ES2682959T3 - Compuestos de 3-benciloxi-biciclo[3.1.0]hexano 4-sustituidos como antagonistas de mGLuR 2/3 - Google Patents

Compuestos de 3-benciloxi-biciclo[3.1.0]hexano 4-sustituidos como antagonistas de mGLuR 2/3 Download PDF

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Abstract

Un compuesto de fórmula**Fórmula** en la que R1 y R2 son cada uno independientemente hidrógeno, alcoxi C1-C3 carboniloximetilo, alquil C1-C3 carboniloximetilo, o cicloalquil C3-6 carboniloximetilo; R3 es, independientemente en cada aparición, metilo, flúor, o cloro; R4 es hidroxilo, metilcarbonilamino, hidroximetilcarbonilamino, metoxicarbonilamino, imidazol-2-ilsulfanilo, tiazol- 2-ilsulfanilo, 1,2,4-triazolilsulfanilo, 1-metil-1,2,4-triazol-3-ilsulfanilo, o 1-metil-1,2,4-triazol-5-ilsulfanilo; y n es 1 o 2; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

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DESCRIPCION
Compuestos de 3-benciloxi-biciclo[3.1.0]hexano 4-sustituidos como antagonistas de mGLuR 2/3
El glutamate es el principal neurotransmisor excitador del cerebro, y esta implicado en una amplia variedad de procedimientos fisiologicos mediados a traves de no menos de 11 receptores diferentes, cada uno con su propia farmacologfa. Los receptores del glutamato metabotropico de los subtipos 2 y 3 (conocidos como mGlu2 y mGlu3) se agrupan frecuente y conjuntamente como receptores mGlu del Grupo II, basandose en su homologfa de secuencia, acoplamiento similar de segundos mensajeros, y caractensticas farmacologicas similares. Los antagonistas de los receptores mGlu2/3 han mostrado efectos farmacologicos significativos en modelos animales para trastornos depresivos y trastornos de somnolencia excesiva. Como tal, los antagonistas mGlu2/3 se han considerado utiles para el tratamiento de trastornos depresivos tales como el trastorno depresivo mayor (TDM), depresion unipolar, distimia, y/o ciclotimia, y/o util en el tratamiento de tratamiento de trastornos de somnolencia excesiva, tales como somnolencia diurna excesiva (SDE), hipersomnia asociada con apnea del sueno obstructiva o narcolepsia, trastornos del ritmo circadiano del sueno (incluido, aunque no de forma limitativa, a trastorno del sueno por cambio de turno de trabajo, trastorno por cambio de la zona horaria (jet lag), trastorno de fase del sueno retrasada, trastorno del sueno de fase avanzada, y smdrome de fase del sueno no de 24 horas), hipersomnolencia idiopatica y/o somnolencia excesiva asociada con sueno no restaurador (SNR).
El documento US 5.916.920 describe algunos compuestos de biciclo[3.1.0]hexano 3-monosustituidos como moduladores metabotropicos del receptor del glutamato utiles para tratar una variedad de trastornos incluidos como agentes antidepresivos. El documento 7.157.594 describe varios compuestos de biciclo[3.1.0]hexano 3- monosustituidos como antagonistas del receptor mGlu del Grupo II para su uso en el tratamiento de diversos trastornos incluidos smtomas depresivos. El documento US 2007/0021394 A1 describe varios compuestos de biciclo[3.1.0]hexano 3-monosustituidos como antagonistas del receptor mGlu del Grupo II y profarmacos de los mismos para su uso en el tratamiento de diversos trastornos incluida la depresion. El documento EP1897550 describe varios derivados de aminobiciclo[3.1.0]hexano dicarboxflico N-sustituidos que son formas de profarmaco de los agonistas del receptor mGlu2.
La presente invencion proporciona una familia de compuestos de 3-fenilsulfanilmetilbiciclo[3.1.0]hexano 4-sustituidos con elevada potencia antagonista por los receptores mGlu2 y mGlu3. Los compuestos de la presente invencion son tambien selectivos para los receptores mGlu2 y mGlu3, en especial frente a otros receptores de tipo mGlu. Algunos compuestos tambien han demostrado en modelos animales que los compuestos de la presente invencion pueden ser utiles para el tratamiento de trastornos depresivos (que pueden incluir el trastorno depresivo mayor (TDM), depresion unipolar, distimia, y/o ciclotimia) y trastornos de somnolencia excesiva (que pueden incluir somnolencia diurna excesiva (SDE), hipersomnia asociada con apnea del sueno obstructiva o narcolepsia, trastornos del ritmo circadiano del sueno (incluido, aunque no de forma limitativa, a trastorno del sueno por cambio de turno de trabajo, trastorno por cambio de la zona horaria (jet lag), trastorno de fase del sueno retrasada, trastorno del sueno de fase avanzada, y smdrome de fase del sueno no de 24 horas), hipersomnolencia idiopatica y/o somnolencia excesiva asociada con sueno no restaurador (SNR)). Los efectos analogos a los antidepresivos y efectos de estimulacion de la vigilia de este mecanismo tambien predicen un impacto en trastornos como la fatiga que, por otra parte, son difteiles de tratar con los antidepresivos actuales.
La presente invencion proporciona compuestos de Formula I:
imagen1
donde R1 y R2 son cada uno independientemente hidrogeno, alcoxi C1-C3 carboniloximetilo, alquil C1-C3 carboniloximetilo, o cicloalquil C3-6 carboniloximetilo;
R3 es, independientemente en cada aparicion, metilo, fluor, o cloro;
R4 es hidroxilo, metilcarbonilamino, hidroximetilcarbonilamino, metoxicarbonilamino, imidazol-2-ilsulfanilo, tiazol- 2-ilsulfanilo, 1,2,4-triazol-3-ilsulfanilo, 1-metil-1,2,4-triazol-3-ilsulfanilo, o 1-metil-1,2,4-triazol-5-ilsulfanilo; y n es 1 o 2;
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o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
Una caractenstica de la presente invencion es que los compuestos de Formula I en los que R1 y R2 son ambos hidrogeno (los compuestos diacidos) son los compuestos terapeuticamente activos in vivo, mientras que los compuestos donde R1 o R2 o ambos son diferentes de hidrogeno son profarmacos de sus analogos de diacido terapeuticamente activos. Los compuesto donde R1 o R2 o ambos son diferentes de hidrogeno se hidrolizan in vivo para proporcionar el analogo de diacido terapeuticamente activo. Los compuestos profarmacos, cuando se administran por via oral, especialmente los profarmacos de diester, proporcionan una biodisponibilidad mejorada del metabolito diacido, en comparacion con la administracion oral de los compuestos diacido (R1 y R2 ambos hidrogeno), pero los compuestos diacido proporcionan mejores actividades cuando se administran por via intravenosa, intramuscular o subcutanea.
En otro aspecto de la invencion, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de Formula I o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, junto con al menos un transportador, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable. Ademas, este aspecto de la invencion proporciona una composicion farmaceutica adaptada para el tratamiento de trastornos depresivos, como por ejemplo, el trastorno depresivo mayor, depresion unipolar, distimia, y/o ciclotimia, que comprende un compuesto de Formula I o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, junto con uno o mas excipientes, transportadores o diluyentes farmaceuticamente aceptables del mismo.
Una realizacion adicional de este aspecto de la invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de acuerdo con la Formula I, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, junto con al menos un transportador, excipiente o diluyentes farmaceuticamente aceptables, y opcionalmente otros ingredientes terapeuticos. En otra realizacion adicional de este aspecto de la invencion, la composicion farmaceutica comprende ademas un segundo agente terapeutico que es un farmaco util en el tratamiento de trastornos depresivos, como por ejemplo, un inhibidor de la recaptacion de serotonina, como por ejemplo fluoxetina y/o citalopram.
En otra realizacion adicional de este aspecto de la invencion se proporciona una composicion farmaceutica adaptada para el tratamiento de trastornos de somnolencia excesiva, como por ejemplo, somnolencia diurna excesiva (SDE), hipersomnia asociada con apnea del sueno obstructiva o narcolepsia, trastornos del ritmo circadiano del sueno (incluido, aunque no de forma limitativa, a trastorno del sueno por cambio de turno de trabajo, trastorno por cambio de la zona horaria (jet lag), trastorno de fase del sueno retrasada, trastorno del sueno de fase avanzada, y smdrome de fase del sueno no de 24 horas), hipersomnolencia idiopatica y/o somnolencia excesiva asociada con sueno no restaurador (SNR), que comprende un compuesto de Formula I o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, junto con uno o mas excipientes, transportadores o diluyentes farmaceuticamente aceptables del mismo.
La presente invencion tambien proporciona un compuesto de Formula I o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo para su uso en un procedimiento para tratar trastornos depresivos, como por ejemplo, el trastorno depresivo mayor (TDM), depresion unipolar, distimia, y/o ciclotimia, en un mairnfero. Otra realizacion de este aspecto de la invencion, comprende un compuesto de Formula I o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo para su uso en una combinacion simultanea, independiente o secuencial, un segundo agente terapeutico que es un farmaco util en el tratamiento de trastornos depresivos, como por ejemplo, un inhibidor de la recaptacion de serotonina, como por ejemplo fluoxetina y/o citalopram.
Otras realizaciones de la invencion proporcionan un compuesto de Formula I o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo para su uso en procedimientos para el tratamiento de trastornos de somnolencia excesiva. En otras realizaciones de este aspecto de la invencion, la somnolencia excesiva se debe a uno cualquiera o mas de los siguientes: somnolencia diurna excesiva (SDE), hipersomnia asociada con apnea del sueno obstructiva o narcolepsia, trastornos del ritmo circadiano del sueno (incluido, aunque no de forma limitativa, a trastorno del sueno por cambio de turno de trabajo, trastorno por cambio de la zona horaria (jet lag), trastorno de fase del sueno retrasada, trastorno del sueno de fase avanzada, y smdrome de fase del sueno no de 24 horas), hipersomnolencia idiopatica o somnolencia excesiva asociada con sueno no restaurador (SNR).
En una realizacion particular de estos procedimientos de tratamiento, el mam^era es un ser humano.
La presente invencion tambien proporciona un compuesto de Formula I o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo para su uso en terapia. Dentro de este aspecto, la invencion proporciona un compuesto de Formula I, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de trastornos depresivos. En realizaciones adicionales, el trastorno depresivo es uno cualquiera del trastorno depresivo mayor (TDM), depresion unipolar, distimia, y/o ciclotimia. En otra realizacion de este aspecto de la invencion, la invencion proporciona un compuesto de acuerdo con la Formula I, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para su uso en una combinacion simultanea, independiente o adicional junto con un inhibidor de la recaptacion de serotonina, como por ejemplo fluoxetina y/o citalopram, en el tratamiento de trastornos depresivos.
Adicionalmente, este aspecto de la invencion incluye un compuesto de Formula I, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de trastornos de somnolencia excesiva. En realizaciones concretas de este aspecto de la invencion, la somnolencia excesiva se debe a uno cualquiera o mas de los
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siguientes: somnolencia diurna excesiva (SDE), hipersomnia asociada con apnea del sueno obstructiva o narcolepsia, trastornos del ritmo circadiano del sueno (incluido, aunque no de forma limitativa, a trastorno del sueno por cambio de turno de trabajo, trastorno por cambio de la zona horaria (jet lag), trastorno de fase del sueno retrasada, trastorno del sueno de fase avanzada, y smdrome de fase del sueno no de 24 horas), hipersomnolencia idiopatica o somnolencia excesiva asociada con sueno no restaurador (SNR).
Una realizacion particular de este aspecto de las invenciones, los usos son en mairnferos, particularmente seres humanos.
Otro aspecto de la presente invencion proporciona el uso de un compuesto de Formula I, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de trastornos depresivos, como por ejemplo, el trastorno depresivo mayor (TDM), depresion unipolar, distimia, y/o ciclotimia. Otra realizacion de este aspecto de la invencion proporciona el uso de un compuesto de Formula I, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, y un segundo agente terapeutico util en el tratamiento de trastornos depresivos, como por ejemplo, un inhibidor de la recaptacion de serotonina, como por ejemplo fluoxetina y/o citalopram, en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de trastornos depresivos. Otra realizacion de la invencion proporciona el uso de un compuesto de Formula I, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de trastornos de somnolencia excesiva. En realizaciones concretas de este aspecto de la invencion, el medicamento es para el tratamiento de una cualquiera o mas de los siguientes: somnolencia diurna excesiva (SDE), hipersomnia asociada con apnea del sueno obstructiva o narcolepsia, trastornos del ritmo circadiano del sueno (incluido, aunque no de forma limitativa, a trastorno del sueno por cambio de turno de trabajo, trastorno por cambio de la zona horaria (jet lag), trastorno de fase del sueno retrasada, trastorno del sueno de fase avanzada, y smdrome de fase del sueno no de 24 horas), hipersomnolencia idiopatica o somnolencia excesiva asociada con sueno no restaurador (SNR).
