del anticuerpo se obtiene a partir de una poblacion sustancialmente homogenea de anticuerpos y no debe interpretarse que requiere la produccion del anticuerpo mediante ningun metodo particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se usaran de acuerdo con la presente invencion pueden prepararse mediante el metodo de hibridoma descrito por
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primera vez por Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975) o pueden prepararse mediante metodos de ADN recombinante (vease, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. N.° 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" tambien pueden aislarse a partir de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las tecnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), por ejemplo. Los ejemplos espedficos de anticuerpos monoclonales en el presente documento incluyen anticuerpos quimericos, anticuerpos humanizados y anticuerpos humanos.
Un anticuerpo monoclonal "secado por pulverizacion" se ha sometido a secado por pulverizacion. El termino incluye el anticuerpo monoclonal secado por pulverizacion en forma de polvo (es decir, antes de la suspension) y en forma lfquida (es decir, cuando se suspende en el vedculo de suspension no acuoso para formar la formulacion de suspension).
Los anticuerpos monoclonales en el presente documento incluyen espedficamente anticuerpos "quimericos" (inmunoglobulinas) en los que una porcion de la cadena pesada y/o ligera es identica o homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la cadena o cadenas es identica o homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, a condicion de que muestren la actividad biologica deseada (Patente de los EE.UU. N.° 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quimericos de interes en el presente documento incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de union a antigeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, mono del Viejo Mundo, tal como babuino, macaco de la India o macaco cangrejero) y secuencias de region constante humanas (Patente de los EE.UU. N.° 5.693.780). Un ejemplo de un anticuerpo quimerico en el presente documento es rituximab.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quimericos que contienen una secuencia minima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los restos de una region hipervariable del receptor se reemplazan por residuos de una region hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como raton, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la region marco conservada (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por restos no humanos correspondientes. Ademas, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se realizan para perfeccionar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todos de al menos un dominio variable y normalmente dos, en los que todas o sustancialmente todas las regiones hipervariables corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana, excepto por la sustitucion o sustituciones de FR como se ha indicado anteriormente. El anticuerpo humanizado opcionalmente tambien comprendera al menos una porcion de una region constante de inmunoglobulina, normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para mas detalles, vease Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992). Los ejemplos de anticuerpos humanizados del presente documento incluyen trastuzumab y bevacizumab.
Un "anticuerpo humano" en el presente documento es uno que comprende una estructura de secuencia de aminoacidos que se corresponde con la estructura de la secuencia de aminoacidos de un anticuerpo que puede obtenerse a partir de una celula B humana. Dichos anticuerpos pueden identificarse o prepararse mediante diversas tecnicas, que incluyen, pero no se limitan a: la produccion mediante animales transgenicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, despues de la inmunizacion, de producir anticuerpos humanos en ausencia de produccion de inmunoglobulina endogena (vease, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7: 33 (1993); y las Patentes de los EE.UU. N.° 5.591.669, 5.589.369 y 5.545.807)); la seleccion de bibliotecas de expresion de fagos que expresan anticuerpos humanos (vease, por ejemplo, McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990); Johnson et al., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993); Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991); Griffith et al., EMBOJ. 12: 725-734 (1993); las Patentes de los EE.UU. N.° 5.565.332 y 5.573.905); la generacion a traves de celulas B activadas in vitro (veanse las Patentes de los EE.UU. 5.567.610 y 5.229.275); y el aislamiento de hibridomas productores de anticuerpos humanos. Un ejemplo de un anticuerpo humano en el presente documento es ofatumumab.
Un "anticuerpo multiespedfico" en el presente documento es un anticuerpo que tiene especificidades de union para dos o mas epttopos diferentes.
Un "anticuerpo biespedfico" es un anticuerpo con especificidades de union para dos epftopos diferentes. Un ejemplo de un anticuerpo biespedfico espedficamente contemplado en el presente documento es la molecula Fab de doble accion HER3/EGFR (DAF), tal como DL11f comprende cadenas pesadas de IgG1 humana (documento US 2010/0255010; documento WO2010/108127).
Los anticuerpos del presente documento incluyen "variantes de secuencia de aminoacidos" con actividad biologica o
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union a antfgeno alterada. Los ejemplos de dichas alteraciones de aminoacidos incluyen anticuerpos con afinidad potenciada por antfgeno (por ejemplo, anticuerpos "madurados por afinidad") y anticuerpos con region Fc alterada, por ejemplo, con citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo alterada (aumentada o disminuida) (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) (vease, por ejemplo, el documento WO 00/42072, Presta, L. y el documento WO 99/51642, Iduosogie et al.); y/o una vida media en suero aumentada o disminuida (vease, por ejemplo, el documento WO00/42072, Presta, L.).
Una "variante de afinidad madurada" tiene uno o mas restos de region hipervariable sustituida de un anticuerpo original (por ejemplo, de un anticuerpo parental quimerico, humanizado o humano) que mejora la union de la variante de afinidad madurada.
El anticuerpo del presente documento puede conjugarse con una "molecula heterologa", por ejemplo, para aumentar la vida media o la estabilidad del anticuerpo o mejorarlo de otro modo. Por ejemplo, el anticuerpo puede estar unido a uno de diversos polfmeros no protemicos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, polioxialquilenos o copolfmeros de polietilenglicol y polipropilenglicol.
El anticuerpo del presente documento puede ser una "variante de glucosilacion" de manera que cualquier hidrato de carbono unido a su region Fc este alterado. Por ejemplo, los anticuerpos con una estructura de hidrato de carbono madura que carece de fucosa unida a una region Fc del anticuerpo se describen en la Solicitud de Patente de los EE.UU. N.° US 2003/0157108 (Presta, L.). Vease tambien el documento US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Los anticuerpos con una N-acetilglucosamina bisecante (GlcNAc) en el hidrato de carbono unida a una region Fc del anticuerpo se mencionan en el documento WO 2003/011878, Jean-Mairet et al. y la Patente de los EE.UU. N.° 6.602.684, Umana et al. Los anticuerpos con al menos un resto de galactosa en el oligosacarido unido a una region Fc del anticuerpo se notifican en el documento WO 1997/30087, Patel et al. Veanse, tambien, el documento WO 1998/58964 (Raju, S.) y el documento WO 1999/22764 (Raju, S.) relativos a anticuerpos con hidratos de carbono alterados unidos a la region Fc de los mismos. Vease tambien el documento US 2005/0123546 (Umana et al.) que describe anticuerpos con glicosilacion modificada.
La expresion "region hipervariable" cuando se usa en el presente documento se refiere a los restos de aminoacidos de un anticuerpo que son responsables de la union del antfgeno. La region hipervariable comprende restos de aminoacidos de una "region determinante de complementariedad" o "CDR" (por sus siglas en ingles) (por ejemplo, restos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.° Ed. Servicio de Salud Publica, Institutos Nacionales de Salud de los EE.UU., Bethesda, MD. (1991)) y/o los restos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, restos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Los restos de "region marco conservada" o "FR" (por sus siglas en ingles) son aquellos restos de dominio variable distintos de los restos de la region hipervariable como se define en el presente documento. Las CDR de rituximab, bevacizumab y trastuzumab se desvelan en las Figuras 8A-B, 9A-B y 10A-B, respectivamente.
Un "anticuerpo de longitud completa" es uno que comprende una region variable de union a antfgeno, asf como un dominio constante de cadena ligera (CL) y dominios constantes de cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de secuencia nativa humana) o variantes de secuencia de aminoacidos de los mismos. Preferentemente, el anticuerpo de longitud completa tiene una o mas funciones efectoras. En una realizacion, una region Fc de cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226 o desde Pro230, hasta el extremo carboxilo de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C terminal (Lys447) de la region Fc puede estar presente o no. A menos que se especifique lo contrario en el presente documento, la numeracion de restos de aminoacidos en la region Fc o region constante es de acuerdo con el sistema de numeracion EU, tambien denominado mdice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Servicio de Salud Publica, Institutos Nacionales de Salud de los EE.UU., Bethesda, MD, 1991. Rituximab, trastuzumab y bevacizumab son ejemplos de anticuerpos de longitud completa.
Un "anticuerpo desnudo" es un anticuerpo monoclonal que no esta conjugado con una molecula heterologa, tal como un resto citotoxico, polfmero o radiomarcador. Rituximab, trastuzumab y bevacizumab son ejemplos de anticuerpos desnudos.
Las "funciones efectoras" de anticuerpo se refieren a las actividades biologicas atribuibles a la region Fc (una region Fc de secuencia nativa o region Fc de la variante de secuencia de aminoacidos) de un anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpos incluyen la union de C1q, la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la union al receptor de Fc, la citotoxicidad mediada por celulas dependientes de anticuerpo (ADCC), etc.
Dependiendo de la secuencia de aminoacidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, pueden asignarse anticuerpos de longitud completa los a diferentes clases. Existen cinco clases principales de anticuerpos de longitud completa: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y varias de ellas pueden dividirse adicionalmente en "subclases" (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA y IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se denominan alfa, delta, epsilon, gamma y mu, respectivamente. Las estructuras
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de subunidades y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. El anticuerpo en el presente documento es una IgG1 humana de acuerdo con una realizacion de la invencion.
Un anticuerpo "IgG1 humana" en el presente documento se refiere a un anticuerpo de longitud completa que comprende dominios constantes de cadena pesada de IgG1 humana.
La expresion "anticuerpo recombinante" como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo monoclonal (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal humano, humano o quimerico) que se expresa mediante una celula hospedadora recombinante que comprende un acido nucleico que codifica el anticuerpo monoclonal. Los ejemplos de "celulas hospedadoras" para producir anticuerpos recombinantes incluyen: (1) celulas de mairnfero, por ejemplo, ovario de hamster chino (CHO), COS, celulas de mieloma (incluyendo celulas Y0 y NS0), rinon de hamster bebe (BHK), Celulas Hela y Vero; (2) celulas de insecto, por ejemplo, sf9, sf21 y Tn5; (3) celulas vegetales, por ejemplo, plantas que pertenecen al genero Nicotians (por ejemplo, Nicotians tabacum); (4) celulas de levadura, por ejemplo, las que pertenecen al genero Saccharomyces (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) o el genero Aspergillus (por ejemplo, Aspergillus niger); (5) celulas bacterianas, por ejemplo, celulas de Escherichia coli o celulas de Bacillus subtilis , etc.
Como se usa en el presente documento, "unirse espedficamente" o "se une espedficamente a" se refieren a un anticuerpo que se une de forma selectiva o preferencial a un antfgeno. Preferentemente, la afinidad de union por el antfgeno es de un valor de Kd de 10-9 mol/l o inferior (por ejemplo, 10-10 mol/l), preferentemente con un valor de Kd de 10-10 mol/l o inferior (por ejemplo, 10-12 mol/l). La afinidad de union se determina con un ensayo de union convencional, tal como la tecnica de resonancia de plasmon superficial (BIACORE®).
Un "anticuerpo monoclonal terapeutico" es un anticuerpo monoclonal utilizado para la terapia de un sujeto humano. Los anticuerpos monoclonales terapeuticos desvelados en el presente documento incluyen: anticuerpos CD20 para la terapia de tumores malignos de celulas B (tales como linfoma no Hodgkin o leucemia linfodtica cronica) o enfermedades autoinmunitarias (tales como artritis reumatoide y vasculitis); anticuerpos HER2 contra el cancer (tal como cancer de mama o cancer gastrico); anticuerpos VEGF para el tratamiento del cancer, la degeneracion macular relacionada con la edad, el edema macular, etc.
Para los fines del presente documento, "rituximab" se refiere a un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoacidos pesada variable en la SEQ ID No. 3 y los aminoacidos de la cadena ligera variable en la SEQ ID No. 4, y, opcionalmente, la secuencia de aminoacidos de la cadena pesada en la SEQ ID No. 1 y la secuencia de aminoacidos de la cadena ligera en la SEQ ID No. 2. Este termino incluye espedficamente rituximab biosimilar.
Para los fines del presente documento, "bevacizumab" se refiere a un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoacidos pesada variable en la SEQ ID No. 13 y los aminoacidos de la cadena ligera variable en la SEQ ID No. 14, y, opcionalmente, la secuencia de aminoacidos de la cadena pesada en la SEQ ID No. 11 y la secuencia de aminoacidos de la cadena ligera en la SEQ ID No. 12. Este termino incluye espedficamente bevacizumab biosimilar.