Los compuestos de la presente invencion tienen restos basicos y acidos y, en consecuencia, reaccionan con numerosos acidos y bases organicos e inorganicos para formar sales farmaceuticamente aceptables. Las sales farmaceuticamente aceptables de la invencion de cada uno de los compuestos de la presente invencion estan incluidos dentro del ambito de la presente solicitud. El termino "sal farmaceuticamente aceptable" tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier sal de un compuesto de la invencion que sea sustancialmente no toxico para los organismos vivos. Dichas sales incluyen las relacionadas en el Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2-19 (1977), que son conocidas del experto en la materia.
Las clases preferidas de compuestos de la presente invencion son compuestos en los que:
1) R1 y R2 son ambos hidrogeno;
2) R1 o R2 o ambos son diferentes de hidrogeno;
3) R1 y R2 son ambos diferentes de hidrogeno;
4) R1 y R2 son iguales y diferentes de hidrogeno;
5) R1 y R2 son cada uno isopropoxicarbonilmetilo;
6) n es 2;
7) n es 2, ambos grupos R3 son cloro, y los grupos cloro estan en las posiciones 3 y 4 del fenilo;
8) R4 es hidroxilo.
Se entendera que otros compuestos preferidos son aquellos que combinan las anteriores selecciones preferidas de sustituyentes dados con selecciones preferidas de otros sustituyentes. Los ejemplos de dichas combinaciones incluyen, aunque no de forma limitativa, las siguientes clases preferidas de compuestos:
9) compuestos preferidos de uno cualquiera de los parrafos 1-5 (selecciones preferidas para R1 y R2) en los que n es 2, ambos grupos R3 son cloro, y los grupos cloro estan en las posiciones 3 y 4 del fenilo (parrafo 7);
10) compuestos preferidos de uno cualquiera de los parrafos 1-5 (selecciones preferidas para R1 y R2) en los que R4 es hidroxilo (parrafo 8);
11) compuestos preferidos de uno cualquiera de los parrafos 1-5 (selecciones preferidas para R1 y R2) en los que n es 2, ambos grupos R3 son cloro, y los grupos cloro estan en las posiciones 3 y 4 del fenilo (parrafo 7), y en los que R4 es hidroxilo (parrafo 8).
Los compuestos preferidos espedficos de la invencion son los descritos en los ejemplos, incluidas sus bases libres y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos.
Algunos compuestos preferidos son:
acido (1S,2R,3S,4S,5R,6R)-2-amino-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-hidroxibiciclo [3.1.0]hexano-2,6-dicarboxflico o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo; y
(1R,2S,3S,4R,5S,6R)-4-amino-3-[(3,4-diclorofenil)metoxi]-2-hidroxi-biciclo[3.1.0]hexano-4,6-dicarboxilato de bis(isopropoxicarboniloximetil) o un sal farmaceuticamente aceptable del mismo (es decir, los compuestos de los Ejemplos 1, 10 y 15, y sales farmaceuticamente aceptables alternativas de los mismos).
Las abreviaturas utilizadas en el presente documento se definen de la siguiente forma:
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"BSA" significa albumina de suero bovino.
"DCG IV" significa (2S,2'R,3'R)-2-(2',3'-dicarboxiciclopropil)glicina.
"DMEM significa medio de Eagle mmimo de Dulbecco.
"DMSO" significa dimetil sulfoxido.
"DPBS" significa solucion salina tamponada con fosfato de Dulbecco.
"EDTA" significa acido etilendiaminotetraacetico.
"GTP" significa trifosfato de guanosina.
"HBSS" significa solucion salina tamponada de Hank.
"HEPES" significa acido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfonico.
"HPLC" significa cromatograffa Kquida de alta presion.
"IBMX" significa 3-isobutil-l-metilxantina
"CI 50" significa la concentracion a la que se consigue el 50 % de la inhibicion.
"i.v." significa intravenosa o por via intravenosa.
"i.p." significa intraperitoneal.
"L-AP-4" significa L-(+)-2-amino-4-fosfonobutmco.
"CL/EM" significa cromatograffa Kquida seguida por espectrometna de masas.
"mFST" significa ensayo de natacion forzada en ratones; un modelo animal de la actividad antidepresiva.
"EM" significa espectrometna de masas.
"EM (ES+)" significa espectrometna de masas utilizando ionizacion por electropulverizacion.
"RMN" significa resonancia magnetica nuclear.
"p.o." significa per os, por boca.
"tBu" significa un resto butilo terciario.
Quimica general
Los compuestos de la presente invencion se pueden preparar de acuerdo con los siguientes esquemas sinteticos por procedimientos bien conocidos y apreciados en la materia. Las condiciones de reaccion adecuadas para las etapas de estos esquemas son bien conocidas en la tecnica y las sustituciones adecuadas de disolventes o correactivos estan comprendidas en las capacidades de la tecnica. Asimismo, los expertos en la materia apreciaran que los productos intermedios sinteticos se pueden aislar y/o purificar mediante tecnicas bien conocidas segun sea necesario o deseado, y que frecuentemente, sera posible utilizar diferentes productos intermedios directamente en etapas sinteticas posterior con poca o ninguna purificacion. Ademas, el experto en la materia apreciara que, en algunas circunstancias, el orden en que se anaden los restos no es cntico. El orden concreto de las etapas necesarias para producir los compuestos de Formula I depende del compuesto particular que se esta sintetizando, el compuesto de partida, y la labilidad relativa de los restos sustituidos, como apreciara bien el qmmico experto. Todos los sustituyentes, salvo que se indique de otra forma, son como se han definido anteriormente, y todos los reactivos son bien conocidos y apreciados en la materia.
Los compuestos de profarmaco 1 se pueden preparar como se ilustra en el Esquema I donde R1, R2, R3, R4 y n son como se han definido anteriormente. R1 y R2 no son ambos hidrogeno en el compuesto 1.
Esquema I
imagen2
Los compuestos 1 se pueden preparar segun la quimica ilustrada en el Esquema I. El compuesto 4 se hace reaccionar con un reactivo protector de amino tal como dicarbonato de di-terc-butilo en condiciones bien conocidas del experto en la materia para proporcionar el compuesto 3. Cuando los grupos R1 y R2 son identicos en el
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compuesto 2, el compuesto 3 se hace reaccionar con cantidad suficiente del correspondiente clorometilaquilcarbonato o yodometilaquilcarbonato y reactivos adecuados tales como yoduro de sodio y carbonato de cesio en un disolvente adecuado tal como dimetilformamida para proporcionar el compuesto de diester 2 deseado donde R1 y R2 son iguales. Cuando R1 y R2 son diferentes en el compuesto 2, cuando se controla la cantidad del primer clorometilaquilcarbonato a aproximadamente un equivalente, el acido carboxflico del anillo de cinco miembros se puede convertir en primer lugar a un monoester de R2 El compuesto monoester de R2 se puede hacer reaccionar adicionalmente con un equivalente de un clorometilaquilcarbonato diferente. El grupo acido carboxflico libre del anillo de tres miembros se puede convertir a continuacion en un ester de R1 para proporcionar el diester deseado con dos R1 y R2 diferentes. Para preparar un monoester de R2 del anillo de cinco miembros del compuesto 2, el compuesto 3 se hace reaccionar con aproximadamente un equivalente del clorometilaquilcarbonato adecuado y reactivos adecuados tales como yoduro de sodio y carbonato de cesio en un disolvente adecuado tal como dimetilformamida para proporcionar el compuesto de monoester de R2 deseado 2, en el cual R1 es hidrogeno. Para preparar un monoester de R1 del anillo de tres miembros, el grupo acido carboxflico del anillo de cinco miembros debera protegerse en primer lugar porque es mas reactivo. De manera mas espedfica, el grupo acido carboxflico del anillo de cinco miembros del compuesto 3 se puede hacer reaccionar con alfa-cloro-4-metoxitolueno, yoduro de sodio y bicarbonato de sodio en un disolvente adecuado tal como dimetilformamida para proporcionar un monoester de 4- metoxilbencilo. El grupo acido carboxflico del anillo de tres miembros del compuesto de monoester de 4- metoxilbencilo protegido se hace reaccionar a continuacion con un clorometilaquilcarbonato adecuado para dar como resultado un ester de R1 adecuado en el anillo de tres miembros. Es diester se trata con un acido adecuado tal como acido trifluoroacetico para desproteger tanto el 4-metoxilbencilo como el grupo N-ferc-butoxicarbonilo para dar como resultado el compuesto de monoester de R1 deseado 1. El compuesto 2, que incluye el monoester de R2 y el diester con R1 y R2 iguales o diferentes, se desprotege seguidamente con un acido adecuado tal como acido clortndrico en dioxano para dar el compuesto deseado 1 o una sal farmaceuticamente aceptable.
Esquema II
imagen3
El compuesto precursor 4 activo se puede preparar como se ilustra en el Esquema II.
El compuesto 9 se hace reaccionar con cloruro de metanosulfonilo y una base adecuada tal como trietilamina en un disolvente adecuado tal como tetrahidrofurano para proporcionar el compuesto de mesilato 6. El compuesto 6 puede reaccionar con heterociclos de tiol tales como 1H-1,2,4-triazol-3-tiol y una base adecuada tal como carbonato de potasio en un disolvente tal como dimetilformamida para dar el compuesto deseado 5, en el cual R4 es un heterociclo con enlace tio deseado. El compuesto 6 tambien puede reaccionar con azida sodica para dar la azida intermedia,
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que se reduce a continuacion con trimetilfosfina en tetrahidrofurano y agua para proporcionar una amina. La amina resultante puede formar adicionalmente una amida o carbamato deseados segun procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia para proporcionar el compuesto 5, en el cual R4 es un grupo amida o carbamato deseados. A continuacion, el compuesto 5 se desprotege con un acido adecuado tal como acido clorUdrico o acido acetico para proporcionar el compuesto 4. Cuando R4 es un grupo hidroxilo en el compuesto 4, el compuesto precursor 4 activo deseado se puede preparar directamente a partir del compuesto 7 eliminando todos los grupos protectores con un acido adecuado tal como HCl en un disolvente adecuado tal como dioxano.
Esquema III
imagen4
Los dos productos intermedios 7 y 9 clave se pueden preparar como se ilustra en el Esquema III.
El compuesto 14 (vease el documento WO03/104217/A2 para los detalles de la smtesis) se reduce al compuesto 13 con un agente reductor adecuado como tri(sec-butil)borohidruro de litio en un disolvente adecuado tal como tetrahidrofurano. El compuesto 13 se hace reaccionar con cloruro de metanosulfonilo y una base tal como trietilamina en un disolvente adecuado tal como tetrahidrofurano para obtener el compuesto de mesilato 12, que se hace reaccionar adicionalmente con fluoruro de trabutilamonio o ferc-butoxido de potasio en tetrahidrofurano para dar el compuesto 11. El compuesto H se hace reaccionar con OsO4, N-metilmorfolina-N-oxido en acetona y agua para dar un compuesto de diol 10. El compuesto 10 se hace reaccionar a continuacion con un haluro de bencilo adecuadamente sustituido tal como bromuro de 3,4-diclorobencilo, usando yoduro de tetra-n-butilamonio y oxido de plata en un disolvente adecuado tal como dimetilformamida para dar como resultado el compuesto 9. En condiciones de reaccion de Mitsunobu, el compuesto 9 se hace reaccionar con acido 4-nitrobenzoico, trifenilfosfina, y azodicarboxilato de diisopropilo en un disolvente adecuado tal como tetrahidrofurano para dar el compuesto 8. A continuacion, el compuesto 8 se hace reaccionar con carbonato de potasio en un disolvente adecuado tal como metanol para proporcionar el compuesto 7.
Preparacion 1: (1S,2S,4S,5R,6R)-2-[(ferc-Butoxicarbonil)amino]-4-hidroxi-biciclo[3.1,0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo
imagen5
Anadir tri(sec-butil)borohidruro de litio 1 M en tetrahidrofurano (42,27 ml, 42,27 mmol) gota a gota a (1S,2S,5R,6R)- 2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]-4-oxobiciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo (7,10 g, 17,25 mmol, vease el documento WO03/104217/A2 para los detalles de la smtesis) en tetrahidrofurano (431,35 ml) a 0 °C y agitar. Despues de 90 minutos, anadir cuidadosamente una solucion acuosa de bicarbonato de sodio 1 M (60,07 ml, 5 62,11 mmol) seguido por peroxido de hidrogeno (30 % en peso, 2,64 ml, 86,27 mmol) a 0 °C. La reaccion se calento
a temperatura ambiente. Despues de 40 minutos, la reaccion se extrajo con acetato de etilo, se lavo con una solucion acuosa de acidos dtrico al 10% seguido por salmuera, se seco con sulfato de sodio, se filtro y se concentraron a presion reducida para dar un residuo. El residuo se purifico mediante cromatograffa ultrarrapida eluyendo con acetato de etilo al 5-50 % en hexano para proporcionaron el compuesto del tftulo (6,70 g, 16,20 mmol, 10 94 %).
Preparacion 2: (1S,2S,4S,5R,6R)-2-[(ferc-Butoxicarbonil)amino]-4-[(metilsulfonil)oxi]biciclo[3.1.0]hexano-2,6-
dicarboxilato de di-ferc-butilo
imagen6
Se anadio cloruro de metanosulfonilo (224,61 pl, 2,90 mmol) a (1S,2S,4S,5R,6R)-2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]-4- 15 hidroxi-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo (400 mg, 967 pmoles) y trietilamina (472 pl, 3,39 mmol)
en tetrahidrofurano(4,84 ml) a 0 °C y se agito. Se retiro el bano de enfriamiento y la reaccion se dejo calentar a temperatura ambiente y se agito durante toda la noche. Diluir con agua y solucion acuosa saturada de bicarbonato de sodio, despues extraer con acetato de etilo. La combinacion de capas organicas se lavo con salmuera, se seco con sulfato de sodio, se filtro y se concentro a presion reducida para dar el compuesto del tftulo (600 mg, 1,22 mmol, 20 100 %).
Preparacion 3: (1S,2S,5R,6S)-2-[(ferc-Butoxicarbonil)amino]biciclo[3.1.0]hex-3-eno-2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo
imagen7
Anadir fluoruro de tetrabutilamonio 1 M en tetrahidrofurano(3,84 ml, 3,84 mmol) a (1S,2S,4S,5R,6R)-2-[(ferc- butoxicarbonil)amino]-4-[(metilsulfonil)oxi]biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo (600,00 mg,
25 1,22 mmol) en tetrahidrofurano (2,03 ml) y calentar a temperatura de reflujo durante 3 horas. A continuacion, la
reaccion se enfrio a temperatura ambiente, se diluyo con agua, y se extrajo con acetato de etilo, se lavo con salmuera, se seco con sulfato de sodio, se filtro, y se concentro a presion reducida para dar un residuo. El residuo se purifico mediante cromatograffa ultrarrapida eluyendo con acetato de etilo al 5-75 % en hexano para proporcionaron el compuesto del tftulo (0,23 g, 0,58 mmol, 48 %).
30 Preparacion_____4. (1S,2R,3S,4R,5R,6R)-2-[(ferc-Butoxicarbonil)amino]-3,4-dihidroxibiciclo[3.1.0]hexano-2,6-
dicarboxilato de di-ferc-butilo
imagen8
Anadir OsO4 (2,5%) en 2-metil-2-propanol (5,48 g, 0,54 mmol) a N-metilmorfolina-N-oxido (2,43 g, 17,97 mmol), (1S,2S,5R,6S)-2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]biciclo[3.1.0]hex-3-eno-2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo (3,23 g,
8,17 mmol), acetona (80,66 g, 102,09 ml, 1,39 moles), y agua (40,83 ml; 40,83 g, 2,27 moles). Agitar a temperatura ambiente. Despues de 5 horas, se anadio a la reaccion una solucion acuosa saturada de tiosulfato de sodio (10 ml).
5 Se concentro hasta la mitad del volumen a presion reducida. Diluir el concentrado con agua, extraer con acetato de etilo (3x50 ml). La combinacion de capas organicas se lavo con salmuera, se seco con sulfato de sodio, se filtro y se concentro a presion reducida para dar un residuo. El residuo se purifico mediante cromatograffa ultrarrapida eluyendo con acetato de etilo al 5-50% en hexano para proporcionaron el compuesto del titulo (2,7 g, 6,3 mmol; 77 %)
10 Preparacion______5 (1S,2R,3 S,4R,5R,6R)-2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-
hidroxibiciclo[3.1,0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo
imagen9
Anadir bromuro de 3,4-diclorobencilo (1,02 ml, 1,02 g, 4,26 mmol) a (1S,2R,3S,4R,5R,6R)-2-[(ferc-
butoxicarbonil)amino]-3,4-dihidroxibiciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo (1,22 g, 2,84 mmol), yoduro 15 de tetra-n-butilamonio (1,07 g, 2,84 mmol) y oxido de plata (987,35 mg, 4,26 mmol) en dimetilformamida (17 ml) a temperatura ambiente. Agitar durante la noche. Diluir con dietil eter y hexanos (1:1), filtrar a traves de celite, y despues lavar con eter y hexanos (1:1). El filtrado se lavo con agua, salmuera, se seco con sulfato de magnesio, y se concentro a presion reducida para dar un residuo. El residuo se purifico mediante cromatograffa ultrarrapida, eluyendo con acetato de etilo al 0-30%: hexanos para dar el compuesto del titulo (1,7 g, 2,84 mmol, 78 %): EM 20 (m/z): 610/612 (M+Na).
Preparacion 6: (1S,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(ferc-Butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-{[(4-
nitrofenil)carbonil]oxi}biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo
imagen10
Trifenilfosfina (12,66 g, 48,26 mmol) y acido 4-nitrobenzoico (8,19 g, 48,26 mmol) se anadieron a 25 (1S,2R,3S,4R,5R,6R)-2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-hidroxibiciclo[3.1.0]hexano-2,6-
dicarboxilato de di-ferc-butilo de (14,20 g, 24,13 mmol) y tetrahidrofurano (241,28 ml, 2,97 moles) a temperatura ambiente. Enfriar la mezcla en un bano de hielo. Se anadio gradualmente azodicarboxilato de diisopropilo (9,57 ml, 9,76 g, 48,26 mmol) en tetrahidrofurano (20 ml) y la mezcla de reaccion se calento gradualmente hasta temperatura ambiente durante la noche. Diluir con dietil eter, y a continuacion lavar con una solucion acuosa de carbonato de 30 sodio. Extraer la capa acuosa de nuevo con dietil eter. Combinar todos los extractos etereos, lavar con agua, salmuera, secar con sulfato de magnesio, y concentrar a presion reducida para obtener un residuo. El residuo se purifico mediante cromatograffa ultrarrapida, eluyendo con acetato de etilo al 10-100% en hexanos para dar el compuesto del tftulo (9 g, 12,2 mmol, 51 %): EM (m/z): 759 (M+1).
imagen11
Se anadio carbonato de potasio (5,11 g, 36,60 mmol) a una solucion de (1S,2R,3 S,4S,5R,6R)-2-[(ferc- butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-didorobencil)oxi]-4-{[(4-nitrofenil)carbonil]oxi}bicido[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo (9,00 g, 12,20 mmol) y metanol (122,01 ml, 3,01 moles), y a continuacion se agito a temperatura 5 ambiente. Despues de 1 hora, diluir la mezcla de reaccion con acetato de etilo, lavaron con agua (75 ml), salmuera (75 ml), secar con sulfato de sodio, y concentrar a presion reducida para obtener un residuo. El residuo se purifico mediante cromatograffa ultrarrapida, eluyendo con acetato de etilo al 10-60 %: hexanos para dar el compuesto del tftulo (5,3 g, 9,01 mmol, 74 %). EM (m/z): 610/612 (M+1).
Preparacion 8: (1S,2R,3S,4R,5R,6R)-2-[(ferc-Butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-
10 [(metilsulfonil)oxi]biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo
imagen12
Se anadio cloruro de metanosulfonilo (0,841ml, 1,25 g, 10,87 mmol) a (1S,2R,3S,4R,5R,6R)-2-[(ferc-
butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-hidroxibiciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo
(2,00 g, 3,40 mmol), trietilamina (1,66 ml, 1,20 g, 11,89 mmol), y tetrahidrofurano (33,98 ml, 30,11 g, 417,61 mmol) a 15 0 °C y se agito. Calentar gradualmente la reaccion a temperatura ambiente y agitar durante la noche. Diluir la
reaccion con una solucion acuosa saturada de bicarbonato sodico, despues extraer con acetato de etilo (3x100 ml). La combinacion de extractos organicos se lavo con salmuera, se seco con sulfato de magnesio, se filtro y se concentro a presion reducida para dar un residuo. El residuo se purifico mediante cromatograffa ultrarrapida eluyendo con acetato de etilo al 5-60 % en hexano para proporcionaron el compuesto del tftulo (1,40 g, 2,10 mmol, 20 62 %).
Preparacion 9: (1R,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-(1H-1,2,4-triazol-3-
ilsulfanil)biciclo[3.1,0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo
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Se anadio carbonato de potasio (1,45 g, 10,50 mmol) a 1H-1,2,4-triazol-3-tiol (424,79 mg, 4,20 mmol) y 25 dimetilformamida (10,50 ml, 9,93 g, 135,80 mmol) a temperatura ambiente y se agito. Despues de 5 minutos, se anadio (1S,2R,3S,4R,5R,6R)-2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-
[(metilsulfonil)oxi]biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo (1,40 g, 2,10 mmol) a la reaccion y se agito a 85 °C. Despues de 2 dfas, enfriar la reaccion a temperatura ambiente, diluir con una solucion saturada de bicarbonato sodico, a continuacion extraer con acetato de etilo (3X). La combinacion de extractos organicos se lavo 30 con agua, salmuera, se filtro y se concentro a presion reducida para dar un residuo. El residuo se purifico mediante cromatograffa ultrarrapida eluyendo con acetato de etilo al 5-75 % en hexano para proporcionaron el compuesto del tftulo (978,0 mg, 1,46 mmol, 69 %). EM (m/z): 671/669 (M-1).
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Preparacion 10: (1R,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(ferc-Butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-(1,3-tiazol-2-
ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo
imagen14
Este compuesto se preparo esencialmente como se describe en la Preparacion 9 usando 2-mercaptotiazol. El residuo se purifico mediante cromatograffa en fase normal para obtener un rendimiento del 29 % de los compuestos del tftulo. EM (m/z): 465 (M+1).
Preparacion 11: (1R,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(ferc-Butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-[(1-metil-1,2,4-
triazol-3-il)sulfanil]biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo
imagen15
Disolver (1R,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-(1H-1,2,4-triazol-3-
ilsulfanil)biciclo[3.1,0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo (0,60 g, 0,893 mmol) en tetrahidrofurano anhidro (3,6 ml) en un matraz secado a la llama y enfriar a -78 °C. Anadir f-butoxido de potasio (0,80 g, 0,893 mmol) y agitar durante 15 minutos. Anadir yoduro de metilo (0,127 g, 0,893 mmol, pretratado por filtracion a traves de alumina basica) y dejar en agitacion a -78 °C durante 15 minutos. Dejar que la muestra se caliente a temperatura ambiente y despues agitar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Verter la mezcla de reaccion en bruto en agua y ajustar el pH a 6 con una solucion acuosa de HCl 1 N y extraer con acetato de etilo. Secar la capa organica con sulfato de magnesio, filtrar y concentrar a presion reducida. Purificar mediante cromatograffa ultrarrapida en fase invertida (columna C18 100 g eluyendo con acetonitrilo al 45-95 % en agua (con acido trifluoroacetico al 0,1 % en ambos casos), el compuesto se eluye a un 89 % de acetonitrilo). Combinar las fracciones deseadas y neutralizar con una solucion acuosa de bicarbonato. Extraer con acetato de etilo, secar la capa organica con sulfato de magnesio, filtrar y concentrar a presion reducida para obtener el compuesto del tftulo en forma de una espuma de color blanco (0,16 g, 0,23 mmol, 26 %): EM (m/z): 473/475/477 (M+1).
Preparacion_____________12: (1S,2R,3R,4S,5R,6S)-4-azido-2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-
diclorobencil)oxi]biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo
imagen16
Se anadio azida de sodio (8,29 g, 127,45 mmol) a (1S,2R,3S,4R,5R,6R)-2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4- diclorobencil)oxi]-4-[(metilsulfonil)oxi]biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo (16,99 g, 25,49 mmol) y 15-corona-5 (508,57 pl, 561,46 mg, 2,55 mmol) en dimetilformamida (254,90 ml, 240,96 g, 3,30 moles) a 85 °C y se
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agito. Despues de 7 d^as, la reaccion se enfrio a temperatura ambiente, despues se diluyo con agua y se extrajo con acetato de etilo (3X). La combinacion de extractos organicos se lavo con agua, salmuera, se seco con sulfato de magnesio, se filtro, y se concentro a presion reducida para dar un residuo. El residuo se purifico mediante cromatograffa ultrarrapida eluyendo con acetato de etilo al 2-60 % en hexano para obtener el compuesto del titulo (11,2 g, 18,3 mmol, 72 %). EM (m/z): 635/637 (M+1).
Preparacion 13: (1S,2R,3R,4S,5R,6S)-4-amino-2-[(ferc-Butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-
diclorobencil)oxi]biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo
imagen17
Anadir una solucion de trifenilfosfina 1 M en tetrahidrofurano(19,56 ml, 19,56 mmol) a (1S,2R,3R,4S,5R,6S)-4-azido- 2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo (8,00 g, 13,04 mmol) en tetrahidrofurano(43,46 ml) y agua (130,39 ml) a temperatura ambiente y agitar durante la noche. Se anadio a la reaccion una solucion acuosa saturada de bicarbonato sodico, despues se extrajo con acetato de etilo (3X). La combinacion de capas organicas se lavo con salmuera, se seco con sulfato de magnesio, se filtro y se concentro a presion reducida, dando el compuesto del tttulo (7,42 g, 12,63 mmol, 97 %). EM (m/z): 609/611 (M+Na).