Para los fines del presente documento, "trastuzumab" se refiere a un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoacidos pesada variable en la SEQ ID No. 23 y los aminoacidos de la cadena ligera variable en la SEQ ID No. 24, y, opcionalmente, la secuencia de aminoacidos de la cadena pesada en la SEQ ID No. 21 y la secuencia de aminoacidos de la cadena ligera en la SEQ ID No. 22. Este termino incluye espedficamente trastuzumab biosimilar.
El anticuerpo monoclonal que se formula en el presente documento es preferentemente esencialmente puro y deseablemente esencialmente homogeneo (es decir, libre de protemas contaminantes, etc.). Un anticuerpo "esencialmente puro" significa una composicion que comprende al menos aproximadamente el 90 % en peso del anticuerpo, basado en el peso total de la composicion, preferentemente al menos aproximadamente el 95 % en peso. Anticuerpo "esencialmente homogeneo" significa una composicion que comprende al menos aproximadamente el 99 % en peso de anticuerpo, basado en el peso total de la composicion.
II. Anticuerpos monoclonales que se han de formular en el presente documento
A continuacion, se describen tecnicas de ejemplo para producir anticuerpos monoclonales que pueden formularse de acuerdo con la presente invencion. En una realizacion, el antfgeno al que se une el anticuerpo es una protema biologicamente importante y la administracion del anticuerpo a un mamffero que padece una enfermedad o trastorno puede dar como resultado un beneficio terapeutico en ese mamffero. Sin embargo, tambien se contemplan anticuerpos dirigidos contra antfgenos no polipeptfdicos (tales como antfgenos de glucolfpidos asociados a tumores, vease la Patente de los EE.UU. 5.091.178).
Cuando el antfgeno es un polipeptido, puede ser una molecula transmembrana (por ejemplo, un receptor) o un ligando tal como un factor de crecimiento. Los antfgenos ilustrativos incluyen moleculas tales como renina; una hormona del crecimiento, incluyendo la hormona de crecimiento humana y la hormona de crecimiento bovina; factor de liberacion de la hormona del crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante de la tiroides; lipoprotemas; alfa-1-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona estimuladora folicular;
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calcitonina; hormona luteinizante; glucagon; factores de coagulacion tales como factor VIIIC, factor IX, factor tisular (TF) y factor de von Willebrand; factores anticoagulantes tales como Protema C; peptido natriuretico auricular; tensioactivo pulmonar; un activador de plasminogeno, tal como uroquinasa u orina humana o activador de plasminogeno de tipo tisular (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyetico; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES (regulado en la activacion normalmente de linfocito T expresado y secretado); protema inflamatoria de macrofagos humanos (MIP-1-alfa); una albumina serica tal como albumina serica humana; sustancia inhibidora muelleriana; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorelaxina; peptido asociado a gonadotropina de raton; una protema microbiana, tal como beta-lactamasa; DNasa; IgE; un antfgeno asociado a linfocitos T citotoxicos (CTLA), tal como CTLA-4; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; protema A o D; factores reumatoides; un factor neurotrofico tal como el factor neurotrofico derivado de los huesos (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5 o -6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6) o un factor de crecimiento nervioso tal como NGF-b; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos tal como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidermico (EGF); factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-b1, TGF-b2, TGF-b3, TGF-b4 o TGF-b5; un factor de necrosis tumoral (TNF) tal como TNF-alfa o TNF-beta; factor de crecimiento similar a la insulina I y II (IGF-I e IGF-II); des(l-3)-IGF-I (IGF-I del cerebro), protemas de union al factor de crecimiento similar a la insulina; protemas Cd tales como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD22 y CD40; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; una protema morfogenetica osea (BMP); un interferon tal como interferon-alfa, -beta y -gamma; factores estimulantes de colonias (CSF), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (IL), por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 e IL-10; superoxido dismutasa; receptores de linfocitos T; protemas de membrana superficiales; factor de aceleracion de la desintegracion; antfgeno vmco tal como, por ejemplo, una porcion de la envoltura del SIDA; protemas de transporte; receptores de migracion; adresinas; protemas reguladoras; integrinas tales como CD11a, CD11b, CD11e, CD18, un ICAM, VLA-4 y VCAM; un antfgeno asociado a tumor tal como receptor HER2, HER3 o HER4; y fragmentos de cualquiera de los polipeptidos enumerados anteriormente.
Las dianas moleculares de ejemplo para anticuerpos abarcadas por formulacion de la presente invencion incluyen protemas CD tales como Cd3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD22, CD34 y CD40; miembros de la familia de receptores ErbB tales como el receptor de EGF, el receptor HER2, HER3 o HER4; antfgenos de superficie de celulas B, tales como CD20 o BR3; un miembro de la superfamilia del receptor de necrosis tumoral, incluyendo DR5; antfgeno prostatico de celulas madre (PSCA); moleculas de adhesion celular tales como LFA-1, Macl, p150.95, VLA-4, ICAM- 1, VCAM, integrina alfa4/beta7 e integrina alfav/beta3 incluyendo ya sea subunidades alfa o beta de las mismas (por ejemplo, anticuerpos anti-CD11a, anti-CD18 o anti-CD11b); factores de crecimiento tales como VEGF asf como tambien receptores para los mismos; factor tisular (TF); un factor de necrosis tumoral (TNF) tal como TNF-alfa o TNF-beta, interferon alfa (alfa-IFN); una interleucina, tal como IL-8; IgE; antfgenos del grupo sangumeo; receptor flk2/flt3; receptor de obesidad (OB); receptor mpl; CTLA-4; protema C, etc.
Los antfgenos solubles o fragmentos de los mismos, opcionalmente conjugados con otras moleculas, pueden usarse como inmunogenos para generar anticuerpos. Para moleculas transmembrana, tales como receptores, pueden usarse fragmentos de estos (por ejemplo, el dominio extracelular de un receptor) como inmunogeno. Como alternativa, pueden usarse celulas que expresan la molecula transmembrana como inmunogeno. Dichas celulas pueden derivar de una fuente natural (por ejemplo, estirpes celulares cancerosas) o pueden ser celulas que se han transformado mediante tecnicas recombinantes para expresar la molecula transmembrana. Otros antfgenos y formas de los mismos utiles para preparar anticuerpos seran evidentes para los expertos en la materia.
Los ejemplos de anticuerpos que pueden formularse de acuerdo con la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: anticuerpos anti-ErbB, incluyendo anticuerpos anti-HER2 (por ejemplo, trastuzumab o pertuzumab); anticuerpos que se unen a un marcador de superficie de celulas B, tal como CD20 (por ejemplo, rituximab y 2H7/ocrelizumab humanizado), CD22, CD40 o BR3; anticuerpos que se unen a IgE, incluyendo omalizumab (XOLAIR®) disponible en el mercado de Genentech, E26, HAE1, anticuerpo IgE con una sustitucion de aminoacido en la posicion 265 de una region Fc del mismo (documento US 2004/0191244 A1), Hu-901, un anticuerpo IgE como en el documento W02004/070011 o anticuerpo que se une al segmento extracelular pequeno en IgE, M1' (por ejemplo, 47H4v5; vease la Patente de los EE.UU. N.° 8.071.097), vease, tambien, Presta et al., J. Immunol. 151: 2623-2632 (1993); la Publicacion Internacional N.° WO 95/19181; la Patente de los EE.UU. N.° 5.714.338, expedida el 3 de febrero de 1998; la Patente de los EE.UU. N.° 5.091.313, expedida el 25 de febrero de 1992; el documento WO 93/04173 publicado el 4 de marzo de 1993; el documento WO 99/01556 publicado el 14 de enero de 1999; y la Patente de los EE.UU. N.° 5.714.338; anticuerpos que se unen al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (por ejemplo, bevacizumab) o un receptor de VEGF; anticuerpos anti-IL-8 (St John et al., Chest, 103: 932 (1993) y la Publicacion Internacional N.° WO 95/23865); anticuerpos anti-PSCA (documento WO01/40309); anticuerpos anti-CD40, incluyendo S2C6 y variantes humanizadas de los mismos (documento WO00/75348); anticuerpos anti-CD11a, incluyendo efalizumab (RAPTIVA®) (Patente de los EE.UU. N.° 5.622.700, WO 98/23761, Steppe et al., Transplant Intl. 4: 3-7 (1991) y Hourmant et al., Transplantation 58: 377-380 (1994)); anticuerpos anti- CD18 (Patente de los EE.UU. N.° 5.622.700, expedida el 22 de abril de 1997 o como en el documento WO 97/26912, publicado el 31 de julio de 1997); anticuerpo anti-receptor Apo-2 (documento WO 98/51793 publicado el 19 de noviembre de 1998); anticuerpos anti-TNF-alfa incluyendo cA2 (ReMiCADE®) y adalimumab (HUMIRA®), CDP571 y MAK-195 (Afelimomab) (vease, la Patente de los EE.UU. N.° 5.672.347 expedida el 30 de septiembre de
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1997, Lorenz et al., J. Immunol. 156 (4): 1646-1653 (1996) y Dhainaut et al., Crit. Care Med. 23 (9): 1461-1469 (1995)); factor anti-tejido (TF) (Patente Europea N.° 0 420 937 B1 concedida el 9 de noviembre de 1994); integrina a4p7 anti-humana (documento WO 98/06248 publicado el 19 de febrero de 1998); anticuerpos anti-EGFR, incluyendo anticuerpo 225 quimerizado o humanizado como en el documento WO 96/40210 publicado el 19 de diciembre de 1996; anticuerpos anti-CD3, tales como OKT3 (Patente de los EE.UU. N.° 4.515.893 expedida el 7 de mayo de 1985); anticuerpos anti-CD25 o anti-tac tales como CHI-621 (SIMULECT®) y (ZENAPaX®) (Vease la Patente de los EE.UU. N.° 5.693.762, expedida el 2 de diciembre de 1997); anticuerpos anti-CD4 tales como el anticuerpo cM-7412 (Choy et al., Arthritis Rheum 39(1): 52-56 (1996)); anticuerpos anti-CD52 tales como alemtuzumab (CAMpAtH-1H®) (Riechmann et al., Nature 332: 323-337 (1988); anticuerpos del receptor anti-Fc tales como el anticuerpo M22 dirigido contra FcyRI como en Graziano et al., J. Immunol. 155 (10): 4996-5002 (1995); antfgeno anti-carcinoembrionico (CEA) anticuerpos tales como hMN-14 (Sharkey et al Cancer Res. 55 (Supl. 23): 5935s-5945s (1995); anticuerpos dirigidos contra celulas epiteliales de mama incluyendo huBrE-3, hu-Mc3 y CHL6 (Ceriani et al., Cancer Res. 55 (23): 5852s-5856s (1995) y Richman et al. Cancer Res. 55 (Supl. 23): 5916s-5920s (1995)), anticuerpos que se unen a celulas de carcinoma de colon tales como C242 (Litton et al., Eur. J. Immunol. 26 (1): 1-9 (1996)); anticuerpos anti-CD38, por ejemplo, AT 13/5 (Ellis et al. al. J. Immunol. 155 (2): 925-937 (1995)), anticuerpos anti-CD33 tales como Hu M195 (Jurcic et al., Cancer Res 55 (Supl. 23): 5908s-5910s (1995) y CMA-676 o CDP771; anticuerpos anti-CD22 tales como LL2 o LymphoCide (Juweid et al., Cancer Res 55 (Supl. 23): 5899s- 5907s (1995); anticuerpos anti-EpCAM tales como 17-1A (PAnOrEX®); anticuerpos anti-Gpllb/IIIa tales como abciximab o c7E3 Fab (REOPRO®); anticuerpos anti-RSV tales como MEDI-493 (SYNAGIS®); anticuerpos anti- CMV tales como PROTOVIR®; anticuerpos anti-VIH tales como PRO542; anticuerpos anti-hepatitis tales como el anticuerpo anti-Hep B OSTAVIR®; anticuerpo anti-CA 125 OvaRex; anticuerpo BEC2 de epttopo GD3 antiidiotfpico; anticuerpo anti-avp3 VITAXIN®; anticuerpo anti-carcinoma de celulas renales humano tal como ch-G250; ING-1; anticuerpo 17-1A antihumano (3622W94); anticuerpo tumoral colorrectal antihumano (A33); anticuerpo de melanoma antihumano R24 dirigido contra gangliosido GD3; carcinoma de celulas escamosas antihumano (SF-25); y anticuerpos anti-antigeno leucocitario humano (HLA) tales como Smart ID10 y el anticuerpo DR anti-HLA Oncolym (Lym-1); anti-CCR5 (PRO 140); ABT-325; ABT-308; ABT-147; anti-beta7 (etrolizumab); DAF anti-HER3/EGFR (DL11f); receptor anti-interleucina 6 (IL6R) tal como tocilizumab (ACTEMRA®); y anti-Abeta (vease el documento WO2003/070760 y el documento WO2008/011348), etc.
En una realizacion, el anticuerpo que se formula en el presente documento se une a CD20 y se selecciona entre: rituximab, ocrelizumab/2H7 humanizado (Genentech), ofatumumab (documento WO 04/035607, Genmab, Dinamarca), 1F5 parcheado de region marco conservada/humanizado (documento WO03/002607, Leung, S.), AME- 133 (Evolucion Molecular Aplicada) y anticuerpo A20 humanizado (documento US 2003/0219433, Immunomedics).
En una realizacion, el anticuerpo que se formula se une a HER2 y es trastuzumab o pertuzumab.
En una realizacion, el anticuerpo que se formula se une a VEGF y es bevacizumab.
En una realizacion, el anticuerpo que se formula en el presente documento es un anticuerpo humanizado.
En una realizacion, el anticuerpo que se formula es un anticuerpo recombinante.
En una realizacion, el anticuerpo que se formula ha sido expresado por una celula recombinante de ovario de hamster chino (CHO).
En una realizacion, el anticuerpo que se formula es un anticuerpo de longitud completa.
En una realizacion, el anticuerpo que se formula es un anticuerpo IgG1 humano de longitud completa.
En una realizacion, el anticuerpo que se formula es un anticuerpo IgG1 humanizado de longitud completa.
En una realizacion, el anticuerpo que se formula es un anticuerpo IgG1 humanizado recombinante de longitud completa.
En una realizacion, el anticuerpo que se formula es un anticuerpo IgG1 humanizado de longitud completa que ha sido expresado por una celula recombinante de ovario de hamster chino (CHO).
En una realizacion, el anticuerpo que se formula se une a un antfgeno seleccionado entre: CD20 (por ejemplo, rituximab), HER2 (por ejemplo, trastuzumab), VEGF (bevacizumab), IL6R (tocilizumab), beta7 (etrolizumab), Abeta, HER3 y EGFR (DL11f) y M1' (47H4v5).
En una realizacion, el anticuerpo formulado es rituximab.
En una realizacion, el anticuerpo formulado es trastuzumab.
En una realizacion, el anticuerpo formulado es bevacizumab.
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III. La preparacion secada previamente por pulverizacion
Generalmente se prepara una preparacion del anticuerpo monoclonal que se va a someter a secado por pulverizacion, la denominada "preparacion secada previamente por pulverizacion" del presente documento.
En una realizacion, la preparacion secada previamente por pulverizacion comprende una preparacion de anticuerpo monoclonal que se ha sometido a una o mas etapas de purificacion anteriores, tales como cromatograffa de afinidad (por ejemplo, cromatograffa de protema A), cromatograffa de interaccion hidrofoba, cromatograffa de intercambio ionico (cromatograffa de intercambio anionico y/o cationico), filtracion de virus, etc. Por tanto, la preparacion de anticuerpo puede purificarse, ser esencialmente pura y/o esencialmente homogenea.
En una realizacion, el anticuerpo monoclonal en la preparacion secada previamente por pulverizacion se concentra. Los metodos de ejemplo para concentrar el anticuerpo incluyen filtracion (tal como filtracion de flujo tangencial o ultrafiltracion), dialisis, etc.
La preparacion secada previamente por pulverizacion puede ser ffquida o congelada.
El pH de la preparacion secada previamente por pulverizacion se ajusta opcionalmente mediante un tampon. El tampon puede, por ejemplo, tener un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 8, por ejemplo, de aproximadamente 5 a 7, por ejemplo, de 5,8 a 6,2, y, en una realizacion, es de aproximadamente 6,0. Un tampon de histidina es una realizacion ejemplificada en el presente documento. La concentracion del tampon esta dictada, al menos en parte, por el pH deseado. Las concentraciones de ejemplo para el tampon son de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM o de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 40 mM.
La preparacion secada previamente por pulverizacion tambien comprende opcionalmente uno o mas estabilizadores que evitan la desnaturalizacion y/o la agregacion del anticuerpo durante el proceso de secado por pulverizacion. Los ejemplos de dichos estabilizadores incluyen sacaridos (por ejemplo, sacarosa o trehalosa) y/o tensioactivos (por ejemplo, polisorbato 20 o polisorbato 80) y/o aminoacidos (por ejemplo, histidina, arginina, glicina y/o alanina). Los estabilizadores generalmente se anaden en cantidades que protegen y/o estabilizan el anticuerpo monoclonal en la cantidad mas baja de estabilizador posible, para evitar el aumento de la viscosidad de la formulacion final.
Con respecto a los estabilizadores de sacaridos, tales como los disacaridos (por ejemplo, trehalosa o sacarosa), la relacion molar de sacarido:anticuerpo monoclonal (o disacarido:anticuerpo monoclonal) es opcionalmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 400:1, por ejemplo, de aproximadamente 100 a aproximadamente 250:1. Expresado de manera diferente, las concentraciones de ejemplo de sacaridos en la preparacion previamente secada por pulverizacion son, por ejemplo, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 1 M, por ejemplo, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 300 mM.
Con respecto al tensioactivo (si se incluye en la formulacion secada previamente por pulverizacion), polisorbato 20 o polisorbato 80 son ejemplos de tensioactivos que pueden incluirse. El tensioactivo generalmente se incluye en una cantidad que reduce o evita la desnaturalizacion y/o agregacion del anticuerpo monoclonal durante el proceso de secado por pulverizacion. La concentracion de tensioactivo (por ejemplo, polisorbato 20 o polisorbato 80) es opcionalmente de aproximadamente el 0,0001 % a aproximadamente el 1,0 %, por ejemplo, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 0,1 %.
La preparacion secada previamente por pulverizacion puede someterse a procedimientos de secado por pulverizacion tales como los que se describen en la siguiente seccion.
IV. Secado por pulverizacion de la preparacion
El secado por pulverizacion en el presente documento es distinto del secado por congelacion habitualmente utilizado para preparar formulaciones de anticuerpos monoclonales en la medida en que se realiza a temperaturas superiores a la temperatura ambiente. Las temperaturas de secado por pulverizacion se expresan habitualmente como temperaturas de "entrada de aire" y "salida de aire". En una realizacion, el secado por pulverizacion se realiza a una temperatura de entrada de aire de aproximadamente 100 °C a aproximadamente 220 °C (por ejemplo, de aproximadamente 120 °C a aproximadamente 160 °C) y una temperatura de salida de aire de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 100 °C (por ejemplo, de aproximadamente 60 °C a aproximadamente 80 °C).
El proceso de secado por pulverizacion generalmente comprende: atomizacion de la alimentacion de ffquido; secado de las gotitas; y separacion o recuperacion del producto seco.
Las realizaciones de los atomizadores en el presente documento incluyen: atomizadores giratorios, atomizadores de boquilla neumatica, atomizadores de boquillas ultrasonicas, boquillas sonicas, etc.
El contacto entre la alimentacion de ffquido y el aire de secado puede producirse de dos modos diferentes. En un sistema de corrientes paralelas, el aire de secado y las parffculas (gotitas) se mueven a traves de la camara de
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secado en la misma direccion. Cuando se secan el aire y las gotitas se mueven en una direccion opuesta, esto se denomina modo a contracorriente. Las partfculas producidas en el modo a contracorriente generalmente muestran una temperatura mas alta que el aire que se expulsa. El aire expulsado puede salir del sistema o puede recircularse. Escogiendo entre los diferentes disenos de secador por pulverizacion (tamano, atomizador, condiciones asepticas, etc.) y ajustando los diferentes parametros del proceso (flujo del aire de secado, temperatura del aire de secado, etc.), las propiedades finales del polvo como el tamano de partfcula, la forma y estructura o incluso la esterilidad pueden modificarse. Si la humedad resultante del polvo recuperado no es suficientemente baja, podna ser necesario un tratamiento posterior, por ejemplo, en forma de secadores y enfriadores de lecho fluido, secadores de contacto o incluso secadores de microondas.
Cuando se atomiza el lfquido de alimentacion, aumenta su relacion de superficie a masa, la transferencia de calor entre el aire y las gotitas se acelera y las gotitas pueden secarse con relativa rapidez. Pueden estar implicados dos procesos de conveccion: transferencia de calor (aire a gotita) y transferencia de humedad en masa (gotita a aire). En esta ultima, la humedad penetra a traves de la capa lfmite que rodea cada gotita. Las tasas de transferencia pueden estar influenciadas por la temperatura, la humedad, las propiedades de transporte del aire circundante, el diametro de la gotita y la velocidad relativa entre la gotita y el aire.
La ultima etapa de un proceso de secado por pulverizacion es normalmente la separacion del polvo del aire/gas y la retirada del producto secado. En algunas realizaciones, esta etapa es tan eficaz como sea posible para obtener altos rendimientos de polvo y para evitar la contaminacion del aire a traves de la emision de polvo a la atmosfera. Para este fin, hay disponibles diversos metodos tales como ciclones, filtros de bolsa, precipitadores electrostaticos, gas a alta presion, carga electrostatica y combinaciones de los mismos.
El proceso de secado por pulverizacion produce partfculas que comprenden el anticuerpo monoclonal.
En una realizacion, las caractensticas del polvo secado por pulverizacion comprenden uno cualquiera o mas de los siguientes:
(a) tamano de partfcula promedio: de aproximadamente 2 micrometros a aproximadamente 30 micrometros; por ejemplo, de aproximadamente 2 micrometros a aproximadamente 10 micrometros;
(b) morfologfa de partfculas: partfculas predominantemente esfericas, algunos hoyuelos o agujeros en las partfculas, forma de "pasas secas";
(c) contenido de agua: menos de aproximadamente el 10 %, por ejemplo, menos de aproximadamente el 5 %, por ejemplo, donde el contenido de agua se mide mediante un metodo de titulacion qrnmica (por ejemplo, metodo de Karl Fischer) o un metodo de perdida de peso (calentamiento a alta temperatura); y
(d) estabilidad: por ejemplo, evaluada mediante la suspension de las partfculas en un vehfculo y la evaluacion de la estabilidad ffsica y/o la estabilidad qrnmica y/o la actividad biologica de la preparacion de suspension. En una realizacion, el porcentaje de monomero de dicha preparacion es del 95 % al 100 %, por ejemplo, segun se evalua mediante cromatograffa de exclusion por tamano (CET).
V. La formulacion de suspension
Las partfculas de anticuerpo monoclonal secadas por pulverizacion preparadas como se describe en la seccion anterior se combinan con un vehfculo de suspension no acuoso para generar la formulacion de suspension. Esta formulacion es adecuada para la administracion a un sujeto. En general, la formulacion de suspension no se sometera a liofilizacion ni cristalizacion previa o posterior. En una realizacion, un dispositivo de administracion subcutanea (por ejemplo, una jeringa precargada) se carga con la formulacion de suspension y se usa para administrar la formulacion (vease a continuacion una divulgacion mas detallada con respecto a los dispositivos y metodos de tratamiento).
La invencion tambien proporciona un metodo de fabricacion de una formulacion de suspension que comprende suspender el anticuerpo monoclonal secado por pulverizacion en un vehfculo de suspension no acuoso.
En una realizacion, la concentracion de anticuerpo en la formulacion de suspension es de aproximadamente 200 mg/ml o mas.
En una realizacion, la concentracion de anticuerpo en la formulacion de suspension es de aproximadamente 200 mg/ml a aproximadamente 500 mg/ml.
La concentracion de anticuerpo en la formulacion de suspension puede ser de aproximadamente 250 mg/ml a aproximadamente 400 mg/ml.
La concentracion de anticuerpo en la formulacion de suspension puede ser de aproximadamente 250 mg/ml a aproximadamente 350 mg/ml.
El vehfculo de suspension no acuoso tiene preferentemente una viscosidad a 25 °C, que es inferior a
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aproximadamente 20 centipoise, por ejemplo, inferior a aproximadamente 10 centipoise y, opcionalmente, inferior a aproximadamente 5 centipoise.
La viscosidad de la formulacion de suspension puede ser de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 centipoise, por ejemplo, de aproximadamente 10 a aproximadamente 70 centipoise a 25 °C. En una realizacion, la viscosidad de la formulacion de suspension se mide usando un reometro de cono y placa (por ejemplo, un reometro AR-G2 TA Instrument).