Preparacion 14: (1S,2R,3R,4S,5R,6S)-4-(acetilamino)-2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-
diclorobencil)oxi]biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo
imagen18
Se anadio cloruro de acetilo (334,31 pl, 368,75 mg, 4,70 mmol) en diclorometano (5 ml) a una solucion enfriada en agitacion de (1S,2R,3R,4S,5R,6S)-4-amino-2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-
diclorobencil)oxi]biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo (2,30 g, 3,91 mmol) y trietilamina (709.32 pl, 514,97 mg, 5,09 mmol) en diclorometano (19,57 ml) a 0 °C despues se agito. Despues de 90 minutos, diluir con agua y extraer con diclorometano (3X25 ml). La combinacion de extractos organicos se seco con sulfato de magnesio, se filtro y se concentro a presion reducida, dando el compuesto del tttulo (2,40 g, 3,81 mmol, 97 %): EM (m/z): 653 (M+1).
Preparacion 15: (1S,2R,3R,4S,5R,6S)-2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-
[(metoxicarbonil)amino]biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo
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Este compuesto se preparo esencialmente como se describe en la Preparacion 14 usando cloroformiato de metilo para proporcionar un 88 % del compuesto del tttulo.
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Anadir 2-metil-1H-1,2,4-triazol-3-tiona (0,126 g, 1,09 mmol) y carbonato de potasio (0,35 g, 2,52 mmol) a una solucion de (1S,2R,3S,4R,5R,6R)-2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-
[(metilsulfonil)oxi]biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo (0,80 g, 0,84 mmol) en dimetilformamida (l,68 ml. Tras calentar durante 2 dfas a 80 °C, verter la solucion en salmuera y extraer con acetato de etilo tres veces, se car la combinacion de fases organicas con sulfato de sodio, filtrar y concentrar a presion reducida. Purificar mediante cromatograffa ultrarrapida eluyendo con acetato de etilo al 10 % en CH2Cl2 para obtener el compuesto del tttulo en forma de un aceite (0,576 g, 0,84 mmol, 100 %). EM (m/z): 685/687/689 (M+1).
Preparacion 17: (1R,2R,3 S,4S,5R,6R)-2-(ferc-butoxicarbonilamino)-3-[(3,4-diclorofenil)metoxi]-4-(1H-imidazol-2- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo
imagen21
Este compuesto se preparo esencialmente como se describe en la Preparacion 20 usando (1S,2R,3S,4R,5R,6R)-2- [(ferc-butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-[(metilsulfonil)oxi]biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di- ferc-butilo. Purificar mediante cromatograffa ultrarrapida eluyendo con acetato de etilo al 30-50 %: hexanos para obtener el compuesto del tftulo con rendimiento del 38 %. EM (m/z): 671/673/675 (M+1).
Preparacion_______18: (1S,2R,3R,4S,SR,6S)-4-[(2-Acetoxiacetil)amino]-2-(ferc-butoxicarbonilamino)-3-[(3,4-
diclorofenil)metoxi]biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de dietilo
imagen22
Anadir cloruro de acetoxiacetilo (0,116 ml, 1,08 mmol) a una solucion de (1S,2R,3R,4S,5R,6S)-4-amino-2-(ferc- butoxicarbonilamino)-3-[(3,4-diclorofenil)metoxi]biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de dietilo (0,47 g, 0,89 mmol) y diisopropiletilamina (0,32 ml, 1,83 mmol) en diclorometano (9 ml) a temperatura ambiente. Despues de 2,5 horas, lavar la solucion con una solucion saturada de NaHCO3 (2x), salmuera (1x), secar con MgSO4, filtrar, y conc. a presion reducida. Purificar mediante cromatograffa ultrarrapida eluyendo con un gradiente de acetato de etilo de 0 al 100 % en hexanos durante 30 min. para obtener el compuesto del tftulo en forma de solido de color blanco (0,43 g, 0,68 mmol, 76 %). EM (m/z): 531 (M+H-BOC).
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Preparacion 19: Acido (1S,2R,3R,4S,5R,6S)-2-(ferc-butoxicarbonilamino)-3-[(3,4-diclorofenil)metoxi]-4-[(2-
hidroxiacetil)amino]biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarbox^lico
imagen23
Anadir hidroxido de litio 1 M (4,0 ml, 4,0 mmol) a una solucion de (1S,2R,3R,4S,5R,6S)-4-[(2-acetoxiacetil)amino]-2- (ferc-butoxicarbonilamino)-3-[(3,4-diclorofenil)metoxi]biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de dietilo (0,42 g,
0,67 mmol) en tetrahidrofurano (7.0 ml) a temperatura ambiente y agitar durante la noche. Acidificar la reaccion hasta aproximadamente pH 1 con una solucion acuosa de HCl 5 N. Extraer con acetato de etilo (3 x 25 ml). Secar las capas organicas combinadas, filtrar, y conc. a presion reducida. El analisis mediante HPLC de la mezcla de reaccion en bruto muestra que queda material de partida. Anadir una solucion acuosa de hidroxido de litio 1 M (4,0 ml, 4,0 mmol) a una solucion de la mezcla de reaccion en bruto en tetrahidrofurano (7,0 ml) y calentar a 50 °C. Despues de 17 horas, acidificar la reaccion hasta aproximadamente pH 1 con una solucion acuosa de HCl 5 N. Extraer con acetato de etilo (3 x 25 ml). Secar los extractos combinados, filtrar, y conc. a presion reducida. Purificar mediante cromatograffa lfquida de alto rendimiento preparativa en fase invertida usando un gradiente del 95 % agua (con HCl al 0,03 %) / 5 % acetonitrilo hasta 5 % agua (con HCl al 0,03 %) / 95 % acetonitrilo durante 40 min para proporcionar acido (1S,2R,3R,4S,5R,6S)-2-(ferc-butoxicarbonilamino)-3-[(3,4-diclorofenil)metoxi]-4-[(2-
hidroxiacetil)amino]biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxflico (0,181 g, 0,34 mmol, 51 %) en forma de un solido de color blanco. EM (m/z): 531 (M-H).
Preparacion 20: Acido (1S,2R,3 S,4S,5R,6R)-2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-
hidroxibiciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxflico
imagen24
Disolver acido (1S,2R,3S,4S,5R,6R)-2-amino-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-hidroxibiciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxflico (2 g, 5,32 mmol) en dioxano (10,63 ml), a continuacion tratar con una solucion acuosa saturada de bicarbonato de sodio (10,63 ml, 6,90 mmol) y carbonato de di-ferc-butilo (5,80 g, 26,58 mmol). Agitar la mezcla bifasica a temperatura ambiente durante 18 dfas, despues concentro para eliminar el disolvente. Disolver el residuo resultante en acetonitrilo (ayudado con HCl 1 N) y extraer dos veces para eliminar el dicarbonato de di-ferc-butilo. Concentrar la capa de acetonitrilo. Disolver el residuo resultante en acetato de etilo, despues lavar dos veces con HCl 1 N, lavar una vez con salmuera, secar con sulfato de sodio, y concentrar a sequedad para obtener el compuesto del tttulo (2,1 g, 4,41 mmol, 83 %). EM (m/z): 474 (M-1).
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Este compuesto se prepare esencialmente como se describe en la Preparacion 20 usando acido (1S,2R,3R,4S,5R,6S)-4-(acetilamino)-2-amino-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxflico para obtener el compuesto del trtulo con un 74 % de rendimiento. EM (m/z): 515/517 (M-1).
5 Preparacion_________22: (1S,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(fe/'c-butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-
hidroxibiciclo[3.1,0]hexano-2,6-dicarboxilato de bis({[(1-metiletoxi)carbonil]oxi}metilo)
imagen26
A una solucion de acido (1S,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(fe/'c-butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-
hidroxibiciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxflico (1,89 g, 3,96 mmol) en dimetilformamida (23,3 ml) se anadio carbonato 10 de clorometilisopropilo (1,27 g, 8,33 mmol), yoduro de sodio (59,4 mg, 0,396 mmol), y carbonato de cesio (2,84 g, 8,72 mmol). Agitar la mezcla durante la noche a temperatura ambiente bajo atmosfera de nitrogeno. Diluir la mezcla de reaccion con acetato de etilo y agua. Separar las capas. Extraer la capa acuosa dos veces con acetato de etilo. Extraer las capas organicas combinadas con salmuera, secar con sulfato de magnesio, filtrar y concentrar. Purificar el residuo por cromatografia ultrarrapida eluyendo con acetato de etilo de 0 al 75 % en hexano para proporcionar el 15 compuesto del trtulo en forma de una espuma (940 mg, 1,33 mmol, 33 %). EM (m/z): 732 (M+Na).
Los compuestos de la Preparacion 23-26 se pueden preparar esencialmente como se describe en la Preparacion 22:
Prep. N.°
Nombre qmmico Estructura Rendimiento (%) Datos fisicos EM (m/z)
23
(1S,2R,3S, 4S,5R,6R)-2-[(ferc- Butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]- 4-hidroxibiciclo [3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de bis {[(etoxicarbonil)oxi]metilo} Absoluto OH 0 H ; <r^C 0 /—0 H ^ x ^0 0 NH V W / % ’/ °~V. 58 702 (M+Na)
(continuacion)
Prep. N.°
Nombre qmmico Estructura Rendimiento (%) Datos ffsicos EM (m/z)
24
(1S,2R, 3S,4S,5R,6R)-2-[(ferc- butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]- 4-hidroxibiciclo [3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de bis{[(ciclopropilcarbonil)oxi]metilo} OH ^ H / a 9. — Q \\ VO Ml XV 55 694/696 (M+Na)
25
(1S,2R, 3S,4S,5R,6R)-2-[(ferc- butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]- 4-hidroxibiciclo [3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de bis {[(2-metilpropanoil)oxi]metilo} OH h / . ^ y-h —■■ o .—o hr " V, ° Vo O N T 4 V. ■ V 49 698/700 (M+Na)
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(1S,2R,3R,4S,5R,6S)-4-(acetilamino)-2-[(ferc- butoxicarbonil) amino]-3-[(3,4- diclorobencil)oxi]biciclo[3.1.0]hexano-2,6- dicarboxilato de bis[(acetiloxi)metilo] ■x / Wac, Vo ONI f r % o s X y
Ejemplo 1: Acido (1S,2R,3S,4S,5R,6R)-2-amino-3-[(3,4-didorobencN)oxi]-4-hidroxibicido[3.1.0]hexano-2,6-
dicarbox^lico
imagen27
5 Se anadio (1S,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-
hidroxibiciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo (5,30 g, 9,01 mmol) a agua (30,02 ml) y acido acetico (30,02 ml). Calentar la reaccion a reflujo hasta el agotamiento completo del material de partida. Enfriar y concentrar en un evaporador rotatorio. Triturar el concentrado con dietil eter, recoger el precipitado, despues secar en un horno de vado para obtener el compuesto del fftulo (3,30 g, 8,77 mmol, 97 %). EM (m/z): 376/378 (M+1).
10 Los compuestos de los Ejemplos 2-3 se pueden preparar esencialmente como se describe en el Ejemplo 1:
N.° Ej.
Nombre qmmico Estructura Rendimiento (%) Datos ffsicos EM (m/z)
2
Acido (1R,2R,3S,4S,5R,6R)-2-amino-3-[(3,4- diclorobencil)oxi]-4-(1H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)bicido[3.1.0]hexano-2,6-dicarbox^lico N—. il H Cl 0 81 EM (m/z): 459/461 (M+1)
(continuacion)
N.° Ej.
Nombre qrnmico Estructura Rendimiento (%) Datos ffsicos EM (m/z)
3
Acido (1R,2R,3S,4S,5R,6R)-2-amino-3-[(3,4- diclorobencil)oxi]-4-(1,3-tiazol-2-ilsulfanil) biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarbox^lico J[S rOT H0^r>o ci H2^ || o 73 EM (m/z): 475/477 (M+1)
Ejemplo 4: Acido (1S,2R,3R,4S,5R,6S)-4-(acetilamino)-2-amino-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]biciclo[3.1.0]hexano-2,6- dicarbox^lico
imagen28
Se anadio (1S,2R,3R,4S,5R,6S)-4-(acetilamino)-2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-
5 diclorobencil)oxi]biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo (2,40 g, 3,81 mmol) a acido acetico (7,99 g, 7,62 ml, 133,05 mmol,) y agua (3,81 ml, 3,81 g, 211,60 mmol) y se calento en un horno de microondas hasta 140 °C. Despues de 15 minutos, enfriar a temperatura ambiente, diluir con agua y filtrar para recoger los solidos. Secuencialmente, lavar los solidos con agua (2x50 ml) y dietil eter (2x50 ml), y despues secar en un horno de vado para obtener el compuesto del tttulo (1,23 g, 2,95 mmol, 77 %): EM (m/z): 417/419 (M+1).
10 Ejemplo 5: Acido (1S,2R,3R,4S,5R,6S)-2-amino-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-
[(metoxicarbonil)amino]biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxflico
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Este compuesto se preparo esencialmente como se describe en el Ejemplo 4 usando acido (1S,2R,3R,4S,5R,6S)-2- amino-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-[(metoxicarbonil)amino]biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxflico. rendimiento del 15 81 %. EM (m/z): 433/435 (M+1).