En una realizacion, el tamano promedio de partfcula en la formulacion de suspension es de aproximadamente 2 micrometros a aproximadamente 30 micrometros, por ejemplo, de aproximadamente 5 micrometros a aproximadamente 10 micrometros.
En una realizacion, la formulacion de suspension tiene una fuerza de deslizamiento de la inyeccion inferior a aproximadamente 20 Newton, por ejemplo, inferior a aproximadamente 15 Newton. Dicha fuerza de deslizamiento de inyeccion puede determinarse como una funcion de la concentracion de anticuerpos monoclonales mediante la inyeccion de una suspension de 1 ml usando una jeringa de 1 ml de longitud a traves de una aguja fija TW de calibre 27 en 10 segundos.
El vetnculo de suspension no acuoso puede seleccionarse entre: dicaprilato/dicaprato de propilenglicol, benzoato de bencilo, lactato de etilo o mezclas de dos o tres de los mismos.
De acuerdo con la invencion, el vetnculo de suspension no acuoso comprende lactato de etilo.
El vetnculo de suspension no acuoso puede comprender una mezcla de al menos dos vetnculos de suspension no acuosos: Vetnculo A mas vetnculo B, en los que la viscosidad del vetnculo A es inferior a la del vetnculo B, pero la estabilidad del anticuerpo monoclonal en el Vetnculo B es superior a la del Vetnculo A. Una realizacion de dicta mezcla se ejemplifica mediante la mezcla de lactato de etilo y dicaprilato/dicaprato de propilenglicol (por ejemplo).
En un aspecto, la formulacion de suspension comprende un anticuerpo monoclonal IgG1 tiumano de longitud completa secado por pulverizacion a una concentracion de aproximadamente 200 mg/ml a aproximadamente 400 mg/ml suspendido en un vetnculo de suspension no acuoso con una viscosidad inferior a aproximadamente 20 centipoise, en la que la formulacion tiene un tamano de partfcula promedio de aproximadamente 2 micrometros a aproximadamente 10 micrometros y una fuerza de deslizamiento de la inyeccion inferior a aproximadamente 15 Newton.
La formulacion de suspension comprende opcionalmente ademas uno o mas excipientes o estabilizadores. Los ejemplos de dictios estabilizadores incluyen sacaridos (por ejemplo, sacarosa o tretialosa) y/o tensioactivos (por ejemplo, polisorbato 20 o polisorbato 80) y/o aminoacidos (por ejemplo, Nstidina, arginina, glicina y/o alanina). Los estabilizadores estan generalmente presentes en una cantidad que protege y/o estabiliza el anticuerpo monoclonal en la cantidad mas baja de estabilizador posible, para evitar el aumento de la viscosidad de la formulacion de suspension. En una realizacion, los estabilizadores estan presentes en la formulacion de suspension como resultado de taberse anadido a la preparacion previamente secada por pulverizacion y/o tiaberse anadido a la formulacion de suspension, segun se desee.
Con respecto a estabilizadores de sacaridos, tales como disacaridos (por ejemplo, tretialosa o sacarosa), la relacion molar de sacarido:anticuerpo monoclonal (o disacarido:anticuerpo monoclonal) en la formulacion de suspension es opcionalmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 400:1, por ejemplo, de aproximadamente 100 a aproximadamente 250:1. Dictio de forma diferente, las concentraciones de ejemplo de sacarido en la formulacion de suspension son de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 1 M, por ejemplo, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 300 mM.
Con respecto al tensioactivo (si se incluye en la preparacion secada previamente por pulverizacion), el polisorbato 20 o el polisorbato 80 son ejemplos de tensioactivos que pueden estar presentes en la formulacion de suspension. La concentracion de tensioactivo (por ejemplo, polisorbato 20 o polisorbato 80) es opcionalmente de aproximadamente el 0,0001 % a aproximadamente el 1,0 %, por ejemplo, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 0,1 %.
La formulacion de suspension generalmente es esteril y esto puede conseguirse de acuerdo con los procedimientos conocidos por el experto en la materia para generar formulaciones farmaceuticas esteriles adecuadas para la administracion a sujetos tiumanos, incluyendo la filtracion a traves de membranas de filtracion esteriles, antes o despues de la preparacion de la formulacion de suspension.
Ademas, la formulacion es deseablemente una que se tia demostrado que es estable durante el almacenamiento. Hay disponibles diversos ensayos de estabilidad para el experto en la materia para confirmar la estabilidad de la formulacion. La estabilidad puede someterse a ensayo mediante la evaluacion de la estabilidad ffsica, la estabilidad qrnmica y/o la actividad biologica del anticuerpo en la formulacion de suspension en el momento de la formulacion,
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asf como despues del almacenamiento a diferentes temperaturas y puntos temporales. En una realizacion, la estabilidad del anticuerpo monoclonal se evalua mediante distribucion de tamano (porcentaje de monomero, agregacion y/o fragmentacion) antes y despues del secado por pulverizacion (por ejemplo, antes y despues del secado por pulverizacion durante 3 meses de almacenamiento a la temperatura acelerada de 40 °C). En una realizacion, la distribucion del tamano se evalua mediante el uso de cromatograffa ffquida de exclusion por tamano- cromatograffa de alta resolucion (CET-HPLC). En una realizacion, el porcentaje de perdida de monomero en la formulacion de suspension (medido por CET-HPLC) durante 3 meses es inferior a aproximadamente el 10 %, por ejemplo, inferior a aproximadamente el 5 %.
En una realizacion, la divulgacion proporciona un metodo de fabricacion de una formulacion farmaceutica que comprende preparar la formulacion de suspension como se describe en el presente documento y evaluar una o mas de las siguientes propiedades de la formulacion:
(a) estabilidad ffsica, estabilidad qrnmica y/o actividad biologica del anticuerpo monoclonal en la suspension (por ejemplo, medicion del porcentaje de monomero usando cromatograffa de exclusion por tamano);
(b) viscosidad de la formulacion de suspension;
(c) inyectabilidad o fuerza de deslizamiento de inyeccion de la formulacion de suspension;
(d) analisis de energfa superficial (AES) o calor de sorcion, por ejemplo, mediante cromatograffa de gases inversa (CGI) para evaluar la interaccion parffcula-vefffculo de suspension;
(e) tamano de parffcula (por ejemplo, tamano de parffcula promedio y/o pico, por ejemplo, mediante un analizador de difraccion laser); y/o
(e) estabilidad ffsica de la suspension (sedimentacion, homogeneidad en el tiempo, tasa de sedimentacion de parffculas, etc.).
Se proporcionan detalles adicionales de ensayos de ejemplo para estas propiedades se proporcionan en el ejemplo a continuacion.
Pueden incluirse uno o mas vefffculos, excipientes o estabilizadores farmaceuticamente aceptables adicionales tales como los que se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edicion, Osol, A. Ed. (1980) en la formulacion a condicion de que no afecten adversamente a las caractensticas deseadas de la formulacion. Los vefffculos, excipientes o estabilizadores aceptables son atoxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas e incluyen; agentes tamponantes adicionales; cosolventes; antioxidantes incluyendo acido ascorbico y metionina; agentes quelantes tales como EDTA; complejos metalicos (por ejemplo, Zn-protema); poffmeros biodegradables tales como poliesteres; conservantes; y/o contraiones formadores de sal tales como sodio.
VI. Medicamentos y tratamientos usando la formulacion de suspension
En una realizacion, la invencion proporciona una formulacion que se describe en el presente documento para su uso en un metodo de tratamiento de una enfermedad o trastorno en un sujeto que comprende administrar la formulacion de suspension que se describe en el presente documento a un sujeto en una cantidad eficaz para el tratamiento de la enfermedad o trastorno.
Por tanto, la invencion proporciona: la formulacion de suspension como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de un paciente que necesita tratamiento con el anticuerpo monoclonal en la formulacion de suspension; y el uso de la formulacion de suspension en la preparacion de un medicamento para el tratamiento de un paciente que necesita tratamiento con el anticuerpo monoclonal en la formulacion de suspension. En una realizacion alternativa, la invencion proporciona: la formulacion como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno en un paciente; y el uso de la formulacion en la preparacion de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno en un paciente.
Ademas, la invencion proporciona una formulacion que se describe en el presente documento para su uso en un metodo para el tratamiento de un paciente que comprende administrar la formulacion que se describe en el presente documento a un paciente para el tratamiento de una enfermedad o trastorno en el sujeto. Preferentemente, la formulacion se administra por via subcutanea al sujeto o paciente. En una realizacion, la formulacion se administra mediante una jeringa precargada que contiene la formulacion en la misma.
Cuando el anticuerpo en la formulacion se une a HER2, la formulacion de suspension se usa preferentemente para el tratamiento del cancer. El cancer comprendera generalmente celulas que expresan HER2, de manera que el anticuerpo HER2 del presente documento puede unirse a las celulas cancerosas. Por tanto, la invencion en esta realizacion se refiere a un metodo para el tratamiento del cancer que expresa HER2 en un sujeto, que comprende administrar la formulacion farmaceutica de anticuerpo HER2 al sujeto en una cantidad eficaz para el tratamiento del cancer. Son canceres de ejemplo que se tratan en el presente documento con un anticuerpo contra HER2 (por ejemplo, trastuzumab o pertuzumab) el cancer de mama o el cancer gastrico positivos para HER2.
Cuando el anticuerpo en la formulacion se une a un marcador de superficie de celulas B tal como CD20, la formulacion puede usarse para el tratamiento de una malignidad de celulas B, tal como LNH o LLC o una
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enfermedad autoinmunitaria (por ejemplo, artritis reumatoide o vasculitis).
Cuando el anticuerpo en la formulacion se une a VEGF (por ejemplo, bevacizumab), la formulacion puede usarse para inhibir la angiogenesis, tratar el cancer (tal como el cancer colorrectal, cancer de pulmon no microdtico (CPNM), glioblastoma, cancer de mama y carcinoma de celulas renales) o para tratar la degeneracion macular relacionada con la edad (DMRE) o el edema macular.
Cuando la indicacion es cancer, el paciente puede tratarse con una combinacion de la formulacion de suspension y un agente quimioterapico. La administracion combinada incluye la coadministracion o administracion simultanea, usando formulaciones separadas o una formulacion farmaceutica unica y la administracion consecutiva en cualquier orden, en la que existe un penodo de tiempo cuando ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultaneamente sus actividades biologicas. Por tanto, el agente quimioterapico puede administrarse antes o despues de la administracion de la composicion. En esta realizacion, el tiempo entre al menos una administracion del agente quimioterapico y al menos una administracion de la formulacion es preferentemente de aproximadamente 1 mes o menos y mucho mas preferentemente de aproximadamente 2 semanas o menos. Como alternativa, el agente quimioterapico y la formulacion se administran simultaneamente al paciente, en una unica formulacion o formulaciones separadas.
El tratamiento con la formulacion de suspension dara como resultado una mejora en los signos o smtomas de la enfermedad o trastorno. Ademas, el tratamiento con la combinacion del agente quimioterapico y la formulacion del anticuerpo puede dar como resultado un beneficio terapeutico para el paciente sinergico o mayor que el aditivo.
La formulacion se administra a un paciente humano de acuerdo con metodos conocidos, tales como la administracion intravenosa, por ejemplo, en bolo o mediante infusion continua durante un penodo de tiempo, mediante administracion intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutanea, intraarticular, intrasinovial o intratecal.
Se prefiere la administracion intramuscular o subcutanea de la composicion de anticuerpo, siendo la administracion subcutanea la mas preferida.
Para la entrega subcutanea, la formulacion puede administrarse mediante una jeringa (por ejemplo, jeringa precargada); autoinyector; dispositivo de inyeccion (por ejemplo, dispositivo INJECT-EASE™ y GENJECT™); bolfgrafo inyector (tal como GENPEN™); u otro dispositivo adecuado para la administracion de una formulacion de suspension por via subcutanea. El dispositivo preferido en el presente documento es una jeringa precargada.