Ejemplo 6: Clorhidrato del acido (1R,2R,3S,4S,5R,6R)-2-amino-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-[(1-metil-1H-1,2,4-triazol- 5-il)sulfanil]biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxflico
imagen30
Anadir acido acetico (2,0 ml) y agua (2.0 ml) a (1 R,2R,3S,4S,5R,6R)-2-(ferc-butoxicarbonilamino)-3-[(3,4-
diclorofenil)metoxi]-4-[(2-metil-1,2,4-triazol-3-il)sulfanil]bicido[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo
(0,305 g, 0,445 mmol) en un recipiente para horno microondas y precintar y calentar la mezcla a 140 °C durante 25 minutes. Enfriar y concentrar la mezcla a sequedad, y despues anadir acido cloriddrico 5 N (2 ml), acetonitrilo (2 ml), y transferir a un vial. Liofilizar durante la noche para obtener el compuesto del tttulo en forma de un solido de color 5 blanco (0,227 g, 0,445 mmol; 95 %): EM (m/z): 473/475/477 (M+1).
Los compuestos de los Ejemplos 7-8 se pueden preparar esencialmente como se describe en el Ejemplo 6:
Ej. N.°
Nombre qrnmico Estructura Rendimiento (%) Datos ffsicos EM (m/z)
7
Clorhidrato del acido (1R,2R,3S,4S,5R,6R)-2-Amino- 3-[(3,4-diclorofenil)metoxi]-4-[(1-metil-1,2,4-triazol-3- il)sulfanil]biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxflico. \ i II c, N""\ / $ --------f HO /-------\ /-----01 HCI ° 91 473/475/4 77 (M+1).
8
Clorhidrato del acido (1R,2R,3S,4S,5R,6R)-2-amino- 3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-(1H-imidazol-2-ilsulfanil) biciclo[3.1.0]hexano-2,6-acido dicarboxflico Cl “ HU /-------\ /~C' h,n'\— oh HCI ° 88 458/460/4 62 (M+1)
Ejemplo 9: Clorhidrato del acido (1S,2R,3R,4S,5R,6S)-2-amino-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-
[(hidroxiacetil)amino]biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxflico
imagen31
10 Anadir acido clorlddrico 4 N (3,0 ml, 12,0 mmol) en 1,4-dioxano a una mezcla de acido (1S,2R,3R,4S,5R,6S)-2-(ferc-
butoxicarbonilamino)-3-[(3,4-diclorofenil)metoxi]-4-[(2-hidroxiacetil)amino]biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxflico (0,032 g, 0,06 mmol) en agua (0,3 ml). Lavar el solido con acetonitrilo y dietil eter sobre un embudo de placa fritada. Secuencialmente, lavar el solido con acetonitrilo y dietil eter y despues secar de nuevo en un horno de vado durante la noche a 50 °C para proporcionar el compuesto del tftulo en forma de un solido de color blanco (0,018 g, 15 0,04 mmol, 65 %). EM (m/z): 433 (M-H).
Ejemplo 10: Clorhidrato de (1S,2R,3S,4S,5R,6R)-2-amino-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-hidroxibiciclo[3.1.0]hexano-2,6- dicarboxilato de bis({[(1-metiletoxi)carbonil]oxi}metilo)
imagen32
Anadir (1S,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-hidroxibiciclo[3.1,0]hexano-
20 2,6-dicarboxilato de bis({[(1-metiletoxi)carbonil]oxi}metilo) a una solucion de acido clorhidrico 4,0 M en dioxano (14,47 ml, 57,87 mmol) y agitar durante 45 minutos. Anadir acetato de etilo, y concentrar la mezcla de reaccion hasta conseguir una espuma. Triturar la espuma con acetato de etilo para producir un solido. Concentrar y secar al vado a
40 °C durante la noche para proporcionar el compuesto del titulo en forma de un solido de color crema (1,77 g, 2,75 mmol, 95 %): EM (m/z): 608 (M-H).
Los compuestos de los Ejemplos 11-14 se pueden preparar esencialmente como se describe en el Ejemplo 10:
Ej. N.°
Nombre qmmico Estructura Rendimiento (%) Datos ffsicos EM (m/z)
11
Clorhidrato de (1S,2R,3S,4S,5R, 6R)-2-amino-3- [(3,4-diclorobencil)oxi]-4- hidroxibiciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de bis {[(etoxicarbonil)oxi]metilo} OH n f Cl v<rv°1 O i—O Y-6 h2$ T .—O HCl 0 .« 6 \ 97 608 (M+1)
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Clorhidrato de (1S,2R,3S,4S,5R, 6R)-2-amino-3- [(3,4-diclorobencil)oxi]-4- hidroxibiciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de bis{[(2-metilpropanoil)oxi]metilo} OH H J Cl r° H >—O H;N 1. ■ ' f: ■ l:: o . ” 73 575/577 (M+1)
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Clorhidrato de (1S,2R,3S,4S, 5R,6R)-2-amino-3- [(3,4-diclorobencil)oxi]-4- hidroxibiciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de bis{[(ciclopropilcarbonil)oxi]metilo} IH OH J------t v.] w : ■ 1:1 o., o hi ci . - ' ° * o 1 97 572/574 (M+1)
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Clorhidrato de (1S,2R,3R,4S,5R,6S)-4- (acetilamino)-2-amino-3-[(3,4-diclorobencil)oxi] biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de bis[(acetiloxi)metilo] o >— H N q v „ - ■ . .i;| - >~° T 5 O j—O -l" 3 ■ ■ . ■ ,-| l ' 1 82 561/563 (M+1)
Ejemplo 15: Clorhidrato de (1S,2R,3S,4S,5R,6R)-2-amino-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-hidroxibiciclo[3.1.0]hexano-2,6- 5 dicarboxilato de bis({[(1-metiletoxi)carbonil]oxi}metilo)
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Etapa 1: (1S,2S,4S,5R,6R)-2-[(ferc-Butoxicarbonil)amino]-4-hidroxibiciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-terc- butilo
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Anadir tri(sec-butil)borohidruro de litio 1 M en tetrahidrofurano (2,67 l, 2,67 mol) gota a gota a una solucion de (1S,2S,5R,6R)-2-[(terc-butoxicarbonil)amino]-4-oxobiciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-terc-butilo (1000 g, 2,43 mol) en tetrahidrofurano seco (10 l) a 0 °C bajo atmosfera de nitrogeno. Despues de 2 horas a 0 °C, se anadio Na2CO3 2 M en agua (850 g, 8,02 mol) a 0 °C durante 2 horas, seguido de una solucion acuosa de peroxido de hidrogeno al 35 % (740 ml, 8,99 mol) en agua (3,3 l). Despues de 40 minutos, la mezcla se calento a temperature ambiente, despues de lo cual, la fase organica se separo. La fase organica se diluyo con metil terc- butil eter (3,5 l) y las capas se separaron de nuevo. La fase acuosa se extrajo con metil terc- butil eter (3,5 l). Todas las fases organicas combinadas se lavaron sucesivamente con una solucion acuosa de Na2SO3 1 M (2,67 l), agua (2,67 l), y salmuera (2,67 l), se seco con sulfato de sodio, se filtro y se concentro a un volumen de 3 l. El solido precipitado se filtro y se lavo con heptano (1,3 l) para obtener el compuesto del tftulo (864,76 g). Los licores madre se concentraron a sequedad y el residuo se trituro con heptano (500 ml) y se filtro para obtener mas compuestos del tftulo (130,64 g, total 995,4 g, rendimiento 99 %). EM (m/z): 436 (M+23).
Etapa 2: (1S,2S,5R,6S)-2-[(ferc-Butoxicarbonil)amino]biciclo[3.1.0]hex-3-eno-2,6-dicarboxilato de di-terc-butilo
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Se anadio trietilamina (735 ml, 5,30 mol) gota a gota a 0 °C bajo atmosfera de N2 durante 40 minutos a una solucion de (2S,4S)-2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]-4-hidroxibiciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-terc-butilo (995,4 g, 2,41 mol) en tetrahidrofurano seco (8,4 l) Se anadio cloruro de metanosulfonilo (373 ml, 4,82 mol) a 0 °C durante 50 minutos. La reaccion se calento a 23 °C. Despues de 3 horas, la reaccion se filtro para eliminar la sal de clorhidrato de trietilamina. Lavar la torta de filtro con tetrahidrofurano seco (2x2 l). El filtrado (13 l) se dividio en dos partes iguales. A la mitad del filtrado, se anadio terc-butoxido de potasio 1 M en tetrahidrofurano (3,6 l, 3,6 mol) gota a gota a la solucion obtenida en la etapa anterior (en bruto V=6,5 l, 1,2 mol) a 15 °C durante 2 horas 15 minutos despues dejar calentar a 23 °C. Despues de 2 horas 30 minutos, la reaccion se inactivo rapidamente vertiendo en una solucion acuosa de acido acetico al 10 % (950 ml). Separar las capas y extraer la capa acuosa con acetato de etilo (1,7 l). Las capas organicas se combinaron y se concentraron al vado para obtener un solido que se disolvio en acetona (1,45 l) y se anadio a agua (7,3 l). Agitar la solucion resultante durante la noche a 23 °C. Eliminar el precipitado por filtracion, lavar con agua (2x1 l), y secar en el horno de vado a 40 °C para obtener el compuesto del tftulo (450,67 g, rendimiento del 95 %). EM (m/z): 418 (M+23).
Etapa 3: (1S,2R,3S,4R,5R,6R)-2-[(ferc-Butoxicarbonil)amino]-3,4-dihidroxibiciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-terc-butilo
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Tetroxido de osmio (4 % p/p en agua, 231,78 ml, 241,05 g, 37,93 mmol,) se anadio una solucion a 23 °C de hidrato de N-metilmorfolina-N-oxido (101,62 ml; 114,83 g, 424,78 mmol), hidrato de N-metilmorfolina-N-oxido (116,88 g, 864,74 mmol), 4-metilmorfolina-4-oxido (198,88 ml; 195,50 g, 1,67 mol), y (1S,2S,5R,6S)-2-[(terc-
butoxicarbonil)amino]biciclo[3.1.0]hex-3-eno-2,6-dicarboxilato de di-terc-butilo (600,00 g, 1,52 mol) en acetona (12,00 l) y agua (1,80 l). La mezcla se agito a 23 °C durante la noche. El analisis mediante cromatograffa en capa fina (hexano/acetato de etilo 3:2; tincion: PMA) de la mezcla de reaccion revelo un agotamiento completo del (1S,2S,5R,6S)-2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]biciclo[3.1.0]hex-3-eno-2,6-dicarboxilato de di-terc-butilo. La reaccion se inactivo rapidamente con una solucion acuosa saturada de Na2S2O3 (1 l) y se extrajo con metil terc-butil eter (15 l). La fase organica se lavo con una solucion acuosa (1,5 l) preparada a partir de una solucion acuosa de HCl al 37 % (300 ml) y salmuera (1,2 l), se seco con MgSO4 anhidro, se filtro y se concentro al vado. El residuo se suspendio en heptano (1,5 l), se filtro y se lavo con heptano (2 x 500 ml), y se produjo un solido. El solido se seco al vado para producir el compuesto del tftulo (450 g, rendimiento del 69 %).
Etapa 4: (1S,2R,3S,4R,5R,6R)-2-[(ferc-Butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-hidroxibiciclo[3.1,0]hexano-
2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo
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A una solucion de (1S,2R,3S,4R,5R,6R)-2-[(terc-Butoxicarbonil)amino]-3,4-dihidroxibiciclo[3.1.0]hexano-2,6- 5 dicarboxilato de di-ferc-butilo (450 g, 1,05 mol) en diclorometano (4,50 l) a temperatura ambiente se anadieron sucesivamente bromuro de 3,4-diclorobencilo (144,73 ml, 238,80 g, 995,32 mmol), cloruro de tetra-N-butilamonio (58,24 g, 209,54 mmol), y una solucion acuosa al 50 % p/p de hidroxido de sodio (829,80 ml, 15,72 mol). Despues de 7 horas, diluir la reaccion con agua (1 l) y separar las fases. Extraer la fase organica con salmuera (500 ml), secar con MgSO4 anhidro, filtrar y concentrar. Purificar el residuo por cromatograffa (2,5 kg de SO2; eluyente: 10 hexano/acetato de etilo de 12:1 a 0:1) para dar el compuesto de fftulo (539 g, rendimiento del 72 %).
Etapa__________5: (1S,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(ferc-Butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-{[(4-
nitrofenil)carbonil]oxi}biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo
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A una solucion de (1S,2R,3S,4R,5R,6R)-2-[(ferc-butoxicarbonil) amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-
15 hidroxibiciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo (539,00 g, 751,00 mmol) en tetrahidrofurano (6,76 l) se anadieron trifenilfosfina (393,96 g, 1,50 mol) y acido 4-nitrobenzoico (251,02 g, 1,50 mol). La mezcla se enfrio a 10 °C despues de lo cual, azodicarboxilato de diisopropilo (40 % v/v en tolueno, 744,41 ml, 759,30 g, 1,50 mol) se anade gota a gota durante 15 minutos y se dejo calentar a 23 °C. Despues de 18 horas, la mezcla se diluyo con metil ferc-butil eter (2 l), se lavo secuencialmente con una solucion acuosa saturada de NaHCO3 (2 x 2 l) y salmuera (1 l), 20 y se concentro al vado. El residuo se suspendio en heptano (5 l) a 40 °C durante 30 minutos, despues se enfrio a 23 °C. El solido resultante se filtro y se lavo sucesivamente con heptano (2 x 500 ml), heptano/ metil ferc-butil eter (3 x 1 l). Los filtrados combinados se concentraron al vacfo y el residuo se purifico mediante cromatograffa (2,5 kg de SiO2; eluyente: hexano/acetato de etilo 95:5 a 75:25) seguido por recristalizacion en heptano (10 l/kg) para proporcionar el compuesto del fftulo en forma de un solido de color blanco (273 g, rendimiento del 49 %).