Para la prevencion o el tratamiento de la enfermedad, la dosificacion apropiada del anticuerpo monoclonal dependera del tipo de enfermedad que se trata, como se ha definido anteriormente, la gravedad y el curso de la enfermedad, si el anticuerpo monoclonal se administra con fines preventivos o terapeuticos, la terapia previa, el historial clmico del paciente y la respuesta al anticuerpo monoclonal y el criterio del medico tratante. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente de 1 pg/kg a 50 mg/kg (por ejemplo, 0,1-20 mg/kg) de anticuerpo es una dosificacion candidata inicial para la administracion al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o mas administraciones separadas o por infusion continua. La dosificacion del anticuerpo generalmente sera de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Si se administra un agente quimioterapico, por lo general se administra en las dosis conocidas para el mismo, u opcionalmente reducidas debido a la accion combinada de los farmacos o los efectos secundarios negativos atribuibles a la administracion del agente quimioterapico. Las pautas de preparacion y dosificacion para dichos agentes quimioterapicos pueden usarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante o segun determine empmcamente el experto en la materia. Las pautas de preparacion y dosificacion para dicha quimioterapia tambien se describen en Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992).
VII. Articulos de fabricacion
La invencion del presente documento tambien se refiere a un dispositivo con la formulacion de suspension dentro del mismo. Preferentemente, el dispositivo es un dispositivo de administracion subcutanea, tal como una jeringa precargada.
En un aspecto relacionado, la invencion proporciona un metodo de fabricacion de un artfculo de fabricacion que comprende cargar un recipiente con la formulacion de suspension.
Las realizaciones del recipiente en el artfculo de fabricacion incluyen: jeringas (tales como una jeringa precargada), autoinyectores, frascos, viales (por ejemplo, viales de doble camara) y tubos de ensayo, etc. El recipiente contiene la formulacion de suspension y la etiqueta sobre o asociada al contenedor puede indicar las instrucciones de uso. El artfculo de fabricacion puede incluir adicionalmente otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas e insertos de paquetes con instrucciones de uso como se indica en la seccion anterior.
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La invencion se entendera mas completamente por referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invencion.
Ejemplos
El desarrollo de formulaciones lfquidas de anticuerpos monoclonales de alta concentracion (> 200 mg/ml) para la administracion subcutanea (SC) es con frecuencia un desaffo con una viscosidad aumentada que dificulta la inyeccion. Esta investigacion tiene por objeto superar este obstaculo usando un enfoque de suspension en polvo no acuosa. Se secaron por pulverizacion tres anticuerpos monoclonales IgG1 humanos y se suspendieron en un vehnculo de suspension a diferentes concentraciones de anticuerpos monoclonales. Se emplearon dicaprilato/dicaprato de propilenglicol, benzoato de bencilo y lactato de etilo como vehfculos de suspension modelo. Las suspensiones se caracterizaron por su viscosidad, tamano de partfcula y capacidad de inyeccion. La estabilidad ffsica de la suspension se inspecciono visualmente. Las suspensiones en general superaron a las soluciones lfquidas en terminos de inyectabilidad a pesar de una mayor viscosidad a las mismas concentraciones de anticuerpos monoclonales. Las formulaciones en polvo y las propiedades del polvo paredan tener poco efecto sobre la viscosidad de la suspension o la inyectabilidad. Entre los tres vehfculos de suspension, las suspensiones de lactato de etilo tuvieron la viscosidad mas baja, inferior a 20 centipoise y la menor fuerza de deslizamiento de inyeccion por jeringa, inferior a 15 Newton, a una concentracion de anticuerpos monoclonales tan alta como de 333 mg/ml (concentracion total de polvo a 500 mg/ml). El analisis de cromatograffa de gases inversa (CIG) de la suspension respaldaba la conclusion de que el vehfculo de suspension era el factor mas importante que afectaba al rendimiento de la suspension. El lactato de etilo produjo un mayor calor de sorcion que otros vehfculos de suspension. Sin quedar ligados a teona alguna, esto indica que la fuerte interaccion partfcula-veldculo de suspension puede reducir la autoasociacion partfcula-partfcula, conduciendo a una viscosidad de la suspension y a una fuerza de deslizamiento bajas. Sin embargo, las suspensiones de lactato de etilo caredan de la estabilidad de suspension ffsica presentada por dicaprilato/dicaprato de propilenglicol y benzoato de bencilo. Las mezclas espedficas de lactato de etilo y dicaprilato/dicaprato de propilenglicol mejoraron el rendimiento de la suspension global en suspensiones de alta concentracion de anticuerpos monoclonales.
Entre otras cosas, estos ejemplos demostraron la viabilidad de una alta concentracion de anticuerpos monoclonales (> 300 mg/ml) en formulaciones de suspension para la administracion SC.
Materiales y metodos
Se fabricaron tres anticuerpos monoclonales recombinantes quimericos/humanizados de la subclase IgG1 humana bevacizumab, trastuzumab y rituximab por Genentech (Sur de San Francisco, CA). Estos anticuerpos fueron expresados por estirpes celulares de ovario de hamster chino (CHO). Todas las soluciones lfquidas de sustancia de farmaco de anticuerpo se concentraron a 100 mg/ml usando una unidad de filtracion de flujo tangencial (PELLICON3® 10 kD, Millipore, Billerica, MA) y se formularon con dihidrato de trehalosa. Todos los materiales a granel se tamponaron a un pH de ~6,0. Para la preparacion de la suspension de polvo de anticuerpos se usaron dicaprilato/dicaprato de propilenglicol (Lote n.° 091125, SASOL, Hamburgo, Alemania), benzoato de bencilo (Cat n.° B9550, Sigma-Aldrich, San Luis, MO) y lactato de etilo (Lote n.° BCBC7752, Sigma-Aldrich, San Luis, MO) como vedculos de suspension.
Secado por pulverizacion
Se usaron dos tipos de secadores por pulverizacion en el presente estudio, una unidad a escala piloto (MS-35, SPX Flow Technology Systems, Inc., Elkridge, MD) y una unidad a escala experimental (B-191, Buchi Corp., New Castle, DE). MS-35 es aproximadamente 2 veces mas grande que B-191, es decir, 2,5 frente a 1,6 kg/hora de la tasa maxima de evaporacion de agua y 35 frente a 20 kg/hora de tasa maxima de consumo de aire comprimido. La unidad a escala piloto se construyo principalmente de acero inoxidable con aislamiento termico (camara de secado, ciclon, etc.) mientras que la unidad a escala experimental estaba hecha de vidrio. La unidad a escala piloto estaba equipada con un ciclon de alta eficiencia. Para calcular el rendimiento de la recoleccion de polvo, solo se tuvo en cuenta el polvo recogido en el receptor para la unidad a escala piloto y se incluyeron el polvo recogido en el ciclon y la tapa del receptor para la unidad a escala experimental. Las condiciones de secado por dispersion y los polvos secos caractensticos producidos usando ambos secadores por pulverizacion se enumeran en la Tabla 2.
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Tabla 2: Condiciones de secado por pulverizacion en dos tipos de secadores por pulverizacion y resultados de caracterizacion de tres anticuerpos formulados con trehalosa a una relacion de peso anticuerpo:trehalosa de 1:2
Tipo de anticuerpo monoclonal
Bevacizumab Trastuzumab Rituximab
Condicion de secado
Secador por pulverizacion Piloto Experi mental Piloto Experi mental Piloto Experi mental
Temperatura de entrada ( C)
182 134 182 138 182 136
Temperatura de salida ( C)
87 88 87 89 87 88
Velocidad de alimentacion de liquido (ml/min)
12 3 12 3 13 3
Volumen de liquido secado (ml)
250 50 250 50 250 50
Rendimiento (%)
99 60 100 65 98 59
Tamano de particula (D50) (pm)
9.6 2,5 8,8 2,8 10,6 5,1
Contenido de agua (%)
4.0 7,6 4,7 6,9 5,0 8,8
Secado por congelacion
Tambien se liofilizaron soluciones de anticuerpos monoclonales para comparar la estabilidad en estado seco con muestras secadas por pulverizacion. Las formulaciones lfquidas se dividieron en alfcuotas en 1 ml en viales de vidrio de 2 cc con tapones de butilo, despues se colocaron en estantes previamente enfriados a -50 °C en un liofilizador (Modelo n.° LYOMAX2®, BOC Edward, Tewksbury, MA). Las muestras se secaron mediante la disminucion de la presion a 100 mTorr (13,33 kPa) y el aumento de la temperatura de almacenamiento a -25 °C durante el secado primario, seguido del secado secundario a 35 °C. El tiempo total del ciclo de liofilizacion fue de aproximadamente 60 horas.
Analisis del tamano de particula
La distribucion del tamano de partfcula se midio usando un analizador de difraccion laser (LA-950, Horiba Instruments, Kioto, Japon). El LA-950 consiste en dos fuentes de luz (LAD de color azul, laser de color rojo), un sistema de manipulacion de muestras para controlar la interaccion entre las partfculas y la luz incidente, y una serie de fotodiodos de alta calidad para detectar la luz dispersa en un amplio intervalo de angulos. La luz dispersa recogida en los detectores se uso para calcular la distribucion del tamano de partfcula de la muestra analizada usando la teona de Mie. Para muestras secadas por pulverizacion, se dispersaron varios miligramos de los polvos secos en 50 ml de alcohol isopropflico en la celda MiniFlow fijada a LA-950 y se sometieron a ultrasonidos usando el ultrasonido tambien fijado a LA-950 durante aproximadamente un minuto antes del analisis. Las partfculas suspendidas en vehfculos se diluyeron con cada vehfculo en FractionCell y se mezclaron con un agitador fijado a LA-950 antes del analisis.
Analisis de densidad
La densidad del polvo se determino mezclando 500 mg de polvo en 4 ml de aceite de dicaprilato/dicaprato de propilenglicol en un cilindro volumetrico y midiendo el volumen de aceite desplazado como el volumen de polvo. La densidad del polvo puede calcularse usando el peso y el volumen del polvo.
Microscopia electronica de barrido
Se examino la morfologfa superficial de muestras secadas por pulverizacion usando un microscopio electronico de barrido ambiental (XL30, FEL, Hillsboro, OR). Cada muestra se monto en adaptadores de aluminio y se recubrio con una capa de 10 nm de AuPd y se escaneo a una tension de 2 kV y las fotograffas se tomaron con aumentos de 1000 y 2000.
Analisis de contenido de agua
Se determino la humedad residual en muestras secadas por pulverizacion usando el analizador de titulacion Karl Fischer volumetrico (DL31, Mettler-Toledo). Se inyectaron aproximadamente 100 mg de cada muestra en la celda de titulacion que contema metanol anhidro. Se uso reactivo volumetrico compuesto de Hydranal 2 (n.° de cat. 34696, Hiedel-deHaen, Heidelberg, Alemania) como titulador.
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Cromatografia de exclusion por tamano
La cuantificacion de variantes de tamano se determino mediante cromatograffa de exclusion por tamano. Este analisis utilizo una columna G3000SWxl, DI de 7,8 mm x 30 cm, 5 pm (TOSOH BioScience) ejecutada en un sistema de HPLC (1100, Agilent). Las fases moviles son fosfato de potasio 0,2 M y cloruro de potasio 0,25 M a pH 6,2 para bevacizumab, fosfato de potasio 0,1 M a pH 6,8 para trastuzumab y fosfato de potasio 0,2 M y cloruro de potasio 0,25 M a pH 7,0 para rituximab. La cromatograffa se realizo isocraticamente a un caudal de 0,5 ml/min durante 30 minutos. La temperatura de la columna se mantuvo a temperatura ambiente para bevacizumab y rituximab y 30 °C para trastuzumab y se controlo la absorbancia del eluyente a 280 nm. Cada anticuerpo monoclonal se diluyo con su respectivo tampon de formulacion a 25 mg/ml para bevacizumab y 10 mg/ml para trastuzumab y rituximab. Su volumen de inyeccion es de 10 pl para bevacizumab y de 20 pl para trastuzumab y rituximab.
Estabilidad ffsica de anticuerpos monoclonales en formulaciones de polvo secado por pulverizacion y secado por congelacion
Se dividieron en affcuotas muestras de polvo secado por pulverizacion y secado por congelacion en un vial de vidrio de 2 cc, aproximadamente 25 anticuerpos monoclonales. Cada vial se sello con un tapon de goma y tapa FLIP- OFF® y se almaceno a 40 °C durante un maximo de 3 meses. En los puntos temporales de estabilidad de tiempo cero (inmediatamente despues del secado), 1, 2, 3 meses, cada muestra seca se reconstituyo con 1 ml de agua purificada y la estabilidad ffsica del anticuerpo se determino por distribucion de tamano de protema (% de monomero, agregacion y fragmentacion) usando CET-HPLC.