25 Etapa 6: (1S,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(ferc-Butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-hidroxibiciclo[3.1,0]hexano-
2,6-dicarboxilato de di-ferc-butilo
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Se anadio carbonato de potasio (153,45 g, 1,11 mol) a una suspension de (1S,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(ferc- butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-{[(4-nitrofenil)carbonil]oxi}biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de 30 di-ferc-butilo (273,00 g, 370,11 mmol) en metanol (3.28 l) a temperatura ambiente. Despues de 16 horas, la reaccion
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se concentro al vado. El residuo se disolvio en metil ferc-butil eter (2 l), y se lavo sucesivamente con agua (0,8 l), salmuera (0,8 l), se seco con MgSO4, y se concentro al vado para dar el compuesto del tttulo en forma de un solido de color blanco (215 g, rendimiento del 98 %).
Etapa 7: Clorhidrato del acido (1S,2R,3S,4S,5R,6R)-2-amino-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-hidroxibiciclo[3.1.0]hexano-
2,6-dicarbox^lico
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Una mezcla de agua (430 ml) y HCl al 37 % en agua (299,9 ml, 3,65 mol) se anadio a una suspension de (1S,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(ferc-butoxicarbonil) amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-hidroxibiciclo[3.1.0]hexano-2,6-
dicarboxilato de di-ferc-butilo (215 g, 365.3 mmol) en 1,4-dioxano (73.1 ml). La suspension resultante se agito a 100 °C durante 4,5 horas, se enfrio a 25 °C y se concentro al vado para proporcionar un solido de un solido de color blanco. Triturar sucesivamente con metil ferc-butil eter (2 l) y hexanos (2 l) y filtrar a continuacion para recoger los solidos. Secar al vado durante 16 horas. El solido se volvio a lavar con metil ferc-butil eter (2 x 1 l) y hexano (1 l), despues se seco al vado a 50 °C durante la noche para proporcionar el compuesto del tttulo en forma de un solido de color blanco (140,4 g, rendimiento del 93 %). EM (m/z): 376/378 (M+1).
Etapa______8: Acido (1S,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-
hidroxibiciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxflico
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Trietilamina (212,80 ml, 154,49 g, 1,53 mol) y 2-ferc-butoxicarboniloxiimino)-2-fenilacetonitrilo (125,33 g, 508,90 mmol) se anadieron sucesivamente a una suspension de clorhidrato del acido (1S,2R,3S,4S,5R,6R)-2-amino- 3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-hidroxibiciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxflico (140 g, 339 mmol) en 1,4-dioxano (203,56 ml), y agua (0.6 ml/mmol-puro-LR, 203,56 ml), a temperatura ambiente. Despues de 4,5 horas, anadir mas cantidad de 2-(ferc-butoxicarboniloxiimino)-2-fenilacetonitrilo (25,07 g, 101,78 mmol) y trietilamina (23,64 ml, 17,17 g, 169,63 mmol) a la reaccion y agitar a 50 °C durante la noche. Enfriar a 23 °C, diluir con agua (500 ml), y lavar con metil ferc-butil eter (6 x 500 ml). Diluir la fase acuosa con una solucion acuosa de HCl al 10 % (300 ml; final pH = 2) y extraer con acetato de etilo (2 x 500 ml). Los extractos de acetato de etilo se secaron con MgSO4 y se concentraron al vado para proporcionar el compuesto del tttulo (148,3 g, rendimiento del 92 %).
Etapa 9: (1S,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-hidroxibiciclo[3.1.0]hexano-
2,6-dicarboxilato de bis({[(1-metiletoxi)carbonil]oxi}metilo)
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A una solucion de (1S,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-
hidroxibiciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de bis({[(1-metiletoxi)carbonil]oxi}metilo) (148,30 g, 311,35 mmol) en dimetilformamida (2,49 l) a 23 °C se anadieron sucesivamente carbonato de potasio (172,12 g, 1,25 mol), carbonato
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de clorometilisopropilo (118,03 ml; 135,73 g, 871,79 mmol) y yoduro de sodio (9,33 g, 62,27 mmol). Agitar durante 18 horas. Diluir con metil ferc-butil eter (2 l) y agua (2 l). Separar las capas y lavar la fase organica sucesivamente con agua (200 ml) y salmuera (200 ml). Secar con MgSO4 anhidro, filtrar y concentrar al vado. Purificar el residuo por cromatograffa (2,5 kg de SO2; eluyente: hexano/acetato de etilo de 3:1 a 1:1) para proporcionar el compuesto de tftulo (167 g, rendimiento del 76 %): EM (m/z): 608/610 (M-100 (-CO2tBu)).
Etapa 10: (1S,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-hidroxibiciclo[3.1.0]hexano-
2,6-dicarboxilato de bis({[(1-metiletoxi)carbonil]oxi}metilo)
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(1S,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4-hidroxibiciclo[3.1.0]hexano-2,6- dicarboxilato de bis({[(1-metiletoxi)carbonil]oxi}metilo) (165,50 g, 233,58 mmol) se trato con HCl 4 M en 1,4-dioxano (1,16 l, 4,63 mol) a 23 °C y se agito durante 2 horas. Los componentes volatiles se eliminaron al vado. El residuo obtenido se suspendio en metil ferc-butil eter (1200 ml) durante la noche. El solido resultante se filtro, se lavo con metil ferc-butil eter (2 x 100 ml), y se seco al vado a 1 mbar/45 °C durante 6 horas para proporcionar el compuesto del tftulo en forma de un solido de color blanco (134 g, rendimiento del 89 %). EM (m/z): 608/610 (M+1)
Los datos de la literatura (Kit, Jeffrey M., and Eiler, William J.A. (2006), Antagonism of Metabotropic Glutamate Group II Receptors in the Potential Treatment of Neurological and Neuropsychiatric Disorders. Drug Development Research vol 67, pag. 757-769; y Yasuhara, Akito y Chaki, Shigeyuki, (2010) Metabotropic Glutamate Receptors: Potential Drug Targets for Psychiatric Disorders, The Open Medicinal Chemistry Journal, vol. 4, pag. 20-36.) y los datos generados en estudios no clrnicos con animales respaldan un papel de los antagonistas de mGlu2/3 en el tratamiento de trastornos depresivos y trastornos de somnolencia excesiva. Espedficamente, se ha descubierto que los antagonistas del receptor mGlu2/3 son eficaces en modelos de roedor de los trastornos depresivos y estimulan la vigilia usando roedores vigilados por EEG sin hiperactividad desproporcionada o clrnicamente relevante o hipersomnolencia excesiva de compensacion. La mayor aleta se manifiesta en un aumento en la atencion, mejora del rendimiento cognitivo, y posibilidad de fatiga reducida. Como los trastornos anteriormente descritos representan estados clrnicos comorbidos, un antagonista del receptor mGlu2/3 puede ser especialmente eficaz en poblaciones de pacientes espedficos, tales como pacientes con trastorno depresivo mayor, depresion resistente al tratamiento, depresion unipolar, distimia y/o ciclotimia, o cualesquiera trastornos de somnolencia excesiva. Los trastornos de somnolencia excesiva pueden incluir, aunque no de forma limitativa, somnolencia diurna excesiva (SDE), hipersomnia asociada con apnea del sueno obstructiva o narcolepsia, trastornos del ritmo circadiano del sueno (incluido, aunque no de forma limitativa, a trastorno del sueno por cambio de turno de trabajo, trastorno por cambio de la zona horaria (jet lag), trastorno de fase del sueno retrasada, trastorno del sueno de fase avanzada, y smdrome de fase del sueno no de 24 horas), hipersomnolencia idiopatica y somnolencia excesiva asociada con sueno no restaurador (SNR).
Para demostrar adicionalmente las caractensticas de los presentes compuestos, los compuestos representativos se pueden estudiar en los siguientes ensayos in vifro e in vivo:
Ensayos con los antagonistas de AMPc de los receptores mGlu2 y mGlu3
La actividad antagonista se sometio a ensayo en celulas AV12 que expresaban de forma estable los receptores mGlu2 y mGlu3 humanos, y el transportador de glutamato de rata EAAT1 (Transportador de aminoacido excitador 1). Las lrneas celulares se mantuvieron por cultivo en DMEM con elevado contenido en glucosa y clorhidrato de piridoxina suplementado con suero de feto de bovino dializado al 5 % (FBS), piruvato de sodio 1 mM, HEPES 1 mM y l-glutamina 1 mM; como antibioticos de seleccion se usaron geneticina e higromicina B. Los cultivos confluentes se hicieron crecer a 37 °C en una atmosfera que contema CO2 al 6,5 % y se realizaron pases quincenalmente. Las celulas se recogieron usando tripsina al 0,25 %, se suspendieron en medio de congelacion (FBS con DMSO al 10 %) a 107 celulas/ml, y las aftcuotas se almacenaron en nitrogeno ftquido. Veinticuatro horas antes del ensayo, las celulas se sembraron en placas a una densidad de 8.000-10.000 celulas por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos tratada, con media superficie de color negro (Costar 3875) en 50 pl de DMEM con elevado contenido en glucosa y clorhidrato de piridoxina suplementado con suero de feto de bovino dializado al 5 % (FBS), piruvato de sodio 1 mM, HEPES 1 mM, 100 pg/ml de ampicilina y 250 pM (mGlu2) o 125 pM (mGlu3) de L- glutamina.
La inversion de la inhibicion de la produccion de AMPc estimulada por forskolina realizada por los compuestos experimentales se midio usando tecnologfa de fluorescencia resuelta en tiempo homogenea (HTRF; Cisbio n.° cat.
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62AM4PEB). El medio se elimino, y las celulas se incubaron con 100 |jl de tampon de estimulacion de AMPc (STIM) durante 30 minutes a 37 °C. (El tampon STIM contiene 500 ml de HBSS, 1000 ml de DPBS, BSA al 0,034 %, HEPES 1,67 mM e IBMX 500 jM (Sigma 15879).) Los compuestos se estudiaron en curvas de respuesta a la concentracion de 10 puntos usando diluciones seriadas 3X seguido por una dilucion adicional de 40 veces en tampon STIM. DCG IV (Tocris 0975) sirve como el agonista de referencia. La mezcla de reaccion final contiene 1 jM (para mGlu2) o 3 jM (para mGlu3) de forskolina (Sigma F6886), DCG IV a su CE90, y hasta 25 jM del compuesto experimental. Las celulas se incubaron a 37 °C durante 20 minutos. Para medir los niveles de AMPc, conjugado AMPc-d2 y conjugado anti-AMPc-criptato en tampon de lisis se incubaron con las celulas tratadas a temperatura ambiente durante 1 hora (mGlu2) o 1,5 h (mGlu3). La senal de HTRF se detecto usando un lector de placas Envision (Perkin-Elmer) para calcular el cociente de fluorescencia de 665 a 620 nM. Los datos brutos se convirtieron en cantidad de AMPc (pmol/pocillo) usando una curva patron de AMPc generada para cada experimento. Los valores de CI50 relativos se calcularon par el intervalo superior-inferior de la curva de respuesta a la concentracion usando un programa de ajuste a la curva logfstica de cuatro parametros (ActivityBase v5.3.1.22).
Ensayos FLIPR y AMPc para determinar la selectividad del receptor mGlu
Las potencias agonistas relativas de los compuestos de la invencion para los otros receptores mGlu humanos se puede evaluar bien con un ensayo AMPc o un ensayo fluorimetrico de respuesta al calcio (vease por ejemplo, Fell y col., JPET (en prensa)). En resumen, en estos estudio se utilizaron las lmeas celulares AV12 individuales que contienen el transportador de glutamato EAAT1 de rata y que expresan de forma estable los receptores mGlu1, 2, 3, 4, 5, 6, y 8 humanos. Los receptores mGlu1 y 5 estan acoplados a Gq, por lo que de forma natural realizan la senalizacion a traves de la fosfolipasa C, lo que produce una respuesta de flujo de calcio que se pueden utilizar para medir la activacion usando un lector de placas mediante formacion de imagen fluorometrica (FLIPR, Molecular Devices). Las lmeas de celulas que expresan los receptores mGlu2, 3, 4, y 8 se disenaron para expresar la subunidad Ga15 de forma que estos receptores acoplados a Gi generaran una respuesta de flujo de calcio similar a la de las lmeas celulares que expresan los receptores mGlu1 y 5. El receptor mGlu6 se estudio en un formato de AMPc usando procedimientos analogos a los desarrollados para mGlu2 y mGlu3 anteriores. Estas lmeas de celulas se mantienen como se ha descrito anteriormente salvo que las cantidades de L-glutamina y agentes de seleccion (geneticina, higromicina B, zeocina, y blasticidina) puede variar dependiendo de la lmea de celulas. Se realizaron pases quincenalmente de los cultivos confluentes.