Preparacion de formulaciones de suspension
El polvo se peso en un vial de 2 ml. Basandose en la densidad de polvo determinada, se anadio la cantidad apropiada de vetffculo de suspension para preparar la concentracion de polvo en la unidad de mg de polvo en 1 ml de volumen de suspension. Despues, las muestras se homogeneizaron durante 2 minutos a 7500 rpm usando una sonda de punta de 0,5 cm en un homogeneizador Tempest Virtishear (Virits Corp, Gardiner, NY).
Medicion de la viscosidad
La viscosidad de las muestras de solucion y suspension se midio usando un reometro de cono y placa (AR-G2 TA Instrument, New Castle, DE). Cada muestra se cargo en la placa de medicion inferior y se dejo que alcanzara el equilibrio termico a 25 °C. Se uso una trampa de disolvente equipada con AR-G2 para evitar la evaporacion de la solucion durante la medicion. La viscosidad de la muestra se midio cada 10 segundos durante 2 minutos usando un cono con un diametro de 20 mm y un angulo de 1 grado a una velocidad de cizalla de 1000 por segundo.
Medicion de la fuerza de deslizamiento de la jeringa
Se introdujo un ml de suspension en una jeringa de aguja fija TW de 1^” de 1 ml de longitud 27G (BD, Franklin Lakes, NJ) sellada con un tapon de embolo (W4023/FLT, West Pharmaceutical, Lionville, PA). El cilindro interno de la jeringa se recubrio con 0,5 mg de aceite de silicona (Dow 360 Medical Fluid, 1000 cSt). Se uso un sistema de ensayo de materiales (Modelo 5542, Instron, Grove City, PA) con una celda de carga para aplicar una tasa de compresion constante de 190 mm/min. El perfil de la fuerza de deslizamiento se analizo y establecio en funcion de la distancia del vastago del embolo que se desplaza dentro del cilindro de la jeringa.
Cromatograffa de gases inversa (CGI)
Se realizo un experimento de CGI usando un Sistema de Analisis de Energfa Superficial (AES) (MSM-iGC 2000, Surface Measurement Services Ltd, Allentown, PA). Se compactaron aproximadamente 200 mg de muestra de polvo en columnas de vidrio silanizadas individuales y ambos extremos de las columnas se sellaron usando lana de vidrio silanizada para evitar el movimiento de la muestra. Las areas de superficie espedficas de las muestras de polvo se determinaron midiendo las isotermas de adsorcion de octano a 30 °C y una HR del 0 % a partir del AES por CGI. Las areas de superficie espedficas BET de las muestras se calcularon posteriormente a partir de sus correspondientes isotermas de octano, dentro del intervalo de presion parcial (P/P0 del 10 % a 35 %). El decano, el nonano, el octano y el heptano se usaron como sondas de alcanos para la determinacion de la energfa superficial dispersiva. Tambien se midio la energfa libre de Gibbs espedfica basada en acido usando acetona, acetonitrilo, etanol y acetato de etilo. Para la medicion del calor de sorcion, los vedculos de suspension se usaron como sondas de gas. Todas las muestras se preacondicionaron in situ con un gas vetffculo de helio a 30 °C durante 2 horas y todas las mediciones se realizaron a 30 °C con un caudal de gas vetffculo de 10 cm/seg.
Resultados y discusion
Polvos secados por pulverizacion de anticuerpo/trehalosa
Se formularon tres tipos de anticuerpos monoclonales en soluciones ffquidas que conteman trehalosa, que sirve
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como estabilizador de hidrato de carbono para el anticuerpo monoclonal, en la relacion de peso de trehalosa:anticuerpo de 1:2 antes del secado por pulverization. Esta relacion de peso baja es equivalente a una relacion molar de aproximadamente 220:1 utilizada con el fin de minimizar su contribution de volumen, que estaba por debajo de la relacion molar minima de 300:1 utilizada habitualmente para que el azucar estabilice las protemas como un lioprotector (Shire et al., J Pharm Sci 93: 1390-1402 (2004)). Observese que una suspension de 400 mg de polvo/ml representa una concentration de 270 mg de anticuerpo/ml incluso en la relacion de peso 1:2 de trehalosa:anticuerpo, que se encontraba en el limite inferior de la concentracion de anticuerpo diana para el presente estudio.
Se secaron por pulverizacion tres anticuerpos monoclonales formulados a 100 mg/ml con 50 mg/ml de trehalosa, usando un secador por pulverizacion a escala experimental (B-191) y un secador por pulverizacion a escala piloto (MS-35). Las condiciones de secado por pulverizacion y caracterizacion del polvo se resumen en la Tabla 2. Se emplearon temperaturas de salida comparables de 87-89 °C para todas las muestras porque la temperatura de salida se considero el parametro clave que determina la capacidad de secado por pulverizacion (Maa et al., Pharm Dev Technol 2: 213-223 (1997); Lee G. Spray Drying of Proteins, en "Rational Protein Formulation: Theory and Practice" (Editores, Carpenter J, Manning M), Pharmaceutical Biotechnology Series (Editor Borchardt R). Plenum Press, paginas 135-158 (2002); Maury et al., Eur. J. Pharm. Biopharm., 59: 566-573 (2005); Maa et al., Biotech. Bioeng., 60: 301-309 (1998); y Maa. Et al., J. Pharm. Sci. 87: 152-159 (1998)). El secador por pulverizacion a escala piloto demostro un mejor funcionamiento en el rendimiento de recoleccion de polvo (> 96 %) y un contenido de agua del 4-5 %, mientras que las muestras secadas mediante el secador por pulverizacion a escala experimental teman un rendimiento del 60 % y un contenido de agua del 7-9 %. El secador a escala piloto tambien fue capaz de producir parficulas mas grandes de 8-11 ^m (D50) mientras que el secador a escala experimental produjo parficulas de 25 ^m (D5o). Las ventajas del secador a escala piloto pueden atribuirse al uso eficiente de la energia y a una mayor eficacia de recoleccion de polvo. La forma y morfologia de las parficulas para todos los anticuerpos fue generalmente esferica con hoyuelos, que eran dependientes del anticuerpo. El tipo de secador por pulverizacion no afecto a la morfologia de las parficulas. En general, el funcionamiento del secador y el tipo de anticuerpo dieron como resultado un cierto grado de variaciones en las propiedades de las parficulas. Aunque estas variaciones no son dramaticas, permitieron a los inventores evaluar su efecto sobre el rendimiento de la suspension.
Estabilidad fisica de los anticuerpos en formulaciones de polvo secado por pulverizacion y liofilizado
Una preocupacion general sobre el secado por pulverizacion de productos biologicos era el estres por las altas temperaturas, en particular para el secador piloto que tenia una temperatura de entrada mas alta de > 180 °C. La estabilidad fisica del anticuerpo de las muestras secas se determino tras la reconstitution con agua purificada por distribution de tamano de protema (% de monomero, agregacion y fragmentation) usando CET-HPLC antes y despues del secado por pulverizacion durante 3 meses de almacenamiento a la temperatura acelerada de 40 °C (Figura 1). A pesar de la alta temperatura de secado utilizada en el secador por pulverizacion a escala piloto, la repercusion del proceso de secado sobre el monomero (%) fue mmimo. La estabilidad fisica del anticuerpo para bevacizumab y trastuzumab secados por pulverizacion se comparo con sus homologos liofilizados mediante el control del cambio en monomero (%) a 40 °C durante 3 meses. El monomero (%) para todas las muestras disminuyo en la condition acelerada debido principalmente a la agregacion, lo que no es sorprendente dada la cantidad suboptima de trehalosa para proteger el anticuerpo en la formulation. Sin embargo, las muestras secadas por pulverizacion teman una mayor estabilidad fisica del anticuerpo que las muestras liofilizadas. El monomero (%) de trastuzumab y bevacizumab secados por pulverizacion disminuyo en el ~2 % y el ~4 % respectivamente, mientras que ambos anticuerpos liofilizados experimentaron una mayor perdida de monomero (%) del ~6,5 % durante 3 meses, a pesar de su menor contenido de agua del ~0,8 %. Por tanto, el secado por pulverizacion es un enfoque viable, desde la perspectiva del proceso y la estabilidad, en la fabrication de polvos de anticuerpos para el desarrollo de la formulacion de suspension.
Seleccion de vehiculos de suspension
El criterio principal para la seleccion del velmculo de suspension fue la baja viscosidad, preferentemente < 10 Cp, ya que la viscosidad del velmculo de suspension contribuiria a la viscosidad de la suspension de forma lineal basandose en la ecuacion de Einstein para la viscosidad de soluciones (Einstein, A., Annalen der Physik 34: 591-92 (1911)).
’I - fio (1 + 2,5(p) (Ecuacion 2)
Donde n es la viscosidad de la suspension, n0 la viscosidad del velmculo de suspension puro y 9 la fraction de volumen del soluto.
Los tres vehiculos de suspension seleccionados para el presente estudio, dicaprilato/dicaprato de propilenglicol, benzoato de bencilo y lactato de etilo, cumplieron este criterio (Tabla 3). MIGLYOL 840® es diesteres de propilenglicol de acidos caprilico y caprico de la familia de aceites neutros MIGLYOL®. MIGLYOL 810® y MIGLYOL 812® han sido aprobados para inyecciones intravenosas e intramusculares, pero son viscosos, > 30 cp a temperatura ambiente. El dicaprilato/dicaprato de propilenglicol, el menos viscoso de la familia (~9 cp), se ha usado
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para aplicaciones transdermicas (Mahjour et a., Intl J Pharm 95: 161-169 (1999); Seniro, W., Intl J Toxicol 18: 35-52 (1999)). El benzoato de bencilo es similar al dicaprilato/dicaprato de propilenglicol en su viscosidad, ~9 cp y con frecuencia se ha utilizado como conservante en inyectables Kquidos a una concentration del <10 %. El lactato de etilo se ha utilizado habitualmente en preparaciones farmaceuticas, aditivos alimentarios y fragancias debido a su toxicidad relativamente baja. Aunque el lactato de etilo todavia no se ha aprobado por via parenteral, tiene una baja toxicidad en ratones para inyeccion intramuscular e intravenosa (Spiegel y Noseworthy, J Pharm Sci 52: 917-927 (1963); Mottu et al., PDA J. Pharm. Sci. Technol. 54: 456-469 (2000)). El lactato de etilo tiene una viscosidad similar al agua, ~2 cp.
Tabla 3: Informacion sobre la estructura, la viscosidad y la aplicacion farmaceutica de tres vehfculos de suspension modelos sometidos a ensayo en el presente estudio
Miglyol 840 Lactato de etilo Benzoato de bencilo
Estructura
O -oV OH
Viscosidad (cp) a 20 °C
9 2 9
Aplicaciones farmaceuticas
No aprobado actualmente para su uso parenteral, pero se han realizado algunos estudios de toxicidad en animales para determinar la entrega cutanea Utilizado como potenciador del sabor para medicamentos de dosis orales. No aprobado para el uso parenteral, pero esta disponible la toxicidad aguda en ratones por SC e IV Utilizado como conservante en forma de dosificacion liquida para la administration parenteral en cantidades inferiores al 10 %
Efecto del tipo de anticuerpo y de las propiedades del polvo sobre la viscosidad de la suspension
Todos los anticuerpos secados mediante secadores por pulverization tanto a escala experimental como a escala piloto (Tabla 2) se suspendieron en dicaprilato/dicaprato de propilenglicol. La viscosidad de la suspension se midio en funcion de la concentracion de anticuerpo y se comparo con las soluciones Hquidas de anticuerpo (Figura 2). La viscosidad de la suspension para todos los anticuerpos fue similar en el intervalo de concentraciones de anticuerpos sometido a ensayo, lo que sugiere que las variaciones en los tipos de anticuerpos y las propiedades del polvo (tamano de particula, morfologia y contenido de humedad) tuvieron poco efecto sobre la viscosidad de la suspension. La viscosidad de la suspension aumento al aumentar la concentracion de anticuerpos de manera exponencial, que puede expresarse como:
__ OO/I 0,0088(conc. de polvo)
^iMiglyol 840 “
(Ecuacion 3)
Ciertamente, es muy diferente de la ecuacion de Einstein (Ecuacion 2) que es principalmente para suspensiones diluidas. La Ecuacion 4, una version modificada de la Ecuacion 2, tomo en consideration las interacciones de suspensiones mas concentradas (Kunitz, M., J. General Physiology paginas 715-725 (julio de 1926)), sin embargo, subestimo significativamente los datos empmcos (vease la lmea de trazos en la Figura 2).
r|/r|o (1 + (Ecuacion 4)
Fue interesante encontrar que la viscosidad de la suspension era en realidad mas alta que la viscosidad de la solution liquida del anticuerpo correspondiente a la misma concentracion de anticuerpo. No se observo ninguna diferencia en la viscosidad de la suspension entre los anticuerpos, aunque el tipo de anticuerpo si afecto significativamente a la viscosidad del liquido.