Los niveles de calcio intracelular se vigilaron mediante FLIPR antes y despues de la adicion de los compuestos experimentales y colorante Fluo-3 AM (Invitrogen) o Calcium 4 (Molecular Devices), dependiendo de la lmea de celulas. Las celulas se sembraron en placas 24 horas antes del ensayo en una concentracion variable de glutamina y en una densidad variable de celulas por pocillo, dependiendo de la lmea de celulas. El medio se elimino, y las celulas se incubaron con 8 jM de colorante (50 jl por pocillo) durante 90 o 120 minutos (dependiendo de la lmea de celulas) a 25 °C. Se llevo a cabo un ensayo de adicion unica de FLIPR, que genera una curva de respuesta a la concentracion de 11 puntos para el glutamato agonista, antes de cada experimento, para confirmar la sensibilidad adecuada de las celulas. Los resultados se analizaron mediante GraphPad Prism v4.03 para calcular las concentraciones de glutamato necesarias para inducir las respuestas CE90 (ensayo de antagonista) y CE10 (ensayo de potenciador).
Los compuestos se sometieron a ensayo para cada receptor mGlu en un ensayo de dos adiciones de FLIPR usando un perfil de respuesta a la concentracion de 10 puntos comenzando a una concentracion final de 25 jM para el ensayo de agonista y de 12,5 jM para los ensayos del potenciador y el antagonista. La primera adicion detecta cualquier actividad agonista, y la segunda adicion consiste en 100 jl de concentraciones seleccionadas (dependiendo de la lmea de celulas) de glutamato en tampon de ensayo, generando una CE10 o CE90 de respuesta al glutamato. Los efectos agonistas se cuantifican como porcentaje de estimulacion inducida por el compuesto solo, con respecto a la maxima respuesta al glutamato. Los efectos antagonistas se cuantifican calculando la inhibicion porcentual de la CE90 de respuesta al glutamato producida por el compuesto. Los efectos de potenciacion se cuantifican como porcentaje de aumento en presencia de la CE10 de respuesta en glutamato con respecto a la CEmax de respuesta. Todos los datos se calculan como valores relativos de CI50 o CE50 usando un programe de ajuste a la curva logfstica de cuatro parametros (ActivityBase v5.3.1.22).
La actividad antagonista en celulas mGlu6 se midio usando AMPc en un procedimiento analogo al descrito anteriormente para la actividad de mGlu2 y mGlu3, salvo que el agonista de referencia fue L-AP4 (Tocris). Para medir la actividad agonista de mGlu6, se calculo la extension en la cual el compuesto inhibe la produccion de AMPc estimulada por forskolina. Los valores relativos de CI50 y CE50 se calcularon para el intervalo superior-inferior de la curva de respuesta a la concentracion usando un programa de ajuste a la curva logfstica de cuatro parametros (ActivityBase v5.3.1.22).
Los compuestos ilustrativos en los que R1 y R2 son ambos hidrogeno se sometieron a ensayo esencialmente como se ha descrito anteriormente y se descubrio que teman una fuerte potencia antagonista de los receptores mGlu2 y mGlu3. Tambien se descubrio que los compuestos ilustrativos en los que R1 y R2 son ambos hidrogeno eran antagonistas selectivos de los receptores mGlu2 y mGlu3 respecto de otros subtipo del receptor mGlu, con valores de CI 50 para los receptores mGlu2 y mGlu3 menores de 70 nM y 50 nM, respectivamente, mientras que los valores de CI 50 para otros receptores de mGlu sometidos a ensayo fueron significativamente mayores. Vease la Tabla 1.
5
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Tabla 1. Datos de selectividad
Ej.
mGlu1 % inhib. a 12,5 |jM CI50 mGlu2 nM CI50 mGlu3 nM mGlu4 % inhib. a 12,5 jM mGlu5 % inhib. a 12,5 jM CI50 mGlu6 nM mGlu8 % inhib. a 12,5 jM
1
-0,47 % 43,3±5,8 27,2±4,2 28,5 % 4,8 % 3300 78,4 % (CI50 1900 nM)
2
8,6 % 13,1±1,9 7,8 69,0 % -12,9 % 1290±162 92,3 % (CI50 507 nM)
3
ND 25,4±4,8 10,8 ND ND 2480±295 ND
4
-2 % 25,5±2,8 8,2±0,3 13,3 % 22,6 % 2640±424 23,4 %
5
ND 16,8±1,6 9,5±4,6 ND ND 1580±141 ND
6
ND 18,6±3,9 13,9±2,4 ND ND 1360±433 ND
7
11,2 % 52±17,9 34,8±6,9 32,2 % 22,7 % 3690 46,7 %
8
ND 42,9±1,8 26,0±0,5 ND ND 2580 ND
9
5 % 22±3,0 4,4±0,5 46,9 % 13,8 % 2820 13,3 %
ND = no determinado
Adicionalmente, algunos compuestos de la presente invencion muestran una falta de actividad significativa en otros receptores fisiologicamente relevantes tales como, aunque no de forma limitativa, el canal hERG, receptores de la serotonina (espedficamente 5-HT2A y 5-HT2b), receptores muscarrnicos (espedficamente M2), y receptores iGluR (espedficamente iGluR5). El compuesto del ejemplo 1 se sometio a ensayo usando procedimientos de ensayo conocidos y se descubrio que no tema actividad apreciable con dichos receptores.
Por lo tanto, se espera que las dosis fisiologicamente relevantes de los compuestos de la invencion proporcionen una inhibicion sustancial de los receptores mGlu2 y mGlu3 in vivo, a la que ve no interaction sustancialmente con otros receptores mGlu, u otros receptores fisiologicamente relevantes, y por tanto se espera que proporcionen la farmacologfa deseada, evitando al mismo tiempo efectos indeseables asociados con una actividad no prevista.
Ensayo de natacion forzada en ratones (mFST)
El mFST es un ensayo in vivo bien caracterizado de la actividad antidepresiva (Li y col. J Pharmacol Exp Ther. 319(1):254-9, 2006.). Los ratones tratados con antidepresivos conocidos clrnicamente eficaces (inhibidores de la recaptacion de serotonina y/o antidepresivos tridclicos) presentan el comportamiento de un tiempo reducido en inmovilidad despues de introducirse en un tanque de agua, un comportamiento asociado con la desesperacion. El mFST se utilizo para evaluar la actividad potencial de tipo antidepresivo de los novedosos antagonistas de mGlu2/3 esencialmente como se ha descrito en procedimientos publicados anteriormente (vease, por ejemplo, Li y col. J Pharmacol Exp Ther. 319(1):254-9, 2006.). En resumen, se usaron ratones NIH-Swiss macho (Harlan Sprague- Dawley, Indianapolis, IN), con peso entre 25-30 g. Los animales alojados en grupos se llevaron desde el animalario hasta la zona de ensayo en sus propias jaulas, y se dejo que se adaptaran al nuevo entorno al menos 1 h antes de realizar las pruebas. Los compuestos donde R1 y R2 son ambos hidrogeno se disolvieron en agua con una cantidad minima de NaOH para su disolucion y se administraron i.p. Los compuestos donde R1 y/o R2 son diferentes de hidrogeno se prepararon el dfa de uso en N-metil-pirrolidinona al 2,0-2,5% y posteriormente se suspendieron en HEC al 1 %, Tween 80 al 0,25 %, y antiespumante Dow al 0,05 %, y se administraron por via oral. Los ratones se colocaron en un cilindro (diametro: 10 cm; altura: 25 cm) lleno con 6 cm de agua (22-25 °C) durante 6 min. Se puntuo la duracion de la inmovilidad durante los ultimos 4 min del periodo de 6 cm del ensayo. Se registro que un raton esta inmovil cuando flota sin movimientos o realiza solo los movimientos necesarios para mantener la cabeza por encima del agua.
Los compuestos representativos se sometieron a ensayo esencialmente como se ha descrito anteriormente y se descubrio que redudan significativamente los tiempos de inmovilizacion en ratones naturales. Vease la Tabla 2. Por tanto, se espera que los compuestos de la invencion tengan actividad antidepresiva in vivo.
Tabla 2. mFST
Ejemplo
DE60 (mg/kg) Disminucion maxima (1 compuesto/control)* 100 %
1
1,0 (i.p.) 59 %
2
2,08 (i.p.) 62 %
3
8,2 (i.p.) 47 %
4
9,5 (i.p.) 38 %
5
7,45 (i.p.) 56 %
6
7,3 (i.p.) 47 %
7
>10 (i.p.) 18 %
8
9,1 (i.p.) 41 %
9
9,68 (i.p.) 41 %
10/15
22,1 (p.o.) 50,5 %
11
51,5 (p.o.) 32,9 %
12
>28 (p.o.) 7 %
13
11,3 (p.o.) 62,8 %
En otros experimented, se estudiaron ratones con eliminaciones en el receptores (ratones con mGlu2 desactivado geneticamente); estos ratones se reproduccion mediante reproduccion heterocigoto x heterocigoto y se usaron como companeros de camada para comparaciones entre ratones -/- y +/+ (Taconic Farms). El compuesto del ejemplo 1 5 (10 mg/kg, i.p., 30 min antes) disminuyo significativamente el tiempo de inmovilidad en ratones mGlu2+/+, pero no en
ratones mGlu2-/-. De forma similar, el compuesto del ejemplo 10/15 (30 mg/kg, po, 120 min antes) disminuyo el tiempo de inmovilidad en ratones mGlu2+/+, pero no en ratones mGlu2-/-. Estos hallazgos demostraron adicionalmente que el receptor mGlu2 contribuye a los efectos de tipo antidepresivo de los compuestos de la invencion.
10 Los compuestos de la invencion tambien se pueden someter a ensayo junto con otros compuestos utiles para el tratamiento de trastornos depresivos, como por ejemplo SSRI, para determinar su capacidad para potenciar los efectos de tipo antidepresivo respecto de cualquier compuesto en solitario. El compuesto del ejemplo 10 (17 mg/kg p.o.) se sometio a ensayo en la prueba de natacion forzada en ratones, en solitario y junto con fluoxetina (10 mg/kg, i.p.) y se descubrio que aumentaba significativamente el efecto de tipo antidepresivo respecto al de cada uno de los
15 compuestos en solitario, como se muestra en la Tabla 3, a continuacion. Adicionalmente, el analisis de los niveles en cerebro y en plasma del resto diacido activo del compuesto del ejemplo 10 (es decir, el mismo compuesto que la base libre del ejemplo 1), no mostro aumento en los niveles de exposicion, lo que respalda el hallazgo de que el aumento de la actividad de tipo antidepresivo no se debe a un aumento en la exposicion central al compuesto.
Tabla 3. mFST con SSRI
Compuesto(s)
Tiempo de inmovilizacion (s) Error estandar de la media Disminucion maxima (1 compuesto/control)* 100 %
Vehteulo
174 10
Ejemplo 10
105 12 24,5 %
Fluoxetina
161 8 7,6 %
Ej. 10 + Fluoxetina
66 19 62,1 %
20 Seguimiento del estado de vigilia y la conducta en ratas: Los compuestos representativos de la presente invencion se estudiaron en ratas para determinar su capacidad de aumentar la cantidad de progestina en estado de vigilia sin efectos indeseados tales como la inhibicion del sueno REM, alteracion del motor del despertar (hiperlocomocion o
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hipolocomocion desproporcionada), y/o hipersomnia de rebote. Los animales de ensayo se vigilaron continuamente mediante electroencefalogramas (EEG), electromiogramas (EMG), y movimiento para medir el tiempo de vigilia acumulado, hipersomnia de rebote e intensidad de la actividad locomotora durante el estado de vigilia. Los procedimientos para este tipo de estudios son conocidos en la tecnica (veanse, por ejemplo, los procedimientos descritos en Edgar DM, Seidel WF. Modafinil induces wakefulness without intensifying motor activity or subsequent rebound hypersomnolence in the rat. J Pharmacology & Experimental Therapeutics 1997; 283: 757-769; van Gelder RN, Edgar DM, Dement WC. Real-time automated sleep scoring: validation of a microcomputer-based system for mice. Sleep 1991, 14:48-55; y Gross BA, Walsh CM, Turakhia AA, Booth V, Mashour GA, Poe GR. Open-source logic-based automated sleep scoring software using electrophysiological recordings in rats. J Neurosci Methods. 2009; 184(1): 10-8.) Los estudios se realizaron de la siguiente forma:
Preparacion de los animales. Ratas Wistar macho adultas (de aproximadamente 270-300 g en el momento de la cirugfa) se equiparon quirurgicamente para un registro cronico de EEG, EMG, temperatura corporal, y movimiento, de la siguiente forma: Las ratas se prepararon quirurgicamente con un implante craneal que consistfa en cuatro tornillos de acero inoxidable para registro de EEG (dos frontales [3,9 mm anterior respecto a la bregma, y ±2,0 mm mediolateralmente] y dos occipitales [6,4 mm posterior respecto a la bregma, ±5.5 mm mediolateralmete]), y con dos cables de acero inoxidable revestidos con teflon para el registro de EMG (situado bajo los musculos trapezoidales de la nuca). Todas las puntas se soldaron a un conector en miniatura (Microtech, Boothwyn, PA) antes de la cirugfa. El conjunto de implantes se fijo al craneo mediante la combinacion de los tornillos de acero inoxidable par registro de EEG, cianoacrilato aplicado entre el conector del implante y el craneo, y acnlico dental. La temperatura corporal y la actividad locomotora se registraron mediante un transmisor en miniatura (Minimitter PDT4000G, Philips Respironics, Bend, OR) introducido quirurgicamente en el abdomen. Se dejaron transcurrir al menos 3 semanas para recuperacion.