Energfas de superficie de los polvos secados por pulverizacion por CGI
Kanai y colaboradores (Kanai et al., J. Pharm. Sci97: 4219-4227 (2005)) descubrieron una autoasociacion reversible como resultado de las interacciones Fab-Fab en su estudio de viscosidad sometido a ensayo con dos anticuerpos fabricados a partir de la misma construccion con diferentes secuencias de aminoacidos en la region determinante de la complementariedad (CDR) en soluciones acuosas. Dichas diferencias de viscosidad debido a los tipos de anticuerpos en suspensiones de polvo en vehiculos no acuosos no se observaron (Figura 2). Esta observation podria interpretarse desde la perspectiva de la distribution de energia de la superficie de las partfculas en la suspension de polvo. La energia de superficie de las partfculas, la combination de componentes de energia polares y no polares (dispersivos), puede dictar el nivel de interaction con vehiculos de suspension y partfculas. La CGI es una herramienta comun para la medicion de la energia de superficie. La energia de superficie dispersiva de las
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partfculas usando decano, nonano, octano y heptano como sondas y tambien la energfa libre de Gibbs de acido- base (polar) espedfica se midio usando acetona, acetato de etilo, etanol y acetonitrilo como sondas. La energfa superficial es una distribucion en respuesta a la distribucion del tamano de partfculas de la muestra de polvo, pero en la Tabla 4 solo se notificaron energfas de superficie al 50 %. La energfa superficial dispersiva, Y50, estaba en un intervalo estrecho de 36 a 38 mJ/m2 para los tres anticuerpos. Las diferencias en la energfa libre de Gibbs de acido- base espedfica, AG50, de estos anticuerpos en respuesta a las cuatro sondas acido-base tambien estaban en un intervalo estrecho de 8 a 13 mJ/m2 La distribucion de energfa de superficie comparable entre los tres polvos de anticuerpos podna explicar interacciones similares partfcula-vedculo de suspension y partfcula-partfcula, conduciendo a su viscosidad de suspension comparable en dicaprilato/dicaprato de propilenglicol (Figura 2).
Tabla 4: Energia de superficie dispersiva (Y50), energia libre de Gibbs de acido-base espedfica (AG50) y calor de sorcion de polvos de anticuerpos monoclonales secados por pulverizacion (todas medidas usando CGI)
Polvo
Vedculos de suspension Y50 (mJ/m2) AG50 (mJ//m2) Calor de sorcion AHsorcion (KJ/mol)
Bevacizumab
Decano, nonano, octano y heptano 37,5
Trastuzumab
Decano, nonano, octano y heptano 36,8
Rituximab
Decano, nonano, octano y heptano 38,3
Bevacizumab
Acetona 8,4
Acetato de etilo
6,2
Etanol
14,8
Acetonitrilo
12,9
Trastuzumab
Acetona 8,2
Acetato de etilo
6,6
Etanol
14,5
Acetonitrilo
12,7
Rituximab
Acetona 8,4
Acetato de etilo
7,3
Etanol
14,9
Acetonitrilo
12,8
Bevacizumab
Dicaprilato/dicaprato de propilenglicol 39,9 ± 0,5
Benzoato de bencilo
36,5 ± 0,7
Lactato de etilo
51,5 ± 0,3
Rituximab
Dicaprilato/dicaprato de propilenglicol 43,4 ± 0,5
Benzoato de bencilo
42,8 ± 0,6
Lactato de etilo
58,5 ± 0,4
Inyectabilidad de suspensiones en tres vehfeulos
La capacidad de inyeccion puede controlarse mediante la medicion de la fuerza de deslizamiento, que es un indicador de mantenimiento mas pertinente que la medicion de la viscosidad. La fuerza de deslizamiento de la suspension de polvo de rituximab en tres vedculos se determino en funcion de la concentracion de anticuerpos inyectando una suspension de 1 ml usando una jeringa de 1 ml de longitud a traves de una aguja fija TW de calibre 27 en 10 segundos (Figura 3). La fuerza de deslizamiento para todas las suspensiones aumento con la concentracion de anticuerpos, sin embargo, estaba por debajo de 20 N incluso a una concentracion de anticuerpos de 200 mg/ml a pesar de la alta viscosidad (Figura 2). La fuerza de deslizamiento prevista para las soluciones lfquidas de anticuerpo extrafdas de la Figura 4 en la Referencia 3 fue mayor que la fuerza de deslizamiento de la suspension. La fuerza de deslizamiento en la suspension de lactato de etilo fue la mas baja entre los tres vedculos de suspension sometidos a ensayo. La fuerza de deslizamiento de la suspension de lactato de etilo a 333 mg de anticuerpo/ml fue equivalente a la de los otros dos vedculos de suspension a aproximadamente la mitad de la concentracion de anticuerpo (167 mg/ml), que todavfa estaba por debajo del umbral diana de 15 Newton, incluso a una alta concentracion de anticuerpos de 333 mg/ml. Las razones de la discrepancia en la relacion viscosidad-fuerza de deslizamiento entre la solucion lfquida y la suspension no estan claras.
Efecto del vedculo de suspension sobre la viscosidad de la suspension
La viscosidad de la suspension se sometio a ensayo en tres vedculos que contedan el polvo de rituximab secado por pulverizacion (Figura 4). La viscosidad en lactato de etilo fue la mas baja entre los tres vedculos; la viscosidad de la suspension de lactato de etilo a 333 mg de anticuerpo/ml fue equivalente a la de la suspension en
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dicaprilato/dicaprato de propilenglicol y benzoato de bencilo a aproximadamente la mitad de la concentracion de anticuerpo (167 mg/ml).
Calor de sorcion por CIG y tamano de partlcula
El calor de sorcion (AHsorci6n) es una medida directa de la fuerza de las interacciones entre un solido y moleculas de gas adsorbidas sobre la superficie (Thielmann F., "Inverse gas chromatography: Characterization of alumina and related surfaces", en "Enciclopedia of Surface and Colloid Science" Volumen 4 (edicion de P. Somasundaran) CRC Press, Boca Raton, FL., paginas 3009-3031 (2006); Thielmann y Butler, "Heat of sorption on microcrystalline cellulose by pulse inverse gas chromatography at infinite dilution", Nota de Solicitud de Servicios de Medicion de Superficies 203 (http: //
www.thesorptionsolution.eom/Information_Application_Notes_IGC.php#Aps) (2007)).
El metodo por CGI se empleo para medir el calor de sorcion entre las parficulas secadas por pulverizacion y los vehiculos de suspension (Tabla 4). Tanto para bevacizumab como para rituximab, la suspension de lactato de etilo tuvo un mayor calor de sorcion que los otros dos vehiculos de suspension. El tamano de parficula de las parficulas en suspension tambien se comparo entre las tres suspensiones (Figura 5). El tamano de parficula maximo (el porcentaje mas alto) fue de 28, 25 y 7 mm para dicaprilato/dicaprato de propilenglicol, benzoato de bencilo y lactato de etilo, respectivamente. Tanto el calor de sorcion como el tamano de parficula muestran que el mayor calor de sorcion en suspensiones de lactato de etilo indica una mayor interaction parficula-vehteulo de suspension que la interaction parficula-parficula y que el grado de autoasociacion de parficulas en lactato de etilo fue menor que en dicaprilato/dicaprato de propilenglicol o benzoato de bencilo.
Estabilidad flsica de la suspension
A pesar de la viscosidad y la fuerza de deslizamiento bajas en la suspension de lactato de etilo, mostro una peculiar estabilidad fisica de la suspension en funcion del tiempo. El polvo en la suspension de lactato de etilo sedimento en el fondo y floto a la superficie de la suspension despues de un almacenamiento ambiental de 1 dia (Figura 6A). La homogeneidad de la suspension de lactato de etilo podria restablecerse mediante agitation con formation de vortice (Figura 6B). Por el contrario, la estabilidad fisica de la suspension en dicaprilato/dicaprato de propilenglicol fue mucho mas estable y permanecio bien suspendida durante dos semanas (Figura 6C).
De acuerdo con la tasa de sedimentation de parficulas determinada por la Ley de Stoke (Ecuacion 4 a continuation), las parficulas en lactato de etilo se sedimentan aproximadamente 4,5 veces mas rapido que en dicaprilato/dicaprato de propilenglicol, segun la densidad y viscosidad del lactato de etilo y el dicaprilato/dicaprato de propilenglicol, 1,03 g/cm3 y 0,92 g/cm3 y 2 cP y 9 cP, respectivamente. Por tanto, la ley de Stoke por si sola no podia explicar completamente la observation de la sedimentacion extremadamente rapida de las parficulas en lactato de etilo en comparacion con dicaprilato/dicaprato de propilenglicol, sugiriendo que otros mecanismos tales como la carga electrica superficial (es decir, el potencial zeta) pueden desempenar un papel. Sin embargo, el fenomeno de algunas de las parficulas que flotan en la parte superior de la superficie del lactato de etilo es dificil de explicar debido a que la densidad de las parficulas secadas por pulverizacion es mayor que la del lactato de etilo.
s — d (ps - pi)g / (18r|) (Ecuacion 5)
donde s es la tasa de sedimentacion, d el diametro de la parficula, ps la densidad de la parficula, P1 la densidad del vehiculo de suspension, g la aceleracion debida a la gravedad y n la viscosidad del vehiculo de suspension.
Mezcla de vehiculo de suspension para mejorar el rendimiento de la suspension
Las mezclas de lactato de etilo y dicaprilato/dicaprato de propilenglicol se usaron como vehiculos de suspension para someter a ensayo la estabilidad fisica de la suspension de rituximab. El tamano de parficula se determino para estas suspensiones de mezcla (Figura 7A). El tamano de parficula disminuyo con una contribution decreciente de dicaprilato/dicaprato de propilenglicol en la mezcla donde el tamano de parficula maximo fue de 28, 13, 11,8 y 7 pm para la mezcla de dicaprilato/dicaprato de propilenglicol:lactato de etilo a 100:0, 75:25 , 50:50, 25:75 y 0:100, respectivamente. Desde la perspectiva de la estabilidad fisica de la suspension, se mejoro la mala estabilidad de la suspension del lactato de etilo mezclando con una pequena cantidad de dicaprilato/dicaprato de propilenglicol como se demuestra en la Figura 7B donde se mantuvo una suspension homogenea para el polvo de rituximab en mezcla 25:75 de dicaprilato/dicaprato de propilenglicol:lactato de etilo despues de un almacenamiento ambiental de 2 semanas. Se demostro que el rendimiento general de la suspension puede mejorarse usando una mezcla de vehiculo de suspension.
Conclusion
Estos ejemplos demostraron que el enfoque de suspension en polvo no acuosa fue factible para la administration SC de alta concentracion de anticuerpos monoclonales. La preparation de polvo seco mediante secado por pulverizacion fue escalable usando el proceso de secado por pulverizacion de alta eficiencia. El parametro mas
5
10
15
20
25
30
35
40
importante para el rendimiento general de la suspension se determino como el tipo de vetnculo de suspension. La suspension de polvo en lactato de etilo mostro una excelente inyectabilidad en suspension con una fuerza de deslizamiento baja de < 15 N a traves de una aguja fija TW de calibre 27 para una concentracion de anticuerpo tan alta como de 333 mg/ml (concentracion total de polvo de 500 mg/ml). Sin quedar ligado a teona alguna, la viscosidad y la inyectabilidad bajas podnan atribuirse a la fuerte interaccion partfcula-vetnculo de suspension que evita la aglomeracion partfcula-partfcula en un tamano de partfcula mayor en la suspension. Sin embargo, este mecanismo no respaldo la estabilidad de la suspension ffsica. Las partfculas de anticuerpo seco teman una mayor tendencia a sedimentar en la suspension de lactato de etilo que en el dicaprilato/dicaprato de propilenglicol. El enfoque del uso de la mezcla del vetnculo de suspension demostro ser eficaz en la mejora del rendimiento general de la suspension.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> GENENTECH, INC. ET AL.