Entorno de registro. Cada rata se alojo individualmente en una jaula de microaislamiento modificada con un elevador superior de filtro de policarbonato para permitir mas espacio vertical. Un cable flexible, que restringe mmimamente el movimiento, se conecto por un extremo a un conmutador fijado a la parte superior de la jaula y, por el otro, al implante craneal del animal. Cada jaula se coloco en un compartimiento independiente ventilado de una camara de registro de sueno-despertar de acero inoxidable. El alimento y el agua estuvieron disponibles ad libitum y la temperatura ambiente se mantuvo a aproximadamente 23± 1 °C. Durante la totalidad del estudio se mantuvo un ciclo de luz-oscuridad de 24 horas (LD 12:12) usando luz fluorescente. La humedad relativa promedio fue de aproximadamente el 50 %. Los animales no se molestaron durante al menos 30 h antes y despues de cada tratamiento.
Diseno del estudio y dosificacion. Los compuestos donde R1 y R2 son ambos hidrogeno se disolvieron en agua con una cantidad minima de NaOH para su disolucion y se administraron i.p. en un volumen de 1,0 ml por kg de peso corporal. Los compuestos donde R1 y/o R2 son distintos de hidrogeno se administraron p.o. en un volumen de 2 ml por kg de peso corporal en uno de dos vehmulos alternativos: i) N-metil-2-pirrolidinona al 2,5% en hidroxietilcelulosa; o ii) 10 % de goma arabiga con antiespumante Dow Corning® Antifoam al 0,05 % en agua. El vehmulo o uno de los niveles de dosis del compuesto se administraron pseudoaleatoriamente para que ninguna rata recibiera el mismo tratamiento dos veces, y que ninguna rata recibiera mas de dos de los 8 tratamientos en cualquiera de los estudios. Cada rata se saco de su jaula durante aproximadamente un minuto para determinacion del peso y aplicacion del tratamiento. Un periodo de descanso terapeutico mmimo de 6 dfas precede y sigue a cada tratamiento.
Recopilacion de los datos. La discriminacion entre los estados de sueno y vigilia se puede automatizar (por ejemplo, Van Gelder y col. 1991; Edgar y col. 1997, Winrow y col., 2010; Gross y col., 2009). EEG se amplifica y se filtra (X10,000, paso de banda 1-30 Hz), EMG se amplifica y se integra (paso de banda 10-100 Hz, integracion RMS), y la actividad locomotora no espedfica se supervisa simultaneamente. Los estados de excitacion se clasifican en tramos de 10 segundos como sueno no REM, sueno REM, estado de vigilia, o estado de vigilia de theta predominante. La actividad locomotora (LMA) se registra como cuentas por minuto y se detecta mediante receptores de telemetna comercialmente disponibles (ER4000, Minimitter, Bend, OR).
Analisis estad^stico. Las edades y pesos corporales se resumen por la media, mmimo y maximo para los grupos de tratamiento. Todos los animales que tuvieron al menos un resultado se incluyeron en los resultados del resumen (por ejemplo, los inventores incluyen datos adecuados para el tratamiento de un animal cuyos datos de telemetna son de utilidad, pero los datos del EEG no lo son). El penodo de observacion posterior al tratamiento se dividio en 2 intervalos posteriores a la dosificacion (las primeras 7 horas, y las primeras 19 horas) donde el tiempo de dosificacion se define como el inicio de la Hora = 0. Los resultados se resumen para cada periodo calculando bien el valor horario promedio o el valor acumulado para cada periodo. Cada resultado de cada periodo se analizo mediante el analisis de la covarianza usando los datos del grupo de tratamiento y del tratamiento como los factores y el correspondiente intervalo previo al tratamiento, 24 h anterior, como la covariable. Las medias ajustadas y la media del cambio con respecto al vehmulo y sus correspondientes errores estandar se resumen para cada grupo de tratamiento. Los valores p de Dunnet para comparacion multiple se muestran para cada resultado en cada periodo. No todos los resultados se analizaron para todos los periodos, como se muestra en la Tabla 1, lo que afecta por tanto, a la tasa de error experimental de tipo I. Como tal, no se realizaron ajustes adicionales para multiples ensayos.
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Determinacion de la eficacia. El umbral de la dosis eficaz se estimo como la dosis mas baja para la que el tiempo de vigilia acumulado supera 50 minutos con respecto a los controles tratados con vetnculo durante las primeras 7 horas despues del tratamiento. Se puede realizar una determinacion mas fina realizando estudios posteriores de dosis mas estrechamente separadas alrededor de la dosis eficaz.
Determinacion de los efectos no deseables. En particular, se evaluaron dos efectos potencialmente no deseables: hipersomnolencia de rebote y actividad motora intensificada (Edgar DM, Seidel WF, 1997).
(i) La hipersomnolencia de rebote se puede medir como una disminucion en los niveles de vigilia durante el periodo de 8-19 horas despues de las dosis de tratamiento eficaces. Una disminucion biologicamente significativa se define como mas del 50 por ciento del aumento acumulado durante las primeras 7 horas. Por lo tanto, si la vigilia aumenta en 100 minutos durante las primeras 7 horas, entonces una disminucion en la vigilia acumulada de 50 minutos o mas, con respecto a los controles tratados con vetnculo, durante el periodo de 8-19 horas despues del tratamiento se considerana biologicamente significativa. Los cambios medios del grupo, mostrados en la Tabla 2, muestran una falta de hipersomnolencia de rebote.
(ii) La intensificacion de la actividad motora se define como un aumento promedio respecto a los controles tratados con vetnculo que supere 5 cuentas de LMA por minuto durante la vigilia definida por EEG al a dosis umbral de eficacia, y cuyos efectos estan relacionados con la dosis. Los aumentos en la medio del grupo de la Tabla 2 estan todos por debajo de las 5 cuentas por minuto durante la vigilia y no son dependientes de la dosis.
Los compuestos ilustrativos se sometieron a ensayo esencialmente como se ha descrito y se descubrio que estimulaban el estado de vigilia sin una hipersomnolencia de rebote significativa o intensificacion de la actividad motora. Los compuestos ilustrativos donde R1 y R2 son ambos hidrogeno (administrados i.p.) se sometieron a ensayo esencialmente como se ha descrito y se descubrio que eran eficaces a dosis de 10 mg/kg o menores. El compuesto del Ejemplo 10 se sometio a ensayo esencialmente como se ha descrito y se descubrio que tema el perfil acumulado de tiempo de vigilia y la intensidad de la actividad locomotora que se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4.
Tiempo de vigilia acumulado para las primeras 7 horas
Dosis (mg/kg PO)
N Media DE P
60
9 64,7 13,9 <0,0001
30
8 48,8 14,4 0,0019
10
10
20,4 13,4 0,1387
Tiempo de vigilia acumulado para las 8-19 horas
Dosis (mg/kg PO)
N Media DE P
60
9 34,7 12,4 0,0087
30
8 25,6 13,6 0,0696
10
10
15,2 12,3 0,2257
Intensidad de la actividad locomotora (nota 1)
Dosis (mg/kg PO)
N Media DE P
60
6 4,2 2,0 0,0427
30
5 0,5 2,1 0,8199
10
6 2,7 2,0 0,1999
Resultados estadisticos: Los valores medios representan la diferencia respecto de los controles tratados con vetnculo. DE= Error estandar del promedio; P = valor P ajustado para multiples contrastes para la variable de eficacia. Los valores P sin ajustar se muestran para las medidas de 'efecto no deseable' (tiempo de vigilia acumulado para las 8-19 horas, e Intensidad de la actividad locomotora). El tiempo de vigilia acumulado se proporciona en minutos. Nota 1. Intensidad de la actividad locomotora (LMA) = cuentas de LMA por minuto durante la vigilia definida por EEG, promediada para las primeras 7 horas despues del tratamiento.
5
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Aunque es posible administrar los compuestos utilizados en los procedimientos de la presente invencion directamente sin ninguna formulacion, los compuestos se suelen administrar en forma de composiciones farmaceuticas que comprenden al menos un compuesto de Formula I, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, como principio activo, y al menos un transportador diluyente y/o excipiente farmaceuticamente aceptable. Estas composiciones se pueden administrar mediante una variedad de vfas incluidas la oral, subcutanea, intravenosa, e intramuscular. Dichas composiciones farmaceuticas y procedimientos para prepararlas son bien conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (University of the Sciences in Philadelphia, ed., 21a ed., Lippincott Williams & Wilkins Co., 2005). Los Compuestos de Formula I donde R1 y/o R2 son diferentes a hidrogeno se prefieren para administracion por via oral para mejorar la biodisponibilidad, mientras que los Compuestos de Formula I donde R1 y R2 son ambos hidrogeno se prefieren para administracion i.v. o i.p.
Las composiciones se formulan preferentemente en una forma de dosificacion unitaria, conteniendo cada dosificacion de aproximadamente 1 a aproximadamente 600 mg, de forma mas habitual de aproximadamente 30 a aproximadamente 300 mg, como por ejemplo entre aproximadamente 50 y aproximadamente 250 mg del principio activo. El termino "forma de dosificacion unitaria" se refiere a unidades ffsicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para sujetos humanos y otros mairnferos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado, en asociacion con al menos un transportador, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable.
Los compuestos de Formula I son generalmente eficaces para un amplio intervalo de dosificacion. Por ejemplo, las dosificaciones diarias normalmente estan comprendidas en el intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 mg/kg, mas habitualmente de aproximadamente 0,3 a 5,0 mg/kg, y como por ejemplo, entre 0,5 y 3,0 mg/kg de peso corporal. En algunos casos pueden ser mas que adecuados niveles de dosificacion por debajo del lfmite inferior del anteriormente resenado, mientras que, en otros casos, se pueden utilizar dosis aun mas grandes sin producir ningun efecto secundario perjudicial y, por tanto, el intervalo de dosificacion anterior no pretende limitar el ambito de la invencion en forma alguna. Se entendera que la cantidad del compuesto administrada realmente sera determinada por un medico, segun las circunstancias relevantes, incluyendo la dolencia que se va a tratar, la ruta de administracion escogida, el compuesto o compuestos reales administrados, la edad, peso, y respuesta del paciente individual, y la gravedad de los smtomas del paciente.

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto de formula
    imagen1
    en la que R1 y R2 son cada uno independientemente hidrogeno, alcoxi C1-C3 carboniloximetilo, alquil C1-C3 carboniloximetilo, o cicloalquil C3-6 carboniloximetilo;
    R3 es, independientemente en cada aparicion, metilo, fluor, o cloro;
    R4 es hidroxilo, metilcarbonilamino, hidroximetilcarbonilamino, metoxicarbonilamino, imidazol-2-ilsulfanilo, tiazol- 2-ilsulfanilo, 1,2,4-triazolilsulfanilo, 1-metil-1,2,4-triazol-3-ilsulfanilo, o 1-metil-1,2,4-triazol-5-ilsulfanilo; y n es 1 o 2;
    o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
  2. 2. El compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que n es 2, ambos grupos R3 son cloro, y los grupos cloro estan en las posiciones 3 y 4 del fenilo, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
  3. 3. El compuesto de acuerdo con cualquiera de la reivindicacion 1 o 2 en el que R1 y R2 son cada uno hidrogeno, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
  4. 4. El compuesto de acuerdo con cualquiera de la reivindicacion 1 o 2 en el que R1 y R2 son ambos diferentes de hidrogeno, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
  5. 5. El compuesto de acuerdo con cualquiera de la reivindicacion 1 o 2 en el que R1 y R2 son iguales y son diferentes de hidrogeno, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
  6. 6. El compuesto de acuerdo con la reivindicacion 5 en el que R1 y R2 son cada uno isopropiloxicarboniloximetilo.
  7. 7. El compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1 que es acido (1S,2R,3S,4S,5R,6R)-2-amino-3-[(3,4- diclorobencil)oxi]-4-hidroxibiciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxflico o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
  8. 8. El compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1 que es (1S,2R,3S,4S,5R,6R)-2-amino-3-[(3,4-diclorobencil)oxi]-4- hidroxibiciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de bis({[(1-metiletoxi)carbonil]oxi}metilo) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
  9. 9. Una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, y un vehfculo, excipiente o diluyente farmaceuticamente aceptable.
  10. 10. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para su uso en terapia.
  11. 11. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de trastornos depresivos.
  12. 12. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de trastornos de somnolencia excesiva.
  13. 13. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para su uso en una combinacion simultanea, independiente o adicional junto con un inhibidor de la recaptacion de serotonina en el tratamiento de trastornos depresivos en un mairnfero.
  14. 14. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicacion 13 en el que el inhibidor de la recaptacion de serotonina es fluoxetina.
  15. 15. Una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y un inhibidor de la recaptacion de serotonina.
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