<120> FORMULACIONES DE ANTICUERPOS MONOCLONALES DE ALTA CONCENTRACION
<130> P4910R1-WO
<140>
<141>
<150> 61/649.146 <151 >
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 451 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripcion de Secuencia artificial: Polipeptido sintetico" <400> 1

Claims (19)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Una formulacion de suspension que comprende un anticuerpo monoclonal secado por pulverizacion a una concentracion de aproximadamente 200 mg/ml o mas suspendido en un vetnculo de suspension no acuoso, en la que la viscosidad del vetnculo de suspension es inferior a aproximadamente 20 centipoise a aproximadamente 25 °C y en la que el vetnculo de suspension no acuoso comprende lactato de etilo.
  2. 2. La formulacion de la reivindicacion 1 en la que la viscosidad del vetnculo de suspension es (i) inferior a aproximadamente 10 centipoise o (ii) inferior a aproximadamente 5 centipoise.
  3. 3. La formulacion de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la que la fuerza de deslizamiento de inyeccion de la formulacion es de (i) aproximadamente 20 Newton o menos o de (ii) aproximadamente 15 Newton o menos.
  4. 4. La formulacion de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la que el tamano promedio de partfcula en la formulacion es de (i) aproximadamente 2 micrometros a aproximadamente 30 micrometros o de (ii) aproximadamente 2 micrometros a aproximadamente 10 micrometros.
  5. 5. La formulacion de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la que la concentracion de anticuerpo en la formulacion es de (i) aproximadamente 200 mg/ml a aproximadamente 500 mg/ml o de aproximadamente 200 mg/ml a aproximadamente 350 mg/ml.
  6. 6. La formulacion de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende adicionalmente (a) un sacarido y/o (b) un tensioactivo.
  7. 7. La formulacion de la reivindicacion 6(a) en la que (i) el sacarido es trehalosa o sacarosa y/o (ii) la relacion molar de sacarido:anticuerpo monoclonal es de aproximadamente 50 a aproximadamente 400:1 o de aproximadamente 100 a aproximadamente 250:1.
  8. 8. La formulacion de la reivindicacion 6(b) en la que el tensioactivo es polisorbato 20 o polisorbato 80.
  9. 9. La formulacion de cualquiera de una de las reivindicaciones anteriores que es adecuada para la administracion subcutanea.
  10. 10. La formulacion de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la que el anticuerpo monoclonal (i) es un anticuerpo monoclonal de longitud completa y/o (ii) es un anticuerpo quimerico, humanizado o humano, y/o (iii) se une a un antigeno seleccionado entre el grupo que consiste en: CD20, HER2, VEGF, IL6R, beta7, Abeta, HER3, EGFR y M1'.
  11. 11. La formulacion de las reivindicaciones 10(i) o 10(iii), en la que el anticuerpo monoclonal es un IgG1 humano, o en la que el anticuerpo es rituximab, trastuzumab o bevacizumab, respectivamente.
  12. 12. La formulacion de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el vetnculo de suspension no acuoso comprende una mezcla de dicaprilato/dicaprato de propilenglicol y lactato de etilo.
  13. 13. Un dispositivo de administracion subcutanea con la formulacion de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores dentro del mismo.
  14. 14. El dispositivo de la reivindicacion 13 que comprende una jeringa precargada.
  15. 15. Un metodo de fabricacion de una formulacion de suspension que comprende suspender un anticuerpo monoclonal secado por pulverizacion en un vetnculo de suspension no acuoso con una viscosidad inferior a aproximadamente 20 centipoise a aproximadamente 25 °C, en donde la concentracion de anticuerpos monoclonales en la formulacion de suspension es de aproximadamente 200 mg/ml o mas y en donde el vetnculo de suspension no acuoso comprende lactato de etilo.
  16. 16. Un metodo de fabricacion de un artfculo de fabricacion que comprende cargar un dispositivo de administracion subcutanea con la formulacion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
  17. 17. Una formulacion de suspension de la reivindicacion 1 que comprende un anticuerpo monoclonal lgG1 humano de longitud completa secado por pulverizacion a una concentracion de aproximadamente 200 mg/ml a aproximadamente 400 mg/ml suspendido en un vetnculo de suspension no acuoso con una viscosidad inferior a aproximadamente 20 centipoise a aproximadamente 25 °C, en donde la formulacion tiene un tamano de partfcula promedio de aproximadamente 2 micrometros a aproximadamente 10 micrometros y una fuerza de deslizamiento de inyeccion inferior a aproximadamente 15 Newton, y en donde el vetnculo de suspension no acuoso comprende lactato de etilo.
  18. 18. La formulacion de la reivindicacion 17, que (i) comprende adicionalmente sacarido, en la que la relacion molar de sacarido:anticuerpo monoclonal es de aproximadamente 100 a aproximadamente 250:1 y/o (ii) en la que el anticuerpo es rituximab, trastuzumab o bevacizumab.
    5 19. La formulacion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para su uso en el tratamiento de una
    enfermedad o un trastorno en un paciente.
  19. 20. La formulacion para el uso de la reivindicacion 19 en donde la formulacion se administra (i) por via subcutanea al paciente y/o (ii) mediante una jeringa precargada que contiene la formulacion dentro de la misma.
    10
    Viscosidad (cP) a 25 °C Disminucion de monomero (%)
    imagen1
    O
    o
    LO
    CNJ
    03
    0
    1
    CD
    C>
    a
    CD
    03
    N
    To
    CD
    “O
    CD
    “O
    03
    N
    CD
    30
    25
    20
    15
    10
    5
    0
    A Suspension de rituximab en dicaprilato/ Dicaprato de propilenglicol Suspension de rituximab en lactato de etilo O Suspension de rituximab en benzoato de bencilo
    I §
    m I i Fuerza de deslizamier ito prevista para liquido de mAb
    ni------------------------- J________88
    m a________ A l ) —
    4
    d #
    4 * #
    ^ s ---------
    50
    150 200 250
    Concentration de mAb (mg/ml)
    300
    350
    120
    o
    o
    LO
    CNJ
    03
    6?
    “O
    03
    ■g cn o o
    CO
    80
    60
    40
    20
    A Suspension de rituximab en dicaprilato/ Dicaprato de propilenglicol # Suspension de rituximab en benzoato de bencilo O Suspension de rituximab en lactato de etilo
    &
    # °
    Q o o °
    150 200 250
    Concentration de mAb (mg/ml)
    FIG. 4
    300
    350
    imagen2
    Diametro (micrometro)
    imagen3
    imagen4
    o— Dicaprilato/dicaprato de propilenglicol/Lactato de etilo 100/0 — - Dicaprilato/dicaprato de propilenglicol/Lactato de etilo 75/25
    —a— Dicaprilato/dicaprato de propilenglicol/Lactato de etilo 50/50
    ...#■...Dicaprilato/dicaprato de propilenglicol/Lactato de etilo 25/75
    Dicaprilato/dicaprato de propilenglicol/Lactato de etilo 0/100
    imagen5
    0,1 1 10 100 1000
    Diametro (micrometro)
    imagen6
    imagen7
    FIG. 7B
    cn
    co
    i
    t
    5
    E
    Ei
    s'
    S
    E
    E
    E
    F/G. 8A-1 ■ jFjjIjy
    imagen8
    imagen9
    FIG« fiA-
    Cadena pesada de rituximab
    +1 fr; L 10 15
    Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
    2 0 25 30 31 CDR1 35 36
    Val
    Lys Met Ser Cys Lys A. la Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp
    40 FR2 45 49 50 52 52A 53 54
    Val
    Lys Gin Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp He Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn
    55
    CDR5 60 65 66 FR3 70
    Gly
    Asp Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys
    75 80 82 82A 82B 82C 83 85
    Ser
    Ser
    Ser
    Thr Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
    90
    94 95 CDR2 100 IOOaIOObIOGc 100d 101 102 | 103
    Tyr
    Tyr
    Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val I Trp Gly
    105
    FR4 110 113 114 120
    Ala
    Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
    Gamma 1 humana Constante
    130
    133 140
    Leu
    Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
    150 154 156 157 162
    Lys
    Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Veil Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
    .169
    171 180 .182
    Gly
    Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
    190
    200 203 205 210
    Val
    Val
    Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn
    220 222 225 230 232 235
    His
    Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
    240 243 244 250
    Thr
    His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
    260
    270
    Leu
    Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
    280 290 292
    Cys
    Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
    295
    296 299 300 310 314 317
    Asp
    Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser
    320 330
    Thr
    Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys
    34 0 350 355
    Glu
    Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie
    357
    360 361 363 370
    Ser
    Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
    378 381 390
    Asp
    Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
    400 402 405 408 410 413 420
    Ser
    Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
    428 430 433 440
    Thr
    Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
    450 460
    Asp
    Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
    470 478 N. ° de aminoacido (Rabat)
    Leu
    His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys TER
    imagen10
    Cadena ligera de rituximab
    + 1 FR1 10
    Gin I 10 Val Leu Ser Gin Ser Pro Ala X le Leu Ser Ala Ser
    20 23 24 CDRJ 27/ 29 30 34
    Pro
    Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg AlcL Ser Ser Ser Val Ser Tyr lie His
    35
    FR2 4 0 45 49 50 C ;br2
    Trp
    Phe Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp lie Tyr Ala Thr Ser Asn
    55 56 57 60 A At. fcj I 65 70
    Leu
    Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser
    75 80 85 88 89 90
    Leu
    Thr lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp
    CDR3 95 97 98 100 FR4 105 107 108 110
    Thr
    Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val
    12 0
    Ale.
    Ale Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asd Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr
    Kappa humana constante
    130
    140
    Ala
    Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp
    150 160
    Lys
    Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp
    170 180
    Ser
    Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys A1 a Asp Tyr
    190 200
    Glu
    Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val
    210 214 N. 0 de aminoacido (Rabat)
    Thr
    Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys TER
    imagen11
    Cadena pesada de bevacizumab
    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGE
    QGTLVTVSS
    ASTKGP8VFPLAPS8KST8GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN8GALT SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYN8TYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPXEKT I8KAKGQPREPQVYTLPP3REEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDXAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
    Cadena ligera de bevacizumab
    imagen12
    imagen13
    cn
    Cadena pesada de TRASTUZUMAB
    1 15 30 45
    E V
    Q L V E s G G G L V G P G G S L R L s C A A s G F N I K D T Y I H W V R Q A p G K G L
    46
    60 CDR H1 75 90
    E W
    V A R I Y P T N G Y T R Y A D S V K G R F T I S A D T S K N T A Y L G M N S L R A E D
    91
    CDR H2 105 120 135
    T A
    V Y Y C S R W G G D G F Y A M D Y W G G G T L V T V s s||a S T K G P S V F P L A P S S
    136
    CDR H3 150 165 180
    K S
    T S G G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S w N s GAL T S G V H T F P A V L Q S S
    181
    195 210 225
    G L
    Y s L S S V V T V P S SSL G T Q T Y i C N ¥ N H K P S N T K V D K K V E P K S C D K
    226
    240 255 270
    T H
    T G P P G P A P E L L G G P S V F L F p P K P K D T L M I S R T P E V T G V V V D V s
    271
    285 300 315
    H E
    D P E V K F N W Y V D G V E V K N A K T K P R E E G Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D
    316
    330 345 360
    W L
    N G K E Y K C K V s N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P G V Y T L P p S R E E
    361
    375 390 405
    M T
    K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G
    406
    420 435 449
    S F
    F L Y S K L T V D K S R W G Q G N V F S C s V M H E A L H N H Y T G K S L s L S P G
    imagen14
    Cadena ligera de TRASTUZUMAB
    1 15 30 45
    D I
    Q M T Q S P S S L s A SVG D R V T I T C R A s G D V N T A V A W Y Q Q K P G K A P K
    46
    60 CDR L1 75 90
    L L
    I V A S A S F L Y S G V P S R F S G S R S G T D F T L T I S S V u Q P E D F A T Y Y C Q G
    91
    CDR L2 105 120 135
    H Y
    T T P P T F G Q G T K V E I K r| It V A A P S V F I F P P S D E Q L K S G T A S V V C L
    136
    CDR L3 150 165 180
    L N
    N F Y P R E A K V Q W K V D N A L Q S G N S Q E S V T E Q D S K D S T Y S L S S T L T
    181
    195 210 214
    L S
    K A D Y E K H K V Y A C E V T H Q G L S S P V T K S F N R G E C
    FIG. 10B
ES13724493.5T 2012-05-18 2013-05-17 Formulaciones de anticuerpos monoclonales de alta concentración Active ES2682761T3 (es)

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